JPH11302299A - Ｔ細胞リセプターβ鎖定常領域ペプチド、該ペプチドの製造方法及び用途 - Google Patents
Ｔ細胞リセプターβ鎖定常領域ペプチド、該ペプチドの製造方法及び用途Info
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- JPH11302299A JPH11302299A JP10110607A JP11060798A JPH11302299A JP H11302299 A JPH11302299 A JP H11302299A JP 10110607 A JP10110607 A JP 10110607A JP 11060798 A JP11060798 A JP 11060798A JP H11302299 A JPH11302299 A JP H11302299A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 Ｔ細胞リセプターβ鎖の定常領域の一部
または全部を実質的に含み、且つＴ細胞リセプターβ鎖
の他の領域を実質的に含有しない、免疫抑制作用を有す
るポリペプチド；前記のポリペプチドをコ−ドするＤＮ
Ａ；以下の式： Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （式中、Ｒ１は担体ポリペプチド、Ｘは蛋白質分解酵素
認識部位、そしてＲ２は前記のポリペプチドである）で
示される融合ポリペプチドをコ−ドする塩基配列を有す
るＤＮＡ；前記のＤＮＡを担持した発現ベクタ−；前記
の発現ベクタ−で形質転換された宿主細胞；前記のポリ
ぺプチドの製造方法；および、前記のポリペプチドを有
効成分として含む医薬組成物。 【効果】 投与すべき患者の組織適合性抗原を考慮する
ことなく、抗原特異性を考慮する必要のない、免疫抑制
作用を持ったＴＣＲβが提供された。
または全部を実質的に含み、且つＴ細胞リセプターβ鎖
の他の領域を実質的に含有しない、免疫抑制作用を有す
るポリペプチド；前記のポリペプチドをコ−ドするＤＮ
Ａ；以下の式： Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （式中、Ｒ１は担体ポリペプチド、Ｘは蛋白質分解酵素
認識部位、そしてＲ２は前記のポリペプチドである）で
示される融合ポリペプチドをコ−ドする塩基配列を有す
るＤＮＡ；前記のＤＮＡを担持した発現ベクタ−；前記
の発現ベクタ−で形質転換された宿主細胞；前記のポリ
ぺプチドの製造方法；および、前記のポリペプチドを有
効成分として含む医薬組成物。 【効果】 投与すべき患者の組織適合性抗原を考慮する
ことなく、抗原特異性を考慮する必要のない、免疫抑制
作用を持ったＴＣＲβが提供された。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗原非特異的な免
疫抑制作用を有するＴ細胞リセプターβ鎖の定常領域ポ
リペプチドに関する。
疫抑制作用を有するＴ細胞リセプターβ鎖の定常領域ポ
リペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｔ細胞リセプターβ鎖（以下、Ｔ細胞レ
セプターを「ＴＣＲ」、Ｔ細胞レセプターβ鎖を「ＴＣ
Ｒβ」という）は、抗原を認識する特異的なアミノ酸配
列を持つ可変領域と、生物種ごとに固有のアミノ酸配列
を持つ定常領域からなる。これまでＴＣＲの生物学的機
能としては、ＴＣＲα鎖（以下、「ＴＣＲα」という）
とＴＣＲβ鎖（以下、「ＴＣＲβ」という）の可変領域
が、ＭＨＣ分子上に提示された抗原を認識することによ
って、Ｔ細胞がその抗原に応答し、免疫反応の調節が行
われることであると考えられてきた。また、ＴＣＲα、
βを持つあらゆるＴ細胞において均一であるＴＣＲβの
定常領域（以下、「Ｃβ」という）は、ＴＣＲα鎖の定
常領域（以下、「Ｃα」という）と会合することによっ
てＴＣＲの構造を維持する機能を持つことと、細胞内へ
シグナルを伝達することがその役割と考えられてきた。
セプターを「ＴＣＲ」、Ｔ細胞レセプターβ鎖を「ＴＣ
Ｒβ」という）は、抗原を認識する特異的なアミノ酸配
列を持つ可変領域と、生物種ごとに固有のアミノ酸配列
を持つ定常領域からなる。これまでＴＣＲの生物学的機
能としては、ＴＣＲα鎖（以下、「ＴＣＲα」という）
とＴＣＲβ鎖（以下、「ＴＣＲβ」という）の可変領域
が、ＭＨＣ分子上に提示された抗原を認識することによ
って、Ｔ細胞がその抗原に応答し、免疫反応の調節が行
われることであると考えられてきた。また、ＴＣＲα、
βを持つあらゆるＴ細胞において均一であるＴＣＲβの
定常領域（以下、「Ｃβ」という）は、ＴＣＲα鎖の定
常領域（以下、「Ｃα」という）と会合することによっ
てＴＣＲの構造を維持する機能を持つことと、細胞内へ
シグナルを伝達することがその役割と考えられてきた。
【０００３】マウス及びヒトのＴＣＲβのＣβには、エ
キソンの違いから２種類の遺伝子が存在することがわか
っている。例えば、Hendrick et.al., Nature, 308: 14
9-153, 1984に記載されたマウスＴＣＲβはＣβ１（配
列番号１）であり、Chien et.al., Nature, 309: 322-3
26, 1984に記載されたマウスＴＣＲβはＣβ２（配列番
号２）である。同様なことは、ヒトＴＣＲβのＣβにも
言える。例えば、Ynagi, et. al., Nature, 308: 145-1
49, 1984に記載されたヒトＴＣＲβはＣβ１（配列番号
３）であり、Yoshikai et. al., Nature, 312: 521-52
4, 1984に記載されたヒトＴＣＲβはＣβ２（配列番号
４）である。
キソンの違いから２種類の遺伝子が存在することがわか
っている。例えば、Hendrick et.al., Nature, 308: 14
9-153, 1984に記載されたマウスＴＣＲβはＣβ１（配
列番号１）であり、Chien et.al., Nature, 309: 322-3
26, 1984に記載されたマウスＴＣＲβはＣβ２（配列番
号２）である。同様なことは、ヒトＴＣＲβのＣβにも
言える。例えば、Ynagi, et. al., Nature, 308: 145-1
49, 1984に記載されたヒトＴＣＲβはＣβ１（配列番号
３）であり、Yoshikai et. al., Nature, 312: 521-52
4, 1984に記載されたヒトＴＣＲβはＣβ２（配列番号
４）である。
【０００４】マウスＴＣＲβのＣβ１とＣβ２のシーケ
ンスは、cDNAでは２２ヌクレオチド、アミノ酸では４ア
ミノ酸しか違いがない。また、ヒトＴＣＲβのＣβ１と
Ｃβ２のシーケンスは、 cDNAでは１６ヌクレオチド、
アミノ酸では５アミノ酸しか違いがなく、Ｃβ２の方が
２アミノ酸長いだけである。具体的にはマウスＴＣＲβ
のＣβでは配列番号１に記載された１３５Gln、１６１T
hr、１６４Val、１７０Argが配列番号２に記載された１
３５His、１６１Gly、１６４Leu、１７０Lysに換わって
いて、ヒトＴＣＲβのＣβでは配列番号３に記載された
４Asn、５Lys、３７Phe、１３６Val、１７７Pheが配列
番号４に記載された４Lys 、５Asn 、３７Tyr、１３６G
lu、１７７Serに換わっていて、１７８Argと１７９Gly
が付加されている。ほとんどのアミノ酸の個々の変化が
大きくないため（例えば、マウスＴＣＲβのＣβの１６
４Valと１６４Leuは、両者とも負荷をもたない極性アミ
ノ酸である）ＴＣＲβのＣβタンパクとしての機能への
影響はほとんどみられないと考えられる（Gascoigne e
t. al., 310: 387-391, 1984)。
ンスは、cDNAでは２２ヌクレオチド、アミノ酸では４ア
ミノ酸しか違いがない。また、ヒトＴＣＲβのＣβ１と
Ｃβ２のシーケンスは、 cDNAでは１６ヌクレオチド、
アミノ酸では５アミノ酸しか違いがなく、Ｃβ２の方が
２アミノ酸長いだけである。具体的にはマウスＴＣＲβ
のＣβでは配列番号１に記載された１３５Gln、１６１T
hr、１６４Val、１７０Argが配列番号２に記載された１
３５His、１６１Gly、１６４Leu、１７０Lysに換わって
いて、ヒトＴＣＲβのＣβでは配列番号３に記載された
４Asn、５Lys、３７Phe、１３６Val、１７７Pheが配列
番号４に記載された４Lys 、５Asn 、３７Tyr、１３６G
lu、１７７Serに換わっていて、１７８Argと１７９Gly
が付加されている。ほとんどのアミノ酸の個々の変化が
大きくないため（例えば、マウスＴＣＲβのＣβの１６
４Valと１６４Leuは、両者とも負荷をもたない極性アミ
ノ酸である）ＴＣＲβのＣβタンパクとしての機能への
影響はほとんどみられないと考えられる（Gascoigne e
t. al., 310: 387-391, 1984)。
【０００５】また、ＴＣＲβのＣβは種間でも極めて高
い相同性を示す。例えば、マウスＣβ2とヒトＣβ2との
間の相同性は約８０％（７９％）であり（Morris M. et
al., Immunogenetics, 27, 174-179, 1988)、両者のア
ミノ酸配列は極めて類似している。一方、ＴＣＲと同様
に抗原に特異的に反応する構造を持ったイミュノグロブ
リン（抗体）は、ＴＣＲ同様、可変領域と定常領域から
なり、Ｂ細胞表面にある抗体分子はＴＣＲと類似した生
物学的機能を持っている。しかし抗体では、さらに可溶
性抗体が存在し、これはＢ細胞より分泌される。この場
合、抗原に結合する可変領域以外に、定常領域も重要な
生物学的機能を示す。すなわち、多くの細胞にはこの定
常領域の受容体があり、抗体が定常領域を介してそれら
の細胞に結合する事によって、抗体依存性の様々な免疫
応答を誘導する。
い相同性を示す。例えば、マウスＣβ2とヒトＣβ2との
間の相同性は約８０％（７９％）であり（Morris M. et
al., Immunogenetics, 27, 174-179, 1988)、両者のア
ミノ酸配列は極めて類似している。一方、ＴＣＲと同様
に抗原に特異的に反応する構造を持ったイミュノグロブ
リン（抗体）は、ＴＣＲ同様、可変領域と定常領域から
なり、Ｂ細胞表面にある抗体分子はＴＣＲと類似した生
物学的機能を持っている。しかし抗体では、さらに可溶
性抗体が存在し、これはＢ細胞より分泌される。この場
合、抗原に結合する可変領域以外に、定常領域も重要な
生物学的機能を示す。すなわち、多くの細胞にはこの定
常領域の受容体があり、抗体が定常領域を介してそれら
の細胞に結合する事によって、抗体依存性の様々な免疫
応答を誘導する。
【０００６】これまでＴＣＲβの定常領域に対する受容
体の存在などは、何ら報告されていない。すなわち、可
溶性ＴＣＲβの定常領域が、生物学的な機能を持つこと
を予見させる現象は皆無であった。また、これまで、Ｔ
ＣＲβの免疫抑制作用を示唆する報告は存在するが、こ
れらはいずれもＴＣＲβの可変領域までを含む分子に関
するものであり、その作用は抗原特異的な免疫抑制反応
に関与している可能性が考えられている。例えば、マウ
スの実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルにおいては、抗原
であるミエリン塩基性タンパクに特異的なＴＣＲβの可
変領域ペプチドを免疫することで、この疾患の発症を抑
制したり（Vandenbark et al., Nature, 341 :541-544,
1989、及び、Howell et al., Science, 246 : 668-67
0, 1989）、あるいは時には増強したり（Desquenne-Cla
rk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 : 7219-7
223,1991)することが見出されている。
体の存在などは、何ら報告されていない。すなわち、可
溶性ＴＣＲβの定常領域が、生物学的な機能を持つこと
を予見させる現象は皆無であった。また、これまで、Ｔ
ＣＲβの免疫抑制作用を示唆する報告は存在するが、こ
れらはいずれもＴＣＲβの可変領域までを含む分子に関
するものであり、その作用は抗原特異的な免疫抑制反応
に関与している可能性が考えられている。例えば、マウ
スの実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルにおいては、抗原
であるミエリン塩基性タンパクに特異的なＴＣＲβの可
変領域ペプチドを免疫することで、この疾患の発症を抑
制したり（Vandenbark et al., Nature, 341 :541-544,
1989、及び、Howell et al., Science, 246 : 668-67
0, 1989）、あるいは時には増強したり（Desquenne-Cla
rk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 : 7219-7
223,1991)することが見出されている。
【０００７】これらの結果が示していることは、ＴＣＲ
βが抗原特異的な免疫調節に関わるものであり、この場
合当然、可変領域の構造がその機能を担っていると考え
られることである。なお、本件発明者らは、先にＴＣＲ
α定常領域につき免疫抑制作用を有することを発見し特
許出願を行なっているが（国際公開ＷＯ９７／４３４１
１号；１９９７年１１月２０日）、ＴＣＲαとＴＣＲβ
はいずれもＴ細胞レセプターの構成タンパク質で抗原特
異性に関わる分子である点で関連しているものの、ＴＣ
Ｒαとβは別のタンパク質であり、ＴＣＲαの定常領域
に免疫抑制作用があるとしても、ＴＣＲβの定常領域に
同様作用が期待できるとする合理的理由乃至示唆は全く
ない。
βが抗原特異的な免疫調節に関わるものであり、この場
合当然、可変領域の構造がその機能を担っていると考え
られることである。なお、本件発明者らは、先にＴＣＲ
α定常領域につき免疫抑制作用を有することを発見し特
許出願を行なっているが（国際公開ＷＯ９７／４３４１
１号；１９９７年１１月２０日）、ＴＣＲαとＴＣＲβ
はいずれもＴ細胞レセプターの構成タンパク質で抗原特
異性に関わる分子である点で関連しているものの、ＴＣ
Ｒαとβは別のタンパク質であり、ＴＣＲαの定常領域
に免疫抑制作用があるとしても、ＴＣＲβの定常領域に
同様作用が期待できるとする合理的理由乃至示唆は全く
ない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従来のＴＣＲβを免疫
抑制用途に使用するという試みは、ＴＣＲβの可変領域
が関与した抗原特異的免疫作用を期待したものである
が、実際に臨床上実用化されたものはなく、また、抗原
特異的作用ゆえにそれを免疫抑制用途で使う場合にはそ
れぞれの免疫反応に関る抗原毎に特異的なＴＣＲβを調
製し使用しなくてはならないという治療上の制約がある
と考えられる。従って、投与すべき患者の組織適合性抗
原を考慮することなく、抗原特異性を考慮する必要のな
い、免疫抑制作用を持ったＴＣＲβの開発が望まれてい
た。
抑制用途に使用するという試みは、ＴＣＲβの可変領域
が関与した抗原特異的免疫作用を期待したものである
が、実際に臨床上実用化されたものはなく、また、抗原
特異的作用ゆえにそれを免疫抑制用途で使う場合にはそ
れぞれの免疫反応に関る抗原毎に特異的なＴＣＲβを調
製し使用しなくてはならないという治療上の制約がある
と考えられる。従って、投与すべき患者の組織適合性抗
原を考慮することなく、抗原特異性を考慮する必要のな
い、免疫抑制作用を持ったＴＣＲβの開発が望まれてい
た。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、抗原特異的な
作用に関わると考えられていたＴＣＲβにつき、ＴＣＲ
βの可変領域ではなく定常領域が抗原非特異的な免疫抑
制作用を示すということを初めて見出したことに基づく
ものである。
作用に関わると考えられていたＴＣＲβにつき、ＴＣＲ
βの可変領域ではなく定常領域が抗原非特異的な免疫抑
制作用を示すということを初めて見出したことに基づく
ものである。
【００１０】本発明は、Ｔ細胞リセプターβ鎖の定常領
域の一部または全部を実質的に含み、且つＴ細胞リセプ
ターβ鎖の他の領域を実質的に含有しない、免疫抑制作
用を有するポリペプチドを提供するものである。本明細
書において、「Ｔ細胞リセプターβ鎖の定常領域の一部
または全部を実質的に含む」とは、免疫抑制作用を有す
る限りにおいて、Ｔ細胞リセプターβ鎖の定常領域の一
部または全部、及び、それと同一ではないが約８０％の
相同性を有するものを含むことを意味し、「Ｔ細胞リセ
プターβ鎖の他の領域を実質的に含有しない」とは、他
の領域を一切含有しないか、含有したとしても、免疫抑
制作用に影響を及ぼさず、且つ抗原特異的性質を示さな
い程度に含有することを意味する。なお、ここで、本発
明における「免疫抑制作用」とは、体液性免疫反応及び
細胞性免疫反応を抑制する作用であり、後述の実施例４
のＡ．乃至Ｃ．の試験方法にて確認できるものである。
域の一部または全部を実質的に含み、且つＴ細胞リセプ
ターβ鎖の他の領域を実質的に含有しない、免疫抑制作
用を有するポリペプチドを提供するものである。本明細
書において、「Ｔ細胞リセプターβ鎖の定常領域の一部
または全部を実質的に含む」とは、免疫抑制作用を有す
る限りにおいて、Ｔ細胞リセプターβ鎖の定常領域の一
部または全部、及び、それと同一ではないが約８０％の
相同性を有するものを含むことを意味し、「Ｔ細胞リセ
プターβ鎖の他の領域を実質的に含有しない」とは、他
の領域を一切含有しないか、含有したとしても、免疫抑
制作用に影響を及ぼさず、且つ抗原特異的性質を示さな
い程度に含有することを意味する。なお、ここで、本発
明における「免疫抑制作用」とは、体液性免疫反応及び
細胞性免疫反応を抑制する作用であり、後述の実施例４
のＡ．乃至Ｃ．の試験方法にて確認できるものである。
【００１１】また、本発明は、配列番号２のアミノ酸配
列の一部若しくは全部の配列、または該アミノ酸配列の
一部若しくは全部の配列において１以上のアミノ酸残基
が欠失、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列を有
し、且つ、免疫抑制作用を有するポリペプチドを提供す
る。前記のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列
の１〜１４６位のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列
において１以上のアミノ酸残基が欠失、挿入及び／又は
置換されたアミノ酸配列を有するものであるとよい。
列の一部若しくは全部の配列、または該アミノ酸配列の
一部若しくは全部の配列において１以上のアミノ酸残基
が欠失、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列を有
し、且つ、免疫抑制作用を有するポリペプチドを提供す
る。前記のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列
の１〜１４６位のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列
において１以上のアミノ酸残基が欠失、挿入及び／又は
置換されたアミノ酸配列を有するものであるとよい。
【００１２】また、本発明は、配列番号４のアミノ酸配
列の一部若しくは全部の配列、または該アミノ酸配列の
一部若しくは全部の配列において１以上のアミノ酸残基
が欠失、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列を有
し、且つ、免疫抑制作用を有するポリペプチドを提供す
る。前記のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列
の１〜１５０位のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列
において１以上のアミノ酸残基が欠失、挿入及び／又は
置換されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。
さらにまた、本発明は、上記のポリペプチドをコードす
るＤＮＡを提供する。
列の一部若しくは全部の配列、または該アミノ酸配列の
一部若しくは全部の配列において１以上のアミノ酸残基
が欠失、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列を有
し、且つ、免疫抑制作用を有するポリペプチドを提供す
る。前記のポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列
の１〜１５０位のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列
において１以上のアミノ酸残基が欠失、挿入及び／又は
置換されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。
さらにまた、本発明は、上記のポリペプチドをコードす
るＤＮＡを提供する。
【００１３】本発明はまた、以下の式： Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （式中、Ｒ１は担体ポリペプチド、Ｘは蛋白質分解酵素
認識部位、そしてＲ２は上記ポリペプチドである）で示
される融合ポリペプチドをコ−ドする塩基配列を有する
ＤＮＡを提供する。Ｒ１はカルモジュリンであってもよ
い。Ｘはトロンビンによって認識される部位であっても
よく、トロンビンによって認識される部位は、下記の配
列番号５のアミノ酸配列で示されてもよい。
認識部位、そしてＲ２は上記ポリペプチドである）で示
される融合ポリペプチドをコ−ドする塩基配列を有する
ＤＮＡを提供する。Ｒ１はカルモジュリンであってもよ
い。Ｘはトロンビンによって認識される部位であっても
よく、トロンビンによって認識される部位は、下記の配
列番号５のアミノ酸配列で示されてもよい。
【００１４】Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
（配列番号５） 本発明は、上記のＤＮＡを担持した発現ベクターおよび
該発現ベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
宿主細胞は原核細胞であってもよく、原核細胞は大腸菌
であってもよい。
（配列番号５） 本発明は、上記のＤＮＡを担持した発現ベクターおよび
該発現ベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
宿主細胞は原核細胞であってもよく、原核細胞は大腸菌
であってもよい。
【００１５】本発明は、また、上記ポリペプチドの製造
方法であって、該ポリペプチドをコードする塩基配列を
有するＤＮＡを担持した発現ベクタ−で形質転換された
宿主細胞を培養し、該ポリペプチドを単離することを特
徴とする、前記の製造方法も提供する。宿主細胞は原核
細胞であってもよく、原核細胞は大腸菌であってもよ
い。
方法であって、該ポリペプチドをコードする塩基配列を
有するＤＮＡを担持した発現ベクタ−で形質転換された
宿主細胞を培養し、該ポリペプチドを単離することを特
徴とする、前記の製造方法も提供する。宿主細胞は原核
細胞であってもよく、原核細胞は大腸菌であってもよ
い。
【００１６】本発明は、上記のポリペプチドの製造方法
であって、以下の式： Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （式中、Ｒ１は担体ポリペプチド、Ｘは蛋白質分解酵素
認識部位、そしてＲ２は上記ポリペプチドである）で示
される融合ポリペプチドをコ−ドする塩基配列を有する
ＤＮＡを担持した発現ベクターで形質転換された宿主細
胞を培養し、該融合ポリペプチドを発現させ、該融合ポ
リペプチドを蛋白質分解酵素で開裂処理し、Ｒ２で示さ
れるポリペプチドを単離することを特徴とする、前記の
製造方法も提供する。Ｒ１はカルモジュリンであっても
よい。Ｘはトロンビンによって認識される部位であって
もよく、トロンビンによって認識される部位は、下記の
配列番号５のアミノ酸配列で示されてもよい。
であって、以下の式： Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （式中、Ｒ１は担体ポリペプチド、Ｘは蛋白質分解酵素
認識部位、そしてＲ２は上記ポリペプチドである）で示
される融合ポリペプチドをコ−ドする塩基配列を有する
ＤＮＡを担持した発現ベクターで形質転換された宿主細
胞を培養し、該融合ポリペプチドを発現させ、該融合ポ
リペプチドを蛋白質分解酵素で開裂処理し、Ｒ２で示さ
れるポリペプチドを単離することを特徴とする、前記の
製造方法も提供する。Ｒ１はカルモジュリンであっても
よい。Ｘはトロンビンによって認識される部位であって
もよく、トロンビンによって認識される部位は、下記の
配列番号５のアミノ酸配列で示されてもよい。
【００１７】Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
（配列番号５） さらに、本発明は、上記のポリペプチドを有効成分とし
て含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、
免疫抑制剤、遅延型過敏反応抑制剤、抗体産生抑制剤、
アレルギー疾患の予防および／または治療剤、自己免疫
疾患の予防および／または治療剤、臓器移植時の拒絶反
応の抑制剤などであってもよい。
（配列番号５） さらに、本発明は、上記のポリペプチドを有効成分とし
て含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、
免疫抑制剤、遅延型過敏反応抑制剤、抗体産生抑制剤、
アレルギー疾患の予防および／または治療剤、自己免疫
疾患の予防および／または治療剤、臓器移植時の拒絶反
応の抑制剤などであってもよい。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明のポリペプチドは、少なく
とも免疫抑制作用に必須の領域またはその類縁体を含め
ばよく、例えば、Yoshikai et. al., Nature, 312: 521
-524, 1984やChien et. al., Nature, 309: 322-326, 1
984に記載のヒト、マウスを含む種々の生物のＴ細胞リ
セプターβ鎖の定常領域の全部、少なくとも免疫抑制作
用に必須の領域を含むその一部、これらのアミノ酸配列
の１以上のアミノ酸残基が、免疫抑制作用を有する限り
において、欠失、挿入および／または置換されているも
のを挙げることができる。本発明のポリペプチドには、
アミノ酸配列の１以上のアミノ酸残基が、欠失、挿入お
よび／または置換されていてもよい配列番号２または４
のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。配列番
号２または配列番号４の置換されたアミノ酸配列の例と
して、例えば配列番号１または３のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドが挙げられる。さらに好ましい形態とし
て、本発明のポリペプチドはＴＣＲβのＣβの細胞膜外
領域を含むとよい。その領域は、配列番号１及び２のア
ミノ酸配列では１から１４６位まで、配列番号３及び４
のアミノ酸配列では１から１５０位までに相当する。
とも免疫抑制作用に必須の領域またはその類縁体を含め
ばよく、例えば、Yoshikai et. al., Nature, 312: 521
-524, 1984やChien et. al., Nature, 309: 322-326, 1
984に記載のヒト、マウスを含む種々の生物のＴ細胞リ
セプターβ鎖の定常領域の全部、少なくとも免疫抑制作
用に必須の領域を含むその一部、これらのアミノ酸配列
の１以上のアミノ酸残基が、免疫抑制作用を有する限り
において、欠失、挿入および／または置換されているも
のを挙げることができる。本発明のポリペプチドには、
アミノ酸配列の１以上のアミノ酸残基が、欠失、挿入お
よび／または置換されていてもよい配列番号２または４
のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。配列番
号２または配列番号４の置換されたアミノ酸配列の例と
して、例えば配列番号１または３のアミノ酸配列を含む
ポリペプチドが挙げられる。さらに好ましい形態とし
て、本発明のポリペプチドはＴＣＲβのＣβの細胞膜外
領域を含むとよい。その領域は、配列番号１及び２のア
ミノ酸配列では１から１４６位まで、配列番号３及び４
のアミノ酸配列では１から１５０位までに相当する。
【００１９】本発明のポリペプチドは、後述するような
遺伝子組換え技術や、既知のアミノ酸配列に基づく化学
合成法などにより製造することができる。本発明ポリペ
プチドの免疫抑制作用は、抗原非特異的な作用である。
また、抗体産生という体液性免疫反応だけではなく、細
胞性免疫反応も抑制する。該ポリペプチドの抗原非特異
的な免疫抑制活性は、本願実施例に示すようなin vivo
で動物に投与した場合の免疫抑制作用の有無により容易
に判定できる。また、本発明ポリペプチドは、糖鎖を有
するものであってもよい。糖鎖付加された本発明ポリペ
プチドは、後述するように、例えば哺乳動物細胞や酵母
細胞などの糖蛋白質を産生する能力を有する宿主細胞を
用いた分泌発現による遺伝子組換え産物として製造し得
る。
遺伝子組換え技術や、既知のアミノ酸配列に基づく化学
合成法などにより製造することができる。本発明ポリペ
プチドの免疫抑制作用は、抗原非特異的な作用である。
また、抗体産生という体液性免疫反応だけではなく、細
胞性免疫反応も抑制する。該ポリペプチドの抗原非特異
的な免疫抑制活性は、本願実施例に示すようなin vivo
で動物に投与した場合の免疫抑制作用の有無により容易
に判定できる。また、本発明ポリペプチドは、糖鎖を有
するものであってもよい。糖鎖付加された本発明ポリペ
プチドは、後述するように、例えば哺乳動物細胞や酵母
細胞などの糖蛋白質を産生する能力を有する宿主細胞を
用いた分泌発現による遺伝子組換え産物として製造し得
る。
【００２０】本発明は、また、Ｔ細胞リセプターβ鎖の
定常領域の一部または全部を実質的に含み、且つＴ細胞
リセプターβ鎖の他の領域を実質的に含有しない、免疫
抑制作用を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提
供する。本発明のＤＮＡは、上述の本発明ポリペプチド
を遺伝子組換え技術により製造するために使用できる。
ここで、「コードする」とは、本発明ポリペプチドのア
ミノ酸配列情報がそのＤＮＡの塩基配列上に暗号化され
ていることをいい、種々の宿主／ベクター系において直
接発現或は融合蛋白の形で細胞内或は分泌生産するため
の適切な他のアミノ酸配列をコードする塩基配列を適宜
付加して発現させれば、本発明ポリペプチドの製造が可
能となるものを意味する。直接発現法により本発明ポリ
ペプチドを分泌発現しようとする場合には、その宿主に
応じた既に知られている他の分泌蛋白のシグナルペプチ
ドをコードする塩基配列を、本発明ポリペプチドをコー
ドする塩基配列の上流に付加することにより行うことが
できる。また、宿主細胞内で発現させる場合には、本発
明ポリペプチドをコードする塩基配列の上流に翻訳開始
コドンを付加することにより行うことができる。これら
の技術は、いずれも遺伝子組換え技術分野の当業者には
周知の手法であり、適宜実施し得る。また、融合蛋白発
現における本発明ＤＮＡの具体的態様としては、以下の
式： Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （式中、Ｒ１は担体ポリペプチド、Ｘは蛋白質分解酵素
認識部位、そしてＲ２はＴ細胞リセプターβ鎖の定常領
域の一部または全部を実質的に含み、且つＴ細胞リセプ
ターβ鎖の他の領域を実質的に含有しない、免疫抑制作
用を有するポリペプチドである）で示される融合ポリペ
プチドをコ−ドする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ
る。融合蛋白発現法において使用できる本発明ＤＮＡの
好ましい態様として、Ｒ１についてはカルモジュリン
が、また、Ｘについてはトロンビン認識部位配列（特に
好ましくはＬｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙの
配列）が挙げられるが（Ishii et al., J. Immunol. Me
thods, 186 : 27-36, 1995参照）、これに限定されるも
のではなく、周知の融合蛋白法による遺伝子組換え製造
技術（たとえば、特開昭５４−１４５２８９号参照）を
用いることができる。
定常領域の一部または全部を実質的に含み、且つＴ細胞
リセプターβ鎖の他の領域を実質的に含有しない、免疫
抑制作用を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提
供する。本発明のＤＮＡは、上述の本発明ポリペプチド
を遺伝子組換え技術により製造するために使用できる。
ここで、「コードする」とは、本発明ポリペプチドのア
ミノ酸配列情報がそのＤＮＡの塩基配列上に暗号化され
ていることをいい、種々の宿主／ベクター系において直
接発現或は融合蛋白の形で細胞内或は分泌生産するため
の適切な他のアミノ酸配列をコードする塩基配列を適宜
付加して発現させれば、本発明ポリペプチドの製造が可
能となるものを意味する。直接発現法により本発明ポリ
ペプチドを分泌発現しようとする場合には、その宿主に
応じた既に知られている他の分泌蛋白のシグナルペプチ
ドをコードする塩基配列を、本発明ポリペプチドをコー
ドする塩基配列の上流に付加することにより行うことが
できる。また、宿主細胞内で発現させる場合には、本発
明ポリペプチドをコードする塩基配列の上流に翻訳開始
コドンを付加することにより行うことができる。これら
の技術は、いずれも遺伝子組換え技術分野の当業者には
周知の手法であり、適宜実施し得る。また、融合蛋白発
現における本発明ＤＮＡの具体的態様としては、以下の
式： Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （式中、Ｒ１は担体ポリペプチド、Ｘは蛋白質分解酵素
認識部位、そしてＲ２はＴ細胞リセプターβ鎖の定常領
域の一部または全部を実質的に含み、且つＴ細胞リセプ
ターβ鎖の他の領域を実質的に含有しない、免疫抑制作
用を有するポリペプチドである）で示される融合ポリペ
プチドをコ−ドする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ
る。融合蛋白発現法において使用できる本発明ＤＮＡの
好ましい態様として、Ｒ１についてはカルモジュリン
が、また、Ｘについてはトロンビン認識部位配列（特に
好ましくはＬｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙの
配列）が挙げられるが（Ishii et al., J. Immunol. Me
thods, 186 : 27-36, 1995参照）、これに限定されるも
のではなく、周知の融合蛋白法による遺伝子組換え製造
技術（たとえば、特開昭５４−１４５２８９号参照）を
用いることができる。
【００２１】本発明ＤＮＡの作成は、ｃＤＮＡライブラ
リーからのクローニングやＤＮＡ合成により、またはこ
れにより得られたＤＮＡをオリゴヌクレオチド部位特異
的突然変異法やカセット変異法等の部位特異的突然変異
技術を用いて改変することにより、行うことができる。
ＴＣＲβ遺伝子及びその構造については、前述したよう
にヒト、マウスを含む種々の生物のものについて既に知
られているので、これら公知の塩基配列或はアミノ酸配
列情報に基づき、ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法や
ＤＮＡ合成技術等を用いてＴＣＲβ定常領域をコードす
るＤＮＡを適宜取得／作成することができる。
リーからのクローニングやＤＮＡ合成により、またはこ
れにより得られたＤＮＡをオリゴヌクレオチド部位特異
的突然変異法やカセット変異法等の部位特異的突然変異
技術を用いて改変することにより、行うことができる。
ＴＣＲβ遺伝子及びその構造については、前述したよう
にヒト、マウスを含む種々の生物のものについて既に知
られているので、これら公知の塩基配列或はアミノ酸配
列情報に基づき、ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法や
ＤＮＡ合成技術等を用いてＴＣＲβ定常領域をコードす
るＤＮＡを適宜取得／作成することができる。
【００２２】ｃＤＮＡライブラリーから取得する方法に
ついては、例えばマウスのＣβ領域の場合には、本願実
施例に開示しているように、公知のマウスＴ細胞株から
慣用の手法によりｃＤＮＡライブラリーを作成し、既に
知られているマウスＴＣＲβのＣβ領域の塩基配列に基
づき作成したプライマーを用いたＰＣＲ法により、該Ｔ
ＣＲβｃＤＮＡを取得することができ、このｃＤＮＡを
鋳型としてマウスＣβのＣ領域に対応するＤＮＡ断片を
増幅するようなプライマーを用いて再度ＰＣＲ法を行
い、所望のＤＮＡ断片を得ることができる。また、後者
のプライマーをｃＤＮＡライブラリーに直接用いてＰＣ
Ｒ法を行ない、所望のＤＮＡ断片を得ることもできる。
ヒトＣβ領域の場合にも、公知のヒトＴ細胞株（Thomas
et. al, The Journal of Immunology, 92: 729-737, 1
992等）からｃＤＮＡを作成し、公知であるヒトＴＣＲ
βのＣβ領域の塩基配列に基づき作成したプライマーを
用いて、前述マウスの場合と同様の手法により所望のＤ
ＮＡ断片を得ることができる。
ついては、例えばマウスのＣβ領域の場合には、本願実
施例に開示しているように、公知のマウスＴ細胞株から
慣用の手法によりｃＤＮＡライブラリーを作成し、既に
知られているマウスＴＣＲβのＣβ領域の塩基配列に基
づき作成したプライマーを用いたＰＣＲ法により、該Ｔ
ＣＲβｃＤＮＡを取得することができ、このｃＤＮＡを
鋳型としてマウスＣβのＣ領域に対応するＤＮＡ断片を
増幅するようなプライマーを用いて再度ＰＣＲ法を行
い、所望のＤＮＡ断片を得ることができる。また、後者
のプライマーをｃＤＮＡライブラリーに直接用いてＰＣ
Ｒ法を行ない、所望のＤＮＡ断片を得ることもできる。
ヒトＣβ領域の場合にも、公知のヒトＴ細胞株（Thomas
et. al, The Journal of Immunology, 92: 729-737, 1
992等）からｃＤＮＡを作成し、公知であるヒトＴＣＲ
βのＣβ領域の塩基配列に基づき作成したプライマーを
用いて、前述マウスの場合と同様の手法により所望のＤ
ＮＡ断片を得ることができる。
【００２３】ＤＮＡ化学合成により取得する場合には、
例えばアルトンらの方法（特表昭５９−５０１０９７）
によって、公知のＣβのアミノ酸配列に基づき、必要で
あれば優先コドンの使用も考慮して、塩基配列をデザイ
ンし、Ｃβ領域をコードするＤＮＡ断片を得ることがで
きる。
例えばアルトンらの方法（特表昭５９−５０１０９７）
によって、公知のＣβのアミノ酸配列に基づき、必要で
あれば優先コドンの使用も考慮して、塩基配列をデザイ
ンし、Ｃβ領域をコードするＤＮＡ断片を得ることがで
きる。
【００２４】また、公知の定常領域アミノ酸配列から１
以上のアミノ酸残基が欠失及び／又は置換されたアミノ
酸配列を有するポリペプチドについても、上述したＴＣ
Ｒβ定常領域をコードするＤＮＡを元にオリゴヌクレオ
チド部位特異的突然変異法やカセット変異法等の部位特
異的突然変異技術を用いて（例えば、D.F. Mark等, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.81, p5662-5666, 198
4、 S. Inouye等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.
79, p3438-3441, 1982、 PCT WO85/00817、1985年2月2
8日公開、 R. P. Wharton等, Nature, Vol.316, p601-
605, Aug. 15, 1985等参照）、またＤＮＡの化学合成に
より、そのような変異体ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを作成することができる。
以上のアミノ酸残基が欠失及び／又は置換されたアミノ
酸配列を有するポリペプチドについても、上述したＴＣ
Ｒβ定常領域をコードするＤＮＡを元にオリゴヌクレオ
チド部位特異的突然変異法やカセット変異法等の部位特
異的突然変異技術を用いて（例えば、D.F. Mark等, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.81, p5662-5666, 198
4、 S. Inouye等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.
79, p3438-3441, 1982、 PCT WO85/00817、1985年2月2
8日公開、 R. P. Wharton等, Nature, Vol.316, p601-
605, Aug. 15, 1985等参照）、またＤＮＡの化学合成に
より、そのような変異体ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを作成することができる。
【００２５】また、本発明によれば、上記の本発明ＤＮ
Ａを組み込んだ発現ベクター、該ベクターで形質転換さ
れた宿主細胞、該宿主細胞を培養し本発明ポリペプチド
を分離・精製する製造方法が提供される。この場合の宿
主細胞としては、原核生物（例えば細菌、好ましくは大
腸菌）、真核生物（例えば酵母、昆虫、あるいは哺乳動
物）細胞を用いることができる。哺乳動物細胞の例とし
ては、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Chin
ese Hamster Ovary ）細胞、Ｘ63.6.5.3. 細胞、Ｃ-127
細胞、ＢＨＫ（Baby Hamster Kidney ）細胞、ヒト由来
細胞（例えば、HeLa細胞）等があげられる。酵母の例と
しては、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）やメタ
ノール資化性酵母（Pichia pastoris ）等があげられ
る。昆虫細胞の例としては、蚕培養細胞（例えば、Sf21
細胞）等があげられる。
Ａを組み込んだ発現ベクター、該ベクターで形質転換さ
れた宿主細胞、該宿主細胞を培養し本発明ポリペプチド
を分離・精製する製造方法が提供される。この場合の宿
主細胞としては、原核生物（例えば細菌、好ましくは大
腸菌）、真核生物（例えば酵母、昆虫、あるいは哺乳動
物）細胞を用いることができる。哺乳動物細胞の例とし
ては、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（Chin
ese Hamster Ovary ）細胞、Ｘ63.6.5.3. 細胞、Ｃ-127
細胞、ＢＨＫ（Baby Hamster Kidney ）細胞、ヒト由来
細胞（例えば、HeLa細胞）等があげられる。酵母の例と
しては、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）やメタ
ノール資化性酵母（Pichia pastoris ）等があげられ
る。昆虫細胞の例としては、蚕培養細胞（例えば、Sf21
細胞）等があげられる。
【００２６】これらの宿主細胞を形質転換させるために
用いられるベクターには、大腸菌用としてpKC30 （Shim
atake H. and M. Rosenberg 、Nature、 292、 128-13
2、1981）、pTrc99A （Amann E.ら、 Gene6、69、 301-
315、1988）等があげられる。哺乳動物細胞用としてはp
SV2-neo（Southern and Berg ; J. Mol. Appl. Gene
t.、 1、 327-341、1982）、pCAGGS（Niwaら; Gene、 1
08、 193-200、1991）、あるいはpcDL-SR α296 （Take
beら ; Mol. Cell. Biol. 、 8、 466-472、1988）等が
ある。酵母用としてはpG-1（Schena M. and Yamamoto
K.R.; Science、241、 965-967、1988）等がある。蚕細
胞用としては、組み換えウイルス作製用トランスファー
ベクターpAc373（Luckowら、Bio/Technology、 6、 47-
55、1988）等がある。
用いられるベクターには、大腸菌用としてpKC30 （Shim
atake H. and M. Rosenberg 、Nature、 292、 128-13
2、1981）、pTrc99A （Amann E.ら、 Gene6、69、 301-
315、1988）等があげられる。哺乳動物細胞用としてはp
SV2-neo（Southern and Berg ; J. Mol. Appl. Gene
t.、 1、 327-341、1982）、pCAGGS（Niwaら; Gene、 1
08、 193-200、1991）、あるいはpcDL-SR α296 （Take
beら ; Mol. Cell. Biol. 、 8、 466-472、1988）等が
ある。酵母用としてはpG-1（Schena M. and Yamamoto
K.R.; Science、241、 965-967、1988）等がある。蚕細
胞用としては、組み換えウイルス作製用トランスファー
ベクターpAc373（Luckowら、Bio/Technology、 6、 47-
55、1988）等がある。
【００２７】これらのベクターは必要に応じて複製起
点、選択マーカー、プロモーターを含み、さらに真核細
胞用のベクターには、必要に応じてＲＮＡスプライス部
位、ポリアデニル化シグナル等が付加される。複製起点
として、哺乳動物細胞用ベクターには、SV40、アデノウ
イルス、ウシパピローマウイルス由来のもの等を用いる
ことができる。大腸菌用ベクターとしては、 ColE1、R
因子、F 因子由来のもの等を用いることができる。酵母
用としては２μmＤＮＡ、ARS1由来のもの等を用いるこ
とができる。
点、選択マーカー、プロモーターを含み、さらに真核細
胞用のベクターには、必要に応じてＲＮＡスプライス部
位、ポリアデニル化シグナル等が付加される。複製起点
として、哺乳動物細胞用ベクターには、SV40、アデノウ
イルス、ウシパピローマウイルス由来のもの等を用いる
ことができる。大腸菌用ベクターとしては、 ColE1、R
因子、F 因子由来のもの等を用いることができる。酵母
用としては２μmＤＮＡ、ARS1由来のもの等を用いるこ
とができる。
【００２８】遺伝子発現用プロモーターとして哺乳動物
細胞用ベクターには、ウイルス由来であるレトロウイル
ス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、SV40由来の
もの等あるいは、染色体由来のもの（例えば、EF1-α）
等を用いることができる。大腸菌用ベクターとしてはバ
クテリオファージλ由来のものや、 trp、 lpp、 lac、
tac プロモーター等を用いることができる。パン酵母用
としては ADH、PHO5、GPD 、PGK 、MAF αプロモータ
ー、メタノール資化性酵母についてはAOX1プロモーター
等を用いることができる。蚕細胞用ベクターとしては核
多角体病ウイルス由来のもの等を用いることができる。
細胞用ベクターには、ウイルス由来であるレトロウイル
ス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、SV40由来の
もの等あるいは、染色体由来のもの（例えば、EF1-α）
等を用いることができる。大腸菌用ベクターとしてはバ
クテリオファージλ由来のものや、 trp、 lpp、 lac、
tac プロモーター等を用いることができる。パン酵母用
としては ADH、PHO5、GPD 、PGK 、MAF αプロモータ
ー、メタノール資化性酵母についてはAOX1プロモーター
等を用いることができる。蚕細胞用ベクターとしては核
多角体病ウイルス由来のもの等を用いることができる。
【００２９】選択マーカーとして、哺乳動物細胞用ベク
ターには、ネオマイシン（neo ）耐性遺伝子、チミジン
キナーゼ（TK）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）
遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子等を用いることができ
る。大腸菌用ベクターとしては、カナマイシン耐性遺伝
子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺
伝子等を用いることができる。酵母用としてはLeu2、Tr
p1、Ura3遺伝子等を用いることができる。
ターには、ネオマイシン（neo ）耐性遺伝子、チミジン
キナーゼ（TK）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）
遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子等を用いることができ
る。大腸菌用ベクターとしては、カナマイシン耐性遺伝
子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺
伝子等を用いることができる。酵母用としてはLeu2、Tr
p1、Ura3遺伝子等を用いることができる。
【００３０】以上の様な宿主−ベクター系を用いて本発
明ポリペプチドを得るためには、上記ベクターの適当な
部位に本発明ＤＮＡを組み込んだ組み換えＤＮＡ体によ
り、宿主細胞を形質転換させた後、得られた形質転換体
を培養し、さらに細胞内あるいは培養液から該ポリペプ
チドを分離・精製すればよい。また、本発明によれば、
上記の本発明ＤＮＡを組み込んだ発現ベクター、該ベク
ターで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養し本
発明ポリペプチドを分離・精製する製造方法が提供され
る。具体的な本発明ポリペプチドの製造方法としては、
次の態様が挙げられる。
明ポリペプチドを得るためには、上記ベクターの適当な
部位に本発明ＤＮＡを組み込んだ組み換えＤＮＡ体によ
り、宿主細胞を形質転換させた後、得られた形質転換体
を培養し、さらに細胞内あるいは培養液から該ポリペプ
チドを分離・精製すればよい。また、本発明によれば、
上記の本発明ＤＮＡを組み込んだ発現ベクター、該ベク
ターで形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養し本
発明ポリペプチドを分離・精製する製造方法が提供され
る。具体的な本発明ポリペプチドの製造方法としては、
次の態様が挙げられる。
【００３１】宿主に応じた既に知られている他の分泌蛋
白のシグナルペプチドをコードする塩基配列を、本発明
ポリペプチドをコードする塩基配列の上流に付加する態
様の本発明ＤＮＡを用いて遺伝子組換えによる生産を行
なう場合には、培養液から該ポリペプチドを分離精製す
る。また、本発明ポリペプチドをコードする塩基配列の
上流に翻訳開始コドンを付加する態様の本発明ＤＮＡを
用いて遺伝子組換えによる生産を行なう場合には、宿主
細胞内に該ポリペプチドが生産されるので、細胞内から
該ポリペプチドを分離精製する。
白のシグナルペプチドをコードする塩基配列を、本発明
ポリペプチドをコードする塩基配列の上流に付加する態
様の本発明ＤＮＡを用いて遺伝子組換えによる生産を行
なう場合には、培養液から該ポリペプチドを分離精製す
る。また、本発明ポリペプチドをコードする塩基配列の
上流に翻訳開始コドンを付加する態様の本発明ＤＮＡを
用いて遺伝子組換えによる生産を行なう場合には、宿主
細胞内に該ポリペプチドが生産されるので、細胞内から
該ポリペプチドを分離精製する。
【００３２】融合蛋白発現法を用いた本発明ポリペプチ
ド製造方法の場合は、以下の式： Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （式中、Ｒ１は担体ポリペプチド、Ｘは蛋白質分解酵素
認識部位、そしてＲ２はＴ細胞リセプターβ鎖の定常領
域の一部または全部を実質的に含み、且つＴ細胞リセプ
ターβ鎖の他の領域を実質的に含有しない、免疫抑制作
用を有するポリペプチドである）で示される融合ポリペ
プチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを担持した
発現ベクタ−で形質転換された宿主細胞を培養し、該融
合ポリペプチド発現させ、該融合ポリペプチドを蛋白質
分解酵素で開裂処理し、Ｒ２で示されるポリペプチドを
単離する。Ｒ１の担体ポリペプチドは、融合ポリペプチ
ドを封入体として、外質、外膜、または外部環境へと輸
送するように機能するものであってもよい。なお、Ｒ１
についてはカルモジュリンが、また、Ｘについてはトロ
ンビン認識部位配列（特に好ましくはＬｙｓ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙの配列）が、それぞれ例として
挙げられるが、融合発現に関する本発明ポリペプチド製
造方法は、本発明ＤＮＡに関するところで既に述べたよ
うに、これに限定されるものではないことはいうまでも
ない。
ド製造方法の場合は、以下の式： Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （式中、Ｒ１は担体ポリペプチド、Ｘは蛋白質分解酵素
認識部位、そしてＲ２はＴ細胞リセプターβ鎖の定常領
域の一部または全部を実質的に含み、且つＴ細胞リセプ
ターβ鎖の他の領域を実質的に含有しない、免疫抑制作
用を有するポリペプチドである）で示される融合ポリペ
プチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを担持した
発現ベクタ−で形質転換された宿主細胞を培養し、該融
合ポリペプチド発現させ、該融合ポリペプチドを蛋白質
分解酵素で開裂処理し、Ｒ２で示されるポリペプチドを
単離する。Ｒ１の担体ポリペプチドは、融合ポリペプチ
ドを封入体として、外質、外膜、または外部環境へと輸
送するように機能するものであってもよい。なお、Ｒ１
についてはカルモジュリンが、また、Ｘについてはトロ
ンビン認識部位配列（特に好ましくはＬｙｓ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙの配列）が、それぞれ例として
挙げられるが、融合発現に関する本発明ポリペプチド製
造方法は、本発明ＤＮＡに関するところで既に述べたよ
うに、これに限定されるものではないことはいうまでも
ない。
【００３３】本発明の製法における、発現産物（融合蛋
白発現法の場合は、開裂処理前及び／又は後の産物）の
分離精製については、一般にタンパク質の精製に用いる
工程（イオン交換クロマトグラフィー、レクチンアフィ
ニティークロマトグラフィー、色素吸着クロマトグラフ
ィー、疎水相互クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンアフィ
ニティークロマトグラフィー、硫酸化ゲルクロマトグラ
フィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィ
ー、金属キレーティングクロマトグラフィー、等電点ク
ロマトグラフィー、分取電気泳動法、および等電点電気
泳動法など）等慣用の精製手段を適宜組み合わせて用い
ることができるが、発現産物の安定化のため精製工程に
おいてグリセロールを加えることが好ましい。
白発現法の場合は、開裂処理前及び／又は後の産物）の
分離精製については、一般にタンパク質の精製に用いる
工程（イオン交換クロマトグラフィー、レクチンアフィ
ニティークロマトグラフィー、色素吸着クロマトグラフ
ィー、疎水相互クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト
グラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンアフィ
ニティークロマトグラフィー、硫酸化ゲルクロマトグラ
フィー、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィ
ー、金属キレーティングクロマトグラフィー、等電点ク
ロマトグラフィー、分取電気泳動法、および等電点電気
泳動法など）等慣用の精製手段を適宜組み合わせて用い
ることができるが、発現産物の安定化のため精製工程に
おいてグリセロールを加えることが好ましい。
【００３４】また本発明は、本発明ポリペプチドを有効
成分として含む医薬組成物を提供する。その一態様とし
て免疫抑制剤が挙げられる。本発明の免疫抑制剤は、多
くの免疫疾患の治療に非常に有用である。ひとつの理由
は、可変領域を用いる場合、組織適合性抗原と完全に合
致するタイプのものを患者毎に選択しなければならない
のに対し、定常領域はすべてに共通であるためそのよう
な選択の必要なく用いることができる。
成分として含む医薬組成物を提供する。その一態様とし
て免疫抑制剤が挙げられる。本発明の免疫抑制剤は、多
くの免疫疾患の治療に非常に有用である。ひとつの理由
は、可変領域を用いる場合、組織適合性抗原と完全に合
致するタイプのものを患者毎に選択しなければならない
のに対し、定常領域はすべてに共通であるためそのよう
な選択の必要なく用いることができる。
【００３５】実施例で示すように、本発明ポリペプチド
は、アレルギー疾患発症の引き金となるイムノグロブリ
ンをクリアに抑制する。さらに重要なことは、すでに抗
原によってプライムされた状態のマウスに投与しても、
次の抗原チャレンジによる抗体産生の上昇も抑制する
し、また、on-going抗体産生の状態にあるものでも抑制
するということが示されていることである。これらの効
果を示す薬剤はこれまで、本願発明者らによるＴＣＲα
定常領域ポリペプチド、及び、強い副作用が問題となっ
ているステロイド剤以外には見出されていない。また、
抗体産生抑制という体液性免疫反応抑制以外に、遅延型
過敏反応といった細胞性免疫も抑制する。
は、アレルギー疾患発症の引き金となるイムノグロブリ
ンをクリアに抑制する。さらに重要なことは、すでに抗
原によってプライムされた状態のマウスに投与しても、
次の抗原チャレンジによる抗体産生の上昇も抑制する
し、また、on-going抗体産生の状態にあるものでも抑制
するということが示されていることである。これらの効
果を示す薬剤はこれまで、本願発明者らによるＴＣＲα
定常領域ポリペプチド、及び、強い副作用が問題となっ
ているステロイド剤以外には見出されていない。また、
抗体産生抑制という体液性免疫反応抑制以外に、遅延型
過敏反応といった細胞性免疫も抑制する。
【００３６】今日、体液性免疫と細胞性免疫の調節は、
二つのタイプのヘルパーT細胞（Th1とTh2）のバランス
によって制御されていると考えられるようになってきた
が、本発明ポリペプチドはいずれの免疫応答に対しても
抑制作用を示すことから、前述ＴＣＲα定常領域ポリペ
プチド同様に非常にユニークであり、多くの免疫疾患治
療に有効である可能性を示している。従って、本発明ポ
リペプチドを含有する免疫抑制剤は、抗原非特異的に強
力な抗体産生抑制、あるいは遅延型過敏反応抑制効果を
示すため、種々のアレルギー疾患、自己免疫疾患、ある
いは臓器移植時の拒絶反応等の抑制剤として用いること
ができる。
二つのタイプのヘルパーT細胞（Th1とTh2）のバランス
によって制御されていると考えられるようになってきた
が、本発明ポリペプチドはいずれの免疫応答に対しても
抑制作用を示すことから、前述ＴＣＲα定常領域ポリペ
プチド同様に非常にユニークであり、多くの免疫疾患治
療に有効である可能性を示している。従って、本発明ポ
リペプチドを含有する免疫抑制剤は、抗原非特異的に強
力な抗体産生抑制、あるいは遅延型過敏反応抑制効果を
示すため、種々のアレルギー疾患、自己免疫疾患、ある
いは臓器移植時の拒絶反応等の抑制剤として用いること
ができる。
【００３７】本発明の免疫抑制剤は、治療上有効量の本
発明のポリペプチドとともに、有用で好適な希釈剤、防
腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または
担体を含有してもよい。ここで「治療上有効量」という
用語は、指定の条件および投与法に対して治療効果を提
供する量を示す。このような製剤は、液体であるか、あ
るいは凍結乾燥またはさもなくば乾燥された剤形であっ
て、種々のpH、およびイオン強度から成る緩衝剤（例え
ばトリス- 塩酸、酢酸塩、燐酸塩）より選択した希釈
剤、表面に吸着しないようにするためのアルブミンまた
はゼラチンのような添加剤、界面活性剤（例えばTween
20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩）、可溶化剤
（例えばグリセロール、ポリエチレングリコール）、酸
化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリ
ウム）、防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコ
ール、パラベン）、賦形剤または等張化剤（例えばラク
トース、マンニトール）を配合した製剤が含まれる。ま
た、ポリペプチドに対するポリエチレングリコールのよ
うな重合体との共有結合、金属イオンとの錯体化、ある
いはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのよ
うな重合化合物の粒状製剤中またはその表面上への、あ
るいはリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層
または多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロプラ
スト中への当該物質の取り込みを包含する。このような
組成物は、本発明ポリペプチドの物理的状態、溶解性、
安定性、in vivo 放出速度、in vivo クリアランスに影
響を及ぼすと思われるので、組成の選択は、本発明ポリ
ペプチドの有する物理的および化学的特性による。本発
明の免疫抑制剤の別の剤形としては、粒状形態、保護被
膜で被覆された形態、プロテアーゼ阻害剤または吸収促
進剤を配合した形態などが挙げられる。本発明の免疫抑
制剤は、非経口、経肺、経鼻、および経口を含めた種々
の投与経路で投与されうる。
発明のポリペプチドとともに、有用で好適な希釈剤、防
腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または
担体を含有してもよい。ここで「治療上有効量」という
用語は、指定の条件および投与法に対して治療効果を提
供する量を示す。このような製剤は、液体であるか、あ
るいは凍結乾燥またはさもなくば乾燥された剤形であっ
て、種々のpH、およびイオン強度から成る緩衝剤（例え
ばトリス- 塩酸、酢酸塩、燐酸塩）より選択した希釈
剤、表面に吸着しないようにするためのアルブミンまた
はゼラチンのような添加剤、界面活性剤（例えばTween
20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩）、可溶化剤
（例えばグリセロール、ポリエチレングリコール）、酸
化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリ
ウム）、防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコ
ール、パラベン）、賦形剤または等張化剤（例えばラク
トース、マンニトール）を配合した製剤が含まれる。ま
た、ポリペプチドに対するポリエチレングリコールのよ
うな重合体との共有結合、金属イオンとの錯体化、ある
いはポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのよ
うな重合化合物の粒状製剤中またはその表面上への、あ
るいはリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層
または多層小胞、赤血球ゴースト、またはスフェロプラ
スト中への当該物質の取り込みを包含する。このような
組成物は、本発明ポリペプチドの物理的状態、溶解性、
安定性、in vivo 放出速度、in vivo クリアランスに影
響を及ぼすと思われるので、組成の選択は、本発明ポリ
ペプチドの有する物理的および化学的特性による。本発
明の免疫抑制剤の別の剤形としては、粒状形態、保護被
膜で被覆された形態、プロテアーゼ阻害剤または吸収促
進剤を配合した形態などが挙げられる。本発明の免疫抑
制剤は、非経口、経肺、経鼻、および経口を含めた種々
の投与経路で投与されうる。
【００３８】本発明のポリペプチドを含有する免疫抑制
剤は、活性成分として通常１μｇ／ｋｇ体重〜２ｍｇ／
ｋｇ体重を、病状、性別及び投与経路等に応じて、一日
１乃至数回程度投与することができる。本発明を以下の
実施例によりさらに具体的に説明する。これらの実施例
は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するも
のではない。
剤は、活性成分として通常１μｇ／ｋｇ体重〜２ｍｇ／
ｋｇ体重を、病状、性別及び投与経路等に応じて、一日
１乃至数回程度投与することができる。本発明を以下の
実施例によりさらに具体的に説明する。これらの実施例
は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するも
のではない。
【００３９】
【実施例】〔実施例１〕マウスTCRβ-Cβ2の発現系の構
築 ピジョンチトクロームＣ特異的でH-2E拘束性をもつTCR
α及びβ鎖を発現するマウスヘルパーＴ細胞ハイブリド
ーマ株、２Ｂ４細胞が樹立されている（サメルソン（ S
amelson ）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 80: 69
72-6976, 1983）。この細胞のTCRβ cDNAの取得につい
てもすでに報告されている（チエン(Chien)ら、Nature,
309: 322-326, 1984）。マウス由来 TCRβのCβ2のDNA
フラグメントを取得するために、マウスTCRβ Cβ2の
細胞膜外領域をコードする塩基配列（配列番号６の１〜
４３８）を含みそれぞれ５’末端用に Bam HI 部位を含
有し、３’末端用に停止コドンと Xba I部位を含有する
ＤＮＡフラグメントを、２つのプライマーを使用するＰ
ＣＲにより増幅した。これらのプライマーの配列は以下
の通りである。
築 ピジョンチトクロームＣ特異的でH-2E拘束性をもつTCR
α及びβ鎖を発現するマウスヘルパーＴ細胞ハイブリド
ーマ株、２Ｂ４細胞が樹立されている（サメルソン（ S
amelson ）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 80: 69
72-6976, 1983）。この細胞のTCRβ cDNAの取得につい
てもすでに報告されている（チエン(Chien)ら、Nature,
309: 322-326, 1984）。マウス由来 TCRβのCβ2のDNA
フラグメントを取得するために、マウスTCRβ Cβ2の
細胞膜外領域をコードする塩基配列（配列番号６の１〜
４３８）を含みそれぞれ５’末端用に Bam HI 部位を含
有し、３’末端用に停止コドンと Xba I部位を含有する
ＤＮＡフラグメントを、２つのプライマーを使用するＰ
ＣＲにより増幅した。これらのプライマーの配列は以下
の通りである。
【００４０】 ５’−GACGGATCCGAGGATCTGAGAAATGTGACT−３’（配列番
号８） ５’−TCCTCTAGATTACTACTCATAGAGGATGGT−３’（配列番
号９） 増幅した DNAフラグメントはアガロースゲル電気泳動に
より回収し、発現プラスミド pCF1 ベクター(J. Immuno
logical Methods 186: 27-36, 1995) 内にその特有の B
am HI 及び Xba I部位においてクローン化し、この新規
プラスミドを pCF1-TCRβ-Cβ2と命名した（図１）。な
お、pCF1ベクターは、trp プロモーター及び trpターミ
ネーターを保持し、プロモーターとターミネーターの間
にラットカルモジュリンとそれに続いてトロンビン認識
（切断）部位、Bam HI, Xba I, Not I制限酵素部位に所
望の蛋白の遺伝子を挿入すると融合蛋白を発現できるよ
うになっている。pCF1-TCRβ-Cβ2でコンピテントDH5
大腸菌細胞（ATCC No. 53868）を形質転換し、そのDNA
配列を確認した。さらに、コンピテント W3110大腸菌細
胞（ATCC No. 27325）を形質転換した。
号８） ５’−TCCTCTAGATTACTACTCATAGAGGATGGT−３’（配列番
号９） 増幅した DNAフラグメントはアガロースゲル電気泳動に
より回収し、発現プラスミド pCF1 ベクター(J. Immuno
logical Methods 186: 27-36, 1995) 内にその特有の B
am HI 及び Xba I部位においてクローン化し、この新規
プラスミドを pCF1-TCRβ-Cβ2と命名した（図１）。な
お、pCF1ベクターは、trp プロモーター及び trpターミ
ネーターを保持し、プロモーターとターミネーターの間
にラットカルモジュリンとそれに続いてトロンビン認識
（切断）部位、Bam HI, Xba I, Not I制限酵素部位に所
望の蛋白の遺伝子を挿入すると融合蛋白を発現できるよ
うになっている。pCF1-TCRβ-Cβ2でコンピテントDH5
大腸菌細胞（ATCC No. 53868）を形質転換し、そのDNA
配列を確認した。さらに、コンピテント W3110大腸菌細
胞（ATCC No. 27325）を形質転換した。
【００４１】〔実施例２〕 TCRβ-Cβ2産生大腸菌の培
養 実施例１に示したプラスミドを保持する W3110大腸菌
を、100 μg/mlのアンピシリンを含有する 50 mlのルリ
ア培地で一晩培養した。該接種源培養液を 0.8 %グルコ
ース、0.4 % カザミノ酸、100 μg/mlのアンピシリンか
らなる１ＬのＭ９培地に他の菌が入らないように移し、
３時間３７℃で培養した。この最初の培養の終盤に最終
濃度 20 mMになるようにインドールアクリル酸を添加
し、該培養液をさらに５時間３７℃で培養した。この発
現系において、カルモジュリンTCRβ-Cβ2の融合蛋白質
が可溶性で発現され、それらは全蛋白質の約 10 % であ
った。
養 実施例１に示したプラスミドを保持する W3110大腸菌
を、100 μg/mlのアンピシリンを含有する 50 mlのルリ
ア培地で一晩培養した。該接種源培養液を 0.8 %グルコ
ース、0.4 % カザミノ酸、100 μg/mlのアンピシリンか
らなる１ＬのＭ９培地に他の菌が入らないように移し、
３時間３７℃で培養した。この最初の培養の終盤に最終
濃度 20 mMになるようにインドールアクリル酸を添加
し、該培養液をさらに５時間３７℃で培養した。この発
現系において、カルモジュリンTCRβ-Cβ2の融合蛋白質
が可溶性で発現され、それらは全蛋白質の約 10 % であ
った。
【００４２】〔実施例３〕大腸菌組換え TCRβ-Cβ2の
精製 １．実施例２で培養したそれぞれの細胞約０.５g を、
実施例２と同様に菌体を破砕し、それぞれの上清を回収
した。この融合タンパク質の発現量は、１Ｌ当たり約５
mgであった。さらに、８０℃で１０分間熱処理を行っ
た後、１５０００×g 、１５分間遠心し、上清を回収し
た。 ２．該上清画分を１００倍量の２ mM グルタチオン（還
元型）及び０.２ mM グルタチオン（酸化型）を含有す
る５０ mM トリス HCl緩衝液（pH8.0）で、４℃で一晩
透析した。このサンプル溶液を適当な混合液に添加し
て、該混合液中の最終濃度が２.５ mM CaCl2 となるよ
うにした。
精製 １．実施例２で培養したそれぞれの細胞約０.５g を、
実施例２と同様に菌体を破砕し、それぞれの上清を回収
した。この融合タンパク質の発現量は、１Ｌ当たり約５
mgであった。さらに、８０℃で１０分間熱処理を行っ
た後、１５０００×g 、１５分間遠心し、上清を回収し
た。 ２．該上清画分を１００倍量の２ mM グルタチオン（還
元型）及び０.２ mM グルタチオン（酸化型）を含有す
る５０ mM トリス HCl緩衝液（pH8.0）で、４℃で一晩
透析した。このサンプル溶液を適当な混合液に添加し
て、該混合液中の最終濃度が２.５ mM CaCl2 となるよ
うにした。
【００４３】３．該混合液を 50 mMトリスHCl 緩衝液
（pH8.0）、2.5 mM CaCl2で平衡化したフェニルセファ
ロース６サブカラム（ファルマシア、３×６cm）に４℃
でかけ、0.5 ml/分の流速で流した。同じ緩衝液でカラ
ムを洗浄した後、カルモジュリン-TCRβ-Cβ2融合タン
パク質を５０ mM トリス HCl緩衝液（pH8.0）と５ mM E
DTA（pH8.0）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、カ
ルモジュリン-TCRβ-Cβ2融合タンパク質の発現を確認
した。 ４．該溶出画分を YM10 限外濾過膜にて１０倍濃縮し、
50 mM トリスHCl 緩衝液（pH8.0）で平衡化した DEAE
トヨパールカラム（TOSHO、２×１０ｃｍ）にかけ、０
から０.５ Mの NaCl の濃度勾配を用いて、カルモジュ
リン−TCRβ-Cβ2融合タンパク質を溶出させた。その結
果、カルモジュリン−TCRβ-Cβ2融合タンパク質は、約
３００ mM NaCl濃度で溶出された。
（pH8.0）、2.5 mM CaCl2で平衡化したフェニルセファ
ロース６サブカラム（ファルマシア、３×６cm）に４℃
でかけ、0.5 ml/分の流速で流した。同じ緩衝液でカラ
ムを洗浄した後、カルモジュリン-TCRβ-Cβ2融合タン
パク質を５０ mM トリス HCl緩衝液（pH8.0）と５ mM E
DTA（pH8.0）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、カ
ルモジュリン-TCRβ-Cβ2融合タンパク質の発現を確認
した。 ４．該溶出画分を YM10 限外濾過膜にて１０倍濃縮し、
50 mM トリスHCl 緩衝液（pH8.0）で平衡化した DEAE
トヨパールカラム（TOSHO、２×１０ｃｍ）にかけ、０
から０.５ Mの NaCl の濃度勾配を用いて、カルモジュ
リン−TCRβ-Cβ2融合タンパク質を溶出させた。その結
果、カルモジュリン−TCRβ-Cβ2融合タンパク質は、約
３００ mM NaCl濃度で溶出された。
【００４４】５．該溶出画分を１００倍量の５０ mM ト
リス HCl緩衝液（pH8.0）で、４℃で一晩透析した。50
mL の透析した画分にグリセロールを最終１０％濃度
に、ジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと示す）を最終
２ｍＭ、NaClを１００ｍＭ濃度になるまで添加し、１％
のトロンビン（シグマ）を加えて、２５℃で６時間イン
キュベートして該融合タンパク質を消化した。
リス HCl緩衝液（pH8.0）で、４℃で一晩透析した。50
mL の透析した画分にグリセロールを最終１０％濃度
に、ジチオスレイトール（以下、ＤＴＴと示す）を最終
２ｍＭ、NaClを１００ｍＭ濃度になるまで添加し、１％
のトロンビン（シグマ）を加えて、２５℃で６時間イン
キュベートして該融合タンパク質を消化した。
【００４５】６．該混合液を MACROSEP ３Ｋ（FILTRON
）にて遠心濃縮し、TCRβ-Cβ2は、NAP（ファルマシ
ア）カラムにて１０％グリセロール及び２mMＤＴＴを含
有する５０ mM トリス HCl緩衝液（pH8.0）に交換し
た。１０％グリセロール及び２mMＤＴＴを含有する５０
mM トリス HCl緩衝液（pH8.0）で平衡化したDEAE-5PW
カラム（TOSOH、0.75×7.5 cm）に室温でかけた。この
カラムを１．０ｍｌ／分の流速で、１０％グリセロール
及び２ｍＭＤＴＴを含有する５０ mM トリス HCl緩衝液
（pH8.0）で洗浄後、０から０.５ Mの NaCl の濃度勾配
を用いて、TCRβ-Cβ２タンパク質を溶出させた。その
結果、ＴＣＲβ-Cβは約４００ mM NaCl濃度で溶出され
た。精製された TCRβ-Cβ2のタンパク質量は１Ｌ当た
り約２ mg であった。TCRβ-Cβ2タンパク質は、安定化
させるため１０％グリセロールを含有する PBSにて−８
０℃で保存した。この大腸菌内での組換えTCRβ-Cβ2タ
ンパク質を組換えTCRβ-Cβ（或いはrecCβと略す）と
命名した。
）にて遠心濃縮し、TCRβ-Cβ2は、NAP（ファルマシ
ア）カラムにて１０％グリセロール及び２mMＤＴＴを含
有する５０ mM トリス HCl緩衝液（pH8.0）に交換し
た。１０％グリセロール及び２mMＤＴＴを含有する５０
mM トリス HCl緩衝液（pH8.0）で平衡化したDEAE-5PW
カラム（TOSOH、0.75×7.5 cm）に室温でかけた。この
カラムを１．０ｍｌ／分の流速で、１０％グリセロール
及び２ｍＭＤＴＴを含有する５０ mM トリス HCl緩衝液
（pH8.0）で洗浄後、０から０.５ Mの NaCl の濃度勾配
を用いて、TCRβ-Cβ２タンパク質を溶出させた。その
結果、ＴＣＲβ-Cβは約４００ mM NaCl濃度で溶出され
た。精製された TCRβ-Cβ2のタンパク質量は１Ｌ当た
り約２ mg であった。TCRβ-Cβ2タンパク質は、安定化
させるため１０％グリセロールを含有する PBSにて−８
０℃で保存した。この大腸菌内での組換えTCRβ-Cβ2タ
ンパク質を組換えTCRβ-Cβ（或いはrecCβと略す）と
命名した。
【００４６】７．必要に応じてエンドトキシンを除去す
るため、精製サンプルに１０分の１量のPyoSep C（ダイ
セル化学社製）を添加し、必要に応じて１〜１２時間撹
拌後、上清を回収した。エンドトキシン量はリムラスES
-IIシングルテスト（和光純薬社製）またはエンドスペ
シーES6（生化学工業社製）で測定した。
るため、精製サンプルに１０分の１量のPyoSep C（ダイ
セル化学社製）を添加し、必要に応じて１〜１２時間撹
拌後、上清を回収した。エンドトキシン量はリムラスES
-IIシングルテスト（和光純薬社製）またはエンドスペ
シーES6（生化学工業社製）で測定した。
【００４７】〔実施例４〕組換え TCRβ-Cβの生物活性 A.組換え TCRβ-Cβの in vivo免疫抑制活性 １．recCβが in vivoで免疫応答を抑制するか否かを評
価するために、recCβタンパク質を、ハチ毒 PLA2 で免
疫感作したマウスに投与した。抗原としてハチ毒PLA2
のジニトロフェニル（以下、「DNP」と示す）誘導体を
標準操作により調製し、Balb/cマウスを、１ｍｇの水酸
化アルミニウム（以下、「Alum」という）に吸着させた
DNP-PLA2１μg の腹腔内注射により免疫感作した。recC
βを、-１、０、１に１回あたり５μg の投与量で腹腔
内注射し、コントロールマウスには１０％グリセロール
を含有した PBSだけを投与した。免疫後２週間目に各マ
ウスから血清を採取し、抗 DNP-IgG1 をELISA （イワタ
ら, J. Immunol., 141: 3270-3277, 1988）により測定
した。下に示したように、recCβタンパク質は、顕著に
抗 DNP-IgG1 産生を抑制した。
価するために、recCβタンパク質を、ハチ毒 PLA2 で免
疫感作したマウスに投与した。抗原としてハチ毒PLA2
のジニトロフェニル（以下、「DNP」と示す）誘導体を
標準操作により調製し、Balb/cマウスを、１ｍｇの水酸
化アルミニウム（以下、「Alum」という）に吸着させた
DNP-PLA2１μg の腹腔内注射により免疫感作した。recC
βを、-１、０、１に１回あたり５μg の投与量で腹腔
内注射し、コントロールマウスには１０％グリセロール
を含有した PBSだけを投与した。免疫後２週間目に各マ
ウスから血清を採取し、抗 DNP-IgG1 をELISA （イワタ
ら, J. Immunol., 141: 3270-3277, 1988）により測定
した。下に示したように、recCβタンパク質は、顕著に
抗 DNP-IgG1 産生を抑制した。
【００４８】 recCβによる Balb/c マウスの抗ハプテン抗体応答の抑制 試料 Ｎ 抗 DNP-IgG1 (μg/ml) PBS+10% glycerol ８ 11.10±3.359 recCβ ８ 0.100±０．０７１
【００４９】Ｂ．組換え TCRβ-Cβの on-going 抗体産
生におけるin vivo 抑制活性 recCβが、on-going抗体産生も抑制するか否かを評価し
た。 Balb/c マウスを、1 mgの Alum に吸着させた DNP
-PLA2 １μg の腹腔内注射により免疫感作した。免疫
後、１４日目に DNP抗原に特異的な IgG１を ELISA（イ
ワタら, J. Immunol., 141: 3270-3277, 1988）により
測定し、抗体価の上昇を確認後、recCβを１６、１７、
１８日目に１回あたり５μg の投与量で腹腔内注射し、
コントロールマウスには１０％グリセロールを含有した
PBSだけを投与した。２８日目に各マウスから血清を採
取し、抗 DNP-IgG1 をELISA （イワタら, J. Immunol.,
141: 3270-3277, 1988）により測定した。下に示した
ように OVA特異的 IgG産生は抑制されており、recCβは
on-going 抗体産生も抑制することを示した。
生におけるin vivo 抑制活性 recCβが、on-going抗体産生も抑制するか否かを評価し
た。 Balb/c マウスを、1 mgの Alum に吸着させた DNP
-PLA2 １μg の腹腔内注射により免疫感作した。免疫
後、１４日目に DNP抗原に特異的な IgG１を ELISA（イ
ワタら, J. Immunol., 141: 3270-3277, 1988）により
測定し、抗体価の上昇を確認後、recCβを１６、１７、
１８日目に１回あたり５μg の投与量で腹腔内注射し、
コントロールマウスには１０％グリセロールを含有した
PBSだけを投与した。２８日目に各マウスから血清を採
取し、抗 DNP-IgG1 をELISA （イワタら, J. Immunol.,
141: 3270-3277, 1988）により測定した。下に示した
ように OVA特異的 IgG産生は抑制されており、recCβは
on-going 抗体産生も抑制することを示した。
【００５０】 recCβによる on-going 抗体産生の抑制 試料 Ｎ 抗 DNP-IgG1 (μg/ml) PBS+10% glycerol ８ 121.3±46.28 recCβ ８ 69.50±15.91
【００５１】C. 組換え TCRβ-Cβの自然発症型糖尿病
モデルマウスにおける抑制活性 本実施例は、recCβが自然発症型糖尿病反応を抑制する
ことを示すものである。日本クレア（株）より購入し
た、各群１０匹の雌性 NOD/ShiJic マウスを使用した。
７週例より３５週例までの間、recCβを5 mgの投与量で
週２回腹腔内注射し、コントロールマウスには１０％グ
リセロールを含有した PBSだけを投与した。実験期間
中、Glucometer（マイルス三共）を用い週１回尾静脈か
ら得た血液の血糖値の測定を行った。２回連続して 200
mg/dl以上の血糖値を示した個体を糖尿病と判定した。
モデルマウスにおける抑制活性 本実施例は、recCβが自然発症型糖尿病反応を抑制する
ことを示すものである。日本クレア（株）より購入し
た、各群１０匹の雌性 NOD/ShiJic マウスを使用した。
７週例より３５週例までの間、recCβを5 mgの投与量で
週２回腹腔内注射し、コントロールマウスには１０％グ
リセロールを含有した PBSだけを投与した。実験期間
中、Glucometer（マイルス三共）を用い週１回尾静脈か
ら得た血液の血糖値の測定を行った。２回連続して 200
mg/dl以上の血糖値を示した個体を糖尿病と判定した。
【００５２】その結果、コントロールと比べて、糖尿病
発症率の抑制がみられた（図２）。前述recCβはTCRβ
由来であるが、TCRαの定常領域の組換えポリペプチド
recCα（前出の国際公開 WO97-43411号）についても同
様の試験を行ったところ、やはり投与した該組換えポリ
ペプチドは、抑制を示した。
発症率の抑制がみられた（図２）。前述recCβはTCRβ
由来であるが、TCRαの定常領域の組換えポリペプチド
recCα（前出の国際公開 WO97-43411号）についても同
様の試験を行ったところ、やはり投与した該組換えポリ
ペプチドは、抑制を示した。
【００５３】〔実施例５〕大腸菌組換えヒトTCRβ-Cβ2
蛋白質（大腸菌組換えTCRβ-humanCβ）の発現系の構
築 スネイダー（Schneider）らによってヒトT cell lineで
あるJurkatが樹立されている（Schneider et., al., In
ternational Journal of Cancer,19: 621-626,1977)。
この細胞のTCRβ cDNAの取得についてもすでに報告され
ている（ヤナギ（Yanagi）ら、Proc. Nalt. Acad. Sci.
U.S.A.82: 3430-3434, 1985）。ヒト由来 TCRβの Cβ
2のＤＮＡフラグメントを取得するために、ヒトTCRβの
Cβ2の細胞膜外領域をコードする塩基配列（配列番号
７）を含みそれぞれ５’末端用に Bam HI 部位を含有
し、３’末端用に停止コドンと Xba I部位を含有するＤ
ＮＡフラグメントを、２つのプライマーを使用するＰＣ
Ｒにより増幅する。これらのプライマーの配列は以下の
通りである。
蛋白質（大腸菌組換えTCRβ-humanCβ）の発現系の構
築 スネイダー（Schneider）らによってヒトT cell lineで
あるJurkatが樹立されている（Schneider et., al., In
ternational Journal of Cancer,19: 621-626,1977)。
この細胞のTCRβ cDNAの取得についてもすでに報告され
ている（ヤナギ（Yanagi）ら、Proc. Nalt. Acad. Sci.
U.S.A.82: 3430-3434, 1985）。ヒト由来 TCRβの Cβ
2のＤＮＡフラグメントを取得するために、ヒトTCRβの
Cβ2の細胞膜外領域をコードする塩基配列（配列番号
７）を含みそれぞれ５’末端用に Bam HI 部位を含有
し、３’末端用に停止コドンと Xba I部位を含有するＤ
ＮＡフラグメントを、２つのプライマーを使用するＰＣ
Ｒにより増幅する。これらのプライマーの配列は以下の
通りである。
【００５４】 ５’−GACGGATCCGAGGACCTGAA−３’（配列番号１０） ５’−TCCTCTAGATTACTACTCATAGAGGATGGT−３’（配列番
号９） 増幅した DNAフラグメントはアガロースゲル電気泳動に
より回収し、発現プラスミド pCF1 ベクター(J. Immuno
logical Methods 186: 27-36, 1995) 内にその特有の B
am HI 及び Xba I部位においてクローン化し、この新規
プラスミドを pCF1-TCRβ-humanCβ2と命名する（図
３）。なお、pCF1ベクターは、trp プロモーター及び t
rpターミネーターを保持し、プロモーターとターミネー
ターの間にラットカルモジュリンとそれに続いてトロン
ビン認識（切断）部位、Bam HI, Xba I, Not I制限酵素
部位に所望の蛋白の遺伝子を挿入すると融合蛋白を発現
できるようになっている。pCF1-TCRβ-humanCβ2でコン
ピテントDH5 大腸菌細胞（ATCC No. 53868）を形質転換
し、そのDNA 配列を確認できる。さらに、コンピテント
W3110大腸菌細胞（ATCC No. 27325）を形質転換でき
る。
号９） 増幅した DNAフラグメントはアガロースゲル電気泳動に
より回収し、発現プラスミド pCF1 ベクター(J. Immuno
logical Methods 186: 27-36, 1995) 内にその特有の B
am HI 及び Xba I部位においてクローン化し、この新規
プラスミドを pCF1-TCRβ-humanCβ2と命名する（図
３）。なお、pCF1ベクターは、trp プロモーター及び t
rpターミネーターを保持し、プロモーターとターミネー
ターの間にラットカルモジュリンとそれに続いてトロン
ビン認識（切断）部位、Bam HI, Xba I, Not I制限酵素
部位に所望の蛋白の遺伝子を挿入すると融合蛋白を発現
できるようになっている。pCF1-TCRβ-humanCβ2でコン
ピテントDH5 大腸菌細胞（ATCC No. 53868）を形質転換
し、そのDNA 配列を確認できる。さらに、コンピテント
W3110大腸菌細胞（ATCC No. 27325）を形質転換でき
る。
【００５５】〔実施例６〕 大腸菌組換えTCRβ-humanC
βの発現 実施例５に示したプラスミドを保持する W3110大腸菌
を、100 μg/mlのアンピシリンを含有する 50 mlのルリ
ア培地で一晩培養する。該接種源培養液を 0.8 %グルコ
ース、0.4 % カザミノ酸、100 μg/mlのアンピシリンか
らなる１ＬのＭ９培地に他の菌が入らないように移し、
３時間３７℃で培養する。この最初の培養の終盤に最終
濃度 20 mMになるようにインドールアクリル酸を添加
し、該培養液をさらに５時間３７℃で培養する。この発
現系において、カルモジュリンとTCRβ-humanCβの融合
蛋白質が可溶性で発現される。実施例３に準じて、 TCR
β-humanCβタンパク質を精製することができる。
βの発現 実施例５に示したプラスミドを保持する W3110大腸菌
を、100 μg/mlのアンピシリンを含有する 50 mlのルリ
ア培地で一晩培養する。該接種源培養液を 0.8 %グルコ
ース、0.4 % カザミノ酸、100 μg/mlのアンピシリンか
らなる１ＬのＭ９培地に他の菌が入らないように移し、
３時間３７℃で培養する。この最初の培養の終盤に最終
濃度 20 mMになるようにインドールアクリル酸を添加
し、該培養液をさらに５時間３７℃で培養する。この発
現系において、カルモジュリンとTCRβ-humanCβの融合
蛋白質が可溶性で発現される。実施例３に準じて、 TCR
β-humanCβタンパク質を精製することができる。
【００５６】
【発明の効果】本発明により、投与すべき患者の組織適
合性抗原を考慮することなく、抗原特異性も考慮する必
要のない、免疫抑制作用を持ったＴＣＲβが提供され
た。
合性抗原を考慮することなく、抗原特異性も考慮する必
要のない、免疫抑制作用を持ったＴＣＲβが提供され
た。
【００５７】
配列番号：１ 配列の長さ：１７３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ハツカネズミ（Ｍｕｓ） 配列： Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro 1 5 10 15 Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys 50 55 60 Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala 65 70 75 80 Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe 85 90 95 His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro 100 105 110 Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly 115 120 125 Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu 130 135 140 Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser 145 150 155 160 Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser 165 170
【００５８】配列番号：２ 配列の長さ：１７３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ハツカネズミ（Ｍｕｓ） 配列： Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro 1 5 10 15 Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys 50 55 60 Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala 65 70 75 80 Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe 85 90 95 His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro 100 105 110 Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly 115 120 125 Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu 130 135 140 Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser 145 150 155 160 Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Lys Lys Asn Ser 165 170
【００５９】配列番号：３ 配列の長さ：１７７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ） 配列： Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 1 5 10 15 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 50 55 60 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu 65 70 75 80 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 85 90 95 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 100 105 110 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 115 120 125 Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser 130 135 140 Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala 145 150 155 160 Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp 165 170 175 Phe
【００６０】配列番号：４ 配列の長さ：１７９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ） 配列： Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 1 5 10 15 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 50 55 60 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu 65 70 75 80 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 85 90 95 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 100 105 110 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 115 120 125 Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser 130 135 140 Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala 145 150 155 160 Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp 165 170 175 Ser Arg Gly
【００６１】配列番号：５ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００６２】配列番号：６ 配列の長さ：４３８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ハツカネズミ（Ｍｕｓ） 配列： GAG GAT CTG AGA AAT GTG ACT CCA CCC AAG GTC TCC TTG TTT GAG CCA 48 Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro 1 5 10 15 TCA AAA GCA GAG ATT GCA AAC AAA CAA AAG GCT ACC CTC GTG TGC TTG 96 Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 GCC AGG GGC TTC TTC CCT GAC CAC GTG GAG CTG AGC TGG TGG GTG AAT 144 Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 GGC AAG GAG GTC CAC AGT GGG GTC AGC ACG GAC CCT CAG GCC TAC AAG 192 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys 50 55 60 GAG AGC AAT TAT AGC TAC TGC CTG AGC AGC CGC CTG AGG GTC TCT GCT 240 Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala 65 70 75 80 ACC TTC TGG CAC AAT CCT CGA AAC CAC TTC CGC TGC CAA GTG CAG TTC 288 Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe 85 90 95 CAT GGG CTT TCA GAG GAG GAC AAG TGG CCA GAG GGC TCA CCC AAA CCT 336 His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro 100 105 110 GTC ACA CAG AAC ATC AGT GCA GAG GCC TGG GGC CGA GCA GAC TGT GGA 384 Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly 115 120 125 ATC ACT TCA GCA TCC TAT CAT CAG GGG GTT CTG TCT GCA ACC ATC CTC 432 Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu 130 135 140 TAT GAG 438 Tyr Glu 145
【００６３】配列番号：７ 配列の長さ：４５０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ） 配列： GAG GAC CTG AAA AAC GTG TTC CCA CCC GAG GTC GCT GTG TTT GAG CCA 48 Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 1 5 10 15 TCA GAA GCA GAG ATC TCC CAC ACC CAA AAG GCC ACA CTG GTG TGC CTG 96 Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 GCC ACA GGC TTC TAC CCC GAC CAC GTG GAG CTG AGC TGG TGG GTG AAT 144 Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 GGG AAG GAG GTG CAC AGT GGG GTC AGC ACA GAC CCG CAG CCC CTC AAG 192 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 50 55 60 GAG CAG CCC GCC CTC AAT GAC TCC AGA TAC TGC CTG AGC AGC CGC CTG 240 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu 65 70 75 80 AGG GTC TCG GCC ACC TTC TGG CAG AAC CCC CGC AAC CAC TTC CGC TGT 288 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 85 90 95 CAA GTC CAG TTC TAC GGG CTC TCG GAG AAT GAC GAG TGG ACC CAG GAT 336 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 100 105 110 AGG GCC AAA CCT GTC ACC CAG ATC GTC AGC GCC GAG GCC TGG GGT AGA 384 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 115 120 125 GCA GAC TGT GGC TTC ACC TCC GAG TCT TAC CAG CAA GGG GTG CTG TCT 432 Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser 130 135 140 GCC ACC ATC CTC TAT GAG 450 Ala Thr Ile Leu Tyr Glu 145 150
【００６４】配列番号：８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GACGGATCCG AGGATCTGAG AAATGTGACT 30
【００６５】配列番号：９ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TCCTCTAGAT TACTACTCAT AGAGGATGGT 30
【００６６】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GACGGATCCG AGGACCTGAA 20
【図１】図１は、プラスミド pCF1-TCRβ-Cβ2の制限酵
素地図を示す。
素地図を示す。
【図２】図２は、ＮＯＤマウスの糖尿病自然発症に対す
るＣα及びＣβの作用を示す。
るＣα及びＣβの作用を示す。
【図３】図３は、プラスミド pCF1-TCRβ-humanCβ2の
制限酵素地図を示す。
制限酵素地図を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＣ 15/09 ＺＮＡ ＡＢＦ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (28)
- 【請求項１】 Ｔ細胞リセプターβ鎖の定常領域の一部
または全部を実質的に含み、且つＴ細胞リセプターβ鎖
の他の領域を実質的に含有しない、免疫抑制作用を有す
るポリペプチド。 - 【請求項２】 配列番号２のアミノ酸配列の一部若しく
は全部の配列、または該アミノ酸配列の一部若しくは全
部の配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、挿入及
び／又は置換されたアミノ酸配列を有し、且つ、免疫抑
制作用を有するポリペプチド。 - 【請求項３】 配列番号２のアミノ酸配列の１〜１４６
位のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１以
上のアミノ酸残基が欠失、挿入及び／又は置換されたア
ミノ酸配列を有する請求項２記載のポリペプチド。 - 【請求項４】 配列番号４のアミノ酸配列の一部若しく
は全部の配列、または該アミノ酸配列の一部若しくは全
部の配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、挿入及
び／又は置換されたアミノ酸配列を有し、且つ、免疫抑
制作用を有するポリペプチド。 - 【請求項５】 配列番号４のアミノ酸配列の１〜１５０
位のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１以
上のアミノ酸残基が欠失、挿入及び／又は置換されたア
ミノ酸配列を有する請求項４記載のポリペプチド。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載のポリペ
プチドをコ−ドするＤＮＡ。 - 【請求項７】 以下の式： Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （式中、Ｒ１は担体ポリペプチド、Ｘは蛋白質分解酵素
認識部位、そしてＲ２は請求項１〜５のいずれかに記載
のポリペプチドである）で示される融合ポリペプチドを
コ−ドする塩基配列を有するＤＮＡ。 - 【請求項８】 Ｒ１がカルモジュリンである請求項７記
載のＤＮＡ。 - 【請求項９】 Ｘがトロンビンによって認識される部位
である請求項７記載のＤＮＡ。 - 【請求項１０】 トロンビンによって認識される部位が
下記の配列番号５のアミノ酸配列で示される請求項９記
載のＤＮＡ。 Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号
５） - 【請求項１１】 請求項６〜１０のいずれかに記載のＤ
ＮＡを担持した発現ベクタ−。 - 【請求項１２】 請求項１１記載の発現ベクタ−で形質
転換された宿主細胞。 - 【請求項１３】 宿主細胞が原核細胞である請求項１２
記載の宿主細胞。 - 【請求項１４】 原核細胞が大腸菌である請求項１３記
載の宿主細胞。 - 【請求項１５】 請求項１〜５のいずれかに記載のポリ
ペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドをコ−ド
する塩基配列を有するＤＮＡを担持した発現ベクタ−で
形質転換された宿主細胞を培養し、該ポリペプチドを単
離することを特徴とする、前記の製造方法。 - 【請求項１６】 宿主細胞が原核細胞である請求項１５
記載の製造方法。 - 【請求項１７】 原核細胞が大腸菌である請求項１６記
載の製造方法。 - 【請求項１８】 請求項１〜５のいずれかに記載のポリ
ペプチドの製造方法であって、以下の式： Ｒ１−Ｘ−Ｒ２ （式中、Ｒ１は担体ポリペプチド、Ｘは蛋白質分解酵素
認識部位、そしてＲ２は請求項１〜５のいずれかに記載
のポリペプチドである）で示される融合ポリペプチドを
コ−ドする塩基配列を有するＤＮＡを担持した発現ベク
ターで形質転換された宿主細胞を培養し、該融合ポリペ
プチドを発現させ、該融合ポリペプチドを蛋白質分解酵
素で開裂処理し、Ｒ２で示されるポリペプチドを単離す
ることを特徴とする、前記の製造方法。 - 【請求項１９】 Ｒ１がカルモジュリンである請求項１
８記載の製造方法。 - 【請求項２０】 Ｘがトロンビンによって認識される部
位であり、且つ蛋白質分解酵素としてトロンビンが用い
られる請求項１８記載の製造方法。 - 【請求項２１】 トロンビンによって認識される部位が
下記の配列番号５のアミノ酸配列で示される請求項２０
記載の製造方法。 Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ （配列番号
５） - 【請求項２２】 請求項１〜５のいずれかに記載のポリ
ペプチドを有効成分として含む医薬組成物。 - 【請求項２３】 免疫抑制剤である請求項２２記載の医
薬組成物。 - 【請求項２４】 遅延型過敏反応抑制剤である請求項２
３記載の医薬組成物。 - 【請求項２５】 抗体産生抑制剤である請求項２３記載
の医薬組成物。 - 【請求項２６】 アレルギー疾患の予防および／または
治療剤である請求項２３記載の医薬組成物。 - 【請求項２７】 自己免疫疾患の予防及び／または治療
剤である請求項２３記載の医薬組成物。 - 【請求項２８】 臓器移植時の拒絶反応の抑制剤である
請求項２３記載の医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10110607A JPH11302299A (ja) | 1998-04-21 | 1998-04-21 | Ｔ細胞リセプターβ鎖定常領域ペプチド、該ペプチドの製造方法及び用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10110607A JPH11302299A (ja) | 1998-04-21 | 1998-04-21 | Ｔ細胞リセプターβ鎖定常領域ペプチド、該ペプチドの製造方法及び用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11302299A true JPH11302299A (ja) | 1999-11-02 |
Family
ID=14540131
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10110607A Pending JPH11302299A (ja) | 1998-04-21 | 1998-04-21 | Ｔ細胞リセプターβ鎖定常領域ペプチド、該ペプチドの製造方法及び用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11302299A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009508517A (ja) * | 2005-09-22 | 2009-03-05 | コーエン，イルン，アール | Ｔ細胞受容体定常ドメインの免疫原性断片及びそれに由来するペプチド |
| WO2020138256A1 (ja) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | 国立大学法人京都大学 | Ｔ細胞受容体の改変体 |
-
1998
- 1998-04-21 JP JP10110607A patent/JPH11302299A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009508517A (ja) * | 2005-09-22 | 2009-03-05 | コーエン，イルン，アール | Ｔ細胞受容体定常ドメインの免疫原性断片及びそれに由来するペプチド |
| US9078843B2 (en) | 2005-09-22 | 2015-07-14 | Irun R. Cohen | Immunogenic fragments of T-cell receptor constant domains and peptides derived therefrom |
| WO2020138256A1 (ja) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | 国立大学法人京都大学 | Ｔ細胞受容体の改変体 |
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