KR100257466B1 - Lag-3의 가용성 폴리펩타이드 절편 및 생산 방법 치료 조성물, 항-이디오타입 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 LAG-3 단백질의 4개의 면역글로불린 타입 세포의 도메인 (서열 SEQ ID No. 1의 아미노산 1∼159, 160∼239, 240∼330 및 331∼412)중 적어도 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 부가 및/또는 제거에 의하여 상기 도메인으로부터 유도된 펩타이드 서열의, 전부 또는 일부로 이루어진 가용성 폴리펩타이드 절편으로서, LAG-3의 리간드에 대한 LAG-3의 특이성과 적어도 동일한 특이성을 갖도록 처리하는 것을 포함하는 가용성 폴리펩타이드에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
LAG-3의 가용성 폴리펩타이드 절편 및 생산 방법 치료 조성물, 항-이디오타입 항체
[산업상이용가능성]
본 발명은 면역 자극제(immunostimulants)로서 MHC(주요조직적합유전자 복합체, major histocompatibility complex) 클래스 ll 분자의 특이 결합을 저해할 수 있는 항체뿐만 아니라, 면역억제제 (immunosuppressants)로서 유용한 LAG-3 막(membrare) 단백질로부터 유도된 가용성 형태에 관한 것이다.
[배경기술]
LAG-3이라 명명한 단백질은 WO-A 71/1G672에 기술되어 있다.
LAG-단백질은 NK-세포와 활섬 T-입파구에 의해 선택적으로 발현된다. 아미노산 서열(sequence)의 유사성, 상대적인 엑손/인트론(exon/intron) 조합(organization)과 염색체의 위치 측정 (chromosomal localization)은 LAG-3이 CD4에 관련되어 있음을 보여 준다. LAG-3 유전자에 대한 최초의 특성화는 TRIEBEL et at. (1)에 기술되어 있다.
면역글로불린(immunoglobuline)형의 4개의 세포의 서열을 포함하는 498개 아미노산의 트랜스막(transmembrane) 단백질 I 형의 DNA 코드와 일치하는 IAG-3은 면역글로불린 상과(superfamily)에 속한다
성숙 단백질(mature protein)은 52kD의 이론 분자질량을 가진 476개 아미노산(SEQ ID No. 1)으로 구성되어 있다. 세포외 부위 (region)는 8개의 시스테인 잔기(residues)와 4개의 잠재적인 N-글리코실레이션(N-glycosylation) 자리를 포함한다. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)에 의하면, PHA-아세포 또는 활성 NK 세포 내 LAG-3의 분자량은 70,000이다. N-글리코시다제 F(N-glycosidase F)로 처리한 후, 60kD의 크기로 감소한 것으로서, 원래 LAG-3이 글리코실화되었다는 것을 알 수 있다. 더욱 상세한 것은 WO-A 91/10682에 기술되어 있다.
BAIXERAS et al., J. Exp. Med. 176, 327-337(2)에서, LAG-3으로 트랜스펙트된 세포(그들의 표면에서 LAG-3을 발현하는)와 MHC 클래스 II를 발현하는 B 임파구로 트렌스펙트된 세포 사이에서의 로제트(rosette) 형성은 특히 LAG-3/MHC 클래스 II의 상호작용에 좌우된다는 그들의 발견을 더욱 기술하고 있다.
놀랍게도, MHC 클래스 II의 리간드는 활성 CD4+임파구보다 활성 CD8+임파구(HHC 클래스 I-제한된)에서 더 높은 수준으로 검출되었다. In vivo에서 단지 몇 개의 광범성(disseminated) LAG-3+세포(MHC 클래스 II-제한된)가 주요 림프 기관, 즉 흉선(thymus)과 골수(bone marrow)를 포함하는 비-과형성 림프 조직(non-hyperplastic lymphoid tissue)에서 발견되었다. LAG-3+세포는 고용량의 IL-2 주사를 투여한 환자의 말초혈관 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)뿐만 아니라, 과형성 림프절과 편도선에서 발견되기도 하였다.
상기한 관찰에 의해 LAG-3이 휴면 임파구(resting lymphocytes)와 다른 세포형들, 특히 마크로파지(macrophages)의 아군집(subpopulation)에서 발현된 CD4에 대조적인 활성 항원이라는 것을 확인할 수 있다.
상기 MHC는 T-임파구 수용체(T lymphocytes receptor, TCR)에 대한 단백질 항원의 절편이 존재하는 막 당단백질 (glycoprotein)로서, 클래스 I와 클래스 II 분자를 포함한다. 클래스 I 분자는 내인성으로 합성된 단백질로부터 대부분 유도된 펩타이드의 CD8+세포독성 세포로 존재하는 것인 반면, 클래스 II 세포는 세포봉입체(endocytic) 즉, 외인성(exogenous) 경로로 들어온 외래 단백질로부터 첫 번째로 조합된 CD4+헬퍼 임파구 펩타이드로 존재한다. T 헬퍼 임파구(T helper lymphocytes)는 면역 반응을 조절하고 증폭하는 반면, 세포독성 임파구는 “비-자가(non-self)” 항원, 예를 들면 바이러스성(viral) 항원을 발현하는 조직의 바람직하지 않은 세포를 파괴하는데 필요하다. 상기 인식 기전은 T 임파구의 유효한 활성을 유도하는 세포내 시그널(Slgnal)을 유발한다.
T (CD4+) 임파구에 의해 매개된 면역 반응을 개시하기 위하여 외래 항원은 분화한 세포, 즉 항원제시세포(Antigen presenting cell, APC)에 의하여 펩타이드 형태로 포획되고 내화되어야 한다. 상기 유발된 항원성 펩타이드는 APC의 표면에서 발현되며, MHC 클래스 II 분자와 결합한다. 이러한 MHC 클래스 II/펩타이드 복합체는 특히 T 헬퍼 임파구의 활성과 결과로 생성된 T 임파구 수용체에 의해 인식된다
더욱이, 상기 재조합 기술에 의해 창조된 동물 모델은 in vivo에서 MHC 클래스 II 분자와 그들의 리간드에 의한 역할을 강조할 수 있도록 만든다.
그러므로, MHC 클래스 II가 결핍되어 있고(3), 말초의 CD4+T 임파구가 거의없고, 흉선에 약간의 미성숙 CD4+임파구를 가지고 있는 쥐는 T-의존성 항원에 대한 반응이 완전히 불가능하다는 것이 입증되었다.
CD4-/-돌연변이 쥐(4)는 본질적으로 T 임파구 활성이 감소되었으나 CD8+의 정상적인 성장과 기능을 보이며, 낭세포(daughter cell)와 CD4+, CD8+흉선 세포(thymocyte)에 대한 CD4+의 발현은 성장에 대해 필수적이지 않다는 것을 나타낸다. 이러한 CD4-결핍 쥐는 정상 쥐에 비하여 많은 양의 CD4-, CD8-세포를 가진다.
이러한 이중 음성 세포(doubly negative cell)는 MHC 클래스 II와 항원을 인지하는 능력에 제한된다.
상기 이중 음성 세포가 레슈마니아(Leishmania)에 감염될 때, 이들 마우스는 CD4의 부재에도 불구하고 기능을 가진 T 헬퍼 임파구의 집단(population)을 보인다. 이러한 T 헬퍼 임파구들은 MHC 클래스 II에 대해 제한적이며, 항원에 의해 활성화될 때 인터페론-γ(interferon-γ)을 생산한다. 상기한 사실은 상기 T 헬퍼 임파구의 계통과 그들의 말초적인 기능은 CD4의 기능에 반드시 의존적일 필요가 없다는 것을 나타낸다.
MHC 클래스 II 부위에 의해 암호화한(encoded) 단백질은 면역 인식에 의해 많이 유발되며, 상기 면역 인식은 임파구와 APC와 같은 다양한 림프계 세포(lymphoid cell) 사이의 상호작용을 포함한다. 또한 CD4를 경유하지 않는 다른 기전이 T 헬퍼 임파구의 효과기(effector) 기능에 관여하는 여러 가지 관찰을 할 수 있다.
상기 여러 가지 관찰은 MHC 클래스 II와 그의 면역 시스템에서 리간드에 의해 중요한 역할을 하는 것을 뒷받침한다.
더욱이, 상기 중요성은 리간드에 결합이 가능한 단백질외 세포질의 도메인(domain)과 치료제로서 유용한 단백질과 세포 수용체의 가용성 형태를 얻기 위한 인간 면역글로불린 (Ig)의 일정한 부위로 구성된 미지의 세포가 알려진 것이다.
이런 식으로 CD4의 가용성 형태는 용량-의존성 방법(dose-dependent manner)으로 in vltro에서 HIV 감염을 저해하는데 효력이 있다는 것을 증명하였다.
그럼에도 불구하고, 가용성 CD4 분자, 특히 CD4-lg에 대한 임상시험은 증명되기 위한 바이러스성 역가(viral titres)가 뚜렷하게 감소되지 않았다. 혈청에 207㎛/㎖의 가용성 CD4로 발현한 형질전환(transgenic) 마우스를 만들었다. 이들 마우스는 대조군 마우스에 비하여 면역 기능에 주목할 만한 변화를 보이지 않았다. 지금까지, CD4로부터 유도된 분자는 MHC 클래스 ll에 직접 결합하지 않는다고 보고 되었다. 이것은 가용성 CD4분자들이 MHC 클래스 II분자와 in vivo에서 상호 작용 하지 않는다는 것을 강력히 시사한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 LAG-3의 세포질외 도메인의 여러 절편을 포함하는 가용성 분자는 MHC 클래스 II 분자에 결합하며 면역억제 작용을 가질 수 있다는 것을 알게 되었다.
서열 SEQ ID No. 1에 의해 재도입된(represented) LAG-3의 세포질의 부위는 아미노산 1∼149, 150∼239, 240∼330 및 331∼412로부터 확장한 도메인 Dl, D2, D3 및 D4를 포함한다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 목적은 LAG-3 단백질의 4개의 면역글로불린 타입 세포외 도메인 (서열 SEQ ID No. 1의 아미노산 1∼149, 150∼239, 240∼330 및 331∼412)중 적어도 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 부가 및/또는 제거에 의하여 상기 도메인으로부터 유도된 펩타이드 서열의, 전부 또는 일부로 이루어진 가용성 폴리펩타이드 절편으로서, LAG-3의 리간드에 대한 LAG-3의 특이성과 적어도 동일하거나 더 큰 특이성을 갖는 가용성 폴리펩타이드 절편이다.
본 발명은 특히, 잘 알려진 폴리티피(polytypy) 현상으로부터 조합된 음성 LAG-3 서열로부터 유도된 서열을 가지는 가용성 폴리펩타이드 절편을 포함한다.
가용성 폴리펩타이드 절편은 MHC 클래스 II 분자에 대한 LAG-3의 친화성의 원인이 되는 LAG-3의 펩타이드 부위를 포함한다.
가용성 폴리펩타이드 절편은, 특히 하나 이상의 아미노산의 꼬체, 부가 및/또는 제거에 의하여 이러한 도메인으로부터 유도된 펩타이드 서열을 포함하며, 상기 펩타이드의 리간드 예를 들면, LAG-3의 처음 두 개의 면역글로불린 타입 도메인 전부 또는 LAG-3의 세포질외 도메인의 4개의 면역글로불린 타입 도메인의 리간드에 대해 LAG-3의 리간드가 더 크거나 동일한 특이성을 가지는 것을 포함한다.
유리하게는, 상기 절편은 Arg/Glu, Arg/Glu, Arg/Glu 및 Tyr을 만드는 원자의 평균 위치는 73, 75, 76 및 77 위치 (SEQ ID No. 1)에 대해 표 1 또는 표 2에서 주어진 것이거나 그로부터 5% 이하로 차이가 나고, 109 위치 (SEQ ID No. 1)에 있는 Asp의 원자의 위치 또는 그로부터 5% 이하, 바람직하게는 2% 이하로 차이가 나는 것인 LAG-3의 첫 번째 도메인의 하기한 아미노산: Asp 뿐만 아니라 Arg/Glu, Arg/Glu, Arg/Glu 및 Tyr를 포함하는 가용성 폴리펩타이드 절편을 포함한다.
바람직하게는, 상기 절편은 기본 연결 배열 (basic linkage arrangement)을 형성하는 원자의 평균 위치는 표 1 또는 표 2에 나타난 아미노산 46∼77(SEQ ID No. 1)의 위치이거나 그로부터 5% 이하로 차이가 나는 루프(loop)를 포함한다.
상기 가용성 폴리펩타이드 절편은 유익하게는 LAG-3(아미노산 150∼241)의 두 번째 면역글로불린 타입 세포외 도메인(D2)을 더욱 포함한다.
가용성 폴리펩타이드 절편은 융합단백질 (fusion protein)을 형성하기 위하여, 상기에서 정의된 LAG-3의 펩타이드 서열 외에 LAG-3의 펩타이드 서열은 C-말단 및/또는 N-말단에 보조 펩타이드 서열을 더욱 포함한다. “융합단백질”이란 용어는 LAG-3의 세포질외 도메인의 단위절편(subfragmants)의 물리화학적 형상의 수식(modification)을 허용하는 단백질의 한 부분(portion)을 의미한다. 그와 같은 융합단백질의 예는 상기 정의에 따른 LAG-3의 세포질의 도메인의 절편을 포함하며, 인간 면역글로불린의 중쇄(heavy chain)-CH2-CH3 접합(junction) 부위, 바람직하게는 이소타입(isotype) IgG4 면역글로불린에 결합하는 것을 포함한다.
상기 융합 단백질은 다이머(dimer) 또는 모노머(monomer)일 수 있다.
상기 융합단백질은 숙련가에게 잘 알려져 있는 재조한 기술, 예를 들면 Traunecker et al. (5)에서 기술된 것과 같은 재조합 기술에 의해 얻을 수 있다.
일반적으로 말하면, 상기 정의에 따른 LAG-3 펩타이드 서열을 가진 융합된 면역글로불린을 포함하는 융합단백질의 생산 방법은 LAG-3에 대응하는 또는 LAG-3로부터 유래한 폴리펩타이드 부위를 코딩하는 cDNA의 절편, PCR에 의한 증폭후가 적합하고, 및 면역글로불린의 관련 부위를 코딩하는 cDNA, 이 cDNA는 상기 대응하는 폴리펩타이드 부위 또는 LAG-3 유도체를 코딩하는 cDNA와 융합된 것을 벡터에 삽입하고, 트랜스펙션후 cDNA의 절편을 발현시스템, 특히 포유동물, 예를 들면 햄스터 난소 세포에서 발현시키는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 또한 적당한 절단 사이트를 포함하도록 구성된 LAG-3/면역글로불린 콘쥬게이트의 절단에 의하여 얻을 수 있다.
본 발명의 목적은 또한 본 발명에 따른 가용성 폴리펩타이드 절편을 포함하는 면역억제 작용을 가지는 치료 조성물이다. 이러한 조성물은 면역 억제를 필요로 하는 병리(pathologies), 예를 들면 자가면역질환(autoimmun disease)을 치료하는데 유용할 것 이다.
본 발명의 목적은 또한 면역자극 작용을 가지는 치료조성물의 제조를 위한 상기 정의에 따른 LAG-3 또는 LAG-3로부터 유도된 사용성 폴리펩타이드 절편에 대한 직접적인 항체, 또는 상기 항체의 절편, 특히 Fab, Fab' 및 F(ab')2 절편들의 이용이다. “면역 자극의(immunostimulatory)”란 성숙(maturation), 분화(differentiation), 증식(proliferation) 및/또는 LAG-3를 발현하는 세포의 기능을 자극할 수 있는 분자체(molecular entity)를 의미하며, 상기 분자체는 T 임파구 또는 활성 NK 세포를 말한다. 항-LAG-3 항체는 백신 또는 HIV에 감염되거나 면역억제 물질로 치료 받는 환자와 같이 면역이 억제된 환자에게 면역자극제로서 이용될 수 있으며, 또는 비정상적인 행동을 보이는 자가 세포, 예를 들면 암세포의 제거에 의한 면역 시스템을 자극하는 데에 이용된다.
항-LAG-3 항체의 면역자극 작용은 항-CD4 항체가 면역억제작용을 가지는 것과 마찬가지로 우수하다.
상기 항체는 폴리클론(polyclone) 또는 모노클론(monoclone)일 수 있다; 그러나, 모노클론항체가 더 바람직하다. 상기 폴리클론항체는 BENEDICT A.A. et al. (6)에서 설명되어 있는 것과 같이 잘 알려진 방법에 따라 제조할 수 있다. 모노클론항체는 싱글 에피톱(single epitope)에 특이 적이고 더 우수한 재현성(reproducibility)에 의해 생성된다는 사실에 의하여 더 바람직하다. 모노클론항체의 생산 방법은 특히 KOHLER과 MILSTEIN에 의해 기술된 선행 기술이 잘 알려져 있다. 상기 방법과 함께 다양한 방법들이 YELTON et al. (7)에 의해 기술되어 있다.
본 발명의 목적은 또한 본 발명에 따른 항체에 대한 직접적인 항-이디오타입(anti-idiotype) 항체에 관한 것이며, LAG-3의 내부 형상을 포함하며, 그 결과 MHC 클래스 II에 결합할 수 있다. 상기 항체는 특히 면역억제제로서, 특히 자가면역병리에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 치료조성물은 약제학적인 성분이 가능할 뿐만 아니라, 상기 정의에 따라 가용성 LAG-3 단백질 또는 항체를 포함한다. 이러한 조성물은 보통의 기술에 따라 제조될 수 있다. 상기 부형제는 선택한 투여 경로: 경구(oral), 비경구(parenteral), 설하(sublingual), 직장(rectal) 또는 점비(nasal)에 따라 제형이 다양할 수 있다.
비경구투여에 대한 조성물에 대해서, 상기 부형제는 일반적으로 조성물의 용해도 또는 저장되는 능력을 촉진하는 다른 가능한 성분(ingredients) 뿐만 아니라, 스테릴 수용액 (sterile water)을 포함한다. 비 경구투여 경로는 정맥주사, 근육내주사 또는 피하주사를 포함한다.
상기 치료조성물은 특히 장-시간형 치료(long-term treatment), 예를 들면 자가면역증 치료에서 지속-방출형 형태 (sustained-release type)가 가능하다. 투여 용량은 치료 목적, 특히 바람직한 방어도(degree of protection)를 이를 수 있는 인간 면역 시스템의 용량에 좌우된다. 투여될 정확한 양의 활성 성분은 치료를 시작하는 의사에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 치료 조성물은 가용성 LAG-3 또는 본 발명에 따른 상기 항체들, 다른 활성 성분들을 더욱 포함하며, LAG-3 또는 본 발명에 따른 항체에 화학결합(chemical bond)을 통하여 적절하게 결합하는 것을 허용한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 독소, 예를 들면 리신(ricin) 또는 디프테리아 아나톡신(diphtheria anatoxin)에 융합하거나 또는 방사성 등위원소에 융합한 상기 가용성 LAG-3 단백질은 MHC 클래스 II 분자에 결합하여 목표 세포(target cell), 예를 들면 백혈구 또는 멜라노마 세포(melanoma cell)를 죽일 수 있게 된다.
[실시예]
첨부한 관련 도면과 함께 하기한 실시예는 본 발명을 더욱 상세하게 설명할 것이다.
[실시예 1]
[항-LAG-3 모노클로날 항체의 존제하에 활성 T 임파구의 증식]
사용된 항-LAG-3 모노클로날 항체는 BAIXERS(2) 문헌에 기술되고 1992년 7월 10일 CNCM에 No. 1-1240로 기탁된 17B4와 HUARD(8) 문헌에 기술된 11E3이다.
상기 항체들은 이소타입 IgG1이다. 이들 항체를 활성화된 T 임파구에 대한 이들의 생물학적 영향을 테스트하였고, 특이 항원 펩타이드에 의해 자극되거나 또는 세포를 나타내는, LAG-3을 발현하는 자원성 (autologus) 항원에 의해 발현되는 MHC 클래스 II 분자에 의해 나타나는 항원을 제조하였다.
10 H3으로 명명된 항-CD-48 모노클로날 항체를 관계없는(irrelevant) IgG1 항체로서 사용하였다(음성 대조군),
항-LAG-3과 항-CD48 항체의 포화 농도를 PHA(피토헤마그글루티닌)-아세포((phytohaemagglutinin)-blast)와 엡스테인 바르 바이러스(Ipstein Barr virus) (EBV)에 의해 전환된 세포 라인 (cell line)에서 면역형광법으로 측정하였다. 증식 테스트에서, 상기 모노클로날 항체를 상기 포화 농도의 5배 비율로 첨가하였다.
한편 구형 혈액 임파구로부터 유래된 상기 클론 154인 사용된 상기 T 임파구 라인은 아미노산 306 내지 329로부터 연장된 아미노산 서열 (p20 펩타이드)을 갖는 인플루엔자(influenza) 헤마그글루틴(haemagglutin) (HA)를 모의하는 (mimicking) 펩타이드에 대하여 발생되었고, 다른 한편으로는 단일 인간 공여체의 구형 임파구로 부터 유래된 T 임파구 클론인, 상기 클론 28은 디프테리아 아나톡신(diphteria anatoxin) (DT)에 대하여 발생되었다. 클론 154에 대응하는 상기 세포 발현 항원 (APC)은 T 154와 동일한 공여체의 EBV-전환된 B 임파구이다. 클론 28에 대응하는 상기 세포 발현 항원은 동일한 공여체(DR3/DR11)의 EBV-전환된 B 임파구이다. 이 클론은 HLA DR7으로 제한된다.
클론 154에 대하여, 상기 APC(5× 106)을 37도에서 1시간 반동안 p20 펩타이드의 다양한 투입량(dose)을 사용하여 배양하고, 세척하고 조사하였다(10,000 rad). 동시에 상기 세포를 클론 154 세포로서 (0.5×105내지 lO×105세포/㎖) 3 : 1의 비율로 96-웰 마이크로적정 플레이트(96-well microtitration plate)에 도말하였다. 클론 28에 대하여, 반응 세포/자극 세포의 비율은 1이다.
상기 HLA DR7/EBV APC 세포를 미토마이신(mitomycin)으로 처리하거나 방사선 처리하고, DT 존재하에 T 임파구(상기 배양물에 잔류하는)에 가하였다. 클론 28 세포의 최종 농도는 100, 000 세포/㎖이다.
[3H]티미딘 (1μCi/웰)을 배양 2일후 내지 20일후까지 다양한 시간 간격으로 가하였다.
각 실험을 3번 실시하였다.
결과를 평균 cpm과 음성 대조군(면역항원이 없는 APC와 함께 배양된 T 임파구)에서 발견되는 cpm을 뺀 후로 나타내었다. 증식 테스트를 96-웰 플레이트에서 실시하였다. 각각 200㎕ 웰에서 처리된 티미딘의 흡광도를 배양후 최종 18시간동안 1μCi 티미딘을 첨가한 후 측정하였다. 결과를 3회 테스트한 값의 평균으로 나타내었다. 표준 편차는 보통 12% 미만이었다(매우 낮은 cpm 측정의 경우에 조금 높음). 또한, 혼합 배양물(클론 154/APC) 상층액을 결합하고, 0.22㎛ 막을 통하여 여과하고, 시료로 자른 후 시판되는 면역측정 키트, 이뮤노테크(immunotech) IL-2와 INF-α 적정 키트, 젠자임(Genfyme) IFN-γ 키트와 카이만 케미칼(Cayman Chemicals) IL-4 키트, 를 사용하여 적정할 때까지 -20℃에서 냉동하였다.
p20 특이 항원과 접촉을 야기하는 클론 154의 증식 프로파일을 완성하기 위하여 다양한 농도와 항-LAG-3 모노클로날 항체 또는 관계없는 모노클로날 항체(음성 대조군)의 존재하 또는 함체가 없을때의 투여량 측정을 실시하였다.
16 분리 테스트 각각의 결과는 첨가된 항원의 농도와 관계없이, 증식의 피크 이하의 초기 포인트가 변형되지 않았으나, 항-LAG-3 모노클로날 항체와 배양된 T 임파구 증식의 현저한 증가가 조직적으로 관찰되는 것으로 나타났다. 모노클로날 항체 17B4의 Fab 절편을 제조하고 클론 154의 증식 테스트에 사용하였다. 17B4 Fab 절편(15㎍/㎖)을 갖는 항원에 의해 활성화된 T 임파구의 증식 프로파일은 전체 17B4 모노클로날 항체(40㎍/㎖) 존재하에 배양된 세포의 증식 프로파일과 유사하다(제1도). 이들 결과들은 관찰된 생물학적 효과가 항-LAG-3 모노클로날 항체의 Fc 영역에 의해 유발된 비-특이 반응에 기여하지 않는다는 것을 나타낸다.
유사한 결과가 11E3 항-LAG-3 모노클로날 항체를 사용하여 얻어졌다.
DT 존재하에 APC에 대응하는 것과 함께 배양한 후, 클론 78을 또한 17B4 모노클노날 항체의 존재하에 항원(테타누스 아나톡신(tetanus anatoxin) 10㎍/㎖)으로 자극하였다. 결과를 제2도에 나타내었다.
클론 28을 사용하여 관찰되는 항-LAG-3 모노클로날 항체의 영향, 즉 증식의 증가는 클론 154를 사용하여 관찰되는 영향과 유사하다.
항-LAG-3 모노클로날 항체의 존재하에 배양된 클론 154 세포의 항원성 자극 후에 발생하는 이종혼합(miscellaneous) 세포의 현상을 측정하기 위하여 테스트를 실시하였다.
항-LAG-3 또는 항-CD48 모노클로날 항체의 존재하에 또는 항체없이 클론 154의 종래 항원성 자극동안 상기 세포를 수확하여, LAG-3과 CD25 트랜스멤브레인 수용체의 발현에 대하여 테스트하고, 배양물 상층액의 시료를 자극후 다른 시간 간격으로 수집하여 IFN-γ, TNF-α, IL-2와 IL-2 존재에 대하여 테스트하였다.
두-색상 직접 면역방사선 테스트(항-CD3 모노클로날 항체와 항-CD25 모노클로날 항체)는 IL-2 수용기가 약하게 그러나 항원성 증가 5일후 현저하게 증가된 것을 나타내었다. 항-CD-3과 11E3(항-LAG-3) 모노클로날 항체를 사용한 유사한 테스트는 LAG-3이 이어서 더욱 활성되어 과발현되었다. 첨가하여, IL-2, IL-4, IFN-γ와 TNF-α의 분비는 또한 항-LAG-3 모노클로날 항체와 배양하여 조절되었고, 따라서 항-LAG-3 모노클로날 항체가 존재함에 따라 다른 세포 현상이 변형되는 것과 어떤 현상은 이미 자후 24시간후에 발생하는 것을 나타내었다.
이들 결과들은 간접적으로 LAG-3이 CD4+세포에 대한 조절적인 역할을 하는 것을 나타낸다. 항-LAG-3 모노클로날 항체가 증식을 증가시키고, 따라서 면역강하제로서 작용하는 사실은 LAG-3이 항원-의존적 자극에 대하여 LAG-3의 음성적으로 역할하는 CD4+'T 임파구의 “비활성화”를 포함하는 것을 제시한다.
[실시예 2]
[LAG-3 융합 단백질의 일시적인 발현]
LAG-3로부터 유도된 가용성 단백질은 LAG-3로 코팅한 DNA와 면역글로불린 절편으로 코팅한 DNA를 포함하는 적절한 벡터를 이용한 재조합 DNA 기술에 의해 얻어졌다. 일시적인 발현 시스템은 트랜스펙트한 Cos세포를 구성한다. 이러한 시스템은 재조합 융합 단백질 몇 mg을 생산하는 것이 가능하도록 한다. 재조합 DNA 기술은 MANIATIS et al. (22)에서 기술된 것에 따라 실행하였다. 상기 수식 (modification)은 실행자에 위탁하여 만들었다.
[Lag-3 D1-D4 Ig와 LAG-3 D1D2 Ig의 구성]
D1D2 또는 Dl-D4 부위로 코팅한 절편은 LAG-3 cDNA(TRIEBEL et al. (1))을 포함하고, 5′-엔도뉴클레아제(endonuclease) 활성이 없는 Taq 폴리머라제(Polymerase)를 이용하며, 매우 고온에 노출되는데 비교적 저항성을 가지는 cDNA(FDC 서열)의 한 절편으로부터 증폭되며 (30cyc1es), 상기 증폭(amplification)은 98℃ (Perkin Elmer Cetus “DNA thernal cycler”에서)에서 변성이 일어났다. 특이한 프라이머(primer)는 아래 표에 기록되어 있는데로 이용되었다.
최종의 증폭된 절편(LAG-3 D1D2와 LAG-3 D1-D4 각각에 대해 739bp 와 1312bp)는 pBS 플라스미드(스트라타진, stratagene)에 삽입하였다.
삽입은 XhoI과 Bg1II로 분해(digestion)한 후에 제조하였으며, pCDM-7-CD8-IgG1(스트라타진에서 매매한 pCDM8로부터 유도된 pCDM7) 벡터의 XhoI과 Bg1II 자리에 제3도에서 나타낸 것과 같이 CD8로 코팅한 DNA서열을 LAG-3의 단위절편을 코팅한 것들로 대체하도록 도입하였다. 상기 결과로 인한 발현 벡터는 인간 IgG1 사슬(chain)의 -CH2-CH3 접합 부위를 코팅한 DNA 서열에 융합된 DID2 또는 Dl-D4로 코딩하는 서열을 포함하였다.
[표 1]
CDM7은 DNA의 클로닝 및 E. Coli와 진핵세포를 발현하는 것에 대하여 SEED et al. (10)에 의해 밝혀진 벡터로부터 유도된 진핵성 발현 벡터이다. CDM7은 하기한 특징: (i)포유동물 세포에서 일시적인 발현을 위한 인간 거대세포바이러스(cytomegalovirus)의 프로모터; (ii) T 항원을 발현한 포유동물 세포의 상염색체(autosomal)의 복제를 위한 바이러스성 기원의 SV 40; (iii) 높은 복사 수(high copy number)를 위한 플라스미드 기원에 따른 πVX(타입 Col El) ; (iv) TEtamb와 Ampamb E. coli 종에서 암피실린(ampicillin)과 테트라사이클린(tetracycline) 저항성을 위한 Sup F 선택; (v) 단일 가닥의 방출을 위한 M13의 복제의 기원; (vi) T7 RNA 프로모터, 및 (vii) 이종구조의 DNA의 효과적인 클로닝을 위한 폴리링커(polylinker)의 특성을 가진다.
[Cos 세포의 일시적인 발현]
Cos 세포(5×106)은 셀젝트 기구(Cellject appratus) (Eurogentech, Liege, BE)를 이용한 일렉트로포레이션(electroporation) (200v, 1500㎌, 30-40 msec)방법으로 적당한 발현 벡터(LAG-3 D1D2 Ig, 또는 LAG-3 D1-D4 Ig, 또는 CD8 Ig로 코딩한)인 30㎍의 DNA를 이용하여 트랜스펙트시켰다. 상기 세포들은 다시 배양기로 옮겨 5%의 소태자(fetal calf) 혈청을 함유한 배지에서 배양하였다. 상기 상청액(supernatants)은 트랜스펙션 후 6일간 회수하였다.
상기 결과의 융합 단백질의 합성은 17B4 모노클로날 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석법으로 트랜스펙트된 세포의 추출물 뿐만 아니라 상기 상청액을 분석하였다. 면역반응성 물질은 LAG-3 D1D2 Ig 또는 LAG-3 D1-D4 Ig로 코팅한 DNA로 트랜스펙트된 세포의 상청액에서 관찰되었다.
부수적으로, 재조합 CD8 면역부착제(immunoadhesin) (CD8Ig)는 동일한 발현 시스텔와 pCDM7-CD8(제3도) 발현 벡터를 이용한 음성 대조군에 의하여 얻었다.
상기 재조합 단백질 LAG-3 D1D2 Ig, LAG-3 D1-D4 Ig aLc CD8 Ig는 단백질 A-세파로스(Sepharose)에 대한 표준 방법으로 정제하였다. 상기 결과 물질은 SDS-PAGE, 하기한 쿠마지 스테이닝(Coomassie staining) 또는 항-인간 Ig 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석법으로 분석하였다.
[실시예 3]
[LAG-3의 가용성 부절편의 생산]
대량의 재조합 단백질을 생산하기 위하여, 트랜스펙트된 포유동물 세포를 구성하는 안정한 발현 시스템이 발견되었다. 숙주 세포는 부착의존성 햄스터(anchorage-dependent hamster)의 난소(CHO) 세포가 디하이드로엽산 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR)와 필수적으로 성장에 필요한 글리신(glycine), 퓨린(purine) 및 티미딘(thymidine) 결핍 CHO 세포로부터 분리하였다. 핵산 전구체의 합성에서 DHFR의 중추적인 역할은 메토트렉세이트(methotrexate, MTX)와 같은 테트라하이드로롤레이트 유사체에 관하여 감수성의 DHPR-결핍 세포와 결합하는 것으로서, 두가지 주요 장점이 있다. 즉, DHFR 유전자를 포함하는 발현 벡터를 이용한 상기 셀들의 트랜스펙션은 재조합 DHFR-저항성 클론의 분비를 가능하게 하고, 증가한 양의 MTX를 포함하는 선택적인 중막(media)에서 상기 세포를 배양하는 것은 DHFR 유전자와 그와 관련된 상기 DNA를 증폭시킨다.
[ LAG-3 D1, LAG-3 D1D2, LAG-3 D1-D4의 구성]
Dl, D1D2 또는 D1D2 또는 D1-D4 부위로 코딩한 DNA 절편은 앞서 설명한 것과 동일한 PCR 방법, 하기한 표에서 나타낸 프라이머를 이용하여 증폭시켰다.
[표 2]
결과적으로 증폭된 절편은 SalI으로 분해하여 pUG 18(스트라타진)의 SalI 자리로 삽입하였다.
상기 증폭한 서열은 확인되었으며, 상기 삽입은 COLE et al. (Biotechnology 11, 1014-1024, 1993)에서 설명된 것에 따라 발현 벡터 pCLH3 AXS V2 DHFR hα IVS로 아클론되었다(제4도).
이러한 벡터는 발현 cDNA와 그 진핵세포에서의 증폭에 대하여 다기능적인 진핵성 발현 벡터이다. 상기 벡터는 하기한 특징, (1) 메탈로티오닌-1 (metallothionein-1) 유전자의 쥐 프로모터와 중요한 (공여기(donor)-수용기(acceptor) 접합 자리를 포함하는)유전자의 전사를 유발하는 폴리아데닐화 서열 SV 40, (2) cDNA의 높은 수준의 전사를 얻기 위한 α 글리코프로틴(glycoprotein)의 하위 단위에 대한 유전자의 공여기-수용기 접합 부위를 포함하는 서열 사이에 드는 인간, (3) pER 322의 복제와 박테리아 증폭을 위한 암피실린 내성을 위한 유전자의 기원을 포함하는 p㎖ 서열, 및 (4) 트랜스펙턴트(transfectant)의 선택성과 증폭을 위해 이용하는 서열의 전사를 유발하는 SV 40의 DHFR 전사단위의 특징을 가진다.
[CHO 세포에서 안정한 발현]
LAG-3 D1, LAG-3 D1D2 및 LAG-3 D1-D4로 코딩한 발현 벡터는 CHO DUKX 세포를 트랜스펙트하는데 이용되었으며, 이러한 셀들은 선택 배지에서 배양하였다. 이러한 조건하에 증식이 가능한 세포들은 증가한 양의 MTX를 함유한 배지에서 배양하 였다. 발현 수준은 17B4 모노클로날 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. LAG-3로부터 유도된 재조합 가용성 분자를 높은 수준으로 생산하는 클론들은 생물반응기(bioreactor)에서 증식하였으며, LAG-3로부터 유도된 물질은 이온 교환 크로마토그라피와 면역친화성을 이용하여 정제하였다.
웨스턴 블롯팅 분석은 LAG-3 D1, LAG-3 D1D2 및 LAG-3 D1-D4로 코팅한 발현 벡터를 이용하여 트렌스펙트한 세포의 상층액에서, 15∼18kD, 34∼36kD(두배) 및 55kD(2 가능한 줄무늬)의 분명한 분자 값으로 줄무늬가 나타났다. 이러한 면역반응 물질의 각각의 분자 값은 예상한 글리코실화 LAG-3 D1 Ig(139의 아미노산과 추측한 N-글리코실레이션 자리), 글리코실화 LAG-3 DID2 Ig (3개의 글리코실레이션 자리를 포함하는 239 아미노산) 및 글리코실화 LAG-3 D1-D4 Ig(4개의 글리코실레이션 자리를 포함하는 412의 아미노산)의 분자 값에 일치하였다.
[실시예 4]
[MHC 클래스 II를 발현하는 세포에 대한 LAG-3 Ig의 특이한 결합]
모노클로날 항체와 LAG-3 D1-D4 Ig의 반응성은 간접적인 면역형광법에 의해 연구되었다. 목표 세포(4×105)는 LAG-3 D1-D4 Ig, CDS Ig, 쥐의 모노클로날 항체, 콜터 클론(Coulter clone)으로부터 FITC(fluorescein isothiocyanate)에 콘쥬게이트된 (conjugated) (949) 항-인간 MHC 클래스 II (DR, DP, DQ), 또는 FITC에 콘쥬게이트된 관련없는 면역글로불린 G의 존재하에 4℃에서 30분간 배양하였다. 상기 세포는 세척한 뒤, 형광물질에 콘쥬게이트된 염소 항-인간 Ig 폴리클로날 F(ab′)2또는 형광물질에 콘쥬게이트된 염소 항-인간 Ig 폴리클로날 항체 존재하에 30분 동안 4℃에서 배양하였다.(콜터 클론)
LAG-3/MHC 클래스 II 결합을 확인하기 위하여, LAG-3 D1-D4 Ig는 MHC-양성 또는 음성 세포와 함께 배양하였다. MHC 클래스 II (L31, Phil EBV, Raji, Sanchez 및 personnaz)를 발현한 4개의 B 임파구 라인들은 항-클래스 II 모노클로날 항체 949로 처리하거나, 또는 LAG-3 D1-D4 Ig 또는 CD8 Ig로 코팅한 DNA를 이용하여 트랜스펙트된 Cos 세포의 상청액으로 처리하였다. MHC 클래스 I 분자의 여러 가지 할로타입(halotype)을 발현하는 5개의 세포 라인은 항-클래스 ll 모노클로날 항체(양성 대조군)과 같은 방법으로 LAG-3 Ig에 의하여 인식되었으나, CD8 Is(음성대조군)을 함유한 상청액은 예상했던 것처럼 상기 세포 라인에 결합하지 않았다. 4개의 7HC 클래스 II-음성 세포 라인(CEM, RJ, HSB2, K562)는 상기와 같은 시약(reagent)으로 처리하였다. 항-MHC 클래스 II (음성 대조군) 또는 LAG-3 D1-D4 Ig로 아무런 반응이 없었는데, 이는 LAG-3 D1-D4의 결합은 MHC 클래스 ll 분자에 특이적이라는 것을 보여준다.
더욱이 실험은 (1) 트랜스펙트된 마우스 섬유아세포 또는 인간 DR7 또는 인간 DP4로 코팅한 유전자를 가진 그밖의 것, (2) 발현한 마우스 세포 또는 그밖의 MHC 클래스 II 분자, (3) 활성 인간 CD4+ 또는 CD8+ 세포 및 (4) 여러 가지 MHC 클래스 II 분자의 할로타입을 발현하는 T 임파구 라인을 이용하여 실행하였다(제8도).
CD8 Ig와 달리, LAG-3 D1-D4 Ig는 항-MHC 클래스 II 모노클로날 항체 949만큼 유효하게 MHC 클래스 II를 발현하는 모든 세포에 결합한다. LAG-3 D1-D4는 트랜스펙트한 마우스 세포에 의해 발현되는 인간 MHC 클래스 II 분자, 쥐과의 MHC 클래스 II 분자 및 또한 CD4+또는 CD8+T 임파구에 의해 발현된 MHC 클래스 II 분자로 실험된 모든 DR과 DP 할로타입에 결합한다.
이러한 결과는 MHC 클래스 ll의 리간드로부터 유도된 가용성 분자가 MHC 클래스 II를 발현한 세포에 결합할 수 있다는 증거를 처음으로 보인 것이다.
유사한 실험은 LAG-3 D1D2는 특이한 방법 또는 LAG-3 D1-D4와 같이 효율적으로 MHC 클래스 II를 발현한 세포와 결합하였다.
[LAG-3Ig의 결합 활성과 LAG-3Ig에 대한 리간드의 세포 분포]
세포 리간드에 결합하기 위한 이러한 면역부착제의 능력(capacity)은 인간면역글로불린에 대하여 유도된 형광-표지된 염소 혈청을 사용하여 측정된다.
이러한 실험에 있어서, 목표 세포를 우선 인간 모노클론항체 또는 면역부착제와 함께 FCS(foetal calf serum) 10%를 함유한 RPMI에서 30분동안 4℃에서 배양한다. 그 다음 상기 세포를 쥐의 모노클론항체에 대한 FITC-표지 염소 항-마우스 면역글로불린 혈청(coulter) 또는 면역부착제에 대한 FITC-표지 염소 항-인간 면역글로불린 혈청(Tago)과 함께 배양한다. 상기 형광물질을 2회 세척후, 엘리트 세포분석기 (Elite cytometer) (Coultronics, Hialeah, FL)로 3,000개의 셀을 분석하여 측정한다. 제9도는 LAG-3lg, 0D81g, 항체 949 또는 항체 OKT3(항-CD3, ATCC)의 측정된 형광 강도의 대수함수로 계산된 세포수로 나타낸 결합도를 보여준다.
LAG-3Ig는 HLA DR4분자에 대한 유전자로 트랜스펙트된 쥐의 섬유아세포에 결합하고, 트랜스펙트되지 않은 세포에는 결합하지 않는다. CD8Ig는 같은 조건에서 HLA DR4+ 섬유아세포에 결합할 수 없다.
LAG-3Ig에 대한 리간드의 세포 분포는 면역형광법에 의해 셀의 모집단 표본으로 평가하였다.
LAG-3Ig는 활성 T 와 NK 세포에서 뿐만아니라, (DR1에서 DR10까지 10개의 동형접합체의 라인을 포함하는 유전적으로 관계없는 공여체로부터 유도된) 엡스타인바 바이러스(Epstein-Barr virus)에 의해 형질변환된 B 세포 라인을 포함하여 시험한 모든 양성 클래스 II 셀에서 나타난다.
제9도는 실시예에 의한 클래스 II 항원에 대해 양성인 다우디 (Daudi) 세포에 LAG-3Ig가 결합한 것을 보여준다.
LAG-3Ig에 대한 평균 형광강도는 클래스 II 항원에 대해 특이적인 항체 949에서 관찰된 것과 유사하다. 반면에, 마우스의 섬 유아세포 표면에서 발현된 DR4(제9도), DR2, DR7또는 DPw4(나타내지 않은)에 대한 LAG-3Ig의 결합은 항체 949에서 관찰된 것보다 더 약하다.
T 기원 (말초 혈액 T 세포, CEM, HSB2, RIX 라인), B 기원 (RJ 2.2.5 라인) 또는 (에리트로미오로이드(erythromyoloid) 기원의 K562인 인간의 라인과 흑색종 세포(melanoma cell)로부터 유래된 라인 (나타내지 않은)) 비-임파계 유래의 클래스 II 항원에 대하여 음성인 세포라인에 결합이 검출되지 않았다.
더욱이, LAG-3Ig는 마우스 림프종(Iymphoma) A 20에 의해 발현된 항원과 피토헤마그글루티닌-자극 아세포(데이타를 나타내지 않은)에 의해 발현된 원숭이 클래스 II와 같은 MHC의 이종 개체의 클래스 II 분자와 결합한다.
LAG-3Ig의 결합 특이성은 또한 모노클론항체 17B4를 이용하여 입증되었는데, 세포 부착 시험에서 모노클로날 항체 17B4의 LAG-3/MHC 클래스 II 상호작용을 방해하는 능력은 이미 설명하였다(제10도).
이러한 실험에서, LAG-3Ig 분자를 다우디 세포에 접촉시키기 전에 배지 단독으로 또는 17B4(1mg/㎖) 또는 OKT3(1mg/㎖)와 함께 4℃에서 30분동안 미리 배양한다.
제10도는 17B4와 함께 LAG-3Ig를 전배양한 것에서는 클래스 II+세포에 대한 결합 저해를 나타내는 반면에, OKT3 대조군에서는 저해가 검출되지 않는다.
[실시예 5]
[LAG-3의 가용성 절편에 의한 LAG-3/MHC 클래스 II 상호 작용의 저해]
LAG-3의 가용성 절편에 의한 LAG-3/MHC 클래스 II의 상호작용의 저해는 상기 가용성 절편과 길항적인 실험에 의하여, 클래스 If MHC 분자에 의한 LAG-3lg 결합을 직접 관찰할 수 있다.
CHO 세포에 의하여 생산된 가용성 LAG-3D1D2의 절편이 LAG-3로부터 유도된 면역부착제의 결합을 치환할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 하기한 실험을 행하였다 :
다우디 세포를 그 표면에서 발현된 MHC 클래스 II 항원에 대하여 LAG-3D1D2절편 분자의 결합이 가능하도록 상기 가용성 LAG-3D1D2절편과 함께 배양한다.
두 번째 단계에서, 상기 세포를 다이머 형태로 LAG-3D1D4Ig 또는 모노머 형태로 LAG-3D1D2Ig의 존재하에 배양한다.
LAG-3로부터 유도된 이러한 면역부착제의 결합은 형광물질 (GAH-FITC)에 컨쥬게이트된 염소 항-인간 Ig F(ab′)2를 이용하여 측정된다.
대조군 그룹은 가용성 LAG-3D1D2 절편과 함께 전배양하지 않고, 다이머 LAG-3D1D2Ig 또는 모노머 LAG-3D1D2Ig과 함께 배양된 다우디 세포에 의해 나타난다.
상기 결과는 표 3에 기록하였는데, 이러한 결과는 가용성 LAG-3D1D2절편이 모노머 또는 다이머 형태의 LAG-3로부터 유도된 면역부착제를 치환할 수 있다는 것을 보여준다.
[표 3]
이러한 데이터는 가용성 LAG-3D1D2 절편이 MHC 클래스 II 분자들과 결합한다는 것을 나타낸다.
[LAG-3의 억제/MHC 클래스 II와 CD4/MHC 클래스 II 상호 작용의 억제]
야생형 (wild type) LAG-3와 트랜스펙트된 Cos 세포와 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 BBV와 전환된 B 임파구 사이의 로제트(rosette) 형성이 BAIXERS(2)에 기술되어 있다. 이 상호작용은 항-LAG-3과 항-MHC 클래스 II 모노클로날 항체에 의해 억제된다.
상기 문헌에 기술되어 있는 방법은 영상화(visualization)를 바꾸고 LAG-3을 발현하는 Cos 세포와51Cr-표지된 B 임파구의 배양후 잔존하는 방사활성을 측정하여 B 임파구에 결합되는 Cos 세포를 카운팅함에 따라 변형된다(결합 어세이).
LAG-3/MHC 클래스 II 상호작용 그리고 또한 CD4/MHC 클래스 II 상호작용에서 LAG-3으로부터 유도된 가용성 분자의 가능한 억제 효과를 연구하였다.
Cos 세포를 적당한 발현 벡터 (야생형 LAG-3 또는 CD4를 코딩)와 트랜스팩트 하였다. 이틀 후, 상기 Cos 세포를 트립신(trypsin)으로 처리하고, 바닥이 평평한 12-웰 조직 배양물 평판에 0.05× 106세포/웰로 다시 도말하였다. 24시간 후,51Cr-표지된 다우디 세포(5.5×106)를 Cos 세포의 단층에서 1시간동안 배양하였다(최종 vol. : 1㎖). 목적 B 세포를 흡입여과하고 상기 웰을 5 내지 7번 세척하고 배지 1㎖ 방울방을 천천히 가하였다. 이 웰의 에지 (edge)를 파스테르 피펫을 사용하여 감압하여 세척하였다. 잔존하는 세포를 1㎖ PBS, 1% 트리톤(Triton)으로 37℃에서 15분동안 용균하였다. 이 용균물을 10분간 3000 rpm으로 원심분리하고, 생성되는 상층액 100㎕를 계산하였다.
LAG-3 D1-D4 Ig를51Cr 결합 분석(assay)에서 LAG-3/MHC 클래스 II와 CD4/MHC 클래스 II 상호작용을 억제하기 위하여 사용하였다. 인간 CD8Ig와 IgG1을 차례대로 테스트하고, 음성 대조군(negative controls)으로 사용하였다.
LAG-3 D1-D4 Ig에 의한 LAG-3/MHC 클래스 II 상호작용의 현저한 억제작용이 검출되었다(제5(a)도) 그러나, 상기 LAG-3/MHC 클래스 II 상호작용이 인간 CD8 Ig와 IgG1에 의해 부분적으로 그리고 비-특이적으로 억제될 수 있다. 또한, CD4/MHC 클래스 II 상호작용이 인간 CD8 Ig 또는 IgG1에 의해 변형되지 않는 실험 조건하에서 LAG-3 Ig CD4/클래스 II 상호작용의 포텐셜(potential) 억제제로 판명되었다. 이는 LAG-3/클래스 II 상호작용이 CD4/클래스 II 상호작용보다 약하다는 것을 제시한다. 이들 결과들은 MHC 클래스 II의 리간드와 MHC 클래스 II의 상호작용에서 가용성 분자의 가능한 길항(competitiion)의 첫 번째 증거이다.
[실시예 6]
[LAG-3 D1-D4 Ig의 면역억제 활성]
항-LAG-3 모노클로날 항체의 생물학적 활성에 대하여 상술한 증식 테스트를 이용하여 기능 테스트를 실시하였다.
항원성 자극 3일후와 5일후(D3와 D5)에, LAG-3 D1-D4 Ig는 클론 28 증식의 강한 억제작용을 나타내는 반면, 인간 CD8 Ig와 IgG1은 영향이 없었다(제6도). 유사한 실험을 클론 154를 사용하여 실시하였고(제7도), LAG-3 Ig의 존재하에 부분적 억제를 나타내었다. 대조 실험을 위에서 관찰된 것과 같은 반대영향을 갖는 항-LAG-3 모노클로날 항체를 사용하여 실시하였다.
LAG-3 D1-D4 Ig의 존재하에 배양된 세포의 세포 증식의 현저한 억제가 또한 클론 28에 대하여 관찰되었다
이들 결과들은 LAG-3 D1-D4 Ig가 항원에 의해 자극된 T 임파구의 증식의 포텐셜 면역억제제임을 나타내고, LAG-3이 활성화된 CD4+T 보조자(helper) 임파구에 의해 유발된 2차 면역 반응의 “소거제(extinguisher)”로서 작용할 수 있는 것을 나타낸다
[T 세포의 면역 반응의 음성 조절에 대한 LAG-3의 역할]
막 분자의 기능을 의태한 LAG-3의 가용성 형태가 항원에 의하여 자극된 CD4+T 클론의 활성을 저해할 수 있는지 예를 들어 설명하기 위하여, 클론 T154에 대한 실험을 행하였다 : 상기 T 세포는 포화량의 LAG-3Ig(100nM)와 미리 배양한다. 그 다음에 상기 세포들을 차가운 RPMI로 2회 세척하고, 4℃의 온도에서 30분 동안 인간 면역글로불린(Tago)에 대하여 직접적인 염소 항체 10㎍/㎖와 배양한다.
2회 더 세척한 뒤, 상기 세포는 소태아 혈청을 10% 함유한 RPMI로 재현탁하고 상기 시그날을 첨가하기 전에 37"C에서 B시간 등안 배양한다. 모노클론항체를 연결하기 (“크로스-링크”) 위하여, 10㎍/㎖ 농도의 염소 항-마우스 항체 (Tago)를 이용한다.
제11도는 클론 T154가 두 번째 반응물질 (인간 면역글로불린의 일정부위에 대해 특이한 폴리클론 혈청)에 결합한(“클로스-링킹”) LAG-3Ig와 함께 전배양한 실시예를 묘사한 것이다. 상기 세포에 대한 LAG-3Ig의 결합도는 면역형광법에 의해 측정된다(제11(a)도) 제11(b)도는 LAG-3Ig에 의해 생산된 클론 T154의 증식 저해가 50%이 상임을 보여준다. 같은 실험 조건하에서, “크로스-링킹” (도에 나타내지 않은)없이 대조군 CD8Ig 또는 LAG-3Ig에서는 효과가 없음을 보여준다.
제11(c)도 또한 LAG-3Ig가 항원-제시 B 세포(antigen-presenting B cell)에 의해 발현된 MHC 클래스 II 분자에 결합하는데(“크로스-링크”) 이용될 때 효과가 없음을 보여준다
상기 T 세포의 증식에 관한 항-클래스 II 모노클론 항체 결합의 (“클로스-링크된”) 가능한 효과를 LAG-3Ig 결합의 가능한 효과와 비교하였다. 염소 항-마우스 폴리클론 혈청에 결합한 항체 949와 항체 D1. 12(항-DR)에서 약한 저해 (50% 이하)가 관찰되었다(제17도). 가장 큰 효과가 클래스 II에 대한 결합에 특이적인 LAG-3의 항원결정기(epitope)에 관찰되기 때문에, 상기 증식의 저해는 항원결정 기-의존성이다.
T 세포의 증식에 대한 상기 LAG-3Ig의 효과를 또한 또다른 CD4+T 클론, 미엘린염기성단백질 (basic myelin protein)의 34-53 펩타이드에 대해 특이적인 클론 TDEL에 대한 다양한 시그날을 이용하여 연구하였다.
증식의 저해는 TDEL이 항체 (나타내지 않은), 고정된 OKT3(제13(a)도), 렉틴(PHA+PMA) (제13(b)도), 그리고 IL25IU/㎖(제13(c)도)로 자극될 때 관찰된다(n=2). IL2 100IU/㎖를 사용한 경우는 저해가 나타나지 않았다(제13(d)도).
결론적으로, 이러한 결과들은 공통적으로 각각 T 세포-활성 항원인 LAG-3 와 MHC 클래스 II 분자는, T 세포 반응의 불활성화 단계와 관련된 효과기 분자에 견주어 질 수 있음을 보여준다. 더욱이, 이러한 결과들은 세포 면역 반응의 대조군에서 T 세포 사이의 상호작용의 중요성을 나타낸다.
[실시예 7]
[LAG-3Ig에 의한 세포독성 세포의 자극]
세포 독성 세포에 대한 LAG-3Ig의 역할은 두가지 유형의 효과기 세포를 연구 하였다:
- 새로이 추출해낸 인간 말초 혈액 림파구(PBL),
- SIB5 라인 세포(인간 NK 세포의 클론)
상기 세포들의 세포독성 활성은 배지에 LAG-3가 존재하든 또는 존재하지 않든, 미리 표지한 목표 세포에 의해 배지내에 방출된 51Cr을 계산함으로써 측정된다.
제14도는 상기 배양에 첨가한 여러 가지 반응물질의 기능으로서, 엡스타인-바 바이러스에 의해 형질전환된 인간 B 세포의 라인에 대한 그리고 주요 조직적합성 복합 클래스 I과 II 항원(LAZ 388 라인)을 전달하기 위한 S1B5의 세포독성 정도를 나타낸다.
측정은 효과기 세포/목표 세포(S1B5/LAZ 388)의 비를 3:1(투명한 칼럼) 또는 1 : 1(차양 칼럼)로 배양한 4시간 후 측정한다.
음성 대조군은 배지 단독(MED), 면역부착제 CD8Ig와 모노클론 항체 17.B4(항-LAG-3)로 구성 된다.
양성 대조군은 세 개의 다양한 모노클론 항체로 구성된다 :
- 클래스 II DR 항원에 대해 직접적인 항체 L243
- 클래스 II DR, DP, DQ 항원에 대해 직접적인 항체 9.49
- 인간 주요 조직적합성 복합 클래스 I 항원에 대해 직접적인 항체 W632
항-HLA 클래스 I (W632) 또는 클래스 II (L743)항체는 목표 세포(그리고 17B4 대조군이 아닌)의 세포 용해를 증가시킨다. 상기 면역부착제 LAG-3Ig는 상기 세포 용해를 증가시킨다. CD8Ig 대조군은 효과가 없다
제15도는 효과기 세포/목표 세포 비를 50 : 1(투명한 칼럼)과 15 : 1(차양 칼럼)에 대하여, 다우디 세포(HLA 클래스 I-)에 관한 PBL의 세포독성을 측정한 것으로서, 상술한 것과 유사한 실험결과를 보여준다. 상기 배지에 첨가한 반응물질은 항체 9.49와 항체 17.B4를 제외하고는 첫 번째 실험에 이용된 것과 같다. 항체 10H3는 CD45 표면 항원에 대해 특이적인 이소타입 IgG1 면역글로불린이다. 상기 10H3는 음성 대조군에 이용된다.
주요 조직적합성 복합 클래스 I 항원 (W632)에 직접적인 항체에 대해서 변화가 없었다.
상기 두가지 일련의 측정 법으로부터의 데이터는 음성 대조군에 비교하여 LAG-3Ig가 NK 세포의 세포독성을 활성화하는 것을 보여준다. 이러한 효과는 MHC 클래스 II 분자에 직접적인 항체에서 관찰되는 것과 유사하다.
[서열표]
I - 일반적인 정보
(1) 출원인: 엥스띠튀 귀스따브 루씨/ 엥쎄름, 어플라이드 리서치 시스템스에이알에스 홀딜 엔. 브이.
(2) 발명의 명칭: LAG-3으로부터 유래된 가용성 폴리펩타이드 절편, 치료 조성물, 항-LAG-3 항체의 용도
(3) 서열 번호: 1
II-상기 서열 SEQ ID No. 1에 대한 정보
서열 특성
형태 : 뉴클레오타이드
길이 : 476
가닥 형태 (strandedness) : 이중
기하형태 (topology) : 선형
분자 형태 : CDNA
생물 : 호모 사피엔스
조직 : T 임파구
명칭 : LA7-3
서열 설명
리더 펩타이드(leader peptide)

Claims (16)

  1. 융합 단백질로서 보조 펩티드 서열에 융합되는, SEQ ID No : 1의 아미노산 잔기 1-149, 150-237. 240-330 및 331-412에 해당하는 LAG-3 단백질의 적어도 하나 이상 또는 4개의 면역글로불린 타입 세포의 도메인 이 보조 펩티드 서열에 융합되는 가용성 폴리펩티드 절편.
  2. 제1항에 있어서, 독소 또는 방사성 등위원소에 더욱 결합하는 가용성 폴리펩티드 절편.
  3. 제1항에 있어서, 독소 또는 방사성 등위원소에 더욱 결합하며, 상기 보조 펩티드 서열이 면역글로불린의 일부를 포함하는 가용성 폴리펩티드 절편.
  4. 제1항에 있어서, LAG-3 단백질의 4개의 면역글로불린 타입 세포외 도메인 중 적어도 제1 도메인(서열 SEQ ID No : 1의 아미노산 1-149)을 포함하는 가용성 폴리펩티드 절편으로서, 서열 SEQ ID No : 1의 73, 75, 및 76의 위치에 있는 하나 이상의 아르기닌(Arg)이 글루탐산(Glu)과 치환되고 상기 제1 도메인이 선택적으로 LAG-3 단백질의 나머지 3개의 면역글로불린 타입 세포의 도메인(서열 SEQ ID No : 1의 아미노산 150-239, 240-330 및 331-412) 중 적어도 하나이상과 융합되는 가용성 폴리펩티드 절편.
  5. 제4항에 있어서, 세포독성 분자 또는 방사성 등위원소에 결합된 모노클로날 항체를 포함하는 가용성 폴리펩티드 절편.
  6. 제4항에 있어서, 독소 또는 방사성 등위원소에 더욱 결합하며, 상기 보조 펩티드 서열이 존재하고 면역 글로불린의 일부를 포함하는 가용성 폴리펩티드 절편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 보조 펩티드 서열이 IgG4 이소타입의 면역 글로불린의 일부를 포함하는 가용성 폴리펩티드 절편.
  8. LAG-3에 해당하는 또는 LAG-3에서 유래된 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA의 절편의 융합물을 포함하는 DNA 분자를 면역 글로불린의 일부를 코딩하는 CDNA에 삽입하는 단계 ; 상기 DNA 분자를 호스트 발현 시스템에 트랜스펙션하는 단계 ; 상기 호스트에서 발현시켜 상기 가용성 폴리펩티드 절편을 생산하는 단계를 포함하는 면역 글로불린 부위를 더욱 포함하는 제8항에 따른 가용성 폴리펩티드 절편의 생산 방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 보조 펩티드 서열이 IgG4 이소타입의 면역글로불린의 일부를 포함하는 가용성 폴리펩티드 절편.
  10. LAG-3에 해당하는 또는 LAG-3에서 유래된 폴리펩티드 영역을 코딩하는 cDNA 코딩의 절편의 융합물을 포함하는 DNA 분자를 면역 글로불린의 일부를 코딩하는 cDNA에 삽입하는 단계 ; 상기 DNA 분자를 호스트 발현 시스템에 트랜스펙션하는 단계 ; 상기 호스트에서 발현시켜 상기 가용성 폴리펩티드 절편을 생산하는 단계를 포함하는 면역 글로불린 부위를 더욱 포함하는 제15항에 따른 가용성 폴리펩티드 절편의 생산 방법.
  11. 제1항 또는 제4항에 따르는 가용성 폴리펩티드 절편 및 제약학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 면역억제활성을 가지는 제약학적 조성물.
  12. 제1항 또는 제4항에 따르는 가용성 폴리펩티드 절편을 특이적으로 인지하는 항체.
  13. 제1항 또는 제4항에 따르는 가용성 폴리펩티드 절편을 특이적으로 인지하는 항체 및 제약학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 면역 증강제의 활성을 가지는 제약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체 또는 항체의 절편 중에서 선택되는 제약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 세포독성 분자 또는 방사성 동위원소에 연결된 모노클로날 항체를 포함하는 제약학적 조성물.
  16. 제4항에 있어서, 상기 제1 도메인 또는 상기 제1 도메인과 나머지 3개의 도메인 중 적어도 하나 이상과 융합되는 LAG-3 단백질의 면역글로불린 타입 세포의 도메인이 융합 단백질로서 보조 펩티드 서열과 융합되는 가용성 폴리펩티드 절편.
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