JPH11507843A - タンパク質の可溶性二価および多価ヘテロ二量体類縁体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫応答における特異性は、Ｔ細胞受容体とその同種リガンド（即ち、ペプチド／ＭＨＣ分子）との選択的相互作用によって部分的に制御される。この相互作用の識別特性によって、可溶性形態のこれら分子は、免疫応答を選択的に調節するための良好な候補物質になる。これらタンパク質の下方性類縁体を開発する試みは、そのリガンドに対するこられ分子に固有の低いアビディティーによって妨げられてきた。それらの同族体についての可溶性類縁体のアビディティーを、生物学的に関連したレベルにまで増大するために、二価ペプチド／ＭＨＣ複合体またはＴ細胞受容体（スーパー二量体）を構築した。組換えＤＮＡ戦略を用いて、ＭＨＣクラスII／ペプチドまたはＴＣＲヘテロ二量体を、ネズミＩｇの重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡに連結した。続いて、これらの構築物をバキュウロウイルス発現系で発現させた。Ｉｇと、当該分子のＴＣＲもしくはＭＨＣ画分の多形決定基とに特異的な酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）によって、感染した昆虫細胞は、略１μg／mlの可溶性で且つコンホメーション的に完全なキメラスーパー二量体を分泌することが示された。精製したタンパクのＳＤＳ ＰＡＧＥゲル分析によって、予想分子量の蛋白種が示された。フローサイトメトリーの結果は、ＴＣＲおよびクラスIIキメラが、それらの同族受容体を有する細胞に対して高アビディティーで特異的に結合することを示した。これらのスーパー二量体は、ＴＣＲ／ＭＨＣ相互作用、リンパ球トラッキング、新規抗体の同定の研究ために有用であり、また免疫応答の特異的調節としての可能な用途を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質の可溶性二価および多価ヘテロ二量体類縁体 〔関連出願の相互参照〕 本出願は、1996年3月28日付け米国仮出願第60/014,367号の一部継続出願であ る。 〔技術分野〕 本発明は、免疫調節に関与するタンパク質の可溶性二価および多価ヘテロ二量 体類縁体を含む組成物ならびにその製造法および使用方法に関する。これらの複 合体はそれらの対応リガンドに対して高いアフィニティーを有するため、それら は、移殖拒絶反応および自己免疫疾患に通常関与しているＴ細胞受容体およびＭ ＨＣ分子に対する有効な競合体となりうる。また、二価Ｔ細胞受容体などの分子 は、抗腫瘍応答を増強するのに使用することができ、また、腫瘍の除去を助ける のに使用可能な毒素に結合させることができるため、癌の診断および治療に何ら かのインパクトを与えるかもしれない。また、そのような組成物の使用により、 免疫系の一般的な能力を損なうことなく、選択的免疫調節を達成することが可能 となるであろう。 〔発明の背景〕 シグナル伝達の過程には、しばしば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび 細胞内ドメインを有するタンパク質が関与している。細胞の細胞内成分にシグナ ルを有効に伝達するために、リガンド結合の際にはしばしば、受容体分子のオリ ゴマー化が生じる。免疫系は、このようにして作動するシグナル伝達経路の優れ た一例である(Ｒosenら,Ｊ.Ｍed.Ｃhem.38:48-55)。 免疫系は、高等脊椎動物のほとんどの成長形態に見出される防御系である。適 切に機能しているリンパおよび免疫系は、自己と非自己を識別する。健康な身体 は、細菌、ウイルス、真菌、寄生体などの外来侵入物に対して防御する。身体が 外来物質（非自己）（これは抗原としても公知である）に遭遇すると、免疫系が 活性化される。抗原は、その表面上の特徴的な形状またはエピトープにより認識 される。この防御機構は、病原微生物の侵入に対して生物を防御するのに用いら れる迅速かつ高特異的な応答の手段を与える。主として、免疫系をその現在の形 態にまで進化させたのは、莫大な数の病原微生物である。特異的な免疫応答は、 感染性因子に対する防御の他に、腫瘍発生で認められる自己抗原の改変に対する 監視機構にも関与していると考えられている。また、免疫応答は、自己免疫疾患 、エイズ、および移殖組織の拒絶反応の発生に関与している。リンパ球 免疫系内で、リンパ球は中心的な役割を果たしている。外来生物に対してリン パ球が応答すると、免疫系のエフェクター分枝（effector limbs）が編成され、 最終的には感染の運命が決定される。リンパ球は、Ｂ細胞およびＴ細胞の２つの 主要な範疇に分類することができる。これらの２つの型のリンパ球は、異なるエ フェクター機能を有しており、特異的免疫応答の発生において異なる役割を果た す点において専門化されている。個々のリンパ球は、構造的に関連した抗原の限 られたセットに応答するように運命づけられる点で専門化されている。特異性は 、個々のリンパ球上で発現される細胞表面受容体の特有のセットにより付与され る。これらの受容体は、Ｂ細胞の場合には可溶性タンパク質と相互作用し、Ｔ細 胞の場合には抗原ペプチド／主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と相互作 用する。また、それらのリガンドとの相互作用の性質も、Ｂ細胞とＴ細胞とで異 なる。Ｂ細胞が産生する抗原受容体である免疫グロブリン（Ｉg）は、それらの リガンドと高いアフィニティーで相互作用する。これに対して、Ｔ細胞受容体は 、それらのリガンドと低いアフィニティーで相互作用する。したがって、Ｔ細胞 の応答は、抗原提示細胞表面上の複数の抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体と相互作用 する個々のＴ細胞の表面上の多数のＴ細胞受容体（ＴcＲ）の相互作用により駆 動される。したがって、これらの２つの異なる細胞表面糖タンパク質群（すな わち、ＴcＲおよびＭＨＣ糖タンパク質）は、抗原に対するＴ細胞応答における 特異性のキー成分を形成する。 Ｔ細胞は、免疫系の主要な調節細胞である。それらの調節機能は、特有のＴ細 胞受容体の発現だけでなく、種々の補助分子の発現と、個々のＴ細胞応答に関連 したエフェクター機能とにも左右される。エフェクター機能には、細胞傷害性応 答、エフェクター分子（すなわち、リンホカイン）の分泌により特徴づけられる 他の応答などの応答が含まれる。自己免疫疾患の発生においては、この調節機能 が損なわれることが多い。また、種々のエフェクター機能が、組織移殖拒絶反応 において大きな役割を果たしており、腫瘍拒絶反応において重要となることもあ る。 Ｔ細胞は、クラスＩまたはクラスIIの何れかのＭＨＣ分子環境にある抗原に応 答する。細胞傷害性Ｔ細胞は、クラスＩ糖タンパク質の環境下にある外来抗原、 主にウイルス感染細胞、腫瘍抗原、移殖抗原などに対して応答する。これに対し て、ヘルパーＴ細胞は、主に、クラスII分子の環境下にある外来抗原に対して応 答する。それらの両タイプのＭＨＣ分子は構造的には異なっているが、非常に類 似した形状に折り畳まれる。各ＭＨＣ分子は深い溝を有し、この溝の中に、短い ペプチドまたはタンパク質断片が結合することができる。このペプチドはＭＨＣ 分子自体の一部ではないため、それはＭＨＣ分子によって異なる。個々のＴ細胞 上のクロノタイプＴ細胞受容体を引きつけ、外来抗原に対してそれらを応答させ るのは、ＭＨＣの溝の中に提示された外来ペプチドの存在である。 Ｔ細胞による抗原特異的認識は、ＭＨＣ分子中に位置する種々の抗原ペプチド を識別するクロノタイプＴ細胞受容体の能力に基づく。これらの受容体は、抗原 およびＭＨＣの両方に対する二重特異性を有する(Ｚinkernagelら，Ｎature248: 701-702(1974))。したがって、Ｔ細胞は、抗原特異的であると同時にＭＨＣによ って制限される。Ｔ細胞によるＭＨＣに制限された認識の単純な分子的解釈は、 ＴcＲが、ＭＨＣ残基と、ＭＨＣペプチド複合体中のペプチド残基とを認識する というものである。認識の厳密なメカニズムは別として、クロノタイプＴ細 胞受容体は、ＭＨＣ中に位置する多数のペプチドを識別するのに必要かつ十分な 分子である。 Ｔ細胞は、２つの広範なサブセット（すなわち、α／β ＴcＲを発現するサブ セット、およびγ／δ ＴcＲを発現するもう１つのサブセット）に分類すること ができる。α／β ＴcＲを発現する細胞は、広範に研究されており、ウイルス感 染、自己免疫応答、同種移殖拒絶反応および腫瘍特異的免疫応答において出現す る抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体を認識しうる抗原特異的Ｔ細胞のほとんどを含む ことが知られている。α／β ＴcＲを発現する細胞はさらに、ＣＤ8補助分子を 発現する細胞と、ＣＤ4補助分子を発現する細胞とに分類することができる。Ｃ Ｄ4陽性細胞上およびＣＤ8陽性細胞上で発現されるクロノタイプα／β Ｔ細胞 受容体の間には本質的な相違はないが、該補助分子は、異なるクラスのＭＨＣ分 子に応答するＴ細胞の能力と大きく相関する。クラスＩ ＭＨＣ分子はＣＤ8+ま たは細胞傷害性Ｔ細胞によって認識され、クラスII ＭＨＣ分子はＣＤ4+または ヘルパーＴ細胞によって認識される。 γ／δ Ｔ細胞は、循環中および特異的組織中で認められるもう１つの重要な Ｔ細胞集団を構成する。これらの細胞については十分には理解されていない。そ れらの抗原／ＭＨＣ特異性は十分には特徴づけられておらず、ほとんどの場合、 それらのリガンドは全く知られていない。これらの細胞は、皮膚および腸上皮な どの或る組織に大量に存在し、それらの器官の免疫応答において重要な役割を果 たしていると考えられている。また、それらは自己免疫応答に関与しており、熱 ショックタンパク質の認識に関与しているかもしれない。本発明で大まかに説明 するとおり、抗原複合体の同定のための一般的なアプローチは、これらの細胞が 正常および異常の両方の免疫応答の発生にどのように影響を及ぼすかを理解する のを大いに助けるであろう。げっ歯類およびヒトにおいて発現されるα／βおよ びγ／δ ＴcＲ間には高度の相同性がある。一般には、この広範囲に及ぶ相同性 のおかげで、関連したヒト対応物における結果および関与を予測させうるマウス 実験モデルを開発することが可能となっている。健康および疾患におけるＭＨＣ分子 主要組織適合抗原は、主要組織適合遺伝子複合体と称される遺伝子複合体にコ ードされる抗原のファミリーよりなる。マウスでは、ＭＨＣ抗原はＨ-2抗原（組 織適合−2抗原）と称される。ヒトでは、ＭＨＣ抗原はＨＬＡ抗原（ヒト白血球 会合抗原）と称される。ＭＨＣ糖タンパク質をコードする遺伝子座は多型性であ る。このことは、それぞれの種がそれぞれの遺伝子座にいくつかの異なる対立遺 伝子を有することを意味する。例えば、１つの種においては全体では非常に多数 の異なるクラスＩ抗原が認められるかもしれないが、いずれの個体も、各親から 各遺伝子座において単一の対立遺伝子しか受け継がないため、各クラスＩ抗原の せいぜい２個の異なる形態を発現するにすぎない。 マウス系では、クラスII ＭＨＣ分子はＩ-ＡおよびＩ-Ｅ遺伝子座にコードさ れており、ヒトでは、クラスII分子はＤＲ、ＤＰおよびＤＱ遺伝子座にコードさ れている。クラスII対立遺伝子の多型はαおよびβ鎖に起因し、特異性は、世界 保健機関により発表されている命名法を用いて示される(Ｉmmunogenetics(1992) 36:135)。ＭＨＣ分子の役割−移殖 ＭＨＣ分子は、移殖片の運命の決定において本質的な役割を果たす。様々な種 が、組織移殖片の強い拒絶反応、抗体産生の刺激、混合リンパ球反応（ＭＬＲ） の刺激、移殖片対宿主反応(ＧＶＨ)、細胞媒介性リンパ球溶解(ＣＭＬ)、免疫応 答遺伝子および免疫応答の抑制を含むＭＨＣに関連した主要な免疫機能的特性を 示す。移殖拒絶反応は、ＭＨＣ不適合性を越えて皮膚、器官（例えば、腎臓、肝 臓、肺）または他の組織（例えば、血液、骨髄）を移殖した場合に生じる。レシ ピエントではなくドナーの組織中に存在する一致しない移殖抗原により免疫系が 活性化された場合に、強い拒絶反応が生じる。循環している免疫細胞が外来抗原 に曝されることにより、移殖拒絶反応は移殖片自体において生じるかもしれない 。あるいは、捕捉された移殖抗原または移殖細胞の蓄積により、移殖拒絶反応は 所属リンパ節中で生じるかもしれない。ＭＨＣ抗原の莫大な多様性のため、生理 学 的および病態生理学的な免疫関連活動（例えば、移殖、ウイルス感染および腫瘍 発生）においては多数の特異性が考えられる。認識されるＨＬＡ特異性は、例え ば、Ｂodmerら（Ｄuppont Ｂ.(編)Ｉmmunobiology of ＨＬＡ(Ｖolume Ｉ)Ｎew Ｙork:Ｓpringer-Ｖerlag(1989)）による概説に示されている。ＭＨＣ分子の役割−自己免疫応答 多数の自己免疫疾患に対する感受性は、有意な遺伝的成分および家族連関を示 している。自己免疫疾患のほとんどの遺伝的連関は、あるクラスII ＭＨＣ対立 遺伝子に対するものである（概要については表１を参照されたい）。ある特定の 疾患とＭＨＣ遺伝子座の１つにおける対立遺伝子との関連性の程度は、「相対危 険度」と称される用語により定義される。この用語は、抗原を欠く個体における 疾患の頻度と比較した、抗原を有する個体における疾患の頻度を表す。例えば、 インスリン依存性糖尿病ではＤＱβ遺伝子型と強い関連性があり、ＤＱβ配列は 57位にアスパラギン酸を有するのに対して、コーカソイド集団ではほとんどの場 合、糖尿病患者はその位置にバリン、セリンまたはアラニンを有する。 免疫応答の調節 正常および異常の両方のＴ細胞媒介性免疫応答の分析に関心がもたれたことは 、特異的Ｔ細胞応答を検査し調節するためのＴ細胞受容体およびＭＨＣ分子の一 連の新規可溶性類縁体の開発につながった。これらの試薬の開発は、いくつかの 事実のために困難になった。第１に、Ｔ細胞受容体は、比較的低いアフィニティ ーでペプチド／ＭＨＣ複合体と相互作用する(Ｍatsuiら，Ｓcience 254:1788-18 91(1991)Ｓykulevら，Ｉmmunity 1:15-22(1994)Ｃorrら，Ｓcience 265:946-949 (1994))。免疫応答を特異的に調節するためには、Ｔ細胞受容体またはペプチド ／ＭＨＣ複合体のいずれかに対して高いアフィニティー／アビディティーを有す る可溶性分子が必要である。しかしながら、Ｔ細胞受容体またはペプチド／ＭＨ Ｃ複合体のいずれかの一価類縁体を単に可溶性にすることは、要求される特異性 およびアビディティーで免疫応答を調節するのに有効でないことが判明している 。 免疫応答を選択的に調節するために、研究者らは、免疫応答に関与するタンパ ク質の可溶性形熊を製造した。一回（single）膜貫通ドメインを有する、免疫応 答の調節に関与するタンパク質の可溶性二価類縁体が、いくつかの研究室で製造 されている。まず最初に、ＣＤ4／Ｉgキメラ(Ｃoponら,Ｎature 337:525-531(19 89); Ｂrynら,Ｎature344:667-670(1990))およびＣＲ2／Ｉgキメラ(Ｈebellら, Ｓcience 254:102-105(1991))が製造された。その後、特異的ＣＴＬＡ-4／Ｉgキ メラを使用して、免疫応答を修飾しうることが示された(Ｌinsleyら,Ｓcience 2 57:7920-795(1992); 米国特許第5,434,131号; Ｌenschowら,Ｓcience 257:789-7 91 (1992))。さらに、クラスＩ ＭＨＣ／Ｉgキメラを使用して、インビトロの同 種応答が修飾された(Ｄal Ｐorto，前掲)。しかしながら、これらの例は、一回 膜貫通ポリペプチド分子の可溶性二価類縁体を含むにすぎず、共に膜貫通ポリペ プチドであるαポリペプチドおよびβポリペプチドよりなるヘテロ二量体タンパ ク質のキメラ分子を含んでいない。本発明は、免疫調節において潜在的用途を有 する調怖機能単位を形成するように適切に折り畳まれるαおよびβ多型性一体性 膜ポリペプチドよ りなる一体性膜タンパク質複合体の可溶性二価および多価ヘテロ二量体類縁体の 製造を報告する。 現在のところ、多価類縁体の製造において２個の膜貫通ドメインを置換するこ とは達成されていない。これら分子の製造における課題は、共に膜貫通ドメイン を通常は要する２個のポリペプチドの適切な折り畳みおよび発現の達成にある( 図１)。また、ヘテロ二量体タンパク質の可溶性多価類縁体は、一般には、増加 したアフィニティーを有するため、好ましい治療剤である。機能単位を形成する ように適切に折り畳みするαおよびβ多型性一体性膜ポリペプチドよりなる、こ れらの可溶性タンパク質複合体は、免疫調節剤としての潜在的用途を有する。 〔発明の概要〕 標的分子に特異的に結合して免疫応答を調節する能力を有する、ヘテロ二量体 タンパク質の可溶性組換え二価および多価類縁体を提供することが、本発明の１ つの目的である。 標的分子に対するアフィニティーが増加した可溶性組換え二価ヘテロ二量体タ ンパク質を提供することが、本発明のもう１つの目的である。 ヘテロ二量体一体性膜タンパク質の可溶性二価類縁体をコードする発現ベクタ ーの製造法を特許請求することが、本発明のさらにもう１つの目的である。これ は、少なくとも２つのＤＮＡ配列（例えば、免疫グロブリン重鎖に融合したαポ リペプチド、および免疫グロブリン軽鎖に融合したβポリペプチド）を挿入する ことにより免疫グロブリン分子の発現ベクターを修飾することを含む(図２)。こ れはまた、免疫グロブリン重鎖に融合したβポリペプチドおよび免疫グロブリン 軽鎖に融合したαポリペプチドなどの少なくとも２つのＤＮＡ配列を挿入するこ とにより行なうことも可能であろう。該αおよびβポリペプチドは、結合部位ま たは認識部位をコードするポリペプチドである。また、本発明の融合タンパク質 が２つの適合性発現ベクターにコードされることも可能である。 αおよびβポリペプチドサブユニットを含有する可溶性二価ヘテロ二量体タン パク質を発現する能力を有する該ベクターを含有する宿主細胞も、本発明の目的 である。 また、免疫応答を抑制または軽減する方法も本発明に含まれる。特に、ＴcＲ またはクラスII ＭＨＣ分子の可溶性二価類縁体を使用して、Ｔ細胞と抗原提示 細胞との間の抗原特異的相互作用を抑制することができる。この一例としては、 重症筋無力症、多発性硬化症、関節炎およびアレルギー疾患に見られる自己免疫 応答の抑制を挙げることができよう。また、インテグリンの相互作用により媒介 される細胞の接着は、インテグリン分子の可溶性二価類縁体を使用して抑制する ことができる。また、サイトカインに媒介される細胞刺激の抑制も含まれる。こ れは、サイトカイン受容体の可溶性二価形態が、可溶性サイトカインに結合し、 それにより、細胞増殖を媒介するサイトカインの能力を抑制すると考えられるこ とに基づく。 また、免疫応答の増強方法も本発明に含まれる。特に、抗原特異的Ｔ細胞応答 を刺激するために、基体上に固定化されたＴcＲまたはクラスII ＭＨＣ分子の可 溶性二価類縁体を使用して、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の抗原特異的相互作用 を増強することができる。また、抗原ペプチドを提示する固定化されたＭＨＣ／ Ｉg分子の場合には、特異的Ｔ細胞サブセットを同定し精製するため、すなわち 、クロノタイプＴcＲの同定のために、そのような系を使用することができる。 同様に、固定化されたＴcＲ／Ｉgを使用して、癌または伝染病（例えば、エイズ ）に関与している可能性がある末知のペプチド／ＭＨＣ複合体を同定し精製する ことができる。また、組織培養プレートまたはビーズなどの固体基体上に固定化 されたインテグリン分子の可溶性二価類縁体を使用して、接着受容体を介する細 胞刺激を達成することができる。 本発明はさらに、タンパク質の可溶性組換え二価ヘテロ二量体類縁体を投与す ることによる疾患の治療方法であって、それにより、αおよびβポリペプチドが 一単位を形成し、それにより、特許請求している構築物が、特異的Ｔ細胞サブセ ットの細胞活性化、増殖、アネルギーまたは欠失を選択的に増加または減少さ せることを特徴とする方法を含む。そのような疾患には、自己免疫障害、移殖拒 絶反応、癌およびエイズが含まれる。本発明のそのような二価および多価複合体 は、それらのそれぞれの標的に対する増加したアフィニティーを有するため、そ のような化合物の投与は、その夫々の標的分子に対する結合および細胞対細胞相 互作用の抑制により、特異的移殖抗原および自己抗原のＴ細胞認識を選択的に抑 制または阻止するはずである。 また、当該技術分野で公知の技術を用いて、リシン、シュードモナス外毒素な どの毒素分子を本発明の化合物に結合させることが可能である。本発明はまた、 そのような結合（conjugate）分子を用いる癌およびエイズの治療方法を含む。 例えば、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞のＭＨＣ分子上に提示されるウイルス または腫瘍特異的ペプチドを同定した後、それぞれ、ＨＩＶウイルス保持細胞ま たは癌細胞に結合し破壊する毒素結合性可溶性ヘテロ二量体ＴＣＲ分子を設計す ることができる。さらに、腫瘍またはエイズ関連ペプチドを提示する可溶性二価 または多価ＭＨＣ／ＩＧ分子は、免疫化プロトコールにおいて潜在的用途を有す るであろう。 したがって、可溶性二価ＴcＲを使用して誘導体化された未知の抗原またはペ プチドを同定する方法も本発明に含まれる。可溶性高アフィニティーＴＣＲ／Ｉ gキメラの顕著な利点は、それらのリガンドに関する演繹的な知見がない場合で あっても、特徴づけられていない腫瘍特異的Ｔ細胞および自己免疫応答に関与す るＴ細胞に認識される特異的ペプチド／ＭＨＣリガンドを特定するのに、それら が有用と考えられることである。可溶性二価ＴＣＲ／ＩＧ分子は、特異的ペプチ ド／ＭＨＣ複合体の定量的検出のための効率的なプローブであるばかりでなく、 標的分子に対するそれらの強力なアフィニティーのため、それらは結果的に、そ のような複合体の精製においても重要な役割を果たし、それらの特徴づけを助け ることにもなる。 本発明の一体性膜タンパク質の可溶性二価ヘテロ二量体類縁体は、これらの組 換えタンパク質が、免疫応答を修飾するための増強された結合アフィニティーを 有するため、顕著な利点を提供する。特異的Ｔ細胞応答を選択的に修飾し、多価 リガンド−受容体相互作用により駆動される細胞−細胞相互作用を研究するため に、本発明の二価キメラ分子などの高アフィニティー二価リガンドを使用するこ とができる。 〔図面の簡単な説明〕 図1Ａ：ヘテロ二量体二回（double）膜貫通タンパク質の典型的な立体配置。 図1Ｂ：膜外領域が抗体に共有結合することにより二価および可溶性になった ヘテロ二量体膜貫通タンパク質。 図1Ｃ：抗体に共有結合したＭＨＣクラスIIの膜外領域。 図1Ｄ：ＩgＧ1重鎖に結合したＴcＲαポリペプチド（陰影部）と、ＩgＧκ軽 鎖に結合したＴcＲβポリペプチド（陰影部）とを示すキメラタンパク質の概要 図を示す。キメラ鎖間のリンカーは、短いグリシン／セリンスペーサーよりなる 。推定2Ｃ ＴcＲ／Ｉg構造上のＨ57（ＴcＲ特異的）および1Ｂ2（2Ｃ ＴcＲ特異 的）の２つのモノクローナル抗体（ｍＡb）の推定結合部位も示す。 図２：可溶性二価ヘテロ二量体タンパク質をコードする発現ベクターの地図。 キメラ免疫グロブリン分子を形成するようにＩg重鎖および軽鎖に結合したαお よびβポリペプチドサブユニットの融合を表すために、複数工程の構築の概要を 示す。 図３：プラスミド構築物中に導入されたＤＮＡ配列の詳細。 図４：ＴcＲ／ＭＨＣ相互作用の概要図。 図5Ａ-5Ｃ：ＥＬＩＳＡアッセイによる可溶性ヘテロ二量体タンパク質の検出 。 図６：Ｉ-Ｅ^κ／Ｉgおよび2Ｃ ＴcＲ／Ｉgキメラタンパク質のＳＤＳ-ＰＡＧ Ｅ分析。 図７：ペプチド／Ｈ-2 Ｌ^d複合体に対する可溶性二価2Ｃ ＴcＲ／Ｉgのアフィ ニティーが、可溶性一価2Ｃ ＴcＲのアフィニティーより高いことを示すグラフ を図11に示す。ＲＭＡ Ｓ-Ｌ^d細胞をペプチド（ＱＬ9、p2ＣaまたはpＭＣＭＶ） でローディングし、ついで、一定量のＦＩＴＣ標識30.5.7 Ｆabおよび種々の濃 度の2Ｃ ＴcＲ／ ＩgＧ（実線）または可溶性一価2Ｃ ＴcＲ、sm2Ｃ ＴcＲ（破線）と共にインキ ュベートする。ＦＩＴＣ-30.5.7 Ｆabの結合を、フローサイトメトリーにより測 定した。最大（2Ｃ ＴcＲ類縁体無し）30.5.7結合の割合（％）を、2Ｃ ＴcＲ類 縁体の濃度に対してプロットした。１／(最大30.5.7結合の割合(％))対[ＴcＲ類 縁体]の再プロットから、見掛けアフィニティーを測定した(さらなる考察につい ては本文および表IIを参照されたい)。示されているデータは、少なくとも３回 繰返した１つの代表的な実験からのものである。各データ点は、２回反復の平均 である。 図８：ついで前記のとおり、細胞を収穫し、フローサイトメトリー分析のため に加工した。精製されたmＡb，30.5.7（パネルＡ-Ｄ）または2Ｃ ＴcＲ／Ｉg培 養上清（パネルＥ-Ｈ）（最終濃度20〜40μg/mlに希釈されたもの）で細胞を染 色した。各パネルにおいては、処理細胞（実線）のヒストグラムを、いずれのペ プチドでも処理せずに37℃で１時間培養した細胞（破線）のヒストグラムと対比 させている。示されているヒストグラムは、少なくとも３回繰返した１つの代表 的な実験からのものである。 図９：ペプチドで安定化されたＨ-2Ｌ^d分子における2Ｃ ＴcＲ／Ｉg反応性対m Ａb30.5.7反応性の比較。ＲＭＡ-ＳＬ^d細胞を、種々の条件下でインキュベート した。ＲＭＡ-ＳＬ^d細胞を27℃で一晩インキュベートした後、種々のＨ-2Ｌ^d結 合ペプチドの存在下または不存在下で細胞を培養し、ペプチド細胞を27℃で維持 せず(パネルＡおよびＥ)、tum^-(パネルＢおよびＦ)、p2Ｃa（パネルＣおよびＧ ）およびＱＬ9（パネルＤおよびＨ）を節に記載されているとおりに加えた。 図10：可溶性２Ｃ Ｔc／Ｉgスーパー二量体（supedimer）によるインビトロ2 ＣＴ細胞媒介性溶解の抑制を示すグラフ。 図11：可溶性二価2Ｃ ＴcＲ／ＩgがＳＩＹ／ＭＨＣ複合体とは相互作用するが 、dＥＶ-8／ＭＨＣ複合体とは相互作用しないことを示す蛍光データを図11に示 す。後記のとおり、Ｈ-2Ｋ^d、Ｈ-2Ｋ^bm3、Ｈ-2Ｋ^bm11のいずれかでトランスフェ クトしたＴ2細胞を、27℃で一晩インキュベートし、ペプチドdＥＶ-8(-----)、 ＳＩＹ（ＱＱ）またはpＶＳＶ（aaaaa）でローディングした。「方法」に記載の とおり、細胞を精 製2Ｃ ＴcＲ／Ｉg（〜50mg/ml）およびＧＡＭ-ＩgＧ-ＲＰＥで染色し、ＦＡＣＳ により分析した。得られたヒストグラムを示す：パネルＡ、Ｔ2-Ｋb細胞；Ｂ、 Ｔ2- Ｋ^bm3; Ｃ、Ｔ2-Ｋ^bm11。示されているヒストグラムにおいては、dＥＶ-8( -----)またはpＶＳＶ（aaaaa）のいずれかに対する2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの反応性は実 質的に同一であったため、これらの２つのヒストグラムを識別するのは困難であ った。 図12：種々のペプチド／ＭＨＣ標的上での2Ｃ ＣＴＬ媒介性溶解を、この図面 に示す。Ｈ-2Ｌ^d(パネルＡ)、Ｈ-2Ｋ^b（パネルＢ）またはＨ-2Ｋ^bm3（パネルＣ ）のいずれかでトランスフェクトしたＴ2細胞を、記載されているとおりにクロ ムで標識し、ついで、種々の量のペプチド［p2Ｃa()およびpＭＣＭＶ()（パネル Ａ）;およびdＥＶ-8()；ＳＩＹ;またはpＶＳＶ()(パネルＢおよびＣ)］の存在下 で25℃で1.5時間インキュベートすることによりペプチドでローディングした。 ついで、ペプチドでローティングされた標的細胞を、10：1のエフェクター対標 的比でインキュベートし、後記のとおりに相対溶解を算出した。示されているデ ータは、３個の独立した実験を表す。 図13：γ-ＩＦＮによるＲＥＮＣＡ細胞の表面上の内因性2Ｃ特異的ペプチド／ Ｈ-2Ｌ^d複合体のモジュレーションを示す蛍光データを、図13に示す。ＲＥＮＣ Ａ細胞を、０(パネルＡ＆Ｅ)、５(パネルＢ＆Ｆ)、10（パネルＣ＆Ｇ）または50 （パネルＤ＆Ｈ）単位/mlのγ-ＩＦＮと共に48時間培養した。結果に記載されて いるとおり、γ-ＩＦＮはクラスＩ発現に直接影響を及ぼすことが知られている ため、γ-ＩＦＮで処理された細胞に対する2Ｃ ＴcＲ／Ｉgのバックグラウンド 結合を定める必要がある。これは、飽和量のＨ-2Ｌ^d結合ペプチドであるＭＣＭ Ｖ（これは、任意の2Ｃ反応性ペプチドを含む内因性Ｈ-2Ｌ^d結合ペプチドを効率 的に置換した）と共に、ＲＥＮＣＡ細胞をインキュベートすることにより行なっ た、後記のとおり、細胞を収穫し、2Ｃ ＴcＲ／Ｉg（75mg/ml）（パネルＡ-Ｄ） またはmＡb30.5.7（45mg/ml）（パネルＥ-Ｈ）で染色した。ついで細胞をＧＡＭ -ＩgＧ-ＲＰＥで染色し、ＦＡＣＳにより分析した。得られたヒストグラムを示 す。実線（Ｑ）は、ペプチドが無添加の場合の培養のヒストグラムを表し、一方 、点線(aaa)、pＭＣＭＶと 共にインキュベートした培養からのヒストグラムを表す。すべての実験は重複し て行ない、少なくとも３回繰返した。2Ｃ-ＴcＲ／Ｉgで染色した場合と30.5.7で 染色した場合の蛍光の程度の相違に注目されたい。 〔発明の詳細な説明〕 免疫系の活性を調節する標的分子に特異的に結合するヘテロ二量体タンパク質 の可溶性組換え二価および多価類縁体を製造した。ヘテロ二量体タンパク質の可 溶性組換え二価および多価類縁体の構築および発現は、ヘテロ二量体タンパク質 からのポリペプチド配列を免疫グロブリン重鎖および軽鎖に連結することを含む ものであった。特に、ヘテロ二量体タンパク質の可溶性組換え二価および多価類 縁体では、ヘテロ二量体膜貫通タンパク質のポリペプチド鎖を免疫グロブリン重 鎖に、そしてヘテロ二量体膜貫通タンパク質のもう１つのポリペプチド鎖を免疫 グロブリン軽鎖に連結する。これらの可溶性ハイブリッド構築物は、同一リガン ドに対する２以上の結合部位を含有する。 「ポリペプチド」は、ヘテロ二量体タンパク質の任意のポリペプチドを意味す る。「ポリペプチド」は、タンパク質全体またはその一部を意味することもある 。選択されたポリペプチド配列は、適切な折り畳みおよび結合部位のコンホメー ションに必要なタンパク質の領域また該分子の機能に必要な任意の他の領域を含 む、調節のための特異的免疫応答に関与する任意の結合部位を少なくとも含有す る。「結合部位」は、リガンドまたは標的細胞との相互作用または結合を媒介す る関心のあるタンパク質からのアミノ酸のドメインまたは配列を意味する。結合 部位は、三次元コンホメーションに関連したアミノ酸の不連続的な配列から形成 することができる。また、結合部位は、糖タンパク質の細胞外ドメイン内で見出 されることがある。糖タンパク質は、１以上の炭水化物基を含有するタンパク質 である。 ポリペプチド配列は、約５アミノ酸の配列から約1000アミノ酸の配列を含有す る。好ましくは、ポリペプチド配列は、200アミノ酸以下の配列を含有する。 哺乳動物ポリペプチドが好ましく、より好ましくは、膜貫通タンパク質からのヒ トポリペプチドである。同一リガンドに対する２以上の結合部位を含有する実際 の配列からの若干の非論理的(non-consequential)な配列変異を有するＤＮＡ、 ＲＮＡおよびアミノ酸配列は、本発明の範囲内に含まれる。アミノ酸、ペプチド およびそれらの誘導体の通常の略語は、ペプチドの技術分野で一般に受け入れら れておりＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｃommission on Ｂiochemical Ｎomenclature）で推奨されているものを用いる(Ｅuropean Ｊ．Ｂiochem(1984) 138:9-37)。「若干の非論理的」な配列変異は、該相同配列が、本発明の実質的 に同じタンパク質およびポリペプチドを産生するように実質的に同じ様態で機能 することを意味する。機能的に等価なポリペプチドも、本発明に含まれる。その ようなアミノ酸においては、生物学的または化学的機能を失わせることなく同類 置換を行なうことができる。 本発明で用いる「可溶性」なる語は、関心のある組成物が37℃でまたは体液中 、血漿中などで十分に可溶性であり、本発明に従い該組成物にその意図された機 能を発揮させうるのに必要な特定された範囲の濃度で該組成物を使用することが できることを意味する。 「二価」は、天然に生じるか又は遺伝的に操作された関心のあるキメラタンパ ク質またはポリペプチドが、同一リガンドに対する２個の結合部位を有すること を意味する。これは、異なるリガンドに対する２個の結合部位をキメラタンパク 質が同一ポリペプチド上に有する二重特異性（bifunctional）とは異なる。した がって、すべての免疫グロブリンは、二重特異性であると同時に、少なくとも二 価である。それらはすべて、抗原に対する少なくとも１個の結合部位と、Ｆc受 容体結合のための分離した部位とを有する点で、二重特異性である。また、免疫 グロブリンは、少なくとも２個の同一であるが分離した抗原結合部位を有する点 で、少なくとも二価である。 「多価」は、天然に生じるか又は遺伝的に操作された関心のあるキメラタンパ ク質またはポリペプチドが、同一リガンドに対する２個を上回る結合部位を有 することを意味する。例えば、「多価」は、本発明によるＩgＭおよびＩgＡキメ ラ分子（これらは、それぞれ、五価および四価である）を包含するであろう。さ らに、「多価」は、１個を上回るキメラ抗体分子を有する組成物を示すこともあ ろう。各二価ヘテロ二量体ＩgＧ分子は２個の結合部位を有するため（二価）、４個 のＩgＧ分子を含有するキメラ抗体複合体であれば、８個の抗原結合部位を 有することになる(八価)。当該技術分野で公知の方法を用いて、非キメラである 同様の多価抗体複合体が構築されている。例えば、ＳanoおよびＣantorは、スト レプトアビジン−プロテインＡを使用して、１分子当たり４個以上のＩgＧ結合 部位を有する多価抗体の製造法を開示している(米国特許第5,328,985号)。結合 分子１個当たりの抗体分子の数は、ストレプトアビジン−プロテインＡと、適当 な比率の関心のある抗体とを混合することにより制御される。また、抗体を結合 させるための当該技術分野で公知の他の方法を用いて、本発明の可溶性多価キメ ラ組成物を製造することも可能であろう。 「リンカー」は、免疫グロブリン分子とヘテロ二量体ポリペプチドとの間に挿 入されたリンカー領域を意味する。リンカー配列の長さは、抗原結合および架橋 の程度を調節するための所望の柔軟性に応じて様々となろう。「リンカー」は、 所望により採用される特徴であるとみなされるべきである。ヘテロ二量体ポリペ プチドが、追加的なリンカー領域なしで、免疫グロブリン分子に直接的に共有結 合するように、構築物を設計することができる。リンカー領域を含める場合には 、この領域は、好ましくは、少なくとも３個で30個以下のアミノ酸を含有する。 より好ましくは、リンカーは、約５個で20個以下のアミノ酸、最も好ましくは、 該リンカーは10個未満のアミノ酸である。一般に、リンカーは、短いグリシン／ セリンスペーサーよりなるが、任意の公知アミノ酸を使用することも可能である 。 「免疫グロブリンまたはＩg」は、抗体分泌細胞の産物である一群のタンパク 質を意味する。Ｉgは、それぞれ２個の重（Ｈ）ポリペプチド鎖と２個の軽（Ｌ ）ポリペプチド鎖よりなる１個またはいくつかの単位からなる。各単位は、２個 の 抗原結合部位を有する。ＨおよびＬ鎖は、一連のドメインよりなる。２個の主要 な型（κおよびλ）があるＬ鎖は、２個のドメインよりなる。Ｉg分子のＨ鎖は 、μ、δおよびγ(この中には、いくつかのサブクラスがある)、αおよびεを含 むいくつかの型がある。重鎖アイソタイプによる定義によれば、８個のＩgクラ スおよびサブクラス（ＩgＭ、ＩgＤ、ＩgＧ3、ＩgＧ1、ＩgＧ2b、ＩgＧ2a、1gＥ およびＩgＡ）が遺伝的および構造的に同定されている。さらに、例えば、「Ｉg Ｇ」は、Ｇクラスの免疫グロブリンを意味し、「ＩgＧ1」は、Ｇクラスのサブクラ ス１のＩgＧ分子を意味する。「Ｆab」および「Ｆ(ab')₂」は、無傷Ｉg分子のタ ンパク質分解性消化により産生されうるＩg分子の断片である。ＩgＧ分子のパパ インによる消化は、２個のＦab断片とＦc断片とを与え、ペプシンによる消化は 、Ｆ(ab')₂断片とＦc部分の亜断片とを与えるであろう。 本発明で用いる「移殖抗原」は、移殖片認識および拒絶反応を引き起こす分子 である。レシピエントの免疫学的状態は、移殖片の生存に影響を及ぼす決定的に 重要な因子であるため、許容／拒絶過程には多様な抗原系が関与している可能性 がある。これらは、クラスＩおよびクラスII ＭＨＣ分子などの十分に認められ ているＨＬＡ系を含むばかりでなく、ＡＢＯ式血液型〔二糖類、三糖類、四糖類 、五糖類、オリゴ糖、多糖類、より好ましくは、炭水化物α(1,3)ガラクトシル エピトープ[α(1,3)Ｇal]含む（これらに限定されるものではない）炭水化物を 含む〕、ＴおよびＢ細胞上の自己抗原、および単球／内皮細胞抗原などの他の少 数の組織適合抗原も含む。本発明は、主に、２個のサブユニット分子（それらは それぞれ、天然状態では膜貫通ドメインを有することが一般に知られている）を 有する二価および多価ヘテロ二量体化合物に関するものであるため、本発明の場 合の移殖抗原は、ＭＨＣクラスII抗原を含む。移殖片拒絶反応を抑制または軽減 する治療または療法に関する臨床用途では、抗原特異的応答を選択的に抑制する ことが目標とされる。移殖抗原は、任意のクラスＩまたはクラスII ＭＨＣ分子 であってもよく、特にヒトの場合には、Ａ(例、Ａ1-Ａ74)、Ｂ(例、Ｂ1-Ｂ77)、 Ｃ(例、Ｃ1-Ｃ11)、Ｄ(例、Ｄ1-Ｄ26)、ＤＲ(例、ＤＲ1-ＤＲ8)、ＤＱ(例、ＤＱ 1-ＤＱ9)お よびＤＰ（例、ＤＰ1-ＤＰ6）などのＨＬＡ特異性を含む任意のＭＨＣ分子であ ってもよい。より好ましくは、ＨＬＡ特異性は、Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ａ11、Ａ23、 Ａ24、Ａ28、Ａ30、Ａ33、Ｂ7、Ｂ8、Ｂ35、Ｂ44、Ｂ53、Ｂ60、Ｂ62、ＤＲ1、 ＤＲ2、ＤＲ3、ＤＲ4、ＤＲ7、ＤＲ8およびＤＲ11を含む(Ｚacharyら，Ｔranspl ant．62:272-283)。自己免疫疾患の療法に関する臨床用途においては、移殖抗原 は、関心のある疾患と関連または連鎖している任意のＭＨＣクラスII分子である 。そのような移殖抗原には、特に、任意のＤおよびＤＲ対立遺伝子が含まれるが 、自己免疫疾患と関連していることが示されているＤＱおよびＤＰ対立遺伝子も 含まれる。治療用途は、本発明の可溶性タンパク質（「特異的抗原抑制物質」とも 称される）を使用する移殖抗原の特異的抑制を含む。特に、１つの治療用途は、 特異的抗原抑制物質を使用する、予め生成した抗炭水化物抗体の応答の特異的抑 制を含む。 「ヘテロ二量体」は、関心のあるタンパク質が、２個の分離したポリペプチド 鎖よりなることを意味する。本明細書では、本発明者らは、膜貫通および細胞内 ドメインを有するポリペプチド鎖のみを考えることにする。αおよびβ多型性一 体性膜ポリペプチド（これらは互いに結合して、免疫認識に関与する機能単位を 形成する）を含有する異なるクラスのヘテロ二量体膜貫通タンパク質には、タン パク質、例えばＴ細胞受容体、およびクラスII ＭＨＣ分子、インテグリン(例え ば、20個を上回る細胞表面ヘテロ二量体を含むもの)、およびサイトカイン受容 体（例えば、ＩＬ-2、ＩＬ-3、ＩＬ-4、ＩＬ-5、ＩＬ-6、ＩＬ-7、ＩＬ-9、エリ トロポエチン(ＥＰＯ)、白血病阻害因子(ＬＩＦ)、Ｇ-ＣＳＦ、オンロスタチン Ｍ、毛様体神経栄養因子(ＣＮＴＦ)、成長ホルモンおよびプロラクチン）が含ま れるが、それらに限定されるものではない。 また、重鎖および軽鎖の両方の免疫グロブリン鎖が同一細胞外ドメイン（すな わち、クラスＩ ＭＨＣ分子からの細胞外ドメインまたは糖タンパク質）と融合 するように、本発明の組成物を製造することも可能である。この場合、タンパク 質の発現および折り畳みにより、すべて同一ポリペプチドと融合している２個の 軽鎖および２個の重鎖を含むキメラホモ四量体組成物が得られるであろう。 「インテグリン」は、接着特性を有することにより特徴づけられるタンパク質 のクラスであって、類似細胞間および異なる細胞間の両方の接着の媒介に関与す ることが知られているタンパク質のクラスを意味する。また、これらの分子は、 αポリペプチドおよびβポリペプチドよりなるヘテロ二量体膜貫通タンパク質で ある。 「スーパー二量体（superdimer)」は、ヘテロ二量体タンパク質の二量体を意 味する。この用語は、抗原提示細胞の表面上のＭＨＣ分子のコンホメーションの 性状を表すために造語された。本出願では、この用語は、クラスII ＭＨＣまた はＴcＲ分子のいずれかの可溶性二価または多価形態などの可溶性「スーパー二 量体」のみを表すために使用することにする。 「サイトカイン」は、他の細胞の挙動に影響を及ぼすタンパク質を意味する。 リンパ球により産生されるサイトカインは、しばしば、リンホカインまたはイン ターロイキンと称されるが、本明細書中では、一般的な用語である「サイトカイ ン」を最も頻繁に使用する。サイトカインは、それが影響を及ぼす細胞上の特異 的「サイトカイン受容体」に作用する。また、サイトカイン受容体は、少なくと も２個の成分ポリペプチドが膜貫通伸長タンパク質である分子のファミリーに属 する。この系は、免疫系の細胞を含む多数の細胞型の増殖および調節の中心であ る。サイトカイン／サイトカイン受容体には、以下の具体例が含まれるが、それ らの列挙に限定されるものではない：I）ヘマトポイエチンファミリー(例えば、 エリトロポエチン(ＥＰＯ)/ＥpoＲ；ＩＬ-2(Ｔ細胞増殖因子)/ＣＤ25、ＣＤ122 ；ＩＬ-3(多ロロニーＣＳＦ)/ＣＤ123;ＩＬ-4(ＢＣＧＦ-1、ＢＳＦ-1)/ＣＤ124; ＩＬ-5(ＢＣＧＦ-2)/ＣＤ125；ＩＬ-6（ＩＮＦ-β₂、ＢＳＦ-2、ＢＣＤＦ）/Ｃ Ｄ126；Ｃdw130；ＩＬ-7/ＣＤw127；ＩＬ-9/ＩＬ-9Ｒ；ＩＬ-11/ＩＬ-11Ｒ；Ｃd w130；ＩＬ-13（P600）/ＩＬ-13Ｒ；ＩＬ-15（Ｔ細胞増殖因子）/ＩＬ-15Ｒ；Ｇ Ｍ-ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激ファミリー）/ＣＤw116；ＯＳＭ （ＯＭ、オンコスタチンＭ）/ＯＭＲ、ＣＤw130；ＬＩＦ（白血病阻害因子）/Ｌ ＩＦＲ、ＣＤw130）；II）インターフェロンファミリー（例えば、ＩＦＮ-γ/Ｃ Ｄ119；ＩＮＦ-α/ＣＤ118；ＩＮＦ-β/ＣＤ118）；III）免疫グロブリンスーパ ーフ ァミリー(例えば、Ｂ7.1(ＣＤ80)/ＣＤ28;ＣＴＬＡ-4;Ｂ7.2/ＣＤ28、ＣＴＬＡ- 4)；IV）ＴＮＦファミリー(例えば、ＴＮＦ-α(カケクチン)/p55、p75、ＣＤ120 a、ＣＤ120b；ＴＮＦ-β（リンホトキシン、ＬＴ、ＬＴ-α）/p55、p75、ＣＤ12 0a、ＣＤ120b)、ＬＴ-β)、ＣＤ40リガンド（ＣＤ40-Ｌ）/ＣＤ40；Ｆasリガン ド/ＣＤ95(Ｆas)；ＣＤ27リガンド/ＣＤ27;ＣＤ30リガンド/ＣＤ30;4-1ＢＢＬ/4 -1ＢＢ；Ｖ）ケモカインファミリー（例えば、ＩＬ8（ＮＡＰ-1）/ＣＤw128；Ｍ Ｐ-1（ＭＣＡＰ）；ＭＩＰ-1α；ＭＩＰ-1β；ＲＡＮＴＥＳ）；およびVI）その 他（ＴＦＧ-β；ＩＬ-1α；ＩＬ-1β；ＩＬ10（サイトカイン合成阻害因子Ｆ） ；ＩＬ-12（ナチュラルキラー細胞刺激因子）；およびＭＩＦ)。 本発明のキメラ化合物をコードするＤＮＡ構築物は、一般には、重鎖または軽 鎖免疫グロブリン可変領域配列の最初のアミノ酸に融合したヘテロ二量体複合体 の１つのポリペプチド（すなわち、ＴＣＲαまたはβ、あるいはＭＨＣクラスII αまたはβ）のシグナル配列および細胞外ドメインをコードする配列を含む。そ のようなＤＮＡ構築物は、免疫グロブリン分子の無傷可変領域にスプライシング されている関心のあるポリペプチドのＮ末端（膜貫通領域は含まれない）細胞外 部分を含むタンパク質の発現および分泌を引き起こす（図１参照）。１以上のア ミノ酸が挿入または欠失されているが、標的リガンドに対する結合能を保有する 、この一般構造の変異体またはトランケート化体は、本発明に含まれる。 標準的なクローニング方法： ＴcＲおよびＭＨＣ分子、可溶性融合タンパク質、ならびにαおよびβポリペ プチドサブユニットよりなるハイブリッド融合タンパク質などの一体性膜タンパ ク質の二価ヘテロ二量体類縁体の結合部位に対応するアミノ酸配列をコードする ＤＮＡ配列をクローニングし発現させるための技術、例えば、オリゴヌクレオチ ドの合成、ＰＣＲ、細胞の形質転換、ベクターの構築、発現系などは、十分に確 立されており、当業者は、特定の条件および方法のための標準的な原材料を熟知 している。 一般に、種々の発現系が当該技術分野で公知である。原核生物は、変異体ＤＮ Ａ配列のクローニングに有用である。例えば、大腸菌（Ｅ.coli）株ＳＲ101(Ｍe ssing ら,Ｎucl Ａcids Ｒes 9(2):309-321(1981))、大腸菌（Ｅ.coli）Ｋ12株294(Ａ ＴＴＣ第31446号)、大腸菌（Ｅ.coli）Ｂ、ＵＭ101および大腸菌（Ｅ.coli）χ1 776（ＡＴＴＣ第31537号）が特に有用である。発現のためには、意図される宿主 細胞に適合しうる種に由来するプロモーターと制御配列とを含有するベクター中 に、構築物を挿入する。ベクターは、通常(しかし、必ずしも必要ななわけでは ない)、複製部位と、形質転換細胞において表現型の選択を可能にする１以上の マーカー配列とを保持する。例えば、大腸菌（Ｅ.coli）は、典型的には、大腸 菌（Ｅ.coli）種に由来するプラスミドであるpＢＲ322の誘導体を用いて形質転 換される(Bolivarら，Ｇene 2:95(1977))。pＢＲ322は、アンピシリンおよびテ トラサイクリン耐性用の遺伝子を含有するため、形質転換細胞を同定するための 簡便な手段を提供する。また、pＢＲ322プラスミドまたは他の微生物プラスミド は、組換えＤＮＡ構築で一般に使用されるプロモーターおよび他の制御要素を含 有するか又は含有するように修飾されていなければならない。 原核性宿主と共に使用するのに適したプロモーターには、β−ラクタマーゼお よびラクトースプロモーター系(Ｃhangeら，Ｎature 275:615(1978); Ｇoeddel ら,Ｎature281:544(1979))、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp） プロモーター系(Ｇoeddelら，Ｎucl Ａcid Ｒes 8:4057(1980))、およびハイブ リッドプロモーター、例えばtacプロモーター(de Ｂoerら,Ｐroc Ｎatl Ａcad Ｓci ＵＳＡ80:21-25(1983))が含まれるが、これらに限定されるものではない。 他の機能的細菌プロモーターも適している。関心のあるＤＮＡ配列を当業者が作 動的に連結するのを可能にするリンカーまたはアダプターと称されるヌクレオチ ド配列は、一般に公知である(Ｓiebenlistら，Ｃell 20:269(1980))。また、細 菌系で用いるためのプロモーターは、シャイン・ダルガルノ配列を含有するであ ろう。 原核生物に加えて、酵母培養などの真核微生物が、クローニングまたは発現宿 主として有用である。特に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓaccharomyces cer evisiae）または一般のパン酵母が、一般に使用される(ただし、他の株も一般に 利用することができる)。サッカロミセス（Ｓaccharomyces）中での発現の ためには、例えば、プラスミドＹrp7を一般に使用する(Ｓtinchcombら，Ｎature 282:39(1979))。このプラスミドは、トリプトファン中での増殖能を欠く酵母の 突然変異株に関する選択マーカーを与えるtrp1遺伝子を既に含有する(ＡＴＴＣ 第44076号)。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrp1損傷の存在は、トリプトフ ァンの不存在下での増殖に関する選択の有効な手段を提供する。酵母宿主と共に 使用するのに適したプロモーター配列には、3−ホスホグリセリン酸キナーゼま たは他の解糖酵素（例えば、エノラーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ およびグルコキナーゼ）のプロモーターが含まれる。増殖条件により制御される 転写の追加的な利点を有する誘導プロモーターである他の酵母プロモーターとし ては、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ 2、酸ホスファターゼ、メタロチオ ネインのプロモーター領域が挙げられる。酵母発現において使用するのに適した ベクターおよびプロモーターは、Ｒ．Ｈitzemanら欧州特許公開第73,657Ａ号に 更に詳しく記載されている。 哺乳動物宿主細胞中でのベクターからの転写を制御するためのプロモーターは 、種々の起源から、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス40(ＳＶ40)、アデノ ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（最も好ましくは、サイトメガロ ウイルス(ＣＭＶ)）などのウイルスのゲノムから、あるいは異種哺乳動物プロモ ーター（例えば、βアクチンプロモーター）から得ることができる。ＳＶ40ウイ ルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ40ウイルス複製起点をも含有するＳ Ｖ40制限酵素断片として簡便に得られる(Ｆiersら，Ｎature 273:113(1978))。 ヒトＣＭＶの前初期プロモーターは、ＨindIII Ｅ制限酵素断片として簡便に得 られる(Ｇreenawyら,Ｇene 18:3559-360(1982))。 高等真核生物中でのＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入す ることにより増強される。エンハンサーは、プロモターの転写開始能を増強する ように作用する通常は10〜300bpのシス作用性ＤＮＡ要素である。エンハンサー は、比較的に配向および位置に左右されず、転写単位の5'および3'側において、 イントロン中およびコード領域自体の中で見出されている。現在、多数のエ ンハンサー配列が哺乳動物遺伝子から公知である(例えば、グロビン、エラスタ ーゼ、アルブミンおよびインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウ イルスからのエンハンサーを使用することになろう。具体例には、複製起点の後 期側（bp100〜270）のＳＶ40エンハンサー、ＣＭＶ初期プロモーターエンハンサ ー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハ ンサーが含まれる。 また、真核性宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞 ）中で使用する発現ベクターは、mＲＮＡの発現に影響を及ぼす転写の終結に必 要な配列を含有していてもよい。これらの領域は、所望の配列をコードするmＲ ＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化セグメントとして転写される。可溶性構築 物をコードするＤＮＡを含有するクローンを、発現のための適当な宿主細胞中に トランスフェクトする。使用する宿主細胞に応じて、標準的な技術を用いてトラ ンスフェクションを行なう。哺乳動物細胞中へのトランスフェクションは、ＤＥ ＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、ＣaＰＯ₄共沈法、リポフェク ション、エレクトロポレーションまたはプロトプラスト融合により、また、当該 技術分野で公知のその他の方法、例えば、リゾチーム融合または直接取込み、浸 透圧またはショ糖ショック、直接微量注入、間接微量注入、および／または細胞 に電流を付すことなど（これらに限定されるものではない）により行なう。 本発明のペプチド、タンパク質または分子を、放射能標識(例えば、³²Ｐ)、蛍 光標識、酵素、基質、固体マトリックス、担体（例えば、ビオチンまたはアビジ ン）など（これらに限定されるものではない）のレポーター基に結合させて、本 発明の分子の特異的レベルまたは本発明の特定の分子の特異的結合の検出におい て使用することができる。本発明のハイブリッド構築物をさらに修飾して、毒素 を含むようにすることができる。 本発明の二価および多価ヘテロ二量体化合物は、免疫系を調節する方法におい て、免疫調節剤として使用することができる。例えば、活性化または抑制されう る免疫調節作用には、以下の免疫応答を刺激、抑制または阻害する能力が含まれ る：赤血球系前駆体の産生、Ｔ細胞の増殖、造血産生、Ｂ細胞の活性化、クラス スイッチング（例えば、ＩgＥスイッチ）、好酸球の成長および分化、Ｔ細胞お よびＢ細胞の成長および分化、急性期反応、Ｂ前駆細胞およびＴ前駆細胞の成長 、マスト細胞活性、造血におけるＩＬ-3およびＩＬ-4の関与、サイトカインの活 性化または抑制；髄性単球系列の分化；癌細胞の成長および発生；マクロファー ジの活性化、ＭＨＣ発現、抗ウイルス活性、Ｔ細胞応答、炎症、抗炎症、内皮活 性化、Ｂ細胞活性化、アポトーシス、カルシウム非依存性細胞傷害；好中球、Ｔ 細胞、好酸球およびマクロファージの走化性活性、発熱、細胞（マクロファージ 、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、好酸球、ナチュラルキラー細胞）の機能、抗原提示 、細胞傷害、および受容体架橋。本質的には、本発明のハイブリッド構築物は、 特異的Ｔ細胞サブセットの細胞活性化、増殖、アネルギー（寛容）または欠失を 選択的に増強、軽減または阻害する(Ｈewittら，Ｊ．Ｅxp．Ｍed．175:1493(199 2); Ｃhoiら,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.86:8941(1989); Ｋapplerら,Ｓcience 24 4:811(1989); Ｍinasiら,Ｊ.Ｅxp.Ｍed.177:1451(1993); Ｓundstedtら，Ｉmmno logy 82:117(1994);およびＷhiteら,Ｃell 56:27(1989))。 さらに、本発明の化合物は、免疫不全に関連した疾患の治療に使用することも できる。免疫応答の活性化または抑制から利益が得られると考えられる状態には 、以下の障害および疾患が含まれるが、それらに限定されるものではない：自己 免疫疾患、例えば特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、重症筋 無力症、関節炎、自己免疫溶血、糸球体腎炎、多発性硬化症、乾癬、若年型糖尿 病、原発性特発性粘液水腫、全身性エリテマトーデス、自己免疫喘息、強皮症、 慢性肝炎、アジソン病、性機能不全症、悪性貧血、白斑、円形脱毛症、コエリア ック病(Ｃoelia disease)、特発性血小板紫斑病(idiopathic thrombocytic purp ura)、後天性シュペニック萎縮症(acquired spenic atrophy)、特発性尿崩症、 抗精子（antispermatazoan）抗体による不妊症、急性難聴、感覚ニューロン性（ sensoneural）難聴、多発性筋炎、自己免疫脱髄疾患、横断（traverse）脊髄炎 、失調性硬化症、全身性進行性硬化症、皮膚筋炎、結節性多発性動脈炎、溶血 性貧血、糸球体腎炎、特発性顔面神経麻痺、尋常性天疱瘡、クリオグロブリン血 症、およびエイズ、エプスタイン・バーウイルス関連疾患、例えばシェーグレン 症候群、慢性関節リウマチ、バーキット・リンパ腫、ホジキン病、ウイルス（エ イズまたはＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫、慢性疲労症候群、寄生虫症、例えばリ ーシュマニア症、および免疫抑制疾患状態、例えば同種移殖後のウイルス感染症 またはエイズ、癌、慢性活動性肝炎糖尿病、毒素ショック症候群、食中毒、およ び移殖拒絶反応。 本発明のベクター構築物は、キメラヘテロ二量体分子の各メンバーの分泌のた めのシグナル配列を取込むため、本発明の治療方法を、遺伝子治療用に設計され たポリヌクレオチドまたはベクターで実施することも可能である。該ポリヌクレ オチドは、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよい。該ポリヌクレオチドがＤ ＮＡの場合、そのＤＮＡ配列は、それ自体は非複製型であるが複製プラスミドベ クター中に挿入されるものであってもよい。該ポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲ ノム中に組込まれないように操作することができる。あるいは、該ポリペプチド の発現を制御しうるのであれば、該ポリヌクレオチドを、染色体中への組込みの ために操作することができる。インビボでの適用可能性を有するそのような調節 可能な遺伝子発現系は、当該技術分野で公知であり、本発明で使用することがで きる。例えば、トランスフェクトされた細胞の選択的な殺傷は、ＨＳＶチミジン キナーゼなどの細胞傷害性ペプチドをコードする遺伝子配列を該ポリヌクレオチ ドまたはベクター中に含ませることにより達成されうる(Ｂorrelliら,Ｐroc.Ｎa t.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 85:7572，1988)。患者をガンシクロビルにさらすと、チミ ジンキナーゼ遺伝子は、トランスフェクトされた細胞の自殺遺伝子として作用す る。したがって、本発明のコードされるペプチドの発現が高すぎる場合には、該 ペプチドを発現する細胞の割合を減少させるために、ガンシクロビルを投与する ことができる。 本発明の組成物、より詳しくは、αおよびβ多型性一体性膜ポリペプチド（こ れらは互いに結合して、免疫認識に関与する機能単位を形成する）を含有する異 なるクラスのヘテロ二量体膜貫通タンパク質またはそれをコードするポリヌクレ オチドを、適当な医薬上許容される担体または希釈剤（例えば、循環系内で可溶 性であり生理的に許容される高分子が挙げられる;この場合の生理的な許容性は 、当業者が、治療計画の一部として、前記担体を患者体内に注射することを、当 業者が許容することを意味する）で医薬組成物に製することができる。担体は、 好ましくは、循環系内で比較的に安定であり、許容されるクリアランス血漿半減 期を有する。適当な担体には、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液または懸濁 液（塩類液および緩衝化媒体を含む）、および血清アルブミン、ヘパリン、免疫 グロブリンなどのタンパク質、ポリエチレングリコールまたはポリオキシエチル 化ポリオール、または、例えばポリエチレングリロールで誘導体化することによ り、抗原性を低下させるように修飾されたタンパク質などの重合体が含まれるが 、これらに限定されるものではない。適当な担体は、当該技術分野でよく知られ ており、例えば、米国特許第4,745,180号、第4,766,106号および第4,847,325号 ならびにそれらに引用されている参照文献に記載されている。適宜、医薬組成物 を、固体、半固体、液体または気体形態を含む（これらに限定されるものではな い）製剤（例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注 射剤、吸入剤およびエアゾール剤）に、それらの各々の投与経路のための通常の 方法で製剤化することができる。当該技術分野で公知の方法を用いて、該組成物 が標的器官に到達するまでその放出または吸収を妨げたり、あるいは該組成物の 徐放性を確保することができる。本発明の組成物の効果を損なわない医薬上許容 される形態を使用すべきである。医薬剤形においては、該組成物を単独で、また は医薬的に活性な他の化合物との混合物および組合せとして使用することができ る。例えば、本発明の可溶性構築物、より詳しくは、αおよびα／β一体性膜ポ リペプチド（これらは互いに結合して、免疫認識に関与する機能単位を形成する ）を含有する異なるクラスのヘテロ二量体膜貫通タンパク質の運搬に、本発明の 方法を適用する場合には、そのような運搬を、例えば伝染病、自己免疫状態、癌 の治療の他の手段と共に使用することができる。本発明の化合物は、単独で、ま たは他 の診断剤、治療剤または添加剤と共に投与することができる。治療剤には、ＩＬ -2、α−インターフェロンおよびインターフェロン−γなどのサイトカインまた はリンホカインを含めることができる。 したがって、本発明の医薬組成物は、ある特定の効果を得るために種々の経路 により動物体内の種々の部位に運搬することができる。局所性および全身性運搬 は、体腔内への製剤の適用または点滴投与、エアゾールの吸入または通気により 、あるいは筋肉内、静脈内、腹膜、皮下、皮内および局所投与を含む非経口的導 入により行なうことができる。 本発明の組成物は、各投与単位（例えば、茶匙量（teaspoon）、錠剤、液剤ま たは坐剤）が、予め決められた量の該組成物を単独でまたは、医薬的に活性な他 の物質との適当な組合せとして含有する単位投与形で提供することができる。「 単位投与形」なる語は、ヒトおよび動物対象に対する単位投与に適した物理的に 分離した単位を意味し、その各単位は、予め決められた量の本発明組成物を、単 独で又は所望の効果を得るのに十分な量として算出された他の活性物質と共に、 適宜、医薬上許容される希釈剤、担体（例えば、塩類溶液、緩衝溶液または他の 生理水溶液などの液体担体）またはビヒクルと共に含有する。本発明の新規単位 投与形の仕様は、達成される個々の効果および個々の宿主における医薬組成物に 関連した個々の薬力学に左右される。 さらに、本発明は特に、本発明の可溶性構築物を宿主へ投与する方法であって 、前記投与経路のいずれか、あるいは個々の適用に適した当業者に公知の別の経 路を用いて本発明の組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。該組成 物の「有効量」は、当業者に公知のいくつかの終点を用いてモニターすることが できる宿主中での所望の効果を与える量である。例えば、１つの所望の効果は、 宿主細胞への有効な核酸の導入を含むであろう。そのような導入は、治療効果、 例えば、治療する疾患に関連した或る症状の軽減、あるいは導入遺伝子または宿 主内の遺伝子の発現のさらなる証拠に関して、例えば、宿主内の核酸を検出する ためのＰＣＲ、ノーザンまたはサザンハイブリダイゼーション法または転写アッ セ イを用いて、あるいは導入された核酸にコードされるタンパク質もしくはポリペ プチド、またはそのような導入による衝撃レベル（impacted level）もしくは機 能を検出するための免疫ブロット分析、抗体媒介検出または実施例に記載の特定 のアッセイを用いて、モニターすることができるであろう。記載されているこれ らの方法は、決して包括的なものではなく、特定の適用に適したさらに別の方法 が当業者には明らかであろう。 ある特定の治療方法で使用する二価および多価ヘテロ二量体化合物の個々の投 与量は、治療する状態、その標的に対する個々の試薬の結合アフィニティー、疾 患の進行の程度などによって異なるであろう。しかしながら、投与量は、一般に は、１日当たり１pg/kg〜100mg/kg体重の範囲内となろう。該医薬組成物中の有 効成分が核酸である場合には、投与量は、一般には、１nＭ/kg〜50μＭ/kg体重 の範囲となろう。本明細書に記載の実施例で使用する組成物中に含まれる各有効 物質の量は、インビトロまたはインビボで実施するために本発明の方法を最適化 する際に、実施者が使用する各成分の範囲の一般的な指標となる。さらに、その ような範囲は、ある特定の適用で認められるとおり、それより多量または少量の 成分の使用を決して除外するものではない。例えば、実際の用量および計画は、 該組成物を他の医薬組成物と組合せて投与するか否かによって、あるいは薬物動 態、薬物の性質および代謝における個々の相違によって異なるかもしれない。同 様に、インビトロの適用における量は、使用する個々の細胞系によって、例えば 、使用するプラスミドがその細胞系内で複製する能力によって異なるかもしれな い。さらに、単位細胞または治療当たりに加える核酸の量は、核酸の長さおよび 安定性ならびに該配列の性質によっておそらく異なり、それは、特に、経験的に 決定しなければならないパラメーターであり、本発明の方法に固有でない要因（ 例えば、合成に関連した経費）に応じて変化する可能性がある。当業者であれば 、個々の状況の必要性に応じて必要となるいずれの調整をも容易に行なうことが できるであろう。 以下の実施例は、現在考えられる本発明の最良の実施の形態を単に例示するも のであり、本発明を限定するとみなされるべきではない。 〔実施例〕 細胞および培養条件： ＲＭＡ-Ｓ、ＲＭＡ-Ｓ Ｌ^d、Ｔ2、Ｔ2 Ｋ^b、Ｔ2 Ｋbm3、Ｔ2 Ｋ^bm11およびＲ ＥＮＣＡ細胞を、2mＭグルタミン、非必須アミノ酸、50 5g/mlのゲンタマイシン 、5×10-5Ｍ2−メルカプトエタノールおよび10％ウシ胎児血清で補足されたＲＰ ＭＩ-1640中、毎週３回、1：10継代で維持した。 可溶性2Ｃ ＴcＲ類縁体の発現： 可溶性二価2Ｃ ＴcＲ／Ｉg構築、発現、精製および特徴づけの詳細な点は、他 の文献に記載されているとおりに行なった(Ｏ'Ｈerrinら，準備中の原稿)。簡単 に説明すると、可溶性二価2Ｃ ＴcＲを製造するためには、2Ｃ ＴcＲαおよびβ 鎖をコードするcＤＮＡを、６アミノ酸のグリシン／セリンスペーサーを介して 、それぞれＩgＧ1重鎖およびκ軽鎖をコードするcＤＮＡに遺伝的に連結した(タ ンパク質の概要に関しては図１を参照されたい)。既に記載されているとおりに( Ｃorrら,Ｓcience 265:946-949 1994)、可溶性一価2Ｃ ＴcＲを製造し、精製し た。 細胞のペプチドローディング： ＲＭＡ-ＳおよびＴ2細胞系は、抗原提示の点で欠損しており、機能的に空のク ラスＩ ＭＨＣをそれらの細胞表面上に発現する(Ｓpiesら，Ｎature 355:644-64 6(1992); Ｔownsendら,Ｎature 340:443-448(1989))。これらの空のＭＨＣ分子 は、記載されているとおり(Ｃatipovicら，Ｊournal of Ｅxperimental Ｍedici ne 176:1611-1618(1992); Ｔownsendら,(1989)前掲)、ペプチドでローディング することができる。簡単に説明すると、細胞（ＲＭＡ-Ｓ、ＲＭＡ-ＳＬ^d、Ｔ2、 Ｔ2Ｌ^b、Ｔ2Ｋb、Ｔ2 Ｋbm3またはＴ2 k^bm11）を、27℃で一晩培養した。ついで 、種々の抗原ペプチド（100 5Ｍの最終濃度）の存在下または不存在下、細胞を2 7Ｃで更に1.5時間、ついで37℃で１時間インキュベートした。 ＲＥＮＣＡ細胞を、ペプチド（100 5Ｍの最終濃度）と共に37℃で２時間以上 イ ンキュベートすることにより、ペプチドでローディングした。ついで、記載され ているとおりに、細胞を収穫し、ＦＡＣＳ用に加工した。 Ｈ-2Ｌ^dに対する可溶性2Ｃ ＴcＲのアフィニティーの測定： ペプチドでローディングされた細胞に対する可溶性2Ｃ ＴcＲ類縁体のアフィ ニティーを、既に記載されているのと同様にして(Ｓchlueterら，Ｊournal of Ｍolecular Ｂiology 256:859-869(1996))、ＦＩＴＣ-30.5.7 Ｆabとの競合アッ セイで測定した。30.5.7は、Ｈ-2Ｌ^dのペプチド露出面付近のエピトープを認識 するモノクローナル抗体である。したがって、30.5.7と2Ｃ ＴcＲとは、Ｈ-2Ｌ^d のペプチド露出面に対する結合に関して競合する。ペプチドでローディングされ たＲＭＡ-ＳＬ^d細胞に対する30.5.7 ＦabのＫdを、以下のとおりに測定した。細 胞（0.3×10⁶/0ml）を、前記のとおり、ペプチドでローディングした。ついで、 ペプチドでローディングした細胞または対照細胞を、種々の濃度のＦＩＴＣ-30. 5.7 Ｆabと共に４℃で１時間インキュベートし、ついで、フローサイトメトリー による分析の直前に、ＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ、1％ＦＣＳ、0.02％ＮaＮ₃ ）で１：６に希釈した。Ｋdは、1／(平均チャンネル蛍光)対1／[ＦＩＴＣ-30.5. 7 Ｆab]のプロットから推定した。 2Ｃ ＴcＲ類縁体のアフィニティーは、一定濃度のＦＩＴＣ-30.5.7 Ｆabの競 合により測定した。細胞をペプチドでローディングし、ついで一定濃度のＦＩＴ Ｃ-30.5.7 Ｆabおよび種々の濃度の2Ｃ ＴcＲ類縁体と共に４℃で１時間インキ ュベートした。フローサイトメトリーによる分析の直前に、細胞をＦＡＣＳ洗浄 緩衝液で１：６で希釈した。ＦＩＴＣ-30.5.7 Ｆab結合の最大阻害を、30.5.7 m Ａb（75mg）の存在下でのインキュベーションにより測定した。1／(最大阻害の 割合(％))対［2Ｃ ＴＣＲ類縁体］のプロットから、Ｋappを求めた。ペプチドで ローディングした細胞に対するＦＩＴＣ-30.5.7 Ｆabのアフィニティーに関して 、式Ｋd，ＴcＲ＝Ｋapp／(1＋([ＦＩＴＣ 30.5.7 Ｆab]／Ｋd，30.5.7))に従い( Ｓchlueterら，(1996)前掲)、Ｋappを補正した。 直接フローマイクロフルオリメトリー（Ｄirect Ｆlow Ｍicrofluorimetry） ： ペプチドでローディングされた又は対照の細胞（約3×10⁵個）を、30〜50mlの 容量中の〜50mg/ml mＡb 30.5.7培養上清、50mlの2Ｃ ＴcＲ／Ｉg培養上清(105g /mlの最終濃度)、または25〜50mg/mlの精製された2Ｃ ＴcＲ／Ｉg（30mlの容量 中）と共に４℃で60分間インキュベートした。細胞を、1×ＰＢＳ、1％ＦＢＳ、 0.02％Ｎa−アジド（ＦＡＣＳ洗浄緩衝液）中で１回洗浄し、ついで20 5lの1/20 希釈のヤギ抗マウスＩgＧ-ＲＰＥ（Ｓouthern Biotechnology Ａssociates、Ｉn c.）中、４℃で更に60分間インキュベートした。ついで細胞をＦＡＣＳ洗浄緩衝 液で１回洗浄し、250ulのＦＡＣＳ洗浄緩衝液に懸濁し、Ｂecton Ｄickinson Ｆ ＡＣＳcanフローサイトメーター上で分析した。 ＣＴＬアッセイ（ＣＴＬの生成） 2Ｃ ＴcＲトランスジェニックマウス（Ｓhaら，Ｎature 336:73-76(1988)）か らの脾細胞を、1.25×10⁶/mlで懸濁し、既に3,000 cＧy照射に曝露されている1. 75×10⁶/mlのＢＡＬＢ/c脾細胞で刺激した。７日目に、2Ｃ Ｔ細胞に富む培養を 、5×10⁵/mlにて、2.5×10⁶/mlのＢＡＬＢ/c脾細胞で再刺激した。この上で実験 を行ない、ついで４日目に刺激を行なった。後のすべての刺激は、3.75×10⁵/ml の2Ｃ脾細胞および2.5×10⁶/mlのＢＡＬＢ/c細胞でＩＬ-2（5Ｕ/ml）の存在下に て行なった。 アッセイは、確立されたＣＴＬプロトロールに従い、３回繰返して行なった。 簡単に説明すると、標的細胞（2〜4×10⁶個）を、100 5Ｃiの⁵¹[Ｃr]と共に37℃ で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、細胞をＶ型底の96ウェルプレー ト（3×10³/100 5l）に加え、示されている濃度のペプチドと共にインキュベー ト（25℃で1.5時間）した。2Ｃ Ｔ細胞（3×10⁴/100 5l）を標的細胞に加え、プ ブレートを37℃で4.5時間インキュベートした。標的を５％ Ｔriton Ｘ100と共 にインキュベートすることにより、最大遊離を得た。[(実験的遊離−自発的遊離 )／(最大遊離−自発的遊離)]×100を用いて、相対溶解（％）を生データから計 算した。キメラ分子の一般的な構築および生化学的特徴づけ 免疫グロブリンをバックボーンとして使用して、ヘテロ二量体膜貫通タンパク 質の可溶性組換え二価類縁体の発現のための一般的な系を設計した(図1Ｂ〜Ｄお よび図2)。図２に示すとおり、部位特異的突然変異誘発を用いて、制限酵素部位 （例えば、ＫpnＩおよびＨindIII）を、それぞれＩgの重鎖および軽鎖の5'領域 中に挿入した。該酵素部位を、無傷可変ドメインをコードする成熟タンパク質の 開始前のリーダー配列の直後に導入した。この方法により、キメラポリペプチド の発現のための遺伝系が得られ、これを、２個の異なるクラスのヘテロ二量体タ ンパク質の可溶性二価類縁体の構築のための基礎分子として使用した、αおよび β多型性一体性膜ポリペプチド（これらは互いに結合して、免疫認識に関与する 機能単位を形成する）を含有する異なるクラスのヘテロ二量体膜貫通タンパク質 には、Ｔ細胞受容体、クラスII ＭＨＣ分子、インテグリン、サイトカイン受容 体などのタンパク質が含まれるが、これらに限定されるものではない。 複数工程の構築により、αおよびβポリペプチドをＩgの重鎖および軽鎖に遺 伝的に融合させて、キメラＩgＧ分子を得た。キメラ融合相手は、マウスＩgＧ1 アルソン酸特異的重鎖93Ｇ7およびκ軽鎖91Ａ3をコードするcＤＮＡよりなるも のであった(Ｈasemanら，Ｐroc Ｎatl Ａcad Ｓci ＵＳＡ 87:3942-3946(1990)) 。これらのどちらのＩgポリペプチドも発現されており、バキュロウイルス感染 細胞中で無傷可溶性ＩgＧ1分子を産生する。成熟タンパク質の開始部位の１つの アミノ酸残基Ａspの位置の直前に5'ＨindIII部位とリンカーとを導入することに より、軽鎖クローン91Ａ3をコードするcＤＮＡを修飾した。成熟κポリペプチド 中の停止コドンの後に、ＫpnＩ制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を導入した。成 熟タンパク質の開始部位に位置するアミノ酸残基Ｇluの位置の5'側の直前にＫpn Ｉ制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を、そして成熟ＩgＧ1タンパク質中の停止コ ドンの3'側にＳpＨＩ制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を導入することにより、9 3Ｇ7クローンをコードするcＤＮＡを修飾した。実施例１：可溶性二価クラスII ＭＨＣ分子およびＴ細胞受容体の構築および発 現 可溶性ヘテロ二量体一体性タンパク質（例えば、可溶性二価クラスII ＭＨＣ 分子およびＴ細胞受容体(ＴcＲ)）の構築および発現において生じた問題点は、 αおよびβ鎖ポリペプチドを免疫グロブリン重鎖および軽鎖に連結することによ り克服した(図１および２)。該可溶性二価ＴcＲを使用して得られたデータは、 可溶性タンパク質がペプチド／ＭＨＣ複合体に対する高アフィニティーリガンド であることを示している。ＴcＲの原理および構築： 可溶性二価ＴcＲ類縁体を製造するために、2Ｃ ＴcＲを選択した。2Ｃは、十 分に特徴づけられている同種反応性のペプチド特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｃ ＴＬ）クローンである(Ｋranzら,Ｐroc Ｎatl Ａcad Ｓci ＵＳＡ81:573-577(19 84))。このクローンは、マウスクラスＩ分子Ｈ-2Ｌ^dが結合したα−ケトグルタ ル酸デヒドロゲナーゼに由来する天然にプロセシングされた内因性ペプチドに特 異的である(Ｕdakaら，Ｃell 69:989-998(1992))。p2Ｃaと称される元の2Ｃ反応 性ペプチドは、８アミノ酸残基であることが確認されている。より高いアフィニ ティーおよびより低いアフィニティーの両方の、2Ｃ細胞と反応性のp2Ｃ変異体 が、特徴づけられている（Ｓykulev,Ｉmmutity,前掲;Ｓykulevら,Ｐroc Ｎatl Ａcad Ｓci ＵＳＡ91:11487-11491(1994)）(表３を参照されたい)。 また、2Ｃ ＴcＲに特異的なクロノタイプモノクローナル抗体1Ｂ2が開発され ている(Ｋranz,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 81:573-577(1984))。2Ｃ特異性 を付与するＴcＲが既にクローニングされており、2Ｃ ＴcＲを発現するトランス ジェニックマウスも誘導されている(Ｓhaら,Ｎature 336:73-76(1988);Ｓhaら, Ｎature335:271-274(1988))。前記の先行技術は、2Ｃ ＴcＲを優れた研究モデル とするものである。 可溶性二価ＴcＲを製造するために、ＴcＲのＴcＲαおよびβ鎖をコードするc ＤＮＡを、それぞれ、ＩgＧ1重鎖およびκ軽鎖をコードするcＤＮＡに遺伝的に 連結した。部位特異的突然変異誘発を用いて、リーダー配列の前の5'領域中、お よび膜貫通ドメインをコードする領域の直前のＴcＲαおよびβ遺伝子の3'領域 中に、制限エンドヌクレアーゼ酵素部位を導入した(タンパク質の概要に関して は、図1Ｂ-Ｄを、発現ベクターに関しては図２を、突然変異の誘導に使用したオ リゴヌクレオチドに関しては３を参照されたい)。ＴcＲαおよびβ cＤＮＡの3' 領域中に導入した部位は、それぞれ、免疫グロブリン（Ｉg）重鎖および軽鎖cＤ ＮＡ中に導入した部位と適合しうるものであった。発現のために、バキュロウイ ルス発現ベクターpＡcＵＷ51の修飾体および他のバキュロウイルス発現系中に該 構築物をクローニングした(Ｋozonoら，Ｎature 369:151-154(1994))。この発現 ベクターは、２個の分離したウイルスプロモーター（多面体およびＰ10）を有し 、単一のウイルス感染細胞中での２個のポリペプチドの発現を可能にする。 2Ｃ ＴcＲαポリペプチドの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの境界部位の Ｇln残基の直ぐ3'側に、リンカーとＫpnＩ制限酵素エンドヌクレアーゼ部位とを 導入することにより、2Ｃ ＴcＲα鎖を修飾した。該遺伝子の5'領域は、適当な 制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を既に発現し、追加的な修飾は不要であった。 2Ｃ ＴcＲβ鎖のシグナル配列の出発位置の5'側にＸho1部位を、そして2Ｃ Ｔ cＲβポリペプチドの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの境界部位のＩle残基 の直ぐ3'側にＨindIII制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を導入することにより、 2Ｃ ＴcＲβ鎖を修飾した。クラスII ＭＨＣの原理および構築： クラスII ＭＨＣ分子を研究するために、十分に特徴づけられたマウスＩ-Ｅ^k 分子をモデル抗原として選択した。選択することができると考えられた他のクラ スII分子には、マウスＩ-Ａ分子ならびにヒトＨＬＡ-ＤＲ、ＤＰおよびＤＱ分子 が含まれる。マウスＩ-Ｅ^kは、モデルクラスII抗原蛾シトクロムＣ（ＭＣＣ）に 関する公知制限要素である。関連ＴcＲおよびクラスII ＭＨＦＣ／ペプチド複合 体の可溶性一価形態は、既に作製されている(Ｗettseinら,ＪＥxp Ｍed 174:219 -228(1991);Ｌinら,Ｓcience 249:251(1990))。この複合体に対するＴ細胞応答 は十分に特徴づけられており(Ｊorgensenら,Ｎature 355:224(1992))、ＭＣＣ/ Ｉ-Ｅ^k複合体に 対する特異的Ｔ細胞クローンのアフィニティーが測定されている(Ｍatsui,Ｐroc .Ｎatl.Ａcad.Ｓci.91:12862-12866(1994))。また、ＭＣＣに共有結合したマウ スＩ-Ｅ^kの遺伝的に操作された可溶性形態は、ＭＣＣ特異的Ｔ細胞を刺激するこ とが示されている(Ｋozono，前掲)。したがって、この十分に特徴づけられたＭ ＨＣ系をモデルとして使用して、Ｔ細胞反応性に対する二価クラスII ＭＨＣの 影響を調べた。 可溶性二価クラスII ＭＨＣ分子の発現のために、Ｉ-Ｅ^k _β鎖をコードするcＤ ＮＡを、ＩgＧ重鎖をコードするcＤＮＡに遺伝的に連結した。Ｉ-Ｅ_α鎖をコー ドするcＤＮＡを、κ軽鎖をコードするcＤＮＡに連結した。該β鎖の5'アミノ末 端を、ＭＣＣ（81-101）(Ｋozono，前掲)由来のＩ-Ｅ^k制限抗原ペプチドに、ト ロンビン切断部位を介して予め遺伝的に連結した。部位特異的突然変異誘発を用 いて、膜貫通ドメインをコードする領域の直前のＩ-Ｅ^k _β鎖の3'領域中にＫpnＩ 制限酵素エンドヌクレアーゼ酵素部位を導入した。膜貫通ドメインの直前にＨin dIII制限酵素エンドヌクレアーゼを導入することにより、Ｉ-Ｅ_α鎖をコードす るcＤＮＡを修飾した。該遺伝子の5'Ｉ-Ｅ_αおよびＩ-Ｅ_β領域は、追加的な修 飾が不要であった。一般的なリンカー領域の原理および構築： また、ＴcＲαおよびβならびにＩ-Ｅαおよびβポリペプチドの末端と成熟Ｉ gＧポリペプチドの出発位置との結合部に、６アミノ酸残基のリンカーを付加し た。Ｉgγ1ポリペプチドとの結合の場合には、該リンカーはＧly-Ｇly-Ｇly-Ｔh r-Ｓer-Ｇlyよりなる。Ｉgκポリペプチドとの結合の場合には、該リンカーはＧ ly-Ｓer-Ｌeu-Ｇly-Ｇly-Ｓerよりなる。前記突然変異のすべてを導入するのに 使用したオリゴヌクレオチドを、図３に記載する。 可溶性二価Ｔ細胞受容体類縁体を作製するのに使用した発現ベクターは、バキ ュロウイルス発現ベクターpＡcＵＷ51（Ｐharmingen，Ｃalifornia）に由来する ものであった。このベクターは、２個の分離したウイルスプロモーター（多角体 およびＰ10）を有し、同じ細胞中で両方のキメラポリペプチド鎖の発現を可能に する。該ベクター中への種々の遺伝子のクローニングを容易にするために、各 プロモーターの後にマルチプルクローニングサイトを予め導入した(Ｋozono，前 掲)。実施例２：可溶性ヘテロ二量体タンパク質の検出 前記の可溶性キメラＩg構築物をコードするトランスファーベクターを含有す るバキュロウイルスに感染した細胞は、感染4〜5日後に特異的ＥＬＩＳＡアッセ イにより検出される可溶性キメラＩg様分子を分泌する。2Ｃ ＴcＲ／ＩgＧの場 合、該アッセイは、マウスＩgＧ1 Ｆcに特異的な一次抗体（10μg/mlでプレーテ ィング）と、多数のＴcＲのβ鎖上で発現されるコンホメーション(conformation al)エピトープに特異的なビオチン化二次抗体Ｈ57（1:5000の最終希釈で使用）( 図5、パネルＡ)、または2Ｃ ＴcＲ上で発現されるクロノタイプエピトープに特 異的なビオチン化 1Ｂ2またはモノクローナル抗体（図5、パネルＢ）とに基づく ものであった。Ｉ-Ｅ/ＩgＧキメラ分子の検出には、同じ一次抗体を使用し、ビ オチン化二次抗体は、Ｉ-Ｅα鎖に特異的な14.4.4であった(図5、パネルＣ)。感 染細胞からの上清を室温で１時間インキュベートした。プレートをリン酸緩衝食 塩水で十分に洗浄し、ビオチン化二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし た。ついで該プレート洗浄し、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（1:10000希釈物 の100μl）(Ｓigma,Ｓt.Ｌouis,ＭＯ)と共に室温で１時間インキュベートし、洗 浄し、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンジヒドロクロリド（ＴＭＢ）基質で3 〜5分間展開した。2Ｃ ＴcＲ／ＩgおよびＩ-Ｅ/Ｉgトランスファーベクターを含 有するバキュロウイルスに感染した細胞からの上清を、野生型バキュロウイルス に感染した細胞からの対照上清と比較した。 図５に示すとおり、該キメラタンパク質はコンホメーション的には元のままで ある。可溶性二価2Ｃ ＴcＲ／Ｉgは、ほとんどのＴcＲβ鎖上で発現されるコン ホメーションエピトープに特異的なモノクローナル抗体であるＨ57に対して反応 性であり、また、2Ｃ ＴcＲに特異的な抗クロノタイプモノクローナル抗体決定 基である1Ｂ2に対して反応性である（図5Ａおよび5Ｂに示すとおり）。図5Ｃに 示すとおり、可溶性二価クラスII分子は、無傷Ｉ-Ｅ分子上で発現されるにすぎ ない天然α鎖決定基に特異的なコンホメーション依存的モノクローナル抗体（モ ノクローナル抗体14.4.4）に対して反応性である。前記のとおり、それは、免疫 グロブリン特異的ＥＬＩＳＡに対して反応性であり、それを使用して該キメラ分 子を精製することができる。また、プロテインＧまたはヒ酸（arsenate）−セフ ァロースアフィニティー精製カラム法を用いることができる(データは示してい ない)。 図６に示すとおり、精製された物質は、ＳＤＡ-ＰＡＧＥにより分析した場合 、予想された分子量を有する。キメラＴcＲ／Ｉgκは55,000の見掛け分子量（Ｍ Ｗ）を有し、キメラＴcＲα/Ｉgγ1は約89,000の見掛けＭＷを有する。キメラＩ -Ｅα/Ｉgκは約44,000のＭＷを有し、キメラＩ-Ｅβ/Ｉgγ1は約76,000の見掛 けＭＷを有する(図6)。実施例３：ペプチド／ＭＨＣ複合体との可溶性二価ＴＣＲ相互作用のアフィニテ ィー測定 ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する可溶性2Ｃ ＴcＲ／Ｉgのアフィニティーを測 定するために、競合阻害アッセイを開発した。このアッセイは、ペプチド／ＭＨ Ｃ複合体に対する可溶性一価2Ｃ ＴcＲのアフィニティーを測定するために既に 用いたアッセイと同様に(Ｓchlueterら,Ｊournal of Ｍolecular Ｂiology 256: 859-869(1996))、ＴＣＲ受容体結合と重複するＨ-2 Ｌdのa2ヘリックスの領域に 対するmＡb30.5.7の結合に基づくものである(Ｓolheimら,Ｊournal of Ｉmmunol ogy 154:1188-1197(1995); Ｓolheimら，Ｊournal of Ｉmmunology 150:800-811 (199:3))。簡単に説明すると、ＲＭＡ-Ｓ Ｌ^d細胞に対する30.5.7 Ｆab断片のア フィニティーは、フローサイトメトリーにより分析した細胞に対する30.5.7 Ｆa b結合の直接飽和分析により測定した。次第に増量するＦＩＴＣ標識30.5.7 Ｆab と共に細胞をインキュベートし、1／ＭＣＦ対1／[30.5.7 Ｆab]のプロットから Ｋdを推定した。「方法」に記載のとおり、ＲＭＡ-Ｓ Ｌd細胞に関して2Ｃ ＴＣ Ｒ類縁体を 一定量のＦＩＴＣ標識30.5.7 Ｆab断片と競合させることにより、2Ｃ ＴＣＲ類 縁体のアフィニティーを測定した。Ｋ_appは、(最大30.5.7 Ｆab結合の割合(％))^-1 対[2Ｃ ＴＣＲ類縁体]のプロットから計算した。式Ｋ_d.TCR＝Ｋ_app/(1+{30.5. 7 Ｆab}/Ｋ_d.30.5.7)（Ｓchlueterら，1996）に従い、ＲＭＡ-Ｓ Ｌ^d細胞に対す る30.5.7 Ｆabのアフィニティーに関してＫ_appを補正した。表２に報告されてい る値は、少なくとも３回繰返した１つの代表的な実験からのものである。Ｋ_dの 決定で使用した各データ点は、反復から得られた点の平均である。したがって、 可溶性ＴＣＲ類縁体のアフィニティーは、30.5.7結合のその阻害に関して測定し た。 可溶性2Ｃ ＴＣＲ類縁体のアフィニティーを測定するためには、まず、ペプチ ドでローディングされたＨ-2 Ｌd分子に対する30.5.7 Ｆab断片のＫdを測定しな ければならない。この測定値は、ＲＭＡ-Ｓ Ｌd細胞の表面上のＨ-2 Ｌd分子に 対する30.5.7-ＦＩＴＣ Ｆab結合の直接飽和分析により測定した。ＲＭＡ-Ｓ細 胞は、関心のある特異的ペプチドを容易にローディングすることができる空のＭ ＨＣ分子を発現するため、ＲＭＡ-Ｓ細胞を選択した(Ｃatipovicら,Ｊournal of Ｅxpermental Ｍedicine 176:1611-1618(1992); Ｔownsendら,Ｎature 340:443 -428(1989))。Ｈ-2 Ｌd分子に対する30.5.7のアフィニティーは、Ｈ-2 Ｌ^d中に ローディングされたペプチドに左右される(表２)。ＱＬ9でローディングされた Ｈ-2Ｌ^d分子に対する30.5.7のアフィニティーは12.2nＭであり、一方、p2Ｃa、p ＭＣＭＶおよびＳＬ9でローディングされたＨ-2Ｌ^d分子に対するアフィニティー は4.8〜6.4nＭの範囲である。ペプチドに依存する、アフィニティーのこれらの 小さな相違は、再現性があり、アフィニティーのばらつきは、競合結合アッセイ において説明された。これらの値は、同じペプチド／Ｈ-2Ｌ^d複合体に対する125 1-30.5.7 Ｆabの既に測定されているアフィニティー(8.8〜16nＭ)と良く一致す る(Ｓchlueterら,1996)。 2Ｃ ＴＣＲ／Ｉgは、ＱＬ9またはp2ＣaペプチドでローディングされたＨ-2Ｌ^d 分子に対する30.5.7 Ｆabの結合を阻害したが、pＭＣＭＶでローディングされた Ｈ-2Ｌ^d分子に対する30.5.7 Ｆabの結合は阻害しなかった(図７)。ＱＬ9でロー ディングされた分子に対する可溶性二価2Ｃ ＴＣＲ／Ｉgのアフィニティーは、1 3.3nＭ である(図７および表２)。予想どおり、p2Ｃaでローディングされた分子に対す る2Ｃ ＴＣＲ／Ｉgのアフィニティー(90nＭ)は、ＱＬ9でローディングされたＨ- 2Ｌ^dのアフィニティーより低い。ＳＬ9でローディングされた細胞では少量の競 合阻害が認められたが、ＳＬ9でローディングされた分子に対する可溶性二価2Ｃ ＴcＲ／Ｉgキメラのアフィニティーは非常に低いため、試験した条件下で正確 に測定することは不可能である(データは示していない)。 分析したすべての場合において、可溶性二価2Ｃ ＴＣＲ／Ｉgのアフィニティ ーは、対応リガンドに対する可溶性一価2Ｃ ＴＣＲのアフィニティーより有意に 高かった(図７および表２)。可溶性二価2Ｃ ＴＣＲ／Ｉgのアフィニティーは、 ＱＬ9でローディングされたＨ-2Ｌ^dに対しては50倍、p2Ｃaでローティングされ たＨ-2Ｌ^d分子に対しては少なくとも20倍、同じペプチド／ＭＨＣ複合体に対す る可溶性一価2Ｃ ＴＣＲのアフィニティーより高かった(表２)。したがって、可 溶性2Ｃ ＴＣＲ／Ｉgキメラの二価の性質は、対応リガンドに対するＴＣＲ類縁 体のアフィニティーを有意に増加させた。本発明のキメラ分子がそれらの特異的 リガンドに対して示すアフィニティーが、一価分子で認められるアフィニティー と比べて増加したという知見は、予想外の結果であった。実際のところ、Ｃapon らに開示されているキメラＣＤ4-ＩgＧ分子は標的アフィニティーの増加を示し ておらず、このことは、本発明の組成物の価値および新規性を更に証明するもの である。 ¹ndc−30.5.7Ｆab断片との競合は検出できなかった。² 使用した2Ｃ-smＴＣＲの最高濃度で競合が検出されたが、Ｋdの正確な測定値を 決定することはできなかった。³ −測定せず。実施例４：ペプチドでローディングされたＨ-2Ｌd分子に対する可溶性二価ＴＣ Ｒキメラの結合特異性 ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する可溶性二価2Ｃ ＴcＲ／Ｉgのアフィニティー が比較的高いことに基づき、本発明者らは、これらの分子が、直接フローサイト メトリーに基づくアッセイによるペプチド／ＭＨＣ複合体の分析において有用で あろうと仮定した。2Ｃ ＴcＲ／Ｉgのペプチド特異性を研究するために、本発明 者らは、直接フローサイトメトリーアッセイにおいて、2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの反応性 を、Ｈ-2Ｌ^dに反応性のmＡbである30.5.7の反応性と比較した。特異的ペプチド （配列に関しては表３を参照されたい）を、ＲＭＡ-ＳＬ^d細胞上のＨ-2 Ｌd分子 中にローディングした。表２に挙げたペプチドは、可溶性二価2Ｃ ＴＣＲ／Ｉg の反応性の分析で使用したＨ-2Ｌ^dおよびＨ-2Ｋ^dに結合性の一群のペプチドであ る。細胞溶解性およびアフィニティーのデータは、それらの一次文献(Ｃorrら， 1994;Ｈuangら,196;Ｓolheimら,1993;Ｓykulevら,1994a;Ｓykulevら,1994b; Ｔa llquistら,1996; Ｕdakaら,1996; Ｖan ＢleekおよびＮathanson，1990)から要 約したもの である。 na−入手できず。 nd−検出せず。そのアフィニティーは、使用したアッセイの感度未満であった。 2Ｃ ＴcＲ／Ｉgに対するＲＭＡ-ＳＬ^dの温度依存的反応性は、mＡb 30.5.7に 対するＲＭＡ-ＳＬ^dの反応性と有意に異なっていた。予想どおり(Ｓolheimら,(1 995)前掲;Ｓolhe1mら,(1993)前掲)、ＲＭＡ-ＳＬ^d細胞は、37℃で培養された場 合より、27℃で培養された場合に、該細胞上のmＡb 30.5.7に認識される血清学 的により反応性のＨ-2 Ｌ^d分子を発現し(図8Ａ)、平均チャンネル蛍光（mean ch annel fluorescence）（ＦＣＳ）は約５倍増加した。このように、mＡb 30.5.7 に認識されるＨ-2 Ｌ^d分子上のエピトープは、細胞を低温でインキュベートする ことにより安定化することができる。これに対して、ＲＭＡ-Ｓ Ｌ^d細胞は、27 ℃または37℃のいずれかで培養された細胞上で2Ｃ ＴcＲ／Ｉgに認識される非常 に少量のＨ-2Ｌ^d分子を発現した(図８、パネルＥ)。この知見は、2Ｃ ＴcＲ／Ｉ g（これは、たとえ温度を低下させることによりコンホメーション上安定化させ たとしても、ローディングされていないＭＨＣを認識するはずがない）の予想さ れたペプチド依存的 反応性と一致する。 また、2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの反応性は、非常に高いペプチド特異性を示した。予想 どおり、Ｈ-2Ｌdに結合するすべてのペプチドは、mＡb 30.5.7に認識されるエピ トープの発現を安定化させた(図８、パネルＢ-Ｄおよび図９)。2Ｃ反応性ペプチ ドであるペプチドp2Ｃa、ＱＬ9およびＳＬ9でローディングされたＨ-2 Ｌ^d分子 のみが、2Ｃ ＴcＲ／Ｉgと反応するペプチド／Ｈ-2 Ｌ^dエピトープを発現した( 図８、パネルＦ-Ｈおよび図９)。ＭＣＦは、ローディングされていない細胞また は無関係なＨ-2 Ｌ^d結合性ペプチドでローディングされた細胞の場合の10から、 ペプチドＱＬ9でローティングされたＲＭＡ-Ｓ Ｌ^d細胞の場合の2200へと、約10 〜200倍増加した(図９)。反応性のパターンは、ペプチド／Ｈ-2 Ｌ^d複合体に対 する一価2Ｃ ＴcＲの公知アフィニティーと類似している(アフィニティーについ ては表３を参照されたい)。ペプチドＱＬ9、p2ＣaまたはＳＬ9でローディングさ れたＲＭＡ-Ｓ Ｌ^d細胞は、2Ｃ ＴcＲ／Ｉgで染色された場合には、それぞれ、2 200、550および100のＭＣＦ値を有していた。このように、可溶性二価2Ｃ ＴcＲ ／Ｉgキメラは、ＱＬ9/Ｈ-2 Ｌ^d複合体とは強力に反応し、p2Ｃa/Ｈ-2 Ｌ^d複合 体とは中等度に反応し、ＳＬ9/Ｈ-2 Ｌ^d複合体とは弱く反応した。ＳＬ9でロー ディングされたＨ-2 Ｌ^d分子に2Ｃ ＴcＲ／Ｉgが結合したという事実は、直接フ ローサイトメトリーにおいても、一価2Ｃ ＴcＲに対しては僅か71mＭのアフィニ ティーしか有さない特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体を検出するために可溶性二価 2Ｃ ＴcＲ／Ｉgキメラを使用しうることを示している。実施例５：可溶性二価2Ｃ ＴcＲ／Ｉg分子によるインビトロ2Ｃ Ｔ細胞媒介性溶 解の抑制 可溶性二価2Ｃ ＴcＲ／Ｉgは、2Ｃ反応性Ｔ細胞応答を阻止する。可溶性二価2 Ｃ ＴcＲ／Ｉgは、フローサイトメトリーアッセイにおいて、適当なペプチドで ローディングされたＨ-2 Ｌ^d分子と高いアビディティーで相互作用するため、該 試薬が2Ｃ Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害性ＣＴＬアッセイを有効に阻害するか否 かを調べ た。Ｈ-2 Ｌ^dを発現する腫瘍標的細胞を溶解するために2Ｃトランスジェニック マウス由来の細胞系を使用して、これを分析した。通常の４時間の⁵¹Ｃr細胞傷 害性アッセイにおいて、ＣＴＬを試験した。すべてのＣＴＬアッセイの標的とし て、トランスフェクトされていないＭＣ57Ｇと、Ｌ^dでトランスフェクトされた ＭＣ57Ｇ Ｌ^d細胞とを使用した。相対溶解(％)を、⁵¹Ｃr cpm(実験値)−ＣＰＭ( 自発的)／cpm(最大)−cpm(自発的)として求めた。標準誤差は、通常は5％未満で あり、自発的遊離は、通常、最大遊離の10〜15％であった。 トランスフェクトされていないＭＣ57Ｇと、Ｌ^dでトランスフェクトされたＭ Ｃ57Ｇ Ｌ^d細胞との両方を使用して、本発明者らは、2Ｃ ＣＴＬ系により媒介さ れるＨ-2Ｌ^d特異的溶解のウィンドウを確認することができた。2Ｃ ＴcＲ／Ｉg の影響を調べるために、標的細胞を2Ｃ ＴcＲ／ＩgまたはＩ-Ｅ^κ/Ｉgのいずれ かで前処理し、2Ｃトランスジェニックマウス由来のＣＴＬ細胞系による溶解に 関して分析した。細胞を2Ｃ ＴcＲ／Ｉgで処理した場合に分析したエフェクター 対標的細胞の各比率で、溶解の有意な抑制が認められた(図10参照)。Ｉ-Ｅ^κ/Ｉ gで処理された標的細胞では、ある程度の非特異的抑制が認められたが、2Ｃ Ｔc Ｒ／Ｉgで処理された標的細胞では、それより有意に高い抑制が認められた。 このアッセイにおける標的細胞は、それらの細胞表面ＭＨＣ分子に種々の異な る内因性ペプチドをローディングする正常な腫瘍細胞であった。これらの標的細 胞を使用する場合には、Ｈ-2 Ｌ^d分子にp2Ｃaペプチドを特にローディングする 必要がない。なぜなら、pＣcaまたはp2Ｃa様ペプチドおよび多数の無関係なペプ チドが、細胞ＭＨＣ分子上に内因的にローディングされるからである。ＣＴＬ媒 介性溶解の抑制は、可溶性二価2Ｃ ＴcＲ／Ｉgが、多数の無関係なペプチドの環 境内においても、関連ペプチドと有効に相互作用しうることを示している。した がって、関心のある特異的Ｔ細胞応答と関連のある複合体のみを同定するために ペプチド／ＭＨＣ複合体の領域（universe）を調べるために、このアプローチを 用いることが可能であろう。特に、ヘテロ二量体タンパク質のこれらの高いアビ ディティーの可溶性類縁体は、未知の腫瘍抗原および自己免疫抗原の同定に特 に有用かもしれない。実施例６：自己拘束されたペプチド／ＭＨＣ複合体に対する可溶性二価ＴＣＲキ メラの結合 また、認識ペプチド／Ｈ-2 Ｌ^dリガンドに加えて、2Ｃ ＣＴＬによる溶解のた めにＨ-2Ｋ^bまたはＨ-2Ｋ^bm3標的を感作する２つのペプチド（ＳＩＹおよびdＥ Ｖ-8）を特徴づけた(配列については表３を参照されたい)。これらの代替的2Ｃ 反応性複合体に対する2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの結合能を分析するために、ペプチドでロ ーディングされたトランスフェクトされたＴ2細胞に対する2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの結 合を調べた。Ｔ2細胞はヒト細胞系に由来するため、Ｔ2細胞は、ＲＭＡ-Ｓ細胞 のようには、Ｈ-２Ｋ^bを天然に発現しない。したがって、Ｔ2系は、親細胞系か らのＭＨＣの発現によって複雑になることがないため、ペプチドでローディング されたＨ-2 Ｌ^dまたは種々のＨ-2Ｋ^bm突然変異分子に対する2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの結 合を研究するために、Ｔ2系を選択した。ＲＭＡ-Ｓ Ｌ^d細胞と同様に、Ｔ2細胞 もまた、種々のペプチドを容易にローディングすることができる空のＭＨＣ分子 を発現する。これらの研究には、Ｈ-2 Ｋ^b、Ｔ2 Ｋ^b；Ｈ-2 Ｋ^bm3、Ｔ2 Ｋ^bm3； およびＨ-2 Ｋ^bm11、Ｔ2 Ｋ^bm11でトランスフェクトされペプチドでローディン グされたＴ2細胞（Ｔallquistら,Ｊournal of Ｉmmunology 155:2419-2426(1995 ); Ｔallquistら,Ｊournal of Ｅxperimental Ｍedicine 184:1017-1026(1996) ）を利用した。 ペプチドＳＩＹでローディングされたＴ2 Ｋ^bまたはＴ2 Ｋ^bm11細胞は共に、2 Ｃ ＴcＲ／Ｉgに認識されるエピトープを発現した(図11Ａ,Ｃ)。2Ｃ ＴcＲ／Ｉg と共にインキュベートした細胞のＭＣＦは、pＶＳＶでローディングされたＴ2 Ｋ^bの場合の14から、ＳＩＹをローディングされたＴ2 Ｋ^bの場合の276へ、また 、pＶＳＶでローディングされたＴ2 Ｋ^bm11の場合の16から、ＳＩＹでローディ ングされたＴ2 Ｋ^bm11の場合の250へ、約20倍増加した。ＳＩＹでローディング されたＴ2 Ｋ^bm3細胞は、それよりはるかに弱いが、それでも有意な、2Ｃ ＴcＲ ／Ｉgとの相互作用を示した(図11B)。ＳＩＹでローディングされたＴ2 Ｋ^bm3細 胞（実線；ＭＣＦ,36）と、pＶＳＶ でローディングされたＴ2 Ｋ^bm3細胞（点線；ＭＣＦ,12）とを比較されたい。Ｓ ＩＹ／ＭＨＣ複合体に対する2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの結合のデータは、種々のＳＩＹ／ ＭＨＣ標的上の2Ｃ ＣＴＬ媒介性溶解と一致した(図12)。2Ｃ ＣＴＬは、ＳＩＹ でローディングされたＴ2 Ｋ^bまたはＴ2 Ｋ^bm11細胞の効率的な溶解を媒介した( 図12Bおよび示されていないデータ、ＳＩＹ／Ｔ2 Ｋ^bについてはＬＤ50〜10ng/m l)。ＳＩＹでローディングされた Ｔ2 Ｋ^bm3細胞の2Ｃ ＣＴＬ媒介性溶解は、そ れにより有意に非効率的であった(図12Ｃ、ＬＤ50〜100ng/ml)。 dＥＶ-8でローディングされた細胞に対する2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの結合は、dＥＶ-8 ／ＭＨＣ複合体に対する2Ｃ ＴcＲ／Ｉgのアフィニティーと、その同じペプチド ／ＭＨＣ複合体が2Ｃ ＣＴＬによる溶解を媒介する能力との間の顕著な相違を明 らかにした。予想どおり、dＥＶ-8でローディングされたＴ2 Ｋb細胞は、2Ｃ Ｃ ＴＬにより溶解されず(図12B)、フローサイトメトリーアッセイにおいて2Ｃ Ｔc Ｒ／Ｉgに認識されなかった(図12Ａ)。興味深いことに、dＥＶ-8でローディング されたＴ2 Ｋ^bm3細胞に対する2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの有意な結合は認められなかった( 図12B)。dＥＶ-8または対照Ｈ-2 Ｋb結合性ペプチドpＶＳＶのいずれで細胞をロ ーディングするかにかかわらず、2Ｃ ＴcＲ／Ｉgで染色された細胞のＭＣＦは同 様のものとなった(図12；点線と破線とを比較されたい)。これまでの報告（Ｔal lquistら,(1996)前掲）と一致して、ｄＥＶ-8でローディングされたＴ2 Ｋ^bm3細 胞が2Ｃ ＣＴＬにより効率的に溶解された点で(図12Ｃ)、これは最も驚くべきこ とである。実際に、dＥＶ-8でローディングされたＴ2 Ｋ^bm3細胞（ＬＤ50〜0.5- 1.0ng/ml）は、ＳＩＹでローディングされたＴ2 Ｋ^bm3細胞（ＬＤ50〜100ng/ml ）（この場合には、2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの有意な結合が認められた(図12B)）より、 はるかに良好な標的細胞であった。dＥＶ-8でローディングされたＴ2 Ｋ^bm3細胞 の2Ｃ ＣＴＬによる溶解の効率は、p2ＣでローディングされたＴ2 Ｌ^d細胞（図1 2Ａ、ＬＤ50〜0.5ng/ml）（これは、2Ｃ ＴcＲ／Ｉg結合アッセイにおいても効 率的に認識された(図８)）と同程度であった。それほど有意に顕著ではないが同 様の、細胞溶解と2Ｃ ＴcＲ／Ｉg結合との間の相関性の欠如が、dＥＶ-8でロー ディングされたＴ2 Ｋ^bm11細胞に関して認められた。 dＥＶ-8でローディングされたＴ2 Ｋ^bm11細胞は、2Ｃ ＣＴＬのそれほど良好な 標的ではないが（Ｔallqistら,（1996）前掲）(データは示していない)、フロー サイトメトリーアッセイにおいて2Ｃ ＴcＲ／Ｉgに対して反応性ではなかった( 図11Ｃ)。実施例７：内因性2Ｃ特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体の発現に対するγ-ＩＦＮの 効果の分析 ペプチド／ＭＨＣ複合体に対する2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの特異性およびアフィニティ ーは、この試薬が、内因性の細胞表面のペプチド／ＭＨＣ複合体に対するリンホ カインの影響を調べるのに使用可能であることを示唆した。この可能性を分析し 、異種ペプチド／ＭＨＣ環境内での内因性2Ｃ反応性ペプチド／Ｈ-2 Ｌ^d複合体 の発現を追跡するために、Ｈ-2 Ｌ^dを発現するマウス細胞系ＲＥＮＣＡに対する γ-ＩＦＮの影響を調べた。天然でローディングされるペプチド／ＭＨＣ複合体 のアップレギュレーションを誘導する種々の量のγ-ＩＦＮの存在下、ＲＥＮＣ Ａ細胞を培養した。ＲＥＮＣＡ細胞に対する2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの結合は、γ-ＩＦ Ｎ誘導の関数として増加した(図13Ａ-Ｄ、実線)。γ-ＩＦＮの効果は用量依存的 であり、最大で2〜3倍の増加が、10単位/mlのγ-ＩＦＮで処理した細胞上で認め られた。γ-ＩＦＮは、クラスＩの発現に直接的な影響を及ぼすことが知られて いるため（図13Ｅ-Ｈ）(Ｈengelら,Ｊournal of Ｖirology 68:289-297(1994)) 、Ｈ-2 Ｌ^dの発現の増加に派生するいずれかの非特異的2Ｃ ＴcＲ／Ｉg結合に関 して正規化する必要がある。これは、対照の無関係なＨ-2 Ｌ^d結合性ペプチドp ＭＣＭＶと共にＲＥＮＣＡ細胞をインキュベートすることにより達成された。p2 Ｃaは、Ｈ-2 Ｌ^dに対して弱いアフィニティーを有することが知られているため( Ｓykulevら,Ｉmmunity 1:15-22(1994a))、より高いアフィニティーのＨ-2 Ｌd結 合性ペプチド（例えば、pＭＣＭＶ(Ｓykulevら,(1994a)前掲)）との交換は非常 に効率的であるはずである。したがって、2Ｃ ＴcＲ／Ｉgのバックグラウンド反 応性を、飽和量の対照pＭＣＭＶペプチドと共に該細胞をインキュベートするこ とによる内因性p2Ｃaまたはp2Ｃa様ペプチドの効率的置換により測定することが 可能であろう。対照のＨ-2 Ｌ^d結合 性pＭＣＭＶと共に細胞を予めインキュベートすることにより、すべての場合に 、2Ｃ ＴcＲ／Ｉg結合を阻止することができた(図13Ａ-Ｄ、点線)。ＲＥＮＣＡ 細胞を２Ｃ特異的ペプチドＱＬ9と共に予めインキュベートすることにより、2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの結合の劇的な増加が誘導された(データは示していない)。これら の実験の結果は、2Ｃ ＴcＲ／Ｉgが、内因性2Ｃ反応性ペプチド／ＭＨＣ複合体 の細胞表面発現を分析するための感受性プローブとして使用可能であることを示 している。 2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの反応性に対するγ-ＩＦＮの効果は、それが30.5.7の反応性 に及ぼす効果とは異なっていた。mＡb 30.5.7による認識によれば、分析したす べての濃度において、5〜50単位/mlのγ-ＩＦＮが、血清学的に反応性のＨ-2 Ｌ^d の5〜6倍の増加を誘導した(図13Ｅ-Ｈ)。未刺激のＲＥＮＣＡ細胞のＭＣＦは50 0であったのに対して、γ-ＩＦＮで刺激された細胞のＭＣＦは2666〜3038であっ た。γ-ＩＦＮの最大の効果は、記載されている実験においては、使用した最少 用量（5Ｕ/ml）で認めら、他の実験では、わずか1Ｕ/mlの用量のγ-ＩＦＮでも 認められた(データは示していない)。興味深いことに、2Ｃ ＴcＲ／Ｉgの反応性 に対するγ-ＩＦＮの用量反応曲線が移動した。5Ｕ/mlのγ-ＩＦＮは、2Ｃ Ｔc Ｒ／Ｉgの反応性に対して、比較的小さいが有意な影響を及ぼした。2Ｃ ＴcＲ／ Ｉgの反応性に対するγ-ＩＦＮの最大の効果を得るためには、10単位/mlのγ-Ｉ ＦＮでの処理が必要であり、これは、30.5.7の反応性に対するγ-ＩＦＮの最大 効果に必要な量の約10倍であった。これらの結果は、ＭＨＣ重鎖の発現に対する γ-ＩＦＮの効果が、特異的ペプチド抗原／ＭＨＣ複合体の発現に対するγ-ＩＦ Ｎの効果と異なることを示している。 これらの結果は、このアプローチが、ヘテロ二量体タンパク質の可溶性二価形 態を製造するための一般的なアプローチであることを示している。本発明のヘテ ロ二量体タンパク質の可溶性二価類縁体は、それらの標的に対して高いアビディ ティーを有することにより特徴づけられる。 単一のマウスクラスII ＭＨＣおよびα/β ＴcＲに関してこれを行なったのと 同じ方法、可溶性二価ヘテロ二量体タンパク質を製造する同じ技術を用いて、他 の 哺乳動物系を開発することができる。これらには、げっ歯類およびヒトの両方の クラスII ＨＬＡ分子およびα/βおよびγ/δ Ｔ細胞受容体が含まれるであろう 。 本発明は、本発明の精神または本質的な特徴から逸脱することなく、前記で具 体的に開示した以外の形態で具体化することが可能である。したがって、前記の 個々の具体例は限定的なものではなく、例示とみなされるべきである。すべての 参照文献および特許出願を、それぞれの刊行物または特許出願が参考として組入 れられると明示的かつ個別的に示されているのと同じ程度に、参考として本明細 書に組入れるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｃ０７Ｋ 14/725 // Ｃ０７Ｋ 14/725 14/74 14/74 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 オーヘリン、シーン アメリカ合衆国、メリーランド州 21210、 ボルチモア、ウエスト・サーティーナイン ス・ストリート 110、アパートメント 1400 【要約の続き】 分泌することが示された。精製したタンパクのＳＤＳ ＰＡＧＥゲル分析によって、予想分子量の蛋白種が示さ れた。フローサイトメトリーの結果は、ＴＣＲおよびク ラスIIキメラが、それらの同族受容体を有する細胞に対 して高アビディティーで特異的に結合することを示し た。これらのスーパー二量体は、ＴＣＲ／ＭＨＣ相互作 用、リンパ球トラッキング、新規抗体の同定の研究ため に有用であり、また免疫応答の特異的調節としての可能 な用途を有する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．免疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチドに作動的に結合したヘテロ二 量体タンパク質の細胞外ドメインを含んでなる、可溶性組換え二価タンパク質組 成物。 ２．該免疫グロブリンが、ＩgＭ、ＩgＤ、ＩgＧ3、ＩgＧ1、ＩgＧ2b、ＩgＧ2a 、ＩgＥおよびＩgＡよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の組換えタンパク 質組成物。 ３．該ヘテロ二量体タンパク質の細胞外ドメインが、少なくとも、免疫認識に 関与する結合部位を含有する、請求項１に記載の組換えタンパク質組成物。 ４．さらに、該ヘテロ二量体タンパク質の細胞外ドメインと該免疫グロブリン ポリペプチドとの間にリンカードメインを含む、請求項１に記載の組換えタンパ ク質組成物。 ５．該ヘテロ二量体タンパク質がαポリペプチド鎖とβポリペプチド鎖とを含 む、請求項３に記載の組換えタンパク質組成物。 ６．該ヘテロ二量体タンパク質がγポリペプチド鎖とδポリペプチド鎖とを含 む、請求項３に記載の組換えタンパク質組成物。 ７．該ヘテロ二量体タンパク質がＭＨＣクラスII分子である、請求項５に記載 の組換えタンパク質組成物。 ８．該ヘテロ二量体タンパク質がＴcＲ分子である、請求項５に記載の組換え タンパク質組成物。 ９．さらに、該ＭＨＣクラスII分子のペプチド結合溝中に抗原ペプチドを含む 、請求項７に記載の組換えタンパク質組成物。 10．免疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチドに作動的に結合したヘテロ二 量体タンパク質の細胞外ドメインを含んでなる可溶性組換え多価タンパク質組成 物。 11．該免疫グロブリンが、ＩgＭ、ＩgＤ、ＩgＧ3、ＩgＧ1、ＩgＧ2b、ＩgＧ2a 、ＩgＥおよびＩgＡよりなる群から選ばれる、請求項10に記載の組換えタンパク 質組成物。 12．核ヘテロ二量体タンパク質の細胞外ドメインが、少なくとも、免疫認識に 関与する結合部位を含有する、請求項10に記載の組換えタンパク質組成物。 13．さらに、二価ヘテロ二量体タンパク質の細胞外ドメインと該免疫グロブリ ンポリペプチドとの間にリンカードメインを含む、請求項10に記載の組換えタン パク質組成物。 14．該ヘテロ二量体タンパク質がαポリペプチド鎖とβポリペプチド鎖とを含 む、請求項10に記載の組換えタンパク質組成物。 15．該ヘテロ二量体タンパク質がγポリペプチド鎖とδポリペプチド鎖とを含 む、請求項10に記載の組換えタンパク質組成物。 16．該ヘテロ二量体タンパク質がＭＨＣクラスII分子である、請求項14に記載 の組換えタンパク質組成物。 17．該ヘテロ二量体タンパク質がＴcＲ分子である、請求項14に記載の組換え タンパク質組成物。 18．さらに、該ＭＨＣクラスII分子のペプチド結合溝中に抗原ペプチドを含む 、請求項16に記載の組換えタンパク質組成物。 19．請求項１〜８および10〜17のいずれか１項に記載の組換えタンパク質組成 物をコードする発現ベクターの製造法であって、該免疫グロブリン重鎖または軽 鎖に作動的に結合した該細胞外ドメインの１つをアミノ末端に含む融合タンパク 質が産生されるように、ヘテロ二量体一体性膜タンパク質の細胞外ドメインをコ ードするＤＮＡ配列を挿入することにより免疫グロブリン重鎖および軽鎖の発現 ベクターを修飾することを含んでなる製造法。 20．該重鎖および軽鎖融合タンパク質が、別々の発現ベクターにコードされる 、請求項19に記載の製造法。 21．可溶性ヘテロ二量体タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでなる発現 ベクターであって、該ＤＮＡ配列のそれぞれが、それぞれ免疫グロブリン重鎖ま たは軽鎖ポリペプチドのいずれかをコードするＤＮＡ配列に作動的に結合してい ることを特徴とする発現ベクター。 22．ヘテロ二量体タンパク質の１つのメンバーの可溶性類縁体をコードするＤ ＮＡ配列を含んでなる発現ベクターであって、該ＤＮＡ配列が、免疫グロブリン 重鎖または軽鎖ポリペプチドのいずれかをコードするＤＮＡ配列に作動的に結合 していることを特徴とする発現ベクター。 23．さらに、該可溶性ヘテロ二量体タンパク質をコードするＤＮＡ配列と該免 疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードするそれぞれのＤＮＡ配列と の間にリンカードメインを含む、請求項21に記載の発現ベクター。 24．さらに、可溶性ヘテロ二量体タンパク質の１つのメンバーをコードするＤ ＮＡ配列と該免疫グロブリン重鎖または軽鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ配 列との間にリンカードメインを含む、請求項22に記載の発現ベクター。 25．請求項21〜24に記載のベクターのいずれか１つを含んでなる宿主細胞。 26．請求項22または24のいずれかに記載の２つのベクターを含んでなる宿主細 胞であって、前記の２つのベクターのうちの１つが、免疫グロブリン重鎖ポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列に作動的に結合した該ヘテロ二量体タンパク質の １つのメンバーをコードするＤＮＡ配列を含み、前記の２つのベクターのうちの もう１つが、免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動的 に結合した該ヘテロ二量体タンパク質のもう１つのメンバーをコードするＤＮＡ 配列を含むことを特徴とする宿主細胞。 27．請求項１〜９のいずれか１項に記載の可溶性組換え二価タンパク質組成物 を医薬上許容される担体中に含んでなる医薬組成物。 28．請求項10〜18のいずれか１項に記載の可溶性組換え多価タンパク質組成物 を医薬上許容される担体中に含んでなる医薬組成物。 29．免疫応答を選択的に抑制または軽減する方法であって、医薬上許容される 担体中の請求項１〜９のいずれか１項に記載の可溶性組換え二価タンパク質組成 物の有効量を患者に投与して、該免疫応答を抑制または軽減することを含んでな る方法。 30．該免疫応答が外来移殖抗原に対するものである、請求項29に記載の方法。 31．該免疫応答が自己免疫疾患を引き起こす、請求項29に記載の方法。 32．免疫応答を選択的に抑制または軽減する方法であって、医薬上許容される 担体中の請求項10〜18のいずれか１項に記載の可溶性組換え多価タンパク質組成 物の有効量を患者に投与して、該免疫応答を抑制または軽減することを含んでな る方法。 33．該免疫応答が外来移殖抗原に対するものである、請求項32に記載の方法。 34．該免疫応答が自己免疫疾患を引き起こす、請求項32に記載の方法。 35．請求項９に記載の可溶性組換え二価タンパク質組成物を基体上に固定化し 、該固定化タンパク質組成物をＴ細胞の集団にさらして、抗原特異的Ｔ細胞応答 を刺激することを含んでなる、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激方法。 36．請求項18に記載の可溶性組換え多価タンパク質組成物を基体上に固定化し 、該固定化タンパク質組成物をＴ細胞の集団にさらして、抗原特異的Ｔ細胞応答 を刺激することを含んでなる、抗原特異的Ｔ細胞応答の刺激方法。 37．該方法を、特異的Ｔ細胞サブセットの同定および精製に使用する、請求項 35または36に記載の方法。 38．請求項８に記載の可溶性組換え二価タンパク質組成物を基体上に固定化し 、該固定化タンパク質組成物をペプチド／ＭＨＣ複合体の集団にさらして、ある 特定のペプチド／ＭＨＣ複合体を同定することを含んでなる、未知ペプチド／Ｍ ＨＣ複合体を同定し精製する方法。 39．請求項17に記載の可溶性組換え多価タンパク質組成物を基体上に固定化し 、該固定化タンパク質組成物をペプチド／ＭＨＣ複合体の集団にさらして、ある 特定のペプチド／ＭＨＣ複合体を同定することを含んでなる、未知ペプチド／Ｍ ＨＣ複合体を同定し精製する方法。 40．該ペプチドが腫瘍抗原またはウイルス抗原である、請求項38または39に記 載の方法。 41．免疫グロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方に作動的に結合した結 合部位をコードする細胞外ドメインを含んでなる可溶性組換え多価タンパク質 組成物。 42．該結合部位がポリペプチド、炭水化物または糖タンパク質によりコードさ れる、請求項42に記載のタンパク質組成物。