ES2225901T3

ES2225901T3 - Metodos para prevenir el rechazo de injertos en transplante y para producir una celula hospedante universal para terapia genica haciendo uso de activacion linfocitica (lag - 3).

Info

Publication number: ES2225901T3
Application number: ES96940658T
Authority: ES
Inventors: Mauro Biffoni; Ruben Papoian
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1996-11-29
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2016-11-29
Also published as: PT941329E; NO992569L; US20020081282A1; CA2272130C; AU733825B2; CA2272130A1; WO1998023748A1; KR20000053291A; ATE271607T1; DE69632967D1; UA73270C2; AR018489A1; ZA9710737B; JP3920928B2; EP0941329A1; IL130168A; HK1023599A1; KR100481230B1; EA199900507A1; IL130168A0

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PREVENCION DEL RECHAZO DE UN INJERTO CONSTITUIDO POR CELULAS, TEJIDOS U ORGANOS TRASPLANTADOS, SIN INMUNODEPRESION GENERAL. EN ESTE PROCEDIMIENTO, SE UTILIZA UNA PROTEINA RECIENTEMENTE DESCUBIERTA: LA LAG - 3. CUANDO SE MANIPULAN UNAS CELULAS HALOGENICAS O XENOGENICAS DE FORMA QUE EXPRESEN LAG - 3 EN SU SUPERFICIE, Y TRASPLANTADAS, IMPIDEN LA DESTRUCCION INMUNOLOGICA DE LA CELULA, DEL TEJIDO O DEL ORGANO IMPLANTADO, MIENTRAS QUE EL SISTEMA INMUNITARIO DEL HUESPED QUEDA FUNCIONAL. UNA APLICACION PARTICULAR DE ESTE PROCEDIMIENTO PERMITE LA PREPARACION DE UNA CELULA HUESPED UNIVERSAL DE TERAPIA GENICA QUE EXPRESA LAG - 3 EN SU SUPERFICIE PARA IMPEDIR UN RECHAZO DEL INJERTO POR EL SISTEMA INMUNITARIO DE UN HUESPED.

Description

Método para prevenir el rechazo de injertos en trasplante y para producir una célula hospedante universal para terapia génica haciendo uso de activación linfocítica (LAG-3).

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para evitar el rechazo del injerto de órganos, tejidos o células trasplantados, en particular a los métodos que comprenden la modificación genética de un tipo de célula con el fin de expresar una proteína LAG-3 cuando es trasplantada a un hospedante. Más particularmente, la invención se refiere a la producción de una célula hospedante de terapia génica universal que expresa una proteína LAG-3 sobre su superficie.

Descripción de la técnica anterior

El gen de activación de los linfocitos (LAG-3) es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas, que se transcribe selectivamente en las células T activadas humanas (tanto CD4^{+} como CD8^{+}) y en las células agresoras (NK) (Triebel et al., 1990). El aislamiento y clonación de LAG-3 han sido descritos en la solicitud WO 91/10 682. Los datos de la secuencia, la comparación de la organización de exones/intrones, y la localización cromosómica, revelaron que el LAG-3 está estrechamente relacionado con CD4 (Baixeras et al., 1992). La estrecha relación entre LAG-3 y CD4 se reforzó adicionalmente por la demostración de que ambos comparten el mismo ligando, esto es las moléculas MHC clase II (Baixeras et al., 1992). Sin embargo, en contraste a las CD4, el LAG-3 no se une a la proteína gp 120 del virus de la inmunodeficiencia humana (Baixeras et al., 1992). Nunca se ha encontrado in vivo la expresión de LAG-3 ni en los órganos linfoides primarios tales como el bazo, ni en el tejido linfoide asociado con las mucosas ni en los nódulos linfáticos normales. Sin embargo, se ha detectado fácilmente en las amígdalas inflamadas, o en los nódulos linfáticos con hiperplasia folicular, confirmando el punto de vista de que incluso in vivo se expresa el LAG-3 después de activación (Huard et al., 1994A). La estimulación específica del antígeno de los clones de células T en presencia del anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 (mAb) lleva al aumento de la incorporación de timidina, a una expresión más alta del marcador de activación CD25 y al aumento de la producción de citoquina (Huard et al., 1994B).

Por consiguiente, la adición de una forma recombinante soluble de LAG-3 inhibió la proliferación de las células T específicas del antígeno, lo que da a entender un papel regulador de LAG-3 en la activación de los linfocitos T CD4^{+} (Huard, 1996) y su implicación en la extinción del avance de las respuestas inmunitarias. Recientemente, se ha demostrado que LAG-3 actúa también como un co-receptor para las células NK y define diferentes modos de agresión a las células tumorales controlados por el sistema inmunitario innato (Miyazaki et al., 1996).

Los mecanismos por los que se produce la respuesta de las células T a una proteína o célula u órgano extraño (alogénico o xenogénico) es bastante bien conocido. Las células presentadoras de antígenos (las APC) son atraídas a las áreas de inflamación o daño (que puede haber sido inducido por un trasplante quirúrgico). El repertorio de células T en la periferia está rodeando constantemente a los tejidos para probar la existencia de patógenos o la presencia de tejido extraño (alogénico o xenogénico). Una vez que se reconoce cualquiera de estas señales de alerta, las APC envuelven a la proteína, la digieren y la presentan al sistema inmunitario del hospedante.

Las células tumorales alogénicas o singénicas han sido modificadas genéticamente para expresar la IL-10 viral que induce la anergia local en los tumores. Dicho tratamiento no afectó al rechazo de un tumor no transducido en un sitio distante (Suzuki et al., 1995). Se cree que la IL-10 administrada localmente aumenta el repertorio de células T reactivas a las células trasplantadas hasta un fenotipo Th2 que no es citolítico y que incluso puede ser protector.

Las células que expresan naturalmente el ligando de Fas han sido trasplantadas a través de barreras alogénicas o xenogénicas sin inmunodepresión. La vigilancia del sitio de implantación por medio de las células T del hospedante da como resultado su destrucción cuando se ponen en contacto mediante el ligando de Fas (Bellgrau et al., 1995). Además, se ha evitado el rechazo de los aloinjertos de islotes pancreáticos mediante el co-trasplante de mioblastos singénicos modificados genéticamente para expresar el ligando de Fas (Lau et al., 1996).

El sistema inmunitario está bien preparado para identificar rápidamente el tejido extraño, enfermo o inflamado y destruirlo rápidamente. Esto ha sido siempre un obstáculo importante para el trasplante de tejidos, órganos o células así como para la terapia génica. Los principales problemas se asocian generalmente con la inmunodepresión crónica, la encapsulación o el inmunoaislamiento. Los efectos secundarios indeseados de la inmunodepresión crónica incluyen el aumento de la susceptibilidad a las infecciones oportunistas y la formación de tumores.

El deseo de la aceptación a largo plazo del tejido injertado en ausencia de una inmunodepresión continuada es desde hace mucho tiempo un objetivo de la medicina humana.

La cita que se hace aquí de cualquier documento no pretende ser una admisión de que tal documento está relacionado con la técnica anterior, ni que se considera un material para la patentabilidad de cualquier reivindicación de la presente solicitud. Cualquier declaración sobre el contenido o fecha de cualquier documento se basa en la información disponible en el momento de esta solicitud y no constituye ninguna admisión sobre la exactitud de dicha declaración.

Sumario de la invención

Se ha encontrado ahora que el trasplante de células que expresan una proteína LAG-3 en su superficie da como resultado la protección contra el rechazo del injerto por el sistema inmunitario del hospedante.

La presente invención proporciona por tanto una célula modificada por ingeniería genética que puede ser parte de un tejido u órgano a ser trasplantado, que comprende DNA que codifica una proteína LAG-3 transmembranal sobre su superficie, dando como resultado la protección contra el rechazo del injerto por el sistema inmunitario del hospedante, siendo el DNA, DNA genómico o cDNA. Dicho DNA puede ser exógeno o, en una realización particular de la invención, el DNA endógeno, cuya expresión es activada o modificada por medio de la inserción dirigida al objetivo de una secuencia reguladora y/o de un gen amplificable por recombinación homóloga. La proteína LAG-3 es una proteína que es reconocida por los anticuerpos dirigidos frente a LAG-3.

Cuando la célula es parte del tejido u órgano a ser trasplantado, se puede llevar a cabo la transfección del DNA de LAG-3 directamente sobre el tejido u órgano a ser trasplantado.

En particular, la célula es una célula hospedante de terapia génica universal, adecuada, por ejemplo, para cualquier tipo de terapia génica somática o "ex vivo".

En una realización específica, la célula hospedante de la terapia génica comprende DNA exógeno que codifica un agente terapéutico de interés, y las células modificadas por ingeniería genética se emplean como un agente terapéutico. El término "terapéutico" como se usa aquí, incluye el tratamiento y/o la profilaxis.

En una realización adicional, el gen que codifica un agente terapéutico de interés está presente en el genoma de la célula y la célula comprende además DNA exógeno que codifica una secuencia reguladora o un gen amplificable para activar o modificar la expresión del gen endógeno de interés.

La célula de la invención modificada por ingeniería genética, puede contener de todos modos el DNA exógeno de LAG-3 solamente, para ser usado en una mezcla con otras células hospedantes de terapia génica que contienen el DNA terapéutico de interés.

Las células de la presente invención se seleccionan preferiblemente entre los mioblastos, fibroblastos, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias, células hepáticas fetales, células endoteliales de la vena umbilical, y células CHO (células de ovario de hámster chino).

Células como las anteriores, derivadas de animales transgénicos, están también dentro del alcance de la presente invención.

Un objetivo adicional de la presente invención es el uso de una proteína LAG-3 transmembranal, incluyendo las muteínas y variantes de la misma, expresada sobre la superficie de las células, en la fabricación de un medicamento destinado a inducir la protección contra el rechazo de injertos por parte del sistema inmunitario de un hospedante.

Además, la presente invención proporciona el uso de una célula que comprende DNA que codifica una proteína LAG-3 transmembranal expresada sobre la superficie de la célula, en la fabricación de un medicamento destinado a inducir la protección contra el rechazo de injertos por parte del sistema inmunitario de un hospedante.

El uso de dicha célula que expresa LAG-3 sobre su superficie, en la fabricación de un medicamento destinado a ser mezclado con las células, tejidos u órganos a ser trasplantados, con el fin de inducir la protección contra el rechazo de injertos por parte del sistema inmunitario de un hospedante, está también dentro del alcance de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 - Actividad citotóxica frente a las células LH-CHO de esplenocitos procedentes de ratones cebados con células LAG-3-CHO o LH-CHO. El valor de la media (\pm SD) de 5 ratones cebados como se indica en la leyenda; se evaluaron también 2 ratones no cebados.

Figura 2 - Actividad citotóxica frente a las células LAG-3-CHO de esplenocitos procedentes de ratones cebados con células LAG-3-CHO o LH-CHO. El valor de la media (\pm SD) de 5 ratones cebados como se indica en la leyenda; se evaluaron también 2 ratones no cebados.

Figura 3 - Mapa del vector de expresión D\alpha de mamíferos.

Abreviaturas usadas: DHFR, unidad de transcripción de dehidrofolato (Subraimani et al., 1981); pML, derivado de pBR322 (Lusky and Botohan, 1981); hAIVSA, fragmento del intrón A de la subunidad \alpha de las hormonas de glucoproteínas humanas (Fiddes and Goodman, 1981); MMT-1, promotor de la metalotioneina 1 de ratón (Hamer and Walling, 1982).

Descripción detallada de la invención

Cada año mueren cientos de miles de personas como resultado de una insuficiencia cardiaca, renal, hepática, pulmonar o pancreática. La terapia individual más eficaz es el trasplante.

La terapia asociada con el trasplante de células, tejidos u órganos provoca un estado general inmuno-protector en el hospedante con relación a la célula, tejido u órgano trasplantado. Es deseable establecer una protección eficaz del injerto contra el rechazo por el sistema inmunitario del hospedante, particularmente en el trasplante alogénico, trasplante xenogénico y terapia génica. También, es deseable inhibir la tolerancia al tejido tumoral o de lo contrario permitir que el sistema inmunitario del hospedante ataque al tejido tumoral.

Por consiguiente, la presente invención se dirige a todos los métodos descritos antes con el fin de utilizar el hallazgo de que el trasplante de células o tejidos que expresan una proteína LAG-3 transmembranal produce la protección contra el rechazo del injerto por el sistema inmunitario del hospedante.

La invención emplea el gen y la proteína LAG-3 descubierta ahora, que normalmente se expresa sobre las células T activadas y las células NK activadas.

La definición "proteína LAG-3 transmembranal" como se usa aquí se refiere a cualquier proteína transmembranal que contiene el dominio extracitoplasmático de LAG-3, a sus sales, derivados funcionales, precursores y fracciones activas así como a sus mutantes activos y sus variantes activas, que se expresan todos sobre la superficie de una célula.

La definición se refiere también a una proteína transmembranal expresada en su estado natural o que puede ser fusionada, por ejemplo por ingeniería genética, a otra proteína, tal como un anclaje de glucosil-fosfatidil-inositol o cualquier fragmento relevante de otra proteína transmembranal, por ejemplo receptor-NF, ligando-MPL o una inmunoglobulina transmembranal.

La definición "sales" como se usa aquí se refiere tanto a las sales de los grupos carboxilo como a las sales de las funciones amino del compuesto, obtenibles por métodos conocidos. Las sales de los grupos carboxilo comprenden sales inorgánicas como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio y sales con bases orgánicas como las formadas con una amina tal como trietanolamina, arginina o lisina. Las sales de los grupos amino comprenden por ejemplo, sales con ácidos inorgánicos tales como el ácido clorhídrico y con ácidos orgánicos tales como el ácido acético.

La definición "derivados funcionales" como se usa aquí se refiere a derivados que se pueden preparar a partir de grupos funcionales presentes sobre las cadenas laterales de los restos de aminoácidos o sobre los grupos N- o C- terminales según métodos conocidos y están comprendidos en la invención cuando son farmacéuticamente aceptables, esto es cuando no destruyen la actividad de la proteína o no imparten toxicidad a las composiciones farmacéuticas que los contienen. Tales derivados incluyen, por ejemplo, ésteres o amidas alifáticas de los grupos carboxilo y N-acil-derivados de los grupos amino libres o O-acil-derivados de los grupos hidroxilo libres y se forman con grupos acilo como por ejemplo, grupos alcanoilo o aroilo.

Los "precursores" son compuestos que se convierten en LAG-3 en el cuerpo humano o animal.

Como "fracciones activas" de la proteína, la presente invención se refiere a cualquier fragmento o precursor de la cadena polipeptídica del propio compuesto, solo o en combinación con moléculas relacionadas o residuos unidos a él, por ejemplo, residuos de azúcares o fosfatos, o agregados de la molécula del polipéptido cuando tales fragmentos o precursores muestran la misma actividad de LAG-3 como medicamento.

Las "fracciones activas" preferidas son fracciones solubles procedentes de la porción extracelular de la proteína LAG-3, incluyendo uno o más de los cuatro dominios, D1, D2, D3, D4, del dominio extracitoplasmático de LAG-3.

La definición "mutantes activos" como se usa aquí se refiere a otras proteínas o polipéptidos en los que uno o más aminoácidos de la estructura se han eliminado o sustituido por otros aminoácidos, o uno o más aminoácidos se han añadido a dicha secuencia con el fin de obtener polipéptidos o proteínas que tienen la misma actividad de LAG-3. Por ejemplo, Arg 73 y/o Arg 75 y/o Arg 76 pueden ser sustituidas con un aminoácido diferente, preferiblemente con Glu.

Las "variantes activas" de LAG-3, son variantes procedentes de cortes y empalmes diferenciales así como todos los transcritos génicos primarios, que derivan de mecanismos alternativos de corte y empalme en diferentes sitios de escisión del gen. Las variantes preferidas son proteínas solubles o transmembranales que carecen de los dominios D3 y/o D4 de la porción extracelular de LAG-3, conteniendo opcionalmente algunos aminoácidos adicionales después del dominio D2 o del dominio D3.

La expresión de la proteína LAG-3 transmembranal sobre la superficie de una célula se verifica por métodos inmunorreactivos. La proteína transmembranal se reconoce, por ejemplo, por los anticuerpos anti-LAG-3, 11 E3 (Depósito No. CNCM I-1612), 17B4 (Depósito No. CNCM I-1240) o 15A9 (Depósito No. CNCM I-1239).

La presente invención se refiere también a una mezcla de polipéptidos y derivados como se ha dicho antes.

Cuando se usan en la presente solicitud y en las reivindicaciones, las expresiones "LAG-3" "proteína LAG-3" o "molécula LAG-3", se pretende incluir las formas natural, sintética o recombinante del polipéptido así como todas las definiciones indicadas antes.

Las células de la presente invención se pueden seleccionar a partir de células primarias o secundarias. Como se usa aquí, el término célula primaria incluye las células presentes en una suspensión de células aisladas de una fuente de tejido de vertebrados (antes de haber sido dispuesto en placas, esto es unido a un sustrato de cultivo de tejido tal como una placa o un frasco), las células presentes en un fragmento separado del tejido, tanto de los tipos de células previos dispuestos en placas por primera vez como de las suspensiones derivadas de estas células dispuestas en placas. El término célula secundaria o cepa celular se refiere a las células en todas las subsiguientes etapas del cultivo. Esto es, la primera vez que una célula primaria dispuesta en placas se separa del sustrato de cultivo y se vuelve a poner en placas (tratamiento por pases), se denomina aquí una célula secundaria, como son todas las células en los subsiguientes pases. Las células secundarias son cepas celulares que constan de células secundarias que han sido sometidas a pases una o más veces. Una cepa celular consta de células secundarias que: 1) han sido sometidas a pases una o más veces; 2) presentan un número finito de ciclos completos de cultivo de la población media; 3) presenta las propiedades de crecimiento dependiente del anclaje inhibido por contacto (la dependencia de anclaje no se aplica a las células que se propagan en cultivo en suspensión; y 4) no están inmortalizadas. Una "cepa celular clonal" se define como una cepa celular que se deriva de una única célula fundadora. Una "cepa celular heterogénea" se define como una cepa celular que se deriva de dos o más células fundadoras.

La presente invención incluye células somáticas primarias y secundarias, tales como fibroblastos, queratinocitos, células epiteliales, células endoteliales, células gliales, células neurales, elementos maduros de la sangre, células musculares, otras células somáticas que se pueden cultivar y precursores de las células somáticas, que han sido transfectados con DNA exógeno que se integra de forma estable en sus genomas o se expresa en las células en el episoma. Las células resultantes se denominan, respectivamente, células primarias transfectadas y células secundarias transfectadas.

Cuando el gen que codifica una molécula de LAG-3 es insertado en células de mamíferos y las células son trasplantadas a un hospedante alogénico o xenogénico, son reconocidas por el sistema inmunitario del hospedante pero no se produce una respuesta inmunitaria.

El sistema inmunitario del hospedante se hace incapaz de rechazar las células que de otro modo habrían sido rechazadas si no hubieran sido modificadas genéticamente para expresar la molécula de LAG-3 en su superficie celular. La LAG-3 se puede expresar también sobre la superficie celular de un tipo de célula no relacionado y se puede mezclar con las células o tejidos a ser trasplantados con resultados similares a los descritos antes. Por tanto, esta invención se refiere al trasplante de células, tejidos, u órganos sin inmunodepresión general.

Estas células, tejidos u órganos son trasplantados con el fin de proporcionar proteínas o de realizar ciertas funciones para tratar ciertas enfermedades. Ellos son aceptados por el hospedante mediante el uso de una técnica en la que LAG-3 se presenta al sistema inmunitario del hospedante.

La prevención del rechazo del injerto de células, tejidos u órganos específicos se puede conseguir también en los receptores mediante la co-administración de fibroblastos u otras células primarias o secundarias que hayan sido modificadas por ingeniería genética para expresar LAG-3. Este estado protector puede ser debido a la inhibición local o general de los mecanismos que median las respuestas inmunitarias. Este estado protector puede ser debido a anergia, deleción, falta de respuesta, tolerancia o prevención de la citotoxicidad mediada por las células. Una vez que se establece un estado protector, éste permanece durante extensos periodos de tiempo, incluso permanentemente debido a un fenómeno tal como la tolerancia infecciosa (Qin et al., 1993).

La invención puede ser utilizada para el trasplante de células, tejidos, órganos o células hospedantes para suministrar genes o productos génicos para una variedad de necesidades médicas humanas.

La expresión del gen LAG-3 puede ser inducida por técnicas estándares de DNA recombinante o por técnicas que emplean la recombinación homóloga para activar el gen LAG-3 endógeno. Los tipos de células pueden ser obtenidos a partir de animales transgénicos que tienen el gen LAG-3 expresado en tejidos específicos o en células no relacionadas, mediante cualquier método. Tales células pueden ser mezcladas después con las células en las que se desea la protección contra el rechazo del injerto. Esto sugiere que la secreción local de la molécula LAG-3 inmunoprotectora no actúa sistémicamente. Los fibroblastos no transformados, transducidos con LAG-3, dan respuestas similares in vivo. Los efectos inmunoprotectores del inóculo de los fibroblastos transducidos con LAG- 3, son dependientes de la dosis pero independientes de la fuente de la molécula de LAG-3.

La co-administración de células que expresan LAG-3 inactiva a las células T del donante mientras que al mismo tiempo evita el ataque desde el sistema inmunitario del hospedante. Este tratamiento induce una anergia específica, tolerancia u otro tipo de protección contra la citotoxicidad mediada por las células en el receptor que puede dar como resultado un cambio a largo plazo del microentorno inmunitario que permite la protección frente a las células T autorreactivas. Esto se puede hacer por la co-administración de un pequeño número de células alogénicas de la médula ósea procedentes de un donante sano junto con las células alogénicas humanas que han sido modificadas genéticamente para expresar LAG-3. Esto da como resultado una disminución de las células T autorreactivas a través del desarrollo de microquimerismo (Delaney et al., 1996).

Los seres humanos con enfermedades o deficiencias específicas se pueden beneficiar del trasplante alogénico de muchas células, tejidos u órganos diferentes. Por ejemplo, son usualmente trasplantados órganos tales como hígado, riñón, corazón, páncreas, intestino delgado, y son adecuadas para trasplante células tales como los islotes, tejidos neurales para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson o epilepsia focal, células madre hematopoyéticas como un tratamiento para la quimioterapia o radioterapia, hepatocitos normales para tratar la hipercolesterolemia, células cardiacas para el infarto de miocardio y células musculares para la distrofia muscular.

Los trasplantes alogénicos de médula ósea han sido difíciles de realizar por una serie de razones. Ellas incluyen: rechazo del injerto, infección debida a infecciones oportunistas como resultado de la contaminación del injerto o de los fármacos inmunodepresores, u otras razones. El rechazo puede ser debido a la resistencia del receptor al injerto de la médula ósea de donantes y a la tendencia de las células inmunes competentes a atacar al receptor, esto es, la enfermedad del injerto frente al hospedante (GVHD). La GVHD puede ser controlada por la disminución del injerto de células T o la co-administración de fármacos inmunodepresores. La realización del injerto se reduce cuando se eliminan las células T.

Como resultado de la eliminación de las células T hay una mayor incidencia de fallos de los injertos. Se cree que ellas pueden proporcionar una importante función para la realización del injerto tal como la elaboración de citoquinas (Keman et al., 1987).

Se ha demostrado que sólo unas pequeñas cantidades de células de la médula ósea alogénicas pero sanas pueden reducir o incluso evitar la aparición de la enfermedad autoinmune en los modelos experimentales. Sin embargo, tratamientos tales como estos, producen la enfermedad del injerto frente al hospedante.

El trasplante de médula ósea ha sido usado también como un método para erradicar ciertos tumores. Esto es probablemente debido a la capacidad de las células T alogénicas de reconocer y destruir el tejido tumoral, por ejemplo en el injerto contra la leucemia.

En todos los casos anteriores se evita la inmunodepresión general si las células u órganos a ser trasplantados se modifican genéticamente con un gen que codifica LAG-3, de tal modo que expresan una proteína LAG-3 cuando son trasplantados a un hospedante e inducen la protección del injerto.

Un primer problema en el trasplante alogénico es la falta de tejido humano trasplantable y actualmente la demanda de órganos excede en mucho a la oferta. Aunque todavía se mira como un procedimiento experimental, el xenotrasplante se considera como una alternativa viable para el alotrasplante. Animales tales como el cerdo y los babuinos se están considerando ahora como donadores de órganos o células. La protección contra el rechazo del injerto puede ser esencial para el uso clínico satisfactorio de órganos procedentes de diferentes especies. La resistencia del hospedante puede ser superada al menos parcialmente, por ejemplo, usando anticuerpos contra las células CD4, CD8, NK humanas, o microencapsulando las células animales a ser trasplantadas. Según la presente invención, los animales pueden ser modificados transgénicamente con el fin de expresar el gen LAG-3 en ciertos tipos de células tales como las células de los islotes mediante el uso del promotor del gen de la insulina y el sistema de señalización del objetivo u otro sistema marcador específico del tejido.

La expresión de LAG-3 sobre el tejido tumoral se cree que desempeña un papel importante en la resistencia al ataque mediado por las células contra el tejido tumoral por parte del sistema inmunitario del hospedante.

Según una particular realización de la presente invención, mediante el uso de la terapia génica o por tratamiento ex vivo de una pequeña cantidad del tejido tumoral y reimplantación, el tejido tumoral puede ser modificado genéticamente para expresar moléculas de LAG-3 antisentido o ribozimas específicas para el mensaje de LAG-3. Esto permitiría que el sistema inmunitario reaccionara contra el tejido y le llevara a destruirlo. Se puede tratar también una pequeña cantidad del tejido tumoral con un anticuerpo contra LAG-3 para evitar la inhibición de las células T inducida por LAG-3 y permitir la inducción de la inmunidad celular y humoral contra el mismo.

La terapia génica es ahora altamente deseable para el tratamiento de una variedad de enfermedades, incluyendo pero sin limitarse a ellas la deficiencia de adenosina-desaminasa (ADA), anemia de células falciformes, talasemia, hemofilia, diabetes, deficiencia de alfa-antitripsina, trastornos cerebrales tales como la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades tales como los trastornos de crecimiento y enfermedades cardiacas, por ejemplo las causadas por alteraciones en el modo en que se metaboliza el colesterol, y los defectos del sistema inmunitario.

Se pueden usar diferentes células para el trasplante en individuos que lo necesiten, por ejemplo mioblastos para administración de distrofina, células que segregan un material tal como TPO, GH, EPO, factor IX u otros factores, células sanguíneas para el tratamiento de trastornos sanguíneos hereditarios y otras células primarias humanas o animales, tales como las células endoteliales, células epiteliales, células del tejido conjuntivo, fibroblastos, células mesenquimales, células mesoteliales y células parenquimales.

Los resultados de la terapia génica no han sido muy satisfactorios debido a una serie de problemas. Incluso en los ensayos clínicos más avanzados en los que una muchacha joven ha sido tratada con el gen de la adenosina-desaminasa (ADA), la paciente recibe también semanalmente una inyección de PEG-ADA por miedo a que la terapia génica sola sea inefectiva.

Una de las deficiencias de los protocolos de la terapia génica hoy, es el requerimiento de la producción individual de células hospedantes para intentar evitar el rechazo de las células por parte del sistema inmunitario del hospedante. La terapia génica se debe realizar con base individuo a individuo. Además, usualmente se observa que la expresión de los transgenes es transitoria debido a la expresión de otras proteínas virales que ocupan el sistema inmunitario del hospedante a través del uso de células autólogas para la terapia génica.

Se usan vectores adenovirales mutilados pero estos tienen problemas debidos a las otras proteínas virales que son expresadas y que evocan una respuesta inmunitaria. Las grandes concentraciones de virus, incluso de uno mutilado, estimulan una respuesta inflamatoria y un ataque inmunitario. El sistema inmunitario del hospedante recordará el vector viral de modo que las futuras administraciones serán incluso menos eficaces.

En los protocolos de terapia génica se emplean rutinariamente los adenovirus de replicación defectuosa con la región EI delecionada de la proteína viral. Desafortunadamente, estos sólo tienen efectos transitorios en los hospedantes inmunocompetentes adultos, presumiblemente como resultado de una respuesta inmunitaria dirigida contra las proteínas adenovirales o recombinantes (Kozarsky and Wilson, 1993; Barr et al., 1992; Stratford et al., 1992; Rosenfeld et al., 1992; Lemarchand et al., 1992). Por tanto hay una gran necesidad de desarrollar nuevos vectores que no sean tan inmunogénicos o métodos que permitan la protección inmunológica de las células modificadas por ingeniería
genética.

Estos vectores se preparan a un alto título de hasta 10^{11} unidades formadoras de placas por ml e infectan muchas células replicadoras y no replicadoras. Se usan adenovirus con replicación defectuosa para administrar niveles fisiológicos de proteína recombinante a la circulación sistémica. El gen LAG-3 está preferiblemente bajo el control transcripcional del promotor celular EF1\alpha activo de forma ubicua y del potenciador 4F2HC (Tripathy et al., 1994).

Se han hecho intentos para evitar este problema mediante el encapsulado de las células y mediante la inmunodepresión del hospedante.

Con los métodos descritos aquí, se pueden usar células xenogénicas o alogénicas como hospedantes de terapia génica que expresan una molécula de LAG-3 sobre su superficie, de tal modo que inducen la protección contra el rechazo del injerto por parte del sistema inmunitario del hospedante. Estas células son por ejemplo, mioblastos, fibroblastos, células madre hematopoyéticas, células madre embrionarias, células hepáticas fetales, células endoteliales de la vena umbilical, o células CHO. Las células hospedantes de la terapia génica se pueden modificar también por ingeniería genética con el fin de expresar el gen de la timidina-quinasa del herpex simple. Tales células se pueden destruir específicamente por adición de ganciclovir.

Las células sensibles a tk-ganciclovir tienen una ventaja importante sobre las células no sensibles, porque pueden ser eliminadas en cualquier momento (Bi et al., 1993).

La célula hospedante universal que se prepara según la presente invención para expresar LAG-3 y el gen Hsv-tk sobre su superficie celular permite de este modo la generación de una célula hospedante de terapia génica universal que puede ser implantada sin inmunodepresión y que puede ser destruida en cualquier punto en que su actividad no sea ya requerida.

Las células hospedantes de la terapia génica alogénicas o xenogénicas de la presente invención se pueden modificar por ingeniería genética con el fin de expresar un transgen y/o el gen LAG-3 por medio del uso de cualquier método de transferencia génica tal como la replicación de virus defectuosos, virus asociados con adenovirus, retrovirus de alta eficiencia, inyección directa de DNA en la médula ósea, electroporación, transfección de fosfato de calcio, microinyección, encapsulación en liposomas o en membranas (fantasmas) de eritrocitos, pero sin limitarse a ellos. Las células que expresan LAG-3, tales como los mioblastos o células CHO se pueden co-administrar con las células que expresan una proteína de interés para ser injertada de modo permanente. Si la exposición transitoria a LAG-3 es adecuada, entonces los mioblastos o células CHO transfectados con LAG-3 pueden contener un gen suicida, tal como tk, como se ha indicado antes, de modo que se puedan separar por tratamiento con ganciclovir.

Se puede usar este método para restaurar la función normal mediante la administración de un gen o producto génico o por la separación o inactivación de un gen que es peligroso para el cuerpo (tal como un oncogen). Este objetivo se puede alcanzar también implantando células que liberan ribozimas o cDNA antisentido para inhibir la producción de las proteínas no deseadas tales como las proteínas HIV o los factores de crecimiento. Se puede usar el método para corregir las deficiencias enzimáticas tales como la enfermedad de Gaucher o deficiencia de ADA.

Según otra realización, la presente invención se dirige a un método de terapia génica que comprende: (I) insertar en las células humanas o animales de elección el gen necesario para la terapia y el gen que codifica una molécula de LAG-3; y (II) introducir las células resultantes de la etapa (I) en el paciente. Alternativamente, los genes como los anteriores se pueden insertar en un tejido u órgano de un paciente, in vivo, por transfección directa de los genes como tales, o en un vehículo que tiene como objetivo tal tejido u órgano.

Por ejemplo, el sistema de expresión reivindicado permite la inyección de un DNA desnudo o de un vector viral directamente a un grupo de células tales como las células musculares o se administra directamente en las vías respiratorias (por ejemplo para tratar la fibrosis quística). La estructura artificial contiene no solamente el gen de interés (tal como el regulador de la conductancia (CFTR cDNA) sino también el gen de LAG-3 para ser co-expresado en el tipo de célula para evitar la posible respuesta inmunitaria humoral, por ejemplo frente a las proteínas de la capsida de adenovirus, lo que debería limitar la eficacia de las administraciones repetidas. La transferencia génica a las células madre hematopoyéticas se puede usar para la administración de genes con multi-resistencia a fármacos para combatir uno de los efectos secundarios de la quimioterapia, la represión de la rápida división de las células inmunitarias. Los vectores retrovirales se pueden usar en combinación con citoquinas tales como el factor de Steel, el ligando de kit, ILS, GM-CSF, IL6, G-CSF, LIF, IL 12 para animar a las células madre a dividirse.

Las células de elección se pueden co-transfectar con genes que codifican otros agentes inmunodepresores, tales como IL 10, TGF\beta, ligando de Fas, en adición al gen LAG-3.

Como una realización particular de la presente invención, los métodos descritos antes se usan para tratar al receptor con un pequeño número de células de interés modificadas genéticamente para expresar el gen LAG-3 que harán que el hospedante sea tolerante para la próxima administración de células, tejidos u órganos debido a la tolerancia infecciosa por el sistema inmunitario del hospedante.

La invención será descrita ahora a modo de ilustración con referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Métodos

Generación de células CHO que expresan LAG-3 transmembranal

Se escindió el cDNA de LAG-3 como un fragmento Xho de 1620 bp a partir del plásmido pCDM8 (Invitrogen San Diego CA) y se purificó por electroforesis en gel de agarosa.

Se subclonó el fragmento en el vector de expresión de mamíferos pCLH3AXSV2DHFRh\alphaIVSA (D\alpha) (Figura 3) y se digirió con Xho. Las células CHO-DUKX (DHFR^{-}) se transfectaron con la estructura artificial D\alphaLAG-3 por el método de precipitación con CaPO_{4}. Se cultivaron las células transfectadas en el medio de selección (medio MEM sin desoxi- ni ribonucleótidos + 10% de suero fetal bovino dializado + 1% de L-glutamina + metotrexato 0,02 \muM). La expresión de LAG-3 se comprobó por transferencia Western sobre las preparaciones de membranas celulares lisadas y periódicamente por análisis citométrico de flujo usando el anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 17B4.

Trasplante de células CHO a ratones

Las células de ovario de hámster chino (CHO), o bien no transfectadas (tipo natural) o bien transfectadas con LAG-3 humano de longitud completa o con cDNA de LH humano, fueron separadas de los frascos de plástico y fueron suspendidas en el medio mínimo esencial modificado por Dulbecco (DMEM) a una concentración de 1,75 x 10^{7}células/ml. Veintiséis ratones hembras C57BL/6 de 6-7 semanas de edad se distribuyeron en 7 grupos como se indica en la Tabla 1 y se inyectaron 200 ml de la suspensión de células indicada, que contiene 3,5 x 10^{6} células, subcutáneamente en el flanco derecho de cada animal. En los grupos 3, 6 y 7 los mismos ratones recibieron las células transfectadas con LAG-3 en el flanco derecho y las células de control (transfectadas con LH o no transfectadas) en el otro flanco. Se sacrificaron los ratones cuatro días después de la inyección por inhalación de CO_{2} y se abrió la piel para examinar el sitio de la inyección.

TABLA 1

1

Evaluación de la citotoxicidad frente a células CHO

Se inyectaron s.c. cinco ratones hembras C57BL/6 por grupo con 4 x 10^{5} células CHO transfectadas o con cDNA de LH humano o con cDNA de LAG-3 humano. Después de 14 días se sacrificaron los ratones y se separaron los bazos para obtener suspensiones de esplenocitos. Se diluyeron las suspensiones de esplenocitos (efectores) en medio de cultivo (RPMI 1640 + 10% de suero fetal bovino + antibióticos) a 10^{7}células/ml y se pusieron en placas por triplicado a diferentes diluciones para obtener los diferentes efectores a las concentraciones deseadas; se prepararon 2 placas para cada suspensión. Se añadieron a las placas las células objetivo a 5 x 10^{3} células/100 \mul (células transfectadas con LH o con LAG-3), marcadas con ^{51}Cr, (una placa por cada objetivo). Después de 20 horas a 37ºC, se tomaron 20 \mul del sobrenadante de cada pocillo y se evaluó la liberación de ^{51}Cr por centelleo líquido. La actividad citotóxica se calculó como porcentaje de lisis según la siguiente fórmula:

% = \frac{\text{(CPM muestra - CPM espontáneo)}}{\text{(CPM máximo - CPM espontáneo)}} x 100

en la que espontáneo y máximo indican los pocillos con medio de cultivo (liberación espontánea de Cr desde las células objetivo) y Triton X 1% (máxima liberación de Cr) que reemplazan la suspensión del efector, respectivamente.

Resultados Trasplante de células CHO a los ratones

La mayor parte de los ratones que recibieron células transfectadas con LAG-3 presentaron un nódulo blanco en el sitio de la inyección que no apareció en los animales tratados con CHO tipo natural o en los que recibieron células CHO transfectadas con LH. La inyección de células CHO tipo natural produjo la aparición de una hemorragia difusa en el sitio de la inyección en la mayoría de los ratones. Este fenómeno fue menos evidente en los animales que recibieron células transfectadas con LH. En los animales inyectados tanto con células CHO tipo natural como con células CHO transfectadas con LAG-3 en diferentes sitios, apareció este nódulo solamente en el sitio inyectado con las últimas mientras que la hemorragia apareció en el otro sitio (Tabla 2).

El análisis histológico realizado previamente en un experimento similar demostró la presencia de células heterólogas en los nódulos. Los resultados del experimento se muestran en las figuras adjuntas (véase la Tabla 1 para la identificación de los ratones) y se resumen en la Tabla 3.

TABLA 2

3

TABLA 3

4

Citotoxicidad frente a las células CHO

La expresión de LAG-3 sobre la superficie de las células CHO no afectó a la capacidad de los ratones para ser cebados inmunológicamente frente a las células xenogénicas. De hecho, los esplenocitos de los ratones inyectados con células LAG-3-CHO lisaron ambas células objetivo tan eficientemente como los de los ratones cebados con células LH-CHO y mejor que los ratones no cebados. Sin embargo la expresión de LAG-3 sobre la superficie celular se asoció con una reducción de la sensibilidad para la actividad citotóxica inducida por inmunización de los ratones frente al objetivo como se puede ver comparando el porcentaje de lisis en la Fig. 1 y en la Fig. 2. La citotoxicidad "natural" ejercida por los esplenocitos de los ratones no cebados, no se reduce por la expresión sobre la superficie de LAG-3. Esto indica que la expresión en la superficie de LAG-3 reduce la rama eferente de la actividad de los linfocitos T citotóxicos (CTL). Los CTL son uno de los efectores que desempeñan un papel importante en el rechazo de los órganos trasplantados (G. Berke, 1993), con lo que la inhibición de sus funciones puede prolongar la supervivencia de los aloinjertos.

Referencias

1.: Triebel et al., J. Exp. Med., 171: 1393, 1990

2.: Baixeras et al., J. Exp. Med., 176: 327, 1992

3.: Huard et al., Immunogenetics, 39: 213, 1994A

4.: Huard et al., Eur. J. Immunol., 24: 3216, 1994B

5.: Huard et al., Eur. J. Immunol., 26: 1180-1186, 1996

6.: Miyazaki et al., Science, 272. 405-408, 1996

7.: Susuki et al., J. Exp. Med., 182: 477-486, 1995

8.: Bellgrau et al., Nature, 377: 630-632, 1995

9.: Lau et al., Science, 273: 109-112, 1996

10.: Subraimani et al., Mol. Cell. Biol., 1: 854-864, 1981

11.: Luski and Botchan, Nature 293: 79-81, 1981

12.: Fiddes and Goodman, J. Mol. Appl. Genetic 1: 3-18, 1981

13.: Hamer and Walling, J. Mol. Appl. Genetic 1: 273-288, 1982

14.: Qin et al., Science, 259: 974, 1993

15.: Delaney et al., J. Clin. Inves., 97: 217-225, 1996

16.: Keman et al., Transplantation, 43: 842, 1987

17.: Kozarsky and Wilson, Current Opinions Genet. Dev., 3: 499, 1993

18.: Barr et al., Gene Therapy, 1: 51, 1992

19.: Strarford et al., J. Clin. Inves., 90: 626, 1992

20.: Rosenfeld et al., Cell 68: 143, 1992

21.: Lemarchand et al., PNAS, 89: 6482, 1992

22.: Tripathy et al., PNAS, 91: 11657, 1994

23.: Bi et al., Human Gene Therapy 4: 725, 1993

24.: Berke, The functions and mechanisms of action of cytolytic lymphocytes. Chapter 28 pages 972-974 in: Fundamental Immunology edited by W.E. Paul New York, 1993.

Claims

1. Una célula de mamífero modificada genéticamente, que comprende DNA que codifica un gen de activación de los linfocitos-3 transmembranal (LAG-3) sobre su superficie, capaz de inducir la protección contra el rechazo del injerto por el sistema inmunitario de un hospedante, estando integrado dicho DNA de manera estable en el genoma de dicha célula.

2. Una célula según la reivindicación 1, en la que el DNA que codifica una proteína LAG-3 es exógeno.

3. Una célula según la reivindicación 1, en la que el DNA que codifica una proteína LAG-3 es endógeno y su expresión se activa o se modifica por la inserción dirigida al objetivo, de una secuencia reguladora y/o de un gen amplificable por recombinación homóloga.

4. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es parte de un tejido u órgano a ser trasplantado.

5. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es una célula hospedante de terapia génica.

6. Una célula según la reivindicación 5, en la que la terapia génica es una terapia génica somática o "ex vivo".

7. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además un agente inmunodepresor suplementario, tal como IL-10, TGF\beta o el ligando de Fas.

8. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además el gen de la timidina-quinasa (tk) con el fin de ser sensible al sistema suicida tk-ganciclovir.

9. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, derivada de animales transgénicos.

10. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, seleccionada entre mioblastos, fibroblastos, células madre hematopoyéticas, células hepáticas fetales, células endoteliales de la vena umbilical o células CHO.

11. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, que comprende además DNA exógeno que codifica un agente terapéutico de interés.

12. Una célula según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, que comprende además DNA exógeno que codifica una secuencia reguladora y/o un gen amplificable con el fin de activar o modificar la expresión de un gen endógeno de interés.

13. El uso de una proteína LAG-3 transmembranal expresada sobre la superficie de una célula que ha sido transfectada con DNA exógeno que codifica un gen de activación de los linfocitos-3 transmembranal (LAG-3) que está integrado de manera estable en su genoma, en la fabricación de un medicamento destinado a inducir la protección contra el rechazo del injerto por el sistema inmunitario de un hospedante.

14. El uso de una célula como se ha descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la fabricación de un medicamento destinado a inducir la protección contra el rechazo del injerto por el sistema inmunitario de un hospedante.

15. El uso de una célula como se ha descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la fabricación de un medicamento destinado a ser mezclado con células, tejidos u órganos a ser trasplantados, con el fin de inducir la protección contra el rechazo del injerto por el sistema inmunitario de un hospedante.

16. Una célula modificada genéticamente, que comprende DNA que codifica una proteína LAG-3 transmembranal sobre su superficie según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para uso como un medicamento.