EA003772B1 - Средство для обеспечения защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина на основе штамма генетически сконструированных эукариотических клеток, содержащих днк, кодирующую трансмембранный белок lag-3 - Google Patents
Средство для обеспечения защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина на основе штамма генетически сконструированных эукариотических клеток, содержащих днк, кодирующую трансмембранный белок lag-3 Download PDFInfo
- Publication number
- EA003772B1 EA003772B1 EA199900507A EA199900507A EA003772B1 EA 003772 B1 EA003772 B1 EA 003772B1 EA 199900507 A EA199900507 A EA 199900507A EA 199900507 A EA199900507 A EA 199900507A EA 003772 B1 EA003772 B1 EA 003772B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- host
- dna encoding
- immune system
- genetically engineered
- Prior art date
Links
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 title claims abstract description 31
- 230000004224 protection Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 title claims abstract 9
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 title abstract description 10
- 101100510617 Caenorhabditis elegans sel-8 gene Proteins 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 182
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims abstract description 26
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 13
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 17
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 claims description 15
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 8
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 abstract 6
- 101150030213 Lag3 gene Proteins 0.000 abstract 6
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 abstract 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 abstract 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 abstract 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 abstract 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 abstract 1
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 abstract 1
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 38
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 18
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 8
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 8
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 5
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical class [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- -1 for example Proteins 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101100324465 Caenorhabditis elegans arr-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 2
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 208000036556 autosomal recessive T cell-negative B cell-negative NK cell-negative due to adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 101150081322 LAC3 gene Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710094503 Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000282520 Papio Species 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061334 Partial seizures Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100020526 Pycnoporus cinnabarinus LCC3-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000009642 Severe combined immunodeficiency due to adenosine deaminase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 201000009628 adenosine deaminase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000008431 aliphatic amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003435 aroyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 201000007186 focal epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 230000008949 local secretion Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005033 mesothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000004203 pancreatic function Effects 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108010027841 pegademase bovine Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000005211 primary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000024642 stem cell division Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2066—IL-10
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к применению штамма генетически сконструированных эукариотических клеток, содержащих ДНК, кодирующую трансмембранный белок LAG-3, экспрессирующийся на поверхности указанных клеток, для защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина, одну или в комбинации с дополнительным иммуносупрессорным агентом, например IL-10, TGF-β или Fas-лигандом, или в комбинации с геном тимидинкиназы (tk), который сообщает этой клетке восприимчивость к системе "самоубийства" под действием tk-ганцикловира, и к применению такого штамма для изготовления лекарственного средства для индуцирования защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина.
Description
Область, к которой относится изобретение
Настоящая заявка относится к способам предупреждения отторжения трансплантированных органов, тканей или клеток, а в частности, к способам, предусматривающим конструирование такого типа клеток, которые экспрессируют белок ЬАО-3 при трансплантации хозяину. Более конкретно, настоящее изобретение относится к продуцированию универсальной клетки-хозяина для генной терапии, экспрессирующей белок ЬЛО-3 на своей поверхности.
Описание предшествующего уровня техники
Ген активации лимфоцитов (ЬЛО-3) является членом надсемейства иммуноглобулинов и селективно транскрибируется в активированных Т-клетках как в СЭ4'. так и в СИ8+) и в ΝΚклетках человека (1леЬе1 е! а1., 1990). Данные о последовательности гена, сравнение его экзон/интронной структуры и хромосомной локализации выявили, что белок ЬЛО-3 является близкородственным СЭ4 (Ва1хегак е! а1., 1992). Кроме того, близкое родство между ЬЛО-3 и СЭ4 было еще наглядней продемонстрировано тем, что оба эти белка имеют один и тот же общий лиганд, т.е. молекулы МНС класса II (Ва1хегак е! а1., 1992). Однако в противоположность СЭ4. белок ЬЛО-3 не связывается с др120 вируса иммунодефицита человека (Ва1хегак е! а1., 1992). Экспрессия ЬЛО-3 -ίη νίνο не была обнаружена ни в первичных лимфоидных органах, таких как селезенка, ни в лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой, ни в нормальных лимфатических узлах. Однако этот белок легко обнаруживался в воспаленных небных миндалинах или в лимфатических узлах с фолликулярной гиперплазией, что подтверждает ту точку зрения, что даже ίη νίνο, ЬЛО-3 экспрессируется после активации (Ниагб е! а1., 1994А). Антиген-специфическая стимуляция Т-клеточных клонов в присутствии моноклонального антитела (тАЬ) против ЬАО-3 приводит к повышенному включению тимидина, к повышенной экспрессии маркера активации СО25 и к увеличению продуцирования цитокинов (Ниагб е! а1., 1994В).
В соответствии с этим, добавление растворимой рекомбинантной формы ЬАО-3 ингибировало пролиферацию антиген-специфических Т-клеток, что дало основание предположить регуляторную роль ЬАО-3 в активации СЭ4' Тлимфоцитов (Ниагб, 1996) и его участие в торможении действующих иммунных реакций. Недавно было показано, что ЬАО-3 также действует как корецептор для ΝΚ-клеток и определяет различные механизмы уничтожения опухолевых клеток, контролируемого неизмененной иммунной системой (М1уа7ак1 е! а1., 1996).
Механизмы, с помощью которых развивается Т-клеточный ответ к чужеродному (аллогенному или ксеногенному) белку или к клетке или к органу, пока еще не достаточно ясны. Ан тиген-презентирующие клетки (АПК) обладают хемотаксисом к участкам воспаления или повреждения (которые могут быть индуцированы хирургической трансплантацией). Популяция Тклеток на периферии осуществляет постоянный надзор за тканями в целях выявления патогенов или присутствия чужеродной (алло- или ксеногенной) ткани. После распознавания сигналов тревоги, МНС захватывают этот белок, гидролизуют его и презентируют его иммунной системе хозяина.
Были сконструированы аллогенные или сингенные опухолевые клетки, экспрессирующие вирусный 1Ь-10, который индуцирует локальную толерантность к опухолям. Такое лечение не влияет на отторжение нетрансдуцированной опухоли на удаленном участке (8ιιζι.ι1<ί е! а1., 1995). Очевидно, что !Ь-10, поставляемый локально, индуцирует сдвиг популяции Тклеток, являющихся реактивными по отношению к трансплантированным клеткам, в сторону фенотипа !Ъ2, который не является цитолитическим и может даже быть протективным.
Клетки, которые в норме экспрессируют Рак-лиганд, были трансплантированы через аллогенные или экзогенные барьеры без иммуносупрессии. Надзор хозяйских Т-клеток за участком имплантации приводил к их уничтожению при контакте с Рак-лигандом (Ве11дгаи е! а1., 1995). Более того, отторжение аллотрансплантата панкреатических островков предотвращалось котрансплантацией сингенных миобластов, генетически сконструированных для экспрессии Рак-лиганда (Ьаи е! а1., 1996).
Иммунная система обладает способностью быстро идентифицировать чужеродную, патологическую или воспаленную ткань и быстро разрушает ее. Это явление всегда создавало большие препятствия для трансплантации ткани, органа или клетки, а также для генной терапии. Главные проблемы связаны, в основном, с хронической иммуносупрессией, инкапсулированием или иммуноизоляцией. Нежелательными побочными эффектами хронической иммуносупрессии являются повышенная восприимчивость к условно-патогенной инфекции и образованию опухолей.
Возможность добиться продолжительной приживляемости трансплантированной ткани в отсутствие непрерывной иммуносупрессии давно является давней целью исследователей в области медицины человека.
Цитирование любого документа в настоящем описании не означает, что заявитель считает этот документ прототипом, или считает рассматриваемый материал патентоспособным по любому из заявленных пунктов формулы изобретения настоящей заявки. Любое указание на содержание или дату любого документа основано на информации, известной заявителю в момент подачи заявки, и не должно рассматри ваться как подтверждение точности такого указания.
Краткое описание изобретения
В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что трансплантация клеток, которые экспрессируют белок ЬЛС-3 на своей поверхности, приводит к защите трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина.
Таким образом, настоящее изобретение относится к генетически сконструированной клетке, которая может быть частью трансплантированной ткани или трансплантированного органа и которая включает ДНК, кодирующую трансмембранный белок ЬЛС-3 на своей поверхности, что приводит к защите трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина; при этом, указанной ДНК является геномная ДНК или кДНК. Указанная ДНК может быть экзогенной, или, в конкретном варианте осуществления изобретения, эндогенной ДНК, экспрессия которой активируется или модифицируется путем направленной инсерции регуляторной последовательности и/или амплифицируемого гена посредством гомологичной рекомбинации. Белок ЬЛС-3 представляет собой белок, который распознается антителами, направленными против ЬЛС-3.
В том случае, когда клетка является частью трансплантируемой ткани или трансплантируемого органа, трансфекция ЬЛС-3-ДНК может быть осуществлена непосредственно в ткани или органе, подлежащем трансплантации.
В частности, эта клетка представляет собой универсальную клетку-хозяина для генной терапии, которая является подходящей, например, для любого вида соматической или ех νίνο генной терапии.
В конкретном варианте осуществления изобретения клетка-хозяин для генной терапии, кроме того, включает экзогенную ДНК, кодирующую нужный терапевтический агент; и эти генетически сконструированные клетки используют в качестве терапевтического агента. Термин терапевтический, используемый в настоящем описании, относится к лечению и/или профилактике.
В еще одном варианте осуществления изобретения, ген, кодирующий нужный терапевтический агент, присутствует в геноме клетки, и эта клетка, кроме того, включает экзогенную ДНК, кодирующую регуляторную последовательность, или амплифицируемый ген для активации или модификации экспрессии нужного эндогенного гена.
Генетически сконструированная клетка настоящего изобретения может, так или иначе, содержать только экзогенную ЬЛС-3-ДНК, которая может быть использована в смеси с другими клетками-хозяевами для генной терапии, содержащими нужную терапевтическую ДНК.
Клетку настоящего изобретения предпочтительно, выбирают из миобластов, фибробла стов, гемопоэтических стволовых клеток, эмбриональных стволовых клеток, фетальных гепатоцитов, эндотелиальных клеток пупочной вены и клеток СНО.
Клетки, указанные выше, происходящие от трансгенных животных, также входят в объем настоящего изобретения.
Другой целью настоящего изобретения является использование трансмембранного белка ЬЛС-3, включая его мутеины и варианты, экспрессированные на поверхности клеток, в изготовлении лекарственных средств для индуцирования защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина.
Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию клетки, содержащей ДНК, кодирующую трансмембранный белок ЬЛС-3, экспрессируемый на поверхности этой клетки, в изготовлении лекарственных средств для индуцирования защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина.
В объем настоящего изобретения также входит использование указанной клетки, экспрессирующей ЬЛС-3 на своей поверхности, в изготовлении лекарственного средства, смешиваемого с трансплантируемыми клетками, тканями или органами, для индуцирования защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - цитотоксическая активность спленоцитов по отношению к клеткам ЬН-СНО, где указанные спленоциты были получены от мыши, примированной клетками ЬЛС-3-СНО или ЬН-СНО. Приводятся средние значения (± ст. откл.) для 5 мышей, как указано в надписи к чертежу; были также оценены 2 интактные мыши;
фиг. 2 - цитотоксическая активность спленоцитов по отношению к клеткам ЬЛС-3-СНО, где указанные спленоциты были получены от мыши, примированной клетками ЬЛС-3-СНО или ЬН-СНО. Приводятся средние значения (± ст. откл.) для 5 мышей, как указано в надписи к чертежу; были также оценены 2 интактные мыши;
фиг. 3 - карта экспрессирующего вектора Ба млекопитающего. Используемые сокращения: БНРК, единица транскрипции дегидрофолатредуктазы (8иЬга1таш с1 а1., 1981); рМЬ, производное рВК.322 (Ьикку & Βοϊοΐιαη. 1981); ΙιΛίνδΛ. фрагмент от интрона А асубъединицы гликопротеиновых гормонов человека (Е1ббек & Сообтап, 1981); ММТ-1, промотор мышиного металлотионеина 1 (Натег & №а11тд, 1982).
Подробное описание изобретения
Каждый год сотни тысяч людей умирают от сердечной недостаточности, почечной недостаточности, печеночной недостаточности, дыхательной недостаточности или от недостаточно сти функции поджелудочной железы. Единственным наиболее эффективным лечением является трансплантация.
Лечение, связанное с трансплантацией клеток, тканей или органов, индуцирует общее иммунопротективное состояние в организме хозяина по отношению к имплантированным клеткам, тканям или органам. Желательно обеспечить специфическую защиту трансплантата от его отторжения иммунной системой хозяина, в частности, при аллогенной трансплантации, ксеногенной трансплантации и генной терапии. При этом также желательно ингибировать толерантность к опухолевым тканям или каким-либо другим способом обеспечить реакцию иммунной системы хозяина на опухолевую ткань.
В соответствии с этим настоящее изобретение относится ко всем вышеописанным способам использования обнаруженного факта, что трансплантация клеток или тканей, которые экспрессируют трансмембранный белок ЬАС-3, способствует защите трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина.
В настоящем изобретении использован только что открытый ген и белок ЬАС-3, который обычно экспрессируется на активированных Т-клетках и активированных ΝΚ-клетках.
Термин трансмембранный белок ЬАС-3, используемый в настоящем описании, означает трансмембранный белок, содержащий экстрацитоплазматический домен ЬАС-3, его соли, функциональные производные, предшественники и активные фракции, а также его активные мутанты и его активные варианты, каждый из которых экспрессируется на поверхности клетки.
Этот термин также означает трансмембранный белок, который экспрессируется в его природном состоянии или который может быть гибридизован, например, методами генной инженерии, с другим белком, таким как гликозилфосфатидилинозит-содержащий якорь, или с любыми подходящими фрагментами другого трансмембранного белка, например, ΤΝΕрецептора, МРЬ-лиганда или трансмембранного иммуноглобулина.
Термин соли, используемый в настоящем описании, означает соли карбоксильных групп и соли функциональных аминогрупп соединений, получаемых хорошо известными способами. Соли карбоксильных групп включают неорганические соли, например, соли натрия, калия, кальция, и соли, образованные с органическими основаниями, например, с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин. Соли аминогрупп включают, например, соли неорганических кислот, таких как соляная кислота, и соли органических кислот, таких как уксусная кислота.
Термин функциональные производные, используемый в настоящем описании, означает производные, которые могут быть получены известными методами из функциональных групп, присутствующих на боковых цепях аминокислотных молекул или на концевых Ν- или С-группах и которые входят в объем настоящего изобретения, при условии, что они являются фармацевтически приемлемыми, т.е. не нарушают активности белка или не оказывают токсического воздействия, входя в состав фармацевтических композиций. Такими производными являются, например, сложные эфиры или алифатические амиды карбоксильных групп и Ν-ацильные производные свободных аминогрупп или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп и производные, образованные ацильными группами, например алканоильными или ароильными группами.
Термин предшественники означает соединения, которые превращаются в ЬАС-3 в организме человека или животного.
Термин активные фракции белка настоящего изобретения означает любой фрагмент или предшественник полипептидной цепи самого соединения, взятый отдельно или в комбинации со связанными с ним родственными молекулами или остатками, например, с остатками сахаров или фосфатов; или агрегаты полипептидных молекул, при условии, что такие фрагменты или предшественники, используемые в качестве лекарственного средства, обладают активностью, аналогичной активности ЬАС-3.
Термин активные фракции, предпочтительно, означает растворимые фракции внеклеточной части белка ЬАС-3, включая один или несколько из четырех доменов Ό1, Ό2, Ό3, Ό4 внеклеточного домена ЬАС-3.
Термин активные мутанты, используемый в настоящем описании, означает другие белки или полипептиды, где одна или несколько аминокислот этой структуры делетированы или заменены другими аминокислотами или где одна или несколько аминокислот добавлены к данной последовательности с получением полипептидов или белков, имеющих активность, аналогичную активности ЬАС-3. Так, например, Агд 73 и/или Агд 75 и/или Агд 76 могут быть заменены другой аминокислотой, предпочтительно С1и.
Термин активные варианты ЬАС-3 означает альтернативно-сплайсированные варианты, а также все первичные генные транскрипты, которые возникают в результате механизмов альтернативного сплайсинга в различных сайтах расщепления генов. Предпочтительными вариантами являются растворимые или трансмембранные белки, не имеющие доменов Ό3 и/или Ό4 во внеклеточной части ЬАС-3 и необязательно содержащие несколько дополнительных аминокислот после домена Ό2 или Ό3.
Экспрессия трансмембранного белка ЬАС3 на поверхности клеток подтверждается иммунореактивными методами. Трансмембранный белок распознается, например, антителами 11Е3 против ЬЛС-3 (№ депозита СЫСМ 1-1612), 17В4 (№ депозита СЫСМ 1-1240) или 15А9 (№ депозита С\С\1 1-1239).
Настоящее изобретение также относится к смеси полипептидов и производных, указанных выше.
Термин ЬЛС-3, белок ЬЛС-3 или молекула ЬЛС-3, используемый в описании и формуле изобретения в выражении экспрессия ЬЛС-3, белка ЬЛС-3 или молекулы ЬЛС-3, означает природные, синтетические и рекомбинантные формы полипептида, а также все определения, описанные выше.
Клетки настоящего изобретения могут быть отобраны из первичных или вторичных клеток. Используемый в настоящем описании термин первичная клетка означает клетки, присутствующие в суспензии клеток, выделенных из источника ткани позвоночных (перед тем, как они были засеяны, т.е. связаны с субстратом культуры ткани, таким как чашка или колба); клетки, присутствующие в эксплантате, полученном из ткани; клетки обоих из вышеуказанных типов, засеянных в первый раз; и клеточные суспензии, полученные из этих засеянных клеток. Термин вторичная клетка или клеточный штамм относится к клеткам во всех последующих стадиях культивирования. Таким образом, в первый раз посеянная первичная клетка удаляется из культурального субстрата и засеивается снова, и такая клетка именуется в настоящем описании вторичной клеткой, как и все клетки в последующих пассажах. Вторичными клетками являются клеточные штаммы, состоящие из вторичных клеток, которые были пассированы один или несколько раз. Клеточный штамм состоит из вторичных клеток, которые: 1) были посеяны один или несколько раз; 2) имеют ограниченное число средних удвоений популяции в культуре; 3) обладают способностью к контакт-ингибированному субстратзависимому росту (рост на субстрате не применим к клеткам, которые размножаются в суспензионной культуре); и 4) не являются иммортализованными. Термин клональный клеточный штамм означает клеточный штамм, который происходит от одиночной стволовой клетки. Термин гетерологичный клеточный штамм означает клеточный штамм, который происходит от двух или нескольких стволовых клеток.
Настоящее изобретение относится к первичным и вторичным соматическим клеткам, таким как фибробласты; кератиноциты; эпителиальные клетки; эндотелиальные клетки; глиальные клетки; нервные клетки; форменные элементы крови; мышечные клетки; другие соматические клетки, которые могут быть культивированы; и предшественники соматических клеток, где все указанные клетки являются трансфицированными экзогенной ДНК, стабильно интегрированной в их геном, или эписомально экспрессированной в клетках. Получен ные клетки называются, соответственно, трансфицированными первичными клетками и трансфицированными вторичными клетками.
Если ген, кодирующий молекулу ЬЛС-3, вводят в клетки млекопитающего, и эти клетки трансплантируют аллогенному или ксеногенному хозяину, то они узнаются иммунной системой хозяина, но при этом иммунный ответ не вырабатывается.
Иммунная система хозяина становится неспособной отторгать клетки, которые, в противном случае, т. е. в случае, если они не были бы сконструированы так, чтобы они экспрессировали на своей поверхности молекулы ЬЛС-3, должны были бы отторгнуться. ЬЛС-3 может также экспрессироваться на клеточной поверхности клеток не родственного типа и может быть смешан с трансплантируемыми клетками или тканями, что приводит к результатам, аналогичным описанным выше. Таким образом, настоящее изобретение относится к трансплантации клеток, тканей или органов, в основном, без индуцирования общей иммуносупрессии.
Эти клетки, ткани или органы трансплантируют в целях введения белков или индуцирования некоторых функций, необходимых для лечения некоторых заболеваний. Они могут приживляться в организме хозяина путем использования механизма, посредством которого белок ЬЛС-3 презентируется иммунной системе хозяина.
Профилактика отторжения трансплантированных специфических клеток, тканей или органов у реципиента может быть также достигнута путем совместного введения фибробластов или других первичных или вторичных клеток, которые были сконструированы так, что они экспрессируют ЬЛС-3. Этот протективный статус может быть обусловлен локальным или общим ингибированием механизмов, опосредующих иммунные ответы. Указанный протективный статус может быть обусловлен анергией, делецией, невосприимчивостью, толерантностью или предупреждением клеточноопосредованной цитотоксичности. После установления протективного статуса, он продолжается в течение длительного периода времени, или даже длится непрерывно, что обусловлено таким явлением, как инфекционная толерантность Ют е1 а1., 1993).
Настоящее изобретение может быть использовано для трансплантации клеток, тканей, органов или клеток-хозяев для доставки генов или генных продуктов, необходимых для различных медицинских целей.
Экспрессия гена ЬЛС-3 может быть индуцирована с помощью стандартной техники рекомбинантных ДНК или техники с использованием гомологичной рекомбинации для активации эндогенного гена ЬЛС-3. Эти типы клеток могут быть получены от трансгенных животных, которые имеют ген ЬЛС-3, экспрессируе мый в специфических тканях или в неродственных клетках, любым методом. Затем эти клетки могут быть смешаны с клетками, в которых было бы желательно обеспечить защиту от отторжения трансплантата. Это дает основание предположить, что локальная секреция иммунопротективной молекулы ЬЛС-3 не имеет системного действия. ЬЛС-3 -трансдуцированные нетрансформированные фибробласты дают аналогичный ответ ίη νίνο. Иммунопротективные эффекты инокулята ЬЛС-3 -трансдуцированных фибробластов являются дозозависимыми, но не зависят от источника молекулы ЬЛС-3.
Совместное введение ЬЛС-3-экспрессирующих клеток приводит к инактивации донорных Т-клеток и в то же время к предотвращению атакующего действия иммунной системы хозяина. Это введение индуцирует специфическую анергию, толерантность или какую-либо другую защиту от клеточно-опосредованной цитотоксичности у реципиента, которая может затем приводить к длительному изменению в иммунном микроокружении, обеспечивая защиту против аутореактивных Т-клеток. Это может быть достигнуто путем совместного введения небольшого числа аллогенных клеток костного мозга от здорового донора вместе с аллогенными клетками человека, которые были сконструированы так, что они экспрессируют ЬЛС-3. Это приводит к снижению числа аутореактивных Т-клеток посредством развития микрохимеризма (Эе1апеу с1 а1., 1996).
Люди со специфическими заболеваниями или дефицитными состояниями могут вылечиться благодаря аллогенной трансплантации множества различных клеток, тканей или органов. Так, например, обычно трансплантируются такие органы, как печень, почки, сердце, поджелудочная железа, тонкая кишка; и подходящими для трансплантации являются такие клетки, как островковые клетки, нервная ткань для лечения болезни Паркинсона или очаговой эпилепсии, гемопоэтические стволовые клетки для лечения состояний при химиотерапии или лучевой терапии, нормальные гепатоциты для лечения гиперхолестеринемии, клетки сердечной ткани для лечения инфаркта миокарда и мышечные клетки для лечения мышечной дистрофии.
Введение аллогенных трансплантатов костного мозга является довольно трудной задачей по ряду причин. Такими причинами являются отторжение трансплантата; инфицирование, обусловленное условно-патогенной инфекцией в результате контаминации трансплантата или иммуносупрессорных лекарственных средств; или другие причины. Отторжение трансплантата может быть обусловлено резистентностью реципиента к приживлению костного мозга донора и тенденцией компетентных иммунных клеток к индуцированию иммунного ответа у реципиента, т. е. к индуцированию реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). РТПХ может регулироваться путем истощения Тклеток у трансплантата или путем совместного введения иммуносупрессорных лекарственных средств. При элиминации Т-клеток, вероятность приживления трансплантата снижается.
В результате элиминации Т-клеток, риск отторжения трансплантата возрастает. Очевидно, эти клетки могут играть важную роль в приживлении трансплантата, такую как вырабатывание цитокинов (Кегпа1 е1 а1., 1987).
Было показано, что только небольшое число аллогенных, но здоровых клеток костного мозга может снижать или даже предупреждать возникновение аутоиммунных заболеваний в экспериментальных моделях. Однако лечение таких болезней приводит к индуцированию реакции трансплантат против хозяина.
Трансплантация костного мозга была также использована в качестве метода уничтожения некоторых опухолей. Это может быть достигнуто благодаря способности аллогенных Тклеток распознавать и уничтожать опухолевую ткань, например, при трансплантационном лейкозе.
Во всех вышеуказанных случаях, общую иммуносупрессию можно предотвратить путем создания предназначенных для трансплантации клеток или органов, которые содержали бы ген, кодирующий ЬЛС-3, так, чтобы при их трансплантации хозяину, экспрессировался белок ЬЛС-3 и обеспечивалась защита трансплантата.
Первая проблема, возникающая при аллогенной трансплантации, заключается в недостатке трансплантируемой ткани человека и в сильно возросшем в настоящее время спросе на поставку органов. Хотя ксенотрансплантация рассматривается пока еще как экспериментальная процедура, однако, она является реальной альтернативой к аллотрансплантации. В качестве доноров клеток или органов в настоящее время используются животные, такие как свиньи или павианы. Защита от отторжения трансплантата может иметь важное значение для успешного использования органов от различных видов животных. Резистентность хозяина может быть преодолена, по крайней мере, частично, например, с использованием антител против СЭ4. СЭ8. ΝΚ-клеток, или путем микроинкапсулирования клеток животных, предназначенных для трансплантации. В соответствии с настоящим изобретением животные могут быть трансгенно модифицированы так, чтобы в их клетках некоторых типов, подобно островковым клеткам, экспрессировался ген ЬЛС-3, что может быть осуществлено путем использования промотора гена инсулина и системы доставки, или специфической маркерной системы от других тканей.
Очевидно, что экспрессия ЬЛС-3 на опухолевой ткани играет важную роль в резистентности к клеточно-опосредованной реакции им мунной системы хозяина, направленной на опухолевые ткани.
В соответствии с конкретным вариантом своего осуществления, настоящее изобретение относится к использованию генной терапии или ех νίνο-обработки небольшого количества опухолевой ткани и ее реимплантации, причем, указанная опухолевая ткань может быть модифицирована так, чтобы она экспрессировала антисмысловые молекулы ЬАО-3 или рибозимы, специфичные к транскрипту ЬАО-3. Это должно индуцировать реакцию иммунной системы на данную ткань, и научить иммунную систему разрушать эту ткань. Небольшое количество опухолевой ткани может быть также обработано антителом против ЬАО-3 для предупреждения ЬАО-3-индуцированного игибирования Тклеток и продуцирования клеточного и гуморального иммунного ответа против этой опухоли.
Генная терапия является в настоящее время наиболее предпочтительной для лечения ряда заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, дефицит аденозиндезаминазы (АДА), серповидноклеточная анемия, талассемия, гемофилия, сахарный диабет, дефицит альфаантитрипсина, нарушения функций головного мозга, такие как болезнь Альцгеймера, и другие заболевания, такие как нарушения роста, и сердечно-сосудистые заболевания, вызываемые изменениями в пути метаболизма холестерина, и нарушения иммунной системы.
Для трансплантации индивидуумам, нуждающимся в такой трансплантации, могут быть использованы различные клетки, например, миобласты для доставки дистрофина; клетки, секретирующие такой материал, как ТРО, ОН, ЕРО, Фактор IX или другие факторы; клетки крови для лечения не наследственных болезней крови; и другие первичные клетки человека или животных, такие как эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки, клетки соединительной ткани, фибробласты, мезенхимальные клетки, мезотелиальные клетки и паренхиматозные клетки.
Результаты генной терапии были не совсем удачными, что обусловлено рядом проблем. Даже при наиболее успешных испытаниях, в которых молодая девушка проходила курс лечения с использованием гена аденозиндезаминазы (АДА), пациентке все еще еженедельно вводили инъекцию ПЭГ-АДА из-за опасений, что одна генная терапия окажется неэффективной.
Один из недостатков существующих на сегодняшний день схем генной терапии заключается в том, что она требует индивидуального продуцирования клеток-хозяев для предупреждения отторжения клетки иммунной системой хозяина. Генная терапия должна быть осуществлена индивидуально для каждого отдельного пациента. Кроме того, было установлено, что экспрессия трансгенов является, обычно, крат ковременной, что обусловлено экспрессией других вирусных белков, которые отвлекают на себя иммунную систему хозяина даже при использовании аутологичных клеток для генной терапии.
Были использованы аттенюированные аденовирусные векторы, но в этом случае возникают проблемы, связанные с другими экспрессируемыми вирусными белками, которые продуцируют иммунный ответ. Большие концентрации вируса, даже ослабленного, стимулируют воспалительную реакцию и иммунный ответ. Клетки иммунной системы хозяина запоминают вирусный вектор, в результате чего, последующие введения будут даже менее эффективными.
Обычно в схемах генной терапии используются дефектные по репликации аденовирусы, у которых был делетирован вирусный белок Е1. К сожалению, они обладают лишь кратковременным действием у взрослых иммунокомпетентных хозяев, что вероятно обусловлено иммунным ответом, направленным против аденовирусных или рекомбинантных белков (Кохаг8ку & ^ίίδοη. 1993; Вагг е! а1., 1992; 81та1£огб е! а1., 1992; Ко8еп£е1б е! а1., 1992; Ьешатсйапб е! а1., 1992). Поэтому существует крайняя необходимость в разработке новых векторов, которые не являются такими иммуногенными, или в разработке методов, которые обеспечивают иммунологическую защиту генетически сконструированных клеток.
Эти векторы были получены с высоким титром, составляющим вплоть до 1011 колониеобразующих единиц на один мл, и они инфицируют многие реплицирующиеся и не реплицирующиеся клетки. Дефектные по репликации аденовирусы используют для доставки физиологических уровней рекомбинантного белка в систему кровообращения. Ген ЬАО-3 находится предпочтительно под транскрипционным контролем конститутивно активного клеточного промотора ΕΕΊα и энхансера 4Е2НС (ТпраФу е! а1., 1994).
Были сделаны попытки избежать этой проблемы путем инкапсулирования клеток и путем индуцирования иммуносупрессии хозяина.
В методах, описанных в настоящей заявке, ксеногенные или аллогенные клетки могут быть использованы в качестве хозяев для генной терапии, экспрессирующих молекулу ЬАО-3 на своей поверхности, в результате чего будет обеспечиваться защита трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина. Такими клетками являются, например, миобласты, фибробласты, гемопоэтические стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки, фетальные гепатоциты, эндотелиальные клетки пупочной вены или клетки СНО. Клетки-хозяева для генной терапии могут быть также сконструированы так, чтобы они экспрессировали ген тимидин киназы вируса простого герпеса. Такие клетки могут быть специфически разрушены путем добавления ганцикловира.
Клетки, восприимчивые к 1к-ганцикловиру имеют преимущество перед невосприимчивыми клетками, заключающееся в том, что они могут быть удалены в любое время (Βί с1 а1., 1993).
Универсальная клетка-хозяин, полученная в соответствии с настоящим изобретением, экспрессирует ген ЬАО-3 и ген Нку-1к на своей поверхности, что позволяет, тем самым, генерировать универсальные клетки-хозяева для генной терапии, которые могут быть имплантированы без индуцирования иммуносупрессии, и которые могут быть разрушены в любое время, когда их активность больше не нужна.
Аллогенные или ксеногенные клеткихозяева для генной терапии настоящего изобретения, которые экспрессируют трансген и/или ген ЬЛС-З. могут быть сконструированы любыми методами переноса гена, такими как, но не ограничиваясь ими, метод с использованием дефектных по репликации вирусов, аденоассоциированного вируса, ретровируса высокой эффективности; прямая инъекция ДНК в костный мозг; электропорация; трансфекция с использованием фосфата кальция; микроинъекция; инкапсуляция в липосомы или тени эритроцита. Клетки, экспрессирующие ЬАО-3, такие как миобласты, или клетки СНО, могут быть введены совместно с клетками, экспрессирующими нужный белок, для длительного приживления. Если достаточно кратковременного воздействия ЬАО-3, то ЬАО-3-трансфицированные миобласты или клетки СНО могут содержать генсамоубийцу, такой как ген 1к, упомянутый выше, так, чтобы они могли быть удалены после введения ганцикловира.
Этот метод может быть использован для восстановления нормальной функции при введении гена или генного продукта, либо для удаления или инактивации гена, который опасен для организма (такой как онкоген). Эта цель может быть также достигнута путем имплантации клеток, которые доставляют рибозимы или антисмысловую кДНК для ингибирования продуцирования нежелательного белка, такого как белки ВИЧ или факторы роста. Этот метод может быть использован для коррекции состояния дефицита ферментов, такого как болезнь Гоше или дефицит АДА.
В соответствии с другим вариантом своего осуществления настоящее изобретение относится к способу генной терапии, предусматривающему: (ί) введение в выбранные клетки человека или животного гена, необходимого для этой терапии, и гена, кодирующего молекулу ЬАО-3; и (ίί) введение пациенту клеток, полученных в стадии (ί). Альтернативно вышеуказанные гены могут быть введены в ткань или орган пациента ίη νίνο путем прямой трансфекции генов как таковых или в носителе, который доставляет эти гены в такую ткань или орган.
Так, например, заявленная система экспрессии позволяет инъецировать оголенную ДНК или вирусный вектор непосредственно в клетки определенного типа, такие как мышечные клетки, или вводить их непосредственно в дыхательные пути (например, для лечения кистозного фиброза). Эта конструкция содержит не только нужный ген (такой как ген-регулятор проводимости (кДНК СЕТК), но также и ген ЬАО-3, предназначенный для коэкспрессии на клетке определенного типа в целях предупреждения возможного гуморального иммунного ответа, например, против капсидных аденовирусных белков, который может ограничивать эффективность повторного введения. Для устранения побочного действия, заключающегося в вызываемой химиотерапией супрессии быстро делящихся иммунных клеток, может быть использован перенос гена в гемопоэтические стволовые клетки в целях введения генов резистентности к нескольким лекарственным средствам. Для стимуляции деления стволовых клеток могут быть использованы ретровирусные векторы в комбинации с цитокинами, такими как фактор 81ее1, лиганд из готового набора, 1Ь3, ОМ-С8Е, 1Ь-6, О-С8Е, Ь1Е, 1Ь-12.
Выбранные клетки могут быть котрансфицированы, помимо гена ЬАО-3, генами, кодирующими другие иммуносупрессорные агенты, такие как 1Ь-10, ТСЕ-β, Еак-лиганд.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения вышеописанные способы используются для лечения реципиента с использованием небольшого числа представляющих интерес клеток, сконструированных так, что они экспрессируют ген ЬАО-3, который сообщает хозяину толерантность к последующему введению клеток, тканей или органов, обусловленную толерантностью к этой инфекции иммунной системы хозяина.
Более подробно настоящее изобретение описано ниже со ссылками на следующие иллюстративные примеры.
Пример 1.
Методы.
Генерирование клеток СНО, экспрессирующих трансмембранный ЬАС-3 кДНК ЬАО-3 вырезали в виде 1650 п.о.Х1о-фрагмента из плазмиды рСЭМ8 (Ιηνίΐτο^η 8ап Э|едо СА) и очищали с помощью электрофореза в агарозном геле.
Фрагмент субклонировали в экспрессирующий вектор млекопитающего рСЬН3АХ8У2ПНЕК.йа1У8А (ϋα) (фиг. 3), гидролизованный ферментом Х1о. Клетки СНОΌυΚΧ (ЭНЕК-) трансфецировали с использованием конструкции ЭаЬАС-3 методом осаждения СаРО4. Трансфецированные клетки культивировали в среде для отбора (в среде МЕМ без дезокси- и рибонуклеотидов + 10% диализованной фетальной бычьей сыворотки + 1% Ьглутамина + 0,02 мкМ метотрексата). Экспрессию ЬАС-3 оценивали посредством Вестернблоттинга на лизированных препаратах клеточных мембран и периодически оценивали путем проведения проточной цитометрии с использованием моноклонального антитела 17В4 против ЬАС-3.
Трансплантация клеток СНО мышам
Клетки яичек китайского хомячка (СНО), либо нетрансфецированные (дикого типа), либо трансфецированные полноразмерным ЬАО-3 человека или кДНК ЬН человека, были отделены от пластиковых колб и суспендированы в минимальной поддерживающей среде, модифи цированной по способу Дульбекко (ΌΜΕΜ), при концентрации 1,75 х 107 клеток/мл. 26 самок 7-9 недельных мышей С57ВЬ/6 разделяли на 7 групп, как указано в табл. 1, и 200 мл указанной клеточной суспензии, содержащей 3,5 х 106 клеток, подкожно инъецировали каждому животному в правый бок. В группах 3, 6 и 7 тем же мышам в правый бок инъецировали ЬАО-3 трансфецированные клетки, а в другой бок инъецировали контрольные клетки (ЬНтрансфецированные или нетрансфецированные). Через четыре дня после инъекции мышей умерщвляли путем ингаляции СО2 и кожу в месте инъекции вскрывали для осмотра участка инъекции.
Таблица1
Экспериментальные группы
| Группа | № мыши | Идентификация мышей | Клетки СНО, инъецированные в правый бок | Клетки СНО, инъецированные в левый бок |
| 1 | 5 | 1-5 | дикого типа | - |
| 2 | 5 | 6-10 | ЬАО-3 | - |
| 3 | 5 | 11-15 | ЬАО-3 | дикого типа |
| 4 | 2 | 16 и 17 | ЬН | - |
| 5 | 5 | 18-22 | ЬАО-3 | - |
| 6 | 2 | 23 и 24 | ЬАО-3 | дикого типа |
| 7 | 2 | 25 и 26 | ЬАО-3 | ЬН |
Оценка цитотоксичности против клеток
СНО
Пяти самкам мышей С57ВЬ/6 на каждую группу подкожно (8.с.) инъецировали 4 х 105 клеток СНО, трансфецированных либо человеческим ЬН, либо кДНК человеческого ЬАО-3. Через 14 дней мышей умерщвляли и удаляли селезенку для получения суспензии спленоцитов. Суспензии спленоцитов (эффекторы) разводили в культуральной среде (ΚΡΜΙ 1640 + 10% фетальной бычьей сыворотки + антибиотики) при плотности 107 клеток/мл и засевали в тройных дубликатах с различными разведениями в целях получения различных отношений эффектор/мишень; для каждой суспензии приготавливали 2 планшета. В эти планшеты (один для каждой мишени) добавляли клетки-мишени (либо ЬН-, либо ЬАО-3-трансфецированные клетки) при концентрации 5 х 103 клеток/100 мкл, меченные 51 Сг. После 20-часового культивирования при 37°С из каждой лунки брали 20 мкл супернатанта и оценивали высвобождение 51 Сг с помощью жидкостного сцинтиллятора. Цитотоксическую активность вычисляли как процент лизиса в соответствии со следующей формулой:
(Число имп./минобразец - Число имп./минспонт) % =-------х 100 (Число имп./минмакс - Число имп./мииСПонт) где спонт и макс относятся к лункам, содержащим культуральную среду (спонтанное вы свобождение Сг из клеток-мишеней) и 1% Тритон Х (максимальное высвобождение Сг), вместо суспензии эффектора соответственно.
Результаты.
Трансплантация клеток СНО мышам
У большинства мышей, которым были введены ЬАО-3-трансфецированные клетки, обнаруживались белые узелковые утолщения в месте инъекции, которые не наблюдались у мышей, обработанных клетками СНО дикого типа, или у мышей, обработанных ЬНтрансфецированными клетками СНО. У большинства мышей, инъекция клеток СНО дикого типа вызывала появление диффузной геморрагии в месте инъекции. Это явление было меньше выражено у животных, которым инъецировали ЬН-траисфецированные клетки. У мышей, которым инъецировали как клетки дикого типа, так и ЬАО-3-трансфецированные клетки СНО в разные участки, эти узелковые утолщения наблюдались только в месте инъекции в случае клеток дикого типа, тогда как геморрагии наблюдались в месте другой инъекции (табл. 2).
Гистологический анализ, осуществленный ранее в аналогичном эксперименте, выявил присутствие гетерологичных клеток в узелковых утолщениях. Результаты этого эксперимента показаны на прилагаемых чертежах (см. табл. 1 для идентификации мышей) и систематизированы в табл. 3.
Таблица 2
| Инъецированные клетки | № мышей | Частота (число положительных данных/общее число инъецированных участков) | |
| геморрагия | узловое утолщение | ||
| ЬАС-3 | 10 | 1/10 | 9/10 |
| Дикого типа | 5 | 3/5 | 0/5 |
| ЬН | 2 | 1/2 | 1/2 |
| ЬАС-3 + дикого типа* | 7 | 0/7(а) 5/7(с) | 7/7(а) 1/7(с) |
| ЬАС-3+ЬН* | 2 | 0/2(Ь) 1/2(а) | 0/2(Ь) 2/2(а) |
* Клетки каждого типа были инъецированы отдельно в один бок (a) = участок, в который вводили ЬЛС-3 (b) = участок, в который вводили ЬН (c) = участок, в который вводили \УТ
Таблица 3
| Инъецированные клетки | Частота (число положительных данных/общее число инъецированных участков) | |
| геморрагия | узловые утолщения | |
| СНО дикого типа | 8/12 (67%) | 0/12 (0%) |
| ЬН СНО | 1/4 (25%) | 1/4 (25%) |
| ЬАС-3 СНО | 2/19 (11%) | 16/19 (84%) |
Цитотоксичность против клеток СНО
Экспрессия ЬЛС-3 на поверхности клеток СНО не влияет на способность мышей к иммунологическому примированию против ксеногенных клеток. Действительно, спленоциты мышей, которым были инъецированы клетки ЬЛС-3-СНО, лизировали оба типа клетокмишеней так же эффективно, как и клетки мышей, примированных клетками ЬН-СНО, и более эффективно, чем клетки непримированных мышей. Однако экспрессия ЬЛС-3 на клеточной поверхности ассоциировалась с более низкой восприимчивостью к цитотоксической активности, индуцированной путем иммунизации мышей, по отношению к клеткам-мишеням, как можно видеть из сравнения процента лизиса на фиг. 1 и 2. При этом природная цитотоксичность, индуцированная спленоцитами от непримированных мышей, не снижалась при экспрессии ЬЛС-3 на поверхности клетки. Это свидетельствует о том, что экспрессия ЬЛС-3 на поверхности клетки способствует снижению активности эфферентной ветви цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ). ЦТЛ представляют собой один из типов эффекторных клеток, которые играют важную роль в отторжении трансплантированных органов (С. Вегке, 1993), а поэтому ингибирование их функции может продлить жизнь аллотрансплантатов.
Литература
1. ТпеЬе1 е! а1., 1. Ехр. Меб., 171: 1393, 1990
2. Ва1хетак е! а1., 1. Ехр. Меб., 176: 327, 1992
3. Ниагб е! а1., 1ттиподеиейск, 39: 213, 1994А
4. Ниагб е! а1., Еиг. 1. 1тиио1., 24: 3216, 1994 В.
5. Ниагб е! а1., Еиг. 1. 1ттиио1., 26: 11801186, 1996
6. М|уахакт е! а1., 8с1еисе, 272: 405-408, 1996
7. 8икик1 е! а1., 1. Ехр. Меб., 182: 477-486, 1995
8. Ве11дгаи е! а1., №!иге, 377: 630-632, 1995
9. Ьаи е! а1., 8аеисе, 273: 109-112, 1996
10. 8иЬта1таш е! а1., Мо1. Се11. В1о1., 1: 854864, 1981
11. Ьикк1 аиб Во!сйаи, Ыа!иге 293: 79-81, 1981
12. Иббек аиб Сообтаи, 1. Мо1. Арр1. Сеиебс 1: 3-18, 1981
13. Натег аиб ^аШид, 1. Мо1. Арр1. Сеиебс 1: 273-288, 1982
14. 061 е! а1., 8с1еисе, 259: 974, 1993
15. Эектеу е! а1., 1. С1т. 1иуек., 97: 217225, 1996
16. Кегиаи е! а1., Тгаикр1аи1абои, 43: 842, 1987
17. Кохагкку аиб ^бкои, Ситтеи! Оршюик Сеие!. Эеу., 3: 499, 1993
18. Вагг е! а1., Сеие Тйетару, 1: 51, 1992
19. 8баботб е! а1., 1. С1ш. 1иуек, 90: 626,
1992
20. ВокеиеШ е! а1., Се11 68: 143, 1992
21. Ьетатсбаиб е! а1., ΡΝΑ8, 89: 6482,1992
22. Тпра111у е! а1., ΡΝΑ8, 91: 11557, 1994
23. В1 е! а1., Нитам Сеие Тбегару 4: 725,
1993
Claims (15)
1. Применение штамма генетически сконструированных эукариотических клеток, содержащих ДНК, кодирующую трансмембранный белок ЬАС-3, экспрессирующийся на поверхности указанных клеток, для защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина.
2. Применение по п.1, где указанная ДНК, кодирующая белок ЬАС-3, является экзогенной.
3. Применение по π. 1, где указанная ДНК, кодирующая белок ЬАС-3. является эндогенной и ее экспрессия активируется или модифицируется путем направленного встраивания регуляторной последовательности и/или амплифицируемого гена посредством гомологичной рекомбинации.
4. Применение по любому из пи. 1-3, где указанные клетки принадлежат ткани или органу, подлежащим трансплантации.
5. Применение по любому из пи. 1-3, где указанные клетки являются клетками-хозяевами для генной терапии.
6. Применение по и. 5, где генная терапия является соматической или ех νίνο генной терапией.
7. Применение по любому из пи. 1-6, где указанные клетки являются клетками трансгенного животного.
8. Применение по любому из пи. 1-7, где указанные клетки выбраны из миобластов, фибробластов, гемопоэтических стволовых клеток, эмбриональных стволовых клеток, гепатоцитов плода, эндотелиальных клеток пупочной вены или клеток СНО.
9. Применение комбинации штамма генетически сконструированных эукариотических клеток, содержащих ДНК, кодирующую трансмембранный белок ЬАС-3, экспрессирующийся на поверхности указанных клеток, и дополнительного иммуносупрессорного агента, например 1Ь-10, ТСР-β или Рак-лиганда, для защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина.
10. Применение по п.9, где указанные клетки являются клетками трансгенного животного.
11. Применение по п.9 или 10, где указанные клетки выбраны из миобластов, фибробластов, гемопоэтических стволовых клеток, эмбриональных стволовых клеток, гепатоцитов плода, эндотелиальных клеток пупочной вены или клеток СНО.
12. Применение штамма генетически сконструированных эукариотических клеток, содержащих ДНК, кодирующую трансмембранный белок ЬАС-3, экспрессирующийся на поверхности указанных клеток, и ген тимидинкиназы (1к), который сообщает этим клеткам восприимчивость к системе самоубийства под действием 1к-ганцикловира, для защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина.
13. Применение по и. 12, где указанные клетки являются клетками трансгенного животного.
14. Применение по и. 12 или 13, где указанные клетки выбраны из миобластов, фибробластов, гемопоэтических стволовых клеток, эмбриональных стволовых клеток, гепатоцитов плода, эндотелиальных клеток пупочной вены или клеток СНО.
15. Применение штамма генетически сконструированных эукариотических клеток, содержащих ДНК, кодирующую трансмембранный белок ЬАСг-3, экспрессирующийся на поверхности указанных клеток, для изготовления лекарственного средства для индуцирования защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/EP1996/005280 WO1998023748A1 (en) | 1996-11-29 | 1996-11-29 | Methods for preventing graft rejection in transplantation and for producing a universal gene therapy host cell using lymphocyte activation (lag-3) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA199900507A1 EA199900507A1 (ru) | 2000-02-28 |
| EA003772B1 true EA003772B1 (ru) | 2003-08-28 |
Family
ID=8166413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA199900507A EA003772B1 (ru) | 1996-11-29 | 1996-11-29 | Средство для обеспечения защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина на основе штамма генетически сконструированных эукариотических клеток, содержащих днк, кодирующую трансмембранный белок lag-3 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6500422B2 (ru) |
| EP (1) | EP0941329B1 (ru) |
| JP (1) | JP3920928B2 (ru) |
| KR (1) | KR100481230B1 (ru) |
| AR (1) | AR018489A1 (ru) |
| AT (1) | ATE271607T1 (ru) |
| AU (1) | AU733825B2 (ru) |
| BR (1) | BR9612821A (ru) |
| CA (1) | CA2272130C (ru) |
| DE (1) | DE69632967T2 (ru) |
| DK (1) | DK0941329T3 (ru) |
| EA (1) | EA003772B1 (ru) |
| ES (1) | ES2225901T3 (ru) |
| HK (1) | HK1023599A1 (ru) |
| IL (1) | IL130168A (ru) |
| NO (1) | NO324378B1 (ru) |
| PT (1) | PT941329E (ru) |
| UA (1) | UA73270C2 (ru) |
| WO (1) | WO1998023748A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA9710737B (ru) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100481230B1 (ko) * | 1996-11-29 | 2005-04-07 | 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이. | 이식에서 이식편 거부를 예방하고, 보편적인 유전자 치료 숙주세포를 생산하는 방법 |
| ES2439580T3 (es) | 2003-02-28 | 2014-01-23 | The Johns Hopkins University | Regulación de células T |
| KR20050082389A (ko) * | 2004-02-18 | 2005-08-23 | 메덱스젠 주식회사 | 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체를 포함하는 장기이식합병증 치료용 약제학적 조성물 |
| EP2044949A1 (en) | 2007-10-05 | 2009-04-08 | Immutep | Use of recombinant lag-3 or the derivatives thereof for eliciting monocyte immune response |
| AR072999A1 (es) | 2008-08-11 | 2010-10-06 | Medarex Inc | Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos |
| UY34887A (es) | 2012-07-02 | 2013-12-31 | Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware | Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos |
| SG11201601763SA (en) | 2013-09-20 | 2016-04-28 | Bristol Myers Squibb Co | Combination of anti-lag-3 antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat tumors |
| GB201322626D0 (en) | 2013-12-19 | 2014-02-05 | Immutep S A | Combined preparations for the treatment of cancer |
| JO3663B1 (ar) | 2014-08-19 | 2020-08-27 | Merck Sharp & Dohme | الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين |
| GB201500374D0 (en) | 2015-01-09 | 2015-02-25 | Immutep S A | Combined preparations for the treatment of cancer |
| WO2017055404A1 (en) | 2015-10-02 | 2017-04-06 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3 |
| JP7000322B2 (ja) | 2015-12-16 | 2022-02-04 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション | 抗ｌａｇ３抗体および抗原結合性フラグメント |
| WO2018184964A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15 |
| US11285207B2 (en) | 2017-04-05 | 2022-03-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific antibodies specifically binding to PD1 and LAG3 |
| US11723975B2 (en) | 2017-05-30 | 2023-08-15 | Bristol-Myers Squibb Company | Compositions comprising an anti-LAG-3 antibody or an anti-LAG-3 antibody and an anti-PD-1 or anti-PD-L1 antibody |
| EP4306542A3 (en) | 2017-05-30 | 2024-04-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Treatment of lag-3 positive tumors |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2656800B1 (fr) * | 1990-01-08 | 1992-05-15 | Roussy Inst Gustave | Nouvelles proteines produits par les lymphocytes humains, sequence d'adn codant pour ces proteines et applications pharmaceutiques et biologiques. |
| US5876708A (en) * | 1992-02-19 | 1999-03-02 | The General Hospital Corporation | Allogeneic and xenogeneic transplantation |
| IL113617A (en) | 1994-05-06 | 2007-09-20 | Florence Faure | Use of LAG-3 antibodies to prepare a therapeutic agent that stimulates the immune system |
| KR100481230B1 (ko) * | 1996-11-29 | 2005-04-07 | 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이. | 이식에서 이식편 거부를 예방하고, 보편적인 유전자 치료 숙주세포를 생산하는 방법 |
-
1996
- 1996-11-29 KR KR10-1999-7004274A patent/KR100481230B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-11-29 JP JP52611398A patent/JP3920928B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-29 IL IL130168A patent/IL130168A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-11-29 BR BR9612821-6A patent/BR9612821A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-11-29 CA CA002272130A patent/CA2272130C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-29 AT AT96940658T patent/ATE271607T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-11-29 EP EP96940658A patent/EP0941329B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-29 AU AU10667/97A patent/AU733825B2/en not_active Ceased
- 1996-11-29 EA EA199900507A patent/EA003772B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-11-29 UA UA99063590A patent/UA73270C2/uk unknown
- 1996-11-29 US US09/319,147 patent/US6500422B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-29 WO PCT/EP1996/005280 patent/WO1998023748A1/en active IP Right Grant
- 1996-11-29 DE DE69632967T patent/DE69632967T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-29 DK DK96940658T patent/DK0941329T3/da active
- 1996-11-29 ES ES96940658T patent/ES2225901T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-29 PT PT96940658T patent/PT941329E/pt unknown
-
1997
- 1997-11-28 AR ARP970105619A patent/AR018489A1/es not_active Application Discontinuation
- 1997-11-28 ZA ZA9710737A patent/ZA9710737B/xx unknown
-
1999
- 1999-05-27 NO NO19992569A patent/NO324378B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-05-05 HK HK00102732A patent/HK1023599A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69632967T2 (de) | 2005-08-11 |
| NO324378B1 (no) | 2007-10-01 |
| IL130168A0 (en) | 2000-06-01 |
| JP3920928B2 (ja) | 2007-05-30 |
| US20020081282A1 (en) | 2002-06-27 |
| US6500422B2 (en) | 2002-12-31 |
| IL130168A (en) | 2006-09-05 |
| WO1998023748A1 (en) | 1998-06-04 |
| ATE271607T1 (de) | 2004-08-15 |
| NO992569D0 (no) | 1999-05-27 |
| NO992569L (no) | 1999-05-27 |
| EP0941329A1 (en) | 1999-09-15 |
| CA2272130C (en) | 2007-10-23 |
| ES2225901T3 (es) | 2005-03-16 |
| AU733825B2 (en) | 2001-05-24 |
| KR100481230B1 (ko) | 2005-04-07 |
| AR018489A1 (es) | 2001-11-28 |
| EP0941329B1 (en) | 2004-07-21 |
| KR20000053291A (ko) | 2000-08-25 |
| DK0941329T3 (da) | 2004-11-29 |
| HK1023599A1 (en) | 2000-09-15 |
| PT941329E (pt) | 2004-11-30 |
| EA199900507A1 (ru) | 2000-02-28 |
| AU1066797A (en) | 1998-06-22 |
| CA2272130A1 (en) | 1998-06-04 |
| JP2001505770A (ja) | 2001-05-08 |
| DE69632967D1 (de) | 2004-08-26 |
| ZA9710737B (en) | 1998-07-30 |
| BR9612821A (pt) | 2000-04-11 |
| UA73270C2 (en) | 2005-07-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tolstoshey | Gene therapy, concepts, current trials and future directions | |
| Cournoyer et al. | Gene therapy of the immune system | |
| ES2205792T3 (es) | Celulas madre mesenquimatosas como inmunosupresores. | |
| EA003772B1 (ru) | Средство для обеспечения защиты трансплантата от отторжения иммунной системой хозяина на основе штамма генетически сконструированных эукариотических клеток, содержащих днк, кодирующую трансмембранный белок lag-3 | |
| Yasuda et al. | Local expression of immunoregulatory IL-12p40 gene prolonged syngeneic islet graft survival in diabetic NOD mice. | |
| US20090010901A1 (en) | Primary cultured adipocytes for gene therapy | |
| US9592259B2 (en) | APC-mediated tolerance induction for therapy of multiple sclerosis | |
| JP5291278B2 (ja) | 腸管における調節されたタンパク質発現のための組成物と方法 | |
| Tamura et al. | Targeted killing of migrating glioma cells by injection of HTK-modified glioma cells | |
| US20020160973A1 (en) | Use of combretastatin A4 and its prodrugs as an immune enhancing therapy | |
| Knechtle et al. | Gene theram in transdantation | |
| US6677311B1 (en) | Inducible HSV-TK in transformed cell populations | |
| MXPA99004550A (en) | Methods for preventing graft rejection in transplantation and for producing a universal gene therapy host cell using lymphocyte activation (lag-3) | |
| Evans et al. | Section Review: Biologicals & Immunologicals: Gene therapy as a treatment for rheumatoid arthritis | |
| Whartenby et al. | Gene therapy: clinical potential and relationships to drug treatment | |
| Rahim et al. | Gene therapy modalities in lung transplantation | |
| Hawthorne | Beta cell therapies for type 1 diabetes | |
| JP4879867B2 (ja) | 遺伝子治療用初代培養脂肪細胞 | |
| Vandana et al. | Gene therapy: current status and future | |
| ROY et al. | Gene therapy: current status and future | |
| Hardwick | Mechanisms of anti-tumour immune stimulation following GDEPT | |
| Tremblay | Immune Reaction Following Cell and Gene Therapy | |
| Monastersky et al. | Gene Transfer Technology: Alternative Techniques and Applications | |
| CN1234834A (zh) | 防止移植中移植排斥和产生通用基因治疗宿主细胞的方法 | |
| EP1083935A1 (en) | Prosthetic implant and methods of use for therapeutic gene expression |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |