DE69632967T2

DE69632967T2 - Verfahren zur Verhinderung der Transplantabstoßung bei einer Transplantation und zur Herstellung einer universalen Gentherapie-Wirtszelle unter Anwendung von Lymphocyten-Aktivierungsgen (LAG-3)

Info

Publication number: DE69632967T2
Application number: DE69632967T
Authority: DE
Inventors: Mauro Biffoni; Ruben Papoian
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1996-11-29
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2016-11-30
Also published as: PT941329E; NO992569L; US20020081282A1; CA2272130C; AU733825B2; CA2272130A1; WO1998023748A1; KR20000053291A; ATE271607T1; DE69632967D1; UA73270C2; AR018489A1; ZA9710737B; JP3920928B2; EP0941329A1; IL130168A; HK1023599A1; KR100481230B1; EA199900507A1; IL130168A0

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Verhinderung der Transplantatabstoßung von transplantierten Organen, Geweben oder Zellen, besonders solche Methoden, welche die gentechnische Veränderung eines Zelltyps umfassen, um LAG-3-Protein zu exprimieren, wenn er in einen Wirt transplantiert wird. Besonders betrifft die Erfindung die Herstellung einer universalen Gentherapie-Wirtszelle, die das LAG-3-Protein an ihrer Oberfläche exprimiert.
Beschreibung des Standes der Technik
Das Lymphocyten-Aktivierungsgen (LAG-3) ist ein Mitglied der Immunoglobulin-Familie, das selektiv in humanen aktivierten T- (sowohl CD4⁺ als auch CD8⁺) und NK-Zellen transkribiert wird (Triebel et al., 1990). Die Isolierung und das Klonen von LAG-3 wurden beschrieben in der Patentanmeldung WO 91/10 682. Die Sequenzdaten, der Vergleich der Exon-Intron-Organisation und die chromosomale Lokalisierung zeigten, daß LAG-3 nahe verwandt ist mit CD4 (Baixeras et al., 1992). Die nahe Verwandtschaft zwischen LAG-3 und CD4 wurde noch deutlicher gemacht durch den Nachweis, daß beide den gleichen Liganden, d. h. MHC-Klasse II Moleküle aufweisen (Baixeras et al., 1992). Jedoch bindet LAG-3 im Gegensatz zu CD4 nicht das Human-Immun-Defizienzvirus GP120 (Baixeras et al., 1992). In vivo wurde die LAG-3-Exprimierung weder in primären lymphoiden Organen, wie Milz, mukosa-assoziiertem Lymphoidgewebe oder normalen Lymphknoten gefunden. Jedoch wurde er ohne weiteres nachgewiesen in entzündeten Mandeln oder Lymphknoten mit follikularer Hyperplasia, was die Ansicht stützt, daß selbst in vivo LAG-3 nach Aktivierung exprimiert wird (Huard et al., 1994A). Die antigenspezifische Stimulierung von T-Zell-Klonen in Gegenwart von anti-LAG-3-monoklonalem Antikörper (mAb) führt zu gesteigertem Thymidineinbau, höherer Exprimierung des Aktivierungsmarkers CD25 und gesteigerter Cytokinproduktion (Huard et al., 1994B).
Entsprechend hinderte die Zugabe einer löslichen rekombinanten Form von LAG-3 die antigenspezifische T-Zell-Proliferation, was auf eine regulierende Rolle von LAG-3 bei der CD4⁺ T-Lymphocyten-Aktivierung (Huard, 1996) und seine Beteiligung beim Löschen von ablaufenden Immunresponsen hinweist. Neuerdings wurde gezeigt, daß LAG-3 auch als ein Korezeptor für NK-Zellen wirkt und verschiedene Arten von Tumorzellabtötung definiert, die durch das angeborene Immunsystem kontrolliert werden (Miyazaki et al., 1996).
Die Mechanismen, durch welche ein T-Zellrespons auf ein fremdes (allogenisches oder xenogenisches) Protein oder Zelle oder Organ in Gang gesetzt werden, werden ziemlich gut verstanden. Antigenpräsentierungszellen (APCs) werden zu Bereichen der Entzündung oder Schädigung (welche durch chirurgische Transplantation induziert sein kann) hingezogen. Der Bestand der T-Zellen in der Peripherie überwacht dauernd Gewebe auf das Auftreten von Pathogenen oder die Anwesenheit von fremdem (allo- oder xenogenischem) Gewebe. Sobald irgendwelche dieser Warnsignale erkannt werden, schließen die APCs das Protein ein, verdauen es und präsentieren es dem Immunsystem des Wirts.
Allogenische oder syngenische Tumorzellen sind gentechnisch verändert worden, um virales IL-10 zu exprimieren, welches bei den Tumoren lokale Anergie induziert. Eine solche Behandlung beeinflußt nicht die Abstoßung eines nicht transduzierten Tumors an einer entfernten Stelle (Suzuki et al., 1995). Es wird angenommen, daß örtlich abgegebenes IL-10 den gegenüber den transplantierten Zellen reaktiven T-Zellenbestand in einen Th2-Phänotyp verändert, der nicht cytolytisch ist und sogar schützend sein kann.
Zellen, die von Natur aus den Fas-Liganden exprimieren, sind ohne Immunsuppression über allogenische oder exogenische Schranken hinweg transplantiert worden. Die Überwachung der Implantationsstelle durch T-Zellen des Wirts führt zu ihrer Abtötung, wenn sie durch den Fas-Liganden berührt werden (Bellgrau et al., 1995). Darüber hinaus wurde die Abstoßung von pankreatischen Islet-Allografts durch die Kotransplantation von syngenischen Myoblasten verhindert, die gentechnisch verändert waren, um den Fas-Liganden zu exprimieren (Lau et al., 1996).
Das Immunsystem ist gut ausgerüstet, um rasch fremdes, erkranktes oder entzündetes Gewebe zu identifizieren und zerstört dieses rasch. Das ist stets ein Haupthindernis für die Gewebe-, Organ- und Zelltransplantation sowie für die Gentherapie gewesen. Hauptprobleme hängen im allgemeinen zusammen mit chronischer Immunsuppression, Verkapselung oder Immunisolation. Zu den unerwünschten Nebeneffekten chronischer Immunsuppression gehören eine gesteigerte Empfänglichkeit für opportunistische Infektion und Tumorbildung.
Der Wunsch nach Langzeitannahme des übertragenen Gewebes in Abwesenheit einer kontinuierlichen Immunsuppression ist seit langem ein Ziel der Humanmedizin.
Wenn hier irgendein Dokument zitiert wird, soll das keine Anerkennung bedeuten, daß ein solches Dokument ein einschlägiger Stand der Technik ist oder substantiell für die Patentfähigkeit irgendeines Patentanspruchs der vorliegenden Anmeldung ist. Jede Angabe zum Inhalt oder Datum irgendeines Dokuments beruht auf der dem Anmelder zum Zeitpunkt der Anmeldung verfügbaren Information und bedeutet nicht eine Zustimmung hinsichtlich der Richtigkeit einer solchen Angabe.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde jetzt gefunden, daß die Transplantation von Zellen, welche an ihrer Oberfläche ein LAG-3-Protein exprimieren, zu einem Schutz vor einer Abstoßung des Transplantats durch das Immunsystem des Wirts führt.
Die vorliegende Erfindung liefert also eine gentechnisch veränderte Zelle, die ein Teil eines zu transplantierenden Gewebes oder Organs sein kann und DNA enthält, die für ein Transmembran-LAG-3-Protein auf ihrer Oberfläche codiert, was zum Schutz vor Transplantatabstoßung durch das Immunsystem des Wirts führt, wobei die DNA genomische DNA oder cDNA ist. Die besagte DNA kann exogen oder in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung die endogene DNA sein, deren Expression durch gezielte Insertion einer Regulationssequenz und/oder ein amplifizierbares Gen durch homologe Rekombination aktiviert oder modifiziert wird. Das LAG-3-Protein ist ein Protein, das durch gegen LAG-3 gerichtete Antikörper erkannt wird.
Wenn die Zelle ein Teil des zu transplantierenden Gewebes oder Organs ist, kann die Transfizierung der LAG-3-DNA direkt an dem zu transplantierenden Gewebe oder Organ vorgenommen werden.
Besonders ist die Zelle eine universale Gentherapie-Wirtszelle, die geeignet ist für beispielsweise jede Art von somatischer oder "ex vivo"-Gentherapie.
In einer spezifischen Ausführungsform enthält die Gentherapie-Wirtszelle außerdem exogene DNA, die für ein interessierendes therapeutisches Mittel codiert, und die gentechnisch veränderten Zellen werden als ein therapeutisches Mittel verwendet. Der Ausdruck "therapeutisch", wie er hier verwendet wird, schließt Behandlung und/oder Prophylaxe ein.
In einer weiteren Ausführungsform ist das für ein interessierendes therapeutisches Mittel codierende Gen im Genom der Zelle vorhanden, und die Zelle enthält außerdem exogene DNA, welche für eine Regulationssequenz oder ein amplifizierbares Gen zur Aktivierung oder Modifizierung der Exprimierung des interessierenden endogenen Gens codiert.
Die erfindungsgemäße gentechnisch veränderte Zelle kann jedenfalls auch nur die exogene LAG-3-DNA enthalten zur Verwendung in einer Mischung mit anderen Gentherapie-Wirtszellen, welche die interessierende therapeutische DNA enthalten.
Die erfindungsgemäße Zelle wird vorzugsweise ausgewählt aus Myoblasten, Fibroblasten, blutbildenden Stammzellen, fötalen Leberzellen, Nabelvenenendothelzellen und CHO-Zellen.
Zellen wie oben, die von transgenen Tieren abgeleitet sind, liegen ebenfalls im Bereich der Erfindung.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Verwendung eines Transmembran-LAG-3-Proteins einschließlich dessen Muteine und Varianten, das an der Oberfläche der Zellen exprimiert ist, in der Herstellung eines Arzneimittels zum Verleihen eines Schutzes vor dem Abstoßen eines Transplantats durch das Immunsystem des Wirts. Weiterhin sieht die Erfindung die Verwendung einer Zelle vor, die DNA enthält, die für ein Transmembran-LAG-3-Protein codiert, das an der Oberfläche der Zelle exprimiert wird, bei der Herstellung eines Arzneimittels zum Verleihen eines Schutzes vor Transplantatabstoßung durch das Immunsystem eines Wirts.
Ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegt die Verwendung der genannten, an ihrer Oberfläche LAG-3 exprimierenden Zelle bei der Herstellung eines Medikaments, das mit zu transplantierenden Zellen, Geweben oder Organen gemischt werden soll, um Schutz vor Transplantatabstoßung durch das Immunsystem eines Wirts zu bewirken.
Figurenbeschreibung
1 Cytotoxische Aktivität gegen LH-CHO-Zellen von Splenocyten von Mäusen, die mit LAG-3-CHO- oder LH-CHO-Zellen behandelt (primed) wurden. Der Mittelwert (±SD) von fünf Mäusen, wie in der Legende angegeben, behandelt; zwei nicht behandelte Mäuse wurden ebenfalls bewertet.
2 Cytotoxische Aktivität gegen LAG-3-CHO-Zellen von Splenocyten von Mäusen, die mit LAG-3-CHO- oder LH-CHO-Zellen behandelt (primed) waren. Der Mittelwert (±SD) von fünf Mäusen, wie in der Legende angegeben, behandelt; zwei nicht behandelte Mäuse wurden ebenfalls bewertet.
3 Karte des Dα-Säugetierexprimierungsvektors.
Verwendete Abkürzung: DHFR, Dehydrofolat-Transkriptionseinheit (Subraimani et al., 1981); pML, Derivat von pBR322 (Lusky und Botchan. 1981); hAIVSA, Fragment vom Intron A der α-Subeinheit von Human-Glucoproteinhormonen (Fiddes und Goodman, 1981); MMT-1-Promoter des Maus-Metallothioneins 1 (Harner und Walling, 1982).
Genauere Beschreibung der Erfindung
Hunderttausende von Menschen sterben jedes Jahr als Folge eines Herz-, Nieren-, Leber-, Lungen- oder Pankreasversagens. Die einzige wirksamste Therapie ist Transplantation.
Eine Therapie, die mit der Transplantation von Zellen, Geweben oder Organen arbeitet, induziert im Wirt einen allgemeinen Immunabwehrzustand bezüglich der transplantierten Zelle, des Gewebes oder Organs. Erwünscht ist es, einen spezifischen Transplantatschutz gegen die Abstoßung durch das Immunsystem des Wirts zu erhalten, besonders bei allogener Transplantation, xenogener Transplantation und Gentherapie. Es ist auch erwünscht, Toleranz gegen Tumorgewebe zu inhibieren oder auf andere Weise dem Immunsystem des Wirts zu ermöglichen, Tumorgewebe anzugreifen.
Demgemäß ist die Erfindung auf alle oben beschriebenen Methoden gerichtet, um die Erkenntnis zu verwenden, daß die Transplantation von Zellen oder Geweben, welche ein Transmembran-LAG-3-Protein exprimieren, zum Schutz vor Transplantatabstoßung durch das Immunsystem des Wirts führt.
Die Erfindung verwendet das neu entdeckte Gen und Protein, LAG-3, das normalerweise an aktivierten T-Zellen und aktivierten NK-Zellen exprimiert wird.
Die Definition "Transmembran-LAG-3Protein", wie hier verwendet, bezieht sich auf jedes Transmembran-Protein, das die extracytoplasmatische Domäne von LAG-3 enthält, dessen Salze, funktionelle Derivate, Vorläufer und aktive Fraktionen sowie seine aktiven Mutanten und seine aktiven Varianten, welche alle an der Oberfläche einer Zelle exprimiert werden.
Die Definition bezieht sich auch auf ein Transmembran-Protein, das in seinem natürlichen Zustand exprimiert wird oder mit einem anderen Protein, wie einem Glycosyl-Phosphatidylinositol-Anker oder irgendeinem anderen relevanten Fragment eines anderen Transmembran-Proteins, beispielsweise TNF-Rezeptor, MPL-Ligand oder ein Transmembran-Immunglobulin fusioniert sein kann, beispielsweise durch gentechnische Veränderung.
Die Definition "Salze", wie hier verwendet, bezieht sich sowohl auf Salze der Carboxylgruppen wie auch auf Salze der Aminofunktion der Verbindung, die durch bekannte Methoden erhältlich sind. Zu den Salzen der Carboxylgruppen gehören anorganische Salze, wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Calciumsalze und Salze mit organischen Basen, wie sie mit einem Amin, wie Triethanolamin, Arginin oder Lysin, gebildet werden. Zu den Salzen der Aminogruppen gehören beispielsweise Salze mit anorganischen Säuren, wie Salzsäure, und mit organischen Säuren, wie Essigsäure.
Die Definition "funktionelle Derivate", wie hier verwendet, bezieht sich auf Derivate, die nach bekannten Methoden hergestellt werden können ausgehend von den funktionellen Gruppen, die an den Seitenketten der Aminosäureeinheiten oder an den endständigen N- oder C-Gruppen vorhanden sind, und liegen im Rahmen der Erfindung, wenn sie pharmazeutisch annehmbar sind, d. h. wenn sie die Proteinaktivität nicht zerstören oder den sie enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen keine Toxizität verleihen. Zu solchen Derivaten gehören beispielsweise Ester oder aliphatische Amide der Carboxylgruppen und N-Acylderivate der freien Aminogruppen oder O-Acylderivate freier Hydroxylgruppen, und sie werden gebildet mit Acylgruppen, wie beispielsweise Alkanoyl- oder Aroylgruppen.
Die "Vorläufer " sind Verbindungen, die im menschlichen oder tierischen Körper zu LAG-3 umgewandelt werden.
Als "aktive Fraktionen" des Proteins bezeichnet die Erfindung jedes Fragment oder jeden Vorläufer der Polypeptidkette der Verbindung selbst, allein oder in Verbindung mit verwandten Molekülen oder Resten, die daran gebunden sind, beispielsweise Zucker- oder Phosphatresten, oder Aggregate des Polypeptidmoleküls, wenn solche Fragmente oder Vorläufer die gleiche Aktivität des LAG-3 als Arzneimittel zeigen.
Bevorzugte "aktive Fraktionen" sind lösliche Fraktionen vom extrazellularen Teil des LAG-3-Proteins, einschließlich einer oder mehrerer der vier Domänen, D1, D2, D3, D4 der extracytoplasmatischen Domäne des LAG-3.
Die Definition "aktive Mutanten", wie hier verwendet, bezieht sich auf andere Proteine oder Polypeptide, worin eine oder mehrere Aminosäuren der Struktur entfernt oder durch andere Aminosäuren ersetzt sind, oder eine oder mehrere Aminosäuren an die Sequenz addiert sind, um Polypeptide oder Proteine mit der gleichen Aktivität wie LAG-3 zu erhalten. Beispielsweise können Arg 73 und/oder Arg 75 und/oder Arg 76 mit einer anderen Aminosäure, vorzugsweise mit Glu substituiert sein.
Die „aktiven Varianten" des LAG-3 sind in verschiedener Weise gespleißte Varianten sowie alle primären Gentranskripte, die sich von alternativen Verbindungsmechanismen an verschiedenen Spaltstellen des Gens ableiten. Bevorzugte Varianten sind lösliche oder Transmembran-Proteine, denen die D3 und/oder D4 Domänen des extrazellularen Teils der LAG-3 fehlen, und die gegebenenfalls einige wenige zusätzliche Aminosäuren nach der D2 oder D3 Domäne enthalten.
Die Exprimierung des Transmembran-LAG-3-Proteins an der Oberfläche einer Zelle wird durch immunreaktive Methoden verifiziert. Das Transmembran-Protein wird beispielsweise durch die Anti-LAG-3-Antikörper 11E3 (Deposit Nr. CNCM I-1612), 17B4 (Deposit Nr. CNCM I-1240) oder 15A9 (Deposit Nr. CNCM I-1239) erkannt.
Die Erfindung betrifft auch eine Mischung von Polypeptiden und Derivaten wie oben angegeben.
Bei der Verwendung in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen sollen die Ausdrücke „LAG-3", „LAG-3-Protein" oder „LAG-3-Molekül" die natürlichen, synthetischen und rekombinanten Formen des Polypeptids sowie alle die oben angegebenen Definitionen umfassen.
Die erfindungsgemäßen Zellen können aus Primär- oder Sekundärzellen ausgewählt werden. Wie hier verwendet, umfaßt der Ausdruck Primärzellen Zellen, die in einer Suspension von Zellen vorhanden sind, die von einer Wirbeltiergewebequelle isoliert wurden (bevor sie ausplattiert wurden, d. h. auf ein Gewebekultursubstrat wie eine Schale oder in einen Kolben aufgebracht wurden), sowie Zellen, die in einem von Gewebe abgeleiteten Explant vorhanden sind, beide der vorigen Typen von Zellen zum ersten Mal ausplattiert, und Zellsuspensionen, die von diesen ausplattierten Zellen abgeleitet sind. Der Ausdruck Sekundärzelle oder Zellstamm bezieht sich auf Zellen in allen nachfolgenden Kulturstufen. Das heißt, wenn eine ausplattierte Primärzelle das erste Mal vom Kultursubstrat entfernt und wieder ausplattiert (einer Passage unterworfen) wird, wird sie hier als eine Sekundärzelle bezeichnet, ebenso wie alle Zellen in anschließenden Passagen. Sekundärzellen sind Zellstämme, die aus Sekundärzellen bestehen, die einer oder mehreren Passagen unterworfen wurden. Ein Zellstamm besteht aus Sekundärzellen, die 1) eine oder mehrere Passagen durchlaufen haben; 2) eine endliche Zahl von mittleren Populationsverdoppelungen in der Kultur aufweisen; 3) die Eigenschaften von kontaktinhibiertem, von der Verankerung abhängigen Wachstum zeigen (Verankerungsabhängigkeit gilt nicht für Zellen, die in Suspensionskultur vermehrt werden) und 4) nicht immortalisiert sind. Ein „klonaler Zellstamm" ist definiert als ein Zellstamm, der von einer einzigen Gründerzelle abgeleitet ist. Ein „heterogener Zellstamm" ist definiert als ein Zellstamm, der von zwei oder mehr Gründerzellen abgeleitet ist.
Die Erfindung umfaßt primäre und sekundäre somatische Zellen, wie Fibroblasten, Keratinozyten, Epithelzellen, Endothelzellen, Glialzellen, Neuralzellen, geformte Elemente des Bluts, Muskelzellen, andere somatische Zellen, die kultiviert werden können und Vorläufer somatischer Zellen, die mit exogener DNA transfiziert worden sind, die stabil in ihre Genome integriert ist oder in den Zellen episomal exprimiert wird. Die erhaltenen Zellen werden jeweils als transfizierte Primärzellen und transfizierte Sekundärzellen bezeichnet.
Wenn das für ein LAG-3-Molekül codierende Gen in Säugetierzellen inseriert wird und die Zellen in einen allogenischen oder xenogenischen Wirt transplantiert werden, werden sie vom Immunsystem des Wirts erkannt, jedoch erfolgt kein Immunrespons.
Das Immunsystem des Wirts wird unfähig, die Zellen abzustoßen, die sonst abgestoßen worden wären, wenn sie nicht genetisch so verändert worden wären, daß sie das LAG-3-Molekül an ihrer Zelloberfläche exprimieren. LAG-3 kann auch auf der Zelloberfläche eines nicht verwandten Zelltyps exprimiert und mit den zu transplantierenden Zellen oder Geweben gemischt werden, wobei ähnliche Ergebnisse wie die oben beschriebenen erhalten werden. So bezieht sich diese Erfindung auf die Transplantation von Zellen, Geweben oder Organen ohne allgemeine Immunsuppression.
Diese Zellen, Gewebe oder Organe werden transplantiert, um Proteine zu liefern oder bestimmte Funktionen zu erfüllen, um bestimmte Krankheiten zu behandeln. Sie werden vom Wirt akzeptiert durch die Verwendung einer Methode, bei der dem Immunsystem des Wirts LAG-3 präsentiert wird.
Die Verhinderung der Transplantatabstoßung von spezifischen Zellen, Geweben oder Organen bei Empfängern kann auch erreicht werden durch gemeinsame Verabreichung von Fibroblasten oder anderen primären oder sekundären Zellen, die genetisch verändert wurden, um LAG-3 zu exprimieren. Dieser Schutzzustand kann zurückzuführen sein auf örtliche oder allgemeine Inhibierung von Mechanismen, welche Immunresponse vermitteln. Dieser Schutzzustand kann zurückzuführen sein auf Anergie, Deletion, Fehlen von Respons, Toleranz oder Verhinderung von durch Zellen vermittelter Cytotoxizität. Nachdem einmal ein Schutzzustand erreicht wurde, hält er für längere Zeitdauer an, sogar dauernd, infolge eines Phänomens wie Infektionstoleranz (Qin et al., 1993).
Die Erfindung kann verwendet werden für die Transplantation von Zellen, Geweben, Organen oder Wirtszellen, um Gene oder Genprodukte für verschiedene humanmedizinische Bedürfnisse zu liefern.
LAG-3-Genexprimierung kann induziert werden durch Standard-rekombinante DNA-Methoden oder durch Methoden, die homologe Rekombination verwenden, um das endoge ne LAG-3-Gen zu aktivieren. Die Zelltypen können durch irgendeine Methode erhalten werden von transgenen Tieren, welche das LAG-3-Gen in spezifischen Geweben oder in nicht verwandten Zellen exprimiert haben. Solche Zellen können dann mit den Zellen gemischt werden, bei denen Schutz vor Transplantatabstoßung gewünscht wird. Das läßt vermuten, daß die örtliche Abscheidung des immunschützenden Moleküls LAG-3 nicht systemisch wirkt. LAG-3-transduzierte nicht transformierte Fibroblaste liefern ähnliche Response in vivo. Die Immunschutzwirkungen des Inokulums der LAG-3-transduzierten Fibroblasten sind dosisabhängig jedoch unabhängig von der Quelle des LAG-3-Moleküls.
Die gemeinsame Verabreichung von LAG-3 exprimierenden Zellen inaktiviert Spender-T-Zellen und verhindert gleichzeitig einen Angriff vom Immunsystem des Wirts. Diese Behandlung induziert spezifische Anergie, Toleranz oder anderen Schutz vor durch Zellen vermittelter Cytotoxicität im Empfänger, was dann zu einer Langzeitveränderung in der Immun-Mikroumgebung führen kann, welche Schutz gegen autoreaktive T-Zellen zuläßt. Das kann erfolgen durch gemeinsame Verabreichung einer kleinen Zahl von allogenen Knochenmarkzellen von einem gesunden Spender zusammen mit humanen allogenischen Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um LAG-3 zu exprimieren. Das führt zu einer Verringerung von autoreaktiven T-Zellen durch die Entwicklung von Mikrochimerismus (Delaney et al., 1996).
Menschen mit spezifischen Krankheiten oder Mängeln können von der allogenischen Transplantation vieler verschiedener Zellen, Gewebe oder Organe profitieren. Beispielsweise werden gewöhnlich Organe, wie Leber, Niere, Herz, Bauchspeicheldrüse, Dünndarm transplantiert, und Zellen, wie Islets, Nervengewebe für die Behandlung von Parkinson-Krankheit oder fokaler Epilepsie, blutbildende Stammzellen als eine Behandlung für Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie, normale Hepatocyten zur Behandlung von Hypocholesterolämia, Herzzellen für myocardialen Infarkt, Muskelzellen für Muskelschwund sind geeignet für die Transplantation.
Allogenische Knochenmarktransplantate haben sich aus verschiedenen Gründen als schwierig erwiesen. Dazu gehören Transplantatabstoßung, Infektion durch opportunistische Infektionen als eine Folge einer Kontaminierung des Transplantats oder immununterdrückende Arzneimittel oder andere Gründe. Die Abstoßung kann zurückzuführen sein auf die Resistenz des Empfängers gegen Transplantationen von Knochenmark von Spendern und die Tendenz kompetenter Immunzellen, das Transplantat anzugreifen, d. h. Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (Graft-versus-host disease). GVHD kann unter Kontrolle gebracht werden durch Entfernung von T-Zellen aus dem Transplantat oder die gleichzeitige Verab reichung von Immunsuppressions-Arzneimitteln. Das Anwachsen des Transplantats wird verringert, wenn T-Zellen beseitigt werden.
Als ein Ergebnis der T-Zellenbeseitigung tritt häufiger ein Transplantationsmißerfolg auf. Es wird deshalb angenommen, daß sie eine wichtige Funktion für das Anwachsen erfüllen, wie die Entwicklung von Cytokinen (Kernan et al., 1987).
Es wurde gezeigt, daß bereits eine kleine Zahl von allogenischen jedoch gesunden Knochenmarkzellen das Auftreten von Autoimmun-Krankheit in experimentellen Modellen verringern oder sogar verhindern kann. Jedoch führen derartige Behandlungen zur Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (GVAD).
Knochenmarktransplantation ist auch als eine Methode zur Beseitigung bestimmter Tumore verwendet worden. Das ist angeblich zurückzuführen auf die Fähigkeit von allogenen T-Zellen, Tumorgewebe zu erkennen und abzutöten, z. B. in Transplantat-gegen-Leukämie.
In allen obigen Fällen wird allgemeine Immunsuppression vermieden, wenn die zu transplantierenden Zellen oder Organe gentechnisch mit einem für LAG-3 codierenden Gen verändert wurden, um ein LAG-3-Protein zu exprimieren, wenn sie in einen Wirt transplantiert werden, und Transplantatschutz zu induzieren.
Ein erstes Problem bei der allogenischen Transplantation ist das Fehlen von transplantierbarem Humangewebe und heutzutage übersteigt die Nachfrage nach Organen bei weitem das Angebot. Obgleich sie noch als ein experimentelles Verfahren angesehen wird, wird Xenotransplantation als eine brauchbare Alternative zur Allotransplantation angesehen. Tiere, wie Schweine oder Paviane werden jetzt als Organ- oder Zellspender in Betracht gezogen. Ein Schutz gegen Transplantatabstoßung kann wesentlich für eine erfolgreiche klinische Verwendung von Organen verschiedener Spezies sein. Eine Wirtresistenz kann wenigstens teilweise überwunden werden, beispielsweise durch Verwendung von Antikörpern gegen humane CD4, CD8, NK-Zellen oder Mikroverkapselung der zu transplantierenden Tierzellen. Erfindungsgemäß können die Tiere transgenisch verändert werden, um LAG-3-Gen in bestimmten Zelltypen wie den Islet-Zellen zu exprimieren durch Verwendung des Insulingenpromoters und Zielsystems oder eines anderen gewebespezifischen Bildungssystems.
Es wird angenommen, daß die Exprimierung des LAG-3 an Tumorgewebe eine wesentliche Rolle in der Resistenz gegen durch Zellen vermittelten Angriff gegen Tumorgewebe vom Immunsystem des Wirts spielt.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung durch die Verwendung von Gentherapie oder Ex vivo-Behandlung einer kleinen Menge von Tumorgewebe und Re- Implantation kann das Tumorgewebe gentechnisch verändert werden, um Antisense LAG-3-Moleküle oder für LAG-3-Message spezifische Ribozyme zu exprimieren. Das würde dem Immunsystem erlauben, auf das Gewebe zu reagieren und zu lernen, es zu zerstören. Eine kleine Menge des Tumorgewebes kann auch mit einem Antikörper für LAG-3 behandelt werden, um durch LAG-3 induzierte T-Zelleninhibierung zu verhindern und eine Induktion von zellularer und humoraler Immunität dagegen zu induzieren.
Die Gentherapie ist jetzt sehr erwünscht für die Behandlung verschiedener Krankheiten, einschließlich jedoch nicht begrenzt auf Adenosindeaminasedefizienz (ADA), Sichelzellenanämie, Thalassämie, Hämophilie, Diabetes, Alpha-Antitripsindefizienz, Gehirnstörungen, wie Alzheimer Krankheit und andere Krankheiten, wie Wachstumsstörungen und Herzkrankheiten, beispielsweise solche, die durch Veränderungen im Weg des Cholesterinstoffwechsels verursacht werden, und Defekte des Immunsystems.
Verschiedene Zellen können zur Transplantation in Individuen, die sie benötigen, verwendet werden, wie beispielsweise Myoblaste für Dystrophinabgabe, Zellen, die Stoffe wie TPO, GH, EPO, Faktor IX oder andere Faktoren abscheiden, Blutzellen für die Behandlung von erblichen Blutkrankheiten und andere primäre menschliche oder tierische Zellen, wie Endothelzellen, Epithelzellen, Bindegewebszellen, Fibroblasten, Mesenchymzellen, Mesothelialzellen und Parenchymalzellen.
Die Ergebnisse der Gentherapie waren bisher nicht sehr befriedigend wegen einer Anzahl von Problemen. Selbst bei den am weitesten fortgeschrittenen Versuchen, bei denen ein junges Mädchen mit dem Gen für Adenosindeaminase (ADA) behandelt wurde, erhält die Patientin immer noch wöchentliche Injektionen von PEG-ADA aus Befürchtungen, daß die Gentherapie allein nicht effektiv ist.
Einer der Nachteile der heutigen Gentherapiemaßnahmen ist das Erfordernis der individuellen Herstellung von Wirtszellen um zu versuchen, die Abstoßung der Zellen durch das Immunsystem des Wirts zu verhindern. Die Gentherapie muß auf jeweils individueller Basis erfolgen. Weiter erweist sich die Exprimierung von Transgenen gewöhnlich als vorübergehend wegen der Exprimierung anderer viraler Proteine, auf welche das Immunsystem des Wirts anspricht, selbst durch die Verwendung von autologen Zellen für Gentherapie.
Verkrüppelte adenovirale Vektoren werden verwendet, jedoch haben diese Probleme wegen der exprimierten anderen viralen Proteine, die einen Immunrespons evozieren. Hohe Konzentrationen von Virus, selbst eines verkrüppelten, stimulieren einen Entzündungsrespons und einen Immunangriff. Das Immunsystem der Wirtszelle erinnert sich an den viralen Vektor, so daß künftige Anwendungen noch weniger effektiv sein werden.
In Gentherapiemaßnahmen werden routinemäßig Adenoviren mit Replikationsdefizienz und Virusprotein, aus dem EI entfernt wurde, verwendet. Leider sind sie in erwachsenen immunkompetenten Wirten nur vorübergehend effektiv, vermutlich als Ergebnis eines Immunresponses, der gegen adenovirale oder rekombinante Proteine gerichtet ist (Kozarsky and Wilson, 1993; Barr et al., 1992; Stratford et al., 1992; Rosenfeld et al., 1992; Lemarchand et al., 1992). Daher besteht ein großer Bedarf neue Vektoren zu entwickeln, die nicht so immunogen sind, oder Methoden, welche einen immunologischen Schutz der gentechnisch veränderten Zellen zulassen.
Diese Vektoren werden mit einem hohen Titer von bis zu 10¹¹ plaquebildenden Einheiten pro ml hergestellt und infizieren viele replizierende und nicht replizierende Zellen. Man verwendet replikationsdefekte Adenoviren zur Abgabe von physiologischen Niveaus von rekombinanten Proteinen zur systemischen Zirkulation. Das LAG-3-Gen steht vorzugsweise unter der Transkriptions-Kontrolle des überall aktiven zellularen EF1α-Promoters und des 4F2HC-Enhancers (Tripathy et al., 1994).
Versuche zur Vermeidung dieses Problems wurden unternommen durch Verkapselung der Zellen und durch Immunosuppression des Wirts.
Mit den hier beschriebenen Methoden können xenogenische oder allogenische Zellen als Gentherapie-Wirte verwendet werden, die ein LAG-3-Molekül an ihre Oberfläche exprimieren, so daß Schutz vor Transplantatabstoßung durch das Immunsystem des Wirts induziert wird. Sie sind beispielsweise Myoblasten, Fibroblasten, blutbildende Stammzellen, embryonale Stammzellen, fötale Leberzellen, Nabelschnurvenenendothelzellen oder CHO-Zellen. Die Gentherapie-Wirtszellen können auch gentechnisch verändert werden, um das Herpessimplex-Thymidinkinasegen zu exprimieren. Solche Zellen können spezifisch durch Zugabe von Gancyclovir zerstört werden.
Die tk-Gancyclovir-sensiblen Zellen haben einen wesentlichen Vorteil gegenüber nicht sensitiven Zellen, indem sie jederzeit entfernt werden können (Bi et al., 1993).
Die universale Wirtszelle, die erfindungsgemäß hergestellt wird, um LAG-3 und das Hsv-tk-Gen auf ihrer Zelloberfläche zu exprimieren, erlaubt so die Erzeugung einer universalen Gentherapiewirtszelle, die ohne Immunsuppression implantiert und zu jedem Zeitpunkt zerstört werden kann, wenn ihre Aktivität nicht länger erforderlich ist.
Die erfindungsgemäßen allogenen oder xenogenen Gentherapie-Wirtszellen können gentechnisch verändert werden, um ein Transgen und/oder das LAG-3-Gen zu exprimieren, wobei irgendeine Methode des Gentransfers angewandt wird, wie, ohne Begrenzung darauf, replikationsdefekte Viren, adenoassoziertes Virus, hochwirksames Retrovirus, Direktinjekti on von DNA in Knochenmark, Elektroporation, Calziumphosphattransfizierung, Mikroinjektion, Verkapselung in Liposome oder Erythrocytenghosts. Zellen, die LAG-3 exprimieren, wie Myoblasten oder CHO-Zellen können gemeinsam verabreicht werden mit Zellen, die ein interessierendes Protein exprimieren, um dauernd transplantiert zu werden. Wenn eine vorübergehende LAG-3-Exposition angemessen ist, können die LAG-3 transfizierten Myoblasten oder CHO-Zellen ein Suizid-Gen, wie tk, enthalten, wie oben angegeben, so daß sie durch Behandlung mit Gancyclovir entfernt werden können.
Diese Methode kann verwendet werden, um die normale Funktion wiederherzustellen durch Verabreichung eines Gens oder Genprodukts oder die Entfernung oder Inaktivierung eines Gens, das für den Körper gefährlich ist (wie ein Onkogen). Dieses Ziel kann auch erreicht werden durch Implantieren von Zellen, die Ribozyme oder Antisense-cDNA abgeben, um die Produktion von unerwünschtem Protein, wie HIV-Proteinen oder Wachstumsfaktoren zu inhibieren. Die Methode kann verwendet werden, um Enzymmängel, wie Gauchers Krankheit oder ADA-Mangel zu korrigieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Erfindung gerichtet auf ein Verfahren zur Gentherapie, welches umfaßt: (i) es werden in die gewählten humanen oder tierischen Zellen das für die Therapie erforderliche Gen und das für ein LAG-3-Molekül codierende Gen inseriert; und (ii) die aus der Stufe (i) gewonnenen Zellen werden in den Patienten eingeführt. Statt dessen können die obigen Gene in ein Gewebe oder Organ eines Patienten in vivo durch direkte Transfizierung der Gene als solche oder in ein Vehikel, welches auf ein solches Gewebe oder Organ zielt, inseriert werden.
Beispielsweise erlaubt das beanspruchte Exprimierungssystem die Injektion einer nackten DNA oder eines viralen Vektors direkt in eine Zellgruppe wie Muskelzellen oder die direkte Verabreichung in die Atemwege (beispielsweise um cystische Fibrose zu behandeln). Das Konstrukt enthält nicht nur das interessierende Gen (wie den Konduktanzregulierer (CFTR cDNA) sondern auch das an dem Zelltyp zu ko-exprimierende LAG-3-Gen, um mögliche humorale Immunresponse auf beispielsweise die Adenovirus-Kapsid-Proteine zu verhindern, welche die Wirksamkeit wiederholter Verabreichungen begrenzen würden. Gentransfer in blutbildende Stammzellen kann verwendet werden zur Verabreichung von Multi-Drug-Resistenz-Genen, um eine der Nebenwirkungen von Chemotherapie-Suppression von sich rasch teilenden Immunzellen zu bekämpfen. Retrovirale Vektoren können in Kombination mit Cytokinen, wie Steel Factor, Kitligand, IL3, GM-CSF, IL6, G-CSF, LIF, IL12 verwendet werden, um die Teilung der Stammzellen zu fördern.
Die gewählten Zellen können kotransfiziert werden mit Genen, die für andere immunsuppressive Mittel codieren, wie IL10, TGFβ, Fas-Ligand, zusätzlich zum LAG-3-Gen.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden die oben beschriebenen Methoden verwendet zur Behandlung des Empfängers mit einer kleinen Anzahl von interessierenden Zellen, die gentechnisch verändert sind, um das LAG-3-Gen zu exprimieren, was den Wirt tolerant für eine folgende Verabreichung von Zellen, Geweben oder Organen macht wegen der Infektionstoleranz durch das Immunsystem des Wirts.
Die Erfindung wird nun weiter zur Erläuterung beschrieben mit Bezug auf die folgenden Beispiele:
BEISPIEL 1
Methoden
Erzeugung von CHO-Zellen, die transmembrane LAG-3 exprimieren
LAG-3-cDNA wurde als ein 1620 bp Xho-Fragment aus pCDM8-Plasmid (Invitrogen San Diego CA) herausgeschnitten und durch Agarosegel-Elektrophorese gereinigt.
Das Fragment wurde subkloniert in den pCLH3AXSV2DHFRhαIVSA(Dα)-Säugetierexpressionsvektor (3) verdaut mit Xho. CHO-DUKX(DHFR')-Zellen wurden mit dem DαLAG-3-Konstrukt durch die CaPO₄-Fällungsmethode transfiziert. Transfizierte Zellen wurden in Selektionsmedium gezüchtet (MEM Medium ohne Deoxy- und Ribonukleotide + 10% dialysiertes Fötalrinderserum + 1% L-Glutamin + 0,02 μM Methothrexat). Die Exprimierung des LAG-3 wurde überprüft durch Western Blotting auf lysierten Zellmembranpräparaten und periodisch durch durchflußzytometrische Analyse und Verwendung von Anti-LAG-3 monoklonalem Antikörper 17B4 überprüft.
Transplantation der CHO-Zellen in Mäuse
Ovarzellen von chinesischem Hamster (Chinese Hamster Ovary, CHO), entweder nicht transfiziert (Wildtyp) oder transfiziert mit Human-LAG-3 in voller Länger oder Human-LH-cDNA wurden abgelöst von Kunststoffkolben und in Dulbeccos Modifizierung von Minimum-Essentialmedium (DMEM) in einer Konzentration von 1,75 × 10⁷ Zellen/ml suspendiert. Sechsundzwanzig C57BL/6 weibliche Mäuse im Alter von 7 bis 9 Wochen wurden auf geteilt in 7 Gruppen wie in Tabelle 1 angegeben, und 200 ml der angegebenen Zellsuspension, welche 3,5 × 10⁶ Zellen enthielten, wurden subkutan in die rechte Flanke jedes Tieres injiziert. In den Gruppen 3, 6 und 7 erhielt die gleiche Maus LAG-3-transfizierte Zellen in die rechte Flanke und Kontrollzellen (LH-transfiziert oder nicht transfiziert) in die andere Flanke. Vier Tage nach der Injektion wurden die Mäuse durch CO₂-Inhalation getötet und die Haut wurde geöffnet, um die Injektionsstelle zu untersuchen.
Tabelle 1
Bewertung der Cytotoxizität gegen CHO-Zellen
Fünf C57BL/6 weiblichen Mäusen pro Gruppe wurden subkutan injiziert 4 × 10⁵ CHO-Zellen, die entweder mit Human-LH oder Human-LAG-3-cDNA transfiziert waren. Nach 14 Tagen wurden die Mäuse getötet, und die Milz wurde entfernt, um Splenocyten-Suspensionen zu erhalten. Splenocytensuspensionen (Effektoren) wurden im Kulturmedium (RPMI 1640 + 10% Fötalrinderserum + Antibiotika) verdünnt auf 10⁷ Zellen/ml und in Triplikat mit verschiedenen Verdünnungen ausplattiert, um die verschiedenen Effektor zu Zielverhältnisse zu erhalten; für jede Suspension wurden zwei Platten hergestellt. Zielzellen mit 5 × 10³ Zellen/100 μl (entweder LH- oder LAG-3-transfizierte Zellen) markiert mit ⁵¹Cr wurden den Platten zugesetzt (eine Platte für jedes Ziel). Nach 20 Stunden bei 37°C wurden 20 μl des Überstands von jedem Napf genommen und die Abgabe von ⁵¹Cr wurde durch Flüssigkeitsszintillation gemessen. Die cytotoxische Aktivität wurde berechnet als Prozent Lyse nach der folgenden Formel:
worin spont und max die Schächte mit Kulturmedium (spontane Cr-Abgabe von den Zielzellen) und Triton X 1% (maximale Cr-Abgabe) angeben, welche jeweils die Effektorsuspension ersetzen.
Ergebnisse
Transplantation von CHO-Zellen in Mäuse
Die meisten Mäuse, die LAG-3-transfizierte Zellen erhielten, zeigten einen weißen Knoten an der Injektionsstelle, der nicht in den Tieren auftrat, die mit Wildtyp-CHO behandelt waren, oder in denen, die LH-transfizierte CHO-Zellen erhielten. Die Injektion von Wildtyp-CHO-Zellen bewirkte das Auftreten einer diffusen Blutung an der Injektionsstelle in der Mehrzahl der Mäuse. Dieses Phänomen war weniger offensichtlich in Tieren, die LH-transfizierte Zellen erhielten. In den mit sowohl Wildtyp- als auch LAG-3-transfizierten CHO-Zellen an verschiedenen Stellen injizierten Mäusen trat dieser Knoten nur in der mit letzteren injizierten Stelle auf, während eine Blutung in der anderen Stelle auftrat (Tabelle 2).
Histologische Analyse, die zuvor in einem ähnlichen Experiment durchgeführt wurde, zeigte die Anwesenheit von heterologen Zellen in den Knoten. Die Ergebnisse des Experiments sind in den beigefügten Bildern dargestellt (siehe Tabelle 1 für die Identifizierung der Mäuse) und in Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 2

(a): LAG-3-Seite
(b): LH-Seite
(c): WT-Seite

Tabelle 3
Cytotoxizität gegen CHO-Zellen
Die Exprimierung von LAG-3 an der Oberfläche von CHO-Zellen beeinflußte nicht die Fähigkeit der Mäuse, sich immunologisch gegen die xenogenischen Zellen behandeln zu lassen (primed). Tatsächlich lysierten die Splenocyten von mit LAG-3-CHO-Zellen injizierten Mäusen beide Zielzellen ebenso wirksam wie diejenigen von Mäusen, die mit LH-CHO-Zellen behandelt waren und besser als nicht behandelte Mäuse. Jedoch ging die Exprimierung von LAG-3 an der Zelloberfläche einher mit einer verringerten Empfänglichkeit für die cytotoxische Aktivität, die durch Immunisierung der Mäuse gegen das Ziel induziert wurde, wie ersichtlich durch Vergleich der Prozent Lyse in 1 und 2. Die „natürliche" Cytoxizität, die von Splenocyten von nicht behandelten Mäusen ausgeübt wird, wird durch die Oberflächenexprimierung von LAG-3 nicht verringert. Das zeigt, daß LAG-3- Oberflächenexprimierung den efferenten Arm der cytotoxischen T-Lymphocyten(CTL)-Aktivität verringert. CTLs sind einer der Effektoren, die eine Hauptrolle in der Abstoßung von transplantierten Organen spielen (G. Berke, 1993) so daß die Inhibierung ihrer Funktion das Überleben von Allotransplantaten verlängern kann.
Referenzen

1. Triebel et al., J. Exp. Med., 171: 1393, 1990
2. Baixeras et al., J. Exp. Med., 176: 327, 1992
3. Huard et al., Immunogenetics, 39: 213, 1994A
4. Huard et al., Eur. J. Immunol., 24: 3216, 1994B
5. Huard et al., Eur. J. Immunol., 26: 1180–1186, 1996
6. Miyazaki et al., Science, 272: 405–408, 1996
7. Susuki et al., J. Exp. Med., 182: 477–486, 1995
8. Bellgrau et al., Nature, 377: 630–632, 1995
9. Lau et al., Science, 273: 109–112, 1996
10. Subraimani et al., Mol. Cell. Biol., 1: 854–864, 1981
11. Luski and Botchan, Nature, 293: 79–81, 1981
12. Fiddes and Goodman, J. Mol. Appl. Genetic, 1: 3–18, 1981
13. Hamer and Walling, J. Mol. Appl. Genetic, 1: 273–288, 1982
14. Qin et al., Science, 259: 974, 1993
15. Delaney et al., J. Clin. Inves., 97: 217–225, 1996
16. Kernan et al., Transplantation, 43: 842, 1987
17. Kozarsky and Wilson, Current Opinions Genet. Dev., 3: 499, 1993
18. Barr et al., Gene Therapy, 1: 51, 1992
19. Stratford et al., J. Clin. Inves., 90: 626, 1992
20. Rosenfeld et al., Cell, 68: 143, 1992
21. Lemarchand et al., PNAS, 89: 6482, 1992
22. Tripathy et al., PNAS, 91: 11557, 1994
23. Bi et al., Human Gene Therapy, 4: 725, 1993
24. Berke, The functions and mechanisms of action of cytolytic lymphocytes. Chapter 28, pages 972–974, in: Fundamental Immunology edited by W. E. Paul, New York, 1993

Claims

Gentechnisch veränderte Säugetierzellen, welche DNA enthalten, die für das Transmembran-Lymphocyten-Aktivierungsgen-3 (LAG-3) auf ihrer Oberfläche codiert, das in der Lage ist, Schutz vor dem Abstoßen eines Transplantats durch das Immunsystem des Wirts zu verleihen, wobei die DNA in das Genom dieser Zellen stabil integriert ist.
Zellen nach Anspruch 1, worin die für das LAG-3-Protein codierende DNA exogen ist.
Zellen nach Anspruch 1, worin die für das LAG-3-Protein codierende DNA endogen ist und ihre Exprimierung durch gezielte Insertion einer Regulationssequenz und/oder ein amplifizierbares Gen durch homologe Rekombination aktiviert oder modifiziert wird.
Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die Bestandteil eines zu transplantierenden Gewebes oder Organs sind.
Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die Wirtszellen für eine Gentherapie sind.
Zellen nach Anspruch 5, wobei die Gentherapie eine somatische oder „ex-vivo"-Gentherapie ist.
Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die weiterhin ein zusätzliches immunosuppressives Mittel wie IL-10, TGFβ oder einen Fas-Liganden enthalten.
Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die ferner das Thymidinkinase(tk)-Gen enthalten, das gegenüber dem tk-Gancyclovir-Suizidsystem empfindlich ist.
Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, die von transgenen Tieren abgeleitet sind.
Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, die aus Myoblasten, Fibroblasten, blutbildenden Stammzellen, fötalen Leberzellen, Nabelvenenendothelzellen oder CHO-Zellen ausgewählt sind.
Zellen nach einem der Ansprüche 5 bis 10, die außerdem exogene DNA enthalten, die für ein interessierendes therapeutisches Mittel codiert.
Zellen nach Anspruch 5 oder 10, die ferner exogene DNA enthalten, die für eine Regulationssequenz und/oder ein amplifizierbares Gen zur Aktivierung oder Modifizierung der Exprimierung eines interessierenden endogenen Gens codiert.
Verwendung eines Transmembran-LAG-3-Proteins, das auf der Oberfläche von Zellen exprimiert worden ist, die mit exogener DNA transfiziert worden sind, die für das Transmembran-Lymphocyten-Aktivierungsgen-3 (LAG-3) codiert, das in ihrem Genom stabil integriert ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zum Verleihen eines Schutzes vor dem Abstoßen eines Transplantats durch das Immunsystem des Wirts.
Verwendung von Zellen wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 beschrieben für die Herstellung eines Arzneimittels zum Verleihen eines Schutzes vor dem Abstoßen eines Transplantats durch das Immunsystem eines Wirts.
Verwendung von Zellen wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 beschrieben für die Herstellung eines Arzneimittels, das mit zu transplantierenden Zellen, Geweben oder Organen vermischt werden soll, um einen Schutz vor dem Abstoßen des Transplantats durch das Immunsystem des Wirts zu verleihen.
Gentechnisch veränderte Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, welche DNA enthalten, die für das Transmembran-LAG-3-Protein auf ihrer Oberfläche codiert, und welche für eine Verwendung als Arzneimittel vorgesehen sind.