ES2237764T3

ES2237764T3 - Control de la expresion genica en plantas por transactivacion mediada por un receptor en presencia de un ligando quimico.

Info

Publication number: ES2237764T3
Application number: ES96904817T
Authority: ES
Inventors: Stephen Arthur Goff; Lyle Dean Crossland; Laura Stein Privalle
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1995-03-03
Filing date: 1996-02-19
Publication date: 2005-08-01
Anticipated expiration: 2016-02-19
Also published as: WO1996027673A1; AU703124B2; CA2213340C; HUP9800353A3; HUP9800353A2; US6939711B2; JPH11500922A; EP0813604A1; US20010022004A1; DE69634630T2; ATE293699T1; US6147282A; CA2213340A1; AU4878296A; DE69634630D1; US5880333A; EP0813604B1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN METODO PARA CONTROLAR LA EXPRESION GENICA EN PLANTAS. ESPECIFICAMENTE, EL METODO COMPRENDE LA OBTENCION DE UNA PLANTA TRANSGENICA QUE CONTENGA, AL MENOS, DOS CASSETTES PARA EXPRESION DEL RECEPTOR Y UN CASSETTE PARA EXPRESION DE LA DIANA. EL PRIMER CASSETTE PARA EXPRESION DEL RECEPTOR CONTIENE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA PARA UNA REGION REGULADORA 5'' UNIDA DE FORMA OPERATIVA A UNA SECUENCIA NUCELOTIDICA QUE CODIFICA PARA UN PRIMER POLIPEPTIDO RECEPTOR, Y UNA REGION 3'' DE TERMINACION. EL SEGUNDO CASSETTE PARA EXPRESION DEL RECEPTOR CONTIENE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA PARA UNA REGION REGULADORA 5'' UNIDA DE FORMA OPERATIVA A UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA PARA UN SEGUNDO POLIPEPTIDO RECEPTOR, Y UNA REGION 3'' DE TERMINACION. EL CASSETTE PARA EXPRESION DE LA DIANA COMPRENDE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA PARA UNA REGION REGULADORA 5'' UNIDA DE FORMA OPERATIVA A UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA PARA UN POLIPEPTIDO DIANA, Y UNA REGION 3'' DE TERMINACION, EN EL QUE LA REGION REGULADORA 5'' DE DICHO CASSETTE PARA EXPRESION DE LA DIANA ESTA ACTIVADA POR LOS YA MENCIONADOS PRIMERO Y SEGUNDO POLIPEPTIDOS RECEPTORES, EN PRESENCIA DE UNO O MAS LIGANDOS QUIMICOS COMPLEMENTARIOS AL DOMINIO DE UNION A LIGANDO DE DICHOS POLIPEPTIDOS RECEPTORES, MEDIANTE LO CUAL SE LLEVA A CABO LA EXPRESION DE DICHO POLIPEPTIDO DIANA. EL METODO ES UTIL PASA CONTROLAR ALGUNAS CARACTERISTICAS DE IMPORTANCIA EN AGRONOMIA, COMO ES LA FERTILIDAD DE LA PLANTA.

Description

Control de la expresión génica en plantas por transactivación mediada por un receptor en presencia de un ligando químico.

La presente invención se refiere al control químico de la expresión génica en las plantas. En particular, se refiere a un método por el cual polipéptidos receptores en presencia de un ligando químico adecuado regulan la expresión de un polipéptido diana en una célula vegetal, así como también a los casetes de expresión que codifican los polipéptidos diana y receptor y a las plantas transgénicas que contienen los casetes de expresión.

En algunos casos, es deseable controlar el tiempo o el grado de expresión de un rasgo fenotípico en plantas, en células vegetales o en tejidos vegetales. Una situación ideal sería la regulación de la expresión de tal rasgo a voluntad, provocada mediante una sustancia química que se podría aplicar fácilmente en las cosechas de campo, en los arbustos ornamentales, etc. Un sistema como éste para regular la expresión génica, que se podría utilizar para conseguir esta situación ideal, que no se sabe todavía que se encuentre de manera natural en las plantas, es la superfamilia de los receptores nucleares de las hormonas esteroideas y tiroideas.

La superfamilia de los receptores nucleares de las hormonas esteroideas y tiroideas se encuentra en los mamíferos y en los insectos, y se compone de unas 100 proteínas conocidas. Estos receptores se clasifican en al menos dos categorías funcionalmente distintas, conocidas como clase I y clase II [Beato, Cell 56: 335-344 (1989); Parker, Sem. Cancer Biol. Ser. 1: 81-87 (1990)]. De las dos clases, sólo los receptores de la clase II funcionan en el núcleo como heterodímeros para afectar la expresión de los genes diana en presencia de la hormona. Los ejemplos mejor estudiados de proteínas receptoras de clase II son el receptor del ácido retinoico (RAR), el receptor de la vitamina D (VDR), el receptor de la hormona tiroidea (T_{3}R) y el receptor X retinoide (RXR). Los receptores se unen a la región reguladora 5' del gen diana y, tras unirse un ligando químico al receptor, el dominio de activación transcripcional (transactivación) del receptor afecta la expresión génica al interactuar con otros factores de iniciación de la transcripción.

Además de las proteínas receptoras de la clase II presentes en los mamíferos, como se describió arriba, se han identificado receptores de estructura y de actividad similares en el insecto Drosophila. [Koelle et al., Cell 67: 59 (1991); Christianson and Kafatos, Biochem. Biophys. Res. Comm. 193: 131B (1993); Henrich et al., Nucleic Acid Res. 18: 4143 (1990)]. El receptor de la ecdisona (EcR) se une a la hormona esteroidea 20-hidroxiecdisona y, cuando heterodimeriza con el producto del gen Ultraespiráculo (Ultraspiracle, USP), transactivará la expresión génica. USP es más homólogo a RXR\alpha, y RXR es capaz de formar heterodímeros con EcR [Thomas et al., Nature 362: 471-475 (1993)]. También se unirán a estos receptores y causarán la transactivación de un gen diana otros ligandos químicos además de la 20-hidroxiecdisona como, por ejemplo, otros agonistas o antagonistas de la hormona.

Se ha demostrado que un miembro de la superfamilia de los receptores nucleares esteroideos y tiroideos, el receptor de glucocorticoides (GR) de clase I que utiliza chaperoninas y que no funciona heterodimerizándose con otros receptores, transactiva un gen diana en las células vegetales [Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421-10425 (1991)]. Se fusionó un fragmento que contenía el dominio de unión a ligando del GR con la proteína reguladora de antocianinas conocida como "R" y se mostró que estimulaba la producción de antocianinas en una Arabidopsis thaliana transgénica en respuesta a la aplicación del ligando químico adecuado [Lloyd et al., Science 226: 436 (1994)]. Lloyd et al. describieron también que el GR completo no activaba la expresión del gen en una Arabidopsis thaliana transformada de forma estable, mientras que sí lo hacía en los ensayos transitorios con protoplastos de tabaco. Además, las fusiones de R con un fragmento del receptor de estrógenos (RE), otro receptor de la clase I que utiliza chaperoninas, también estimulaba la producción de antocianinas en presencia del ligando químico adecuado, pero mostraron una expresión de fondo "considerable".

La característica diferenciadora de las proteínas receptoras de clase II, la transactivación de un gen diana mediante receptores heterodimerizados en presencia de un ligando químico adecuado, ofrecen unas oportunidades hasta ahora desconocidas para controlar químicamente la expresión génica en las plantas. El uso de heterodímeros permite un margen más amplio de estrategias de control génico, y ya se conocen productos químicos usados en la agricultura que pueden desencadenar la transactivación, mediada por el receptor, de la expresión de un gen diana de esta clase. Además, las estrategias de control génico en las plantas que utilizan receptores nucleares que no se producen de manera natural en las plantas presentan la atrayente característica de inducir sólo el gen diana manipulado genéticamente. Sin embargo, los receptores de la clase II, en general, poseen unos dominios de activación transcripcional francamente malos y la capacidad de los receptores para transactivar los genes diana se puede potenciar añadiendo otros dominios de activación transcripcional, en concreto de plantas o de especies víricas. Se necesitarán modificaciones adiconales para proporcionar una actividad basal mínima que aumente rápidamente hasta unos niveles elevados en presencia de una substancia química desencadenante. Tal como se ha demostrado mediante la presente invención, se han desarrollado unos polipéptidos receptores basados en el modelo de la clase II y los genes que los codifican, que funcionan en las células vegetales para controlar la expresión de un polipéptido diana, en el que los polipéptidos receptores activan la región reguladora 5' de un casete de expresión diana en presencia de un ligando químico. Este método para controlar la expresión génica en las plantas sirve para controlar varios rasgos de importancia agronómica, como la fertilidad de la planta.

La WO93/09237 describe plantas mejoradas de maíz superdulce que tienen sus genes naturales sh-2 o bt-2, así como también un gen regulado por ADP-GDP bajo el control de un promotor heterólogo. El promotor heterólogo utilizado para transcribir el gen SH-2 o Bt-2 puede ser un promotor inducible, como por ejemplo un promotor sensible a esteroides. Se describen las construcciones que comprenden un promotor inducible por el complejo binario de la proteína que une 20-hidroxiecdisona operativamente unido a los genes Sh-2 o Bt-2 y un terminador transcripcional.

La WO93/23431 describe proteínas receptoras de hormonas esteroides modificadas y los métodos para su uso, así como también un interruptor molecular. El interruptor molecular consta de un receptor de esteroides modificado, que incluye en dicho receptor un dominio de unión al DNA del receptor de esteroides natural ligado a un dominio de unión a ligando modificado. Se puede usar el interruptor molecular para regular la expresión en una terapia génica.

La EP 0589841 describe un método para producir plantas estériles macho, que sirven para producir semillas híbridas. Se cruza una primera planta, transformada con un casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un promotor específico de anteras unido operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica un transactivador, con una segunda planta transformada con un casete de expresión que comprende una secuencia nucleotídica (que es capaz de mediar la interrupción de la formación de un polen viable) bajo el control de una secuencia capaz de ser activada mediante el transactivador.

Con la presente invención se delinea un método para controlar la expresión génica en las plantas. Específicamente, el método comprende transformar una planta con al menos dos casetes de expresión de receptor y al menos un casete de expresión diana. El primer casete de expresión de receptor comprende una secuencia nucleotídica de una región reguladora 5' unida operativamente a una región terminadora 3'. El segundo casete de expresión de receptor comprende una secuencia nucleotídica de una región reguladora 5' unida operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica un segundo polipéptido receptor unido operativamente a una región terminadora 3'. Los polipéptidos receptores primero y segundo comprenden un primer y segundo dominio de unión a ligando, respectivamente, que son distintos entre sí. El casete de expresión diana comprende una secuencia nucleotídica de una región reguladora 5' unida operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido diana unido operativamente a una región terminadora 3', en el que la región reguladora 5' de dicho casete de expresión diana se activa mediante los mencionados primero y segundo polipéptidos receptores en presencia de uno o más ligandos químicos, gracias a lo cual se lleva a cabo la expresión de dicho polipéptido diana. El método es útil para controlar varios rasgos de importancia agronómica, tal como la fertilidad de la planta.

Además, la invención delinea las plantas transgénicas que comprenden un primer y segundo casete de expresión de receptor y un casete de expresión diana, y en la presente memoria se describen tales casetes de expresión de receptor y los casetes diana del receptor, capaces de una elevada expresión en las plantas.

Los polipéptidos del receptor comprenden un dominio de unión a ligando, un dominio de unión al DNA y un dominio de transactivación. Además, los polipéptidos receptores pueden tener forma quimérica, donde uno o más dominios de unión a ligando, de unión al DNA o de transactivación se obtienen de una fuente heteróloga en relación con otros dominios presentes en el polipéptido receptor quimérico.

Figura 1. Representación gráfica de una célula vegetal que comprende un primer casete de expresión de receptor que codifica un primer polipéptido receptor que comprende un primer dominio de unión a ligando, y de un segundo casete de expresión de receptor que codifica un segundo polipéptido receptor que comprende un segundo dominio de unión al ligando. El primer y el segundo polipéptidos receptores son distintos entre sí. Además, la célula vegetal comprende un casete de expresión diana que codifica un polipéptido diana, en el que el polipéptido diana se expresa tras activarse la región reguladora 5' del casete de expresión diana que comprende un promotor con un elemento sensible (RE) al primer y al segundo polipéptidos receptores en presencia de un ligando químico que es complementario a dicho primer o segundo dominio de unión a ligando.

Figura 2. Representación gráfica de una realización específica de la célula vegetal de la figura 1, en la que el primer polipéptido receptor es el receptor de la ecdisona (EcR), el segundo polipéptido receptor es ultraespiráculo (USP), la región reguladora 5' del casete de expresión diana comprende un elemento de respuesta al receptor de la ecdisona (EcRE), y el ligando químico es la tebufenocida.

Figura 3. Representación gráfica de una realización específica de la célula vegetal de la figura 1, en la que el primer polipéptido receptor es una fusión GAL4-EcR, el segundo polipéptido receptor es una fusión USP-VP16, la región reguladora 5' del casete de expresión diana comprende un elemento de respuesta a GAL4 (GAL4RE) y el ligando químico es la tebufenocida.

"Polipéptido receptor" tal como se usa en la presente memoria se refiere a los polipéptidos que activan la expresión de un polipéptido diana en respuesta a la aplicación de ligando químico. El polipéptido receptor consta un dominio de unión al ligando, de un dominio de unión al DNA y de un dominio de transactivación. Un "casete de expresión de receptor" comprende una secuencia nucleotídica de una región reguladora 5' unida operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido receptor y una región terminadora 3' que no se traduce (codón de parada y secuencia de poliadenilación).

El dominio de unión al ligando incluye una secuencia de aminoácidos cuya estructura se une de manera no covalente a un ligando químico complementario. Por lo tanto, un dominio de unión al ligando y su ligando químico forman un par de unión complementario.

El dominio de unión al DNA comprende una secuencia de aminoácidos que se une de manera no covalente a una secuencia nucleotídica específica, que se conoce como elemento de respuesta (RE). Los elementos de respuesta se ubican en la región reguladora 5' del casete de expresión diana y comprenden un par de semisitios, teniendo cada semisitio un núcleo de 6 pares de base donde un sólo dominio de unión al DNA reconoce un sólo semisitio. Los semisitios se disponen en una orientación relativamente lineal los unos a los otros, bien como repeticiones directas, repeticiones palindrómicas o repeticiones invertidas. Un elemento de respuesta se une bien a un homodímero o a un heterodímero de polipéptidos receptores. La secuencia nucleotídica y la orientación lineal de los semisitios determina qué dominio o dominios de unión al DNA formarán un par de unión complementario con dicho elemento de respuesta, así como también la capacidad de los polipéptidos receptores para interactuar entre sí en un dímero.

El dominio de transactivación comprende una o más secuencias de aminoácidos que actúan como unos subdominios que afectan a la operación de los factores de transcripción durante la preiniciación y el ensamblaje en la caja TATA. El efecto del dominio de transactivación es permitir iniciar la transcripción repetidas veces, lo que conduce a unos mayores niveles de expresión génica.

Un "resto" se refiere a esta parte o porción de un polipéptido receptor que se obtiene de la fuente mencionada. Por ejemplo, "resto de EcR" se refiere a la porción del polipéptido receptor que se obtuvo del receptor de la ecdisona nativo. El término resto, tal como se usa aquí, puede comprender uno o más dominios.

"Homólogo" se utiliza para indicar que un polipéptido receptor tiene el mismo origen natural con respecto a su hospedador actual. Por ejemplo, el receptor de la ecdisona (EcR) se encuentra en determinadas especies de insectos y se dice que es homólogo con respecto a las especies de insectos en las que se origina. "Homólogo" también se usa para indicar que uno o más de los dominios presentes en un polipéptido del receptor tienen el mismo origen natural el uno respecto al otro. Por ejemplo, se considera que el dominio de unión al DNA y el dominio de unión a ligando de EcR tienen un origen homólogo el uno respecto al otro.

"Heterólogo" se utiliza para indicar que un polipéptido receptor tiene un origen natural distinto con respecto a su hospedador actual. Por ejemplo, si el receptor de la ecdisona (EcR) de una especie de insecto se expresa en una célula vegetal, entonces el EcR se describe como heterólogo respecto a su hospedador actual, que es la célula vegetal. También se usa "heterólogo" para indicar que uno o más de los dominios presentes en un polipéptido receptor difieren en su origen natural con respecto al otro dominio presente. Por ejemplo, si se fusiona el dominio de transactivación de la proteína VP16 del herpes simple con el receptor USP de Drosophila, entonces el dominio de transactivación de VP16 es heterólogo con respecto al resto de USP. Además, si se fusiona un dominio de USP con un dominio de RXR para fabricar un receptor funcional, entonces la fusión quimérica tendría unos dominios que serían heterólogos el uno respecto al otro. Además, cuando se expresara en una planta, un polipéptido receptor heterólogo que comprenda la fusión de un dominio de transactivación de VP16 y de un resto de USP también se consideraría heterólogo con respecto al hospedador vegetal.

El término "quimérico" se utiliza para indicar que el polipéptido receptor se compone de unos dominios, de los cuales al menos uno tiene un origen que es heterólogo con respecto a los otros dominios presentes. Estos polipéptidos receptores quiméricos los codifican secuencias nucleotídicas que se han fusionado o ligando juntas, lo que da lugar a una secuencia codificante que no se encuentra en la naturaleza.

Los polipéptidos receptores quiméricos de la presente invención se nombran mediante una nomenclatura lineal desde el extremo amino al carboxilo del polipéptido. Utilizando esta nomenclatura, se designaría como VP16-USP a un polipéptido receptor quimérico que tuviera el dominio de transactivación de VP16 fusionado al extremo amino del receptor USP. Recíprocamente, si se fusionara VP16 al extremo carboxilo del receptor USP, el polipéptido receptor quimérico se nombraría como USP-VP16.

Las construcciones génicas se nombran en términos de una región reguladora 5' y su secuencia codificante unida operativamente, donde la región reguladora 5' se designa antes de una barra inclinada (/) y la secuencia codificante se nombra después de la barra inclinada. Por ejemplo, la construcción génica 35S/USP-VP16 designa el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) fusionado con el receptor quimérico USP-VP16, donde el dominio de transactivación de VP16 se fusiona con el extremo carboxilo de USP.

Un "casete de expresión diana" comprende una secuencia nucleotídica de una región reguladora 5' unida operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido diana, cuya expresión se activa mediante los polipéptidos receptores en presencia de un ligando químico. La región reguladora 5' del gen diana comprende una secuencia promotora central, una secuencia de iniciación de la transcripción y el elemento de respuesta o elementos de respuesta necesarios para la unión complementaria de los polipéptidos receptores. El casete de expresión diana también posee una región terminadora 3' (codón de parada y secuencia de poliadenilación).

El método de la presente invención comprende expresar dentro de una planta al menos dos polipéptidos receptores que, en presencia de uno o de más ligandos químicos, activan la región reguladora 5' de un casete de expresión diana dentro de una planta transgénica (figura 1). Se necesitan al menos dos polipéptidos receptores para activar la región reguladora 5'. Estos dos polipéptidos receptores forman un dímero. Cuando los dos polipéptidos receptores son idénticos, forman un "homodímero" y cuando los dos polipéptidos receptores son diferentes forman un "heterodímero". Uno o los dos polipéptidos receptores presentes en un homodímero o en un heterodímero pueden ser quiméricos, tal como se describe más abajo. Ejemplos de heterodímeros que abarca la invención incluyen, pero no se limitan a, EcR+USP, EcR+RXR o formas quiméricas de los mismos.

Los polipéptidos receptores se componen de un dominio de unión al ligando, un dominio de unión al DNA y de un dominio de transactivación. El dominio de unión al DNA une el polipéptido receptor a la región reguladora 5' del casete de expresión diana en el sitio del elemento de respuesta. El dominio de unión a ligando de los polipéptidos receptores se une, cuando está presente, al ligando químico complementario. La unión del ligando químico causa un cambio conformacional en el polipéptido receptor y permite que el dominio de transactivación afecte la transcripción de la secuencia codificante del casete de expresión diana, lo que da lugar a la producción del polipéptido diana.

Los polipéptidos receptores quiméricos utilizados en la presente invención tienen uno o más dominios obtenidos de una fuente heteróloga. El uso de los polipéptidos receptores quiméricos tiene el beneficio de combinar dominios de diferentes fuentes, lo que proporciona un polipéptido receptor que se activa mediante una selección de ligandos químicos y que posee unas características superiores en relación a la unión de ligando, la unión al DNA y la transactivación. Una realización preferida de la presente invención son los polipéptidos receptores quiméricos, donde el ligando químico complementario se selecciona entre un insecticida, una hormona de insectos, o antagonistas o agonistas de hormonas de insectos.

La región reguladora 5' de los casetes de expresión de receptor comprenden además un promotor que permite la expresión en tejidos y células vegetales. Se escogen los promotores adecuados para los casetes de expresión de receptor para que la expresión de los polipéptidos receptores pueda ser constitutiva, regulada por el desarrollo, específica de tejido, específica de célula o específica de compartimento celular. También se pueden escoger los promotores de manera que se pueda inducir químicamente en la planta la expresión de los propios polipéptidos receptores, con lo cual se aumenta el nivel de la inducción del promotor por el ligando. Mediante la combinación de los elementos del promotor que confieren una expresión específica con los que confieren una expresión inducida químicamente, se pueden expresar o activar los polipéptidos receptores en células o de tejidos específicos de la planta en respuesta a la aplicación de un compuesto químico. Se puede modificar la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido receptor para mejorar la expresión en las plantas, para mejorar la funcionalidad o para ambas cosas. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, alterar el uso de codones, insertar intrones o crear mutaciones, preferiblemente en el dominio de unión al ligando. En una realización de la invención se usan para activar la expresión de un polipéptido diana los casetes de expresión que incluyen un promotor específico de anteras o específico del pistilo unido operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido receptor quimérico.

También se describen polipéptidos diana cuya expresión se activa por los polipéptidos receptores en presencia de un ligando químico. Se puede controlar la expresión de cualquier secuencia codificante mediante la presente invención, siempre y cuando el promotor unido operativamente a dicha secuencia codificante se haya construido conteniendo el elemento de respuesta o los elementos de respuesta que sean complementarios al dominio de unión al DNA de los polipéptidos receptores utilizados. Por ejemplo, los polipéptidos receptores activan, en presencia de un ligando químico, los polipéptidos diana que sirven para controlar la fertilidad de la planta.

Los polipéptidos receptores quiméricos se pueden utilizar en la presente invención para activar la expresión de un polipéptido diana. Se pueden elegir de una fuente heteróloga uno o más de los tres dominios de un polipéptido receptor, en base a su eficacia para la transactivación, la unión al DNA o la unión al ligando químico. También se pueden obtener de cualquier organismo los dominios del polipéptido receptor quimérico, tales como plantas, insectos y mamíferos, que tengan unas funciones reguladoras de la transcripción similares. En una realización de la invención, se seleccionan estos dominios de otros miembros de la superfamilia de los receptores nucleares de las hormonas esteroideas y tiroideas. Los polipéptidos receptores quiméricos, como se describe en la presente memoria, ofrecen la ventaja de combinar una óptima actividad transactivadora, la unión complementaria de un ligando químico determinado y el reconocimiento de un elemento de respuesta específico. Así, se puede construir un polipéptido quimérico específicamente confeccionado para un propósito determinado. Estos polipéptidos receptores quiméricos también proporcionan una funcionalidad mejorada en el entorno heterólogo de una célula vegetal.

En los métodos de la invención, se pueden ensamblar los dominios de transactivación, de unión a ligando y de unión al DNA en el polipéptido receptor quimérico en cualquier disposición funcional. Por ejemplo, cuando un subdominio de un dominio de transactivación se encuentra en la porción amino terminal de un receptor natural, el polipéptido receptor quimérico de la presente invención puede incluir un subdominio de transactivación en el extremo carboxilo en lugar de, o además de, un subdominio en el extremo amino. Como se describe en la presente invención, los polipéptidos receptores quiméricos también pueden tener múltiples dominios del mismo tipo, por ejemplo, más de un dominio de transactivación (o dos subdominios) por polipéptido receptor.

El "dominio de unión al ligando" del polipéptido receptor proporciona el medio mediante el cual se activa la región reguladora 5' del casete de expresión diana en respuesta a la presencia de un ligando químico. El receptor de la ecdisona (EcR) de Drosophila es un ejemplo de un polipéptido receptor donde se han identificado los ligandos químicos complementarios que se unen al dominio de unión a ligando. La hormona esteroidea ecdisona provoca cambios coordinados en el desarrollo del tejido que dan lugar a la metamorfosis, mostrándose que la ecdisona se une al EcR [Koelle et al. Cell 67: 59-77 (1991)]. El análogo de la ecdisona producido por la planta, la muristerona, también se une al dominio de unión al ligando de EcR. Otras sustancias químicas, tales como los agonistas no esteroideos de la ecdisona RH 5849 [Wing, Sience 241: 467-469 (1988)], y la tebufenocida, ésta última conocida como el insecticida MIMIC®,también actuarán como un ligando químico del domino de unión a ligando de EcR. En la presente invención, el EcR y su dominio de unión a ligando han resultado ser particularmente útiles para controlar la expresión del polipéptido diana en las células vegetales, tal y como se describe en los ejemplos de más adelante.

Se ha aislado y clonado otro receptor de Drosophila, el ultraespiráculo (Ultraspiracle, USP), que se conoce también como "2C", y se ha identificado su dominio de unión al ligando [Henrich et al., Nucleic Acids Research 18: 4143-4148 (1990)]. El USP es más parecido al receptor de esteroides RXR\alpha, cuyo ligando químico es el ácido 9-cis-retinoico. También se ha demostrado que el USP forma un heterodímero con el EcR y que regula la expresión de un polipéptido diana en las células de riñón de ratón transformadas en respuesta a la aplicación de la ecdisona (Evans et al. WO 94/01558). En la presente invención, el receptor USP y su dominio de unión a ligando han resultado ser particularmente útiles para controlar la expresión del polipéptido diana en las plantas, como se describe en los ejemplos de más adelante.

Los dominios de unión al ligando para construir polipéptidos receptores quiméricos se pueden obtener también de muchas otras fuentes. Fuentes de dominios de unión a ligando particularmente útiles incluyen, pero no se limitan a, proteínas receptoras de clase II de la superfamilia de receptores nucleares de las hormonas esteroideas y tiroideas.

La elección del ligando químico dependerá de qué dominios de unión a ligando están presentes en el polipéptido receptor. Bastará cualquier compuesto químico con tal de que se demuestre que forma un par de unión complementario con el dominio de unión a ligando elegido. Cuando se sabe que un compuesto natural forma un par de unión complementario con un dominio de unión al ligando determinado, estos compuestos conocidos también se podrán usar en la presente invención. Fuentes de dominios de unión a ligando particularmente útiles incluyen, pero no se limitan a, proteínas receptoras de la clase II de la superfamilia de receptores nucleares de las hormonas esteroideas y tiroideas. Productos químico particularmente útiles incluyen, pero no se limitan a, insecticidas que forman un par de unión complementario con el dominio de unión al ligando. Tales compuestos químicos incluyen, pero no se limitan a, hormonas, agonistas de hormonas o antagonistas de hormonas cuya función como insecticidas se pueda atribuir a que se unen a proteínas receptoras naturales en los insectos. Además, los compuestos químicos con esas propiedades hormonales o relacionadas con hormonas que se sabe que son insecticidas tienen el beneficio adicional de haber sido ya examinados en relación a la producción agrícola, por lo que estos compuestos están "listos para usar" sobre campos de cultivo. Compuestos químicos útiles con tales propiedades incluyen, pero no se limitan a, el fenoxycarb, CGA 59 205, tebufenocida y RH 5849.

La invención también abarca las maneras de reducir el ruido de fondo para que la inducción sea grande en comparación con la expresión del fondo suprimida. Muchos dominios de unión a ligando formarán un par de unión complementario con más de un ligando químico. En algunos casos, estos ligandos químicos se unirán pero no tienen función conocida. En otros casos, puede que haya ligando químicos endógenos del propio hospedador en los que los polipéptidos receptores se expresen que se unirán al dominio de unión a ligando. Para evitar que los ligandos químicos endógenos se unan a los polipéptidos receptores expresados en los hospedadores heterólogos y que afecten involuntariamente la expresión del gen diana, sería deseable mutar la secuencia codificante del polipéptido receptor para que reconozca sólo el ligando químico aplicado exógenamente. En la técnica se conocen métodos útiles para la mutagénesis, tales como la mutagénesis química o la mutagénesis específica de sitio.

En un método, los polipéptidos receptores mutantes se preparan mediante mutagénesis por PCR de la secuencia nucleotídica que codifica el dominio de unión a ligando de EcR o USP. Estos polipéptidos receptores mutantes se expresan en un organismo hospedador que se presta a las técnicas de detección y aislamiento convenientes, como la levadura. La detección de polipéptidos receptores mutantes que exhiban una actividad basal disminuida y una inducción varias veces mayor en tal organismo hospedador sólo proporcionará, sin embargo, candidatos para pruebas adicionales en células vegetales, ya que está claro de los trabajos con el receptor de los glucocorticoides (GR) que, aunque los receptores de la superfamilia de las hormonas esteroideas y tiroideas puedan funcionar en levadura, no se puede predecir que funcione en las plantas transgénicas [Lloyd et al., Science 226: 436 (1994)]. Aún más limitante de la aplicación de los resultados con levadura es la observación de que las células de levadura que expresan GR no responden a los ligandos químicos usados corrientemente como la dexametasona, mientras que este ligando sí funciona en otros sistemas heterólogos [Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421-10425 (1991)].

Se llevan a cabo pruebas adicionales en células vegetales preparando casetes de expresión de receptor que codifican los polipéptidos receptores mutados y transformando las células vegetales con ellos en combinación con un casete de expresión diana. En las células vegetales transformadas se comprueba que, en presencia de un ligando químico apropiado, los polipéptidos receptores mutantes activan la región reguladora 5' del casete de expresión diana. Para controlar la expresión génica en las plantas resultan útiles los polipéptidos receptores mutantes que producen una expresión basal baja del polipéptido diana en ausencia del ligando químico y producen la expresión elevada del polipéptido diana en presencia del ligando químico apropiado.

Además, la heterodimerización en ausencia del ligando también da lugar a la activación involuntaria de la región 5' reguladora del casete de expresión diana, con lo cual se producen altos niveles de expresión basal del polipéptido diana. Se piensa que otra región del dominio de unión a ligando conocida como la región de repetición de heptadas repetidas influye sobre el grado de heterodimerización en ausencia del ligando [Au-Fliegner et al., Mol. Cell. Biol. 13: 5725 (1993)]. En una realización de la presente invención, se muta la novena repetición de heptadas de la región de repetición de heptadas con mutagénesis dirigida mediante PCR de tal manera que se altere la interacción entre las subunidades de los heterodímeros polipeptídicos receptores en ausencia del ligando químico.

El "dominio de unión al DNA" es una secuencia de aminoácidos que tiene ciertas características funcionales que lo hacen responsable de la unión del polipéptido receptor a una secuencia nucleotídica específica, los elementos de respuesta, que se encuentran presentes en la región reguladora 5' del casete de expresión diana. En una realización de la invención, el dominio de unión al DNA se obtiene de los receptores nucleares de clase II y contiene restos de cisteína dispuestos de tal manera que, cuando se coordinan con iones de cinc, forman el denominado motivo de "dedo de cinc". La estructura de los dominios de unión al DNA para los receptores nucleares de clase II se conserva enormemente de una especie a otra y, por consecuencia, hay poca variación en los elementos de respuesta usados para formar un par de unión complementario [Evans, Science 240: 889-895 (1998)]. A pesar de todo, se puede introducir una considerable flexibilidad en el método para controlar la expresión génica usando estos elementos de respuesta conservados de otras formas. En una realización preferida de la invención, se colocan en la región reguladora 5' múltiples copias, y preferiblemente entre 1 y 11 copias, del elemento de respuesta apropiado, lo que habilita muchos sitios de unión de heterodímeros polipeptídicos receptores que dan lugar a un mayor grado de activación.

Se puede producir más flexibilidad en el método de control génico cambiando la orientación lineal o la posición de los elementos de respuesta en la región reguladora 5'. Los elementos de respuesta que reconocen las proteínas receptoras de clase II tienen una simetría "en diada", coherente con su funcionamiento con polipéptidos receptores dimerizados para controlar la expresión génica [Evans, Science 240: 889-895 (1988)]. Así, un dímero polipeptídico receptor se une a un "sitio entero", con cada polipéptido receptor individualmente unido a un "semisitio". Además, estos "semisitios" se pueden orientar a modo de tanto una repetición directa, como una repetición invertida o un palíndromo. Los polipéptidos receptores nativos EcR y USP reconocen un elemento de respuesta palindrómico, a diferencia de la mayoría de las proteínas receptoras de clase II que reconocen los elementos de respuesta en repetición directa con la separación adecuada.

Se puede obtener una flexibilidad adicional a la hora de controlar la expresión génica mediante la presente invención con el uso de dominios de unión al DNA y elementos de respuesta de otros activadores transcripcionales que incluyen, pero no se limitan a, las proteínas LexA o GAL4. Se puede utilizar el dominio de unión al DNA de la proteína LexA codificada por el gen lexA de E. coli y su sitio de unión complementario [Brent y Ptashne, Cell 43: 729-736 (1985), donde se describe un activador transcripcional LexA/GAL4]. Otra procedencia útil es de la proteína GAL4 de levadura.[Sadowski et al., Nature 335: 563-564 (1998), donde se describe un activador transcripcional GAL4-VP16]. En una realización preferida de la invención, se construye un polipéptido receptor quimérico al fusionar el dominio de unión al DNA de GAL4 con el resto que contiene el dominio de unión a ligando de EcR que, cuando se heterodimeriza con USP o un resto de USP, puede controlar la expresión de un polipéptido diana.

Aún se puede obtener un grado más flexibilidad a la hora de controlar la expresión génica al combinar los elementos de respuesta que forman pares de unión complementarios con los dominios de unión al DNA de diferentes tipos de activadores transcripcionales, esto es, usando elementos de respuesta solapantes de GAL4 y un miembro de la superfamilia de receptores nucleares de hormonas esteroideas y tiroideas. Un ejemplo es la región 5' reguladora de un casete de expresión diana que comprende el elemento de respuesta de GAL4 y que solapa con el elemento de respuesta de T_{3}R. Cuando las proteínas T_{3}R homodimerizan en ausencia de un ligando químico, reconocerán su propio elemento de respuesta y se unirán a él, con lo cual bloquean el elemento de respuesta adyacente para GAL4. No hay activación de la región reguladora 5' del casete de expresión diana en esta situación. Al añadir un ligando complementario para T_{3}R, el homodímero se separa y se libera de su elemento de respuesta, descubriendo el elemento de respuesta adyacente para GAL4. Una vez descubierto, los polipéptidos receptores quiméricos que usan el dominio de unión al DNA de GAL4 se pueden unir al elemento de respuesta en las condiciones de dimerización apropiadas y, de tal modo, activan la expresión del polipéptido diana.

Los "dominios de transactivación" se pueden definir como secuencias de aminoácidos que, cuando se combinan con el dominio de unión al DNA en un polipéptido receptor, aumentan la iniciación productiva de la transcripción por las RNA-polimerasas [Véase de modo general Ptashne, Nature 334, 683-689 (1988)]. Se sabe que diferentes dominios de transactivación tienen diferentes grados de efectividad en su capacidad de aumentar el inicio de la transcripción. En la presente invención es deseable utilizar dominios de transactivación que tengan mayor efectividad transactivadora en las células vegetales para generar un elevado nivel de expresión del polipéptido diana en las plantas como respuesta a la presencia de un ligando químico. Los dominios de transactivación que se ha demostrado que son particularmente eficaces en el método de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, VP16 (aislada del virus del herpes simple) y C1 (aislada de maíz). En una realización preferida de la presente invención, el dominio de transactivación de VP16 se fusiona con el resto de USP para usarlo como un monómero de un heterodímero polipeptídico receptor para controlar la expresión del polipéptido diana en las plantas. Una realización más preferible es la fusión del dominio de transactivación de C1 con el resto de EcR como un monómero. Otros dominios de transactivación también pueden ser eficaces.

Como se ha descrito antes, el método de la presente invención se puede usar para aumentar la expresión génica sobre un nivel basal mínimo. Uno de los beneficios sobresalientes del presente método, sin embargo, es que se puede usar para disminuir o inhibir la expresión génica, esto es, represión génica. La represión se puede conseguir mediante la formación de homodímeros en los que los semisitios del elemento de respuesta tienen una orientación lineal distinta de la orientación lineal que permite la unión de los heterodímeros. En estas condiciones, los homodímeros unidos a la región reguladora 5' del casete de expresión diana reprimen la expresión génica ya que interfieren con el proceso de transcripción. Por eso, la represión génica se puede conseguir incluyendo en la región reguladora 5' un elemento de respuesta o elementos de respuesta que permitan la unión del homodímero. En una realización de la invención, la represión génica se consigue al unir un homodímero de USP o EcR a la región reguladora 5' de un casete de expresión diana que comprende un semisitio complementario en repetición directa.

La represión génica provocada por la unión del homodímero se liberaría al añadir un ligando químico que desencadene la heterodimerización. Posteriormente, esta heterodimerización activa la región reguladora 5' del casete de expresión diana. Por ejemplo, se reprimirá la expresión del polipéptido diana en una planta transgénica que exprese los polipéptidos receptores EcR y USP y que comprenda un casete de expresión diana que tenga tanto un elemento de respuesta con un semisitio palindrómico como un elemento de respuesta con un semisitio de repetición directa (o de repetición invertida) complementarios al dominio de unión al DNA de USP y EcR. En presencia de tebufenocida u otro ligando químico que se una al dominio de unión al ligando de EcR o USP, o ambas, se produce la heterodimerización con USP y, como consecuencia, la unión al otro elemento de respuesta presente, lo que, a su vez, conduce a la activación de la región reguladora 5' del casete de expresión diana. Así, la represión del casete de expresión diana se liberaría.

Para su expresión en plantas, se deben escoger los promotores adecuados para tanto las casetes de expresión del receptor como para el casete de expresión diana. A menos que se indique otra cosa, los promotores que se comentan más adelante se pueden usar directamente para la expresión en plantas de tanto los polipéptidos receptores como el polipéptido diana. Estos promotores incluyen, pero no se limitan a, promotores constitutivos, inducibles, regulados temporalmente, regulados por el desarrollo, regulados químicamente, preferidos de tejido o específicos de tejido. Los promotores constitutivos preferidos incluyen, pero no se limitan a, los promotores 35S y 19S del CaMV (n.º de patente de los EE.UU. 5 352 605). Los promotores preferidos adicionalmente incluyen, pero no se limitan a, uno de los varios genes de la actina, que se sabe que se expresan en la mayoría de los tipos celulares. El promotor descrito por McElroy [McElroy et al., Mol Gen. Genet. 231: 150.160 (1991)] se puede incorporar fácilmente en los casetes de expresión de receptores para usarlos en la presente invención y son particularmente adecuados para usarlos cuando el hospedador es una monocotiledónea. Todavía otro promotor constitutivo preferido se obtiene de la ubicuitina, que es otro producto génico que se sabe que se acumula en muchos tipos celulares. El promotor de la ubicuitina se ha clonado en varias especies para usarlo en plantas transgénicas [p. ej. Girasol: Binet et al., Plant Science 79: 87-94 (1991); maíz: Christensen et al., Plant Molec Biol. 12: 619-632 (1989)]. El promotor de la ubicuitina de maíz se ha desarrollado en sistemas de monocotiledóneas transgénicas y su secuencia y los vectores que se construyeron para transformar las plantas monocotiledóneas se describen en la EP-342 926. El promotor de la ubicuitina es apropiado para usarlo en la presente invención con plantas transgénicas, especialmente las monocotiledóneas. Los promotores de los snRNA U2 y U5 de maíz [Brown et al., Nucleic Acids Res. 17: 8991 (1989) y el promotor de la alcohol-deshidrogenasa [Dennis et al., Nucleic Acids Res. 12: 3983 (1984)] son más promotores útiles.

Los promotores específicos de tejido o preferentes de tejido útiles en la presente invención en plantas, particularmente maíz, son los que dirigen la expresión en raíces, médula, hoja o polen. Tales promotores se describen en la WO 93/07278. También son útiles los promotores que confieren expresión específica de semilla, como los descritos por Schemthaner [Schemthaner et al., EMBO J. 7: 1249 (1988)], los promotores específicos de anteras ant32 y ant43D descritos en la EP-A-578 611, el promotor B6 específico de anteras (tapetum) [Huffman et al., J. Cell Biochem. 17B: resumen #D209 (1993)] y los promotores específicos del pistilo como un promotor modificado S13 [Dzelkains et al., Plant Cell 5: 855 (1993)].

También son útiles para la presente invención los promotores químicamente inducidos. En la EP-A-332 104, por ejemplo, se describen los promotores de esta categoría en particular que sirven para dirigir la expresión de los polipéptidos receptores o del polipéptido diana.

La región reguladora 5' de tanto el casete de expresión de receptor como del casete de expresión diana también puede incluir otras secuencias potenciadoras. Se ha encontrado que numerosas secuencias potencian la expresión génica en plantas transgénicas. Por ejemplo, se sabe que numerosas secuencias líder no traducidas derivadas de virus potencian la expresión. En particular, se ha visto que las secuencias líder derivadas del virus del mosaico del tabaco (TMV, la "secuencia \Omega"), virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) y el virus del mosaico de la alfalfa (AMV) son eficaces potenciadores de la expresión (p. ej. Gallie et al., Nucl Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec Biol. 15: 65-79 (1990)]. Otros líderes conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a:

\bullet líderes de los Picornavirus, por ejemplo, el líder del EMCV (región 5' no codificante de la endefalomiocarditis) [Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R. y Moss, B. PNAS USA 86: 6126-6130 (1989)];

\bullet líderes de los Potyvirus, por ejemplo, líder del TEV (virus Etch del tabaco) y líder del MDMV (vírus del mosaico del enanismo del maíz) [Allison et al., Virology 154: 9-20(1986)];

\bullet líder de la proteína que se une a la cadena pesada de las inmunoglobulinas humanas (BiP) [Macejak, D. G. y Samov, P., Nature 353: 90-94 (1991)];

\bullet líder no traducido de la proteína recubridora del mRNA del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) [Jobling, S. A. y Gehrke, L., Nature 325: 622-625 (1987)];

\bullet líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) [Gallie, D. R. et al., Molecular Biology or RNA, pp. 237-256 (1989)] y

\bullet líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) [Lommel, S. A. et al., Virology 81: 382-385 (1991); véase también Delta-Cioppa et al., Plant Physiology 84: 965-968 (1987)].

Se ha demostrado que varias secuencias intrónicas potencian la expresión cuando se añaden a la región reguladora 5', en particular en las células de monocotiledóneas. Por ejemplo, se ha visto que los intrones del gen Adh1 del maíz potencian significativamente la expresión del gen salvaje con su promotor cognado cuando se introduce en las células de maíz [Callis et al., Genes Develop. 1: 1183-1200 (1987)].

Además de los promotores, también se pueden usar en la presente invención una colección disponible de terminadores transcripcionales en 3'. Los terminadores transcripcionales son los responsables de la terminación de la transcripción y de la correcta poliadenilación del mRNA. Los terminadores de la transcripción adecuados y los que se sabe que funcionan en las plantas incluyen el terminador 35S del CaMV, el terminador tml, el terminador de la nopalina-sintasa, el terminador rbcS E9 del guisante y otros conocidos en la técnica. Éstos se pueden usar tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas.

Además de incorporar uno o más de los elementos antes mencionados en la región reguladora 5' del casete de expresión diana, también se pueden incorporar otros elementos propios del casete de expresión diana. Tales elementos incluyen, pero no se limitan a, un promotor mínimo. Con el promotor mínimo se pretende que los elementos del promotor basal estén inactivos o casi inactivos sin la activación hacia 5'. Un promotor así tiene poca actividad de fondo en plantas cuando no hay transactivador presente o cuando no hay potenciadores o sitios de unión de elementos de respuesta. Un promotor mínimo que es particularmente útil para los genes diana en las plantas es el promotor mínimo Bz1 que se obtiene del gen bronze1 del maíz. El núcleo del promotor Bz1 se obtuvo mediante la escisión por el sitio NheI localizado entre las posiciones -53 y -58 en la construcción Bz1 mutante "myc"-luciferasa pBz1LucR98 [Roth et al., Plant Cell 3: 317 (1991)]. El fragmento del promotor central derivado de Bz1 se extiende así entre -53 y +227 e incluye el intrón 1 de Bz1 en la región 5' no traducida.

Los casetes de expresión de la presente invención se pueden introducir en una célula vegetal de varias maneras conocidas en la técnica. Los expertos en la técnica se darán cuenta de que la elección del método podría depender del tipo de planta, esto es, monocotiledónea o dicotiledónea, que se va a transformar. Los métodos adecuados para transformar células vegetales incluyen, pero no se limitan a, microinyección [Crossway et al., BioTechniques 4: 320-334 (1988)], electroporación [Riggs et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602-5606 (1986)], transformación mediante Agrobacterium (Hinchee et al., Biotechnology 6: 915-921 (1988)], trasferencia directa de genes [Paszkowski et al., EMBO J 3: 2717-2722 (1984)] y la aceleración de partículas balísticas usando dispositivos disponibles de Agracetus, Inc (Madison, Wisconsin) y BioRad (Hercules, California) [véase, por ejemplo, Stanford et al., patente de los EE.UU. n.º 4 945 050; McCabe et al., Biotechnology 6: 923-926 (1988)]. Véase también Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22: 421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5: 27-37 (1987) (cebolla); Christou et al., Plant Physiol. 87: 671-674 (1988) (soja); McCabe et al., Biotechnology 6: 923-926 (1988) (soja); Datta et al., Biotechnology 8: 736-740 (1990) (arrroz); Klein et al., Proc Natl Acad. Sci. USA 85: 4305-4309 (1988) (maíz); Klein et al., Biotechnology 6: 559-563 (1988) (maíz); Klein et al., Plant Physiol 91: 440-444 (1988) (maíz); Fromm et al., Biotechnology 8: 833-839 (1990) (maíz); y Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990) (maíz); Syrab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530 (1990) (cloroplastos de tabaco); Koziel et al., Biotechnology 11: 194-200 (1993) (maíz); Shimamoto et al., Nature 388: 274-277 (1989) (arroz); Christou et al., Biotechnology 9: 957-962 (1991) (arroz); la solicitud de patente europea EP-332 581 (Dactylis glomerata y otras Pooidae); Vasil et al., Biotechnology 11: 1553-1558 (1993) (trigo); Weeks et al., Plant Physiol 102: 1077-1084 (1993) (trigo).

Un conjunto de realizaciones particulamente preferidas para introducir los casetes de expresión de la presente invención en maíz mediante bombardeo con microproyectiles lo describe Koziel [Koziel et al., Biotechnology 11: 194-200 (1993)] que se incorpora completa en la presente memoria mediante su referencia. Otra realización adicional preferida es el método de transformación de protoplastos de maíz tal como se describe en la solicitud de patente europea EP-292 435, así como en la EPA-A-292 435. Un conjunto de realizaciones particularmente preferida para introducir los casetes de expresión en trigo mediante bombardeo con microproyectiles se puede encontrar en la WO 94/13822.

La transformación de las plantas se puede emprender con una única molécula de DNA o múltiples moléculas de DNA (esto es, cotransformación), y ambas técnicas son adecuadas para usarlas con los casetes de expresión de la presente invención. Se dispone de numerosos vectores de transformación para la transformación de las plantas, y los casetes de expresión de esta invención se pueden usar junto con cualquiera de estos vectores. La selección del vector dependerá de la técnica de transformación preferida y la especie que se quiere transformar.

Se dispone de muchos vectores para transformar usando Agrobacterium tumefaciens. Éstos típicamente portan al menos una secuencia del extremo del T-DNA e incluyen vectores como pBIN19 [Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)]. En una realización preferida, los casetes de expresión usados en la presente invención se pueden insertar en cualquiera de los vectores binarios pCIB200 y pCIB2001 para usarlos con Agrobacterium. Estos casetes en el vector para transformar mediante Agrobacterium se construyeron de la siguiente manera. Se creó el pTJS75kan mediante la digestión con NarI del pTJS75 [Schmidhauser y Helinski, J. Bacteriol. 164: 446-455 (1985)]. para liberar el gen de resistencia a kanamicina, seguido de la inserción de un fragmento AccI del pUC4K que lleva un NPTII [Messing y Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983); McBride et al., Plant Mol. Biol. 14: 266-276 (1990)]. Se ligaron unos conectores XhoI al fragmento EcoRV del pCIB7 que contiene los extremos derecho e izquierdo del T-DNA, un gen quimérico nos/nptII que permite la selección el plantas y el policonector del pUC [Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)], y el fragmento digerido con XhoI se clonó en el pTJS75kan digerido con SalI para crear el pCIB200 (véase también la EP-332 104, ejemplo 19). El pCIB200 contiene los siguientes sitios de restricción únicos en el policonector: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI y SalI. El plásmido pCIB2001 se deriva del pCIB200 mediante la inserción de sitios de restricción únicos adicionales en el policonector. Los sitios de restricción únicos del policonector de pCIB2001 son EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI y StuI. El pCIB2001, además de contener estos sitios de restricción únicos, también tiene una selección por kanamicina para bacterias y plantas, los extremos derecho e izquierdo del T-DNA para la transformación mediante Agrobacterium, la función trfA derivada de RK2 para que se transfiera entre E. coli y otros huéspedes, y las funciones OriV y OriT también de RK2. El policonector del pCIB2001 es adecuado para la clonación de casetes de expresión de plantas que contengan sus propias señales reguladoras.

Un vector adicional útil para la transformación mediante Agrobacterium es el vector binario pCIB10, que contiene un gen que codifica la resistencia a kanamicina para poderlo seleccionar en plantas, secuencias de los extremos derecho e izquierdo del T-DNA, e incorpora secuencias del plásmido de amplio margen de huéspedes pRK252 que le permiten replicarse tanto en E. coli como en Agrobacterium. Su construcción se describe en Rothstein et al., Gene 53153-161 (1987). Se han construido varios derivados del pCIB10 que incorporan el gen de la higromicina B fosfotransferasa descrito por Gritz [Gritz et al., Gene 25: 179-188 (1983)]. Estos derivados permiten seleccionar las células vegetales transgénicas sobre higromicina sola (pCIB743) o sobre higromicina y kanamicina (pCIB715, pCIB717).

Los métodos que usan tanto una forma de transferencia directa de genes como los que usan una transferencia mediante Agrobacterium normalmente, pero no necesariamente, se acometen con un marcador de selección que proporciona resistencia a un antibiótico (p. ej., kanamicina, higromicina o metotrexato) o un herbicida (p. ej. fosfinotricina). Sin embargo, la elección del marcador de selección para la transformación de plantas no es crítico para la invención.

En ciertas especies se pueden preferir distintos marcadores de selección de antibióticos o herbicidas. Los marcadores de selección usados rutinariamente en la transformación incluyen el gen nptII que confiere resistencia al kanamicina y antibióticos relacionados [Messing y Vierra, Gene 19: 259-268 (1982)], el gen bar que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina [White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990); Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625-631 (1990)], el gen hph que confiere resistencia al antibiótico higromicina [Blochinger y Diggelmann, Mol. Cell. Biol. 4: 2929-2931] y el gen dhfr, que confiere resistencia al metotrexato [Bourouis et al., EMBO J. 2: 1099-1104 (1983)].

pCIB3064 es uno de los vectores útiles para la transferencia directa de genes en combinación con la selección por el herbicida Basta (o fosfinotricina). Este vector está basado en el plásmido pCIB246, que comprende el promotor 35S del CaMV en una fusión operativa con el gen GUS de E. coli y el terminador transcripcional 35S del CaMV, y se describe en la solicitud PCT publicada WO 93/07278, incorporada en esta memoria por su referencia. Un gen útil por conferir resistencia a la fosfinotricina es el gen bar de Streptomyces viridochromogenes [Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-2523 (1987)]. Este vector es apropiado para la clonación de los casetes de expresión de plantas que contengan sus propias señales reguladoras.

Un vector de transformación adicional es pSOG35 que utiliza el gen de la dihidrofolato-reductasa (DHFR) de E. coli como marcador de selección al conferir resistencia al metotrexato. Se utilizó la PCR para amplificar el promotor 35S (\sim800 pb), el intrón 6 del gen Adh1 del maíz (\sim550 pb) y 18 pb de la secuencia líder no traducida de GUS del pSOG10. Un fragmento de 250 pb que codifica el gen de la dihidrofolato-reductasa de tipo II de E. coli también se amplificó por PCR y estos dos fragmentos se ensamblaron con un fragmento SacI-PstI de pBI221 (Colontech) que comprende la estructura básica del vector pUC19 y el terminador de la nopalina-sintasa. El ensamblaje de estos fragmentos generó el pSOG19 que contiene el promotor 35S en fusión con la secuencia del intrón 6, el líder de GUS, el gen DHFR y el terminador de la nopalina-sintasa. El reemplazo del líder de GUS en el pSOG19 por la secuencia líder del controlador del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) generó el vector pSOG35. Los vectores pSOG19 y pSOG35 portan el gen de resistencia a ampicilina derivado del pUC y tienen disponibles los sitios HindIII, SphI, PstI y EcoRI para clonar secuencias foráneas.

Uno de los aspectos ventajosos de la presente invención es su uso para controlar la fertilidad de la planta en condiciones de campo. La fertilización eficaz es el resultado de la formación de cigotos viables y se puede medir como el porcentaje de semillas que forman cigotos viables. De acuerdo con la presente invención, la fertilidad se puede controlar incorporando una secuencia nucleotídica que codifique la diana adecuada en el casete de expresión diana, en el que la expresión de dicho polipéptido diana interfiere con la fertilidad de la planta, lo que quiere decir que reduce o aumenta estadísticamente la fertilidad de la planta. En una realización preferida de la invención, dicho polipéptido diana hace que el proceso de la fertilización sea infructuoso, lo que quiere decir que la formación de cigotos viables se impedirá o se prevendrá. Tal fertilización infructuosa se puede medir como el porcentaje de semillas que no forman cigotos viables y que se pueden causar por muchos medios. Estos incluyen, pero no se limitan a, 1) interrumpir o alterar aquellos procesos que son críticos para formar gametos viables, 2) polen u óvulos que, en caso de formarse, no son funcionales, o 3) se malogra el desarrollo apropiado del saco embrionario, el pistilo, el estigma o el conducto de transmisión. En la presente invención se aplica un ligando químico a las plantas transgénicas en condiciones de campo, en las que se activa la expresión del polipéptido diana, gracias lo cual la fertilización se hace infructuosa. En otra realización de la presente invención, la expresión de dicho polipéptido diana aumenta o restaura la fertilidad de una planta.

Se reconoce que se pueden conseguir distintos grados de eficacia o ineficacia en la fertilización con la presente invención. En una realización preferida, se puede alcanzar más del 80%, y más preferiblemente más del 95%, de fertilizaciones infructuosas. La capacidad de proporcionar variabilidad en el nivel de fertilidad permite que la invención se adapte a una gran variedad de propósitos agrícolas.

Secuencias codificantes útiles para el polipéptido diana incluyen, pero no se limitan a, cualquier secuencia que codifique un producto capaz de hacer infructuosa la fertilización. Estas secuencias codificantes pueden ser tanto de origen homólogo como heterólogo. Los productos génicos de esas secuencias codificantes incluyen, pero no se limitan a:

\bullet la cadena A de la toxina diftérica (DTA), que inhibe la síntesis de proteínas [Greenfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6853 (1983); Palmiter et al., Cell 50: 435 (1987)];

\bullet la pectato liasa pelE de Erwinia chrysanthemi EC16, que degrada la pectina y causa la lisis celular [Keen et al., J. Bacteriololy 168: 595 (1986)];

\bulletT-urf13 (TURF-13) de los genomas mitocondriales cms-T de maíz; este gen codifica un polipéptido denominado URF13 que rompe las membranas plasmática o mitocondrial [Braun et al., Plant Cell 2: 153 (1990); Dewey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5374 (1987); Dewey et al., Cell 44: 439 (1986)];

\bullet la recombinasa Gin del gen a del fago \mu (mu), que codifica una recombinasa específica de sitio que causará reordenamientos en el genoma y pérdida de la viabilidad de la célula cuando se expresa en células vegetales [Maeser et al., Mol. Gen. Genet., 230: 170-178 (1991)];

\bullet la ácido indolacético-lisina sintetasa (iaaL) de Pseudomonas syringae, que codifica una enzima que conjuga la lisina con el ácido indolacético (IAA). Cuando se expresa en las células de las plantas causa alteraciones en el desarrollo debido a que retira el IAA de la célula mediante la conjugación [Romano et al., Genes and Development 5: 438-446 (1991); Spena et al., Mol. Gen. Genet. 227: 205-212 (1991); Roberto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5795-5801];

\bullet la ribonucleasa de Bacillus amyloliquefaciens, también conocida como barnasa, que digiere los mRNA en las células en las que se expresa, conduciendo a la muerte celular [Mariani et al., Nature 347: 737-741 (1990); Mariani et al., Nature 357: 384-387 (1992)]; y

\bullet el gen de la toxina CytA de Bacillus thuringiensis isrealiensis que codifica una proteína que es hemolítica y mosquitocida. Cuando se expresa en las células vegetales causa la muerte de la célula debido a la rotura de la membrana celular [McLean et al., J. Bacteriology 169: 1017-1023 (1987); Ellar et al., patente de los Estados Unidos n.º 4 918 006 (1990)].

\bullet Tales polipéptidos también incluyen la adenina fosforribosiltransferasa (APRT) [Moffalt y Somerville, Plant Physiol. 86: 1150-1154 (1988)], DNAsa, RNAsa, proteasa, salicilato hidroxilasa, etc.

Se reconoce además que el casete de expresión diana puede comprender una región reguladora 5' unida operativamente a una secuencia nucleotídica que, cuando se transcribe, produce una versión antisentido de la secuencia codificante crítica para la formación de gametos viables, como la de la APRT. Alternativamente se pueden utilizar ribozimas que se dirijan al mRNA de un gen que es crítico para la formación o la funcionalidad de los gametos. Tales ribozimas comprenderán una región de hibridación de unos nueve nucleótidos que sean complementarios a la secuencia nucleotídica de al menos parte del RNA diana y una región catalítica que esté adaptada para escindir el RNA diana. Las ribozimas se describen en la EP-321 201 y la WO 88/04300. Véanse también Haseloff y Gerlach, Nature 334, 585-591 (1988); Fedor y Ulhenbeck, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1668-1672 (1990); Cech y Bass, Ann. Rev. Biochem. 55: 599-629 (1988); Cech, T. R., 236: 1532-1539 (1987); Cech, T. R. Gene 73: 259-271 (1988); y Zang y Cech, Science 213: 470-465 (1986).

Se reconoce que las secuencias nucleotídicas de antes que codifican un polipéptido diana pueden también unirse operativamente a una secuencia reguladora 5' que dirija su expresión de una manera específica de célula o tejido. La manera de proporcionar tal expresión específica de célula o tejido se ha descrito anteriormente. Esta especificidad en la expresión asegura que el efecto del polipéptido diana se ejercerá sólo en los tejidos o células que sean necesarios para la formación de gametos viables y no será perjudicial para la planta más allá de su efecto sobre la fertilidad.

Se reconoce que está dentro del alcance de la invención el que tanto la fertilidad masculina de las plantas transgénicas como la fertilidad femenina de las plantas transgénicas, o ambas, se puedan controlar. La androesterilidad es el fracaso o la incapacidad de producir polen funcional o viable. La androesterildad puede ser el resultado de defectos que desemboquen en la no formación del polen o en la falta de la capacidad funcional del polen cuando se transforma. Por eso, en condiciones normales, tanto si el polen se forma como si no, bien no es viable o es incapaz de fertilizar con eficacia.

La esterilidad femenina es el fracaso o la incapacidad de producir megasporas o sacos embrionarios viables o funcionales, u otros tejidos requeridos para la germinación, crecimiento o fertilización del polen. La esterilidad femenina puede ser el resultado de defectos que desemboquen en la no formación de megasporas o el saco embrionario, o el fracaso del desarrollo apropiado del ovario, el óvulo, el pistilo, el estigma o el conducto de transmisión. Por eso, en condiciones normales, el saco embrionario viable incapaz de fertilizar con eficacia tanto si no logra desarrollarse como si llega a formarse.

Por ejemplo, se puede obtener una planta transgénica que exprese los polipéptidos receptores EcR y USP en las anteras fusionando un promotor específico de anteras a las secuencias nucleotídicas apropiadas. Además, la planta transgénica comprenderá también un casete de expresión diana, que tiene una secuencia reguladora 5' que comprende la secuencia del elemento de respuesta apropiado con los elementos del núcleo del promotor de Bz1, unido operativamente a la secuencia codificante de la ribonucleasa barnasa. Tras la aplicación de la tebufenocida en la planta transgénica a modo de ligando químico se produce la heterodimerización de los polipéptidos receptores EcR y USP, que activan la secuencia reguladora 5' del casete de expresión diana y producirán posteriormente el polipéptido diana barnasa. La expresión resultante específica de las anteras de la barnasa causa la muerte celular y la androesterilidad consecuente. Una combinación similar de polipéptidos receptores y de casete de expresión diana, en los que las secuencias nucleotídicas que codifican los polipéptidos receptores están operativamente unidas a un promotor específico de pistilo, puede producir esterilidad femenina.

Alternativamente, la planta se podría modificar de manera que la expresión del polipéptido diana restaure la fertilidad en una planta con androesterilidad o esterilidad femenina. Por ejemplo, se podría obtener una planta que exprese el gen de la barnasa bajo el control de los promotores Ant43D, Ant32 o B6, o como describe Mariani [Mariani et al, Nature 347: 737-741 (1990); Nature 357: 384-387 (1992)], bajo el control del promotor TA29. Estas plantas comprenderían adicionalmente los casetes de expresión de receptor que expresen los polipéptidos receptores EcR y USP mediante el mismo promotor específico de anteras o mediante un promotor constitutivo como el de la ubicuitina del maíz, el 35S o el de la actina del arroz. Estas plantas comprenderían además un casete de expresión diana que tenga una secuencia reguladora 5' que comprenda la secuencia de los elementos reguladores apropiados con los elementos del núcleo del promotor de Bz1 unido operativamente a la secuencia codificante del barstar, inhibidor de la barnasa. Las plantas serían androestériles pero, tras la aplicación de la tebufenocida a modo de ligando químico, se produciría la heterodimerización de los polipéptidos receptores USP y EcR, dando lugar a la activación de la secuencia reguladora 5' del casete de expresión diana y la producción del polipéptido diana barstar. Barstar inhibiría la actividad ribonucleásica del polipéptido barnasa, con lo que el desarrollo de las anteras y el polen procedería con normalidad. Se restauraría la fertilidad.

Un enfoque similar se puede usar para controlar la esterilidad femenina. Se puede producir la esterilidad femenina en las plantas utilizando promotores específicos para la expresión en los tejidos reproductores femeninos para impulsar la expresión de la barnasa, en lugar de los promotores específicos de anteras. Inducir el casete de expresión diana que comprende la secuencia codificante de barstar con ligandos químicos daría lugar a la restauración de la fertilidad femenina.

Los elementos de propagación de la planta (fruto, tubérculos, granos, semillas), y muy especialmente las semillas, se tratan usualmente con una capa protectora que comprende herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas o mezclas de varios de estos compuestos. Si se desea, estos compuestos se formulan juntos con excipientes adicionales, surfactantes o adyuvantes que facilitan la aplicación que se emplean rutinariamente en la técnica de formulación para proteger de los daños causados por las plagas bacterianas, fúngicas o animales.

Para tratar la semilla se puede aplicar una capa protectora a las semillas tanto impregnando los tubérculos o los granos con una formulación líquida como recubriéndolos con una formulación seca o húmeda. En determinados casos se pueden usar otros métodos de aplicación a las plantas, como el tratamiento dirigido a las yemas o al fruto.

Una semilla de la planta, de acuerdo con la invención, se puede tratar con una capa protectora de semillas que comprende un compuesto para el tratamiento de las semillas como el captano, carboxina, thiram (TMTD®), metalaxilo (Apron®), pirimifos-metilo (Actellic®) y otros que se usan corrientemente en el tratamiento de las semillas. Es un objetivo adicional de la presente invención el proporcionar elementos de propagación de la planta y, especialmente, semillas tratadas con una capa protectora de las semillas que se usa habitualmente para el tratamiento de las semillas.

Los enfoques anteriores podían utilizar cualquier gen de androesterilidad o de esterilidad femenina para los cuales se podía fabricar un gen restaurador. Otros genes restauradores potenciales se describen en la solicitud de patente europea EP-412 911.

Por consiguiente, la presente invención se puede usar en cualquier planta que se pueda transformar y regenerar para obtener plastas transgénicas en las que la androesterilidad y la esterilidad femenina se pueda controlar mediante la aplicación del ligando químico apropiado. El control de la fertilidad de la planta es particularmente útil para producir semillas híbridas. Para producir semillas híbridas sin contaminar con la propia semilla se deben instaurar métodos de control de la polinización para asegurar la polinización cruzada y no la autopolinización. Esto se consigue usualmente mediante hibridadores mecánicos, genéticos o químicos (HQ). Por ejemplo, la práctica habitual con el maíz es el desespigado mecánico del progenitor femenino (o semilla), lo cual lleva mucho tiempo y es muy trabajoso. En el trigo, el control de la fertilidad mediante medios mecánicos es impracticable a escala de producción de semillas y no se han establecido formas de control de origen genético. El uso de la presente invención para producir semillas híbridas ofrece las ventajas de la fiabilidad, facilidad de uso y control de la fertilidad tanto masculina como femenina.

Las plantas transgénicas que contienen los casetes de expresión de receptor y el casete de expresión diana apropiados se pueden hacer homocigóticas y mantenerse indefinidamente. Para obtener semillas híbridas se cruzan las líneas homocigóticas del progenitor 1 y el progenitor 2. En un ejemplo del uso de la presente invención para producir semillas híbridas, el progenitor 1 se modifica genéticamente para hacerlo androestéril en presencia del ligando químico apropiado mientras que el progenitor 2 se modifica genéticamente para provocarle la esterilidad femenina en presencia del ligando químico apropiado. Tras la aplicación de un ligando químico apropiado, que viene determinado por la elección del dominio de unión a ligando presente en los polipéptidos receptores, la única producción de semillas fructífera será el resultado de fertilizar los óvulos del progenitor 1 con el polen del progenitor 2. En un segundo ejemplo del uso de la presente invención, el progenitor 1 se modifica genéticamente para hacerlo androestéril en ausencia del ligando químico apropiado y el progenitor 2 se modifica genéticamente para tener esterilidad femenina en ausencia del ligando químico. Se aplica el ligando químico apropiado para que cada línea se mantenga mediante autofertilización. Para producir una semilla híbrida, las dos líneas progenitoras se entreplantan y sólo se obtienen semillas híbridas. La fertilidad se restaura en las plantas híbridas de la progenie mediante la introducción de un gen restaurador. Por estos medios se pueden producir cualquier semilla híbrida deseada.

Los siguientes ejemplos describen adicionalmente los materiales y los métodos usados para llevar a cabo la invención y los resultados subsecuentes. Se proporcionan a modo de ilustración y su enumeración no se debe considerar como una limitación de la invención reivindicada.

Ejemplo 1 Construcción de un casete de expresión de receptor expresable en plantas que codifica el receptor de la ecdisona

La región de DNA que codifica el receptor de la ecdisona (EcR) de Drosophila se aisló de una genoteca de cDNA de las pupas Canton S (día 6) preparadas en \lambdagt11 (Clontech, n.º de catálogo IL 1005b) y de fragmentos generados por PCR genómica con oligonucleótidos diseñados a partir de la secuencia publicada para la isoforma B1 del EcR [Koelle et al., Cell 67: 59 (1991)]. La secuencia de la isoforma B1 de EcR se confirmó mediante análisis por secuenciación automática usando los métodos estándar y alineándola con la secuencia publicada [Talbot et al., Cell 73: 1323 (1993)]. La región codificante completa de EcR expresada se modificó para que contuviera el sitio BamHI inmediatamente delante del codón de iniciación mediante el oligonucleótido SF43 (5'-CGC GGA TCC TAA ACA ATG AAG CGG CGC TGG TCG AAC AAC GGC-3') (SEQ ID N.º 1) en una PCR. Los vectores de expresión en plantas pMF6 y pMF7 contienen un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S), un intrón 1 del Adh1 de maíz y una señal de terminación y de poliadenilación de la nopalina sintetasa [véase Goff et al, Genes and Development 5: 298 (1991)]. Los vectores pMF6 y pMF7 se diferencian sólo en la orientación del policonector usado para insertar la secuencia codificante deseada. La secuencia codificante completa de EcR se ligó con el vector pMF6 de expresión de plantas con el CaMV 35S mediante el empleo de los sitios de restricción BamHI flanqueantes. Este casete de expresión de receptor se denominó 35S/EcR.

Ejemplo 2 Construcción de un casete de expresión de receptor expresable en plantas que codifica el receptor ulraespiráculo

El cDNA que codifica el receptor ultraespiráculo (USP) nativo de Drosophila se describe en Henrich et al., Nucleic Acids Research 18: 4143 (1990). La secuencia codificante completa de USP con las regiones flanqueantes 5' y 3' no traducidas se ligó al vector de expresión pMF7 (descrito en el ejemplo 1) usando los sitios de restricción EcoRI flanqueantes. Este casete de expresión de receptor se denominó 35S/USP.

Ejemplo 3 Construcción de un casete de expresión de receptor que tiene el dominio de unión al DNA de GAL4 y el dominio de unión a ligando de EcR

Se construyó un casete de expresión de receptor en el que el dominio de unión al DNA de EcR se reemplazó con el dominio de unión al DNA de GAL4 fusionado del lado amino terminal. El DNA de la región codificante del EcR de Drosophila se obtuvo como se describió en el ejemplo 1. La secuencia codificante del dominio de unión al DNA de GAL4 se subclonó del plásmido pMA20 [Ma y Patashne, Cell 48: 847 (1987)].

Se construyó un casete de expresión de receptor que codificaba un polipéptido receptor quimérico GAL4-EcR mediante la fusión del dominio de unión al DNA de GAL4 con el dominio de unión a ligando y el extremo carboxilo del EcR. Para hacer esta fusión, se usó el oligonucleótido SF23 (5'-CGC GGG ATC CAT GCG GCC GGA ATG CGT CGT CCC G-3') (SEC ID N.º 2) para introducir por PCR un sitio BamHI en la secuencia del cDNA de EcR en la posición de nucleótido equivalente al resto de aminoácido 330 (inmediatamente detrás del dominio de unión al DNA de EcR). La secuencia codificante truncada de EcR resultante (EcR^{330-878}) se subclonó en el plásmido pKS+ (Stratagene).

Se obtuvo un subclón de GAL4 del plásmido pMA210 que contenía la secuencia codificante del dominio de unión al DNA (aminoácidos 1 a 147) subclonando el extremo amino de GAL4 en el sitio ClaI del pSK+ (Stratagene) tal y como se ha descrito previamente [Goff et al., Genes and Development 5: 298 (1991)]. Este plásmido se denominó pSKGAL2, se cortó con ClaI y KpnI y se le insertó el siguiente oligonucleótido bicatenario:

100

El plásmido resultante se denominó pSKGAL2.3. La fusión completa 35S/GAL4-EcR^{330-878} se generó usando los sitios BamHI del policonector que flanquean el dominio de unión al DNA de GAL4 en el pSK+ y el resto EcR^{330-878} en el pKS+. Estas secuencias codificantes se ligaron al vector de expresión en monocotiledóneas pMF6 (descrito en el ejemplo 1) mediante el uso de los sitios de restricción EcoRI flanqueantes. Este casete de expresión de receptor se denominó 35S/GAL4-EcR^{330-878}.

Ejemplo 4 Construcción de un casete de expresión de receptor expresable en plantas que tiene un dominio de unión a ligando de ultraespiráculo y el dominio de transactivación de VP16

Se construyó un casete de expresión de receptor que comprende el dominio de unión al ligando de USP con el dominio de transactivación de VP16 fusionado tanto al extremo amino como al carboxilo del polipéptido USP.

Para construir el casete de expresión de receptor que codifica un polipéptido quimérico que tiene el dominio de transactivación de VP16 en el extremo carboxilo, el extremo carboxilo y el codón de parada del cDNA del receptor USP (descrito en el ejemplo 2) se retiraron al subclonar en el pKS+ (Stratagene) usando el sitio XhoI en la posición 1471 de la secuencia codificante de USP. El subclón de USP resultante, que codifica los aminoácidos 1 a 490, se fusionó con el dominio de transactivación de VP16 usando el sitio de restricción KpnI flanqueante del subclon de USP y el sitio KpnI de pSJT1193CRF3 que codifica los 80 aminoácidos del extremo carboxilo de VP16 [Triezenberg et al., Genes and Development 2: 718-729 (1988)]. La fusión USP-VP16 resultante se clonó en el vector pMF7 de expresión de plantas con el CaMV 35S (descrito en el ejemplo 1) por medio de los sitios de restricción BamHI y EcoRI que flanquean la secuencia codificante de USP-VP16. Este casete de expresión de receptor se denominó 35S/USP-VP16.

El derivado de USP con el dominio de activación transcripcional fusionado en el extremo amino se construyó comenzando por la introducción de un sitio BamHI adyacente al codón de iniciación de USP mediante el oligonucleótido SF42 (5'-CGC GGA TCC ATG GAC AAC TGC GAC CAG GAC-3') (SEQ ID N.º 3) en una PCR. El codón de parada de VP16 se eliminó y se introdujo un sitio BamHI flanqueante mediante el oligonucleótido SF37 (5'-GCG GGA TCC CCC ACC GTA CTC GTC AAT TC-3') (SEQ ID N.º 4) y se introdujo, en el extremo amino, un codón de iniciación con una secuencia consenso para plantas inmediatamente delante del codón de iniciación así como un sitio BamHI mediante el oligonucleótido SA115 (5'-GTC GAG CTC TCG GAT CCT AAA ACA ATG GCC CCC CCG ACC GAT GTC-3') (SEQ ID N.º 5) como cebadores en una PCR. El dominio de activación de VP16 y la secuencia codificante de USP (que codifica los aminoácidos 1 a 507) resultantes se unieron en fase mediante los sitios BamHI adyacentes, y la secuencia codificante VP16-USP se insertó en el vector pMF7 de expresión en plantas con el CaMV 35S mediante los sitios BamHI en 5' y EcoRI en 3'. Este casete de expresión de receptor se denominó 35S/VP16-USP.

Ejemplo 5 Construcción de un casete de expresión de receptor que tiene el dominio de unión al DNA y el dominio de unión a ligando de EcR y el dominio de transactivación de gen regulador C1 de maíz

La fusión EcR^{227-825}-C1 se generó colocando un codón de iniciación inmediatamente antes del dominio de unión al DNA de EcR con el oligonucleótido SF30 (5'CGC-GGA-TCC-ATG-GGT-CGC-GAT-GAT-CTC-TCG-CCT-TC-3') (SEQ ID N.º 8) usado en una PCR sobre la secuencia codificante de EcR completa. La secuencia codificante del dominio de activación transcripcional (aminoácidos 219 a 273) de la proteína C1 de maíz [Golf et al. Genes and Develop. 5: 298-309 (1991)] se fusionó en fase con la secuencia codificante de los aminoácidos 51 a 825 de EcR (en el sitio de restricción KpnI de EcR). El dominio de transactivación de C1 se unió a EcR mediante un policonector que codifica VPGPPSRSRVSISLHA (SEQ ID N.º 9). La fusión 35S/EcR^{227-825}-C1 en el vector de expresión de plantas se construyó mediante la inserción de un fragmento BamHI que lleva la secuencia codificante en el vector pMF7. Este casete de expresión de receptor se denominó 35S/EcR^{227-825}-C1.

Ejemplo 6 Construcción de un casete de expresión de receptor que tiene un dominio de unión al DNA de GAL4, el dominio de unión al ligando de EcR y el dominio de transactivación del gen regulador C1 de maíz

Se construyó una fusión GAL4-EcR^{330-825}-C1 usando la construcción GAL4-EcR^{330-878} descrita en el ejemplo 3 y la construcción EcR^{227-825}-C1 del ejemplo 5. La secuencia de la región codificante de EcR (que comienza en el aminoácido 456) se cambió por un sitio AatII. Este casete de expresión de receptor se denominó 35S/GAL4-EcR^{330-825}-C1.

Ejemplo 7 Construcción de un casete de expresión de receptor expresable en plantas que codifica el receptor X retinoide (RXR)

La isoforma \alpha del receptor del ácido retinoico en ratones se clonó mediante amplificación por PCR de la primera cadena del cDNA de hígado de ratón usando cebadores específicos de la secuencia descrita por Chambon et al. [N.º de acceso en GenBank M84817; Purification, cloning, and RXR identity of the HeLa cell factor with which RAR or TR heterodimerizes to bind target sequences efficiently, Cell 68: 377-395 (1992)]. El fragmento de PCR de RXR\alpha se generó utilizando los oligonucleótidos dT_{30} y SF165 (5'-CGC GGA TCC ATG GAC ACC AAA CAT TTC CT-3') (SEQ ID N.º 12) o SF167 (5'-CGC GGA ATT CTA AAC AAT GGA CAC CAA ACA TTT CCT-3') (SEQ ID N.º 13). Los productos de PCR resultantes se digirieron con NsiI (que corta en la región 3' no traducida del cDNA de RXR amplificado) y un sitio del cebador 5' (BamHI en el caso de SF165 o EcoRI en el caso de SF167), y se subclonó en el pUC21. El cebador SF167 contiene un codón de iniciación consenso para plantas para RXR\alpha. Se generó una secuencia codificante de RXR\alpha mediante la subclonación de la región codificante clonada de RXR\alpha con el codón de inicio consenso para plantas en un vector de expresión con el 35S de CaMV (pMF7) gracias a los sitios de restricción flanqueantes EcoRI en 5' y BglII en 3'. Este casete de expresión se denominó 35S/RXR.

Ejemplo 8 Construcción de un casete de receptor expresable en plantas que codifica el receptor RXR y el dominio de transactivación de VP16

Se construyo un derivado de RXR\alpha con el dominio de activación transcripcional de VP16 fusionado con el extremo amino utilizando el sitio BamHI adyacente a la región codificante de RXR\alpha descrito en el ejemplo 7. Se eliminó el codón de parada en VP16 y se introdujo un sitio flanqueante BamHI tal como se describió más arriba en el ejemplo 4. El dominio de activación de VP16 y la secuencia codificante de RXR\alpha (que codifica los aminoácidos 1 a 468) se unieron en fase mediante los sitios adyacentes BamHI, y la secuencia codificante VP16-RXR\alpha se insertó en el vector pMF7 de expresión en plantas con el 35S de CaMV mediante los sitios flanqueantes EcoRI en 5' y BglII en 3'. Este casete de expresión de receptor se denominó 35S/VP16-RXR.

Ejemplo 9 Construcción de un casete de receptor expresable en plantas que codifica el receptor RXR y el dominio de transactivación del gen regulador C1 de maíz

Se construyo un derivado de RXR\alpha con el dominio de activación transcripcional de C1 fusionado con el extremo carboxilo mediante la eliminación, en primer lugar, del codón de parada de RXR\alpha y la inserción de un sitio de restricción BglII para fusionarlo en fase con C1 usando el oligonucleótido SF170 (5-CGC AGA TCT GGG TGG CTT GAT GTG GTG CCT C-3') (SEQ ID N.º 14) en una reacción de amplificación por PCR junto con el oligonucleótido SF168 (5'-CTC TTC ACT CTT GTG GAG TG-3') (SEQ ID N.º 15) que reconoce una secuencia interna. El fragmento de PCR resultante se digirió por los sitios de restricción BamHI interno y BglII flanqueante, y se clonó en el pUC21 digerido con BamHI y BglII. Este subclón se digirió por los sitios flanqueantes BamHI y NotI, y las secuencias codificantes aminoterminales de RXR\alpha se insertaron para regenerar la secuencia codificante de RXR\alpha intacta con un codón de iniciación consenso para plantas (tal como se describió previamente en el ejemplo 7) y para retirar el codón de parada. El dominio de activación del activador transcripcional C1 del maíz se preparó mediante PCR usando los cebadores oligonucleotídicos SF140 (5'-CGC AGA TCT TGG ACG AGC CGT GCT TCT CCG GC-3') (SEQ ID N.º 18) y el cebador directo universal para secuenciación (5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3') (New England Biolabs Ref n.º 1211; SEQ ID N.º 17) sobre un subclón que contiene el cDNA de C1 [Goff et al., Identification of functional domains in the maize transcriptional activator C1: comparison of wild-type and dominant inhibitor proteins. Genes and Development 5: 298-309 (1991)]. El dominio de activación de C1 resultante (aminoácidos de 234 a 273) y la región no traducida 3' flanqueante se fusionó en fase con la secuencia codificante de RXR\alpha a través del sitio BglII que hay tras la secuencia codificante de RXR\alpha y el sitio BglII que precede al dominio de activación transcripcional de C1. Esta secuencia codificante híbrida RXR\alpha-C1 se insertó en el vector pMF7 de expresión en plantas con el 35S del CaMV usando los sitios EcoRI flanqueantes en 5' y 3'. Este casete de expresión de receptor se denominó 35S/RXR-C1.

Ejemplo 10 Construcción de un casete de expresión diana expresable en plantas que codifica la luciferasa de luciérnaga y que tiene el elemento de respuesta del dominio de unión al DNA de GAL4

El casete de expresión diana expresable en plantas que codifica la luciferasa de luciérnaga y que tiene el elemento de respuesta del dominio de unión al DNA de GAL4 se construyó de la siguiente manera. El núcleo del promotor de Bronze-18 (Bz1) que dirige la síntesis de la luciferasa de luciérnaga se eliminó del delator de Bz1 en pBz1LucR98 [Roth et al., Plant Cell 3: 317 (1991)] mediante los sitios NheI y SphI y se colocó en un plásmido derivado del pUC6S que lleva el gen de la luciferasa. El núcleo del promotor de Bz1 modificado contiene un sitio NheI () y la secuencia del promotor de Bz1 hasta el nucleótido en posición -53 [Roth et al., Plant Cell 3: 317 (1991)]. Se retiraron 10 sitios de unión a GAL4 del delator regulado por GAL4 en pGALLuc2 [Goff et al., Genes and Development 5: 298 (1991)] mediante la digestión con EcoRI y PstI y se insertaron en el pBlueScript (Stratagene) usando los mismos sitios de enzimas de restricción. El sitio HindIII del extremo 5' de los sitios de unión a GAL4 se cambió a BamHI mediante la inserción de un adaptador HindIII/BamHI/HindIII y el fragmento BamHI resultante que contiene los sitios de unión de GAL4 se retiraron y se colocaron en un sitio BglII hacia 5' del núcleo del promotor de Bz1 con el que se transcribe la luciferasa. Este casete de expresión diana se denominó (GAL4_{b.s.})_{10}-Bz1_{TATA}/Luc.

Ejemplo 11 Construcción de un casete de expresión diana expresable en plantas que codifica la luciferasa de luciérnaga y que tiene el elemento de respuesta del dominio de unión al DNA de EcR

El casete de expresión diana expresable en plantas que codifica la luciferasa de luciérnaga y que tiene el elemento de respuesta del dominio de unión al DNA de EcR (EcRE) se construyó; de la siguiente manera. La construcción con núcleo del promotor de Bz1 de maíz-luciferasa en el plásmido derivado del pUC6S, tal como se describió en el ejemplo 7, se usó como punto de partida. Los oligonucleótidos bicatenarios sintéticos que contenían el elemento de respuesta de hsp27 de Drosophila que se complementa con el dominio de unión al DNA de EcR se construyeron con extremos cohesivos BamHI y BglII (SF25, SEQ ID N.º 6: 5'-GAT CCG ACA AGG GTT CAA TGC ACT TGT CA-3') (SF26, SEQ ID N.º 7: 5'-GAT CTG ACA AGT GCA TTG AAC CCT TGT CG-3') fosforilados y ligados hacia 5' del núcleo del promotor de Bz1 mediante la inserción en un sitio BglII único. Se obtuvieron múltiples copias del elemento de respuesta mediante digestión secuencial con BglII y la inserción de oligonucleótidos bicatenarios adicionales. Este casete de expresión diana se denomina (EcRE)_{5}-Bz1/Luc, (EcRE)_{6}-Bz1/Luc o (EcRE)_{8}-Bz1/Luc dependiendo del número de elementos de respuesta palindrómicos completos contenidos en la región promotora (5, 6 y 8, respectivamente).

Ejemplo 12 Transformación de células vegetales y control de la expresión del polipéptido diana mediante polipéptidos receptores en presencia de un ligando químico

Se puede demostrar el control de la expresión del polipéptido diana mediante varios polipéptidos receptores, que incluyen los polipéptidos receptores quiméricos de la presente invención, mediante la transformación simultánea de células vegetales con las construcciones génicas necesarias mediante el bombardeo con microproyectiles a gran velocidad, seguido de un ensayo bioquímico que detecte la presencia del polipéptido diana. Las construcciones génicas necesarias comprenden un primer casete de expresión de receptor que codifica un primer polipéptido receptor y un segundo casete de expresión de receptor que codifica un segundo polipéptido receptor. Adicionalmente, también es necesario un casete de expresión diana que codifica un polipéptido diana (Figura 1).

Los casetes de expresión se introdujeron simultáneamente en las células de maíz suspendidas y cultivadas en medio N6 líquido [Chu et al., Stientia Sinica XVIII: 659-668 (1975)] mediante bombardeo con microproyectiles a gran velocidad usando técnicas estándares de precipitación de DNA sobre microproyectiles y bombardeo a gran velocidad impulsado por helio comprimido (PDS-1000/He, BioRad, Hercules, CA). Las células transfectadas se incubaron en una suspensión líquida en presencia del ligando químico apropiado durante 48 horas aproximadamente en el medio N6. Tras la incubación, las células transformadas se recogieron y luego se homogeneízan a 0ºC. Los residuos presentes en los extractos se retiran por centrifugación a 10 000g a 4ºC durante 5 minutos.

La expresión del polipéptido diana se detectó ensayando la presencia del producto codificado por el casete de expresión diana en el extracto. La luciferasa de luciérnaga es una secuencia codificante usada corrientemente para detectar el polipéptido diana cuando se ensaya el control de la expresión realizado por los polipéptidos receptores en presencia de un ligando químico. La actividad de la luciferasa de luciérnaga se determina cuantificando la quimioluminiscencia producida por la reacción catalizada por la luciferasa en la que la luciferina se fosforila usando ATP como sustrato (Promega Luciferase Kit, n.º de catálogo E1500) en un luminómetro Analytical Luminiscence Model 2001.

Ejemplo 13 Los polipéptidos receptores EcR y USP activan la expresión de un polipéptido diana en las células vegetales

Utilizando el método de transformación del ejemplo 12, se contransformaron en las células de maíz el casete de expresión de receptor 35S/EcR (ejemplo 1), el casete de expresión de receptor 35S/USP (ejemplo 2) y el casete de expresión diana (EcRE)_{5}-Bz1/Luc (ejemplo 11) (véase figura 2). Las células transformadas se incubaron en presencia de los ligandos químicos tebufenocida a 10 \muM o muristerona a 2 \muM durante 48 horas aproximadamente. Los ensayos de la luciferasa se realizaron como se describió en el ejemplo 12. Los resultados se presentan en la tabla 1.

TABLA 1

1

Los resultados anteriores demuestran que la región reguladora en 5' del casete de expresión diana que comprende los elementos de respuesta a EcR se puede activar en las células vegetales mediante los polipéptidos receptores EcR y USP en presencia de un ligando químico complementario. El nivel de expresión del polipéptido diana luciferasa estuvo entre 2 y 3 veces por encima del observado en ausencia de ligando químico.

Ejemplo 14 Los polipéptidos receptores VP16-USP y EcR activan la expresión de un polipéptido diana en las células vegetales

Utilizando el método de transformación del ejemplo 12 se contransformaron en células de maíz el casete de expresión de receptor 35S/EcR (ejemplo 1), el casete de expresión de receptor 35S/VP16-USP (ejemplo 4) y el casete de expresión diana (EcRE)_{6}-Bz1/Luc (ejemplo 11). Las células transformadas se incubaron en presencia de los ligandos químicos ecdisona a 1 \muM, tebufenocida 10 \muM o muristerona a 2 \muM durante 48 horas. Los ensayos de la luciferasa se realizaron como se describe en el ejemplo 12. Los resultados se presentan en la tabla 2.

TABLA 2

2

Los resultados anteriores demuestran que la región reguladora en 5' del casete de expresión diana que comprende los elementos de respuesta a EcR se puede activar en las células vegetales mediante el polipéptido receptor EcR y el polipéptido receptor quimérico VP16-USP en presencia de un ligando químico complementario. El nivel de expresión del polipéptido diana luciferasa estuvo entre 2 y 3 veces por encima del observado en ausencia de ligando químico.

Ejemplo 15 Los polipéptidos receptores EcR^{227-825} y USP activan la expresión de un polipéptido diana en las células vegetales

Utilizando el método de transformación del ejemplo 12 se contransformaron en células de maíz el casete de expresión de receptor 35S/USP (ejemplo 2), el casete de expresión de receptor 35S/EcR^{227-825}-C1 (ejemplo 5) y el casete de expresión diana (EcRE)_{6}-Bz1/Luc (ejemplo 8). Las células transformadas se incubaron en presencia de tebufenocida a 10 \muM como ligando químico durante 48 horas. Los ensayos de la luciferasa se realizaron como se describe en el ejemplo 12. Los resultados se presentan en la tabla 3.

TABLA 3

3

Los resultados anteriores demuestran que la región reguladora en 5' del casete de expresión diana que comprende los elementos de respuesta a EcR se puede activar en las células vegetales mediante el polipéptido receptor USP y el polipéptido receptor quimérico EcR^{227-825}-C1 en presencia de un ligando químico complementario. El polipéptido receptor quimérico utiliza el dominio de transactivación del gen regulador C1 del maíz fusionado con el extremo carboxilo de un EcR truncado, en el que el truncamiento ha retirado el dominio de transactivación de EcR. El nivel de expresión del polipéptido diana luciferasa fue más de 2 veces superior al observado en ausencia del ligando químico.

Ejemplo 16 La activación de un casete de expresión diana en células vegetales se potencia con el uso de un polipéptido receptor quimérico que tenga un dominio de transactivación fuerte

Utilizando el método de transformación del ejemplo 12 se contransformaron en células de maíz el casete de expresión de receptor 35S/GAL4-EcR^{330-878} (ejemplo 3), el casete de expresión de receptor 35S/USP-VP16 (ejemplo 4) y el casete de expresión diana (GAL4)_{10}-Bz1/Luc (ejemplo 10) (Figura 3). Las células transformadas se incubaron en presencia de tebufenocida a 10 \muM como ligando químico durante 48 horas aproximadamente. Los ensayos de la luciferasa se realizaron como se describe en el ejemplo 12. Los resultados se presentan en la tabla 4.

TABLA 4

4

Los resultados anteriores demuestran que la región reguladora en 5' del casete de expresión diana que comprende los elementos de respuesta a GAL4 se puede activar en las células vegetales mediante los polipéptidos receptores GAL4-EcR^{330-878} y USP-VP16 en presencia de un ligando químico complementario. El nivel de expresión del polipéptido diana luciferasa fue 36 veces superior al observado en ausencia del ligando químico. Esto indica 1) que el polipéptido receptor quimérico se unía a los elementos de respuesta a GAL4 del casete de expresión diana, 2) que la tebufenocida se unía al dominio de unión al ligando de la parte EcR^{330-878} del polipéptido receptor quimérico, 3) que los dos polipéptidos receptores quiméricos se heterodimerizan correctamente, y 4) que la heterodimerización colocó el dominio de transactivación de VP16 en posición para activar.

Ejemplo 17 Activación del casete de expresión diana en células vegetales usando un polipéptido receptor quimérico de EcR y un derivado de RXR que tiene un dominio de transactivación fuerte

Utilizando el método de transformación del ejemplo 12 se contransformaron en células de maíz el casete de expresión de receptor 35S/GAL4-EcR^{330-878} (ejemplo 3), el casete de expresión de receptor 35S/VP16-RXR (ejemplo 8) y el casete de expresión diana (GAL4)_{10}-Bz1/Luc (ejemplo 10) (Figura 3). Las células transformadas se incubaron en presencia de tebufenocida a 10 \muM como ligando químico durante 48 horas aproximadamente. Los ensayos de la luciferasa se realizaron como se describe en el ejemplo 12. Los resultados se presentan en la tabla 5.

TABLA 5

5

Los resultados anteriores demuestran que la región reguladora en 5' del casete de expresión diana que comprende los elementos de respuesta a GAL4 se puede activar en las células vegetales mediante los polipéptidos receptores GAL4-EcR^{330-878} y VP16-RXR en presencia de un ligando químico complementario. El nivel de expresión del polipéptido diana luciferasa fue 27 veces superior al observado en ausencia del ligando químico. Esto indica 1) que el polipéptido receptor quimérico se unía a los elementos de respuesta a GAL4 del casete de expresión diana, 2) que la tebufenocida se unía al dominio de unión a ligando de la parte EcR^{330-878} del polipéptido receptor quimérico, 3) que los dos polipéptidos receptores quiméricos se heterodimerizan correctamente, y 4) que la heterodimerización colocó el dominio de transactivación de VP16 en posición para activar.

Ejemplo 18 Se puede usar un dominio de transactivación en cada polipéptido receptor quimérico

Utilizando el método de transformación del ejemplo 12 se contransformaron en células de maíz el casete de expresión de receptor 35S/GAL4-EcR^{330-825}-C1 (ejemplo 6), los casetes de expresión de receptor 35S/USP-VP16, 35S/VP16-USP (ejemplo 4), 35S/VP16-RXR (ejemplo 8) o 35S/RXR-C1 (ejemplo 9), y el casete de expresión diana (GAL4)_{10}-Bz1/Luc (ejemplo 10). Las células transformadas se incubaron en presencia de tebufenocida a 10 \muM como ligando químico durante 48 horas aproximadamente. Los ensayos de la luciferasa se realizaron como se describe en el ejemplo 12. Los resultados se presentan en la tabla 6.

TABLA 6

6

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Los resultados anteriores demuestran que la región reguladora en 5' del casete de expresión diana (GAL4)_{10}-Bz1/Luc que comprende los elementos de respuesta a GAL4 se puede activar en las células vegetales mediante los polipéptidos receptores 35S/GAL4-EcR^{330-825}-C1 y 35S/VP16-USP, 35S/USP-VP16, 35S/VP16-RXR o 35S/RXR-C1 en presencia de un ligando químico complementario. La expresión del polipéptido diana se aumentó entre unas pocas veces y más de 50 veces por la presencia del ligando.

Ejemplo 19 Aislamiento de mutantes del polipéptido receptor con menor actividad basal

Las mutaciones en el dominio de unión del ligando tanto del receptor de la ecdisona (EcR) como del receptor ultraespiráculo (USP) se generaron in vitro mediante mutagénesis por PCR tal como describe Leung [Leung et al., Technique 1: 11-15 (1989)]. Los fragmentos de PCR del dominio de unión al ligando del EcR mutado se clonaron en un vector de expresión de levaduras en forma de fusión con el dominio de unión al DNA de GAL4 de levaduras. Los fragmentos de PCR del dominio de unión al ligando del USP mutados se clonaron en un vector de expresión de levaduras como una fusión con el dominio de activación transcripcional de VP16. Las construcciones mutantes se transformaron en la cepa de levaduras con el delator de GAL4 GGY1::171. Las construcciones mutantes GAL3-EcR se transformaron en combinación con el VP16-USP sin mutar, y las construcciones mutantes USP-VP16 se transformaron en combinación con el GAL4-EcR^{330-825}-C1 sin mutar. Los transformantes de levadura se plaquearon sobre un medio que contenía el indicador X-Gal. Los mutantes que tenían un menor nivel basal de actividad del polipéptido receptor en forma de heterodímero generaron colonias entre blancas y azul claro sobre las placas con el indicador X-Gal, mientras que los heterodímeros de polipéptido receptor sin mutagenizar generaron colonias azul oscuro. Se ensayó el nivel de actividad del polipéptido receptor inducido por un ligando químico o basal en las colonias entre blanco y azul claro haciendo crecer las células de levadura representativas de las colonias seleccionadas en un medio sintético (medio S) que contiene glicerol, etanol y galactosa como fuentes de carbono. El cultivo resultante se dividió en dos partes, una de las cuales se trató con un ligando químico apropiado y la otra se usó como un control en ausencia del ligando químico. Tras la exposición al ligando químico, se ensayó la actividad \beta-galactosidasa tanto la parte del cultivo tratada como la control de acuerdo con el procedimiento de Miller [Experiments in Molecular Genetics, pp. 352-355, J. H. Miller, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1972)]. Las secuencias nucleotídicas que codifican los polipéptidos receptores mutantes aislados e identificados mediante esta técnica fueron candidatos para pruebas adicionales ya que podían exhibir, en células vegetales, una actividad basal menor y una mayor inducción de la expresión del gen diana en presencia del ligando químico.

Ejemplo 20 Aislamiento de mutantes del polipéptido receptor que tienen menor interacción basal

Se ha descrito que las mutaciones en la región de interacción proteína-proteína de la novena repetición de la heptada del dominio de unión del ligando del receptor de la hormona tiroidea y del receptor del ácido retinoico muestran una mayor dependencia del ligando para heterodimerizar con su compañero habitual RXR [Au-Fliegner et al., Mol Cell Biol. 13: 5725 (1993)]. Tales mutaciones en la región conservada de la novena repetición de la heptada de EcR no se ha probado, pero podría ser capaz de aumentar la activación transcripcional dependiente del ligando. Para determinar si una mutación en la novena repetición de la heptada de EcR conduciría a una mayor activación transcripcional dependiente del ligando, la leucina de la posición 617 en el EcR se cambió por una arginina mediante mutagénesis dirigida con el oligonucleótido SF197 (5'-TTC TAC GCA AAG CGC CTC TCG ATC CTC-3') (SEQ ID N.º 16). La secuencia codificante alterada resultante se reconstruyó en un derivado expresado GAL4-EcR-C1 tal como se describe en el ejemplo 6. Este casete de expresión de receptor se denomina 35S/GAL4-EcR(L617R)-C1.

Ejemplo 21 Identificación de polipéptidos receptores mutantes cuya función en las células vegetales está mejorada

Los casetes de expresión de receptor que codifican los polipéptidos receptores mutados de EcR o USP de los ejemplos 19 y 20 se prepararon de acuerdo con los anteriores ejemplos 1 hasta 9. Con estos casetes de expresión de receptor, en combinación con uno de los casetes de expresión diana de los ejemplos 10 y 11, se transformaron células vegetales de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 12. Se probó la activación de la región reguladora 5' del casete de expresión diana mediante los polipéptidos receptores mutantes en presencia del ligando químico adecuado en las células vegetales transformadas. Los resultados se presentan en la tabla 7.

7

Estos resultados demuestran que las mutaciones dentro de los dominios de unión al ligando de los receptores EcR o USP puede dar lugar a receptores con la expresión de un polipéptido diana dependiente de ligando aumentada.

Ejemplo 22 Construcción de vectores para transformar plantas de Arabidopsis que expresan derivados de EcR, USP o RXR y llevan un delator regulado por el receptor

Los vectores plasmídicos con T-DNA de Agrobacterium se construyeron a partir de los plásmidos previamente descritos pGPTV-Kan y pGPTV-Hyg [Becker et al., Plant. Mol. Biol. 20: 1195-1197 (1992)]. El gen delator uidA (GUS) SacI/HindIII de ambos plásmidos pGPTV-Kan y pGPTV-Hyg se reemplazó con el policonector SacI/HindIII de pGEM4Zf(+), pSORT1, pBluescriptKS(+), pIC20H o pUC18 para dar los plásmidos pSGCFW, pSGCFX, pSGCFY, pSGCFZ, pSGCGA, pSGCGC, pSGCGE, pSGCGF y pSGCGG, respectivamente. Como casete de expresión diana se construyó un delator de luciferasa regulado por GAL4 como un plásmido con T-DNA de Agrobacterium subclonando en primer lugar un fragmento KpnI/HindIII de 328 pb con 10 sitios de unión para GAL4 y una TATA de Bronze-1 de maíz, tal y como se describió en el ejemplo 10, en los sitios KpnI/HindIII del plásmido con la luciferasa delatora modificada pSPLuc+ (Promega) para crear el plásmido pSGCFO1. Un fragmento KpnI/XbaI de 1991 kpb de pSGCFO1, que contiene los sitios de unión de GAL4, la TATA de Bz1 y la luciferasa delatora, se subclonó en el vector con T-DNA mediante la ligación con un fragmento NdeI/SpeI de 7194 kpb de pSGCFX1 y un fragmento NdeI/KpnI de 4111 kpb de pSGCFZ1 descritos antes. El plásmido resultante se denominó pSGCGL1 y lleva un marcador de selección NPTII transcrito por un promotor nos que confiere resistencia a kanamicina en la planta transgénica, y una luciferasa delatora regulada por GAL4. El GUS delator regulado por GAL4 con 10 sitios de unión para GAL4, una región TATA de 35S y una región codificante de GUS se construyó de manera similar y se denominó pAT86. Un delator con el elemento de respuesta de repeticiones directas (DR) con 3 copias del elemento de respuesta DR, una TATA de Bz1, una región que codifica la luciferasa y un terminador nos se introdujo de una manera similar a la descrita para pSGCGL1, y se denominó pSGCHU1. Los casetes de expresión de receptor descritos en los ejemplos 3 a 9 anteriores se usaron para construir construcciones con T-DNA de Agrobacterium análogas que portaran el promotor 35S del CaMV y las señales de poliadenilación de nos.

Ejemplo 23 Generación de Arabidopsis transgénicas que expresan un derivado de EcR y USP (o RXR) y llevan un delator de luciferasa regulado

Se transformó Arabidopsis thaliana (Columbia) con vectores de Agrobacterium que portaban un delator de luciferasa regulado por ligando y derivados de los casetes de expresión de receptor apropiados mediante el siguiente procedimiento de infiltración al vacío. Se prepararon células de Agrobacterium GV3101 electrocompetentes incubando los Agrobacterium GV3101 en el medio YT 2X a 28ºC con aireación durante 24 a 30 horas hasta alcanzar una DO_{600} entre 0,5 y 0,7 unidades. Las células se enfriaron en hielo durante 10 a 30 minutos y se centrifugaron a 5000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se descartó y el sedimento de células se respuspendió en 1 volumen de glicerol al 10% enfriado en hielo. Las células se centrifugaron de nuevo a 5000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se descartó y el sedimento de células se respuspendió en 0,05 volúmenes de glicerol al 10% enfriado en hielo. Las células se centrifugaron de nuevo a 5000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se descartó y el sedimento de células se respuspendió en 0,02 volúmenes de glicerol al 10% enfriado en hielo. Las células se centrifugaron de nuevo a 5000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se descartó y el sedimento de células se respuspendió en 0,02 volúmenes de glicerol al 10% enfriado en hielo. Las células se centrifugaron de nuevo a 5000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se descartó y el sedimento de células se respuspendió en 0,01 volúmenes de glicerol al 10% enfriado en hielo. Se hicieron alícuotas de 200 \mul de células en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, se congelaron rápidamente en N_{2} líquido y se almacenaron a -80ºC. Las células electrocompetentes congeladas se descongelaron en hielo y se transfirieron 40 \mul a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml preenfriado. Se añadió 1 \mul del DNA plasmídico de Agrobacterium adecuado (entre 2 y 10 ng) a las células descongeladas y se mezcló en hielo. La mezcla de plásmido y células se transfirió a una cubeta de electroporación de BioRad de 0,2 cm preenfriada y se electroporó a 2,0 kV, 600 \Omega y 25 \muF con una constante de tiempo de 6 ms. Se añadió 1 ml del medio YT 2X a la cubeta de electroporación, se mezcló la solución de células y plásmido con la punta de la pipeta y el contenido se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml nuevo. Se incubaron las células a 37ºC durante 1 hora en un agitador a 2000 rpm. Las células se centrifugaron durante 2 minutos en una microcentrífuga Eppendorf de velocidad ajustable en grupos de 6, se decantó el sobrenadante y el sedimento de células se resuspendió en el líquido remanente. Las células resuspendidas se sembraron en una placa con medio LB que contenía kanamicina. Las placas se incubaron a 28 ó 30ºC durante 2 ó 3 días. Se inocularon 50 ml de cultivo de LB con una colonia transformada aislada en un matraz de 250 ml con rifampicina a 100 \mug/ml, gentamicina a 25 \mug/ml y kanamicina a 100 \mug/ml. El cultivo se incubó entre 24 y 36 horas a 28ºC y 250 rpm, y se usaron 10 ml del cultivo para inocular 500 ml de LB + antibióticos en un matraz de 2 litros. Este cultivo se incubó durante la noche a 28ºC con agitación a 250 rpm. El DNA plasmídico se aisló de este cultivo de Agrobacterium y se verificó mediante análisis de restricción.

Las plantas de Arabidopsis se cultivaron en una tierra cubierta por una malla en macetas de plástico cuadradas de 7,62 cm en un fitotrón programado para 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad a 20ºC durante 4 ó 5 semanas. Las plantas se dejaron crecer hasta que el meristemo floral medía unos 5,08 cm de alto. Los meristemos florales de las plantas de Arabidopsis que había que transformar se retiraron dos días antes de exponerlos al Agrobacterium. El cultivo de Agrobacterium se centrifugó a 5000 rpm durante 5 minutos y el sedimento resultante se resuspendió en 500 ml de medio de infiltración (4,3 g de sales MS por litro, sacarosa al 5%, bencilaminopurina a 0,01 mg/ml, Silwet L77 a 100 ml/l, pH 5,8). Las plantas de Arabidopsis se empaparon en agua para saturar la tierra. Se transfirieron 500 ml de la suspensión celular de bacterias al fondo de un desecador de vacío estéril y las plantas de Arabidopsis en sus macetas se colocaron boca abajo en la solución de Agrobacterium. Se aplicó el vacío en el desecador durante 5 minutos y luego se liberó lentamente. Este tratamiento con vacío se repitió tres veces, las plantas se lavaron para eliminar el exceso de Agrobacterium y se devolvieron a la cámara de cultivo. Las plantas infiltradas al vacío se dejaron madurar, florecer y producir semillas. Las semillas resultantes se secaron en un cuarto de secado con baja humedad a 35ºC durante 5 ó 10 días aproximadamente. Las semillas se retiraron de las flores secas por aplastamiento, luego se filtraron por una criba de malla de 425 \mum. Se esterilizaron aproximadamente 240 mg de semillas mediante la adición de 1 ml de etanol al 70%, se mezcló en vórtex minuciosamente y se incubó durante 2 minutos a temperatura ambiente. Las semillas se centrifugaron brevemente a gran velocidad en una microcentrífuga Eppendorf y el sobrenadante se eliminó. Las semillas sedimentadas se resuspendieron en 1 ml de tampón de esterilización (1 parte de tritón X-100 al 10%, 10 partes de lejía y 20 partes de agua bidestilada), se mezclaron con vórtex y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las semillas se centrifugaron brevemente a gran velocidad en una microcentrífuga Eppendorf y el sobrenadante se decantó. Las semillas se resuspendieron en 1 ml de agua bidestilada, se mezclaron con vórtex, se centrifugaron a gran velocidad en una microcentrífuga y el sobrenadante se retiró. Esta etapa de lavado se repitió tres veces y luego las semillas se transfirieron a un tubo de centrífuga de 50 ml para un lavado final en 5 ml de agua bidestilada. Las semillas se centrifugaron brevemente a la máxima velocidad en una centrífuga de sobremesa Beckman. El sobrenadante se decantó y las semillas se resuspendieron en 24 ml de agarosa LMP (de bajo punto de fusión) al 0,8% a 50ºC, se mezclaron y 8 ml se hicieron alícuotas en tres placas de GM de 150 mm que contenían el antibiótico para la selección (bien kanamicina a 50 \mug/ml o bien higromicina a 50 \mug/ml) y carbenicilina a 500 \mug/ml. Las semillas plaqueadas se incubaron a 4ºC en la oscuridad durante 24 h, luego a 20ºC con un ciclo diario de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Los almácigos germinados se seleccionaron sobre placas durante 5 ó 10 días, las plántulas se trasplantaron a nuevas placas de selección y se trasplantaron a tierra unos 5 ó 10 días después de la selección. Las plántulas recién trasplantadas se cubrieron con un envoltorio de plástico durante 2 ó 3 días y luego se dejaron crecer hasta el inicio de los meristemos florales.

Ejemplo 24 Aumento de la progenie de las plantas transgénicas

Las plantas de Arabidopsis thaliana (Columbia) transformadas preparadas en el ejemplo 23 se hicieron crecer en tierra cubierta por una malla en macetas de plástico cuadradas de de 7,62 cm en un fitotroón programado con 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad y 20ºC durante 4 ó 5 semanas. Las plantas contienen el DNA foráneo integrado en su genoma en la forma de los casetes de expresión diana y de receptor de acuerdo con la invención. Dicho DNA integrado se transfiere de una generación a otra de la planta mediante el proceso de fertilización como consecuencia del cliclo de vida de la planta transformada.

La fertilización es un procedimiento por el cual el gametofito masculino y los tejidos esporofítico o gametofítico femenino interactúan para conseguir una producción satisfactoria de un cigoto. Los granos de polen maduros se producen en las anteras de la flor y se depositan sobre la superficie del estigma (polinización), donde se hidrata y germina para producir un tubo polínico. Las células espermáticas en el tubo polínico se dirigen al saco embrionario presente en el ovario (gineceo) donde tienen lugar los verdaderos episodios de la fertilización (fusión de los gametos) para producir el cigoto. El cigoto, en la forma de una semilla, es la realización de la siguiente generación de una línea vegetal. La siguiente generación se denomina la "progenie" de la planta transformada.

La progenie se puede formar por autofertilización, en la que el gametofito masculino y el tejido gametofítico femenino proceden de la misma planta. Esto quiere decir que una única planta es la fuente del DNA genómico para la siguiente generación. Alternativamente, la progenie se puede producir por fertilización cruzada de dos plantas separadas al poner en contacto el gametofito masculino de una planta con los tejidos esporofíticos femeninos de otra planta distinta para producir la siguiente generación de plantas. En este caso, el DNA genómico de la progenie se deriva de dos plantas distintas. Además, cuando una planta transformada se fertiliza de forma cruzada con una planta no transformada, el DNA genómico de la progenie se compone de una DNA genómico transgénico de una planta y un DNA genómico no transgénico de una planta diferente. Sin tener en cuenta si la progenie de la planta transformada se produce por autofertilización o fertilización cruzada, parte de la progenie recibirá una contribución genética desigual debido a la presencia del DNA foráneo integrado en el genoma. Esta contribución genética desigual se puede averiguar usando las técnicas de genética clásica y biología molecular.

Para producir la siguiente generación de plantas que contienen los casetes de expresión diana y de receptor de acuerdo con la invención, las plantas transformadas originales se dejan madurar, florecer y producir semillas en condiciones medioambientales controladas. Las semillas resultantes se secan posteriormente en un cuarto de secado con baja humedad a 35ºC durante 5 ó 10 días, aproximadamente. Las semillas se retiran de las flores secas aplastando las silicuas y luego filtrando a través de una criba de malla de 425 \mum para separar las semillas de otro material vegetal. Las semillas se pueden utilizar para criar más generaciones de plantas.

Este procedimiento de producir una siguiente generación de plantas transformadas, aunque se ha descrito para Arabidopsis, se puede aplicar a todas las angiospermas que tienen integrado en su genoma los casetes de expresión diana y de receptor de acuerdo con la invención.

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Todas las publicaciones y patentes mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la técnica a los que pertenece esta invención.

Aunque la anterior invención se ha descrito con cierto detalle por medio de dibujos y ejemplos con el propósito de facilitar su comprensión, resultará obvio que se pueden practicar ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

1) Información general:

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i): Solicitante:

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A): Nombre: Ciba-Geigy AG

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B): Calle: Klybeckstr. 141

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C): Ciudad: Basilea

\vskip0.500000\baselineskip

E): País: Suiza

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F): Código postal (zip): 4002

\vskip0.500000\baselineskip

G): Teléfono: +41 61 69 11 11

\vskip0.500000\baselineskip

H): Fax: +41 61 696 79 76

\vskip0.500000\baselineskip

I): Télex: 962 991

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Título de la invención: Control de la expresión génica en plantas mediante transactivación mediada por receptor en presencia de un ligando químico

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Número de secuencias: 18

\vskip0.800000\baselineskip

iv): Formulario legible por ordenador:

\vskip0.500000\baselineskip

A): Soporte: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

B): Ordenador: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

C): Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

D): Programa: Patente a liberar n.º 1.0, versión n.º 1.30B

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 1:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF43"

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Hipotético: no

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGATCCT AAACAATGAA GCGGCGCTGG TCGAACAACG GC

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 2:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF23"

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Hipotético: no

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGATCC ATGCGGCCGG AATGCGTCGT CCCG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 3:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF42"

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Hipotético: no

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGATCCA TGGACAACTG CGACCAGGAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 4:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF37"

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Hipotético: no

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGGATCCC CCACCGTACT CGTCAATTC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 5:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SA115"

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Hipotético: no

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCGAGCTCT CGGATCCTAA AACAATGGCC CCCCCGACCG ATGTC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 6:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF25"

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Hipotético: no

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCCGACAA GGGTTCAATG CACTTGTCA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 7:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF26"

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Hipotético: no

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCTGACAA GTGCATTGAA CCCTTGTCG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 8:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF30"

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Hipotético: no

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGATCCA TGGGTCGCGA TGATCTCTCG CCTTC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 9:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 11 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Hipotético: no

\vskip0.800000\baselineskip

ix): Rasgos distintivos

\vskip0.500000\baselineskip

A): Nombre/clave: rasgo misceláneo

\vskip0.500000\baselineskip

B): Localización: 1..11

\vskip0.500000\baselineskip

C): Otra información: /nota = "policonector usado para unir el dominio de transactivación de C1 a EcR"

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

VGSRSRVSSH A

\hfill

11

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 10:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "cadena positiva del oligonucleótido usado para crear pSKGAL2.3"

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Hipotético: no

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGGGATCC TAAGTAAGTA AGGTAC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 11:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "cadena complementaria del oligonucleótido usado para crear pSKGAL2.3"

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Hipotético: no

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTACTTACT TAGGATCCCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 12:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF165"

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGATCCA TGGACACCAA ACATTTCCT

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 13:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF167"

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGAATTC TAAACAATGG ACACCAAACA TTTCCT

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 14:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF170"

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCAGATCTG GGTGGCTTGA TGTGGTGCCT C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 15:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF168"

\vskip0.800000\baselineskip

iii): Hipotético: no

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTTCACTC TTGTGGAGTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 16:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF197"

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTACGCAA AGCGCCTCTC GATCCTC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 17:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido NEB1211"

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAAACGAC GGCCAGT

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

2) Información para la SEQ ID N.º 18:

\vskip0.800000\baselineskip

i): Características de la secuencia

\vskip0.500000\baselineskip

A): Longitud: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

B): Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

C): Catenariedad: simple

\vskip0.500000\baselineskip

D): Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

ii): Tipo de molécula: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

A): Descripción: /des = "oligonucleótido SF140"

\vskip0.800000\baselineskip

xi): Descripción de la secuencia: SEQ ID N.º 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCAGATCTT GGACGAGCCG TGCTTCTCCG GC

\hfill

32

Claims

1. Una célula vegetal o planta transgénica y la progenie de la misma que comprende:

a) un primer casete de expresión de receptor que codifica un primer polipéptido receptor de clase II de la familia de receptores nucleares de hormonas esteroideas y tiroideas que comprende un primer dominio de unión a ligando;

b) un segundo casete de expresión de receptor que codifica un segundo polipéptido receptor de clase II de la familia de receptores nucleares de hormonas esteroideas y tiroideas que comprende un segundo dominio de unión a ligando; y

c) un casete de expresión diana que codifica un polipéptido diana.

2. Una célula vegetal o planta de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el casete de expresión diana codifica un polipéptido diana que interfiere con la fertilidad de la planta.

3. Un método para producir una célula vegetal o planta de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende transformar una célula vegetal o una planta con

c) un casete de expresión diana que codifica un polipéptido diana.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, que adicionalmente comprende obtener progenie de las células vegetales o plantas transformadas con dichos casetes de expresión.

5. La planta de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha planta es maíz.

6. La planta de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha planta es trigo.

7. Un método para controlar la expresión génica en una planta de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

a) expresar los mencionados primer y segundo polipéptidos receptores en dicha planta; y

b) poner en contacto dicha planta con uno o más ligandos químicos que son complementarios al dominio de unión a ligando de dichos primer y segundo polipéptidos receptores por lo cual dichos polipéptidos receptores, en presencia de dicho ligando químico, activan la expresión de dicho polipéptido diana.

8. El método de las reivindicación 7, en el que dicho primer polipéptido receptor es el receptor de la ecdisona

9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho primer polipéptido receptor comprende además un dominio de transactivación heterólogo.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicho dominio de transactivación heterólogo es el dominio de transactivación del gen regulador C1 de maíz.

11. El método de la reivindicación 8, en el que dicho primer polipéptido receptor comprende además un dominio de unión al DNA heterólogo.

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicho dominio de unión al DNA es el dominio de unión al DNA de la proteína GAL4 de levadura.

13. El método de la reivindicación 7, en el que dicho segundo polipéptido receptor es ultraespiráculo.

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicho segundo polipéptido receptor comprende además un dominio de transactivación heterólogo.

15. El método de la reivindicación 14, en el que dicho dominio de transactivación heterólogo es el dominio de transactivación de la proteína VP16 del virus del herpes simple.

16. El método de la reivindicación 7, en el que dicho primer o segundo polipéptido receptor ha sido mutado en el dominio de unión a ligando para que el dominio de unión a ligando mutado sólo reconozca el uno o más ligandos químicos con los que se pone en contacto la planta en la etapa b).

17. El método de la reivindicación 7, en el que dicho ligando químico es una hormona de insectos, un antagonista de hormona de insectos o un agonista de hormona de insectos.

18. El método de la reivindicación 17, en el que dicho ligando químico es fenoxycarb, CGA 59 205, tebufenocida o RH 5849.

19. El método de la reivindicación 7, en el que dicho casete de expresión diana comprende una región reguladora 5' que además comprende entre 1 y 11 copias de un elemento de respuesta.

20. Un método para controlar la fertilidad de una planta de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende:

a) expresar los mencionados primer y segundo polipéptidos receptores en dicha planta transformada; y

b) poner en contacto dicha planta transformada con uno o más ligandos químicos que son complementarios al dominio de unión a ligando de los mencionados primer y segundo polipéptidos receptores por lo cual dichos polipéptidos receptores, en presencia de dicho ligando químico, activan la expresión de dicho polipéptido diana.

21. El método de la reivindicación 20, en el que al menos uno de dichos casetes de expresión de receptor comprende un promotor específico de anteras unido operativamente a la secuencia codificante de dicho polipéptido receptor.

22. El método de la reivindicación 20, en el que al menos uno de dichos casetes de expresión de receptor comprende un promotor específico de pistilo unido operativamente a la secuencia codificante de dicho polipéptido receptor.

23. El método de la reivindicación 20, en el que la expresión de dicho polipéptido diana reduce la fertilidad de la planta.

24. El método de la reivindicación 23, en el que dicho polipéptido diana es la ribonucleasa barnasa.

25. El método de la reivindicación 20, en el que dicho casete de expresión diana codifica la versión antisentido de una secuencia codificante crítica para la fertilización.

26. El método de la reivindicación 20, en el que la expresión de dicho polipéptido diana aumenta la fertilidad de la planta.

27. El método de la reivindicación 26, en el que dicho polipéptido diana es el inhibidor de ribonucleasa barstar.

28. El uso de la planta de acuerdo con la reivindicación 1 para inducir la expresión del polipéptido diana mediante una hormona de insectos, un antagonista de hormona de insectos o un agonista de hormona de insectos.

29. El uso de una planta de acuerdo con la reivindicación 2 para controlar la fertilidad de la planta.