CN110462040A - 通过新基因开关表达系统调节多肽的表达 - Google Patents

通过新基因开关表达系统调节多肽的表达 Download PDF

Info

Publication number
CN110462040A
CN110462040A CN201880017197.6A CN201880017197A CN110462040A CN 110462040 A CN110462040 A CN 110462040A CN 201880017197 A CN201880017197 A CN 201880017197A CN 110462040 A CN110462040 A CN 110462040A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
polypeptide
gene
sequence
gene switching
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880017197.6A
Other languages
English (en)
Inventor
鲁图尔·R·沙阿
托马斯·D·里德
谢丽尔·G·博林格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Interlakson Corp
Precigen Inc
Original Assignee
Interlakson Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Interlakson Corp filed Critical Interlakson Corp
Publication of CN110462040A publication Critical patent/CN110462040A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4635—Cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464404—Epidermal growth factor receptors [EGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/23—On/off switch
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/47—Brain; Nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Abstract

本文公开了编码配体诱导型基因开关多肽的多核苷酸，和包含用于调节宿主细胞中异源基因和白介素表达的基因开关多肽的系统。本文所述的组合物、方法和系统促进包括但不限于细胞因子和抗原结合多肽的多肽的配体依赖性表达。

Description

通过新基因开关表达系统调节多肽的表达
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年1月10日提交的第62/444,775号美国临时专利申请和2017年2月28日提交的第62/464,958号美国临时专利申请的权益，这些临时申请通过引用整体并入本文。
序列表的引用
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式通过电子方式提交，并且通过引用整体并入于此。所述ASCII副本创建于2018年1月9日，被命名为50471_706_601_SL.txt，大小为421，163个字节。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
背景技术
已经显示使用嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)的过继性T细胞免疫疗法成功地引导杀死肿瘤细胞。虽然这种创新技术很有前景，但将修饰的T细胞施用于携带肿瘤的个体并非没有安全性问题，例如肿瘤裂解和细胞因子释放综合征。另外，单独表达CAR或TCR可能不足以实现功效，可能需要额外表达诸如IL-2、IL-12、IL-15或IL-21等细胞因子来增加此类治疗的功效。然而，这可能会导致额外的安全性问题。因此，感兴趣的是在患者施用后完全控制目的治疗基因的表达。
发明内容
在某些实施方案中，本文公开了包含基因开关多肽和编码该基因开关多肽的多核苷酸的系统、方法或组合物。
本文提供了一种组合物，其包含编码用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关多肽的多核苷酸，其中所述基因开关多肽包含：(a)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域；和(b)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接。
本文提供了一种组合物，其包含一种或多种编码用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关系统的多核苷酸，其中所述基因开关系统包含：(a)第一基因开关多肽，其包含反式激活域；(b)第二基因开关多肽，其包含与配体结合域融合的DNA结合域；和(c)至少一种异源基因多肽；其中所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽之一通过多肽连接体与所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽中的另一个连接；并且其中所述多肽连接体包含可切割的连接体或核糖体跳跃连接体序列。
在一些实施方案中，本文提供的任何组合物的DNA结合域包含GAL4(GAL4 DBD)、LexA DBD、转录因子DBD、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员DBD、细菌LacZ DBD和酵母DBD中的至少一种。在一些实施方案中，本文提供的任何组合物的DNA结合域具有如SEQIDNO：184所示的序列。在一些实施方案中，本文提供的任何组合物的反式激活域包含VP16反式激活域和B42酸性激活物反式激活域中的至少一种。在一些实施方案中，如本文提供的任何组合物的反式激活域具有如SEQ ID NO：181所示的序列。
在一些情况下，本文提供的任何组合物的第一核受体配体结合域、第二核受体配体结合域和配体结合域中的至少一种包含蜕皮素受体(EcR)、遍在受体、孤儿受体1、NER-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15、肝X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝X受体α、类法尼醇X受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。在其它情况下，本文提供的任何组合物的第一核受体配体结合域、第二核受体配体结合域和配体结合域中的至少一种具有如SEQ ID NO：185-186中任一个所示的序列。在另一种情况下，第一基因开关多肽包含与EcR核受体配体结合域融合的GAL4 DBD，并且所述第二基因开关多肽包含与类视黄醇受体X(RXR)核受体配体结合域融合的VP16反式激活域。在又一种情况下，所述与EcR核受体配体结合域融合的GAL4 DBD具有如SEQ ID NO：185-186或187-188中任一个所示的序列，并且所述与类视黄醇受体X(RXR)核受体配体结合域融合的VP16反式激活域具有如SEQ ID NO：183所示的序列。
在一些情况下，本文提供的任何组合物的连接体是可切割的连接体、核糖体跳跃连接体序列或IRES连接体。在一些情况下，该连接体是IRES连接体并且具有如SEQ ID NO：18-19中任一个所示的序列。在其它情况下，该连接体是可切割的连接体或核糖体跳跃连接体序列。在一些实施方案中，该可切割的连接体或核糖体跳跃连接体序列包含2A连接体、p2A连接体、T2A连接体、F2A连接体、E2A连接体、GSG-2A连接体、GSG连接体、SGSG连接体、furinlink连接体变体及其衍生物中的一种或多种。在其它实施方案中，该可切割的连接体或所述核糖体跳跃连接体序列具有如SEQ ID NO：146-162中任一个所示的序列。
在一个实施方案中，本文提供的任何组合物的多核苷酸或所述一种或多种多核苷酸进一步编码抗原结合多肽。在另一个实施方案中，本文提供的任何组合物的抗原结合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体中的至少一种。在其它实施方案中，该抗原结合多肽包含CAR，并且所述CAR能够结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。在另一个实施方案中，该抗原结合多肽包含CAR，并且该CAR具有如SEQ ID NO：210-244中任一个所示的序列。
在其它实施方案中，本文提供的任何组合物的多核苷酸或所述一种或多种多核苷酸进一步编码细胞标签。在一些情况下，该细胞标签包含HER1截短变体或CD20截短变体中的至少一种。在其它情况下，该细胞标签具有如SEQ ID NO：189-202中任一个所示的序列。
在一些实施方案中，本文提供的任何组合物的第一基因开关多肽、第二基因开关多肽、抗原结合多肽和细胞标签中的至少一种的表达由启动子调节，其中该启动子是组织特异性启动子或EF1A启动子或其功能变体。在一些情况下，该启动子是EF1A启动子或其功能变体，其具有如SEQ ID NO：58-60中任一个所示的序列。在其它情况下，该启动子是包含T细胞特异性应答元件的组织特异性启动子。在另一种情况下，该组织特异性启动子包含一个或多个NFAT应答元件。在又一种情况下，该NFAT应答元件具有如SEQ ID NO：51-57中任一个所示的序列。
在一些实例中，本文提供的任何组合物进一步包含编码异源基因多肽的第二多核苷酸。在一些情况下，该异源基因多肽包含细胞因子、细胞标签和嵌合抗原受体(CAR)中的至少一种。在一些情况下，该细胞因子包含细胞因子，并且所述细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα或IL-15变体的融合体中的至少一种。在其它情况下，该细胞因子是分泌形式。在另一种情况下，该细胞因子是膜结合形式。在又一种情况下，该细胞因子具有如SEQ ID NO：203-209中任一个所示的序列。
在一个实施方案中，本文提供的任何组合物的至少一种异源基因多肽的表达由诱导型启动子调节。在一些实施方案中，该诱导型启动子具有如SEQ ID NO：40-64中任一个所示的序列。在其它实施方案中，该诱导型启动子由第一基因开关多肽和第二基因开关多肽中的至少一种调节。
本文还提供了一种载体，其包含本文提供的任何组合物的多核苷酸。在一个实施方案中，该载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在另一个实施方案中，该非病毒载体是睡美人(Sleeping Beauty)转座子。
本文提供了一种调节效应细胞中的异源基因表达的方法，该方法包括：(a)向所述效应细胞中引入一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码(i)包含与配体结合域融合的DNA结合域的第一基因开关多肽，(ii)包含反式激活域的第二基因开关多肽，(iii)由所述异源基因编码的异源基因多肽，和(iv)包含可切割的或核糖体跳跃连接体序列的多肽连接体，其中所述多肽连接体将所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽之一连接至所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽中的另一个；以及(b)使所述效应细胞以足以诱导所述异源基因的表达的量与配体接触。
在一个实例中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法的一种或多种多核苷酸中的至少一种进一步编码抗原结合多肽。在一些情况下，该抗原结合多肽选择性地结合靶细胞的预定细胞表面蛋白质。在一些情况下，该靶细胞是哺乳动物细胞。在其它情况下，该靶细胞是肿瘤细胞。
在一些实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法的预定细胞表面蛋白质是肿瘤抗原。在一些情况下，所述抗原结合多肽在效应细胞与配体接触之前选择性地结合靶细胞的预定细胞表面蛋白质。在一些情况下，在效应细胞与配体接触之前，将效应细胞暴露于靶细胞的预定细胞表面蛋白质至少7天。在其它情况下，预定细胞表面蛋白质被抗原结合多肽的结合活化效应细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述效应细胞与表达所述预定细胞表面蛋白质的人工抗原呈递细胞(aAPC)共培养，其中所述抗原结合多肽与所述aAPC的所述预定细胞表面蛋白质的结合活化所述效应细胞。在一些实施方案中，共培养至少7天、14天、21天或28天。在一些情况下，所述aAPC是转基因K562细胞。
在其它实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的抗原结合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体中的至少一种。在另一个实施方案中，该抗原结合多肽包含CAR，并且所述CAR能够结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC-16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。在另一个实施方案中，该抗原结合多肽包含具有如SEQ ID NO：210-244中任一个所示序列的CAR。在一些实施方案中，该异源基因多肽包含抗原结合多肽。
在一些情况下，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的一种或多种多核苷酸中的至少一种进一步编码细胞标签。在一些情况下，该细胞标签包含HER1截短变体和CD20截短变体中的至少一种。在其它情况下，该细胞标签具有如SEQ ID NO：189-202中任一个所示的序列。在一些情况下，该异源基因多肽包含细胞标签。
在其它情况下，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的一种或多种多核苷酸中的至少一种进一步编码细胞因子。在一些情况下，该细胞因子包含IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα或IL-15变体的融合体中的至少一种。在一个实施方案中，该细胞因子是分泌形式。在另一个实施方案中，该细胞因子是膜结合形式。在又一个实施方案中，该细胞因子具有如SEQ ID NO：203-209中任一个所示的序列。在其它实施方案中，该异源基因多肽包含所述细胞因子。
在一个实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中异源基因多肽的表达由诱导型启动子调节。在某些实施方案中，该诱导型启动子具有如SEQ IDNO：40-64中任一个所示的序列。
在另一个实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的DNA结合域包含GAL4(GAL4 DBD)、LexA DBD、转录因子DBD、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员DBD、细菌LacZ DBD和酵母DBD中的至少一种。在又一个实施方案中，该DNA结合域具有如SEQ ID NO：184所示的序列。
在又一个实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的反式激活域包含VP16反式激活域和B42酸性激活物反式激活域中的至少一种。在一些情况下，该反式激活域具有如SEQ ID NO：181所示的序列。在其它实施方案中，所述第一和第二基因开关多肽中的至少一种进一步包含能够与所述DNA结合域结合的应答元件。
在一些实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的配体结合域包含蜕皮素受体(EcR)、遍在受体、孤儿受体1、NER-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15、肝X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝X受体α、类法尼醇X受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。在某些实施方案中，该配体结合域具有如SEQ ID NO：185-186中任一个所示的序列。在某些实施方案中，第一基因开关多肽包含与EcR核受体配体结合域融合的GAL4 DBD，并且第二基因开关多肽包含与类视黄醇受体X(RXR)核受体配体结合域融合的VP16反式激活域。在一些实施方案中，所述与EcR融合的Ga14 DBD具有如SEQ ID NO：185-186中任一个所示的序列，并且所述与类视黄醇受体X(RXR)核受体配体结合域融合的VP16反式激活域具有如SEQ ID NO：183所示的序列。
在某些实施方案中，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中的配体包含以下至少一种：(2S，3R，5R，9R，10R，13R，14S，17R)-17-[(2S，3R)-3，6-二羟基-6-甲基庚烷-2-基]-2，3，14-三羟基-10，13-二甲基-2，3，4，5，9，11，12，15，16，17-十氢-1H-环戊并[a]菲-6-酮；N′-(3，5-二甲基苯甲酰基)-N′-[(3R)-2，2-二甲基-3-已烷基]-2-乙基-3-甲氧基苯并酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；2-甲氧基-烟酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(2，2-二甲基-1-苯基-丙基)-N′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；和3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼。
在一些情况下，与在配体的存在下的表达相比，在不存在配体的情况下，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中异源基因的表达减少或消除。在某些情况下，通过提供额外量的配体来恢复所述异源基因的表达。
在其它情况下，在本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法中，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽中的至少一种的表达由启动子调节，其中所述启动子是组织特异性启动子或EF1A启动子或其功能变体。在某些情况下，该启动子是EF1A启动子或其功能变体，其具有如SEQ ID NO：58-60中任一个所示的序列。在其它情况下，该启动子是组织特异性启动子，并且该组织特异性启动子包含T细胞特异性应答元件。在另一种情况下，该组织特异性启动子包含一个或多个NFAT应答元件。在又一种情况下，该NFAT应答元件具有如SEQ ID NO：50-57中任一个所示的序列。
在某些情况下，如本文提供的调节效应细胞中异源基因表达的方法的所述一种或多种多核苷酸被包含在载体内。在一些情况下，该载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在某些情况下，该非病毒载体是睡美人转座子。
本文提供了一种用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关系统，其中所述基因开关系统包含一个或多个表达盒，其中所述一个或多个表达盒包含：(a)编码第一基因开关多肽的序列，所述第一基因开关多肽包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域；(b)编码第二基因开关多肽的序列，所述第二基因开关多肽包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域；其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过多肽连接体连接。
本文提供了一种用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关系统，其中所述基因开关系统包含一个或多个表达盒，其中所述一个或多个表达盒包含：(a)编码第一基因开关多肽的序列，所述第一基因开关多肽包含反式激活域；(b)编码第二基因开关多肽的序列，所述第二基因开关多肽包含与配体结合域融合的DNA结合域；和(c)编码异源基因多肽的序列；其中所述反式激活域、与所述配体结合域融合的DNA结合域和所述异源基因多肽之一通过多肽连接体与所述反式激活域、与所述配体结合域融合的DNA结合域和所述异源基因多肽中的另一个连接，并且其中所述多肽连接体包含可切割的或核糖体跳跃连接体序列。
在一些实施方案中，如本文提供的基因开关系统的所述一个或多个表达盒进一步包含编码异源基因多肽的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个表达盒进一步包含以下一种或多种：(a)一个或多个重组酶附着位点；和(b)编码丝氨酸重组酶的序列。在其它实施方案中，所述一个或多个表达盒进一步包含以下一种或多种：(a)非诱导型启动子；和(b)诱导型启动子。
在某些实施方案中，如本文提供的基因开关系统的DNA结合域具有如SEQ ID NO：184所示的序列。在其它实施方案中，如本文提供的基因开关系统的反式激活域具有如SEQID NO：181所示的序列。在另一个实施方案中，第一和第二核受体配体结合域和所述配体结合域中的至少一种具有如SEQ ID NO：185-186中任一个所示的序列。在某些实施方案中，所述非诱导型启动子具有如SEQ ID NO：40-64中任一个所示的序列。在某些实施方案中，所述诱导型启动子具有如SEQ ID NO：40-64中任一个所示的序列。在某些实施方案中，所述多肽连接体具有如SEQ ID NO：146-162中任一个所示的序列。在一些实施方案中，所述多肽连接体是其具有如SEQ ID NO：18-19和146-162中任一个所示的序列的可切割的连接体、核糖体跳跃连接体或IRES连接体。
在一些实例中，如本文提供的基因开关系统的所述一个或多个表达盒包括包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列的表达盒，其中该嵌合抗原受体的表达由非诱导型启动子调节。在某些实例中，该CAR能够结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC-16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
在其它实例中，如本文提供的基因开关系统的非诱导型启动子包含EF1A或其变体。在某些情况下，所述表达盒具有如SEQ ID NO：131所示的序列。在其它情况下，所述表达盒进一步包含编码细胞标签的序列，其中该细胞标签通过连接体与CAR连接。在一些情况下，该细胞标签包含HER1截短变体和CD20截短变体中的至少一种。
在另一个实例中，如本文提供的基因开关系统的表达盒具有如SEQ ID NO：132所示的序列。在一些实施方案中，该表达盒进一步包含编码第一基因开关多肽的序列和编码第二基因开关多肽的序列，其中第一和第二基因开关多肽之一通过连接体与CAR连接。
在一些实施方案中，如本文提供的基因开关系统的第一和第二基因开关多肽通过所述多肽连接体连接，并且该多肽连接体是可切割的连接体。在一些实施方案中，所述表达盒具有如SEQ ID NO：133所示的序列。在一些实施方案中，第一和第二基因开关多肽通过多肽连接体连接，并且该多肽连接体是IRES连接体。
在某些实施方案中，如本文提供的基因开关系统的表达盒具有如SEQ ID NO：134所示的序列。在其它实施方案中，所述一个或多个表达盒包括包含编码异源基因多肽的序列的表达盒，其中所述异源基因多肽的表达由诱导型启动子调节。在其它实施方案中，该异源基因多肽包含细胞因子。在一些情况下，该细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα或IL-15变体的融合体中的至少一种。
在另一个实施方案中，如本文提供的基因开关系统的表达盒具有如SEQ ID NO：135所示的序列。在一些实施方案中，该表达盒包含编码第二异源基因多肽的序列，其中第二异源基因多肽包含细胞标签。在某些情况下，该细胞标签包含HER1截短变体和CD20截短变体中的至少一种。在其它情况下，该细胞标签通过连接体与细胞因子连接。在另一种情况下，该表达盒具有如SEQ ID NO：136所示的序列。
在一些情况下，如本文提供的基因开关系统用于将异源基因整合到宿主细胞中，其中在丝氨酸重组酶和所述一个或多个重组酶附着位点的存在下使宿主细胞与所述一个或多个表达盒接触时，所述异源基因整合在所述宿主细胞中。在某些情况下，所述基因开关系统进一步包含配体，其中在宿主细胞与该配体接触时，所述异源基因在宿主细胞中表达。在某些情况下，该宿主细胞是T细胞或NK细胞。在某些情况下，所述一个或多个重组酶附着位点可包含噬菌体基因组重组附着位点(attP)或细菌基因组重组附着位点(attB)。在一些情况下，所述丝氨酸重组酶可以是SF370。
在某些情况下，如本文提供的基因开关系统的诱导型启动子被反式激活域激活。在某些情况下，该系统被包含在一个或多个载体中。在某些情况下，该系统被包含在一个载体中。
公开了编码如本文提供的基因开关系统的一种或多种组分的多核苷酸。本文还公开了一种载体，其包含编码如本文提供的基因开关系统的一种或多种组分的多核苷酸。在某些情况下，该载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体中的任何一种。在某些情况下，该载体是非病毒载体，并且所述非病毒载体是睡美人转座子。
本文提供了一种多核苷酸构建体，其包含：编码第一基因开关多肽的多核苷酸，编码第二基因开关多肽的多核苷酸，和编码目的基因(GOI)的多核苷酸，其中所述编码GOI的多核苷酸包含位于编码第一基因开关多肽的多核苷酸与编码第二基因开关多肽的多核苷酸之间的连续开放阅读框(ORF)，其中所述多核苷酸构建体进一步包含编码连接体的多核苷酸，并且其中所述GOI通过所述连接体连接至每个所述第一和第二基因开关多肽。
本文提供了一种多核苷酸，其包含以下至少一种：(i)编码第一基因开关多肽的第一序列，所述第一基因开关多肽包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域；和(ii)编码第二基因开关多肽的第二序列，所述第二基因开关多肽包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域；其中所述第一序列和所述第二序列中的至少一种的表达由一个或多个FAT应答元件调节。
本文提供了一种刺激工程化细胞增殖和/或存活的方法，该方法包括：(a)从受试者获得细胞样品，以及(b)用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染所述细胞样品的细胞，其中所述一个或多个转座子编码：嵌合抗原受体(CAR)或TCR、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于所述细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将所述一种或多种多核苷酸有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体；其中所述基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接。
本文提供了一种增强工程化细胞在有需要的受试者中的体内持久性的方法，该方法包括：(a)从受试者获得细胞样品，以及(b)用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染所述细胞样品的细胞，其中所述一个或多个转座子编码：嵌合抗原受体(CAR)或TCR、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于所述细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将DNA有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体；其中所述基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接。
在一些实施方案中，在本文提供的方法中转染细胞包括对细胞进行电穿孔。在某些实施方案中，所述一种或多种多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码基因开关多肽，并且所述至少一种多核苷酸由启动子调节，其中该启动子是组织特异性启动子或EF1A启动子或其功能变体。在某些情况下，该启动子是EF1A启动子或其功能变体，其具有如SEQ ID NO：58-60中任一个所示的序列。在某些情况下，该启动子是组织特异性启动子，并且该组织特异性启动子包含T细胞特异性应答元件。在某些情况下，该启动子是组织特异性启动子，并且该组织特异性启动子包含一个或多个NFAT应答元件。在某些情况下，该NFAT应答元件具有如SEQ ID NO：50-57中任一个所示的序列。在某些情况下，该细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα或IL-15变体的融合体中的至少一种。在其它情况下，该细胞因子是分泌形式。在另一种情况下，该细胞因子是膜结合形式。在又一种情况下，该细胞因子具有如SEQ ID NO：203-209中任一个所示的序列。在又一种情况下，该细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞或T细胞祖细胞。
在其它情况下，本文提供的方法进一步包括向有需要的受试者施用有效量的工程化细胞。在某些情况下，施用包括立即向受试者输注所述工程化细胞。在某些情况下，该方法进一步包括施用有效量的配体以诱导细胞因子的表达。在某些情况下，该配体是veledimex。在一些情况下，该CAR能够结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC-16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。在某些情况下，该CAR能够结合CD19。在某些情况下，该CAR能够结合CD33。在某些情况下，该转座酶是鲑鱼型Tcl样转座酶。在某些情况下，该转座酶是SB11或SB100x转座酶。在某些情况下，所述一种或多种细胞标签包含HER1截短变体和CD20截短变体中的至少一种。在某些情况下，所述一种或多种细胞标签具有如SEQ ID NO：189-202中任一个所示的序列。
本文提供了一种治疗患有实体瘤的受试者的方法，该方法包括：(a)从受试者获得细胞样品，(b)用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染所述细胞样品的细胞，其中所述一个或多个转座子编码：嵌合抗原受体(CAR)或TCR、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于所述细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将DNA有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体；其中所述基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接，以及(c)将所述工程化细胞群体施用于所述受试者。
在一些实施方案中，所述治疗方法中的细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα的融合体或IL-15变体中的至少一种。在一些实施方案中，该细胞因子包括IL-12。在一些实施方案中，所述一种或多种多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码基因开关多肽，并且所述至少一种多核苷酸由启动子调节，其中该启动子是组织特异性启动子或EF1A启动子或其功能变体。在一些实施方案中，该启动子是EF1A启动子或其功能变体，其具有如SEQ ID NO：58-60中任一个所示的序列。在某些实施方案中，该启动子是组织特异性启动子，并且该组织特异性启动子包含T细胞特异性应答元件。在一些实施方案中，该启动子是组织特异性启动子，并且该组织特异性启动子包含一个或多个NFAT应答元件。在一些实施方案中，该NFAT应答元件具有如SEQ ID NO：50-57中任一个所示的序列。
还公开了一种工程化效应细胞，其中所述工程化效应细胞包含：(a)编码工程化受体构建体的第一多核苷酸，该工程化受体构建体选择性地结合由靶细胞表达的预定细胞表面蛋白质；(b)编码一种或多种工程化基因开关多肽的一种或多种多核苷酸，其中所述工程化基因开关多肽包含反式激活域、DNA结合域和配体结合域中的一种或多种；和(c)在由所述工程化基因开关多肽调节的配体诱导型启动子控制下的异源基因；其中所述异源基因编码细胞因子。
在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞表面蛋白质在所述肿瘤细胞的表面上表达。在一些实施方案中，所述细胞表面蛋白质在人工抗原呈递细胞(aAPC)中表达。在一些实施方案中，所述工程化受体构建体是嵌合抗原受体。在一些实施方案中，该嵌合抗原受体结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123或VEGF-R2。在一些实施方案中，该嵌合抗原受体结合EGFRvIII。
在一些实施方案中，所述工程化受体构建体是工程化T细胞受体。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-2、IL-15、IL-12、IL-21或IL-15与IL-15Rα的融合体。在一些实施方案中，所述细胞因子是IL-12。在一些实施方案中，所述效应细胞进一步包含编码包含细胞标签的蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中，该细胞标签是截短的HER1变体或CD20截短变体。在一些实施方案中，所述效应细胞是免疫效应细胞。在一些实施方案中，所述效应细胞是T细胞、NK细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方案中，所述一种或多种工程化基因开关多肽包含反式激活域、DNA结合域和配体结合域。在一些实施方案中，所述一种或多种工程化基因开关多肽包含第一基因开关多肽和第二基因开关多肽，第一基因开关多肽包含所述与核受体配体结合域融合的DNA结合域，第二基因开关多肽包含所述与核受体配体结合域融合的反式激活域。
在一些实施方案中，所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过多肽连接体连接。在一些实施方案中，该多肽连接体是可切割的或核糖体跳跃连接体序列。在一些实施方案中，该多肽连接体包含2A、F/T2A、GSG-2A、GSG连接体、SGSG连接体、furinlink变体及其衍生物中的一种。在一些实施方案中，所述反式激活域包含VP16反式激活域。在一些实施方案中，所述一种或多种工程化基因开关多肽包含蜕皮素受体(EcR)、遍在受体、孤儿受体1、NER-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15、肝X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝X受体α、类法尼醇X受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。在一些实施方案中，所述DNA结合域(DBD)包含GAL4(GAL4 DBD)、LexA DBD、转录因子DBD、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员DBD、细菌LacZ DBD和酵母DBD中的至少一种。
本文进一步公开了一种调节异源基因表达的方法，该方法包括使靶细胞与本文公开的效应细胞接触。在一些情况下，该调节包括增加或降低所述异源基因的表达。在一些情况下，与在所述配体的存在下的表达相比，在不存在所述配体的情况下，所述表达减少或消除。在一些情况下，通过提供额外量的所述配体来复苏所述表达。
进一步公开了一种调节效应细胞中的异源基因表达的方法，该方法包括：向所述效应细胞中引入编码一种或多种工程化基因开关多肽的多核苷酸、工程化受体构建体和所述异源基因；其中所述异源基因处于诱导型启动子的控制之下；通过所述工程化受体构建体活化所述效应细胞；以及向所述效应细胞呈递配体，以便在所述活化所述效应细胞后，通过所述一种或多种工程化基因开关多肽诱导所述异源基因的表达。
在一些情况下，所述活化包括使效应细胞与抗原接触。在一些情况下，该抗原是肿瘤抗原。在一些情况下，在向效应细胞呈递配体之前，该效应细胞暴露于肿瘤抗原至少7天。在一些情况下，活化效应细胞包括将效应细胞与人工抗原呈递细胞(aAPC)共培养。在一些情况下，共培养至少7天、14天、21天或28天。在一些情况下，该aAPC是转基因K562细胞。在一些情况下，所述工程化受体构建体包含嵌合抗原受体(CAR)。在一些情况下，该CAR结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123或VEGF-R2。在一些情况下，所述工程化受体构建体包含工程化T细胞受体(TCR)。在一些情况下，效应细胞包括使效应细胞与TCR结合多肽接触。在一些情况下，该TCR结合多肽包含TCR结合抗体或其片段。在一些情况下，在向效应细胞呈递配体之前，该效应细胞暴露于TCR结合多肽至少7天。在一些情况下，该TCR结合多肽由aAPC表达。在一些情况下，所述异源基因编码细胞因子。在一些情况下，该细胞因子是IL-2、IL-15、IL-12、IL-21或IL-15与IL-15Rα的融合体。在一些情况下，该细胞因子是IL-12。
在一些情况下，所述异源基因编码至少一种细胞标签。在一些情况下，该细胞标签是HER1截短变体或CD20截短变体。在一些情况下，所述一个或多个基因表达盒进一步包含编码细胞标签的核苷酸序列。在一些情况下，所述效应细胞是免疫效应细胞。在一些情况下，该免疫效应细胞是T细胞、NK细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。在一些情况下，所述一种或多种工程化基因开关多肽包含反式激活域、DNA结合域和配体结合域。在一些情况下，该配体结合域包含蜕皮素受体(EcR)、遍在受体、孤儿受体1、NER-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15、肝X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝X受体α、类法尼醇X受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。在一些情况下，该DNA结合域包含GAL4(GAL4 DBD)、LexA DBD、转录因子DBD、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员DBD、细菌LacZ DBD和酵母DBD中的至少一种。在一些情况下，该反式激活域包含VP16反式激活域。
在一些情况下，所述一种或多种工程化基因开关多肽进一步包含能够与所述DNA结合域结合的应答元件。在一些情况下，所述一种或多种工程化基因开关多肽进一步包含超螺旋蛋白(USP)、类视黄醇受体X(RXR)或功能片段及其变体中的至少一种，其中所述功能片段及其变体能够与EcR结合。在一些情况下，所述一种或多种工程化基因开关多肽进一步包含一种或多种多肽连接体。在一些情况下，所述一种或多种多肽连接体进一步包含2A、GSG-2A、GSG连接体、SGSG连接体、furinlink变体及其衍生物中的至少一种。在一些情况下，所述配体包含以下至少一种：(2S，3R，5R，9R，10R，13R，14S，17R)-17-[(2S，3R)-3，6-二羟基-6-甲基庚烷-2-基]-2，3，14-三羟基-10，13-二甲基-2，3，4，5，9，11，12，15，16，17-十氢-1H-环戊并[a]菲-6-酮；N′-(3，5-二甲基苯甲酰基)-N′-[(3R)-2，2-二甲基-3-已烷基]-2-乙基-3-甲氧基苯并酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；2-甲氧基-烟酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(2，2-二甲基-1-苯基-丙基)-N′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；和3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼。
本文进一步公开了一种用于工程化细胞中异源基因表达的配体诱导型控制的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：(a)编码能够结合由靶细胞表达的预定细胞表面蛋白质的工程化受体构建体的第一序列；和(b)编码一种或多种工程化基因开关多肽的第二序列，其用于通过响应于所述配体的存在调节与所述异源基因连接的启动子，对所述异源基因表达进行配体诱导型控制；其中所述工程化受体构建体和所述一种或多种工程化基因开关多肽通过多肽连接体连接。
在一些实施方案中，所述多肽连接体包含可切割的连接体序列。在一些实施方案中，所述可切割的连接体序列是F2A连接体。在一些实施方案中，所述一种或多种工程化基因开关多肽包含第一基因开关多肽和第二基因开关多肽，第一基因开关多肽包含与核受体配体结合域融合的DNA结合域，第二基因开关多肽包含与核受体配体结合域融合的反式激活域。在一些实施方案中，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一些实施方案中，该连接体是可切割的或核糖体跳跃连接体序列。在一些实施方案中，该连接体是2A连接体、GSG-2A连接体、GSG连接体、SGSG连接体、furinlink变体及其衍生物。在一些实施方案中，该2A连接体是F2A连接体。在一些实施方案中，所述异源基因编码细胞因子。在一些实施方案中，该细胞因子是IL-2、IL-15、IL-12、IL-21或IL-15与IL-15Rα的融合体。在一些实施方案中，该细胞因子是IL-12。在一些实施方案中，所述异源基因编码至少一种细胞标签。在一些实施方案中，该细胞标签是HER1截短变体或CD20截短变体。在一些实施方案中，将所述多核苷酸引入工程化细胞中。
本文进一步公开了一种用于在靶细胞附近的宿主细胞中表达细胞因子的系统，其中该系统包含：(a)宿主细胞，其编码：(i)选择性地结合在靶细胞中表达的预定细胞表面蛋白质的工程化受体构建体；(ii)工程化基因开关多肽，其中该工程化基因开关多肽包含反式激活域、DNA结合域和配体结合域中的一种或多种；和(iii)由连接至被所述工程化基因开关多肽调节的启动子的异源基因表达的细胞因子；以及(b)配体；使得当在所述配体的存在下，所述工程化受体构建体与所述细胞表面蛋白质结合后，由靶细胞附近的宿主细胞表达细胞因子。
在一些情况下，所述工程化受体构建体包含嵌合抗原受体。在一些情况下，该嵌合抗原受体结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123或VEGF-R2。在一些情况下，该嵌合抗原受体结合EGFRvIII。在一些情况下，所述工程化受体构建体包含工程化T细胞受体。在一些情况下，所述细胞因子是IL-2、IL-15、IL-12、IL-21或IL-15与IL-15Rα的融合体。在一些情况下，所述细胞因子是IL-12。在一些情况下，所述宿主细胞进一步编码至少一种细胞标签。在一些情况下，该细胞标签是HER1截短变体或CD20截短变体。
本文进一步提供了一种从靶细胞附近的宿主细胞表达细胞因子的方法，该方法包括在配体的存在下使本文公开的系统与所述靶细胞接触。本文进一步提供了一种调节从靶细胞附近的宿主细胞表达细胞因子的方法，该方法包括在配体的存在下使本文公开的系统与靶细胞接触，以及调节配体的量。在一些情况下，与在所述配体的存在下的表达相比，在不存在所述配体的情况下，所述表达减少或消除。在一些情况下，通过提供额外量的所述配体来复苏所述表达。在一些情况下，所述宿主细胞是动物细胞或哺乳动物细胞。在一些情况下，该哺乳动物细胞是人细胞。在一些情况下，该哺乳动物细胞是T细胞、NK细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。在一些情况下，靶细胞是肿瘤细胞。在一些情况下，所述系统被包含在一个或多个载体中。在一些情况下，每个载体包含质粒。在一些情况下，每个载体包含表达质粒。在一些情况下，每个载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在一些情况下，该非病毒载体包括睡美人转座酶和SB转座子。
本文进一步公开了一种用于结合EGFRvIII的多肽，其中该多肽包含与SEQ ID NO：233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243或244所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
在一些情况下，所述多肽在工程化效应细胞中表达。在一些情况下，该效应细胞是免疫效应细胞。在一些情况下，该免疫效应细胞是T细胞、NK细胞或肿瘤浸润淋巴细胞。在一些情况下，所述多肽包含抗体或其片段。在一些情况下，所述多肽包含嵌合抗原受体(CAR)。在一些情况下，所述EGFRvIII结合所述抗体或其片段的scFv抗原结合域或所述CAR。在一些情况下，所述多肽不与野生型EGFR交叉反应。
本文进一步公开了一种多核苷酸，其编码：a)能够结合EGFRvIII的工程化受体构建体；b)包含反式激活域和核受体配体结合域的第一多肽；和(c)包含DNA结合域和核受体配体结合域的第二多肽；其中F/T2A连接体连接工程化受体构建体、第一多肽和第二多肽中的至少两种。
在一些情况下，所述F/T2A连接体将所述工程化受体构建体与所述第一多肽和所述第二多肽中的至少一种连接。在一些情况下，所述F/T2A连接体将第一多肽与所述第二多肽连接。在一些情况下，所述多核苷酸进一步编码IRES连接体。在一些情况下，该IRES连接体将第一多肽与第二多肽连接。
本文进一步公开了一种包含本文公开的多核苷酸的效应细胞。在一些情况下，该效应细胞编码与能够被所述第一多肽或所述第二多肽调节的诱导型启动子连接的异源基因。
本文进一步公开了一种能够结合EGFRvIII的嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含：(a)EGFRvIII结合区；(b)跨膜区；和(c)连接所述跨膜区与所述EGFRvIII结合区的间隔区，其中该间隔区包含含有至少一个二聚化位点的茎区，和含有与该茎区具有至少75％序列同一性的序列的茎延伸区。
本文进一步公开了一种工程化效应细胞，其包含：(a)在所述工程化效应细胞表面的、有效结合EGFRvIII分子或其变体的EGFRvIII结合部分；(b)工程化基因开关多肽，其中该工程化基因开关多肽包含反式激活域、DNA结合域和配体结合域中的一种或多种；和(c)编码细胞因子的异源基因，该异源基因由被所述工程化基因开关多肽调节的启动子控制。
附图说明
在所附权利要求书中具体阐述了本公开内容的特征。通过参考以下对利用了本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本公开内容的特征和优点获得更好的理解，在附图中：
图1是适于遗传修饰T细胞的睡美人(SB)系统的示意图。将表达SB转座子系统即SB11、膜结合的IL-15(mbIL-15)和嵌合抗原受体(CAR)的DNA质粒转染至外周血单核细胞(PBMC)，以重定向T细胞特异性。在设计者活化和增殖细胞(AaPC)上稳定表达整合体的T细胞被增殖并扩充。
图2A-2D示意性地说明了不同配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分。所描绘的示例性CAR可包括CD19 CAR。EF1A启动子是示例性的组成型启动子。
图3是配体诱导型基因开关多肽的多载体系统的示意图。
图4描绘了在存在/不存在veledimex配体(溶剂：DMSO)的情况下核转染后第1天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。构建体1、4、5、6、7和9对应于如图2A-2D中示意性描绘的构建体。
图5描绘了在CD19特异性CAR阳性群体上门控的，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：DMSO)的情况下核转染后第21天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。在流式细胞术分析前48小时加入配体。构建体1、4、5、6和9对应于如图2A-2D中示意性描绘的构建体。
图6描绘了在CD19特异性CAR阳性群体上门控的，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：DMSO)的情况下核转染后第29天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。在配体添加后开启mbIL-15的表达。构建体1、4、5、6、7和9对应于如图2A-2D中示意性描绘的构建体。
图7显示了在CD19特异性CAR阳性群体上门控的，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：DMSO)的情况下核转染后第35天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。配体撤除后mbIL-15的表达关闭。构建体1、4、5、6和9对应于如图2A-2D中示意性描绘的构建体。
图8显示了在CD19特异性CAR阳性群体上门控的，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：DMSO)的情况下核转染后第40天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。mbIL-15的表达在重新引入配体后得到保持。构建体1、4、5、6和9对应于如图2A-2D中示意性描绘的构建体。
图9显示了在CD19特异性CAR阳性群体上门控的，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：DMSO)的情况下核转染后第48天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。mbIL-15的表达在重新引入配体后连续保持。构建体1、4、5、6和9对应于如图2A-2D中示意性描绘的构建体。
图10显示了在CD19特异性CAR阳性群体上门控的，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：DMSO)的情况下核转染后第50天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析。mbIL-15的表达在重新引入配体后连续保持。构建体1、4、5、6和9对应于如图2A-2D中示意性描绘的构建体。
图11显示了在存在和不存在本文所述的配体的情况下核转染后第29、33、35和40天，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞中mbIL-15表达的定量RT-qPCR分析，证明了该基因开关对mbIL-15表达的配体依赖性调节。
图12显示了细胞存活试验的结果，其说明配体调节的mbIL-15表达在不存在IL-2和IL-21细胞因子的情况下促进优先的CAR-T细胞存活。
图13A、13B、13C和13D显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析，证明了veledimex配体的剂量响应。图13D显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析，证明了veledimex配体的剂量响应。在FSC/SSC/LIVE/CD3+上对细胞进行门控。在与100nM、25nM、6.25nM、1.56nM、0.4nM和0nM(DMSO对照)的veledimex孵育2天后取样。
图14是在存在/不存在veledimex配体的情况下，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞中mb-IL-15表达的Western印迹分析。
图15A和图15B是本文所述的通用多样化配体诱导型基因开关载体系统的不同结构组分的示意性描绘。在该示意图中，“PR”代表启动子；“IP”是用于基因转录的基因开关配体诱导型启动子；“5′UTR”是5′非翻译区(用于转录成mRNA)；“GOI”、“GOI-1”、“GOI-2”是将被转录并仅表达为mRNA(例如，siRNA)或表达为mRNA和多肽的目的基因(或第一个(GOI-1)和第二个GOI(GOI-2))；“连接体”“是可切割的或核糖体跳跃连接体序列；”TAD“是转录反式激活域(例如但不限于来自疱疹病毒的VP16 TAD)；”LBD“是核受体配体结合域(例如但不限于USP结构域、RXR结构域或嵌合体(例如，USP/RXR嵌合体)和来源于脊椎动物和无脊椎动物物种的置换突变LBD结构域)；“DBD”是DNA结合域(例如但不限于Gal4 DBD)；“EcR”是蜕皮素受体配体结合域，包括截短的和置换突变的EcR结构域(如EcR结构域，其赋予在体外和体内在甾类和/或非甾类配体(激动剂)的存在下形成活性转录激活复合物的能力；包括甾类配体(如百日青蜕皮酮A和幕黎甾酮A)和非甾类配体(如二酰基肼、虫酰肼和甲氧虫酰肼)；“可选的GOI”是将被转录并表达为mRNA或多肽的任何可选的目的基因；而“BD polyA”是双向聚腺苷尾序列。
图16A和图16B是本文所述的多样化配体诱导型基因开关载体系统的不同结构组分的示意性描绘。
图17是具有重组酶附着位点的示例性配体诱导型基因开关载体系统的示意性描述。此类系统可利用重组酶(如丝氨酸重组酶)将单一载体整合到免疫细胞(例如，T细胞)中。
图18A是描绘在第1、8和15天的％CAR阳性T细胞的表格。使用丝氨酸重组酶(SF370)介导的整合，修饰此类T细胞，以从单一载体表达CAR和基因开关控制的mbIL-15(RTS-mbIL15)。图18B描绘了在第15天，在存在和不存在veledimex时mbIl-15表达的诱导。该图还显示了在第22天去除veledimex后mbIL15表达的丧失。图18C是RTS-mbIL15-组成型CAR构建体的示例性描绘。
图19A-B示意性地说明了在组成型或T细胞特异性启动子控制下的多样化配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分。
图20A示意性地说明了在组成型或T细胞特异性启动子控制下的多样化配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分。图20B-20E显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的定量流式细胞术分析，证明了mbIL-15的表达依赖于T细胞活化(加入ConA)和veledimex的存在。构建体1-6对应于如图20A中示意性描绘的构建体。
图21A-21B描绘了IL-12的各种构型。
图22示意性地说明了在组成型或诱导型启动子控制下的多样化配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分。
图23示意性地说明了多样化配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分，其用来在组成型、诱导型启动子或组织特异性启动子(PR)的控制下表达不同形式的IL-12。IL-12可以被表达为单链IL-12、膜结合的IL-12或通过p35和p40结构域的单独表达。
图24A-24D示意性地说明了在组成型或诱导型启动子控制下的多样化配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分。
图25A-25B示意性地说明了在组成型、诱导型或T细胞特异性启动子控制下的多样化配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分。
图26显示了定量流式细胞术分析，其描绘了通过使用多个供体与AaPC共培养经由连续刺激离体扩充的EGFRvIII CAR T细胞中CAR的表达。
图27显示了在存在/不存在veledimex配体(溶剂：DMSO)的情况下，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞产生IL-12。
图28显示了IL-12表达水平的分析。图28A显示了在不存在细胞活化的情况下，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：DMSO)的情况下，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的IL-12表达水平。图28B显示了在抗原特异性激活后，在存在/不存在veledimex配体(溶剂：DMSO)的情况下，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的IL-12表达水平。
图29显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染并在存在/不存在aAPC和veledimex配体(溶剂：DMSO)的情况下共培养的细胞中IL-12表达水平的分析。
图30A和30B显示了IL-12表达水平的时程分析。图30A显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染并在存在/不存在veledimex配体(溶剂：DMSO)且不存在AaPC的情况下共培养的细胞的IL-12表达水平。在24小时时添加配体，并在48小时时撤除配体。图30B显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染并在存在/不存在veledimex配体(溶剂：DMSO)且存在AaPC的情况下共培养的细胞的IL-12表达水平。在24小时时添加配体，并在48小时时撤除配体。在添加配体后24、48和120小时对IL-12的表达进行定量。
图31A和31B显示了IL-12表达水平的分析。图31A显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染并且通过预先在不含veledimex的培养基中与AaPC共培养而扩充(循环1)的细胞在存在/不存在veledimex和AaPC时的IL-12表达水平。图31B显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染并且通过预先在培养基中与AaPC共培养而扩充(循环1)的细胞在存在/不存在veledimex和AaPC时的IL-12产生。
图32A和32B显示了IL-12表达水平的分析。图32A显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的IL-12产生。在时间0时加入Veledimex配体，在48小时时撤除，在168小时时再次加入，并在216小时时撤除。图32B显示了通过流式细胞术分析，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞中的CAR表达。细胞在CD3阳性群体上门控。
图33显示了在存在veledimex且存在(循环1)/不存在(循环2)AaPC的情况下，用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的IL-12表达水平。
图34显示了用本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染的细胞的veledimex剂量依赖性IL-12表达。
图35显示了通过本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染而产生并以1∶1的效应物：靶细胞比与靶细胞共培养的CAR-T细胞的IFNγ产生。使用CAR-T细胞与EL4、EL4EGFRvIII靶细胞以及无靶细胞(单独的效应物)对照的共培养来测量IFNγ的产生。
图36A和36B显示了CAR-T细胞的特异性细胞毒性。图36A显示了通过本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染而产生的CAR-T细胞的IFNγ产生。将效应CAR-T细胞与U87MG、U87MG-FLuc-GFP、U87MG-EGFRvIII-FLuc-GFP、U251MG、U251MG-FLuc-GFP和U251MG-EGFRvIII-FLuc-GFP靶细胞以1∶1的效应物：靶细胞比共培养24小时，之后在培养上清液中分析IFNγ表达。图36B显示了通过本文所述的配体诱导型基因开关载体系统转染而产生的CAR-T细胞对表达EGFRvIII的胶质母细胞瘤细胞的％裂解。将效应CAR-T细胞与EL4、表达EL4的EGFRvIII、K562和表达K562的EGFRvIII靶细胞系以不同的效应物：靶细胞比共孵育。
具体实施方式
以下描述和实例详细说明了本公开内容的实施方案。应该理解，本公开内容不限于本文所述的特定实施方案，因此可以变化。本领域技术人员将会认识到，本公开内容存在许多变化和修改，这些均涵盖在本公开内容的范围内。
所有术语旨在被理解成它们将被本领域技术人员所理解的那样。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
本文使用的章节标题仅用于组织结构目的，不应解释为限制所描述的主题。
尽管可以在单个实施方案的上下文中描述本公开的各种特征，但是这些特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在单独的实施方案的上下文中描述本公开内容，但是本公开内容也可以在单个实施方案中实现。
定义
以下定义补充了本领域中的定义，并且针对本申请，并且不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。本文描述了优选的材料和方法，但是与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可以在测试本公开内容的实践中使用。因此，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并非旨在限制。
在本申请中，除非另外明确指出，否则单数的使用包括复数。必须注意，如在本说明书中所用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。在本申请中，除非另外指出，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其它形式如“包含”、“含有”和“具有”的使用并非限制性的。
本说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其它实施方案”的提及意指关于该实施方案描述的特定特征、结构或特性包含在本公开内容的至少一些实施方案中，但不一定包含在所有实施方案中。
如在本说明书和权利要求书中所用的，词语“包含”(和任何形式的包含)、“具有”(和任何形式的具有)、“包括”(和任何形式的包括)或“含有”(和任何形式的含有)是包含性的或开放式的，并不排除其它未列举的要素或方法步骤。可以想到，本说明书中讨论的任何实施方案可以采用本公开的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本公开的组合物可以用来实现本公开的方法。
术语“约”或“大约”意指如本领域普通技术人员所测定的，在特定值的可接受误差范围内，其将部分依赖于该值是如何测量或确定的，即测量系统的局限性。例如，根据本领域中的实践，“约”可指在1个或大于1个标准偏差之内。或者，“约”可指给定值的多达20％、多达10％、多达5％或多达1％的范围。在另一个实例中，“约10”的量包括10以及9至11的任何量。在又一个实例中，关于参考数值的术语“约”还可以包括该数值加或减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数值范围。或者，尤其是对于生物系统或过程，术语“约”可指在某个值的数量级之内，优选在5倍以内，更优选在2倍以内。当特定值在本申请和权利要求书中描述时，除非另有说明，否则应假设术语“约”意指在特定值的可接受误差范围内。
如本文所用的术语“分离的”及其语法等同语是指将核酸从其天然环境中取出。如本文所用的术语“纯化的”及其语法等同语是指纯度增加的分子或组合物，无论是从自然界中取出的(包括基因组DNA和mRNA)还是在实验室条件下合成(包括cDNA)和/或扩增的，其中“纯度”是一个相对的术语，而不是“绝对纯度”。然而，应该理解，核酸和蛋白质可以与稀释剂或佐剂一起配制，而出于实际目的仍然是分离的。例如，当用于引入细胞中时，核酸通常与可接受的载体或稀释剂混合。如本文所用的术语“基本上纯化的”及其语法等同语是指这样的核酸序列、多肽、蛋白质或其它化合物，其基本上不含，即超过约50％不含、超过约70％不含、超过约90％不含与该核酸、多肽、蛋白质或其它化合物天然关联的多核苷酸、蛋白质、多肽和其它分子。
如本文所用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”是指任何长度的核苷酸或核酸——核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸——的聚合形式。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链DNA、三链DNA以及双链和单链RNA。它还包括修饰形式(例如通过甲基化和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。该术语还意在包括包含非天然存在的核苷酸或合成核苷酸以及核苷酸类似物的分子。
如本文所用的“多肽”、“肽”、“蛋白质”及其语法等同语是指氨基酸残基的聚合物。“成熟蛋白质”是全长的并且任选地包含在给定细胞环境中对蛋白质而言典型的糖基化或其它修饰的蛋白质。本文公开的多肽和蛋白质(包括其功能部分和功能变体)可包含合成氨基酸来代替一种或多种天然存在的氨基酸。这类合成氨基酸是本领域已知的，并且包括，例如，氨基环已烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环已基丙氨酸、环已基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’，N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环已烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)--羧酸、α，γ-二氨基丁酸、α，β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。本公开进一步预期，本文所述多肽在工程化细胞中的表达可与多肽构建体的一种或多种氨基酸的翻译后修饰相关。翻译后修饰的非限制性实例包括磷酸化、酰化(包括乙酰化和甲酰化)、糖基化(包括N-连接的和O-连接的)、酰胺化、羟基化、烷基化(包括甲基化和乙基化)、泛素化、加入吡咯烷酮羧酸、形成二硫键、硫酸化、豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、法尼基化、牻牛儿基化(geranylation)、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、脂化(lipoylation)和碘化。
当核酸和/或核酸序列天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，它们是“同源的”。当蛋白质和/或蛋白质序列的编码DNA天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，这些蛋白质和/或蛋白质序列是同源的。同源分子可称为同源物。例如，如本文所述的任何天然存在的蛋白质均可以通过任何可用的诱变方法进行修饰。当表达时，该诱变的核酸编码的多肽与原始核酸编码的蛋白质同源。通常从两种或更多种核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列同一性推断同源性。可用于确立同源性的序列间精确同一性百分比随所讨论的核酸和蛋白质而变化，但是常规使用低至25％的序列同一性来确立同源性。更高水平的序列同一性，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更高，也可用来确立同源性。用于确定序列同一性百分比的方法(例如，使用默认参数的BLASTP和BLASTN)在本文中描述并且通常是可获得的。
在两个核酸序列或多肽的氨基酸序列的语境中，如本文所用的术语“相同的”及其语法等同语或“序列同一性”，是指在指定的比较窗口上，两个序列中的残基在为了获得最大对应性而对齐时相同。如本文所用的，“比较窗口”是指至少约20个连续位置的片段，通常为约50至约200个，更通常为约100至约150个，其中可在两个序列最佳对齐后，将序列与相同连续位置数目的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的最佳序列比对可以通过以下方法来进行：Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482(1981)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443(1970)的比对算法；Pearson和Lipman，Proc.Nat.Acad.Sci U.S.A.，85：2444(1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实现(包括但不限于Intelligentics，Mountain ViewCalif.的PC/Gene程序中的CLUSTAL，Wisconsin Genetics SoftwarePackage，Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.，Madison，Wis.，U.S.A.中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)；CLUSAL程序由以下文献很好地描述：Higgins和Sharp，Gene，73∶237-244(1988)以及Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Corpet等人，Nucleic Acids Res.，16：10881-10890(1988)；Huang等人，Computer Applications in the Biosciences，8：155-165(1992)；和Pearson等人，Methods in Molecular Biology，24：307-331(1994)。通常还通过检查和手动对齐来进行比对。在一类实施方案中，本文的多肽与参考多肽或其片段至少80％、85％、90％、98％、99％或100％相同，例如，如通过BLASTP(或CLUSTAL，或任何其它可用的比对软件)使用默认参数来测定的。类似地，核酸也可以参考起始核酸来描述，例如，它们可以与参考核酸或其片段50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、98％、99％或100％相同，例如，如通过BLASTN(或CLUSTAL，或任何其它可用的比对软件)使用默认参数来测定的。当描述一个分子与较大分子具有一定百分比的序列同一性时，这意味着当两个分子最佳对齐时，根据两个分子最佳对齐的顺序，较小分子中所述百分比的残基在较大分子中找到匹配残基。
当应用于核酸或氨基酸序列时，术语“基本上相同的”及其语法等同语的意思是，使用以上描述的程序，例如BLAST，使用标准参数，核酸或氨基酸序列包含的序列与参考序列相比具有至少90％或更高、至少95％、至少98％和至少99％的序列同一性。例如，BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下默认值：字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下默认值：使用字长(W)为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1992))。通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列来确定序列同一性的百分比，其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)，以使两个序列最佳比对。如下计算百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。在实施方案中，基本同一性存在于长度至少约为50个残基的序列区域上，至少约100个残基的区域上，并且在实施方案中，序列在至少约150个残基上基本相同。在实施方案中，序列在编码区的整个长度上基本相同。
“转座子”或“转座因子”(TE)是可以改变其在基因组内的位置的载体DNA序列，其有时产生或逆转突变并改变细胞的基因组大小。转座经常导致TE的复制。I类TE在两个阶段中拷贝：首先，它们从DNA转录为RNA，然后所产生的RNA被逆转录为DNA。然后，拷贝的DNA插入基因组的新位置。逆转录步骤由逆转录酶催化，该逆转录酶可以由TE本身编码。逆转录转座子的特征类似于逆转录病毒，如HIV。II类TE的剪切-粘贴转座机制不涉及RNA中间体。转座由几种转座酶催化。一些转座酶非特异性地结合DNA中的任何靶位点，而其它转座酶结合特定的DNA序列靶标。转座酶在靶位点处进行交错剪切，从而产生单链5’或3’DNA突出端(粘端)。该步骤切下DNA转座子，然后将其连接到新的靶位点；该过程涉及补平缺口的DNA聚合酶和封闭糖-磷酸骨架的DNA连接酶的活性。这导致靶位点的复制。DNA转座子的插入位点可以通过短的定向重复序列(其可以通过在靶DNA中交错剪切并通过DNA聚合酶补平而产生)和随后的对转座酶切除TE至关重要的一系列反向重复序列来鉴定。如果当在细胞周期的S期中供体位点已被复制但靶位点尚未复制时发生剪切-粘贴TE的转座，则该剪切-粘贴TE可以被复制。在I类和II类TE中，转座可被分为“自主的”或“非自主的”。自主TE可以自己移动，而非自主TE的移动需要存在另一TE。这通常是因为非自主TE缺乏转座酶(对于II类)或逆转录酶(对于I类)。
“转座酶”是指结合至转座子末端并通过剪切-粘贴机制或复制转座机制催化转座子移动到基因组另一部分的酶。在一些实施方案中，转座酶的催化活性可用来将基因从载体移动到基因组。在一些实施方案中，转座酶的催化活性可用来将基因从载体(例如转座子)移动到基因组。在某些实施方案中，睡美人转座酶作为mRNA提供。在一些方面，该mRNA包含帽和poly-A尾。
可以通过“转染”、“转化”、“核转染”或“转导”将本文公开或考虑的核酸序列和载体引入细胞中。如本文所用的，“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞中。许多转染技术是本领域已知的，并且包括例如磷酸钙DNA共沉淀(参见，例如，Murray E.J.(编著)，Methods in Molecular Biology，Vol.7，Gene Transfer and Expression Protocols，Humana Press(1991))；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston，Nature，346：776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人，Mol.Cell Biol.，7：2031-2034(1987))；和核转染(Trompeter等人，J.Immunol.Methods 274：245-256(2003))。在合适的包装细胞中生长感染性颗粒后，可将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞中，其中许多包装细胞可商购获得。
如本文所用的“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞中产生或过表达的任何抗原物质。例如，它可以在宿主中触发免疫应答。或者，对于本公开内容来说，肿瘤抗原可以是由健康和肿瘤细胞均表达的蛋白质，但因为它们标识出某种肿瘤类型，所以是合适的治疗靶标。在实施方案中，肿瘤抗原是CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123或VEGF-R2。在一个实施方案中，该肿瘤抗原是EGFRvIII，它是用于治疗髓系恶性肿瘤，例如胶质母细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤(GBM)的CAR T细胞疗法的靶标。在另一个实施方案中，该肿瘤抗原是CD19。在又一个实施方案中，该肿瘤抗原是CD33。
如本文所用的术语“增强子”是指增加例如与其可操作地连接的核酸序列的转录的DNA序列。增强子可以位于远离核酸序列编码区的数千碱基处，并且可以介导调节因子的结合、DNA甲基化的模式或DNA结构的改变。来自多种不同来源的大量增强子是本领域公知的，并且可作为克隆的多核苷酸(来自诸如ATCC等保藏中心以及其它商业或个体来源)或在克隆的多核苷酸内获得。许多包含启动子(如常用的CMV启动子)的多核苷酸也包含增强子序列。增强子可位于编码序列的上游、内部或下游。术语“Ig增强子”是指衍生自定位于免疫球蛋白(Ig)基因座内的增强子区域的增强子元件(这样的增强子包括例如重链(μ)5’增强子、轻链(κ)5’增强子、κ和μ内含增强子和3’增强子)(一般性地参见Paul W.E.(编著)，Fundamental Immunology，第3版，Raven Press，New York(1993)，第353-363页；以及美国专利5,885,827)。
如本文所用的“编码序列”是指编码多肽的多核苷酸区段。该区域或序列由5′端附近的起始密码子和3′端附近的终止密码子来界定。编码序列也可以被称为开放阅读框。
如本文所用的“可操作地连接的”是指DNA区段与另一DNA区段的物理和/或功能连接，从而允许这些区段以其预期方式起作用。当编码基因产物的DNA序列与调节序列如启动子、增强子和/或沉默子以某种方式连接，使得允许直接或间接调节该DNA序列的转录时，该DNA序列与调节序列可操作地连接。例如，当DNA序列与启动子在启动子的转录起始位点下游连接，与该转录起始位点符合正确的阅读框架，并允许转录延伸通过该DNA序列进行时，该DNA序列与该启动子可操作地连接。当增强子或沉默子以某种方式连接到编码基因产物的DNA序列上，从而分别增加或减少该DNA序列的转录时，该增强子或沉默子与该DNA序列可操作地连接。增强子和沉默子可位于DNA序列的编码区的上游、下游或嵌入其中。如果信号序列被表达为参与多肽分泌的前蛋白质，则该信号序列的DNA与编码该多肽的DNA可操作地连接。DNA序列与调节序列的连接通常通过在合适的限制位点连接或通过使用本领域技术人员已知的限制性内切核酸酶插入该序列中的衔接子或连接体来完成。
术语“转录调节物”是指这样的生化元件，其在某些环境条件下用来阻止或抑制启动子驱动的DNA序列的转录(例如，阻遏物或核抑制蛋白)，或者在某些环境条件下用来允许或刺激启动子驱动的DNA序列的转录(例如，诱导物或增强子)。
如本文所用的术语“诱导”及其语法等同语是指相对于一定的基础转录水平，由转录调节物引起的核酸序列转录、启动子活性和/或表达的增加。
“靶”基因或“异源”基因或“目的基因(GOI)”是指通过基因转移引入宿主细胞中的基因。示例性的GOI可以是抗原结合多肽，其可以包括如本文所述的抗原结合多肽、嵌合受体、CAR、TCR、细胞因子和/或细胞标签。
如本文所用的“重组酶”是指可以促进在限定位点之间的位点特异性重组的一组酶，其中这些位点在单个DNA分子上物理分离，或者这些位点位于单独的DNA分子上。所定义的重组位点的DNA序列不一定是相同的。重组的起始取决于蛋白质-DNA相互作用，在该组内有大量蛋白质催化噬菌体整合和切除(例如，λ整合酶、.φC31)、循环质粒的解离(例如，Tn3、gamma delta、Cre、Flp)、用于表达替代基因的DNA反转(例如，Hin、Gln、Pin)、发育期间基因的装配(例如，鱼腥藻(Anabaena)固氮基因)和转座(例如，IS607转座子)。基于进化和机制相关性，大多数位点特异性重组酶属于两个家族之一。它们是.λ整合酶家族或酪氨酸重组酶(例如Cre、Flp、Xer D)和解离酶(resolvase)/整合酶家族或丝氨酸重组酶家族(例如，φC31、TP901-1、Tn3、gamma delta)。
“重组附着位点”是被本文所述的重组酶识别的特定多核苷酸序列。通常，涉及两个不同的位点(称为“互补位点”)，一个存在于靶核酸(例如，真核生物或原核生物的染色体或附加体)中，另一个存在于待整合至目标重组位点的核酸上。本文使用术语“attB”和“attP”，它们分别是指最初来自细菌靶标和噬菌体供体的附着(或重组)位点，尽管针对特定酶的重组位点可能具有不同的名称。重组位点通常包括由核心或间隔区隔开的左臂和右臂。因此，attB重组位点由BOB′组成，其中B和B′分别是左臂和右臂，而O是核心区。类似地，attP是POP′，其中P和P′是臂，而O是核心区。在attB与attP位点之间重组并且核酸同时整合到靶标上时，整合DNA侧翼的重组位点被称为“attL”和“attR”。使用上述术语，attL和attR位点因此分别由BOP′和POB′组成。在本文的一些表示中，省略“O”，并且例如将attB和attP分别表示为BB′和PP′。
基因表达的调节
在遗传工程领域，对基因表达的精确控制是用于研究、操纵和控制发育和其它生理过程的有价值的工具。基因表达是涉及许多特定蛋白质-蛋白质相互作用的复杂生物学过程。紧密调节的诱导型基因表达系统或“基因开关”可用于各种应用，如基因疗法、细胞中的大规模蛋白质生产、基于细胞的高通量筛选试验、功能基因组学以及转基因植物和动物中性状的调节。然而，对于治疗，受调节的和局部化的表达对于防止脱靶效应是重要的。本文提供了在需要时和在靶细胞或位置的特定附近调节异源基因如细胞因子的表达的手段。本文进一步提供了调节异源基因如细胞因子的表达的方法，其中该细胞因子例如在配体诱导型启动子的控制下。在一些情况下，该方法在不存在配体的情况下导致异源基因表达的基础水平低或没有。在进一步的实施方案中，配体诱导型启动子是基因开关配体诱导型启动子。本文进一步提供了调节从工程化细胞表达异源基因如细胞因子的方法。本文中，工程化细胞是已经从其天然或内源性状态修饰的细胞。工程化细胞的实例是本文所述的细胞，其已被修饰(例如，通过将多核苷酸转染到细胞中)。在一些情况下，工程化细胞可以是工程化的免疫效应细胞。在一种情况下，工程化细胞是T细胞。在另一种情况下，工程化细胞是NK细胞。在一种情况下，在用配体诱导异源基因的表达之前，活化工程化细胞。在另一种情况下，通过将细胞暴露于抗原来活化工程化细胞。该抗原可以是被工程化细胞表达的抗原结合多肽识别的抗原。该抗原可以是肿瘤抗原或传染病抗原。在一种情况下，工程化细胞可包含结合这样的抗原的抗原结合多肽。
在另一种情况下，基因开关配体诱导型启动子的基因开关组分可以通过组织特异性启动子进一步调节。在这类情况下，基因开关组分仅在组织特异性启动子被激活时表达，例如，在活化的T细胞或活化的NK细胞中表达。
载体
“表达载体”或“载体”是任何遗传元件，例如质粒、染色体、病毒、转座子，其表现为细胞内多核苷酸复制的自主单元(即能够在其自身控制下复制)或通过插入宿主细胞染色体中而能够复制，其已附接有另一多核苷酸区段，以便实现所附接的区段的复制和/或表达。合适的载体包括但不限于质粒、转座子、噬菌体和粘粒。载体可含有实现载体连接或插入所需宿主细胞中以及实现附接区段的表达所必需的多核苷酸序列。这样的序列根据宿主生物体而不同；它们包括实现转录的启动子序列、增加转录的增强子序列、核糖体结合位点序列以及转录和翻译终止序列。或者，表达载体可以能够直接表达其中编码的核酸序列产物，而无需载体连接或整合到宿主细胞DNA序列中。
载体还可以包含“选择标记基因”。如本文所用的，术语“选择标记基因”是指在相应选择剂的存在下允许表达核酸序列的细胞被特异性选择或排除的核酸序列。合适的选择标记基因是本领域已知的，并描述于例如国际专利申请公开WO 1992/08796和WO 1994/28143；Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：3567(1980)；O’Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：1527(1981)；Mulligan&Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072(1981)；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.，150：1(1981)；Santerre等人，Gene，30：147(1984)；Kent等人，Science，237：901-903(1987)；Wigler等人，Cell，11：223(1977)；Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：2026(1962)；Lowy等人，Cell，22：817(1980)；和美国专利5,122,464和5,770,359。
在一些实施方案中，所述载体是“附加型表达载体”或“附加体”，其能够在宿主细胞中复制，并且在适当选择压力的存在下作为DNA的染色体外区段存在于宿主细胞内(参见，例如，Conese等人，Gene Therapy，11：1735-1742(2004))。代表性的可商购的附加型表达载体包括但不限于利用EB核抗原1(EBNA1)和EB病毒(EBV)复制起点(oriP)的附加型质粒。来自Invitrogen(Carlsbad，Calif.)的载体pREP4、pCEP4、pREP7和pcDNA3.1以及来自Stratagene(La Jolla，Calif.)的pBK-CMV代表了使用T-抗原和SV40复制起点来代替EBNA1和oriP的附加型载体的非限制性实例。
如本文所用的，“基因表达盒”是载体的一部分，并且可含有组成型启动子如EF1a或诱导型启动子、5’UTR、3’UTR和polyA元件以及一种或多种目的基因(GOI)。在一个实施方案中，polyA元件是SV40epolyA(SEQ ID NO 65)。在另一个实施方案中，polyA元件是双向aCA polyA(SEQ ID NO 66)。在另一个实施方案中，polyA是PA2 polyA(SEQ ID NO 67)。在一些方面，基因表达盒可以进一步包含基因开关组分，例如与核受体配体结合域融合的DNA结合域和/或与核受体配体结合域融合的反式激活域。载体可包括一个或多个基因表达盒。
载体修饰
可用于本文所述的方法和组合物的多核苷酸载体可以是优良生产规范(GMP)兼容的载体。例如，GMP载体可能比非GMP载体更纯。在一些情况下，纯度可以通过生物负荷来测量。例如，生物负荷可以是在载体组合物中存在或不存在需氧菌、厌氧菌、产芽孢菌、真菌或其组合。在一些情况下，纯载体可以是低内毒素的或无内毒素的。纯度也可以通过双链引物步移测序来测量。质粒身份可以是确定载体纯度的来源。本公开内容的GMP载体可以比非GMP载体纯10％至99％。如通过存在生物负荷、内毒素、测序或其组合所测量的，GMP载体可以比非GMP载体纯10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些情况下，使用第一基因程序结束时的终止子序列。终止子序列可确保转录物在启动第二个基因程序之前终止。例如，表达载体可以含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这样的序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5′非翻译区以及偶尔从3′非翻译区获得。这些区域可以含有在mRNA的非翻译部分中转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。包含表达载体的细胞在提供所需多肽表达的条件下于体内或体外生长。
在一些情况下，可以在由载体中的多核苷酸编码的第一多肽的末端使用间隔区序列。在其它情况下，可以在载体中的第二个基因的末端使用间隔区序列。也可以在载体中的第一个基因和第二个基因之后使用间隔区序列。
这些载体可用来表达由基因或目的基因的一部分编码的多肽。部分基因或基因可以通过使用任何(病毒性或非病毒性)方法插入。例如；一种方法可以是基于非病毒的技术。
IRES元件
本文还公开了包含IRES元件的构建体，以促进本文所述的多核苷酸和多肽的表达和功能。如本文所用的术语“内部核糖体进入位点(IRES)”可旨在表示内部核糖体进入位点。在包含IRES序列的载体中，第一基因可以通过具有其自身5′-UTR的帽依赖性核糖体扫描机制进行翻译，而后续基因的翻译可以通过以帽非依赖性方式直接将核糖体募集至IRES来完成。IRES序列可以允许真核核糖体结合并在不与5′加帽端结合的情况下开始翻译。IRES序列可以允许从一个转录物表达多个基因(Mountford和Smith 1995)。
如本文所用的术语“CAP”或“帽”是指经修饰的核苷酸，通常是7-甲基鸟苷，其以3′至5′(7meG-ppp-G)连接至真核nRNA的5′端，其在从该mRNA表达蛋白质的过程中充当正常翻译起始途径中的必需元件。
在某些情况下，IRES区域可以来源于病毒，如小核糖核酸病毒、脑心肌炎病毒、丙型肝炎病毒IRES序列。在其它情况下，IRES序列可以来源于脑心肌炎病毒。如本文所用的术语“EMCV”或“脑心肌炎病毒”是指小核糖核酸病毒科的属的脑心肌炎病毒种的任何成员分离物或毒株。实例为：EMCV-R(Rueckert)毒株病毒，Columbia-SK病毒。在一些情况下，可以使用细胞IRES元件，诸如真核起始因子4G、免疫球蛋白重链结合蛋白、c-myc原癌基因、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子-1IRES或其任何组合或修饰。在一些情况下，细胞IRES与病毒IRES相比可以具有增加的基因表达。
病毒、细胞或其组合的IRES序列可在载体中使用。IRES可以来自脑心肌炎病毒(EMCV)或脊髓灰质炎病毒(PV)。在一些情况下，IRES元件选自脊髓灰质炎病毒(PV)、脑脊髓炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪捷申病毒-1(PTV-1)、爱知病毒(AiV)、塞尼卡谷病毒(SVV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、人免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人巨细胞病毒潜伏(pUL138)、EB病毒(EBNA-1)、疱疹病毒马立克氏病(MDVRLORF9)、SV40多顺反子19S(SV4019S)、禾谷缢管蚜病毒(RhPV)、蟋蟀麻痹病毒(CrPV)、茶尺蠖小RNA样病毒(EoPV)、大豆尺蠖病毒(PSIV)、吸血猎蝽病毒(TrV)、蜜蜂麻痹双顺反子病毒(IAPV，KBV)、黑醋栗逆转病毒(BRV)、天竺葵花破裂病毒(PFBV)、木槿属褪绿环斑病毒(HCRSV)、感染十字花科的烟草花叶病毒(CrTMV)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、贾第虫病毒(GLV)、利什曼虫RNA病毒-1(LRV-1)及其组合或修饰。在一些情况下，IRES选自Apaf-1、XIAP、HIAP2/c-IAP1、DAP5、Bc1-2、c-myc、CAT-1、INR、分化LEF-1、PDGF2、HIF-1a、VEGF、FGF2、BiP、BAG-1、CIRP、p53、SHMT1、PITSLREp58、CDK1、Rpr、hid、hsp70、grim、skl、Antennapedia、dFoxO、dInR、Adh-Adhr、HSP101、ADH、URE-2、GPR1、NCE102、YMR181a、MSN1、BOI1、FLO8、GIC1及其任何组合或修饰。当IRES元件被包含在两个开放阅读框(ORF)之间时，翻译的启动可以通过第一ORF中的规范5′-m7GpppN帽依赖性机制和IRES元件下游的第二ORF的帽非依赖性机制而发生。
在一些情况下，基因可以通过内部核糖体进入位点(IRES)连接。IRES可以允许同时表达多个基因。例如，IRES序列可以允许从单个mRNA转录物产生多种蛋白质。核糖体可以以5′帽非依赖性方式与IRES结合并启动翻译。
在一些情况下，IRES序列可以是500个碱基对或可以是约500个碱基对。IRES序列可以是300个碱基对至1000个碱基对。例如，IRES可以是300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个碱基对长。
在一些情况下，可以降低包含IRES序列的载体内的下游基因的表达。例如，IRES序列之后的基因可以比IRES序列之前的基因表达降低。表达降低可以是与前面的基因相比1％至99％的降低。
在某些实施方案中，IRES是EMCV IRES，其包含与SEQ ID NO 18的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％同一性的核苷酸序列连接体
还公开了包含连接体以促进本文所述多核苷酸和多肽的表达和功能性的构建体。在一些实施方案中，多核苷酸连接体可以在本文所述的多核苷酸中使用。多核苷酸连接体可以是含有所需限制位点的DNA的双链区段，该限制位点可以被添加以产生与包含本文所述多核苷酸的载体相容的末端结构。在一些情况下，多核苷酸连接体可用于修饰包含本文所述多核苷酸的载体。例如，包含多核苷酸连接体的载体修饰可以是多克隆位点的改变，或聚组氨酸尾的添加。多核苷酸连接体也可用于使钝性插入DNA的末端适应克隆到用限制酶切割的、具有粘端的载体中。多核苷酸连接体的使用可以比向载体中的钝端连接更有效，并且可以提供在下游应用中从载体释放插入物的方法。在一些情况下，插入物可以是编码可用于治疗应用的多肽的多核苷酸序列。在一些情况下，连接体可以是可切割的连接体。
多核苷酸连接体可以是寡聚体。多核苷酸连接体可以是DNA双链、单链或其组合。在一些情况下，连接体可以是RNA。在一些情况下，多核苷酸连接体可以通过T4连接酶连接到包含本文所述多核苷酸的载体中。为了促进连接，可将过量的多核苷酸连接体添加到包含插入物和载体的组合物中。在一些情况下，插入物和载体在引入连接体之前进行预处理。例如，用甲基化酶预处理可以防止插入物DNA的不希望的切割。
在某些实施方案中，由本文所述的多核苷酸编码的两个或更多个多肽可以被编码间插连接体多肽的间插序列隔开。本文中，术语“间插连接体多肽”是指隔开由多核苷酸编码的两个或更多个多肽的氨基酸序列，与术语“肽连接体”不同，后者是指任选地包括在本文公开的多肽构建体中的氨基酸序列，以将跨膜结构域连接至细胞表面多肽(例如，包含天然多肽的截短变体)。在某些情况下，间插连接体是易切割的间插连接体多肽。在一些实施方案中，该连接体是可切割的或核糖体跳跃连接体。在一些实施方案中，该可切割的连接体或核糖体跳跃连接体序列选自2A、GSG-2A、GSG连接体、SGSG连接体、furinlink变体及其衍生物。在一些实施方案中，该2A连接体是p2A连接体、T2A连接体、F2A连接体或E2A连接体。在一些实施方案中，目的多肽被表达为通过易切割的间插连接体多肽连接的融合蛋白。在某些实施方案中，易切割的间插连接体多肽可以是以下任何一种或多种：F/T2A、T2A、p2A、2A、GSG-p2A、GSG连接体和furinlink变体。在某些实施方案中，该连接体多肽包含下表中公开的那些：
表1.连接体氨基酸序列和多核苷酸序列
在一些实施方案中，间插连接体多肽包含与Whitlow连接体(SEQ ID NO 146)、GSG连接体(SEQ ID NO 148)、SGSG连接体(SEQ ID NO 149)、(G4S)3连接体(SEQ ID NO 150)、弗林蛋白酶切割位点/Furlink1(SEQ ID NO 151)、Fmdv连接体(SEQ ID NO 152)、Thoseaasigna病毒2A区(T2A)(SEQ ID NO 153)、弗林蛋白酶-GSG-T2A(SEQ ID NO 154)、弗林蛋白酶-SGSG-T2A(SEQ ID NO 155)、猪捷申病毒-12A区(P2A)(SEQ ID NO 156)、GSG-P2A(SEQID NO 157)、马鼻炎A病毒2A区(E2A)(SEQ ID NO 158)或口蹄疫病毒2A区(F2A)(SEQ IDNO：159)的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，间插连接体多肽包含与连接体的氨基酸序列(SEQ IDNO 147、161或162)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。在一些情况下，可以使用病毒2A序列。2A元件可以比IRES更短，其具有5至100个碱基对。在一些情况下，2A序列可以在长度上具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或100个核苷酸。2A连接的基因可以在一个单开放阅读框中表达，并且“自切割”可以共翻译地发生在2A多肽的C-末端处的最后两个氨基酸GP之间，产生等量的共表达的蛋白质。
病毒2A序列可以是约20个氨基酸。在一些情况下，病毒2A序列可以含有共有基序Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro。共有基序序列可以共翻译地起作用。例如，可以防止在甘氨酸与脯氨酸残基之间形成正常的肽键，其可以导致核糖体跳跃和新生多肽的切割。这种效应可以产生等摩尔水平的多种基因。
2A肽可允许将多个蛋白质在单个开放阅读框中翻译成多肽，该多肽随后可通过核糖体跳跃机制(Funston，Kallioinen等人2008)“切割”成单个多肽。在一些实施方案中，2A序列可以包括：F/T2A、T2A、p2A、2A、T2A、E2A、F2A和BmCPV2A、BmIFV2A及其任何组合。
在一些情况下，载体可以包含IRES序列和2A连接体序列。在其它情况下，用2A肽连接的多个基因的表达可以通过2A肽之前的间隔区序列(GSG)来促进。在一些情况下，构建体可以组合间隔区、连接体、衔接子、启动子或其组合。例如，连接体可以具有带有不同2A肽的间隔区(SGSG或GSG或Whitlow连接体)和弗林蛋白酶连接体(R-A-K-R)切割位点。间隔区可以是I-Ceui。在一些情况下，可以对连接体进行工程化。例如，可以将连接体设计为包含化学特性，如疏水性。在一些情况下，至少两个连接体序列可以产生相同的蛋白质。在其它情况下，可以在载体中使用多个连接体。例如，目的基因可以被至少两个连接体隔开，如图2和图3所示。
在某些实施方案中，由本文所述的多核苷酸编码的两个或更多个多肽可以被编码连接体多肽的间插序列隔开。在某些情况下，该连接体是易切割的连接体。在一些实施方案中，目的多肽被表达为通过易切割的连接体多肽连接的融合蛋白。在某些实施方案中，易切割的连接体多肽可以是以下任一种或两种：以下所述的Furinlink、fmdv、p2a、GSG-p2a和/或fp2a。在一些情况下，连接体是APVKQGSG(SEQ ID NO 161)。
在某些情况下，连接体多肽可以包含氨基酸序列“RAKR”(SEQ ID NO 151)。在某些情况下，弗林蛋白酶连接体多肽可由包含“CGTGCAAAGCGT”(SEQ ID NO 6)或“AGAGCTAAGAGG”(SEQ ID NO 9)的多核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，连接体可在本文所述的多核苷酸中使用。连接体可以是柔性连接体、刚性连接体、体内可切割连接体或其任何组合。在一些情况下，连接体可以将功能域连接在一起(如在柔性和刚性连接体中)或在体内释放游离功能域，如同在体内可切割连接体中那样。
连接体可以改善生物学活性、增加表达产率和实现理想的药代动力学谱。连接体还可以包含腙、肽、二硫键或硫醚(thioesther)。
在一些情况下，本文所述的连接体序列可以包括柔性连接体。当连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时，可以应用柔性连接体。柔性连接体可以由小的非极性(例如，Gly)或极性(例如，Ser或Thr)氨基酸组成。柔性连接体可以具有主要由Gly和Ser残基(“GS”连接体)段组成的序列。柔性连接体的实例可以具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQID NO 150)的序列。通过调整拷贝数“n”，可以优化该示例性GS连接体的长度以实现功能域的适当隔离或维持必需的结构域间相互作用。除GS连接体外，其它柔性连接体也可用于重组融合蛋白。在一些情况下，柔性连接体也可以富含小氨基酸或极性氨基酸如Gly和Ser，但可以含有另外的氨基酸如Thr和Ala以维持柔性。在其它情况下，可以使用极性氨基酸如Lys和Glu来提高溶解度。
包含在本文所述连接体序列中的柔性连接体可以富含小氨基酸或极性氨基酸，如Gly和Ser，以提供良好的柔性和溶解度。当融合蛋白结构域需要特定的移动或相互作用时，柔性连接体可能是合适的选择。另外，虽然柔性连接体可能没有刚性结构，但它们可以用作惰性连接体以保持功能域之间的距离。可以调节柔性连接体的长度以允许适当折叠或实现融合蛋白的最佳生物活性。
在一些情况下，本文所述的连接体可以进一步包括刚性连接体。刚性连接体可以用来维持多肽结构域之间的固定距离。刚性连接体的实例可以是(举几个例子来说)：α-螺旋形成连接体、富含Pro的序列、(XP)n、X-Pro骨架、A(EAAAK)nA(n＝2-5)。在一些情况下，刚性连接体可以通过采用α-螺旋结构或通过包含多个Pro残基来表现出相对僵硬的结构。
在一些情况下，本文所述的连接体可以是可切割的。在其它情况下，连接体是不可切割的。不可切割的连接体可将功能域共价连接在一起，以在整个体内过程或体外过程中充当一个分子。连接体也可以是体内可切割的。可以引入可切割的连接体以在体内释放游离的功能域。举几个例子来说，可通过还原剂、蛋白酶的存在来切割可切割的连接体。例如，可以利用二硫键的还原来产生可切割的连接体。在二硫键连接体的情况下，通过与硫醇如谷胱甘肽的二硫键交换的切割事件可以产生切割。在其它情况下，重组融合蛋白中连接体的体内切割也可以通过蛋白酶进行，该蛋白酶可在病理条件(例如癌症或炎症)下于特定细胞或组织中体内表达或约束于某些细胞区室内。在一些情况下，可切割的连接体可允许靶向切割。例如，许多蛋白酶的特异性可以在约束区室中提供较慢的连接体切割。可切割的连接体还可以包含腙、肽、二硫键或硫醚(thioesther)。例如，腙可以赋予血清稳定性。在其它情况下，腙可以允许在酸性区室中切割。酸性区室可具有最高为7的pH。连接体还可以包含硫醚。硫醚可以是不可还原的。硫醚可以被设计用于细胞内蛋白水解降解。
在某些实施方案中，fmdv连接体多肽包含可以与SEQ ID NO152至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些实施方案中，fmdv连接体多肽是连接两个或更多个融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在某些情况下，fmdv连接体多肽可以由多核苷酸开放阅读框(ORF)核酸序列编码。在一些情况下，编码fmdv的ORF包含SEQ ID NO 7的序列或由之组成。在某些实施方案中，编码fmdv的多核苷酸与SEQ ID NO 7至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
在某些情况下，连接体多肽可以是“p2a”连接体。在某些实施方案中，p2a多肽可以包含与SEQ ID NO 156可能至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些实施方案中，p2a连接体多肽可以是连接两个或更多个融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在一些情况下，p2a连接体多肽可以由多核苷酸开放阅读框(ORF)核酸序列编码。在某些实施方案中，编码p2a的ORF包含SEQ ID NO 11的序列或由之组成。在某些情况下，编码p2a的多核苷酸与SEQID NO11可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些情况下，连接体多肽可以是“GSG-P2a”连接体。在某些实施方案中，GSG-p2a连接体多肽可以包含与SEQ ID NO 157可能至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些实施方案中，GSG-p2a连接体多肽可以是连接两个或更多个融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在一些情况下，GSG-p2a连接体多肽可以由多核苷酸开放阅读框(ORF)核酸序列编码。编码GSG-p2a的ORF可以包含SEQ ID NO 12的序列。在一些情况下，编码GSG-p2a的多核苷酸与SEQ ID NO 12可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
连接体多肽可以是本文提供的“fp2a”连接体。在某些实施方案中，fp2a连接体多肽可以包含与SEQ ID NO 160可能至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在某些情况下，fp2a连接体多肽可以是连接两个或更多个融合蛋白且在单个载体中编码的一个或多个连接体。在一些情况下，fp2a连接体多肽可由多核苷酸开放阅读框(ORF)核酸序列编码。在某些实施方案中，编码fp2a连接体的多核苷酸与SEQ ID NO 15可以或可以大约至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些情况下，连接体可以是工程化的。例如，连接体可以被设计成包含化学特性如疏水性。在一些情况下，至少两个连接体序列可以产生相同的蛋白质。序列与SEQ ID NO147、161或162的多肽序列可以或可以大约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在其它情况下，可以在载体中使用多个连接体。例如，目的基因和一个或多个本文所述的基因开关多肽序列可以被至少两个连接体隔开，如图15和图16所示。在一些情况下，基因可以被2、3、4、5、6、7、8、9或最多10个连接体隔开。
连接体可以是工程化的连接体。设计连接体的方法可以是计算的。在一些情况下，计算方法可以包括图形技术。可以使用计算方法从源自数据库的三维肽结构文库中搜索合适的肽。例如，可以使用Brookhaven Protein Data Bank(PDB)跨越连接体的选定氨基酸之间的空间距离。
在一些实施方案中是编码包含弗林蛋白酶多肽和2A多肽的多肽构建体的多核苷酸，其中弗林蛋白酶多肽和2A多肽通过包含至少三个疏水性氨基酸的多肽连接体连接。在一些情况下，至少三个疏水性氨基酸选自由甘氨酸(Gly)(G)、丙氨酸(Ala)(A)、缬氨酸(Val)(V)、亮氨酸(Leu)(L)、异亮氨酸(Ile)(I)、脯氨酸(Pro)(P)、苯丙氨酸(Phe)(F)、甲硫氨酸(Met)(M)、色氨酸(Trp)(W)组成的列表。在一些情况下，多肽连接体还可以包含一个或多个GS连接体序列，例如(GS)n、(SG)n、(GSG)n(SEQ ID NO：78)和(SGSG)n(SEQ ID NO：79)，其中n可以是零到十五的任何数字。
提供了获得多肽构建体的改进表达的方法，该方法包括：提供编码包含第一功能性多肽和第二功能性多肽的所述多肽构建体的多核苷酸，其中所述第一功能性多肽和第二功能性多肽通过连接体多肽连接，该连接体多肽包含与序列APVKQ(SEQ ID NO 162)具有至少60％同一性的序列；以及在宿主细胞中表达所述多核苷酸，其中与不具有包含与序列APVKQ具有至少60％同一性的序列的连接体多肽的相应多肽构建体相比，所述表达导致多肽构建体的改进表达。
启动子
“启动子”是指启动编码序列转录的多核苷酸区域。启动子位于基因的转录起始位点附近，位于DNA的同一链和上游(朝向有义链的5’区)。一些启动子是组成型的，因为它们在细胞中在所有情况下都具有活性，而其它启动子响应于特定刺激被调节变得具有活性(例如，诱导型启动子)。另外其它的启动子是组织特异性或活化的启动子，包括但不限于T细胞特异性启动子。
术语“启动子活性”及其语法等同语是指与正被测量活性的启动子可操作地连接的核苷酸序列的表达程度。启动子活性可以通过确定产生的RNA转录物的量直接测定(例如通过Northern印迹分析)，或通过确定由所连接的核酸序列(如与启动子连接的报告核酸序列)编码的产物的量间接测定。
如本文所用的“诱导型启动子”是指通过转录调节物(例如，生物或非生物因素)的存在或不存在而诱导活性的启动子。诱导型启动子是有用的，因为与它们可操作连接的基因的表达可以在生物体的某些发育阶段或在特定组织中打开或关闭。诱导型启动子的实例是醇调节的启动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子、金属调节的启动子、发病机理调节的启动子、温度调节的启动子和光调节的启动子。在一个实施方案中，诱导型启动子是遗传开关的部分。诱导型启动子可以是基因开关配体诱导型启动子。在一些情况下，诱导型启动子可以是基于小分子配体诱导型双多肽蜕皮素受体的基因开关，如基因开关。在一些情况下，基因开关可以选自基于蜕皮素的受体组分，如在但不限于以下所述的任何系统中所描述的：PCT/US2001/009050(WO 200I/070816)；美国专利7,091,038；7,776,587；7,807,417；8,202,718；PCT/US2001/030608(WO 2002/029075)；美国专利8,105,825；8,168,426；PCT/1J52002/005235(WO 2002/066613)；美国申请10/468,200(美国公开20120167239)；PCT/US2002/005706(WO 2002/066614)；美国专利7,531,326；8,236,556；8,598,409；PCT/U52002/005090(WO2002/066612)；美国专利8,715,959(美国公开20060100416)；PCT/US2002/005234(WO 2003/027266)；美国专利7,601,508；7,829,676；7,919,269；8,030,067；PCT/U52002/005708(WO 2002/066615)；美国申请10/468,192(美国公开20110212528)；PCT/US2002/005026(WO2003/027289)；美国专利7,563,879；8,021,878；8,497,093；PCT/US2005/015089(WO 2005/108617)；美国专利7,935,510；8,076,454；PCT/U52008/011270(WO 2009/045370)；美国申请12/241,018(美国公开20090136465)；PCT/US2008/011563(WO 2009/048560)；美国申请12/247,738(美国公开20090123441)；PCT/US2009/005510(WO2010/042189)；美国申请13/123,129(美国公开20110268766)；PCT/US2011/029682(WO 2011/119773)；美国申请13/636,473(美国公开20130195800)；PCT/US2012/027515(WO 2012/122025)；和美国专利9,402,919，以上每一个均通过引用整体并入。
本文提供了方法，其包括向受试者施用至少一种包含编码本文所述多肽序列的多核苷酸的非病毒载体，该多肽包含至少两个功能性蛋白质或其部分；至少一个启动子；和至少一个工程化重组位点；其中所述至少一个启动子驱动所述至少两个功能性蛋白质的表达。在一些情况下，至少一个启动子可以是组成型的。在一些情况下，至少一个启动子可以是组织特异性的。在一些情况下，至少一个启动子可以是诱导型的。在一些情况下，诱导型启动子是基于小分子配体诱导型双多肽蜕皮素受体的基因开关。在其它情况下，可以使用启动子的组合，其中至少一个启动子可以是诱导型启动子，而至少一个启动子可以是活化特异性的。
诱导型启动子利用配体对所述至少两种基因的表达进行剂量调节的控制。在一些情况下，配体可以选自蜕皮类固醇、9-顺式-视黄酸、视黄酸的合成类似物、N，N’-二酰基肼、噁二唑啉、二苯甲酰基烷基氰基肼、N-烷基-N，N’-二芳酰基肼、N-酰基-N-烷基羰基肼、N-芳酰基-N-烷基-N’-芳酰基肼、氨基酮(arnidoketones)、3，5-二-叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈巴苷、氧化固醇、22(R)羟基胆甾醇、24(S)羟基胆甾醇、25-环氧胆甾醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆甾醇-3-硫酸酯(ECHS)、7-酮基胆甾醇-3-硫酸酯、framesol、胆汁酸、1，1-二膦酸酯、保幼激素III、RG-115819(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N’-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼-)、RG-115932((R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)和RG-115830(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)及其任何组合。
在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子是非诱导型启动子。在某些情况下，启动子可以是组织特异性启动子。本文中，“组织特异性”是指基因在组织或细胞类型的子集中的受调节的表达。在一些情况下，可以在空间上调节组织特异性启动子，使得该启动子仅在生物体的某些组织或细胞类型中驱动表达。在其它情况下，可以在时间上调节组织特异性启动子，使得该启动子在时间上不同地驱动细胞类型或组织中的表达，包括在生物体的发育期间。在一些情况下，组织特异性启动子在空间和时间上都受到调节。在某些实施方案中，组织特异性启动子在细胞类型的特定时间或阶段组成型地或间歇性地在某些细胞类型中被激活。例如，组织特异性启动子可以是当特定细胞如T细胞或NK细胞被活化时被激活的启动子。T细胞可以多种方式被活化，例如，当通过MHC II类分子呈递肽抗原时或当包含抗原结合多肽的工程化T细胞与抗原接合时。在一种情况下，这样的工程化T细胞或NK细胞表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
在一种情况下，至少一种启动子是工程化启动子或其变体。如本文所述，启动子可以并入来自IL-2和以下一种或多种的最小启动子序列：活化T细胞核因子(NFAT)应答元件，如SEQ ID NO 51；NFIL2D应答元件、NFkB/TCF应答元件、NF_AT/NFIL2B应答元件或NFIL2A/OCT应答元件。应答元件的实例描述于Mattila等人，EMBO J.1990December；9(13)：4425-4433；其整体并入本文。
在一些实施方案中，至少一种启动子包含IL-2核心启动子(SEQ ID NO 40)。在一个实施方案中，至少一种启动子包含IL-2最小启动子(SEQ ID NO 41)。在另一个实施方案中，至少一种启动子包含IL-2增强子和启动子变体(SEQ ID NO 42-43)。在又一个实施方案中，至少一种启动子包含NF-κB结合位点(SEQ ID NO 44-46)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含(NF-κB)1-IL2启动子变体(SEQ ID NO 47)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含(NF-κB)3-IL2启动子变体(SEQ ID NO 48)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含(NF-κB)6-IL2启动子变体(SEQ ID NO 49)。在一个实施方案中，至少一种启动子包含1XNFAT应答元件-IL2启动子变体(SEQ ID NO 50)。在另一个实施方案中，至少一种启动子包含活化T细胞核因子(NFAT)应答元件(SEQ ID NO 51)。在又一个实施方案中，至少一种启动子包含6X NFAT应答元件-IL2启动子变体(SEQ ID NO 52-55)。在又一个实施方案中，至少一种启动子包含3X NFAT应答元件-IL2启动子变体(SEQ ID NO56-57)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含人EF1A1启动子变体(SEQ ID NO 58-59)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含人EF1A1启动子和增强子(SEQ ID NO 60)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含人UBC启动子(SEQ ID NO 61)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含6位点GAL4诱导型近端因子结合元件(PFB)(SEQ ID NO 62)。在一些实施方案中，至少一种启动子包含合成的最小启动子1(诱导型启动子)(SEQ ID NO 63)。人IL-2基因和5′侧翼区包含SEQ IDNO 95的核苷酸序列。
使用基因开关进行本文所述的IL-12表达的配体诱导型控制可以通过例如允许调节的表达和改善治疗指数来改善IL-12的安全性谱。然而，使用基因开关的IL-12的配体剂量依赖性表达的条件是存在或不存在激活物配体(例如veledimex)。在某些实施方案中，考虑了用于诱导IL-12表达的另外的条件性控制。提供了在T细胞活化的特异性启动子控制下的基因开关组件。这导致在基因开关控制下veledimex控制的转基因表达所必需的基因开关组分的条件性表达(例如，T细胞活化)。在一些实施方案中，当存在veledimex并且T细胞被活化时，这导致肿瘤特异性T细胞优先表达细胞因子如IL-12或IL-15。这可以导致基因开关控制的转基因表达的局部水平增加。
例如，基因开关组分的T细胞活化特异性表达可以由包含活化T细胞核因子(NFAT)应答元件的启动子来控制。NFAT转录因子是效应T细胞状态的关键调节物。NFAT是逐渐驱动消耗的早期转录检查点。在TCR刺激后，NFAT在T细胞中快速活化，并与适当的共刺激信号传导诱导的AP-1形成蛋白质复合物，并调节效应基因和T细胞功能。NFAT应答元件可以与其它最小启动子序列(例如，IL2最小启动子)融合以响应于T细胞活化来驱动转基因的表达。
活化特异性启动子的其它实例包括但不限于白介素-2(IL2)启动子和程序性死亡(PD)-1(CD279)启动子。基因开关组分也可以通过将促炎信号传导途径的其它核因子如NF-κB的结合位点与最小启动子序列(例如，IL2)融合而在免疫细胞活化时条件性地表达。
在一些实施方案中，启动子包含NF-κB结合位点(SEQ ID NO44-46)、活化T细胞核因子(NFAT)应答元件(SEQ ID NO 51)、6位点GAL4-诱导型近端因子结合元件(PFB)(SEQ IDNO 62)或基于RPL6的合成5’UTR(SEQ ID NO 64)。在某些实施方案中，启动子可以是以下任何一种或多种：IL-2核心启动子、IL-2最小启动子、IL-2增强子和启动子变体、(NF-κB)1-IL2启动子变体、(NF-κB)3-IL2启动子变体、(NF-κB)6-IL2启动子变体、1X NFAT应答元件-IL2启动子变体、3X NFAT应答元件-IL2启动子变体、6X NFAT应答元件-IL2启动子变体、人EEF1A1启动子变体、人EEF1A1启动子和增强子、人UBC启动子和合成的最小启动子1。在某些实施方案中，启动子核苷酸包括下表中公开的那些：
表2.启动子多核苷酸序列
基因开关
本文提供了基因开关多肽，编码配体诱导型基因开关多肽的多核苷酸，以及并入这些多肽和/或多核苷酸的方法和系统。
术语“基因开关”或“基因的开关”是指与启动子关联的应答元件的组合，例如，基于EcR的系统，其在一种或多种配体的存在下，调节并入了应答元件和启动子的基因的表达。紧密调节的诱导型基因表达系统或基因开关可用于各种应用，如基因疗法、细胞中的大规模蛋白质生产、基于细胞的高通量筛选试验、功能基因组学以及转基因植物和动物中性状的调节。这类诱导型基因表达系统可包括配体诱导型异源基因表达系统。
早期形式的基于EcR的基因开关使用黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)EcR(DmEcR)和小鼠(Mus musculus)RXR(MmRXR)多肽，并且显示这些受体在类固醇、百日青蜕皮酮A的存在下在哺乳动物细胞系和转基因小鼠中反式激活报告基因(Christopherson等人，1992；No等人，1996)。后来，Suhr等人，1998表明非甾类蜕皮素激动剂虫酰肼在不存在外源异二聚体配偶体的情况下通过家蚕(Bombyx mori)EcR(BmEcR)在哺乳动物细胞中诱导报告基因的高水平反式激活。
国际专利申请PCT/US97/05330(WO 97/38117)和PCT/US99/08381(WO99/58155)公开了调节外源基因表达的方法，其中包含外源基因和蜕皮素应答元件的DNA构建体被包含蜕皮素受体的第二DNA构建体激活，该蜕皮素受体在其配体的存在下，任选地在能够充当沉默配偶体的受体的存在下，与蜕皮素应答元件结合以诱导基因表达。在该实例中，蜕皮素受体是从黑腹果蝇中分离的。通常，此类系统需要存在沉默配偶体，优选类视黄醇X受体(RXR)，以提供最佳激活。在哺乳动物细胞中，昆虫蜕皮素受体(EcR)能够与哺乳动物类视黄醇X受体(RXR)异二聚化，从而用于以配体依赖性方式调节靶基因或异源基因的表达。国际专利申请PCT/US98/14215(WO 99/02683)披露，从蚕蛾家蚕中分离的蜕皮素受体在哺乳动物系统中是功能性的，不需要外源二聚体配偶体。在一些实施方案中，RXR包含与SEQ ID NO69至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸，或与SEQ ID NO 182至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽。在一些实施方案中，基因开关包含VP16-连接体-RxR，其中VP16-连接体-RXR包含与至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的核苷酸，或与SEQ ID NO 183至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽。
美国专利6,265,173披露，类固醇/甲状腺超家族受体的各个成员可以与黑腹果蝇超螺旋受体(USP)或其至少包含USP二聚化结构域的片段相组合，以用于基因表达系统。美国专利5,880,333公开了在植物中使用的黑腹果蝇EcR和超螺旋(USP)异二聚体系统，其中反式激活域和DNA结合域位于两个不同的杂合蛋白上。在这些情况中的每一种中，反式激活域和DNA结合域(如国际专利申请PCT/US98/14215中的天然EcR或国际专利申请PCT/US97/05330中的修饰的EcR)并入单个分子中，并且其它异二聚体配偶体(USP或RXR)以其天然状态使用。在一些实施方案中，基因开关包含EcR配体结合域-VY变体，其中EcR配体结合域-VY变体包含与SEQ ID NO 72或73至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸，或与SEQ ID NO 185或186至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽。在其它实施方案中，基因开关包含GAL4-连接体-EcR，其中GAL4-连接体-ECR包含与SEQ ID NO 74或75至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸，或与SEQ ID NO 187或188至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的多肽。
国际专利申请PCT/US01/0905公开了基于蜕皮素受体的诱导型基因表达系统，其中反式激活域和DNA结合域通过将它们置于两个不同的蛋白质上而彼此分离，导致在不存在配体的情况下背景活性大大降低，而在配体的存在下，活性比背景显著增加。与申请PCT/US97/05330和PCT/US98/14215中公开的两种系统相比，这种双杂交系统是显著改进的诱导型基因表达调节系统。据认为，这种双杂交系统利用了一对相互作用蛋白质的以下能力：它们使转录激活域相对于DNA结合域处于更有利的位置，使得当DNA结合域与基因上的DNA结合位点结合时，反式激活域更有效地激活启动子(参见，例如，美国专利5,283,173)。这种双杂交基因表达系统包含两个基因表达盒；第一个编码与核受体多肽融合的DNA结合域，第二个编码与不同的核受体多肽融合的反式激活域。在配体的存在下，认为诱导了构象变化，这促进第一多肽与第二多肽的相互作用，从而导致DNA结合域与反式激活域的二聚化。由于DNA结合域和反式激活域位于两个不同的分子上，因此在不存在配体的情况下，背景活性大大降低。
另一个令人惊讶的发现是，与甾类配体(例如，百日青蜕皮酮A(“PonA”)或幕黎甾酮A(“MurA”)相比，所述双杂交系统的某些修饰还可以提供对非甾类配体(例如，二酰基肼)的改善的敏感性。也就是说，与类固醇相比，非甾类配体在较低的配体浓度下提供较高的基因转录活性。此外，所述双杂交系统避免了由于当未修饰的RXR用作开关配偶体时可能发生的RXR过表达而导致的一些副作用。在优选的双杂交系统中，消除了EcR或RXR的天然DNA结合域和反式激活域，因此，这些杂合分子与细胞中存在的其它类固醇激素受体相互作用的机会较少，从而导致副作用降低。
蜕皮素受体(EcR)是核受体超家族的成员，并且被分类为亚家族1，H组(在本文中称为“H组核受体”)。每组的成员在E(配体结合)结构域中具有40-60％的氨基酸同一性(Laudet等人，A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily，1999；Cell 97：161-163)。除蜕皮素受体外，该核受体亚家族1，H组的其它成员还包括：遍在受体(UR)、孤儿受体1(OR-1)、类固醇激素核受体1(NER-1)、RXR相互作用蛋白-15(RIP-15)、肝x受体β(LXRβ)、类固醇激素受体样蛋白(RLD-1)、肝x受体(LXR)、肝x受体α(LXRα)、类法尼醇x受体(FXR)、受体相互作用蛋白质14(RIP-14)和法尼醇受体(HRR-1)。
在一些情况下，诱导型启动子可以是小分子配体诱导型基于双多肽蜕皮素受体的基因开关，如Intrexon Corporation的基因开关。在一些情况下，基因开关可以选自基于蜕皮素的受体组分，如在但不限于以下所述的任何系统中所描述的：PCT/US2001/009050(WO 2001/070816)；美国专利7,091,038；7,776,587；7,807,417；8,202,718；PCT/US2001/030608(WO 2002/029075)；美国专利8,105,825；8,168,426；PCT/1J52002/005235(WO 2002/066613)；美国申请10/468,200(美国公开20120167239)；PCT/US2002/005706(WO 2002/066614)；美国专利7,531,326；8,236,556；8,598,409；PCT/U52002/005090(WO2002/066612)；美国专利8,715,959(美国公开20060100416)；PCT/US2002/005234(WO 2003/027266)；美国专利7,601,508；7,829,676；7,919,269；8,030,067；PCT/U52002/005708(WO 2002/066615)；美国申请10/468,192(美国公开20110212528)；PCT/US2002/005026(WO2003/027289)；美国专利7,563,879；8,021,878；8,497,093；PCT/US2005/015089(WO 2005/108617)；美国专利7,935,510；8,076,454；PCT/U52008/011270(WO 2009/045370)；美国申请12/241,018(美国公开20090136465)；PCT/US2008/011563(WO 2009/048560)；美国申请12/247,738(美国公开20090123441)；PCT/US2009/005510(WO2010/042189)；美国申请13/123,129(美国公开20110268766)；PCT/US2011/029682(WO 2011/119773)；美国申请13/636,473(美国公开20130195800)；PCT/US2012/027515(WO 2012/122025)；和美国专利9,402,919，以上每一个均通过引用整体并入。
提供了用于调节宿主细胞中的异源基因和白介素表达的系统，其包含表达本文公开的基因开关多肽的多核苷酸。在组成型或诱导型启动子控制下的非限制性示例性配体诱导型基因开关载体系统的各种结构组分示于图22中。
在一些实施方案中，基因开关载体系统的表达盒是XON-64并且具有如SEQ ID NO：131所示的序列。在一些实施方案中，基因开关载体系统的表达盒是XON-30并且具有如SEQID NO：132所示的序列。在一些实施方案中，基因开关载体系统的表达盒是XON-59并且具有如SEQ ID NO：133所示的序列。在一些实施方案中，基因开关载体系统的表达盒是XON-60并且具有如SEQ ID NO：134所示的序列。在一些实施方案中，基因开关载体系统的表达盒是XON-61并且具有如SEQ ID NO：135所示的序列。在一些实施方案中，基因开关载体系统的表达盒是XON-62并且具有如SEQ ID NO：136所示的序列。
在一些实施方案中是用于调节宿主细胞中的异源基因和细胞因子表达的系统，其包含第一基因表达盒，该第一基因表达盒包含编码第一多肽的第一多核苷酸；第二基因表达盒，该第二基因表达盒包含编码第二多肽的第二多核苷酸；和配体；其中所述第一和第二多肽包含以下一种或多种：(i)反式激活域；(ii)DNA结合域；(iii)配体结合域；(iv)所述异源基因；和(vi)所述细胞因子，使得在所述配体的存在下使所述宿主细胞与所述第一基因表达盒和所述第二基因表达盒接触后，所述异源基因和所述细胞因子在所述宿主细胞中表达。在一些情况下，所述异源基因包含本文所述的抗原结合多肽。在一些情况下，该抗原结合多肽可以是本文所述的CAR，例如，结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种的CAR。
细胞因子
本文提供了编码基因开关多肽和细胞因子或其变体或衍生物的多核苷酸，以及并入该多核苷酸的方法和系统。细胞因子是一类约5-20kDa的参与细胞信号传导的小蛋白质。在一些情况下，细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、集落刺激因子或肿瘤坏死因子。在一些实施方案中，趋化因子起到用于引导细胞迁移的化学引诱物的作用，并且被分类为四个亚家族：CXC、CC、CX3C和XC。示例性趋化因子包括来自CC亚家族的趋化因子：CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3、CCL4、CCL5(RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(或CCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27和CCL28；来自CXC亚家族的趋化因子：CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16和CXCL17；来自XC亚家族的趋化因子：XCL1和XCL2；以及来自CX3C亚家族的趋化因子：CX3CL1。
干扰素(IFN)包括I型干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω)、II型干扰素(例如IFN-γ)和III型干扰素。在一些实施方案中，IFN-α进一步分类为约13种亚型，包括IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17和IFNA21。
白介素由白血球或白细胞表达，并且它们促进T和B淋巴细胞和造血细胞的发育和分化。示例性白介素包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35和IL-36。
在一些实施方案中，白介素包括mbIL-15。在一些实施方案中，mbIL-15是膜结合的嵌合IL-15，其可以与本文所述的经修饰的效应细胞共表达。在一些实施方案中，mbIL-15包含与全长IL-15Rα、其功能片段或变体符合读框地融合的全长IL-15(例如，天然IL-15多肽)或其片段或变体。在一些情况下，IL-15通过连接体与IL-15Rα间接连接。在一些情况下，mbIL-15如Hurton等人，“Tethered IL-15augments antitumor activity and promotes astem-cell memory subset in tumor-specific T cells，”PNAS 2016所述。
肿瘤坏死因子(TNF)是一组调节凋亡的细胞因子。在一些情况下，TNF家族中约有19个成员，包括但不限于TNFα、淋巴毒素-α(LT-α)、淋巴毒素-β(LT-β)、T细胞抗原gp39(CD40L)、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L和TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)。
集落刺激因子(CSF)是分泌的糖蛋白，其与造血干细胞表面上的受体蛋白相互作用，这随后调节细胞增殖和向特定种类血细胞的分化。在一些情况下，CSF包括巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或促巨核细胞生成素(promegapoietin)。
在一些实施方案中，细胞因子是膜结合细胞因子，其与本文所述的嵌合抗原受体共表达。
在一些实施方案中，本文所述的一种或多种方法进一步包括施用细胞因子。在一些情况下，该细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、集落刺激因子或肿瘤坏死因子。在一些情况下，本文所述的一种或多种方法进一步包括施用选自趋化因子、干扰素、白介素、集落刺激因子或肿瘤坏死因子的细胞因子。在一些情况下，本文所述的一种或多种方法进一步包括施用选自IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IFNγ或TNF-α的细胞因子。
在一些情况下，细胞因子包含至少一种趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、肿瘤坏死因子或其变体或组合。在一些情况下，细胞因子是白介素。在一些情况下，白介素是IL-12、IL-2、IL-15、IL-21及其功能变体和片段中的至少一种。在一些实施方案中，细胞因子是IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα或IL-15变体的融合体中的至少一种。在一个实施方案中，细胞因子是IL-15的变体(SEQ ID NO90；SEQ ID NO 203)。在一个实施方案中，细胞因子包含IL-15受体α(SEQ ID NO 91；SEQ ID NO 204)。在一些实施方案中，细胞因子可以是膜结合的或分泌的。在其它实施方案中，细胞因子可以是细胞内的。白介素可包含膜结合的IL-15(mbIL-15)、IL-15与IL-15Rα(SEQ ID NO91；SEQ ID NO 204)或IL-15变体(SEQ ID NO 90；SEQ ID NO 203)的融合体。在一些实施方案中，mbIL-15是膜结合的嵌合IL-15，其可以与本文所述的经修饰的效应细胞共表达。在一些实施方案中，mbIL-15包含与全长IL-15Rα、其功能片段或变体符合读框地融合的全长IL-15(例如，天然IL-15多肽)或其片段或变体。在一些情况下，IL-15通过连接体间接连接至IL-15Rα。在一些实施方案中，mbIL-15包含信号肽(SEQ ID NO 92；SEQ ID NO 205)。在一些情况下，mbIL-15如Hurton等人，“Tethered IL-15augments antitumor activity and promotes a stem-cell memorysubset in tumor-specific T cells，”PNAS 2016所述。在另一方面，白介素可包含IL-12。在一些实施方案中，IL-12可以是单链IL-12(scIL-12)、蛋白酶敏感的IL-12\、去稳定的IL-12、膜结合的IL-12或插入的IL-12。在一些实施方案中，IL-12是鼠IL-12亚单位β(p40)(SEQID NO 206)。在一些实施方案中，IL-12是鼠IL-12亚单位α(p35)(SEQ ID NO 207)。在一些实施方案中，IL-12是鼠单链IL-12(p40-连接体-p35)(SEQ ID NO 93；SEQ ID NO 208)。在一些实施方案中，IL-12是人单链IL-12(p40-连接体-p35)(SEQ ID NO 94；SEQ ID NO209)。在某些实施方案中，IL-12是单链IL-12。在一些情况下，IL-12变体如WO2015/095249、WO2016/048903和WO2017/062953所述，所有这些文献都通过引用整体并入。
本文提供了编码基因开关多肽的多核苷酸，其中所述基因开关多肽包含：a)第一基因开关多肽，其包含与核受体配体结合域融合的DNA结合域，和b)第二基因开关多肽，其包含与核受体配体结合域融合的反式激活域，其中第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一些情况下，该连接体可以是本文所述的连接体，例如GSG连接体，furinlink，2A连接体，如F/T2A、T2A、p2A、GSG-p2A，其变体和衍生物。在其它情况下，该连接体可以是IRES。在一些实施方案中，该IRES是EMCV IRES或2xRbm3 IRES。示例性IRES序列可见于SEQ ID NO：18和19。在某些情况下，编码2xRbm3 IRES a的多核苷酸可以与SEQ ID NO：19至少或至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在某些情况下，编码EMCV IRES a的多核苷酸可以与SEQ ID NO：18至少或至少约45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
在一些情况下，DNA结合域(DBD)包含本文所述的DBD，例如GAL4(GAL4 DBD)(SEQID NO 71；SEQ ID NO 184)、LexA DBD、转录因子DBD、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员DBD、细菌LacZ DBD和酵母DBD中的至少一种。反式激活域可包含本文所述的反式激活域，例如VP16反式激活域(SEQ ID NO 68；SEQ ID NO 181)、p53反式激活域和B42酸性激活物反式激活域之一。核受体配体结合域可包含蜕皮素受体(EcR)、遍在受体、孤儿受体1、NER-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15、肝X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝X受体α、类法尼醇X受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。
在一些情况下，与基因开关多肽通过非编码序列如IRES连接的配体诱导型基因开关相比，通过多肽连接体或核糖体跳跃序列连接的基因开关多肽表现出改善的对基因表达的剂量依赖性配体诱导型控制。在一些情况下，与所述基因开关多肽被IRES隔开的基因开关相比，通过2A连接体连接的基因开关多肽可以表现出改善的对异源基因表达的剂量依赖性配体诱导型控制。
如本文所述的多肽和多核苷酸可以在工程化细胞中表达。本文中，工程化细胞是已经从其天然或内源状态修饰的细胞。工程化细胞的实例是本文所述的细胞，其已被修饰(例如，通过将多核苷酸转染到细胞中)以编码例如基因开关多肽、目的基因(GOI)、细胞标签、异源基因和本文描述的其它任何多肽和多核苷酸。
配体
在一些实施方案中，用于诱导型基因开关调节的配体可以选自但不限于以下任一种：N-[(1R)-1-(1，1-二甲基乙基)丁基]-N′-(2-乙基-3-甲氧基苯甲酰基)-3，5-二甲基苯并酰肼(也称为veledimex)、(2S，3R，5R，9R，10R，13R，14S，17R)-17-[(2S，3R)-3，6-二羟基-6-甲基庚烷-2-基]-2，3，14-三羟基-10，13-二甲基-2，3，4，5，9，11，12，15，16，17-十氢-1H-环戊并[a]菲-6-酮；N′-(3，5-二甲基苯甲酰基)-N′-[(3R)-2，2-二甲基-3-已烷基]-2-乙基-3-甲氧基苯并酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；2-甲氧基-烟酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(2，2-二甲基-1-苯基-丙基)-N′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；和3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼。
在一些情况下，用于基于蜕皮素受体的诱导型基因开关调节的剂量调节的控制的配体可以选自但不限于以下任一种：蜕皮类固醇(如蜕皮素、20-羟基蜕皮酮、百日青蜕皮酮A、幕黎甾酮A等)、9-顺式-视黄酸、视黄酸的合成类似物、N，N’-二酰基肼，如美国专利6,013,836、5,117,057、5,530,028和5,378,726以及美国公开申请2005/0209283和2006/0020146所公开的那些；噁二唑啉，如美国公开申请2004/0171651中所述；二苯甲酰基烷基氰基肼，如在欧洲申请461，809中所公开的那些；N-烷基-N，N’-二芳酰基肼，如在美国专利5,225,443中所公开的那些；N-酰基-N-烷基羰基肼，如在欧洲申请234，994中所公开的那些；N-芳酰基-N-烷基-N’-芳酰基肼，如美国专利4,985,461中所述的那些；氨基酮，如美国公开申请2004/0049037中所述的那些；以上每一个均通过引用并入本文，以及其它类似材料，包括3，5-二叔丁基-4-羟基-N-异丁基-苯甲酰胺、8-O-乙酰基哈巴苷、氧化固醇、22(R)羟基胆甾醇、24(S)羟基胆甾醇、25-环氧胆甾醇、T0901317、5-α-6-α-环氧胆甾醇-3-硫酸酯(ECHS)、7-酮基胆甾醇-3-硫酸酯、framesol、胆汁酸、1，1-二膦酸酯、保幼激素III等。可用于本公开的二酰基肼配体的实例包括RG-115819(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N’-(2-甲基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼-)、RG-115932((R)-3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)和RG-115830(3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N’-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼)。参见例如序列号为12/155,111的美国专利申请和PCT申请PCT/US2008/006757，以上两者均通过引用整体并入本文。
抗原结合多肽
本文公开的多肽和蛋白质(包括其功能部分和功能变体)可包含合成氨基酸来代替一种或多种天然存在氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域已知的，并且包括例如氨基环已烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨甲基-半胱氨酸、反式-3-羟基脯氨酸和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环已基丙氨酸、环已基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’，N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环已烷羧酸α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α，γ-二氨基丁酸、α，β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
如本文所用的“抗体”是指单克隆或多克隆抗体。如本文所用的，术语“单克隆抗体”是指由B细胞的单个克隆产生并结合相同表位的抗体。相反，“多克隆抗体”是指由不同B细胞产生并结合相同抗原的不同表位的抗体群体。完整抗体通常由四个多肽组成：重(H)链多肽的两个相同拷贝和轻(L)链多肽的两个相同拷贝。每条重链含有一个N端可变(VH)区和三个C端恒定(CH1、CH2和CH3)区，并且每条轻链含有一个N端可变(VL)区和一个C端恒定(CL)区。每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。VH区和VL区具有相似的一般结构，每个区包含四个序列相对保守的框架区。框架区通过三个互补决定区(CDR)连接。被称为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR形成抗体的“高变区”，其负责抗原结合。
“抗原识别部分”或“抗体识别结构域”是指特异性结合抗原的分子或分子部分。在一个实施方案中，抗原识别部分是抗体、抗体样分子或其片段，并且抗原是肿瘤抗原或传染病抗原。
“抗体样分子”可以是例如作为Ig超家族成员的蛋白质，其能够选择性地结合配偶体。MHC分子和T细胞受体是这样的分子。在一个实施方案中，抗体样分子是TCR。在一个实施方案中，TCR已被修饰以增加其MHC结合亲和力。
术语“抗体的片段”、“抗体片段”、“抗体的功能片段”、“抗原结合部分”或其语法等同语在本文中可互换使用，是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段或部分(大体上参见Holliger等人，Nat.Biotech.，23(9)：1126-1129(2005))。例如，抗体片段理想地包含一个或多个CDR、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)或其组合。抗体片段的实例包括但不限于(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其为包含两个Fab片段的二价片段，该Fab片段通过茎区处的二硫键连接；(iii)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(iv)单链Fv(scFv)，其为由Fv片段的通过合成连接体连接的两个结构域(即VL和VH)组成的单价分子，该合成连接体使得两个结构域能够作为单个多肽链合成(参见例如，Bird等人，Science，242：423-426(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883(1988)；以及Osbourn等人，Nat.Biotechnol.，16：778(1998))，以及(v)双抗体，其为多肽链的二聚体，其中每个多肽链包含通过肽连接体与VL连接的VH，该肽连接体太短而不允许同一肽链上的VH与VL之间进行配对，从而驱动不同VH-VL多肽链上的互补结构域之间进行配对以生成具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子。抗体片段是本领域已知的，并且在例如美国专利8,603,950中有更详细的描述。其它抗体片段可包括重链抗体的可变片段(VHH)。
当与CAR结合使用时，术语“功能部分”是指本公开内容的CAR的任何部分或片段，该部分或片段保留其作为一部分的CAR(亲本CAR)的生物活性。关于编码亲本CAR的核酸序列，编码CAR的功能部分的核酸序列可编码构成亲本CAR的例如约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多的蛋白质。
如本文所用的，术语“功能变体”是指这样的多肽或蛋白质，其与参考多肽具有较高或显著的序列同一性或相似性，并且保留其作为变体的参照多肽的生物活性。在一些实施方案中，功能变体例如包含参考蛋白质的氨基酸序列，其具有至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个保守氨基酸置换。功能变体包括，例如，本文所述CAR(亲本CAR)的那些变体，其保留与亲本CAR相似程度、相同程度或更高程度的识别靶细胞的能力。关于编码亲本CAR的核酸序列，编码CAR的功能变体的核酸序列可以与编码亲本CAR的核酸序列例如约10％相同、约25％相同、约30％相同、约50％相同、约65％相同、约80％相同、约90％相同、约95％相同或约99％相同。
术语“保守氨基酸置换”或“保守突变”是指将一个氨基酸置换为另一种具有共同性质的氨基酸。定义各个氨基酸之间的共同性质的功能性方法是分析同源生物体的相应蛋白质之间氨基酸变化的归一化频率(Schulz，G.E.and Schirmer，R.H.，Principles ofProtein Structure，Springer-Verlag，New York(1979))。根据这样的分析，可以定义氨基酸组，其中组内的氨基酸彼此优先交换，因此它们在对总体蛋白质结构的影响上最相似(Schulz，G.E.and Schirmer，R.H.，同上)。保守突变的实例包括上述亚组内的氨基酸的氨基酸置换，例如赖氨酸置换精氨酸，反之亦然，使得可以保持正电荷；谷氨酸置换天冬氨酸，反之亦然，使得可以保持负电荷；丝氨酸置换苏氨酸，使得可以保持游离的-OH；谷氨酰胺置换天冬酰胺，使得可以保持游离-NH2。备选地或另外，功能变体可包含参考蛋白质的氨基酸序列，其具有至少一个非保守氨基酸置换。
术语“非保守突变”涉及不同组之间的氨基酸置换，例如，赖氨酸置换色氨酸，或苯丙氨酸置换丝氨酸等。在这种情况下，优选非保守氨基酸置换不干扰或抑制功能变体的生物学活性。非保守氨基酸置换可以增强功能变体的生物活性，使得与亲本CAR相比，功能变体的生物活性增加。
在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对于CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2是特异性的或与之结合。在实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scFv)，该片段包含通过柔性连接体如甘氨酸-丝氨酸连接体或Whitlow连接体连接的靶抗原特异性单克隆抗体的可变域轻链(VL)和可变域重链(VH)。在实施方案中，scFv是人源化的。在一些实施方案中，抗原结合部分可包含定向连接的VH和VL，例如，从N到C末端、VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。在一些情况下，抗原结合域识别靶标的表位。在一些实施方案中，本文描述的包括CAR或CAR-T细胞，其中抗原结合域包含F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。
在一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对CD19是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对CD33是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对BCMA是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对CD44是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对α-叶酸受体是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对CAIX是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对CD30是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对ROR1是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对CEA是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对EGP-2是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对EGP-40是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对HER2是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对HER3是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对叶酸结合蛋白是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对GD2是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对GD3是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对IL-13R-a2是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对KDR是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对EDB-F是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对间皮素是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对CD22是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对EGFR是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对MUC-1是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对MUC-16是特异性的。在一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对MAGE-A1是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对h5T4是特异性的。在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对PSMA是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对TAG-72是特异性的。在又一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对EGFRvIII是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对CD123是特异性的。在另一个实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对VEGF-R2是特异性的。
嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施方案中，本文描述的包括编码在细胞表面上表达的嵌合受体的多核苷酸。在一些情况下，嵌合受体包含能够识别和结合肿瘤抗原(例如肿瘤抗原，如肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)的抗原结合区。在一些情况下，抗原结合区包含抗体或结合片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、scFv、sc(Fv)2、dsFv、双抗体、微抗体和纳米抗体或其结合片段。在一些情况下，抗原结合区包含scFv。在一些情况下，嵌合受体包含scFv(例如，嵌合抗原受体(CAR))。在一些情况下，嵌合抗原受体包含模式识别受体。在其它情况下，嵌合受体包含工程化T细胞受体(TCR)。
如本文所用的术语“嵌合抗原受体(CAR)”、“人工T细胞受体”、“嵌合T细胞受体”或“嵌合免疫受体”是指将外源特异性移植到免疫效应细胞上的工程化受体。在一些情况下，CAR包含细胞外结构域(胞外域)和细胞内结构域(胞内域)，该细胞外结构域包含抗原结合域、茎区、跨膜结构域。在一些情况下，细胞内结构域进一步包含一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些情况下，本文所述的CAR包含抗原结合域、茎区、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和用于T细胞活化的信号传导结构域。
在实施方案中，本公开的CAR包含靶标特异性结合元件，其另外被称为抗原结合部分。在实施方案中，通过工程化与肿瘤细胞上的抗原特异性结合的所需抗原结合部分，将本公开的CAR工程化成靶向感兴趣的肿瘤抗原。在本公开的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性病症抗原”或“与过度增殖性病症相关的抗原”是指特定过度增殖性病症如癌症所共有的抗原。
抗原结合域可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。互补决定区(CDR)是在抗原受体(例如，免疫球蛋白和T细胞受体)蛋白的可变域中发现的短氨基酸序列，该短氨基酸序列与抗原互补并因此为受体提供针对该特定抗原的特异性。抗原受体的每条多肽链可含有三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。在一些情况下，抗原结合域包含F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。在一些情况下，抗原结合域是scFv。在一些情况下，抗原结合域是Fab。在一些情况下，抗原结合域是Fab’。在一些情况下，抗原结合域是F(ab’)2。在一些情况下，抗原结合域是Fv。
在一些实施方案中，本文描述的CAR包含与CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2上的表位结合的抗原结合域。在一些实施方案中，本文描述的CAR包含与CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2上的表位结合的抗原结合域。在一些实施方案中，本文描述的CAR包含与CD19、CD33或EGFRvIII上的表位结合的抗原结合域。在一些情况下，本文描述的CAR包含与CD19上的表位结合的抗原结合域。在一些情况下，本文描述的CAR包含与CD33上的表位结合的抗原结合域。在进一步的实施方案中，本文描述的CAR或嵌合受体或抗原结合多肽包含自身抗原或与HLA-A2、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、因子VIII(FVIII)、MAdCAM1、SDF1或II型胶原蛋白上的表位结合的抗原结合区。
在另一个实施方案中，本文描述的CAR是EGFRvIII特异性CAR。“EGFRvIII”、“EGFR变体III”、“EGFR III型突变体”、“EGFR.D2-7”或“de2-7EGFR”是表皮生长因子受体(EGFR；ErbB-1；HER1)的突变形式，表皮生长因子受体是人和非人受试者中的细胞外蛋白质配体的表皮生长因子(EGF)家族成员的受体。EGFRvIII的特征在于野生型EGFR基因的外显子2-7缺失，这导致全长野生型EGFR蛋白的细胞外结构域中267个氨基酸的框内缺失。EGFRvIII还含有插入融合连接处的新型甘氨酸残基。截短的受体EGFRvIII不能结合任何已知的EGFR配体；然而，它显示出组成型酪氨酸激酶活性。这种组成型激活对其促致癌作用至关重要。激酶缺陷型EGFRvIII不能赋予类似的致癌优势。EGFRvIII在胶质母细胞瘤(GBM)中高度表达，并且可以在一些其它实体瘤类型中检测到，但在正常组织中检测不到。
在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对EGFRvIII(EGFRvIII CAR)是特异性的。当在细胞表面上表达时，EGFRvIII特异性CAR将T细胞的特异性重定向至人EGFRvIII。在实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scFv)，后者包含通过柔性连接体如甘氨酸-丝氨酸连接体或Whitlow连接体连接的靶抗原特异性单克隆抗EGFRvIII抗体的可变域轻链(VL)和可变域重链(VH)。在实施方案中，scFv是鼠MR1 IgG。在一些实施方案中，scFv是抗EGFRvIII scFv克隆MR1(SEQ ID NO 115；SEQ ID NO 229)、抗EGFRvIII scFv克隆MR1-1(SEQ ID NO 116；SEQ ID NO 230)、抗EGFRvIII scFv克隆huMR1-1(SEQ ID NO 117；SEQ ID NO 231)、抗EGFRvIII scFv克隆huMR1-2(SEQ ID NO 118；SEQ ID NO 232)。在一些实施方案中，抗原结合部分可包含定向连接的VH和VL，例如，从N末端到C末端、VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO 221的氨基酸序列(抗EGFRvIII克隆MR1 VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ ID NO 220的氨基酸序列(抗EGFRvIII克隆MR1VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO223的氨基酸序列(抗EGFRvIII克隆MR1-1VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ ID NO 222的氨基酸序列(抗EGFRvIII克隆MR1-1VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。
在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ IDNO 225的氨基酸序列(抗EGFRvIII克隆humMR1-1 VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ ID NO 224的氨基酸序列(抗EGFRvIII克隆humMR1-1 VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ ID NO 227的氨基酸序列(抗EGFRvIII克隆humMR1-2VL)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VL多肽。在实施方案中，本文描述的CAR包含抗原结合部分，该抗原结合部分包含与SEQ ID NO 226的氨基酸序列(抗EGFRvIII克隆humMR1-2 VH)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的VH多肽。
在一个实施方案中，本文描述的CAR是CD19特异性CAR。“CD19”、分化簇19或B-淋巴细胞抗原CD19是人体中由CD19基因编码的蛋白质。CD19基因编码与B淋巴细胞的抗原受体装配的细胞表面分子，以降低抗原受体依赖性刺激的阈值。CD19在滤泡树突细胞和B细胞上表达。事实上，它存在于在向B细胞母细胞发育过程中来自最早可识别的B谱系细胞的B细胞中，但在成熟为浆细胞时丢失。它主要作为B细胞共受体与CD21和CD81一起发挥作用。一旦激活，CD19的细胞质尾部变为磷酸化的，这导致Src-家族激酶的结合和PI-3激酶的募集。与在T细胞上一样，几种表面分子形成抗原受体并在B淋巴细胞上形成复合物。(几乎)B细胞特异性CD19磷酸糖蛋白是这些分子中的一种。其它的是CD21和CD81。这些表面免疫球蛋白(slg)相关分子促进信号转导。在B细胞上，模拟外源抗原的抗免疫球蛋白抗体导致CD19与slg结合并与其内化。反向过程尚未得到证实，提示该受体复合物的形成是抗原诱导的。这种分子关联已经通过化学研究得到证实。
在另一个实施方案中，本文描述的CAR是CD33特异性CAR。“CD33”、Siglec-3、唾液酸结合Ig样凝集素3、SIGLEC3、SIGLEC-3、gp67或p67是67kDa单次跨膜糖蛋白，并且是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs)超家族的成员。CD33的特征在于负责唾液酸结合的V-组Ig样结构域和其细胞外域中的C2-组Ig样结构域。CD33mRNA的可变剪接导致缺乏V-组Ig样结构域以及连接V-组和C2-组Ig样结构域的二硫键的较短同种型(CD33m)。在健康受试者中，CD33主要表达为在正常多能骨髓前体、单能集落形成细胞、单核细胞和成熟粒细胞上发现的髓样分化抗原。CD33在超过80％的髓样白血病细胞上表达，但在正常的造血干细胞或成熟粒细胞上不表达(Andrews，R.等人，The L4F3antigen is expressed by unipotentand multipotent colony-forming cells but not by their precursors，Blood，68(5)：1030-5(1986))。已报道CD33在恶性骨髓细胞、活化T细胞和活化NK细胞上表达，并且在绝大多数AML患者的至少一部分母细胞上发现(Pollard，J.等人，Correlation ofCD33expression level with disease characteristics and response to gemtuzumabozogamicin containing chemotherapy in childhood AML，Blood，119(16)：3705-11(2012))。除了在AML母细胞上的广泛表达之外，CD33还可以在导致AML的干细胞上表达。
在实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对CD33是特异性的(CD33CAR)。当CD33特异性CAR在细胞表面上表达时，其将T细胞的特异性重定向至人CD33。在实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scFv)，后者包含通过柔性连接体如甘氨酸-丝氨酸连接体或Whitlow连接体连接的靶抗原特异性单克隆抗CD33抗体的可变域轻链(VL)和可变域重链(VH)。在实施方案中，scFv是M195、m2H12、DRB2和/或My9-6。在实施方案中，scFv是人源化的，例如hM195。在一些实施方案中，该抗原结合部分可包含定向连接的VH和VL，例如，从N到C末端、VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。在一些实施方案中，CD33抗原结合域包含与SEQ IDNO 214(hM195 VL)的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，CD33抗原结合域包含与SEQ ID NO215(hM195 VH)的的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，CD33抗原结合域包含与SEQ ID NO216(具有连接体的hM195 scFv)的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸、多肽和方法可用于治疗过度增殖性疾病如癌症、自身免疫性疾病，或用于治疗感染，如病毒、细菌或寄生虫感染。在一些方面，抗原是在癌细胞、自身免疫细胞或被病毒、细菌或寄生虫感染的细胞中升高的抗原。可以被靶向的病原体包括但不限于疟原虫、锥虫、曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、HSV、HPV、RSV、EBV、CMV、JC病毒、BK病毒或埃博拉病原体。自身免疫性疾病可包括移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、狼疮、乳糜泻、克罗恩病、合格伦综合征、风湿性多肌痛、多发性硬化、视神经脊髓炎、强直性脊柱炎、1型糖尿病、斑秃、血管炎、颞动脉炎、大疱性类天疱疮、银屑病、寻常型天疱疮或自身免疫性葡萄膜炎。
被CAR识别的病原体可以基本上是任何种类的病原体，但在一些实施方案中，病原体是真菌、细菌或病毒。示例性病毒病原体包括以下科的病毒病原体：腺病毒科、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、JC病毒、BK病毒、HPV病毒科、HSV病毒科、HHV病毒科、肝炎病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头多瘤空泡病毒科、多瘤病毒、弹状病毒科和披膜病毒科。示例性的致病病毒引起天花、流感、流行性腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉和风疹。示例性的致病真菌包括假丝酵母属、曲霉属、隐球酵母属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺囊虫属(Pneumocystis)和葡萄穗霉属(Stachybotrys)。示例性的致病细菌包括链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、志贺菌属(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、螺杆菌属(Helicobacter)、大肠杆菌(E.coli)、立克次体属(Rickettsia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、博德特氏菌属(Bordetella)、衣原体属(Chlamydia)、螺旋体属(Spirochetes)和沙门菌属(Salmonella)。在一些实施方案中，病原体受体Dectin-1可用于生成识别真菌如曲霉的细胞壁上的碳水化合物结构的CAR。在另一实施方案中，CAR可以基于识别病毒决定簇(例如来自CMV和埃博拉的糖蛋白)的抗体来制备，以中断病毒感染和病理学。
在一些实施方案中，“茎”、“茎区”或“茎结构域”，其包括术语“间隔区”或“间隔域”或“铰链”、“铰链区”或“铰链域”，用于将抗原结合域与跨膜结构域连接。在一些情况下，“茎结构域”或“茎区”包括任何寡核苷酸或多肽，其起到将跨膜结构域连接到细胞外结构域或多肽链中的胞质域的作用。在一些实施方案中，其足够灵活以允许抗原结合域在不同方向上定向，从而促进抗原识别。在一些情况下，茎区包含来自IgG1的铰链区。在备选的情况下，茎区包含免疫球蛋白的CH2CH3区和可选的CD3的部分。在一些情况下，茎区包含CD8α铰链区(SEQ ID NO 29；SEQ ID NO 170)、IgG4-Fc 12氨基酸铰链区(ESKYGPPCPPCP)或IgG4铰链区，如WO/2016/073755所述。
在一些实施方案中，茎区包含至少一种与CD8α 2X(SEQ ID NO30；SEQ ID NO171)、CD8α 3X(SEQ ID NO 31；SEQ ID NO 172)或CD8α4X(SEQ ID NO 32；SEQ ID NO 173)的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽中。
在其它实施方案中，在CAR的细胞外结构域与跨膜结构域之间，并入间隔区。间隔区可包含茎区和茎延伸区。在一个实施方案中，间隔区可包括单个茎区。在另一个实施方案中，间隔区可包含茎区和茎延伸区。例如，间隔区可包含一(1)个茎区和0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17，18、19或20个茎区。在进一步的实施方案中，茎区可以通过连接体与茎延伸区连接。
跨膜结构域可以来自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。合适的跨膜结构域可包括T细胞受体的α、β或ζ链的跨膜区；或来自CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜区。或者，跨膜结构域可以是合成的，并且可以包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，在合成跨膜结构域的一个或两个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，在一些实施方案中，长度为2至10个氨基酸的短寡核苷酸或多肽连接体可以形成CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间的连接。在一些实施方案中，连接体是甘氨酸-丝氨酸连接体。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。在其它实施方案中，跨膜结构域包含CD3ζ跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜区包含至少一种与CD8α跨膜结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO 174)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。在一些实施方案中，跨膜区包含至少一种与CD28跨膜结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO 175)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
细胞内结构域可包含一个或多个共刺激结构域。示例性共刺激结构域包括但不限于CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合。在一些情况下，本文所述的CAR包含选自CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的CAR包含选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、OX40(CD134)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的CAR包含选自CD8、CD28、4-1BB(CD137)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的CAR包含选自CD28、4-1BB(CD137)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD28和4-1BB(CD137)或其各自的片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD28和OX40(CD134)或其各自的片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD8和CD28或其各自的片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD28或其片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域4-1BB(CD137)或其片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域OX40(CD134)或其片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD8或其片段。
本公开内容的CAR的细胞内信号传导结构域(也称为细胞质结构域)负责激活已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应物功能。术语“效应物功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应物功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应物功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整条链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分时，可以使用这样的截短部分代替完整的链，只要它转导效应物功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意味着包括足以转导效应物功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。在一些实施方案中，细胞内结构域进一步包含用于T细胞活化的信号传导结构域。在一些情况下，用于T细胞活化的信号传导结构域包含衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的结构域。在一些情况下，用于T细胞活化的信号传导结构域包含衍生自CD3ζ的结构域。
在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含至少一种与CD28(SEQ ID NO176)、CD3ζ信号传导结构域(SEQ ID NO 177)、4-1BB信号传导结构域(SEQ ID NO 178)、DNAX激活蛋白10(DAP 10)信号传导结构域(SEQ ID NO 179)或DNAX激活蛋白12(DAP12)信号传导结构域(SEQ ID NO 180)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
CD19特异性CAR
CD19是免疫球蛋白超家族的细胞表面糖蛋白。在一些情况下，已经在诸如胰腺癌、肝癌和前列腺癌的实体瘤中检测到CD19。
在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对CD19是特异性的。当在细胞表面上表达时，CD19特异性CAR可以将T细胞的特异性重定向至人CD19。在实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scFv)，后者包含通过柔性连接体如甘氨酸-丝氨酸连接体或Whitlow连接体连接的靶抗原特异性单克隆抗CD19抗体的可变域轻链(VL)和可变域重链(VH)。在实施方案中，scFv是SJ25C1和/或FMC63。在实施方案中，scFv是人源化的。在一些实施方案中，抗原结合部分可包含定向连接的VH和VL，例如，从N到C末端、VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。
在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR，其中抗原结合域包含结合CD19的scFv。在一些情况下，抗原结合域识别CD19上的表位。
在一些实施方案中，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被JCAR014、JCAR015、JCAR017或19-28z CAR(Juno Therapeutics)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR-T细胞，其中抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被JCAR014、JCAR015、JCAR017或19-28z CAR(Juno Therapeutics)识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文描述的包括包含scFv抗原结合域的CD19特异性CAR-T细胞，并且抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被JCAR014、JCAR015、JCAR017或19-28zCAR(Juno Therapeutics)识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞包含US20160152723中描述的抗CD19抗体。
在一些实施方案中，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被KTE-C19(KitePharma，Inc.)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR-T细胞，其中抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被KTE-C19识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文描述的包括包含scFv抗原结合域的CD19特异性CAR-T细胞，并且抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被KTE-C19识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞包含WO2015187528中描述的抗CD19抗体或其片段或衍生物。
在一些实施方案中，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被CTL019(Novartis)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR-T细胞，其中抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被CTL019识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文描述的包括包含scFv抗原结合域的CD19特异性CAR-T细胞，并且抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被CTL019识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被UCART19(Cellectis)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR-T细胞，其中抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被UCART19识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文描述的包括包含scFv抗原结合域的CD19特异性CAR-T细胞，并且抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被UCART19识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被BPX-401(Bellicum)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR-T细胞，其中抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被BPX-401识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文描述的包括包含scFv抗原结合域的CD19特异性CAR-T细胞，并且抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被BPX-401识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些情况下，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被兰妥莫单抗(Amgen)、克托西单抗(coltuximabravtansine)(ImmunoGen Inc./Sanofi-aventis)、MOR208(Morphosys AG/Xencor Inc.)、MEDI-551(Medimmune)、地宁图珠单抗(denintuzumabmafodotin)(Seattle Genetics)、B4(或DI-B4)(Merck Serono)、泰普利莫单抗(taplitumomabpaptox)(National Cancer Institute)、XmAb 5871(Amgen/Xencor，Inc.)、MDX-1342(Medarex)或AFM11(Affimed)识别。在一些情况下，CD19特异性CAR进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR-T细胞，其中抗原结合域包含F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。在一些情况下，抗原结合域识别CD19上的表位。在一些情况下，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被兰妥莫单抗(Amgen)、克托西单抗(ImmunoGen Inc./Sanofi-aventis)、MOR208(Morphosys AG/Xencor Inc.)、MEDI-551(Medimmune)、地宁图珠单抗(Seattle Genetics)、B4(或DI-B4)(Merck Serono)、泰普利莫单抗(National Cancer Institute)、XmAb 5871(Amgen/Xencor，Inc.)、MDX-1342(Medarex)或AFM11(Affimed)识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些情况下，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞包含scFv抗原结合域，并且抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被兰妥莫单抗(Amgen)、克托西单抗(ImmunoGen Inc./Sanofi-aventis)、MOR208(Morphosys AG/Xencor Inc.)、MEDI-551(Medimmune)、地宁图珠单抗(Seattle Genetics)、B4(或DI-B4)(Merck Serono)、泰普利莫单抗(National CancerInstitute)、XmAb 5871(Amgen/Xencor，Inc.)、MDX-1342(Medarex)或AFM11(Affimed)识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO 210的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的CD19特异性CAR(CD19-CD8α-CD28-CD3ζ)。在实施方案中，本文描述的CAR包含与SEQ ID NO 211的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的CD19特异性CAR(具有信号肽的CD19-CD8α-CD28-CD3ζ)。
在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对CD19是特异性的。当CD19特异性CAR在细胞表面上表达时，其将T细胞的特异性重定向至人CD19。在实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scFv)，后者包含通过柔性连接体如甘氨酸-丝氨酸连接体或Whitlow连接体连接的靶抗原特异性单克隆抗CD19抗体的可变域轻链(VL)和可变域重链(VH)。在实施方案中，scFv是具有whitlow连接体的抗CD19克隆FMC63 scFv(SEQ ID NO213)。在实施方案中，抗CD19抗体包含抗CD19单克隆抗体克隆FMC63可变重链(SEQ IDNO212)。在一些实施方案中，抗原结合部分可包含定向连接的VH和VL，例如，从N到C末端、VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。
工程化T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，由本文描述的多核苷酸编码的嵌合受体包含工程化T细胞受体。T细胞受体(TCR)由两条链(αβ或γδ)组成，这两条链在T细胞表面上配对以形成异二聚体受体。在一些情况下，αβTCR在体内的大多数T细胞上表达，并且已知参与特定MHC限制性抗原的识别。每条α和β链由两个结构域组成：恒定域(C)，其将蛋白质锚定至细胞膜并与CD3信号传导器的不变亚单位缔合；以及可变域(V)，其通过称为互补决定区(CDR)的六个环赋予抗原识别。在一些情况下，每个V结构域包含三个CDR；例如，CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR3作为高变区。这些CDR与抗原肽结合至由主要组织相容性复合物(pepMHC)编码的蛋白质而形成的复合物(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA或HLA-DRB1复合物)相互作用。在一些情况下，恒定域进一步包含将恒定域连接到可变域的接合区。在一些情况下，β链进一步包含构成接合区的一部分的较短的多样性区域。
在一些情况下，这样的TCR对特定肿瘤抗原(例如NY-ESO、Mage A3、Titin)具有反应性。在其它情况下，这样的TCR对患者肿瘤内表达的特定新抗原(即，由肿瘤表达的患者特异性突变、体细胞突变、非同义突变)具有反应性。在一些情况下，工程化TCR可以是亲和力增强的。
在一些实施方案中，使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法描述TCR，并且该TCR链接至TCR序列的IMGT公共数据库。例如，可存在几种类型的α链可变(Vα)区和几种类型的β链可变(Vβ)区，按其框架、CDR1、CDR2和CDR3序列区分。因此，Vα类型可以在IMGT命名法中指代为独特的TRAV编号。例如，“TRAV21”定义了具有独特框架和CDR1和CDR2序列以及CDR3序列的TCR Vα区域，该CDR3序列由在TCR之间保守的氨基酸序列部分限定但也包括在TCR之间变化的氨基酸序列。类似地，“TRBV5-1”定义了具有独特框架和CDR1和CDR2序列以及仅部分限定的CDR3序列的TCR Vβ区域。
在一些情况下，β链多样性区域在IMGT命名法中用缩写TRBD表示。
在一些情况下，由IMGT命名法定义的独特序列是公知的，并且可供TCR领域的工作人员访问。例如，它们可见于IMGT公共数据库和“T cell Receptor Factsbook”，(2001)LeFranc和LeFranc，Academic Press，ISBN 0-12-441352-8中。
在一些实施方案中，例如，αβ异二聚体TCR作为具有胞质域和跨膜结构域的全长链转染。在一些情况下，TCR在相应恒定域的残基之间含有引入的二硫键，如例如WO 2006/000830中所述。
在一些情况下，本文所述的TCR是单链形式，例如参见WO2004/033685。单链形式包括Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ、Vα-Cα-L-Vβ-Cβ类型的αβ TCR多肽，其中Vα和Vβ分别是TCR α和β可变区，Cα和Cβ分别是TCR α和β恒定区，并且L是连接体序列。在某些实施方案中，本公开的单链TCR可以在相应恒定域的残基之间具有引入的二硫键，如WO2004/033685中所述。
本文所述的TCR可以与可检测标记、治疗剂或PK修饰部分缔合。
用于诊断目的的示例性可检测标记包括但不限于荧光标记、放射性标记、酶、核酸探针和造影剂。
其它遗传元件
尽管细胞疗法对于人类疾病的治疗具有很大的希望，但细胞本身或其转基因产物带来的显著毒性阻碍了临床研究。在本文所述的实施方案中，可以消除已经输注到哺乳动物受试者例如人中的包含本文所述的CAR或TCR的免疫效应细胞，以便调节这类免疫效应细胞的效果，如果它们的使用会产生毒性的话。因此，在某些实施方案中，除了本文所述的特异性嵌合抗原受体之外，还将第二基因引入本文所述的工程化免疫效应细胞中。第二基因实际上是“杀伤开关”或“细胞标签”，其允许CAR或TCR或含有抗原结合多肽的细胞的消耗。在某些实施方案中，“杀伤开关”是截短的HER1肽(本文称为HER1t或EGFRt)，其至少包含HER1的抗体结合表位或其功能片段，和可选的信号多肽序列或其片段。
在某些实施方案中，第二基因是HER1标签，其为表皮生长因子受体(HER1)或其片段或变体。在实施方案中，第二基因是HER1标签，其为截短的人表皮生长因子受体1(例如HER1t)(SEQ ID NO 76；SEQ ID NO 189)。在一些情况下，第二基因是截短的人表皮生长因子受体1的变体。在一些情况下，截短的HER1的变体是HER1t1(SEQ ID NO 77；SEQ ID NO190)、HER1t2(SEQ ID NO 78；SEQ ID NO 191)、HER1t3(SEQ ID NO 79；SEQ ID NO 192)、HER1t4(SEQ ID NO 80；SEQ ID NO 193)、HER1t5(SEQ ID NO 81；SEQ ID NO 194)、HER1t6(SEQ ID NO 82；SEQ ID NO 195)、HER1t7(SEQ ID NO 83；SEQ ID NO 196)、HER1t8(SEQ IDNO 84；SEQ ID NO 197)、HER1t9(SEQ ID NO 85；SEQ ID NO 198)、HER1t10(SEQ ID NO 86；SEQ ID NO 199)或HER1t11(SEQ ID NO 87；SEQ ID NO 200)。在实施方案中，HER1、HER1t、HER1t1、HER1t2、HER1t3、HER1t4、HER1t5、HER1t6、HER1t7、HER1t8、HER1t9、HER1t10和HER1t11中的至少一种通过允许通过施用FDA批准的西妥昔单抗或识别HER1、HER1t、HER1t1、HER1t2、HER1t3、HER1t4、HER1t5、HER1t6、HER1t7、HER1t8、HER1t9、HER1t10和/或HER1t11的任何抗体来消耗输注的CAR-T细胞而提供安全性机制。
在实施方案中，HER1t基因包含与SEQ ID NO：76的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，HER1t1基因包含与SEQ ID NO：77的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，HER1t2基因包含与SEQ ID NO：78的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，HER1t3基因包含与SEQ ID NO：79的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，HER1t4基因包含与SEQ ID NO：80的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，HER1t5基因包含与SEQ ID NO：81的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，HER1t6基因包含与SEQ ID NO：82的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，HER1t7基因包含与SEQ IDNO：83的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，HER1t8基因包含与SEQ ID NO：84的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，HER1t9基因包含与SEQ ID NO：85的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，HER1t10基因包含与SEQ ID NO：86的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，HER1t11基因包含与SEQ ID NO：87的酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
截短的HER1序列，例如HER1t、HER1t1、HER1t2、HER1t3、HER1t4、HER1t5、HER1t6、HER1t7、HER1t8、HER1t9、HER1t10和/或HER1t11，消除了EGFR配体结合、EGFR的同源和异源二聚化和EGFR介导的信号传导的可能性，同时保持西妥昔单抗与完整受体结合(Ferguson，K.，2008.A structure-based view of Epidermal Growth Factor Receptorregulation.Annu Rev Biophys，Volume 37，pp.353-373)。
在进一步的实施方案中，除了本公开的治疗性靶标特异性嵌合抗原受体之外，引入的第二基因还有HER1标签。在某些情况下，HER1标签是全长HER1多肽或截短的HER1多肽(HER1t1)、HER1t2、HER1t3、HER1t4、HER1t5、HER1t6、HER1t7、HER1t8、HER1t9、HER1t10或HER1t11。在一些情况下，HER1标签是截短的HER1变体。在一些情况下，HER1标签，例如HER1、HER1t1、HER1t2、HER1t3、HER1t4、HER1t5、HER1t6、HER1t7、HER1t8、HER1t9、HER1t10或HER1t11，还通过允许通过施用FDA批准的利妥昔单抗疗法消耗输注的CAR-T细胞来提供安全性机制。在某些实施方案中，HER1标签具有与SEQ ID NO：189的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，HER1标签是HER1t1标签，并且具有与SEQ ID NO：190的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，HER1标签是HER1t2标签，并且具有与SEQ ID NO：191的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，HER1标签是HER1t3标签，并且具有与SEQ ID NO：192的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，HER1标签是HER1t4标签，并且具有与SEQ ID NO：193的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，HER1标签是HER1t5标签，并且具有与SEQ ID NO：194的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，HER1标签是HER1t6标签，并且具有与SEQ ID NO：195的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，HER1标签是HER1t7标签，并且具有与SEQ ID NO：196的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，HER1标签是HER1t8标签，并且具有与SEQ ID NO：197的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，HER1标签是HER1t9标签，并且具有与SEQ ID NO：198的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，HER1标签是HER1t10标签，并且具有与SEQ ID NO：199的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。在某些实施方案中，HER1标签是HER1t11标签，并且具有与SEQ ID NO：200的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽序列。
在某些实施方案中，第二基因是CD20标签(SEQ ID NO 88；SEQID NO 201)，它是活化的糖基化磷蛋白或其片段或变体。在一些情况下，第二基因是截短的CD20的变体——CD20t1(SEQ ID NO 89；SEQ ID NO202)。在实施方案中，CD20标签、CD20标签的变体(CD20t1)或CD20或CD20t1标签的片段通过允许通过施用识别CD20的抗体消耗输注的CAR-T细胞而提供安全性机制。在实施方案中，编码CD20标签的基因包含与SEQ ID NO：88的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，编码CD20t1标签的基因包含与SEQ ID NO：89的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在进一步的实施方案中，除了本公开的治疗性靶标特异性嵌合抗原受体之外，引入的第二基因还有CD20标签。在一些情况下，CD20标签是全长CD20多肽或截短的CD20多肽(CD20t1)。
在实施方案中，包含本文所述CAR的CAR载体进一步包含全长CD20标签，后者包含与SEQ ID NO：88的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在实施方案中，包含本文所述CAR的CAR载体进一步包含CD20标签的变体(CD20t1)，后者包含与SEQ ID NO：89的核酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。
在实施方案中，编码杀伤标签如HER1t、HER1t1、HER1t2、HER1t3、HER1t4、HER1t5、HER1t6、HER1t7、HER1t8、HER1t9、HER1t10或HER1t11的基因通过采用自切割肽，例如但不限于Thosea asigna病毒(T2A)肽，与CAR或TCR或细胞因子符合读框地遗传融合。在实施方案中，T2A肽具有与SEQ ID NO 153的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在其它实施方案中，编码杀伤标签如HER1t、HER1t1、HER1t2、HER1t3、HER1t4、HER1t5、HER1t6、HER1t7、HER1t8、HER1t9、HER1t10或HER1t11的基因通过采用自切割肽，例如但不限于Thosea asigna病毒(T2A)肽，与细胞因子在3′端符合读框地遗传融合。
在实施方案中，将两种基因均克隆到质粒中。在其它实施方案中，将细胞标签克隆到单独的慢病毒载体中。在其它实施方案中，将细胞标签基因克隆到睡美人转座子载体骨架中，与CAR基因符合读框。在其它实施方案中，将细胞标签如HER1t、HER1t1、HER1t2、HER1t3、HER1t4、HER1t5、HER1t6、HER1t7、HER1t8、HER1t9、HER1t10或HER1t11克隆到多个睡美人转座子载体中。
在某些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如GM-CSFRα信号肽，其中该GM-CSFRα信号肽与SEQ ID NO：163的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在某些实施方案中，信号肽是IgK，其具有与SEQ ID NO：164的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，信号肽是IgE，其具有与SEQ ID NO：165的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，信号肽是CD8α，其具有与SEQ ID NO：166的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，信号肽是TVB2(T21A)，其具有与SEQ ID NO：167的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，信号肽是CD52，其具有与SEQ ID NO：168的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在某些实施方案中，信号肽是低亲和力神经生长因子受体(LNGFR，TNFRSF16)，其具有与SEQ ID NO：169的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些情况下，信号肽可选自GM-CSFRα、IgK、IgE、CD8α、T21A、CD52、低亲和力神经生长因子受体变体及其片段。
在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如GM-CSFRα信号肽，其中该GM-CSFRα信号肽由与SEQ ID NO 20或SEQ ID NO 21的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如IgK信号肽，其中该IgK信号肽由与SEQ ID NO22的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如IgE信号肽，其中该IgK信号肽由与SEQ ID NO 23的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如CD8α信号肽，其中该CD8α信号肽由与SEQ ID NO 24或SEQ ID NO 25的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如TVB2(T21A)信号肽，其中该TVB2(T21A)信号肽由与SEQ ID NO 26的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如CD52信号肽，其中该信号肽CD52信号肽由与SEQ ID NO 27的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，细胞标签具有信号肽，例如，低亲和力神经生长因子受体(LNGFR，TNFRSF16)信号肽，其中该低亲和力神经生长因子受体(LNGFR，TNFRSF16)信号肽由与SEQ ID NO 28的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列编码。
信号肽是通常位于新合成的蛋白质或多肽的N-末端的氨基酸序列，其将蛋白质或多肽引导至细胞表面。在一些实施方案中，信号肽将多肽引导至细胞表面，以便插入(例如，通过跨膜结构域)细胞膜内。在一些实施方案中，合成具有信号肽的本文所述的多肽构建体，但随后翻译后加工以切割信号肽，使得成熟多肽构建体缺乏信号肽氨基酸序列。在其它实施方案中，信号肽序列不被切割，而是保留在成熟多肽构建体中。
本公开内容提供了包含能够将多肽构建体引导和/或运输至细胞表面的任何已知或未知信号肽的多肽构建体。例如，在一些实施方案中，多肽构建体包含对应于GMCSFRα、Igκ、免疫球蛋白E、CD8α、TVB2(T21A)、CD52或低亲和力神经生长因子受体(LNGFR，TNFRSF16)的信号肽的信号序列。
在实施方案中，信号肽由包含核苷酸序列的多核苷酸编码，该核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：20-28组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，信号肽包含与选自由SEQ ID NO：163-169组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
经修饰的效应细胞
提供了经修饰以表达一种或多种异源基因或由本文公开的基因开关多肽调节的基因的效应细胞(也称为免疫效应细胞)。
如本文所用的“T细胞”或“T淋巴细胞”是在细胞介导的免疫中起重要作用的一种类型的淋巴细胞。它们与其它淋巴细胞如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的区别可在于在细胞表面上存在T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，经修饰的效应细胞是包含T细胞和/或自然杀伤细胞的经修饰的免疫细胞。T细胞或T淋巴细胞是参与细胞介导的免疫的白细胞亚型。示例性T细胞包括T辅助细胞、细胞毒性T细胞、TH17细胞、记忆性干细胞样T细胞(TSCM)、幼稚T细胞、记忆T细胞、效应T细胞、调节性T细胞或自然杀伤T细胞。
“T辅助细胞”(TH细胞)在免疫过程中协助其它白细胞，该免疫过程包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化。在一些情况下，由于CD4糖蛋白在细胞表面上的表达，TH细胞被称为CD4+T细胞。辅助性T细胞在通过MHC II类分子呈递肽抗原时被活化，该MHC II类分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。辅助性T细胞一旦被活化，就迅速分裂并分泌出被称为细胞因子的小蛋白质，该细胞因子调节或协助主动免疫应答。这些细胞可以分化成几种亚型中的一种，包括TH1、TH2、TH3、TH17、TH9或TFH，这些亚型分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。来自APC的信号传导将T细胞引导至特定的亚型。
“细胞毒性T细胞”(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还参与移植排斥。这些细胞也被称为CD8+T细胞，因为其在表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与MHC I类分子缔合的抗原而识别它们的靶标，该MHC I类分子存在于所有有核细胞的表面上。通过IL-10、腺苷和由调节性T细胞分泌的其它分子，CD8+细胞可以被灭活至无反应状态，从而防止自身免疫性疾病。
“记忆T细胞”是在感染消退后长期持续存在的抗原特异性T细胞的一个亚群。其在重新暴露于其同源抗原后迅速扩充成大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对以往感染的“记忆”。记忆T细胞包括以下亚型：干细胞记忆性T细胞(TSCM)、中枢记忆性T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞可以表达细胞表面蛋白质CD45RO、CD45RA和/或CCR7。
“调节性T细胞”(Treg细胞)，以前称为抑制性T细胞，在维持免疫耐受性中起作用。其主要作用是在免疫反应结束时停止T细胞介导的免疫，并抑制逃避胸腺中的阴性选择过程的自身反应性T细胞。
“自然杀伤T细胞”(NKT细胞)将先天免疫系统与适应性免疫系统联系起来。与识别由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞不同，NKT细胞识别由被称为CD1d的分子呈递的糖脂抗原。一旦被活化，这些细胞可以执行属于Th细胞和Tc细胞的功能(即，细胞因子产生和细胞溶解/细胞杀伤分子的释放)。它们还能够识别并消除一些肿瘤细胞和感染疱疹病毒的细胞。自然杀伤(NK)细胞是先天免疫系统的一种类型的细胞毒性淋巴细胞。在一些情况下，NK细胞提供针对病毒感染和/或肿瘤形成的第一线防御。NK细胞可检测被感染细胞或癌细胞上呈递的MHC，从而触发细胞因子释放，随后诱导裂解和凋亡。NK细胞可以在不存在抗体和/或MHC的情况下进一步检测应激的细胞，从而允许快速免疫应答。
经修饰的效应细胞剂量
在一些实施方案中，将一定量的经修饰的效应细胞施用于有需要的受试者，并且基于功效和诱导细胞因子相关毒性的潜力来确定该量。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约108个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106至约108个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约107至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106至约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约107至约108个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约108至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约108个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105个经修饰的效应细胞/kg。
在一些实施方案中，经修饰的效应细胞是经修饰的T细胞。在一些情况下，经修饰的T细胞是CAR-T细胞。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约105至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约105至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约105至约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约106至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约106至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约107至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约105至约106个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约106至约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约107至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约108至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约106个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约105个CAR-T细胞/kg。
在一些实施方案中，CAR-T细胞是CD19特异性CAR-T细胞。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约105至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约105至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约105至约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约106至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约106至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约107至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约105至约106个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约106至约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约107至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约108至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约106个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约105个CAR-T细胞/kg。
在一些实施方案中，经修饰的T细胞是工程化TCR T细胞。在一些情况下，一定量的工程化TCR T细胞包含约105至约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约105至约108个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约105至约107个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约106至约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约106至约108个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约107至约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约105至约106个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约106至约107个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约107至约108个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约108至约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约108个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约107个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约106个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约105个TCR细胞/kg。
适应证
在一些实施方案中，本文公开了向患有病症(例如癌症或传染病)的受试者施用编码本文所述多核苷酸的经修饰的效应细胞的方法。在一些情况下，该癌症是与CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123或VEGF-R2的表达相关的癌症。
在一些实施方案中，本文公开了向患有与CD19过表达相关的癌症的受试者施用多核苷酸、多肽或编码本文所述多核苷酸的修饰的效应细胞的方法。在一些实施方案中，本文公开了向患有与CD33过表达相关的癌症的受试者施用经修饰的效应细胞的方法。在一些实施方案中，本文公开了向患有与CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123或VEGF-R2的过表达相关的癌症的受试者施用经修饰的效应细胞的方法。在一些情况下，该癌症是转移性癌症。在其它情况下，该癌症是复发性或难治性癌症。
在一些情况下，癌症是实体瘤或血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是实体瘤。在其它情况下，该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是转移性癌症。在一些情况下，该癌症是复发性或难治性癌症。
在一些情况下，所述癌症是实体瘤。示例性实体瘤包括但不限于肛门癌；阑尾癌；胆道癌(即胆管癌)；膀胱癌；脑肿瘤；乳腺癌；宫颈癌；结肠癌；原发灶不明癌(CUP)；食道癌；眼癌；输卵管癌；胃肠癌；肾癌；肝癌；肺癌；髓母细胞瘤；黑素瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；甲状旁腺疾病；阴茎癌；垂体瘤；前列腺癌；直肠癌；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；喉癌；甲状腺癌；子宫癌；阴道癌；外阴癌；或胶质母细胞瘤。
“胶质母细胞瘤”或“多形性胶质母细胞瘤”(GBM)是一种侵袭性神经上皮脑癌。GBM可以源自神经胶质型细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞或神经干细胞。已经鉴定出四种胶质母细胞瘤亚型。经典亚型(大多数GBM)携带表皮生长因子受体(EGFR)基因的额外拷贝，并且大多数具有高于正常的表皮生长因子受体(EGFR)表达。在一部分病例中，EGFR扩增伴随着基因重排，其中最常见的是EGFR变体III(EGFRvIII)。经常在胶质母细胞瘤中突变的基因TP53(p53)在经典亚型中很少发生突变。原神经亚型通常具有TP53(p53)和PDGFRA(编码血小板衍生生长因子受体A的基因)和IDH1(编码异柠檬酸脱氢酶-1的基因)的高变化率。间充质亚型的特征在于NF1(编码神经纤维瘤蛋白1的基因)中的高突变或其它改变率，和EGFR基因中的较少改变以及EGFR低于其它类型的表达。神经亚型的特点为神经元标志物如NEFL、GABRA1，SYT1和SLC12A5的表达。已经描述了胶质母细胞瘤中的其它遗传改变，并且它们中的大多数聚集在两个途径中，即RB和PI3K/AKT。胶质母细胞瘤分别在68-78％和88％的这些途径中具有改变。
在一些情况下，所述癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，血液系统恶性肿瘤包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或B细胞恶性肿瘤。在一些情况下，血液系统恶性肿瘤包括淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。在一些情况下，示例性血液系统恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、高危CLL、非CLL/SLL淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病(PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高等级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，血液系统恶性肿瘤包括髓样白血病。在一些实施方案中，血液系统恶性肿瘤包括急性髓样白血病(AML)或慢性髓样白血病(CML)。
在一些情况下，本文公开了向患有血液系统恶性肿瘤的受试者施用本文所述的经修饰的效应细胞的方法，该血液系统恶性肿瘤选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、高危CLL、非CLL/SLL淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病(PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高等级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些情况下，本文公开了向患有选自AML或CML的血液系统恶性肿瘤的受试者施用经修饰的效应细胞的方法。
在其它情况下，本文公开了向具有传染病引起的感染的受试者施用的方法。传染病可以是由细菌、病毒或真菌感染引起的疾病。在其它情况下，示例性病毒病原体包括以下科的病毒病原体：腺病毒科、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、JC病毒、BK病毒、HSV病毒科、HHV病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头多瘤空泡病毒科、多瘤病毒、弹状病毒科和披膜病毒科。示例性的致病病毒引起天花、流感、流行性腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉和风疹。示例性的致病真菌包括假丝酵母属、曲霉属、隐球酵母属、组织胞浆菌属、肺囊虫属和葡萄穗霉属。示例性的致病细菌包括链球菌属、假单胞菌属、志贺菌属、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、螺杆菌属、大肠杆菌、立克次体属、芽孢杆菌属、博德特氏菌属、衣原体属、螺旋体属和沙门菌属。
基于病毒的递送系统
本发明还提供了递送系统，如基于病毒的系统，其中插入了本文所述的核酸。代表性的病毒表达载体包括但不限于腺相关病毒载体、基于腺病毒的载体(例如，可从Crucell，Inc.(Leiden，The Netherlands)获得的基于腺病毒的Per.C6系统)、基于慢病毒的载体(例如，来自Life Technologies(Carlsbad，Calif.)的基于慢病毒的pLPI)、逆转录病毒载体(例如，pFB-ERV加pCFB-EGSH)和基于疱疹病毒的载体。在一个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为其允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体比衍生自致癌逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有额外优势，因为其可以转导非增殖细胞如肝细胞。慢病毒载体还具有低免疫原性的额外优势。在另外的实施方案中，病毒载体是腺相关病毒载体。在进一步的实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。通常来说，并且在实施方案中，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；以及美国专利6,326,193)。
其它合适的载体包括整合表达载体，其可以随机整合到宿主细胞的DNA中，或者可以包括重组位点以实现表达载体与宿主细胞染色体之间的特异性重组。这样的整合表达载体可利用宿主细胞染色体的内源表达控制序列来实现所需蛋白质的表达。以位点特异性方式整合的载体的实例包括，例如，来自Invitrogen(Carlsbad，Calif.)的flp-in系统的组分(例如，pcDNATM5/FRT)，或例如可见于来自Stratagene(La Jolla，Calif.)的pExchange-6核心载体中的cre-lox系统。随机整合到宿主细胞染色体中的载体的实例包括，例如，来自Invitrogen(Carlsbad，Calif.)的pcDNA3.1(当在没有T-抗原的情况下引入时)和来自Promega(Madison，Wis.)的pCI或pFN10A(ACT)FLEXTTM。额外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。尽管最近已示出许多启动子也包含在起始位点下游的功能元件，但通常这些启动子元件位于起始位点上游30-110bp的区域。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至相隔50bp。似乎单个元件可以协同或独立地起作用以激活转录，这取决于启动子。
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。
合适的启动子的另一实例是人延伸生长因子1α1(hEF1a1)。在实施方案中，包含本公开的CAR和/或TCR的载体构建体包含hEF1a1功能变体。
然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本公开内容不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被考虑为本公开内容的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，其能够开启可操作地连接的多核苷酸序列的表达(当需要这样的表达时)，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
诱导型启动子的其它实例包括但不限于本文所述的组织特异性启动子。在一些实施方案中，启动子包含NF-κB结合位点(SEQ ID NO 44-46)、活化T细胞核因子(NFAT)应答元件(SEQ ID NO 51)、6位点GAL4-诱导型近端因子结合元件(PFB)(SEQ ID NO 62)或基于RPL6的合成5’UTR(SEQ ID NO 64)。在某些实施方案中，启动子可以是以下任何一种或多种：IL-2核心启动子、IL-2最小启动子、IL-2增强子和启动子变体、(NF-κB)1-IL2启动子变体、(NF-κB)3-IL2启动子变体、(NF-κB)6-IL2启动子变体、1X NFAT应答元件-IL2启动子变体、3XNFAT应答元件-IL2启动子变体、6X NFAT应答元件-IL2启动子变体、人EEF1A1启动子变体、人EEF1A1启动子和增强子、人UBC启动子和合成的最小启动子1。在某些实施方案中，启动子核苷酸包括表2中公开的那些。
为了评估CAR或TCR多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可含有选择标记基因或报告基因或两者，以便于从试图通过病毒载体来转染或感染的细胞群体中鉴别和选择表达细胞。在其它方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。选择标记和报告基因都可以侧接适当的调节序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素抗性基因如新霉素抗性基因(neo)和氨苄青霉素抗性基因等。在一些实施方案中，截短的表皮生长因子受体(HER1t)标签可用作选择标记基因。
报告基因可用于鉴定潜在转染的细胞和评价调节序列的功能。通常，报告基因是不存在于接受体生物体或组织中且不由其表达的基因，其编码多肽，该多肽的表达通过一些易于检测的性质(例如酶活性)表现。在将DNA引入接受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，FEBS Letters 479：79-82(2000))。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或商购获得。通常，示出报告基因最高表达水平的具有最小5′侧翼区的构建体被鉴别为启动子。这样的启动子区可以与报告基因连接，并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些实施方案中，载体包含驱动转基因表达的hEF1a1启动子、增强转录的牛生长激素ployA序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)以及衍生自pFUGW质粒的LTR序列。
将基因引入细胞以及使基因在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，如哺乳动物细胞、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物方式将表达载体转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。例如，参见Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York (2001))。在实施方案中，用于将多核苷酸引入宿主细胞的方法是磷酸钙转染或聚乙烯亚胺(PEI)转染。
用于将目的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入哺乳动物细胞(例如人细胞)中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。
在利用病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(在体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子附接于脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质结合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于在溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“折叠”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪小液滴，以及含有长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma，St.Louis，Mo.获得；双十六烷基磷酸酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview，N.Y.)获得；胆固醇(“Chol”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，Ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。将氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其包括通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征可以在于具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，多层脂质体自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人，Glycobiology 5：505-10(1991))。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。
基于非病毒的递送系统
在一些情况下，还可以使用基于非病毒的递送系统如“睡美人(SB)转座子系统”将编码用于表达本文所述的CAR和/或TCR的基因开关多肽的多核苷酸引入T细胞中，该睡美人转座子系统是指一种合成的DNA转座子系统，用于将DNA序列引入脊椎动物的染色体中。该系统的一些示例性实施例描述于美国专利6,489,458、8,227,432、9,228,180和WO2016/145146中。睡美人转座子系统由睡美人(SB)转座酶和SB转座子组成。在一些实施方案中，睡美人转座子系统可包括SB11转座子系统、SB 100X转座子系统或SB110转座子系统及其任何其它变体。
DNA转座子以简单的剪切-粘贴方式从一个DNA位点易位到另一DNA位点。转座是一个精确的过程，其中限定的DNA片段从一个DNA分子切下并移动到相同或不同DNA分子或基因组中的另一位点。与其它Tc1/mariner型转座酶一样，SB转座酶将转座子插入接受体DNA序列中的TA二核苷酸碱基对中。插入位点可以在相同DNA分子中的其它地方，或在另一DNA分子(或染色体)中。在哺乳动物基因组(包括人基因组)中大约有2亿个TA位点。TA插入位点在转座子整合过程中重复。这种TA序列的重复是转座的标志，并用于确定一些实验中的机理。转座酶可以在转座子内编码，或者转座酶可以由另一来源例如DNA或mRNA来源提供，在该情况下，转座子成为非自主元件。非自主转座子作为遗传工具最有用，因为在插入后它们不能独立地继续切除和重新插入。SB转座子被设想用作非病毒载体，用于将基因引入脊椎动物的基因组中和基因疗法。简言之，睡美人(SB)系统(Hackett等人，Mol Ther 18：674-83，(2010))适用于对T细胞进行遗传修饰(Cooper等人，Blood 105：1622-31，(2005))。这涉及两个步骤：(i)表达SB转座子(即，嵌合抗原受体(CAR)，用于重定向T细胞特异性(Jin等人，Gene Ther18：849-56，(2011)；Kebriaei等人，Hum Gene Ther 23：444-50，(2012))和SB转座酶的DNA质粒的电转移，以及(ii)稳定表达整合体的T细胞在衍生自K562细胞系的设计者人工抗原呈递细胞(AaPC)(也是称为AaPC(活化和扩增细胞))上的增殖和扩充。在一个实施方案中，SB转座子系统包括编码tdIL-15、IL-21和/或嵌合抗原受体的编码序列。这样的系统于例如Singh等人，Cancer Res(8)：68(2008).2008年4月15日和Maiti等人，JImmunother.36(2)：112-123(2013)中有述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，编码CAR或TCR、一种或多种基因开关多肽和mbIL-15的多核苷酸在一个或多个睡美人转座子中编码，并且SB转座酶在单独的载体中编码。在实施方案中，CD19特异性CAR在转座子DNA质粒载体中编码，mb-IL15在第二转座子DNA质粒载体中编码，并且SB转座酶在第三DNA质粒载体中编码。在一些实施方案中，mbIL-15被编码具有细胞标签。细胞标签的实例可包括截短的表皮生长因子受体标签(HER1t)、HER1t1、HER1t2、HER1t3、HER1t4、HER1t5、HER1t6、HER1t7、HER1t8、HER1t9、HER1t10、HER1t11、CD20和CD20t1。用作消耗或杀伤开关或富集标记的CD20标签或其它任何适当的细胞标签。包含细胞标签的非限制性示例性基因开关载体系统在图2A-2D、图3、图19A-19B、图20A、图22、图24A-24D和图25A-25B中示出。
在一些实施方案中，HER1t通过允许通过施用FDA批准的西妥昔单抗或识别HER1t的任何抗体来消耗输注的CAR-T细胞而提供安全性机制。在一些实施方案中，CD20还通过允许通过施用FDA批准的利妥昔单抗疗法消耗输注的CAR-T细胞来提供安全性机制。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本公开的抑制剂的方法是哪一种，为了确认宿主细胞中存在重组DNA序列，可以进行多种试验。这类试验包括，例如，本领域技术人员公知的分子试验，如Southern和Northern印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”试验，如检测是否存在特定肽，例如通过免疫学手段(ELISA和Western印迹法)或通过本文所述的用于鉴别落入本公开内容范围内的药剂的试验。
在实施方案中，使用SB 11转座子系统、SB100X转座子系统、SB110转座子系统，piggyBac转座子系统(参见例如Wilson等人，“PiggyBac Transposon-mediated GeneTransfer in Human Cells.”Molecular Therapy15：139-145(2007)，其通过引用整体并入本文)和/或piggyBac转座子系统(参见例如Mitra等人，“Functional characterizationof piggyBac from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNAtransposon，”Proc.Natl.Acad.Sci USA 110：234-239(2013))将本文所述的经修饰的效应细胞和其它遗传元件递送至细胞。另外的转座酶和转座子系统在美国专利6,489,458；6,613,752，7,148,203；7,985,739；8,227,432；9,228,180；美国专利公开2011/0117072；Mates等人，Nat Genet，41(6)：753-61(2009).doi：10.1038/ng.343.2009年5月3日电子发表，Gene Ther.，18(9)：849-56(2011).doi：10.1038/gt.2011.40.2011年3月31日电子发表，以及Ivics等人，Cell.91(4)：501-10，(1997)中提供，其各自通过引用整体并入本文。
其它合适的非病毒系统可以包括整合表达载体，其可以随机整合到宿主细胞的DNA中，或者可以包括重组位点以使表达载体与宿主细胞染色体之间能够进行特异性重组。将转基因靶向整合到预定义的遗传基因座中是许多应用的理想目标。首先，将位点特异性重组酶的第一重组位点插入基因组位点，无论是随机位置还是预定位置。随后，用携带目的基因或DNA和第二重组位点的质粒和重组酶来源(表达质粒、RNA、蛋白质或病毒表达的重组酶)转染细胞。第一与第二重组位点之间的重组导致质粒DNA的整合。
此类整合表达载体可利用宿主细胞染色体的内源表达控制序列来实现所需蛋白质的表达。在一些实施方案中，通过在供体多核苷酸上存在与整合位点侧翼序列同源的序列来促进靶向整合。例如，使用本文所述的供体多核苷酸的靶向整合可以按照常规转染技术实现，例如，用来通过同源重组产生基因敲除或敲入的技术。在其它实施方案中，通过在供体多核苷酸上存在与整合位点侧翼序列同源的序列，以及通过在位点特异性重组酶的存在下使细胞与供体多核苷酸接触，来促进靶向整合。所谓位点特异性重组酶，或者简称为重组酶，意指催化其相容的重组位点之间的保守位点特异性重组的多肽。如本文所用的，位点特异性重组酶包括天然多肽以及保留活性的衍生物、变体和/或片段，以及编码保留活性的重组酶的天然多核苷酸、衍生物、变体和/或片段。
本文还提供了用于将异源基因整合到宿主细胞中的系统，所述系统包含一个或多个基因表达盒。在一些情况下，该系统包括第一基因表达盒，其包含编码第一多肽构建体的第一多核苷酸。在其它情况下，该系统可包括第二基因表达盒，其包含编码第二多肽构建体的第二多核苷酸。在其它情况下，该系统可包括第三基因表达盒。在一个实施方案中，所述基因表达盒之一可包含编码以下一种或多种的基因开关多核苷酸：(i)反式激活域；(ii)核受体配体结合域；(iii)DNA结合域；和(iv)蜕皮素受体结合域。在另一个实施方案中，该系统还包括重组附着位点；和丝氨酸重组酶；使得在所述丝氨酸重组酶的存在下，在所述宿主细胞与至少所述第一基因表达盒接触时，所述异源基因被整合到所述宿主细胞中。
在一些情况下，所述系统进一步包含配体；使得在所述配体的存在下，在所述宿主细胞接触时，所述异源基因在所述宿主细胞中表达。在一种情况下，该系统还包括重组附着位点。在一些情况下，一个重组附着位点是噬菌体基因组重组附着位点(attP)或细菌基因组重组附着位点(attB)。在一种情况下，宿主细胞是真核细胞。在另一种情况下，宿主细胞是人细胞。在其它情况下，宿主细胞是T细胞或K细胞。
在一个实施方案中，上述系统中的异源基因包含CAR。在一些实施方案中，该CAR结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123或VEGF-R2中的至少一种。
在另一个实施方案中，所述系统包括含有细胞因子的异源基因。在一种情况下，该细胞因子包括IL-15、IL-12、IL-21和IL-15与IL-15Rα的融合体中的至少一种。在一个实施方案中，所述系统包括含有至少一种细胞标签的异源基因。在一种情况下，所述细胞标签包含HER1t和CD20中的至少一种。在一些实施方案中，mbIL-15被编码具有细胞标签。细胞标签的实例可包括截短的表皮生长因子受体标签(HER1t)、CD20标签或用作消耗或杀伤开关或富集标记的其它任何适当的细胞标签。细胞标签的示例性序列如下：
表3.细胞标签氨基酸序列和多核苷酸序列
在进一步的实施方案中，至少一个所述基因表达盒包含编码被反式激活域激活的启动子的多核苷酸。在进一步的实施方案中，所述系统被包含在一个或多个载体中。在一种情况下，所述系统被包含在一个载体中。在一种情况下，第一基因表达盒、第二基因表达盒和重组附着位点被包含在一个载体中。在一种情况下，第一基因表达盒、第二基因表达盒、第三基因表达盒和重组附着位点被包含在一个载体中。在另一种情况下，丝氨酸重组酶是SF370。在其它情况下，丝氨酸重组酶在单独的载体中。
可以在引入靶向载体之前、同时或之后将重组酶引入靶细胞中。重组酶可以作为蛋白质直接引入细胞中，例如，使用脂质体、包被的颗粒或显微注射。或者，可以使用合适的表达载体将编码重组酶的多核苷酸(DNA或信使RNA)引入细胞中。上述靶向载体组分可用于构建含有编码感兴趣的重组酶的序列的表达盒。然而，重组酶的表达可以以其它方式调节，例如，通过将重组酶的表达置于可调节启动子(即，可以选择性地诱导或抑制其表达的启动子)的控制下。
用于实施本发明的重组酶可以如前所述重组产生或纯化。具有所需重组酶活性的多肽可通过蛋白质硫酸铵沉淀、纯化领域中已知的方法纯化至所需纯度水平，包括但不限于大小分级分离、亲和色谱法、HPLC、离子交换色谱法、肝素琼脂糖亲和色谱法(例如，Thorpe&Smith，Proc.Nat.Acad.Sci.95：5505-5510，1998)。
在一个实施方案中，可以将重组酶引入真核细胞中，该真核细胞含有通过任何合适的方法需要重组的重组附着位点。例如通过显微注射或其它方法将功能性蛋白质引入细胞中的方法是本领域熟知的。纯化的重组酶蛋白质的引入确保了蛋白质及其功能的短暂存在，这通常是优选的实施方案。或者，编码重组酶的基因可以被包括在用于转化细胞的表达载体中，其中编码重组酶的多核苷酸与介导多核苷酸在真核细胞中表达的启动子可操作地连接。还可以通过编码重组酶多肽的信使RNA将该重组酶多肽引入真核细胞中。通常优选重组酶仅存在将核酸片段插入被修饰的基因组中所必需的时间。因此，预计缺乏与大多数表达载体相关的持久性并非不利的。可以在引入外源目的多核苷酸之前、之后或同时将重组酶基因引入细胞中。在一个实施方案中，重组酶基因存在于携带待插入的多核苷酸的载体内；重组酶基因甚至可以被包括在多核苷酸内。在其它实施方案中，将重组酶基因引入转基因真核生物中。可以制备转基因细胞或动物，其组成型地或在细胞特异性、组织特异性、发育特异性、细胞器特异性或小分子诱导型或可阻抑型启动子下表达重组酶。重组酶还可以表达为与其它肽、蛋白质、核定位信号肽、信号肽或细胞器特异性信号肽(例如，线粒体或叶绿体转运肽，以促进在线粒体或叶绿体中的重组)的融合蛋白。
例如，重组酶可以来自融合酶或解离酶家族。整合酶重组酶家族具有超过一百个成员，并且包括例如FLP、Cre和λ整合酶。整合酶家族，也称为酪氨酸家族或λ整合酶家族，使用催化酪氨酸的羟基对DNA的磷酸二酯键进行亲核攻击。通常，酪氨酸家族的成员最初在DNA上形成切口，后来形成双链断裂。酪氨酸家族整合酶的实例包括Cre、FLP、SSV1和lambda(λ)整合酶。在解离酶家族(也称为丝氨酸重组酶家族)中，保守的丝氨酸残基与DNA靶位点形成共价连接(Grindley，等人，(2006)Ann Rev Biochem 16：16)。
在一个实施方案中，重组酶是分离的多核苷酸序列，其包含编码重组酶的核酸序列，该重组酶选自SPβc2重组酶、SF370.1重组酶、Bxb1重组酶、A118重组酶和φRv1重组酶。丝氨酸重组酶的实例在美国专利9,034,652中详细描述，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，用于位点特异性重组的方法包括提供第一重组位点和第二重组位点；使第一和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，导致重组位点之间的重组，其中该重组酶多肽可介导第一与第二重组位点之间的重组，第一重组位点是attP或attB，第二重组位点是attB或attP，并且该重组酶选自单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)噬菌体重组酶、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是attB时，第二重组附着位点是attP，并且当第一重组附着位点是attP时，第二重组附着位点是attB。
进一步的实施方案提供将位点特异性重组酶引入其基因组将被修饰的细胞中。一个实施方案涉及用于在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，其包括提供包含第一重组附着位点和第二重组附着位点的真核细胞；使第一和第二重组附着位点与原核重组酶多肽接触，导致在重组附着位点之间的重组，其中该重组酶多肽可介导在第一与第二重组附着位点之间的重组，第一重组附着位点是噬菌体基因组重组附着位点(attP)或细菌基因组重组附着位点(attB)，第二重组附着位点是attB或attP，并且该重组酶选自单核细胞增生李斯特菌噬菌体重组酶、酿脓链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是attB时，第二重组附着位点是attP，并且当第一重组附着位点是attP时，第二重组附着位点是attB。在一个实施方案中，该重组酶选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SPβc2重组酶、φRv1重组酶和Bxb1重组酶。在一个实施方案中，该重组导致整合。
免疫效应细胞来源
在某些方面，本文所述的实施方案包括制备和/或扩充抗原特异性重定向免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞或NK T细胞)的方法，其包括用含有编码CAR的DNA(或RNA)构建体的表达载体转染细胞，然后任选地用饲养细胞、重组抗原或针对受体的抗体刺激细胞，以使细胞增殖。在某些方面，经工程化以表达CAR或TCR的细胞(或细胞群体)是干细胞、iPS细胞、免疫效应细胞或这些细胞的前体。
免疫效应细胞的来源可包括同种异体来源和自体来源。在一些情况下，免疫效应细胞可以从干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)分化。因此，根据实施方案的用于工程化的细胞可以从脐带血、外周血、人胚胎干细胞或iPSC中分离。例如，可以将同种异体T细胞修饰成包括嵌合抗原受体(并且任选地缺乏功能性TCR)。在一些方面，免疫效应细胞是原代人T细胞，如来源于人外周血单核细胞(PBMC)的T细胞。PBMC可以从外周血中收集，或者在用G-CSF(粒细胞集落刺激因子)刺激后从骨髓收集，或从脐带血收集。在(例如，用CAR表达构建体)转染或转导后，可以立即输注细胞或者可以冷冻保存细胞。在某些方面，在转染后，细胞可以在基因转移到细胞后的约1、2、3、4、5天或更多天内作为本体群体离体增殖数天、数周或数月。在另一方面，在转染后，将转染体克隆，并将表现出存在单个整合的或附加体保持的表达盒或质粒以及嵌合抗原受体的表达的克隆离体扩充。选择用于扩充的克隆表现出特异性识别和裂解表达抗原的靶细胞的能力。可以通过用IL-2或结合共同γ链的其它细胞因子(例如IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)刺激来扩充重组T细胞。可以通过用人工抗原呈递细胞刺激来扩充重组T细胞。重组T细胞可以在人工抗原呈递细胞上扩充，或者用与T细胞表面上的CD3交联的抗体如OKT3扩充。可以使用基于磁珠的分离方法和/或荧光激活细胞分选技术进一步选择重组T细胞的亚组，并将其进一步与AaPC一起培养。在另一方面，可以冷冻保存经遗传修饰的细胞。
T细胞也可以从许多来源获得，包括外周血、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤(肿瘤浸润淋巴细胞)。在本公开的某些实施方案中，可以使用本领域可获得的任何数目的T细胞系。在本公开的某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何技术如分离从采集自受试者的血液单位获得T细胞。在实施方案中，来自个体的循环血液的细胞通过单采血液成分术获得。单采产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中，以用于随后的处理步骤。在本公开的一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代的实施方案中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁或者可能缺少许多(即便不是全部)二价阳离子。在没有钙的情况下的初始激活步骤导致放大的激活。本领域普通技术人员将会容易理解，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如根据制造商的说明使用半自动“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液，如无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其它含有或不含缓冲液的盐水溶液中。或者，可以去除单采样品中的不需要的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在另一实施方案中，通过裂解红细胞并消耗单核细胞(例如，通过梯度离心或通过逆流离心淘洗)，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗-CD3/抗-CD28(即，3x28)缀合的珠子(如M-450CD3/CD28 T)一起孵育足够用于所需T细胞的阳性选择的时间段来分离T细胞。在一个实施方案中，该时间段是约30分钟。在进一步的实施方案中，该时间段的范围为30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在进一步的实施方案中，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又一实施方案中，该时间段是10至24小时。在一个实施方案中，孵育时间段是24小时。为了从白血病患者中分离T细胞，使用更长的孵育时间(如24小时)可以增加细胞产率。可以在T细胞与其它细胞类型相比较少的任何情况下，例如在从肿瘤组织或免疫受损的个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的情况下使用更长的孵育时间来分离T细胞。进一步地，使用更长的孵育时间可以提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠子结合的时间，和/或通过增加或减少珠子与T细胞(如本文进一步描述的)的比值，可以在培养开始时或在该过程中的其它时间点优先选择或排除某T细胞亚群。此外，通过增加或减少珠子或其它表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比值，可以在培养起始时或在其它所需时间点优先选择或排除某T细胞亚群。技术人员将会认识到，在本公开的上下文中也可以使用多轮选择。在某些实施方案中，可能需要执行选择程序并在激活和扩充过程中使用“未选择的”细胞。也可使“未选择的”细胞经历进一步轮次的选择。
T细胞群体通过阴性选择的富集可以用针对阴性选择的细胞的特有表面标志物的抗体组合来完成。一种方法是经由负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该负磁性免疫粘附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些实施方案中，T调节细胞被抗CD25缀合的珠子或其它类似的选择方法消耗。
为了通过阳性或阴性选择分离所需的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，如珠子)的浓度。在某些实施方案中，可能需要显著降低珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、35000万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能较弱表达感兴趣的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)或者来自存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群体可能具有治疗价值并且将是需要获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关的实施方案中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒，如珠子)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小。这选择表达大量待与颗粒结合的所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一个实施方案中，使用的细胞浓度是5x106/ml。在其它实施方案中，使用的浓度可以是约1x105/ml至1x106/ml以及其间的任何整数值。
在其它实施方案中，细胞可以在2-10℃或室温下以变化的速度在旋转器上孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可在洗涤步骤后冷冻。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并在这种情况下将会是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃下或液氮中的不受控的速冻。
在某些实施方案中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在使用本公开的方法活化之前使其在室温下静置1小时。
在本公开的上下文中还考虑了在可能需要如本文所述的经扩充细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产品。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩充细胞的来源，并且分离和冷冻所需的细胞如T细胞，以供随后在T细胞疗法中用于将受益于T细胞疗法的任何数目的疾病或病况，例如本文所述的疾病或病况。在一个实施方案中，血液样品或单采物取自大体健康的受试者。在某些实施方案中，血液样品或单采物取自大体健康的受试者，该受试者有发展出疾病的风险但尚未发展出该疾病，并且感兴趣的细胞被分离并冷冻以供随后使用。在某些实施方案中，T细胞可以扩充、冷冻并在随后使用。在某些实施方案中，在任何治疗之前，在诊断如本文所述的特定疾病之后的较短时间内从患者收集样品。在进一步的实施方案中，在任何数目的相关治疗方式前，从受试者的血液样品或单采物中分离细胞，该治疗方式包括但不限于采用诸如以下的药剂的治疗：那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化疗、放射、诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸酯和FK506等免疫抑制剂、抗体或其它免疫清除剂，如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228和辐射。这些药物抑制钙依赖性的磷酸酶——钙依赖磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人，Cell 66：807-815，(1991)；Henderson等人，Immun73：316-321，(1991)；Bierer等人，Curr.Opin.Immun 5：763-773，(1993))。在进一步的实施方案中，为患者分离细胞并将其冷冻，以供随后与骨髓或干细胞移植、使用化学治疗剂如氟达拉滨的T细胞消融疗法、外照射放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH结合使用(例如，在其之前、同时或之后)。在另一实施方案中，细胞预先分离并且可被冷冻以供随后用于在B细胞消融疗法(如与CD20反应的药剂，例如利妥昔单抗)之后的治疗。
在本公开的进一步的实施方案中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗特别是用损害免疫系统的药物治疗之后，在该治疗后不久且在患者通常将从治疗中恢复的时期中，所获得的T细胞的质量可能是最佳的或改善的，因为其有离体扩充的能力。同样地，在使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可以处于植入和体内扩充增强的优选状态。因此，在本公开的上下文中考虑在该恢复期中收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。进一步地，在某些实施方案中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调节方案可用于在受试者体内产生这样的条件，其中特别细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩充是有利的，尤其是在疗法后限定的时间窗口内。示例性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
T细胞的活化和扩充
在某些实施方案中是包含编码用于表达本文所述的白介素、CAR和/或TCR的基因开关多肽的多核苷酸的T细胞。无论是在将T细胞遗传修饰成表达所需CAR之前还是之后，T细胞通常可以使用如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开号20060121005中所述的方法进行活化和扩充。
“过继性T细胞转移”是指肿瘤特异性T细胞的分离和离体或体内扩充，以获得比单独接种疫苗或患者的天然肿瘤应答所获得的更多数目的T细胞。然后将肿瘤特异性T细胞输注到癌症患者体内，试图通过可以攻击和杀死癌的T细胞使其免疫系统具有压倒剩余的肿瘤的能力。有许多形式的过继性T细胞疗法用于癌症治疗；培养肿瘤浸润淋巴细胞或TIL，分离并扩充一种特定的T细胞或克隆，甚至使用经过工程化以有效识别并攻击肿瘤的T细胞。在一些方面，过继性T细胞疗法可以包括经过修饰并立即输注到患者体内的工程化抗原特异性T细胞，从而允许在患者体内发生抗原特异性T细胞的体内扩充。
在一些情况下，本文所述的T细胞通过与已附接有药剂(刺激CD3/TCR复合物相关信号)和配体(刺激T细胞表面上的共刺激分子)的表面接触而活化和/或扩充。特别地，可以如本文所述地刺激T细胞群体，如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与结合钙离子载体的蛋白激酶C激活剂接触(例如，苔藓抑制素)。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，采用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3，B-T3，XR-CD28(Diaclone，Besancon，France)，其可以与本领域公知的其它方法一样使用(Berg等人，TransplantProc.30(8)：3975-3977，(1998)；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：13191328，(1999)；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)：53-63，(1999))。
在某些实施方案中，T细胞的主要刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到相同表面(即，“顺式”排列)或不同表面(即“反式”排列)。或者，可以将一种药剂偶联到表面而另一药剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的药剂结合到细胞表面，并且提供主要激活信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在某些实施方案中，两种药剂可以都在溶液中。在另一实施方案中，药剂可以是可溶形式，并然后交联至表面，如表达Fc受体的细胞或将会与该药剂结合的抗体或其它结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开20040101519和20060034810中的预期用于活化和扩增本公开的T细胞的人工抗原呈递细胞(AaPC)。
在一个实施方案中，将两种药剂固定在珠子上(固定在相同的珠子上，即“顺式”，或者固定在不同的珠子上，即“反式”)。例如，提供主要激活信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，而提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种药剂以相等的分子量共同固定到相同的珠子。在一个实施方案中，用于CD4+T细胞扩充和T细胞生长的与珠子结合的每种抗体使用1∶1的比值。在本公开的某些方面，使用这样的与珠子结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比，使得与使用1∶1的比值观察到的扩充相比，观察到T细胞扩充增加。在一个特定的实施方案中，与使用1∶1的比值观察到的扩充相比，观察到约1倍至约3倍的增加。在一个实施方案中，与珠子结合的CD3抗体：CD28抗体的比值范围为100∶1至1∶100以及其间的所有整数值。在本公开的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3∶CD28比小于1。在本公开的某些实施方案中，与珠子结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比值大于2∶1。在一个特定的实施方案中，与珠子结合的抗体使用1∶100的CD3∶CD28比。在另一实施方案中，与珠子结合的抗体使用1∶75的CD3∶CD28比。在进一步的实施方案中，与珠子结合的抗体使用1∶50的CD3∶CD28比。在另一的实施方案中，与珠子结合的抗体使用1∶30的CD3∶CD28比。在实施方案中，与珠子结合的抗体使用1∶10的CD3∶CD28比。在另一实施方案中，与珠子结合的抗体使用1∶3的CD3∶CD28比。在又一实施方案中，与珠子结合的抗体使用3∶1的CD3∶CD28比。
从1∶500至500∶1以及其间的任何整数值的颗粒与细胞的比值可用于刺激T细胞或其它靶细胞。本领域普通技术人员可以容易理解，颗粒与细胞的比值可以取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，大小较小的珠子只能结合少量细胞，而较大的珠子可以结合许多细胞。在某些实施方案中，细胞与颗粒的比值范围为1∶100至100∶1以及其间的任何整数值，并且在进一步的实施方案中，该比值包括1∶9至9∶1以及其间的任何整数值，也可用于刺激T细胞。如上所述，抗CD3和抗CD28偶联的颗粒与T细胞的导致T细胞刺激的比值可以变化，但是某些值包括1∶100、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1和15∶1，其中一个比值是T细胞/颗粒为至少1∶1。在一个实施方案中，使用1∶1或更小的颗粒：细胞比。在一个特定的实施方案中，颗粒：细胞比为1∶5。在进一步的实施方案中，颗粒：细胞比可以根据刺激的天数而变化。例如，在一个实施方案中，颗粒：细胞比在第一天为1∶1至10∶1，并且之后每天或每隔一天将额外的颗粒添加到细胞，持续至多10天，最终比值为1∶1至1∶10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定实施方案中，颗粒：细胞比在刺激的第一天为1∶1，并且在刺激的第三天和第五天被调整为1∶5。在另一实施方案中，每天或每隔一天添加颗粒，直至第一天的最终比值为1∶1，并且在刺激的第三天和第五天的最终比值为1∶5。在另一实施方案中，颗粒：细胞比在刺激的第一天为2∶1，并且在刺激的第三天和第五天被调整为1∶10。在另一实施方案中，每天或每隔一天添加颗粒，直至第一天的最终比值为1∶1，并且在刺激的第三天和第五天的最终比值为1∶10。本领域技术人员将会理解，多种其它比值可适用于本公开。特别地，比值将根据粒度和细胞大小和类型而变化。
在本公开的进一步的实施方案中，将细胞如T细胞与药剂包被的珠子组合，然后将珠子和细胞分离，并随后培养细胞。在替代的实施方案中，在培养之前，未分离药剂包被的珠子和细胞，而是将其一起培养。在进一步的实施方案中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠子和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
举例来说，可以通过允许抗CD3和抗CD28所附接至的顺磁珠(3x28个珠子)与T细胞接触来连接细胞表面蛋白质。在一个实施方案中，将细胞(例如，104到109个T细胞)和珠子(例如，比值为1∶1的M-450 CD3/CD28 T顺磁珠，或来自Miltenyi Biotec的MicroBeads)在缓冲液例如PBS(无二价阳离子，如钙和镁)中混合。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常罕见并且仅构成0.01％的样品，或者整个样品(即100％)可包含感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数都在本公开的情况的范围内。在某些实施方案中，可能需要显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、35000万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产率、细胞活化和细胞扩充增加。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能较弱低表达感兴趣的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。这样的细胞群体可能具有治疗价值并且在某些实施方案中需要获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在本公开的一个实施方案中，可以将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何整数小时的值。在另一实施方案中，可以将混合物培养21天。在本公开的一个实施方案中，将珠子和T细胞一起培养约8天。在另一实施方案中，将珠子和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适合T细胞培养的条件包括可含有增殖和生存所必需的因子的适当培养基(例如，基本必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，该因子包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充适量血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使T细胞生长和扩充的量的细胞因子的RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包含在实验培养物中，而不包含在待注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CQ2)。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可展现不同的特征。例如，典型的血液或单采的外周血单核细胞产品具有大于细胞毒性T细胞群体或抑制性T细胞群体(TC，CD8+)的辅助T细胞群体(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体体外扩充T细胞产生T细胞群体，该T细胞群体在约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，该T细胞群体包含越来越多的TC细胞群体。因此，根据治疗目的，向受试者输注主要由TH细胞构成的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已经分离了TC细胞的抗原特异性亚组，则将该亚组扩展到更大程度可能是有益的。
进一步地，除了CD4和CD8标志物之外，其它表型标志物显著变化，但在很大程度上，在细胞扩充过程中该变化可再现。因此，这样的再现性使得能够针对特定目的定制激活的T细胞产物。
在一些情况下，将实施方案的免疫效应细胞(例如，T细胞)与活化和增殖细胞(AaPC)共培养，以帮助细胞扩充。AaPC也可称为人工抗原呈递细胞(AaPC)。例如，抗原呈递细胞(APC)可用于制备实施方案的治疗组合物和细胞疗法产品。在一个方面，AaPC可以是转基因K562细胞。关于抗原呈递系统的制备和使用的一般指导，参见例如美国专利6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662；美国专利申请公开2009/0017000和2009/0004142；以及国际公开WO2007/103009，其各自通过引用并入本文。在实施方案的又一方面，培养转基因CAR细胞包括在刺激表达CAR的免疫效应细胞扩充的树突细胞或活化和增殖细胞(AaPC)的存在下培养转基因CAR细胞。在更进一步的方面，AaPC包含在AaPC表面上表达的CAR结合抗体或其片段。在其它实施方案中，AaPC包含在AaPC表面上表达的TCR结合多肽或TCR结合抗体或其片段。在一些情况下，AaPC可以包括活化或共刺激T细胞的其它分子。在一些情况下，其它分子可以包括膜结合的Cγ细胞因子。在更进一步的方面，AaPC被灭活或辐射，或已经过测试并证实不含感染性物质。在更进一步的方面，在AaPC的存在下培养转基因CAR细胞包括在包含可溶性细胞因子如IL-15、IL-21和/或IL-2的培养基中培养转基因CAR细胞。细胞可以以约10∶1至约1∶10、约3∶1至约1∶5、约1∶1至约1∶3(免疫效应细胞比AaPC)或其中可导出的任何范围的比值培养。例如，T细胞和AaPC的共培养物可以是约1∶1、约1∶2或约1∶3的比值。
在一个方面，AaPC可以表达CD137L。在其它方面，AaPC可以进一步表达CD19、CD64、CD86或mIL15。在某些方面，AaPC可以表达至少一种抗CD3抗体克隆，例如OKT3和/或UCHT1。在一个方面，AaPC可以被处理(例如，辐射或丝裂霉素C)以消除其生长潜力。在一个方面，AaPC可能已经过测试并证实不含感染性物质。用于产生这样的AaPC的方法是本领域已知的。在一个方面，将CAR修饰的T细胞群体与AaPC一起培养可以包括以约10∶1至约1∶10、约3∶1至约1∶5、约1∶1至约1∶3(T细胞比AaPC)或其中可导出的任何范围的比值培养细胞。例如，T细胞和AaPC的共培养物可以是约1∶1、约1∶2或约1∶3的比值。在一个方面，培养步骤可以进一步包括用氨基二膦酸盐(例如唑来膦酸)培养。
在进一步的方面，培养和/或刺激CAR-T细胞群体不超过7、14、21、28、35、42、49、56、63或70天。在一些实施方案中，培养和/或刺激CAR-T细胞群体至少0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30天或更多天。在一些实施方案中，培养和/或刺激CAR-T细胞群体至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60天或更多天。在一些实施方案中，培养和/或刺激CAR-T细胞群体至少7、14、21、28、35、42、49、56、63天或更多天。在其它实施方案中，刺激包括CAR-T细胞与AaPC的共培养以促进CAR阳性T细胞的生长。在另一方面，刺激转基因CAR细胞群体不超过：1X刺激、2X刺激、3X刺激、4X刺激、5X刺激、5X刺激、6X刺激、7X刺激、8X刺激、9X刺激或10X刺激。在一些情况下，转基因细胞不在AaPC的存在下离体培养。在一些具体情况下，实施方案的方法进一步包括在转染和/或培养步骤后富集细胞群体中的表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)。富集可以包括荧光激活细胞分选(FACS)和针对CAR表达细胞的分选。在进一步的方面，针对表达CAR的细胞的分选包括使用CAR结合抗体。富集还可以包括CD56+细胞的消耗。在实施方案的又一方面，方法进一步包括冷冻保存转基因CAR细胞群体的样品。
在一些情况下，将AaPC与最佳长度的肽一起孵育，该最佳长度允许肽直接结合MHC分子而无需额外处理。或者，细胞可以表达感兴趣的抗原(即，在不依赖MHC的抗原识别的情况下)。此外，在一些情况下，APC可以表达抗体，该抗体与特定CAR多肽结合或与一般的CAR多肽结合(例如，通用活化和增殖细胞(uAPC))。这样的方法公开于WO/2014/190273中，其通过引用并入本文。除了肽-MHC分子或感兴趣的抗原之外，AaPC系统还可包含至少一种外源辅助分子。可以采用任何合适数目的辅助分子和辅助分子的组合。辅助分子可选自诸如共刺激分子和粘附分子等辅助分子。示例性的共刺激分子包括CD70和B7.1(B7.1以前称为B7，并且也称为CD80)，除其它分子外，它们还与T细胞表面上的CD28和/或CTLA-4分子结合，从而影响例如T细胞扩增、Th1分化、短期T细胞存活和细胞因子分泌，如白介素(IL)-2。粘附分子可包括碳水化合物结合糖蛋白如选择蛋白、跨膜结合糖蛋白如整联蛋白、钙依赖性蛋白质如钙黏着蛋白，以及单次跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白如细胞间粘附分子(ICAM)，其促进例如细胞与细胞或细胞与基质的接触。示例性粘附分子包括LFA-3和ICAM，如ICAM-1。用于选择、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术、方法和试剂例示于例如美国专利6,225,042、6,355,479和6,362,001中，其通过引用并入本文。
选择成为AaPC的细胞优选在细胞内抗原加工、细胞内肽运输和/或细胞内MHC I类或II类分子-肽负载方面存在缺陷，或者是变温的(即，相较于哺乳动物细胞系对温度攻击的敏感性更低)，或具有缺陷和变温性质二者。优选地，选择成为AaPC的细胞还缺乏表达被引入细胞中的外源性MHC I类或II类分子和辅助分子组分的至少一种内源性对应物(例如，如上所述的内源性MHC I类或II类分子和/或内源性辅助分子)的能力。此外，AaPC优选地保留细胞在其修饰以生成AaPC之前所具有的缺陷和变温性质。示例性AaPC由与抗原加工(TAP)缺陷型细胞系如昆虫细胞系相关的转运蛋白构成或衍生。示例性的变温昆虫细胞系是果蝇细胞系，如Schneider 2细胞系(参见例如，Schneider 1972，美国专利6,225,042、6,355,479和6,362,001中提供了用于Schneider 2细胞的制备、生长和培养的说明性方法)。
在一个实施方案中，还使AaPC经历冻融循环。在示例性的冻融循环中，可以通过使容纳AaPC的合适容器与适量的液氮、固体二氧化碳(即干冰)或类似的低温材料接触来冷冻AaPC，使得冷冻迅速发生。然后通过将AaPC从低温材料中取出并暴露于室温条件下，或者通过促进解冻过程(其中采用温水浴或温暖的手来缩短解冻时间)来解冻冷冻的APC。此外，可以将AaPC冷冻并在解冻之前储存一段延长的时间。也可以将冷冻的AaPC解冻并随后在进一步使用前冻干。优选地，可能对冻融程序产生不利影响的防腐剂，如二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)和其它防腐剂不存在于含有经历冻融循环的AaPC的培养基中，或例如通过将AaPC转移到基本上不含这样的防腐剂的培养基中而基本上去除。
在进一步的实施方案中，相对于AaPC的异种核酸和内源核酸可以通过交联而灭活，使得在灭活后基本上不发生细胞生长、复制或核酸表达。在一个实施方案中，AaPC在外源性MHC和辅助分子表达、这些分子在AaPC表面上呈递，以及所呈递的MHC分子负载选定的一种或多种肽之后的某一点处灭活。因此，这样的灭活且负载选定肽的AaPC虽然基本上不能增殖或复制，但保留了选定的肽呈递功能。优选地，交联还产生基本上不含污染微生物(如细菌和病毒)的AaPC，而基本上不降低AaPC的抗原呈递细胞功能。因此，交联保持了重要的AaPC功能，同时有助于减轻对使用AaPC开发的细胞疗法产品的安全性的担忧。对于与交联和AaPC相关的方法，参见例如美国专利申请公开20090017000，其通过引用并入本文。
在某些实施方案中，进一步提供了工程化抗原呈递细胞(APC)。例如，如上所述，这样的细胞可用于使免疫效应细胞离体增殖。在进一步的方面，工程化APC本身可以施用于患者，由此在体内刺激免疫效应细胞的扩充。实施方案的工程化APC本身可用作治疗剂。在其它实施方案中，工程化APC可以用作治疗剂，其可以刺激对靶抗原特异的内源性免疫效应细胞的活化和/或增加对靶抗原特异的过继转移免疫效应细胞的活性或持久性。
如本文所用的，术语“工程化APC”是指包含至少第一转基因的细胞，其中第一转基因编码HLA。这样的工程化APC可以进一步包含用于表达抗原的第二转基因，使得抗原与HLA复合呈递在APC表面。在一些方面，工程化APC可以是呈递抗原的细胞类型(例如，树突细胞)。在进一步的方面，工程化APC可以由通常不呈递抗原的细胞类型如T细胞或T细胞祖细胞(称为“T-APC”)产生。因此，在一些方面，实施方案的工程化APC包含编码靶抗原的第一转基因和编码人白细胞抗原(HLA)的第二转基因，使得HLA与靶抗原的表位复合地在工程化APC的表面上表达。在某些具体方面，在工程化APC中表达的HLA是HLA-A2。
在一些方面，实施方案的工程化APC可以进一步包含编码共刺激分子的至少第三转基因。共刺激分子可以是共刺激细胞因子，其可以是膜结合的Cγ细胞因子。在某些方面，共刺激细胞因子是IL-15，如膜结合的IL-15。在一些进一步的方面，工程化APC可包含经编辑的(删除的)基因。例如，可以编辑抑制基因，如PD-1、LIM-3、CTLA-4或TCR以减少或消除该基因的表达。实施方案的工程化APC可以进一步包含编码任何感兴趣的靶抗原的转基因。例如，靶抗原可以是感染性疾病抗原或肿瘤相关抗原(TAA)。
调节表达的方法
在一个实施方案中，提供了调节工程化细胞中异源基因表达的方法。提供了编码用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关多肽、抗原结合多肽和异源基因的多核苷酸。在一些情况下，所述多核苷酸位于一个或多个基因表达盒中，如图1至16中任一个所示。在另一种情况下，通过病毒或非病毒载体将多核苷酸并入工程化细胞中。病毒载体可包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体。非病毒载体可包括睡美人转座子。在其它情况下，通过重组酶或基因编辑技术将多核苷酸整合到工程化细胞中。重组酶的实例是如本文所述的丝氨酸重组酶。基因编辑技术的实例可包括CRISPR或Argnonaute系统。在本文中，“CRISPR系统”的“CRISPR基因编辑系统”是指任何RNA指导的Cas蛋白介导的过程，其用于将DNA序列的改变靶向至基因组的特定区域。在本文中，“Argonaute基因编辑系统”是指任何单链DNA指导的Argonaute内切核酸酶介导的过程，其用于将DNA序列的改变靶向至基因组的特定区域。
在一些情况下，所述抗原结合多肽可以是抗原结合多肽或配体结合多肽。例如，抗原结合多肽可以是抗体或其片段、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、重链抗体的可变片段(VHH)、CAR或工程化TCR。作为另一个实例，配体结合多肽可以是受体。在某些方面，异源基因是细胞因子。该细胞因子可以是IL-2、IL-15、IL-12、IL-21或IL-15与IL-15R(mbIL-15)的融合体。在某些情况下，该细胞因子是IL-12。例如，IL-12是单链IL-12(scIL-12)、蛋白酶敏感的IL-12、去稳定化的IL-12、膜结合的IL-12、插入的IL-12。在一些情况下，异源基因处于诱导型启动子的控制之下。例如，诱导型启动子是用于基因转录的基因开关配体诱导型启动子。
在某些情况下，所述细胞是工程化细胞。在本文中，工程化细胞是已经从其天然或内源状态修饰的细胞。工程化细胞的实例是本文所述的细胞，其已被修饰(例如，通过将多核苷酸转染到细胞中)。在一些情况下，工程化细胞可以是工程化的免疫效应细胞。
本文提供了调节异源基因表达的方法，其中该异源基因处于配体诱导型启动子的控制下。在一些情况下，该方法在不存在配体的情况下导致异源基因表达的基础水平低或没有。在一种情况下，在用配体诱导异源基因的表达之前，活化工程化细胞。在另一种情况下，通过将细胞暴露于抗原来活化工程化细胞。该抗原可以是被工程化细胞表达的抗原结合多肽识别的抗原。该抗原可以是肿瘤抗原或传染病抗原。
工程化细胞可以暴露于抗原至少：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天。在一些情况下，工程化细胞可以暴露于抗原至少：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时。
在另一种情况下，已经用包含基因开关多肽和目的可诱导基因的载体转导的免疫效应细胞群体(在此在图2A-2D、图3、图19A-19B、图20A、图22、图24A-24D和图25A-25B中描述)用实施方案的工程化AaPC培养和/或刺激至少1X刺激、2X刺激、3X刺激或4X刺激。在一些情况下，工程化AaPC包含被工程化细胞上表达的结合多肽识别的抗原或配体。在最后一次刺激之后，使细胞休息，然后输注到患者体内。然后给患者施用适当剂量的用于诱导型基因开关调节的配体以激活并表达目的基因。在一个方面，该配体是veledimex。另一方面，veledimex以5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg提供。在另一方面，提供较低剂量的veledimex，例如，0.5mg、1mg、5mg、10mg、15mg或20mg。
定点照护
在本公开的一个实施方案中，本文所述的免疫效应细胞在照护点场所处被修饰。在一些情况下，照护点场所位于需要治疗的受试者附近的医院或设施(例如，医疗设施)。受试者经历单采血液成分术，并且获得的外周血单核细胞(PBMC)可以例如通过淘洗来富集。在一种情况下，使用含有人血清白蛋白的缓冲溶液进行淘洗过程。可通过本文所述的选择方法分离免疫效应细胞，如T细胞。在一种情况下，T细胞的选择方法包括对T细胞上的CD3和CD8具有特异性的珠子。在一种情况下，该珠子可以是顺磁珠子。收获的免疫效应细胞可以在修饰前在任何合适的冷冻保存溶液中冷冻保存。免疫效应细胞在输注前可以解冻长达24小时、36小时、48小时、72小时或96小时。解冻的细胞在修饰前可以置于细胞培养缓冲液，例如补充有胎牛血清(FBS)的细胞培养缓冲液(例如RPMI)中，或置于包含IL-2和IL-21的缓冲液中。另一方面，可以立即修饰收获的免疫效应细胞而不需要冷冻保存。
在一些情况下，通过将嵌合受体、一种或多种细胞标签和/或细胞因子工程化/引入免疫效应细胞中然后快速输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在一些情况下，免疫效应细胞的来源可包括同种异体和自体来源。在一种情况下，免疫效应细胞可以是T细胞或NK细胞。在一种情况下，嵌合受体可以是CAR或TCR。在另一种情况下，细胞因子可以是mbIL-15。在一种情况下，该mbIL-15是SEQ ID NO：15，或其变体或片段。在又一种情况下，mbIL-15的表达由本文所述的配体诱导型基因开关表达系统调节。例如，可以将诸如veledimex的配体递送至受试者以调节mbIL-15的表达。另一方面，以5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg提供veledimex。在另一方面，提供较低剂量的veledimex，例如，0.5mg、1mg、5mg、10mg、15mg或20mg。在一个实施方案中，在输注经修饰的免疫效应细胞之前0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天将veledimex施用于受试者。在另一个实施方案中，大约每12小时一次、大约每24小时一次、大约每36小时一次或大约每48小时一次向受试者施用veledimex，在输注经修饰的免疫效应细胞后持续一段有效的时间。在一个实施方案中，施用veledimex的有效时间段为约：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天。在其它实施方案中，可以在休息期之后、休药期之后或当受试者经历复发时再次施用veledimex。
在某些情况下，当观察到对受试者的不利影响或不需要治疗时，可以例如通过西妥昔单抗激活细胞标签，以用于条件性体内消融包含本文所述的细胞标签如截短的表皮生长因子受体标签的经修饰的免疫效应细胞。
在一些实施方案中，此类免疫效应细胞通过电穿孔用如图2A-2D、图3、图19A-19B、图20A、图22、图24A-24D和图25A-25B所述的构建体修饰。在一种情况下，用电穿孔仪如Lonza的NucleofectorTM电穿孔仪进行电穿孔。在其它实施方案中，包含上述构建体的载体是非病毒或病毒载体。在一种情况下，非病毒载体包括睡美人转座子-转座酶系统。在一种情况下，使用特定序列对免疫效应细胞进行电穿孔。例如，免疫效应细胞可以用一个转座子进行电穿孔，然后用编码转座酶的DNA，接着用第二个转座子进行电穿孔。在另一种情况下，免疫效应细胞可以同时用所有转座子和转座酶进行电穿孔。在另一种情况下，免疫效应细胞可以用转座酶进行电穿孔，然后用两个转座子或一次一个转座子进行电穿孔。在进行连续电穿孔时，免疫效应细胞可以在下一个电穿孔步骤之前休息一段时间。
在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞不经历增殖和激活步骤。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞不经历孵育或培养步骤(例如离体增殖)。在某些情况下，经修饰的免疫效应细胞在输注之前置于包含IL-2和IL21的缓冲液中。在其它情况下，经修饰的免疫效应细胞在输注之前置于或静置在细胞培养缓冲液，例如补充有胎牛血清(FBS)的细胞培养缓冲液(例如RPMI)中。在输注之前，可以收获经修饰的免疫效应细胞，洗涤，并在盐水缓冲液中配制以准备输注到受试者体内。
在一种情况下，受试者在输注前已进行淋巴细胞消耗。在其它情况下，不需要淋巴细胞消耗，而是将经修饰的免疫效应细胞快速输注到受试者体内。示例性淋巴细胞消耗方案在以下表4和表5中列出：
表4.方案1
D-6 加入/IV补水
D-5 氟达拉滨25mg/m2，环磷酰胺250mg/m2
D-4 氟达拉滨25mg/m2，环磷酰胺250mg/m2
D-3 氟达拉滨25mg/m2 IV，环磷酰胺250mg/m2
D-2 休息
D-1 休息
D0 T细胞输注
表5.方案2
D-6 加入/IV补水
D-5 氟达拉滨30mg/m2，环磷酰胺500mg/m2
D-4 氟达拉滨30mg/m2，环磷酰胺500mg/m2
D-3 氟达拉滨30mg/m2 IV，环磷酰胺500mg/m2
D-2 休息
D-1 休息
D0 T细胞输注
在另一种情况下，受试者经历最小的淋巴细胞消耗。本文中的最小的淋巴细胞消耗是指减少的淋巴细胞消耗方案，使得受试者可以在淋巴细胞消耗方案后1天、2天或3天内输注。在一种情况下，减少的淋巴细胞消耗方案可包括较低剂量的氟达拉滨和/或环磷酰胺。在另一种情况下，减少的淋巴细胞消耗方案可以包括缩短的淋巴细胞消化期，例如1天或2天。
在一个实施方案中，通过将嵌合受体和细胞因子工程化/引入所述免疫效应细胞中然后快速输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在其它情况下，通过将嵌合受体和细胞因子工程化/引入所述细胞中，然后在至少0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50小时内输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在其它情况下，通过将嵌合受体和细胞因子工程化/引入免疫效应细胞中，然后在0天、＜1天、＜2天、＜3天、＜4天、＜5天、＜6天或＜7天内输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。
在一些实施方案中，将一定量的经修饰的效应细胞施用于有需要的受试者，并且基于功效和诱导细胞因子相关毒性的潜力来确定该量。在另一个实施方案中，经修饰的效应细胞是CAR+或TCR+和CD3+细胞。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约104至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约104至约105个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106至约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含＞104但≤105个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含＞105但≤106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含＞106但≤107个经修饰的效应细胞/kg。
在其它实施方案中，刺激工程化细胞的增殖和/或存活的方法包括从受试者获得细胞样品，并用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该细胞样品的细胞。在一个实施方案中，转座子编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将所述一种或多种多核苷酸有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一个实施方案中，基因开关多肽包含i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域。在一些实施方案中，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。
在一种情况下，体外增殖工程化细胞的方法包括从受试者获得细胞样品，并用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该细胞样品的细胞。在一个实施方案中，转座子编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和所述一种或多种多核苷酸有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一个实施方案中，基因开关多肽包含i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域。在一些实施方案中，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。
在另一个实施方案中，增强工程化细胞在有需要的受试者中的体内持久性的方法包括从受试者获得细胞样品，并用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该细胞样品的细胞。在一些情况下，转座子编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将DNA有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一些情况下，基因开关多肽包含i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。
在另一个实施方案中，治疗患有实体瘤的受试者的方法包括从受试者获得细胞样品，用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该样品的细胞，并将工程化细胞群体施用于该受试者。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。在一些情况下，所述一个或多个转座子编码嵌合抗原受体(CAR)或TCR、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将DNA有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶。在一些情况下，基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一些情况下，通过电穿孔转染细胞。在一些情况下，编码基因开关多肽的多核苷酸由启动子调节。在一些情况下，该启动子是组织特异性启动子或EF1A启动子或其功能变体。在一些情况下，该组织特异性启动子包含T细胞特异性应答元件或NFAT应答元件。在一些情况下，该细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα或IL-15变体的融合体中的至少一种。在一些情况下，该细胞因子是分泌形式。在一些情况下，该细胞因子是膜结合形式。在一些情况下，所述细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞或T细胞祖细胞。在一些情况下，将细胞施用于受试者(例如通过向受试者输注工程化细胞)。在一些情况下，该方法进一步包括施用有效量的配体(例如veledimex)以诱导细胞因子的表达。在一些情况下，所述CAR能够结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC-16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。在一些情况下，转座酶是鲑鱼型Tc1样转座酶。在一些情况下，转座酶是SB11或SB100x转座酶。在一些情况下，细胞标签包含HER1截短变体和CD20截短变体中的至少一种。
药物组合物和剂量
在一些实施方案中，本文公开了用于在受试者中施用的包含本文公开的多核苷酸或多肽的组合物。在一些情况下是编码本文公开的多核苷酸或多肽并且任选地含有细胞因子和/或另外的治疗剂的经修饰的效应细胞组合物。在一些情况下，本文还包括编码用于调节嵌合抗原受体的表达的基因开关多肽的载体，以用于效应细胞的修饰。
在一些情况下，使用一种或多种生理学上可接受的载剂以常规方式配制经修饰的效应细胞或编码基因开关多肽和嵌合抗原受体的载体的药物组合物，该载剂包括有助于将活性化合物加工成可药用的制剂的赋形剂和助剂。适当的配方取决于选定的结药途径。本文所述药物组合物的综述可见于例如Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第十九版(Easton，Pa.：Mack Publishing Company，1995)；Hoover，John E.，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.，编著，Pharmaceutical Dosage Forms，MarcelDecker，New York，N.Y.，1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems，第七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
任选地以常规方式制备药物组合物，仅举例来说，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或压缩方法。
在某些实施方案中，组合物还可包含一种或多种pH调节剂或缓冲剂，包括酸，如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲液，如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。所包含的这类酸、碱和缓冲液的量是将组合物的pH维持在可接受范围内所需的量。
在其它实施方案中，组合物还可包含使组合物的重量摩尔渗透压浓度处于可接受范围内所需的量的一种或多种盐。这类盐包括具有钠、钾或铵阳离子以及氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
本文所述的药物组合物通过任何合适的给药途径施用，包括但不限于口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)、鼻内、颊部、舌下或直肠给药途径。在一些情况下，配制药物组合物用于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)给药。
将本文所述的药物组合物配制成任何合适的剂型，包括但不限于用于由待治疗个体口服摄取的水性口服分散体、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液、悬浮液等，固体口服剂型、气雾剂、控制释放制剂、快速熔化制剂、泡腾制剂、冻干制剂、片剂、粉剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂，以及立即和控制释放混合型制剂。在一些实施方案中，将药物组合物配制成胶囊。在一些实施方案中，将药物组合物配制成溶液(例如，用于IV给药)。在一些情况下，将药物组合物配制成输注剂。在一些情况下，将药物组合物配制成注射剂。
本文所述的药物固体剂型任选地包含本文所述的化合物和一种或多种药学上可接受的添加剂，如相容的载剂、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透增强剂、湿润剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或多种组合。
在其它方面，使用标准包衣程序，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第20版(2000)中所述的标准包衣程序，在组合物周围提供膜包衣。在一些实施方案中，将组合物配制成颗粒(例如用于通过胶囊施用)并且对一些或所有颗粒进行包衣。在一些实施方案中，将组合物配制成颗粒(例如用于通过胶囊施用)并且将一些或所有颗粒制成微胶囊。在一些实施方案中，将组合物配制成颗粒(例如用于通过胶囊施用)并且一些或所有颗粒未制成微胶囊且未包衣。
在某些实施方案中，本文提供的组合物还可包含一种或多种防腐剂以抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞物质，如硼酸苯汞(merfen)和硫柳汞(thiomersal)；稳定化的二氧化氯；以及季铵化合物，如苯扎氯铵、十六烷基三甲基澳化铵和西吡氯铵。
如本文所提及的“增殖性疾病”是指统一的概念，即细胞的过度增殖和细胞基质的更新对包括癌症在内的若干疾病的发病机理有显著贡献。
如本文所用的“患者”或“受试者”是指被诊断为患有或怀疑患有或发展为生理状况，例如癌症或自身免疫性病况或感染的哺乳动物受试者。在一些实施方案中，术语“患者”是指具有高于平均的发生癌症可能性的哺乳动物受试者。示例性患者可以是人、猿、狗、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿动物和其它可以受益于本文公开的疗法的哺乳动物。示例性的人类患者可以是男性和/或女性。
“有需要的患者”或“有需要的受试者”在本文中是指被诊断为患有或怀疑患有疾病或病症，例如但不限于增殖性疾病如癌症的患者。在一些情况下，癌症是实体瘤或血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是实体瘤。在其它情况下，该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是转移性癌症。在一些情况下，该癌症是复发性或难治性癌症。在一些情况下，该癌症是实体瘤。示例性实体瘤包括但不限于肛门癌；阑尾癌；胆道癌(即胆管癌)；膀胱癌；脑肿瘤；乳腺癌；宫颈癌；结肠癌；原发灶不明癌(CUP)；食道癌；眼癌；输卵管癌；胃肠癌；肾癌；肝癌；肺癌；髓母细胞瘤；黑素瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；甲状旁腺疾病；阴茎癌；垂体瘤；前列腺癌；直肠癌；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；喉癌；甲状腺癌；子宫癌；阴道癌；外阴癌；或胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，白血病可以是例如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓样白血病(CML)。
“施用”在本文中是指向患者提供本公开的组合物。作为实例而非限制的，组合物施用(例如，注射)可通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射或肌肉内(i.m.)注射进行。可以采用一种或多种这样的途径。肠胃外施用可以是，例如，通过推注或通过随时间平缓灌注。备选地地或同时地，可通过口服途径施用。此外，还可以通过手术沉积细胞团或细胞丸或放置医疗装置来施用。在一个实施方案中，本公开的组合物可包含表达本文所述核酸序列的工程化细胞或宿主细胞，或包含至少一种本文所述核酸序列的载体，其量可有效治疗或预防增殖性病症。药物组合物可包含本文所述的靶细胞群体，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。此类组合物可包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。
如本文所用的，术语“治疗”、“处理”及其语法等同语是指获得所需的药理学和/或生理学效果。在实施方案中，该效果是治疗性的，即该效果部分或完全地治愈疾病和/或由该疾病引起的不良症状。为此，本文所述的方法包括施用“治疗有效量”的组合物，该组合物包含表达本文所述的核酸序列的宿主细胞，或包含本文所述的核酸序列的载体。
术语“治疗有效量”、“治疗量”、“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或其语法等同语是指在必要的剂量和时间段上有效获得所需治疗结果的量。治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及本文所述组合物在个体中引发所需反应的能力而变化。待施用的本发明组合物的精确量可以由医师在考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异的情况下确定。
或者，向患者或受试者施用一种或多种本文所述组合物的药理学和/或生理学效果可以是“预防性的”，即该效果完全或部分地预防疾病或其症状。
“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段上有效获得所需预防结果(例如，疾病发作的预防)的量。
“消泡剂”减少加工过程中的起泡，这种起泡可以造成水性分散体的凝聚、成品膜中的气泡或通常受损的加工。示例性的消泡剂包括硅乳剂或失水山梨醇倍半油酸酯(sorbitan sesquoleate)。
“抗氧化剂”包括例如丁羟甲苯(BHT)、抗坏血酸钠、抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠和生育酚。在某些实施方案中，如需要，抗氧化剂增强化学稳定性。
本文所述的制剂可受益于抗氧化剂、金属螯合剂、含巯基的化合物和其它普通稳定剂。这类稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v甘油；(b)约0.1％至约1％w/v甲硫氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v一硫代甘油，(d)约1mM至约10mM EDTA，(e)约0.01％至约2％w/v抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v聚山梨醇酯80，(g)0.001％至约0.05％w/v聚山梨醇酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)硫酸葡聚糖，(k)环糊精，(1)多硫酸戊聚糖酯和其它类肝素类，(m)二价阳离子，如镁和锌；或(n)其组合。
“粘合剂”赋予粘结性质，并且包括例如藻酸及其盐；纤维素衍生物，如羧甲基纤维素、甲基纤维素(例如)、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如)、乙基纤维素(例如)和微晶纤维素(例如)；微晶右旋糖；直链淀粉；硅酸镁铝；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯聚吡咯烷酮；聚维酮；淀粉；预胶化淀粉；黄蓍胶、糊精、糖，如蔗糖(例如)、葡萄糖、右旋糖、糖蜜、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇(例如)和乳糖；天然或合成树胶，如阿拉伯胶、黄蓍胶、茄替胶、车前籽胶、聚乙烯吡咯烷酮(例如CL、CL、XL-10)、落叶松阿拉伯半乳聚糖、聚乙二醇、蜡、藻酸钠等。
“载剂”或“载剂材料”包括任何在制药学中常用的赋形剂，并且应根据与本文公开的化合物如依鲁替尼和抗癌剂化合物的相容性以及所需剂型的释放谱性质而选择。示例性的载剂材料包括，例如，粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。药学上相容的载剂材料可包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第十九版(Easton，Pa.：MackPublishing Company，1995)；Hoover，John E.，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania 1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.编著，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第七版(LippincottWilliams&Wilkins1999)。
“分散剂”和/或“粘度调节剂”包括通过液体介质或造粒方法或混合方法控制药物的扩散和均匀性的材料。在一些实施方案中，这些药剂还有助于包被或侵蚀基质的有效性。示例性扩散促进剂/分散剂包括例如亲水性聚合物、电解质、60或80、PEG、聚乙烯吡咯烷酮(PVP；商品名为)和基于碳水化合物的分散剂，如羟丙基纤维素(例如，HPC、HPC-SL和HPC-L)、羟丙基甲基纤维素(例如，HPMC K100、HPMC K4M、HPMC K15M和HPMCK100M)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯(HPMCAS)、非结晶纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、4-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯酚聚合物与环氧乙烷和甲醛(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，和它们是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；以及泊洛沙胺(例如，Tetronic也称为Poloxamine它是由将环氧丙烷和环氧乙烷依次添加至乙二胺而得到的四官能嵌段共聚物(BASF Corporation，Parsippany，N.J.))、聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S-630)、聚乙二醇例如可具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量的聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、树胶如黄蓍树胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原树胶)、糖、纤维素制品如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮、卡波姆、聚乙烯醇(PVA)、藻酸盐、壳聚糖及其组合。增塑剂如纤维素或三乙基纤维素也可用作分散剂。在脂质体分散体和自乳化分散体中特别有用的分散剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、来自蛋类的天然磷脂酰胆碱、来自蛋类的天然磷脂酰甘油、胆固醇和豆蔻酸异丙酯。
一种或多种蚀解促进剂与一种或多种扩散促进剂的组合也可以在本发明的组合物中使用。
术语“稀释剂”是指用来在递送前稀释感兴趣的化合物的化学化合物。稀释剂也可用来稳定化合物，因为它们可提供更稳定的环境。本领域中利用溶解在缓冲溶液(其也可提供pH控制或维持)中的盐作为稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些实施方案中，稀释剂增加组合物的体积，以便于压缩或者产生用于均匀掺合以供胶囊填充的足够体积。这类化合物包括例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、微晶纤维素如磷酸氢钙、磷酸二钙二水合物；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥的乳糖；预胶化淀粉、可压缩糖，如(Amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、基于蔗糖的稀释剂、糖果糖；一碱式硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物；乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂(dextrate)；水解谷物固体、直链淀粉；粉状纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇、氯化钠；肌醇、膨润土等。
“填充剂”包括诸如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等化合物。
“润滑剂”和“助流剂”是防止、减少或抑制材料粘附或摩擦的化合物。示例性的润滑剂包括例如硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂酰富马酸钠，烃如矿物油，或氢化植物油如氢化大豆油高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐，如铝、钙、镁、锌盐，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡，硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如，PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇如CarbowaxTM，油酸钠，苯甲酸钠，山萮酸甘油酯，聚乙二醇，十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠，胶体二氧化硅如SyloidTM，淀粉如玉米淀粉，硅油，表面活性剂，等等。
“增塑剂”是用来软化微胶囊化材料或膜包衣以使其更不易碎的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350和PEG 800、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三醋精。在一些实施方案中，增塑剂也可用作分散剂或润湿剂。
“增溶剂”包括诸如三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200-600、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、二乙二醇单乙基醚(transcutol)、丙二醇、二甲基异山梨醇等化合物。
“稳定剂”包括诸如任何抗氧化剂、缓冲液、酸、防腐剂等化合物。
“悬浮剂”包括诸如聚乙烯吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、聚乙二醇(例如，聚乙二醇可具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、羟乙基纤维素、藻酸钠、树胶如黄蓍胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原树胶)、糖、纤维素如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮等化合物。
“表面活性剂”包括诸如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或80、三醋精、维生素ETPGS、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(polaxomer)、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物如(BASF)等化合物。一些其它表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯昔醇(octoxynol)10、辛苯昔醇40。在一些实施方案中，可包含表面活性剂以增强物理稳定性或用于其它目的。
“粘度增强剂”包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
“润湿剂”包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三醋精、吐温80、维生素E TPGS、铵盐等化合物。
药盒/制品
在某些实施方案中，本文公开了与一种或多种本文所述的方法一起使用的药盒和制品。这样的药盒包括载具、包装或被区室化为接纳一个或多个容器如小瓶、管等的容器，每个容器包含将在本文所述的方法中使用的一个单独要素。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由诸如玻璃或塑料等各种材料形成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、袋、容器、瓶以及适于所选制剂及预期的给药和治疗方式的任何包装材料。
例如，容器包含编码基因开关多肽以用于本文所述CAR的调节表达的CAR-T细胞(例如，CD19特异性CAR-T细胞)，并且任选地还包含本文公开的细胞因子和/或化疗剂。这样的药盒任选地包含关于其在本文所述方法中的使用的标识性描述或标签或说明。
药盒通常包括列出内容物的标签和/或使用说明书，以及具有使用说明的包装插页。通常也将会包括一套说明书。
在一些实施方案中，标签处于容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当构成标签的字母、数字或其它字符附着、模制或蚀刻在容器本身上时，标签处于容器上；当标签存在于也容纳容器的接纳器或载具内(例如作为包装插页)时，标签与容器相关联。在一个实施方案中，标签用来指示内容物将用于具体治疗应用。标签也指示关于内容物诸如在本文所述方法中的使用的指导。
实施例
提供这些实施例仅仅是为了说明目的，并非限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1.SB基因开关系统对PBMC的核转染
通过核转染，将表达SB转座子系统即SB11、膜结合的IL-15(mbIL-15)和嵌合抗原受体(CAR)的各种DNA质粒转染至外周血单核细胞(PBMC)，以重定向T细胞特异性(图1)。
在第0天，将2000万个PBMC重悬于与总共15μg转座子和5μg转座酶(SB11)混合的100μl Amaxa Human T cell Nucleofector溶液(目录号VPA-1002；Lonza，Basel，Switzerland)中，并进行电穿孔。
次日(第1天)对细胞进行计数，并通过流式细胞术测量CAR表达。CAR T细胞用γ-照射的(100Gy)或丝裂霉素C处理的AaPC以1∶1的比例刺激。使用的AaPC细胞是表达CD19抗原的K562-AaPC。培养物仅针对第一轮刺激补充IL-21(30ng/ml)，随后对于剩余的刺激补充重组人IL-2(50IU/ml)和IL-21(30ng/ml)(Pepro Tech)。在每个刺激周期结束时对T细胞培养物进行表型分型，该周期通常持续7天。使用蛋白L或识别CD19特异性CAR的抗独特型抗体，通过多参数流式细胞术对培养物进行CAR表达的表型分型。还密切监测培养物中NK细胞的生长(定义为CD3negCD56+群体)，并且当百分比超过总细胞群体的10％时，使用CD56特异性磁珠(Stem Cell Technologies和/或Miltenyi Biotec)根据制造商的说明从CAR T细胞培养物中移出。
实施例2.ON-OFF SB基因开关系统的流式细胞术分析
从PB或UCB衍生的单核细胞(MNC)产生CD19特异性T细胞，其中使用SB转座引入CAR，然后加入AaPC，以CAR依赖性方式数值扩充T细胞。
对于用来评估各种标志物和目的基因的表达的流式细胞术分析，将细胞轻轻地重悬浮，并使用台盼蓝排除法用Countess仪器测量细胞数和活力。还记录细胞直径大小。对每个样品在10℃下以330xg 4min收获5×105个细胞以供抗体染色。将收获的细胞在冰上与HBSS中的10％人AB血清一起孵育至少15min。含有荧光缀合的抗体的抗体混合物在HBSS+0.1％BSA+2mM EDTA中包括一种或多种CD4(克隆RPA-T4)、CD8(克隆SK1)、CD3(克隆UCHT1)、CD56、CD19特异性CAR(抗独特型抗体)、IL-15和IL-15Ra特异性抗体。加入制备的抗体混合物和相关荧光-1/同种型对照以对细胞样品进行染色，然后将样品在冰上孵育30min。然后用FACS缓冲液(FIBSS+0.5％BSA+2mM EDTA)洗涤样品，并用Fixable Viability Dye(eBiosciences)在冰上染色30min。将细胞用FACS缓冲液洗涤，然后用4％低聚甲醛溶液(BDCytofix；BD Biosciences)固定。所有样品在LSR II流式细胞仪、Fortessa X-20流式细胞仪(BD Biosciences)或iQue Screener Plus(Intellicyt)上运行，并使用FlowJo V10(TreeStar，Ashland，OR)或iQue Screener软件分析数据。
为了使用配体(veledimex)诱导表达，以1×106个细胞/ml收获AaPC刺激的CAR-T细胞。向培养物中加入veledimex或DMSO(以使DMSO浓度在两种培养物中保持恒定)。Veledimex的使用浓度为20nM、50nM、100nM或如所述。然后将细胞在37℃下在veledimex或DMSO的存在下培养2-3天。培养2-3天后，对每个样品在10℃下以330×g 4min收获5×105个细胞以供抗体染色。将收获的细胞在冰上与HBSS中的10％人AB血清一起孵育至少15min。含有荧光缀合的抗体的抗体混合物包括在HBSS+0.1％BSA+2mM EDTA中包括一种或多种CD4(克隆RPA-T4)、CD8(克隆SK1)、CD3(克隆UCHT1)、CD56、CD19特异性CAR(抗独特型抗体)、IL-15和IL-15Ra特异性抗体。加入制备的抗体混合物和相关同种型对照以对细胞样品进行染色，然后将样品在冰上孵育30min。然后用FACS缓冲液(FIBSS+0.5％BSA+2mM EDTA)洗涤样品，并用Fixable Viability Dye(eBiosciences)在冰上染色30min。将细胞用FACS缓冲液洗涤，并用4％低聚甲醛溶液(BD Cytofix；BD Biosciences)固定。所有样品在LSR II流式细胞仪、Fortessa X-20流式细胞仪(BD Biosciences)或iQue Screener Plus(Intellicyt)上运行，并使用FlowJo V10(TreeStar，Ashland，OR)或iQue Screener软件分析数据。
对于veledimex ON-OFF-ON实验，首先将veledimex以所述浓度(一般在20-100nM之间)加入细胞培养物中2-3天。收获等份细胞，并通过如上所述的流式细胞术分析各种蛋白质的表达(ON)。然后洗涤剩余的细胞培养物，并重悬浮于不含veledimex的完全培养基中并培养最多5天。收获等份细胞，并如上所述通过流式细胞术在提及的时间分析表达(OFF)。然后洗涤剩余的细胞培养物，并用含有veledimex的完全培养基重悬浮，以使靶基因的表达重新开始。培养2-3天后，收获等份细胞，并通过流式细胞术分析表达。
实施例3.存活实验
通过核转染，将编码RTS-膜结合的IL-15(RTS-mbIL-15)、CD19特异性嵌合抗原受体(CD19 CAR)的多个睡美人转座子DNA质粒(设计9，图2)与编码睡美人转座酶SB11的质粒DNA一起转染到外周血单核细胞(PBMC)中(图1)。在第0天，将2000万个PBMC重悬于与总共15μg转座子和5μg转座酶混合的100μl Amaxa Human T cell Nucleofector溶液(目录号VPA-1002；Lonza，Basel，Switzerland)中，并核转染到细胞中。次日(第1天)对细胞进行计数，并使用流式细胞术测量CAR表达。细胞用γ-照射的(100Gy)或丝裂霉素C处理的在其表面上表达CD19的基于K562的AaPC以1∶1的比例刺激。培养物仅针对第一轮刺激补充IL-21(30ng/ml)，随后对于剩余的刺激补充重组人IL-2(50IU/ml)和IL-21(30ng/ml)(Pepro Tech)。在每个刺激周期结束时对T细胞培养物进行表型分型，该周期通常持续7天。通过多参数流式细胞术，利用抗独特型抗体染色检测CD19特异性CAR-T细胞，对培养物进行CAR表达的表型分型。还密切监测培养物中NK细胞的生长(定义为CD3negCD56+群体)，并且当百分比超过总细胞群体的10％时，使用针对CD56的磁珠(Stem Cell Technologies和/或MiltenyiBiotec)根据制造商的说明从CAR T细胞培养物中移出。
为了测量从培养基中撤除细胞因子(IL-2和IL-21)后共表达RTS-mbIL-15的CD19特异性CAR-T细胞的持久性，收获CAR-T细胞，并以1×106个细胞/ml的浓度接种于6孔板中含有或不含IL-2和IL-21的完全RPMI培养基中。将Veledimex(50nM终浓度)或DMSO对照加入培养基中。每2-3天更换培养基，收获小等份的细胞用于流动分析。进行流动分析以测量mbIL-15表达，并在培养基中存在或不存在细胞因子的情况下测量培养物中活细胞的百分比。在存在和不存在细胞因子的情况下，CAR-T细胞的存活显示于图12中。在培养物中不存在细胞因子的情况下，当加入veledimex以诱导mbIL-15表达时，观察到CAR-T细胞的存活率提高。当未添加veledimex(未诱导mbIL-15表达)时，细胞在离体培养物中不能存活。
实施例4.Western印迹分析
用睡美人系统的质粒对PBMC进行核转染，以表达在组成型启动子下的CD19特异性CAR(单独的CD19 CAR)，或均在组成型启动子下的CD19特异性CAR和mblL-15(CD19 CAR+组成型-mbIL-15)，或在组成型启动子下的CD19特异性CAR和RTS-mbIL-15(CD19 CAR+RTS-mbIL-15)。如实施例1所述，在AaPC的存在下培养经核转染的细胞。
经过四轮刺激后，细胞在不存在(仅CD19 CAR、CD19 CAR+组成型-mbIL-15和CD19CAR+RTS-mbIL-15)或存在(CD19 CAR+RTS-mbIL-15)veledimex的情况下培养2-3天。制备细胞裂解物以供Western印迹分析。NuPAGE 10％Bis-Tris凝胶的每个泳道加载大约10μg裂解物。使用(Life Technologies)半干转移装置将蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用在PBS+吐温-20(PBST；1X PBS+0.05％吐温-20)溶液中的5％(w/v)奶粉溶液封闭膜，用山羊抗人IL-15(R&D Systems)第一抗体和兔抗山羊IgG HRP(KPLLaboratories)第二抗体染色。使用用于增强化学发光(ECL)检测的SuperSignalTM WestPico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)。
使用Digital Darkroom软件和Alpha软件(ProteinSimple)在FluorChemTME Imager(ProteinSimple，San Jose，CA)系统上捕获Western印迹的图像。图14显示了了Western印迹的图像。当不存在veledimex时(CD19 CAR+RTS-mbIL-15)，通过Western印迹分析未检测到mbIL-15表达，但是当向培养物中添加veledimex时观察到mbIL-15的强表达。在仅CD19 CAR的阴性对照中，未观察到mbIL-15表达。在CD19 CAR+组成型-mbIL-15阳性对照中，检测到mbIL-15的表达。
实施例5.T细胞活化和mbIL-15转基因表达的配体特异性控制
将睡美人转座子设计用于稳定表达CD19特异性CAR、细胞标签以及基因开关控制的mbIL-15。一种或两种基因开关组分(例如，VP16/RxR和Gal4/EcR)的表达在T细胞活化特异性启动子的控制下进行。在该实施例中，利用由与最小IL-2启动子融合的6X NFAT应答元件产生的T细胞活化依赖性启动子(NFAT6-IL2启动子)来驱动基因开关组分-VP16-RxR和/或Gal4-EcR融合蛋白的表达，以用于mbIL-15的条件性表达。当基因开关的组分处于NFAT6-IL2启动子的控制下时，mbIL-15的表达需要满足两个条件：1)T细胞被活化；和2)存在激活物配体——veledimex。图20A所示的SB转座子构建体组合与SB11转座酶一起在供体T细胞中转染。
在第0天，将1000-2000万个T细胞重悬于与总共15μg转座子和5μg转座酶(SB11)混合的100μl Amaxa Human T cell Nucleofector溶液(目录号VPA-1002；Lonza，Basel，Switzerland)中，并进行电穿孔。
次日(第1天)对细胞进行计数，并通过流式细胞术测量CAR表达。CAR T细胞通过每7-10天用γ-照射的(100Gy)或丝裂霉素C处理的AaPC以1∶1的比例连续数轮刺激多达4个循环而离体选择性扩充。使用的AaPC细胞是表达CD19抗原的K562-AaPC。培养物仅针对第一轮刺激补充IL-21(30ng/ml)，随后对于剩余的刺激补充重组人IL-2(50IU/ml)和IL-21(30ng/ml)(Pepro Tech)。
对于用来评估各种标志物和目的基因的表达的流式细胞术分析，将细胞轻轻地重悬浮，并使用台盼蓝排除法用Countess仪器测量细胞数和活力。还记录细胞直径大小。对每个样品在10℃下以330xg 4min收获5×105个细胞以供抗体染色。将收获的细胞在冰上与HBSS中的10％人AB血清一起孵育至少15min。含有荧光缀合的抗体的抗体混合物在HBSS+0.1％BSA+2mM EDTA中包括一种或多种CD4、CD8、CD3、CD56、CD19特异性CAR(抗独特型抗体)、IL-15和/或IL-15Ra特异性抗体。加入制备的抗体混合物和相关荧光-1/同种型对照以对细胞样品进行染色，然后将样品在冰上孵育30min。然后用FACS缓冲液(FIBSS+0.5％BSA+2mM EDTA)洗涤样品，并用Fixable Viability Dye(eBiosciences)在冰上染色30min。将细胞用FACS缓冲液洗涤，然后用4％低聚甲醛溶液(BD Cytofix；BD Biosciences)固定。所有样品在LSR II流式细胞仪、Fortessa X-20流式细胞仪(BD Biosciences)或iQue ScreenerPlus(Intellicyt)上运行，并使用FlowJo V10(TreeStar，Ashland，OR)或iQue Screener软件分析数据。
为了评估T细胞活化对mbIL-15表达的影响，在最后一次AaPC刺激后将细胞保持在培养基中至少7天以测试基线(无刺激)表达水平。在用veledimex或DMSO处理之前，使用不同剂量的ConA(1或5μg/mL)活化T细胞48小时或用PMA/离子霉素活化T细胞24小时。
收获未活化的或活化的CAR-T细胞，并向培养物中加入100nM veledimex或DMSO(以使DMSO浓度在两种培养物中保持恒定)。然后在veledimex或DMSO的存在下将细胞在37℃下培养至少24小时，然后进行流式细胞术分析以测量转基因表达。在静息T细胞(图20B)或存在或不存在veledimex时的活化T细胞(图20C：ConA 1μg/mL；ConA 5μg/mL：图20D，PMA/离子霉素：图20E)中对CAR和mbIL-15的表达进行定量。
图20B显示，在不存在T细胞活化的情况下，仅有携带用于在组成型启动子下表达基因开关组分(例如VP16/RxR和Ga14/EcR)的转座子的CAR-T细胞能够在向培养物中加入veledimex时表达mbIL-15。如图20C至20E所示，携带用于在NFAT6-IL-2启动子下表达一种或多种基因开关组分的转座子(构建体#3、4和6)的CAR-T细胞在向培养物中加入veledimex时表现出mbIL-15的表达，显示出CAR-T细胞诱导型表达mbIL-15必须满足两个条件。此外，在固定浓度的veledimex的存在下，mbIL-15表达水平随着T细胞活化水平的增加而增加(图20C和图20D)。对于所有测试的构建体组合，在不存在veledimex的情况下，通过流式细胞术检测到极低水平的mbIL-15表达。与这些配体诱导型开关系统的设计一致，只有CAR+T细胞能够在veledimex的存在下诱导mbIL-15。
实施例6.使用基因开关系统的IL-12表达
睡美人转座子如图22所示设计，以稳定表达EGFRvIII特异性CAR、细胞标签和RTS-IL-12。如前所述，将转座子质粒在几个供体T细胞中电穿孔。EGFRvIII-CAR-T细胞通过每7-10天在补充有IL-2和IL-21的培养基中用γ-照射的或丝裂霉素C处理的充当“饲养细胞”的AaPC以1∶1的比例连续数轮刺激多达4个循环而离体选择性扩充。使用的AaPC细胞是表达EGFRvIII抗原的K562-AaPC。图26描绘了在CAR+T细胞离体选择性扩增时，来自多个供体的T细胞中的CAR表达。
Veledimex ON-OFF循环实验：对于每个ON-OFF循环，首先将veledimex以先前提到的浓度(一般在20-100nM之间)加入(ON)至细胞培养物中2-3天。收获等份细胞，并在指定的时间点通过流式细胞术和/或ELISA分析各种蛋白质的表达(ON)。然后洗涤剩余的细胞培养物，并重悬浮于不含veledimex的完全培养基中(OFF)并培养最多5天。收获等份细胞，并如上所述通过流式细胞术和/或ELISA提及的时间分析表达(OFF)。通过重复该过程，可以用剩余细胞培养物再次重复Veledimex ON-OFF循环。
为了测定EGFRvIII-CAR-T细胞中的IL-12诱导，在含有IL-21的培养基中，在AaPC的存在下，用DMSO(对照)或veledemix处理核转染后24小时的Pan T细胞。在核转染后48小时后，通过ELISA分析培养上清液的IL-12水平。
图27显示，用veledimex处理诱导了T细胞的IL-12表达，所述T细胞用SB转座子转染以共表达CAR和RTS-IL-12。然而，缺乏RTS-IL-12的CAR-T细胞未能在培养上清液中产生IL-12。用DMSO对照处理显示IL-12诱导的低背景水平。
此外，在存在或不存在抗原特异性刺激的情况下评估RTS-IL-12/CAR-T细胞产生诱导型IL-12的能力。通过用EGFRvIII+AaPC连续三轮刺激来离体扩充EGFRvIII-CAR/RTS-IL-12T细胞。在不存在(图28A)或存在(图28B)EGFRvIII+AaPC的情况下，将Veledimex(100nM)或DMSO(对照)加入到EGFRvIII-CAR/RTS-IL-12T细胞的培养物中48小时，之后分析培养上清液中的IL-12水平。如图28A和图28B所示，EGFRvIII-CAR/RTS-IL-12T细胞表达veledimex诱导的IL-12的能力在EGFRvIII抗原特异性刺激的存在下大大增强，在不存在veledimex的情况下具有低背景水平的IL-12表达。
实施例7.使用RTS基因开关系统在EGFRvIII CAR表达细胞中的Veledimex ON-OFF循环
通过与AaPC共培养，在存在和不存在抗原特异性T细胞活化的情况下，在体外测定了重复处理和撤除veledimex对携带诱导型IL-12基因的EGFRvIII-CAR-T细胞的影响。在配体处理的第一个循环(ON-OFF)中，通过用EGFRvIII+AaPC连续四轮刺激而离体扩充的CAR-T细胞(106/m1)用DMSO或veledimex处理，并在含有IL-21和IL-2的培养基中在存在或不存在AaPC的情况下培养。处理后48小时，彻底洗涤细胞以除去配体，并在新培养容器中在含有IL-21和IL-2的培养基中培养5天。然后分析处理后24-120小时收获的培养上清液中IL-12和IFNγ的表达。
在配体处理的第二个循环(ON-OFF)中，在撤除veledimex(在循环1中)后5天收集来自在循环1中在AaPC的存在下用DMSO或veledimex处理的培养物的CAR-T细胞，并在存在或不存在通过与AaPC共培养发生抗原特异性T细胞活化的情况下用DMSO或veledimex进行第二循环的配体处理。处理后48小时，彻底洗涤细胞以除去配体，并在新培养容器中在含有IL-21加IL-2的培养基中培养5天。然后分析在处理后24-120小时收获的培养上清液中IL-12和IFNγ的表达。
图29A显示，在也携带诱导型IL-12构建体(XON-61或XON-62；SEQ ID NO 135或136)的EGFRvIII-CAR-T细胞中用veledimex处理导致相对于用DMSO处理，在处理后48小时的培养上清液中的IL-12表达增加。与不存在抗原特异性刺激相比，在AaPC介导的抗原特异性刺激的存在下，IL-12诱导水平增强。在存在或不存在抗原特异性刺激的情况下，在没有veledimex的情况下，观察到非常低的IL-12表达背景水平。不含诱导型IL-12的EGFRvIII-CAR-T细胞在存在或不存在抗原特异性刺激的情况下未能表达任何IL-12。
撤除veledimex对IL-12表达的影响显示在图30A(在不存在AaPC的情况下培养的细胞)和图30B(在AaPC的存在下培养的细胞)中。在存在和不存在AaPC介导的抗原特异性刺激的情况下，在处理后48小时撤除veledimex均导致IL-12表达减少。与存在抗原特异性刺激(图30B)相比，在不存在抗原特异性刺激的情况下，IL-12诱导水平显著降低(图30A)。但是，在撤除veledimex后，IL-12的水平逐渐降低回基线水平，表现出对诱导型基因表达的严格控制。
图31A和图31B显示了在循环1期间撤除试剂后，在采用veledimex或DMSO的第2循环期间，配体处理后48小时的培养上清液中的IL-12诱导水平。在循环1中在表达EGFRvIII的AaPC的存在下培养的DMSO或veledimex处理的细胞，在循环2中在存在或不存在EGFRvIII+AaPC的情况下用veledimex(或DMSO)处理。结果显示，相对于在循环1期间用DMSO和EGFRvIII+AaPC处理的细胞(图31A)，当在循环1期间用veledimex和EGFRvIII+-AaPC处理时(图31B)，在循环2中用veledimex和EGFRvIII+AaPC处理的细胞显示出增加的IL-12诱导。在不存在veledimex的情况下，再次观察到非常低的IL-12表达背景水平。
用veledimex处理两个循环后RTS-IL-12表达的动力学在图32A中捕获。如上所述，通过两个循环的配体处理，评价携带诱导型IL-12构建体(XON-61或XON-62；SEQ ID NO 135或136)的EGFRvIII-CAR-T细胞在存在或不存在veledimex的情况下诱导IL-12表达的能力。设计本实施例中的配体诱导型基因开关载体，使得只有表达两种转座子的细胞才能进行基因开关控制的IL-12表达。在配体处理的循环1开始之前，通过流式细胞术在T细胞中对EGFRvIII CAR的表达进行定量，如图34B所示。细胞在CD3上门控。
如图32A所示，通过在延长的培养期间添加或撤除激活物配体veledimex，可以反复打开和关闭这些CAR-T细胞的IL-12表达。IL-12表达在撤除veledimex后降至基线水平，并且在加入veledimex后可以重新开始。该数据是来自一个供体的代表性数据。
图33显示了用veledimex处理两个循环后RTS-IL-12表达的动力学的另一个实例。如上所述，通过两个循环的配体处理，评价携带诱导型IL-12构建体(XON-61或XON-62；SEQID NO 135或136)的EGFRvIII-CAR-T细胞在存在或不存在veledimex的情况下诱导IL-12表达的能力。在这种情况下，在EGFRvIII+AaPC的存在下进行第一个处理循环，并在不存在EGFRvIII+AaPC的情况下进行第二个循环。与先前的发现一致，veledimex可以在延长的培养期间经反复处理和撤除来调节EGFRvIII-CAR-T细胞的IL-12表达。在循环2期间去除AaPC介导的EGFRvIII特异性刺激导致IL-12水平的相应降低。该数据是来自第二个供体的代表性数据。
实施例8.Veledimex剂量响应
通过用EGFRvIII+AaPCs连续三轮刺激来离体扩充具有或不具有RTS-IL-12的EGFRvIII-CAR T细胞。然后用从0nM(DMSO对照)到100nM的不同剂量的veledimex处理T细胞。在veledimex处理后48小时，收获培养上清液，并通过ELISA分析IL-12水平。所有组中的EGFRvIII-CAR表达均用流式细胞术来确认，并且随着剂量逐渐增加的veledimex(数据未示出)而稳定，如在组成型启动子控制下的CAR表达所预期的那样。
结果显示在图34中。结果显示，EGFRvIII-CAR/RTS-IL-12T细胞以veledimex剂量依赖性方式产生IL-12。与缺乏细胞标签表达的细胞相比，在用除了CAR和IL-12之外还表达细胞标签的转座子转染的细胞中，对于给定的veledimex浓度观察到较低的IL-12表达水平。不具有RTS-IL-12的EGFRvIII-CAR-T细胞不能表达IL-12。
实施例9.EGFRvIII-CAR-T细胞对EGFRvIII+靶细胞的特异性细胞毒性
测试了表达EGFRvIII-CAR的T细胞响应于EGFRvlII+靶细胞的能力。通过用EGFRvlII+AaPC连续四轮刺激来离体扩充具有或不具有RTS-IL-12的EGFRvIII-CAR T细胞。将这些效应EGFRvIII-CAR-T细胞在含有2％FBS和L-谷氨酰胺的RPMI中静置48h，然后在不存在veledimex的情况下与EGFRvIII+和EGFRvIIIneg靶细胞以1∶1的效应细胞：靶细胞之比共培养。培养后24h收集培养上清液，并分析IFNγ作为EGFRvIII-CAR-T细胞的特异性的功能读数。
图35显示了在与靶细胞共培养后24h，CAR-T细胞的EGFRvIII抗原特异性IFNγ产生。与单独的EGFRvIIIneg EL4细胞系或效应CAR-T细胞共培养不导致IFNγ表达。
图36A显示了在与表达EGFRvIII的胶质母细胞瘤靶细胞共培养(无veledimex)后24h，培养上清液中的IFNγ。结果显示，EGFRvIII+胶质母细胞瘤靶细胞(U251MG-EGFRvIII-Fluc-GFP和U87MG-EGFRvIII-Fluc-GFP)诱导EGFRvIII-CAR T细胞的IFNγ分泌，而单独的EGFRvIIIneg靶细胞(U251MG、U251MG-EGFRvIII-Fluc-GFP、U87MG和U87MG-Fluc-GFP)或效应细胞不能诱导IFNγ分泌。
在2小时铕释放试验中检测EGFRvII-CAR-T细胞对EGFRvIII+和EGFRvIIIneg靶细胞的细胞毒性。使用DELFIA BATDA试剂(DELFIA EuTDA细胞毒性试验；Perkin Elmer)标记靶细胞系。将EGFRvIII-CAR-T效应(E)细胞与标记的靶(T)细胞以3∶1、1∶1或0.3∶1的(E∶T)比在RPMI-1640+5％热灭活的FBS中共培养。2小时后，收获来自共培养物的上清液，并加入DELFIA铕试剂进行显色，并在时间分辨荧光仪器上读数以测量靶细胞的细胞毒性。示例实验的结果在图36B中示出。
如图36B所示，具有或不具有RTS-IL-12的EGFRvIII-CAR-T细胞显示出靶细胞的EGFRvIII抗原特异性、剂量依赖性细胞毒性。
实施例10.用丝氨酸重组酶系统对PBMC的核转染
通过核转染将如图17所示含有丝氨酸重组酶附着位点和基因开关系统组分的各种DNA质粒转染到外周血单核细胞(PBMC)中以重定向T细胞特异性。具体而言，在存在和不存在丝氨酸重组酶SF370的情况下测试3种单一载体：
(i)CAR：HER1t+组成型mbIL15(阳性对照)
(ii)CAR：HER1t+无启动子mbIL15(阴性对照)
(iii)CAR：HER1t+RTS：mbIL15
每周(在第1天、第8天、第15天和第22天)评价CAR和mbIL15的表达。在每次流动之前24-48h用DMSO或veledimex处理等份细胞以评估诱导型mbIL15表达。每周以1∶1的比例向AaPC克隆1添加CAR+细胞。
仅观察到接受CAR/mbIL15载体构建体+SF370重组酶的细胞扩充；尽管转染效率相似，但其它所有培养物在一周内均未能扩充。该结果指示测试构建体的重组酶介导的整合。HER1t表达仅在第22天和第29天评价，并且与CAR表达很好地相关(数据未示出)。
转染后两周，veledimex处理(～48h)导致mbIL-15表达的诱导。在不存在veledimex的情况下，mbIL-15表达在阴性对照“无启动子mbIL15”样品的范围内。去除veledimex导致mbIL15表达的完全丧失。
尽管本文中已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本公开内容的情况下现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，本文所述的实施方案的各种替代方案，或者这里描述的这些实施方案或方面中的一个或多个的组合，可用于实施本发明。旨在以下述权利要求书限定本公开的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
序列表
<110> 英特拉克森公司
<120> 通过新基因开关表达系统调节多肽的表达
<130> 50471-706.601
<140>
<141>
<150> 62/464,958
<151> 2017-02-28
<150> 62/444,775
<151> 2017-01-10
<160> 244
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="Whitlow连接体"
<400> 1
ggcagcacct ccggcagcgg caagcctggc agcggcgagg gcagcaccaa gggc 54
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="连接体"
<400> 2
tctggcggag gatctggagg aggcggatct ggaggaggag gcagtggagg cggaggatct 60
ggcggaggat ctctgcag 78
<210> 3
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GSG连接体"
<400> 3
ggaagcgga 9
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="SGSG连接体"
<400> 4
agtggcagcg gc 12
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="(G4S)3连接体"
<400> 5
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="弗林蛋白酶切割位点/ 弗林蛋白酶link1"
<400> 6
cgtgcaaagc gt 12
<210> 7
<211> 84
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒
<220>
<221> 来源
<223> /备注="Fmdv"
<400> 7
agagccaaga gggcaccggt gaaacagact ttgaattttg accttctgaa gttggcagga 60
gacgttgagt ccaaccctgg gccc 84
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> Thosea asigna 病毒
<220>
<221> 来源
<223> /备注="Thosea asigna 病毒 2A区(T2A)"
<400> 8
gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg acct 54
<210> 9
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="弗林蛋白酶-GSG-T2A"
<400> 9
agagctaaga ggggaagcgg agagggcaga ggaagtctgc taacatgcgg tgacgtcgag 60
gagaatcctg gacct 75
<210> 10
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="弗林蛋白酶-SGSG-T2A"
<400> 10
agggccaaga ggagtggcag cggcgagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg 60
gaggagaatc ccggccct 78
<210> 11
<211> 57
<212> DNA
<213> Porcine tescho病毒
<220>
<221> 来源
<223> /备注="Porcine tescho病毒-1 2A区(P2A)"
<400> 11
gcaacgaact tctctctcct aaaacaggct ggtgatgtgg aggagaatcc tggtcca 57
<210> 12
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GSG-P2A"
<400> 12
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 马鼻炎A病毒
<220>
<221> 来源
<223> /备注="马鼻炎A病毒 2A区(E2A)"
<400> 13
cagtgtacta attatgctct cttgaaattg gctggagatg ttgagagcaa ccctggacct 60
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒
<220>
<221> 来源
<223> /备注="口蹄疫病毒 2A区(F2A)"
<400> 14
gtcaaacaga ccctaaactt tgatctgcta aaactggccg gggatgtgga aagtaatccc 60
ggcccc 66
<210> 15
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="FP2A"
<400> 15
cgtgcaaagc gtgcaccggt gaaacaggga agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag 60
caggctggag acgtggagga gaaccctgga cct 93
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="连接体-GSG"
<400> 16
gcaccggtga aacagggaag cgga 24
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="连接体"
<400> 17
gcaccggtga aacag 15
<210> 18
<211> 570
<212> DNA
<213> 脑心肌炎病毒
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EMCV IRES"
<400> 18
ccccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatc 570
<210> 19
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="2xRbm3 IRES"
<400> 19
actagtttta taatttcttc ttccagaatt tctgacattt tataatttct tcttccagaa 60
gactcacaac ctc 73
<210> 20
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GM-CSFR-alpha 信号肽"
<400> 20
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 21
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GM-CSFR-alpha 信号肽"
<400> 21
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atcccc 66
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="Ig Kappa 信号肽"
<400> 22
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtcccagg atccagtggg 60
<210> 23
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="IgE 信号肽"
<400> 23
atggattgga cctggattct gtttctggtg gccgctgcca caagagtgca cagc 54
<210> 24
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8-alpha 信号肽"
<400> 24
atggcgctgc ccgtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 25
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8-alpha 信号肽"
<400> 25
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 26
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="TVB2(T21A)信号肽"
<400> 26
atgggcacca gcctcctctg ctggatggcc ctgtgtctcc tgggggcaga tcacgcagat 60
gct 63
<210> 27
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD52 信号肽"
<400> 27
atgaagcgct tcctcttcct cctactcacc atcagcctcc tggttatggt acagatacaa 60
actggactct ca 72
<210> 28
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="低亲和力神经生长因子受体
(LNGFR, TNFRSF16) 信号肽"
<400> 28
atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt 60
ctgggggtgt cccttggagg tgcc 84
<210> 29
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8-alpha 铰链区"
<400> 29
aagcccacca ccacccctgc ccctagacct ccaaccccag cccctacaat cgccagccag 60
cccctgagcc tgaggcccga agcctgtaga cctgccgctg gcggagccgt gcacaccaga 120
ggcctggatt tcgcctgcga c 141
<210> 30
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8 alpha 2x"
<400> 30
aaacctacta caactcctgc cccccggcct cctacaccag ctcctactat cgcctcccag 60
ccactcagtc tcagacccga ggcttctagg ccagcggccg gaggcgcggt ccacacccgc 120
gggctggact ttgcatccga taagcccacc accacccctg cccctagacc tccaacccca 180
gcccctacaa tcgccagcca gcccctgagc ctgaggcccg aagcctgtag acctgccgct 240
ggcggagccg tgcacaccag aggcctggat ttcgcctgcg ac 282
<210> 31
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8 alpha 3x"
<400> 31
aagcctacca ccacccccgc acctcgtcct ccaacccctg cacctacgat tgccagtcag 60
cctctttcac tgcggcctga ggccagcaga ccagctgccg gcggtgccgt ccatacaaga 120
ggactggact tcgcgtccga taaacctact accactccag ccccaaggcc cccaacccca 180
gcaccgacta tcgcatcaca gcctttgtca ctgcgtcctg aagccagccg gccagctgca 240
gggggggccg tccacacaag gggactcgac tttgcgagtg ataagcccac caccacccct 300
gcccctagac ctccaacccc agcccctaca atcgccagcc agcccctgag cctgaggccc 360
gaagcctgta gacctgccgc tggcggagcc gtgcacacca gaggcctgga tttcgcctgc 420
gac 423
<210> 32
<211> 564
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8 alpha 4x"
<400> 32
aagcctacca ccacccccgc acctcgtcct ccaacccctg cacctacgat tgccagtcag 60
cctctttcac tgcggcctga ggccagcaga ccagctgccg gcggtgccgt ccatacaaga 120
ggactggact tcgcgtccga taaacctact accactccag ccccaaggcc cccaacccca 180
gcaccgacta tcgcatcaca gcctttgtca ctgcgtcctg aagccagccg gccagctgca 240
gggggggccg tccacacaag gggactcgac tttgcgagtg ataaacctac tacaactcct 300
gccccccggc ctcctacacc agctcctact atcgcctccc agccactcag tctcagaccc 360
gaggcttcta ggccagcggc cggaggcgcg gtccacaccc gcgggctgga ctttgcatcc 420
gataagccca ccaccacccc tgcccctaga cctccaaccc cagcccctac aatcgccagc 480
cagcccctga gcctgaggcc cgaagcctgt agacctgccg ctggcggagc cgtgcacacc 540
agaggcctgg atttcgcctg cgac 564
<210> 33
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8-alpha TM域"
<400> 33
atctacatct gggcccctct ggccggcacc tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtcatc 60
accctgtact gcaaccaccg gaat 84
<210> 34
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD28 TM域"
<400> 34
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 35
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD28信号域"
<400> 35
aggagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc ccggaggcct 60
ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gcccctccca gggacttcgc cgcctaccgg 120
agc 123
<210> 36
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD3 zeta信号域"
<400> 36
cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaacctggg ccggagggag gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 120
cgggaccctg agatgggcgg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataac 180
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240
cggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 300
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 336
<210> 37
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="4-1BB信号域"
<400> 37
aagagaggcc ggaagaaact gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 60
accacccagg aagaggacgg ctgcagctgc cggttccccg aggaagagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 38
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="DNAX-激活蛋白10 (DAP 10)信号域"
<400> 38
ctgtgcgcac gcccacgccg cagccccgcc caagaagatg gcaaagtcta catcaacatg 60
ccaggcaggg gc 72
<210> 39
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="DNAX-激活蛋白12 (DAP12)信号域"
<400> 39
tacttcctgg gccggctggt ccctcggggg cgaggggctg cggaggcagc gacccggaaa 60
cagcgtatca ctgagaccga gtcgccttat caggagctcc agggtcagag gtcggatgtc 120
tacagcgacc tcaacacaca gaggccgtat tacaaa 156
<210> 40
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="IL-2核心启动子"
<400> 40
acattttgac acccccataa tatttttcca gaattaacag tataaattgc atctcttgtt 60
caagagttcc ctatcactct ctttaatcac tactcacagt aacctcaact cctg 114
<210> 41
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="IL-2最小启动子"
<400> 41
tcaagagttc cctatcactc tctttaatca ctactcacag taacctcaac tcctg 55
<210> 42
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="IL-2增强子和启动子可变"
<400> 42
tgatatcttt tctgagttac ttttgtatcc ccaccccctt aaagaaagga ggaaaaactg 60
tttcatacag aaggcgttaa ttgcatgaat tagagctatc acctaagtgt gggctaatgt 120
aacaaagagg gatttcacct acatccattc agtcagtctt tgggggttta aagaaattcc 180
aaagagtcat cagaagagga aaaatgaagg taatgttttt tcagactggt aaagtctttg 240
aaaatatgtg taatatgtaa aacattttga cacccccata atatttttcc agaattaaca 300
gtataaattg catctcttgt tcaagagttc cctatcactc tctttaatca ctactcacag 360
taacctcaac tcctgccaca 380
<210> 43
<211> 373
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="IL-2增强子和启动子可变"
<400> 43
ttttctgagt tacttttgta tccccacccc cttaaagaaa ggaggaaaaa ctgtttcata 60
cagaaggcgt taattgcatg aattagagct atcacctaag tgtgggctaa tgtaacaaag 120
agggatttca cctacatcca ttcagtcagt ctttgggggt ttaaagaaat tccaaagagt 180
catcagaaga ggaaaaatga aggtaatgtt ttttcagact ggtaaagtct ttgaaaatat 240
gtgtaatatg taaaacattt tgacaccccc ataatatttt tccagaatta acagtataaa 300
ttgcatctct tgttcaagag ttccctatca ctctctttaa tcactactca cagtaacctc 360
aactcctgcc aca 373
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="NF-kappa-B结合位点"
<400> 44
aagagggatt tcacctacat 20
<210> 45
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="NF-kappa-B结合位点"
<400> 45
aagagggatt t 11
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="NF-kappa-B结合位点"
<400> 46
agagggattt cacctacatc 20
<210> 47
<211> 161
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="(NF-kappa-B)1-IL2启动子可变"
<400> 47
aattggtccc atcgaagagg gatttcacct acataattgg tcccgggaca ttttgacacc 60
cccataatat ttttccagaa ttaacagtat aaattgcatc tcttgttcaa gagttcccta 120
tcactctctt taatcactac tcacagtaac ctcaactcct g 161
<210> 48
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="(NF-kappa-B)3-IL2 启动子可变"
<400> 48
aattggtccc atcgaagagg gatttcacct acataagagg gatttcacct acataagagg 60
gatttcacct acataattgg tcccgggaca ttttgacacc cccataatat ttttccagaa 120
ttaacagtat aaattgcatc tcttgttcaa gagttcccta tcactctctt taatcactac 180
tcacagtaac ctcaactcct g 201
<210> 49
<211> 268
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="(NF-kappa-B)6-IL2启动子可变"
<400> 49
aattggtccc atcgaagagg gatttcacct acataagagg gatttcacct acataagagg 60
gatttcacct acataattgg taagagggat ttcacctaca taagagggat ttcacctaca 120
taagagggat ttcacctaca taattggtcc cgggacattt tgacaccccc ataatatttt 180
tccagaatta acagtataaa ttgcatctct tgttcaagag ttccctatca ctctctttaa 240
tcactactca cagtaacctc aactcctg 268
<210> 50
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="1X NFAT 应答元件-IL2启动子可变"
<400> 50
aattggtccc atcgaattag gaggaaaaac tgtttcatac agaaggcgtc aattggtccc 60
gggacatttt gacaccccca taatattttt ccagaattaa cagtataaat tgcatctctt 120
gttcaagagt tccctatcac tctctttaat cactactcac agtaacctca actcctg 177
<210> 51
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="活化T-细胞核因子(NFAT)应答元件"
<400> 51
aattaggagg aaaaactgtt tcatacagaa ggcgtc 36
<210> 52
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="6X NFAT 应答元件-IL2启动子可变"
<400> 52
gaattaggag gaaaaactgt ttcatacaga aggcgtcaat taggaggaaa aactgtttca 60
tacagaaggc gtcaattagg aggaaaaact gtttcataca gaaggcgtca attggtccca 120
tcgaattagg aggaaaaact gtttcataca gaaggcgtca attaggagga aaaactgttt 180
catacagaag gcgtcaatta ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt caattggtcc 240
cgggacattt tgacaccccc ataatatttt tccagaatta acagtataaa ttgcatctct 300
tgttcaagag ttccctatca ctctccttaa tcactactca cagtaacctc aactcctg 358
<210> 53
<211> 374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="6X NFAT 应答元件-IL2启动子可变"
<400> 53
tgatatcgaa ttaggaggaa aaactgtttc atacagaagg cgtcaattag gaggaaaaac 60
tgtttcatac agaaggcgtc aattaggagg aaaaactgtt tcatacagaa ggcgtcaatt 120
ggtcccatcg aattaggagg aaaaactgtt tcatacagaa ggcgtcaatt aggaggaaaa 180
actgtttcat acagaaggcg tcaattagga ggaaaaactg tttcatacag aaggcgtcaa 240
ttggtcccgg gacattttga cacccccata atatttttcc agaattaaca gtataaattg 300
catctcttgt tcaagagttc cctatcactc tctttaatca ctactcacag taacctcaac 360
tcctgaattc catg 374
<210> 54
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="6X NFAT 应答元件-IL2启动子可变"
<400> 54
gaattaggag gaaaaactgt ttcatacaga aggcgtcaat taggaggaaa aactgtttca 60
tacagaaggc gtcaattagg aggaaaaact gtttcataca gaaggcgtca attggtccca 120
tcgaattagg aggaaaaact gtttcataca gaaggcgtca attaggagga aaaactgttt 180
catacagaag gcgtcaatta ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt caattggtcc 240
cgggacattt tgacaccccc ataatatttt tccagaatta acagtataaa ttgcatctct 300
tgttcaagag ttccctatca ctctctttaa tcactactca cagtaacctc aactcctg 358
<210> 55
<211> 365
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="6X NFAT 应答元件-IL2启动子可变"
<400> 55
tgatatcgaa ttaggaggaa aaactgtttc atacagaagg cgtcaattag gaggaaaaac 60
tgtttcatac agaaggcgtc aattaggagg aaaaactgtt tcatacagaa ggcgtcaatt 120
ggtcccatcg aattaggagg aaaaactgtt tcatacagaa ggcgtcaatt aggaggaaaa 180
actgtttcat acagaaggcg tcaattagga ggaaaaactg tttcatacag aaggcgtcaa 240
ttggtcccgg gacattttga cacccccata atatttttcc agaattaaca gtataaattg 300
catctcttgt tcaagagttc cctatcactc tctttaatca ctactcacag taacctcaac 360
tcctg 365
<210> 56
<211> 256
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="3X NFAT 应答元件-IL2启动子可变"
<400> 56
tgatatcaat tggtcccatc gaattaggag gaaaaactgt ttcatacaga aggcgtcaat 60
taggaggaaa aactgtttca tacagaaggc gtcaattagg aggaaaaact gtttcataca 120
gaaggcgtca attggtcccg ggacattttg acacccccat aatatttttc cagaattaac 180
agtataaatt gcatctcttg ttcaagagtt ccctatcact ctctttaatc actactcaca 240
gtaacctcaa ctcctg 256
<210> 57
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="3X NFAT 应答元件-IL2启动子可变"
<400> 57
aattggtccc atcgaattag gaggaaaaac tgtttcatac agaaggcgtc aattaggagg 60
aaaaactgtt tcatacagaa ggcgtcaatt aggaggaaaa actgtttcat acagaaggcg 120
tcaattggtc ccgggacatt ttgacacccc cataatattt ttccagaatt aacagtataa 180
attgcatctc ttgttcaaga gttccctatc actctcttta atcactactc acagtaacct 240
caactcctg 249
<210> 58
<211> 244
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人EEF1A1启动子可变"
<400> 58
gagcgtgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 60
gagaagttgg ggggaggggg tcggcgattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
acag 244
<210> 59
<211> 236
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人EEF1A1启动子可变"
<400> 59
gcgtgaggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag 60
ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg 120
gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata 180
agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacaca 236
<210> 60
<211> 1266
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人EEF1A1启动子和增强子"
<400> 60
gagctttgca aagatggata aagttttaaa cagagaggaa tctttgcagc taatggacct 60
tctaggtctt gaaaggagtg ggaattggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat 120
cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa 180
ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg 240
gtgggggaga accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt 300
ttgccgccag aacacaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg 360
gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactt ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc 420
ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt 480
cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt 540
ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat 600
gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc 660
acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca 720
catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc 780
aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg 840
cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc 900
ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac 960
ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt 1020
accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg tcgtctttag 1080
gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag 1140
ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat 1200
cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt 1260
cgtgag 1266
<210> 61
<211> 571
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人UBC启动子"
<400> 61
ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg 60
ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag 120
cggcccgctg ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag gacattttag 180
gacgggactt gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg 240
aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat 300
gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt 360
cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg ctgctgggct 420
gggtacgtgc gctcggggtt ggcgagtgtg ttttgtgaag ttttttaggc accttttgaa 480
atgtaatcat ttgggtcaat atgtaatttt cagtgttaga ctagtaaatt gtccgctaaa 540
ttctggccgt ttttggcttt tttgttagac g 571
<210> 62
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="6位点GAL4-诱导型近端因子结合元件(PFB)"
<400> 62
attgttcgga gcagtgcggc gcgtttagcg gagtactgtc ctccgatatt aatcggggca 60
gactattccg gggtttaccg gcgcactctc gcccgaactt caccggcggt ctttcgtccg 120
tgctttatcg gggcggatca ctccgaac 148
<210> 63
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="合成最小启动子1 [诱导型启动子]"
<400> 63
aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accctcattc tggagacgga tcccgagccg 60
agtgttttga cctccataga a 81
<210> 64
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="基于RPL6的合成5' UTR"
<400> 64
cagccgctaa atccaaggta aggtcagaag a 31
<210> 65
<211> 132
<212> DNA
<213> Simian 病毒 40
<220>
<221> 来源
<223> /备注="SV40e polyA"
<400> 65
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
tatcatgtct gg 132
<210> 66
<211> 275
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="双向aCA polyA [双向polyA]"
<400> 66
atcgattaat ctagcggccc tagacgagca gacatgataa gatacattga tgagtttgga 60
caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt 120
gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat 180
tttatgtttc aggttcaggg ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac 240
aaatgtggta aaatccgata agcgtaccta gaggc 275
<210> 67
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="PA2 polyA"
<400> 67
ggccgcaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgag 57
<210> 68
<211> 258
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="VP16激活域"
<400> 68
ggccccaaga agaaaaggaa ggtggccccc cccaccgacg tgagcctggg cgacgagctg 60
cacctggacg gcgaggacgt ggccatggcc cacgccgacg ccctggacga cttcgacctg 120
gacatgctgg gcgacggcga cagccccggc cccggcttca ccccccacga cagcgccccc 180
tacggcgccc tggacatggc cgacttcgag ttcgagcaga tgttcaccga cgccctgggc 240
atcgacgagt acggcggc 258
<210> 69
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="类视黄醇x受体(RxR)"
<400> 69
gagatgcccg tggacaggat tctggaggcc gaactcgccg tggagcagaa aagcgaccag 60
ggcgtggagg gccccggcgg aaccggcggc agcggcagca gccccaacga ccccgtgacc 120
aacatctgcc aggccgccga caagcagctg ttcaccctgg tggagtgggc caagaggatt 180
ccccacttca gcagcctgcc cctggacgac caggtgatcc tgctgagggc cggatggaac 240
gagctgctga tcgccagctt cagccacagg agcatcgacg tgagggacgg catcctgctg 300
gccaccggcc tgcacgtcca taggaacagc gcccacagcg ccggagtggg cgccatcttc 360
gacagggtgc tgaccgagct ggtgagcaag atgagggaca tgaggatgga caagaccgag 420
ctgggctgcc tgagggccat catcctgttc aaccccgagg tgaggggcct gaaaagcgcc 480
caggaggtgg agctgctgag ggagaaggtg tacgccgccc tggaggagta caccaggacc 540
acccaccccg acgagcccgg cagattcgcc aagctgctgc tgaggctgcc cagcctgagg 600
agcatcggcc tgaagtgcct ggagcacctg ttcttcttca ggctgatcgg cgacgtgccc 660
atcgacacct tcctgatgga gatgctggag agccccagcg acagc 705
<210> 70
<211> 969
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="VP16-连接体-RxR"
<400> 70
ggccccaaga agaaaaggaa ggtggccccc cccaccgacg tgagcctggg cgacgagctg 60
cacctggacg gcgaggacgt ggccatggcc cacgccgacg ccctggacga cttcgacctg 120
gacatgctgg gcgacggcga cagccccggc cccggcttca ccccccacga cagcgccccc 180
tacggcgccc tggacatggc cgacttcgag ttcgagcaga tgttcaccga cgccctgggc 240
atcgacgagt acggcggcga attcgagatg cccgtggaca ggattctgga ggccgaactc 300
gccgtggagc agaaaagcga ccagggcgtg gagggccccg gcggaaccgg cggcagcggc 360
agcagcccca acgaccccgt gaccaacatc tgccaggccg ccgacaagca gctgttcacc 420
ctggtggagt gggccaagag gattccccac ttcagcagcc tgcccctgga cgaccaggtg 480
atcctgctga gggccggatg gaacgagctg ctgatcgcca gcttcagcca caggagcatc 540
gacgtgaggg acggcatcct gctggccacc ggcctgcacg tccataggaa cagcgcccac 600
agcgccggag tgggcgccat cttcgacagg gtgctgaccg agctggtgag caagatgagg 660
gacatgagga tggacaagac cgagctgggc tgcctgaggg ccatcatcct gttcaacccc 720
gaggtgaggg gcctgaaaag cgcccaggag gtggagctgc tgagggagaa ggtgtacgcc 780
gccctggagg agtacaccag gaccacccac cccgacgagc ccggcagatt cgccaagctg 840
ctgctgaggc tgcccagcct gaggagcatc ggcctgaagt gcctggagca cctgttcttc 900
ttcaggctga tcggcgacgt gcccatcgac accttcctga tggagatgct ggagagcccc 960
agcgacagc 969
<210> 71
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GAL4 DNA结合域"
<400> 71
atgaagctgc tgagcagcat cgagcaggct tgcgacatct gcaggctgaa gaagctgaag 60
tgcagcaagg agaagcccaa gtgcgccaag tgcctgaaga acaactggga gtgcagatac 120
agccccaaga ccaagaggag ccccctgacc agggcccacc tgaccgaggt ggagagcagg 180
ctggagaggc tggagcagct gttcctgctg atcttcccca gggaggacct ggacatgatc 240
ctgaagatgg acagcctgca agacatcaag gccctgctga ccggcctgtt cgtgcaggac 300
aacgtgaaca aggacgccgt gaccgacagg ctggccagcg tggagaccga catgcccctg 360
accctgaggc agcacaggat cagcgccacc agcagcagcg aggagagcag caacaagggc 420
cagaggcagc tgaccgtgag ccccgagttt 450
<210> 72
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="蜕皮素受体配体结合域- VY 可变 (EcR)"
<400> 72
atcaggcccg agtgcgtggt gcccgagacc cagtgcgcca tgaaaaggaa ggagaagaag 60
gcccagaagg agaaggacaa gctgcccgtg agcaccacca ccgtcgatga ccacatgccc 120
cccatcatgc agtgcgagcc cccccccccc gaggccgcca ggattcacga ggtcgtgccc 180
aggttcctga gcgacaagct gctggtgacc aacaggcaga agaacatccc ccagctgacc 240
gccaaccagc agttcctgat cgccaggctg atctggtatc aggacggcta cgagcagccc 300
agcgacgagg acctgaaaag gatcacccag acctggcagc aggccgacga cgagaacgag 360
gagagcgaca cccccttcag gcagatcacc gagatgacca tcctgaccgt gcagctgatc 420
gtggagttcg ccaagggcct gcccggattc gccaagatca gccagcccga ccagatcacc 480
ctgctgaagg cttgcagcag cgaggtgatg atgctgaggg tggccaggag gtacgacgcc 540
gccagcgaca gcatcctgtt cgccaacaac caggcttaca ccagggacaa ctacaggaag 600
gctggcatgg ccgaggtgat cgaggacctc ctgcacttct gcagatgtat gtacagcatg 660
gccctggaca acatccacta cgccctgctg accgccgtgg tgatcttcag cgacaggccc 720
ggcctggagc agccccagct ggtggaggag atccagaggt actacctgaa caccctgagg 780
atctacatcc tgaaccagct gagcggcagc gccaggagca gcgtgatcta cggcaagatc 840
ctgagcatcc tgagcgagct gaggaccctg ggaatgcaga acagcaatat gtgtatcagc 900
ctgaagctga agaacaggaa gctgcccccc ttcctggagg agatttggga cgtggccgac 960
atgagccaca cccagccccc ccccatcctg gagagcccca ccaacctg 1008
<210> 73
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="蜕皮素受体配体结合域- VY 可变 (EcR)"
<400> 73
cggcctgagt gcgtagtacc cgagactcag tgcgccatga agcggaaaga gaagaaagca 60
cagaaggaga aggacaaact gcctgtcagc acgacgacgg tggacgacca catgccgccc 120
attatgcagt gtgaacctcc acctcctgaa gcagcaagga ttcacgaagt ggtcccaagg 180
tttctctccg acaagctgtt ggtgacaaac cggcagaaaa acatccccca gttgacagcc 240
aaccagcagt tccttatcgc caggctcatc tggtaccagg acgggtacga gcagccttct 300
gatgaagatt tgaagaggat tacgcagacg tggcagcaag cggacgatga aaacgaagag 360
tcggacactc ccttccgcca gatcacagag atgactatcc tcacggtcca acttatcgtg 420
gagttcgcga agggattgcc agggttcgcc aagatctcgc agcctgatca aattacgctg 480
cttaaggctt gctcaagtga ggtaatgatg ctccgagtcg cgcgacgata cgatgcggcc 540
tcagacagta ttctgttcgc gaacaaccaa gcgtacactc gcgacaacta ccgcaaggct 600
ggcatggccg aggtcatcga ggatctactg cacttctgcc ggtgcatgta ctctatggcg 660
ttggacaaca tccattacgc gctgctcacg gctgtcgtca tcttttctga ccggccaggg 720
ttggagcagc cgcaactggt ggaagagatc cagcggtact acctgaatac gctccgcatc 780
tatatcctga accagctgag cgggtcggcg cgttcgtccg tcatatacgg caagatcctc 840
tcaatcctct ctgagctacg cacgctcggc atgcaaaact ccaacatgtg catctccctc 900
aagctcaaga acagaaagct gccgcctttc ctcgaggaga tctgggatgt ggcggacatg 960
tcgcacaccc aaccgccgcc tatcctcgag tcccccacga atctctag 1008
<210> 74
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GAL4-连接体-EcR"
<400> 74
atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60
tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120
tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 180
ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 240
ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 300
aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 360
acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 420
caaagacagt tgactgtatc gccggaattc ccggggatcc ggcctgagtg cgtagtaccc 480
gagactcagt gcgccatgaa gcggaaagag aagaaagcac agaaggagaa ggacaaactg 540
cctgtcagca cgacgacggt ggacgaccac atgccgccca ttatgcagtg tgaacctcca 600
cctcctgaag cagcaaggat tcacgaagtg gtcccaaggt ttctctccga caagctgttg 660
gtgacaaacc ggcagaaaaa catcccccag ttgacagcca accagcagtt ccttatcgcc 720
aggctcatct ggtaccagga cgggtacgag cagccttctg atgaagattt gaagaggatt 780
acgcagacgt ggcagcaagc ggacgatgaa aacgaagagt cggacactcc cttccgccag 840
atcacagaga tgactatcct cacggtccaa cttatcgtgg agttcgcgaa gggattgcca 900
gggttcgcca agatctcgca gcctgatcaa attacgctgc ttaaggcttg ctcaagtgag 960
gtaatgatgc tccgagtcgc gcgacgatac gatgcggcct cagacagtat tctgttcgcg 1020
aacaaccaag cgtacactcg cgacaactac cgcaaggctg gcatggccga ggtcatcgag 1080
gatctactgc acttctgccg gtgcatgtac tctatggcgt tggacaacat ccattacgcg 1140
ctgctcacgg ctgtcgtcat cttttctgac cggccagggt tggagcagcc gcaactggtg 1200
gaagagatcc agcggtacta cctgaatacg ctccgcatct atatcctgaa ccagctgagc 1260
gggtcggcgc gttcgtccgt catatacggc aagatcctct caatcctctc tgagctacgc 1320
acgctcggca tgcaaaactc caacatgtgc atctccctca agctcaagaa cagaaagctg 1380
ccgcctttcc tcgaggagat ctgggatgtg gcggacatgt cgcacaccca accgccgcct 1440
atcctcgagt cccccacgaa tctctag 1467
<210> 75
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GAL4-连接体-EcR"
<400> 75
atgaagctgc tgagcagcat cgagcaggct tgcgacatct gcaggctgaa gaagctgaag 60
tgcagcaagg agaagcccaa gtgcgccaag tgcctgaaga acaactggga gtgcagatac 120
agccccaaga ccaagaggag ccccctgacc agggcccacc tgaccgaggt ggagagcagg 180
ctggagaggc tggagcagct gttcctgctg atcttcccca gggaggacct ggacatgatc 240
ctgaagatgg acagcctgca agacatcaag gccctgctga ccggcctgtt cgtgcaggac 300
aacgtgaaca aggacgccgt gaccgacagg ctggccagcg tggagaccga catgcccctg 360
accctgaggc agcacaggat cagcgccacc agcagcagcg aggagagcag caacaagggc 420
cagaggcagc tgaccgtgag ccccgagttt cccgggcggc ctgagtgcgt agtacccgag 480
actcagtgcg ccatgaagcg gaaagagaag aaagcacaga aggagaagga caaactgcct 540
gtcagcacga cgacggtgga cgaccacatg ccgcccatta tgcagtgtga acctccacct 600
cctgaagcag caaggattca cgaagtggtc ccaaggtttc tctccgacaa gctgttggtg 660
acaaaccggc agaaaaacat cccccagttg acagccaacc agcagttcct tatcgccagg 720
ctcatctggt accaggacgg gtacgagcag ccttctgatg aagatttgaa gaggattacg 780
cagacgtggc agcaagcgga cgatgaaaac gaagagtcgg acactccctt ccgccagatc 840
acagagatga ctatcctcac ggtccaactt atcgtggagt tcgcgaaggg attgccaggg 900
ttcgccaaga tctcgcagcc tgatcaaatt acgctgctta aggcttgctc aagtgaggta 960
atgatgctcc gagtcgcgcg acgatacgat gcggcctcag acagtattct gttcgcgaac 1020
aaccaagcgt acactcgcga caactaccgc aaggctggca tggccgaggt catcgaggat 1080
ctactgcact tctgccggtg catgtactct atggcgttgg acaacatcca ttacgcgctg 1140
ctcacggctg tcgtcatctt ttctgaccgg ccagggttgg agcagccgca actggtggaa 1200
gagatccagc ggtactacct gaatacgctc cgcatctata tcctgaacca gctgagcggg 1260
tcggcgcgtt cgtccgtcat atacggcaag atcctctcaa tcctctctga gctacgcacg 1320
ctcggcatgc aaaactccaa catgtgcatc tccctcaagc tcaagaacag aaagctgccg 1380
cctttcctcg aggagatctg ggatgtggcg gacatgtcgc acacccaacc gccgcctatc 1440
ctcgagtccc ccacgaatct ctag 1464
<210> 76
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="截短的EGFR (huEGFRt) (Her1t)"
<400> 76
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600
gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660
gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720
cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 780
acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc 840
ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt 900
gaaggctgtc caacgaatgg gcctaagatc ccgtccatcg ccactgggat ggtgggggcc 960
ctcctcttgc tgctggtggt ggccctgggg atcggcctct tcatg 1005
<210> 77
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计1 (Her1截短设计1)
(HER1t1)"
<400> 77
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctctggtg gcggtggctc gggcggtggt 600
gggtcgggtg gcggcggatc tggtggcggt ggctcgtttt gggtgctggt ggtggttggt 660
ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 720
agtaagagga gc 732
<210> 78
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计2 (Her1截短设计2)
(HER1t2)"
<400> 78
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600
gaatgcgtgg acaagggtgg cggtggctcg ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatct 660
ggtggcggtg gctcgttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 720
ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag c 771
<210> 79
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计3 (Her1截短设计3)
(HER1t3)"
<400> 79
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600
gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660
gagtgcatac agggtggcgg tggctcgggc ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctggt 720
ggcggtggct cgttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg 780
ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagc 828
<210> 80
<211> 885
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计4 (Her1截短设计4)
(HER1t4)"
<400> 80
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600
gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660
gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720
cggggaccag acaactgtat ccagggcgga ggcggaagcg gaggcggagg ctccggcgga 780
ggcggaagct tttgggtgct ggtggtggtt ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta 840
gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg aggagtaaga ggagc 885
<210> 81
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计5 (Her1截短设计5)
(HER1t5)"
<400> 81
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600
gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660
gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720
cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 780
accggcggag gcggaagcgg aggcggaggc tccggcggag gcggaagctt ttgggtgctg 840
gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 900
ttctgggtga ggagtaagag gagc 924
<210> 82
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计6 (Her1截短设计6)
(HER1t6)"
<400> 82
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600
gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660
gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720
cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 780
acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc 840
ggccatgtgt gccacctggg cggaggcgga agcggaggcg gaggctcctt ttgggtgctg 900
gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 960
ttctgggtga ggagtaagag gagc 984
<210> 83
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计7 (Her1截短设计7)
(HER1t7)"
<400> 83
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600
gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660
gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720
cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 780
acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc 840
ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt 900
gaaggctgtc caggtggcgg tggcggcgga tctttttggg tgctggtggt ggttggtgga 960
gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 1020
aagaggagct aa 1032
<210> 84
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计8 (Her1截短设计8)
(HER1t8)"
<400> 84
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctctggtg gcggtggctc gggcggtggt 600
gggtcgggtg gcggcggatc tggtggcggt ggctcggaga taacactcat tatttttggg 660
gtgatggctg gtgttattgg aacgatcctc ttaatttctt acggtattcg ccgaggaggt 720
ggaagc 726
<210> 85
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计9 (Her1截短设计9)
(HER1t9)"
<400> 85
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctctggtg gcggtggctc gggcggtggt 600
gggtcgggtg gcggcggatc tggtggcggt ggctcgataa cactcattat ttttggggtg 660
atggctggtg ttattggaac gatcctctta atttcttacg gtattggagg tggaagc 717
<210> 86
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计10 (Her1截短设计10)
(HER1t10)"
<400> 86
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctctggtg gcggtggctc gggcggtggt 600
gggtcgggtg gcggcggatc tggtggcggt ggctcgataa cactcattat ttttggggtg 660
atggctggtg ttattggaac gatcctctta gccctgctca tctggggagg tggaagc 717
<210> 87
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计11 (Her1截短设计11)
(HER1t11)"
<400> 87
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctctggtg gcggtggctc gggcggtggt 600
gggtcgggtg gcggcggatc tggtggcggt ggctcgctct gctacctgct ggatggaatc 660
ctcttcatct atggtgtcat tctcactgcc ttgttcctgg gaggtggaag c 711
<210> 88
<211> 891
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="FL CD20"
<400> 88
atgacaacac ccagaaattc agtaaatggg actttcccgg cagagccaat gaaaggccct 60
attgctatgc aatctggtcc aaaaccactc ttcaggagga tgtcttcact ggtgggcccc 120
acgcaaagct tcttcatgag ggaatctaag actttggggg ctgtccagat tatgaatggg 180
ctcttccaca ttgccctggg gggtcttctg atgatcccag cagggatcta tgcacccatc 240
tgtgtgactg tgtggtaccc tctctgggga ggcattatgt atattatttc cggatcactc 300
ctggcagcaa cggagaaaaa ctccaggaag tgtttggtca aaggaaaaat gataatgaat 360
tcattgagcc tctttgctgc catttctgga atgattcttt caatcatgga catacttaat 420
attaaaattt cccatttttt aaaaatggag agtctgaatt ttattagagc tcacacacca 480
tatattaaca tatacaactg tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc 540
caatactgtt acagcataca atctctgttc ttgggcattt tgtcagtgat gctgatcttt 600
gccttcttcc aggaacttgt aatagctggc atcgttgaga atgaatggaa aagaacgtgc 660
tccagaccca aatctaacat agttctcctg tcagcagaag aaaaaaaaga acagactatt 720
gaaataaaag aagaagtggt tgggctaact gaaacatctt cccaaccaaa gaatgaagaa 780
gacattgaaa ttattccaat ccaagaagag gaagaagaag aaacagagac gaactttcca 840
gaacctcccc aagatcagga atcctcacca atagaaaatg acagctctcc t 891
<210> 89
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="截短的CD20设计1 (CD20t1) [CD20(M1-E263]"
<400> 89
atgaccacac cacggaactc tgtgaatggc accttcccag cagagccaat gaagggacca 60
atcgcaatgc agagcggacc caagcctctg tttcggagaa tgagctccct ggtgggccca 120
acccagtcct tctttatgag agagtctaag acactgggcg ccgtgcagat catgaacgga 180
ctgttccaca tcgccctggg aggactgctg atgatcccag ccggcatcta cgcccctatc 240
tgcgtgaccg tgtggtaccc tctgtggggc ggcatcatgt atatcatctc cggctctctg 300
ctggccgcca cagagaagaa cagcaggaag tgtctggtga agggcaagat gatcatgaat 360
agcctgtccc tgtttgccgc catctctggc atgatcctga gcatcatgga catcctgaac 420
atcaagatca gccacttcct gaagatggag agcctgaact tcatcagagc ccacacccct 480
tacatcaaca tctataattg cgagcctgcc aacccatccg agaagaattc tccaagcaca 540
cagtactgtt attccatcca gtctctgttc ctgggcatcc tgtctgtgat gctgatcttt 600
gccttctttc aggagctggt catcgccggc atcgtggaga acgagtggaa gaggacctgc 660
agccgcccca agtccaatat cgtgctgctg tccgccgagg agaagaagga gcagacaatc 720
gagatcaagg aggaggtggt gggcctgacc gagacatcta gccagcctaa gaatgaggag 780
gatatcgag 789
<210> 90
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="白介素-15"
<400> 90
aactgggtga atgtgatcag cgacctgaag aagatcgagg atctgatcca gagcatgcac 60
attgatgcca ccctgtacac agaatctgat gtgcacccta gctgtaaagt gaccgccatg 120
aagtgttttc tgctggagct gcaggtgatt tctctggaaa gcggagatgc ctctatccac 180
gacacagtgg agaatctgat catcctggcc aacaatagcc tgagcagcaa tggcaatgtg 240
acagagtctg gctgtaagga gtgtgaggag ctggaggaga agaacatcaa ggagtttctg 300
cagagctttg tgcacatcgt gcagatgttc atcaatacaa gc 342
<210> 91
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="白介素-15受体alpha"
<400> 91
attacatgcc ctcctccaat gtctgtggag cacgccgata tttgggtgaa gtcctacagc 60
ctgtacagca gagagagata catctgcaac agcggcttta agagaaaggc cggcacctct 120
tctctgacag agtgcgtgct gaataaggcc acaaatgtgg cccactggac aacacctagc 180
ctgaagtgca ttagagatcc tgccctggtc caccagaggc ctgcccctcc atctacagtg 240
acaacagccg gagtgacacc tcagcctgaa tctctgagcc cttctggaaa agaacctgcc 300
gccagctctc ctagctctaa taataccgcc gccacaacag ccgccattgt gcctggatct 360
cagctgatgc ctagcaagtc tcctagcaca ggcacaacag agatcagcag ccacgaatct 420
tctcacggaa caccttctca gaccaccgcc aagaattggg agctgacagc ctctgcctct 480
caccagcctc caggagtgta tcctcagggc cactctgata caacagtggc catcagcaca 540
tctacagtgc tgctgtgtgg actgtctgcc gtgtctctgc tggcctgtta cctgaagtct 600
agacagacac ctcctctggc ctctgtggag atggaggcca tggaagccct gcctgtgaca 660
tggggaacaa gcagcagaga tgaggacctg gagaattgtt ctcaccacct g 711
<210> 92
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="具有信号肽的膜结合白介素-15"
<400> 92
atggattgga cctggattct gtttctggtg gccgctgcca caagagtgca cagcaactgg 60
gtgaatgtga tcagcgacct gaagaagatc gaggatctga tccagagcat gcacattgat 120
gccaccctgt acacagaatc tgatgtgcac cctagctgta aagtgaccgc catgaagtgt 180
tttctgctgg agctgcaggt gatttctctg gaaagcggag atgcctctat ccacgacaca 240
gtggagaatc tgatcatcct ggccaacaat agcctgagca gcaatggcaa tgtgacagag 300
tctggctgta aggagtgtga ggagctggag gagaagaaca tcaaggagtt tctgcagagc 360
tttgtgcaca tcgtgcagat gttcatcaat acaagctctg gcggaggatc tggaggaggc 420
ggatctggag gaggaggcag tggaggcgga ggatctggcg gaggatctct gcagattaca 480
tgccctcctc caatgtctgt ggagcacgcc gatatttggg tgaagtccta cagcctgtac 540
agcagagaga gatacatctg caacagcggc tttaagagaa aggccggcac ctcttctctg 600
acagagtgcg tgctgaataa ggccacaaat gtggcccact ggacaacacc tagcctgaag 660
tgcattagag atcctgccct ggtccaccag aggcctgccc ctccatctac agtgacaaca 720
gccggagtga cacctcagcc tgaatctctg agcccttctg gaaaagaacc tgccgccagc 780
tctcctagct ctaataatac cgccgccaca acagccgcca ttgtgcctgg atctcagctg 840
atgcctagca agtctcctag cacaggcaca acagagatca gcagccacga atcttctcac 900
ggaacacctt ctcagaccac cgccaagaat tgggagctga cagcctctgc ctctcaccag 960
cctccaggag tgtatcctca gggccactct gatacaacag tggccatcag cacatctaca 1020
gtgctgctgt gtggactgtc tgccgtgtct ctgctggcct gttacctgaa gtctagacag 1080
acacctcctc tggcctctgt ggagatggag gccatggaag ccctgcctgt gacatgggga 1140
acaagcagca gagatgagga cctggagaat tgttctcacc acctg 1185
<210> 93
<211> 1605
<212> DNA
<213> 小鼠
<220>
<221> 来源
<223> /备注="鼠单链IL-12 (p40-连接体-p35)"
<400> 93
atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60
atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat 120
gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg 180
acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa 240
gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca 300
catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaattct gaagaacttc 360
aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattaca gcggccggtt cacgtgctca 420
tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct 480
gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgagcg ccgagaaggt cacactggac 540
cagagagact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc 600
gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc agcagaacaa gtatgagaac 660
tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag acccgcccaa gaacttgcag 720
atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780
actccccatt cctacttctc cctcaagttc tttgtgagaa tccagcgcaa gaaagaaaag 840
atgaaggaga cagaggaggg gtgtaaccag aaaggtgcgt tcctcgtaga gaagacatct 900
accgaagtcc aatgcaaagg cgggaatgtc tgcgtgcaag ctcaggatcg ctattacaat 960
tcctcatgca gcaagtgggc atgtgttccc tgccgcgtcc gatccggtgg cggtggcggc 1020
ggatctaggg tcattccagt ctctggacct gccaggtgtc ttagccagtc ccgaaacctg 1080
ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg gccagagaaa aactgaaaca ttattcctgc 1140
actgctgaag acattgacca tgaagacatc acacgggacc aaaccagcac attgaagacc 1200
tgtttaccac tggaactaca caagaacgag agttgcctgg ctactagaga gacttcttcc 1260
acaacaagag ggagctgcct gcccccacag aagaccagct tgatgatgac cctgtgcctt 1320
ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac cagacagagt tccaggccat caacgcagca 1380
cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt ctagacaagg gcatgttggt ggccatcgac 1440
gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc gagactctgc gccagaaacc tcctgtggga 1500
gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag ctctgcatcc tgcttcacgc cttcagcacc 1560
cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc tatctgagca gcgcc 1605
<210> 94
<211> 1596
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人单链IL-12 (p40-连接体-p35)"
<400> 94
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttcagcctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatct gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatcccgac 120
gcccctggag aaatggtggt cctgacatgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaga ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgacattct gaaggaccag 360
aaagaaccca agaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactcagcgc cgagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agcccctgaa gaacagcaga caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg ctccggtggc ggtggcggcg gatctagaaa cctccccgtg 1020
gccactccag acccaggaat gttcccatgc cttcaccaca gccagaacct gctgagggcc 1080
gtcagcaaca tgctccagaa ggccagacaa actctagaat tttacccttg cacttctgaa 1140
gagattgatc atgaagatat cacaaaagat aaaaccagca cagtggaggc ctgtttacca 1200
ttggaattaa ccaagaatga gagttgccta aattccagag agacctcttt cataactaat 1260
gggagttgcc tggcctccag aaagacctct tttatgatgg ccctgtgcct tagtagtatt 1320
tatgaagact tgaagatgta ccaggtggag ttcaagacca tgaatgcaaa gctgctgatg 1380
gaccccaaga ggcagatctt tctagatcaa aacatgctgg cagttattga tgagctgatg 1440
caggccctga atttcaacag tgagactgtg ccacaaaaat cctcccttga agaaccggat 1500
ttttataaaa ctaaaatcaa gctctgcata cttcttcatg ctttcagaat cagagcagtg 1560
actattgata gagtgatgag ctatctgaat gcttcc 1596
<210> 95
<211> 6684
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人白介素-2 (IL-2)基因和5'-侧翼区"
<400> 95
agtggttttt ggagtcagta cattctcttt tcaaatcctt ctctgcccct tactggcaat 60
aagggctgag tgacctagag gcaaattact taacttctct gagcctcagt tttctaatct 120
gcaaaatagg agccatcact tcacaagtct gtaagactta tattagacta agtgcctgcc 180
tgtacactgt tctctttttc tctctttcta tatacctgaa ggcattatag tgctagatgt 240
ctgtttaaag accagacaat attgtcttaa aaaaacaaac aaaaacacag acaataccat 300
ctttaaaaaa aaaaaaaaag tccaggtaag aaataaataa ggccatagaa tggaagcttt 360
acaaggactc tctttgagac aggatctcct caagtgtccc caggttaaat tagaagtata 420
tatccgtaca attgttcagc cagtttgtgc actgtactga ggatgaatga acacctatcc 480
taaatatcct agtcttctga ctaaaaacaa gatcatattt cataacgatt attgttacat 540
tcatagtgtc ccaggtgatt tagaggataa ataaaaatcc attaaagagg taaagacata 600
aaaacgagaa acatggactg gtttacacat aacacataca aagtctatta taaaactagc 660
atcagtatcc ttgaatcgaa acctttttct gagtatttaa caatcgcacc ctttaaaaaa 720
tgtacataga cattaagaga cttaaacaga tatataatca ttttaaatta aaatagcgtt 780
aaacagtacc tcaagctcaa taagcatttt aagtattcta atcttagtat ttctctagct 840
gacatgtaag aagcaatcta tcttattgta tgcaattagc tctttgtgtg gataaaaagg 900
taaaaccatt ctgaaacagg aaaccaatac acttcctgtt taatcaacaa atctaaacat 960
ttattctttt catctgttta ctcttgctct tgtccaccac aatatgctat tcacatgttc 1020
agtgtagttt tatgacaaag aaaattttct gagttacttt tgtatcccca cccccttaaa 1080
gaaaggagga aaaactgttt catacagaag gcgttaattg catgaattag agctatcacc 1140
taagtgtggg ctaatgtaac aaagagggat ttcacctaca tccattcagt cagtctttgg 1200
gggtttaaag aaattccaaa gagtcatcag aagaggaaaa atgaaggtaa tgttttttca 1260
gactggtaaa gtctttgaaa atatgtgtaa tatgtaaaac attttgacac ccccataata 1320
tttttccaga attaacagta taaattgcat ctcttgttca agagttccct atcactcttt 1380
aatcactact cacagtaacc tcaactcctg ccacaatgta caggatgcaa ctcctgtctt 1440
gcattgcact aagtcttgca cttgtcacaa acagtgcacc tacttcaagt tctacaaaga 1500
aaacacagct acaactggag catttactgc tggatttaca gatgattttg aatggaatta 1560
atgtaagtat atttcctttc ttactaaaat tattacattt agtaatctag ctggagatca 1620
tttcttaata acaatgcatt atactttctt agaattacaa gaatcccaaa ctcaccagga 1680
tgctcacatt taagttttac atgcccaaga aggtaagtac aatattttat gttcaatttc 1740
tgttttaata aaattcaaag taatatgaaa atttgcacag atgggactaa tagcagctca 1800
tctgaggtaa agagtaactt taatttgttt ttttgaaaac ccaagtttga taatgaagcc 1860
tctattaaaa cagttttacc tatattttta atatatattt gtgtgttggt gggggtggga 1920
gaaaacataa aaataatatt ctctcacttt atcgataaga caattctaaa caaaaatgtt 1980
catttatggt ttcatttaaa aatgtaaaac tctaaaatat ttgattatgt cattttagta 2040
tgtaaaatac caaaatctat ttccaaggag cccactttta aaaatctttt cttgttttag 2100
gaaaggtttc taagtgagag gcagcataac actaatagca cagagtctgg ggccagatat 2160
ctgaagtgaa atctcagctc tgccatgtcc tagctttcat gatctttggc aaattaccta 2220
ctctgtttgt gattcagttt catgtctact taaatgaata actgtatata cttaatatgg 2280
ctttgtgaga attagtaagt aaatgtaaag cactcagaac cgtgtctggc ataaggtaaa 2340
taccatacaa gcattagcta ttattagtag tattaaagat aaaattttca ctgagaaata 2400
caaagtaaaa ttttggactt tatcttttta ccaatagaac ttgagattta taatgctata 2460
tgacttattt tccaagatta aaagcttcat taggttgttt ttggattcag atagagcata 2520
agcataatca tccaagctcc taggctacat taggtgtgta aagctaccta gtagctgtgc 2580
cagttaagag agaatgaaca aaatctggtg ccagaaagag cttgtgccag ggtgaatcca 2640
agcccagaaa ataataggat ttaaggggac acagatgcaa tcccattgac tcaaattcta 2700
ttaattcaag acaaatctgc ttctaactac ccttctgaaa gatgtaaagg agacagctta 2760
cagatgttac tctagtttaa tcagagccac ataatgcaac tccagcaaca taaagatact 2820
agatgctgtt ttctgaagaa aatttctcca cattgttcat gccaaaaact taaacccgaa 2880
tttgtagaat ttgtagtggt gaattgaaag cgcaatagat ggacatatca ggggattggt 2940
attgtcttga cctacctttc ccactaaaga gtgttagaaa gatgagatta tgtgcataat 3000
ttaggggtgg tagaattcat ggaaatctaa gtttgaaacc aaaagtaatg ataaactcta 3060
ttcatttgtt catttaaccc tcattgcaca tttacaaaag attttagaaa ctaataaaaa 3120
tatttgattc caaggatgct atgttaatgc tataatgaga aagaaatgaa atctaattct 3180
ggctctacct acttatgtgg tcaaattctg agatttagtg tgcttattta taaagtggag 3240
atgatacttc actgcctact tcaaaagatg actgtgagaa gtaaatgggc ctattttgga 3300
gaaaattctt ttaaattgta atataccata gaaatatgaa atattatata taatatagaa 3360
tcaagaggcc tgtccaaaag tcctcccaaa gtattataat cttttatttc actgggacaa 3420
acatttttaa aatgcatctt aatgtagtga ttgtagaaaa gtaaaaattt aagacatatt 3480
taaaaatgtg tcttgctcaa ggctatattg agagccacta ctacatgatt attgttacct 3540
agtgtaaaat gttgggattg tgatagatgg catccaagag ttccttctct ctcaacattc 3600
tgtgattctt aactcttaga ctatcaaata ttataatcat agaatgtgat ttttatgcct 3660
tccacattct aatctcatct ggttctaatg attttctatg cagattggaa aagtaatcag 3720
cctacatctg taataggcat ttagatgcag aaagtctaac attttgcaaa gccaaattaa 3780
gctaaaacca gtgagtcaac tatcacttaa cgctagtcat aggtacttga gccctagttt 3840
ttccagtttt ataatgtaaa ctctactggt ccatctttac agtgacattg agaacagaga 3900
gaatggtaaa aactacatac tgctactcca aataaaataa attggaaatt aatttctgat 3960
tctgacctct atgtaaactg agctgatgat aattattatt ctaggccaca gaactgaaac 4020
atcttcagtg tctagaagaa gaactcaaac ctctggagga agtgctaaat ttagctcaaa 4080
gcaaaaactt tcacttaaga cccagggact taatcagcaa tatcaacgta atagttctgg 4140
aactaaaggt aaggcattac tttatttgct ctcctggaaa taaaaaaaaa aaagtagggg 4200
gaaaagtacc acattttaaa gtgacataac atttttggta tttgtaaagt acccatgcat 4260
gtaattagcc tacattttaa gtacactgtg aacatgaatc atttctaatg ttaaatgatt 4320
aactggggag tataagctac tgagtttgca cctaccatct actaatggac aagcctcatc 4380
ccaaactcca tcacctttca tattaacaca aaactgggag tgagagagaa gtgactgagt 4440
tgagtttcac agaaacgcag gcaagatttt attatatatt tttcaagttc cttcacagat 4500
catttactgg aatagccaat actgagttac ctgaaaggct tttcaaatgg tgtttcctta 4560
tcatttgatg gaaggactac ccataagaga tttgtcttaa aaaaaaaaac tggagccatt 4620
aaaatggcca gtggactaaa caaacaacaa tctttttaga ggcaatccca ctttcagaat 4680
cttaagtatt tttaaatgca caggaagcat aaaatatgca agggactcag gtgatgtaaa 4740
agagattcac ttttgtcttt ttatatcccg tctcctaagg tataaaattc atgagttaat 4800
aggtatccta aataagcagc ataagtatag tagtaaaaga cattcctaaa agtaactcca 4860
gttgtgtcca aatgaatcac ttattagtgg actgtttcag ttgaattaaa aaaatacatt 4920
gagatcaatg tcatctagac attgacagat tcagttcctt atctatggca agagttttac 4980
tctaaaataa ttaacatcag aaaactcatt cttaactctt gatacaaatt taagacaaaa 5040
ccatgcaaaa atctgaaaac tgtgtttcaa aagccaaaca ctttttaaaa taaaaaaatc 5100
ccaagatatg acaatattta aacaattatg cttaagagga tacagaacac tgcaacagtt 5160
ttttaaaaga gaatacttat ttaaagggaa cactctatct cacctgcttt tgttcccagg 5220
gtaggaatca cttcaaattt gaaaagctct cttttaaatc tcactatata tcaaaatagt 5280
tgcctcctta gcttatcaac tagaggaagc gtttaaatag ctcctttcag cagagaagcc 5340
taatttctaa aaagccagtc cacagaacaa aatttctaat gtttaaagct tttaaaagtt 5400
ggcaaattca cctgcattga tactatgatg gggtagggat aggtgtaagt atttatgaag 5460
atgttcattc acacaaattt acccaaacag gaagcatgtc ctacctagct tactctagtg 5520
tagctcgttt cgtctttggg gaaaatataa ggagattcac ttaagtagaa aaataggaga 5580
ctctaatcaa gatttagaaa agaagaaagt ataatgtgca tatcaattca tacatttaac 5640
ttacacaaat ataggtgtac attcagagga aaagcgatca agtttatttc acatccagca 5700
tttaatattt gtctagatct atttttattt aaatctttat ttgcacccaa tttagggaaa 5760
aaatttttgt gttcattgac tgaattaaca aatgaggaaa atctcagctt ctgtgttact 5820
atcatttggt atcataacaa aatacgcaat tttggcattc attttgatca tttcaagaaa 5880
atgtgaataa ttaatatgtt tggtaagctt gaaaataaag gcaacaggcc tataagactt 5940
caattgggaa taactgtata taaggtaaac tactctgtac tttaaaaaat taacattttt 6000
cttttatagg gatctgaaac aacattcatg tgtgaatatg ctgatgagac agcaaccatt 6060
gtagaatttc tgaacagatg gattaccttt tgtcaaagca tcatctcaac actgacttga 6120
taattaagtg cttcccactt aaaacatatc aggccttcta tttatttaaa tatttaaatt 6180
ttatatttat tgttgaatgt atggtttgct acctattgta actattattc ttaatcttaa 6240
aactataaat atggatcttt tatgattctt tttgtaagcc ctaggggctc taaaatggtt 6300
tcacttattt atcccaaaat atttattatt atgttgaatg ttaaatatag tatctatgta 6360
gattggttag taaaactatt taataaattt gataaatata aacaagcctg gatatttgtt 6420
attttggaaa cagcacagag taagcattta aatatttctt agttacttgt gtgaactgta 6480
ggatggttaa aatgcttaca aaagtcactc tttctctgaa gaaatatgta gaacagagat 6540
gtagacttct caaaagccct tgctttgtcc tttcaagggc tgatcagacc cttagttctg 6600
gcatctctta gcagattata ttttccttct tcttaaaatg ccaaacacaa acactcttga 6660
aactcttcat agatttggtg tggc 6684
<210> 96
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD19-特异性嵌合抗原受体(CD19-CD8a-CD28-CD3z)"
<400> 96
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggagcag 240
gaggacatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggagatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gagagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg taccgtgtcc ggcgtgtccc tgcccgacta cggcgtgtcc 480
tggatccggc agccccctag gaagggcctg gagtggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgt 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtgt ccagcaagcc caccaccacc cctgccccta gacctccaac cccagcccct 780
acaatcgcca gccagcccct gagcctgagg cccgaagcct gtagacctgc cgctggcgga 840
gccgtgcaca ccagaggcct ggatttcgcc tgcgacatct acatctgggc ccctctggcc 900
ggcacctgtg gcgtgctgct gctgagcctg gtcatcaccc tgtactgcaa ccaccggaat 960
aggagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc ccggaggcct 1020
ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gcccctccca gggacttcgc cgcctaccgg 1080
agccgggtga agttcagccg gagcgccgac gcccctgcct accagcaggg ccagaaccag 1140
ctgtacaacg agctgaacct gggccggagg gaggagtacg acgtgctgga caagcggaga 1200
ggccgggacc ctgagatggg cggcaagccc cggagaaaga accctcagga gggcctgtat 1260
aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag 1320
cggcggaggg gcaagggcca cgacggcctg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggat 1380
acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg ccccccaga 1419
<210> 97
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="具有信号肽的CD19-特异性嵌合抗原受体(CD19-CD8a-CD28-CD3z)"
<400> 97
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120
gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240
cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gagcaggagg acatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360
ggcggcggaa caaagctgga gatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420
ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaga gcggccctgg cctggtggcc 480
cccagccaga gcctgagcgt gacctgtacc gtgtccggcg tgtccctgcc cgactacggc 540
gtgtcctgga tccggcagcc ccctaggaag ggcctggagt ggctgggcgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660
agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720
tactgtgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accagcgtga ccgtgtccag caagcccacc accacccctg cccctagacc tccaacccca 840
gcccctacaa tcgccagcca gcccctgagc ctgaggcccg aagcctgtag acctgccgct 900
ggcggagccg tgcacaccag aggcctggat ttcgcctgcg acatctacat ctgggcccct 960
ctggccggca cctgtggcgt gctgctgctg agcctggtca tcaccctgta ctgcaaccac 1020
cggaatagga gcaagcggag cagaggcggc cacagcgact acatgaacat gaccccccgg 1080
aggcctggcc ccacccggaa gcactaccag ccctacgccc ctcccaggga cttcgccgcc 1140
taccggagcc gggtgaagtt cagccggagc gccgacgccc ctgcctacca gcagggccag 1200
aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc cggagggagg agtacgacgt gctggacaag 1260
cggagaggcc gggaccctga gatgggcggc aagccccgga gaaagaaccc tcaggagggc 1320
ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag 1380
ggcgagcggc ggaggggcaa gggccacgac ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc 1440
aaggatacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc ccaga 1485
<210> 98
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-CD19单克隆抗体克隆FMC63可变重链"
<400> 98
gaggtgaagc tgcaggagag cggccctggc ctggtggccc ccagccagag cctgagcgtg 60
acctgtaccg tgtccggcgt gtccctgccc gactacggcg tgtcctggat ccggcagccc 120
cctaggaagg gcctggagtg gctgggcgtg atctggggca gcgagaccac ctactacaac 180
agcgccctga agagccggct gaccatcatc aaggacaaca gcaagagcca ggtgttcctg 240
aagatgaaca gcctgcagac cgacgacacc gccatctact actgtgccaa gcactactac 300
tacggcggca gctacgccat ggactactgg ggccagggca ccagcgtgac cgtgtccagc 360
<210> 99
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="具有Whitlow连接体的抗-CD19克隆FMC63单链片段可变(scFv)"
<400> 99
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggagcag 240
gaggacatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggagatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gagagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg taccgtgtcc ggcgtgtccc tgcccgacta cggcgtgtcc 480
tggatccggc agccccctag gaagggcctg gagtggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgt 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtgt ccagc 735
<210> 100
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="hM195 VL"
<400> 100
gacattcaga tgacccagtc tccgagctct ctgtccgcat cagtaggaga cagggtcacc 60
atcacatgca gagccagcga aagtgtcgac aattatggca ttagctttat gaactggttc 120
caacagaaac ccgggaaggc tcctaagctt ctgatttacg ctgcatccaa ccaaggctcc 180
ggggtaccct ctcgcttctc aggcagtgga tctgggacag acttcactct caccatttca 240
tctctgcagc ctgatgactt cgcaacctat tactgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300
acgttcggtc aagggaccaa ggtggagatc aaa 333
<210> 101
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="hM195 VH"
<400> 101
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggagctc agtgaaggtt 60
tcctgcaaag cttctggcta caccttcact gactacaaca tgcactgggt gaggcaggct 120
cctggccaag gcctggaatg gattggatat atttatcctt acaatggtgg taccggctac 180
aaccagaagt tcaagagcaa ggccacaatt acagcagacg agagtactaa cacagcctac 240
atggaactct ccagcctgag gtctgaggac actgcagtct attactgcgc aagagggcgc 300
cccgctatgg actactgggg ccaagggact ctggtcactg tctcttca 348
<210> 102
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="具有连接体的hM195 scFv"
<400> 102
gacattcaga tgacccagtc tccgagctct ctgtccgcat cagtaggaga cagggtcacc 60
atcacatgca gagccagcga aagtgtcgac aattatggca ttagctttat gaactggttc 120
caacagaaac ccgggaaggc tcctaagctt ctgatttacg ctgcatccaa ccaaggctcc 180
ggggtaccct ctcgcttctc aggcagtgga tctgggacag acttcactct caccatttca 240
tctctgcagc ctgatgactt cgcaacctat tactgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300
acgttcggtc aagggaccaa ggtggagatc aaaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg 360
tcgggtggcg gcggatctca ggttcagctg gtgcagtctg gagctgaggt gaagaagcct 420
gggagctcag tgaaggtttc ctgcaaagct tctggctaca ccttcactga ctacaacatg 480
cactgggtga ggcaggctcc tggccaaggc ctggaatgga ttggatatat ttatccttac 540
aatggtggta ccggctacaa ccagaagttc aagagcaagg ccacaattac agcagacgag 600
agtactaaca cagcctacat ggaactctcc agcctgaggt ctgaggacac tgcagtctat 660
tactgcgcaa gagggcgccc cgctatggac tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 720
tcttca 726
<210> 103
<211> 2773
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR 可变 III (EGFRvIII)"
<400> 103
atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg 60
gcgagtcggg ctctggagga aaagaaaggt aattatgtgg tgacagatca cggctcgtgc 120
gtccgagcct gtggggccga cagctatgag atggaggaag acggcgtccg caagtgtaag 180
aagtgcgaag ggccttgccg caaagtgtgt aacggaatag gtattggtga atttaaagac 240
tcactctcca taaatgctac gaatattaaa cacttcaaaa actgcacctc catcagtggc 300
gatctccaca tcctgccggt ggcatttagg ggtgactcct tcacacatac tcctcctctg 360
gatccacagg aactggatat tctgaaaacc gtaaaggaaa tcacagggtt tttgctgatt 420
caggcttggc ctgaaaacag gacggacctc catgcctttg agaacctaga aatcatacgc 480
ggcaggacca agcaacatgg tcagttttct cttgcagtcg tcagcctgaa cataacatcc 540
ttgggattac gctccctcaa ggagataagt gatggagatg tgataatttc aggaaacaaa 600
aatttgtgct atgcaaatac aataaactgg aaaaaactgt ttgggacctc cggtcagaaa 660
accaaaatta taagcaacag aggtgaaaac agctgcaagg ccacaggcca ggtctgccat 720
gccttgtgct cccccgaggg ctgctggggc ccggagccca gggactgcgt ctcttgccgg 780
aatgtcagcc gaggcaggga atgcgtggac aagtgcaacc ttctggaggg tgagccaagg 840
gagtttgtgg agaactctga gtgcatacag tgccacccag agtgcctgcc tcaggccatg 900
aacatcacct gcacaggacg gggaccagac aggagtcatg ggagaaaaca acaccctggt 960
ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc catccaaact gcacctacgg 1020
atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg cctaagatcc cgtccatcgc 1080
cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg gccctgggga tcggcctctt 1140
catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg cacgctgcgg aggctgctgc aggagaggga 1200
gcttgtggag cctcttacac ccagtggaga agctcccaac caagctctct tgaggatctt 1260
gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc ggtgcgttcg gcacggtgta 1320
taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt cccgtcgcta tcaaggaatt 1380
aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc gatgaagcct acgtgatggc 1440
cagcgtggac aacccccacg tgtgccgcct gctgggcatc tgcctcacct ccaccgtgca 1500
gctcatcacg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac tatgtccggg aacacaaaga 1560
caatattggc tcccagtacc tgctcaactg gtgtgtgcag atcgcaaagg gcatgaacta 1620
cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga cctggcagcc aggaacgtac tggtgaaaac 1680
accgcagcat gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa ctgctgggtg cggaagagaa 1740
agaataccat gcagaaggag gcaaagtgcc tatcaagtgg atggcattgg aatcaatttt 1800
acacagaatc tatacccacc agagtgatgt ctggagctac ggggtgactg tttgggagtt 1860
gatgaccttt ggatccaagc catatgacgg aatccctgcc agcgagatct cctccatcct 1920
ggagaaagga gaacgcctcc ctcagccacc catatgtacc atcgatgtct acatgatcat 1980
ggtcaagtgc tggatgatag acgcagatag tcgcccaaag ttccgtgagt tgatcatcga 2040
attctccaaa atggcccgag acccccagcg ctaccttgtc attcaggggg atgaaagaat 2100
gcatttgcca agtcctacag actccaactt ctaccgtgcc ctgatggatg aagaagacat 2160
ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag cagggcttct tcagcagccc 2220
ctccacgtca cggactcccc tcctgagctc tctgagtgca accagcaaca attccaccgt 2280
ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgtcccatc aaggaagaca gcttcttgca 2340
gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac agcatagacg acaccttcct 2400
cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg cccgctggct ctgtgcagaa 2460
tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc agagacccac actaccagga 2520
cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac actgtccagc ccacctgtgt 2580
caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaaa ggcagccacc aaattagcct 2640
ggacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa gccaagccaa atggcatctt 2700
taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc gcgccacaaa gcagtgaatt 2760
tattggagca tga 2773
<210> 104
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆139 VH"
<400> 104
gaagtgcagg tgctggaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt gcgccaggcc 120
cctggaaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atctctggct ccggcggcag caccaattac 180
gccgatagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc cggaagctct 300
gggtggagcg agtattgggg ccagggcaca ctcgtgaccg tgtccagc 348
<210> 105
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆139 VL"
<400> 105
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcca gggcatccgg aacaacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagcggct gatctacgcc gccagcaatc tgcagagcgg cgtgccctct 180
agattcaccg gctctggcag cggcaccgag ttcaccctga tcgtgtctag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag caccacagct accccctgac atctggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 106
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆MR1 VH"
<400> 106
caagtgaagc tgcagcagtc tggcggaggc ctcgtgaaac ctggcgcctc tctgaagctg 60
agctgcgtga ccagcggctt caccttcaga aagttcggca tgagctgggt gcgccagacc 120
agcgacaagc ggctggaatg ggtggccagc atcagcaccg gcggctacaa cacctactac 180
agcgacaacg tgaagggcag attcaccatc agcagagaga acgccaagaa taccctgtac 240
ctgcagatga gcagcctgaa gtccgaggac accgccctgt actactgcac cagaggctac 300
agcagcacca gctacgccat ggactattgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtctagt 360
<210> 107
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆MR1 VL"
<400> 107
gacatcgagc tgacacagag ccctgccagc ctgtctgtgg ccaccggcga gaaagtgacc 60
atccggtgca tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcgagcccc ccaagttcct gatcagcgag ggcaacacac tgcggcctgg cgtgccaagc 180
agattcagca gctctggcac cggcaccgac ttcgtgttca ccatcgagaa caccctgagc 240
gaggacgtgg gcgactacta ctgcctgcag agcttcaacg tgcccctgac ctttggcgac 300
ggcaccaagc tggaaatcaa g 321
<210> 108
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆MR1-1 VH"
<400> 108
caagtgaagc tgcagcagtc tggcggaggc ctcgtgaaac ctggcgcctc tctgaagctg 60
agctgcgtga ccagcggctt caccttcaga aagttcggca tgagctgggt gcgccagacc 120
agcgacaagc ggctggaatg ggtggccagc atcagcaccg gcggctacaa cacctactac 180
agcgacaacg tgaagggcag attcaccatc agcagagaga acgccaagaa taccctgtac 240
ctgcagatga gcagcctgaa gtccgaggac accgccctgt actactgcac cagaggctac 300
agcccctaca gctacgccat ggactattgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtctagt 360
<210> 109
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆MR1-1 VL"
<400> 109
gacatcgagc tgacacagag ccctgccagc ctgtctgtgg ccaccggcga gaaagtgacc 60
atccggtgca tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcgagcccc ccaagttcct gatcagcgag ggcaacacac tgcggcctgg cgtgccaagc 180
agattcagca gctctggcac cggcaccgac ttcgtgttca ccatcgagaa caccctgagc 240
gaggacgtgg gcgactacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgac 300
ggcaccaagc tggaaatcaa g 321
<210> 110
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆humMR1-1 VH"
<400> 110
caggtgcagc tgcaggaatc tggcggaggg ctcgtgaagc ctggcggaag cctgaagctg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aagttcggca tgagctgggt gcgccagacc 120
cccgacaaga gactggaatg ggtggccagc atcagcaccg gcggctacaa tacctactac 180
agcgacaacg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga gcagcctgaa gtccgaggac accgccatgt actactgtgc cagaggctac 300
agcccctaca gctacgccat ggattactgg ggccagggca caatggtcac cgtgtcctct 360
<210> 111
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆humMR1-1 VL"
<400> 111
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaagaccc ccaagctgct gatctacgag ggcaacaccc tgaggcctgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcatcttca ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 112
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆humMR1-2 VH"
<400> 112
caggtgcagc tgcaggaatc tggcggaggg ctcgtgaagc ctggcggaag cctgaagctg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc aagttcggca tgagctgggt gcgccagacc 120
cccgacaaga gactggaatg ggtggccagc atcagcaccg gcggctacaa caccttctac 180
agcgacaacg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga gcagcctgaa gtccgaggac accgccatgt actactgtgc cagaggctac 300
agcccctaca gcttcgccat ggattactgg ggccagggca caatggtcac cgtgtcctct 360
<210> 113
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆humMR1-2 VL"
<400> 113
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaagaccc ccaagctgct gatctacgag ggcaacaccc tgaggcctgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcatcttca ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 114
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII scFv克隆139"
<400> 114
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcca gggcatccgg aacaacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagcggct gatctacgcc gccagcaatc tgcagagcgg cgtgccctct 180
agattcaccg gctctggcag cggcaccgag ttcaccctga tcgtgtctag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag caccacagct accccctgac atctggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcagcaca agcggcagcg gaaaacctgg atctggcgag 360
ggctctacca agggcgaagt gcaggtgctg gaaagcggcg gaggactggt gcagcctggc 420
ggatctctga gactgagctg tgccgccagc ggcttcacct tcagcagcta cgccatgagc 480
tgggtgcgcc aggcccctgg aaaaggcctg gaatgggtgt ccgccatctc tggctccggc 540
ggcagcacca attacgccga tagcgtgaag ggccggttca ccatcagccg ggacaacagc 600
aagaacaccc tgtacctgca gatgaacagc ctgagagccg aggacaccgc cgtgtactac 660
tgtgccggaa gctctgggtg gagcgagtat tggggccagg gcacactcgt gaccgtgtcc 720
agc 723
<210> 115
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII scFv克隆MR1"
<400> 115
gacatcgagc tgacacagag ccctgccagc ctgtctgtgg ccaccggcga gaaagtgacc 60
atccggtgca tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcgagcccc ccaagttcct gatcagcgag ggcaacacac tgcggcctgg cgtgccaagc 180
agattcagca gctctggcac cggcaccgac ttcgtgttca ccatcgagaa caccctgagc 240
gaggacgtgg gcgactacta ctgcctgcag agcttcaacg tgcccctgac ctttggcgac 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcaag tgaagctgca gcagtctggc ggaggcctcg tgaaacctgg cgcctctctg 420
aagctgagct gcgtgaccag cggcttcacc ttcagaaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagaccagcg acaagcggct ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaacacc 540
tactacagcg acaacgtgaa gggcagattc accatcagca gagagaacgc caagaatacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccctgtacta ctgcaccaga 660
ggctacagca gcaccagcta cgccatggac tattggggcc agggcaccac cgtgaccgtg 720
tctagt 726
<210> 116
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗EGFRvIII scFv克隆MR1-1"
<400> 116
gacatcgagc tgacacagag ccctgccagc ctgtctgtgg ccaccggcga gaaagtgacc 60
atccggtgca tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcgagcccc ccaagttcct gatcagcgag ggcaacacac tgcggcctgg cgtgccaagc 180
agattcagca gctctggcac cggcaccgac ttcgtgttca ccatcgagaa caccctgagc 240
gaggacgtgg gcgactacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgac 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcaag tgaagctgca gcagtctggc ggaggcctcg tgaaacctgg cgcctctctg 420
aagctgagct gcgtgaccag cggcttcacc ttcagaaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagaccagcg acaagcggct ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaacacc 540
tactacagcg acaacgtgaa gggcagattc accatcagca gagagaacgc caagaatacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccctgtacta ctgcaccaga 660
ggctacagcc cctacagcta cgccatggac tattggggcc agggcaccac cgtgaccgtg 720
tctagt 726
<210> 117
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII scFv克隆huMR1-1"
<400> 117
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaagaccc ccaagctgct gatctacgag ggcaacaccc tgaggcctgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcatcttca ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcagg tgcagctgca ggaatctggc ggagggctcg tgaagcctgg cggaagcctg 420
aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc ttcagcaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagacccccg acaagagact ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaatacc 540
tactacagcg acaacgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaacgc caagaacacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccatgtacta ctgtgccaga 660
ggctacagcc cctacagcta cgccatggat tactggggcc agggcacaat ggtcaccgtg 720
tcctct 726
<210> 118
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII scFv克隆huMR1-2"
<400> 118
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaagaccc ccaagctgct gatctacgag ggcaacaccc tgaggcctgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcatcttca ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcagg tgcagctgca ggaatctggc ggagggctcg tgaagcctgg cggaagcctg 420
aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc ttcagcaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagacccccg acaagagact ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaacacc 540
ttctacagcg acaacgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaacgc caagaacacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccatgtacta ctgtgccaga 660
ggctacagcc cctacagctt cgccatggat tactggggcc agggcacaat ggtcaccgtg 720
tcctct 726
<210> 119
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (克隆139 scFv.CD8alpha 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 119
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcca gggcatccgg aacaacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagcggct gatctacgcc gccagcaatc tgcagagcgg cgtgccctct 180
agattcaccg gctctggcag cggcaccgag ttcaccctga tcgtgtctag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag caccacagct accccctgac atctggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcagcaca agcggcagcg gaaaacctgg atctggcgag 360
ggctctacca agggcgaagt gcaggtgctg gaaagcggcg gaggactggt gcagcctggc 420
ggatctctga gactgagctg tgccgccagc ggcttcacct tcagcagcta cgccatgagc 480
tgggtgcgcc aggcccctgg aaaaggcctg gaatgggtgt ccgccatctc tggctccggc 540
ggcagcacca attacgccga tagcgtgaag ggccggttca ccatcagccg ggacaacagc 600
aagaacaccc tgtacctgca gatgaacagc ctgagagccg aggacaccgc cgtgtactac 660
tgtgccggaa gctctgggtg gagcgagtat tggggccagg gcacactcgt gaccgtgtcc 720
agcaagccca ccaccacccc tgcccctaga cctccaaccc cagcccctac aatcgccagc 780
cagcccctga gcctgaggcc cgaagcctgt agacctgccg ctggcggagc cgtgcacacc 840
agaggcctgg atttcgcctg cgacatctac atctgggccc ctctggccgg cacctgtggc 900
gtgctgctgc tgagcctggt catcaccctg tactgcaacc accggaataa gagaggccgg 960
aagaaactgc tgtacatctt caagcagccc ttcatgcggc ccgtgcagac cacccaggaa 1020
gaggacggct gcagctgccg gttccccgag gaagaggaag gcggctgcga actgcgggtg 1080
aagttcagcc ggagcgccga cgcccctgcc taccagcagg gccagaacca gctgtacaac 1140
gagctgaacc tgggccggag ggaggagtac gacgtgctgg acaagcggag aggccgggac 1200
cctgagatgg gcggcaagcc ccggagaaag aaccctcagg agggcctgta taacgaactg 1260
cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggca tgaagggcga gcggcggagg 1320
ggcaagggcc acgacggcct gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga tacctacgac 1380
gccctgcaca tgcaggccct gccccccaga 1410
<210> 120
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (MR1 scFv.CD8alpha 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 120
gacatcgagc tgacacagag ccctgccagc ctgtctgtgg ccaccggcga gaaagtgacc 60
atccggtgca tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcgagcccc ccaagttcct gatcagcgag ggcaacacac tgcggcctgg cgtgccaagc 180
agattcagca gctctggcac cggcaccgac ttcgtgttca ccatcgagaa caccctgagc 240
gaggacgtgg gcgactacta ctgcctgcag agcttcaacg tgcccctgac ctttggcgac 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcaag tgaagctgca gcagtctggc ggaggcctcg tgaaacctgg cgcctctctg 420
aagctgagct gcgtgaccag cggcttcacc ttcagaaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagaccagcg acaagcggct ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaacacc 540
tactacagcg acaacgtgaa gggcagattc accatcagca gagagaacgc caagaatacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccctgtacta ctgcaccaga 660
ggctacagca gcaccagcta cgccatggac tattggggcc agggcaccac cgtgaccgtg 720
tctagtaagc ccaccaccac ccctgcccct agacctccaa ccccagcccc tacaatcgcc 780
agccagcccc tgagcctgag gcccgaagcc tgtagacctg ccgctggcgg agccgtgcac 840
accagaggcc tggatttcgc ctgcgacatc tacatctggg cccctctggc cggcacctgt 900
ggcgtgctgc tgctgagcct ggtcatcacc ctgtactgca accaccggaa taagagaggc 960
cggaagaaac tgctgtacat cttcaagcag cccttcatgc ggcccgtgca gaccacccag 1020
gaagaggacg gctgcagctg ccggttcccc gaggaagagg aaggcggctg cgaactgcgg 1080
gtgaagttca gccggagcgc cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac 1140
aacgagctga acctgggccg gagggaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg 1200
gaccctgaga tgggcggcaa gccccggaga aagaaccctc aggagggcct gtataacgaa 1260
ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg 1320
aggggcaagg gccacgacgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac 1380
gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc aga 1413
<210> 121
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (MR1-1 scFv.CD8alpha 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 121
gacatcgagc tgacacagag ccctgccagc ctgtctgtgg ccaccggcga gaaagtgacc 60
atccggtgca tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcgagcccc ccaagttcct gatcagcgag ggcaacacac tgcggcctgg cgtgccaagc 180
agattcagca gctctggcac cggcaccgac ttcgtgttca ccatcgagaa caccctgagc 240
gaggacgtgg gcgactacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgac 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcaag tgaagctgca gcagtctggc ggaggcctcg tgaaacctgg cgcctctctg 420
aagctgagct gcgtgaccag cggcttcacc ttcagaaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagaccagcg acaagcggct ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaacacc 540
tactacagcg acaacgtgaa gggcagattc accatcagca gagagaacgc caagaatacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccctgtacta ctgcaccaga 660
ggctacagcc cctacagcta cgccatggac tattggggcc agggcaccac cgtgaccgtg 720
tctagtaagc ccaccaccac ccctgcccct agacctccaa ccccagcccc tacaatcgcc 780
agccagcccc tgagcctgag gcccgaagcc tgtagacctg ccgctggcgg agccgtgcac 840
accagaggcc tggatttcgc ctgcgacatc tacatctggg cccctctggc cggcacctgt 900
ggcgtgctgc tgctgagcct ggtcatcacc ctgtactgca accaccggaa taagagaggc 960
cggaagaaac tgctgtacat cttcaagcag cccttcatgc ggcccgtgca gaccacccag 1020
gaagaggacg gctgcagctg ccggttcccc gaggaagagg aaggcggctg cgaactgcgg 1080
gtgaagttca gccggagcgc cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac 1140
aacgagctga acctgggccg gagggaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg 1200
gaccctgaga tgggcggcaa gccccggaga aagaaccctc aggagggcct gtataacgaa 1260
ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg 1320
aggggcaagg gccacgacgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac 1380
gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc aga 1413
<210> 122
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (humMR1-1 scFv.CD8alpha 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 122
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaagaccc ccaagctgct gatctacgag ggcaacaccc tgaggcctgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcatcttca ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcagg tgcagctgca ggaatctggc ggagggctcg tgaagcctgg cggaagcctg 420
aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc ttcagcaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagacccccg acaagagact ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaatacc 540
tactacagcg acaacgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaacgc caagaacacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccatgtacta ctgtgccaga 660
ggctacagcc cctacagcta cgccatggat tactggggcc agggcacaat ggtcaccgtg 720
tcctctaagc ccaccaccac ccctgcccct agacctccaa ccccagcccc tacaatcgcc 780
agccagcccc tgagcctgag gcccgaagcc tgtagacctg ccgctggcgg agccgtgcac 840
accagaggcc tggatttcgc ctgcgacatc tacatctggg cccctctggc cggcacctgt 900
ggcgtgctgc tgctgagcct ggtcatcacc ctgtactgca accaccggaa taagagaggc 960
cggaagaaac tgctgtacat cttcaagcag cccttcatgc ggcccgtgca gaccacccag 1020
gaagaggacg gctgcagctg ccggttcccc gaggaagagg aaggcggctg cgaactgcgg 1080
gtgaagttca gccggagcgc cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac 1140
aacgagctga acctgggccg gagggaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg 1200
gaccctgaga tgggcggcaa gccccggaga aagaaccctc aggagggcct gtataacgaa 1260
ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg 1320
aggggcaagg gccacgacgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac 1380
gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc aga 1413
<210> 123
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (humMR1-2 scFv.CD8alpha 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 123
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaagaccc ccaagctgct gatctacgag ggcaacaccc tgaggcctgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcatcttca ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcagg tgcagctgca ggaatctggc ggagggctcg tgaagcctgg cggaagcctg 420
aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc ttcagcaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagacccccg acaagagact ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaacacc 540
ttctacagcg acaacgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaacgc caagaacacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccatgtacta ctgtgccaga 660
ggctacagcc cctacagctt cgccatggat tactggggcc agggcacaat ggtcaccgtg 720
tcctctaagc ccaccaccac ccctgcccct agacctccaa ccccagcccc tacaatcgcc 780
agccagcccc tgagcctgag gcccgaagcc tgtagacctg ccgctggcgg agccgtgcac 840
accagaggcc tggatttcgc ctgcgacatc tacatctggg cccctctggc cggcacctgt 900
ggcgtgctgc tgctgagcct ggtcatcacc ctgtactgca accaccggaa taagagaggc 960
cggaagaaac tgctgtacat cttcaagcag cccttcatgc ggcccgtgca gaccacccag 1020
gaagaggacg gctgcagctg ccggttcccc gaggaagagg aaggcggctg cgaactgcgg 1080
gtgaagttca gccggagcgc cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac 1140
aacgagctga acctgggccg gagggaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg 1200
gaccctgaga tgggcggcaa gccccggaga aagaaccctc aggagggcct gtataacgaa 1260
ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg 1320
aggggcaagg gccacgacgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac 1380
gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc aga 1413
<210> 124
<211> 1554
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (MR1-1 scFv.CD8alpha 2x 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 124
gacatcgagc tgacacagag ccctgccagc ctgtctgtgg ccaccggcga gaaagtgacc 60
atccggtgca tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcgagcccc ccaagttcct gatcagcgag ggcaacacac tgcggcctgg cgtgccaagc 180
agattcagca gctctggcac cggcaccgac ttcgtgttca ccatcgagaa caccctgagc 240
gaggacgtgg gcgactacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgac 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcaag tgaagctgca gcagtctggc ggaggcctcg tgaaacctgg cgcctctctg 420
aagctgagct gcgtgaccag cggcttcacc ttcagaaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagaccagcg acaagcggct ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaacacc 540
tactacagcg acaacgtgaa gggcagattc accatcagca gagagaacgc caagaatacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccctgtacta ctgcaccaga 660
ggctacagcc cctacagcta cgccatggac tattggggcc agggcaccac cgtgaccgtg 720
tctagtaaac ctactacaac tcctgccccc cggcctccta caccagctcc tactatcgcc 780
tcccagccac tcagtctcag acccgaggct tctaggccag cggccggagg cgcggtccac 840
acccgcgggc tggactttgc atccgataag cccaccacca cccctgcccc tagacctcca 900
accccagccc ctacaatcgc cagccagccc ctgagcctga ggcccgaagc ctgtagacct 960
gccgctggcg gagccgtgca caccagaggc ctggatttcg cctgcgacat ctacatctgg 1020
gcccctctgg ccggcacctg tggcgtgctg ctgctgagcc tggtcatcac cctgtactgc 1080
aaccaccgga ataagagagg ccggaagaaa ctgctgtaca tcttcaagca gcccttcatg 1140
cggcccgtgc agaccaccca ggaagaggac ggctgcagct gccggttccc cgaggaagag 1200
gaaggcggct gcgaactgcg ggtgaagttc agccggagcg ccgacgcccc tgcctaccag 1260
cagggccaga accagctgta caacgagctg aacctgggcc ggagggagga gtacgacgtg 1320
ctggacaagc ggagaggccg ggaccctgag atgggcggca agccccggag aaagaaccct 1380
caggagggcc tgtataacga actgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1440
ggcatgaagg gcgagcggcg gaggggcaag ggccacgacg gcctgtacca gggcctgagc 1500
accgccacca aggataccta cgacgccctg cacatgcagg ccctgccccc caga 1554
<210> 125
<211> 1695
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (MR1-1 scFv.CD8alpha 3x 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 125
gacatcgagc tgacacagag ccctgccagc ctgtctgtgg ccaccggcga gaaagtgacc 60
atccggtgca tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcgagcccc ccaagttcct gatcagcgag ggcaacacac tgcggcctgg cgtgccaagc 180
agattcagca gctctggcac cggcaccgac ttcgtgttca ccatcgagaa caccctgagc 240
gaggacgtgg gcgactacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgac 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcaag tgaagctgca gcagtctggc ggaggcctcg tgaaacctgg cgcctctctg 420
aagctgagct gcgtgaccag cggcttcacc ttcagaaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagaccagcg acaagcggct ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaacacc 540
tactacagcg acaacgtgaa gggcagattc accatcagca gagagaacgc caagaatacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccctgtacta ctgcaccaga 660
ggctacagcc cctacagcta cgccatggac tattggggcc agggcaccac cgtgaccgtg 720
tctagtaagc ctaccaccac ccccgcacct cgtcctccaa cccctgcacc tacgattgcc 780
agtcagcctc tttcactgcg gcctgaggcc agcagaccag ctgccggcgg tgccgtccat 840
acaagaggac tggacttcgc gtccgataaa cctactacca ctccagcccc aaggccccca 900
accccagcac cgactatcgc atcacagcct ttgtcactgc gtcctgaagc cagccggcca 960
gctgcagggg gggccgtcca cacaagggga ctcgactttg cgagtgataa gcccaccacc 1020
acccctgccc ctagacctcc aaccccagcc cctacaatcg ccagccagcc cctgagcctg 1080
aggcccgaag cctgtagacc tgccgctggc ggagccgtgc acaccagagg cctggatttc 1140
gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct gtggcgtgct gctgctgagc 1200
ctggtcatca ccctgtactg caaccaccgg aataagagag gccggaagaa actgctgtac 1260
atcttcaagc agcccttcat gcggcccgtg cagaccaccc aggaagagga cggctgcagc 1320
tgccggttcc ccgaggaaga ggaaggcggc tgcgaactgc gggtgaagtt cagccggagc 1380
gccgacgccc ctgcctacca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1440
cggagggagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggcc gggaccctga gatgggcggc 1500
aagccccgga gaaagaaccc tcaggagggc ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg 1560
gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcggc ggaggggcaa gggccacgac 1620
ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggatacct acgacgccct gcacatgcag 1680
gccctgcccc ccaga 1695
<210> 126
<211> 1836
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (MR1-1 scFv.CD8alpha 4x 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 126
gacatcgagc tgacacagag ccctgccagc ctgtctgtgg ccaccggcga gaaagtgacc 60
atccggtgca tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcgagcccc ccaagttcct gatcagcgag ggcaacacac tgcggcctgg cgtgccaagc 180
agattcagca gctctggcac cggcaccgac ttcgtgttca ccatcgagaa caccctgagc 240
gaggacgtgg gcgactacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgac 300
ggcaccaagc tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcaag tgaagctgca gcagtctggc ggaggcctcg tgaaacctgg cgcctctctg 420
aagctgagct gcgtgaccag cggcttcacc ttcagaaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagaccagcg acaagcggct ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaacacc 540
tactacagcg acaacgtgaa gggcagattc accatcagca gagagaacgc caagaatacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccctgtacta ctgcaccaga 660
ggctacagcc cctacagcta cgccatggac tattggggcc agggcaccac cgtgaccgtg 720
tctagtaagc ctaccaccac ccccgcacct cgtcctccaa cccctgcacc tacgattgcc 780
agtcagcctc tttcactgcg gcctgaggcc agcagaccag ctgccggcgg tgccgtccat 840
acaagaggac tggacttcgc gtccgataaa cctactacca ctccagcccc aaggccccca 900
accccagcac cgactatcgc atcacagcct ttgtcactgc gtcctgaagc cagccggcca 960
gctgcagggg gggccgtcca cacaagggga ctcgactttg cgagtgataa acctactaca 1020
actcctgccc cccggcctcc tacaccagct cctactatcg cctcccagcc actcagtctc 1080
agacccgagg cttctaggcc agcggccgga ggcgcggtcc acacccgcgg gctggacttt 1140
gcatccgata agcccaccac cacccctgcc cctagacctc caaccccagc ccctacaatc 1200
gccagccagc ccctgagcct gaggcccgaa gcctgtagac ctgccgctgg cggagccgtg 1260
cacaccagag gcctggattt cgcctgcgac atctacatct gggcccctct ggccggcacc 1320
tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtcatc accctgtact gcaaccaccg gaataagaga 1380
ggccggaaga aactgctgta catcttcaag cagcccttca tgcggcccgt gcagaccacc 1440
caggaagagg acggctgcag ctgccggttc cccgaggaag aggaaggcgg ctgcgaactg 1500
cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1560
tacaacgagc tgaacctggg ccggagggag gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 1620
cgggaccctg agatgggcgg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataac 1680
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 1740
cggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 1800
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 1836
<210> 127
<211> 1695
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (huMR1-1 scFv.CD8alpha 3x 铰链
& TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 127
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaagaccc ccaagctgct gatctacgag ggcaacaccc tgaggcctgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcatcttca ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcagg tgcagctgca ggaatctggc ggagggctcg tgaagcctgg cggaagcctg 420
aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc ttcagcaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagacccccg acaagagact ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaatacc 540
tactacagcg acaacgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaacgc caagaacacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccatgtacta ctgtgccaga 660
ggctacagcc cctacagcta cgccatggat tactggggcc agggcacaat ggtcaccgtg 720
tcctctaagc ctaccaccac ccccgcacct cgtcctccaa cccctgcacc tacgattgcc 780
agtcagcctc tttcactgcg gcctgaggcc agcagaccag ctgccggcgg tgccgtccat 840
acaagaggac tggacttcgc gtccgataaa cctactacca ctccagcccc aaggccccca 900
accccagcac cgactatcgc atcacagcct ttgtcactgc gtcctgaagc cagccggcca 960
gctgcagggg gggccgtcca cacaagggga ctcgactttg cgagtgataa gcccaccacc 1020
acccctgccc ctagacctcc aaccccagcc cctacaatcg ccagccagcc cctgagcctg 1080
aggcccgaag cctgtagacc tgccgctggc ggagccgtgc acaccagagg cctggatttc 1140
gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct gtggcgtgct gctgctgagc 1200
ctggtcatca ccctgtactg caaccaccgg aataagagag gccggaagaa actgctgtac 1260
atcttcaagc agcccttcat gcggcccgtg cagaccaccc aggaagagga cggctgcagc 1320
tgccggttcc ccgaggaaga ggaaggcggc tgcgaactgc gggtgaagtt cagccggagc 1380
gccgacgccc ctgcctacca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1440
cggagggagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggcc gggaccctga gatgggcggc 1500
aagccccgga gaaagaaccc tcaggagggc ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg 1560
gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcggc ggaggggcaa gggccacgac 1620
ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggatacct acgacgccct gcacatgcag 1680
gccctgcccc ccaga 1695
<210> 128
<211> 1836
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (huMR1-1 scFv.CD8alpha 4x 铰链
& TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 128
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaagaccc ccaagctgct gatctacgag ggcaacaccc tgaggcctgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcatcttca ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcagg tgcagctgca ggaatctggc ggagggctcg tgaagcctgg cggaagcctg 420
aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc ttcagcaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagacccccg acaagagact ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaatacc 540
tactacagcg acaacgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaacgc caagaacacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccatgtacta ctgtgccaga 660
ggctacagcc cctacagcta cgccatggat tactggggcc agggcacaat ggtcaccgtg 720
tcctctaagc ctaccaccac ccccgcacct cgtcctccaa cccctgcacc tacgattgcc 780
agtcagcctc tttcactgcg gcctgaggcc agcagaccag ctgccggcgg tgccgtccat 840
acaagaggac tggacttcgc gtccgataaa cctactacca ctccagcccc aaggccccca 900
accccagcac cgactatcgc atcacagcct ttgtcactgc gtcctgaagc cagccggcca 960
gctgcagggg gggccgtcca cacaagggga ctcgactttg cgagtgataa acctactaca 1020
actcctgccc cccggcctcc tacaccagct cctactatcg cctcccagcc actcagtctc 1080
agacccgagg cttctaggcc agcggccgga ggcgcggtcc acacccgcgg gctggacttt 1140
gcatccgata agcccaccac cacccctgcc cctagacctc caaccccagc ccctacaatc 1200
gccagccagc ccctgagcct gaggcccgaa gcctgtagac ctgccgctgg cggagccgtg 1260
cacaccagag gcctggattt cgcctgcgac atctacatct gggcccctct ggccggcacc 1320
tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtcatc accctgtact gcaaccaccg gaataagaga 1380
ggccggaaga aactgctgta catcttcaag cagcccttca tgcggcccgt gcagaccacc 1440
caggaagagg acggctgcag ctgccggttc cccgaggaag aggaaggcgg ctgcgaactg 1500
cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1560
tacaacgagc tgaacctggg ccggagggag gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 1620
cgggaccctg agatgggcgg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataac 1680
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 1740
cggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 1800
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 1836
<210> 129
<211> 1695
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (huMR1-2 scFv.CD8alpha 3x 铰链
& TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 129
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaagaccc ccaagctgct gatctacgag ggcaacaccc tgaggcctgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcatcttca ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcagg tgcagctgca ggaatctggc ggagggctcg tgaagcctgg cggaagcctg 420
aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc ttcagcaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagacccccg acaagagact ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaacacc 540
ttctacagcg acaacgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaacgc caagaacacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccatgtacta ctgtgccaga 660
ggctacagcc cctacagctt cgccatggat tactggggcc agggcacaat ggtcaccgtg 720
tcctctaagc ctaccaccac ccccgcacct cgtcctccaa cccctgcacc tacgattgcc 780
agtcagcctc tttcactgcg gcctgaggcc agcagaccag ctgccggcgg tgccgtccat 840
acaagaggac tggacttcgc gtccgataaa cctactacca ctccagcccc aaggccccca 900
accccagcac cgactatcgc atcacagcct ttgtcactgc gtcctgaagc cagccggcca 960
gctgcagggg gggccgtcca cacaagggga ctcgactttg cgagtgataa gcccaccacc 1020
acccctgccc ctagacctcc aaccccagcc cctacaatcg ccagccagcc cctgagcctg 1080
aggcccgaag cctgtagacc tgccgctggc ggagccgtgc acaccagagg cctggatttc 1140
gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct gtggcgtgct gctgctgagc 1200
ctggtcatca ccctgtactg caaccaccgg aataagagag gccggaagaa actgctgtac 1260
atcttcaagc agcccttcat gcggcccgtg cagaccaccc aggaagagga cggctgcagc 1320
tgccggttcc ccgaggaaga ggaaggcggc tgcgaactgc gggtgaagtt cagccggagc 1380
gccgacgccc ctgcctacca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1440
cggagggagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggcc gggaccctga gatgggcggc 1500
aagccccgga gaaagaaccc tcaggagggc ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg 1560
gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcggc ggaggggcaa gggccacgac 1620
ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggatacct acgacgccct gcacatgcag 1680
gccctgcccc ccaga 1695
<210> 130
<211> 1836
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (huMR1-2 scFv.CD8alpha 4x 铰链
& TM.4-1BB.CD3-zeta"
<400> 130
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaagaccc ccaagctgct gatctacgag ggcaacaccc tgaggcctgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcatcttca ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggatatcg ccacctacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac ctttggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc tgggggaggc 360
ggctctcagg tgcagctgca ggaatctggc ggagggctcg tgaagcctgg cggaagcctg 420
aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc ttcagcaagt tcggcatgag ctgggtgcgc 480
cagacccccg acaagagact ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg ctacaacacc 540
ttctacagcg acaacgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaacgc caagaacacc 600
ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccatgtacta ctgtgccaga 660
ggctacagcc cctacagctt cgccatggat tactggggcc agggcacaat ggtcaccgtg 720
tcctctaagc ctaccaccac ccccgcacct cgtcctccaa cccctgcacc tacgattgcc 780
agtcagcctc tttcactgcg gcctgaggcc agcagaccag ctgccggcgg tgccgtccat 840
acaagaggac tggacttcgc gtccgataaa cctactacca ctccagcccc aaggccccca 900
accccagcac cgactatcgc atcacagcct ttgtcactgc gtcctgaagc cagccggcca 960
gctgcagggg gggccgtcca cacaagggga ctcgactttg cgagtgataa acctactaca 1020
actcctgccc cccggcctcc tacaccagct cctactatcg cctcccagcc actcagtctc 1080
agacccgagg cttctaggcc agcggccgga ggcgcggtcc acacccgcgg gctggacttt 1140
gcatccgata agcccaccac cacccctgcc cctagacctc caaccccagc ccctacaatc 1200
gccagccagc ccctgagcct gaggcccgaa gcctgtagac ctgccgctgg cggagccgtg 1260
cacaccagag gcctggattt cgcctgcgac atctacatct gggcccctct ggccggcacc 1320
tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtcatc accctgtact gcaaccaccg gaataagaga 1380
ggccggaaga aactgctgta catcttcaag cagcccttca tgcggcccgt gcagaccacc 1440
caggaagagg acggctgcag ctgccggttc cccgaggaag aggaaggcgg ctgcgaactg 1500
cgggtgaagt tcagccggag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaaccagctg 1560
tacaacgagc tgaacctggg ccggagggag gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 1620
cgggaccctg agatgggcgg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataac 1680
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 1740
cggaggggca agggccacga cggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggatacc 1800
tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc cccaga 1836
<210> 131
<211> 3224
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="XON-64"
<400> 131
gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat 60
gcaaagcatc gagcggccgc aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt 120
ttttgtgtga atcgtaacta acatacgctc tccatcaaaa caaaacgaaa caaaacaaac 180
tagcaaaata ggctgtcccc agtgcaagtg caggtgccag aacatttctc tatcgaagga 240
tctgcgatcg ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga 300
agttgggggg aggggtcggc aattgaaccg gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact 360
gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata 420
taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagc 480
tgaagcttcg aggggctcgc atctctcctt cacgcgcccg ccgccctacc tgaggccgcc 540
atccacgccg gttgagtcgc gttctgccgc ctcccgcctg tggtgcctcc tgaactgcgt 600
ccgccgtcta ggtaagttta aagctcaggt cgagaccggg cctttgtccg gcgctccctt 660
ggagcctacc tagactcagc cggctctcca cgctttgcct gaccctgctt gctcaactct 720
acgtctttgt ttcgttttct gttctgcgcc gttacagatc caagctgtga ccggcgccta 780
cctgagatca ccggcgaagg aggcctatca tgaagatcta tcgattgtac agctagccgc 840
caccatgctg ctgctggtga ccagcctgct gctgtgtgag ctgccccacc ccgcctttct 900
gctgatcccc gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga 960
cagagtgacc atcacctgta tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca 1020
gcagaagccc ggcaagaccc ccaagctgct gatctacgag ggcaacaccc tgaggcctgg 1080
cgtgcccagc agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcatcttca ccatcagctc 1140
cctgcagccc gaggatatcg ccacctacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac 1200
ctttggcgga ggcaccaagg tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc 1260
tgggggaggc ggctctcagg tgcagctgca ggaatctggc ggagggctcg tgaagcctgg 1320
cggaagcctg aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc ttcagcaagt tcggcatgag 1380
ctgggtgcgc cagacccccg acaagagact ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg 1440
ctacaatacc tactacagcg acaacgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaacgc 1500
caagaacacc ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccatgtacta 1560
ctgtgccaga ggctacagcc cctacagcta cgccatggat tactggggcc agggcacaat 1620
ggtcaccgtg tcctctaagc ctaccaccac ccccgcacct cgtcctccaa cccctgcacc 1680
tacgattgcc agtcagcctc tttcactgcg gcctgaggcc agcagaccag ctgccggcgg 1740
tgccgtccat acaagaggac tggacttcgc gtccgataaa cctactacca ctccagcccc 1800
aaggccccca accccagcac cgactatcgc atcacagcct ttgtcactgc gtcctgaagc 1860
cagccggcca gctgcagggg gggccgtcca cacaagggga ctcgactttg cgagtgataa 1920
gcccaccacc acccctgccc ctagacctcc aaccccagcc cctacaatcg ccagccagcc 1980
cctgagcctg aggcccgaag cctgtagacc tgccgctggc ggagccgtgc acaccagagg 2040
cctggatttc gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct gtggcgtgct 2100
gctgctgagc ctggtcatca ccctgtactg caaccaccgg aataagagag gccggaagaa 2160
actgctgtac atcttcaagc agcccttcat gcggcccgtg cagaccaccc aggaagagga 2220
cggctgcagc tgccggttcc ccgaggaaga ggaaggcggc tgcgaactgc gggtgaagtt 2280
cagccggagc gccgacgccc ctgcctacca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct 2340
gaacctgggc cggagggagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggcc gggaccctga 2400
gatgggcggc aagccccgga gaaagaaccc tcaggagggc ctgtataacg aactgcagaa 2460
agacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcggc ggaggggcaa 2520
gggccacgac ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggatacct acgacgccct 2580
gcacatgcag gccctgcccc ccagatgaga tatcactagt ctcgagtcga tcatgctcat 2640
agtggcaaga gagagccgta cgtgatcagc gggatctgct gtgccttcta gttgccagcc 2700
atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 2760
cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 2820
ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 2880
tggggatgcg gtgggctcta tgggtaccca ggtgctgaag aattgacccg gttcctcctg 2940
ggccagaaag aagcaggcac atccccttct ctgtgacaca ccctgtccac gcccctggtt 3000
cttagttcca gccccactca taggacactc atagctcagg agggctccgc cttcaatccc 3060
acccgctaaa gtacttggag cggtctctcc ctccctcatc agcccaccaa accaaaccta 3120
gcctccaaga gtgggaagaa attaaagcaa gataggctat taagtgcaga gggagagaaa 3180
atgcctccaa catgtgagga agtaatgaga gaaatcatag aatt 3224
<210> 132
<211> 3319
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="XON-30"
<400> 132
gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat 60
gcaaagcatc gagcggccgc aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt 120
ttttgtgtga atcgtaacta acatacgctc tccatcaaaa caaaacgaaa caaaacaaac 180
tagcaaaata ggctgtcccc agtgcaagtg caggtgccag aacatttctc tatcgaagga 240
tctgcgatcg ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga 300
agttgggggg aggggtcggc aattgaaccg gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact 360
gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata 420
taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagc 480
tgaagcttcg aggggctcgc atctctcctt cacgcgcccg ccgccctacc tgaggccgcc 540
atccacgccg gttgagtcgc gttctgccgc ctcccgcctg tggtgcctcc tgaactgcgt 600
ccgccgtcta ggtaagttta aagctcaggt cgagaccggg cctttgtccg gcgctccctt 660
ggagcctacc tagactcagc cggctctcca cgctttgcct gaccctgctt gctcaactct 720
acgtctttgt ttcgttttct gttctgcgcc gttacagatc caagctgtga ccggcgccta 780
cctgagatca ccggcgaagg aggcctatca tgaagatcta tcgattgtac agctagccgc 840
caccatgctg ctgctggtga ccagcctgct gctgtgtgag ctgccccacc ccgcctttct 900
gctgatcccc gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga 960
cagagtgacc atcacctgta tgaccagcac cgacatcgac gacgacatga actggtatca 1020
gcagaagccc ggcaagaccc ccaagctgct gatctacgag ggcaacaccc tgaggcctgg 1080
cgtgcccagc agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcatcttca ccatcagctc 1140
cctgcagccc gaggatatcg ccacctacta ctgcctgcag agctggaacg tgcccctgac 1200
ctttggcgga ggcaccaagg tggaaatcaa gggcggaggc ggatctggcg gcggaggatc 1260
tgggggaggc ggctctcagg tgcagctgca ggaatctggc ggagggctcg tgaagcctgg 1320
cggaagcctg aagctgagct gtgccgccag cggcttcacc ttcagcaagt tcggcatgag 1380
ctgggtgcgc cagacccccg acaagagact ggaatgggtg gccagcatca gcaccggcgg 1440
ctacaatacc tactacagcg acaacgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaacgc 1500
caagaacacc ctgtacctgc agatgagcag cctgaagtcc gaggacaccg ccatgtacta 1560
ctgtgccaga ggctacagcc cctacagcta cgccatggat tactggggcc agggcacaat 1620
ggtcaccgtg tcctctaagc ctaccaccac ccccgcacct cgtcctccaa cccctgcacc 1680
tacgattgcc agtcagcctc tttcactgcg gcctgaggcc agcagaccag ctgccggcgg 1740
tgccgtccat acaagaggac tggacttcgc gtccgataaa cctactacca ctccagcccc 1800
aaggccccca accccagcac cgactatcgc atcacagcct ttgtcactgc gtcctgaagc 1860
cagccggcca gctgcagggg gggccgtcca cacaagggga ctcgactttg cgagtgataa 1920
gcccaccacc acccctgccc ctagacctcc aaccccagcc cctacaatcg ccagccagcc 1980
cctgagcctg aggcccgaag cctgtagacc tgccgctggc ggagccgtgc acaccagagg 2040
cctggatttc gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct gtggcgtgct 2100
gctgctgagc ctggtcatca ccctgtactg caaccaccgg aataagagag gccggaagaa 2160
actgctgtac atcttcaagc agcccttcat gcggcccgtg cagaccaccc aggaagagga 2220
cggctgcagc tgccggttcc ccgaggaaga ggaaggcggc tgcgaactgc gggtgaagtt 2280
cagccggagc gccgacgccc ctgcctacca gcagggccag aaccagctgt acaacgagct 2340
gaacctgggc cggagggagg agtacgacgt gctggacaag cggagaggcc gggaccctga 2400
gatgggcggc aagccccgga gaaagaaccc tcaggagggc ctgtataacg aactgcagaa 2460
agacaagatg gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcggc ggaggggcaa 2520
gggccacgac ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggatacct acgacgccct 2580
gcacatgcag gccctgcccc ccagaagggc caagaggagt ggcagcggcg agggcagagg 2640
aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc cctatgaggc tccctgctca 2700
gctcctgggg ctgctaatgc tctgggtccc aggatccagt gggcgcaaag tgtgtaacgg 2760
aataggtatt ggtgaattta aagactcact ctccataaat gctacgaata ttaaacactt 2820
caaaaactgc acctccatca gtggcgatct ccacatcctg ccggtggcat ttaggggtga 2880
ctccttcaca catactcctc ctctggatcc acaggaactg gatattctga aaaccgtaaa 2940
ggaaatcaca gggtttttgc tgattcaggc ttggcctgaa aacaggacgg acctccatgc 3000
ctttgagaac ctagaaatca tacgcggcag gaccaagcaa catggtcagt tttctcttgc 3060
agtcgtcagc ctgaacataa catccttggg attacgctcc ctcaaggaga taagtgatgg 3120
agatgtgata atttcaggaa acaaaaattt gtgctatgca aatacaataa actggaaaaa 3180
actgtttggg acctccggtc agaaaaccaa aattataagc aacagaggtg aaaacagctg 3240
caaggccaca ggccaggtct gccatgcctt gtgctccccc gagggctgct ggggcccgga 3300
gcccagggac tgcgtctct 3319
<210> 133
<211> 4763
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="XON-59"
<400> 133
gagcgtgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 60
gagaagttgg ggggaggggg tcggcgattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
acagcagccg ctaaatccaa ggtaaggtca gaagagctag cgccaccatg ctgctgctgg 300
tgaccagcct gctgctgtgt gagctgcccc accccgcctt tctgctgatc cccgacatcc 360
agatgaccca gagccccagc agcctgtctg ccagcgtggg cgacagagtg accatcacct 420
gtatgaccag caccgacatc gacgacgaca tgaactggta tcagcagaag cccggcaaga 480
cccccaagct gctgatctac gagggcaaca ccctgaggcc tggcgtgccc agcagatttt 540
ctggcagcgg ctccggcacc gacttcatct tcaccatcag ctccctgcag cccgaggata 600
tcgccaccta ctactgcctg cagagctgga acgtgcccct gacctttggc ggaggcacca 660
aggtggaaat caagggcgga ggcggatctg gcggcggagg atctggggga ggcggctctc 720
aggtgcagct gcaggaatct ggcggagggc tcgtgaagcc tggcggaagc ctgaagctga 780
gctgtgccgc cagcggcttc accttcagca agttcggcat gagctgggtg cgccagaccc 840
ccgacaagag actggaatgg gtggccagca tcagcaccgg cggctacaat acctactaca 900
gcgacaacgt gaagggccgg ttcaccatct cccgggacaa cgccaagaac accctgtacc 960
tgcagatgag cagcctgaag tccgaggaca ccgccatgta ctactgtgcc agaggctaca 1020
gcccctacag ctacgccatg gattactggg gccagggcac aatggtcacc gtgtcctcta 1080
agcctaccac cacccccgca cctcgtcctc caacccctgc acctacgatt gccagtcagc 1140
ctctttcact gcggcctgag gccagcagac cagctgccgg cggtgccgtc catacaagag 1200
gactggactt cgcgtccgat aaacctacta ccactccagc cccaaggccc ccaaccccag 1260
caccgactat cgcatcacag cctttgtcac tgcgtcctga agccagccgg ccagctgcag 1320
ggggggccgt ccacacaagg ggactcgact ttgcgagtga taagcccacc accacccctg 1380
cccctagacc tccaacccca gcccctacaa tcgccagcca gcccctgagc ctgaggcccg 1440
aagcctgtag acctgccgct ggcggagccg tgcacaccag aggcctggat ttcgcctgcg 1500
acatctacat ctgggcccct ctggccggca cctgtggcgt gctgctgctg agcctggtca 1560
tcaccctgta ctgcaaccac cggaataaga gaggccggaa gaaactgctg tacatcttca 1620
agcagccctt catgcggccc gtgcagacca cccaggaaga ggacggctgc agctgccggt 1680
tccccgagga agaggaaggc ggctgcgaac tgcgggtgaa gttcagccgg agcgccgacg 1740
cccctgccta ccagcagggc cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg ggccggaggg 1800
aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gccgggaccc tgagatgggc ggcaagcccc 1860
ggagaaagaa ccctcaggag ggcctgtata acgaactgca gaaagacaag atggccgagg 1920
cctacagcga gatcggcatg aagggcgagc ggcggagggg caagggccac gacggcctgt 1980
accagggcct gagcaccgcc accaaggata cctacgacgc cctgcacatg caggccctgc 2040
cccccagaag agctaagagg ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg 2100
acgtcgagga gaatcctgga cctggcccca agaagaaaag gaaggtggcc ccccccaccg 2160
acgtgagcct gggcgacgag ctgcacctgg acggcgagga cgtggccatg gcccacgccg 2220
acgccctgga cgacttcgac ctggacatgc tgggcgacgg cgacagcccc ggccccggct 2280
tcacccccca cgacagcgcc ccctacggcg ccctggacat ggccgacttc gagttcgagc 2340
agatgttcac cgacgccctg ggcatcgacg agtacggcgg cgaattcgag atgcccgtgg 2400
acaggattct ggaggccgaa ctcgccgtgg agcagaaaag cgaccagggc gtggagggcc 2460
ccggcggaac cggcggcagc ggcagcagcc ccaacgaccc cgtgaccaac atctgccagg 2520
ccgccgacaa gcagctgttc accctggtgg agtgggccaa gaggattccc cacttcagca 2580
gcctgcccct ggacgaccag gtgatcctgc tgagggccgg atggaacgag ctgctgatcg 2640
ccagcttcag ccacaggagc atcgacgtga gggacggcat cctgctggcc accggcctgc 2700
acgtccatag gaacagcgcc cacagcgccg gagtgggcgc catcttcgac agggtgctga 2760
ccgagctggt gagcaagatg agggacatga ggatggacaa gaccgagctg ggctgcctga 2820
gggccatcat cctgttcaac cccgaggtga ggggcctgaa aagcgcccag gaggtggagc 2880
tgctgaggga gaaggtgtac gccgccctgg aggagtacac caggaccacc caccccgacg 2940
agcccggcag attcgccaag ctgctgctga ggctgcccag cctgaggagc atcggcctga 3000
agtgcctgga gcacctgttc ttcttcaggc tgatcggcga cgtgcccatc gacaccttcc 3060
tgatggagat gctggagagc cccagcgaca gcagagctaa gaggggaagc ggagagggca 3120
gaggaagtct gctaacatgc ggtgacgtcg aggagaatcc tggacctaag ctgctgagca 3180
gcatcgagca ggcttgcgac atctgcaggc tgaagaagct gaagtgcagc aaggagaagc 3240
ccaagtgcgc caagtgcctg aagaacaact gggagtgcag atacagcccc aagaccaaga 3300
ggagccccct gaccagggcc cacctgaccg aggtggagag caggctggag aggctggagc 3360
agctgttcct gctgatcttc cccagggagg acctggacat gatcctgaag atggacagcc 3420
tgcaagacat caaggccctg ctgaccggcc tgttcgtgca ggacaacgtg aacaaggacg 3480
ccgtgaccga caggctggcc agcgtggaga ccgacatgcc cctgaccctg aggcagcaca 3540
ggatcagcgc caccagcagc agcgaggaga gcagcaacaa gggccagagg cagctgaccg 3600
tgagccccga gtttcccggg atcaggcccg agtgcgtggt gcccgagacc cagtgcgcca 3660
tgaaaaggaa ggagaagaag gcccagaagg agaaggacaa gctgcccgtg agcaccacca 3720
ccgtcgatga ccacatgccc cccatcatgc agtgcgagcc cccccccccc gaggccgcca 3780
ggattcacga ggtcgtgccc aggttcctga gcgacaagct gctggtgacc aacaggcaga 3840
agaacatccc ccagctgacc gccaaccagc agttcctgat cgccaggctg atctggtatc 3900
aggacggcta cgagcagccc agcgacgagg acctgaaaag gatcacccag acctggcagc 3960
aggccgacga cgagaacgag gagagcgaca cccccttcag gcagatcacc gagatgacca 4020
tcctgaccgt gcagctgatc gtggagttcg ccaagggcct gcccggattc gccaagatca 4080
gccagcccga ccagatcacc ctgctgaagg cttgcagcag cgaggtgatg atgctgaggg 4140
tggccaggag gtacgacgcc gccagcgaca gcatcctgtt cgccaacaac caggcttaca 4200
ccagggacaa ctacaggaag gctggcatgg ccgaggtgat cgaggacctc ctgcacttct 4260
gcagatgtat gtacagcatg gccctggaca acatccacta cgccctgctg accgccgtgg 4320
tgatcttcag cgacaggccc ggcctggagc agccccagct ggtggaggag atccagaggt 4380
actacctgaa caccctgagg atctacatcc tgaaccagct gagcggcagc gccaggagca 4440
gcgtgatcta cggcaagatc ctgagcatcc tgagcgagct gaggaccctg ggaatgcaga 4500
acagcaatat gtgtatcagc ctgaagctga agaacaggaa gctgcccccc ttcctggagg 4560
agatttggga cgtggccgac atgagccaca cccagccccc ccccatcctg gagagcccca 4620
ccaacctgtg aaacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca 4680
caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca 4740
tcaatgtatc ttatcatgtc tgg 4763
<210> 134
<211> 4785
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="XON-60"
<400> 134
gagcgtgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 60
gagaagttgg ggggaggggg tcggcgattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
acagcagccg ctaaatccaa ggtaaggtca gaagagctag cgccaccatg ctgctgctgg 300
tgaccagcct gctgctgtgt gagctgcccc accccgcctt tctgctgatc cccgacatcc 360
agatgaccca gagccccagc agcctgtctg ccagcgtggg cgacagagtg accatcacct 420
gtatgaccag caccgacatc gacgacgaca tgaactggta tcagcagaag cccggcaaga 480
cccccaagct gctgatctac gagggcaaca ccctgaggcc tggcgtgccc agcagatttt 540
ctggcagcgg ctccggcacc gacttcatct tcaccatcag ctccctgcag cccgaggata 600
tcgccaccta ctactgcctg cagagctgga acgtgcccct gacctttggc ggaggcacca 660
aggtggaaat caagggcgga ggcggatctg gcggcggagg atctggggga ggcggctctc 720
aggtgcagct gcaggaatct ggcggagggc tcgtgaagcc tggcggaagc ctgaagctga 780
gctgtgccgc cagcggcttc accttcagca agttcggcat gagctgggtg cgccagaccc 840
ccgacaagag actggaatgg gtggccagca tcagcaccgg cggctacaat acctactaca 900
gcgacaacgt gaagggccgg ttcaccatct cccgggacaa cgccaagaac accctgtacc 960
tgcagatgag cagcctgaag tccgaggaca ccgccatgta ctactgtgcc agaggctaca 1020
gcccctacag ctacgccatg gattactggg gccagggcac aatggtcacc gtgtcctcta 1080
agcctaccac cacccccgca cctcgtcctc caacccctgc acctacgatt gccagtcagc 1140
ctctttcact gcggcctgag gccagcagac cagctgccgg cggtgccgtc catacaagag 1200
gactggactt cgcgtccgat aaacctacta ccactccagc cccaaggccc ccaaccccag 1260
caccgactat cgcatcacag cctttgtcac tgcgtcctga agccagccgg ccagctgcag 1320
ggggggccgt ccacacaagg ggactcgact ttgcgagtga taagcccacc accacccctg 1380
cccctagacc tccaacccca gcccctacaa tcgccagcca gcccctgagc ctgaggcccg 1440
aagcctgtag acctgccgct ggcggagccg tgcacaccag aggcctggat ttcgcctgcg 1500
acatctacat ctgggcccct ctggccggca cctgtggcgt gctgctgctg agcctggtca 1560
tcaccctgta ctgcaaccac cggaataaga gaggccggaa gaaactgctg tacatcttca 1620
agcagccctt catgcggccc gtgcagacca cccaggaaga ggacggctgc agctgccggt 1680
tccccgagga agaggaaggc ggctgcgaac tgcgggtgaa gttcagccgg agcgccgacg 1740
cccctgccta ccagcagggc cagaaccagc tgtacaacga gctgaacctg ggccggaggg 1800
aggagtacga cgtgctggac aagcggagag gccgggaccc tgagatgggc ggcaagcccc 1860
ggagaaagaa ccctcaggag ggcctgtata acgaactgca gaaagacaag atggccgagg 1920
cctacagcga gatcggcatg aagggcgagc ggcggagggg caagggccac gacggcctgt 1980
accagggcct gagcaccgcc accaaggata cctacgacgc cctgcacatg caggccctgc 2040
cccccagaag agctaagagg ggaagcggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg 2100
acgtcgagga gaatcctgga cctggcccca agaagaaaag gaaggtggcc ccccccaccg 2160
acgtgagcct gggcgacgag ctgcacctgg acggcgagga cgtggccatg gcccacgccg 2220
acgccctgga cgacttcgac ctggacatgc tgggcgacgg cgacagcccc ggccccggct 2280
tcacccccca cgacagcgcc ccctacggcg ccctggacat ggccgacttc gagttcgagc 2340
agatgttcac cgacgccctg ggcatcgacg agtacggcgg cgaattcgag atgcccgtgg 2400
acaggattct ggaggccgaa ctcgccgtgg agcagaaaag cgaccagggc gtggagggcc 2460
ccggcggaac cggcggcagc ggcagcagcc ccaacgaccc cgtgaccaac atctgccagg 2520
ccgccgacaa gcagctgttc accctggtgg agtgggccaa gaggattccc cacttcagca 2580
gcctgcccct ggacgaccag gtgatcctgc tgagggccgg atggaacgag ctgctgatcg 2640
ccagcttcag ccacaggagc atcgacgtga gggacggcat cctgctggcc accggcctgc 2700
acgtccatag gaacagcgcc cacagcgccg gagtgggcgc catcttcgac agggtgctga 2760
ccgagctggt gagcaagatg agggacatga ggatggacaa gaccgagctg ggctgcctga 2820
gggccatcat cctgttcaac cccgaggtga ggggcctgaa aagcgcccag gaggtggagc 2880
tgctgaggga gaaggtgtac gccgccctgg aggagtacac caggaccacc caccccgacg 2940
agcccggcag attcgccaag ctgctgctga ggctgcccag cctgaggagc atcggcctga 3000
agtgcctgga gcacctgttc ttcttcaggc tgatcggcga cgtgcccatc gacaccttcc 3060
tgatggagat gctggagagc cccagcgaca gctgagcatg cactagtttt ataatttctt 3120
cttccagaat ttctgacatt ttataatttc ttcttccaga agactcacaa cctccatatg 3180
gccaccatga agctgctgag cagcatcgag caggcttgcg acatctgcag gctgaagaag 3240
ctgaagtgca gcaaggagaa gcccaagtgc gccaagtgcc tgaagaacaa ctgggagtgc 3300
agatacagcc ccaagaccaa gaggagcccc ctgaccaggg cccacctgac cgaggtggag 3360
agcaggctgg agaggctgga gcagctgttc ctgctgatct tccccaggga ggacctggac 3420
atgatcctga agatggacag cctgcaagac atcaaggccc tgctgaccgg cctgttcgtg 3480
caggacaacg tgaacaagga cgccgtgacc gacaggctgg ccagcgtgga gaccgacatg 3540
cccctgaccc tgaggcagca caggatcagc gccaccagca gcagcgagga gagcagcaac 3600
aagggccaga ggcagctgac cgtgagcccc gagtttcccg ggatcaggcc cgagtgcgtg 3660
gtgcccgaga cccagtgcgc catgaaaagg aaggagaaga aggcccagaa ggagaaggac 3720
aagctgcccg tgagcaccac caccgtcgat gaccacatgc cccccatcat gcagtgcgag 3780
cccccccccc ccgaggccgc caggattcac gaggtcgtgc ccaggttcct gagcgacaag 3840
ctgctggtga ccaacaggca gaagaacatc ccccagctga ccgccaacca gcagttcctg 3900
atcgccaggc tgatctggta tcaggacggc tacgagcagc ccagcgacga ggacctgaaa 3960
aggatcaccc agacctggca gcaggccgac gacgagaacg aggagagcga cacccccttc 4020
aggcagatca ccgagatgac catcctgacc gtgcagctga tcgtggagtt cgccaagggc 4080
ctgcccggat tcgccaagat cagccagccc gaccagatca ccctgctgaa ggcttgcagc 4140
agcgaggtga tgatgctgag ggtggccagg aggtacgacg ccgccagcga cagcatcctg 4200
ttcgccaaca accaggctta caccagggac aactacagga aggctggcat ggccgaggtg 4260
atcgaggacc tcctgcactt ctgcagatgt atgtacagca tggccctgga caacatccac 4320
tacgccctgc tgaccgccgt ggtgatcttc agcgacaggc ccggcctgga gcagccccag 4380
ctggtggagg agatccagag gtactacctg aacaccctga ggatctacat cctgaaccag 4440
ctgagcggca gcgccaggag cagcgtgatc tacggcaaga tcctgagcat cctgagcgag 4500
ctgaggaccc tgggaatgca gaacagcaat atgtgtatca gcctgaagct gaagaacagg 4560
aagctgcccc ccttcctgga ggagatttgg gacgtggccg acatgagcca cacccagccc 4620
ccccccatcc tggagagccc caccaacctg tgaaacttgt ttattgcagc ttataatggt 4680
tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 4740
agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctgg 4785
<210> 135
<211> 2009
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="XON-61"
<400> 135
attgttcgga gcagtgcggc gcgtttagcg gagtactgtc ctccgatatt aatcggggca 60
gactattccg gggtttaccg gcgcactctc gcccgaactt caccggcggt ctttcgtccg 120
tgctttatcg gggcggatca ctccgaaccc cgggaggtct atataagcag agctcgttta 180
gtgaaccctc attctggaga cggatcccga gccgagtgtt ttgacctcca tagaacagcc 240
gctaaatcca aggtaaggtc agaagagcta gcgccaccat gtgtcaccag cagttggtca 300
tctcttggtt cagcctggtt tttctggcat ctcccctcgt ggccatctgg gaactgaaga 360
aagatgttta tgtcgtagaa ttggattggt atcccgacgc ccctggagaa atggtggtcc 420
tgacatgtga cacccctgaa gaagatggta tcacctggac cttggaccag agcagtgagg 480
tcttaggctc tggcaagacc ctgaccatcc aagtcaaaga gtttggagat gctggccagt 540
acacctgtca caaaggaggc gaggttctaa gccattcgct cctgctgctt cacaaaaagg 600
aagatggaat ttggtccact gacattctga aggaccagaa agaacccaag aataagacct 660
ttctaagatg cgaggccaag aattattctg gacgtttcac ctgctggtgg ctgacgacaa 720
tcagtactga tttgacattc agtgtcaaaa gcagcagagg ctcttctgac ccccaagggg 780
tgacgtgcgg agctgctaca ctcagcgccg agagagtcag aggggacaac aaggagtatg 840
agtactcagt ggagtgccag gaggacagtg cctgcccagc tgctgaggag agtctgccca 900
ttgaggtcat ggtggatgcc gttcacaagc tcaagtatga aaactacacc agcagcttct 960
tcatcaggga catcatcaaa cctgacccac ccaagaactt gcagctgaag cccctgaaga 1020
acagcagaca ggtggaggtc agctgggagt accctgacac ctggagtact ccacattcct 1080
acttctccct gacattctgc gttcaggtcc agggcaagag caagagagaa aagaaagata 1140
gagtcttcac ggacaagacc tcagccacgg tcatctgccg caaaaatgcc agcattagcg 1200
tgcgggccca ggaccgctac tatagctcat cttggagcga atgggcatct gtgccctgct 1260
ccggtggcgg tggcggcgga tctagaaacc tccccgtggc cactccagac ccaggaatgt 1320
tcccatgcct tcaccacagc cagaacctgc tgagggccgt cagcaacatg ctccagaagg 1380
ccagacaaac tctagaattt tacccttgca cttctgaaga gattgatcat gaagatatca 1440
caaaagataa aaccagcaca gtggaggcct gtttaccatt ggaattaacc aagaatgaga 1500
gttgcctaaa ttccagagag acctctttca taactaatgg gagttgcctg gcctccagaa 1560
agacctcttt tatgatggcc ctgtgcctta gtagtattta tgaagacttg aagatgtacc 1620
aggtggagtt caagaccatg aatgcaaagc tgctgatgga ccccaagagg cagatctttc 1680
tagatcaaaa catgctggca gttattgatg agctgatgca ggccctgaat ttcaacagtg 1740
agactgtgcc acaaaaatcc tcccttgaag aaccggattt ttataaaact aaaatcaagc 1800
tctgcatact tcttcatgct ttcagaatca gagcagtgac tattgataga gtgatgagct 1860
atctgaatgc ttcctaaaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 1920
gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 1980
aactcatcaa tgtatcttat catgtctgg 2009
<210> 136
<211> 2873
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="XON-62"
<400> 136
attgttcgga gcagtgcggc gcgtttagcg gagtactgtc ctccgatatt aatcggggca 60
gactattccg gggtttaccg gcgcactctc gcccgaactt caccggcggt ctttcgtccg 120
tgctttatcg gggcggatca ctccgaaccc cgggaggtct atataagcag agctcgttta 180
gtgaaccctc attctggaga cggatcccga gccgagtgtt ttgacctcca tagaacagcc 240
gctaaatcca aggtaaggtc agaagagcta gcgccaccat gtgtcaccag cagttggtca 300
tctcttggtt cagcctggtt tttctggcat ctcccctcgt ggccatctgg gaactgaaga 360
aagatgttta tgtcgtagaa ttggattggt atcccgacgc ccctggagaa atggtggtcc 420
tgacatgtga cacccctgaa gaagatggta tcacctggac cttggaccag agcagtgagg 480
tcttaggctc tggcaagacc ctgaccatcc aagtcaaaga gtttggagat gctggccagt 540
acacctgtca caaaggaggc gaggttctaa gccattcgct cctgctgctt cacaaaaagg 600
aagatggaat ttggtccact gacattctga aggaccagaa agaacccaag aataagacct 660
ttctaagatg cgaggccaag aattattctg gacgtttcac ctgctggtgg ctgacgacaa 720
tcagtactga tttgacattc agtgtcaaaa gcagcagagg ctcttctgac ccccaagggg 780
tgacgtgcgg agctgctaca ctcagcgccg agagagtcag aggggacaac aaggagtatg 840
agtactcagt ggagtgccag gaggacagtg cctgcccagc tgctgaggag agtctgccca 900
ttgaggtcat ggtggatgcc gttcacaagc tcaagtatga aaactacacc agcagcttct 960
tcatcaggga catcatcaaa cctgacccac ccaagaactt gcagctgaag cccctgaaga 1020
acagcagaca ggtggaggtc agctgggagt accctgacac ctggagtact ccacattcct 1080
acttctccct gacattctgc gttcaggtcc agggcaagag caagagagaa aagaaagata 1140
gagtcttcac ggacaagacc tcagccacgg tcatctgccg caaaaatgcc agcattagcg 1200
tgcgggccca ggaccgctac tatagctcat cttggagcga atgggcatct gtgccctgct 1260
ccggtggcgg tggcggcgga tctagaaacc tccccgtggc cactccagac ccaggaatgt 1320
tcccatgcct tcaccacagc cagaacctgc tgagggccgt cagcaacatg ctccagaagg 1380
ccagacaaac tctagaattt tacccttgca cttctgaaga gattgatcat gaagatatca 1440
caaaagataa aaccagcaca gtggaggcct gtttaccatt ggaattaacc aagaatgaga 1500
gttgcctaaa ttccagagag acctctttca taactaatgg gagttgcctg gcctccagaa 1560
agacctcttt tatgatggcc ctgtgcctta gtagtattta tgaagacttg aagatgtacc 1620
aggtggagtt caagaccatg aatgcaaagc tgctgatgga ccccaagagg cagatctttc 1680
tagatcaaaa catgctggca gttattgatg agctgatgca ggccctgaat ttcaacagtg 1740
agactgtgcc acaaaaatcc tcccttgaag aaccggattt ttataaaact aaaatcaagc 1800
tctgcatact tcttcatgct ttcagaatca gagcagtgac tattgataga gtgatgagct 1860
atctgaatgc ttccagagct aagaggggaa gcggagaggg cagaggaagt ctgctaacat 1920
gcggtgacgt cgaggagaat cctggaccta ggctccctgc tcagctcctg gggctgctaa 1980
tgctctgggt cccaggatcc agtgggcgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat 2040
ttaaagactc actctccata aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca 2100
tcagtggcga tctccacatc ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc 2160
ctcctctgga tccacaggaa ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt 2220
tgctgattca ggcttggcct gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa 2280
tcatacgcgg caggaccaag caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca 2340
taacatcctt gggattacgc tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag 2400
gaaacaaaaa tttgtgctat gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg 2460
gtcagaaaac caaaattata agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg 2520
tctgccatgc cttgtgctcc cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct 2580
ctggtggcgg tggctcgggc ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctggt ggcggtggct 2640
cgttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag 2700
tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagcta aaacttgttt attgcagctt 2760
ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 2820
tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tgg 2873
<210> 137
<211> 3532
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="FLC-2B12/13-2"
<400> 137
attgttcgga gcagtgcggc gcgtttagcg gagtactgtc ctccgatatt aatcggggca 60
gactattccg gggtttaccg gcgcactctc gcccgaactt caccggcggt ctttcgtccg 120
tgctttatcg gggcggatca ctccgaaccc cgggaggtct atataagcag agctcgttta 180
gtgaaccctc attctggaga cggatcccga gccgagtgtt ttgacctcca tagaacagcc 240
gctaaatcca aggtaaggtc agaagagcta gcgccaccat ggattggacc tggattctgt 300
ttctggtggc cgctgccaca agagtgcaca gcaactgggt gaatgtgatc agcgacctga 360
agaagatcga ggatctgatc cagagcatgc acattgatgc caccctgtac acagaatctg 420
atgtgcaccc tagctgtaaa gtgaccgcca tgaagtgttt tctgctggag ctgcaggtga 480
tttctctgga aagcggagat gcctctatcc acgacacagt ggagaatctg atcatcctgg 540
ccaacaatag cctgagcagc aatggcaatg tgacagagtc tggctgtaag gagtgtgagg 600
agctggagga gaagaacatc aaggagtttc tgcagagctt tgtgcacatc gtgcagatgt 660
tcatcaatac aagctctggc ggaggatctg gaggaggcgg atctggagga ggaggcagtg 720
gaggcggagg atctggcgga ggatctctgc agattacatg ccctcctcca atgtctgtgg 780
agcacgccga tatttgggtg aagtcctaca gcctgtacag cagagagaga tacatctgca 840
acagcggctt taagagaaag gccggcacct cttctctgac agagtgcgtg ctgaataagg 900
ccacaaatgt ggcccactgg acaacaccta gcctgaagtg cattagagat cctgccctgg 960
tccaccagag gcctgcccct ccatctacag tgacaacagc cggagtgaca cctcagcctg 1020
aatctctgag cccttctgga aaagaacctg ccgccagctc tcctagctct aataataccg 1080
ccgccacaac agccgccatt gtgcctggat ctcagctgat gcctagcaag tctcctagca 1140
caggcacaac agagatcagc agccacgaat cttctcacgg aacaccttct cagaccaccg 1200
ccaagaattg ggagctgaca gcctctgcct ctcaccagcc tccaggagtg tatcctcagg 1260
gccactctga tacaacagtg gccatcagca catctacagt gctgctgtgt ggactgtctg 1320
ccgtgtctct gctggcctgt tacctgaagt ctagacagac acctcctctg gcctctgtgg 1380
agatggaggc catggaagcc ctgcctgtga catggggaac aagcagcaga gatgaggacc 1440
tggagaattg ttctcaccac ctgtgaaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 1500
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 1560
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggga gcgtgcgtga ggctccggtg 1620
cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg ggagggggtc 1680
ggcgattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg 1740
tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc 1800
gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac agcagccgct aaatccaagg 1860
taaggtcaga agagctagcg ccaccatgaa gctgctgagc agcatcgagc aggcttgcga 1920
catctgcagg ctgaagaagc tgaagtgcag caaggagaag cccaagtgcg ccaagtgcct 1980
gaagaacaac tgggagtgca gatacagccc caagaccaag aggagccccc tgaccagggc 2040
ccacctgacc gaggtggaga gcaggctgga gaggctggag cagctgttcc tgctgatctt 2100
ccccagggag gacctggaca tgatcctgaa gatggacagc ctgcaagaca tcaaggccct 2160
gctgaccggc ctgttcgtgc aggacaacgt gaacaaggac gccgtgaccg acaggctggc 2220
cagcgtggag accgacatgc ccctgaccct gaggcagcac aggatcagcg ccaccagcag 2280
cagcgaggag agcagcaaca agggccagag gcagctgacc gtgagccccg agtttcccgg 2340
gatcaggccc gagtgcgtgg tgcccgagac ccagtgcgcc atgaaaagga aggagaagaa 2400
ggcccagaag gagaaggaca agctgcccgt gagcaccacc accgtcgatg accacatgcc 2460
ccccatcatg cagtgcgagc cccccccccc cgaggccgcc aggattcacg aggtcgtgcc 2520
caggttcctg agcgacaagc tgctggtgac caacaggcag aagaacatcc cccagctgac 2580
cgccaaccag cagttcctga tcgccaggct gatctggtat caggacggct acgagcagcc 2640
cagcgacgag gacctgaaaa ggatcaccca gacctggcag caggccgacg acgagaacga 2700
ggagagcgac acccccttca ggcagatcac cgagatgacc atcctgaccg tgcagctgat 2760
cgtggagttc gccaagggcc tgcccggatt cgccaagatc agccagcccg accagatcac 2820
cctgctgaag gcttgcagca gcgaggtgat gatgctgagg gtggccagga ggtacgacgc 2880
cgccagcgac agcatcctgt tcgccaacaa ccaggcttac accagggaca actacaggaa 2940
ggctggcatg gccgaggtga tcgaggacct cctgcacttc tgcagatgta tgtacagcat 3000
ggccctggac aacatccact acgccctgct gaccgccgtg gtgatcttca gcgacaggcc 3060
cggcctggag cagccccagc tggtggagga gatccagagg tactacctga acaccctgag 3120
gatctacatc ctgaaccagc tgagcggcag cgccaggagc agcgtgatct acggcaagat 3180
cctgagcatc ctgagcgagc tgaggaccct gggaatgcag aacagcaata tgtgtatcag 3240
cctgaagctg aagaacagga agctgccccc cttcctggag gagatttggg acgtggccga 3300
catgagccac acccagcccc cccccatcct ggagagcccc accaacctgt gatgatgggt 3360
ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc 3420
ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct 3480
ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg aa 3532
<210> 138
<211> 4423
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="XON-02"
<400> 138
attgttcgga gcagtgcggc gcgtttagcg gagtactgtc ctccgatatt aatcggggca 60
gactattccg gggtttaccg gcgcactctc gcccgaactt caccggcggt ctttcgtccg 120
tgctttatcg gggcggatca ctccgaaccc cgggaggtct atataagcag agctcgttta 180
gtgaaccctc attctggaga cggatcccga gccgagtgtt ttgacctcca tagaacagcc 240
gctaaatcca aggtaaggtc agaagagcta gcgccaccat ggattggacc tggattctgt 300
ttctggtggc cgctgccaca agagtgcaca gcaactgggt gaatgtgatc agcgacctga 360
agaagatcga ggatctgatc cagagcatgc acattgatgc caccctgtac acagaatctg 420
atgtgcaccc tagctgtaaa gtgaccgcca tgaagtgttt tctgctggag ctgcaggtga 480
tttctctgga aagcggagat gcctctatcc acgacacagt ggagaatctg atcatcctgg 540
ccaacaatag cctgagcagc aatggcaatg tgacagagtc tggctgtaag gagtgtgagg 600
agctggagga gaagaacatc aaggagtttc tgcagagctt tgtgcacatc gtgcagatgt 660
tcatcaatac aagctctggc ggaggatctg gaggaggcgg atctggagga ggaggcagtg 720
gaggcggagg atctggcgga ggatctctgc agattacatg ccctcctcca atgtctgtgg 780
agcacgccga tatttgggtg aagtcctaca gcctgtacag cagagagaga tacatctgca 840
acagcggctt taagagaaag gccggcacct cttctctgac agagtgcgtg ctgaataagg 900
ccacaaatgt ggcccactgg acaacaccta gcctgaagtg cattagagat cctgccctgg 960
tccaccagag gcctgcccct ccatctacag tgacaacagc cggagtgaca cctcagcctg 1020
aatctctgag cccttctgga aaagaacctg ccgccagctc tcctagctct aataataccg 1080
ccgccacaac agccgccatt gtgcctggat ctcagctgat gcctagcaag tctcctagca 1140
caggcacaac agagatcagc agccacgaat cttctcacgg aacaccttct cagaccaccg 1200
ccaagaattg ggagctgaca gcctctgcct ctcaccagcc tccaggagtg tatcctcagg 1260
gccactctga tacaacagtg gccatcagca catctacagt gctgctgtgt ggactgtctg 1320
ccgtgtctct gctggcctgt tacctgaagt ctagacagac acctcctctg gcctctgtgg 1380
agatggaggc catggaagcc ctgcctgtga catggggaac aagcagcaga gatgaggacc 1440
tggagaattg ttctcaccac ctgtgaaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 1500
aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 1560
gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggga gcgtgcgtga ggctccggtg 1620
cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg ggagggggtc 1680
ggcgattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg 1740
tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc 1800
gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac agcagccgct aaatccaagg 1860
taaggtcaga agagctagcg ccaccatgct gctgctggtg accagcctgc tgctgtgtga 1920
gctgccccac cccgcctttc tgctgatccc cgacatccag atgacccaga ccacctccag 1980
cctgagcgcc agcctgggcg accgggtgac catcagctgc cgggccagcc aggacatcag 2040
caagtacctg aactggtatc agcagaagcc cgacggcacc gtcaagctgc tgatctacca 2100
caccagccgg ctgcacagcg gcgtgcccag ccggtttagc ggcagcggct ccggcaccga 2160
ctacagcctg accatctcca acctggagca ggaggacatc gccacctact tttgccagca 2220
gggcaacaca ctgccctaca cctttggcgg cggaacaaag ctggagatca ccggcagcac 2280
ctccggcagc ggcaagcctg gcagcggcga gggcagcacc aagggcgagg tgaagctgca 2340
ggagagcggc cctggcctgg tggcccccag ccagagcctg agcgtgacct gtaccgtgtc 2400
cggcgtgtcc ctgcccgact acggcgtgtc ctggatccgg cagcccccta ggaagggcct 2460
ggagtggctg ggcgtgatct ggggcagcga gaccacctac tacaacagcg ccctgaagag 2520
ccggctgacc atcatcaagg acaacagcaa gagccaggtg ttcctgaaga tgaacagcct 2580
gcagaccgac gacaccgcca tctactactg tgccaagcac tactactacg gcggcagcta 2640
cgccatggac tactggggcc agggcaccag cgtgaccgtg tccagcaagc ccaccaccac 2700
ccctgcccct agacctccaa ccccagcccc tacaatcgcc agccagcccc tgagcctgag 2760
gcccgaagcc tgtagacctg ccgctggcgg agccgtgcac accagaggcc tggatttcgc 2820
ctgcgacatc tacatctggg cccctctggc cggcacctgt ggcgtgctgc tgctgagcct 2880
ggtcatcacc ctgtactgca accaccggaa taggagcaag cggagcagag gcggccacag 2940
cgactacatg aacatgaccc cccggaggcc tggccccacc cggaagcact accagcccta 3000
cgcccctccc agggacttcg ccgcctaccg gagccgggtg aagttcagcc ggagcgccga 3060
cgcccctgcc taccagcagg gccagaacca gctgtacaac gagctgaacc tgggccggag 3120
ggaggagtac gacgtgctgg acaagcggag aggccgggac cctgagatgg gcggcaagcc 3180
ccggagaaag aaccctcagg agggcctgta taacgaactg cagaaagaca agatggccga 3240
ggcctacagc gagatcggca tgaagggcga gcggcggagg ggcaagggcc acgacggcct 3300
gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga tacctacgac gccctgcaca tgcaggccct 3360
gccccccaga agggccaaga ggagtggcag cggcgagggc agaggaagtc ttctaacatg 3420
cggtgacgtg gaggagaatc ccggccctat gaggctccct gctcagctcc tggggctgct 3480
aatgctctgg gtcccaggat ccagtgggcg caaagtgtgt aacggaatag gtattggtga 3540
atttaaagac tcactctcca taaatgctac gaatattaaa cacttcaaaa actgcacctc 3600
catcagtggc gatctccaca tcctgccggt ggcatttagg ggtgactcct tcacacatac 3660
tcctcctctg gatccacagg aactggatat tctgaaaacc gtaaaggaaa tcacagggtt 3720
tttgctgatt caggcttggc ctgaaaacag gacggacctc catgcctttg agaacctaga 3780
aatcatacgc ggcaggacca agcaacatgg tcagttttct cttgcagtcg tcagcctgaa 3840
cataacatcc ttgggattac gctccctcaa ggagataagt gatggagatg tgataatttc 3900
aggaaacaaa aatttgtgct atgcaaatac aataaactgg aaaaaactgt ttgggacctc 3960
cggtcagaaa accaaaatta taagcaacag aggtgaaaac agctgcaagg ccacaggcca 4020
ggtctgccat gccttgtgct cccccgaggg ctgctggggc ccggagccca gggactgcgt 4080
ctctggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc ggcggatctg gtggcggtgg 4140
ctcgttttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac 4200
agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc taatgatggg tggcatccct 4260
gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc 4320
ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta 4380
tggggtggag gggggtggta tggagcaagg ggcaagttgg gaa 4423
<210> 139
<211> 4423
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="XON-02(h)"
<400> 139
gagcgtgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 60
gagaagttgg ggggaggggg tcggcgattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
acagcagccg ctaaatccaa ggtaaggtca gaagagctag cgccaccatg ctgctgctgg 300
tgaccagcct gctgctgtgt gagctgcccc accccgcctt tctgctgatc cccgacatcc 360
agatgaccca gaccacctcc agcctgagcg ccagcctggg cgaccgggtg accatcagct 420
gccgggccag ccaggacatc agcaagtacc tgaactggta tcagcagaag cccgacggca 480
ccgtcaagct gctgatctac cacaccagcc ggctgcacag cggcgtgccc agccggttta 540
gcggcagcgg ctccggcacc gactacagcc tgaccatctc caacctggag caggaggaca 600
tcgccaccta cttttgccag cagggcaaca cactgcccta cacctttggc ggcggaacaa 660
agctggagat caccggcagc acctccggca gcggcaagcc tggcagcggc gagggcagca 720
ccaagggcga ggtgaagctg caggagagcg gccctggcct ggtggccccc agccagagcc 780
tgagcgtgac ctgtaccgtg tccggcgtgt ccctgcccga ctacggcgtg tcctggatcc 840
ggcagccccc taggaagggc ctggagtggc tgggcgtgat ctggggcagc gagaccacct 900
actacaacag cgccctgaag agccggctga ccatcatcaa ggacaacagc aagagccagg 960
tgttcctgaa gatgaacagc ctgcagaccg acgacaccgc catctactac tgtgccaagc 1020
actactacta cggcggcagc tacgccatgg actactgggg ccagggcacc agcgtgaccg 1080
tgtccagcaa gcccaccacc acccctgccc ctagacctcc aaccccagcc cctacaatcg 1140
ccagccagcc cctgagcctg aggcccgaag cctgtagacc tgccgctggc ggagccgtgc 1200
acaccagagg cctggatttc gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct 1260
gtggcgtgct gctgctgagc ctggtcatca ccctgtactg caaccaccgg aataggagca 1320
agcggagcag aggcggccac agcgactaca tgaacatgac cccccggagg cctggcccca 1380
cccggaagca ctaccagccc tacgcccctc ccagggactt cgccgcctac cggagccggg 1440
tgaagttcag ccggagcgcc gacgcccctg cctaccagca gggccagaac cagctgtaca 1500
acgagctgaa cctgggccgg agggaggagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggccggg 1560
accctgagat gggcggcaag ccccggagaa agaaccctca ggagggcctg tataacgaac 1620
tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggcgga 1680
ggggcaaggg ccacgacggc ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gatacctacg 1740
acgccctgca catgcaggcc ctgcccccca gaagggccaa gaggagtggc agcggcgagg 1800
gcagaggaag tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct atgaggctcc 1860
ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtcccagg atccagtggg cgcaaagtgt 1920
gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct acgaatatta 1980
aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg gtggcattta 2040
ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat attctgaaaa 2100
ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac aggacggacc 2160
tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat ggtcagtttt 2220
ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc aaggagataa 2280
gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat acaataaact 2340
ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac agaggtgaaa 2400
acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag ggctgctggg 2460
gcccggagcc cagggactgc gtctctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg 2520
gcggcggatc tggtggcggt ggctcgtttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg 2580
cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg agtaagagga 2640
gctaatgatg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt 2700
gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac 2760
taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt 2820
gggaaattgt tcggagcagt gcggcgcgtt tagcggagta ctgtcctccg atattaatcg 2880
gggcagacta ttccggggtt taccggcgca ctctcgcccg aacttcaccg gcggtctttc 2940
gtccgtgctt tatcggggcg gatcactccg aaccccggga ggtctatata agcagagctc 3000
gtttagtgaa ccctcattct ggagacggat cccgagccga gtgttttgac ctccatagaa 3060
cagccgctaa atccaaggta aggtcagaag agctagcgcc accatggatt ggacctggat 3120
tctgtttctg gtggccgctg ccacaagagt gcacagcaac tgggtgaatg tgatcagcga 3180
cctgaagaag atcgaggatc tgatccagag catgcacatt gatgccaccc tgtacacaga 3240
atctgatgtg caccctagct gtaaagtgac cgccatgaag tgttttctgc tggagctgca 3300
ggtgatttct ctggaaagcg gagatgcctc tatccacgac acagtggaga atctgatcat 3360
cctggccaac aatagcctga gcagcaatgg caatgtgaca gagtctggct gtaaggagtg 3420
tgaggagctg gaggagaaga acatcaagga gtttctgcag agctttgtgc acatcgtgca 3480
gatgttcatc aatacaagct ctggcggagg atctggagga ggcggatctg gaggaggagg 3540
cagtggaggc ggaggatctg gcggaggatc tctgcagatt acatgccctc ctccaatgtc 3600
tgtggagcac gccgatattt gggtgaagtc ctacagcctg tacagcagag agagatacat 3660
ctgcaacagc ggctttaaga gaaaggccgg cacctcttct ctgacagagt gcgtgctgaa 3720
taaggccaca aatgtggccc actggacaac acctagcctg aagtgcatta gagatcctgc 3780
cctggtccac cagaggcctg cccctccatc tacagtgaca acagccggag tgacacctca 3840
gcctgaatct ctgagccctt ctggaaaaga acctgccgcc agctctccta gctctaataa 3900
taccgccgcc acaacagccg ccattgtgcc tggatctcag ctgatgccta gcaagtctcc 3960
tagcacaggc acaacagaga tcagcagcca cgaatcttct cacggaacac cttctcagac 4020
caccgccaag aattgggagc tgacagcctc tgcctctcac cagcctccag gagtgtatcc 4080
tcagggccac tctgatacaa cagtggccat cagcacatct acagtgctgc tgtgtggact 4140
gtctgccgtg tctctgctgg cctgttacct gaagtctaga cagacacctc ctctggcctc 4200
tgtggagatg gaggccatgg aagccctgcc tgtgacatgg ggaacaagca gcagagatga 4260
ggacctggag aattgttctc accacctgtg aaacttgttt attgcagctt ataatggtta 4320
caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag 4380
ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tgg 4423
<210> 140
<211> 4487
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="FLC-2B8-1"
<400> 140
gagcgtgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 60
gagaagttgg ggggaggggg tcggcgattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
acagcagccg ctaaatccaa ggtaaggtca gaagagctag cgccaccatg ctgctgctgg 300
tgaccagcct gctgctgtgt gagctgcccc accccgcctt tctgctgatc cccgacatcc 360
agatgaccca gaccacctcc agcctgagcg ccagcctggg cgaccgggtg accatcagct 420
gccgggccag ccaggacatc agcaagtacc tgaactggta tcagcagaag cccgacggca 480
ccgtcaagct gctgatctac cacaccagcc ggctgcacag cggcgtgccc agccggttta 540
gcggcagcgg ctccggcacc gactacagcc tgaccatctc caacctggag caggaggaca 600
tcgccaccta cttttgccag cagggcaaca cactgcccta cacctttggc ggcggaacaa 660
agctggagat caccggcagc acctccggca gcggcaagcc tggcagcggc gagggcagca 720
ccaagggcga ggtgaagctg caggagagcg gccctggcct ggtggccccc agccagagcc 780
tgagcgtgac ctgtaccgtg tccggcgtgt ccctgcccga ctacggcgtg tcctggatcc 840
ggcagccccc taggaagggc ctggagtggc tgggcgtgat ctggggcagc gagaccacct 900
actacaacag cgccctgaag agccggctga ccatcatcaa ggacaacagc aagagccagg 960
tgttcctgaa gatgaacagc ctgcagaccg acgacaccgc catctactac tgtgccaagc 1020
actactacta cggcggcagc tacgccatgg actactgggg ccagggcacc agcgtgaccg 1080
tgtccagcaa gcccaccacc acccctgccc ctagacctcc aaccccagcc cctacaatcg 1140
ccagccagcc cctgagcctg aggcccgaag cctgtagacc tgccgctggc ggagccgtgc 1200
acaccagagg cctggatttc gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct 1260
gtggcgtgct gctgctgagc ctggtcatca ccctgtactg caaccaccgg aataggagca 1320
agcggagcag aggcggccac agcgactaca tgaacatgac cccccggagg cctggcccca 1380
cccggaagca ctaccagccc tacgcccctc ccagggactt cgccgcctac cggagccggg 1440
tgaagttcag ccggagcgcc gacgcccctg cctaccagca gggccagaac cagctgtaca 1500
acgagctgaa cctgggccgg agggaggagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggccggg 1560
accctgagat gggcggcaag ccccggagaa agaaccctca ggagggcctg tataacgaac 1620
tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggcgga 1680
ggggcaaggg ccacgacggc ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gatacctacg 1740
acgccctgca catgcaggcc ctgcccccca gaagagctaa gaggggaagc ggagagggca 1800
gaggaagtct gctaacatgc ggtgacgtcg aggagaatcc tggacctggc cccaagaaga 1860
aaaggaaggt ggcccccccc accgacgtga gcctgggcga cgagctgcac ctggacggcg 1920
aggacgtggc catggcccac gccgacgccc tggacgactt cgacctggac atgctgggcg 1980
acggcgacag ccccggcccc ggcttcaccc cccacgacag cgccccctac ggcgccctgg 2040
acatggccga cttcgagttc gagcagatgt tcaccgacgc cctgggcatc gacgagtacg 2100
gcggcgaatt cgagatgccc gtggacagga ttctggaggc cgaactcgcc gtggagcaga 2160
aaagcgacca gggcgtggag ggccccggcg gaaccggcgg cagcggcagc agccccaacg 2220
accccgtgac caacatctgc caggccgccg acaagcagct gttcaccctg gtggagtggg 2280
ccaagaggat tccccacttc agcagcctgc ccctggacga ccaggtgatc ctgctgaggg 2340
ccggatggaa cgagctgctg atcgccagct tcagccacag gagcatcgac gtgagggacg 2400
gcatcctgct ggccaccggc ctgcacgtcc ataggaacag cgcccacagc gccggagtgg 2460
gcgccatctt cgacagggtg ctgaccgagc tggtgagcaa gatgagggac atgaggatgg 2520
acaagaccga gctgggctgc ctgagggcca tcatcctgtt caaccccgag gtgaggggcc 2580
tgaaaagcgc ccaggaggtg gagctgctga gggagaaggt gtacgccgcc ctggaggagt 2640
acaccaggac cacccacccc gacgagcccg gcagattcgc caagctgctg ctgaggctgc 2700
ccagcctgag gagcatcggc ctgaagtgcc tggagcacct gttcttcttc aggctgatcg 2760
gcgacgtgcc catcgacacc ttcctgatgg agatgctgga gagccccagc gacagcagag 2820
ctaagagggg aagcggagag ggcagaggaa gtctgctaac atgcggtgac gtcgaggaga 2880
atcctggacc taagctgctg agcagcatcg agcaggcttg cgacatctgc aggctgaaga 2940
agctgaagtg cagcaaggag aagcccaagt gcgccaagtg cctgaagaac aactgggagt 3000
gcagatacag ccccaagacc aagaggagcc ccctgaccag ggcccacctg accgaggtgg 3060
agagcaggct ggagaggctg gagcagctgt tcctgctgat cttccccagg gaggacctgg 3120
acatgatcct gaagatggac agcctgcaag acatcaaggc cctgctgacc ggcctgttcg 3180
tgcaggacaa cgtgaacaag gacgccgtga ccgacaggct ggccagcgtg gagaccgaca 3240
tgcccctgac cctgaggcag cacaggatca gcgccaccag cagcagcgag gagagcagca 3300
acaagggcca gaggcagctg accgtgagcc ccgagtttcc cgggatcagg cccgagtgcg 3360
tggtgcccga gacccagtgc gccatgaaaa ggaaggagaa gaaggcccag aaggagaagg 3420
acaagctgcc cgtgagcacc accaccgtcg atgaccacat gccccccatc atgcagtgcg 3480
agcccccccc ccccgaggcc gccaggattc acgaggtcgt gcccaggttc ctgagcgaca 3540
agctgctggt gaccaacagg cagaagaaca tcccccagct gaccgccaac cagcagttcc 3600
tgatcgccag gctgatctgg tatcaggacg gctacgagca gcccagcgac gaggacctga 3660
aaaggatcac ccagacctgg cagcaggccg acgacgagaa cgaggagagc gacaccccct 3720
tcaggcagat caccgagatg accatcctga ccgtgcagct gatcgtggag ttcgccaagg 3780
gcctgcccgg attcgccaag atcagccagc ccgaccagat caccctgctg aaggcttgca 3840
gcagcgaggt gatgatgctg agggtggcca ggaggtacga cgccgccagc gacagcatcc 3900
tgttcgccaa caaccaggct tacaccaggg acaactacag gaaggctggc atggccgagg 3960
tgatcgagga cctcctgcac ttctgcagat gtatgtacag catggccctg gacaacatcc 4020
actacgccct gctgaccgcc gtggtgatct tcagcgacag gcccggcctg gagcagcccc 4080
agctggtgga ggagatccag aggtactacc tgaacaccct gaggatctac atcctgaacc 4140
agctgagcgg cagcgccagg agcagcgtga tctacggcaa gatcctgagc atcctgagcg 4200
agctgaggac cctgggaatg cagaacagca atatgtgtat cagcctgaag ctgaagaaca 4260
ggaagctgcc ccccttcctg gaggagattt gggacgtggc cgacatgagc cacacccagc 4320
ccccccccat cctggagagc cccaccaacc tgtgaaactt gtttattgca gcttataatg 4380
gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt 4440
ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca tgtctgg 4487
<210> 141
<211> 4509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="FLC-2A3-1"
<400> 141
gagcgtgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 60
gagaagttgg ggggaggggg tcggcgattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
acagcagccg ctaaatccaa ggtaaggtca gaagagctag cgccaccatg ctgctgctgg 300
tgaccagcct gctgctgtgt gagctgcccc accccgcctt tctgctgatc cccgacatcc 360
agatgaccca gaccacctcc agcctgagcg ccagcctggg cgaccgggtg accatcagct 420
gccgggccag ccaggacatc agcaagtacc tgaactggta tcagcagaag cccgacggca 480
ccgtcaagct gctgatctac cacaccagcc ggctgcacag cggcgtgccc agccggttta 540
gcggcagcgg ctccggcacc gactacagcc tgaccatctc caacctggag caggaggaca 600
tcgccaccta cttttgccag cagggcaaca cactgcccta cacctttggc ggcggaacaa 660
agctggagat caccggcagc acctccggca gcggcaagcc tggcagcggc gagggcagca 720
ccaagggcga ggtgaagctg caggagagcg gccctggcct ggtggccccc agccagagcc 780
tgagcgtgac ctgtaccgtg tccggcgtgt ccctgcccga ctacggcgtg tcctggatcc 840
ggcagccccc taggaagggc ctggagtggc tgggcgtgat ctggggcagc gagaccacct 900
actacaacag cgccctgaag agccggctga ccatcatcaa ggacaacagc aagagccagg 960
tgttcctgaa gatgaacagc ctgcagaccg acgacaccgc catctactac tgtgccaagc 1020
actactacta cggcggcagc tacgccatgg actactgggg ccagggcacc agcgtgaccg 1080
tgtccagcaa gcccaccacc acccctgccc ctagacctcc aaccccagcc cctacaatcg 1140
ccagccagcc cctgagcctg aggcccgaag cctgtagacc tgccgctggc ggagccgtgc 1200
acaccagagg cctggatttc gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct 1260
gtggcgtgct gctgctgagc ctggtcatca ccctgtactg caaccaccgg aataggagca 1320
agcggagcag aggcggccac agcgactaca tgaacatgac cccccggagg cctggcccca 1380
cccggaagca ctaccagccc tacgcccctc ccagggactt cgccgcctac cggagccggg 1440
tgaagttcag ccggagcgcc gacgcccctg cctaccagca gggccagaac cagctgtaca 1500
acgagctgaa cctgggccgg agggaggagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggccggg 1560
accctgagat gggcggcaag ccccggagaa agaaccctca ggagggcctg tataacgaac 1620
tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggcgga 1680
ggggcaaggg ccacgacggc ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gatacctacg 1740
acgccctgca catgcaggcc ctgcccccca gaagagctaa gaggggaagc ggagagggca 1800
gaggaagtct gctaacatgc ggtgacgtcg aggagaatcc tggacctggc cccaagaaga 1860
aaaggaaggt ggcccccccc accgacgtga gcctgggcga cgagctgcac ctggacggcg 1920
aggacgtggc catggcccac gccgacgccc tggacgactt cgacctggac atgctgggcg 1980
acggcgacag ccccggcccc ggcttcaccc cccacgacag cgccccctac ggcgccctgg 2040
acatggccga cttcgagttc gagcagatgt tcaccgacgc cctgggcatc gacgagtacg 2100
gcggcgaatt cgagatgccc gtggacagga ttctggaggc cgaactcgcc gtggagcaga 2160
aaagcgacca gggcgtggag ggccccggcg gaaccggcgg cagcggcagc agccccaacg 2220
accccgtgac caacatctgc caggccgccg acaagcagct gttcaccctg gtggagtggg 2280
ccaagaggat tccccacttc agcagcctgc ccctggacga ccaggtgatc ctgctgaggg 2340
ccggatggaa cgagctgctg atcgccagct tcagccacag gagcatcgac gtgagggacg 2400
gcatcctgct ggccaccggc ctgcacgtcc ataggaacag cgcccacagc gccggagtgg 2460
gcgccatctt cgacagggtg ctgaccgagc tggtgagcaa gatgagggac atgaggatgg 2520
acaagaccga gctgggctgc ctgagggcca tcatcctgtt caaccccgag gtgaggggcc 2580
tgaaaagcgc ccaggaggtg gagctgctga gggagaaggt gtacgccgcc ctggaggagt 2640
acaccaggac cacccacccc gacgagcccg gcagattcgc caagctgctg ctgaggctgc 2700
ccagcctgag gagcatcggc ctgaagtgcc tggagcacct gttcttcttc aggctgatcg 2760
gcgacgtgcc catcgacacc ttcctgatgg agatgctgga gagccccagc gacagctgag 2820
catgcactag ttttataatt tcttcttcca gaatttctga cattttataa tttcttcttc 2880
cagaagactc acaacctcca tatggccacc atgaagctgc tgagcagcat cgagcaggct 2940
tgcgacatct gcaggctgaa gaagctgaag tgcagcaagg agaagcccaa gtgcgccaag 3000
tgcctgaaga acaactggga gtgcagatac agccccaaga ccaagaggag ccccctgacc 3060
agggcccacc tgaccgaggt ggagagcagg ctggagaggc tggagcagct gttcctgctg 3120
atcttcccca gggaggacct ggacatgatc ctgaagatgg acagcctgca agacatcaag 3180
gccctgctga ccggcctgtt cgtgcaggac aacgtgaaca aggacgccgt gaccgacagg 3240
ctggccagcg tggagaccga catgcccctg accctgaggc agcacaggat cagcgccacc 3300
agcagcagcg aggagagcag caacaagggc cagaggcagc tgaccgtgag ccccgagttt 3360
cccgggatca ggcccgagtg cgtggtgccc gagacccagt gcgccatgaa aaggaaggag 3420
aagaaggccc agaaggagaa ggacaagctg cccgtgagca ccaccaccgt cgatgaccac 3480
atgcccccca tcatgcagtg cgagcccccc ccccccgagg ccgccaggat tcacgaggtc 3540
gtgcccaggt tcctgagcga caagctgctg gtgaccaaca ggcagaagaa catcccccag 3600
ctgaccgcca accagcagtt cctgatcgcc aggctgatct ggtatcagga cggctacgag 3660
cagcccagcg acgaggacct gaaaaggatc acccagacct ggcagcaggc cgacgacgag 3720
aacgaggaga gcgacacccc cttcaggcag atcaccgaga tgaccatcct gaccgtgcag 3780
ctgatcgtgg agttcgccaa gggcctgccc ggattcgcca agatcagcca gcccgaccag 3840
atcaccctgc tgaaggcttg cagcagcgag gtgatgatgc tgagggtggc caggaggtac 3900
gacgccgcca gcgacagcat cctgttcgcc aacaaccagg cttacaccag ggacaactac 3960
aggaaggctg gcatggccga ggtgatcgag gacctcctgc acttctgcag atgtatgtac 4020
agcatggccc tggacaacat ccactacgcc ctgctgaccg ccgtggtgat cttcagcgac 4080
aggcccggcc tggagcagcc ccagctggtg gaggagatcc agaggtacta cctgaacacc 4140
ctgaggatct acatcctgaa ccagctgagc ggcagcgcca ggagcagcgt gatctacggc 4200
aagatcctga gcatcctgag cgagctgagg accctgggaa tgcagaacag caatatgtgt 4260
atcagcctga agctgaagaa caggaagctg ccccccttcc tggaggagat ttgggacgtg 4320
gccgacatga gccacaccca gccccccccc atcctggaga gccccaccaa cctgtgaaac 4380
ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 4440
aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 4500
catgtctgg 4509
<210> 142
<211> 3155
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="FLC-2A7-1"
<400> 142
attgttcgga gcagtgcggc gcgtttagcg gagtactgtc ctccgatatt aatcggggca 60
gactattccg gggtttaccg gcgcactctc gcccgaactt caccggcggt ctttcgtccg 120
tgctttatcg gggcggatca ctccgaaccc cgggaggtct atataagcag agctcgttta 180
gtgaaccctc attctggaga cggatcccga gccgagtgtt ttgacctcca tagaacagcc 240
gctaaatcca aggtaaggtc agaagagcta gcgccaccat gctgctgctg gtgaccagcc 300
tgctgctgtg tgagctgccc caccccgcct ttctgctgat ccccgacatc cagatgaccc 360
agaccacctc cagcctgagc gccagcctgg gcgaccgggt gaccatcagc tgccgggcca 420
gccaggacat cagcaagtac ctgaactggt atcagcagaa gcccgacggc accgtcaagc 480
tgctgatcta ccacaccagc cggctgcaca gcggcgtgcc cagccggttt agcggcagcg 540
gctccggcac cgactacagc ctgaccatct ccaacctgga gcaggaggac atcgccacct 600
acttttgcca gcagggcaac acactgccct acacctttgg cggcggaaca aagctggaga 660
tcaccggcag cacctccggc agcggcaagc ctggcagcgg cgagggcagc accaagggcg 720
aggtgaagct gcaggagagc ggccctggcc tggtggcccc cagccagagc ctgagcgtga 780
cctgtaccgt gtccggcgtg tccctgcccg actacggcgt gtcctggatc cggcagcccc 840
ctaggaaggg cctggagtgg ctgggcgtga tctggggcag cgagaccacc tactacaaca 900
gcgccctgaa gagccggctg accatcatca aggacaacag caagagccag gtgttcctga 960
agatgaacag cctgcagacc gacgacaccg ccatctacta ctgtgccaag cactactact 1020
acggcggcag ctacgccatg gactactggg gccagggcac cagcgtgacc gtgtccagca 1080
agcccaccac cacccctgcc cctagacctc caaccccagc ccctacaatc gccagccagc 1140
ccctgagcct gaggcccgaa gcctgtagac ctgccgctgg cggagccgtg cacaccagag 1200
gcctggattt cgcctgcgac atctacatct gggcccctct ggccggcacc tgtggcgtgc 1260
tgctgctgag cctggtcatc accctgtact gcaaccaccg gaataggagc aagcggagca 1320
gaggcggcca cagcgactac atgaacatga ccccccggag gcctggcccc acccggaagc 1380
actaccagcc ctacgcccct cccagggact tcgccgccta ccggagccgg gtgaagttca 1440
gccggagcgc cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac aacgagctga 1500
acctgggccg gagggaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg gaccctgaga 1560
tgggcggcaa gccccggaga aagaaccctc aggagggcct gtataacgaa ctgcagaaag 1620
acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg aggggcaagg 1680
gccacgacgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc 1740
acatgcaggc cctgcccccc agaagagcta agaggggaag cggagagggc agaggaagtc 1800
tgctaacatg cggtgacgtc gaggagaatc ctggacctga ttggacctgg attctgtttc 1860
tggtggccgc tgccacaaga gtgcacagca actgggtgaa tgtgatcagc gacctgaaga 1920
agatcgagga tctgatccag agcatgcaca ttgatgccac cctgtacaca gaatctgatg 1980
tgcaccctag ctgtaaagtg accgccatga agtgttttct gctggagctg caggtgattt 2040
ctctggaaag cggagatgcc tctatccacg acacagtgga gaatctgatc atcctggcca 2100
acaatagcct gagcagcaat ggcaatgtga cagagtctgg ctgtaaggag tgtgaggagc 2160
tggaggagaa gaacatcaag gagtttctgc agagctttgt gcacatcgtg cagatgttca 2220
tcaatacaag ctctggcgga ggatctggag gaggcggatc tggaggagga ggcagtggag 2280
gcggaggatc tggcggagga tctctgcaga ttacatgccc tcctccaatg tctgtggagc 2340
acgccgatat ttgggtgaag tcctacagcc tgtacagcag agagagatac atctgcaaca 2400
gcggctttaa gagaaaggcc ggcacctctt ctctgacaga gtgcgtgctg aataaggcca 2460
caaatgtggc ccactggaca acacctagcc tgaagtgcat tagagatcct gccctggtcc 2520
accagaggcc tgcccctcca tctacagtga caacagccgg agtgacacct cagcctgaat 2580
ctctgagccc ttctggaaaa gaacctgccg ccagctctcc tagctctaat aataccgccg 2640
ccacaacagc cgccattgtg cctggatctc agctgatgcc tagcaagtct cctagcacag 2700
gcacaacaga gatcagcagc cacgaatctt ctcacggaac accttctcag accaccgcca 2760
agaattggga gctgacagcc tctgcctctc accagcctcc aggagtgtat cctcagggcc 2820
actctgatac aacagtggcc atcagcacat ctacagtgct gctgtgtgga ctgtctgccg 2880
tgtctctgct ggcctgttac ctgaagtcta gacagacacc tcctctggcc tctgtggaga 2940
tggaggccat ggaagccctg cctgtgacat ggggaacaag cagcagagat gaggacctgg 3000
agaattgttc tcaccacctg tgaaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 3060
gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 3120
tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctgg 3155
<210> 143
<211> 3476
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="FLC-2A5-2"
<400> 143
attgttcgga gcagtgcggc gcgtttagcg gagtactgtc ctccgatatt aatcggggca 60
gactattccg gggtttaccg gcgcactctc gcccgaactt caccggcggt ctttcgtccg 120
tgctttatcg gggcggatca ctccgaaccc cgggaggtct atataagcag agctcgttta 180
gtgaaccctc attctggaga cggatcccga gccgagtgtt ttgacctcca tagaacagcc 240
gctaaatcca aggtaaggtc agaagagcta gcgccaccat ggattggacc tggattctgt 300
ttctggtggc cgctgccaca agagtgcaca gcaactgggt gaatgtgatc agcgacctga 360
agaagatcga ggatctgatc cagagcatgc acattgatgc caccctgtac acagaatctg 420
atgtgcaccc tagctgtaaa gtgaccgcca tgaagtgttt tctgctggag ctgcaggtga 480
tttctctgga aagcggagat gcctctatcc acgacacagt ggagaatctg atcatcctgg 540
ccaacaatag cctgagcagc aatggcaatg tgacagagtc tggctgtaag gagtgtgagg 600
agctggagga gaagaacatc aaggagtttc tgcagagctt tgtgcacatc gtgcagatgt 660
tcatcaatac aagctctggc ggaggatctg gaggaggcgg atctggagga ggaggcagtg 720
gaggcggagg atctggcgga ggatctctgc agattacatg ccctcctcca atgtctgtgg 780
agcacgccga tatttgggtg aagtcctaca gcctgtacag cagagagaga tacatctgca 840
acagcggctt taagagaaag gccggcacct cttctctgac agagtgcgtg ctgaataagg 900
ccacaaatgt ggcccactgg acaacaccta gcctgaagtg cattagagat cctgccctgg 960
tccaccagag gcctgcccct ccatctacag tgacaacagc cggagtgaca cctcagcctg 1020
aatctctgag cccttctgga aaagaacctg ccgccagctc tcctagctct aataataccg 1080
ccgccacaac agccgccatt gtgcctggat ctcagctgat gcctagcaag tctcctagca 1140
caggcacaac agagatcagc agccacgaat cttctcacgg aacaccttct cagaccaccg 1200
ccaagaattg ggagctgaca gcctctgcct ctcaccagcc tccaggagtg tatcctcagg 1260
gccactctga tacaacagtg gccatcagca catctacagt gctgctgtgt ggactgtctg 1320
ccgtgtctct gctggcctgt tacctgaagt ctagacagac acctcctctg gcctctgtgg 1380
agatggaggc catggaagcc ctgcctgtga catggggaac aagcagcaga gatgaggacc 1440
tggagaattg ttctcaccac ctgtgaatcg attaatctag cggccctaga cgagcagaca 1500
tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct 1560
ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac 1620
aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag atgtgggagg 1680
ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat ccgataagcg tacctagagg 1740
ccgcctagag attcgtgggg gactcgagga taggcggcgg ttgggtgtgc gacatgtccg 1800
ccacatccca gatctcctcg aggaaaggcg gcagctttct gttcttgagc ttgagggaga 1860
tgcacatgtt ggagttttgc atgccgagcg tgcgtagctc agagaggatt gagaggatct 1920
tgccgtatat gacggacgaa cgcgccgacc cgctcagctg gttcaggata tagatgcgga 1980
gcgtattcag gtagtaccgc tggatctctt ccaccagttg cggctgctcc aaccctggcc 2040
ggtcagaaaa gatgacgaca gccgtgagca gcgcgtaatg gatgttgtcc aacgccatag 2100
agtacatgca ccggcagaag tgcagtagat cctcgatgac ctcggccatg ccagccttgc 2160
ggtagttgtc gcgagtgtac gcttggttgt tcgcgaacag aatactgtct gaggccgcat 2220
cgtatcgtcg cgcgactcgg agcatcatta cctcacttga gcaagcctta agcagcgtaa 2280
tttgatcagg ctgcgagatc ttggcgaacc ctggcaatcc cttcgcgaac tccacgataa 2340
gttggaccgt gaggatagtc atctctgtga tctggcggaa gggagtgtcc gactcttcgt 2400
tttcatcgtc cgcttgctgc cacgtctgcg taatcctctt caaatcttca tcagaaggct 2460
gctcgtaccc gtcctggtac cagatgagcc tggcgataag gaactgctgg ttggctgtca 2520
actgggggat gtttttctgc cggtttgtca ccaacagctt gtcggagaga aaccttggga 2580
ccacttcgtg aatccttgct gcttcaggag gtggaggttc acactgcata atgggcggca 2640
tgtggtcgtc caccgtcgtc gtgctgacag gcagtttgtc cttctccttc tgtgctttct 2700
tctctttccg cttcatggcg cactgagtct cgggtactac gcactcaggc cgcccgggaa 2760
actcggggct cacggtcagc tgcctctggc ccttgttgct gctctcctcg ctgctgctgg 2820
tggcgctgat cctgtgctgc ctcagggtca ggggcatgtc ggtctccacg ctggccagcc 2880
tgtcggtcac ggcgtccttg ttcacgttgt cctgcacgaa caggccggtc agcagggcct 2940
tgatgtcttg caggctgtcc atcttcagga tcatgtccag gtcctccctg gggaagatca 3000
gcaggaacag ctgctccagc ctctccagcc tgctctccac ctcggtcagg tgggccctgg 3060
tcagggggct cctcttggtc ttggggctgt atctgcactc ccagttgttc ttcaggcact 3120
tggcgcactt gggcttctcc ttgctgcact tcagcttctt cagcctgcag atgtcgcaag 3180
cctgctcgat gctgctcagc agcttcatgg tggcccgaaa agcacacaat gcctgtgttc 3240
tggcggcaaa cccgttgcga aaaagaacgt tcacggcgac tactgcactt atatacggtt 3300
ctcccccacc ctcgggaaaa aggcggagcc agtacacgac atcactttcc cagtttaccc 3360
cgcgccacct tctctaggca ccggttcaat cgccgacccc ctccccccaa cttctcgggg 3420
actgtgggcg atgtgcgctc tgcccactga cgggcaccgg agcctcacgc acgctc 3476
<210> 144
<211> 3503
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="FLC-2A6-1"
<400> 144
gagcgtgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 60
gagaagttgg ggggaggggg tcggcgattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
acagcagccg ctaaatccaa ggtaaggtca gaagagctag cgccaccatg ctgctgctgg 300
tgaccagcct gctgctgtgt gagctgcccc accccgcctt tctgctgatc cccgacatcc 360
agatgaccca gaccacctcc agcctgagcg ccagcctggg cgaccgggtg accatcagct 420
gccgggccag ccaggacatc agcaagtacc tgaactggta tcagcagaag cccgacggca 480
ccgtcaagct gctgatctac cacaccagcc ggctgcacag cggcgtgccc agccggttta 540
gcggcagcgg ctccggcacc gactacagcc tgaccatctc caacctggag caggaggaca 600
tcgccaccta cttttgccag cagggcaaca cactgcccta cacctttggc ggcggaacaa 660
agctggagat caccggcagc acctccggca gcggcaagcc tggcagcggc gagggcagca 720
ccaagggcga ggtgaagctg caggagagcg gccctggcct ggtggccccc agccagagcc 780
tgagcgtgac ctgtaccgtg tccggcgtgt ccctgcccga ctacggcgtg tcctggatcc 840
ggcagccccc taggaagggc ctggagtggc tgggcgtgat ctggggcagc gagaccacct 900
actacaacag cgccctgaag agccggctga ccatcatcaa ggacaacagc aagagccagg 960
tgttcctgaa gatgaacagc ctgcagaccg acgacaccgc catctactac tgtgccaagc 1020
actactacta cggcggcagc tacgccatgg actactgggg ccagggcacc agcgtgaccg 1080
tgtccagcaa gcccaccacc acccctgccc ctagacctcc aaccccagcc cctacaatcg 1140
ccagccagcc cctgagcctg aggcccgaag cctgtagacc tgccgctggc ggagccgtgc 1200
acaccagagg cctggatttc gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct 1260
gtggcgtgct gctgctgagc ctggtcatca ccctgtactg caaccaccgg aataggagca 1320
agcggagcag aggcggccac agcgactaca tgaacatgac cccccggagg cctggcccca 1380
cccggaagca ctaccagccc tacgcccctc ccagggactt cgccgcctac cggagccggg 1440
tgaagttcag ccggagcgcc gacgcccctg cctaccagca gggccagaac cagctgtaca 1500
acgagctgaa cctgggccgg agggaggagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggccggg 1560
accctgagat gggcggcaag ccccggagaa agaaccctca ggagggcctg tataacgaac 1620
tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggcgga 1680
ggggcaaggg ccacgacggc ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gatacctacg 1740
acgccctgca catgcaggcc ctgcccccca gatgaatcga ttaatctagc ggccctagac 1800
gagcagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa 1860
aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct 1920
gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggaga 1980
tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtaaaatc cgataagcgt 2040
acctagaggc tcacaggtgg tgagaacaat tctccaggtc ctcatctctg ctgcttgttc 2100
cccatgtcac aggcagggct tccatggcct ccatctccac agaggccaga ggaggtgtct 2160
gtctagactt caggtaacag gccagcagag acacggcaga cagtccacac agcagcactg 2220
tagatgtgct gatggccact gttgtatcag agtggccctg aggatacact cctggaggct 2280
ggtgagaggc agaggctgtc agctcccaat tcttggcggt ggtctgagaa ggtgttccgt 2340
gagaagattc gtggctgctg atctctgttg tgcctgtgct aggagacttg ctaggcatca 2400
gctgagatcc aggcacaatg gcggctgttg tggcggcggt attattagag ctaggagagc 2460
tggcggcagg ttcttttcca gaagggctca gagattcagg ctgaggtgtc actccggctg 2520
ttgtcactgt agatggaggg gcaggcctct ggtggaccag ggcaggatct ctaatgcact 2580
tcaggctagg tgttgtccag tgggccacat ttgtggcctt attcagcacg cactctgtca 2640
gagaagaggt gccggccttt ctcttaaagc cgctgttgca gatgtatctc tctctgctgt 2700
acaggctgta ggacttcacc caaatatcgg cgtgctccac agacattgga ggagggcatg 2760
taatctgcag agatcctccg ccagatcctc cgcctccact gcctcctcct ccagatccgc 2820
ctcctccaga tcctccgcca gagcttgtat tgatgaacat ctgcacgatg tgcacaaagc 2880
tctgcagaaa ctccttgatg ttcttctcct ccagctcctc acactcctta cagccagact 2940
ctgtcacatt gccattgctg ctcaggctat tgttggccag gatgatcaga ttctccactg 3000
tgtcgtggat agaggcatct ccgctttcca gagaaatcac ctgcagctcc agcagaaaac 3060
acttcatggc ggtcacttta cagctagggt gcacatcaga ttctgtgtac agggtggcat 3120
caatgtgcat gctctggatc agatcctcga tcttcttcag gtcgctgatc acattcaccc 3180
agttgctgtg cactcttgtg gcagcggcca ccagaaacag aatccaggtc caatccatgg 3240
tggcgctagc ccgaaaagca cacaatgctt ctatggaggt caaaacactc ggctcgggat 3300
ccgtctccag aatgagggtt cactaaacga gctctgctta tatagacctc ccggggttcg 3360
gagtgatccg ccccgataaa gcacggacga aagaccgccg gtgaagttcg ggcgagagtg 3420
cgccggtaaa ccccggaata gtctgccccg attaatatcg gaggacagta ctccgctaaa 3480
cgcgccgcac tgctccgaac aat 3503
<210> 145
<211> 4079
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="XON-00(h)"
<400> 145
gagcgtgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 60
gagaagttgg ggggaggggg tcggcgattg aaccggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
acagcagccg ctaaatccaa ggtaaggtca gaagagctag cgccaccatg ctgctgctgg 300
tgaccagcct gctgctgtgt gagctgcccc accccgcctt tctgctgatc cccgacatcc 360
agatgaccca gaccacctcc agcctgagcg ccagcctggg cgaccgggtg accatcagct 420
gccgggccag ccaggacatc agcaagtacc tgaactggta tcagcagaag cccgacggca 480
ccgtcaagct gctgatctac cacaccagcc ggctgcacag cggcgtgccc agccggttta 540
gcggcagcgg ctccggcacc gactacagcc tgaccatctc caacctggag caggaggaca 600
tcgccaccta cttttgccag cagggcaaca cactgcccta cacctttggc ggcggaacaa 660
agctggagat caccggcagc acctccggca gcggcaagcc tggcagcggc gagggcagca 720
ccaagggcga ggtgaagctg caggagagcg gccctggcct ggtggccccc agccagagcc 780
tgagcgtgac ctgtaccgtg tccggcgtgt ccctgcccga ctacggcgtg tcctggatcc 840
ggcagccccc taggaagggc ctggagtggc tgggcgtgat ctggggcagc gagaccacct 900
actacaacag cgccctgaag agccggctga ccatcatcaa ggacaacagc aagagccagg 960
tgttcctgaa gatgaacagc ctgcagaccg acgacaccgc catctactac tgtgccaagc 1020
actactacta cggcggcagc tacgccatgg actactgggg ccagggcacc agcgtgaccg 1080
tgtccagcaa gcccaccacc acccctgccc ctagacctcc aaccccagcc cctacaatcg 1140
ccagccagcc cctgagcctg aggcccgaag cctgtagacc tgccgctggc ggagccgtgc 1200
acaccagagg cctggatttc gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct 1260
gtggcgtgct gctgctgagc ctggtcatca ccctgtactg caaccaccgg aataggagca 1320
agcggagcag aggcggccac agcgactaca tgaacatgac cccccggagg cctggcccca 1380
cccggaagca ctaccagccc tacgcccctc ccagggactt cgccgcctac cggagccggg 1440
tgaagttcag ccggagcgcc gacgcccctg cctaccagca gggccagaac cagctgtaca 1500
acgagctgaa cctgggccgg agggaggagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggccggg 1560
accctgagat gggcggcaag ccccggagaa agaaccctca ggagggcctg tataacgaac 1620
tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggcgga 1680
ggggcaaggg ccacgacggc ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gatacctacg 1740
acgccctgca catgcaggcc ctgcccccca gaagagctaa gaggggaagc ggagagggca 1800
gaggaagtct gctaacatgc ggtgacgtcg aggagaatcc tggacctatg cttctcctgg 1860
tgacaagcct tctgctctgt gagttaccac acccagcatt cctcctgatc ccacgcaaag 1920
tgtgtaacgg aataggtatt ggtgaattta aagactcact ctccataaat gctacgaata 1980
ttaaacactt caaaaactgc acctccatca gtggcgatct ccacatcctg ccggtggcat 2040
ttaggggtga ctccttcaca catactcctc ctctggatcc acaggaactg gatattctga 2100
aaaccgtaaa ggaaatcaca gggtttttgc tgattcaggc ttggcctgaa aacaggacgg 2160
acctccatgc ctttgagaac ctagaaatca tacgcggcag gaccaagcaa catggtcagt 2220
tttctcttgc agtcgtcagc ctgaacataa catccttggg attacgctcc ctcaaggaga 2280
taagtgatgg agatgtgata atttcaggaa acaaaaattt gtgctatgca aatacaataa 2340
actggaaaaa actgtttggg acctccggtc agaaaaccaa aattataagc aacagaggtg 2400
aaaacagctg caaggccaca ggccaggtct gccatgcctt gtgctccccc gagggctgct 2460
ggggcccgga gcccagggac tgcgtctctt gccggaatgt cagccgaggc agggaatgcg 2520
tggacaagtg caaccttctg gagggtgagc caagggagtt tgtggagaac tctgagtgca 2580
tacagtgcca cccagagtgc ctgcctcagg ccatgaacat cacctgcaca ggacggggac 2640
cagacaactg tatccagtgt gcccactaca ttgacggccc ccactgcgtc aagacctgcc 2700
cggcaggagt catgggagaa aacaacaccc tggtctggaa gtacgcagac gccggccatg 2760
tgtgccacct gtgccatcca aactgcacct acggatgcac tgggccaggt cttgaaggct 2820
gtccaacgaa tgggcctaag atcccgtcca tcgccactgg gatggtgggg gccctcctct 2880
tgctgctggt ggtggccctg gggatcggcc tcttcatgga gggcagagga agtctgctaa 2940
catgcggtga cgtcgaggag aatcctggac ctatgggccc caagaagaaa aggaaggtgg 3000
ccccccccac cgacgtgagc ctgggcgacg agctgcacct ggacggcgag gacgtggcca 3060
tggcccacgc cgacgccctg gacgacttcg acctggacat gctgggcgac ggcgacagcc 3120
ccggccccgg cttcaccccc cacgacagcg ccccctacgg cgccctggac atggccgact 3180
tcgagttcga gcagatgttc accgacgccc tgggcatcga cgagtacggc ggcgaattcg 3240
agatgcccgt ggacaggatt ctggaggccg aactcgccgt ggagcagaaa agcgaccagg 3300
gcgtggaggg ccccggcgga accggcggca gcggcagcag ccccaacgac cccgtgacca 3360
acatctgcca ggccgccgac aagcagctgt tcaccctggt ggagtgggcc aagaggattc 3420
cccacttcag cagcctgccc ctggacgacc aggtgatcct gctgagggcc ggatggaacg 3480
agctgctgat cgccagcttc agccacagga gcatcgacgt gagggacggc atcctgctgg 3540
ccaccggcct gcacgtccat aggaacagcg cccacagcgc cggagtgggc gccatcttcg 3600
acagggtgct gaccgagctg gtgagcaaga tgagggacat gaggatggac aagaccgagc 3660
tgggctgcct gagggccatc atcctgttca accccgaggt gaggggcctg aaaagcgccc 3720
aggaggtgga gctgctgagg gagaaggtgt acgccgccct ggaggagtac accaggacca 3780
cccaccccga cgagcccggc agattcgcca agctgctgct gaggctgccc agcctgagga 3840
gcatcggcct gaagtgcctg gagcacctgt tcttcttcag gctgatcggc gacgtgccca 3900
tcgacacctt cctgatggag atgctggaga gccccagcga cagctgaaac ttgtttattg 3960
cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 4020
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgg 4079
<210> 146
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="Whitlow连接体"
<400> 146
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 147
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="连接体"
<400> 147
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln
20 25
<210> 148
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GSG连接体"
<400> 148
Gly Ser Gly
1
<210> 149
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="SGSG连接体"
<400> 149
Ser Gly Ser Gly
1
<210> 150
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="(G4S)3连接体"
<400> 150
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 151
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="弗林蛋白酶切割位点/ 弗林蛋白酶link1"
<400> 151
Arg Ala Lys Arg
1
<210> 152
<211> 28
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<220>
<221> 来源
<223> /备注="Fmdv"
<400> 152
Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu
1 5 10 15
Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 153
<211> 18
<212> PRT
<213> Thosea asigna 病毒
<220>
<221> 来源
<223> /备注="Thosea asigna 病毒 2A区(T2A)"
<400> 153
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 154
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="弗林蛋白酶-GSG-T2A"
<400> 154
Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 155
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="弗林蛋白酶-SGSG-T2A"
<400> 155
Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 156
<211> 19
<212> PRT
<213> Porcine tescho病毒
<220>
<221> 来源
<223> /备注="Porcine tescho病毒-1 2A区(P2A)"
<400> 156
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 157
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GSG-P2A"
<400> 157
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 158
<211> 20
<212> PRT
<213> 马鼻炎A病毒
<220>
<221> 来源
<223> /备注="马鼻炎A病毒 2A区(E2A)"
<400> 158
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 159
<211> 22
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<220>
<221> 来源
<223> /备注="口蹄疫病毒 2A区(F2A)"
<400> 159
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 160
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="FP2A"
<400> 160
Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
1 5 10 15
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25 30
<210> 161
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="连接体-GSG"
<400> 161
Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly
1 5
<210> 162
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="连接体"
<400> 162
Ala Pro Val Lys Gln
1 5
<210> 163
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GM-CSFR-alpha 信号肽"
<400> 163
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 164
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="Ig Kappa 信号肽"
<400> 164
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly
20
<210> 165
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="IgE 信号肽"
<400> 165
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser
<210> 166
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8-alpha 信号肽"
<400> 166
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 167
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="TVB2(T21A)信号肽"
<400> 167
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp Ala
20
<210> 168
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD52 信号肽"
<400> 168
Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser
20
<210> 169
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="低亲和力神经生长因子受体
(LNGFR, TNFRSF16) 信号肽"
<400> 169
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala
20 25
<210> 170
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8-alpha 铰链区"
<400> 170
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 171
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8 alpha 2x"
<400> 171
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys
35 40 45
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
50 55 60
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
65 70 75 80
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
85 90
<210> 172
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8 alpha 3x"
<400> 172
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys
35 40 45
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
50 55 60
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala
65 70 75 80
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro
85 90 95
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
100 105 110
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
115 120 125
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
130 135 140
<210> 173
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8 alpha 4x"
<400> 173
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys
35 40 45
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
50 55 60
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala
65 70 75 80
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro
85 90 95
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
100 105 110
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly
115 120 125
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Thr
130 135 140
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
145 150 155 160
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
165 170 175
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
180 185
<210> 174
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD8-alpha TM域"
<400> 174
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
20 25
<210> 175
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD28 TM域"
<400> 175
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 176
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD28信号域"
<400> 176
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 177
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD3 zeta信号域"
<400> 177
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 178
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="4-1BB信号域"
<400> 178
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 179
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
肽"
<220>
<221> 来源
<223> /备注="DNAX-激活蛋白10 (DAP 10)信号域"
<400> 179
Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 180
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="DNAX-激活蛋白12 (DAP12)信号域"
<400> 180
Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala
1 5 10 15
Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu
20 25 30
Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg
35 40 45
Pro Tyr Tyr Lys
50
<210> 181
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="VP16激活域"
<400> 181
Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala
20 25 30
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser
35 40 45
Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu
50 55 60
Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly
65 70 75 80
Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
85
<210> 182
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="类视黄醇x受体(RxR)"
<400> 182
Glu Met Pro Val Asp Arg Ile Leu Glu Ala Glu Leu Ala Val Glu Gln
1 5 10 15
Lys Ser Asp Gln Gly Val Glu Gly Pro Gly Gly Thr Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Ser Ser Pro Asn Asp Pro Val Thr Asn Ile Cys Gln Ala Ala Asp Lys
35 40 45
Gln Leu Phe Thr Leu Val Glu Trp Ala Lys Arg Ile Pro His Phe Ser
50 55 60
Ser Leu Pro Leu Asp Asp Gln Val Ile Leu Leu Arg Ala Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Leu Leu Ile Ala Ser Phe Ser His Arg Ser Ile Asp Val Arg Asp
85 90 95
Gly Ile Leu Leu Ala Thr Gly Leu His Val His Arg Asn Ser Ala His
100 105 110
Ser Ala Gly Val Gly Ala Ile Phe Asp Arg Val Leu Thr Glu Leu Val
115 120 125
Ser Lys Met Arg Asp Met Arg Met Asp Lys Thr Glu Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Arg Ala Ile Ile Leu Phe Asn Pro Glu Val Arg Gly Leu Lys Ser Ala
145 150 155 160
Gln Glu Val Glu Leu Leu Arg Glu Lys Val Tyr Ala Ala Leu Glu Glu
165 170 175
Tyr Thr Arg Thr Thr His Pro Asp Glu Pro Gly Arg Phe Ala Lys Leu
180 185 190
Leu Leu Arg Leu Pro Ser Leu Arg Ser Ile Gly Leu Lys Cys Leu Glu
195 200 205
His Leu Phe Phe Phe Arg Leu Ile Gly Asp Val Pro Ile Asp Thr Phe
210 215 220
Leu Met Glu Met Leu Glu Ser Pro Ser Asp Ser
225 230 235
<210> 183
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="VP16-连接体-RxR"
<400> 183
Gly Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala
20 25 30
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser
35 40 45
Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu
50 55 60
Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly
65 70 75 80
Ile Asp Glu Tyr Gly Gly Glu Phe Glu Met Pro Val Asp Arg Ile Leu
85 90 95
Glu Ala Glu Leu Ala Val Glu Gln Lys Ser Asp Gln Gly Val Glu Gly
100 105 110
Pro Gly Gly Thr Gly Gly Ser Gly Ser Ser Pro Asn Asp Pro Val Thr
115 120 125
Asn Ile Cys Gln Ala Ala Asp Lys Gln Leu Phe Thr Leu Val Glu Trp
130 135 140
Ala Lys Arg Ile Pro His Phe Ser Ser Leu Pro Leu Asp Asp Gln Val
145 150 155 160
Ile Leu Leu Arg Ala Gly Trp Asn Glu Leu Leu Ile Ala Ser Phe Ser
165 170 175
His Arg Ser Ile Asp Val Arg Asp Gly Ile Leu Leu Ala Thr Gly Leu
180 185 190
His Val His Arg Asn Ser Ala His Ser Ala Gly Val Gly Ala Ile Phe
195 200 205
Asp Arg Val Leu Thr Glu Leu Val Ser Lys Met Arg Asp Met Arg Met
210 215 220
Asp Lys Thr Glu Leu Gly Cys Leu Arg Ala Ile Ile Leu Phe Asn Pro
225 230 235 240
Glu Val Arg Gly Leu Lys Ser Ala Gln Glu Val Glu Leu Leu Arg Glu
245 250 255
Lys Val Tyr Ala Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Arg Thr Thr His Pro Asp
260 265 270
Glu Pro Gly Arg Phe Ala Lys Leu Leu Leu Arg Leu Pro Ser Leu Arg
275 280 285
Ser Ile Gly Leu Lys Cys Leu Glu His Leu Phe Phe Phe Arg Leu Ile
290 295 300
Gly Asp Val Pro Ile Asp Thr Phe Leu Met Glu Met Leu Glu Ser Pro
305 310 315 320
Ser Asp Ser
<210> 184
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GAL4 DNA结合域"
<400> 184
Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu
1 5 10 15
Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu
20 25 30
Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro
35 40 45
Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu
50 55 60
Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile
65 70 75 80
Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu
85 90 95
Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala
100 105 110
Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser
115 120 125
Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu
130 135 140
Thr Val Ser Pro Glu Phe
145 150
<210> 185
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="蜕皮素受体配体结合域
- VY 可变 (EcR)"
<400> 185
Ile Arg Pro Glu Cys Val Val Pro Glu Thr Gln Cys Ala Met Lys Arg
1 5 10 15
Lys Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu Lys Asp Lys Leu Pro Val Ser Thr
20 25 30
Thr Thr Val Asp Asp His Met Pro Pro Ile Met Gln Cys Glu Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Glu Ala Ala Arg Ile His Glu Val Val Pro Arg Phe Leu Ser
50 55 60
Asp Lys Leu Leu Val Thr Asn Arg Gln Lys Asn Ile Pro Gln Leu Thr
65 70 75 80
Ala Asn Gln Gln Phe Leu Ile Ala Arg Leu Ile Trp Tyr Gln Asp Gly
85 90 95
Tyr Glu Gln Pro Ser Asp Glu Asp Leu Lys Arg Ile Thr Gln Thr Trp
100 105 110
Gln Gln Ala Asp Asp Glu Asn Glu Glu Ser Asp Thr Pro Phe Arg Gln
115 120 125
Ile Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala
130 135 140
Lys Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys Ile Ser Gln Pro Asp Gln Ile Thr
145 150 155 160
Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Val Ala Arg
165 170 175
Arg Tyr Asp Ala Ala Ser Asp Ser Ile Leu Phe Ala Asn Asn Gln Ala
180 185 190
Tyr Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys Ala Gly Met Ala Glu Val Ile Glu
195 200 205
Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Cys Met Tyr Ser Met Ala Leu Asp Asn
210 215 220
Ile His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Val Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro
225 230 235 240
Gly Leu Glu Gln Pro Gln Leu Val Glu Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Leu
245 250 255
Asn Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn Gln Leu Ser Gly Ser Ala Arg
260 265 270
Ser Ser Val Ile Tyr Gly Lys Ile Leu Ser Ile Leu Ser Glu Leu Arg
275 280 285
Thr Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn Met Cys Ile Ser Leu Lys Leu Lys
290 295 300
Asn Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val Ala Asp
305 310 315 320
Met Ser His Thr Gln Pro Pro Pro Ile Leu Glu Ser Pro Thr Asn Leu
325 330 335
<210> 186
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="蜕皮素受体配体结合域
- VY 可变 (EcR)"
<400> 186
Arg Pro Glu Cys Val Val Pro Glu Thr Gln Cys Ala Met Lys Arg Lys
1 5 10 15
Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu Lys Asp Lys Leu Pro Val Ser Thr Thr
20 25 30
Thr Val Asp Asp His Met Pro Pro Ile Met Gln Cys Glu Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Glu Ala Ala Arg Ile His Glu Val Val Pro Arg Phe Leu Ser Asp
50 55 60
Lys Leu Leu Val Thr Asn Arg Gln Lys Asn Ile Pro Gln Leu Thr Ala
65 70 75 80
Asn Gln Gln Phe Leu Ile Ala Arg Leu Ile Trp Tyr Gln Asp Gly Tyr
85 90 95
Glu Gln Pro Ser Asp Glu Asp Leu Lys Arg Ile Thr Gln Thr Trp Gln
100 105 110
Gln Ala Asp Asp Glu Asn Glu Glu Ser Asp Thr Pro Phe Arg Gln Ile
115 120 125
Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys
130 135 140
Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys Ile Ser Gln Pro Asp Gln Ile Thr Leu
145 150 155 160
Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Val Ala Arg Arg
165 170 175
Tyr Asp Ala Ala Ser Asp Ser Ile Leu Phe Ala Asn Asn Gln Ala Tyr
180 185 190
Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys Ala Gly Met Ala Glu Val Ile Glu Asp
195 200 205
Leu Leu His Phe Cys Arg Cys Met Tyr Ser Met Ala Leu Asp Asn Ile
210 215 220
His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Val Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly
225 230 235 240
Leu Glu Gln Pro Gln Leu Val Glu Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Leu Asn
245 250 255
Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn Gln Leu Ser Gly Ser Ala Arg Ser
260 265 270
Ser Val Ile Tyr Gly Lys Ile Leu Ser Ile Leu Ser Glu Leu Arg Thr
275 280 285
Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn Met Cys Ile Ser Leu Lys Leu Lys Asn
290 295 300
Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val Ala Asp Met
305 310 315 320
Ser His Thr Gln Pro Pro Pro Ile Leu Glu Ser Pro Thr Asn Leu
325 330 335
<210> 187
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GAL4-连接体-EcR"
<400> 187
Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu
1 5 10 15
Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu
20 25 30
Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro
35 40 45
Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu
50 55 60
Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile
65 70 75 80
Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu
85 90 95
Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala
100 105 110
Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser
115 120 125
Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu
130 135 140
Thr Val Ser Pro Glu Phe Pro Gly Ile Arg Pro Glu Cys Val Val Pro
145 150 155 160
Glu Thr Gln Cys Ala Met Lys Arg Lys Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu
165 170 175
Lys Asp Lys Leu Pro Val Ser Thr Thr Thr Val Asp Asp His Met Pro
180 185 190
Pro Ile Met Gln Cys Glu Pro Pro Pro Pro Glu Ala Ala Arg Ile His
195 200 205
Glu Val Val Pro Arg Phe Leu Ser Asp Lys Leu Leu Val Thr Asn Arg
210 215 220
Gln Lys Asn Ile Pro Gln Leu Thr Ala Asn Gln Gln Phe Leu Ile Ala
225 230 235 240
Arg Leu Ile Trp Tyr Gln Asp Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Asp Glu Asp
245 250 255
Leu Lys Arg Ile Thr Gln Thr Trp Gln Gln Ala Asp Asp Glu Asn Glu
260 265 270
Glu Ser Asp Thr Pro Phe Arg Gln Ile Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr
275 280 285
Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys
290 295 300
Ile Ser Gln Pro Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu
305 310 315 320
Val Met Met Leu Arg Val Ala Arg Arg Tyr Asp Ala Ala Ser Asp Ser
325 330 335
Ile Leu Phe Ala Asn Asn Gln Ala Tyr Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys
340 345 350
Ala Gly Met Ala Glu Val Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Cys
355 360 365
Met Tyr Ser Met Ala Leu Asp Asn Ile His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala
370 375 380
Val Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly Leu Glu Gln Pro Gln Leu Val
385 390 395 400
Glu Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Leu Asn Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu
405 410 415
Asn Gln Leu Ser Gly Ser Ala Arg Ser Ser Val Ile Tyr Gly Lys Ile
420 425 430
Leu Ser Ile Leu Ser Glu Leu Arg Thr Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn
435 440 445
Met Cys Ile Ser Leu Lys Leu Lys Asn Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu
450 455 460
Glu Glu Ile Trp Asp Val Ala Asp Met Ser His Thr Gln Pro Pro Pro
465 470 475 480
Ile Leu Glu Ser Pro Thr Asn Leu
485
<210> 188
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="GAL4-连接体-EcR"
<400> 188
Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu
1 5 10 15
Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu
20 25 30
Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro
35 40 45
Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu
50 55 60
Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile
65 70 75 80
Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu
85 90 95
Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala
100 105 110
Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser
115 120 125
Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu
130 135 140
Thr Val Ser Pro Glu Phe Pro Gly Arg Pro Glu Cys Val Val Pro Glu
145 150 155 160
Thr Gln Cys Ala Met Lys Arg Lys Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu Lys
165 170 175
Asp Lys Leu Pro Val Ser Thr Thr Thr Val Asp Asp His Met Pro Pro
180 185 190
Ile Met Gln Cys Glu Pro Pro Pro Pro Glu Ala Ala Arg Ile His Glu
195 200 205
Val Val Pro Arg Phe Leu Ser Asp Lys Leu Leu Val Thr Asn Arg Gln
210 215 220
Lys Asn Ile Pro Gln Leu Thr Ala Asn Gln Gln Phe Leu Ile Ala Arg
225 230 235 240
Leu Ile Trp Tyr Gln Asp Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Asp Glu Asp Leu
245 250 255
Lys Arg Ile Thr Gln Thr Trp Gln Gln Ala Asp Asp Glu Asn Glu Glu
260 265 270
Ser Asp Thr Pro Phe Arg Gln Ile Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr Val
275 280 285
Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys Ile
290 295 300
Ser Gln Pro Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val
305 310 315 320
Met Met Leu Arg Val Ala Arg Arg Tyr Asp Ala Ala Ser Asp Ser Ile
325 330 335
Leu Phe Ala Asn Asn Gln Ala Tyr Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys Ala
340 345 350
Gly Met Ala Glu Val Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Cys Met
355 360 365
Tyr Ser Met Ala Leu Asp Asn Ile His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Val
370 375 380
Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly Leu Glu Gln Pro Gln Leu Val Glu
385 390 395 400
Glu Ile Gln Arg Tyr Tyr Leu Asn Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn
405 410 415
Gln Leu Ser Gly Ser Ala Arg Ser Ser Val Ile Tyr Gly Lys Ile Leu
420 425 430
Ser Ile Leu Ser Glu Leu Arg Thr Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn Met
435 440 445
Cys Ile Ser Leu Lys Leu Lys Asn Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu Glu
450 455 460
Glu Ile Trp Asp Val Ala Asp Met Ser His Thr Gln Pro Pro Pro Ile
465 470 475 480
Leu Glu Ser Pro Thr Asn Leu
485
<210> 189
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="截短的EGFR (huEGFRt) (Her1t)"
<400> 189
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 190
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计1 (Her1截短设计1)
(HER1t1)"
<400> 190
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
210 215 220
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
225 230 235 240
Ser Lys Arg Ser
<210> 191
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计2 (Her1截短设计2)
(HER1t2)"
<400> 191
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
225 230 235 240
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
245 250 255
Ser
<210> 192
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计3 (Her1截短设计3)
(HER1t3)"
<400> 192
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
245 250 255
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
260 265 270
Ser Lys Arg Ser
275
<210> 193
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计4 (Her1截短设计4)
(HER1t4)"
<400> 193
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
260 265 270
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
275 280 285
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
290 295
<210> 194
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计5 (Her1截短设计5)
(HER1t5)"
<400> 194
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
275 280 285
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
290 295 300
Ser Lys Arg Ser
305
<210> 195
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计6 (Her1截短设计6)
(HER1t6)"
<400> 195
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
290 295 300
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
305 310 315 320
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
325
<210> 196
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计7 (Her1截短设计7)
(HER1t7)"
<400> 196
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
305 310 315 320
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
325 330 335
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
340
<210> 197
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计8 (Her1截短设计8)
(HER1t8)"
<400> 197
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly
210 215 220
Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser
<210> 198
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计9 (Her1截短设计9)
(HER1t9)"
<400> 198
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val
210 215 220
Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Gly Gly Gly Ser
225 230 235
<210> 199
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计10 (Her1截短设计10)
(HER1t10)"
<400> 199
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val
210 215 220
Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ala Leu Leu Ile Trp Gly Gly Gly Ser
225 230 235
<210> 200
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR截短设计11 (Her1截短设计11)
(HER1t11)"
<400> 200
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr
210 215 220
Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Gly Gly Gly Ser
225 230 235
<210> 201
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="FL CD20"
<400> 201
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
275 280 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295
<210> 202
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="截短的CD20设计1 (CD20t1) [CD20(M1-E263]"
<400> 202
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu
260
<210> 203
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="白介素-15"
<400> 203
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 204
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="白介素-15受体alpha"
<400> 204
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val
65 70 75 80
Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly
85 90 95
Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr
100 105 110
Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro
115 120 125
Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr
130 135 140
Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser
145 150 155 160
His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val
165 170 175
Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser
180 185 190
Leu Leu Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser
195 200 205
Val Glu Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser
210 215 220
Ser Arg Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
225 230 235
<210> 205
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="具有信号肽的膜结合白介素-15"
<400> 205
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp
20 25 30
Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp
35 40 45
Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu
50 55 60
Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr
65 70 75 80
Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly
85 90 95
Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys
100 105 110
Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe
115 120 125
Ile Asn Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln Ile Thr
145 150 155 160
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
165 170 175
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
180 185 190
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
195 200 205
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp
210 215 220
Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu
245 250 255
Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala
260 265 270
Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr
275 280 285
Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser
290 295 300
Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln
305 310 315 320
Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile
325 330 335
Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu
340 345 350
Ala Cys Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu
355 360 365
Met Glu Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg
370 375 380
Asp Glu Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
385 390 395
<210> 206
<211> 335
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 来源
<223> /备注="鼠白介素-12亚单位beta (p40)"
<400> 206
Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln
50 55 60
Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr
85 90 95
Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys
115 120 125
Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln
130 135 140
Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys
165 170 175
Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln
180 185 190
Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser
210 215 220
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
225 230 235 240
Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
245 250 255
Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val
260 265 270
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys
275 280 285
Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln
290 295 300
Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser
325 330 335
<210> 207
<211> 215
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 来源
<223> /备注="鼠白介素-12亚单位alpha (p35)"
<400> 207
Met Cys Gln Ser Arg Tyr Leu Leu Phe Leu Ala Thr Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Asn His Leu Ser Leu Ala Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg
20 25 30
Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val
35 40 45
Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp
50 55 60
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr
65 70 75 80
Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg
85 90 95
Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr
100 105 110
Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
115 120 125
Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His
130 135 140
Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp
145 150 155 160
Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys
165 170 175
Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys
180 185 190
Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val
195 200 205
Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala
210 215
<210> 208
<211> 535
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 来源
<223> /备注="鼠单链IL-12 (p40-连接体-p35)"
<400> 208
Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln
50 55 60
Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr
85 90 95
Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys
115 120 125
Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln
130 135 140
Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro
145 150 155 160
Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys
165 170 175
Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln
180 185 190
Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu
195 200 205
Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser
210 215 220
Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln
225 230 235 240
Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro
245 250 255
Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val
260 265 270
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys
275 280 285
Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln
290 295 300
Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Gly
325 330 335
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Ile Pro Val Ser Gly Pro Ala Arg
340 345 350
Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asp Met Val
355 360 365
Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr Ala Glu Asp
370 375 380
Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr Leu Lys Thr
385 390 395 400
Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu Ala Thr Arg
405 410 415
Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro Gln Lys Thr
420 425 430
Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys
435 440 445
Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu Gln Asn His
450 455 460
Asn His Gln Gln Ile Ile Leu Asp Lys Gly Met Leu Val Ala Ile Asp
465 470 475 480
Glu Leu Met Gln Ser Leu Asn His Asn Gly Glu Thr Leu Arg Gln Lys
485 490 495
Pro Pro Val Gly Glu Ala Asp Pro Tyr Arg Val Lys Met Lys Leu Cys
500 505 510
Ile Leu Leu His Ala Phe Ser Thr Arg Val Val Thr Ile Asn Arg Val
515 520 525
Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala
530 535
<210> 209
<211> 532
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人单链IL-12 (p40-连接体-p35)"
<400> 209
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg
325 330 335
Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His
340 345 350
His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala
355 360 365
Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His
370 375 380
Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro
385 390 395 400
Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser
405 410 415
Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met
420 425 430
Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln
435 440 445
Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg
450 455 460
Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu
485 490 495
Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu
500 505 510
His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr
515 520 525
Leu Asn Ala Ser
530
<210> 210
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="CD19-特异性嵌合抗原受体
(CD19-CD8a-CD28-CD3z)"
<400> 210
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
245 250 255
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
260 265 270
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
275 280 285
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
290 295 300
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
305 310 315 320
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
325 330 335
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
340 345 350
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
355 360 365
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
370 375 380
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
385 390 395 400
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
405 410 415
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
420 425 430
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
435 440 445
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
450 455 460
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 211
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="具有信号肽的CD19-特异性嵌合抗原受体(CD19-CD8a-CD28-CD3z)"
<400> 211
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser
340 345 350
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
355 360 365
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
370 375 380
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
385 390 395 400
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
405 410 415
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
420 425 430
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
435 440 445
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
450 455 460
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
465 470 475 480
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490 495
<210> 212
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-CD19单克隆抗体克隆FMC63可变重链"
<400> 212
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 213
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="具有Whitlow连接体的抗-CD19克隆FMC63单链片段可变(scFv)"
<400> 213
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 214
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="hM195 VL"
<400> 214
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 215
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="hM195 VH"
<400> 215
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 216
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="具有连接体的hM195 scFv"
<400> 216
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val
130 135 140
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
165 170 175
Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ser
180 185 190
Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 217
<211> 943
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFR 可变 III (EGFRvIII)"
<400> 217
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr
20 25 30
Val Val Thr Asp His Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser
35 40 45
Tyr Glu Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly
50 55 60
Pro Cys Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp
65 70 75 80
Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr
85 90 95
Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp
100 105 110
Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu
115 120 125
Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro
130 135 140
Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg
145 150 155 160
Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu
165 170 175
Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly
180 185 190
Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile
195 200 205
Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile
210 215 220
Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His
225 230 235 240
Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys
245 250 255
Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys
260 265 270
Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys
275 280 285
Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys
290 295 300
Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp
305 310 315 320
Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn
325 330 335
Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu
340 345 350
Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly
355 360 365
Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val
370 375 380
Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe
385 390 395 400
Met Arg Arg Arg His Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu
405 410 415
Gln Glu Arg Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro
420 425 430
Asn Gln Ala Leu Leu Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile
435 440 445
Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp
450 455 460
Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu
465 470 475 480
Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala
485 490 495
Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly
500 505 510
Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe
515 520 525
Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser
530 535 540
Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr
545 550 555 560
Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val
565 570 575
Leu Val Lys Thr Pro Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala
580 585 590
Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys
595 600 605
Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr
610 615 620
Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu
625 630 635 640
Met Thr Phe Gly Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile
645 650 655
Ser Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys
660 665 670
Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala
675 680 685
Asp Ser Arg Pro Lys Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met
690 695 700
Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met
705 710 715 720
His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp
725 730 735
Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro
740 745 750
Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu
755 760 765
Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp
770 775 780
Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln
785 790 795 800
Arg Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp
805 810 815
Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys
820 825 830
Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu
835 840 845
Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr
850 855 860
Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val
865 870 875 880
Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His
885 890 895
Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys
900 905 910
Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala
915 920 925
Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala
930 935 940
<210> 218
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆139 VH"
<400> 218
Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Ser Ser Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 219
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆139 VL"
<400> 219
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His His Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 220
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆MR1 VH"
<400> 220
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 221
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆MR1 VL"
<400> 221
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Phe Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 222
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆MR1-1 VH"
<400> 222
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Tyr Ser Pro Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 223
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆MR1-1 VL"
<400> 223
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 224
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆humMR1-1 VH"
<400> 224
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Ser Pro Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 225
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆humMR1-1 VL"
<400> 225
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 226
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆humMR1-2 VH"
<400> 226
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Asn Thr Phe Tyr Ser Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Ser Pro Tyr Ser Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 227
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII克隆humMR1-2 VL"
<400> 227
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 228
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII scFv克隆139"
<400> 228
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His His Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
115 120 125
Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Ser
210 215 220
Ser Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser
<210> 229
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII scFv克隆MR1"
<400> 229
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Phe Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr Ser Ser
210 215 220
Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 230
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗EGFRvIII scFv克隆MR1-1"
<400> 230
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 231
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII scFv克隆huMR1-1"
<400> 231
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 232
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="抗-EGFRvIII scFv克隆huMR1-2"
<400> 232
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Phe Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 233
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (克隆139 scFv.CD8alpha 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 233
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His His Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
115 120 125
Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Ser
210 215 220
Ser Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
290 295 300
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg
305 310 315 320
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
325 330 335
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
340 345 350
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
355 360 365
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
370 375 380
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
385 390 395 400
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
405 410 415
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
420 425 430
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
435 440 445
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
450 455 460
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 234
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (MR1 scFv.CD8alpha 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 234
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Phe Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr Ser Ser
210 215 220
Thr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
275 280 285
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
290 295 300
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 235
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (MR1-1 scFv.CD8alpha 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 235
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
275 280 285
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
290 295 300
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 236
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (humMR1-1 scFv.CD8alpha 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 236
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
275 280 285
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
290 295 300
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 237
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (humMR1-2 scFv.CD8alpha 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 237
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Phe Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
275 280 285
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
290 295 300
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 238
<211> 518
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (MR1-1 scFv.CD8alpha 2x 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 238
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser
275 280 285
Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
290 295 300
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
305 310 315 320
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
325 330 335
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
340 345 350
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg
355 360 365
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
370 375 380
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
385 390 395 400
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
405 410 415
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
420 425 430
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
435 440 445
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
450 455 460
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
465 470 475 480
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
485 490 495
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
500 505 510
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515
<210> 239
<211> 565
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (MR1-1 scFv.CD8alpha 3x 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 239
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser
275 280 285
Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
290 295 300
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro
305 310 315 320
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp
325 330 335
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
340 345 350
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
355 360 365
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
370 375 380
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
385 390 395 400
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys
405 410 415
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
420 425 430
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
435 440 445
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
450 455 460
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
465 470 475 480
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
485 490 495
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
500 505 510
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
515 520 525
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
530 535 540
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
545 550 555 560
Ala Leu Pro Pro Arg
565
<210> 240
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (MR1-1 scFv.CD8alpha 4x 铰链
&TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 240
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ala Thr Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45
Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser
50 55 60
Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Lys Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Val Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser
275 280 285
Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
290 295 300
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro
305 310 315 320
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp
325 330 335
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
340 345 350
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala
355 360 365
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys
370 375 380
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
385 390 395 400
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
405 410 415
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
420 425 430
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
435 440 445
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys
450 455 460
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
465 470 475 480
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
485 490 495
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
500 505 510
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
515 520 525
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
530 535 540
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
545 550 555 560
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
565 570 575
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
580 585 590
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
595 600 605
Leu Pro Pro Arg
610
<210> 241
<211> 565
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (huMR1-1 scFv.CD8alpha 3x 铰链
& TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 241
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser
275 280 285
Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
290 295 300
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro
305 310 315 320
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp
325 330 335
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
340 345 350
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
355 360 365
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
370 375 380
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
385 390 395 400
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys
405 410 415
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
420 425 430
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
435 440 445
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
450 455 460
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
465 470 475 480
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
485 490 495
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
500 505 510
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
515 520 525
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
530 535 540
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
545 550 555 560
Ala Leu Pro Pro Arg
565
<210> 242
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (huMR1-1 scFv.CD8alpha 4x 铰链
& TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 242
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser
275 280 285
Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
290 295 300
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro
305 310 315 320
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp
325 330 335
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
340 345 350
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala
355 360 365
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys
370 375 380
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
385 390 395 400
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
405 410 415
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
420 425 430
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
435 440 445
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys
450 455 460
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
465 470 475 480
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
485 490 495
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
500 505 510
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
515 520 525
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
530 535 540
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
545 550 555 560
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
565 570 575
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
580 585 590
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
595 600 605
Leu Pro Pro Arg
610
<210> 243
<211> 565
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (huMR1-2 scFv.CD8alpha 3x 铰链
& TM.4-1BB.CD3-zeta)"
<400> 243
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Phe Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser
275 280 285
Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
290 295 300
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro
305 310 315 320
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp
325 330 335
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
340 345 350
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
355 360 365
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
370 375 380
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
385 390 395 400
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys
405 410 415
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
420 425 430
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
435 440 445
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
450 455 460
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
465 470 475 480
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
485 490 495
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
500 505 510
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
515 520 525
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
530 535 540
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
545 550 555 560
Ala Leu Pro Pro Arg
565
<210> 244
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽
<220>
<221> 来源
<223> /备注="EGFRvIII CAR (huMR1-2 scFv.CD8alpha 4x 铰链
& TM.4-1BB.CD3-zeta"
<400> 244
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Met Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp
20 25 30
Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Trp Asn Val Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe Gly Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Thr Gly
165 170 175
Gly Tyr Asn Thr Phe Tyr Ser Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Pro
210 215 220
Tyr Ser Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser
275 280 285
Asp Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
290 295 300
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro
305 310 315 320
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp
325 330 335
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
340 345 350
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala
355 360 365
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys
370 375 380
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
385 390 395 400
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
405 410 415
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
420 425 430
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
435 440 445
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys
450 455 460
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
465 470 475 480
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
485 490 495
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
500 505 510
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
515 520 525
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
530 535 540
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
545 550 555 560
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
565 570 575
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
580 585 590
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
595 600 605
Leu Pro Pro Arg
610

Claims (160)

1.一种组合物，其包含编码用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关多肽的多核苷酸，其中所述基因开关多肽包含：
a)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和
b)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，
其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接。
2.一种组合物，其包含一种或多种编码用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关系统的多核苷酸，其中所述基因开关系统包含：
a)第一基因开关多肽，其包含反式激活域；和
b)第二基因开关多肽，其包含与配体结合域融合的DNA结合域；和
c)至少一种异源基因多肽；
其中所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽之一通过多肽连接体与所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽中的另一个连接；并且其中所述多肽连接体包含可切割的连接体或核糖体跳跃连接体序列。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述DNA结合域包含GAL4(GAL4 DBD)、LexADBD、转录因子DBD、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员DBD、细菌LacZ DBD和酵母DBD中的至少一种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述DNA结合域具有如SEQ ID NO：184所示的序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述反式激活域包含VP16反式激活域和B42酸性激活物反式激活域中的至少一种。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述反式激活域具有如SEQ ID NO：181所示的序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述第一核受体配体结合域、所述第二核受体配体结合域和所述配体结合域中的至少一种包含蜕皮素受体(EcR)、遍在受体、孤儿受体1、NER-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15、肝X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝X受体α、类法尼醇X受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述第一核受体配体结合域、所述第二核受体配体结合域和所述配体结合域中的至少一种具有如SEQ ID NO：185-186中任一个所示的序列。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一基因开关多肽包含与EcR核受体配体结合域融合的GAL4 DBD，并且所述第二基因开关多肽包含与类视黄醇受体X(RXR)核受体配体结合域融合的VP16反式激活域。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中与所述EcR核受体配体结合域融合的所述GAL4DBD具有如SEQ ID NO：185-186或187-188中任一个所示的序列，并且与所述类视黄醇受体X(RXR)核受体配体结合域融合的所述VP16反式激活域具有如SEQ ID NO：183所示的序列。
11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述连接体是可切割的连接体、核糖体跳跃连接体序列或IRES连接体。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述连接体是IRES连接体，并且所述IRES连接体具有如SEQ ID NO：18-19中任一个所示的序列。
13.根据权利要求11所述的组合物，其中所述连接体是可切割的连接体或核糖体跳跃连接体序列。
14.根据权利要求2或13所述的组合物，其中所述可切割的连接体或所述核糖体跳跃连接体序列包含2A连接体、p2A连接体、T2A连接体、F2A连接体、E2A连接体、GSG-2A连接体、GSG连接体、SGSG连接体、furinlink连接体变体及其衍生物中的一种或多种。
15.根据权利要求2或13所述的组合物，其中所述可切割的连接体或所述核糖体跳跃连接体序列具有如SEQ ID NO：146-162中任一个所示的序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸或所述一种或多种多核苷酸进一步编码抗原结合多肽。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述抗原结合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体中的至少一种。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述抗原结合多肽包含CAR，并且所述CAR能够结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
19.根据权利要求17所述的组合物，其中所述抗原结合多肽包含CAR，并且所述CAR具有如SEQ ID NO：210-244中任一个所示的序列。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸或所述一种或多种多核苷酸进一步编码细胞标签。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述细胞标签包含FIER1截短变体或CD20截短变体中的至少一种。
22.根据权利要求20所述的组合物，其中所述细胞标签具有如SEQ ID NO：189-202中任一个所示的序列。
23.根据权利要求20所述的组合物，其中所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽、所述抗原结合多肽和所述细胞标签中的至少一种的表达由启动子调节，其中所述启动子是组织特异性启动子或EF1A启动子或其功能变体。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述启动子是EF1A启动子或其功能变体，其具有如SEQ ID NO：58-60中任一个所示的序列。
25.根据权利要求23所述的组合物，其中所述启动子是组织特异性启动子，并且所述组织特异性启动子包含T细胞特异性应答元件。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组织特异性启动子包含一个或多个NFAT应答元件。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述NFAT应答元件具有如SEQ ID NO：51-57中任一个所示的序列。
28.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含编码异源基因多肽的第二多核苷酸。
29.根据权利要求2或28所述的组合物，其中所述异源基因多肽包含细胞因子、细胞标签和嵌合抗原受体(CAR)中的至少一种。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述细胞因子包含细胞因子，并且所述细胞因子包含IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα或IL-15变体的融合体中的至少一种。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述细胞因子是分泌形式。
32.根据权利要求30所述的组合物，其中所述细胞因子是膜结合形式。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的组合物，其中所述细胞因子具有如SEQ ID NO：203-209中任一个所示的序列。
34.根据权利要求2和28-33中任一项所述的组合物，其中所述至少一种异源基因多肽的表达由诱导型启动子调节。
35.根据权利要求33所述的组合物，其中所述诱导型启动子具有如SEQ ID NO：40-64中任一个所示的序列。
36.根据权利要求34或35所述的组合物，其中所述诱导型启动子受所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽中的至少一种调节。
37.一种载体，其包含权利要求1的所述多核苷酸或权利要求2的所述一种或多种多核苷酸中的至少一种。
38.根据权利要求37所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
39.根据权利要求38所述的载体，其中所述非病毒载体是睡美人转座子。
40.一种调节效应细胞中的异源基因表达的方法，该方法包括：
向所述效应细胞中引入一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码(i)包含与配体结合域融合的DNA结合域的第一基因开关多肽，(ii)包含反式激活域的第二基因开关多肽，(iii)由所述异源基因编码的异源基因多肽，和(iv)包含可切割的或核糖体跳跃连接体序列的多肽连接体，其中所述多肽连接体将所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽之一连接至所述第一基因开关多肽、所述第二基因开关多肽和所述异源基因多肽中的另一个；以及
使所述效应细胞以足以诱导所述异源基因的表达的量与配体接触。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸中的至少一种进一步编码抗原结合多肽。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述抗原结合多肽选择性地结合靶细胞的预定细胞表面蛋白质。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述靶细胞是哺乳动物细胞。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述靶细胞是肿瘤细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述预定细胞表面蛋白质是肿瘤抗原。
46.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述抗原结合多肽在所述效应细胞与所述配体的所述接触之前选择性地结合所述靶细胞的所述预定细胞表面蛋白质。
47.根据权利要求46所述的方法，其中在所述效应细胞与所述配体的所述接触之前，将所述效应细胞暴露于所述靶细胞的所述预定细胞表面蛋白质至少7天。
48.根据权利要求42-47中任一项所述的方法，其中所述预定细胞表面蛋白质被所述抗原结合多肽的结合活化所述效应细胞。
49.根据权利要求38-48中任一项所述的方法，其中所述抗原结合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体中的至少一种。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述抗原结合多肽包含CAR，并且所述CAR能够结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC-16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述抗原结合多肽包含CAR，并且所述CAR具有如SEQ ID NO：210-244中任一个所示的序列。
52.根据权利要求38-51中任一项所述的方法，其中所述异源基因多肽包含所述抗原结合多肽。
53.根据权利要求37-52中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸中的至少一种进一步编码细胞标签。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述细胞标签包含HER1截短变体和CD20截短变体中的至少一种。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述细胞标签具有如SEQ ID NO：189-202中任一个所示的序列。
56.根据权利要求53-55中任一项所述的方法，其中所述异源基因多肽包含所述细胞标签。
57.根据权利要求37-56中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸中的至少一种进一步编码细胞因子。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα或IL-15变体的融合体中的至少一种。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述细胞因子是分泌形式。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述细胞因子是膜结合形式。
61.根据权利要求57-60中任一项所述的方法，其中所述细胞因子具有如SEQ ID NO：203-209中任一个所示的序列。
62.根据权利要求57-61中任一项所述的方法，其中所述异源基因多肽包含所述细胞因子。
63.根据权利要求37-62中任一项所述的方法，其中所述异源基因多肽的表达由诱导型启动子调节。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述诱导型启动子具有如SEQ ID NO：40-64中任一个所示的序列。
65.根据权利要求37-64中任一项所述的方法，其中所述DNA结合域包含GAL4(GAL4DBD)、LexA DBD、转录因子DBD、类固醇/甲状腺激素核受体超家族成员DBD、细菌LacZ DBD和酵母DBD中的至少一种。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述DNA结合域具有如SEQ ID NO：184所示的序列。
67.根据权利要求37-66中任一项所述的方法，其中所述反式激活域包括VP16反式激活域和B42酸性激活物反式激活域中的至少一种。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述反式激活域具有如SEQ ID NO：181所示的序列。
69.根据权利要求37-68中任一项所述的方法，其中所述第一和第二基因开关多肽中的至少一种进一步包含能够与所述DNA结合域结合的应答元件。
70.根据权利要求37-69中任一项所述的方法，其中所述配体结合域包含蜕皮素受体(EcR)、遍在受体、孤儿受体1、NER-1、类固醇激素核受体1、类视黄醇X受体相互作用蛋白-15、肝X受体β、类固醇激素受体样蛋白、肝X受体、肝X受体α、类法尼醇X受体、受体相互作用蛋白14和法尼醇受体中的至少一种。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述配体结合域具有如SEQ ID NO：185-186中任一个所示的序列。
72.根据权利要求37-71中任一项所述的方法，其中所述第一基因开关多肽包含与EcR核受体配体结合域融合的GAL4 DBD，并且所述第二基因开关多肽包含与类视黄醇受体X(RXR)核受体配体结合域融合的VP16反式激活域。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述与EcR融合的GAL4DBD具有如SEQ ID NO：185-186中任一个所示的序列，并且所述与类视黄醇受体X(RXR)核受体配体结合域融合的VP16反式激活域具有如SEQ ID NO：183所示的序列。
74.根据权利要求37-73中任一项所述的方法，其中所述配体包括以下至少一种：
(2S，3R，5R，9R，10R，13R，14S，17R)-17-[(2S，3R)-3，6-二羟基-6-甲基庚烷-2-基]-2，3，14-三羟基-10，13-二甲基-2，3，4，5，9，11，12，15，16，17-十氢-1H-环戊并[a]菲-6-酮；
N′-(3，5-二甲基苯甲酰基)-N′-[(3R)-2，2-二甲基-3-已烷基]-2-乙基-3-甲氧基苯并酰肼；
5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；
5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；
5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；
5-甲基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；
5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；
5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-N′-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-酰肼；
5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲基-苯甲酰基)-酰肼；
5-乙基-2，3-二氢-苯并[1，4]二噁英-6-甲酸N′-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酰基)-酰肼；
3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；
3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；
3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；
3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；
3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；
3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-乙基-2，2-二甲基-丙基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；
3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；
3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-丁基)-N′-(2-乙基-3-甲氧基-苯甲酰基)-酰肼；
2-甲氧基-烟酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；
3，5-二甲基-苯甲酸N-(2，2-二甲基-1-苯基-丙基)-N′-(4-乙基-苯甲酰基)-酰肼；
3，5-二甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼；和
3，5-二甲氧基-4-甲基-苯甲酸N-(1-叔丁基-戊基)-N′-(3-甲氧基-2-甲基-苯甲酰基)-酰肼。
75.根据权利要求37-74中任一项所述的方法，其中与在所述配体的存在下的表达相比，在不存在所述配体的情况下所述异源基因的所述表达减少或消除。
76.根据权利要求75所述的方法，其中通过提供额外量的所述配体来恢复所述异源基因的所述表达。
77.根据权利要求37-76中任一项所述的方法，其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽中的至少一种的表达由启动子调节，其中所述启动子是组织特异性启动子或EF1A启动子或其功能变体。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述启动子是EF1A启动子或其功能变体，其具有如SEQ ID NO：58-60中任一个所示的序列。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述启动子是组织特异性启动子，并且所述组织特异性启动子包含T细胞特异性应答元件。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述组织特异性启动子包含一个或多个NFAT应答元件。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述NFAT应答元件具有如SEQ ID NO：50-57中任一个所示的序列。
82.根据权利要求40-81中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸被包含在载体内。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述非病毒载体是睡美人转座子。
85.一种用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关系统，其中所述基因开关系统包含一个或多个表达盒，其中所述一个或多个表达盒包含：
a)编码第一基因开关多肽的序列，所述第一基因开关多肽包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域；
b)编码第二基因开关多肽的序列，所述第二基因开关多肽包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域；
其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过多肽连接体连接。
86.一种用于异源基因表达的配体诱导型控制的基因开关系统，其中所述基因开关系统包含一个或多个表达盒，其中所述一个或多个表达盒包含：
a)编码第一基因开关多肽的序列，所述第一基因开关多肽包含反式激活域；
b)编码第二基因开关多肽的序列，所述第二基因开关多肽包含与配体结合域融合的DNA结合域；和
c)编码异源基因多肽的序列；
其中所述反式激活域、与所述配体结合域融合的DNA结合域和所述异源基因多肽之一通过多肽连接体与所述反式激活域、与所述配体结合域融合的DNA结合域和所述异源基因多肽中的另一个连接，并且其中所述多肽连接体包含可切割的或核糖体跳跃连接体序列。
87.根据权利要求85所述的基因开关系统，其中所述一个或多个表达盒进一步包含编码异源基因多肽的序列。
88.根据权利要求85-87中任一项所述的基因开关系统，其中所述一个或多个表达盒进一步包含以下一种或多种：
a)一个或多个重组酶附着位点；和
b)编码丝氨酸重组酶的序列。
89.根据权利要求85-88中任一项所述的基因开关系统，其中所述一个或多个表达盒进一步包含以下一种或多种：
a)非诱导型启动子；和
b)诱导型启动子。
90.根据权利要求85-89中任一项所述的基因开关系统，其中所述DNA结合域具有如SEQID NO：184所示的序列。
91.根据权利要求85-90中任一项所述的基因开关系统，其中所述反式激活域具有如SEQ ID NO：181所示的序列。
92.根据权利要求85-91中任一项所述的基因开关系统，其中所述第一和第二核受体配体结合域和所述配体结合域中的至少一种具有如SEQ ID NO：185-186中任一个所示的序列。
93.根据权利要求89所述的基因开关系统，其中所述非诱导型启动子具有如SEQ IDNO：40-64中任一个所示的序列。
94.根据权利要求89所述的基因开关系统，其中所述诱导型启动子具有如SEQ ID NO：40-64中任一个所示的序列。
95.根据权利要求85所述的基因开关系统，其中所述多肽连接体具有如SEQ ID NO：146-162中任一个所示的序列。
96.根据权利要求86所述的基因开关系统，其中所述多肽连接体是具有如SEQ ID NO：18-19和146-162中任一个所示序列的可切割的连接体、核糖体跳跃连接体或IRES连接体。
97.根据权利要求85所述的基因开关系统，其中所述一个或多个表达盒包括包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列的表达盒，其中所述嵌合抗原受体的表达由非诱导型启动子调节。
98.根据权利要求97所述的基因开关系统，其中所述CAR能够结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC-16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
99.根据权利要求97所述的基因开关系统，其中所述非诱导型启动子包括EF1A或其变体。
100.根据权利要求97所述的基因开关系统，其中所述表达盒具有如SEQ ID NO：131所示的序列。
101.根据权利要求97所述的基因开关系统，其中所述表达盒进一步包含编码细胞标签的序列，其中所述细胞标签通过连接体与所述CAR连接。
102.根据权利要求101所述的基因开关系统，其中所述细胞标签包含HER1截短变体和CD20截短变体中的至少一种。
103.根据权利要求102所述的基因开关系统，其中所述表达盒具有如SEQ ID NO：132所示的序列。
104.根据权利要求97所述的基因开关系统，其中所述表达盒进一步包含编码所述第一基因开关多肽的所述序列和编码所述第二基因开关多肽的所述序列，其中所述第一和第二基因开关多肽之一通过连接体与所述CAR连接。
105.根据权利要求104所述的基因开关系统，其中所述第一和第二基因开关多肽通过所述多肽连接体连接，并且所述多肽连接体是可切割的连接体。
106.根据权利要求105所述的基因开关系统，其中所述表达盒具有如SEQ ID NO：133所示的序列。
107.根据权利要求106所述的基因开关系统，其中所述第一和第二基因开关多肽通过所述多肽连接体连接，并且所述多肽连接体是IRES连接体。
108.根据权利要求107所述的基因开关系统，其中所述表达盒具有如SEQ ID NO：134所示的序列。
109.根据权利要求86或87所述的基因开关系统，其中所述一个或多个表达盒包括包含编码所述异源基因多肽的所述序列的表达盒，其中所述异源基因多肽的表达由诱导型启动子调节。
110.根据权利要求109所述的基因开关系统，其中所述异源基因多肽包含细胞因子。
111.根据权利要求110所述的基因开关系统，其中所述细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα或IL-15变体的融合体中的至少一种。
112.根据权利要求109所述的基因开关系统，其中所述表达盒具有如SEQ ID NO：135所示的序列。
113.根据权利要求109所述的基因开关系统，其中所述表达盒包含编码第二异源基因多肽的序列，其中所述第二异源基因多肽包含细胞标签。
114.根据权利要求113所述的基因开关系统，其中所述细胞标签包含HER1截短变体和CD20截短变体中的至少一种。
115.根据权利要求114所述的基因开关系统，其中所述细胞标签通过连接体与所述细胞因子连接。
116.根据权利要求115所述的基因开关系统，其中所述表达盒具有如SEQ ID NO：136所示的序列。
117.根据权利要求88所述的基因开关系统，其中所述基因开关系统用于将异源基因整合到宿主细胞中，其中在所述丝氨酸重组酶和所述一个或多个重组酶附着位点的存在下使所述宿主细胞与所述一个或多个表达盒接触时，所述异源基因整合在所述宿主细胞中。
118.根据权利要求117所述的基因开关系统，其中所述系统进一步包含配体，其中在所述宿主细胞与所述配体接触时，所述异源基因在所述宿主细胞中表达。
119.根据权利要求117或118所述的基因开关系统，其中所述宿主细胞是T细胞或K细胞。
120.根据权利要求89所述的基因开关系统，其中所述诱导型启动子被所述反式激活域激活。
121.根据权利要求85-120中任一项所述的基因开关系统，其中所述系统被包含在一个或多个载体中。
122.根据权利要求121所述的基因开关系统，其中所述系统被包含在一个载体中。
123.一种多核苷酸，其编码根据权利要求85-89中任一项所述的基因开关系统的一种或多种组分。
124.一种载体，其包含根据权利要求123所述的多核苷酸。
125.根据权利要求124所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体中的任何一种。
126.根据权利要求125所述的载体，其中所述载体是非病毒载体，并且所述非病毒载体是睡美人转座子。
127.一种多核苷酸构建体，其包含：
编码第一基因开关多肽的多核苷酸，
编码第二基因开关多肽的多核苷酸，和
编码目的基因(GOI)的多核苷酸，
其中所述编码GOI的多核苷酸包含位于编码第一基因开关多肽的多核苷酸与编码第二基因开关多肽的多核苷酸之间的连续开放阅读框(ORF)，其中所述多核苷酸构建体进一步包含编码连接体的多核苷酸，并且其中所述GOI通过所述连接体连接至每个所述第一和第二基因开关多肽。
128.一种多核苷酸，其包含以下至少一种：(i)编码第一基因开关多肽的第一序列，所述第一基因开关多肽包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域；和(ii)编码第二基因开关多肽的第二序列，所述第二基因开关多肽包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域；
其中所述第一序列和所述第二序列中的至少一种的表达由一个或多个FAT应答元件调节。
129.一种刺激工程化细胞增殖和/或存活的方法，该方法包括：
(a)从受试者获得细胞样品，以及
(b)用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染所述细胞样品的细胞，其中所述一个或多个转座子编码：
嵌合抗原受体(CAR)或TCR、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于所述细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将所述一种或多种多核苷酸有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体；
其中所述基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接。
130.一种增强工程化细胞在有需要的受试者中的体内持久性的方法，该方法包括：
(a)从受试者获得细胞样品，以及
(b)用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染所述细胞样品的细胞，其中所述一个或多个转座子编码：
嵌合抗原受体(CAR)或TCR、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于所述细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将DNA有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体；
其中所述基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接。
131.根据权利要求129或130所述的方法，其中所述转染细胞包括对细胞进行电穿孔。
132.根据权利要求129-131中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码所述基因开关多肽，并且所述至少一种多核苷酸由启动子调节，其中所述启动子是组织特异性启动子或EF1A启动子或其功能变体。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述启动子是EF1A启动子或其功能变体，其具有如SEQ ID NO：58-60中任一个所示的序列。
134.根据权利要求132所述的方法，其中所述启动子是组织特异性启动子，并且所述组织特异性启动子包含T细胞特异性应答元件。
135.根据权利要求132所述的方法，其中所述启动子是组织特异性启动子，并且所述组织特异性启动子包含一个或多个NFAT应答元件。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述NFAT应答元件具有如SEQ ID NO：50-57中任一个所示的序列。
137.根据权利要求129-136中任一项所述的方法，其中所述细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα或IL-15变体的融合体中的至少一种。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述细胞因子是分泌形式。
139.根据权利要求137所述的方法，其中所述细胞因子是膜结合形式。
140.根据根据权利要求137-139中任一项所述的方法，其中所述细胞因子具有如SEQID NO：203-209中任一个所示的序列。
141.根据权利要求129-140中任一项所述的方法，其中所述细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞或T细胞祖细胞。
142.根据权利要求129-141中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向有需要的受试者施用有效量的所述工程化细胞。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述施用包括立即向所述受试者输注所述工程化细胞。
144.根据权利要求142或143所述的方法，其中所述方法进一步包括施用有效量的所述配体以诱导所述细胞因子的表达。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述配体是veledimex。
146.根据权利要求129-145中任一项所述的方法，其中所述CAR能够结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MAGE-A1、MUC-16、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述CAR能够结合所述CD19。
148.根据权利要求146所述的方法，其中所述CAR能够结合所述CD33。
149.根据权利要求129-148中任一项所述的方法，其中所述转座酶是鲑鱼型Tc1样转座酶。
150.根据权利要求129-149中任一项所述的方法，其中所述转座酶是SB11或SB100x转座酶。
151.根据权利要求129-150中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞标签包含HER1截短变体和CD20截短变体中的至少一种。
152.根据权利要求129-151中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞标签具有如SEQ ID NO：189-202中任一个所示的序列。
153.一种治疗患有实体瘤的受试者的方法，该方法包括：
(a)从受试者获得细胞样品，
(b)用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染所述细胞样品的细胞，其中所述一个或多个转座子编码：
嵌合抗原受体(CAR)或TCR、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于所述细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将DNA有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体；
其中所述基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中所述第一基因开关多肽和所述第二基因开关多肽通过连接体连接，以及
(c)将所述工程化细胞群体施用于所述受试者。
154.根据权利要求153所述的方法，其中所述细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα或IL-15变体的融合体中的至少一种。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述细胞因子包括IL-12。
156.根据权利要求153所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸中的至少一种多核苷酸编码所述基因开关多肽，并且所述至少一种多核苷酸由启动子调节，其中所述启动子是组织特异性启动子或EF1A启动子或其功能变体。
157.根据权利要求156所述的方法，其中所述启动子是EF1A启动子或其功能变体，其具有如SEQ ID NO：58-60中任一个所示的序列。
158.根据权利要求156所述的方法，其中所述启动子是组织特异性启动子，并且所述组织特异性启动子包含T细胞特异性应答元件。
159.根据权利要求156所述的方法，其中所述启动子是组织特异性启动子，并且所述组织特异性启动子包含一个或多个NFAT应答元件。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述NFAT应答元件具有如SEQ ID NO：50-57中任一个所示的序列。
CN201880017197.6A 2017-01-10 2018-01-10 通过新基因开关表达系统调节多肽的表达 Pending CN110462040A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762444775P 2017-01-10 2017-01-10
US62/444,775 2017-01-10
US201762464958P 2017-02-28 2017-02-28
US62/464,958 2017-02-28
PCT/US2018/013196 WO2018132494A1 (en) 2017-01-10 2018-01-10 Modulating expression of polypeptides via new gene switch expression systems

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110462040A true CN110462040A (zh) 2019-11-15

Family

ID=61094600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880017197.6A Pending CN110462040A (zh) 2017-01-10 2018-01-10 通过新基因开关表达系统调节多肽的表达

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11692194B2 (zh)
EP (1) EP3568474A1 (zh)
JP (2) JP7288401B2 (zh)
KR (1) KR20190102259A (zh)
CN (1) CN110462040A (zh)
AU (1) AU2018207281A1 (zh)
CA (1) CA3049652A1 (zh)
IL (2) IL267865B1 (zh)
SG (1) SG11201906213UA (zh)
WO (1) WO2018132494A1 (zh)
ZA (1) ZA201904623B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234757A (zh) * 2014-02-14 2021-08-10 得克萨斯州大学系统董事会 嵌合抗原受体及制备方法
CN115176016A (zh) * 2020-02-19 2022-10-11 上海药明生物技术有限公司 增强的表达系统及其使用方法

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11278570B2 (en) 2016-12-16 2022-03-22 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
US11111483B2 (en) 2016-12-16 2021-09-07 B-Mogen Biotechnologies, Inc. Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems and methods
WO2019079486A1 (en) * 2017-10-18 2019-04-25 Intrexon Corporation POLYPEPTIDE COMPOSITIONS COMPRISING SPACERS
WO2019160956A1 (en) * 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
CN112543808A (zh) 2018-06-21 2021-03-23 比莫根生物科技公司 增强的hAT家族转座子介导的基因转移及相关组合物、系统和方法
KR20210043562A (ko) * 2018-07-10 2021-04-21 프레시전 인코포레이티드 Ror-1 특이적 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
CN110832071A (zh) * 2018-09-14 2020-02-21 上海原能细胞医学技术有限公司 表面包含免疫调节剂的细胞及其用途
WO2020052645A1 (zh) * 2018-09-14 2020-03-19 上海原能细胞医学技术有限公司 表面包含免疫调节剂的细胞及其用途
JP2022513888A (ja) * 2018-12-14 2022-02-09 プロヴィヴァ セラピューティクス （ホン コン） リミテッド Ｉｌ－１５組成物およびその使用方法
WO2020206395A1 (en) * 2019-04-05 2020-10-08 Nektar Therapeutics Method for enhancing cellular immunotherapy
BR112021021608A2 (pt) * 2019-04-30 2021-12-21 Atara Biotherapeutics Inc Células car-t direcionadas a cd19 específicas para antígeno
EP3753566A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-23 Medizinische Hochschule Hannover All-in one viral vector for car and therapeutic effector molecule
US20220332780A1 (en) 2019-09-10 2022-10-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Ca2-il15 fusion proteins for tunable regulation
EP3914699A4 (en) * 2019-12-09 2023-03-29 ImmunityBio, Inc. SCREENING OF CELLULAR CLONES EXPRESSING POLYGENIC TRANSGENES BY POSITIVE SELECTION NOT DEPENDENT ON ANTIBIOTICS
CN115087466A (zh) * 2019-12-12 2022-09-20 森迪生物科学公司 用于细胞的调控装甲的方法和组合物
WO2022109611A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Simcere Innovation, Inc. Armed dual car-t compositions and methods for cancer immunotherapy
CN117396607A (zh) * 2020-12-30 2024-01-12 阿劳诺斯治疗公司 包含多顺反子表达盒的重组载体及其使用方法
CA3216765A1 (en) * 2021-05-04 2022-11-10 John Anthony Zuris Engineered cells for therapy
AU2022375623A1 (en) * 2021-10-25 2024-05-02 Genvivo, Inc. Compositions and methods for therapeutic delivery

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000078951A1 (en) * 1999-06-18 2000-12-28 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Chimeric oca-b transcription factors
CN101868241A (zh) * 2007-09-28 2010-10-20 英特瑞克斯顿股份有限公司 表达生物治疗分子的治疗基因开关构建物和生物反应器以及它们的应用
CN102014626A (zh) * 2008-03-14 2011-04-13 英特瑞克斯顿股份有限公司 甾族配体及其在基因开关调控中的应用

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5117057A (en) 1985-10-21 1992-05-26 Rohm And Haas Company Insecticidal N' substituted-N-N'-disubstituted-hydrazines
US4985461A (en) 1985-10-21 1991-01-15 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
FR2593630B1 (fr) 1986-01-27 1988-03-18 Maurice Francois Ecran d'affichage a matrice active a resistance de drain et procedes de fabrication de cet ecran
US5225443A (en) 1986-05-01 1993-07-06 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N'-substituted N,N'-diacylhydrazines
US6218525B1 (en) * 1988-02-25 2001-04-17 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding CD28
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US20040049014A1 (en) * 1988-12-28 2004-03-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
AU655417B2 (en) 1990-03-22 1994-12-22 Salk Institute For Biological Studies, The Insect retinoid receptor compositions and methods
CA2043775A1 (en) 1990-06-14 1991-12-15 Dat P. Le Dibenzoylakylcyanohydrazines
DE69128037T2 (de) 1990-11-13 1998-05-07 Immunex Corp Bifunktionelle wählbare fusionsgene
IL100643A (en) 1991-01-25 1996-10-31 Nippon Kayaku Kk History of hydrazine and pesticides containing these histories as an active ingredient
US5530028A (en) 1992-11-23 1996-06-25 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-diacylhydrazines
US6013836A (en) 1992-02-28 2000-01-11 Rohm And Haas Company Insecticidal N'-substituted-N,N'-disubstitutedhydrazines
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
EP0804590A1 (en) 1993-05-21 1997-11-05 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
ES2237764T3 (es) 1995-03-03 2005-08-01 Syngenta Participations Ag Control de la expresion genica en plantas por transactivacion mediada por un receptor en presencia de un ligando quimico.
CA2214649C (en) 1995-03-08 2007-06-12 Zeling Cai Antigen presenting system and methods for activation of t-cells
US5785682A (en) * 1995-03-22 1998-07-28 Abbott Laboratories Pre-filled syringe drug delivery system
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US5885827A (en) 1996-01-23 1999-03-23 The Regents Of The Universtiy Of California Eukaryotic high rate mutagenesis system
EP0910652B1 (en) 1996-04-05 2014-10-08 The Salk Institute For Biological Studies Hormone-mediated methods for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
IL126843A (en) 1996-05-23 2007-06-17 Scripps Research Inst Mhc class ii antigen-presenting systems and methods for activating cd4+t cells in vitro
US6489458B2 (en) 1997-03-11 2002-12-03 Regents Of The University Of Minnesota DNA-based transposon system for the introduction of nucleic acid into DNA of a cell
AU738494B2 (en) 1997-07-10 2001-09-20 Salk Institute For Biological Studies, The Modified lepidopteran receptors and hybrid multifunctional proteins for use in regulation of transgene expression
US6333318B1 (en) 1998-05-14 2001-12-25 The Salk Institute For Biological Studies Formulations useful for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
US6790662B1 (en) 1999-03-12 2004-09-14 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Method of isolating CD8+ cells, and related hybridoma cells antibodies and polypeptides
EP1235842A4 (en) 1999-10-15 2003-04-23 Univ Massachusetts GENESIS OF THE RNA INTERFERENCE PATH AS AID OF TARGETED GENTIAN INTERFERENCE
WO2001030965A2 (en) 1999-10-28 2001-05-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of in vivo gene transfer using a sleeping beauty transposon system
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
JP2004500095A (ja) 2000-02-24 2004-01-08 エクサイト　セラピーズ，　インコーポレイテッド 細胞の同時の刺激および濃縮
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US20040033600A1 (en) 2001-03-21 2004-02-19 Palli Subba Reddy Ecdysone receptor-based inducible gene expression system
DE60122685T2 (de) 2000-03-22 2007-08-23 Rheogene Holdings Inc. Induziertes genexpressionssystem basierend auf ecdysonrezeptoren
AU2001275474A1 (en) 2000-06-12 2001-12-24 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
US8105825B2 (en) 2000-10-03 2012-01-31 Intrexon Corporation Multiple inducible gene regulation system
DK1534738T3 (da) 2001-02-20 2012-10-01 Intrexon Corp Nye substitutionsmutantreceptorer og anvendelse heraf i et inducérbart genekpressionssystem på basis af en nuklear receptor
US20040071671A1 (en) 2001-02-20 2004-04-15 Leturcq Didier J. Cell therapy method for the treatment of tumors
WO2002066614A2 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Rheogene Holdings, Inc. Chimeric retinoid x receptors and their use in a novel ecdysone receptor-based inducible gene expression system
EP1373470B1 (en) 2001-02-20 2013-04-24 Intrexon Corporation Novel substitution mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
ES2385598T3 (es) 2001-02-20 2012-07-27 Intrexon Corporation Sistema novedoso de expresión génica inducible basado en el receptor de ecdisona/receptor X retinoide de invertebrado
US7919269B2 (en) 2001-09-26 2011-04-05 Intrexon Corporation Whitefly ecdysone receptor nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
JP2005532781A (ja) 2001-09-26 2005-11-04 レオジーン・ホールディングス，インコーポレーテッド ヨコバイエクジソン受容体核酸、ポリペプチド、およびそれらの使用
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
WO2003089618A2 (en) 2002-04-22 2003-10-30 Regents Of The University Of Minnesota Transposon system and methods of use
US7375093B2 (en) 2002-07-05 2008-05-20 Intrexon Corporation Ketone ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
WO2004033685A1 (en) 2002-10-09 2004-04-22 Avidex Ltd Single chain recombinant t cell receptors
US7304161B2 (en) 2003-02-10 2007-12-04 Intrexon Corporation Diaclhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes in mammalian systems via an ecdysone receptor complex
US7304162B2 (en) 2003-02-21 2007-12-04 Intrexon Corporation Oxadiazoline ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US7456315B2 (en) 2003-02-28 2008-11-25 Intrexon Corporation Bioavailable diacylhydrazine ligands for modulating the expression of exogenous genes via an ecdysone receptor complex
US8802643B1 (en) 2003-05-30 2014-08-12 University Of South Florida Method for the treatment of malignancies
US7985739B2 (en) 2003-06-04 2011-07-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhanced sleeping beauty transposon system and methods for using the same
NZ570709A (en) 2003-06-13 2010-04-30 Univ Pennsylvania Nucleic acid sequences encoding and compositions comprising IgE signal peptide and/or IL-15 and methods for using the same
US7935510B2 (en) 2004-04-30 2011-05-03 Intrexon Corporation Mutant receptors and their use in a nuclear receptor-based inducible gene expression system
EP1765988B1 (en) 2004-05-27 2017-09-20 The Trustees of The University of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
EP1791865B1 (en) 2004-06-29 2010-07-28 Immunocore Ltd. Cells expressing a modified t cell receptor
US7847064B2 (en) * 2004-07-09 2010-12-07 Donald Danforth Plant Science Center Methods and compositions for regulating gene expression in plant cells
WO2007037780A2 (en) 2004-10-08 2007-04-05 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy with enhanced t lymphocyte survival
CA2608474C (en) 2005-05-17 2019-11-12 University Of Connecticut Compositions and methods for immunomodulation in an organism
EP1777294A1 (en) 2005-10-20 2007-04-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) IL-15Ralpha sushi domain as a selective and potent enhancer of IL-15 action through IL-15Rbeta/gamma, and hyperagonist (IL15Ralpha sushi -IL15) fusion proteins
BRPI0708446A2 (pt) 2006-03-01 2011-06-07 Janssen Pharmaceutica Nv tratamento de cáncer combinando agente de linfodepleção com ctls e citocinas
AU2007257683A1 (en) * 2006-06-12 2007-12-21 Symphogen A/S Pan-cell surface receptor- specific therapeutics
MX2009003764A (es) 2006-10-04 2009-04-22 Janssen Pharmaceutica Nv Preparaciones de celulas presentadoras de antigeno artificiales y su uso en terapias celulares.
WO2008103475A1 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Anaptysbio, Inc. Somatic hypermutation systems
EP2141997B1 (en) 2007-03-30 2012-10-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred t lymphocytes
WO2009002562A2 (en) 2007-06-27 2008-12-31 Marine Polymer Technologies, Inc. Complexes of il-15 and il-15ralpha and uses thereof
WO2009003671A2 (en) 2007-07-04 2009-01-08 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Hyperactive variants of the transposase protein of the transposon system sleeping beauty
HUE024479T2 (en) * 2007-10-08 2016-01-28 Intrexon Corp Genetically altered dendritic cells and uses for cancer treatment
CN102575227A (zh) 2008-10-08 2012-07-11 英特瑞克斯顿股份有限公司 表达多种免疫调节剂的工程改造细胞及其应用
CA2760446C (en) * 2009-04-30 2018-01-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Inducible interleukin-12
JP5508625B2 (ja) 2009-12-14 2014-06-04 トヨタ自動車株式会社 車両の制御装置及び車両の制御方法
RU2612788C2 (ru) 2010-03-23 2017-03-13 Интрексон Корпорейшн Векторы, условно экспрессирующие терапевтические белки, клетки-хозяева, содержащие указанные векторы, и их применение
US9331524B1 (en) 2010-07-03 2016-05-03 Best Energy Reduction Technologies, Llc Method, system and apparatus for monitoring and measuring power usage
EP2681327B1 (en) 2011-03-04 2018-11-21 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
CA2812739A1 (en) * 2011-03-25 2012-10-04 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Hetero-dimeric immunoglobulins
ES2872077T3 (es) * 2011-04-08 2021-11-02 Us Health Receptor de antígenos quiméricos anti-variante III del receptor de factor de crecimiento epidérmico y uso de los mismos para el tratamiento de cáncer
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
WO2014159415A1 (en) 2013-03-12 2014-10-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Colloidal coomassie stain
EP3783098A1 (en) 2013-05-14 2021-02-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (car) t-cells
WO2014190273A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptor-targeting monoclonal antibodies
WO2014193898A1 (en) * 2013-05-31 2014-12-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Combination therapies for cancer
WO2015079053A2 (en) * 2013-11-29 2015-06-04 Ucb Biopharma Sprl Synthetic promoters
SG11201604781RA (en) 2013-12-18 2016-07-28 Intrexon Corp Single chain il-12 nucleic acids, polypeptids, and uses thereof
JP6731346B2 (ja) * 2014-02-10 2020-07-29 メルク パテント ゲーエムベーハー 標的ＴＧＦβ阻害
US9814215B2 (en) 2014-03-11 2017-11-14 Little Big Cat, Inc. Pet toy with telescoping wand with metallic wire
WO2015142675A2 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
JP2017514476A (ja) * 2014-05-01 2017-06-08 ユニバーシティ・オブ・ワシントン アデノウイルスベクターを用いたインビボでの遺伝子操作
SG11201609118RA (en) 2014-05-15 2016-11-29 Univ Singapore Modified natural killer cells and uses thereof
AU2015270912B9 (en) 2014-06-02 2021-01-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting CD-19
US11030531B2 (en) 2014-06-06 2021-06-08 Trustees Of Boston University DNA recombinase circuits for logical control of gene expression
JP6655061B2 (ja) 2014-07-29 2020-02-26 ノバルティス アーゲー 状態を治療するためのｉｌ−１５およびｉｌ−１５ｒアルファヘテロ二量体用量増加レジメン
TWI751102B (zh) 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
EP3197911A4 (en) 2014-09-22 2018-06-20 Intrexon Corporation Improved therapeutic control of heterodimeric and single chain forms of interleukin-12
JP2017535284A (ja) 2014-11-05 2017-11-30 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 免疫エフェクター細胞の拡大のための遺伝子改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子操作細胞
WO2016094679A1 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
AU2016229094B2 (en) 2015-03-11 2020-02-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Transposase polypeptides and uses thereof
AU2016275030B2 (en) * 2015-06-10 2021-12-09 Nantkwest, Inc. Modified NK-92 cells for treating cancer
WO2017053649A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Altor Bioscience Corporation Interleukin-15 superagonist significantly enhances graft-versus-tumor activity
AU2016334401A1 (en) 2015-10-10 2018-04-26 Intrexon Corporation Improved therapeutic control of proteolytically sensitive, destabilized forms of interleukin-12
WO2017079703A1 (en) * 2015-11-05 2017-05-11 Juno Therapeutics, Inc. Vectors and genetically engineered immune cells expressing metabolic pathway modulators and uses in adoptive cell therapy
KR20180069081A (ko) 2015-11-11 2018-06-22 인트렉손 코포레이션 심장 이상 및 기타 병리 이상의 치료를 위한 복수의 생물학적으로 활성화된 폴리펩티드를 단일 벡터로부터 발현하기 위한 조성물 및 방법
CN106967685B (zh) * 2016-01-13 2020-06-02 北京马力喏生物科技有限公司 共表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体和免疫检查点抑制分子的转基因淋巴细胞及其用途
US20190117690A1 (en) 2016-04-06 2019-04-25 The University State Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Hum Use of heterodimeric il-15 in adoptive cell transfer
EP3377637B1 (en) * 2016-04-08 2020-03-18 Krystal Biotech, LLC Compositions for use in methods for the treatment of wounds, disorders, and diseases of the skin
IL306102A (en) 2017-06-07 2023-11-01 Precigen Inc Expression of new cell markers

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000078951A1 (en) * 1999-06-18 2000-12-28 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Chimeric oca-b transcription factors
CN101868241A (zh) * 2007-09-28 2010-10-20 英特瑞克斯顿股份有限公司 表达生物治疗分子的治疗基因开关构建物和生物反应器以及它们的应用
CN102014626A (zh) * 2008-03-14 2011-04-13 英特瑞克斯顿股份有限公司 甾族配体及其在基因开关调控中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陈秋菊;王韵斐;崔易虹;朱广琴;杨明明;宋宇轩;曹斌云;: "FMDV 2A介导的乳腺上皮细胞双基因表达载体构建及表达", 畜牧兽医学报, no. 10, pages 1397 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234757A (zh) * 2014-02-14 2021-08-10 得克萨斯州大学系统董事会 嵌合抗原受体及制备方法
CN115176016A (zh) * 2020-02-19 2022-10-11 上海药明生物技术有限公司 增强的表达系统及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
IL267865A (en) 2019-09-26
AU2018207281A1 (en) 2019-07-18
JP2023065438A (ja) 2023-05-12
US20200283778A1 (en) 2020-09-10
JP7288401B2 (ja) 2023-06-07
US20180291384A1 (en) 2018-10-11
IL267865B1 (en) 2024-03-01
EP3568474A1 (en) 2019-11-20
CA3049652A1 (en) 2018-07-19
IL310711A (en) 2024-04-01
US11692194B2 (en) 2023-07-04
JP2020513777A (ja) 2020-05-21
SG11201906213UA (en) 2019-08-27
WO2018132494A1 (en) 2018-07-19
KR20190102259A (ko) 2019-09-03
ZA201904623B (en) 2023-12-20
US11946054B2 (en) 2024-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110462040A (zh) 通过新基因开关表达系统调节多肽的表达
KR102557834B1 (ko) 신규의 세포 태그의 발현
KR102469703B1 (ko) Cd33 특이적 키메라 항원 수용체
JP6775515B2 (ja) トランスポザーゼポリペプチド及びその使用
US20210177902A1 (en) Ror-1 specific chimeric antigen receptors and uses thereof
US20170137515A1 (en) Car based immunotherapy
CN110291200A (zh) 对哺乳动物细胞中转基因表达的药剂配体诱导具有增大的灵敏度的嵌合转录因子变异体
AU2016306209A1 (en) Bispecific CAR T-cells for solid tumor targeting
KR20200096758A (ko) 스페이서를 포함하는 폴리펩타이드 조성물
KR20210021493A (ko) Muc16 특이적 키메라 항원 수용체 및 그의 용도
JP2022513372A (ja) シアリルルイスａを標的とするキメラ抗原受容体およびその使用
KR20230143140A (ko) 키메라 수용체 요법
RU2795198C2 (ru) Специфичные к muc16 химерные антигенные рецепторы и их применения
RU2796334C9 (ru) Экспрессия новых клеточных меток
RU2796334C2 (ru) Экспрессия новых клеточных меток
EP4382913A2 (en) Modulating expression of polypeptides via new gene switch expression systems
TW202307210A (zh) Ｃｄ１９和ｃｄ２２嵌合抗原受體及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Country or region after: U.S.A.

Address after: Virginia

Applicant after: Presagern Co.

Address before: Virginia

Applicant before: Intrexon Corp.

Country or region before: U.S.A.

CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Country or region after: U.S.A.

Address after: American Maryland

Applicant after: Presagern Co.

Address before: Virginia

Applicant before: Presagern Co.

Country or region before: U.S.A.