DE602004011061T2

DE602004011061T2 - Erhöhte t-zell tumor-eindringung durch light- mutanten

Info

Publication number: DE602004011061T2
Application number: DE602004011061T
Authority: DE
Inventors: Yang-Xin Chicago FU
Original assignee: University of Chicago
Current assignee: University of Chicago
Priority date: 2003-06-11
Filing date: 2004-06-10
Publication date: 2008-11-06
Anticipated expiration: 2024-06-11
Also published as: EP1641491B1; CA2529058A1; DE602004011061D1; US20050025754A1; EP1641491A1; JP2007516694A; WO2005002628A1; ES2297479T3; AU2004253465A1; US7807784B2; ATE382372T1; JP5049011B2

Description

Hintergrund der Offenbarung
Der Mangel an aktivierten T-Zellen, die in immunokompetenten Wirten ausgebildete Tumore infiltrieren, erklärt die Unfähigkeit der Wirt die Tumore zu entfernen. Experimente in Tiermodellen ebenso wie klinische Studien, zeigen an, dass das Immunsystem individuelle Tumorzellen erkennen und töten kann, aber dass ein Wirt ausgebildete feste Tumore im Allgemeinen nicht entfernen kann. Es kann zahlreiche Erklärungen für das Unvermögen des Wirtes geben, effektiv auf etablierte Tumore zu reagieren: 1) Mangel an frühem T-Zell Priming wegen schwacher direkter oder indirekter Präsentation in lymphoiden Geweben, da eine unzureichende Menge von Tumorzellen (insbesondere solchen von nicht hämatopoetischem Ursprung) in das Gewebe wandert; 2) unzureichende Mengen von Immunzellen wandern wegen biologischer Barrieren um die Tumorgewebe zu den Tumorstellen; 3) erschöpfte oder kurzlebige aktivierte Antigen-spezifische T-Zellen, die beim Bekämpfen des Tumorwachstums wegen ihres begrenzten Repertoires versagen; 4) keine Reaktion oder Ignorieren von T-Zellen gegenüber Tumoren; 5) eine hemmende Mikroumgebung oder ein Mangel an Stimulation innerhalb der Tumore, um das Immunsystem zu aktivieren.
Klinisch ist der Anstieg der Infiltration der T-Zellen in die Tumorstelle eng mit einer besseren Prognose assoziiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass präventive Vakzinierungen wirksam waren, das Abstoßen der inokulierten Tumorzellen zu induzieren. Nachdem es jedoch zu Tumorwachstum gekommen war, waren die therapeutischen Vakzinierungen gewöhnlich nicht in der Lage den Tumor abzustoßen. Chirurgisches Verkleinern des Tumors verstärkt nicht die Immunantwort auf Tumoren. Weiterhin wurde berichtet, dass sogar die Expression eines starken Antigens auf Tumorzellen nicht ausreichend war, um die Abstoßung eines ausgebildeten Tumors zu fördern, trotz der Präsens einer überschüssigen Mengen von Antigen spezifischen T-Zellen in den lymphoiden Geweben. Mangel an T-Zell Priming und/oder Infiltrierung eines ausgebildeten Tumors ist eines der Haupthindernisse für entweder natürliche oder therapeutische Ansätze gegen antigene Krebsarten. Zusätzlich ist ungenügende Expression von kostimulatorischen Molekülen innerhalb der Tumorgewebe nicht in der Lage infiltrierende T-Zellen zu aktivieren und resultiert in der Anergie von Tumor reaktiven T-Zellen.
Der Mangel an frühem T-Zell Priming ist möglicherweise auf wenige Tumorzellen zurückzuführen, die aus dem festen Gewebe in lymphoide Gewebe zur direkten Präsentation gewandert sind. Genetische Analyse mit Knochenmarkschimeren enthüllte zwei Modi der Antigenpräsentation, um MHC-I restringierte CD8⁺ T-Zellen zu Primen. Direktes Priming wird durch die Beteiligung von T-Zellen mit den Zellen vermittelt, die das Protein mit antigenen Epitopen synthetisieren, während über Kreuz Priming durch die Antigen präsentierenden Wirtszellen vermittelt wird, die die Antigene aufnehmen, die durch andere Zellen synthetisiert werden. Die Mechanismen zum Primen von Tumor spezifischen T-Zellen wurden heftig debattiert und bleiben bisher unklar. Zu verstehen, wie und wo Tumorantigen gegenüber T-Zellen präsentiert werden, würde helfen ein therapeutisches Mittel gegen Tumore zu finden.
Die Signalvermittlung über LTβR wird benötigt um organisierte lymphoide Geweben zu bilden. Lymphotoxin β Rezeptor (LTβR) spielt eine wichtige Rolle bei der Ausbildung lymphoider Strukturen. LTβR wird durch zwei Mitglieder der TNF Familie aktiviert, Membran-Lymphotoxin αβ und LIGHT (1). LTβR spielt herausragende Rollen bei der Bildung von LNs und der genauen Organization von T, B Zonen in sekundären lymphoiden Organen. Die Signalvermittlung über LTβR reguliert die Expression von Chemokinen und Adhäsionsmolekülen innerhalb der sekundären lymphoiden Organe. Chemokine und Adhäsionsmoleküle kontrollieren die Wanderung und Positionierung von DCs und Lymphozyten in der Milz. Überexpression von löslichem LT oder TNF in nicht lymphoiden Geweben war ausreichend, um funktionale lymphoide Neogenese auszulösen.
LIGHT spielt eine einzigartige Rolle bei der T-Zellaktivierung und der Ausbildung von lymphoiden Geweben. LIGHT ist ein Ligand für LTβR und "herpes virus entry mediator (HVEM)". LIGHT wird überwiegend in lymphoiden Geweben expremiert. Wechselwirkungen zwischen LIGHT und LTβR stellen lymphoide Strukturen in der Milz von LTα^–/– Mäusen wieder her. Zusätzlich verursacht das Heraufregulieren von LIGHT T-Zellaktivierung und Migration in nicht lymphoide Gewebe und bildet lymphoidartige Strukturen. Umgekehrt zeigten LIGHT^–/– Mäuse beeinträchtigte T-Zell Aktivierung und verzögertet kardiale Abstoßung. Daher ist LIGHT ein potententielles kostimularatorisches Molekül, das auch die Bildung von lymphoiden Geweben fördert, um die lokalen Immunantworten zu verstärken.
Mangel an effizientem Priming von naiven T-Zellen in ableitenden lymphoiden Geweben und Unvermögen Tumor-spezifische T-Zellen innerhalb von Tumoren zu expandieren verhindert das Auslöschen des Krebs.
Zusammenfassung der Erfindung
Mutiertes LIGHT erschafft eine lymphoidartige Mikroumgebung, die Chemokine, Adhäsionsmoleküle und kostimulatorische Moleküle zum Priming von T-Zellen expremiert, um Tumorzellen zu töten.
Mutiertes LIGHT (LIGHT^m) wird erzeugt, um Proteaseabbau zu verhindern, so dass LIGHT in Tumorzellen exprimiert werden kann. Nicht mutiertes LIGHT wird nicht auf der Oberfläche von Tumoren expremiert und induziert nicht eine wirksame Anti-Tumoraktivität.
Die Einführung von mutiertem LIGHT^m, einem Liganden für im Stroma expremierten Lymphotoxin-Rezeptor und T-Zell expremiertes HVEM, in die Tumorumgebung induzierte hohe Niveaus von Chemokinen und Adhäsionsmolekülen, begleitet von massiver Infiltrierung durch naive T-Lymphozyten. In mutiertem LIGHT (bezeichnet als LIGHT^m) wurde die proteolytische Stelle EKLI an den Positionen 79–82 aus der Aminosäuresequenz von normalem LIGHT (3A) entfernt (Tamada et al., 2000). LIGHT verstärkt die Abstoßung eines ausgebildeten hoch progressiven parentalen Tumors an lokalen und distalen Stellen. LIGHT^m expremierende Tumorzellen sind die Basis für ein klinisch relevantes therapeutische und prophylaktische Vakzine um weit ausgebildete parentale Tumore auszulöschen und neue Tumore zu verhindern, die sich durch Metastase bilden.
LIGHT^m expremierende Tumoren als ein therapeutische Vakzin zieht mehr naive T-Zellen an und aktivieren sie dann, so dass mehr Antitumor-spezifische T-Zellen erzeugt werden, um lokale und distale Tumore zu bekämpfen.
LIGHT^m und Tumore (oder Tumorantigene) Primen T-Zellen und führen als ein vorbeugendes Vakzin zu langfristigem Schutz.
Ein neues Verfahren zum Behandeln von Tumoren (insbesondere festen Tumoren) ist es, lymphoidartige Mikroumgebungen zu erschaffen, die Chemokine, Adhäsionsmoleküle und kostimulatorische Moleküle expremieren, die benötigt werden, um naive T-Zellen zu Primen und aktivierte T-Zellen zu expandieren, indem mutierte LIGHT Moleküle verwendet werden. Breitere T-Zellen werden gegen Tumore erzeugt. Adenovirale Vektoren, die mutierte LIGHT kodierende Sequenzen einschließen, sind gegen Tumore und Metastasen wirksam. Das Tumorvolumen wurde in vivo in Vergleich zu Tumoren reduziert, die mit Kontrollvektoren injiziert wurden, wenn Vektoren mutiertes LIGHT an Tumoren verabreichten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht ein gegenwärtiges Modell für die Interaktionen zwischen den TNF/LT/LIGHT Familienmitgliedern. LTβR bindet sowohl Membran-LT als auch LIGHT, während HVEM an LIGHT bindet. Lösliches TNF3 und LTa3 binden an TNFRI und TNFRII.
2 zeigt, dass sowohl LIGHT^m als auch Antigen spezifische T-Zellen für optimale Tumorabstoßung benötigt werden. Tumorzellen (5 × 10⁵) wurden in CB6F1 inokuliert: Tumor transfiziert mit LIGHT^m auf der linken Seite und Kontrolltumor auf der rechten Seite. Vierzehn Tage später wurden 2C T-Zellen (10 × 10⁵) in die Mäuse transferiert und das Tumorwachstum wurde beobachtet. Tumorwachstumskurven werden gezeigt.
3 zeigt die Wachstumskinetiken von LIGHT expremierendem Ag104L^d und parentalem Tumor in C3B6F1 und B6/RAG-1^–/– Mäusen. A. Vier Aminosäuren, die zu einer proteolytischen Stellen korrespondieren, wurden aus der extrazellulären Domäne von LIGHT deletiert, um stabile Expression auf der Oberfläche der Tumorzellen sicher zu stellen. B. Ag104L^d parentale Tumorzellen, Ag104L^d Tumorzellen, die mit LIGHT^m transfiziert wurden, als Menge oder kloniert, wurden mit humanem LTβR Ig, murinem HVEM Ig, gefolgt von einem FITC konjugiertem Eselsantikörper gegen humanes IgG bzw. Ziegenantikörper gegen murines IgG (durchgezogene Linien) gefärbt. Tumorzellen, die nur mit dem Antikörper des zweiten Schrittes gefärbt sind, werden als gepunktete Linen gezeigt. C. C3B6F1 Mäuse wurden subkutan mit 5 × 10⁶ Ag104L^d parentalen Tumorzellen (ausgefüllte Diamanten) oder LIGHT^m expremierenden Ag104L^d Tumorzellen (hohle Diamanten) inokuliert. Ag104L^d wuchs progressiv, während Ag104L^d-LIGHT^m in C3B6F1 Mäusen abgetoßen wurden. D. B6/RAG-1^–/– Mäuse wurden mit subkutaner Injektion von 10⁶ Ag104L^d Tumorzellen (ausgefüllte Diamanten) oder LIGHT^m expremierenden 104L^d Tumorzellen (hohle Diamanten) gechallenged. Beide Tumoren wuchsen in den B6/RAG-1^–/– Mäusen progressiv.
4 zeigt, dass eine modifizierte extrazelluläre Domäne von LIGHT^m ausreichend ist, um Antworten von gereinigten T-Zellen kozustimulieren. A. Rekombinantes Protein enthaltend die extrazelluläre Domäne von LIGHT^m (85–239 Aminosäuren) und eine Flagsequenz, um die Aufreinigung von rekombinantem Protein zu ermöglichen. B. Aufgereinigte T-Zellen wurden mit immobilisierter extrazellulärer Domäne von LIGHT^m in der Gegenwart von Antikörper gegen CD3 (Anti-CD3) stimuliert.
5 sind photographische Veranschaulichungen, die erhöhte Infiltration von CD8⁺ T-Zellen in LIGHT^m expremierende Ag104L^d Tumorgeweben zeigen. 5 × 10⁶ Ag104L^d, Ag104L^d-B7.1 oder Ag104L^d-LIGHT^m Tumorzellen wurden subkutan in C3B6F1 Mäuse injiziert. Tumorgewebe wurde 10–14 Tage nach Tumorinokulierung entnommen. Gefrorene Schnitte von Tumorgeweben wurden mit HE (oberes Panel) oder anti-Th1.2-PE (mittleres Panel), anti-CD8-PE, wie angegeben (unteres Panel) gefärbt.
6A. veranschaulicht erhöhte LTβR assoziierte Chemokine und Adhäsionsmoleküle in Ag104L^d-LIGHT^m Tumoren. (1) 5 × 10⁶ Ag104L^d, (2) Ag104L^d-B7.1 oder (3) Ag104L^d-LIGHT^m Tumorzellen wurden subkutan in C3B6F1 oder B6/RAG-1^–/– Mäuse inokuliert. Tumorgewebe wurden 10–14 Tage nach Tumor-Challange gesammelt. B. Die gleiche Menge von Tumorgewebe wurde sorgfältig in PBS enthaltend Proteaseinhibitoren zermahlen. SLC in dem Überstand wurde durch ELISA nach dem Zentrifugierem gemessen. Ag104L^d-LIGHT^m Tumore, die sowohl von C3B6F1 als auch B6/RAG-1^–/– Mäusen, wie angegeben, gesammelt wurden, enthielten höhere Niveaus an SLC als die parentalen Tumore. C. Tumorgewebe von Ag104L^d, Ag104L^d-B7.1 oder Ag104L^d-LIGHT^m wurden in 10% neutralem Formalin fixiert, geschnitten und mit Anti-Maus SLC gefärbt gefolgt von einem sekundären Antikörper, Farbentwicklung (rot) wird durch Pfeile angezeigt; der Hintergrund war mit Hemotoxilyn gegengefärbt (blau.) D. Gesamt-RNA wurde aus dem Tumorgewebe isoliert und quantitative Echtzeit-RT-PCR wurde durchgeführt, um die Expression von Adhäsionsmolekül MAdCAM-1 und Chemokin SLC zu analysieren. E. Ein Gen-Array wurde durchgeführt, um die Expression anderer Chemokine, wie angegeben, in dem LIGHT^m expremierendem Ag104L^d und parentalem Tumor zu analysieren, indem Gesamt-RNA aus dem Tumorgewebe aufgereinigt wurde. Der Anstieg der LTβR assoziierten Chemokine und Adhäsionsmoleküle wurde in den LIGHT^m expremierenden Tumorgeweben gefunden. Die relativen Expressionsnivaus werden in dem linken Panel angezeigt. Der Faktor des Anstiegs der Expression von Ag104L^d-LIGHT^m wird in dem rechten Panel gezeigt. Die Gesamt-RNA wurde aus dem Tumorgewebe isoliert und eine Gen-Array wurde durchgeführt, um die Expression von Chemokinen, wie angegeben, in dem LIGHT^m expremierendem Ag104L^d und parentalem Tumor zu analysieren.
7 zeigt, dass LIGHT^m vermittelte Ag104L^d Tumorumgebung naive 2C T-Zellen rekrutiert, sie aktiviert und Tumorabstoßung verursacht. A. Ag104L^d und Ag104L^d-LIGHT^m expremierten das gleiche Niveau an Antigen L^d. Ag104L^d (schwarze durchgezogene Line) oder Ag104L^d-LIGHT^m (graue durchgezogene Linie). Tumorzellen wurden mit Anti-L^d gefärbt gefolgt von einem zweiten Schritt zur Färbung mit FITC konjugiertem Ziegen-Antikörper gegen murines IgG. Tumorzellen, die nur mit dem Antikörper des zweiten Schrittes gefärbt wurden, werden als gepunktete Linie gezeigt. B. In OT-1/RAG-1^–/– Mäuse wurden 10⁶ Ag104L^d oder Ag104L^d-LIGHT^m Tumorzellen subkutan injiziert. 3 × 10⁶ CFSE markierte 2C TCR transgene T-Zellen wurden in diese Mäuse 10–14 Tage nach Tumor-Challenge transferiert. Tumor abführende Lymphknoten, nicht abführende Lymphknoten, Milz und Tumorgewebe wurden 48, 132, 168 und 336 Stunden, wie angegeben, nach 2C T-Zelltransfer gesammelt. T-Zellen, die Tumore infiltrierten, wurden durch eine positiv selektionierende magnetische Säule isoliert. Zellen aus Lymphknoten, Milz und Tumor wurden der FACS Analyse unterzogen, nachdem sie mit Anti-CD8 und 2C TCR clonotypischem Antikörper 1B2 gefärbt wurden. Proliferation von CD8 und 1B2 doppelpositiven 2C T-Zellen wurde gezeigt. C. OT-1/RAG-1-Mäuse wurden mit 10⁶ Ag104L^d oder Ag104L^d-LIGHT^m Tumorzellen subkutan injiziert. 3 × 10⁶ CFSE markierte 2C TCR transgene T-Zellen wurden in diese Mäsue 10–14 Tage nach Tumorchallange transferiert. Tumor abführende Lymphknoten, nicht abführende Lymphknoten, Milz und Tumorgewebe wurden 48, 132, 168 und 336 Stunden, wie angegeben, nach 2C T-Zelltransfer gesammelt. T-Zellen, die Tumore infiltrierten, wurde durch eine positiv selektionierende magnetische Säule isoliert. Zellen aus Lymphknoten, Milz und Tumor wurden der FACS Analyse unterzogen, nachdem sie mit Antikörper 1B2 und Antikörper gegen die Aktivierungsmarker CD62L oder CD44 gefärbt wurden. CD62L oder CD44 Expression durch 1B2 positive 2C T-Zellen wurde gezeigt. D. In OT-1/RAG-1^–/– Mäuse wurden 10⁶ Ag104L^d oder Ag104L^d-LIGHT^m Tumorzellen subkutan injiziert. 3 × 10⁶ CFSE markierte 2C TCR transgene T-Zellen wurden in diese Mäuse 10–14 Tage nach Tumor-Challenge transferiert. Adoptiv transferierte 2C T-Zellen waren in der Lage, das Wachstum von LIGHT^m expremierenden Ag104L^d in den OT-1/RAG-1^–/– Wirten zu unterdrücken, aber nicht in den parentalen Tumoren.
8 zeigt, dass die intra-tumor Injektion von LIGHT expremierendem Ag104L^d ausgebildete parentale Tumore auslöscht. 10⁵ Ag104L^d Tumorzellen wurden in C3B6F1 Mäuse inokuliert gefolgt von Intratumor Injektion von 10⁶ LIGHT^m expremierenden Tumorzellen oder PBS als Kontrolle, wie angegeben, 14 Tage nach Challenge von parentalem Tumor. Ag104L^d Tumore, die mit Ag104L^d-LIGHT^m behandelt wurden, wurden abgestoßen, während die, die mit PBS behandelt wurden, progressiv wuchsen.
9 zeigt die Nukleinsäuresequenz, die ein LIGHT Protein kodiert. Das Start-Codon ATG ist in Fettdruck markiert und die Region, die für eine proteolytische Stelle kodiert, die in LIGHT^m deletiert wurde, ist unterstrichen.
10 zeigt, dass die Verabreichung von mutiertem LIGHT durch Adenovirus in Tumorgewebe eine wirksame Immunantwort und Tumorabstoßung ermöglicht. C3B6F1 Mäuse wurden mit 2 × 10⁵ Ag104L^d Tumorzellen inokuliert, gefolgt von einer intratumoralen Injektion von 5 × 10¹⁰ LIGHT expremierendem Adenovirus (links) oder LacZ expremierendem Adenovirus, wie angegeben, (rechts) 14 Tage nach parentalem Tumor-Challenge. Das Tumorvolumen wurde berechnet durch die Formel (Länge × Weite × Höhe)/2.
11 zeigt Hemmung von 4T1 Tumor und Abnahme von spontan metastatierenden Tumoren. An Tag 0 wurden 4T1 Mäuse mit Kontrolle, mutiertem LIGHT oder LIGHT^m und Anti-4.1 BB inokuliert. An Tag 7 zeigte Ad-LIGHT^m (oder D10 2A) eine gewisse Abnahme, an Tagen 14 und 17 war diese Volumenabnahme ausgeprägter. An Tag 19 werden die Tumoren entfernt. An Tag 34 wurden die Gewebe auf Lungenmetastasen geprüft.
12 zeigt die Ergebnisse eines clonogenen Assays der Behandlungsgruppen aus 11. Metastasen in Mäusen mit Ad-mutiertem LIGHT^m mit und ohne 41 BB wurden verhindert.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Expression von LIGHT^m auf Tumorzellen fördert die Tumorabstoßung. Der Tumor Ag104A und seine Derivate wurden als eines der Tumormodelle verwendet. Ag104A wurde ursprünglich aus spontanen Osteosarcoma in C3H (H-2^k) Mäusen abgeleitet und sogar sehr geringe Mengen von Ag104A (10⁴) können aggressiv in C3H oder B6C3F1 Mäusen bei sehr geringen Infiltraten wachsen. Wenn das starke Antigen, L^d, in einen Tumor eingeführt wurde, blieb er gegenüber der Immunerkennung resistent, was eine mögliche starke Tumorsperre nahe legt. Ag104L^d Tumor, der retroviral mit mutiertem LIGHT^m transfiziert war, expremierte LIGHT^m stabil auf seiner Oberfläche.
LIGHT^m-Ag104L^d Tumor wurde zuerst in B6C3F1 Mäuse für 2 Wochen inokuliert, dann wurden 1 × 10⁶ 2C T-Zellen in die Mäuse, die ausgebildete Tumore besaßen, transferiert. Beindruckenderweise wurde alle ausgebildeten LIGHT^m-Ag104L^d Tumore (10/10) eine Woche nach dem Transfer der 2C T-Zellen abgestoßen, während Ag104L^d Tumore (0/10) nicht abgestoßen wurden. Obwohl B7-1 ein starkes kostimulatorische Molekül zum Induzieren von T-Zellaktivierung und Expansion ist, war im Gegensatz zu LIGHT^m die Expression von B7-1 auf Ag104L^d nicht ausreichend für die Abstoßung eines Tumors. Diese Daten legen nahe, dass LIGHT^m potenter als B7-1 ist, die Tumortoleranz zu brechen. In Anbetracht der zweifachen Wirkung von LIGHT^m, kann die lokale Expression von LIGHT^m an der Tumorstelle dendritische Zellen und T-Zellen über die Tumor-„Barriere” anziehen, indem es die Expression von Chemokinen und Adhäsionsmoleküle des lymphoiden Gewebes reguliert. Weiterhin wird die lokale Expression von LIGHT^m zu einem starken kostimulatorischen Molekül, das die direkte Präsentation von Tumorantigenen gegenüber Antigen spezifischen T-Zellen verstärkt und die Anergie von infiltrierenden T-Zellen innerhalb der Tumor-Mikroumgebung verhindern kann. Tumore mit H-2^B Hintergrund, MC57 Tumore (Fibrosarcoma), MC57-L^d und MC57-SIY mit oder ohne LIGHT^m Expression wurden erzeugt und in B6 Mausmodellen verwendet, was LTβR, LIGHT^m und HVEM KO Mäuse einschließt, um die Rolle von LIGHT^m und seinen Rezeptoren bei der Tumorimmunität weiter zu kennzeichnen. LIGHT^m scheint bei der Vermittlung von Tumorimmunität multiple Funktionen zu besitzen. LIGHT^m kann auch die Tumorapoptose in vivo verstärken. Interessanterweise induzierte die intratumorale Injektion von cDNA, die für LIGHT^m kodiert, eine Antigen spezifische zytolytische T-Zellantwort und therapeutische Immunität gegen den ausgebildeten murinen Tumor P815.
LIGHT^m, das innerhalb des Tumors expremiert wurde, verstärkte die Wirtsresistenz um mehr als 500 Mal. Fibrosarcoma Ag104L^d war hoch tumorgen und wuchs zu 100% aus, wenn 10⁴ Zellen in Empfängermäsue C3B6F1 subkutan injiziert wurden (Tabelle 1). Es wurde berichtet, dass 2C T-Zellrezeptor (TCR) transgene Mäuse, die mit T-Zellen gegen das Antigen L^d, das auf dem Tumor expremiert wird, gefüllt wurden, nicht in der Lage waren, ihn auszulöschen, nachdem sie sogar ein Hauttransplant, das das gleichen Antigen enthielt, abgestoßen haben (Hans, 1997). Das Verfahren, die Tumor spezifischen T-Zellen in die Tumore zu lenken und sie an den Tumorstellen zu aktivieren scheint eine kritische Hürde für die Abstoßung zu sein, wie auch die klinischen Immuntherapie des Krebs. LIGHT, das in der Tumorumgebung expremiert wurde, kann die Toleranz brechen, indem es T-Zellen anzieht und sie innerhalb des Tumors über LTβR bzw. HVEM aktiviert, was zur Tumorabstoßung führt (2). Um dies zu demonstrieren, wurde LIGHT auf dieser Tumorzelllinie durch retrovirale Transduktion unter Verwendung des retroviralen Vectors MFG expremiert. Anfänglich wurde keine LIGHT Expression auf der Tumorzelloberfläche nach Transduktion detektiert. Da LIGHT proteolytische Stellen in seiner Sequenz besitzt, die seine stabile Präsens auf der Oberfläche einer Tumorzelllinie verhindern können, wurden eine mutierte Version von LIGHT (LIGHT^m) verwendet, die die Proteolyse von LIGHT auf der Membran reduziert. (3A). Nach retroviraler Transduktion von mutiertem LIGHT^m/MFG in AG104L^d, wurde LIGHT^m Expression auf der Oberfläche von transduzierten Tumorzellen durch LTβR-Ig detektiert. (3B). Diese Zellen wurden als Ag104L^d-LIGHT^m Pulk definiert. LIGHT^m expremierende Ag104L^d Tumorzellen wurden weiter durch limitierende Verdünnungen kloniert. Einer der Klone, H10 wurden in den meisten der Experimente verwendet, falls es nicht anders spezifiziert wurde. Mutiertes LIGHT^m war in der Lage seine beiden Rezeptoren, LTβR und HVEM, zu binden. Ag104L^d-LIGHT^m Pulk und alle getesteten Klone banden Rezeptoren von LIGHT^m, LTβR und HVEM, was durch ihre Fähigkeit gezeigt wurde, durch lösliches LTβR und HVEM angefärbt zu werden. Das typische Färbeprofil von Ag104L^d-LIGHT^m Pulk und Klone H10 durch LTβR-Ig und HVEM-Ig wird gezeigt (3B). Das Wachstum der parentalen Tumorzellen und LIGHT-Transfektanden war sowohl bei der Gewebekultur als auch den RAG-1^–/– Mäusen das Gleiche (3D). Verschiedene Zahlen von LIGHT^m expremierenden injizierten Tumorzellen, Pulk oder Klon H10 wurden subkutan in C3B6F1 Mäuse inokuliert. Die Rezipienten stießen die höchste Dosis von LIGHT^m expremierendem Tumorzellen ab, 5 × 10⁶, die das 500 Fache der Dosis war, zu der die parentale Tumore 100% progressiv wuchsen (Tabelle 1). Die typischen Wachstumskinetiken des LIGHT^m expremierenden Tumors, Pulks oder Klon H10 und des parentalen Tumors, wenn 5 × 10⁶ Zellen inokuliert wurden, wurde in 3C gezeigt. Ag104L^d-LIGHT^m wuchs in den ersten zwei Wochen nach Inokulierung gefolgt von nachfolgender Regression, während parentaler Tumor weiter voranschritt und den Wirt in 3–4 Wochen tötete (3C). Die Tumorabstoßung ist wahrscheinlich LIGHT^m abhängig, da die LIGHT^m expremierenden Tumore wuchsen, wenn die LIGHT^m Funktion mit löslichem LTβR geblockt wurde (Tabelle 1). Die Tumorabstoßung ist abhängig von den Lymphozyten. LIGHT^m expremierende AG104L^d, wuchsen ebenso progressiv wie der parentale Tumor in RAG-1^–/– Mäusen, denen Lymphozyten fehlten (3D). CD8⁺ T-Zellen, aber nicht CD4⁺ T-Zellen waren essentiell dabei, die Abstoßung des LIGHT expremierendem AG104L^d zu vermitteln, da C3B6F1 Mäuse, die mit Anti-CD8 Antikörper depletiert wurden, nicht in der Lage waren diese Tumore abzustoßen (Tabelle 1). Jedoch sind CD4⁺ T-Zellen für die Tumorabstoßung nicht notwendig.
Eine LIGHT^m vermittelte Tumorumgebung besitzt mehr infiltrierende CD8⁺ T-Zellen. Um die möglichen Mechanismen zu untersuchen, die der LIGHT^m vermittelten Tumorabstoßung zu Grunde lagen, wurden 5 × 10⁶ LIGHT^m expremierende AG104L^d, oder die gleiche Anzahl an parentalen Tumorzellen subkutan in die C3B6F1 Mäuse injiziert. Zehn bis vierzehn Tage nach Tumorinokulation, bevor die LIGHT^m expremierenden Tumore abgestoßen wurden, wurden Tumorgewebe gesammelt. HE-Färbung der Tumorgewebe zeigte eine große Menge von infiltrierenden Lymphozyten (5), während die parentalen Tumore sehr wenig Infiltration zeigten (5). Immunfluoreszenzfärbung bestätigte, dass unter den infiltrierenden Lymphozyten große Mengen von Thy1.2⁺ T-Zellen (5), insbesondere CD8⁺ T-Zellen innerhalb der LIGHT^m expremierenden Tumore präsent waren (5).
Eine modifizierte extrazelluläre Domäne von LIGHT ist ausreichend, um T-Zellen kozustimulieren. Es wurde berichtet, das LIGHT eine potente kostimulatorische Aktivität besitzt, die zu T-zellproliferation führt. In der mutierten Form von LIGHT wurden vier Aminosäuren, die einer proteolytischen Stelle in der extrazellulären Domäne entsprachen, die sehr nahe der Transmembrandomäne waren, deletiert (3A). Die Mutation in dem LIGHT^m Molekül beinflusst seine kostimulatorische Wirkung. Rekombinantes LIGHT^m Protein wurde hergestellt, das nur die Aminosäuren 85 bis 239, eine verkürzte Form der extrazellulären Domäne mit einem Flag-Peptid enthält, um die Aufreinigung zu vereinfachen (rekombinantes LIGHT^m) (4A). Die modifizierte extrazelluläre Domäne von LIGHT^m war ausreichend, um T-Zellen kozustimulieren. Für diesen Test wurde ein in vitro Kostimulationsassay mit Platten gebundenem rekombinantem LIGHT^m verwendet, um gereinigte Maus T-Zellen in der Gegenwart eines immobilisierten monoklonalen Antikörpers gegen CD3 bei einer suboptimalen Dosis zu stimulieren. Immobilisiertes rekombinantes LIGHT^m stimulierte stark eine Proliferation der gereinigten Mäuse T-Zellen in einer Dosis abhängigen Weise in der Gegenwart von suboptimalen Mengen von Antikörper gegen CD3 (4B). Die modifizierte extrazelluläre Domäne von LIGHT^m, die die Aminosäuren 85 bis 239 umfasst und die proteolytische Stelle nicht enthält, die von dem LIGHT^m Molekül deletiert wurde, ist ausreichend, um das T-Zellwachstum kozustimulieren, wenn die Beteiligung des T-Zellrezeptors eintritt.
Tumore, die B7.1 Moleküle expremieren, enthalten infiltrierende T-Zellen in vergleichbarer Weise wie parentale Tumore. Infiltrierende CD8⁺ T-Zellen korrelierten mit Tumorabstoßung durch LIGHT^m vermittelte Tumorumgebung. Da LIGHT^m einen starken kostimulatorischen Effekt auf T-Zellen besitzt, war es eine Frage, ob B7.1, ein anderes stark kostiumlierende Molekül, ausreichend ist, um Tumorabstoßung zu vermitteln, die mit einer großen Anzahl von infiltrierenden T-Zellen assoziiert ist. 5 × 10⁶ Ag104L^d-B7.1 Tumorzellen, die in der gleichen Weise wie Ag104L^d-LIGHT^m transduziert wurden, wurden subkutan in C3B6F1 Mäuse inokuliert. Diese Tumore wuchsen in den Empfängern progressiv. HE Färbung der Tumorgewebe zeigte geringe Lymphozyteninfiltration (5). Immunofluoreszenzfärbung mit Anti-Thy1.2 und Anti-CD8 offenbarte, dass Ag104L^d-B7.1 Tumorgewebe Mengen an T-Zellen, einschließlich von CD-8 T-Zellen enthielten, die mit denen von parentalem Tumor Ag104L^d vergleichbar waren (5), die im Vergleich mit LIGHT^m expremierendem Ag104L^d wesentlich geringer war (5). Diese Daten waren konsistent mit früheren Befunden, dass Ag104L^d, das zwei kostimulatorische Moleküle B7.1 und CD48 expremierte, nicht in der Lage war, durch 2C TCR transgene Mäuse abgestoßen zu werden (Hans, 1997 JEM). Diese Beweislinie legte nahe, dass starke Kostimulation alleine nicht ausreichend ist, um Tumorabstoßung in diesen Tumormodellen zu vermitteln.
Eine LIGHT^m vermittelte Tumorumgebung enthält große Menge des Chemokins SLC und das hochregulierte Adhäsionsmolekül MAdCAM-1. Eine Frage war, was einzigartig an einer LIGHT^m vermittelte Tumorumgebung ist? Obgleich LIGHT^m an HVEM bindet, ist der Rezeptor, der auf T-Zellen expremierte wird, über den LIGHT^m wahrscheinlich seine Kostimulation von T-Zellen vermittelt, LTβR, ein anderer Rezeptor als der, der mit LIGHT^m interagiert. LTβR Signalübertragung ist eine wichtiger Regulator für das Chemokin SLC und Adhäsionsmolekül MAdCAM-1, der das Homing der naiven T-Zellen in die sekundären lymphoiden Gewebe kontrolliert. LIGHT^m in der Tumorumgebung könnte mit LTβR auf die Tumor-Stromazellen so interagieren, dass SLC und MAdCAM-1 in der Tumorumgebung hoch reguliert werden. Tumorgewebe wurde entweder von parentalem Ag104L^d oder LIGHT^m expremierendem Ag104L^d 10–14 Tage nach Inokulierung entnommen. Echtzeit RT-PCR zeigte, das LIGHT^m positive Tumormasse höhere Mengen an SLC expremierte als parentaler Tumor (6A). Dieses Ergebnis wurde unabhängig durch ELISA bestätigt, der SLC in Ag104L^d-LIGHT^m überall detektierte. (6B). SLC war in den parentalen Tumoren kaum detektierbar (6B). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die höheren Mengen an SLC, die in den LIGHT^m expremierendem Tumor detektiert wurden, allein auf länger andauernde Immunantworten mit mehr T-Zellen in der Tumorumgebung, Tumorgewebe von RAG-1^–/– Tumorträgern. Ag104L^d-LIGHT^m Tumore, die in den Lymphozyten defizienten Mäusen wuchsen, enthielten höhere Mengen von SLC als parentale Tumore (6B). Weiterhin legten gleiche Mengen von sowohl LIGHT^m positiven als auch negativen Tumoren in RAG-1^–/– Mäusen nahe, dass das Chemokin SLC alleine nicht ausreicht, um Tumorabstoßung zu vermitteln. Diese Daten waren konsistent mit der immunhistochemischen Anfärbung von Gewebeschnitten von den anderen 5 Paaren von LIGHT^m positiven und negativen Tumorproben, die von C3B6F1 Tumor tragenden Tieren (TBA) entnommen wurden. Sehr starke Anfärbung von SLC wurde nahe den stromareichen Regionen in den LIGHT expremierenden Tumoren detektiert, die von einer hohen Dichte von infiltrierenden Lymphozyten umgeben sind, wie klar durch SLC und Hemotoxylin doppelt gefärbte Tumorgewebe gezeigt (6C) ist. Jedoch wurde SLC nicht in den stromareichen Gebieter der Tumorgewebe detektiert, die für LIGHT^m negativ sind (6C). Die Gewebe aus B7.1 expremierenden Tumoren wiesen auch keine SLC Färbung auf und zeigten sehr geringe Lymphozyteninfiltration, ähnlich zu denjenigen der Kontrolltumore (6C).
Adhäsionsmoleküle sind kritisch für die Migration der Lymphozyten in die peripheren Gewebe und LTβR Signalvermittlung ist wichtig für die Expression eines der Adhäsionsmoleküle MAdCAM-1 (Kang, 2002). Das Expressionslevel von MAdCAM-1 in der LIGHT^m expremierenden Tumormasse oder dem parentalen Tumor wurde durch Echtzeit RT-PCR geprüft. Erhöhte Expression für das Adhäsionsmolekül MAdCAM-1 in der LIGHT^m expremierenden Tumormasse war vergleichbar mit der in der parentalen Tumormasse (6D). Diese Experimente legen es sehr nahe, dass LIGHT in der Tumorumgebung mit LTβR interagiert, das vom Tumorstroma abgeleitet ist, um das Chemokin SLC und Adhäsionsmolekül MAdCAM-1 hoch zu regulieren, um Lymphozyten in die Tumorumgebung anzuziehen.
Zusätzlich zu den Chemokinen des lymphoiden Gewebes reguliert LTβR Signalvermittlung auch einen Satz von INF-γ induzierten Chemokinen IP-10 und Mig. Ein Genarray, um die Expressionslevels von anderen Chemokinen zu vergleichen, enthüllte, dass IP-10 und Mig, die potentiell aktivierte T-Zellen anziehen können, auch in der LIGHT^m vermittelten Tumorumgebung hoch reguliert waren verglichen mit dem parentalen Tumor, während andere getestete Chemokine zu LIGHT^m positiven oder negativen Tumoren vergleichbar waren. Daher spielt LIGHT^m eine wichtige Rolle bei der Bildung einer lymphoiden Mikroumgebung zum Rekrutieren naiver und möglicherweise aktivierter T-Zellen.
Naive T-Zellen können in eine LIGHT^m vermittelte Tumorumgebung rekrutiert werden, wo sie proliferieren und Tumore abstoßen. Eine LIGHT^m vermittelte Tumorumgebung enthält hohe Levels an Chemokin SLC und Adhäsionsmolekül MAdCAM-1, die den Eintritt naiver T-Zellen potentiell ermöglichen. Drei Fragen wurden hier direkt betrachtet: 1) ob eine solche Umgebung in der Lage ist, den Eintritt naiver T-Zellen zu ermöglichen; 2) ob naive T-Zellen innerhalb des Tumors in vivo in der Gegenwart von LIGHT^m aktiviert werden können; und 3) ob ein Tumor, der das Antigen trägt, durch diese T-Zellen abgestoßen werden kann. Das Antigen L^d, das durch AG104 expremiert wird, ist ein allogenes MHC Klasse I Molekül, das Peptide auf der Oberfläche der Tumorzellen präsentiert, die von dem Haushaltsgen α-Ketoglutarat-dehydrogenase abgeleitet wurden. IN C3B6F1 (H-2^kXb) oder B6 (H-2^k) Wirten, erkannten adoptiv transferierte 2C TCR transgene T-Zellen nur Ag104 Tumorzellen, die L^d direkt präsentierten, da 2C T-Zellantworten L^d in seiner naiven Form benötigten, die verloren geht, wenn das Antigen prozessiert und durch Antigen präsentierende Zellen (APCs) von den Wirtszellen kreuz-präsentiert wird. Subkutan wachsende Tumore Primen T-Zellen über den direkten Weg in den lymphoiden Geweben sehr ineffizient. Ag104L^d, das 24 Stunden nachdem 3–5 × 10⁵ CFSE markierte 2C T-Zellen subkutan inokuliert wurden, wurden adoptiv in die C3B6F1 Wirte transferiert. Proliferation von 2C T- Zellen wurde durch Fluoreszenzfarbstoff CFSE Verdünnung in den Tumor ableitenden Lymphknoten, oder anderen nicht ableitenden Lymphknoten oder der Milz für bis zu 7 Tage nach Ag104L^d Tumor-Challenge, weder detektiert oder gemessen. 2C T-Zellen in den sekundären lymphoiden Organen behielten ihren naiven Phänotyp bei, wie durch geringes CD25, CD69 oder CD44 auf ihrer Oberflächen während der 7-tägigen Beobachtung angezeigt wird. Dies wies darauf hin, dass T-Zellen, die spezifisch für Antigene waren, die auf den Tumorzellen expremiert wurden, nicht aktiviert werden konnten, wenn die Antigene aus vielen Gründen nicht effizient kreuz-präsentiert werden konnten. Konsequenterweise wurden 10⁶ Ag104L^d Tumorzellen nicht durch C3B6F1 Mäuse abgestoßen, selbst wenn die Menge von 5 × 10⁶ Tumorantigen spezifischen T-Zellen in die Wirte transferiert wurde.
Um zu untersuchen, was passiert, wenn adoptiv transferierte 2C T-Zellen, wenn LIGHT^m innerhalb der Tumorumgebung vorliegt. LIGHT^m expremierende Ag104L^d Tumore wurden durch endogene CD8⁺ T-Zellen ohne 2C T-Zelltransfer in C3B6F1 abgestoßen. Um Antigen spezifische T-Zellen zu verfolgen und ihre Migration, ihr Primen und ihre Fähigkeit Tumor abzustoßen zu beobachten wurden H-Y oder OT-1 TCR transgene Mäuse in B6 (H-2b/RAG-1^–/–) Hintergrund als Empfänger für Tumor-Challenge verwendet. Diese Mäuse besitzen monoklonale CD8⁺ T-Zellen, die auf Ag104L^d Tumor nicht antworten. Daher wuchsen Ag104L^d oder LIGHT^m expremierender Ag104L^d beide aggressiv in diesen Mäusen ähnlich wie in RAG-1^–/– Mäusen (7D). Jedoch durchliefen adoptiv transferierte 2C T-Zellen bis zu 14 Tage unter konstanter Beobachtung keine starke homeostatische Proliferation wegen des Vorliegens dieser CD8⁺ H-Y oder OT-1 transgenen T-Zellen in diesen Mäusen (7B.). Daher war die starke Proliferation von 2C T-Zellen in diesen Wirten innerhalb der 14 Tagen nach dem adoptiven Transfer durch das Antigen L^d angetrieben. 10⁶ L^d oder Ag104L^d-LIGHT^m, die das gleiche Level von Antigen L^d auf ihrer Oberfläche expremierten (7A), wurden subkutan in diese Mäuse inokuliert. Dann wurden adoptiv transferierte 3 × 10⁶ CFSE markierte 2C T-Zellen an die Mäuse 10–14 Tage nach Tumor-Challenge. Die Mäuse wurden 48, 132, 168 und 336 Stunden nach T-Zell Transfer getötet und Tumor ableitende Lymphknoten (DLN), andere nicht ableitende Lymphknoten (NDLN), MHz (SPL) und Tumormasse wurden gesammelt. Einzelzellsuspension der Tumormassen wurde durch Collagenase-Verdau erhalten. Wenn notwendig wurden T-Zellen, die Tumore infiltrierten, mit einem positiv selektiven magnetischem System aus den Tumorzellen gereinigt. 2C T-Zellmigration und Proliferation wurde evaluiert. Naive 2C T-Zellen mit hoher CFSE Färbung, hohem CD62L und niedrigem CD44 waren in ähnlicher Weise in den sekundären lymphoiden Organen sowohl in Ag104L^d als auch Ag104L^d-LIGHT^m enthaltenden Mäusen 48 Stunden nach T-Zelltransfer enthalten (7B & C). Eine signifikante Anzahl an naiven 2C T-Zellen, die CD62^hoch und CD44^niedrig sind, wurden innerhalb der LIGHT^m expremierenden Tumore aber nicht in den parentalen Tumoren detektiert (7B & C). Diese Population von 2C T-Zellen proliferierte innerhalb der LIGHT^m expremierenden Tumore, wie durch die Verdünnung von CFSE 132 Stunden nach T-Zelltransfer angezeigt wurde (7B). Zu diesem Zeitpunkt konnten keine 2C T-Zellen, naiv oder proliferiert, in den parentalen Tumoren detektiert werden (7B). Zu 168 Stunden nach 2C T-Zelltransfer waren großen Mengen von proliferierten 2C T-Zellen nur in den LIGHT^m expremierenden Tumoren vorhanden. Bis zu 7 Tage 168 (Stunden) nach 2C T-Zelltransfer konnten keine signifikanten CFSE markierte 2C T-Zellproliferation oder proliferierte 2C T-Zellen in den sekundären lymphoiden Geweben von Mäusen detektiert werden, die LIGHT^m positive oder negative Tumore enthielten (5B). Aktivierung von 2C T-Zellen durch Antigen L^d kam nicht in den Tumor ableitenden Knoten, anderen Lymphknoten oder der Milz vor, sondern nur innerhalb von LIGHT^m positevem Tumor. 14 Tage nach 2C T-Zelltransfer wurden CFSE geringe, voll proliferierte 2C T-Zellen in den sekundären lymphoiden Organen der Mäuse detektiert, die LIGHT^m expremierende Tumoren enthielten. Die 2C T-Zellen, die in den Lymphknoten vorliegen, expremierten hohe Levels von CD44 und CD62L. Jedoch waren die 2C T-Zellen, die in die Milz migrierten, Mischungen aus CD44^hochCD62L^niedriegen und CD44^hochCD62L^hoch Populationen (5C). Dieses Ergebnis war konsistent mit den früheren Befunden, dass zentrale Gedächtnis-T-Zellen in den Lymphknoten migrieren und sowohl zentrale als auch periphäre Gedächtnis-T-Zellen in die Milz gehen können (Ref., Ahmed). In den Mäusen, die parentale Tumore enthielten, behielten 2C T-Zellen, die in den sekundären lymphoiden Organen vorlagen, eine naiven Phenotyp bei (Cd62L^hoch und CD44^niedrig) ohne signifikante Proliferation nach 14 Tagen (7B & C). Weiterhin waren keine detektierbaren 2C T-Zellen, naiv oder aktiviert, innerhalb der parentalen Tumore (7B & C).
Noch wichtiger war, dass 2C T-Zellproliferation mit Tumorabstoßung korrelierte. Ag104L^d-LIGHT^m Tumore, die für 10 Tage in diesen H-Y transgenen Mäusen ausgebildet waren, wurden vollständig unterdrückt, während die parentalen Tumore vergleichbar den Mäusen ohne 2C T-Zelltransfer wuchsen (7D).
C3B6F1 Mäuse wurden als Tumorempfänger verwendet. 5 × 10⁶ Ag104L^d oder Ag104L^d-LIGHT wurden adoptiv in die Wirte transferiert und Migration und Proliferation der T-Zellen in die Tumor abführenden Lymphknoten, anderen nicht ableitenden Lymphknoten, MHz oder Tumormasse wurden nach 48 Stunden und 168 Stunden geprüft. Es ergaben sich ähnliche Ergebnisse wie in H-Y oder OT-1 TCR transgenen Mäusen.
Naive Tumor Antigen spezifische T-Zellen können zu der Tumorstelle rekrutiert werden und sie proliferierten effektiv und töteten die Tumorzellen in der LIGHT^m vermittelten Umgebung, sogar wenn die Antigene nicht gut kreuz-präsentiert werden. Signifikanter war, dass diese T-Zellen in der Lage waren, Tumorwachstum in situ zu unterdrücken. Interessanterweise erzeugte die LIGHT^m vermittelte Tumorumgebung eine große Menge von Tumorantigen spezifischen T-Zellen, die in der Lage waren, die Tumorstelle zu verlassen, zu rezirkulieren und potentielle andere Tumore in den distalen Stellen abzustoßen, die das gleiche Antigen ohne LIGHT^m trugen (Tabelle 3).
Therapeutische Vakzinierung mit LIGHT^m expremierendem Ag104L^d löscht ausgebildete parentale Tumore aus. LIGHT^m vermittelte Tumorumgebung ist in der Lage naive T-Zellen zu rekrutieren und aktiviert sie innerhalb des Tumors und verursacht Tumorabstoßung. Der potentielle therapeutische Effekt des Befundes wurde durch Injektion von LIGHT^m expremierenden Tumorzellen in den etablierten parentalen Tumor gezeigt. Eine solche Behandlung konnte eine lymphoide Umgebung erzeugen, um naive T-Zellen anzuziehen und dann Tumor-spezifische über Kostimulation in der Gegenwart von Antigen zu aktivieren, was zu der Abstoßung dieses ausgebildeten Tumors führt. 10⁵ Ag104L^d wurden subkutan in C3B6F1 Empfänger inokuliert und den Tumoren wurde ermöglicht, sich für 14 Tage auszubilden. Dann wurden 10⁶ LIGHT^m expremierenden Ag104L^d Tumorzellen in die ausgebildeten parentalen Tumore injiziert. Als Kontrolle wurde das gleiche Volumen PBS in den Tumor in der gleichen Weise injiziert. Die ausgebildeten parentalen Tumore, die mit LIGHT^m expremierenden Tumorzellen behandelt wurden, fuhren fort für 10–15 Tage zu wachsen, bevor sie anfingen zurückzugehen und verschwanden (8). Ag104L^d Tumore, die mit PBS behandelt wurden, wuchsen aggressiv.
Die LIGHT^m vermittelte Tumorumgebung erzeugte viele Tumorantigen spezifische zentrale und Effektorgedächtnis T-Zellen, die zurück in die Zirkulation gingen. Die Erzeugung eines solchen Pools von Lymphozyten kann wichtig beim Auslöschen von Metastasen nach der chirurgischen Entfernung von primären Tumoren sein. Tumorantigen spezifische Gedächtnis-T-Zellen in großer Menge aus einer LIGHT^m vermittelten Umgebung können in der Lage sein, ausgebildete parentale Tumoren an distaler Steller abzustoßen. Um ein klinisch relevantes Model zu etablieren, wurden 10⁴ Ag104L^d Tumorzellen in die linke Seite von C3B6F1 Wirten injiziert und die Tumore konnten sich für 20 Tage ausbilden. 10⁶ Ag104L^d LIGHT^m Tumorzellen wurden 20 Tage in die rechte Seite der Mäuse injiziert. Alternative wurde das gleiche Volumen von PBS in die Ag104L^d Tumor tragenden Mäuse in der Kontrollgruppe injiziert. 100% der Mäuse, die mit LIGHT^m tragenden Tumorzellen behandelt wurden, stießen die ausgebildeten parentalen Tumore ab. Ag104L^d Tumore wuchsen progressiv in den Mäusen der Kontrollgruppe 100% (Tabelle 2).
Die therapeutische Wirkung von LIGHT^m expremierenden Tumorzellen wurde in einem anderen Modell demonstriert, das klinische metastasierte Tumore besser simulierte. 10⁶ (primärer Tumor) und 5 × 10⁴ (distaler Tumor) Ag104L^d Tumorzellen wurden in die linke bzw. rechte Seite der Empfängermaus inokuliert. Der primäre Tumor wurde chirurgisch 14 Tage nach Tumorinokulierung entfernt und 10⁶ LIGHT^m expremierende Ag104L^d Tumorzellen wurden in den oberen Rücken der Maus injiziert. Das Wachstum der ausgebildeten distalen Tumore wurde beobachtet. Alle Mäuse in der behandelten Gruppe stießen die distalen Tumore ab. Jedoch ohne Behandlung mit LIGHT^m expremierendem Tumor, tötete der distale Tumor all Wirte in der Kontrollgruppe (Tabelle 2).
Eine LIGHT^m vermittelte Tumorumgebung ist in der Lage naive T-Zellen zu rekrutieren, und aktivierte und expandierte Tumorantigen spezifische T-Zellen und stieß Tumorzelle ab, die das Anigen in situ trugen. Darüber hinaus wurden großen Mengen von Tumorantigen spezifischen zentralen Effektorgedächtnistyp T-Zellen in der Umgebung erzeugt und sind in der Lage an distale Stelle zu migrieren, um Tumore abzustoßen, die das gleiche Antigen trugen (Tabelle 3).
Übertragung von mutiertem LIGHT (LIGHT^m) durch Adenovirus in Tumorgewebe ermöglicht einen effektive Tumorantwort und Tumorabstoßung.
10 veranschaulicht die Reduktionen des Tumorvolumens, die mit der Präsens in vivo der Expression von mutierter LIGHT in Tumorzellen korrelierten.
11 veranschaulicht die Reduktion von spontanen Metastasen in Mäusen an Tagen 14, 17 und bis Tag 34 nach Inokulation. Es gibt einen synergistischen Effekt von Anti-41BB, einem Antikörper, der T-Zellen stimuliert, auf Tumorreduktionen.

12 zeigt, dass der clonogene Assay keinen Nachweis von Metastasen nach Behandlung mit mutiertem LIGHT' erbringt. Tabelle 1. LIGHT unterstützt die Wirtsresistenz gegenüber Ag104L^d Tumor-Challenges

Injizierte Tumorzellen^a		Inzidenz von Tumorwachstum^b	(Prozent)
Ag104L^d	5 × 10⁶	10/10	(100)
	1 × 10⁶	11/11	(100)
	5 × 10⁵	10/10	(100)
	1 × 10⁵	5/5	(100)
	5 × 10⁴	4/4	(100)
	1 × 10⁴	4/4	(100)
Ag104L^d-LIGHT	5 × 10⁵ Klon H10	0/10	(0)
	1 × 10⁶ Klon H10	0/11	(0)
	5 × 10⁵ Klon e H10	0/10	(0)
	5 × 10⁶ Pulk	0/10	(0)
^a Die angegebene Zahl von Tumorzellen wurde subkutan in C3B6F1 Mäuse injiziert. ^b Die Ergebnisse wurden aus 1 bis 3 unabhängigen Experimenten zusammengestellt.

Tabelle 2. Inzidenz von Ag104L^d Tumoren in C3B6F1 Mäusen

Injizierte Tumorzellen/Behandlung	Inzidenz von Tumorwachstum^a	(Prozent)
10⁶ Ag104L^d/keine Behandlung	16/16	(100)
10⁶ Ag104L^d/CD8-Depletion^b	6/6	(100)
10⁶ Ag104L^d-LIGHT/keine Behandlung	0/6	(0)
10⁶ Ag104L^d-LIGHT/CD8-Depletion^b	6/6	(100)
10⁵ Ag104L^d-LIGHT/LTβR-Ig^c	6/6	(100)
14⁷ Ag104L^d/10⁶ Ag104L^d-LIGHT 40 Tage zuvor	0/5	(0)
10⁷ Ag104L^d/10⁶ Ag104L^d-LIGHT 60 Tage zuvor	0/5	(0)
^a Die Ergebnisse wurden aus 1 bis 4 unabhängigen Experimenten zusammengestellt. ^b CD8⁺ Zellen wurden durch Anti-CD8 Antikörper depletiert. Depletion wurde durch Kontrollieren peripherer Blutproben bestätigt. ^c 100 μg LTβR-Ig wurde am Tag des Tumor-Challenge jedem Empfänger injiziert.

Tabelle 3. Behandlung mit Ag104L^d-LIGHT löscht ausgebildete Tumore an distalen Stellen aus

Injizierte Ag104L^d Tumorzellen	Tage der Tumorausbildung^a	Behandlung	Inzidenz von Tumorwachstum (Prozent)
10⁴	20 Tage	keine Behandlung	4/4	(100)
10⁴	20 Tage	10⁶ Ag104L^d-LIGHT^b	0/4	(0)
5 × 10⁴	20 Tage	keine Behandlung	4/4	(100)
5 × 10⁴	20 Tage	10⁶ Ag104L^d-LIGHT^b	2/4	(50)
10⁶ (primär) + 5 × 10⁶ (distal)	14 Tage	Chirurgische Entfernung vom primären Tumor	4/4	(100)
10⁶ (primär) + 5 × 10⁴ (distal)	14 Tage	Chirurgische Entfernung vom primären Tumor & 10⁶ Ag104L^d-LIGHT^b	0/4	(0)
5 × 10⁶ (primär) + 10⁶ (distal)	20 Tage	Chirurgische Entfernung vom primären Tumor	4/4	(100)
5 × 10⁶ (primär) + 10⁶ (distal)	20 Tage	Chirurgische Entfernung vom primären Tumor & 10⁶ Ag104L^d-LIGHT^b	2/4	(50)
^a Tage von Wachstum von subkutan injiziertem Ag104L^d in den Wirten bevor die Behandlung begann ^b 10⁶ Ag104L^d-LIGHT Tumorzellen wurden an einer anderen Stelle injiziert als an der, an der Ag104L^d wuchsen.

Material und Methoden
Mäuse, Zelllinien Reagenzien. Weibliche C3HXC57BL/6 F1 (C3B6F1) Mäuse, 4–8 Wochen alt wurden von dem "National Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility, (Frederick, MD)" erworben. C57BL/6-RAG-1 defiziente (RAG-1^–/–) Mäuse wurden von dem "Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)" erworben. H-Y TCR transgene Mäuse (H-Y Mäuse) auf dem RAG-2 defizienten/B6 Hintergrund wurden von "Taconic Farms (Germantown, NY)" erworben. 2C TCR transgene Mäuse auf RAG-1 defizientem Hintergrund, die in B6 für 10 Generationen (2C Mäuse) gezüchtet wurden, wurden durch J. Chen (Massachusetts Institute of Technology, Boston, MA) zur Verfügung gestellt. OT-1 TCR transgene Mäuse (OT-1 Mäuse) wurden durch A. Ma (The University of Chicago) zur Verfügung gestellt. RAG-1^–/–, H-Y, 2C, OT-1 Mäuse wurden in der geeigneten Pathogen freien Einrichtung an der "University of Chicago" gezüchtet und gehalten. Tierversorgung und -verwendung folgten den institutionellen Richtlinien.
Die AG104A Fibrosarcoma wuchsen spontan in einer alternden C3H Maus aus und wurden an die Kultur wie beschrieben angepasst (Ward 1989 JEM). Das AG104A, das murines H-2L^d (AG104-L^d) expremierte, das Transfectant der AG104A Zellen, wurden zuvor beschrieben (Wick M, 1997, JEM). Diese Tumorzelllinien wurden in DMEM (Mediatech) supplementiert mit 10% FCS (Sigma-Aldrich), 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (BioWhittaker) gehalten. Die Hybridomazelllinien, die Anti-L^d (Klon 30-5-7) und Anti-2C TCR (1B2) Antikörper produzierten, wurden von D. Sachs (National Institutes of Health, Bethesda, MD) bzw. T. Gajweski (The University of Chicago) erhalten.
Die monoklonalen Antikörper, die durch die Hybridomas produziert wurden, wurden aus dem Kulturüberstand mit Protein G-Säule durch Standartverfahren aufgereinigt. Der 1B2 Antikörper wurde mit FITC oder Biotin durch die „Monoclonal Antibody Facility of The University of Chicago" konjugiert. PE gekoppelter Anti-CD8 Antikörper, Cy-Chrom (CyC) gekoppeltes Streptavidin, CyC gekoppelter Anti-CD44 Antikörper, PE gekoppelter Anti-CD62L Antikörper und PE gekoppelter Th1.2 Antikörper wurden von „BD Biosciences" erworben. FITC konjugierter Ziegen-Anti-Maus IgG wurde von Caltag erworben. PE gekoppeltes Streptavidin wurden von Immunotech erworben. PE gekoppeltes Esel Anti-human IgG wurde von „Jackson Immunological Research Lab (West grove, PA)" erworben. Biotinilierter Ziegen Anti-SLC Antikörper wurde von R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN) erworben. AP konjugierter Kaninchen Anti-Ziegen Ig Antikörper wurde von "Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA)" erworben. Gereinigter Ziegen Anti-SLC Antikörper wurde von PeproTech (Rock hill, NJ) erworben. Collagenase (Typ 4) wurden von Sigma-Aldrich erworben. CFSE wurde von "Molecular Probes" erworben.
Die in dieser Studie verwendeten HVEM-Ig und LTβR-Ig Fusionsproteine wurden zuvor beschrieben. (Jing's JCI und Q. Wu JEM 1999).
Die Produktion von B7.1 oder mutierten LIGHT^m Expressionsvektoren und Klonen. Um pMFG-S mutiertes LIGHT^m herzustellen, wurde pcDNA3.1 mutiertes LIGHT^m mit NcoI und BamHI verdaut und in einen NcoI und BamHI verdautes pMFG-S-TPA Plasmid ligiert (Dr. Mulligan RC, Massachusetts Institute of Technology, Boston, MA). ΦNxEco Verpackungszellen, die die Viren produzierten, die mutiertes LIGHT^m enthielten, wurden durch transiente Transfektion mit MFG-S mutiertem LIGHT^m mittels des Kalziumfällungsverfahrens hergestellt. Die Expression von mutiertem LIGHT^m durch infizierte AG104L^d Tumorzellen (AG104L^d-LIGHT^m Pulk) wurde durch Färben der Zellen mit einem Kaninchen Antiserum, das mutiertes LIGHT^m erkennt, bestimmt. Danach wurden die infizierten mutierten LIGHT^m expremierenden AG104L^d Tumorzellen durch das Grenzverdünnungsverfahren kloniert. AG104L^d-LIGHT^m Klon H10 war einer, der in diesen Experimenten verwendeten Klone.
Tumorwachstum in vivo. Tumorzellen wurden subkutan in den unteren Rücken injiziert, das heißt, 0.5–1 cm über der Schwanzbasis der Mäuse. Tumorwachstum wurde alle 3 bis 4 Tage mit einer Schieblehre gemessen. Die Größe in Kubikzentimetern wurde durch die Formel V = πabc/6, berechnet, wobei a, b und c die drei orthogonalen Durchmesser sind.
Histologie. Tumorgewebe zur histologischen Untersuchung wurden an den angegebenen Zeiten gesammelt und in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, und mit Hematoxylin und Eosin gefärbt. Zum immunhistochemischen Färben von SLC wurden Tumorgewebe entnommen, in OCT Verbindung (Miles-Yeda, Rehovot, Israel) eingebettet und bei –70°C gefroren. Gefrorene Schnitte (5–10 μm dick) wurden in kaltem 2% Formalin in PBS fixiert und mit 0.1% Saponin/PBS permeabilisiert. Die Sektion wurden mit 5% Ziegenserum in 0.1% Saponin/PBS für eine halbe Stunde bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer vorgeblockt. Färbung auf SLC hin wurde durchgeführt, indem zuerst mit biotiniliertem Ziegen Anti-SLC Antikörper (R&D Systems Inc. Minneapolis, MN) bei einer 1/25 Verdünnung in Blockingpuffer inkubiert wurde. Alkalische Phosphatase, die Kaninchen Anti-Ziegen Ig Antikörper konjugiert wurde (Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA), wurde 2 h später zugegeben. Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden Schnitte mit 2% normalem Mausserum, Kaninchenserum und Ziegenserum in PBS für eine halbe Stunde bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer geblockt. Blockinglösung wurde mit 50 μl primären Antikörpern, PE konjugiertem Anti-Th1.2 BD (PharMingen) oder PE konjugiertem Anti-CD8 BD (PharMingen), 1/100 in Blockinglösung verdünnt, und die Schnitte wurden für eine 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer inkubiert. Einzelne Proben wurden in Mowiol 4-88 (BD Biosciences, La Jolla, CA) eingelassen, das 10% 1,4-Diazobicyclo-[2.2.2]-Octan enthielt. Die Proben wurden innerhalb von 48 h mit einem Zeiss Axioplan Mikroskop (Zeiss, Oberkochen, Germany) und einer Photometrics PXL CCD Kamera (Photometrics, Tucson, AZ) analysiert. Keine-Nachbar Dekonvolierung wurde mit einem Openlab v2.0.6 (Improvision, Lexington, MA) durchgeführt.
ELISA für CCL21. Tumorhomogenate wurden hergestellt und auf CCL21 getestet. Vergleichbare Mengen von Tumorgeweben aus Tumor tragenden Mäusen wurden gesammelt und gewogen, in PBS homogenisiert, das Proteaseinhibitoren enthielt, und die Überstände wurden durch Zentrifugation gesammelt. Polystyrol 96-Nocken Mikrotiterplatten (Immulon 4, Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) wurden mit Anti-Maus CCL21 bei 2 μg/ml in PBS beschichtet und dann mit 0.1% bovinen Serumalbumin (BSA) in PBS für 30 Min bei Raumtemperatur geblockt. Nach dem Waschen wurden serielle Verdünnungen von Standards bekannter Konzentrationen (rekombinantes CCL21, 50 ng/ml, R&D) und die Proben hinzugegeben und für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3 Waschschritten wurde biotiniliertes Kaninchen Anti-SLC Ab zu den Nocken hinzugegeben. Nach 2 h Inkubation und Waschen, wurden 50 μl eines 1/1000 verdünnten alkalischem Phosphatase konjugiertem Avidin (Dako) für 1 h hinzugegeben und dann entwickelt. Die Farbentwicklung wurde bei 405 nm auf einem automatisiertem Plattenlesegerät gemessen (Spectra-Max 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) und die Menge von CCL21 wurde durch ELISA mittels der Standartkurve bestimmt, und gemäß dem Gewebegewicht normalisert. Die Daten stellen das Mittel ± Standartabweichung (s. d.) dar.
Quantitativer Echtzeit RT-PCR Array. Echtzeit PCR wurde durchgeführt. Gesamt-RNA aus Tumoren wurde mit dem „Absolute RNA miniprep Kit" (Stratagene, La Jolla, CA) isoliert und mit DNaseI (Life Technologies, Grand Island, NY) verdaut, um die chromosomale DNA zu entfernen. Die verbleibenden DNaseI wurde bei 75°C für 20 min inaktiviert und die Integrität der RNA wurde durch Visualisierung in Ethidiumbromid gefärbten Gelen bestimmt. 5 μg Gesamt-RNA wurde in cDNA revers mit dem „First Strand cDNA Synthesis kit" (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) transkribiert. Die quantitative Echtzeit PCR Analyse wurde mit dem ABI Prism 7700-Sequenzdetektionssystem (PE Applied Biosystems) durchgeführt. Die Primersequenzen für CCL21 waren 5'-AGACTCAGGAGCCCAAAGCA-3' (Vorwärtsprimer) und 5'-GTTGAAGCAGGGCA AGGGT-3 (Reversprimer), und die Sonde für CCL21 war 5'-CCACCTCATGCTGGCCTCCGTC-3'. Die Primer für MAdCAM-1 waren 5'-GACACCAGCTTGGGCAGTGT-3' (Vorwärtsprimer) und 5'-CAGCATGCCCCGTACAGAG-3' (Reversprimer), und die die Sonde für MAdCAM-1 war 5'-CAGACCCTCCCAGGCAGCAGTATCC-3'. Die Primer für GAPDH waren 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3' (Vorwärtsprimer) und 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3' (Reversprimer), und die Sonde für GAPDH war 5'-TGCATCCTGCACCACCAACTGCTTAG-3'. Die CCL21 und MAdCAM-1 Sonde war mit 6-Carboxy-Fluorescein markiert (FAM). Die GAPDH Sonde war mit Tetrachloro-6-carboxy-fluorescein (TET) markiert. Jede cDNA Probe wurde zweifach für CCL21 und GAPDH oder MAdCAM-1 und GAPDH mit der TaqMan Universal PCR Mastermischung, die AmpliTaq Gold DNA enthielt, Polymerase gemäß den Herstellerangaben (PE Applied Biosystems) amplifiziert. Die PCR Bedingungen waren 2 min bei 50°C, 10 min bei 95°C, 15 s bei 95°C und 1 min bei 60°C für 40 Zyklen. Die Konzentration des Zielgenes wurde mit der komparativen C_T Methode (Grenzwert Zykluszahl am Kreuzungspunkt zwischen Amplifikationsplot und Grenzwert) und gegen die interne GAPDH Kontrolle normalisiert.
Tumorgewebe Chemokin Microarrray. Für dieses Experiment wurden GEArray Q Serie Maus Chemokin und „Receptors Gene Array" Membran (SuperArray, Bethesda, MD) verwendet. Gesamt-RNA aus Tumoren wurden mit dem „Absolute RNA miniprep Kit (Stratagene, La Jolla, CA)" isoliert und mit DNaseI (Life Technologies, Grand Island, NY) verdaut, um chromosomale DNA zu entfernen. Die verbleibende DNaseI wurde bei 75°C für 20 min inaktiviert. Die Integrität der RNA wurde durch Färbung in Ethidiumbromid-Gelen bestimmt. Die Microarrays wurden gemäß den Herstellerangaben eingesetzt. Kurz gesagt wurde mit den bereitgestellten Reagenzien cDNA aus Gesamt-RNA durch reverse Transkription mit MMLV reverser Transkriptase hergestellt, mit [–32P] dCTP (3,000 Ci/mM) radioaktiv markiert, dann unter präzisen spezifizierten Bedingungen auf eine positiv geladene Nylonmembran hybridisiert, die die DNA aus dem Array enthielt. Nach den Waschschritten, wurden die Arrays durch Phosphorimager sichtbar gemacht. Die Beladung wurde basierend auf der Intensität der Hybridisierungssignale der Haushaltsgene, PUC18, Actin and GAPDH angepasst, dann wurde die Genexpression quantifiziert, nachdem das Digitalbild, das vom Phosphorimager aufgenommen wurde, in Digitaldaten mittels ImageQuant Software umgewandelt war. Die Rohdaten wurden mit der GEArrayAnalyzer Software gemäß den Herstelleranweisungen analysiert.
T-Zell-Kostimulierungsassay. T-Zellen wurden durch eine Negativselektionsmethode in einem magnetischen Feld gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt (Miltenyi Biotec, Auburn, Kalifornien). Die Reinheit der isolierten T-Zellen war über 95%, wie durch Flusscytometrie mittels monoklonalen Antikörpers gegen CD3 bestimmt wurde. Platten, die mit 0.2 g/ml monoklonalem Antikörper gegen CD3 beschichtet waren, wurden bei 37°C für 4 h mit LIGHT^m-flag weiter beschichtet. Nachdem sie gewaschen waren, wurden aufgereinigte T-Zellen (1 × 10⁶ Zellen/ml) in den Nocken kultiviert. Monoklonaler Antikörper gegen CD28 (1 μg/ml) wurde in löslicher Form verwendet. In allen Assays wurde die Proliferation der T-Zellen durch die Zugabe von 1 Ci/Nocke ³H-Thymidin während der letzten 15 h der 3-tägigen Kultur bestimmt. ³H-Thymidin Einbau wurde in einem TopCount Mikroplatten Szintillationszähler gemessen (Packard instrument, Meriden, CT).
Analyse der Zellen durch FACS. Um zu bestätigen, das mutiertes LIGHT^m an LTbR und HVEM bindet, wurden AG104L^d Tumorzellen, die mit mutiertem LIGHT (AG104L^d-LIGHT^m) transfiziert waren, mit LTbR-Ig oder HVEM-Ig (0.02 mg/mL) inkubiert, gewaschen und mit PE gekoppeltem Esel Anti-human IgG bzw. FITC gekoppeltem Ziegen Anti-Maus IgG gefärbt. Zur Analyse der L^d Expression wurden die Tumorzellen mit dem Anti-L^d Antikörper inkubiert, gewaschen und mit FITC gekoppeltem Anti-Mause IgG Antikörper inkubiert. Zur Detektion der Proliferation von CFSE markierten 2C T-Zellen wurden isolierte Lymphknoten (LN) Zellen, Splenozyten und Tumor infilrierende T-Zellen (TIL) mit biotiniliertem 1B2 Antikörper inkubiert, gewaschen und mit Cyc gekoppeltem Streptavidin und PE gekoppeltem Anti-CD8 gefärbt. Zur Analyse der CFSE markierten 2C T-Zellen und der CD44 Expression wurden isolierte LN Zellen, Splenozyten oder TIL mit biotiniliertem 1B2 Antikörper inkubiert, gewaschen und mit einer Mischung aus PE gekoppeltem Streptavidin und CyC gekoppeltem Anti-CD44 gefärbt. Zur Analyse der CFSE markierten 2C T-Zellen und der CD62L Expression wurden isolierte LN Zellen, Splenozyten oder TIL mit biotiniliertem 1132 Antikörper inkubiert, gewaschen und mit CyC gekoppeltem Streptavidin und PE gekoppeltem Anti-CD62L gefärbt. Proben wurden auf einem FACScan analysiert und Daten wurden mit den Programmen CELLQuest oder FlowJo analysiert.
Adoptiver Transfer von 2C T-Zellen. LN Zellen und Splenozyten wurde aus 2C Mäusen isoliert und CD8⁺ T-Zellen wurden mit einem CD8⁺ T-Zellanreicherungskit negativ selektioniert (Miltenyi Biotec, Auburn, California). Wenn sie analysiert wurden, expremierten > 90% der angereicherten CD8⁺ T-Zellen den 2C Rezeptor. Ungefähr 3 × 10 2C T-Zellen wurden in H-Y oder OT-1 Mäuse für Assays auf Tumorwachstum überführt. Die gleiche Anzahl von 2C T-Zellen wurden in jede Maus in jedem Experiment transferiert. Um CFSE markierte T-Zellen zu transferieren, wurden T-Zellen bei einer Konzentration von 2 × 10⁷/ml mit 10 μM CFSE in PBS bei 37°C für 30 min markiert. Die Zellen wurden mit einem gleichen Volumen von FCS für 1 min gequencht und drei Mal gewaschen, und 3 × 10⁶ CFSE markierte T-Zellen wurden intravenös in den retroorbitalen Plexus in einem 0.2 ml Volumen in die Tumor tragenden Mäuse injiziert. Zellen wurden aus den inguinalen Lymphknoten (DLNs), den anderen Lymphknoten (nicht abführenden Lymphknoten [NDLN]), Milz oder Tumoren zu den angegebenen Zeiten isoliert.
Zelldepletionen und in vivo Blockierung von LIGHT^m Aktivität mit LTbR-Ig. Mäuse wurden von Lymphozyten Untergruppen mittels Standartprozeduren (aktuelles Protokoll für Immunologie) mittels monoklonalem Antikörper (mAb) GK1.5 (Dialynas DM JI 1983) für CD4⁺ Zellen, und mAb 2,34 für CD8⁺ Zellen (Sarmiento M 1980 JI) depletiert. Untersuchung der Splenozyten und Lymphknotenzellen durch FACS enthüllte, das die depletierte Untergruppe < 0.5% der Gesamtlymphozyten darstellte, bei normalen Levels der anderen Untergruppen. Um LIGHT^m in Mäusen zu blockieren, wurde das LTβR-Ig (100 μg/Injektion) am gleichen Tag und eine Woche nach Tumor-Challenge intraperitoneal gegeben.
Zellisolierung aus Tumorgewebe. Die Mäuse wurden zuerst ausgeblutet, um die Blutkontamination der Tumorgewebes zu reduzierten. Die Tumorgewebe wurden gesammelt, in PBS gewaschen, in Teile geschnitten und in DMEM für 40 min in einem 37° Schüttelinkubator resuspendiert, das mit 2% FCS und 1.25 mg/ml Collagenase D (Collagenase D Lösung) supplemiert war. Die Einzelzellsuspension wurde nach 40 min entnommen und die Zellklumpen wurden für weitere 40 min in der Collagenase D Lösung verdaut, bis alles Tumorgewebe in eine Einzelzellsuspension sich gelöst hatte.
Verabreichung von LIGHT^m und LIGHT^m expremierenden Zellen. Verabreichung von Nukleinsäuren, die für LIGHT^m kodiert, in einen Patienten kann entweder direkt sein, in welchem Fall der Patient der Nukleinsäure oder den Nukleinsäuren tragenden Vektoren exponiert wird, oder indirekt, in welchem Fall, die Tumorzellen, die von einer Biopsie erhalten wurden, zuerst mit den Nukleinsäuren in vitro transformiert werden, bestrahlt, und dann in den Patienten transplantiert werden. Diese Ansätze werden routinemäßig in Gentherapien zum Unterdrücken von Tumoren oder Behandeln anderer Krankheiten verfolgt.
Verabreichung von Nukleinsäuren. Die Nukleinsäuresequenzen werden direkt in vivo verabreicht, wo sie expremiert werden, um die kodierten Produkte herzustellen. Dies kann durch jede der zahlreichen Methoden, die in der Technik bekannt sind, erreicht werden, z. B. indem man sie als Teil eines geeigneten Nukleinsäurenexpressionsvektors konstruiert und sie so verabreicht, das sie in die Zelle gelangen, z. B. durch Infektion mit defekten oder attenuierten retroviralen oder anderen viralen Vektoren ( U.S. Pat. Nr. 4,980,286 ) oder durch direkte Injektion von nackter DNA, oder durch Einsatz eines Mikropartikel-Bombardements, oder durch Beschichten mit Lipiden oder Zelloberflächenrezeptoren oder Transfektionsagenzien, Einkapselung in Liposomen, Mikropartikeln oder Mikrokapseln oder indem man sie in kovalenter Bindung mit einem Peptid verabreicht, von dem bekannt ist, dass es in den Nukleus eintritt, indem sie in Verbindung mit einem Liganden zur Rezeptor vermittelten Endocytose verabreicht wird (die verwendet werden kann, um Zelltypen anzuzielen, die die Rezeptor spezifisch expremieren) etc. Alternativ kann die Nukleinsäure intrazellulär eingeführt werden und in die Wirtszell-DNA zur Expression mittels homologer Rekombination eingebaut werden.
Biologisch abbaubare Mikrokügelchen wurden auch bei der Genverabreichung verwendet, die die Nukleinsäure einkapseln. Mikrokügelchen wie Matrizen, Filme, Gele und Hydrogele, die Hyaluronsäure (HA) einschließen, das mit einem Dihydrazid derivatisiert wurde und mit einer Nukleinsäure quervernetzt wurde, so dass langsam freisetzende Mikrokügelchen gebildet wurden, wurden verwendet, um Nukleinsäuren zu verabreichen. U.S. Pat. Nr. 6048551 offenbart ein Verabreichungssystem zur kontrollierten Genfreisetzung, das Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA), Hydroxypropylmethylzellulose-phthalat, Zellulose-acetat-phthalat und Kopolymermikrokügelchen verwendet, um den Genvektor einzukapseln.
Die therapeutischen Zusammensetzungen, die bei der Umsetzung der vorstehenden Verfahren verwendet werden, können in pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden, die einen Träger umfassen, der für das gewünschte Verabreichungsverfahren geeignet ist. Geeignete Träger schließen Materialien ein, die wenn sie mit der therapeutischen Zusammensetzung kombiniert werden, die Anti-Tumorfunktion der therapeutischen Zusammensetzung beibehalten. Beispiele schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, jegliche Zahl von pharmazeutischen Standartträgern wie steriler Phosphat gepufferte Salzlösung, bakteriostatischem Wasser, und ähnliches. Therapeutische Formulierungen können gelöst werden und über jeden Weg verabreicht werden, der in der Lage ist, die therapeutische Zusammensetzung an die Tumorstelle zu verabreichen. Potentiell wirksame Behandlungswege schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf intravenöse, parenterale, intrapertioneale, intramuskuläre, intratumor, intradermale, intraorgan, orthotopische und ähnliche. Eine bevorzugte Formulierung für intravenöse Injektion umfasst die therapeutische Zusammensetzung in einer Lösung aus konserviertem bakteriostatischem Wasser, sterilem nicht Konservierungsstoffe enthaltenem Wasser und/oder sie ist in Polyvinylchlorid- oder Polyethylenbbeuteln Beuteln, die steriles Natriumchlorid zur Injektion enthalten, verdünnt. Therapeutische Proteinzubereitungen können lyophilisiert und als sterile Pulver aufbewahrt werden, vorzugsweise unter Vakuum, und dann in bakteriostatischem Wasser (das zum Beispiel Benzylalkohol als Konservierungsmittel enthält) oder in sterilem Wasser vor der Injektion rekonstituiert werden. Dosierungen und Verabreichungsprotokolle zur Behandlung von Krebsarten, die die vorstehenden Verfahren verwenden, werden mit dem Verfahren und dem angezielten Krebs variieren, und werden im Allgemeinen von einer Anzahl von anderen Faktoren abhängen, die in der Technik berücksichtigt werden.
Verabreichung unter der Verwendung von viralen Vektoren. Virale Vektoren, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, die für einen Antikörper der Erfindung kodieren, werden zur Verabreichung spezifischer Nukleinsäuren verwendet. Zum Beispiel kann ein retroviraler Vektor verwendet werden. Diese retroviralen Vektoren enthalten die Komponenten, die für die korrekte Verpackung des viralen Genoms und die Integration in die Wirtszell-DNA notwendig sind. Die Nukleinsäuresequenzen, die für das gewünschte Protein kodieren, das in der Gentherapie verwendet werden soll, werden in einen oder mehrere Vektoren kloniert, was die Verabreichung des Gens in einen Patienten ermöglicht. Adenoviren sind andere virale Vektoren, die bei der Gentherapie verwendet werden können. Adenoviren sind besonders attraktive Vehikel für das Verabreichen von Genen an respiratorische Epithelien, und andere Ziele für auf Adenovirus basierende Verabreichungssysteme sind Leber, das zentrale Nervensystem, Endothelzellen und Muskel. Adenovirus hat den Vorteil in der Lage zu sein, nicht teilende Zellen infizieren zu können. Adeno-asszoziierter Virus (AAV) wurde auch zur Verwendung in der Gentherapie vorgeschlagen ( U.S. Pat. Nr. 5,436,146 ). Lentaviren sind hinsichtlich der Verwendung in der Gentherapie vielversprechend.
Transfizieren von Zellen in Gewebekultur gefolgt von Verabreichung an Patienten. Ein anderer Ansatz für die Gentherapie involviert das Übertragen eines Gens in Zellen in Zellkultur durch solche Verfahren, wie Elektroporation, Lipofektion, Kalziumphosphat vermittelte Transfektion oder virale Infektion. Gewöhnlich schließt das Verfahren zur Übertragung die Übertragung eines selektierbaren Markergens in die Zellen ein. Die Zellen werden dann Selektionsdruck unterworfen, um diejenigen Zellen zu isolieren, die das Übertragene aufgenommen haben und es expremieren. Diese Zellen werden dann an einen Patienten verabreicht. In diesem Verfahren wird die Nukleinsäure in eine Zelle vor der in vivo Verabreichung der resultierenden rekombinanten Zelle eingeführt. Solches Einführen kann durch jegliches in der Technik bekanntes Verfahren, was einschließt, aber nicht beschränkt ist auf, Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Infektion mit einem vitalem oder Bakteriophagenvektor, die die Nukleinsäuresequenzen enthalten, Zellfusion, Chromosomen vermittelter Gentransfer, Mikrozell vermittelter Gentransfer, Spheroplastenfusion etc. durchgeführt werden. Die Technik sollte für den stabilen Transfer der Nukleinsäuren in die Zelle sorgen, so dass die Nukleinsäure durch die Zelle expremiert wird und ist vorzugsweise vererbbar und durch ihre Zellnachfahren expremierbar.
Die resultierenden rekombinanten Zellen können bestrahlt werden und können an einen Patienten durch zahlreiche in der Technik bekannten Verfahren verabreicht werden. Rekombinante Zellen (z. B. hematopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen) werden vorzugsweise intravenös verabreicht. Die Menge der Zellen, die für die Anwendung in Betracht gezogen wird, hängt von der gewünschten Wirkung, dem Patientenstatus, etc. ab und kann durch den Fachmann bestimmt werden. Zellen, in die eine Nukleinsäure für Zwecke der Gentherapie eingeführt werden kann, umfassen jeden gewünschten verfügbaren Zelltyp, und schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Epithelzellen, Endothelzellen, Keratinocyten, Fibroblasten, Muskelzellen, Hepatocyten, Blutzellen wie T-Lymphocyten, B-Lymphocyten, Monocyten, Macrophagen, Neutrophile, Eosinophile, Megakaryocyten, Granulocyten, zahlreiche Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere hematopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen, z. B. wie sie vom Knochenmark, Nabelschnurblut, peripherem Blut, fötaler Leber etc. erhalten werden.
Vakzine. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Vakzin" auf eine Zusammensetzung (z. B. ein LIGHT^m Antigen und ein Adjuvanz), das eine Tumor-spezifische Immunantwort hervorruft. Diese Vakzine schließen prophylaktische (die neue Tumor verhindern) und therapeutische (die parentale Tumore auslöschen) ein. Ein Vakzinvektor, wie ein DNA Vakzin, das für mutiertes LIGHT kodiert, kann verwendet werden, um eine Immunantwort gegen Tumore herzurufen. Die Antwort wird durch das eigene Immunsystem des Subjektes hervorgerufen, indem die Vakzinzusammensetzung an einer Stelle verabreicht wird (z. B. einer Stelle, die von dem Tumor entfernt ist). Die Immunantwort kann in der Auslöschung der Tumorzellen in dem Körper resultierten (z. B. sowohl der primären als auch der metastatischen Tumorzellen). Verfahren zum Erzeugen von Tumorvakzinen sind in der Technik wohl bekannt (siehe z. B. U.S. Pat. Nr. 5,994,523 und 6,207,147 , die beide hier durch Bezugnahme aufgenommen werden).
Die Vakzine können eines oder mehrere Tumorantigene in einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassen. In einigen Fällen wird das Tumorantigen vor der Verabreichung inaktiviert. In einigen Ausführungsformen umfasst das Vakzin ferner eines oder mehrere zusätzliche therapeutische Agenzien (z. B. Cytokine oder Cytokin expremierende Zellen).
In bestimmten Fällen werden Zellen, die aus einem Patienten ausgewählt wurden, wie Fibroblasten, die zum Beispiel durch eine routinemäßige Hautbiopsie erhalten wurden, genetisch modifiziert, um eines oder mehrere der gewünschten Proteine zu expremieren. Alternativ können auch Patientenzellen, die normalerweise als Antigen präsentierende Zellen in dem Immunsystem dienen, wie Makrophagen, Monocyten und Lymphocyten auch genetisch modifiziert werden, um eines oder mehrere der gewünschten Antigene zu expremieren. Die Antigen expremierenden Zellen werden mit den Tumorzellen (z. B. einem Tumorantigen) gemischt, zum Beispiel in der Form von bestrahlten Tumorzellen, oder alternativ in der Form von aufgereinigtem natürlichem oder rekombinantem Tumorantigen, und in Immunisierungen verwendet werden, zum Beispiel subkutan, um systemische Anti-Tumor Immunität zu induzieren. Die Vakzine können durch jedes geeignetes Verfahren verabreicht werden, was diejenigen einschließt, die oben beschrieben sind, aber nicht auf diese beschränkt ist.
Clonogener Assay.
Clonogener Assay für die Lunge
Materialen:

1) DMEM 5% FCS (+ P/S, HEPES)
2) Collagenase Typ IV (Sigma)
3) 60 μM 6-Thioguanin
4) 50 ml konische Röhrchen
5) 6 Nocken Gewebekulturplatten
6) 37°C Schüttelinkubator/Gewebekulturinkubator
7) Sektionierausrüstung: Scheren, gekrümmte Scheren und Pinzette
8) 70 μm Nylonzellsieb
9) ACK Lyse
10) Methanol
11) 0.03% (w/v) Methylenblau Lösung

Anmerkung: Alle Lösungen und Ausrüstungsgegenstände müssen steril sein und aseptische Techniken sollten entsprechend verwendet werden.
Zubereitung des Collagenase Mediums:
Zu ungefähr 25 ml Medium pro Lungenzahl, geben Sie Collagenase so zu, dass die Mediumkonzentration 1.5 mg/ml beträgt
Erstellung der Lungenprobe:

1. Entfernen Sie die Lunge aus der Mause und überführen sie Sie in eine 6 Nockenplatte
2. Geben Sie ungefähr 200 μl Medium auf die Lunge
3. Mit den gekrümmten Scheren schneiden sie die Lunge in kleine Stücke
4. Verwenden sie den gekrümmten Bereich der geschlossenen Schere, überführen sie die zerkleinerte Lunge in 50 ml konisches Röhrchen mit 5 ml Collagenase Medium
5. Geben Sie 5 ml Medium zu den Nocken und pipettieren Sie und überführen Sie die verbleibenden Lungenstücke in dir konische Röhre
6. Platzieren Sie es in dem Schüttelinkubator für 20 Minuten bei 37°C bei 175 rpm.
7. Gießen Sie den Überstand durch einen Zellsieb in ein sauberes 50 ml konisches Röhrchen – jegliche Lungenstücke auf dem Zellsieb sollten in das konische Röhrchen für einen zweiten Verdau zurück überführt werden.
a. Zentrifugieren sie das Röhrchen mit dem Überstand aus dem Verdau bei 1500 rpm für 5 min in einer Zentrifuge.
b. Verwerfen Sie den Überstand nach dem Zentrifugationsschritt.
c. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml frischem Collagenase freiem Medium.
8. ACK Lyse für 5 Minuten
9. Zählen Sie die Zellen
10. Plattieren Sie 3 × 10⁵, 3 × 10⁴, 3 × 10³ Zellen in 12 Nockenplatten
11. Geben Sie 60 μM 6-Thioguanin zu jeder Nocke
12. Platzieren Sie die Platte in einen 37°C Gewebekulturinkubator, 5% CO₂ für 5–10 Tage

Entnahme der clonogenen metastatischen Kolonien:

(nicht notwendig, macht das Zählen der Kolonien aber einfacher)

1. Verwerfen Sie die Kulturmedien der Gewebekulturplatte
2. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 5 ml Methanol zu jeder Platte hinzugeben und schwenken. Inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 5 min.
a. Anmerkung: Kolonien sollten sich weiß färben
3. Verwerfen Sie den Methanol und spülen Sie jede Platten vorsichtig mit 5 ml destilliertem Wasser
a. wichtige Anmerkung: Lassen Sie die Zellen nicht mit Wasser in Kontakt kommen, nachdem die Zellen fixiert wurden.
4. Geben Sie 5 ml 0.03% (w/v) Methylenblau Lösung zu jeder Platte hinzu. Schwenke Sie sie, so dass die gesamte Platte bedeckt ist und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 5 min.
5. Verwerfen sie den Farbstoff und spülen Sie die Platten vorsichtig mit 5 ml destilliertem Wasser
6. Lassen die Platten lufttrocknen bevor sie die blauen Kolonien zählen

Eine Kolonie stellt eine klonogene mestastatische Zelle dar.
Zitierte Veröffentlichungen
Die zitierten Veröffentlichungen warden durch Bezugnahme so weit aufgenommen, wie sie sich auf die vorliegende Erfindung beziehen.

Boon, T. & van der Bruggen, P. Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. J. Exp. Med. 183, 725–29 (1996).
Cannon, R. E. et al. Induction of transgene expression in Tg.AC(v-Ha-ras) transgenic mice concomitant with DNA hypomethylation. Mol Carcinog 21, 244–50 (1998).
Chen, L., Linsley, P. S. & Hellstrom, K. E. Costimulation of T cells for tumor immunity. Immunol Today 14, 483–6. (1993).
Cyster, J. G. Chemokines and cell migration in secondary lymphoid organs. Science 286, 2098–102. (1999).
Dougall, W. C. et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes Dev 13, 2412–24. (1999).
Ettinger, R. The role of tumor necrosis factor and lymphotoxin in lymphoid organ development. Curr Top Microbiol Immunol 251, 203–10 (2000).
Fu, Y. X. & Chaplin, D. D. Development and maturation of secondary lymphoid tissues. Annu Rev Immunol 17, 399–433 (1999).
Kang, H. S. et al. Signaling via LTbetaR on the lamina propria stromal cells of the gut is required for IgA production. Nat Immunol 3, 576–82 (2002).
Kim, D. et al. Regulation of peripheral lymph node genesis by the tumor necrosis factor family member TRANCE. J Exp Med 192, 1467–78. (2000).
Kong, Y. Y. et al. Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand. Nature 402, 304–9. (1999).
Leder, A., Kuo, A., Cardiff R. D., Sinn, E. & Leder, P. v-Ha-ras transgene abrogates the initiation step in mouse skin tumorigenesis: effects of phorbol esters and retinoic acid. Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A. 87, 9178–82 (1990).
Mauri, D. N. et al. LIGHT, a new member of the TNF superfamily, and lymphotoxin alpha are ligands for herpesvirus entry mediator. Immunity 8, 21–30. (1998).
Melero, I. et al. Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors. Nat Med 3, 682–5. (1997).
Ochsenbein, A. F. et al. Roles of tumour localization, second signals and cross priming in cytotoxic T-cell induction. Nature 411, 1058–64. (2001).
Ostrand-Rosenberg, S. et al. Cell-based vaccines for the stimulation of immunity to metastatic cancers. Immunol Rev 170, 101–14. (1999).
Peace, D. J. et al. Lysis of ras oncogene-transformed cells by specific cytotoxic T lymphocytes elicited by primary in vitro immunization with mutated ras peptide. J Exp Med 179, 473–9 (1994).
Rooney, I. A. et al. The lymphotoxin-beta receptor is necessary and sufficient for LIGHT-mediated apoptosis oftumor cells. J Biol Chem 275, 14307–15. (2000).
Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature 411, 380–4. (2001).
Ruddle, N. H. Lymphoid neo-organogenesis: lymphotoxin's role in inflammation and development. Immunol Res 19, 119–25 (1999).
Sarma, S. et al. Cytotoxic T lymphocytes to an unmutated tumor rejection antigen P1A: normal development but restrained effector function in vivo. J Exp Med 189, 811–20. (1999).
Schreiber, H. Tumor Immunology. in Fundamental Immunology (ed. Paul, W. E.) 1247–1280 (Lippincott Raven Press, New York, 1999).
Sha, W. C. et al. Selective expression of an antigen receptor on CD8-bearing T lymphocytes in transgenic mice. Nature 335, 271–4 (1988).
Tamada, K. et al. Modulation of T-cell-mediated immunity in tumor and graft-versus-host disease models through the LIGHT co-stimulatory pathway. Nat Med 6, 283–9. (2000).
Wang, J. et al. The complementation of lymphotoxin deficiency with LIGHT, a newly discovered TNF family member, for the restoration of secondary lymphoid structure and function. Eur J Immunol 132: 1969 (2002).
Wang, J. et al. The regulation of T cell homeostasis and autoimmunity by T cell derived LIGHT. J. Clinic. Invest. 108: 1771–1780 (2001).
Wick, M. et al. Antigenic cancer cells grow progressively in immune hosts without evidence for T cell exhaustion or systemic anergy. J Exp Med 186, 229–38. (1997).
Wu, Q. et al. The requirement of membrane lymphotoxin for the presence of dendritic cells in lymphoid tissues. J Exp Med 190, 629–38 (1999).
Ye, Q. et al. Modulation of LIGHT-HVEM costimulation prolongs cardiac allograft survival. J Exp Med 195, 795–800. (2002).
Ye, Z. et al. Gene therapy for cancer using single-chain Fv fragments specific for 4-1BB. Nat Med 8, 343–8. (2002).
Zhai, Y. et al. LIGHT, a novel ligand for lymphotoxin beta receptor and TR2/HVEM induces apoptosis and suppresses in vivo tumor formation via gene transfer. Journal of Clinical Investigation 102, 1142–51 (1998).
Zinkernagel, R. M. Immunity against solid tumors? Int J Cancer 93, 1–5. (2001).
U.S. Pat. Nr. 6048551
U.S. Pat. Nr. 5,436,146
U.S. Pat. Nr. 4,980,286
U.S. Pat. Nr. 5,994,523
U.S. Pat. Nr. 6,207,147

Claims

Die Verwendung eines cDNA Moleküls, kodierend ein LIGHT Protein ohne die proteolytische Stelle für die Herstellung eines Medikaments, um effektive Antitumoraktivität von T-Zellen gegen einen Tumor zu indizieren, wobei das Medikament in den Tumor eingeführt wird und das cDNA Molekül exprimiert wird.
Ein therapeutisches Vakzin umfassend Tumorzellen, die ein LIGHT Protein ohne die proteolytische Stelle exprimieren.
Ein proteolytisches Vakzin, umfassend ein LIGHT Protein ohne die proteolytische Stelle und Tumorantigene in Tumorzellen.
Die Verwendung eines cDNA Moleküls, kodierend ein LIGHT Protein ohne die proteolytische Stelle zur Herstellung eines Medikaments, um einen Tumor zu zerstören oder abzustoßen durch Schaffen eines lymphoid-ähnlichen Mikroumfeldes, das Chemokine, Adhäsionsmolküle und co-stimulierende Moleküle exprimiert, die erforderlich sind, um naive T-Zellen zu Primen, wobei das Medikament in den Tumor eingeführt wird und das cDNA Molekül exprimiert wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei der Tumor ein fester Tumor ist.
Eine cDNA, kodierend ein LIGHT Protein ohne die proteolytische Stelle.
Die cDNA gemäß Anspruch 6, wobei die proteolytische Stelle des LIGHT Proteins zwischen den Positionen 79–82 des Leitproteins ist.
Ein LIGHT Protein, das keine Stelle für einen proteolytischen Abbau hat.
Das LIGHT Protein gemäß Anspruch 8, mit der Aminosäuresequenz von Positionen 85–239 des LIGHT Proteins und einer Markierungssequenz.
Das LIGHT Protein gemäß Anspruch 9, wobei das LIGHT Protein ein rekombinantes Protein ist.
Einte Wirtzelle, transformiert mit der LIGHT cDNA gemäß Anspruch 6 oder 7.
Ein Vektor mit einem LIGHT cDNA Molekül gemäß Anspruch 6 oder 7.
Der Vektor gemäß Anspruch 12 ist ein adenoviraler Vektor.
Ein Verfahren um Kandidaten Antitumorverbindungen zu screenen, wobei das Verfahren umfasst: (a) Verabreichen von Kandidaten Antitumorverbindung an Zellen, die ein LIGHT Protein ohne die proteolytische Stelle exprimieren und an Kontrollzellen; und (b) Bestimmen, ob Tod oder Verlust der Tumorzellen auftritt in den Zellen, die das LIGHT exprimieren, verglichen mit den Kontrollzellen.
Das LIGHT Protein gemäß Anspruch 10, wobei die Stelle des proteolytischen Abbaus, die nicht vorhanden ist, flankiert ist durch eine Aminosäuresequenz im aminoterminalen Ende, kodiert durch eine Nukleotidsequenz GGC TCC TGG.