ES2297479T3 - Infiltracion aumentada en tumor de celulas t por el mutante ligth. - Google Patents

Abstract

El uso de una molécula de ADNc que codifica una Proteína LIGHT que carece del sitio proteolítico para la preparación de un medicamento para inducir la actividad antitumoral eficaz de las células T contra un tumor, en el que el medicamento se ha de introducir en el tumor y la molécula de ADNc se ha de expresar.

Description

Infiltración aumentada en tumor de células T por el mutante LIGHT.

Antecedentes de la descripción

La escasez de células T activadas que se infiltran en tumores establecidos en huéspedes inmunocompetentes explica la incapacidad de los huéspedes para eliminar tumores. Los experimentos en modelos animales así como estudios clínicos indican que el sistema inmune puede reconocer y matar células tumorales individuales, pero un huésped no puede erradicar en general tumores sólidos establecidos. Pueden existir varias explicaciones para el fallo del huésped en responder de manera eficaz a tumores establecidos: 1) carencia de cebado de células T tempranas debido a una presentación escasa directa o indirecta en los tejidos linfáticos debido a un número inadecuado de células tumorales (especialmente aquellos de origen no hemopoyético) que migran al tejido; 2) números inadecuados de células inmunes que migran a sitios tumorales debido a las barreras biológicas alrededor de los tejidos tumorales; 3) células T especificas de antígeno agotadas o de vida corta que fallan para combatir el crecimiento tumoral debido a repertorios limitados; 4) insensibilidad o ignorancia de células T a los tumores; 5) un microambiente inhibidor o carencia de estimulación dentro de los tumores para activar el sistema inmune.

Clínicamente, incremento de la infiltración de células T en el sitio del tumor está asociado estrechamente con mejor prognosis. Estudios previos han mostrado que las vacunaciones preventivas eran eficaces en la inducción del rechazo de células tumorales inoculadas. Sin embargo después de que el crecimiento tumoral se ha establecido, las vacunaciones terapéuticas usualmente fallan para rechazar tumor. La disminución en tamaño quirúrgica del tumor no ayuda a la respuesta inmune de los tumores. Además, se ha reseñado que incluso la expresión de un fuerte antígeno sobre las células tumorales era insuficiente en la promoción del rechazo de un tumor establecido, a pesar de la presencia de un excesivo número de células T específica de antígeno en los tejidos linfáticos. La carencia de cebado de células T y/o infiltración de un tumor establecido es uno de los principales obstáculos para o bien planteamientos o bien naturales o terapéuticos contra los cánceres antigénicos. Además, la expresión insuficiente de moléculas coestimuladoras dentro de los tejidos tumorales puede fallar para activar la infiltración de células T y dan como resultado la desensibilización de células T reactivas a tumores.

La carencia de cebado de células T tempranas se atribuye posiblemente a unas pocas células tumorales que migran del tejido sólido a tejidos linfáticos para la presentación directa. Los análisis genéticos que usan quimeras de médula ósea han revelado dos modos de presentación de antígeno para cebar las células CD8^{+} T restringidas por MHC-I. El cebado directo está mediado por el ajuste de células T con las células que sintetizan la proteína con epítopes antigénicos, mientras que el cebado cruzado está mediado por las células que presentan antígeno de huésped que captan antígenos sintetizados por otras células. Los mecanismos para el cebado de células T específicas de tumor se han debatido de manera vigorosa y hasta ahora permanece indeterminada. El entendimiento de cómo y dónde los antígenos de tumor se presentan a las células T ayudarían a encontrar una acción terapéutica contra los
tumores.

La señalización LT\betaR se requiere para la formación de tejidos linfáticos organizados. El receptor \beta de linfotoxina (LT\betaR) juega un papel importante en la formación de estructuras linfáticas. LT\betaR se active mediante dos miembros de la familia TNF, linfotoxina de membrana \alpha\beta y LIGHT (Fig. 1). LT\betaR juega papeles centrales en la formación de LNs y la distinta organización de las zonas T, B en los órganos linfáticos secundarios. La señalización mediante LT\betaR regula la expresión de quimioquinas y moléculas de adhesión dentro de los órganos linfáticos secundarios. La quimioquinas y moléculas de adhesión controlan la migración y posicionamiento de DCs y linfocitos en el bazo. La sobre expresión de LT o TNF solubles en los tejidos no linfáticos era suficiente para promover neogénesis linfática
funcional.

LIGHT juega un único papel en la activación de las células T y la formación de tejido linfático. LIGHT es un ligando para LT\betaR y el mediador de entrada del virus herpes (HVEM). LIGHT se expresa predominantemente sobre tejidos linfáticos. Las interacciones entre LIGHT y LT\betaR restablecen las estructuras linfáticas en el bazo de ratones LT\alpha^{-/-}. Además, la regulación hacia arriba de LIGHT provoca la activación d las células T y migración en tejidos no linfáticos y forma estructuras de tipo linfáticos. Recíprocamente, los ratones LIGHT-/- muestran una alteración de la activación de las células T y mostraron rechazo cardíaco. Por lo tanto, LIGHT es una molécula coestimuladora potente que también promueve la formación de tejidos linfáticos para potenciar respuestas inmunes locales.

La carencia de cebado eficaz de células T vírgenes en el drenado de tejidos linfáticos e incapacidad de expandir las células T específicas de tumor dentro de los tumores previenen la erradicación del cáncer.

Sumario de la invención

El mutante LIGHT crea un microambiente de tipo linfático que expresa quimioquinas, moléculas de adhesión y moléculas coestimuladoras para cebar las Células T para matar las células tumorales.

El mutante LIGHT (LIGHT^{m}) se genera para prevenir la digestión por proteasa de manera que LIGHT se puede expresar sobre células tumorales.

El no mutante LIGHT no se expresa sobre la superficie de tumores y no inducen la actividad antitumoral eficaz.

La introducción del mutante LIGHT^{m}, un ligando para el receptor de linfotoxina expresado en el estroma y HVEM expresado en las células T, dentro del ambiente tumoral provoca el alto nivel de quimioquinas y las moléculas de adhesión, que se acompaña por la infiltración masiva de linfocitos T vírgenes. El mutante LIGHT (denominado LIGHT^{m}), tiene el sitio proteolítico EKLI de las posiciones 79 - 82 suprimidas de la secuencia de aminoácidos de LIGHT normal (Fig. 3A) (Tamada et al., 2000). LIGHT potencia el rechazo de un tumor paternal establecido, altamente progresivo en sitios locales y distales. Las células tumorales que expresan LIGHT^{m} son la base para las vacunas terapéuticas y profilácticas relevantes para erradicar tumores paternales bien establecidos y prevenir la nueva formación de tumores mediante metástasis.

Los tumores que expresan LIGHT^{m} como una vacuna terapéutica atrae más células T vírgenes y por lo tanto las activa de manera que más células T específicas antitumorales se generan para combatir tumores locales y distales.

Las células T cebadas con LIGHT^{m} y tumorales (o antígenos de tumor) conducen a una protección a largo plazo como una vacuna preventiva.

Un procedimiento novedosos para tratar tumores (tumores sólidos en particular) es crear microambientes de tipo linfático que expresan quimioquinas, moléculas de adhesión, y moléculas coestimuladoras requeridas para el cebado de células T vírgenes y la expansión de células T activadas mediante el uso de moléculas de Mutante LIGHT. Las células T más amplias se generan contra tumores. Los vectores adenovirales que incluyen el mutante LIGHT que codifica las secuencias, son eficaces contra tumores y metástasis. El volumen de los tumores se redujo in vivo cuando los vectores distribuyeron el mutante LIGHT a tumores cuando se compara con los tumores inyectados con vectores de control.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 ilustra un modelo actual para la interacción entre los miembros de la familia TNF/LT/LIGHT. LT\betaR se une a tanto LT como LIGHT, mientras HVEM se une a LIGHT. TNF3 y LT\alpha3 solubles se unen a TNFRI y
TNFRII.

La Fig. 2 muestra que tanto LIGHT^{m} como las células T específicas de antígeno se requieren para el rechazo óptimo de tumores. Las células tumorales (5 x 10^{5}) se inocularon en CB6F1: Tumor transfectado con LIGHT^{m} sobre el lado izquierdo y tumor control sobre el lado derecho. Catorce días después, Células 2 C T (10 x 10^{5}) se transfirieron en los ratones y se controló el crecimiento tumoral. Se muestran las curvas de crecimiento tumoral.

La Fig. 3 muestra la cinética de crecimiento de LIGHT- que expresa Ag104L^{d} y tumor paternal en ratones C3B6F1 y B6/RAG-1^{-/-}. A. Cuatro aminoácidos que corresponde a un sitio proteolítico se suprimieron del dominio extracelular de LIGHT para asegurar la expresión establa sobre la superficie de células tumorales. B. Células tumorales paternales Ag104L^{d}, células tumorales transfectadas Ag104L^{d} con LIGHT^{m}, en masa o clonadas, se tiñeron con LT\betaR - Ig humana, HVEM - Ig murina, seguido de anticuerpo de burro conjugado a FITC contra anticuerpo de IgG de cabra contra IgG murina, respectivamente (líneas en negro). Las células tumorales teñidas con una segunda etapa de anticuerpos solos se muestran en las líneas de puntos. C. Ratones C3B6F1 sen inocularon por vía subcutánea con 5 X 10^{6} de células tumorales paternales Ag104Ld (diamantes en negro) o células tumorales Ag104L^{d} que expresan LIGHT^{m} (diamantes en blanco). Ag104Ld crecieron de manera progresiva mientras que Ag104L^{d}- LIGHT^{m} se rechazó en ratones C3B6F1. D. Se expusieron ratones B6/RAG-1^{-/-} con inyección por vía subcutánea de 10^{6} células tumorales Ag104L^{d} (diamantes en negro) o células tumorales 104L^{d} que expresan LIGHT^{m} (diamantes en blanco). Ambos tumores crecieron progresivamente en los ratones B6/RAG-1^{-/-}.

La Fig. 4 muestra que un dominio extracelular modificado de LIGHT^{m} es suficiente para coestimular las respuestas de células T purificadas.

A. La proteína recombinante que contiene el dominio extracelular de LIGHT^{m} (85 - 239 aminoácidos) y una secuencia de información para facilitar la purificación de la proteína recombinante. B. Células T purificadas se estimularon con el dominio extracelular inmovilizado de LIGHT^{m} en la presencia de anticuerpo contra CD3 (anti-CD3).

La Fig. 5 son ilustraciones fotográficas que muestran un incremento de infiltración de células CD8^{+} en tejidos tumorales Ag104L^{d} que expresan LIGHT^{m}. Se inyectaron 5 X 10^{6} de células tumorales Ag104L^{d}, Ag104L^{d}-B7.1 o Ag104L^{d}- LIGHT^{m} por vía subcutánea en ratones C3B6F1. SE recogieron tejidos tumorales 10 - 14 días después de la inoculación de tumor. Se tiñeron secciones congeladas de tejidos tumorales con HE (panel superior) o anti- Th1.2-PE (panel de en medio), anti-CD8-PE, como se ha indicado (panel inferior).

La Fig. 6 A. ilustra el incremento de quimioquinas asociadas a LT\betaR y moléculas de adhesión en tumores Ag104L^{d}- LIGHT^{m}. (1) 5 X 10^{6} células tumorales de Ag104L^{d}, (2) Ag104L^{d}-B7.1 o (3) Ag104L^{d}- LIGHT^{m} se inocularon por vía subcutánea en ratones 3B6F1 o B6/RAG-1^{-/-}. Se recogieron tejidos tumorales 10 - 14 días después de la exposición tumoral. B. Se molió completamente tejido tumoral en los inhibidores que contenían PBS. SLC en el sobrenadante se midió mediante ELISA después de centrifugación. Tumores Ag104L^{d}-LIGHT-^{m} se recogieron de ratones tanto C3B6F1 como B6/RAG-1^{-/-}, como se ha indicado, que contenía un nivel mayor de SLC que los tumores paternales. C. Los tejidos tumorales de Ag104L^{d}, Ag104L^{d}-B7.1 o Ag104L^{d}- LIGHT^{m} se fijaron en formalina neutra al 10%, se seccionaron y se tiñeron con SLC anti-murino seguido de una segunda etapa de anticuerpo, desarrollo de color (rojo) se muestra por las flechas; el fondo era tinción por contraste de fase con hematoxilina (azul). D. Se aisló el ARN total del tejido tumoral y se realizó la RT-PCR cuantitativa a tiempo real para analizar la expresión de la molécula de adhesión MAdCAM-1 y quimioquina SLC. E. La disposición génica se realizó para analizar la expresión de otras quimioquinas como se indica en Ag104L^{d} que expresa LIGHT^{m} y tumor paternal que usa ARN total purificado a partir del tejido tumoral. El incremento de la quimioquinas asociadas a LT\betaR y las moléculas de adhesión se encontró en los tejidos tumorales que expresan LIGHT^{m}. Los niveles de expresión relativos se mostraron en el panel de la izquierda. El número de veces de incremento de la expresión por Ag104L^{d} - LIGHT^{m} se mostró en el panel de la derecha. Se aisló el ARN a partir de tejido tumoral y se realizó la disposición génica para analizar la expresión de las quimioquinas como se indica en Ag104L^{d} que expresa LIGHT^{m} y tumor paternal.

La Fig. 7 muestra que el ambiente tumoral de Ag104L^{d} mediada por LIGHT^{m} recluta células T 2C, les activa y provoca el rechazo tumoral. A. Ag104L^{d} y Ag104L^{d}- LIGHT^{m} expresaron el mismo nivel de antígeno L^{d}. Se tiñeron células Ag104L^{d} (línea de color negro) o Ag104L^{d}-LIGHT^{m} (línea de color gris oscuro) con anti-Ld seguido de una etapa de tinción de anticuerpo de cabra conjugado contra IgG de tipo murino. Las células tumorales teñidas con una segunda etapa de anticuerpo solo se muestran en las líneas de punto. B. Ratones OT- 1/RAG-1^{-/-} se inyectaron con 10^{6} células tumorales Ag104L^{d} o Ag104L^{d}- LIGHT^{m} por vía subcutánea. 3 X 10^{6} de células transgénicas 2 C TRC marcadas con CFSE se transfirieron a estos ratones 10 - 14 días después de la exposición de tumor. Los ganglios linfáticos que drenan tumores, los ganglios linfáticos que no drenan, tejido de bazo y de tumor se recogieron 48, 132, 168 y 336 horas, como se ha indicado, después de la transferencia de las células 2 C T. Se aislaron células T que infiltran tumores mediante una columna magnética de selección positiva. Las células de los ganglios linfáticos, bazo y tumores se sometieron a análisis de FACS después se tiñeron anti-CD8 y anticuerpo 1B2 clonotípico 2 C TCR. Se muestra la proliferación de células CD8 y 2 C T 1B2 doble positivas. C. Ratones OT-1/RAG-1^{-/-} se inyectaron con 10^{6} células tumorales Ag104L^{d} o Ag104L^{d}-LIGHT^{m} por vía subcutánea. 3 X 10^{6} de células transgénicas 2 C T CR marcadas con CFSE se transfirieron a estos ratones 10 - 14 días después de la exposición a tumor. Los ganglios linfáticos que drenan tumores, ganglios linfáticos que no drenan tumores, bazo y tejido tumoral se recogieron a las 48, y 336 horas, como se ha indicado, después de la transferencia de células 2 C T. Los tumores que infiltran células T se aislaron mediante una columna magnética reselección positiva. Las células de ganglios linfáticos, bazo y tumor se sometieron a análisis de FACS después se tiñeron con anticuerpo 1B2 y anticuerpos contra marcadores de activación CD62L o CD44 se mostró la expresión de CD62L o CD44 por las células 1B2 positivas 2 C T. D. Ratones OT-1/RAG-1^{-/-} se inyectaron con 10^{6} de células tumorales Ag104Ld o Ag104Ld-LIGHT por vía subcutánea. Se transfirieron 3 X 10^{6} de células T transgénicas 2C TCR a estos ratones 10 - 14 días después de la exposición al tumor. Las células 2 C T transferidas de manera adoptiva fueron capaces de suprimir el crecimiento de Ag104L^{d} que expresa LIGHT^{m} en los huéspedes OT-1/RAG-1^{-/-} pero o en los tumores paternales.

La Fig. 8 muestra que la inyección intra tumoral de Ag104L^{d} que expresa LIGHT erradica los tumores paternales establecidos. 10^{5} de células tumorales Ag104L^{d} se inocularon en ratones C3B6F1 seguido de la inyección intratumoral de 10^{6} células tumorales que expresan LIGHT^{m} o PBS como control como se indica 14 días después de la exposición de tumor paternal. Los tumores Ag104L^{d} tratados con Ag104L^{d}- LIGHT^{m} se rechazaron mientras que los tratados con PBS crecieron de manera progresiva.

La Fig. 9 muestra la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína LIGHT. El codón de partida ATG está indicado en letra negrita y la región que codifica un sitio proteolítico que se ha suprimido en LIGHT^{m} está subrayada.

La Fig. 10 muestra que la distribución del mutante LIGHT por adenovirus en tejidos tumorales permite la respuesta inmune eficaz y rechazo de tumor. Los ratones C3B6F1 se inocularon con 2 X 10^{5} de células tumorales Ag104L^{d}, seguido de la inyección intratumoral de 5 X 10^{10} de adenovirus que expresa LIGHT (izquierda) o adenovirus que expresa LacZ como se indica (derecha) 14 d después de la exposición de tumor paternal. Se calculó el volumen de tumor paternal mediante la fórmula (longitud X anchura X altura)/2.

La Fig. 11 muestra la inhibición de crecimiento de tumor 4T1 y reducción de los tumores matastásicos espontáneos. El día 0 los ratones 4T1 Se inocularon con control, el mutante LIGHT o LIGHT^{m} y anti 4-1 BB. El día 7 Ad-LIGHT^{m} (o D10 2A) mostraron alguna reducción, en los Días 14 y 17 esta reducción de volumen era más pronunciada. El día 19 se retiraron los tumores. El día 34 se comprobaron los tejidos para evaluar la metástasis de pulmón.

La Fig. 12 muestra los resultados de un ensayo clonogénico de los grupos de tratamiento de la Fig. 11. Se evitó las metástasis en ratones tratados con Ad- mutante LIGHT^{m} con y sin 41 BB.

Descripción detallada de la invención

La expresión de LIGHT^{m} en las células tumorales promueve el rechazo de tumores. El tumor Ag104A y su derivado se usaron como uno de los modelos tumorales. Ag104A se derivó originalmente de osteosarcoma espontáneo en ratones C3H (H-2^{k}) e incluso una dosis muy baja de Ag104A (10^{4}) puede crecer de manera agresiva en ratones C3H o B6C3F1 con muy pocos infiltrados. Cuando el antígeno fuerte, L^{d}, se introdujo en un tumor, el tumor permanecía resistente al reconocimiento inmune, lo que sugiere una posible barrera tumoral fuerte. El tumor Ag104L^{d} transfectado de manera retroviral con LIGHT^{m} mutado expresa de manera estable LIGHT^{m} sobre su superficie.

Se inoculó primero LIGHT^{m} -Ag104L^{d} en ratones B6C3F1 durante dos semanas, después se transfirieron 1 x 10^{6} de células 2 C T en los ratones que llevan el tumor establecido. De manera sorprendente, todos los tumores establecidos LIGHT^{m} -Ag104L^{d} (10/10) se rechazaron una semana después de la transferencia de las células 2 C T mientras no se rechazó ninguno de los tumores Ag104L^{d} (0/10). Incluso aunque B7-1 es una fuerte molécula coestimuladora para inducir la estimulación y expansión de las células T, por el contrario a LIGHT^{m}, la expresión de B7-1 sobre Ag104Ld no fue suficiente para el rechazo de un tumor. Estos datos sugieren que LIGHT^{m} puede ser más potente que B7-1 para romper la tolerancia a tumor. Considerando el efecto dual de LIGHT^{m}, la expresión local de LIGHT^{m} en el sitio del puede atraer células dendríticas y células T a través de la "barrera" tumoral mediante la regulación de la expresión de las quimioquinas de tejido linfático y moléculas de adhesión. Además, la expresión local de LIGHT^{m} llega a ser una molécula coestimuladora fuerte que puede potenciar la presentación directa de antígenos tumorales para las células T especificas de antígeno y evitan la desensibilización de células T infiltradas con el microambiente tumoral. Los tumores de origen H-2^{b}, tumores MC57 (fibrosarcoma), MC57-L^{d} y MC57-SIY con o sin expresión de LIGHT^{m} se han generado y usado en modelos de ratones B6, incluyendo LT\betaR, LIGHT^{m}, y ratones HVEM KO para caracterizar de manera adicional el papel de LIGHT^{m} y sus receptores en la inmunidad tumoral. LIGHT^{m} parece tener múltiples funciones en la mediación de la inmunidad tumoral. LIGHT^{m} también puede potenciar la apoptosis tumoral in vivo. De manera interesante, la inyección intratumoral de ADNc que codifica LIGHT^{m} indujo una respuesta de células T citolítica específica de antígeno e inmunidad terapéutica contra el tumor murino establecido
P815.

LIGHT^{m} expresado dentro del tumor aumentó la resistencia del huésped más de 500 veces. Fibrosarcoma Ag104L^{d} era altamente inmunogénico y perdió el 100% cuando 10^{4} células se inyectaron en los ratones receptores C3B6F1 por vía subcutánea (Tabla 1). Se ha reseñado que ratones transgénicos receptores de células 2 C T (TCR), que se cargaron con células Células T contra el antígeno L^{d} expresados en el tumor, no lo erradicaron incluso después del rechazo del injerto de piel que contenía el mismo antígeno (Hans, 1997). Cómo dirigir las células T específicas tumorales en el tumor y activarlas en los sitios del tumor parece ser un obstáculo crítico para el rechazo, así como la inmunoterapia de cáncer clínicamente. LIGHT expresado en el ambiente de tumor puede romper la tolerancia mediante la atracción y actividad de células T dentro de la ruta tumoral de LT\betaR y HVEM, respectivamente, conduciendo a rechazo de tumor. (Fig. 2). Para demostrar esto, LIGHT se expresó en esta línea celular tumoral mediante la transducción retroviral que utiliza el vector retroviral MFG. Inicialmente, la expresión de LIGHT no se detectó sobre la superficie de de células tumorales después de la transducción. Debido a que LIGHT tiene sitios proteolíticos en su secuencia, que pueden prevenir su presencia estable sobre la superficie de una línea celular tumoral, se usó una versión mutante de LIGHT (LIGHT^{m}), que reduce la proteolisis de LIGHT sobre la membrana. (Fig. 3A). Después de la transducción retroviral de LIGHT^{m} mutante/MFG a AG104Ld, se detectó la expresión de LIGHT^{m} sobre la superficie de células tumorales transducidas por LT\betaR-Ig. (Fig. 3B). Estas células se definieron como volumen de Ag104Ld- LIGHT^{m}. Células tumorales Ag104L^{d} que expresan LIGHT^{m} se clonaron después mediante dilución limitante. Uno de los clones, H10 se usó en la mayoría de los experimentos salvo que se especifique de otra manera. El mutante LIGHT^{m} fue capaz de unirse tanto a sus receptores, LT\betaR como HVEM. El volumen de Ag104L^{d}- LIGHT^{m} y todos los clones ensayados unidos a los receptores de LIGHT^{m}, LT\betaR y HVEM, mostraron su capacidad para teñirse mediante LT\betaR y HVEM solubles. Se mostró el perfil de tinción típica de Ag104L^{d}- LIGHT^{m} en masa y clon H10 por LT\betaR-Ig y HVEM-Ig (Fig. 3B). El crecimiento de células tumorales paternales y LIGHT-transfectantes era el mismo en tanto los cultivos de tejidos como en ratones RAG-1-/- (Fig. 3D). El número diferentes de células tumorales que expresan LIGHT^{m} -, masa o clon H10, se inocularon por vía subcutánea a ratones C3B6F1. Los receptores rechazaron la dosis más alta de L células tumorales que expresan LIGHT^{m}, 5 X 10^{6}, que era 500 veces la dosis a la que los tumores paternales crecieron de manera progresiva al 100% (Tabla 1). La cinética típica del crecimiento del tumor que expresa LIGHT^{m}, masa, o clon H10, y el único paternal cuando se inoculan 5 X 10^{6} células se mostraron en la Fig. 3C. Ag104Ld- LIGHT^{m} crecieron en las primeras dos semanas después de la inoculación seguido de la regresión posterior cuando el tumor paternal continúa progresando y matan el huésped en 3 - 4 semanas (Fig. 3C). El rechazo del tumor es probable que se use dependiendo de LIGHT^{m} -ya que los tumores que expresan LIGHT^{m} -se desarrollaron si la función de LIGHT^{m} se bloqueaba con LT\betaR soluble (Tabla 1). El rechazo del tumor depende de de los linfocitos. Ag104L^{d} que expresa LIGHT^{m} se desarrollaron de manera progresiva igual que el tumor paternal en ratones RAG-1^{-/-}, que carecen de linfocitos (Fig. 3D). Las células CD8^{+} T pero no las células CD4^{+} T eran esenciales para mediar el rechazo de Ag104L^{d} que expresa LIGHT debido a que los ratones C3B6F1, que carecían de las células CD8^{+} Células T con anticuerpo anti-CD8, no rechazaban estos tumores (Tabla 1). Sin embargo, las células CD4^{+} T no se requerían para el rechazo de tumores.

El ambiente de tumor mediado por LIGHT^{m} tiene más infiltración de células CD8^{+} T. Para investigar los posibles mecanismos que subyacen al rechazo de tumores mediados por LIGHT^{m}, 5 X 10^{6} Ag104L^{d} que expresa LIGHT^{m} o el mismo número de células tumorales paternales se inyectaron por vía subcutánea en los ratones C3B6F1. Entre diez y catorce días después de la inoculación tumoral, antes de que se eliminaran los tumores que expresan LIGHT^{m}, se recogieron los tejidos tumorales. La tinción de HE de los tejidos tumorales mostraron una gran cantidad de linfocitos de infiltración (Fig. 5) mientras que los tumores paternales mostraron muy poca infiltración (Fig. 5). La tinción Inmunofluorescente confirmó que entre los linfocitos de infiltración, una gran cantidad de células Thy1.2^{+} T (Fig. 5), especialmente las células CD8^{+} T estaban presentes dentro de los tumores que expresan LIGHT^{m}
(Fig. 5).

El dominio extracelular modificado de LIGHT es suficiente para coestimular las células T. Se ha reseñado que LIGHT tiene una actividad potente coestimuladora que conduce a la proliferación de células T. En la forma mutante de LIGHT, se suprimieron cuatro aminoácidos que corresponden a un sitio proteolítico en el dominio extracelular, muy próximo al dominio transmembrana de la molécula (Fig. 3A). La mutación en la molécula LIGHT^{m} afecta a su efecto coestimulador. La proteína recombinante LIGHT^{m} se prepare de manera que solamente contuviera los aminoácidos 85 a 239, una forma acortada del dominio extracelular, con un péptido de bandera para facilitar la purificación (LIGHT^{m} recombinante) (Fig. 4A). El dominio extracelular modificado de LIGHT^{m} era suficiente para coestimular las células T. Para este ensayo, se usó un ensayo de coestimulación in vitro con el recombinante LIGHT^{m} unido a placas para estimular las células T de ratón purificadas en la presencia de un anticuerpo monoclonal inmovilizado contra CD3 a una dosis por debajo e la óptima. El LIGHT^{m} recombinante inmovilizado estimulaba fuertemente una proliferación de Células T de ratón purificadas de una manera dependiente de la dosis en la presencia de cantidades por debajo de las óptimas de anticuerpo contra CD3 (Fig. 4B). El dominio extracelular modificado de LIGHT^{m}, que es el aminoácido 85 a 239 que excluye el sitio proteolítico suprimido de la molécula LIGHT^{m}, es suficiente para estimular el crecimiento de células T cuando se produce la vinculación del receptor de las células T.

Tumor que expresa la molécula B7.1 contiene células T de infiltración comparables con el tumor paternal. Infiltración de las células CD8^{+} T correlacionada con el rechazo tumoral por el ambiente tumoral mediado por LIGHT^{m}. Debido a que LIGHT^{m} tiene un potente efecto coestimulador sobre las células T, una pregunta era si B7.1, otra potente molécula coestimuladora es suficiente para mediar el rechazo tumoral con una gran cantidad de células T de infiltración. 5 X 10^{6} de células tumorales Ag104L^{d}-B7.1, que se transdujeron de la misma manera que Ag104L^{d}- LIGHT^{m}, se inocularon en ratones C3B6F1 por vía subcutánea. Estos tumores se hicieron crecer en los recipientes. La tinción de HE sobre los tejidos tumorales mostró poca infiltración de linfocitos (Fig. 5). La tinción inmunofluorescente con anti-Thyl.2 y anti-CD8 reveló que los tejidos tumorales de Ag104L^{d}-B7.1 contenían un nivel comparable de células T que incluyen infiltración de células CD8^{+} T con Ag104L^{d} de tumor paternal (Fig. 5), que era sustancialmente menos que cuando se compara con Ag104L^{d} que expresa LIGHT^{m} (Fig. 5). Estos datos eran consistentes con los hallazgos previos a dos moléculas coestimuladoras que expresan Ag104L^{d}, B7.1 y CD48, no eran rechazadas por ratones transgénicos 2 C TCR (Hans, 1997 JEM). Estas líneas de evidencia sugieren que la fuerte coestimulación sola no es suficiente para mediar el rechazo tumoral en estos modelos tumorales.

Ambiente tumoral mediado por LIGHT^{m} contiene un alto nivel de quimioquina SLC y molécula de adhesión regulada hacia arriba MAdCAM-1. Una cuestión fue, ¿cuál es el único ambiente tumoral mediado por LIGHT? Aunque LIGHT^{m} se une a HVEM, el receptor expresado sobre las Células T, mediante el cual LIGHT^{m} probablemente media su coestimulación de las Células T, LT\betaR es otro receptor que interactúa con LIGHT^{m}. La señalización de LT\betaR es un regulador importante para la quimioquina SLC y molécula de adhesión MAdCAM-1, que controla el domicilio de las células T vírgenes en los tejidos linfáticos secundarios. LIGHT^{m} en el ambiente tumoral puede interactuar con LT\betaR sobre estas células tumorales de estroma para regular hacia SLC y MAdCAM-1 en el ambiente tumoral. El tejido tumoral se puede recoger o bien de Ag104L^{d} paternal o Ag104L^{d} que expresa LIGHT^{m} 10 - 14 días después de la inoculación. La RT-PCR de tiempo real, mostró que la masa tumoral positiva a LIGHT^{m} expresaba un mayor nivel de SLC que el tumor paternal (Fig. 6A). Este resultado se confirmó independiente por ELISA que detecta la abundancia de SLC en Ag104L^{d}-LIGHT^{m} (Fig. 6B). SLC se podía detectar solamente en los tumores paternales (Fig. 6B). Para excluir la posibilidad que SLC mayor detectada en el tumor que expresa LIGHT^{m} se debía solamente a las respuestas inmunes progresivas vigorosas con más células T en el ambiente tumoral, tejidos tumorales que llevan el tumor RAG-1^{-/-}. Los tumores Ag104L^{d}- LIGHT^{m} que se desarrollan en los ratones deficientes en linfocitos contenían un mayor nivel de SLC que los tumores paternales (Fig. 6B). Además, el crecimiento igual de tumores tanto positivos como negativos de LIGHT^{m} en ratones RAG-1^{-/-} sugerían que la quimioquina SLC sola no es suficiente para mediar el rechazo de tumor. Estos datos eran consistentes con la tinción inmunohistoquímica de secciones tumorales de otros 5 pares de muestras de tumores LIGHT^{m} -positivo y negativo recogidas de animales que llevan el tumor C3B6F1 (TBA). La tinción muy fuerte de SLC se detectó cerca del área rica en estroma en los tumores que expresan LIGHT rodeados por una alta densidad de linfocitos de infiltración, como se muestra claramente por SLC y tejidos de tumores de doble tinción con hemotoxilina (Fig. 6C). Sin embargo, SLC no se detectó en el área rica en estroma sobre los tejidos tumorales que son negativos para LIGHT^{m} (Fig. 6C). Los tejidos de tumores que expresan B7.1- no tenían tampoco tinción de SLC y muy poca infiltración de linfocitos, similar a los de los tumores de control
(Fig. 6C).

Las moléculas de adhesión son críticas para la migración de linfocitos en los tejidos periféricos y la señalización de LT\betaR es importante para la expresión de una de las moléculas de adhesión MAdCAM-1 (Kang, 2002). El nivel de expresión de MAdCAM-1 en la masa tumoral que expresa LIGHT^{m} o el tumor paternal se comprobó mediante RT-PCR de tiempo real. El incremento de expresión para la molécula de adhesión MAdCAM-1 en la masa tumoral que expresa LIGHT^{m} se comparó con las paternales (Fig. 6D). Estos experimentos sugieren de manera fuerte que LIGHT en el ambiente tumoral interactúa con LT\betaR derivado de estroma tumoral para regular hacia arriba la quimioquina SLC y molécula de adhesión MAdCAM-1 para atraer los linfocitos en el ambiente
tumoral.

Además de las quimioquinas de tejido linfático, la señalización de LT\betaR también regula un conjunto de quimioquinas inducidas por INF-\gamma IP-10 y Mig. Una disposición génica para comparar el nivel de expresión de otras quimioquinas revelaron que IP-10 y Mig, que pueden potencialmente atraer Células T activadas, también se regularon hacia arriba específicamente en el ambiente tumoral mediado por LIGHT^{m} comparado con el paternal mientras que las otras quimioquinas ensayadas eran comparables entre tumores LIGHT^{m} -positivo o negativo. Por lo tanto, LIGHT^{m} juega un papel importante en la formación de microambiente linfático para reclutar células T vírgenes y posiblemente activadas.

Células T vírgenes se pueden reclutar en el ambiente tumoral mediado por LIGHT^{m} donde proliferan y rechazan tumores. El ambiente tumoral mediado por LIGHT^{m} contiene un alto nivel de quimioquina SLC y molécula de adhesión MAdCAM-1, que potencialmente permite la entrada de células T vírgenes. Las tres cuestiones directamente dirigidas eran: 1) si tal ambiente es capaz de reclutar células T vírgenes; 2) si las células T vírgenes se pueden activar dentro del tumor, in vivo, en la presencia de LIGHT^{m}; y 3) si el antígeno que leva el tumor puede ser rechazado por estas Células T. El antígeno L^{d} expresado por Ag104, es una molécula de clase I de MHC alogénco que presenta péptidos derivados del gen \alpha-cetoglutarato deshidrogenasa doméstico, sobre la superficie de las células tumorales. En los huéspedes C3B6F1 (H-2^{kXb}) o B6 (H-2^{k}), las células T transgénicas 2C TCR transferidas de manera adoptiva solamente reconocen las células tumorales Ag104 que presentan directamente L^{d} debido a que las respuestas de las células 2C T requerían L^{d} en su forma virgen, que se pierde cuando el antígeno se procesa y se presenta de manera cruzada por las células que presentan el antígeno (APCs) de los huéspedes. Los tumores que crecen subcutáneamente son muy ineficientes para cebar las células T por vía directa en los tejidos linfáticos. Ag104L^{d} inoculado por vía subcutánea 24 horas después con 3 - 5 X 10^{5} células 2 C T marcadas con CFSE se transfirieron de manera adoptiva en los huéspedes C3B6F1. La proliferación de células 2 C T no se detectó o midió mediante por dilución del tinte CFSE fluorescente en los ganglios linfáticos que drenan los tumores, otros ganglios linfáticos que no drenan los tumores o bazo hasta 7 días después de la exposición tumoral de Ag104L^{d}. Las células 2C Células T en los órganos linfáticos secundarios mantenían su fenotipo virgen como se indica por su bajo CD25, CD69 o CD44 sobre su superficie durante el día 7 de observación. Éstos indican que las Células T específicas para los antígenos expresadas sobre las células tumorales no se pueden activar si los antígenos no se presentan de manera cruzada de manera eficaz por muchas razones. Por consiguiente, 10^{6} células tumorales Ag104L^{d} no se rechazaron por los ratones C3B6F1 incluso cuando se transfirieron tantas como 5 X 10^{6} células 2C T específicas de antígeno tumoral en el
huésped.

Para investigar lo que sucede cuando células 2 C T transferidas de manera adoptiva cuando LIGHT^{m} está presente en el interior del ambiente tumoral. Los tumores Ag104L^{d} que expresan LIGHT^{m} fueron rechazados por las células CD8^{+} T sin transferencia de células 2C T en huéspedes C3B6F1. Con el fin de rastrear las células T específicas de antígeno y controlar su tráfico, cebado y capacidad de rechazar tumores, ratones transgénicos H-Y o OT-1 TCR en B6 (origen de H-2^{b}/RAG-1^{-/-} se usaron como receptores para la exposición a tumores. Estos ratones almacenan CD8^{+} T que no responden a tumor Ag104L^{d}. De este modo, Ag104L^{d} o Ag104L^{d} que expresa LIGHT^{m} se hicieron crecer ambos de manera agresiva en estos ratones de manera similar a los ratones RAG-1^{-/-} (Fig. 7D). Sin embargo las células 2 C T transferidas de manera adoptiva no experimentan proliferación homeostática vigorosa hasta 14 días en constante observación debido a la presencia de estas células CD8^{+} H-Y o OT-1 T transgénicas en estos ratones (Fig. 7B). De este modo, la proliferación vigorosa de las células 2C T en estos huéspedes eran dirigidas por el antígeno L^{d} dentro de 14 días después de la transferencia adoptiva. 10^{6} Ag104L^{d} o Ag104L^{d}- LIGHT^{m}, que expresaban el mismo nivel de antígeno L^{d} sobre su superficie (Fig. 7A), se inocularon por vía subcutánea en estos ratones. Después 3 X 10^{6} células 2 C T marcadas con CFSE se transfirieron de manera adoptiva 10 - 14 días después de la exposición de tumor. Se sacrificaron los ratones 48,132,168 y 336 horas después de la transferencia de células T y se recogieron ganglios linfáticos que drenan los tumores (DLN), otros ganglios linfáticos que no drenan los tumores (NDLN), bazo (SPL) y masa tumoral. La suspensión de células individuales de masa tumoral se obtuvo mediante digestión por colagenasa. Si es necesario, Células T infiltrantes de tumores (TIL) se purificaron con un sistema magnético de manera positiva a partir de células tumorales. Se evaluó el tráfico y proliferación de las células 2C T. Células 2 C T vírgenes con alta tinción de CFSE, alta CD62L y baja CD44 estaban presentes de manera similar en los órganos linfáticos secundarios tanto en ratones que llevan Ag104L^{d} como Ag104L^{d}- LIGHT^{m} 48 horas después de la transferencia de las células T (Fig. 7B & C). Sin embargo, un número significativo de células 2C T vírgenes, que con CD62L^{alto} y CD44^{bajo}, se detectaron dentro de los tumores que expresan LIGHT^{m} pero no en los tumores paternales (Fig. 7B & C). Esta población de células 2 C T proliferan dentro del tumos que expresa LIGHT^{m} indicado por la dilución de CFSE 132 horas después de la transferencia de células T (Fig. 7B). En este momento, no se detectaron células 2C T, vírgenes o proliferadas, se pueden detector en los tumores paternales (Fig. 7B). A las 168 h después de la transferencia de las células 2C T, grandes cantidades de células 2 C T proliferadas estaban presentes solamente en los tumores que expresan LIGHT^{m}. Hasta 7 días (168 h) después de las transferencias de células 2C T, no se puede detectar proliferación de células 2C T marcadas por CFSE o células 2 C T proliferadas en los tejidos linfáticos secundarios de los ratones que llevan tumores positivos o negativos de LIGHT^{m} (Fig. 5B). La activación de las células 2 C T por el antígeno L^{d} so se produjo en los ganglios que drenan los tumores, otros ganglios linfáticos o bazo, pero solamente dentro de tumor LIGHT^{m} positivo. 14 días después de la transferencia de células 2 C T, CFSE-bajo, se detectaron células 2 C T completamente proliferadas en los órganos linfáticos secundarios de los ratones que llevan tumores que expresan LIGHT^{m}. Las células 2C T presentes en los ganglios linfáticos expresaban alto nivel de CD44 y CD62L. Sin embargo, las células 2 C T que se transitan al bazo eran las mezclas de poblaciones de CD44^{high}CD62L^{bajo} y CD44^{alto}CD62L^{alto} (Fig. 5C). Este resultado era consistente con los previos hallazgos que las células T de memoria central que transitan al ganglio linfático y las Células T tanto de memoria central como periférica pueden ir al bazo (ref, Ahmed). En los ratones que llevan tumores paternales, las células 2 C T presentes en los órganos linfáticos secundarios mantenían un fenotipo virgen (CD62L^{alto} y CD44^{bajo}) sin proliferación significativa después de 14 días (Fig. 7B & C). Además, no se detectaron células 2C T, vírgenes o activadas, presentes dentro de los tumores paternales (Fig. 7B
& C).

De manera más importante, la proliferación de las células 2C T se correlacionaba con el rechazo tumoral, los tumores. Ag104L^{d}-LIGHT^{m} establecidos durante 10 días en estos ratones H-Y transgénicos se suprimieron completamente mientras que los tumores paternales se desarrollaron de manera comparable con en los ratones sin transferencia de células 2C T Fig. 7D).

Se usaron ratones C3B6F1 como receptores de tumores. 5 X 10^{6} Ag104L^{d} o Ag104L^{d}-LIGHT se inoculó por vía subcutánea en ratones C3B6F1. 10 -14 días después, 3 X10^{6} células 2 C T marcadas con CFSE se transfirieron de manera adoptiva en los huéspedes y se comprobaron el tránsito y proliferación de las Células T en los ganglios linfáticos que drenan los tumores, otros ganglios linfáticos que no drenan, bazo o masa tumoral después de 48 horas y 168 horas. Produjo resultados similares en ratones transgénicos H-Y o OT-1 TCR.

Células T específicas de antígeno tumoral vírgenes se pueden reclutar en el sitio del tumor y proliferaban allí de manera eficaz y mataron las células tumorales en el ambiente mediado por LIGHT^{m} incluso cuando los antígenos no se presentan bien de manera cruzada. De manera más significativa, estas Células T eran capaces de suprimir el crecimiento tumoral in situ. De manera interesante, el ambiente tumoral mediado por LIGHT^{m} generó una gran cantidad de Células T específicas de antígeno tumoral que eran capaces de abandonar el sitio tumoral, recircular y potencialmente rechazar otros tumores en los sitios distales que llevan el mismo antígeno sin LIGHT^{m}
(Tabla 3).

Vacunación terapéutica con Ag104L^{d} que expresa LIGHT^{m} erradica el tumor paternal establecido. El ambiente tumoral mediado por LIGHT^{m} era capaz de reclutar células T vírgenes y activarlas dentro del tumor y provocar el rechazo tumoral. La eficacia potencial terapéutica de los hallazgos se mostró mediante inyección de células tumorales que expresan LIGHT^{m} en el tumor paternal establecido. Tal tratamiento podría crear ambiente linfático para atraer las células T vírgenes y después activar las específicas de tumores mediante coestimulación en la presencia de antígeno que conduce al rechazo de estos tumores establecidos. 10^{5} Ag104L^{d} se inocularon por vía subcutánea en receptores de C3B6F1 y los tumores se dejaron que se establecieran durante 14 días. Después 10^{6} de células tumorales de Ag104L^{d} que expresan LIGHT^{m} se inyectaron dentro de los tumores paternales establecidos. Como control, se inyectó el mismo volumen de PBS en los tumores de la misma manera. Los tumores paternales establecidos tratados con células tumorales que expresan LIGHT^{m} se continuaron desarrollando 10 - 15 días antes de que comenzaron a retroceder y desaparecer (Fig. 8). Los tumores Ag104L^{d} tratados con PBS de desarrollaron de manera
agresiva.

El ambiente tumoral mediado por LIGHT^{m} generó muchas células T de memoria central y efectoras específicas de antígeno tumoral que vuelven a la circulación. La generación de tal conjunto de linfocitos puede ser importante para erradicar metástasis después de la eliminación quirúrgica de los tumores primarios. Las células T de memoria específicas de antígeno tumoral con alta cantidad de ambiente mediado por LIGHT^{m} pueden ser capaces de rechazar el tumor paternal establecido en el sitio distal. Para establecer un modelo relevante clínicamente, 10^{4} células tumoralesAg104L^{d} se inyectaron en el flanco izquierdo de huéspedes C3B6F1 y se establecieron los tumores durante 20 días. 10^{6} células tumoralesAg104L^{d} -LIGHT^{m} se inyectaron 20 días más tarde en el flanco derecho de los ratones. De manera alternativa, se inyectó el mismo volumen de PBS en los ratones que llevan el tumor Ag104L^{d} en el grupo de control. 100% de los ratones tratados con células tumorales que llevan LIGHT^{m} rechazaron los tumores paternales establecidos. Los tumores Ag104L^{d} se desarrollaron progresivamente sobre los ratones en el 100% del grupo de control
(Tabla 2).

La eficacia terapéutica de células tumorales que expresan LIGHT^{m} se demostró en otro modelo más estrechamente simulado de tumores con metástasis clínica. 10^{6} (tumor primario) y 5 X 10^{4} de células tumorales Ag104L^{d} (tumor distal) se inocularon en el flanco izquierdo y derecho de los ratones receptores, respectivamente. El tumor principal se eliminó mediante cirugía 14 días después de la inoculación del tumor y 10^{6} células tumorales Ag104L^{d} que expresan LIGHT^{m} se inyectaron en la parte superior trasera del ratón. Se observó el crecimiento del tumor distal establecido. Todos los ratones en el grupo tratado rechazaron los tumores distales. Sin embargo, sin el tratamiento con tumor que expresa LIGHT^{m}, el tumor distal tumor mató a todos los huéspedes en el grupo de control (Tabla
2).

El ambiente tumoral mediado por LIGHT^{m} es capaz de reclutar células T vírgenes y células T específicas de antígeno y activadas y expandas y células de rechazo de tumor que llevan el antígeno in situ. Además, se generó una gran cantidad de células T centrales específicas de antígeno y de tipo memoria de efector dentro del ambiente y permitían en tránsito a los sitios distales para rechazar los tumores que llevan el mismo (Tabla 3).

La distribución del mutante LIGHT (LIGHT^{m}) por adenovirus en los tejidos tumorales permite la respuesta inmune eficaz y rechazo de tumor.

La Fig. 10 ilustra las reducciones del volumen tumoral correlacionado con la presencia in vivo de la expresión del mutante LIGHT en células tumorales.

La Fig. 11 ilustra la reducción de la metástasis tumoral en ratones a los días 14, 17 y hasta el día 34 después de la inoculación. Existe un efecto sinérgico de anti-41BB, un anticuerpo que estimula las células T, en las reducciones de tumores.

La Fig. 12 muestra que el ensayo clonogénico no muestra evidencia de metástasis después del tratamiento con el mutante LIGHT.

TABLA 1 LIGHT aumenta la resistencia del huésped a las exposiciones tumorales de Ag104L^{d}

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TABLA 2 Incidencia de tumores Ag104L^{d} en ratones C3B6F1

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TABLA 3 Tratamiento con Ag104L^{d}-LIGHT erradica los tumores establecidos en los sitios distales

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Materiales y procedimientos

Ratones, Líneas celulares, y Reactivos. Ratones hembras C3HXC57BL/6 F1 (C3B6F1), de 4 - 8 semanas de edad se compraron en el Instituto Nacional del Cáncer, Frederick Cáncer Research Facility, (Frederick, MD). Ratones C57BL/deficientes de 6-RAG- 1-(RAG-1^{-/-}) se compraron en Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Ratones transgénicas H-Y TCR (ratones H-Y) sobre RAG-2-deficiente/B6 de origen se compraron en Taconic Farms (Germantown, NY). Ratones transgénicos 2C TCR sobre crías de origen RAG-1-deficiente en B6 durante 10 generaciones (ratones 2C) fueron proporcionados por J. Chen (Massachusetts Institute of Technology, Boston, MA). Los ratones OT-1 TCR transgénicos (ratones OT-1) fueron proporcionados por A. Ma (la Universidad de Chicago). Los ratones RAG-1^{-/-}, H-Y, 2C, OT-1 se crecieron y se desarrollaron y se mantuvieron en la instalación sin patógenos en la Universidad de Chicago. El cuidado y uso de animales estaban de acuerdo con las directrices institucionales.

El fibrosarcoma AG104A se desarrolló espontáneamente en un ratón envejecido C3H y se adaptó al cultivo como se ha descrito (Ward 1989 JEM). El H-2L^{d} (AG104-L^{d}) murino que expresa AG104A, el transfectante de las células AG104A, se ha descrito previamente (Wick M, 1997, JEM). Estas líneas celulares tumorales se mantuvieron en DMEM (Mediatech) suplementado con 10% FCS (Sigma-Aldrich), 100 U/ml penicilina, y 100 \mug/ml de estreptomicina (BioWhittaker). Las líneas celulares de hibridoma que producen los anticuerpos anti-L^{d} (clon 30-5-7) y anti-2C TCR (1B2) se obtuvieron de D. Sachs (National Institutes of Health, Bethesda, MD) y T. Gajweski (La Universidad de Chicago), respectivamente.

Los anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas se purificaron a partir del sobrenadante de cultivos con la columna G mediante un procedimiento convencional. El anticuerpo 1B2 se conjugó a FITC o biotina mediante la facilidad del anticuerpo monoclonal de La Universidad de Chicago. Anticuerpo anti-CD8 acoplado a PE, estreptavidina acoplada a Cy-cromo (CyC), anticuerpo anti-CD44 acoplado a CyC, anticuerpo anti-CD62L acoplado a PE y anticuerpo Th1.2 acoplado a PE- se compraron en BD Biosciences. FITC-conjugado-cabra-anti-ratón IgG se compró en Caltag. Estreptavidina acoplada a PE se compró en Immunotech. PE-acoplado burro anti-humano IgG se compró en Jackson Immunological Research Lab (West grove, PA). El anticuerpo biotinilado de cabra anti-SLC se compró en R&D systems Inc. (Minneapolis, MN). El anticuerpo AP conjugado conejo anti-cabra Ig se compró en Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA). El anticuerpo purificado cabra anti-SLC se compró en PeproTech (Rock hill, NJ). Colagenasa (tipe 4) se compró en Sigma-Aldrich. CFSE se compró en Molecular Probes.

Las proteínas de fusión HVEM-Ig y las proteínas de fusión LT\betaR Ig usadas en este estudio se han descrito anteriormente (jing's JCI y Q. Wu JEM 1999).

La generación de B7.1 o vectores de expresión del mutante LIGHT^{m} y Clones. Para generar pMFG-S-mutante LIGHT^{m}, pADNc3.1-mutante LIGHT^{m} se digirió con NcoI y BamHI y se ligó a un NcoI y se digirió por BamHI el plásmido pMFG-S-TPA (Dr. Mulligan RC, Massachusetts Institute of Technology, Boston, MA). Células que empaquetan \phi NxEco que producen los virus que contienen el mutante LIGHT^{m} se generaron mediante la transfección transitoria con MFG-S- mutante LIGHT^{m} mediante el procedimiento de precipitación con calcio. La expresión del mutante LIGHT^{m} mediante células tumorales AG104L^{d} infectadas (masa de AG104L^{d}-LIGHT^{m}) se ensayó mediante la tinción de las células con un antisuero de conejo que reconoce el mutante LIGHT^{m}. Posteriormente, las células tumorales AG104L^{d} que expresan el mutante LIGHT^{m} infectadas se clonaron mediante el procedimiento de dilución limitante. El clon H10 de AG104L^{d}-LIGHT^{m} era uno de estos clones usados en estos experimentos.

Crecimiento tumoral in Vivo. Se inyectaron células tumorales Desarrolladas de manera subcutánea en la parte trasera inferior, es decir 0,5 - 1 cm por encima de la base de la cola de los ratones. Se midió el crecimiento tumoral cada 3 a 4 días con un calibre. Se calculó el tamaño en centímetros cúbicos mediante la fórmula V = \piabc/6, donde a, b, y c son tres diámetros ortogonales.

Histología Se recogieron tejidos tumorales para en examen histológico en el momento indicado y se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%, se procesaron hasta una incrustación en parafina, y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Para la tinción inmunológica de SLC, se recogieron tejidos tumorales se incrustaron en el compuesto OCT (Miles-Yeda, Rehovot, Israel) y se congelaron a -70ºC. Las secciones congeladas (5 - 10 \mum de espesor) se fijaron en formalina fría al 2% en PBS y se permeabilizaron con 0,1% de saponina/PBS. Las secciones se prebloquearon con suero de cabra al 5% en 0,1% de saponina/PBS durante una hora y media a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Se realizó la tinción para SLC incubando primero con anticuerpo de cabra anti-SLC (R&D systems Inc. Minneapolis, MN) a una dilución de 1/25 en tampón de bloqueo. El anticuerpo anti-cabra Ig de conejo conjugado a fosfatasa alcalina (Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA) se añadió 2 horas más tarde. Para la tinción de inmunofluorescencia, se bloquearon las secciones con 2% de suero de ratón normal, suero de conejo, y suero de cabra en PBS durante una hora y media a temperatura ambiente en una cámara humidificada. La solución de bloqueo se reemplazó con 50 \mul de Abs primario, PE-conjugado anti-Th1.2 (BD PharMingen), o PE conjugado anti- CD8 (BD PharMingen), diluido 1/100 en solución de bloqueo, y se incubaron las secciones durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Se montaron las muestras en Mowiol 4-88 (BD Biosciences, La Jolla, CA) que contenía 10% 1,4-diazobiciclo [2.2.2] octano. Se analizaron las muestras dentro de las 48 h usando un microscopio Zeiss Axioplan (Zeiss, Oberkochen, Alemania) y una cámara Photometrics PXL CCD (Photometrics, Tucson, AZ). Se realizó un desplegamiento no vecino usando Openlab v2.0.6 (Improvision, Lexington, MA).

ELISA para CCL21. Se prepararon homogenatos de tumores y se ensayaron para CCL21. Una cantidad comparable de tejidos de tumor de ratones que llevan tumor se recogieron y se pesaron, se homogeneizaron en PBS que contenía inhibidores de proteasa, y los sobrenadantes se recogieron mediante centrfugación. Placas de poliestireno de microvaloración de 96 pocillos (Immulon 4, Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) se revistieron con anti-ratón de cabra CCL21 a 2 \mug/ml en PBS y después se bloquearon con 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar, se añadieron diluciones en serie de patrones de concentraciones conocidas (Recombinante CCL21, 50 ng/ml, R&D) y muestras y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados, se añadió Ab anti-SLC de conejo biotinilado a los pocillos. Después de 2 h de incubación y lavado, se añadieron 50 l de una avidina conjugada a fosfatasa alcalina diluida 1/1000 (Dako) durante 1 h y se desarrollaron. Se midió el desarrollo de color a 405 nm en un lector de placas automático (Spectra-Max 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y se determinó la cantidad de CCL21 mediante ELISA a partir de la curva estándar, y se normalizaron de acuerdo con el peso del tejido. Los datos son medias \pm d t.

Ensayo de RT- PCR cuantitativo de tiempo real. Se realizó una PCR de tiempo real. Se aisló el ARN total a partir de tumores con el Kit Absolute ARN miniprep (Stratagene, La Jolla, CA) y y se digirieron con la ADNasa I (Life Technologies, Grand Island, NY) para retirar el ADN cromosómico. La ADNasa I restante se inactivó a 75ºC durante 20 min y se ensayó la integridad de ARN mediante visualización de de geles teñidos con bromuro de etidio, 5 \mug de ARN total se transcribió de manera inversa en ADNc con el Kit First Strand ADNc Synthesis (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Se realizó el análisis de PCR cuantitativo de tiempo real sobre el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems). Las secuencias de cebador para CCL21 eran 5'-AGACTCAGGAGCCCAAAG
CA-3' (cebador directo) y 5'- GTTGAAGCAGGGCA AGGGT-3' (cebador inverso), y la sonda para CCL21 era 5'-CCACCTCATGCTGGCCTCCGTC-3'. Los cebadores para MAdCAM-1 eran 5'-GACACCAGCTTGGGCAGTGT-3' (cebador directo) y 5'- CAGCATGCCCCGTACAGAG-3' (cebador inverso), y la sonda para MAdCAM- 1 era 5'-CAGACCCTCCCAGGCAGCAGTATCC-3'. Los cebadores para GAPDH eran 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3' (cebador directo) y 5'- GGCATGGACT GTGGTCATGA-3' (cebador inverso), y la sonda para GAPDH era 5'-TGCATCCTG CACCACCAACTGCTTAG-3'. Las sondas CCL21 y MAdCAM-1 se marcaron con 6-carboxifluoresceína (FAM). La sonda GAPDH se marcó con etracloro-6-carboxi-fluoresceína (TET). Cada muestra de ADNc se amplificó por duplicado con CCL21 y GAPDH o MAdCAM-1 y GAPDH la mezcla maestra TaqMan Universal PCR que contenía la ADN polimerasa Ampli Taq Gold de acuerdo con las instrucciones del fabricante (PE Applied Biosystems). Las condiciones de PCR eran 2 min a 50ºC, 10 min a 95ºC, 15 s a 95ºC y 1 min a 60ºC durante 40 ciclos. Se determine la concentración del gen diana usando la CT comparativa (número de ciclos umbral en el punto de cruce entre la configuración de la amplificación y procedimiento de umbral y normalizado en el control interno de GAPDH.

Microensayo de quimioquina en tejidos tumorales. Para estos experimentos, se usaron Quimioquinas de ratón de la serie GEArray Q y membrana de Disposición de genes de receptores (SuperArray, Bethesda, MD). Se aisló el ARN total de tumores con el Kit Absolute ARN miniprep (Stratagene, La Jolla, CA) y se digirió con DNasa I (Life Technologies, Grand Island, NY) para retirar el ADN cromosómico. La ADNasa restante se inactivó a 75ºC durante 20 min. Se ensayó la integridad de ARN mediante visualización de los geles teñidos con bromuro de etidio. Se emplearon las microdisposiciones de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, usando los reactivos proporcionados, se prepare el ADNc a partir de ARN total mediante transcripción inversa con transcriptasa inversa de MMLV, se marcó radiactivamente usando [-32P] dCTP (3.000 Ci/mM), después se hibridizaron en las condiciones especificadas de manera precisa a una membrana de nylon cargada positivamente que contiene el ADN dispuesto. Después de lavar, las disposiciones se visualizaron mediante un formador de imágenes de fósforo. La carga se ajustó basándose en la intensidad de las señales de hibridación para los genes domésticos, PUC18, actina y GAPDH, después la expresión génica se cuantificó después de que la imagen registrada mediante el formador de imágenes de fósforo se convirtiera en datos digitales usando el software ImageQuant. Se analizaron los datos brutos usando el software GEArrayAnalyzer de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.

Ensayo de coestimulación de células T. Se purificaron células T mediante un procedimiento de selección negativa en el campo magnético como se indica por el fabricante (Miltenyi Biotec, Auburn, California). La pureza de las células T aisladas era mayor que 95%, como se determina mediante citometría de flujo que usa anticuerpo monoclonal contra CD3. Placas revestidas con 0,2 g/ml del anticuerpo monoclonal contra CD3 se revistieron adicionalmente a 37ºC durante 4 h con marca de LIGHT^{m}. Después de lavarse, se cultivaron las células T purificadas (1 X 10^{6} células/ml) en los pocillos. Anticuerpo monoclonal contra CD28 (1 \mug/ml) se usó en forma soluble. En todos los ensayos, la proliferación de las células T se ensayó mediante la adición de 1 Ci/pocillo ^{3}H-timidina durante las últimas 15 h del cultivo de 3 días culture. La incorporación de ^{3}H-timidina se midió en un contador de centelleo de microplacas TopCount (Packard instrument, Meriden, CT).

Análisis de Células por FACS. Con el fin de confirmar que el mutante LIGHT^{m} se une a LTbR y HVEM, células tumorales transfectadas AG104L^{d} con el mutante LIGHT (AG104L^{d}-LIGHT^{m}) se incubaron con LTbR-Ig o HVEM-Ig (0,02 mg/ml), se lavaron y se tiñeron con IgG anti-humana de burro acoplada a PR IgG anti-ratón de cabra acoplada a FITC, respectivamente. Para el análisis de la expresión de L^{d}, se incubaron células tumorales con el anticuerpo anti-L^{d}, se lavaron, y se incubaron con anticuerpo de IgG anti-ratón acoplada a FIAC. Para la detección de la proliferación de las células 2C T marcadas con CFSE, células de ganglios linfáticos aislados (LN), esplenocitos, y células T infiltrantes de tumores (TIL) se tiñeron con anticuerpo 1B2 biotinilado, se lavaron, y se tiñeron con estreptavidina acoplada a CyC y anti-CD8 acoplado a PE. Para el análisis de células 2 C T marcadas con CFSE y expresión de CD44, células LN aisladas, esplenocitos o TIL se tiñeron con el anticuerpo 1B2, se lavaron y se tiñeron con estreptavidina acoplada a PE y anti-CD44 acoplado a CyC. Para el análisis de células 2 C T marcadas con CFSE y expresión de CD62L, células LN aisladas, esplenocitos o TIL se tiñeron con anticuerpo 1B2 biotinilado, se lavaron, y se tiñeron con estreptavidina acoplada a CyC y anti-CD62L acoplado a PE. Las muestras se analizaron sobre FACScan y se analizaron los datos con los softwares CELLQuest o FlowJo

Transferencia adoptiva de células 2C T. Se aislaron células LN y esplenocitos a partir de ratones 2C y las células CD8^{+} T se seleccionaron negativamente con un Kit de enriquecimiento de células CD8^{+} T (Miltenyi Biotec, Auburn, California). Cuando se analizan, > 90% de las células CD8^{+} enriquecidas expresaron el receptor 2C. Aproximadamente 3 x 10^{6} células 2 C T se transfirieron enratones H-Y o OT-1 para ensayo de crecimiento de tumores. El mismo número de células 2 C T se transfirió a cada ratón en cada experimento. Para transferir Células T marcadas con CFSE, Células T a una concentración de 2 x 10^{7}/ml se marcaron con 10 \muM CFSE en PBS a 37ºC durante 30 min. Las células se inactivaron con un volumen igual de FCS durante 1 min y se lavó tres veces, y 3 x 10^{6} células T marcadas con CFSE se inyectaron por vía intravenosa en el plexo retroobital en un volumen de 0,2 ml a los ratones que llevan tumores. Se aislaron células de los ganglios linfáticos inguinales (DLNs), los otros ganglios linfáticos (ganglios linfáticos no drenantes [NDLN]), bazo o tumores en el tiempo indicado.

Agotamiento de células y bloqueo in vivo de la actividad de LIGHT^{m} activity con LTbR- Ig Ratones se agotaron de subconjuntos de linfocitos mediante procedimientos estándar (protocolo actual para inmunología) usando anticuerpo monoclonal (mAb) GK1,5 (Dialynas DM JI 1983) para las células CD4+, y mAb 2,34 para las células CD8+ (Sarmiento M 1980 JI). El examen de esplenocitos y células de ganglios linfáticos por FACS reveló que el subconjunto de agotamiento representaba < 0.5% de los linfocitos totales, con niveles normales de otros subconjuntos. Para bloquear LIGHT^{m} en ratones, el LT\betaR-Ig (100 \mug/inyección) se proporcionaron el mismo día y una semana después de la exposición de tumores por vía intraperitoneal.

Aislamiento de células a partir de tejidos tumorales. A los ratones se les extrajo sangre primero para disminuir la contaminación de la sangre de tejido tumoral. Los tejidos tumorales se recogieron, se lavaron en el PBS, se cortaron en piezas, y se volvieron a suspender en DMEM suplementado con 2% de FCS y 1,25 mg/ml de colagenasa D (solución de colagenasa D) durante 40 min en un incubador con agitación a 37ºC. La suspensión de células individuales se recogió después de 40 min, y los grumos celulares se digirieron durante otros 40 min en la solución de colagenasa D hasta que todo el tejido tumoral se haya resuelto en una suspensión de células individuales.

Distribución de LIGHT^{m} y células que expresan LIGHT^{m}

La distribución de un ácido nucleico que codifica LIGHT^{m} en un paciente puede ser o bien directa, en cuyo caso el paciente se expone directamente al ácido nucleico o vectores que llevan ácido nucleico, o indirecta, en cuyo caso, las células tumorales obtenidas a partir de una biopsia se transforman primero con los ácidos nucleicos in vitro, se irradiaron y después se transplantaron en el paciente. Estos planteamientos se practican de manera rutinaria en terapias génicas para suprimir tumores o tratamiento de otras enfermedades.

Distribución de ácidos nucleicos. Las secuencias de ácidos nucleicos se administran directamente in vivo, cuando se expresan para producir los productos codificados. Esto se puede llevara cabo mediante cualquiera de los numerosos procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, construyéndolos como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de manera que lleguen a ser intracelulares, por ejemplo, mediante infección usando vectores defectivos o atenuados u otros virales. (Patente de Estados Unidos Nº 4.980.286), o mediante inyección directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas, o revestimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas, o mediante su administración en enlace a un péptido que se sabe que entra en el núcleo, mediante su administración en enlace a un sujeto ligando a endocitosis mediada por receptor (que se puede usar para dirigir tipos de células que expresan de manera específica los receptores), etc. De manera alternativa, el ácido nucleico se puede introducir e incorporar con ADN de células huésped, mediante la recombinación homóloga.

También se han usado microesferas biodegradable en la distribución de genes que encapsulan el ácido nucleico. Microesferas tales como matrices, películas, geles e hidrogeles que incluyen ácido hialurónico (HA) derivatizado con una dihidrazida y reticularse a un ácido nucleico que forman microesferas de liberación lenta se han usado para distribuir ácidos nucleicos. La patente de Estados Unidos No. 6048551 describe un sistema de de distribución de genes de liberación controlada que utiliza poli (lactida-co-glicolida) (PLGA), hidroxipropilmetil celulosa ftalato, celulosa acetato ftalato, y microesferas de copolímeros para encapsular el vector génico.

Las composiciones terapéuticas usadas en la práctica de los procedimientos anteriores se pueden formular en las composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo adecuado para el procedimiento de distribución deseada. Los vehículos adecuados incluyen materiales que cuando se combinan con la composición terapéutica retienen la función antitumoral de la composición terapéutica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de un número de vehículos farmacéuticos convencionales tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato estériles, agua bacterioestática, y similares. Las formulaciones terapéuticas se pueden solubilizar y administrar mediante cualquier vía capaz de distribuir la composición terapéutica al sitio del tumor. Las vías potencialmente eficaces de administración incluyen, pero no se limitan a, intravenosa parenteral, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica, intraorgános, ortotópica, y similares. Una formulación preferida para la inyección intravenosa comprende la composición terapéutica en una solución de agua preservada bacteriostáticamente, agua sin preservar estéril, y/o diluida en cloruro de polivinilo o bolsas de polietileno que contienen cloruro sódico para inyección. Las preparaciones de proteínas terapéuticas se pueden liofilizar y almacenar en forma de polvos estériles, preferiblemente a vacío, y después reconstituirse en agua bacteriostática (que contiene por ejemplo, conservante de alcohol bencílico) o en agua estéril antes de la inyección. Las dosificaciones y protocolos de administración para el tratamiento de cánceres que usan los procedimientos anteriores variarán con el procedimiento y el cáncer diana, generalmente dependerán de un número de otros factores apreciados en la técnica.

Distribución que usa vectores virales. Se usan vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de la invención para la distribución de ácidos nucleicos específicos. Por ejemplo, se puede usar un vector retroviral. Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el empaquetamiento correcto del genoma viral e integración en el ADN de células huéspedes. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la proteína deseada a usar en la terapia génica se clonan en uno o más vectores, que facilita la distribución del gen en un paciente. Los adenovirus son otros vectores virales que se pueden usar en terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para la distribución de genes al epitelio respiratorios y otras dianas para los sistemas de distribución basados en adenovirus son hígado, el sistema nervioso central, células endoteliales, y músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células no divididas. Los virus asociados a adeno (AAV) también se ha propuesto para uso en la terapia génica (Patente de Estados Unidos Nº 5.436.146). Lentavirus son prometedores para uso en la terapia génica.

Transfección de células en cultivo de tejidos seguido de la distribución a pacientes. Otro planteamiento para la terapia génica implica la transferencia de un gen a células en cultivo de tejidos mediante procedimientos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio, o infección viral. Usualmente, el procedimiento de transferencia incluye la transferencia de un marcador que se puede seleccionar a las células. Después las células se colocan en selección para aislar las células que se han recogido y que están expresando el gen transferido. Después aquellas células se distribuyen a un paciente. En este procedimiento, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Tal introducción se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, que incluye, pero no se limita a transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión de células, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes medidas por microcélulas, fusión de esferoblastos, etc. La técnica proporcionaría la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de manera que el ácido nucleico se puede expresar por la célula y

\hbox{preferiblemente se puede heredar y expresar por su
progenia celular.}

Las células recombinantes resultantes se pueden irradiar y se pueden distribuir a un paciente mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Células recombinantes (por ejemplo, tronco hematopoyético o células de progenitor) se administran preferiblemente por vía intravenosa. La cantidad de células contempladas para uso depende del efecto definido, estado del paciente, etc., y se puede determinar por los expertos en la técnica. Las células en la que un ácido nucleico se puede introducir para propósitos de terapia génica que abarca cualquier tipo de célula deseada, y disponible, e incluyen pero no se limitan a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos, células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células del tronco o progenitoras, en particular células del tronco hematopoyético o progenitoras, por ejemplo, como se obtienen de médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc.

Vacunas. Como se usa en el presente documento, el "término" vacuna se refiere a una composición (por ejemplo, un antígeno LIGHT^{m} y un adyuvante) que provoca una respuesta inmune específica de tumor. Estas vacunas incluyen profiláctica (que previene nuevos tumores) y terapéutica (que erradica los tumores paternales). Un vector de vacuna tal como vacuna de ADN que codifica el LIGHT mutante se puede usar para provocar la respuesta inmune contra tumores. La respuesta se provoca a partir del sistema inmune del propio sujeto mediante la administración de la composición de vacuna en un sitio (por ejemplo, un sitio distante del tumor). La respuesta inmune puede dar como resultado la erradicación de células tumorales en el cuerpo (por ejemplo, células tumorales tanto primarias como metastásicas). Los procedimientos para generar vacunas tumorales se conocen bien en la técnica (Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 5.994.523 y 6.207.147 cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia).

Las vacunas pueden comprender uno o más antígenos tumorales en una composición farmacéutica. En algunos casos, el antígeno tumoral se inactiva antes de la administración. En otras realizaciones, la vacuna comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales (por ejemplo, citoquinas o células que expresan citoquinas).

En ciertos casos, las células seleccionadas de un paciente, tales fibroblastos, obtenidos, por ejemplo, a partir de una biopsia de piel rutinario, se modifican genéticamente para expresar una de la proteína deseada. Como alternativa, células de paciente que pueden servir normalmente como células que presentan antígeno en el sistema inmune tales como macrófagos, monocitos, y linfocitos también se pueden modificar genéticamente para expresar uno o más antígenos deseados. Las células que expresan antígeno se mezclan después con las células tumorales de paciente (por ejemplo, un antígeno tumoral), por ejemplo en la forma de células tumorales irradiadas, o como alternativa en la forma de antígeno tumoral natural o recombinante purificado, y emplearse en inmunizaciones, por ejemplo, por vía subcutánea, para inducir inmunidad antitumoral sistémica. Las vacunas se pueden administrar usando cualquier procedimiento adecuado que incluye pero no se limita a los descritos anteriormente.

Ensayo clonogénico Ensayo clonogénico para el pulmón Materiales

1)

DMEM 5% FCS (+ p/s, HEPES)

2)

Colagenasa tipo IV (Sigma)

3)

60 \muM 6-tioguanina

4)

Tubos cónicos de 50 ml

5)

Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos

6)

incubador agitados a 37ºC/incubador de cultivo de tejidos

7)

equipo de disección: tijeras, tijeras curvas, y fórceps

8)

cedazos de celdas de nylon de 70 \mum

9)

lisis de ACK

10)

metanol

11)

0,03% (p/v) de solución de azul de metileno

Nota: todas las soluciones y estériles deben estar estériles y se debe usar una técnica aséptica de acuerdo con lo anterior.

Preparar medio de colagenasa

A aproximadamente 25 ml de medio por número de pulmón, añadir colagenasa para preparar una concentración de medio de 1,5 mg/ml.

\vskip1.000000\baselineskip

Preparar muestra de pulmón

1. Retirar el pulmón del ratón y transferirlo a una placa de 6 pocillos

2. Añadir approx 200 ul de medio al pulmón

3. Con las tijeras curvadas, desmenuzar el pulmón en piezas pequeñas

4. Usar la parte curva de las tijeras cerradas, transferir el pulmón troceado a un tubo cónico de 50 ml de medio de colagenasa.

5. Añadir 5 ml de medio a los pocillos y pipetear y transferir las piezas de pulmón remanentes al tubo cónico

6. Colocar en el incubador con agitación durante 20 minutos a 37ºC a 175 rpm

7. Verter el sobrenadante a través de un cedazo de células en un tubo cónico de 50 ml limpio - cualesquiera piezas de pulmón sobre el cedazo de células se deben devolver al tubo cónico para una segunda digestión

a.

hacer girar el tubo con el líquido de la digestión a 1500 rpm durante 5 min en una centrífuga.

b.

Desechar el líquido después de la centrifugación.

c.

Resuspender el sedimento en 1 ml de medio sin colagenasa fresco

8. Lisis de ACK durante 5 minutos

9. Contar las células T

10. Sembrar 3 x 10^^{5}, 3 x 10^^{4}, 3 x 10^^{3} de células en placas de 12 pocillos

11. Añadir 60 \muM 6-tioguanina a cada pocillo

12. Colocar la placa en un incubador de cultivo de tejidos a 37ºC, 5% de CO_{2} durante 5 - 10 días

\vskip1.000000\baselineskip

Recogida de las colonias metastásicas clonogénicas

(no necesaria pero más fácil para contar las colonias)

1. Desechar el medio de cultivo de la placa de cultivo de tejido

2. Fijar las células mediante la adición de 5 ml de metanol a cada placa y girar. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min

a. NOTA: Colonias se deben volver blancas

3. Desechar el metanol y enjuagar cada placa cuidadosamente con 5 ml de agua destilada.

a. NOTA Importante: No dejar que las células se pongan en contacto con agua hasta que se hayan fijado las
células

4. Añadir 5 ml de 0,03% (p/v) de solución de azul de metileno a cada placa. Girar para cubrir la placa entera e incubar a temperatura ambiente durante 5 min

5. Desechar el tinte y enjuagar la placa cuidadosamente con 5 ml de agua destilada.

6. Dejar que la placa se seque al aire antes de contar las colonias de color azul

Una colonia representa una célula metastásica clonogénica

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Publicaciones citadas

Las publicaciones citadas se incorporan por referencia hasta el grado que se relacionan con la presente invención.

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Patente de Estados Unidos Nº 6048551

Patente de Estados Unidos Nº 5.436.146

Patente de Estados Unidos Nº 4.980.286

Patente de Estados Unidos Nº 5.994.523

Patente de Estados Unidos Nº 6.207.147

Claims (15)

1. El uso de una molécula de ADNc que codifica una Proteína LIGHT que carece del sitio proteolítico para la preparación de un medicamento para inducir la actividad antitumoral eficaz de las células T contra un tumor, en el que el medicamento se ha de introducir en el tumor y la molécula de ADNc se ha de expresar.

2. Una vacuna terapéutica que comprende células tumorales que expresan una proteína LIGHT que carece del sitio proteolítico.

3. Una vacuna profiláctica que comprende una Proteína LIGHT que carece del sitio proteolítico y antígenos tumorales en las células tumorales.

4. El uso de una molécula de ADNc que codifica una proteína LIGHT que carece del sitio para la preparación de un medicamento para destruir o rechazar un tumor creando micoambientes de tipo linfoide que expresan quimioquinas, moléculas de adhesión, y moléculas coestimuladoras requeridas para cebar las células T vírgenes, en el que el medicamento se ha de introducir en el tumor y la molécula de ADNc se ha de expresar.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que el tumor es un tumor sólido.

6. Un ADNc que codifica una proteína LIGHT que carece del sitio proteolítico.

7. El ADNc de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el sitio proteolítico de la proteína LIGHT está en las posiciones 79 a 82 de la proteína LIGHT.

8. A Proteína LIGHT que no tienen un sitio para la digestión por proteasa.

9. La proteína LIGHT de acuerdo con la reivindicación 8 que tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones 85 - 239 de LIGHT y una secuencia de marca.

10. La Proteína LIGHT de la reivindicación 9, en la que la proteína LIGHT es una proteína recombinante.

11. Una célula huésped transformada con el ADNc de LIGHT de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7.

12. Un vector con la molécula de ADNc de LIGHT ADNc de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7.

13. El vector de la reivindicación 12 es un vector adenoviral.

14. Un vector para seleccionar compuestos antitumorales candidatos, comprendiendo el procedimiento:

(a) administrar compuestos antitumorales candidatos a las células que expresan una Proteína LIGHT que carece del sitio proteolítico y células de control; y

(b) determinar si existe pérdida o muerte de células tumorales en las células que expresan LIGHT cuando se compara con las células de control.

15. La proteína LIGHT de la reivindicación 10, en la que el sitio para la digestión por proteasa que no está presente está flanqueado por una secuencia de aminoácidos en el extremo terminal, codificada por una secuencia de nucleótidos GGC TCC TGG.