CN110997920A - 新型细胞标签的表达 - Google Patents

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Abstract

本文公开了编码用于免疫治疗应用的细胞标签的多核苷酸，以及包含用于调节细胞活性的多核苷酸细胞标签的系统。本文所述的组合物、方法和系统提供了用于调节遗传工程化细胞在受试者中的活性的工具。

Description

新型细胞标签的表达
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年6月7日提交的第62/516,639号美国临时专利申请的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式通过电子方式提交，并且通过引用整体并入于此。所述ASCII副本创建于2018年5月30日，被命名为50471-708_601_SL.txt，大小为464,445个字节。
背景技术
细胞疗法为治疗常规药物无法充分治疗的疾病提供了希望。输血是治疗血液系统恶性肿瘤的第一类细胞疗法。细胞分离、诱导和基因转移技术的最新进展已允许对各种细胞类型(原代和永生化的)进行遗传修饰，以用于治疗多种疾病，例如癌症、心血管疾病、皮肤病、神经系统疾病和眼科疾病。在许多情况下，关键之处在于在向患者输注之前，富集遗传修饰的细胞治疗产物，以达到允许扩充具有治疗意义的选定细胞所必需的纯度，和/或消除非遗传修饰的细胞或其它细胞类型。另外，使用例如细胞因子、嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)的过继细胞免疫疗法已显示出成功引导肿瘤细胞杀伤的巨大希望。尽管这项创新技术很有希望，但将修饰的免疫细胞施用到荷瘤个体中并非没有安全性问题，例如在CAR-T细胞疗法情况下的毒性、肿瘤溶解和细胞因子释放综合征(即，“细胞因子风暴”)。为了充分利用过继T细胞免疫治疗技术提供的治疗潜力，必须在治疗过程中控制副作用，如细胞因子风暴。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
发明内容
提供了可在细胞中表达以解决一个或多个上述缺陷的多肽构建体和多核苷酸。
提供了一种多肽构建体和编码该多肽构建体的多核苷酸，该多肽构建体包含天然多肽的截短变体。在一些实施方案中，该多肽构建体可以进一步包含跨膜结构域或其片段、信号肽和/或肽连接体。本文还提供了表达所述多核苷酸和多肽构建体的工程化细胞。所述工程化细胞可以在细胞表面表达所述多肽构建体，从而提供细胞标志物(或“细胞标签”)，该细胞标志物在一些实施方案中唯一地标识所述工程化细胞。
本文还提供了一种多肽构建体和编码该多肽构建体的多核苷酸，该多肽构建体包含天然多肽的截短变体和跨膜结构域。在某些实施方案中，该截短变体包含胞外结构域或其部分和跨膜结构域或其部分。在一些实施方案中，所述多肽构建体可包含跨膜结构域和衍生自不同天然蛋白质的截短变体。在一些情况下，多肽构建体的截短变体跨膜结构域是单次通过式(single-pass)跨膜结构域。在其它情况下，多肽构建体的跨膜结构域是多次通过式(multiple-pass)跨膜结构域。
本文提供了一种多肽构建体和编码该多肽构建体的多核苷酸，该多肽构建体包括能够将细胞表面的细胞表面多肽(例如，与跨膜结构域融合的截短变体)偶联至第二细胞表面多肽的跨膜二聚化结构域。在某些实施方案中，相对于非二聚化的构型，经由跨膜二聚化结构域的细胞表面多肽的偶联可以放大源自细胞表面多肽的信号。
本文进一步提供了一种多肽构建体和编码该多肽构建体的多核苷酸，该多肽构建体包含源自不同天然蛋白质的结构域或其片段。在一些实施方案中，本文所述的多肽构建体可包含天然多肽的截短变体，跨膜结构域，可选的将截短变体连接至该跨膜结构域的肽连接体，以及将多肽构建体引导至细胞表面的信号肽。例如，在一些实施方案中，多肽构建体包含的截短变体或其片段与直接或间接融合至该截短变体或其片段的跨膜结构域或其片段衍生自不同的天然蛋白质。在一些实施方案中，本文描述的多肽构建体的特定结构域(例如胞外结构域)是嵌合的，并且包含衍生自不同天然蛋白质的氨基酸序列。
在一些情况下，提供了包含多肽构建体的方法和组合物，该多肽构建体包含细胞表面多肽和跨膜二聚化结构域，其中所述跨膜二聚化结构域诱导所述细胞表面多肽的二聚化，并且所述细胞表面多肽结合预定的抗体或其变体或片段。本文还提供了编码本文所述多肽构建体的多核苷酸序列。
本文提供了包含细胞标签的方法和组合物，所述细胞标签包括诸如HER1、CD20、LNGFR和CD52等多肽的截短变体。在一些情况下，所述多肽的截短变体不结合内源性受体。所公开的截短的非免疫原性多肽可以用作细胞标签，例如用作细胞标志物、消耗标志物或杀伤标签。
本文提供了包含表达如本文所述的多肽构建体或多核苷酸的工程化细胞的组合物。在一些情况下，所述工程化细胞进一步表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和/或细胞因子中的至少一种。
本文提供了调节遗传工程化细胞在受试者中的活性(例如，进行免疫治疗)的方法，其包括向该受试者提供编码本文公开的多核苷酸构建体的遗传工程化细胞，并进一步向该受试者提供结合并调节所述细胞的活性的预定结合配偶体。还提供了用于该方法的系统和试剂盒。
提供了包含细胞表面多肽和跨膜二聚化结构域的多肽构建体，其中所述跨膜二聚化结构域诱导所述细胞表面多肽的二聚化，并且其中所述细胞表面多肽结合预定的抗体或其变体或片段。
在一些实施方案中，所述细胞表面多肽包括HER1多肽、LNGFR多肽、CD20多肽和CD52多肽中的至少一种。在一些情况下，所述细胞表面多肽包括HER1多肽，并且所述HER1多肽包含与SEQ ID No:211、212、213、214、215、216或217所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。在一些情况下，所述HER1多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:211、212、213、214、215、216或217所示的序列。
在一些实施方案中，所述细胞表面多肽包括CD20多肽，并且所述CD20多肽包含与SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219或SEQ ID NO:220所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。在一些情况下，所述CD20多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219或SEQ ID NO:220所示的序列。
在一些实施方案中，所述细胞表面多肽包括LNGFR多肽，并且所述LNGFR多肽包含与SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158或SEQ ID NO:160所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。在一些情况下，所述细胞表面多肽包括LNGFR多肽，并且所述LNGFR多肽包含与SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158或SEQ ID NO:160所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
在一些情况下，所述细胞表面多肽不结合内源性受体。在一些情况下，所述跨膜二聚化结构域可以形成具有互补二聚化结构域的同二聚体或异二聚体。在一些情况下，所述跨膜二聚化结构域包含至少一个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述跨膜二聚化结构域包含血型糖蛋白A跨膜结构域或其片段或变体，血型糖蛋白A-整联蛋白β3嵌合跨膜结构域或其片段或变体，或CD3ζ跨膜结构域。在一些情况下，这样的细胞表面多肽至少包括HER1多肽。
在一些情况下，所述多肽构建体在工程化细胞中表达。在一些实施方案中，所述工程化细胞是动物细胞。在一些情况下，所述动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述人细胞是T细胞或NK细胞。在一些情况下，所述工程化细胞进一步包含Sleeping Beauty转座酶。
在一些情况下，所述工程化细胞进一步表达至少一种另外的外源多肽。在一些情况下，所述工程化细胞进一步表达至少一种外源受体多肽或其片段。在一些情况下，所述工程化细胞进一步表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和细胞因子中的至少一种。在一些实施方案中，所述工程化细胞进一步表达至少一种CAR，并且其中所述CAR结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
在一些情况下，所述工程化细胞进一步表达至少一种重组细胞因子。在一些情况下，所述重组细胞因子包括IL-15、mbIL-15、IL-2、IL-12和IL-21中的至少一种。在一些实施方案中，所述多肽构建体由通过基因组编辑引入到所述工程化细胞中的多核苷酸编码。在一些情况下，所述基因组编辑包括至少使用位点特异性丝氨酸重组酶系统。在一些情况下，所述多肽构建体包含将所述细胞表面多肽融合至所述跨膜二聚化结构域的连接体。在一些情况下，多肽同二聚体或异二聚体包含多肽构建体。
提供了一种编码多肽构建体的多核苷酸，该多肽构建体包含与跨膜二聚化结构域融合的非免疫原性细胞表面多肽，其中所述跨膜二聚化结构域诱导所述细胞表面多肽的二聚化。在一些实施方案中，所述细胞表面多肽不结合内源性受体。在一些情况下，所述细胞表面多肽不包含任何内源性信号传导或运输功能。
在一些情况下，所述多核苷酸包含编码至少一种异源基因的至少一个序列。在一些实施方案中，所述至少一种异源基因由诱导型启动子调节。在一些情况下，所述至少一种异源基因包含嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和细胞因子中的至少一种。在一些实施方案中，所述至少一种异源基因包含所述CAR，并且其中所述CAR结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
在一些实施方案中，所述至少一种异源基因包含细胞因子。在一些情况下，所述细胞因子包括IL-15、IL-2、IL-12、IL-21以及IL-15与IL-15Rα的融合体中的至少一种。在一些实施方案中，所述细胞因子为分泌形式。在一些情况下，所述细胞因子为膜结合形式。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含至少一个序列，该序列包含选自2A、GSG-2A、GSG连接体(SEQ ID NO:16)、SGSG连接体(SEQ ID NO:18)、furinlink变体及其衍生物的多肽连接体。在一些实施方案中，所述2A连接体是p2A连接体、T2A连接体、F2A连接体或E2A连接体。
在一些情况下，所述多肽构建体充当标签，以在表达所述细胞表面多肽的细胞中富集细胞、选择细胞或诱导细胞死亡。在一些情况下，所述细胞表面多肽包括HER1多肽、LNGFR多肽、CD20多肽和CD52多肽中的至少一种。在一些实施方案中，所述跨膜二聚化结构域包含血型糖蛋白A跨膜结构域或其片段或变体，血型糖蛋白A-整联蛋白β3嵌合跨膜结构域或其片段或变体，或CD3ζ跨膜结构域。
在一些情况下，载体包含所述多核苷酸。在一些情况下，所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在一些实施方案中，所述非病毒载体是Sleeping Beauty转座子。在一些情况下，通过基因组编辑将所述多核苷酸引入工程化细胞中。在一些情况下，所述基因组编辑包括至少使用位点特异性丝氨酸重组酶系统。
提供了一种调节遗传工程化细胞在受试者中的活性的方法，其包括：向所述受试者提供一定量的遗传工程化细胞，该遗传工程化细胞编码包含与跨膜二聚化结构域融合的细胞表面多肽的多肽构建体，其中所述跨膜二聚化结构域诱导所述细胞表面多肽的二聚化，并且其中所述细胞表面多肽结合预定的结合配偶体或其变体或片段；以及以足以结合并由此调节所述遗传工程化细胞的活性的量，向所述受试者提供所述预定的结合配偶体。
在一些实施方案中，所述细胞表面多肽是非免疫原性多肽。在一些实施方案中，所述细胞表面多肽包括HER1多肽、LNGFR多肽、CD20多肽和CD52多肽中的至少一种。在一些情况下，所述细胞表面多肽不结合内源性受体。在一些情况下，所述跨膜二聚化结构域可以形成具有互补二聚化结构域的同二聚体或异二聚体。在一些实施方案中，所述跨膜二聚化结构域包含至少一个半胱氨酸残基。在一些情况下，所述跨膜二聚化结构域包含血型糖蛋白A跨膜结构域或其片段或变体，血型糖蛋白A-整联蛋白β3嵌合跨膜结构域或其片段或变体，或CD3ζ跨膜结构域。
在一些情况下，所述结合配偶体包含抗体或其细胞表面多肽结合区。在一些实施方案中，所述抗体包括以下至少一种：单克隆抗体、scFv、scFab、双抗体和骆驼科抗体。在一些情况下，所述抗体包括利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、帕木单抗(panitumumab)和奈昔木单抗(necitumumab)中的至少一种。
在一些情况下，所述遗传工程化细胞包含T细胞和NK细胞中的至少一种。在一些实施方案中，所述遗传工程化细胞中的至少一种进一步表达至少一种另外的外源多肽。在一些情况下，所述遗传工程化细胞中的至少一种进一步表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和细胞因子中的至少一种。在一些情况下，所述遗传工程化细胞中的至少一种进一步表达至少一种CAR，并且其中所述CAR结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
在一些实施方案中，所述遗传工程化细胞中的至少一种进一步表达至少一种重组细胞因子。在一些情况下，所述重组细胞因子包括IL-15、mbIL-15、IL-2、IL-12和IL-21中的至少一种。在一些情况下，以足以引起与细胞因子风暴或全身性炎症反应相关的至少一种症状减轻的量提供所述预定的结合配偶体。在一些实施方案中，以足以引起与肿瘤溶解综合征相关的至少一种症状减轻的量提供所述预定的结合配偶体。在一些情况下，所述多肽构建体由通过基因组编辑引入所述工程化细胞中的多核苷酸编码。在一些情况下，所述基因组编辑包括至少使用位点特异性丝氨酸重组酶系统。
提供了一种编码结合抗CD20抗体的截短的非免疫原性CD20多肽的多核苷酸，其中所述截短的非免疫原性CD20多肽不结合内源性受体。
在一些实施方案中，所述CD20多肽包含与SEQ ID NO:109所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。在一些情况下，所述CD20多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:109的序列。在一些情况下，所述CD20多肽与天然CD20相比以至少50％、60％、70％、80％或90％的结合效率结合所述抗CD20抗体。在一些实施方案中，所述抗CD20抗体包括利妥昔单抗、西妥昔单抗、托西莫单抗(tositumomab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、阿托珠单抗(afutuzumab)、blontuvetmab和obinutuzumab中的至少一种。
提供了一种多核苷酸，其编码至少由HER1结构域III或其片段和截短的HER1结构域IV组成的截短的非免疫原性HER1多肽，其中所述HER1多肽结合抗HER1抗体，并且其中所述HER1多肽在工程化细胞中表达。
在一些实施方案中，所述截短的HER1结构域IV包含所述HER1结构域IV的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的截短。
在一些情况下，所述截短的HER1结构域IV包含与SEQ ID NO:203、204、205、206、207、208或209所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。在一些情况下，所述截短的HER1结构域IV包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:203、204、205、206、207、208或209所示的序列。在一些实施方案中，所述HER1结构域III或其片段包含与SEQ ID NO:200所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。在一些情况下，所述HER1结构域III包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:200所示的序列。
在一些情况下，所述多核苷酸进一步编码CD28跨膜结构域和用于将所述HER1多肽偶联至所述CD28跨膜结构域的肽连接体。在一些情况下，所述多核苷酸编码包含以下多肽序列的多肽构建体，该多肽序列包含SEQ ID NO:57所示的序列。在一些实施方案中，所述抗HER1抗体包括利妥昔单抗、西妥昔单抗、futuximab、depatuxizumab、imgatuzumab、laprituximab、马妥珠单抗(matuzumab)、奈昔木单抗、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、帕木单抗和扎芦木单抗(zalutumumab)中的至少一种。
提供了一种多核苷酸，其编码结合抗CD20抗体的截短的非免疫原性CD20多肽，其中所述截短的非免疫原性CD20多肽不结合内源性受体，并且其中所述非免疫原性CD52多肽在工程化细胞中表达。
在一些情况下，所述CD20多肽包含与SEQ ID NO:143所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。在一些情况下，所述CD52多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:143所示的序列。
在一些实施方案中，多核苷酸在细胞中表达，该细胞进一步包含编码至少一种异源基因的至少一个序列。在一些实施方案中，所述至少一种异源基因由诱导型启动子调节。在一些情况下，所述至少一种异源基因包含嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和细胞因子中的至少一种。在一些实施方案中，所述至少一种异源基因包含CAR，并且其中所述CAR结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
在一些实施方案中，所述至少一种异源基因包含细胞因子。在一些实施方案中，所述细胞因子包括IL-15、IL-2、IL-12、IL-21以及IL-15与IL-15Rα的融合体中的至少一种。在一些情况下，所述细胞因子为分泌形式。在一些情况下，所述细胞因子为膜结合形式。
在一些实施方案中，载体包含所述多核苷酸。在一些情况下，所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。在一些情况下，所述非病毒载体是Sleeping Beauty转座子。在一些实施方案中，通过基因组编辑将所述多核苷酸引入工程化细胞中。在一些情况下，所述基因组编辑包括至少使用位点特异性丝氨酸重组酶系统。在一些情况下，工程化细胞编码所述多核苷酸。在一些情况下，所述工程化细胞是T细胞或NK细胞。在一些情况下，所述多核苷酸编码多肽。
本文还提供了一种治疗癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的包含多核苷酸的工程化细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用至少一种能够与所述工程化细胞上表达的多肽结合的结合配偶体。在一些情况下，所述结合配偶体是抗体。
本文提供了一种调节遗传工程化细胞在受试者中的活性的方法，其包括向所述受试者提供一定量的遗传工程化细胞，该遗传工程化细胞编码包含细胞表面多肽的多肽构建体，该细胞表面多肽是包含第一截短的非免疫原性多肽和第二截短的非免疫原性多肽的嵌合多肽，并且其中所述细胞表面多肽结合至少一种预定的结合配偶体或其变体或片段；以及以足以结合并由此调节所述遗传工程化细胞的活性的量，向所述受试者提供所述预定的结合配偶体。
在一些实施方案中，所述第一截短的非免疫原性多肽包含EGFR家族成员的片段或衍生物。在一些情况下，所述第二截短的非免疫原性多肽包含EGFR家族成员的片段或衍生物。在一些情况下，所述第一截短的非免疫原性多肽包括HER1多肽。在一些实施方案中，所述HER1多肽包含与SEQ ID NO:211、212、213、214、215、216或217所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述HER1多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:211、212、213、214、215、216或217所示的序列。在一些情况下，所述HER1多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:211所示的序列。
在一些情况下，所述第二截短的非免疫原性多肽包括HER2多肽、ErbB3多肽和ErbB4多肽中的至少一种。在一些实施方案中，所述多肽构建体包含与SEQ ID NO:89、SEQID NO:93、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:105所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
在一些实施方案中，所述至少一种预定的结合配偶体结合所述HER1多肽。在一些情况下，所述至少一种预定的结合配偶体包括利妥昔单抗、西妥昔单抗、futuximab、depatuxizumab、imgatuzumab、laprituximab、马妥珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、帕木单抗和扎芦木单抗中的至少一种。在一些情况下，所述至少一种预定的结合配偶体进一步包括与所述第二截短的非免疫原性多肽结合的第二预定的结合配偶体。在一些情况下，所述第二截短的非免疫原性多肽是HER2多肽，并且所述第二预定的结合配偶体是帕妥珠单抗(pertuzumab)。
在一些情况下，所述多肽构建体进一步包含信号肽。在一些情况下，所述多肽构建体进一步包含跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含跨膜二聚化结构域。在一些情况下，所述跨膜二聚化结构域包含血型糖蛋白A跨膜结构域、血型糖蛋白A-整联蛋白β3嵌合跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域。在一些情况下，所述跨膜二聚化结构域包含与SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述跨膜二聚化结构域包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的多肽序列。
在一些情况下，所述第一截短的非免疫原性多肽包括CD20多肽。在一些实施方案中，所述CD20多肽包含与SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219或SEQ ID NO:220所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。在一些情况下，所述CD20多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219或SEQ IDNO:220所示的序列。在一些实施方案中，所述至少一种预定的结合配偶体包括以下至少一种：利妥昔单抗、托西莫单抗、维妥珠单抗、阿托珠单抗、blontuvetmab和obinutuzumab。
提供了一种多肽构建体，其包含由HER1结构域III和截短的HER1结构域IV组成的截短的非免疫原性HER1多肽，其中所述HER1多肽结合抗HER1抗体；CD28跨膜结构域；以及用于将所述HER1多肽偶联至所述CD28跨膜结构域的肽连接体；其中所述多肽构建体在工程化细胞中表达。
在一些实施方案中，所述HER1结构域III包含含有SEQ ID NO:200所示序列的多肽序列，并且所述HER1结构域IV包含含有SEQ ID NO:203所示序列的多肽序列。在一些情况下，所述CD28跨膜结构域包含含有SEQ ID NO:36所示序列的多肽序列，并且所述肽连接体包含G4S肽连接体(SEQ ID NO:221)。在一些情况下，所述G4S肽连接体(SEQ ID NO:221)包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:22所示的序列。在一些实施方案中，所述多肽构建体包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:57所示的序列。
在一些情况下，所述抗-HER1抗体包括利妥昔单抗、西妥昔单抗、futuximab、depatuxizumab、imgatuzumab、laprituximab、马妥珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、帕木单抗和扎芦木单抗中的至少一种。
提供了一种多肽构建体，其包含截短的非免疫原性CD20多肽，其中所述CD20多肽结合抗CD20抗体；其中所述多肽构建体在工程化细胞中表达。
在一些实施方案中，所述多肽构建体与SEQ ID NO:109所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的同一性。在一些情况下，所述多肽构建体包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:109所示的序列。在一些情况下，所述抗CD20抗体包括利妥昔单抗、托西莫单抗、维妥珠单抗、阿托珠单抗、blontuvetmab和obinutuzumab中的至少一种。
附图说明
在所附权利要求书中具体阐述了本发明的特征。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细说明和附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：
图1显示了使用利妥昔单抗通过流式细胞术检测的，与对照细胞标签相比，全长CD20细胞标签(对应于SEQ ID NO:107)和两种形式的截短CD20(对应于SEQ ID NO:109的CD20t1和对应于SEQ ID NO:115的CD20t4)在HEK-293T细胞中的表达水平。阴影区域表示模拟转染的对照细胞，而非阴影区域表示来自经转染细胞的细胞标签的表达。每次转染均重复进行三次。
图2显示了与未转染的细胞(左图)相比，在用编码两种基因的Sleeping Beauty转座子载体共转染的人外周血单个核细胞(PBMC)中(右图)，CD20t1细胞标签(对应于SEQ IDNO:109；y轴)和嵌合抗原受体(CAR；x轴)的共表达。
图3显示了在用CD20t-1转染的Jurkat细胞系中，由利妥昔单抗诱导的特定剂量依赖性抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(以诱导倍数表示；y轴)。未转染的亲本Jurkat细胞和非特异性抗体西妥昔单抗均未显示出活性。
图4A是说明本文所述多肽构建体的实施方案的示意图。上图显示了多肽构建体的实施方案，其包含用于将该多肽构建体引导至细胞表面的信号肽、天然多肽的截短的变体、可选的连接体和跨膜(TM)结构域。下图示出了在本文所述的工程化细胞中表达的多肽构建体的实施方案。该多肽构建体通过跨膜(TM)结构域锚定在细胞表面，该跨膜(TM)结构域通过可选的肽连接体与细胞外朝向的截短变体融合。在所示的实施方案中，连接体充当延伸部分，以从细胞表面引导并延伸截短的变体，从而优化抗体或结合配偶体(以抗截短变体抗体表示)与截短变体的表位的结合。
图4B是说明本文所述多肽构建体的实施方案的示意图。图4A的截短的变体和可选的连接体在图4B中被替换为HER(m)结构域III和HER(n)结构域IV，其中m和n代表EGFR/HER家族的任何成员，包括HER1、HER2、ErbB3和ErbB4(即，m＝1-4且n＝l-4，但n≠m)。在所示的实施方案中，HER(m)结构域III和HER(n)结构域IV各自呈现不同的表位，它们被不同的抗体(即，分别为抗-HER(m)和抗-HER(n)抗体)识别。
图4C是说明具体实施方案的示意图，其中图4B的HER(m)结构域III对应于被抗-EGFR抗体识别的EGFR结构域III，其在c末端与HER2、ErbB3或ErbB4的结构域IV融合，随后是TM结构域。
图4D显示了与同种型对照(“同种型”)和未用HER1t转染的模拟细胞相比，在用不同EGFR-Erb4嵌合体(对应于SEQ ID NO:101的截短EGFR-ErbB4(JM-a)和对应于SEQ ID NO:105的截短EGFR-ErbB4(JM-b))转染并用抗HER1t抗体染色的人供体PBMC(“染色”)中表达的截短HER1(HER1t)多肽的表达。
图4E显示了与未用HER1t转染的模拟细胞相比，在用不同HER1t变体(对应于SEQID NO:57的HER1t1，对应于SEQ ID NO:59的HER1t2，对应于SEQ ID NO:61的HER1t3，对应于SEQ ID NO:63的HER1t4，对应于SEQ ID NO:65的HER1t5，对应于SEQ ID NO:67的HER1t6，和对应于SEQ ID NO:69的HER1t7)转染的人供体PBMC中，HER1t多肽的表达。
图5A显示了与未用HER1t或CAR转染的对照细胞(左图)相比，在用编码两种蛋白质的慢病毒载体共转染的细胞(右图)中，如通过流式细胞术测量的，HER1t1表达(对应于SEQID NO:57；y轴)和CAR表达(x轴)的基于抗体的检测。
图5B显示了与同种型对照(上图)相比，在用编码单独CAR的Sleeping Beauty转座子载体(左图)和CAR加HER1t 1(右图)转染并用抗HER1抗体和CAR特异性蛋白质染色的细胞(下图)中，HER1t1(对应于SEQ ID NO:57；y轴)和CAR(x轴)的水平。
图6显示了在NK细胞(左)、CD16 NK细胞(中)和用CAR和HER1t1转染的CD16 NK细胞(右)中，西妥昔单抗和阿仑珠单抗介导的ADCC活性(表示为％特异性杀伤；y轴)。西妥昔单抗在HER1t1的存在下显示出特异性ADCC。
图7A显示了通过流式细胞术测量的，在遗传修饰的SUP-T1报道细胞系(SUP-T1/CAR-HER1t1)中，CAR和HER1t1细胞标签(对应于SEQ ID NO:57)的表达。针对通过流式细胞术检测的高(中图)或中等(右图)水平的HER1t1表达，通过FACS对SUP-T1/CAR-HER1t1细胞系进行分选以进行富集。左图显示了使用同种型抗体对照进行流式细胞术对SUP-T1/CAR-HER1t1的染色。图7B显示了西妥昔单抗诱导的SUP-T1/CAR-HER1t1细胞系的特异性ADCC(以诱导倍数表示；y轴)，其依赖于HER1t1表达以及西妥昔单抗剂量水平。非特异性抗体利妥昔单抗显示没有SUP-T1/CAR-HER1t1的ADCC。
图8显示了Western印迹分析，其显示了在遗传修饰的SUP-T1细胞系中HER1t1细胞标签的表达。泳道1：仅IP抗体；泳道2：仅Jurkat细胞；泳道3：SUPT1/HER1t1(高水平的HER1t1)；泳道4：SUPT1/HER1t1(低水平的HER1t1)；泳道5：表达全长HER1的A431细胞；泳道6：分子量标准。粗箭头指向西妥昔单抗在除A431以外的所有其它细胞系中下拉的蛋白质。HER1t1对应于SEQ ID NO:57。
图9显示了在西妥昔单抗或非特异性抗体利妥昔单抗的存在下，通过ADCC(左图)和CDC(右图)消除共表达HER1t1细胞标签的CD19CAR-T细胞的功效。
图10是显示本文所述多肽构建体的不同实施方案的示意图。第一代截短的细胞标签(上图)包含通过可选的肽连接体连接的截短的变体和非二聚化的跨膜结构域(TM)。下一代截短的细胞标签(下图)包含跨膜二聚化n结构域(TM-A)，TM-A促进截短的变体在细胞表面上的二聚化。在这两种情况下，抗截短变体抗体都与截短变体上的表位结合。
图11显示了与仅表达CD19 CAR的T细胞相比，经修饰以共表达CD19 CAR和HER1t细胞标签的原代T细胞中CD19 CAR的表达水平(相对于亲本的％)。所用的HERt1细胞标签包括具有跨膜二聚化结构域的截短的HER1多肽(对应于SEQ ID NO:71的变体HER1t8，对应于SEQID NO:75的HER1t9，和对应于SEQ ID NO:79的HER1t10)和包含不具有跨膜二聚化结构域的截短HER1多肽(对应于SEQ ID NO:57的HER1t1)的多肽构建体。
图12显示了与仅表达CD19 CAR的T细胞相比，经修饰以共表达CD19 CAR和HER1t细胞标签的原代T细胞中HER1t细胞标签的表达水平(相对于亲本的％)。所用的HER1t细胞标签包括具有跨膜二聚化结构域的截短的HER1多肽(对应于SEQ ID NO:71的变体HER1t8，对应于SEQ ID NO:75的HER1t9，和对应于SEQ ID NO:79的Her1t10)和包含不具有二聚化结构域的截短HER1多肽(对应于SEQ ID NO:57的HER1t1)的多肽构建体。
图13A和图13B显示了与包含不具有二聚化结构域的截短HER1多肽(对应于SEQ IDNO:57的HER1t对照)的多肽构建体相比，在共表达包含具有二聚化结构域的截短HER1多肽(对应于SEQ ID NO:71的变体HER1t8，对应于SEQ ID NO:75的HER1t9，和对应于SEQ ID NO:79的HER1t10)的多肽构建体的CD19 CAR-T靶细胞中，西妥昔单抗介导的ADCC(以％特异性裂解表示；y轴)的更加优异的效果。使用NK细胞作为效应细胞。使用利妥昔单抗作为ADCC测定的非特异性抗体对照。
图14显示了通过西妥昔单抗介导的ADCC对表达HER1t1的遗传修饰的T细胞(CD19CAR-mbIL-15-T细胞)的选择性消除。
具体实施方式
以下描述和实例详细说明了本发明的实施方案。应该理解，本发明不限于本文所述的特定实施方案，因此可以变化。本领域技术人员将会认识到，本发明存在许多变化和修改，这些均涵盖在本公开内容的范围内。
所有术语旨在被理解成它们将被本领域技术人员所理解的那样。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
本文使用的章节标题仅用于组织结构目的，不应解释为限制所描述的主题。
尽管可以在单个实施方案的上下文中描述本发明的各种特征，但是这些特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在单独的实施方案的上下文中描述本发明，但是本发明也可以在单个实施方案中实现。
以下定义补充了本领域中的定义，并且针对本申请，并且不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。本文描述了优选的材料和方法，但是与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可以在测试本公开内容的实践中使用。因此，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并非旨在限制。
在本申请中，除非另外明确指出，否则单数的使用包括复数。必须注意，如在本说明书中所用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。在本申请中，除非另外指出，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其它形式如“包含”、“含有”和“具有”的使用并非限制性的。
本说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其它实施方案”的提及意指关于该实施方案描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一些实施方案中，但不一定包含在所有实施方案中。
如在本说明书和权利要求书中所用的，词语“包含”(和任何形式的包含)、“具有”(和任何形式的具有)、“包括”(和任何形式的包括)或“含有”(和任何形式的含有)是包含性的或开放式的，并不排除其它未列举的要素或方法步骤。可以想到，本说明书中讨论的任何实施方案可以采用本发明的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用来实现本发明的方法。
如本文所用的，关于参考数值的术语“约”及其语法等同语可包括该数值本身和该数值加或减10％的值的范围。例如，“约10”的量包括10以及9至11的任何量。例如，关于参考数值的术语“约”还可以包括该数值加或减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数值范围。
所谓“分离的”是指将核酸从其天然环境中取出。所谓“纯化的”是指给定的核酸，无论是从自然界中取出的(包括基因组DNA和mRNA)还是在实验室条件下合成(包括cDNA)和/或扩增的，其纯度得到提高，其中“纯度”是一个相对的术语，而不是“绝对纯度”。然而，应该理解，核酸和蛋白质可以与稀释剂或佐剂一起配制，而出于实际目的仍然是分离的。例如，当用于引入细胞中时，核酸通常与可接受的载体或稀释剂混合。
如本文所用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”是指任何长度的核苷酸——核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸——的聚合形式。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链DNA、三链DNA以及双链和单链RNA。它还包括修饰形式(例如通过甲基化和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。该术语还意在包括包含非天然存在的核苷酸或合成核苷酸以及核苷酸类似物的分子。
“多肽”与术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。“成熟蛋白质”是全长的并且任选地包含在给定细胞环境中对蛋白质而言典型的糖基化或其它修饰的蛋白质。
本文公开的多肽和蛋白质(包括其功能部分和功能变体)可包含合成氨基酸来代替一种或多种天然存在的氨基酸。这类合成氨基酸是本领域已知的，并且包括，例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)--羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。本公开进一步预期，本文所述多肽在工程化细胞中的表达可与多肽构建体的一种或多种氨基酸的翻译后修饰相关。翻译后修饰的非限制性实例包括磷酸化、酰化(包括乙酰化和甲酰化)、糖基化(包括N-连接的和O-连接的)、酰胺化、羟基化、烷基化(包括甲基化和乙基化)、泛素化、加入吡咯烷酮羧酸、形成二硫键、硫酸化、豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、法尼基化、牻牛儿基化(geranylation)、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、脂化(lipoylation)和碘化。
如本文所用的“抗体”是指单克隆或多克隆抗体。完整抗体通常由四个多肽组成：重(H)链多肽的两个相同拷贝和轻(L)链多肽的两个相同拷贝。每条重链含有一个N端可变(VH)区和三个C端恒定(CH1、CH2和CH3)区，并且每条轻链含有一个N端可变(VL)区和一个C端恒定(CL)区。每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。VH区和VL区具有相似的一般结构，每个区包含四个序列相对保守的框架区。框架区通过三个互补决定区(CDR)连接。被称为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR形成抗体的“高变区”，其负责抗原结合。
“抗原识别部分或结构域”是指与抗原特异性结合的分子或分子部分。在一个实施方案中，抗原识别部分是抗体、抗体样分子或其片段，并且抗原是肿瘤抗原。
“抗体样分子”可以是例如作为Ig超家族成员的蛋白质，其能够选择性地结合配偶体。MHC分子和T细胞受体是这样的分子。在一些实施方案中，抗体样分子是TCR。在一些实施方案中，TCR已被修饰以增加其MHC结合亲和力。
术语“抗体的片段”、“抗体片段”、“抗体的功能片段”和“抗原结合部分”在本文中可互换使用，是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段或部分(大体上参见Holliger等人,Nat.Biotech.,23(9):1126-1129(2005))。例如，抗体片段理想地包含一个或多个CDR、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)或其组合。抗体片段的实例包括但不限于(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其为包含两个Fab片段的二价片段，该Fab片段通过茎区处的二硫键连接；(iii)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(iv)单链Fv(scFv)，其为由Fv片段的通过合成连接体连接的两个结构域(即VL和VH)组成的单价分子，该合成连接体使得两个结构域能够作为单个多肽链合成(参见例如，Bird等人,Science,242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-5883(1988)；以及Osbourn等人,Nat.Biotechnol.,16:778(1998))，以及(v)双抗体，其为多肽链的二聚体，其中每个多肽链包含通过肽连接体与VL连接的VH，该肽连接体太短而不允许同一肽链上的VH与VL之间进行配对，从而驱动不同VH-VL多肽链上的互补结构域之间进行配对以生成具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子。抗体片段是本领域已知的，并且在例如美国专利8,603,950中有更详细的描述。
当核酸和/或核酸序列天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，它们是“同源的”。当蛋白质和/或蛋白质序列的编码DNA天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，这些蛋白质和/或蛋白质序列是同源的。同源分子可称为同源物。例如，如本文所述的任何天然存在的蛋白质均可以通过任何可用的诱变方法进行修饰。当表达时，该诱变的核酸编码的多肽与原始核酸编码的蛋白质同源。通常从两种或更多种核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列同一性推断同源性。可用于确立同源性的序列间精确同一性百分比随所讨论的核酸和蛋白质而变化，但是常规使用低至25％的序列同一性来确立同源性。更高水平的序列同一性，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更高，也可用来确立同源性。
在两个核酸序列或多肽的氨基酸序列的语境中，如本文所用的术语“相同的”或“序列同一性”，是指在指定的比较窗口上，两个序列中的残基在为了获得最大对应性而对齐时相同。在一些实施方案中，本文的多肽与参考多肽或其片段至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、98％、99％或100％相同，例如，如通过BLASTP(或CLUSTAL，或任何其它可用的比对软件)使用默认参数来测定的。类似地，核酸也可以参考起始核酸来描述，例如，它们可以与参考核酸或其片段50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、98％、99％或100％相同，例如，如通过BLASTN(或CLUSTAL，或任何其它可用的比对软件)使用默认参数来测定的。当描述一个分子与较大分子具有一定百分比的序列同一性时，这意味着当两个分子最佳对齐时，根据两个分子最佳对齐的顺序，较小分子中所述百分比的残基在较大分子中找到匹配残基。
“转座子”或“转座因子”(TE)是可以改变其在基因组内的位置的载体DNA序列，其有时产生或逆转突变并改变细胞的基因组大小。转座经常导致TE的复制。I类TE在两个阶段中拷贝：首先，它们从DNA转录为RNA，然后所产生的RNA被逆转录为DNA。然后，拷贝的DNA插入基因组的新位置。逆转录步骤由逆转录酶催化，该逆转录酶可以由TE本身编码。逆转录转座子的特征类似于逆转录病毒，如HIV。II类TE的剪切-粘贴转座机制不涉及RNA中间体。转座由几种转座酶催化。一些转座酶非特异性地结合DNA中的任何靶位点，而其它转座酶结合特定的DNA序列靶标。转座酶在靶位点处进行交错剪切，从而产生单链5’或3’DNA突出端(粘端)。该步骤切下DNA转座子，然后将其连接到新的靶位点；该过程涉及补平缺口的DNA聚合酶和封闭糖-磷酸骨架的DNA连接酶的活性。这导致靶位点的复制。DNA转座子的插入位点可以通过短的定向重复序列(其可以通过在靶DNA中交错剪切并通过DNA聚合酶补平而产生)和随后的对转座酶切除TE至关重要的一系列反向重复序列来鉴定。如果当在细胞周期的S期中供体位点已被复制但靶位点尚未复制时发生剪切-粘贴TE的转座，则该剪切-粘贴TE可以被复制。在I类和II类TE中，转座可被分为“自主的”或“非自主的”。自主TE可以自己移动，而非自主TE的移动需要存在另一TE。这通常是因为非自主TE缺乏转座酶(对于II类)或逆转录酶(对于I类)。
“转座酶”是指结合至转座子末端并通过剪切-粘贴机制或复制转座机制催化转座子移动到基因组另一部分的酶。在一些实施方案中，转座酶的催化活性可用来将基因从载体移动到基因组。
可以通过“转染”、“转化”、“核转染”或“转导”将本文公开或考虑的核酸序列和载体引入细胞中。如本文所用的，“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞中。许多转染技术是本领域已知的，并且包括例如磷酸钙DNA共沉淀(参见，例如，Murray E.J.(编著),Methods in Molecular Biology,Vol.7,Gene Transfer and Expression Protocols,Humana Press(1991))；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))；和核转染(Trompeter等人,J.Immunol.Methods 274:245-256(2003))。在合适的包装细胞中生长感染性颗粒后，可将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞中，其中许多包装细胞可商购获得。
如本文所用的“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞中产生或过表达的任何抗原物质。例如，它可以在宿主中触发免疫应答。或者，对于本公开内容来说，肿瘤抗原可以是由健康和肿瘤细胞均表达的蛋白质，但因为它们标识出某种肿瘤类型，所以是合适的治疗靶标。
“启动子”是指启动编码序列转录的多核苷酸区域。启动子位于基因的转录起始位点附近，位于DNA的同一链和上游(朝向有义链的5’区)。一些启动子是组成型的，因为它们在细胞中在所有情况下都具有活性，而其它启动子响应于特定刺激被调节变得具有活性，例如诱导型启动子。
术语“启动子活性”是指与正被测量活性的启动子可操作地连接的核苷酸序列的表达程度。启动子活性可以通过确定产生的RNA转录物的量直接测定(例如通过Northern印迹分析)，或通过确定由所连接的核酸序列(如与启动子连接的报道核酸序列)编码的产物的量间接测定。
如本文所用的“诱导型启动子”是指通过转录调节物(例如，生物或非生物因素)的存在或不存在而诱导活性的启动子。诱导型启动子是有用的，因为与它们可操作连接的基因的表达可以在生物体的某些发育阶段或在特定组织中打开或关闭。诱导型启动子的实例是醇调节的启动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子、金属调节的启动子、发病机理调节的启动子、温度调节的启动子和光调节的启动子。在一些实施方案中，诱导型启动子是遗传开关的部分。
如本文所用的术语“增强子”是指增加例如与其可操作地连接的核酸序列的转录的DNA序列。增强子可以位于远离核酸序列编码区的数千碱基处，并且可以介导调节因子的结合、DNA甲基化的模式或DNA结构的改变。来自多种不同来源的大量增强子是本领域公知的，并且可作为克隆的多核苷酸(来自诸如ATCC等保藏中心以及其它商业或个体来源)或在克隆的多核苷酸内获得。许多包含启动子(如常用的CMV启动子)的多核苷酸也包含增强子序列。增强子可位于编码序列的上游、内部或下游。术语“Ig增强子”是指衍生自定位于免疫球蛋白(Ig)基因座内的增强子区域的增强子元件(这样的增强子包括例如重链(μ)5’增强子、轻链(κ)5’增强子、κ和μ内含增强子和3’增强子)(一般性地参见Paul W.E.(编著),Fundamental Immunology,第3版,Raven Press,New York(1993),第353-363页；以及美国专利5,885,827)。
如本文所用的“编码序列”是指编码多肽的多核苷酸区段。该区域或序列由5'端附近的起始密码子和3'端附近的终止密码子来界定。编码序列也可以被称为开放阅读框。
如本文所用的“可操作地连接的”是指DNA区段与另一DNA区段的物理和/或功能连接，从而允许这些区段以其预期方式起作用。当编码基因产物的DNA序列与调节序列如启动子、增强子和/或沉默子以某种方式连接，使得允许直接或间接调节该DNA序列的转录时，该DNA序列与调节序列可操作地连接。例如，当DNA序列与启动子在启动子的转录起始位点下游连接，与该转录起始位点符合正确的阅读框架，并允许转录延伸通过该DNA序列进行时，该DNA序列与该启动子可操作地连接。当增强子或沉默子以某种方式连接到编码基因产物的DNA序列上，从而分别增加或减少该DNA序列的转录时，该增强子或沉默子与该DNA序列可操作地连接。增强子和沉默子可位于DNA序列的编码区的上游、下游或嵌入其中。如果信号序列被表达为参与多肽分泌的前蛋白质，则该信号序列的DNA与编码该多肽的DNA可操作地连接。DNA序列与调节序列的连接通常通过在合适的限制位点连接或通过使用本领域技术人员已知的限制性内切核酸酶插入该序列中的衔接子或连接体来完成。
术语“转录调节物”是指这样的生化元件，其在某些环境条件下用来阻止或抑制启动子驱动的DNA序列的转录(例如，阻遏物或核抑制蛋白)，或者在某些环境条件下用来允许或刺激启动子驱动的DNA序列的转录(例如，诱导物或增强子)。
术语“诱导”是指相对于一定的基础转录水平，由转录调节物引起的核酸序列转录、启动子活性和/或表达的增加。
“靶”基因或“异源”基因或“目的基因(GOI)”是指通过基因转移引入宿主细胞中的基因。
如本文所用的“重组酶”是指可以促进在限定位点之间的位点特异性重组的一组酶，其中这些位点在单个DNA分子上物理分离，或者这些位点位于单独的DNA分子上。所定义的重组位点的DNA序列不一定是相同的。重组的起始取决于蛋白质-DNA相互作用，在该组内有大量蛋白质催化噬菌体整合和切除(例如，λ整合酶、.φC31)、循环质粒的解离(例如，Tn3、gamma delta、Cre、Flp)、用于表达替代基因的DNA反转(例如，Hin、Gln、Pin)、发育期间基因的装配(例如，鱼腥藻(Anabaena)固氮基因)和转座(例如，IS607转座子)。基于进化和机制相关性，大多数位点特异性重组酶属于两个家族之一。它们是.λ整合酶家族或酪氨酸重组酶(例如Cre、Flp、Xer D)和解离酶(resolvase)/整合酶家族或丝氨酸重组酶家族(例如，φC31、TP901-1、Tn3、gamma delta)。
“重组附着位点”是被本文所述的重组酶识别的特定多核苷酸序列。通常，涉及两个不同的位点(称为“互补位点”)，一个存在于靶核酸(例如，真核生物或原核生物的染色体或附加体)中，另一个存在于待整合至目标重组位点的核酸上。本文使用术语“attB”和“attP”，它们分别是指最初来自细菌靶标和噬菌体供体的附着(或重组)位点，尽管针对特定酶的重组位点可能具有不同的名称。重组位点通常包括由核心或间隔区隔开的左臂和右臂。因此，attB重组位点由BOB'组成，其中B和B'分别是左臂和右臂，而O是核心区。类似地，attP是POP'，其中P和P'是臂，而O是核心区。在attB与attP位点之间重组并且核酸同时整合到靶标上时，整合DNA侧翼的重组位点被称为“attL”和“attR”。使用上述术语，attL和attR位点因此分别由BOP'和POB'组成。在本文的一些表示中，省略“O”，并且例如将attB和attP分别表示为BB'和PP'。
术语“基因编辑”或“基因组编辑”是指活生物体基因组中DNA的核苷酸的插入、缺失或替换。通常，基因组编辑使用工程化的核酸酶，其可以在基因组的预定位置处创建位点特异性双链断裂。本公开涵盖用于编辑基因组的任何手段。基因编辑技术的非限制性实例包括CRISPR、Argnonaute和AttSite位点特异性丝氨酸重组酶系统。在本文中，“CRISPR系统”的“CRISPR基因编辑系统”是指任何RNA指导的Cas蛋白介导的过程，其用于将DNA序列的改变靶向至基因组的特定区域。在本文中，“Argonaute基因编辑系统”是指任何单链DNA指导的Argonaute内切核酸酶介导的过程，其用于将DNA序列的改变靶向至基因组的特定区域。在本文中，“AttSite基因编辑系统”或“位点特异性丝氨酸重组酶基因编辑系统”或“位点特异性丝氨酸重组酶系统”是指包括以下步骤的任何方法：提供包含第一重组附着位点和第二重组附着位点的真核细胞；使第一和第二重组附着位点与原核重组酶多肽接触，从而导致重组附着位点之间的重组，其中该重组酶多肽可以介导第一和第二重组附着位点之间的重组，第一重组附着位点是噬菌体基因组重组附着位点(attP)或细菌基因组重组附着位点(attB)，第二重组位点是attB或attP，并且重组酶选自单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)噬菌体重组酶、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)噬菌体重组酶、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是attB时，第二重组附着位点是attP，而当第一重组附着位点是attP时，第二重组附着位点是attB。AttSite丝氨酸重组酶系统的实施方案的实例在美国专利9,034,650中提供，其全部通过引用并入本文。
本文中对于诸如多核苷酸或多肽等分子使用的术语“内源的”是指可以在野生型细胞或生物体中发现的分子的天然存在形式。在生物体中内源性发现的分子可以与本文所述的工程化分子形成对比，该工程化分子通常不是天然存在的。例如，工程化分子可以包含天然存在的多肽或多核苷酸的变体。在一些实施方案中，天然存在的多肽的变体是天然存在的多肽的截短的变体。在本文中，术语“截短的变体”是指相对于蛋白质或多肽的内源形式缺少一个或多个氨基酸序列和/或结构域的蛋白质或多肽。例如，引入本文描述的多肽构建体中的截短变体可以缺少对应于通常在内源蛋白质中存在的结构域(例如，细胞内信号传导结构域、跨膜结构域、配体结合结构域等)的氨基酸序列。截短的多肽的天然形式可以源自任何生物体，包括哺乳动物物种，如小鼠、大鼠、兔和人。本文所述的工程化多核苷酸和多肽可以在工程化细胞中表达。在本文中，工程化细胞是已经从其天然或内源状态修饰的细胞。工程化细胞的实例是本文描述的细胞，其已被修饰(例如，通过将多核苷酸转染到细胞中)以编码天然多肽的截短变体或天然多核苷酸的截短变体。
多肽构建体
本文公开了多肽构建体，编码该多肽构建体的多核苷酸，携带和/或表达该多肽构建体和多核苷酸的工程化细胞，以及调节工程化细胞的活性的方法。如本文所述的工程化细胞可以包括经工程改造以编码并表达细胞因子、嵌合抗原受体和T细胞受体的免疫效应细胞。
在本文中，术语“调节”或“调整”在用于工程化细胞或在其中表达的多肽构建体时，通常是指施用于受试者后对工程化细胞的活性或量的调节。在一些实施方案中，调节工程化细胞的活性是指受试者中工程化细胞的消耗。在一些实施方案中，调节工程化细胞的活性是指由于向受试者施用一定量的结合工程化细胞上表达的多肽构建体的抗体或结合配偶体，受试者中一些工程化细胞的消耗。在一些实施方案中，调节工程化细胞的活性是指由于经由抗体或结合配偶体与在所述工程化细胞上表达或与之缔合的本文所述多肽构建体的结合而激活细胞死亡，工程化细胞的消耗。在一些实施方案中，调节工程化细胞的活性是指激活工程化细胞中的ADCC或CDC途径。
本文公开的多肽、多核苷酸和工程化细胞共同代表了一套治疗工具，其可用来改善常规免疫疗法，特别是过继细胞疗法的功效。例如，本文所述的工程化细胞可在细胞表面编码并表达多肽构建体作为新型细胞标签。在一些实施方案中，细胞标签充当细胞标志物，其将表达该细胞标签的细胞标记、标识或标志为工程化细胞。在细胞标签已经被工程改造为缺乏被内源蛋白质识别的表位的实施方案中，这样的细胞标签可以起到唯一地区分工程化细胞与生物体中的其它细胞的作用，例如在过继细胞免疫疗法中。
在其它实例中，本文所述的多肽、多核苷酸和工程化细胞可用来在安全性受到关注(例如由于细胞因子风暴发作的可能性)的受试者中最小化或消除免疫疗法的毒性。本文所述的细胞标签可包括被抗体识别的一个或多个表位，该抗体在免疫治疗期间引入，从而诱导将减慢治疗输出和/或减轻治疗可能的副作用的细胞机制。在一些实施方案中，该抗体与该表位结合，以诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。因此，本文所述的细胞标签可以提供工程化细胞特有的消耗标志物或“杀伤标签”，从而允许实施者控制治疗输出并由此优化治疗的功效和安全性。
本文所述的免疫治疗工具库通过提供控制过继细胞治疗干预的潜力，在常规免疫疗法之上进行了改进。在一些实施方案中，可以通过在工程化细胞表面表达能够发生二聚化或多聚化的多肽构建体，而使工程化细胞对细胞消耗策略敏感。此类二聚化或多聚化的多肽可用来扩增消耗信号，从而在易发生或正在经历与治疗有关的副作用的受试者中快速下调或消除工程化免疫细胞治疗。表达二聚化或多聚化多肽构建体的工程化细胞的施用可以提供对细胞消耗干预的进一步控制和优化。在进一步的实施方案中，本文公开的多核苷酸构建体作为采用诱导型启动子的“杀伤开关”(或“自杀开关”)系统的一部分的实施可以允许控制何时表达特定的多肽构建体，从而在转录和翻译后水平上均对免疫疗法赋予额外的控制点。
在另一个实施方案中，本文所述的细胞标签可用来富集特异表达此类细胞标签的工程化细胞。例如，细胞标签可用来富集某些工程化细胞，以分离仅表达此类细胞标签的某些工程化细胞，从而达到允许扩充具有治疗意义的选定细胞所必需的纯度。可以适当地使用各种方法，如FAC、柱纯化或基于磁珠的方法。
本文公开的多肽构建体可包含一个或多个结构域或其特定片段。通常，该多肽构建体可包含信号肽序列、胞外结构域、肽连接体和跨膜结构域，它们各自用来赋予多肽构建体特定的所需特性。例如，该多肽构建体可以包含信号肽，以在翻译后将多肽构建体引导至细胞表面；跨膜结构域，以将多肽结构域锚定至细胞；细胞外部分，其可以包括天然多肽的截短变体；以及将跨膜结构域连接至细胞外部分的肽连接体。在一些实施方案中，该肽连接体用作细胞外肽延伸部分，以将多肽的细胞外部分定位在细胞外基质中，从而使其可用于赋予细胞标签功能性(例如，呈现或延伸表位，以允许结合抗体)。在某些实施方案中，一个或多个上述结构域可以不存在于多肽构建体中。例如，本文所述的多肽构建体可以被工程化为缺乏肽连接体结构域。在其它实施方案中，多肽构建体包含一个或多个衍生自不同蛋白质的结构域(即，该多肽构建体是嵌合的)。
在本文中，当用于多肽构建体的一部分时，术语“细胞外”是指位于细胞膜外部的多肽的氨基酸。在一些实施方案中，细胞外部分可以被称为细胞表面多肽。通常，细胞表面多肽的一部分(例如，远端部分)从细胞的质膜向远端延伸或突出到胞外间隙中。在一些情况下，该延伸部分可以被具有与延伸部分的结构互补并对其具有特异性的结构的抗体或抗原识别多肽结合并识别。细胞表面多肽可包括天然存在于细胞表面的多肽或其片段，以及并非天然存在于细胞表面的多肽或其片段(例如，天然多肽的截短变体)。
细胞外部分或细胞表面多肽可包括天然多肽的截短变体。例如，截短的变体可以从质膜的外部(例如，经由与跨膜结构域连接或相邻的连接体)向胞外间隙延伸。在某些实施方案中，截短的变体缺少在多肽的天然形式中有助于细胞内结构域和/或跨膜结构域的氨基酸。可以任何方式从内源多肽修饰截短的变体，以产生细胞标签的细胞外部分。例如，可以修饰截短的变体，以减少或消除通常用来构成胞外结构域中的表位的氨基酸，该表位可以被内源蛋白质如抗原或受体识别。通过除去通常与细胞外分子交界(例如在细胞信号传导途径中)的氨基酸，可以使截短的变体在细胞表面无反应或在免疫/表位上沉默，或使其与内源分子的反应性或结合降低或最小化。本文设想了对天然多肽的任何修饰以去除天然表位，包括全部或部分胞外结构域的截短，以及去除构成表位的一部分或经翻译后修饰而构成表位的一部分的一个或多个氨基酸。
尽管本文所述的截短的变体可以对于内源性信号传导途径在表位上沉默，但是截短的变体可以包括一个或多个能够被通常不接触细胞表面的分子(例如抗体)识别的表位，该细胞对应于本文所述的工程化细胞。在一些实施方案中，(例如，在使用所采用的细胞的免疫治疗期间)外源性引入对截短变体的表位具有特异性的抗体或结合配偶体。在这方面，能够被引入的抗体或其片段识别的截短变体的表位可以被称为休眠的或静息的。也就是说，在用于过继免疫疗法的工程化细胞的细胞表面引入的细胞标签可以包含处于休眠状态的表位，直到将适当的分子引入受试者中以触发或激活该细胞标签(即通过识别表位)。这样的表位不干扰在按需要进行治疗时工程化细胞的治疗输出(即，表位保持沉默或静息)，但是体现了可以在出于任何原因而需要压制免疫治疗时被激活以下调细胞输出的触发物。本公开设想了使用能够识别细胞标签的表位的任何抗体或小分子通过消除此类细胞(例如，经由ADCC或CDC)来抑制表达该标签的工程化细胞的治疗输出。可以用来识别细胞标签的胞外结构域(例如，截短的变体)的表位的抗体的非限制性实例包括利妥昔单抗、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、布加替尼、埃克替尼(icotinib)、奥西替尼、帕木单抗、扎芦木单抗、尼妥珠单抗、马妥珠单抗、阿富珠单抗、blontuvetmab、obinutuzumab、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、奥卡珠单抗(ocaratuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、TRU-015(Trubion)、维妥珠单抗(veltuzumab)(IMMU-106)、阿仑珠单抗、ANT1034、HI186(Bio Rad)、YTH34.5(Bio Rad)和YTH66.9HL(Bio-Rad)、曲妥珠单抗(trastuzumab)和帕妥珠单抗。
可以对内源多肽进行修饰以产生本文设想的截短变体的另一个实例是除去通常有助于或参与细胞内信号传导和/或运输途径的一个或多个氨基酸。截短内源多肽以去除信号结构域会增强细胞标签作为休眠的、可诱导的细胞标志物的功能，该细胞标志物在其休眠状态下不干扰细胞功能(例如在过继细胞治疗期间在接受的细胞中)。
在一些实施方案中，所述多肽构建体的细胞表面多肽可包含受体酪氨酸激酶的截短变体。非限制性实例包括来自EGF受体家族(例如HER1的截短变体)、PDGF受体家族、VEGF受体家族、胰岛素受体家族、FGF受体家族、Trk受体家族和Eph受体家族的受体的截短变体。在其它实施方案中，该细胞表面多肽可包含CD蛋白的截短变体(例如，CD20或CD52)或LNFGR的截短变体(CD271)。
在某些实施方案中，所述细胞标签的细胞表面多肽可包括已被修饰以去除天然或内源多肽的跨膜结构域和细胞内信号传导部分的截短变体。跨膜结构域和细胞内信号传导部分的截短将多肽的细胞表面或细胞外部分从其内源环境中释放出来，例如，使其可用于引入嵌合多肽构建体中，该嵌合多肽构建体包括与衍生自不同天然蛋白质的跨膜结构域(例如，通过连接体)融合的细胞表面多肽。这样的嵌合多肽构建体继而可以赋予细胞表面多肽(例如，截短的变体)与该多肽的内源形式相比改变的活性或特性。在一些实施方案中，当在嵌合多肽构建体中表达时，细胞表面多肽能够二聚化。
本公开设想，可以在同一工程化细胞中表达多种不同的多肽构建体。例如，本文公开的细胞可以表达在细胞表面多肽和/或跨膜结构域的身份上不同的多个多肽构建体。
本文所述的多肽构建体可以包括包含天然多肽的截短变体的细胞表面多肽，与该细胞表面多肽融合的跨膜结构域，可选的将该截短变体连接至该跨膜结构域的连接体，以及将细胞标签引导至工程化细胞的细胞表面的信号肽。
信号肽
信号肽是通常位于新合成的蛋白质或多肽的N-末端的氨基酸序列，其将蛋白质或多肽引导至细胞表面。在一些实施方案中，信号肽将多肽引导至细胞表面，以便插入(例如，通过跨膜结构域)细胞膜内。在一些实施方案中，合成具有信号肽的本文所述的多肽构建体，但随后翻译后加工以切割信号肽，使得成熟多肽构建体缺乏信号肽氨基酸序列。在其它实施方案中，信号肽序列不被切割，而是保留在成熟多肽构建体中。
本公开提供了包含能够将多肽构建体引导和/或运输至细胞表面的任何已知或未知信号肽的多肽构建体。例如，在一些实施方案中，多肽构建体包含对应于GMCSFRα、Igκ、免疫球蛋白E、CD8α、TVB2(T21A)、CD52或低亲和力神经生长因子受体(LNGFR，TNFRSF16)的信号肽的信号序列。
在实施方案中，所述信号肽由包含以下核苷酸序列的多核苷酸编码，该核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:13组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，所述信号肽包含与选自由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
肽连接体
本文所述的多肽构建体可包含肽连接体，以将多肽构建体的结构域或其片段连接至该多肽构建体的不同结构域或其片段。在一些实施方案中，肽连接体将多肽构建体的跨膜结构域连接至该多肽构建体的细胞表面多肽(例如天然多肽的截短变体)。例如，多肽构建体可以包含肽连接体，该肽连接体包括GSG连接体(SEQ ID NO:16)、SGSG连接体(SEQ IDNO:18)、(G4S)3连接体(SEQ ID NO:20)、(G4S)4连接体(SEQ ID NO:22)和/或Whitlow连接体。
本文提供了任何长度或大小的肽连接体，以将跨膜结构域连接至细胞表面多肽(例如，截短的变体)。例如，在一些实施方案中，选择肽连接体的大小，以维持截短的变体与跨膜结构域的距离处于与多肽的天然非截短形式与其内源跨膜结构域之间的距离大致相同。在实施方案中，本文所述的截短变体通过不同大小的G4S连接体(G4S)n(其中n＝0、1、2、3、4、5)(SEQ ID NO:222)连接至跨膜结构域，以维持HER1t与跨膜蛋白之间的“自然”距离。例如，在同一天然多肽的两个不同的截短变体长度不同的情况下，长度较小的截短变体可以用较大尺寸的连接体来补偿，以便将两个截短变体定位在距细胞表面大致相同的距离处。
在某些实施方案中，肽连接体可用来将除跨膜结构域之外的结构域或其部分连接在一起。例如，肽连接体可以连接细胞表面多肽的两个蛋白质部分。在一些情况下，细胞表面多肽可以是嵌合的，并且包含可以通过肽连接体连接的来自多个天然多肽的截短变体。一个实例是包含HER1t以及EGFR家族另一成员(例如，HER2、ErbB3和ErbB4)的一个或多个截短变体的多肽构建体。在其它情况下，细胞表面多肽可包含经由肽连接体连接的两个或更多个拷贝的截短变体(例如，SEQ ID NO:123，其包含通过SGS连接体连接的两个拷贝的CD20截短多肽)。
在实施方案中，肽连接体由包含以下核苷酸序列的多核苷酸编码，该核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。在实施方案中，肽连接体包含与选自由SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22和SEQ ID NO:24组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
跨膜结构域
本文所述的多肽构建体可以包含跨膜结构域，该跨膜结构域可以插入质膜中以将该多肽构建体锚定在细胞表面。本公开提供了包含一个或多个任何已知或未知的跨膜结构域或其片段的多肽构建体。在一些实施方案中，该多肽构建体的跨膜结构域可以包含衍生自一种或多种天然蛋白质和/或与之同源的跨膜结构域。在一些实施方案中，该多肽构建体的跨膜结构域包含与单个天然蛋白质的跨膜结构域相对应的氨基酸序列。在一些实施方案中，该多肽构建体的跨膜结构域包含嵌合的跨膜结构域，该嵌合的跨膜结构域包含来源于两种或更多种天然蛋白质的氨基酸序列。
本文所述的多肽构建体可包含单次通过式或多次通过式跨膜结构域。CD8α是具有单次通过式跨膜结构域的蛋白质的实例。在一些实施方案中，本文公开的多肽构建体包含与来自CD8α蛋白的跨膜结构域或其片段相对应和/或同源的跨膜结构域。在实施方案中，该多肽构建体的跨膜结构域由包含以下核苷酸序列的多核苷酸编码，该核苷酸序列与SEQ IDNO:33的核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。在实施方案中，该跨膜结构域包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
多次通过式蛋白质的一个实例是CD28。在一些实施方案中，多肽构建体的跨膜结构域可包含与来自CD28蛋白的跨膜结构域或其片段相对应和/或同源的跨膜结构域。在实施方案中，多肽构建体的跨膜结构域由包含以下核苷酸序列的多核苷酸编码，该核苷酸序列与SEQ ID NO:35的核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。在实施方案中，该跨膜结构域包含与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域是跨膜二聚化结构域。在本文中，“跨膜二聚化结构域”是指能够在细胞的质膜内与第二跨膜结构域或其片段物理相互作用或“二聚化”的跨膜结构域或其片段。通常，跨膜二聚化结构域被包含在第一多肽构建体中，该构建体通过该跨膜二聚化结构域与第二多肽二聚化。当第一多肽的跨膜二聚化结构域在其远端(细胞外朝向)末端融合至第一细胞表面多肽，而第二多肽的跨膜二聚化结构域在其远端融合至第二细胞表面多肽时，细胞膜内第一和第二跨膜结构域的物理相互作用可导致第一和第二细胞表面多肽的二聚化。在一些实施方案中，该跨膜结构域可以多聚化成三聚体、四聚体或多聚体。
在某些实施方案中，跨膜二聚化结构域诱导细胞表面多肽的二聚化，而不需要任何细胞外诱导剂(例如，对细胞表面多肽的表位具有特异性的配体或抗体)。例如，跨膜二聚化结构域可以通过与细胞的细胞膜内第二跨膜二聚化结构域自发地物理相互作用或偶联来诱导细胞表面多肽的二聚化。因此，应当理解，在施用包含本文所述抗体、蛋白质、配体或分子的任何细胞外细胞表面结合剂之前，表达本文所述多肽构建体的细胞可在细胞的细胞表面上展示二聚化的细胞表面多肽。当二聚化的细胞表面多肽接触并识别配体或抗体时，细胞表面多肽经由跨膜二聚化结构域的二聚化可使表达这种多肽构建体的细胞倾向于增强的细胞应答。例如，在多肽构建体包含含有HER1t的细胞表面多肽的情况下，一对HER1t细胞表面多肽可以在与CDC或ADCC诱导剂如西妥昔单抗接触之前或之时发生二聚化。由于结合西妥昔单抗的细胞表面多肽的二聚化构型，在危难时(例如在细胞因子风暴期间)施用结合剂可以放大细胞毒性作用，从而增加细胞被杀死的可能性。在一些实施方案中，与细胞表面多肽(例如二聚化的细胞表面多肽)结合以在表达本文公开的多肽构建体的工程化细胞中诱导细胞应答的药剂经外源提供，和/或是内源不存在的。本公开提供了跨膜二聚化结构域，以促进包括天然多肽的截短变体如HER1t、LNGFRt、CD20t和CD52t的任何细胞表面多肽的二聚化。
在一些实施方案中，跨膜二聚化结构域可以与第二跨膜结构域形成共价连接，以诱导细胞表面多肽的二聚化。在一些实施方案中，该共价连接是在每个相邻跨膜结构域中存在的半胱氨酸氨基酸之间形成的二硫键的形式。在其它实施方案中，细胞膜内的跨膜二聚化结构域可以与第二跨膜结构域形成非共价连接，以诱导细胞表面多肽的二聚化。
本文所述的多肽构建体可具有与另一跨膜二聚化结构域物理相互作用的跨膜二聚化结构域。在这样的情况下，各自的第一和第二多肽构建体的第一和第二跨膜二聚化结构域可以具有相同的氨基酸序列(即，相对于跨膜二聚化结构域的同二聚体)或不同的氨基酸序列(即，相对于跨膜二聚化结构域的异二聚体)。在某些实施方案中，二聚化多肽对的每个各自的跨膜二聚化结构域包含介导在第一和第二跨膜二聚化结构域中的相应半胱氨酸残基之间形成二硫键的至少一个半胱氨酸残基。
多肽构建体的跨膜结构域可包含与蛋白质血型糖蛋白A的氨基酸序列相对应和/或同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，引入本文所述多肽构建体中的血型糖蛋白A氨基酸序列包括血型糖蛋白A的跨膜结构域或其片段。在一些实施方案中，多肽构建体的跨膜结构域可包含一个或多个通常位于血型糖蛋白A跨膜结构域侧翼的氨基酸。在一些实施方案中，包含全部或部分血型糖蛋白A跨膜结构域的多肽构建体能够与包含全部或部分血型糖蛋白A跨膜结构域的第二多肽构建体发生二聚化(例如，同二聚化)。在这样的情况下，从血型糖蛋白A引入到多肽构建体中的氨基酸序列可以限定跨膜二聚化结构域。例如，血型糖蛋白A二聚化结构域可包含二聚化基序GXXXG。
在一些实施方案中，多肽构建体包含跨膜结构域，该跨膜结构域至少包含血型糖蛋白A的氨基酸E91-R116。在一些实施方案中，多肽构建体包含跨膜结构域，该跨膜结构域至少包含血型糖蛋白A的氨基酸I92-I114。在实施方案中，多肽构建体包含跨膜结构域，该跨膜结构域对应于由以下多核苷酸编码的血型糖蛋白A结构域或其片段，该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，多肽构建体包含跨膜结构域，该跨膜结构域对应于与选自由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的血型糖蛋白A结构域或其片段。
本文所述的多肽构建体可包含跨膜结构域，该跨膜结构域是来自两种或更多种天然多肽的氨基酸序列的嵌合体。例如，该跨膜结构域可包括对应于与来自第二蛋白质的氨基酸序列连接或融合的血型糖蛋白A结构域或其部分的氨基酸序列。在一些实施方案中，这样的嵌合跨膜结构域能够与第二跨膜结构域(例如，嵌合或非嵌合的)二聚化，因此体现为跨膜二聚化结构域。例如，可以将对应于血型糖蛋白A跨膜结构域或其片段的氨基酸序列与对应于整联蛋白β3的结构域或其片段的氨基酸序列融合，以形成多肽构建体的嵌合跨膜结构域。在一些实施方案中，多肽构建体包含跨膜结构域，该跨膜结构域包含与整联蛋白β3的氨基酸A737-W741融合的血型糖蛋白A的氨基酸I92-L109。在实施方案中，多肽构建体包含跨膜结构域，该跨膜结构域对应于由以下多核苷酸编码的血型糖蛋白A-整联蛋白β3嵌合序列，该多核苷酸包含与SEQ ID NO:29的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，多肽构建体包含跨膜结构域，该跨膜结构域与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
多肽构建体的跨膜结构域可包含与CD3ζ链的跨膜结构域内的氨基酸序列相对应和/或同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含CD3ζ链的跨膜结构域或其片段的多肽构建体能够与包含CD3ζ链跨膜结构域的跨膜结构域或其片段的第二多肽构建体二聚化(例如，同二聚化)。在这样的情况下，对应于CD3ζ链跨膜结构域的氨基酸序列可以限定跨膜二聚化结构域。在一些实施方案中，多肽构建体包含由以下多核苷酸编码的跨膜结构域，该多核苷酸包含与SEQ ID NO:31的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在其它实施方案中，跨膜结构域由包含SEQ ID NO:31的核苷酸序列的多核苷酸编码。在实施方案中，多肽构建体包含跨膜结构域，该跨膜结构域与SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在其它实施方案中，本文的多核苷酸构建体的跨膜结构域可包含与来自蛋白质CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞蛋白4)和/或LNGFR(TNFRSF16)的跨膜结构域或其片段相对应和/或同源的氨基酸序列。例如，该多肽构建体可包含由以下多核苷酸编码的跨膜结构域，该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO 39组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，该多肽构建体包含跨膜结构域，该跨膜结构域与选自由SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:40组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
截短的变体
本文所述的多肽构建体可包含连接至跨膜结构域的细胞表面多肽。在某些实施方案中，该细胞表面多肽包含天然多肽的截短变体。在本文中，提供多种天然多肽作为前体或底物，以产生引入多肽构建体中的截短的变体。每种天然多肽前体可以进一步经历多种不同的截短，以产生用于本文所述多肽构建体的大量可能的截短的变体。
前体的实例包括表皮生长因子受体(EGFR或HER1)同工型前体(例如，SEQ ID NO:50)；受体酪氨酸蛋白激酶ErbB2(HER2)同工型前体(例如，SEQ ID NO:51)；受体酪氨酸蛋白激酶ErbB3(HER3)同工型1前体(例如SEQ ID NO:52)、受体酪氨酸蛋白激酶ErbB4(HER4)同工型JM-a/CVT-1前体(例如SEQ ID NO:53)、受体酪氨酸蛋白激酶ErbB4(HER4)同工型JM-b同工型X7(例如SEQ ID NO:54)、CD20前体(例如SEQ ID NO:108)、CD52前体和LNGFR前体(例如，SEQ ID NO:154)。
在某些实施方案中，细胞表面多肽包含截短的HER1多肽(在本文中称为HER1t或EGFRt)。天然HER1包括包含结构域I、II、III和IV的细胞外区域、跨膜结构域以及细胞内酪氨酸激酶和调节区域。已知某些能够诱导ADCC的抗体(例如帕木单抗和西妥昔单抗)与内源HER1的结构域III结合。
本文提供了包含被截短了内源HER1的任何氨基酸、结构域或片段的HER1多肽的多肽构建体。在本文中，HER1多肽可包含HER1t多肽。在一些实施方案中，HER1多肽由或基本上由HER1t多肽组成。在其它实施方案中，除了其它HER1结构域(例如，HER1跨膜结构域)之外，HER1多肽还可包含HER1t多肽。在实施方案中，HER1多肽可以缺少通常在HER1中发现的细胞内结构域或其片段，包括酪氨酸激酶结构域和调节区。在一些实施方案中，HER1多肽可以缺少通常在HER1中发现的跨膜结构域或其片段。在一些实施方案中，HER1多肽可以缺少通常在HER1中发现的胞外结构域或其片段，包括通常在HER1中发现的结构域I、结构域II和结构域IV的全部或部分。
在一些实施方案中，细胞表面多肽包含缺少通常在HER1中发现的结构域III的片段的HER1t多肽。在一些实施方案中，该HER1t多肽由或基本上由内源HER1蛋白的整个或部分结构域III组成。在一些实施方案中，该HER1t多肽由或基本上由内源HER1蛋白的整个结构域III组成。在一个实施方案中，并入细胞表面多肽中的HER1t结构域III由包含与SEQ IDNO:199的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。在一个实施方案中，并入细胞表面多肽中的HER1t结构域III与SEQ ID NO:200的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，并入细胞表面多肽中的HER1t多肽包含内源HER1的结构域IV或其片段。内源HER1结构域IV可由包含与SEQ ID NO:201的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。在一个实施方案中，内源HER1t结构域IV与SEQ ID NO:202的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。在其它实施方案中，并入细胞表面多肽中的HER1t多肽可包含截短的结构域IV。该HER1t截短的域IV可包含天然HER1的结构域IV的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的截短。在一个实施方案中，并入细胞表面多肽中的HER1t截短的结构域IV与选自由SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
本文所述的多肽构建体可包含含有HER1结构域III和结构域IV的HER1t多肽。在一个实施方案中，HER1t多肽包含与SEQ ID NO:210的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的HER1结构域III和结构域IV。
本文所述的多肽构建体可包含含有HER1结构域III和结构域IV片段的HER1t多肽。在一个实施方案中，HER1t多肽与选自由SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216和SEQ ID NO:217组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
天然HER1在结构域IV中还包含多个二硫键对。在一些实施方案中，HER1t截短的结构域IV可在保留二硫键对的位置处包含截短。在进一步的实施方案中，如本文所述的HER1t变体通过不同大小的G4S连接体(G4S)n(其中n＝0、1、2、3、4、5)(SEQ ID NO:222)连接至跨膜结构域，以维持HER1t与跨膜蛋白之间的“自然”距离。在进一步的实施方案中，可以进一步去除结构域IV与EGFR跨膜结构域之间的7个残基的连接体，因为该连接体在EGFR受体的二聚化中起作用，这导致EGF配体活化。
并入本文所述的细胞表面多肽中的HER1t多肽可以包括可被外源引入的结合配偶体或抗体识别的表位。在一些实施方案中，可将HER1t多肽并入西妥昔单抗结合域中，以促进表达本文所述多肽构建体的细胞的靶向消耗。例如，消耗可能是由于由CDC和/或ADCC导致的细胞死亡。可以内源引入以结合和/或识别包含HER1t的细胞表面多肽上的表位的分子的非限制性实例可以包括西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、布加替尼、埃克替尼、奥西替尼、帕木单抗、扎芦木单抗、尼妥珠单抗和马妥珠单抗。在多个实施方案中，该抗体可以是单克隆抗体、scFv、scFab、双抗体或骆驼科抗体。在另一个实施方案中，该抗体可以与药物或毒素缀合。
并入本文所述的多肽构建体中的细胞表面多肽可包含多种不同天然多肽的截短变体。例如，该细胞表面多肽可包含多肽嵌合体，该多肽嵌合体包含来自EGFR家族的多个截短的多肽。图4B示出了赋予细胞标签功能的多肽构建体的实施方案，其中细胞表面多肽包含来自HER/EGFR家族一个成员(HER(m))的结构域III和来自HER/EGFR家族不同成员(HER(n))的结构域IV或其片段。本文提供了嵌合细胞表面多肽，其包含来自EGFR/HER1、HER2、ErbB3和ErbB4中的两个或更多个的胞外结构域的任何组合。图4C描绘了结构域III来源于EGFR/HER1的具体情况。这类嵌合细胞表面多肽的优点是，每个单独的截短可以从各自的天然多肽中去除易于结合内源性分子的表位，同时保留可以被过继细胞治疗期间外源引入的抗体识别的表位。例如，在嵌合细胞表面多肽包含来自EGFR的结构域III和来自HER2的结构域IV的情况下，表达该多肽的工程化细胞可能对抗体西妥昔单抗(识别EGFR的结构域III)和曲妥珠单抗(识别HER2的结构域IV)均敏感。因此，本文所述的嵌合细胞表面多肽通过提供多种抗生素/结合配偶体的结合位点，提供了在免疫治疗期间控制免疫细胞行为的另一机制。例如，在过继细胞治疗期间出现副作用的受试者对施用的靶向嵌合细胞表面多肽中一个截短变体上的表位的抗生素(例如西妥昔单抗)不发生反应的情况下，可以向该受试者施用不同的抗体(例如曲妥珠单抗)，以经由嵌合细胞表面多肽的另一截短变体上的不同表位，靶向相同的工程化细胞。
在一些实施方案中，可将嵌合细胞表面多肽融合至与EGFR家族成员同源的跨膜结构域。例如，该跨膜结构域可以对应于来自EGFR/HER1、HER2、ErbB3或ErbB4的跨膜结构域。在其它实施方案中，该跨膜结构域可以同源于非EGFR跨膜结构域，包括对应于SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:38和SEQ ID NO:40的跨膜结构域。
在一些实施方案中，嵌合细胞表面多肽可包含HER1t多肽和截短的HER2(HER2t)多肽或其片段的嵌合体。例如，多肽构建体可包含含有HER1结构域III的HER1t/EGFRt多肽以及含有HER2结构域IV和HER2跨膜结构域的HER2t多肽。在一个实施方案中，与HER2跨膜结构域融合的EGFR-HER2嵌合细胞表面多肽可以由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包含与选自SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:92(δ16)的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，与HER2跨膜结构域融合的EGFR-HER2嵌合细胞表面多肽与选自SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:93(δ16)的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，嵌合细胞表面多肽可包含HER1t多肽和截短的ErbB3(ErbB3t)多肽或其片段的嵌合体。例如，多肽构建体可包含含有HER1结构域III的HER1t/EGFRt多肽以及含有ErbB3结构域IV和ErbB3跨膜结构域的ErbB3t多肽。在一个实施方案中，与ErbB3跨膜结构域融合的EGFR-ErbB3嵌合细胞表面多肽可以由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包含与SEQ ID NO:96的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，与ErbB3跨膜结构域融合的EGFR-ErbB3嵌合细胞表面多肽与SEQ ID NO:97的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，嵌合细胞表面多肽可包含HER1t多肽和截短的ErbB4(ErbB4t)多肽或其片段的嵌合体。例如，多肽构建体可包含含有结构域III的HER1t/EGFRt多肽以及含有ErbB4结构域IV和ErbB4跨膜结构域的ErbB4t多肽。在一些实施方案中，ErbB4t多肽可包含由ErbB4 JM-a替代转录物编码的JM-a细胞外近膜结构域。在一些实施方案中，ErbB4t多肽可包含由ErbB4 JM-b替代转录物编码的JM-b细胞外近膜结构域。在一个实施方案中，与ErbB4跨膜结构域融合的嵌合细胞表面多肽可以由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:100(EGFR-ErbB4(JM-a))和SEQ ID NO:104(EGFR-ErbB4(JM-b))组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，与ErbB4跨膜结构域融合的EGFR-ErbB4嵌合细胞表面多肽与选自由SEQ ID NO:101(EGFR-ErbB4(JM-a))和SEQ ID NO:105(EGFR-ErbB4)JM-b))组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
本文所述的多肽构建体可包含信号肽、含有HER1t多肽的细胞表面多肽(例如，仅含有HER1t或含有包含HER1t的嵌合多肽)、跨膜结构域和可选的连接体的任何组合。例如，多肽构建体可包含细胞表面多肽，该细胞表面多肽包含HER1t多肽或含有HER1t的嵌合多肽，该HER1t通过连接体(例如一个或多个(例如1-4个)拷贝的G4S(SEQ ID NO:221))与CD28跨膜结构域的衍生物或片段连接或融合。在一些实施方案中，细胞表面多肽可包括由以下多核苷酸编码的HER1t多肽，该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:56(HER1t1)、SEQ ID NO:58(HER1t2)、SEQ ID NO:60(HER1t3)、SEQ ID NO:62(HER1t4)、SEQ.ID NO:64(HER1t5)、SEQID NO:66(HER1t6)、SEQ ID NO:68(HER1t7)、SEQ ID NO:72(HER1t8)、SEQ ID NO:76(HER1t9)、SEQ ID NO:80(HER1t10)和SEQ ID NO:84(HER1t11)组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，细胞表面多肽可包括HER1t多肽，该HER1t多肽包含与选自由SEQ ID NO:55(HER1t)、SEQ ID NO:57(HER1t1)、SEQ ID NO:59(HER1t2)、SEQ ID NO:61(HER1t3)、SEQ.IDNO:63(HER1t4)、SEQ ID NO:65(HER1t5)、SEQ ID NO:67(HER1t6)、SEQ ID NO:69(HER1t7)、SEQ ID NO:73(HER1t8)、SEQ ID NO:77(HER1t9)、SEQ ID NO:81(HER1t10)和SEQ ID NO:85(HER1t11)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多肽构建体可包含信号肽、含有HER1t多肽或包含HER1t多肽的嵌合多肽的细胞表面多肽、含有跨膜二聚化结构域的跨膜结构域以及连接跨膜结构域与细胞表面多肽的连接体。例如，多肽构建体可包含Ig Kappa信号肽、HER1的特定截短变体、连接体(例如(G4S)4(SEQ ID NO:22))和跨膜二聚化结构域(例如，包含血型糖蛋白A的I92-I114或来自CD3ζ的跨膜结构域)。在实施方案中，包含HER1t多肽和跨膜二聚化结构域的多肽构建体由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:70(血型糖蛋白A；HER1t8)、SEQ ID NO:74(血型糖蛋白A；HER1t9)、SEQ ID NO:78(血型糖蛋白A；HER1t10)和SEQ ID NO:82(CD3ζ；HER1t11)组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在实施方案中，包含HER1t多肽和跨膜二聚化结构域的多肽构建体包含与选自由SEQ ID NO:71(血型糖蛋白A；HER1t8)、SEQ ID NO:75(血型糖蛋白A；HER1t9)、SEQ ID NO:79(血型糖蛋白A；HER1t10)和SEQ ID NO:83(CD3ζ；HER1t11)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，多肽构建体可包含细胞表面多肽，该细胞表面多肽包含连接至HER2跨膜结构域的HER1t-HER2t嵌合体。截短的HER1t-HER2t嵌合体和跨膜结构域可以进一步连接至将多肽构建体引导至细胞表面的信号肽(例如，GMCSFRα)。在一个实施方案中，多肽构建体由与选自由SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:90的序列(δ16)组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的多核苷酸编码。在一个实施方案中，多肽构建体具有与选自由SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:91(δ16)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在另一个实例中，多肽构建体可包含细胞表面多肽，该细胞表面多肽包含与ErbB3跨膜结构域连接的HER1t-ErbB3t嵌合体。在一个实施方案中，该HER1t-ErbB3t嵌合体和跨膜结构域进一步连接至将多肽构建体引导至细胞表面的信号肽(例如，GMCSFRα)。在一个实施方案中，多肽构建体由与SEQ ID NO:94的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的多核苷酸编码。在一个实施方案中，多肽构建体具有与SEQ ID NO:95的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在又一个实例中，多肽构建体可包含细胞表面多肽，该细胞表面多肽包含连接至ErbB4跨膜结构域的HER1t-ErbB4t嵌合体。在一个实施方案中，该HER1t-ErbB4t嵌合体和跨膜结构域进一步连接至将多肽构建体引导至细胞表面的信号肽(例如，GMCSFRα)。在一个实施方案中，多肽构建体由与选自由SEQ ID NO:98(JM-a变体)和SEQ ID NO:102(JM-b变体)组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的多核苷酸编码。在一个实施方案中，多肽构建体具有与选自由SEQ ID NO:99(JM-a变体)和SEQ ID NO:103(JM-b变体)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
包含HER1t多肽的多肽构建体可包含能够将多肽构建体引导至细胞表面的任何信号肽。例如，包含HER1t多肽(例如，包含与选自由SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:210、SEQ IDNO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216和SEQ ID NO:217组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列)的细胞表面多肽可以与包含与信号肽融合，该信号肽包含与选自由SEQ ID NO:2(GMCSFRα)、SEQ ID NO:4(Ig Kappa)、SEQ ID NO:6(免疫球蛋白E)、SEQ ID NO:8(CD8α)、SEQ ID NO:10(TVB2)、SEQ ID NO:12(CD52)或SEQ ID NO:14(LNFGR)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
包含HER1t多肽的多肽构建体可以包含任何跨膜结构域，包括不包含二聚化结构域的跨膜结构域。例如，包含HER1t多肽(例如，包含与选自由SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQID NO:216和SEQ ID NO:217组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列)的细胞表面多肽可以连接至跨膜结构域，该跨膜结构域包含与选自由SEQ ID NO:26(血型糖基蛋白A E91-R116)、SEQ ID NO:28(血型糖基蛋白A I92-I114)、SEQ ID NO:30(血型糖基蛋白A(I92-L109).整联蛋白β3(A737-W741)、SEQ ID NO:32(CD3ζ链)、SEQ ID NO:34(CD8α)、SEQ ID NO:36(CD28)、SEQ ID NO:38(CTLA4)和SEQ ID NO:40(LNGFR)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
包含HER1t多肽的多肽构建体可以包含任何肽连接体(或者在一些实施方案中不包含肽连接体)。例如，包含HER1t(例如，包含与选自由SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:210、SEQID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216和SEQ ID NO:217组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列)的细胞表面多肽可以与肽连接体融合，该肽连接体包含与选自由SEQ ID NO:16(GSG)、SEQ ID NO:18(SGSG)、SEQ ID NO:20((G4S)3)、SEQID NO:22((G4S)4)和SEQ ID NO:24(Whitlow)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
细胞表面多肽可并入截短的CD多肽。例如，细胞表面多肽可包括截短的CD20多肽(在本文中称为CD20t)。天然CD20多肽是由跨膜4结构域亚家族A成员1(MS4A1)基因编码的多次通过式跨膜蛋白。在某些实施方案中，全长CD20可以由包含SEQ ID NO:106的核苷酸序列的多核苷酸编码，并且全长CD20氨基酸序列可以对应于SEQ ID NO:107的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD20包含涉及氨基酸57-78、85-105、121-141和189-209的4次跨膜结构域通过。在一些实施方案中，CD20包含涉及氨基酸79-84和142-188的2个胞外结构域。在一些实施方案中，CD20包含涉及氨基酸1-56、106-120和210-297的3个胞质结构域。
本文提供了包含被截短了内源CD20的任何氨基酸、结构域或片段的CD20多肽的多肽构建体。在本文中，CD20多肽可包含CD20t多肽。在一些实施方案中，CD20多肽由或基本上由CD20t多肽组成。在其它实施方案中，除了另一个CD20结构域或其部分(例如，CD20跨膜结构域和/或细胞质结构域)之外，CD20多肽还可包含CD20t多肽。例如，CD20多肽可在细胞内胞质(例如信号传导)结构域或其部分、跨膜(例如螺旋)结构域或其部分和/或其胞外结构域或其部分被截短。在一些实施方案中，相对于野生型多肽，CD20多肽可以缺少多个结构域或结构域的多个部分。在一个实施方案中，CD20多肽包含内源CD20的M1-E263(SEQ ID NO:109；CD20t1)、内源CD20的M117-N214(SEQ ID NO:111(CD20t2))、内源CD20的M1-N214(SEQID NO:115；CD20t4)、内源CD20的V82-N214(SEQ ID NO:117；CD20t5)或内源CD20的V82-I186(SEQ ID NO:119，CD20t6)。
在一个实施方案中，CD20t多肽可包含胞外结构域或其片段。在一个实施方案中，CD20t多肽与选自由SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219和SEQ ID NO:220组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，CD20t多肽可以与跨膜结构域或其片段连接。在一个实施方案中，多肽构建体包含与CD20跨膜结构域连接的CD20t多肽。在一些实施方案中，包含与CD20跨膜结构域连接的CD20t多肽的多肽构建体由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:108(CD20t1，编码M1-E263)、SEQ ID NO:110(CD20t2，编码M117-N214)、SEQ ID NO:114(CD20t4，编码M1-N214)、SEQ ID NO:116(CD20t5，编码V82-N214)、SEQ ID NO:118(CD20t6，编码V82-I186)、SEQ ID NO:132(CD20t13，编码M1-A54和C111-P297)、SEQ ID NO:134(CD20t14，编码M1-A54和C111-E281)、SEQ ID NO:136(CD20t15，编码M1-A54和C111-E263)、SEQ ID NO:138(CD20t16，编码M1-A54和C111-V228)和SEQ ID NO:140(CD20t17，编码M1-V8和C111-P297)组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，包含与CD20跨膜结构域连接的CD20t多肽的多肽构建体可包含与选自由SEQ ID NO:109(CD20t1：M1-E263)、SEQ ID NO:111(CD20t2：M117-N214)、SEQ ID NO:115(CD20t4：M1-N214)、SEQ ID NO:117(CD20t5：V82-N214)、SEQ ID NO:119(CD20t6：V82-I186)、SEQ ID NO:133(CD20t13：M1-A54和C111-P297)、SEQ ID NO:135(CD20t14：M1-A54和C111-E281)、SEQ ID NO:137(CD20t15：M1-A54和C111-E263)、SEQ ID NO:139(CD20t16：M1-A54和C111-V228)和SEQ ID NO:141(CD20t17：M1-V8和C111-P297)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CD20t多肽可以保留内源CD20的利妥昔单抗结合模拟表位的至少一个拷贝，如Philip等人,(2014),“A highly compact epitope-based marker/suicide gene for easier and safer T-cell therapy,”Blood:124:1277-1287所述。在一些实施方案中，可以将CD20t的利妥昔单抗结合表位的一个或多个拷贝融合至一个或多个CD-34衍生的氨基酸序列，如CD34的有助于抗CD34单克隆抗体结合的氨基末端40个氨基酸。在一些实施方案中，CD20t多肽可以有多个结构域被去除，或有多个结构域的一部分被去除。
并入CD20t多肽的细胞表面多肽可以包括可以被外源引入的抗体或结合配偶体识别的表位。例如，包含在细胞表面多肽中的CD20t多肽可以并入利妥昔单抗结合结构域，以促进表达本文所述多肽构建体的细胞的靶向消耗(例如，通过CDC和/或抗体依赖性细胞毒性ADCC)。可用于结合包含CD20t多肽的细胞表面多肽的表位的抗体的非限制性实例包括利妥昔单抗、hOUBM3/6、阿托珠单抗、blontuvetmab、obinutuzumab、替伊莫单抗、托西莫单抗、奥法木单抗、奥卡珠单抗、奥瑞珠单抗、TRU-015(Trubion)和维妥珠单抗(IMMU-106)。在多个实施方案中，该抗体可以是单克隆抗体、scFv、scFab、双抗体或骆驼科抗体。在其它实施方案中，该抗体可以与药物或毒素缀合。在一些实施方案中，CD20t多肽包括在内源CD20的胞外结构域中发现的表位。在一些实施方案中，CD20t多肽的表位包括内源CD20的氨基酸170-185。在一些实施方案中，CD20t多肽的表位包括内源CD20的氨基酸170-173和182-185。
在进一步的实施方案中，包含CD20t多肽的细胞表面多肽对于一种或多种其它多肽的截短变体是嵌合的。例如，嵌合细胞表面多肽可包含CD20t多肽和截短的CD8α(CD8αt)多肽。
细胞表面多肽可以进一步包含多个CD20t连接的序列一起作为多联体。例如，细胞表面多肽可以包含连续重复的相同CD20t氨基酸序列，或连接在一起的不同CD20t变体。在一些实施方案中，CD20t氨基酸序列通过肽连接体在细胞表面多肽中连接在一起。在一个实施方案中，可使用SGS或SG4S连接体(SEQ ID NO:223)将细胞表面多肽中重复的CD20氨基酸序列连接在一起(例如，参见SEQ ID NO:123(SGS连接体)和SEQ ID NO:129(SG4S连接体(SEQ ID NO:223))，其进一步包含通过SG4S连接体(SEQ ID NO:223)连接至CD28跨膜结构域的细胞表面多肽。
本文所述的多肽构建体可包含信号肽、含有CD20t多肽(例如，仅包含CD20t或包含CD20t嵌合体)的细胞表面多肽、跨膜结构域和可选的连接体的任何组合。例如，多肽构建体可包含SG4S连接体(SEQ ID NO:223)，该连接体将包含CD20t多肽的细胞表面多肽连接或融合至跨膜结构域。在某些实施方案中，跨膜结构域衍生自或同源于CD20、CD28或CD8α的跨膜结构域或其片段。在一个实施方案中，包含CD20t的多肽构建体由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:112(CD20t3，编码CD20t(K142-S188)和CD8α(I183-T203)跨膜结构域)、SEQ ID NO:120(CD20t7，编码CD20t(P160-Q187)、SG4S连接体(SEQ ID NO:223)和CD28(I96-D172)跨膜结构域)、SEQ ID NO:122(CD20t8，编码CD20t-多联体(P160-Q187，由SGS连接体隔开)、SG4S连接体(SEQ ID NO:223)和CD28(I96-D172)跨膜结构域)、SEQ IDNO:124(CD20t9，编码CD20t(P160-Q187)、SG4S连接体(SEQ ID NO:223)和CD8α(P120-V201)跨膜结构域)、SEQ ID NO:126(CD20t10，编码CD20t(C167-C183)、SG4S连接体(SEQ IDNO:223)和CD28(I96-D172)跨膜结构域、SEQ ID NO:128(CD20t11，编码CD20多联体(C167-C183，由SG4S连接体(SEQ ID NO:223)隔开)、SG4S连接体(SEQ ID NO:223)和CD28(I96-D172)跨膜结构域和SEQ ID NO:130(CD20t12，编码CD20t(C167-C183)、SG4S连接体(SEQ IDNO:223)和CD8α(P120-V201)跨膜结构域)组成的列表的核苷酸序列。在一个实施方案中，包含CD20t的多肽构建体包含选自由SEQ ID NO:113(CD20t3；CD20t(K142-S188)和CD8α(I183-T203)跨膜结构域)、SEQ ID NO:121(CD20t7，编码CD20t(P160-Q187)、SG4S连接体(SEQ ID NO:223)和CD28(I96-D172)跨膜结构域)、SEQ ID NO:123(CD20t8，编码CD20t-多联体(P160-Q187，由SGS连接体隔开)、SG4S连接体(SEQ ID NO:223)和CD28(I96-D172)跨膜结构域)、SEQ ID NO:125(CD20t9，编码CD20t(P160-Q187)、SG4S连接体(SEQ ID NO:223)和CD8α(P120-V201)跨膜结构域)、SEQ ID NO:127(CD20t10，编码CD20t(C167-C183)、SG4S连接体(SEQ ID NO:223)和CD28(I96-D172)跨膜结构域、SEQ ID NO:129(CD20t11，编码CD20多联体(C167-C183，由SG4S连接体(SEQ ID NO:223)隔开)、SG4S连接体(SEQ ID NO:223)和CD28(I96-D172)跨膜结构域和SEQ ID NO:131(CD20t12，编码CD20t(C167-C183)、SG4S连接体(SEQ ID NO:223)和CD8α(P120-V201)跨膜结构域)组成的列表的氨基酸序列。
包含CD20t多肽的多肽构建体可以包含能够将多肽构建体引导至细胞表面的任何信号肽。例如，可以将包含CD20t多肽(例如，包含选自由SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219和SEQ ID NO:220组成的列表的氨基酸序列的多肽)的多肽构建体融合至信号肽，该信号肽包含与选自由SEQ ID NO:2(GMCSFRα)、SEQ ID NO:4(IG Kappa)、SEQ ID NO:6(免疫球蛋白E)、SEQ ID NO:8(CD8α)、SEQ ID NO:10(TVB2)、SEQ ID NO:12(CD52)或SEQ ID NO:14(LNFGR)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
包含CD20t多肽的多肽构建体可以包含任何跨膜结构域，包括包含二聚化结构域或不包含二聚化结构域的跨膜结构域。例如，可以将包含CD20t多肽(例如，包含选自由SEQID NO:218、SEQ ID NO:219和SEQ ID NO:220组成的列表的氨基酸序列的多肽)的多肽构建体融合至跨膜结构域，该跨膜结构域包含与选自由SEQ ID NO:26(血型糖蛋白A E91-R116)、SEQ ID NO:28(血型糖蛋白A I92-I114)、SEQ ID NO:30(血型糖蛋白A(I92-L109).整联蛋白β3(A737-W741)、SEQ ID NO:32(CD3ζ链)、SEQ ID NO:34(CD8α)、SEQ ID NO:36(CD28)、SEQ ID NO:38(CTLA4)和SEQ ID NO:40(LNGFR)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。包含CD20t的多肽构建体可进一步包含衍生自或同源于CD28和/或CD8α的跨膜结构域。
包含CD20t多肽的多肽构建体可包含任何肽连接体(或者在一些实施方案中不包含肽连接体)。例如，可以将包含CD20t多肽(例如，包含选自由SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219和SEQ ID NO:220组成的列表的氨基酸序列的多肽)的多肽构建体融合至肽连接体，该肽连接体包含与选自由SEQ ID NO:16(GSG)、SEQ ID NO:18(SGSG)、SEQ ID NO:20((G4S)3)、SEQ ID NO:22((G4S)4)和SEQ ID NO:24(Whitlow)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
可以被截短并引入本文所述细胞标签中的CD多肽的另一个实例是CD52。CD52在人类中作为在其C末端与糖磷脂酰肌醇(GPI)锚连接的12个氨基酸的肽而内源性存在。在一些实施方案中，可使用糖磷脂酰肌醇(GPI)将本文所述的多肽锚定至细胞表面。
本文提供了包含被截短了内源CD52的任何氨基酸、结构域或片段的CD52多肽的多肽构建体。在本文中，CD52多肽可包含截短的CD52(CD52t)多肽。在一些实施方案中，CD52多肽由或基本上由包含CD52t多肽的细胞表面多肽组成。在其它实施方案中，CD52多肽可包含细胞表面多肽，该细胞表面多肽除其它CD52结构域(例如CD52信号肽)外还包含CD52t多肽。
本文提供了包含含有截短的CD52t多肽的细胞表面多肽的多肽构建体。在一些实施方案中，CD52t多肽连接至用于将截短变体引导至细胞表面的CD52信号肽。在一些实施方案中，包含CD52t多肽的细胞表面多肽可以并入可以被外源引入的抗体或结合配偶体识别的一个或多个表位。例如，CD52t多肽可并入一个或多个阿仑珠单抗结合结构域，从而促进表达本文所述多肽构建体的细胞的靶向消耗。在一些实施方案中，靶向消耗可以由阿仑珠单抗介导的CDC和/或ADCC或介导阿仑珠单抗识别的细胞毒性作用的另一种细胞机制引起。可以识别包含CD52t多肽的细胞表面多肽的抗CD52分子的非限制性实例包括阿仑珠单抗、ANT1034、HI 186(Bio Rad)、YTH34.5(Bio Rad)和YTH66.9HL(Bio-Rad)。在多个实施方案中，该抗体可以是单克隆抗体、scFv、scFab、双抗体或骆驼科抗体。在一个实施方案中，编码CD52表位的多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:142的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，CD52表位与SEQID NO:143的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
本文所述的多肽构建体可以具有可以被抗体或结合配偶体识别的多个表位。例如，在CD52t多肽的情况下，包含CD52t多肽的多肽构建体可以包含对结合配偶体(例如阿仑珠单抗)具有特异性的多个表位。在一个实施方案中，CD52t多肽包含SEQ ID NO:143所示氨基酸序列的多个拷贝(例如，至少两个拷贝、至少三个拷贝、至少四个拷贝、至少五个拷贝、至少六个拷贝或至少十个拷贝)。氨基酸序列的每个拷贝或重复可以在多肽构建体中被连接体(例如Whitlow连接体)隔开。在一个实施方案中，多肽构建体包含CD52信号肽，该CD52信号肽连接至CD52t多肽的一个或多个拷贝，该拷贝融合至Whitlow连接体，该Whitlow连接体连接至(例如，经由(G4S)连接体(SEQ ID NO:221)的一个或多个拷贝))跨膜结构域(例如，CD28跨膜结构域或其片段)。在一个实施方案中，包含CD52t多肽的多肽构建体由与选自SEQ ID NO:144(CD52t1；编码表位/连接体的一个拷贝)、SEQ ID NO:146(CD52t2；编码表位/连接体的两个拷贝)和SEQ ID NO:148(CD52t3；编码表位/连接体的三个拷贝)的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的多核苷酸编码。在一个实施方案中，包含CD52t多肽的多肽与选自由EQ ID NO:145(CD52t1；编码表位/连接体的一个拷贝)、SEQ ID NO:147(CD52t2；编码表位/连接体的两个拷贝)和SEQ ID NO:149(CD52t3；编码表位/连接体的3个拷贝)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
包含CD52t多肽的多肽构建体可以包含任何跨膜结构域，包括包含二聚化结构域或不包含二聚化结构域的跨膜结构域。例如，包含CD52t多肽的细胞表面多肽可以通过连接体(例如3xGS连接体(SEQ ID NO:224))融合至包含跨膜二聚化结构域的跨膜结构域(例如衍生自或同源于血型糖蛋白A或血型糖蛋白A-整联蛋白β3的跨膜结构域)。在一个实施方案中，包含CD52t多肽的多肽构建体与选自由SEQ ID NO:150(CD52t4；CD52信号肽、3xGS肽连接体(SEQ ID NO:224)和血型糖蛋白A跨膜结构域)，SEQ ID NO:151(CD52t5；CD52信号肽、3xGS肽连接体(SEQ ID NO:224)和血型糖蛋白A跨膜结构域)和SEQ ID NO:152(CD52t6；CD52信号肽、3xGS连接体(SEQ ID NO:224)和血型糖蛋白A-整联蛋白β3跨膜结构域)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在实施方案中，包含CD52t多肽(例如，SEQ ID NO:143，其可以连接至CD52信号肽，以产生与选自由SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:149组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列)的多肽构建体可以连接至跨膜结构域，该跨膜结构域包含与选自由SEQ ID NO:26(血型糖蛋白AE91-R116)、SEQ ID NO:28(血型糖蛋白A I92-I114)、SEQ ID NO:30(血型糖蛋白A(I92-L109).整联蛋白β3(A737-W741)、SEQ ID NO:32(CD3ζ链)、SEQ ID NO:34(CD8α)、SEQ IDNO:36(CD28)、SEQ ID NO:38(CTLA4)和SEQ ID NO:40(LNGFR)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
包含CD52t多肽的多肽构建体可以包含能够将多肽构建体引导至细胞表面的任何信号肽。在一个实施方案中，CD52t多肽连接至CD52的信号肽(例如，多肽构建体包含与选自由SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:149组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列)。在一些实施方案中，多肽构建体包含与信号肽连接的CD52t多肽(例如SEQ ID NO:143)，该信号肽包含与选自由SEQ ID NO:2(GMCSFRα)、SEQ ID NO:4(IG Kappa)、SEQ ID NO:6(免疫球蛋白E)、SEQID NO:8(CD8α)、SEQ ID NO:10(TVB2)、SEQ ID NO:12(CD52)或SEQ ID NO:14(LNFGR)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
包含CD52t多肽的多肽构建体可以包含任何肽连接体(或者在一些实施方案中不包含肽连接体)。例如，包含CD52t的细胞表面多肽(例如，包含与SEQ ID NO:143的氨基酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列)可以融合至肽连接体，该肽连接体包含与选自由SEQ ID NO:16(GSG)、SEQ ID NO:18(SGSG)、SEQ IDNO:20((G4S)3)、SEQ ID NO:22((G4S)4)和SEQ ID NO:24(Whitlow)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在其它实施方案中，细胞表面多肽可包括来自肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的多肽的截短形式。例如，LNGFR是具有胞外结构域的单次通过式I型跨膜糖蛋白，该胞外结构域部分由于该蛋白质的半胱氨酸残基之间形成二硫键而表现出折叠的结构。在一个实施方案中，编码LNGFR或其部分的多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:155(编码LNGFR胞外结构域的K29-N250)、SEQ ID NO:157(编码E65-N250，包括能够形成二硫键的半胱氨酸残基2、3、4)和SEQ ID NO:159(编码R108-N250，包括能够形成二硫键的半胱氨酸残基3、4)组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，LNGFR与选自由SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:156(包含LNGFR胞外结构域的K29-N250)、SEQ ID NO:158(包含E65-N250，包括能够形成二硫键的半胱氨酸残基2、3、4)和SEQ ID NO:160(包括R108-N250，包括能够形成二硫键的半胱氨酸残基3、4)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
本文提供了包含被截短了内源LNGFR的任何氨基酸、结构域或片段的LNGFR多肽的多肽构建体。在本文中，LNGFR多肽可包含LNGFRt多肽。在一些实施方案中，LNGFR多肽由或基本上由包含LNGFRt多肽的细胞表面多肽组成。在其它实施方案中，LNGFR多肽可以包含细胞表面多肽，该细胞表面多肽除了其它LNGFR结构域(例如，LNGFR跨膜结构域)外还包含LNGFRt多肽。
多肽构建体可包含截短的LNGFR(在本文为LNGFRt)多肽，其任何结构域或其片段相对于野生型蛋白质被截短。例如，LNGFRt多肽可被截短跨膜结构域或其部分、细胞内结构域或其部分或胞外结构域或其部分中的一个或多个。在一些实施方案中，LNGFRt多肽可被截短一个或多个构成其配体(例如，NGF、BDNF、NTF3和NTF4)的天然结合域的TNFR-Cys重复序列。在一个实施方案中，多肽构建体包含含有整个胞外结构域的LNGFRt多肽(SEQ ID NO:156)。在一个实施方案中，将包含LNGFRt多肽的多肽构建体融合至LNGFR跨膜结构域。在一个实施方案中，编码与LNGFR跨膜结构域连接的LNGFRt多肽的多核苷酸包含与SEQ ID NO:161(LNGFRt1)的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，与LNGFR跨膜结构域连接的LNGFRt多肽与SEQ ID NO:162(LNGFRt1)的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
包含LNGFRt多肽的多肽构建体可包含任何跨膜结构域，包括包含二聚化结构域或不包含二聚化结构域的跨膜结构域。例如，多肽构建体可包含连接至LNGFR跨膜结构域或其片段的LNGFRt多肽。在其它实施方案中，LNGFRt多肽可以融合(例如，经由连接体)至衍生自不同多肽的跨膜结构域或其片段，包括能够二聚化的跨膜结构域。在一个实施方案中，包含LNGFRt多肽的多肽构建体与选自由SEQ ID NO:163(LNGFRt2；整个LNGFR胞外结构域；GS连接体和CD28跨膜结构域)、SEQ ID NO:164(LNGFRt3；LNGFR胞外结构域的片段，包括半胱氨酸残基2-4、GS肽连接体和CD28跨膜结构域)、SEQ ID NO:165(LNGFRt3；LNGFR胞外域的片段，包括半胱氨酸残基3-4、GS肽连接体和CD28跨膜域)、SEQ ID NO:166(LNGFRt5；LNGFR胞外域的片段，包括半胱氨酸残基3-4、GS连接体和血型糖蛋白A跨膜结构域)、SEQ ID NO:167(LNGFRt6；LNGFR胞外域的片段，包括半胱氨酸残基3-4、GS连接体和血型糖蛋白A跨膜结构域)、SEQ ID NO:168(LNGFRt7；LNGFR胞外域的片段，其包含半胱氨酸残基3-4、GS连接体和血型糖蛋白A-整联蛋白β3跨膜结构域)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，可以将包含LNGFRt多肽的多肽构建体融合至跨膜结构域，该跨膜结构域包含与选自由SEQ ID NO:26(血型糖蛋白A E91-R116)、SEQ ID NO:28(血型糖蛋白A I92-I114)、SEQ ID NO:30(血型糖蛋白A(I92-L109).整联蛋白β3(A737-W741)、SEQID NO:32(CD3ζ链)、SEQ ID NO:34(CD8α)、SEQ ID NO:36(CD28)、SEQ ID NO:38(CTLA4)和SEQ ID NO:40(LNGFR)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
包含LNGFRt多肽的多肽构建体可以包含能够将多肽构建体引导至细胞表面的任何信号肽。例如，可以将包含LNGFRt多肽的细胞表面多肽融合至信号肽，该信号肽包含与选自由SEQ ID NO:2(GMCSFRα)、SEQ ID NO:4(IG Kappa)、SEQ ID NO:6(免疫球蛋白E)、SEQID NO:8(CD8α)、SEQ ID NO:10(TVB2)、SEQ ID NO:12(CD52)或SEQ ID NO:14(LNFGR)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
包含LNGFRt多肽的多肽构建体可以包含任何肽连接体(或者在一些实施方案中不包含肽连接体)。例如，可以将包含LNGFRt多肽的细胞表面多肽融合至肽连接体，该肽连接体包含与选自由SEQ ID NO:16(GSG)、SEQ ID NO:18(SGSG)、SEQ ID NO:20((G4S)3)、SEQID NO:22((G4S)4)和SEQ ID NO:24(Whitlow)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
多核苷酸构建体
载体
本文所述的多肽构建体可以由一种或多种编码经由载体引入到工程化细胞中的多核苷酸编码。在本文中，“表达载体”或“载体”是任何遗传元件，例如质粒、染色体、病毒、转座子，其表现为细胞内多核苷酸复制的自主单元(即能够在其自身控制下复制)或通过插入宿主细胞染色体中而能够复制，其已附接有另一多核苷酸区段，以便实现所附接的区段的复制和/或表达。合适的载体包括但不限于质粒、转座子、噬菌体和粘粒。载体可含有实现载体连接或插入所需宿主细胞中以及实现附接区段的表达所必需的多核苷酸序列。这样的序列根据宿主生物体而不同；它们包括实现转录的启动子序列、增加转录的增强子序列、核糖体结合位点序列以及转录和翻译终止序列。或者，表达载体可以能够直接表达其中编码的核酸序列产物，而无需载体连接或整合到宿主细胞DNA序列中。
载体还可以包含“选择标记基因”。如本文所用的，术语“选择标记基因”是指在相应选择剂的存在下允许表达核酸序列的细胞被特异性选择或排除的核酸序列。合适的选择标记基因是本领域已知的，并描述于例如国际专利申请公开WO 1992/08796和WO 1994/28143；Wigler等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:3567(1980)；O’Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:1527(1981)；Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78:2072(1981)；Colberre-Garapin等人,J.Mol.Biol.,150:1(1981)；Santerre等人,Gene,30:147(1984)；Kent等人,Science,237:901-903(1987)；Wigler等人,Cell,11:223(1977)；Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,48:2026(1962)；Lowy等人,Cell,22:817(1980)；和美国专利5,122,464和5,770,359。
在一些实施方案中，所述载体是“附加型表达载体”或“附加体”，其能够在宿主细胞中复制，并且在适当选择压力的存在下作为DNA的染色体外区段存在于宿主细胞内(参见，例如，Conese等人,Gene Therapy,11:1735-1742(2004))。代表性的可商购的附加型表达载体包括但不限于利用EB核抗原1(EBNA1)和EB病毒(EBV)复制起点(oriP)的附加型质粒。来自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)的载体pREP4、pCEP4、pREP7和pcDNA3.1以及来自Stratagene(La Jolla,Calif.)的pBK-CMV代表了使用T-抗原和SV40复制起点来代替EBNA1和oriP的附加型载体的非限制性实例。
本文提供了一种多肽构建体，其可以包含信号肽、跨膜结构域、含有天然多肽的截短变体的细胞表面多肽，以及可选的将跨膜结构域连接至细胞表面多肽的肽连接体。例如，图4A示出了具有细胞标签功能的多肽构建体的实施方案。截短的变体通过与跨膜结构域连接的肽连接体延伸到细胞外基质中。截短的变体可以包括针对抗截短变体抗体(例如，外源添加的)的一个或多个表位，该抗体可以识别并结合该截短变体/细胞标签。在一些实施方案中，该抗体与截短变体的结合可导致细胞消耗(例如，通过ADCC)，这可能是有益的，例如在细胞已被工程改造成表达一种或多种另外的分子如细胞因子、TCR和/或CAR的过继细胞疗法中。在一些实施方案中，不同的多肽构建体包含恒定的跨膜结构域和信号肽，但是在引入多肽构建体中的截短变体的身份上不同。例如，不同的多肽构建体可以包含相同天然多肽的不同的截短变体。当两个多肽构建体引入同一天然多肽的不同截短变体时，该多肽构建体可以基于该多肽构建体中是否存在肽连接体或该肽连接体的长度而进一步不同。在一些实施方案中，选择每个多肽构建体的肽连接体的大小，以在特定截短变体的远端与细胞表面之间保持相对恒定的距离。
本文提供了多核苷酸和使用该多核苷酸促进构建在免疫疗法中使用的多肽构建体的方法。在某些实施方案中，多核苷酸可包含载体，该载体包含编码信号肽和跨膜结构域(例如，包含或缺乏跨膜二聚化结构域)的序列。该载体可提供在信号肽与跨膜结构域之间克隆插入片段隆，使得该插入片段包含编码特定截短变体和可选的肽连接体的核苷酸序列。或者，可以提供包含编码信号肽、特定截短变体和可选的连接体的多核苷酸的载体，其提供与截短变体或连接体的编码序列相邻的编码跨膜结构域的核苷酸序列的插入。通过提供一系列载体，其在所得多肽构建体中的一个或多个特定结构域保持恒定，但允许交换进和交换出在多肽构建体之间可变的结构域，本公开促进了包含信号肽、截短变体、跨膜结构域和连接体的任何组合的多肽构建体的产生。
载体修饰
可用于本文所述的方法和组合物的多核苷酸载体可以是优良生产规范(GMP)兼容的载体。例如，GMP载体可能比非GMP载体更纯。在一些情况下，纯度可以通过生物负荷来测量。例如，生物负荷可以是在载体组合物中存在或不存在需氧菌、厌氧菌、产芽孢菌、真菌或其组合。在一些情况下，纯载体可以是低内毒素的或无内毒素的。纯度也可以通过双链引物步移测序来测量。质粒身份可以是确定载体纯度的来源。本发明的GMP载体可以比非GMP载体纯10％至99％。如通过存在生物负荷、内毒素、测序或其组合所测量的，GMP载体可以比非GMP载体纯10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些情况下，使用第一基因程序结束时的终止子序列。终止子序列可确保转录物在启动第二个基因程序之前终止。例如，表达载体可以含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这样的序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'非翻译区以及偶尔从3'非翻译区获得。这些区域可以含有在mRNA的非翻译部分中转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。包含表达载体的细胞在提供所需多肽表达的条件下于体内或体外生长。
在一些情况下，可以在由载体中的多核苷酸编码的第一多肽的末端使用间隔区序列。在其它情况下，可以在载体中的第二个基因的末端使用间隔区序列。也可以在载体中的第一个基因和第二个基因之后使用间隔区序列。
这些载体可用来表达由基因或目的基因的一部分编码的多肽。部分基因或基因可以通过使用任何(病毒性或非病毒性)方法插入。例如；一种方法可以是基于非病毒的技术。
构建体编码的其它特征
除上述多核苷酸构建体之外或与之一起，本文公开的多核苷酸可编码一种或多种蛋白质。例如，在一些实施方案中，所述多肽构建体可以与嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和/或细胞因子连接。
嵌合受体
本文所述的一些实施方案包括编码在细胞表面上表达的嵌合受体的多核苷酸。在一些情况下，嵌合受体包含能够识别和结合肿瘤抗原(例如肿瘤抗原，如肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)的抗原结合区。在一些情况下，抗原结合区包含抗体或结合片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、scFv、sc(Fv)2、dsFv、双抗体、微抗体和纳米抗体或其结合片段。在一些情况下，抗原结合区包含scFv。在一些情况下，嵌合受体包含scFv(例如，嵌合抗原受体(CAR))。在一些情况下，嵌合抗原受体包含模式识别受体。在其它情况下，嵌合受体包含工程化T细胞受体(TCR)。
嵌合抗原受体(CAR)
在一些实施方案中，表达本文所述多肽构建体的细胞也表达一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。
本文所述的嵌合抗原受体(CAR)是将外源特异性移植到免疫效应细胞上的工程化受体。在一些情况下，CAR包含胞外结构域(胞外域)和细胞内结构域(胞内域)，该胞外结构域包含抗原结合域、茎区、跨膜结构域。在一些情况下，细胞内结构域进一步包含一个或多个细胞内信号传导结构域。在一些情况下，本文所述的CAR包含抗原结合域、茎区、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和用于T细胞活化的信号传导结构域。
在实施方案中，本公开的CAR包含靶标特异性结合元件，其另外被称为抗原结合部分。在实施方案中，通过工程化与肿瘤细胞上的预定抗原特异性结合的所需抗原结合部分，将本公开的CAR工程化成靶向感兴趣的肿瘤抗原。在本公开的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性病症抗原”或“与过度增殖性病症相关的抗原”是指特定过度增殖性病症如癌症所共有的抗原。
抗原结合域可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。互补决定区(CDR)是在抗原受体(例如，免疫球蛋白和T细胞受体)蛋白的可变域中发现的短氨基酸序列，该短氨基酸序列采取与该抗原的结构互补的结构，因此为受体提供针对该特定抗原的特异性。抗原受体的每条多肽链可含有三个CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。在一些情况下，抗原结合域包含F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。在一些情况下，抗原结合域是scFv。在一些情况下，抗原结合域是Fab。在一些情况下，抗原结合域是Fab’。在一些情况下，抗原结合域是F(ab’)2。在一些情况下，抗原结合域是Fv。
在一些实施方案中，本文描述的CAR包含与CD19、CD20、CD33、CD44、BCMA、CD123、EGFRvIII、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72或VEGF-R2上的表位结合的抗原结合域。在一些实施方案中，本文描述的CAR包含与CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2上的表位结合的抗原结合域。在一些实施方案中，本文描述的CAR包含与CD19或CD33上的表位结合的抗原结合域。在一些情况下，本文描述的CAR包含与CD19上的表位结合的抗原结合域。在一些情况下，本文描述的CAR包含与CD33上的表位结合的抗原结合域。在进一步的实施方案中，本文描述的CAR或嵌合受体或抗原结合多肽包含自身抗原或与HLA-A2、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、因子VIII(FVIII)、MAdCAM1、SDF1或II型胶原蛋白上的表位结合的抗原结合区。
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸、多肽和方法可用于治疗过度增殖性疾病如癌症、自身免疫性疾病，或用于治疗感染，如病毒、细菌或寄生虫感染。在一些方面，抗原是在癌细胞、自身免疫细胞或被病毒、细菌或寄生虫感染的细胞中升高的抗原。可以被靶向的病原体包括但不限于疟原虫、锥虫、曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、HSV、HPV、RSV、EBV、CMV、JC病毒、BK病毒或埃博拉病原体。自身免疫性疾病可包括移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、狼疮、乳糜泻、克罗恩病、舍格伦综合征、风湿性多肌痛、多发性硬化、视神经脊髓炎、强直性脊柱炎、1型糖尿病、斑秃、血管炎、颞动脉炎、大疱性类天疱疮、银屑病、寻常型天疱疮或自身免疫性葡萄膜炎。
被CAR识别的病原体可以基本上是任何种类的病原体，但在一些实施方案中，病原体是真菌、细菌或病毒。示例性病毒病原体包括以下科的病毒病原体：腺病毒科、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、JC病毒、BK病毒、HPV病毒科、HSV病毒科、HHV病毒科、肝炎病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头多瘤空泡病毒科、多瘤病毒、弹状病毒科和披膜病毒科。示例性的致病病毒引起天花、流感、流行性腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉和风疹。示例性的致病真菌包括假丝酵母属、曲霉属、隐球酵母属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺囊虫属(Pneumocystis)和葡萄穗霉属(Stachybotrys)。示例性的致病细菌包括链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、志贺菌属(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、螺杆菌属(Helicobacter)、大肠杆菌(E.coli)、立克次体属(Rickettsia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、博德特氏菌属(Bordetella)、衣原体属(Chlamydia)、螺旋体属(Spirochetes)和沙门菌属(Salmonella)。在一些实施方案中，病原体受体Dectin-1可用于生成识别真菌如曲霉的细胞壁上的碳水化合物结构的CAR。在另一实施方案中，CAR可以基于识别病毒决定簇(例如来自CMV和埃博拉的糖蛋白)的抗体来制备，以中断病毒感染和病理学。
在一些实施方案中，使用“茎区”或“间隔体”或“铰链”区将抗原结合域与跨膜结构域连接。在一些情况下，“茎结构域”或“茎区”包括任何寡核苷酸或多肽，其起到将跨膜结构域连接到胞外结构域或多肽链中的胞质域的作用。在一些实施方案中，其足够灵活以允许抗原结合域在不同方向上定向，从而促进抗原识别。在一些情况下，茎区包含来自IgG1的铰链区。在备选的情况下，茎区包含免疫球蛋白的CH2CH3区和可选的CD3的部分。在一些情况下，茎区包含CD8α铰链区(SEQ ID NO:225)、IgG4-Fc 12氨基酸铰链区(ESKYGPPCPPCP)或IgG4铰链区，如WO/2016/073755所述。
跨膜结构域可以来自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。合适的跨膜结构域可包括T细胞受体的α、β或ζ链的跨膜区；或来自CD28、CD3ε、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154的跨膜区。或者，跨膜结构域可以是合成的，并且可以包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，在合成跨膜结构域的一个或两个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，在一些实施方案中，长度为2至10个氨基酸的短寡核苷酸或多肽连接体可以形成CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间的连接。在一些实施方案中，连接体是甘氨酸-丝氨酸连接体。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。在其它实施方案中，跨膜结构域包含CD3ζ跨膜结构域。在另外其它的实施方案中，跨膜结构域包含跨膜二聚化结构域。
细胞内结构域可包含一个或多个共刺激结构域。示例性共刺激结构域包括但不限于CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合。在一些情况下，本文所述的CAR包含选自CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的CAR包含选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、OX40(CD134)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的CAR包含选自CD8、CD28、4-1BB(CD137)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的CAR包含选自CD28、4-1BB(CD137)或其片段或组合的共刺激结构域中的一种或多种或两种或更多种。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD28和4-1BB(CD137)或其各自的片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD28和OX40(CD134)或其各自的片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD8和CD28或其各自的片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD28或其片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域4-1BB(CD137)或其片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域OX40(CD134)或其片段。在一些情况下，本文所述的CAR包含共刺激结构域CD8或其片段。
本公开的CAR的细胞内信号传导结构域(也称为细胞质结构域)负责激活已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应物功能。术语“效应物功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应物功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应物功能信号并指导细胞执行特化功能。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整条链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分时，可以使用这样的截短部分代替完整的链，只要它转导效应物功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意味着包括足以转导效应物功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。在一些实施方案中，细胞内结构域进一步包含用于T细胞活化的信号传导结构域。在一些情况下，用于T细胞活化的信号传导结构域包含衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的结构域。在一些情况下，用于T细胞活化的信号传导结构域包含衍生自CD3ζ的结构域。
当与CAR结合使用时，术语“功能部分”是指本公开内容的CAR的任何部分或片段，该部分或片段保留其作为一部分的CAR(亲本CAR)的生物活性。关于编码亲本CAR的核酸序列，编码CAR的功能部分的核酸序列可编码构成亲本CAR的例如约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多的蛋白质。
如本文所用的，术语“功能变体”是指这样的多肽或蛋白质，其与参考多肽具有较高或显著的序列同一性或相似性，并且保留其作为变体的参照多肽的生物活性。功能变体包括，例如，本文所述CAR(亲本CAR)的那些变体，其保留与亲本CAR相似程度、相同程度或更高程度的识别靶细胞的能力。关于编码亲本CAR的核酸序列，编码CAR的功能变体的核酸序列可以与编码亲本CAR的核酸序列例如约10％相同、约25％相同、约30％相同、约50％相同、约65％相同、约80％相同、约90％相同、约95％相同或约99％相同。
本文公开的多核苷酸构建体可以与CAR一起在工程化细胞中共表达。在一些实施方案中，多肽构建体和CAR可以由单个转录物编码。编码在同一转录物中包含截短变体和CAR的多肽构建体的一个优势是，产生CAR蛋白的工程化细胞也可能已产生该多肽构建体。因此，在免疫疗法期间需要干预以减少CAR表达(例如，减轻治疗的副作用)的情况下，可以引发与CAR共表达该多肽构建体的工程化细胞，以在相对较短的时间范围内响应于靶向由本文公开的截短变体赋予的细胞标签的外源抗体的施用。
CD19特异性CAR
CD19是免疫球蛋白超家族的细胞表面糖蛋白。在一些情况下，已经在诸如胰腺癌、肝癌和前列腺癌的实体瘤中检测到CD19。
在一些实施方案中，本文描述的CAR的抗原结合部分对CD19是特异性的。当在细胞表面上表达时，CD19特异性CAR可以将T细胞的特异性重定向至人CD19。在实施方案中，抗原结合域包含单链抗体片段(scFv)，后者包含通过柔性连接体如甘氨酸-丝氨酸连接体或Whitlow连接体连接的靶抗原特异性单克隆抗CD19抗体的可变域轻链(VL)和可变域重链(VH)。在实施方案中，scFv是SJ25C1和/或FMC63。在实施方案中，scFv是人源化的。在一些实施方案中，抗原结合部分可包含定向连接的VH和VL，例如，从N到C末端、VH-连接体-VL或VL-连接体-VH。
在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR，其中抗原结合域包含结合CD19的scFv。在一些情况下，抗原结合域识别CD19上的表位。
在一些实施方案中，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被JCAR014、JCAR015、JCAR017或19-28z CAR(Juno Therapeutics)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR-T细胞，其中抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被JCAR014、JCAR015、JCAR017或19-28z CAR(Juno Therapeutics)识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文描述的包括包含scFv抗原结合域的CD19特异性CAR-T细胞，并且抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被JCAR014、JCAR015、JCAR017或19-28zCAR(Juno Therapeutics)识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞包含US20160152723中描述的抗CD19抗体。
在一些实施方案中，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被KTE-C19(KitePharma,Inc.)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR-T细胞，其中抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被KTE-C19识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文描述的包括包含scFv抗原结合域的CD19特异性CAR-T细胞，并且抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被KTE-C19识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞包含WO2015187528中描述的抗CD19抗体或其片段或衍生物。
在一些实施方案中，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被CTL019(Novartis)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR-T细胞，其中抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被CTL019识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文描述的包括包含scFv抗原结合域的CD19特异性CAR-T细胞，并且抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被CTL019识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被UCART19(Cellectis)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR-T细胞，其中抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被UCART19识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文描述的包括包含scFv抗原结合域的CD19特异性CAR-T细胞，并且抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被UCART19识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被BPX-401(Bellicum)识别。在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR-T细胞，其中抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被BPX-401识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文描述的包括包含scFv抗原结合域的CD19特异性CAR-T细胞，并且抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被BPX-401识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些情况下，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被兰妥莫单抗(Amgen)、克托西单抗(coltuximabravtansine)(ImmunoGen Inc./Sanofi-aventis)、MOR208(Morphosys AG/Xencor Inc.)、MEDI-551(Medimmune)、地宁图珠单抗(denintuzumabmafodotin)(Seattle Genetics)、B4(或DI-B4)(Merck Serono)、泰普利莫单抗(taplitumomabpaptox)(National Cancer Institute)、XmAb 5871(Amgen/Xencor,Inc.)、MDX-1342(Medarex)或AFM11(Affimed)识别。在一些情况下，CD19特异性CAR进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些实施方案中，本文描述的包括CD19特异性CAR-T细胞，其中抗原结合域包含F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv或scFv。在一些情况下，抗原结合域识别CD19上的表位。在一些情况下，抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被兰妥莫单抗(Amgen)、克托西单抗(ImmunoGen Inc./Sanofi-aventis)、MOR208(Morphosys AG/Xencor Inc.)、MEDI-551(Medimmune)、地宁图珠单抗(Seattle Genetics)、B4(或DI-B4)(Merck Serono)、泰普利莫单抗(National Cancer Institute)、XmAb 5871(Amgen/Xencor,Inc.)、MDX-1342(Medarex)或AFM11(Affimed)识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一些情况下，本文所述的CD19特异性CAR-T细胞包含scFv抗原结合域，并且抗原结合域识别CD19上的表位，该表位也被兰妥莫单抗(Amgen)、克托西单抗(ImmunoGen Inc./Sanofi-aventis)、MOR208(Morphosys AG/Xencor Inc.)、MEDI-551(Medimmune)、地宁图珠单抗(Seattle Genetics)、B4(或DI-B4)(Merck Serono)、泰普利莫单抗(National CancerInstitute)、XmAb 5871(Amgen/Xencor,Inc.)、MDX-1342(Medarex)或AFM11(Affimed)识别。在一些情况下，CD19特异性CAR-T细胞进一步包含选自CD8α跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域的跨膜结构域；选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、ICOS、DAP10、DAP12、OX40(CD134)或其片段或组合的一个或多个共刺激结构域；以及来自CD3ζ的信号传导结构域。
在一个实施方案中，编码CAR的多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:169(编码CD19-CD3ζCAR)、SEQ ID NO:171(编码CD19-CD137-CD3C CAR)、SEQ ID NO:173(编码CD19-CD28-CD3C CAR)和SEQ ID NO:175(编码进一步包含IgG4 Fc间隔体的CD19-CD28-CD CAR)组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，包含CAR的氨基酸序列与选自由SEQ ID NO:170(CD19-CD3ζCAR)、SEQ ID NO:172(CD19-CD137-CD3ζCAR)、SEQ ID NO:174(CD19-CD28-CD3ζCAR)和SEQID NO:176(CD19-CD28-CD3ζCAR其进一步包含IgG4Fc间隔体)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的CAR。
在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸可以包含密码子优化的cDNA序列，该序列编码抗CD19 CAR和连接至细胞表面多肽(例如HER1t)的可切割T2A连接体。例如，可以将细胞毒性T淋巴细胞工程改造成表达CD19特异性嵌合抗原受体(CAR)，该受体通过与细胞质CD3-ζ结构域融合的细胞质共刺激(CD28)结构域发出信号。该多肽可进一步并入C末端2A可切割连接体，随后并入例如细胞外细胞标签，在一些实施方案中，其包含截短的人HER1(HER1t)、截短的CD20(CD20t)、截短的CD52(CD52t)或截短的LNGFR(LNGFRt)。在其它实施方案中，多肽可包含多肽构建体，该多肽构建体包含在CD19特异性CAR之前(例如通过P2A可切割连接体)的截短变体。
本公开提供了编码CAR和本文所述的任何多肽构建体的多核苷酸和多肽。在一个实施方案中，并入抗CD19 CAR、可切割T2A连接体和细胞表面多肽的多肽构建体由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:181(来自SEQ ID NO:56的CD19-CD28-CD3ζCAR.P2A.Ig Kappa信号肽.HER1t1)和SEQ ID NO:185(来自SEQ ID NO:68的CD19-CD137-CD3ζCAR.E2A.Ig Kappa信号肽.HER1t7)组成的列表的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在一个实施方案中，并入抗CD19CAR、可切割T2A连接体和细胞表面多肽的多肽构建体与选自由SEQ ID NO:179(CD19-CD137-CD3ζCAR.T2A.Ig Kappa信号肽.HER1t，来自SEQID NO:55)、SEQ ID NO:180(CD19-CD137-CD3ζCAR.T2A.Ig Kappa信号肽.HER1t，来自SEQID NO:55)、SEQ ID NO:182(CD19-CD28-CD3ζCAR.P2A.Ig Kappa信号肽.HER1t1，来自SEQID NO:57)、SEQ ID NO:183(Ig Kappa信号肽.HER1t1.P2A.CD8α信号肽.CD19-CD28-CD3ζCAR，其中HER1t1来自SEQ ID NO:57)、SEQ ID NO:184(CD19-CD28-CD3ζCAR.弗林蛋白酶-T2A.Ig Kappa信号肽.HER1t1，来自SEQ ID NO:57)、SEQ ID NO:186(CD19-CD137-CD3ζCAR.E2A.Ig Kappa信号肽.HER1t7，来自SEQ ID NO:69)、SEQ ID NO:187(CD19-CD28-CD3ζCAR.弗林蛋白酶-T2A.Ig Kappa信号肽.HER1t8，来自SEQ ID NO:73)、SEQ ID NO:188(CD19-CD137-CD3ζCAR.E2A.Ig Kappa信号肽.HER1t8，来自SEQ ID NO:73)、SEQ ID NO:189(CD19-CD28-CD3ζCAR.弗林蛋白酶-T2A.Ig Kappa信号肽.HER1t9，来自SEQ ID NO:77)、SEQID NO:190(CD19-CD137-CD3ζCAR.E2A.Ig Kappa信号肽.HER1t9，来自SEQ ID NO:77)、SEQID NO:191(CD19-CD28-CD3ζCAR.弗林蛋白酶-T2A.Ig Kappa信号肽.HER1t10，来自SEQ IDNO:81)、SEQ ID NO:192(CD19-CD137-CD3ζCAR.E2A.Ig Kappa信号肽.HER1t10，来自SEQ IDNO:81)、SEQ ID NO:194(CD19-CD28-CD3ζCAR.P2A.CD20)、SEQ ID NO:195(CD19-CD28-CD3ζCAR.P2A.CD20t1，来自SEQ ID NO:109)、SEQ ID NO:196(CD19-CD28-CD3ζCAR.P2A.CD20t4，来自SEQ ID NO:115)、SEQ ID NO:197(CD52t3.P2A.CD8α信号肽.CD19-CD28-CD3ζCAR、where CD52t3来自SEQ ID NO:149)和SEQ ID NO:198(Ig Kappa信号肽.LNGFRt4.P2A.CD8α信号肽.CD19-CD28-CD3ζCAR，其中LNGFRt4来自SEQ ID NO:165)组成的列表的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
工程化T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，由本文描述的多核苷酸编码的嵌合受体包含工程化T细胞受体。T细胞受体(TCR)由两条链(αβ或γδ)组成，这两条链在T细胞表面上配对以形成异二聚体受体。在一些情况下，αβTCR在体内的大多数T细胞上表达，并且已知参与特定MHC限制性抗原的识别。每条α和β链由两个结构域组成：恒定域(C)，其将蛋白质锚定至细胞膜并与CD3信号传导器的不变亚单位缔合；以及可变域(V)，其通过称为互补决定区(CDR)的六个环赋予抗原识别。在一些情况下，每个V结构域包含三个CDR；例如，CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR3作为高变区。这些CDR与抗原肽结合至由主要组织相容性复合物(pepMHC)编码的蛋白质而形成的复合物(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA或HLA-DRB1复合物)相互作用。在一些情况下，恒定域进一步包含将恒定域连接到可变域的接合区。在一些情况下，β链进一步包含构成接合区的一部分的较短的多样性区域。
在一些情况下，这样的TCR对特定肿瘤抗原(例如NY-ESO、Mage A3、Titin)具有反应性。在其它情况下，这样的TCR对患者肿瘤内表达的特定新抗原(即，由肿瘤表达的患者特异性突变、体细胞突变、非同义突变)具有反应性。在一些情况下，工程化TCR可以是亲和力增强的。
在一些实施方案中，使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法描述TCR，并且该TCR链接至TCR序列的IMGT公共数据库。例如，可存在几种类型的α链可变(Vα)区和几种类型的β链可变(Vβ)区，按其框架、CDR1、CDR2和CDR3序列区分。因此，Vα类型可以在IMGT命名法中指代为独特的TRAV编号。例如，“TRAV21”定义了具有独特框架和CDR1和CDR2序列以及CDR3序列的TCR Vα区域，该CDR3序列由在TCR之间保守的氨基酸序列部分限定但也包括在TCR之间变化的氨基酸序列。类似地，“TRBV5-1”定义了具有独特框架和CDR1和CDR2序列以及仅部分限定的CDR3序列的TCR Vβ区域。
在一些情况下，β链多样性区域在IMGT命名法中用缩写TRBD表示。
在一些情况下，由IMGT命名法定义的独特序列是公知的，并且可供TCR领域的工作人员访问。例如，它们可见于IMGT公共数据库和“T cell Receptor Factsbook”,(2001)LeFranc和LeFranc,Academic Press,ISBN 0-12-441352-8中。
在一些实施方案中，例如，αβ异二聚体TCR作为具有胞质域和跨膜结构域的全长链转染。在一些情况下，TCR在相应恒定域的残基之间含有引入的二硫键，如例如WO 2006/000830中所述。
在一些情况下，本文所述的TCR是单链形式，例如参见WO 2004/033685。单链形式包括Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vβ、Vα-L-Vβ-Cβ、Vα-Cα-L-Vβ-Cβ类型的αβTCR多肽，其中Vα和Vβ分别是TCRα和β可变区，Cα和Cβ分别是TCRα和β恒定区，并且L是连接体序列。在某些实施方案中，本公开的单链TCR可以在相应恒定域的残基之间具有引入的二硫键，如WO 2004/033685中所述。
本文所述的TCR可以与可检测标记、治疗剂或PK修饰部分缔合。
用于诊断目的的示例性可检测标记包括但不限于荧光标记、放射性标记、酶、核酸探针和造影剂。
本公开提供了编码TCR和本文所述的任何多肽构建体的多核苷酸和多肽。在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸可包含密码子优化的cDNA序列，该cDNA序列编码TCR和连接至细胞表面多肽(例如HER1t)的可切割T2A连接体。例如，可以将细胞毒性T淋巴细胞工程改造为表达TCR多肽，该多肽进一步并入C末端2A可切割连接体，随后并入例如胞外细胞标签，在一些实施方案中，其包含截短的人HER1(HER1t)、截短的CD20(CD201)、截短的CD52(CD52t)或截短的LNGFR(LNGFRt)。在其它实施方案中，多肽可以包含多肽构建体，该多肽构建体包含在TCR之前的截短变体(例如，通过P2A可切割连接体连接)。
细胞因子
本文提供了编码多肽细胞标签和细胞因子或其变体或衍生物的多核苷酸，以及并入该多核苷酸的方法和系统。细胞因子是一类约5-20kDa的参与细胞信号传导的小蛋白质。在一些实施方案中，细胞因子可以是膜结合的或分泌的。在其它实施方案中，细胞因子可以是细胞内的。在一些情况下，细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、集落刺激因子或肿瘤坏死因子。在一些实施方案中，趋化因子起到用于引导细胞迁移的化学引诱物的作用，并且被分类为四个亚家族：CXC、CC、CX3C和XC。非限制性示例性趋化因子包括来自CC亚家族的趋化因子：CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3、CCL4、CCL5(RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(或CCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27和CCL28；来自CXC亚家族的趋化因子：CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16和CXCL17；来自XC亚家族的趋化因子：XCL1和XCL2；以及来自CX3C亚家族的趋化因子：CX3CL1。
干扰素(IFN)包括I型干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω)、II型干扰素(例如IFN-γ)和III型干扰素。在一些实施方案中，IFN-α进一步分类为约13种亚型，包括IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17和IFNA21。
白介素由白血球或白细胞表达，并且它们促进T和B淋巴细胞和造血细胞的发育和分化。示例性白介素包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35和IL-36。
在一些实施方案中，白介素包括mbIL-15。在一些实施方案中，mbIL-15是膜结合的嵌合IL-15，其可以与本文所述的经修饰的效应细胞共表达。在一些实施方案中，mbIL-15包含与全长IL-15Rα、其功能片段或变体符合读框地融合的全长IL-15(例如，天然IL-15多肽)或其片段或变体。在一些情况下，IL-15通过连接体与IL-15Rα间接连接。在一些情况下，mbIL-15如Hurton等人,“Tethered IL-15augments antitumor activity and promotes astem-cell memory subset in tumor-specific T cells,”PNAS 2016所述。在一个实施方案中，mbIL-15由以下多核苷酸编码，该多核苷酸包含与SEQ ID NO:177的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在一个实施方案中，mbIL-15与SEQ ID NO:178的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在另一方面，白介素可包括IL-12。在一些实施方案中，该IL-12是单链IL-12(scIL-12)、蛋白酶敏感的IL-12、去稳定的IL-12、膜结合的IL-12、嵌入型IL-12。在一些情况下，IL-12变体如WO2015/095249、WO2016/048903、WO2017/062953中描述，其全部通过引用并入本文。
肿瘤坏死因子(TNF)是一组调节凋亡的细胞因子。在一些情况下，TNF家族中约有19个成员，包括但不限于TNFα、淋巴毒素-α(LT-α)、淋巴毒素-β(LT-β)、T细胞抗原gp39(CD40L)、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L和TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)。
集落刺激因子(CSF)是分泌的糖蛋白，其与造血干细胞表面上的受体蛋白相互作用，这随后调节细胞增殖和向特定种类血细胞的分化。在一些情况下，CSF包括巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或促巨核细胞生成素(promegapoietin)。
在一些实施方案中，细胞因子是膜结合细胞因子，其与本文所述的嵌合抗原受体和/或TCR共表达。
在一些实施方案中，本文所述的一种或多种方法进一步包括施用细胞因子。在一些情况下，该细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、集落刺激因子或肿瘤坏死因子。在一些情况下，本文所述的一种或多种方法进一步包括施用选自趋化因子、干扰素、白介素、集落刺激因子或肿瘤坏死因子的细胞因子。在一些情况下，本文所述的一种或多种方法进一步包括施用选自IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IFNγ或TNF-α的细胞因子。
在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸可包含密码子优化的cDNA序列，该cDNA序列编码细胞因子和连接至细胞表面多肽(例如HER1 t片段)的可切割T2A连接体。例如，可以对细胞毒性T淋巴细胞进行工程改造以使其表达多肽，该多肽包含细胞因子，并进一步并入2A可切割连接体，随后是例如胞外细胞标签，在一些实施方案中，该细胞外标签包含截短的人HER1(HER.lt)、截短的CD20(CD20t)、截短的CD52(CD52t)或截短的LNGFR(LNGFRt)。在其它实施方案中，多肽可以包含多肽构建体，该多肽构建体包含在细胞因子之前的截短变体(例如，经由P2A可切割连接体连接的)。
本公开提供了编码细胞因子以及本文所述的任何多肽构建体的多核苷酸和多肽。在一个实施方案中，并入细胞因子、可切割T2A连接体和细胞表面多肽的多肽构建体与SEQID NO:193的氨基酸性序列(来自SEQ ID NO:57的膜结合的IL-15.T2A.HER1t1)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。
IRES和连接体
本文还公开了包含连接体和IRES元件的构建体，以促进本文所述的多核苷酸和多肽的表达和功能。
IRES元件
如本文所用的术语“内部核糖体进入位点(IRES)”可旨在表示内部核糖体进入位点。在包含IRES序列的载体中，第一基因可以通过具有其自身5'-UTR的帽依赖性核糖体扫描机制进行翻译，而后续基因的翻译可以通过以帽非依赖性方式直接将核糖体募集至IRES来完成。IRES序列可以允许真核核糖体结合并在不与5'加帽端结合的情况下开始翻译。IRES序列可以允许从一个转录物表达多个基因(Mountford和Smith 1995)。
如本文所用的术语“CAP”或“帽”是指经修饰的核苷酸，通常是7-甲基鸟苷，其以3'至5'(7meG-ppp-G)连接至真核mRNA的5'端，其在从该mRNA表达蛋白质的过程中充当正常翻译起始途径中的必需元件。
在某些情况下，IRES区域可以来源于病毒，如小核糖核酸病毒、脑心肌炎病毒、丙型肝炎病毒IRES序列。在其它情况下，IRES序列可以来源于脑心肌炎病毒。如本文所用的术语“EMCV”或“脑心肌炎病毒”是指小核糖核酸病毒科的属的脑心肌炎病毒种的任何成员分离物或毒株。实例为：EMCV-R(Rueckert)毒株病毒，Columbia-SK病毒。在一些情况下，可以使用细胞IRES元件，诸如真核起始因子4G、免疫球蛋白重链结合蛋白、c-myc原癌基因、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子-1IRES或其任何组合或修饰。在一些情况下，细胞IRES与病毒IRES相比可以具有增加的基因表达。
病毒、细胞或其组合的IRES序列可在载体中使用。IRES可以来自脑心肌炎病毒(EMCV)或脊髓灰质炎病毒(PV)。在一些情况下，IRES元件选自脊髓灰质炎病毒(PV)、脑脊髓炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪捷申病毒-1(PTV-1)、爱知病毒(AiV)、塞尼卡谷病毒(SVV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、人免疫缺陷病毒-2(HIV-2)、人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人巨细胞病毒潜伏(pUL138)、EB病毒(EBNA-1)、疱疹病毒马立克氏病(MDVRLORF9)、SV40多顺反子19S(SV4019S)、禾谷缢管蚜病毒(RhPV)、蟋蟀麻痹病毒(CrPV)、茶尺蠖小RNA样病毒(EoPV)、大豆尺蠖病毒(PSIV)、吸血猎蝽病毒(TrV)、蜜蜂麻痹双顺反子病毒(IAPV，KBV)、黑醋栗逆转病毒(BRV)、天竺葵花破裂病毒(PFBV)、木槿属褪绿环斑病毒(HCRSV)、感染十字花科的烟草花叶病毒(CrTMV)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、贾第虫病毒(GLV)、利什曼虫RNA病毒-1(LRV-1)及其组合或修饰。在一些情况下，IRES选自Apaf-1、XIAP、HIAP2/c-IAP1、DAP5、Bcl-2、c-myc、CAT-1、INR、分化LEF-1、PDGF2、HIF-1a、VEGF、FGF2、BiP、BAG-1、CIRP、p53、SHMT1、PITSLREp58、CDK1、Rpr、hid、hsp70、grim、skl、Antennapedia、dFoxO、dInR、Adh-Adhr、HSP101、ADH、URE-2、GPR1、NCE102、YMR181a、MSN1、BOI1、FLO8、GIC1及其任何组合或修饰。
在某些实施方案中，IRES是EMCV IRES，其包含与SEQ ID NO:49的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％同一性的核苷酸序列。
当IRES元件被包含在两个开放阅读框(ORF)之间时，翻译的启动可以通过第一ORF中的规范5'-m7GpppN帽依赖性机制和IRES元件下游的第二ORF的帽非依赖性机制而发生。
在一些情况下，基因可以通过内部核糖体进入位点(IRES)连接。IRES可以允许同时表达多个基因。例如，IRES序列可以允许从单个mRNA转录物产生多种蛋白质。核糖体可以以5'帽非依赖性方式与IRES结合并启动翻译。
在一些情况下，IRES序列可以是500个碱基对或可以是约500个碱基对。IRES序列可以是300个碱基对至1000个碱基对。例如，IRES可以是300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个碱基对长。
在一些情况下，可以降低包含IRES序列的载体内的下游基因的表达。例如，IRES序列之后的基因可以比IRES序列之前的基因表达降低。表达降低可以是与前面的基因相比1％至99％的降低。
连接体
在一些实施方案中，多核苷酸连接体可以在本文所述的多核苷酸中使用。多核苷酸连接体可以是含有所需限制位点的DNA的双链区段，该限制位点可以被添加以产生与包含本文所述多核苷酸的载体相容的末端结构。在一些情况下，多核苷酸连接体可用于修饰包含本文所述多核苷酸的载体。例如，包含多核苷酸连接体的载体修饰可以是多克隆位点的改变，或聚组氨酸尾的添加。多核苷酸连接体也可用于使钝性插入DNA的末端适应克隆到用限制酶切割的、具有粘端的载体中。多核苷酸连接体的使用可以比向载体中的钝端连接更有效，并且可以提供在下游应用中从载体释放插入物的方法。在一些情况下，插入物可以是编码可用于治疗应用的多肽的多核苷酸序列。
多核苷酸连接体可以是寡聚体。多核苷酸连接体可以是DNA双链、单链或其组合。在一些情况下，连接体可以是RNA。在一些情况下，多核苷酸连接体可以通过T4连接酶连接到包含本文所述多核苷酸的载体中。为了促进连接，可将过量的多核苷酸连接体添加到包含插入物和载体的组合物中。在一些情况下，插入物和载体在引入连接体之前进行预处理。例如，用甲基化酶预处理可以防止插入物DNA的不希望的切割。
在实施方案中，多核苷酸连接体包含与猪捷申病毒-1 2A区(P2A)(SEQ ID NO:41)、马鼻炎A病毒2A区(E2A)(SEQ ID NO:43)、Thosea asigna病毒2A区(T2A)(SEQ ID NO:45)或口蹄疫病毒2A区(F2A)(SEQ ID NO:47)的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％同一性的核苷酸序列。
在某些实施方案中，由本文所述的多核苷酸编码的两个或更多个多肽可以被编码间插连接体多肽的间插序列隔开。本文中，术语“间插连接体多肽”是指隔开由多核苷酸编码的两个或更多个多肽的氨基酸序列，与术语“肽连接体”不同，后者是指任选地包括在本文公开的多肽构建体中的氨基酸序列，以将跨膜结构域连接至细胞表面多肽(例如，包含天然多肽的截短变体)。在某些情况下，间插连接体多肽是易切割的间插连接体多肽。在一些实施方案中，目的多肽被表达为通过易切割的间插连接体多肽连接的融合蛋白。在某些实施方案中，易切割的间插连接体多肽可以是以下任何一种或多种：F/T2A、T2A、p2A、2A、GSG-p2A、GSG连接体(SEQ ID NO:16)和furin link变体。
在实施方案中，间插连接体多肽包含与猪捷申病毒-1 2A区(P2A)(SEQ ID NO156)、GSG-P2A(SEQ ID NO:41)、马鼻炎A病毒2A区(E2A)(SEQ ID NO:44)、Thosea asigna病毒2A区(T2A)(SEQ ID NO:46)或口蹄疫病毒2A区(F2A)(SEQ ID NO:48)的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，可以使用病毒2A序列。2A元件可以比IRES更短，其具有5至100个碱基对。在一些情况下，2A序列可以在长度上具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或100个核苷酸。2A连接的基因可以在一个单开放阅读框中表达，并且“自切割”可以共翻译地发生在2A多肽的C-末端处的最后两个氨基酸GP之间，产生等量的共表达的蛋白质。
病毒2A序列可以是约20个氨基酸。在一些情况下，病毒2A序列可以含有共有基序Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro(SEQ ID NO:229)。共有基序序列可以共翻译地起作用。例如，可以防止在甘氨酸与脯氨酸残基之间形成正常的肽键，其可以导致核糖体跳跃和新生多肽的切割。这种效应可以产生等摩尔水平的多种基因。
2A肽可允许将多个蛋白质在单个开放阅读框中翻译成多肽，该多肽随后可通过核糖体跳跃机制(Funston,Kallioinen等人2008)“切割”成单个多肽。在一些实施方案中，2A序列可以包括：F/T2A、T2A、p2A、2A、T2A、E2A、F2A和BmCPV2A、BmIFV2A及其任何组合。
在一些情况下，载体可以包含IRES序列和2A多核苷酸连接体序列。在其它情况下，用2A肽连接的多个基因的表达可以通过2A肽之前的间隔区序列(GSG(SEQ ID NO:16))来促进。在一些情况下，构建体可以组合间隔区、连接体、衔接子、启动子或其组合。例如，构建体可以具有带有不同2A肽的间隔区(SGSG(SEQ ID NO:18)或GSG(SEQ ID NO:16))和弗林蛋白酶间插多肽连接体(R-A-K-R(SEQ ID NO:230))切割位点。间隔区可以是I-Ceui。在一些情况下，可以对连接体进行工程化。例如，可以将连接体设计为包含化学特性，如疏水性。在一些情况下，至少两个连接体序列可以产生相同的蛋白质。在其它情况下，可以在载体中使用多个连接体。
在某些情况下，间插连接体多肽可以包含氨基酸序列“RAKR”(SEQ ID NO:230)。在某些情况下，弗林蛋白酶间插连接体多肽可由包含“AGAGCTAAGAGG(SEQ ID NO:231)”的多核苷酸序列编码。
在某些情况下，间插连接体多肽可以是包含下表中公开的序列的连接体：
表1.连接体氨基酸序列
Figure BDA0002380901660000801
Figure BDA0002380901660000811
在一些实施方案中，连接体可在本文所述的多核苷酸中使用。连接体可以是柔性连接体、刚性连接体、体内可切割连接体或其任何组合。在一些情况下，连接体可以将功能域连接在一起(如在柔性和刚性连接体中)或在体内释放游离功能域，如同在体内可切割连接体中那样。
在一些实施方案中，多核苷酸连接体和间插连接体多肽可以改善生物学活性、增加表达产率，并实现理想的药代动力学谱。
在一些情况下，本文所述的间插连接体多肽序列可以包括柔性连接体。当连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时，可以应用柔性连接体。柔性连接体可以由小的非极性(例如，Gly)或极性(例如，Ser或Thr)氨基酸组成。柔性连接体可以具有主要由Gly和Ser残基(“GS”连接体)段组成的序列。柔性连接体的实例可以具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:221；例如SEQ ID NO:20或22)的序列。通过调整拷贝数“n”，可以优化该示例性GS连接体的长度以实现功能域的适当隔离或维持必需的结构域间相互作用。除GS连接体外，其它柔性连接体也可用于重组融合蛋白。在一些情况下，柔性连接体也可以富含小氨基酸或极性氨基酸如Gly和Ser，但可以含有另外的氨基酸如Thr和Ala以维持柔性。在其它情况下，可以使用极性氨基酸如Lys和Glu来提高溶解度。
包含在本文所述连接体序列中的柔性连接体可以富含小氨基酸或极性氨基酸，如Gly和Ser，以提供良好的柔性和溶解度。当融合蛋白结构域需要特定的移动或相互作用时，柔性连接体可能是合适的选择。另外，虽然柔性连接体可能没有刚性结构，但它们可以用作惰性连接体以保持功能域之间的距离。可以调节柔性连接体的长度以允许适当折叠或实现融合蛋白的最佳生物活性。
在一些情况下，本文所述的间插连接体多肽可以进一步包括刚性连接体。刚性连接体可以用来维持多肽结构域之间的固定距离。刚性连接体的实例可以是(举几个例子来说)：α-螺旋形成连接体、富含Pro的序列、(XP)n、X-Pro骨架(SEQ ID NO:239)、A(EAAAK)nA(SEQ ID NO:240)(n＝2-5)。在一些情况下，刚性连接体可以通过采用α-螺旋结构或通过包含多个Pro残基来表现出相对僵硬的结构。
在一些情况下，本文所述的间插连接体多肽可以是可切割的。在其它情况下，间插连接体多肽是不可切割的。不可切割的连接体可将功能域共价连接在一起，以在整个体内过程或体外过程中充当一个分子。间插连接体多肽也可以是体内可切割的。例如，可以引入可切割的间插连接体多肽以在体内释放游离的功能域。可通过例如还原剂和蛋白酶的存在来切割间插连接体多肽。例如，可以利用二硫键的还原来产生可切割的间插连接体多肽。在二硫键间插连接体多肽的情况下，通过与硫醇如谷胱甘肽的二硫键交换的切割事件可以产生切割。在其它情况下，重组融合蛋白中间插连接体多肽的体内切割也可以通过蛋白酶进行，该蛋白酶可在病理条件(例如癌症或炎症)下于特定细胞或组织中体内表达或约束于某些细胞区室内。在一些情况下，可切割的间插连接体多肽可允许靶向切割。例如，许多蛋白酶的特异性可以在约束区室中提供较慢的间插连接体多肽切割。可切割的间插连接体多肽还可以包含腙、肽、二硫键或硫醚(thioesther)。例如，腙可以赋予血清稳定性。在其它情况下，腙可以允许在酸性区室中切割。酸性区室可具有最高为约7的pH。连接体还可以包含硫醚。硫醚可以是不可还原的，并且/或者可以被设计用于细胞内蛋白水解降解。
连接体可以是工程化的连接体。设计连接体的方法可以是计算的。在一些情况下，计算方法可以包括图形技术。可以使用计算方法从源自数据库的三维肽结构文库中搜索合适的肽。例如，可以使用Brookhaven Protein Data Bank(PDB)跨越连接体的选定氨基酸之间的空间距离。
在一些实施方案中是编码包含弗林蛋白酶多肽和2A多肽的多肽构建体的多核苷酸，其中弗林蛋白酶多肽和2A多肽通过包含至少三个疏水性氨基酸的间插连接体多肽连接。在一些情况下，至少三个疏水性氨基酸选自由甘氨酸(Gly)(G)、丙氨酸(Ala)(A)、缬氨酸(Val)(V)、亮氨酸(Leu)(L)、异亮氨酸(Ile)(I)、脯氨酸(Pro)(P)、苯丙氨酸(Phe)(F)、甲硫氨酸(Met)(M)、色氨酸(Trp)(W)组成的列表。
多肽构建体的表达
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸和多肽可以例如使用病毒和非病毒递送系统的组成型启动子组成性表达(参见下文)。在其它实施方案中，本文提供的多肽构建体、多核苷酸和方法可以在基因开关系统中实施。术语“基因开关”或“基因的开关”是指与启动子关联的应答元件的组合，例如，基于EcR的系统，其在一种或多种配体的存在下，调节并入了应答元件和启动子的基因的表达。紧密调节的诱导型基因表达系统或基因开关可用于各种应用，如基因疗法、细胞中的大规模蛋白质生产、基于细胞的高通量筛选试验、功能基因组学以及转基因植物和动物中性状的调节。这类诱导型基因表达系统可包括配体诱导型异源基因表达系统。
早期形式的基于EcR的基因开关使用黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)EcR(DmEcR)和小鼠(Mus musculus)RXR(MmRXR)多肽，并且显示这些受体在类固醇、百日青蜕皮酮A的存在下在哺乳动物细胞系和转基因小鼠中反式激活报道基因(Christopherson等人,1992；No等人,1996)。后来，Suhr等人,1998表明非甾类蜕皮素激动剂虫酰肼在不存在外源异二聚体配偶体的情况下通过家蚕(Bombyx mori)EcR(BmEcR)在哺乳动物细胞中诱导报道基因的高水平反式激活。
国际专利申请PCT/US97/05330(WO 97/38117)和PCT/US99/08381(WO99/58155)公开了调节外源基因表达的方法，其中包含外源基因和蜕皮素应答元件的DNA构建体被包含蜕皮素受体的第二DNA构建体激活，该蜕皮素受体在其配体的存在下，任选地在能够充当沉默配偶体的受体的存在下，与蜕皮素应答元件结合以诱导基因表达。在该实例中，蜕皮素受体是从黑腹果蝇中分离的。通常，此类系统需要存在沉默配偶体，优选类视黄醇X受体(RXR)，以提供最佳激活。在哺乳动物细胞中，昆虫蜕皮素受体(EcR)能够与哺乳动物类视黄醇X受体(RXR)异二聚化，从而用于以配体依赖性方式调节靶基因或异源基因的表达。国际专利申请PCT/US98/14215(WO 99/02683)披露，从蚕蛾家蚕中分离的蜕皮素受体在哺乳动物系统中是功能性的，不需要外源二聚体配偶体。
美国专利6,265,173披露，类固醇/甲状腺超家族受体的各个成员可以与黑腹果蝇超螺旋受体(USP)或其至少包含USP二聚化结构域的片段相组合，以用于基因表达系统。美国专利5,880,333公开了在植物中使用的黑腹果蝇EcR和超螺旋(USP)异二聚体系统，其中反式激活域和DNA结合域位于两个不同的杂合蛋白上。在这些情况中的每一种中，反式激活域和DNA结合域(如国际专利申请PCT/US98/14215中的天然EcR或国际专利申请PCT/US97/05330中的修饰的EcR)并入单个分子中，并且其它异二聚体配偶体(USP或RXR)以其天然状态使用。
国际专利申请PCT/US01/0905公开了基于蜕皮素受体的诱导型基因表达系统，其中反式激活域和DNA结合域通过将它们置于两个不同的蛋白质上而彼此分离，导致在不存在配体的情况下背景活性大大降低，而在配体的存在下，活性比背景显著增加。与申请PCT/US97/05330和PCT/US98/14215中公开的两种系统相比，这种双杂交系统是显著改进的诱导型基因表达调节系统。据认为，这种双杂交系统利用了一对相互作用蛋白质的以下能力：它们使转录激活域相对于DNA结合域处于更有利的位置，使得当DNA结合域与基因上的DNA结合位点结合时，反式激活域更有效地激活启动子(参见，例如，美国专利5,283,173)。这种双杂交基因表达系统包含两个基因表达盒；第一个编码与核受体多肽融合的DNA结合域，第二个编码与不同的核受体多肽融合的反式激活域。在配体的存在下，认为诱导了构象变化，这促进第一多肽与第二多肽的相互作用，从而导致DNA结合域与反式激活域的二聚化。由于DNA结合域和反式激活域位于两个不同的分子上，因此在不存在配体的情况下，背景活性大大降低。
蜕皮素受体(EcR)是核受体超家族的成员，并且被分类为亚家族1，H组(在本文中称为“H组核受体”)。每组的成员在E(配体结合)结构域中具有40-60％的氨基酸同一性(Laudet等人,A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily,1999；Cell 97:161-163)。除蜕皮素受体外，该核受体亚家族1，H组的其它成员还包括：遍在受体(UR)、孤儿受体1(OR-1)、类固醇激素核受体1(NER-1)、RXR相互作用蛋白-15(RIP-15)、肝x受体β(LXRβ)、类固醇激素受体样蛋白(RLD-1)、肝x受体(LXR)、肝x受体α(LXRα)、类法尼醇x受体(FXR)、受体相互作用蛋白质14(RIP-14)和法尼醇受体(HRR-1)。
在一些情况下，诱导型启动子可以是小分子配体诱导型基于双多肽蜕皮素受体的基因开关，如Intrexon Corporation的
Figure BDA0002380901660000851
基因开关。在一些情况下，基因开关可以选自基于蜕皮素的受体组分，如在但不限于以下所述的任何系统中所描述的：PCT/US2001/009050(WO 2001/070816)；美国专利7,091,038；7,776,587；7,807,417；8,202,718；PCT/US2001/030608(WO 2002/029075)；美国专利8,105,825；8,168,426；PCT/1J52002/005235(WO 2002/066613)；美国申请10/468,200(美国公开20120167239)；PCT/US2002/005706(WO 2002/066614)；美国专利7,531,326；8,236,556；8,598,409；PCT/U52002/005090(WO 2002/066612)；美国专利8,715,959(美国公开20060100416)；PCT/US2002/005234(WO 2003/027266)；美国专利7,601,508；7,829,676；7,919,269；8,030,067；PCT/U52002/005708(WO 2002/066615)；美国申请10/468,192(美国公开20110212528)；PCT/US2002/005026(WO 2003/027289)；美国专利7,563,879；8,021,878；8,497,093；PCT/US2005/015089(WO 2005/108617)；美国专利7,935,510；8,076,454；PCT/U52008/011270(WO 2009/045370)；美国申请12/241,018(美国公开20090136465)；PCT/US2008/011563(WO 2009/048560)；美国申请12/247,738(美国公开20090123441)；PCT/US2009/005510(WO 2010/042189)；美国申请13/123,129(美国公开20110268766)；PCT/US2011/029682(WO 2011/119773)；美国申请13/636,473(美国公开20130195800)；PCT/US2012/027515(WO 2012/122025)；和美国专利9,402,919，以上每一个均通过引用整体并入。
经修饰的效应细胞
提供了经修饰以表达一种或多种能够在效应细胞中作为细胞标签起作用的多肽构建体的效应细胞。
如本文所用的“T细胞”或“T淋巴细胞”是在细胞介导的免疫中起重要作用的一种类型的淋巴细胞。它们与其它淋巴细胞如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)的区别可在于在细胞表面上存在T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，经修饰的效应细胞是包含T细胞和/或自然杀伤细胞的经修饰的免疫细胞。T细胞或T淋巴细胞是参与细胞介导的免疫的白细胞亚型。示例性T细胞包括T辅助细胞、细胞毒性T细胞、TH17细胞、记忆性干细胞样T细胞(TSCM)、幼稚T细胞、记忆T细胞、效应T细胞、调节性T细胞或自然杀伤T细胞。
T辅助细胞(TH细胞)在免疫过程中协助其它白细胞，该免疫过程包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化。在一些情况下，由于CD4糖蛋白在细胞表面上的表达，TH细胞被称为CD4+ T细胞。辅助性T细胞在通过MHC II类分子呈递肽抗原时被活化，该MHC II类分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。辅助性T细胞一旦被活化，就迅速分裂并分泌出被称为细胞因子的小蛋白质，该细胞因子调节或协助主动免疫应答。这些细胞可以分化成几种亚型中的一种，包括TH1、TH2、TH3、TH17、Th9或TFH，这些亚型分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。来自APC的信号传导将T细胞引导至特定的亚型。在本文的一些实施方案中，分泌的细胞因子可以是重组的。
细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还参与移植排斥。这些细胞也被称为CD8+ T细胞，因为其在表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与MHC I类分子缔合的抗原而识别它们的靶标，该MHC I类分子存在于所有有核细胞的表面上。通过IL-10、腺苷和由调节性T细胞分泌的其它分子，CD8+细胞可以被灭活至无反应状态，从而防止自身免疫性疾病。
记忆T细胞是在感染消退后长期持续存在的抗原特异性T细胞的一个亚群。其在重新暴露于其同源抗原后迅速扩充成大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对以往感染的“记忆”。记忆T细胞包括以下亚型：干细胞记忆性T细胞(TSCM)、中枢记忆性T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞可以表达细胞表面蛋白质CD45RO、CD45RA和/或CCR7。
调节性T细胞(Treg细胞)，以前称为抑制性T细胞，在维持免疫耐受性中起作用。其主要作用是在免疫反应结束时停止T细胞介导的免疫，并抑制逃避胸腺中的阴性选择过程的自身反应性T细胞。
自然杀伤T细胞(NKT细胞)将先天免疫系统与适应性免疫系统联系起来。与识别由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞不同，NKT细胞识别由被称为CD1d的分子呈递的糖脂抗原。一旦被活化，这些细胞可以执行属于Th细胞和Tc细胞的功能(即，细胞因子产生和细胞溶解/细胞杀伤分子的释放)。它们还能够识别并消除一些肿瘤细胞和感染疱疹病毒的细胞。
自然杀伤(NK)细胞是先天免疫系统的一种类型的细胞毒性淋巴细胞。在一些情况下，NK细胞提供针对病毒感染和/或肿瘤形成的第一线防御。NK细胞可检测被感染细胞或癌细胞上呈递的MHC，从而触发细胞因子释放，随后诱导裂解和凋亡。NK细胞可以在不存在抗体和/或MHC的情况下进一步检测应激的细胞，从而允许快速免疫应答。
基于病毒的递送系统
本公开还提供了递送系统，如基于病毒的系统，其中插入了本文所述的核酸。代表性的病毒表达载体包括但不限于腺相关病毒载体、基于腺病毒的载体(例如，可从Crucell,Inc.(Leiden,The Netherlands)获得的基于腺病毒的Per.C6系统)、基于慢病毒的载体(例如，来自Life Technologies(Carlsbad,Calif.)的基于慢病毒的pLPI)、逆转录病毒载体(例如，pFB-ERV加pCFB-EGSH)和基于疱疹病毒的载体。在一个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。衍生自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为其允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体比衍生自致癌逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有额外优势，因为其可以转导非增殖细胞如肝细胞。慢病毒载体还具有低免疫原性的额外优势。在另外的实施方案中，病毒载体是腺相关病毒载体。在进一步的实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。通常来说，并且在实施方案中，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一种或多种选择标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；以及美国专利6,326,193)。
其它合适的载体包括整合表达载体，其可以随机整合到宿主细胞的DNA中，或者可以包括重组位点以实现表达载体与宿主细胞染色体之间的特异性重组。这样的整合表达载体可利用宿主细胞染色体的内源表达控制序列来实现所需蛋白质的表达。以位点特异性方式整合的载体的实例包括，例如，来自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)的flp-in系统的组分(例如，pcDNATM5/FRT)，或例如可见于来自Stratagene(La Jolla,Calif.)的pExchange-6核心载体中的cre-lox系统。随机整合到宿主细胞染色体中的载体的实例包括，例如，来自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)的pcDNA3.1(当在没有T-抗原的情况下引入时)和来自Promega(Madison,Wis.)的pCI或pFN10A(ACT)FLEXITM。额外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。尽管最近已示出许多启动子也包含在起始位点下游的功能元件，但通常这些启动子元件位于起始位点上游30-110bp的区域。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至相隔50bp。似乎单个元件可以协同或独立地起作用以激活转录，这取决于启动子。
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。
合适的启动子的另一实例是人延伸生长因子1α1(hEF1a1)。在实施方案中，包含本公开的CAR和/或TCR的载体构建体包含hEF1a1功能变体。
然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本公开内容不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被考虑为本公开内容的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，其能够开启可操作地连接的多核苷酸序列的表达(当需要这样的表达时)，或者当不需要表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR或TCR多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可含有选择标记基因或报道基因或两者，以便于从试图通过病毒载体来转染或感染的细胞群体中鉴别和选择表达细胞。在其它方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。选择标记和报道基因都可以侧接适当的调节序列以实现在宿主细胞中的表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素抗性基因如新霉素抗性基因(neo)和氨苄青霉素抗性基因等。在一些实施方案中，截短的表皮生长因子受体(HER1t)标签可用作选择标记基因。
报道基因可用于鉴定潜在转染的细胞和评价调节序列的功能。通常，报道基因是不存在于接受体生物体或组织中且不由其表达的基因，其编码多肽，该多肽的表达通过一些易于检测的性质(例如酶活性)表现。在将DNA引入接受体细胞后的合适时间测定报道基因的表达。合适的报道基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,FEBS Letters 479:79-82(2000))。合适的表达系统是公知的，并且可以使用已知技术制备或商购获得。通常，示出报道基因最高表达水平的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴别为启动子。这样的启动子区可以与报道基因连接，并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些实施方案中，载体包含驱动转基因表达的hEF1a1启动子、增强转录的牛生长激素ployA序列、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)以及衍生自pFUGW质粒的LTR序列。
将基因引入细胞以及使基因在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，如哺乳动物细胞、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，可以通过物理、化学或生物方式将表达载体转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域公知的。例如，参见Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York(2001))。在实施方案中，用于将多核苷酸引入宿主细胞的方法是磷酸钙转染或聚乙烯亚胺(PEI)转染。
用于将目的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入哺乳动物细胞(例如人细胞)中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利5,350,674和5,585,362。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。
在利用病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(在体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子附接于脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质结合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于在溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“折叠”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪小液滴，以及含有长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,Mo.获得；双十六烷基磷酸酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)获得；胆固醇(“Chol”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。将氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其包括通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征可以在于具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，多层脂质体自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,Glycobiology 5:505-10(1991))。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。
基于非病毒的递送系统
在一些情况下，还可以使用基于非病毒的递送系统如“Sleeping Beauty(SB)转座子系统”将编码本文所述细胞标签的多核苷酸引入T细胞中，该Sleeping Beauty转座子系统是指一种合成的DNA转座子系统，用于将DNA序列引入脊椎动物的染色体中。该系统的一些示例性实施例描述于美国专利6,489,458和8,227,432中。Sleeping Beauty转座子系统由Sleeping Beauty(SB)转座酶和SB转座子组成。在一些实施方案中，Sleeping Beauty转座子系统可包括SB11转座子系统、SB 100X转座子系统或SB110转座子系统。
DNA转座子以简单的剪切-粘贴方式从一个DNA位点易位到另一DNA位点。转座是一个精确的过程，其中限定的DNA片段从一个DNA分子切下并移动到相同或不同DNA分子或基因组中的另一位点。与其它Tc1/mariner型转座酶一样，SB转座酶将转座子插入接受体DNA序列中的TA二核苷酸碱基对中。插入位点可以在相同DNA分子中的其它地方，或在另一DNA分子(或染色体)中。在哺乳动物基因组(包括人基因组)中大约有2亿个TA位点。TA插入位点在转座子整合过程中重复。这种TA序列的重复是转座的标志，并用于确定一些实验中的机理。转座酶可以在转座子内编码，或者转座酶可以由另一来源例如DNA或mRNA来源提供，在该情况下，转座子成为非自主元件。非自主转座子作为遗传工具最有用，因为在插入后它们不能独立地继续切除和重新插入。SB转座子被设想用作非病毒载体，用于将基因引入脊椎动物的基因组中和基因疗法。简言之，Sleeping Beauty(SB)系统(Hackett等人,Mol Ther18:674-83,(2010))适用于对T细胞进行遗传修饰(Cooper等人,Blood 105:1622-31,(2005))。这涉及两个步骤：(i)表达SB转座子(即，嵌合抗原受体(CAR)，用于重定向T细胞特异性(Jin等人,Gene Ther 18:849-56,(2011)；Kebriaei等人,Hum Gene Ther 23:444-50,(2012))和SB转座酶的DNA质粒的电转移，以及(ii)稳定表达整合体的T细胞在衍生自K562细胞系的设计者人工抗原呈递细胞(AaPC)(也是称为AaPC(活化和扩增细胞))上的增殖和扩充。在一个实施方案中，SB转座子系统包括编码膜结合的IL-15和/或嵌合抗原受体的编码序列。这样的系统于例如Singh等人,Cancer Res(8):68(2008).2008年4月15日和Maiti等人,J Immunother.36(2):112–123(2013)中有述，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，将表达包含CAR或TCR以及细胞因子和多肽细胞标签的SB转座子的DNA质粒电穿孔到效应细胞中，然后将其注入患者体内而无需进一步繁殖和扩充。
在一些实施方案中，在本文所述的修饰的效应细胞中编码CAR或TCR或细胞因子和一个或多个多肽细胞标签的多核苷酸在一个或多个转座子质粒载体中编码，并且SB转座酶在单独的载体中编码。在实施方案中，多肽细胞标签在转座子DNA质粒载体中编码，CAR或TCR或细胞因子在第二转座子DNA质粒载体中编码，并且SB转座酶在第三DNA质粒载体中编码。在一些实施方案中，CAR或TCR以及细胞因子和多肽细胞标签在单个转座子中编码。
在一些实施方案中，本文所述的多肽通过允许通过施用FDA批准的抗体或识别多肽构建体以诱导细胞消耗途径的任何抗体来消耗输注的CAR-T细胞而提供安全性机制。在一些实施方案中，本文所述的HER1t变体通过与引入的西妥昔单抗结合并允许细胞消耗而提供了安全性机制。在一些实施方案中，CD20t变体还通过允许通过施用FDA批准的利妥昔单抗疗法消耗输注的CAR-T细胞来提供安全性机制。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本公开的抑制剂的方法是哪一种，为了确认宿主细胞中存在重组DNA序列，可以进行多种试验。这类试验包括，例如，本领域技术人员公知的分子试验，如Southern和Northern印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”试验，如检测是否存在特定肽，例如通过免疫学手段(ELISA和Western印迹法)或通过本文所述的用于鉴别落入本公开内容范围内的药剂的试验。
在实施方案中，使用SB11转座子系统、SB100X转座子系统、SB110转座子系统，piggyBac转座子系统(参见例如Wilson等人,“PiggyBac Transposon-mediated GeneTransfer in Human Cells,”Molecular Therapy 15:139-145(2007)，其通过引用整体并入本文)和/或piggyBac转座子系统(参见例如Mitra等人,“Functional characterizationof piggyBac from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNAtransposon,”Proc.Natl.Acad.Sci USA 110:234-239(2013))将本文所述的经修饰的效应细胞和其它遗传元件递送至细胞。另外的转座酶和转座子系统在美国专利6,489,458；6,613,752,7,148,203；7,985,739；8,227,432；9,228,180；美国专利公开2011/0117072；Mates等人,Nat Genet,41(6):753-61(2009).doi:10.1038/ng.343.2009年5月3日电子发表,Gene Ther.,18(9):849-56(2011).doi:10.1038/gt.2011.40.2011年3月31日电子发表，以及Ivics等人,Cell.91(4):501-10,(1997)中提供，其各自通过引用整体并入本文。其它合适的非病毒系统可以包括整合表达载体，其可以随机整合到宿主细胞的DNA中，或者可以包括重组位点以使表达载体与宿主细胞染色体之间能够进行特异性重组。将转基因靶向整合到预定义的遗传基因座中是许多应用的理想目标。首先，将位点特异性重组酶的第一重组位点插入基因组位点，无论是随机位置还是预定位置。随后，用携带目的基因或DNA和第二重组位点的质粒和重组酶来源(表达质粒、RNA、蛋白质或病毒表达的重组酶)转染细胞。第一与第二重组位点之间的重组导致质粒DNA的整合。
此类整合表达载体可利用宿主细胞染色体的内源表达控制序列来实现所需蛋白质的表达。在一些实施方案中，通过在供体多核苷酸上存在与整合位点侧翼序列同源的序列来促进靶向整合。例如，使用本文所述的供体多核苷酸的靶向整合可以按照常规转染技术实现，例如，用来通过同源重组产生基因敲除或敲入的技术。在其它实施方案中，通过在供体多核苷酸上存在与整合位点侧翼序列同源的序列，以及通过在位点特异性重组酶的存在下使细胞与供体多核苷酸接触，来促进靶向整合。所谓位点特异性重组酶，或者简称为重组酶，意指催化其相容的重组位点之间的保守位点特异性重组的多肽。如本文所用的，位点特异性重组酶包括天然多肽以及保留活性的衍生物、变体和/或片段，以及编码保留活性的重组酶的天然多核苷酸、衍生物、变体和/或片段。
本文还提供了用于将异源基因整合到宿主细胞中的系统，所述系统包含一个或多个基因表达盒。在一些情况下，该系统包括第一基因表达盒，其包含编码第一多肽构建体的第一多核苷酸。在其它情况下，该系统可包括第二基因表达盒，其包含编码第二多肽构建体的第二多核苷酸。在其它情况下，该系统可包括第三基因表达盒。在一个实施方案中，该系统还包括重组附着位点；和丝氨酸重组酶；使得在所述丝氨酸重组酶的存在下，在所述宿主细胞与至少所述第一基因表达盒接触时，所述异源基因被整合到所述宿主细胞中。
在一些情况下，所述系统进一步包含配体；使得在所述配体的存在下，在所述宿主细胞接触时，所述异源基因在所述宿主细胞中表达。在一种情况下，该系统还包括重组附着位点。在一些情况下，一个重组附着位点是噬菌体基因组重组附着位点(attP)或细菌基因组重组附着位点(attB)。在一种情况下，宿主细胞是真核细胞。在另一种情况下，宿主细胞是人细胞。在其它情况下，宿主细胞是T细胞或NK细胞。
在一个实施方案中，上述系统中的异源基因包含CAR。在一些实施方案中，该CAR结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
在另一个实施方案中，所述系统包括含有细胞因子的异源基因。在一种情况下，该细胞因子包括IL-15、IL-2、IL-12、IL-21以及IL-15与IL-15Rα的融合体中的至少一种。在一些实施方案中，所述系统包括含有至少一种本文所述的细胞标签的异源基因。在一些实施方案中，所述细胞标签包含HER1多肽、LNGFR多肽、CD20多肽和CD52多肽中的至少一种。在一些实施方案中，mbIL-15被编码具有细胞标签。细胞标签的实例可包括截短的HER1多肽、LNGFR多肽、CD20多肽、CD52多肽或用作消耗或杀伤开关或富集标记的其它任何适当的细胞标签。
在进一步的实施方案中，所述系统被包含在一个或多个载体中。在一种情况下，所述系统被包含在一个载体中。在一种情况下，第一基因表达盒、第二基因表达盒和重组附着位点被包含在一个载体中。在一种情况下，第一基因表达盒、第二基因表达盒、第三基因表达盒和重组附着位点被包含在一个载体中。在另一种情况下，丝氨酸重组酶是SF370。在其它情况下，丝氨酸重组酶在单独的载体中。
可以在引入靶向载体之前、同时或之后将重组酶引入靶细胞中。重组酶可以作为蛋白质直接引入细胞中，例如，使用脂质体、包被的颗粒或显微注射。或者，可以使用合适的表达载体将编码重组酶的多核苷酸(DNA或信使RNA)引入细胞中。上述靶向载体组分可用于构建含有编码感兴趣的重组酶的序列的表达盒。然而，重组酶的表达可以以其它方式调节，例如，通过将重组酶的表达置于可调节启动子(即，可以选择性地诱导或抑制其表达的启动子)的控制下。
用于实施本发明的重组酶可以如前所述重组产生或纯化。具有所需重组酶活性的多肽可通过蛋白质硫酸铵沉淀、纯化领域中已知的方法纯化至所需纯度水平，包括但不限于大小分级分离、亲和色谱法、HPLC、离子交换色谱法、肝素琼脂糖亲和色谱法(例如，Thorpe&Smith,Proc.Nat.Acad.Sci.95:5505-5510,1998)。
在一个实施方案中，可以将重组酶引入真核细胞中，该真核细胞含有通过任何合适的方法需要重组的重组附着位点。例如通过显微注射或其它方法将功能性蛋白质引入细胞中的方法是本领域熟知的。纯化的重组酶蛋白质的引入确保了蛋白质及其功能的短暂存在，这通常是优选的实施方案。或者，编码重组酶的基因可以被包括在用于转化细胞的表达载体中，其中编码重组酶的多核苷酸与介导多核苷酸在真核细胞中表达的启动子可操作地连接。还可以通过编码重组酶多肽的信使RNA将该重组酶多肽引入真核细胞中。通常优选重组酶仅存在将核酸片段插入被修饰的基因组中所必需的时间。因此，预计缺乏与大多数表达载体相关的持久性并非不利的。可以在引入外源目的多核苷酸之前、之后或同时将重组酶基因引入细胞中。在一个实施方案中，重组酶基因存在于携带待插入的多核苷酸的载体内；重组酶基因甚至可以被包括在多核苷酸内。在其它实施方案中，将重组酶基因引入转基因真核生物中。可以制备转基因细胞或动物，其组成型地或在细胞特异性、组织特异性、发育特异性、细胞器特异性或小分子诱导型或可阻抑型启动子下表达重组酶。重组酶还可以表达为与其它肽、蛋白质、核定位信号肽、信号肽或细胞器特异性信号肽(例如，线粒体或叶绿体转运肽，以促进在线粒体或叶绿体中的重组)的融合蛋白。
例如，重组酶可以来自融合酶或解离酶家族。整合酶重组酶家族具有超过一百个成员，并且包括例如FLP、Cre和λ整合酶。整合酶家族，也称为酪氨酸家族或λ整合酶家族，使用催化酪氨酸的羟基对DNA的磷酸二酯键进行亲核攻击。通常，酪氨酸家族的成员最初在DNA上形成切口，后来形成双链断裂。酪氨酸家族整合酶的实例包括Cre、FLP、SSV1和lambda(λ)整合酶。在解离酶家族(也称为丝氨酸重组酶家族)中，保守的丝氨酸残基与DNA靶位点形成共价连接(Grindley,等人,(2006)Ann Rev Biochem 16:16)。
在一个实施方案中，重组酶是分离的多核苷酸序列，其包含编码重组酶的核酸序列，该重组酶选自SPβc2重组酶、SF370.1重组酶、Bxb1重组酶、A118重组酶和φRv1重组酶。丝氨酸重组酶的实例在美国专利9,034,652中详细描述，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，用于位点特异性重组的方法包括提供第一重组位点和第二重组位点；使第一和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，导致重组位点之间的重组，其中该重组酶多肽可介导第一与第二重组位点之间的重组，第一重组位点是attP或attB，第二重组位点是attB或attP，并且该重组酶选自单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)噬菌体重组酶、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是attB时，第二重组附着位点是attP，并且当第一重组附着位点是attP时，第二重组附着位点是attB。
进一步的实施方案提供将位点特异性重组酶引入其基因组将被修饰的细胞中。一个实施方案涉及用于在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，其包括提供包含第一重组附着位点和第二重组附着位点的真核细胞；使第一和第二重组附着位点与原核重组酶多肽接触，导致在重组附着位点之间的重组，其中该重组酶多肽可介导在第一与第二重组附着位点之间的重组，第一重组附着位点是噬菌体基因组重组附着位点(attP)或细菌基因组重组附着位点(attB)，第二重组附着位点是attB或attP，并且该重组酶选自单核细胞增生李斯特菌噬菌体重组酶、酿脓链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是attB时，第二重组附着位点是attP，并且当第一重组附着位点是attP时，第二重组附着位点是attB。在一个实施方案中，该重组酶选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SPβc2重组酶、φRv1重组酶和Bxb1重组酶。在一个实施方案中，该重组导致整合。
免疫效应细胞来源
在某些方面，本文所述的实施方案包括制备和/或扩充抗原特异性重定向免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞或NK T细胞)的方法，其包括用含有编码多肽构建体的DNA(或RNA)构建体的表达载体转染细胞，然后任选地用饲养细胞、重组抗原或针对受体的抗体刺激细胞，以使细胞增殖。在某些方面，经工程化以表达CAR或TCR的细胞(或细胞群体)是干细胞、iPS细胞、免疫效应细胞或这些细胞的前体。
免疫效应细胞的来源可包括同种异体来源和自体来源。在一些情况下，免疫效应细胞可以从干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)分化。因此，根据实施方案的用于工程化的细胞可以从脐带血、外周血、人胚胎干细胞或iPSC中分离。例如，可以将同种异体T细胞修饰成包括嵌合抗原受体(并且任选地缺乏功能性TCR)。在一些方面，免疫效应细胞是原代人T细胞，如来源于人外周血单核细胞(PBMC)的T细胞。PBMC可以从外周血中收集，或者在用G-CSF(粒细胞集落刺激因子)刺激后从骨髓收集，或从脐带血收集。在(例如，用CAR表达构建体)转染或转导后，可以立即输注细胞或者可以冷冻保存细胞。在某些方面，在转染后，细胞可以在基因转移到细胞后的约1、2、3、4、5天或更多天内作为本体群体离体增殖数天、数周或数月。在另一方面，在转染后，将转染体克隆，并将表现出存在单个整合的或附加体保持的表达盒或质粒以及嵌合抗原受体的表达的克隆离体扩充。选择用于扩充的克隆表现出特异性识别和裂解表达抗原的靶细胞的能力。可以通过用IL-2或结合共同γ链的其它细胞因子(例如IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)刺激来扩充重组T细胞。可以通过用人工抗原呈递细胞刺激来扩充重组T细胞。重组T细胞可以在人工抗原呈递细胞上扩充，或者用与T细胞表面上的CD3交联的抗体如OKT3扩充。可以使用基于磁珠的分离方法和/或荧光激活细胞分选技术进一步选择重组T细胞的亚组，并将其进一步与AaPC一起培养。在另一方面，可以冷冻保存经遗传修饰的细胞。
T细胞也可以从许多来源获得，包括外周血、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤(肿瘤浸润淋巴细胞)。在本公开的某些实施方案中，可以使用本领域可获得的任何数目的T细胞系。在本公开的某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何技术如
Figure BDA0002380901660000991
分离从采集自受试者的血液单位获得T细胞。在实施方案中，来自个体的循环血液的细胞通过单采血液成分术获得。单采产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中，以用于随后的处理步骤。在本公开的一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代的实施方案中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁或者可能缺少许多(即便不是全部)二价阳离子。在没有钙的情况下的初始激活步骤导致放大的激活。本领域普通技术人员将会容易理解，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如根据制造商的说明使用半自动“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver5)。洗涤后，可将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液，如无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其它含有或不含缓冲液的盐水溶液中。或者，可以去除单采样品中的不需要的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在另一实施方案中，通过裂解红细胞并消耗单核细胞(例如，通过
Figure BDA0002380901660001001
梯度离心或通过逆流离心淘洗)，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。在另一个实施方案中，CD14+细胞从T细胞群体中消耗。例如，在一个实施方案中，通过与抗-CD3/抗-CD28(即，3x28)缀合的珠子(如
Figure BDA0002380901660001002
M-450CD3/CD28 T)一起孵育足够用于所需T细胞的阳性选择的时间段来分离T细胞。在一个实施方案中，该时间段是约30分钟。在进一步的实施方案中，该时间段的范围为30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在进一步的实施方案中，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又一实施方案中，该时间段是10至24小时。在一个实施方案中，孵育时间段是24小时。为了从白血病患者中分离T细胞，使用更长的孵育时间(如24小时)可以增加细胞产率。可以在T细胞与其它细胞类型相比较少的任何情况下，例如在从肿瘤组织或免疫受损的个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的情况下使用更长的孵育时间来分离T细胞。进一步地，使用更长的孵育时间可以提高捕获CD8+ T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠子结合的时间，和/或通过增加或减少珠子与T细胞(如本文进一步描述的)的比值，可以在培养开始时或在该过程中的其它时间点优先选择或排除某T细胞亚群。此外，通过增加或减少珠子或其它表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比值，可以在培养起始时或在其它所需时间点优先选择或排除某T细胞亚群。技术人员将会认识到，在本公开的上下文中也可以使用多轮选择。在某些实施方案中，可能需要执行选择程序并在激活和扩充过程中使用“未选择的”细胞。也可使“未选择的”细胞经历进一步轮次的选择。
T细胞群体通过阴性选择的富集可以用针对阴性选择的细胞的特有表面标志物的抗体组合来完成。一种方法是经由负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该负磁性免疫粘附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些实施方案中，T调节细胞被抗CD25缀合的珠子或其它类似的选择方法消耗。
为了通过阳性或阴性选择分离所需的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，如珠子)的浓度。在某些实施方案中，可能需要显著降低珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、35000万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能较弱表达感兴趣的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)或者来自存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群体可能具有治疗价值并且将是需要获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关的实施方案中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒，如珠子)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小。这选择表达大量待与颗粒结合的所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一个实施方案中，使用的细胞浓度是5x106/ml。在其它实施方案中，使用的浓度可以是约1x105/ml至1x106/ml以及其间的任何整数值。
在其它实施方案中，细胞可以在2-10℃或室温下以变化的速度在旋转器上孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可在洗涤步骤后冷冻。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并在这种情况下将会是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃下或液氮中的不受控的速冻。
在某些实施方案中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在使用本公开的方法活化之前使其在室温下静置1小时。
在本公开的上下文中还考虑了在可能需要如本文所述的经扩充细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采产品。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩充细胞的来源，并且分离和冷冻所需的细胞如T细胞，以供随后在T细胞疗法中用于将受益于T细胞疗法的任何数目的疾病或病况，例如本文所述的疾病或病况。在一个实施方案中，血液样品或单采物取自大体健康的受试者。在某些实施方案中，血液样品或单采物取自大体健康的受试者，该受试者有发展出疾病的风险但尚未发展出该疾病，并且感兴趣的细胞被分离并冷冻以供随后使用。在某些实施方案中，T细胞可以扩充、冷冻并在随后使用。在某些实施方案中，在任何治疗之前，在诊断如本文所述的特定疾病之后的较短时间内从患者收集样品。在进一步的实施方案中，在任何数目的相关治疗方式前，从受试者的血液样品或单采物中分离细胞，该治疗方式包括但不限于采用诸如以下的药剂的治疗：那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化疗、放射、诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、霉酚酸酯和FK506等免疫抑制剂、抗体或其它免疫清除剂，如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228和辐射。这些药物抑制钙依赖性的磷酸酶——钙依赖磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815,(1991)；Henderson等人,Immun 73:316-321,(1991)；Bierer等人,Curr.Opin.Immun 5:763-773,(1993))。在进一步的实施方案中，为患者分离细胞并将其冷冻，以供随后与骨髓或干细胞移植、使用化学治疗剂如氟达拉滨的T细胞消融疗法、外照射放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH结合使用(例如，在其之前、同时或之后)。在另一实施方案中，细胞预先分离并且可被冷冻以供随后用于在B细胞消融疗法(如与CD20反应的药剂，例如利妥昔单抗)之后的治疗。
在本公开的进一步的实施方案中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗特别是用损害免疫系统的药物治疗之后，在该治疗后不久且在患者通常将从治疗中恢复的时期中，所获得的T细胞的质量可能是最佳的或改善的，因为其有离体扩充的能力。同样地，在使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可以处于植入和体内扩充增强的优选状态。因此，在本公开的上下文中考虑在该恢复期中收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其它细胞。进一步地，在某些实施方案中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调节方案可用于在受试者体内产生这样的条件，其中特别细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩充是有利的，尤其是在疗法后限定的时间窗口内。示例性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
T细胞的活化和扩充
在某些实施方案中，包含本文所述的多核苷酸和多肽的T细胞可以任选地通常使用如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国专利申请公开号20060121005中所述的方法进行活化和扩充。
“过继性T细胞转移”是指肿瘤特异性T细胞的分离和离体扩充，以获得比单独接种疫苗或患者的天然肿瘤应答所获得的更多数目的T细胞。然后将肿瘤特异性T细胞输注到癌症患者体内，试图通过可以攻击和杀死癌的T细胞使其免疫系统具有压倒剩余的肿瘤的能力。有许多形式的过继T细胞疗法用于癌症治疗；培养肿瘤浸润淋巴细胞或TIL，分离并扩充一种特定的T细胞或克隆，甚至使用经过工程化以有效识别并攻击肿瘤的T细胞。
在一些情况下，本文所述的T细胞通过与已附接有药剂(刺激CD3/TCR复合物相关信号)和配体(刺激T细胞表面上的共刺激分子)的表面接触而活化和/或扩充。特别地，可以如本文所述地刺激T细胞群体，如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与结合钙离子载体的蛋白激酶C激活剂接触(例如，苔藓抑制素)。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，采用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3，B-T3，XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，其可以与本领域公知的其它方法一样使用(Berg等人,TransplantProc.30(8):3975-3977,(1998)；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,(1999)；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,(1999))。
在某些实施方案中，T细胞的主要刺激信号和共刺激信号可以由不同的方案提供。例如，提供每个信号的药剂可以在溶液中或偶联到表面。当偶联到表面时，药剂可以偶联到相同表面(即，“顺式”排列)或不同表面(即“反式”排列)。或者，可以将一种药剂偶联到表面而另一药剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的药剂结合到细胞表面，并且提供主要激活信号的药剂在溶液中或偶联到表面。在某些实施方案中，两种药剂可以都在溶液中。在另一实施方案中，药剂可以是可溶形式，并然后交联至表面，如表达Fc受体的细胞或将会与该药剂结合的抗体或其它结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开20040101519和20060034810中的预期用于活化和扩增本公开的T细胞的人工抗原呈递细胞(APC)。
在一个实施方案中，将两种药剂固定在珠子上(固定在相同的珠子上，即“顺式”，或者固定在不同的珠子上，即“反式”)。例如，提供主要激活信号的药剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，而提供共刺激信号的药剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种药剂以相等的分子量共同固定到相同的珠子。在一个实施方案中，用于CD4+T细胞扩充和T细胞生长的与珠子结合的每种抗体使用1:1的比值。在本公开的某些方面，使用这样的与珠子结合的抗CD3抗体:抗CD28抗体比，使得与使用1:1的比值观察到的扩充相比，观察到T细胞扩充增加。在一个特定的实施方案中，与使用1:1的比值观察到的扩充相比，观察到约1倍至约3倍的增加。在一个实施方案中，与珠子结合的CD3抗体:CD28抗体的比值范围为100:1至1:100以及其间的所有整数值。在本公开的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28比小于1。在本公开的某些实施方案中，与珠子结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比值大于2:1。在一个特定的实施方案中，与珠子结合的抗体使用1:100的CD3:CD28比。在另一实施方案中，与珠子结合的抗体使用1:75的CD3:CD28比。在进一步的实施方案中，与珠子结合的抗体使用1:50的CD3:CD28比。在另一的实施方案中，与珠子结合的抗体使用1:30的CD3:CD28比。在实施方案中，与珠子结合的抗体使用1:10的CD3:CD28比。在另一实施方案中，与珠子结合的抗体使用1:3的CD3:CD28比。在又一实施方案中，与珠子结合的抗体使用3:1的CD3:CD28比。
从1:500至500:1以及其间的任何整数值的颗粒与细胞的比值可用于刺激T细胞或其它靶细胞。本领域普通技术人员可以容易理解，颗粒与细胞的比值可以取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，大小较小的珠子只能结合少量细胞，而较大的珠子可以结合许多细胞。在某些实施方案中，细胞与颗粒的比值范围为1:100至100:1以及其间的任何整数值，并且在进一步的实施方案中，该比值包括1:9至9:1以及其间的任何整数值，也可用于刺激T细胞。如上所述，抗CD3和抗CD28偶联的颗粒与T细胞的导致T细胞刺激的比值可以变化，但是某些值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一个比值是T细胞/颗粒为至少1:1。在一个实施方案中，使用1:1或更小的颗粒:细胞比。在一个特定的实施方案中，颗粒:细胞比为1:5。在进一步的实施方案中，颗粒:细胞比可以根据刺激的天数而变化。例如，在一个实施方案中，颗粒:细胞比在第一天为1:1至10:1，并且之后每天或每隔一天将额外的颗粒添加到细胞，持续至多10天，最终比值为1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定实施方案中，颗粒:细胞比在刺激的第一天为1:1，并且在刺激的第三天和第五天被调整为1:5。在另一实施方案中，每天或每隔一天添加颗粒，直至第一天的最终比值为1:1，并且在刺激的第三天和第五天的最终比值为1:5。在另一实施方案中，颗粒:细胞比在刺激的第一天为2:1，并且在刺激的第三天和第五天被调整为1:10。在另一实施方案中，每天或每隔一天添加颗粒，直至第一天的最终比值为1:1，并且在刺激的第三天和第五天的最终比值为1:10。本领域技术人员将会理解，多种其它比值可适用于本公开。特别地，比值将根据粒度和细胞大小和类型而变化。
在本公开的进一步的实施方案中，将细胞如T细胞与药剂包被的珠子组合，然后将珠子和细胞分离，并随后培养细胞。在替代的实施方案中，在培养之前，未分离药剂包被的珠子和细胞，而是将其一起培养。在进一步的实施方案中，首先通过施加力(如磁力)浓缩珠子和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
举例来说，可以通过允许抗CD3和抗CD28所附接至的顺磁珠(3x28个珠子)与T细胞接触来连接细胞表面蛋白质。在一个实施方案中，将细胞(例如，104到109个T细胞)和珠子(例如，比值为1:1的
Figure BDA0002380901660001071
M-450CD3/CD28 T顺磁珠，或来自Miltenyi Biotec的
Figure BDA0002380901660001072
MicroBeads)在缓冲液例如PBS(无二价阳离子，如钙和镁)中混合。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞在样品中可能非常罕见并且仅构成0.01％的样品，或者整个样品(即100％)可包含感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数都在本公开的情况的范围内。在某些实施方案中，可能需要显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在另一实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、35000万、4000万、4500万或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在又一实施方案中，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产率、细胞活化和细胞扩充增加。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能较弱低表达感兴趣的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。这样的细胞群体可能具有治疗价值并且在某些实施方案中需要获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+ T细胞。
在本公开的一个实施方案中，可以将混合物培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何整数小时的值。在另一实施方案中，可以将混合物培养21天。在本发明的一个实施方案中，将珠子和T细胞一起培养约8天。在另一实施方案中，将珠子和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。适合T细胞培养的条件包括可含有增殖和生存所必需的因子的适当培养基(例如，基本必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，该因子包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充适量血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使T细胞生长和扩充的量的细胞因子的RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包含在实验培养物中，而不包含在待注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO2)。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可展现不同的特征。例如，典型的血液或单采的外周血单核细胞产品具有大于细胞毒性T细胞群体或抑制性T细胞群体(TC，CD8+)的辅助T细胞群体(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩充T细胞产生T细胞群体，该T细胞群体在约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天之后，该T细胞群体包含越来越多的TC细胞群体。因此，根据治疗目的，向受试者输注主要由TH细胞构成的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已经分离了TC细胞的抗原特异性亚组，则将该亚组扩展到更大程度可能是有益的。
进一步地，除了CD4和CD8标志物之外，其它表型标志物显著变化，但在很大程度上，在细胞扩充过程中该变化可再现。因此，这样的再现性使得能够针对特定目的定制激活的T细胞产物。
在一些情况下，将实施方案的免疫效应细胞(例如，T细胞)与活化和增殖细胞(AaPC)共培养，以帮助细胞扩充。AaPC也可称为人工抗原呈递细胞(APC)。例如，抗原呈递细胞(APC)可用于制备实施方案的治疗组合物和细胞疗法产品。在一个方面，AaPC可以是遗传修饰的K562细胞。关于抗原呈递系统的制备和使用的一般指导，参见例如美国专利6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662；美国专利申请公开2009/0017000和2009/0004142；以及国际公开WO2007/103009，其各自通过引用并入本文。在实施方案的又一方面，培养遗传修饰的CAR细胞包括在刺激表达CAR的免疫效应细胞扩充的树突细胞或活化和增殖细胞(AaPC)的存在下培养遗传修饰的CAR细胞。在更进一步的方面，AaPC包含在AaPC表面上表达的CAR结合多肽或TCR结合抗体或其片段。在一些情况下，AaPC可以包括活化或共刺激T细胞的其它分子。在一些情况下，其它分子可以包括膜结合的Cγ细胞因子。在更进一步的方面，AaPC被灭活或辐射，或已经过测试并证实不含感染性物质。在更进一步的方面，在AaPC的存在下培养转基因CAR细胞包括在包含可溶性细胞因子如IL-15、IL-21和/或IL-2的培养基中培养转基因CAR细胞。细胞可以以约10:1至约1:10、约3:1至约1:5、约1:1至约1:3(免疫效应细胞比AaPC)或其中可导出的任何范围的比值培养。例如，T细胞和AaPC的共培养物可以是约1:1、约1:2或约1:3的比值。
在一个方面，AaPC可以表达CD137L。在一些方面，AaPC可以进一步表达被CAR细胞靶向的抗原。在其它方面，AaPC可以进一步表达CD19、CD64、CD86或mIL15。在某些方面，AaPC可以表达至少一种抗CD3抗体克隆，例如OKT3和/或UCHT1。在一个方面，AaPC可以被处理(例如，辐射或丝裂霉素C)以消除其生长潜力。在一个方面，AaPC可能已经过测试并证实不含感染性物质。用于产生这样的AaPC的方法是本领域已知的。在一个方面，将CAR修饰的T细胞群体与AaPC一起培养可以包括以约10:1至约1:10、约3:1至约1:5、约1:1至约1:3(T细胞比AaPC)或其中可导出的任何范围的比值培养细胞。例如，T细胞和AaPC的共培养物可以是约1:1、约1:2或约1:3的比值。在一个方面，培养步骤可以进一步包括用氨基二膦酸盐(例如唑来膦酸)培养。
在进一步的方面，培养和/或刺激CAR-T细胞群体不超过7、14、21、28、35、42、49、56、63或70天。在一些实施方案中，培养和/或刺激CAR-T细胞群体至少0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30天或更多天。在一些实施方案中，培养和/或刺激CAR-T细胞群体至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60天或更多天。在一些实施方案中，培养和/或刺激CAR-T细胞群体至少7、14、21、28、35、42、49、56、63天或更多天。在其它实施方案中，刺激包括CAR-T细胞与AaPC的共培养以促进CAR阳性T细胞的生长。在另一方面，刺激遗传修饰的CAR细胞群体不超过：1X刺激、2X刺激、3X刺激、4X刺激、5X刺激、5X刺激、6X刺激、7X刺激、8X刺激、9X刺激或10X刺激。在一些情况下，遗传修饰的细胞不在AaPC的存在下离体培养。在一些具体情况下，实施方案的方法进一步包括在转染和/或培养步骤后富集细胞群体中的表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)。富集可以包括荧光激活细胞分选(FACS)和针对CAR表达细胞的分选。在进一步的方面，针对表达CAR的细胞的分选包括使用CAR结合抗体。富集还可以包括CD56+细胞的消耗。在实施方案的又一方面，方法进一步包括冷冻保存遗传修饰的CAR细胞群体的样品。
在一些情况下，将AaPC与最佳长度的肽一起孵育，该最佳长度允许肽直接结合MHC分子而无需额外处理。或者，细胞可以表达感兴趣的抗原(即，在不依赖MHC的抗原识别的情况下)。此外，在一些情况下，APC可以表达抗体，该抗体与特定CAR多肽结合或与一般的CAR多肽结合(例如，通用活化和增殖细胞(uAPC))。这样的方法公开于WO/2014/190273中，其通过引用并入本文。除了肽-MHC分子或感兴趣的抗原之外，AaPC系统还可包含至少一种外源辅助分子。可以采用任何合适数目的辅助分子和辅助分子的组合。辅助分子可选自诸如共刺激分子和粘附分子等辅助分子。示例性的共刺激分子包括CD70和B7.1(B7.1以前称为B7，并且也称为CD80)，除其它分子外，它们还与T细胞表面上的CD28和/或CTLA-4分子结合，从而影响例如T细胞扩增、Th1分化、短期T细胞存活和细胞因子分泌，如白介素(IL)-2。粘附分子可包括碳水化合物结合糖蛋白如选择蛋白、跨膜结合糖蛋白如整联蛋白、钙依赖性蛋白质如钙黏着蛋白，以及单次跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白如细胞间粘附分子(ICAM)，其促进例如细胞与细胞或细胞与基质的接触。示例性粘附分子包括LFA-3和ICAM，如ICAM-1。用于选择、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术、方法和试剂例示于例如美国专利6,225,042、6,355,479和6,362,001中，其通过引用并入本文。
选择成为AaPC的细胞优选在细胞内抗原加工、细胞内肽运输和/或细胞内MHC I类或II类分子-肽负载方面存在缺陷，或者是变温的(即，相较于哺乳动物细胞系对温度攻击的敏感性更低)，或具有缺陷和变温性质二者。优选地，选择成为AaPC的细胞还缺乏表达被引入细胞中的外源性MHC I类或II类分子和辅助分子组分的至少一种内源性对应物(例如，如上所述的内源性MHC I类或II类分子和/或内源性辅助分子)的能力。此外，AaPC优选地保留细胞在其修饰以生成AaPC之前所具有的缺陷和变温性质。示例性AaPC由与抗原加工(TAP)缺陷型细胞系如昆虫细胞系相关的转运蛋白构成或衍生。示例性的变温昆虫细胞系是果蝇细胞系，如Schneider 2细胞系(参见例如，Schneider 1972，美国专利6,225,042、6,355,479和6,362,001中提供了用于Schneider 2细胞的制备、生长和培养的说明性方法)。
在一个实施方案中，还使AaPC经历冻融循环。在示例性的冻融循环中，可以通过使容纳AaPC的合适容器与适量的液氮、固体二氧化碳(即干冰)或类似的低温材料接触来冷冻AaPC，使得冷冻迅速发生。然后通过将AaPC从低温材料中取出并暴露于室温条件下，或者通过促进解冻过程(其中采用温水浴或温暖的手来缩短解冻时间)来解冻冷冻的APC。此外，可以将AaPC冷冻并在解冻之前储存一段延长的时间。也可以将冷冻的AaPC解冻并随后在进一步使用前冻干。优选地，可能对冻融程序产生不利影响的防腐剂，如二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)和其它防腐剂不存在于含有经历冻融循环的AaPC的培养基中，或例如通过将AaPC转移到基本上不含这样的防腐剂的培养基中而基本上去除。
在进一步的实施方案中，相对于AaPC的异种核酸和内源核酸可以通过交联而灭活，使得在灭活后基本上不发生细胞生长、复制或核酸表达。在一个实施方案中，AaPC在外源性MHC和辅助分子表达、这些分子在AaPC表面上呈递，以及所呈递的MHC分子负载选定的一种或多种肽之后的某一点处灭活。因此，这样的灭活且负载选定肽的AaPC虽然基本上不能增殖或复制，但保留了选定的肽呈递功能。优选地，交联还产生基本上不含污染微生物(如细菌和病毒)的AaPC，而基本上不降低AaPC的抗原呈递细胞功能。因此，交联保持了重要的AaPC功能，同时有助于减轻对使用AaPC开发的细胞疗法产品的安全性的担忧。对于与交联和AaPC相关的方法，参见例如美国专利申请公开20090017000，其通过引用并入本文。
在某些实施方案中，进一步提供了工程化抗原呈递细胞(APC)。例如，如上所述，这样的细胞可用于使免疫效应细胞离体增殖。在进一步的方面，工程化APC本身可以施用于患者，由此在体内刺激免疫效应细胞的扩充。实施方案的工程化APC本身可用作治疗剂。在其它实施方案中，工程化APC可以用作治疗剂，其可以刺激对靶抗原特异的内源性免疫效应细胞的活化和/或增加对靶抗原特异的过继转移免疫效应细胞的活性或持久性。
如本文所用的，术语“工程化APC”是指包含至少第一转基因的细胞，其中第一转基因编码HLA。这样的工程化APC可以进一步包含用于表达抗原的第二转基因，使得抗原与HLA复合呈递在APC表面。在一些方面，工程化APC可以是呈递抗原的细胞类型(例如，树突细胞)。在进一步的方面，工程化APC可以由通常不呈递抗原的细胞类型如T细胞或T细胞祖细胞(称为“T-APC”)产生。因此，在一些方面，实施方案的工程化APC包含编码靶抗原的第一转基因和编码人白细胞抗原(HLA)的第二转基因，使得HLA与靶抗原的表位复合地在工程化APC的表面上表达。在某些具体方面，在工程化APC中表达的HLA是HLA-A2。
在一些方面，实施方案的工程化APC可以进一步包含编码共刺激分子的至少第三转基因。共刺激分子可以是共刺激细胞因子，其可以是膜结合的Cγ细胞因子。在某些方面，共刺激细胞因子是IL-15，如膜结合的IL-15。在一些进一步的方面，工程化APC可包含经编辑的(删除的)基因。例如，可以编辑抑制基因，如PD-1、LIM-3、CTLA-4或TCR以减少或消除该基因的表达。实施方案的工程化APC可以进一步包含编码任何感兴趣的靶抗原的转基因。例如，靶抗原可以是感染性疾病抗原或肿瘤相关抗原(TAA)。
定点照护
在本公开的一个实施方案中，本文所述的免疫效应细胞在照护点场所处被修饰。在一些情况下，照护点场所位于需要治疗的受试者附近的医院或设施(例如，医疗设施)。受试者经历单采血液成分术，并且获得的外周血单个核细胞(PBMC)或PBMC亚群可以例如通过淘洗或Ficoll分离来富集。富集的PBMC或PBMC亚群可以在进一步处理之前在任何合适的冷冻保存溶液中冷冻保存。在一种情况下，使用含有人血清白蛋白的缓冲溶液进行淘洗过程。可通过本文所述的选择方法分离免疫效应细胞，如T细胞。在一种情况下，T细胞的选择方法包括对T细胞上的CD3和CD8具有特异性的珠子。在一种情况下，该珠子可以是顺磁珠子。收获的免疫效应细胞可以在修饰前在任何合适的冷冻保存溶液中冷冻保存。免疫效应细胞在输注前可以解冻长达24小时、36小时、48小时、72小时或96小时。解冻的细胞在修饰前可以置于细胞培养缓冲液，例如补充有胎牛血清(FBS)的细胞培养缓冲液(例如RPMI)中，或置于包含诸如IL-2和IL-21等细胞因子的缓冲液中。另一方面，可以立即修饰收获的免疫效应细胞而不需要冷冻保存。
在一些情况下，通过将嵌合受体、一种或多种本文所述的细胞标签和/或细胞因子工程化/引入免疫效应细胞中然后快速输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在一些情况下，免疫效应细胞的来源可包括同种异体和自体来源。在一种情况下，免疫效应细胞可以是T细胞或NK细胞。在一种情况下，嵌合受体可以是CD19 CAR。在另一种情况下，嵌合受体可以是CD33CAR。在进一步的情况下，嵌合受体可以是MUC16 CAR。在另一种情况下，细胞因子可以是mbIL-15。在一种情况下，该mbIL-15是SEQ ID NO:178，或其变体或片段。在一种情况下，细胞标签可以是SEQ ID NO:57。在又一种情况下，mbIL-15的表达由本文所述的配体诱导型基因开关表达系统调节。例如，可以将诸如veledimex的配体递送至受试者以调节mbIL-15的表达。另一方面，以5mg、10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg提供veledimex。在另一方面，提供较低剂量的veledimex，例如，0.5mg、1mg、5mg、10mg、15mg或20mg。在一个实施方案中，在输注经修饰的免疫效应细胞之前0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天将veledimex施用于受试者。在另一个实施方案中，大约每12小时一次、大约每24小时一次、大约每36小时一次或大约每48小时一次向受试者施用veledimex，在输注经修饰的免疫效应细胞后持续一段有效的时间。在一个实施方案中，施用veledimex的有效时间段为约：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天。在其它实施方案中，可以在休息期之后、休药期之后或当受试者经历复发时再次施用veledimex。
在某些情况下，当观察到对受试者的不利影响或不需要治疗时，可以例如通过西妥昔单抗激活细胞标签，以用于条件性体内消融包含本文所述的细胞标签如截短的表皮生长因子受体标签(HER1t变体)的经修饰的免疫效应细胞。
在一些实施方案中，此类免疫效应细胞通过电穿孔用构建体修饰。在一种情况下，用电穿孔仪如Lonza的NucleofectorTM电穿孔仪进行电穿孔。在其它实施方案中，包含上述构建体的载体是非病毒或病毒载体。在一种情况下，非病毒载体包括Sleeping Beauty转座子-转座酶系统。在一种情况下，使用特定序列对免疫效应细胞进行电穿孔。例如，免疫效应细胞可以用一个转座子进行电穿孔，然后用编码转座酶的DNA，接着用第二个转座子进行电穿孔。在另一种情况下，免疫效应细胞可以同时用所有转座子和转座酶进行电穿孔。在另一种情况下，免疫效应细胞可以用转座酶进行电穿孔，然后用两个转座子或一次一个转座子进行电穿孔。在进行连续电穿孔时，免疫效应细胞可以在下一个电穿孔步骤之前休息一段时间。
在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞不经历增殖和激活步骤。在一些情况下，经修饰的免疫效应细胞不经历孵育或培养步骤(例如离体增殖)。在某些情况下，经修饰的免疫效应细胞在输注之前置于包含IL-2和IL21的缓冲液中。在其它情况下，经修饰的免疫效应细胞在输注之前置于或静置在细胞培养缓冲液，例如补充有胎牛血清(FBS)的细胞培养缓冲液(例如RPMI)中。在输注之前，可以收获经修饰的免疫效应细胞，洗涤，并在盐水缓冲液中配制以准备输注到受试者体内。
在一种情况下，受试者在输注前已进行淋巴细胞消耗。在其它情况下，不需要淋巴细胞消耗，而是将经修饰的免疫效应细胞快速输注到受试者体内。示例性淋巴细胞消耗方案在以下表2和表3中列出：
表2.方案1
D-6 加入/IV补水
D-5 氟达拉滨25mg/m2，环磷酰胺250mg/m2
D-4 氟达拉滨25mg/m2，环磷酰胺250mg/m2
D-3 氟达拉滨25mg/m2 IV，环磷酰胺250mg/m2
D-2 休息
D-1 休息
D0 T细胞输注
表3.方案2
Figure BDA0002380901660001151
Figure BDA0002380901660001161
在另一种情况下，受试者经历最小的淋巴细胞消耗。本文中的最小的淋巴细胞消耗是指减少的淋巴细胞消耗方案，使得受试者可以在淋巴细胞消耗方案后1天、2天或3天内输注。在一种情况下，减少的淋巴细胞消耗方案可包括较低剂量的氟达拉滨和/或环磷酰胺。在另一种情况下，减少的淋巴细胞消耗方案可以包括缩短的淋巴细胞消化期，例如1天或2天。
在一个实施方案中，通过将嵌合受体和细胞因子工程化/引入所述免疫效应细胞中然后快速输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在其它情况下，通过将嵌合受体和细胞因子工程化/引入所述细胞中，然后在至少0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50小时内输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。在其它情况下，通过将嵌合受体和细胞因子工程化/引入免疫效应细胞中，然后在0天、<1天、<2天、<3天、<4天、<5天、<6天或<7天内输注到受试者中来修饰免疫效应细胞。
在一些实施方案中，将一定量的经修饰的效应细胞施用于有需要的受试者，并且基于功效和诱导细胞因子相关毒性的潜力来确定该量。在另一个实施方案中，经修饰的效应细胞是CAR+和CD3+细胞。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约104至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约104至约105个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106至约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含>104但≤105个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含>105但≤106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含>106但≤107个经修饰的效应细胞/kg。在一个实施方案中，可以输注>102但≤104个修饰的效应细胞/kg的较低剂量。
在一个实施方案中，修饰的免疫效应细胞通过直接向肿瘤组织的区域递送而靶向癌症。例如，在卵巢癌中，可以将修饰的免疫效应细胞腹膜内(IP)递送至腹部或腹膜腔。可以通过放置用于递送化疗药物的端口或预先存在的端口来进行这种IP递送。修饰的免疫效应细胞的区域递送的其它方法可以包括导管输注到切除术腔中、超声引导的肿瘤内注射、肝动脉输注或胸膜内递送。
在一个实施方案中，有需要的受试者可以用通过IP递送的第一剂量的经修饰的免疫效应细胞开始治疗，然后是通过IV递送的第二剂量的经修饰的免疫效应细胞。在另一个实施方案中，第二剂量的修饰的免疫效应细胞之后可以是可以通过IV或IP递送的后续剂量。在一个实施方案中，第一和第二或进一步的后续剂量之间的持续时间可以是约：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天。在一个实施方案中，第一和第二或进一步的后续剂量之间的持续时间可以是约：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个月。在另一个实施方案中，第一和第二或进一步的后续剂量之间的持续时间可以是约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
在另一个实施方案中，可以将导管置于肿瘤或转移部位，以进一步施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个剂量的修饰的免疫效应细胞。在一些情况下，修饰的效应细胞的剂量可包含约102至约109个修饰的效应细胞/kg。在观察到毒性的情况下，修饰的效应细胞的剂量可以包含约102至约105个修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，修饰的效应细胞的剂量可以开始于约102个修饰的效应细胞/kg，并且后续剂量可以增加至约：104、105、106、107、108或109个修饰的效应细胞/kg。
在其它实施方案中，刺激工程化细胞的增殖和/或存活的方法包括从受试者获得细胞样品，并用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该细胞样品的细胞。在一个实施方案中，转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签和有效地将所述一种或多种多核苷酸整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一个实施方案中，转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将所述一种或多种多核苷酸有效整合到人的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一个实施方案中，基因开关多肽包含i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域。在一些实施方案中，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。
在一种情况下，体内增殖工程化细胞的方法包括从受试者获得细胞样品，并用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该细胞样品的细胞。在一个实施方案中，将包含嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签和有效地将所述一种或多种多核苷酸整合到所述细胞基因组中的转座酶的转座子电穿孔到细胞样品中，以提供工程化细胞群体。在另一个实施方案中，转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和所述一种或多种多核苷酸有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一个实施方案中，基因开关多肽包含i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域。在一些实施方案中，第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在另一个实施方案中，单个转座子可包含嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种本文所述的细胞标签如HER1t或任何变体。在一种情况下，在将工程化细胞施用给受试者之前不需要淋巴切除。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。
在另一个实施方案中，增强工程化细胞在有需要的受试者中的体内持久性的方法包括从受试者获得细胞样品，并用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该细胞样品的细胞。在一个实施方案中，将包含嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签和有效地将所述一种或多种多核苷酸整合到所述细胞基因组中的转座酶的转座子电穿孔到细胞样品中，以提供工程化细胞群体。在另一个实施方案中，单个转座子可包含嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种本文所述的细胞标签如HER1t或任何变体。在一些情况下，一种或多种转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将DNA有效整合到所述基因组中的转座酶，以提供工程化细胞群体。在一些情况下，基因开关多肽包含i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。
在另一个实施方案中，治疗患有实体瘤的受试者的方法包括从受试者获得细胞样品，用一种或多种包含一个或多个转座子的多核苷酸转染该样品的细胞，并将工程化细胞群体施用于该受试者。在一种情况下，在将工程化细胞施用于受试者之前不需要淋巴细胞消耗。在一些情况下，一种或多种转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签和将DNA有效整合到细胞基因组中的转座酶。在一些情况下，所述一个或多个转座子编码嵌合抗原受体(CAR)、细胞因子、一种或多种细胞标签、用于细胞因子的配体诱导型控制的基因开关多肽和将DNA有效整合到所述细胞的基因组中的转座酶。在一些情况下，基因开关多肽包含：i)第一基因开关多肽，其包含与第一核受体配体结合域融合的DNA结合域，和ii)第二基因开关多肽，其包含与第二核受体配体结合域融合的反式激活域，其中第一基因开关多肽和第二基因开关多肽通过连接体连接。在一些情况下，通过电穿孔转染细胞。在一些情况下，编码基因开关多肽的多核苷酸由启动子调节。在一些情况下，该启动子是组织特异性启动子或EF1A启动子或其功能变体。在一些情况下，该组织特异性启动子包含T细胞特异性应答元件或NFAT应答元件。在一些情况下，该细胞因子包括IL-1、IL-2、IL-15、IL-12、IL-21、IL-15与IL-15Rα的融合体或IL-15变体中的至少一种。在一些情况下，该细胞因子是分泌形式。在一些情况下，该细胞因子是膜结合形式。在一些情况下，所述细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞或T细胞祖细胞。在一些情况下，将细胞施用于受试者(例如通过向受试者输注工程化细胞)。在一些情况下，该方法进一步包括施用有效量的配体(例如veledimex)以诱导细胞因子的表达。在一些情况下，所述CAR能够结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。在一些情况下，转座酶是鲑鱼型Tc1样转座酶。在一些情况下，转座酶是SB11或SB100x转座酶。在其它情况下，转座酶是PiggyBac。在一些情况下，细胞标签包含HER1t1中的至少一个。
适应症
在一些实施方案中，本文公开了向患有病症(例如癌症或传染病)的受试者施用编码本文所述多核苷酸的经修饰的效应细胞的方法。在一些情况下，该癌症是与CD19、CD20、CD33、CD44、BCMA、CD123、EGFRvIII、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72或VEGF-R2的表达相关的癌症。
在一些实施方案中，本文公开了向患有与CD19过表达相关的癌症的受试者施用多核苷酸、多肽或编码本文所述多核苷酸的修饰的效应细胞的方法。在一些实施方案中，本文公开了向患有与CD33过表达相关的癌症的受试者施用经修饰的效应细胞的方法。在一些实施方案中，本文公开了向患有与CD19、CD20、CD33、CD44、BCMA、CD123、EGFRvIII、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72或VEGF-R2的过表达相关的癌症的受试者施用经修饰的效应细胞的方法。在一些情况下，该癌症是转移性癌症。在其它情况下，该癌症是复发性或难治性癌症。
在一些情况下，癌症是实体瘤或血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是实体瘤。在其它情况下，该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是转移性癌症。在一些情况下，该癌症是复发性或难治性癌症。
在一些情况下，所述癌症是实体瘤。示例性实体瘤包括但不限于肛门癌；阑尾癌；胆道癌(即胆管癌)；膀胱癌；脑肿瘤；乳腺癌；宫颈癌；结肠癌；原发灶不明癌(CUP)；食道癌；眼癌；输卵管癌；胃肠癌；肾癌；肝癌；肺癌；髓母细胞瘤；黑素瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；甲状旁腺疾病；阴茎癌；垂体瘤；前列腺癌；直肠癌；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；喉癌；甲状腺癌；子宫癌；阴道癌；或外阴癌。
在一些情况下，所述癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，血液系统恶性肿瘤包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或B细胞恶性肿瘤。在一些情况下，血液系统恶性肿瘤包括淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。在一些情况下，示例性血液系统恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、高危CLL、非CLL/SLL淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病(PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高等级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些实施方案中，血液系统恶性肿瘤包括髓样白血病。在一些实施方案中，血液系统恶性肿瘤包括急性髓样白血病(AML)或慢性髓样白血病(CML)。
在一些情况下，本文公开了向患有血液系统恶性肿瘤的受试者施用本文所述的经修饰的效应细胞的方法，该血液系统恶性肿瘤选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、高危CLL、非CLL/SLL淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病(PLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高等级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。在一些情况下，本文公开了向患有选自AML或CML的血液系统恶性肿瘤的受试者施用经修饰的效应细胞的方法。
在其它情况下，本文公开了向具有传染病引起的感染的受试者施用的方法。传染病可以是由细菌、病毒或真菌感染引起的疾病。在其它情况下，示例性病毒病原体包括以下科的病毒病原体：腺病毒科、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、JC病毒、BK病毒、HSV病毒科、HHV病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头多瘤空泡病毒科、多瘤病毒、弹状病毒科和披膜病毒科。示例性的致病病毒引起天花、流感、流行性腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉和风疹。示例性的致病真菌包括假丝酵母属、曲霉属、隐球酵母属、组织胞浆菌属、肺囊虫属和葡萄穗霉属。示例性的致病细菌包括链球菌属、假单胞菌属、志贺菌属、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、螺杆菌属、大肠杆菌、立克次体属、芽孢杆菌属、博德特氏菌属、衣原体属、螺旋体属和沙门菌属。
经修饰的效应细胞剂量
在一些实施方案中，将一定量的经修饰的效应细胞施用于有需要的受试者，并且基于功效和诱导细胞因子相关毒性的潜力来确定该量。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约102至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约103至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约104至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约108个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106至约108个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约107至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105至约106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106至约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约107至约108个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约108至约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约109个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约108个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约107个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约106个经修饰的效应细胞/kg。在一些情况下，一定量的经修饰的效应细胞包含约105个经修饰的效应细胞/kg。
在一些实施方案中，经修饰的效应细胞是经修饰的T细胞。在一些情况下，经修饰的T细胞是CAR-T细胞。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约102至约104个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约105至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约105至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约105至约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约106至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约106至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约107至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约105至约106个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约106至约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约107至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约108至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约106个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CAR-T细胞包含约105个CAR-T细胞/kg。
在一些实施方案中，CAR-T细胞是CD19特异性CAR-T细胞。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约102至约109个CAR-T细胞/kg。CAR-T细胞是CD19特异性CAR-T细胞。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约103至约109个CAR-T细胞/kg。CAR-T细胞是CD19特异性CAR-T细胞。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约104至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约105至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约105至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约105至约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约106至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约106至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约107至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约105至约106个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约106至约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约107至约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约108至约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约109个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约108个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约107个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约106个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约105个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约104个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约103个CAR-T细胞/kg。在一些情况下，一定量的CD19特异性CAR-T细胞包含约102个CAR-T细胞/kg。
在一些实施方案中，经修饰的T细胞是工程化TCR T细胞。在一些情况下，一定量的工程化TCR T细胞包含约102至约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR T细胞包含约103至约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR T细胞包含约104至约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR T细胞包含约105至约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约105至约108个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约105至约107个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约106至约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约106至约108个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约107至约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约105至约106个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约106至约107个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约107至约108个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约108至约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约109个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约108个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约107个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约106个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约105个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约104个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约103个TCR细胞/kg。在一些情况下，一定量的工程化TCR细胞包含约102个TCR细胞/kg。
药物组合物和剂型
在一些实施方案中，本文公开了用于在受试者中施用的包含本文公开的多核苷酸或多肽的组合物。在一些情况下是编码本文公开的多核苷酸或多肽并且任选地含有细胞因子和/或另外的治疗剂的经修饰的效应细胞组合物。在一些情况下，本文还包括编码用于表达细胞标签的多肽构建体的载体，以用于效应细胞的修饰。
在一些情况下，使用一种或多种生理学上可接受的载剂以常规方式配制经修饰的效应细胞或编码多肽构建体和嵌合抗原受体的载体的药物组合物，该载剂包括有助于将活性化合物加工成可药用的制剂的赋形剂和助剂。适当的制剂取决于选定的给药途径。本文所述药物组合物的综述可见于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.,编著,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,NewYork,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
任选地以常规方式制备药物组合物，仅举例来说，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或压缩方法。
在某些实施方案中，组合物还可包含一种或多种pH调节剂或缓冲剂，包括酸，如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲液，如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。所包含的这类酸、碱和缓冲液的量是将组合物的pH维持在可接受范围内所需的量。
在其它实施方案中，组合物还可包含使组合物的重量摩尔渗透压浓度处于可接受范围内所需的量的一种或多种盐。这类盐包括具有钠、钾或铵阳离子以及氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的那些盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
本文所述的药物组合物通过任何合适的给药途径施用，包括但不限于口服、肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)、鼻内、颊部、舌下或直肠给药途径。在一些情况下，配制药物组合物用于肠胃外(例如，静脉内、皮下、肌肉内、脑内、脑室内、关节内、腹膜内或颅内)给药。
将本文所述的药物组合物配制成任何合适的剂型，包括但不限于用于由待治疗个体口服摄取的水性口服分散体、液体、凝胶、糖浆、酏剂、浆液、悬浮液等，固体口服剂型、气雾剂、控制释放制剂、快速熔化制剂、泡腾制剂、冻干制剂、片剂、粉剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂，以及立即和控制释放混合型制剂。在一些实施方案中，将药物组合物配制成胶囊。在一些实施方案中，将药物组合物配制成溶液(例如，用于IV给药)。在一些情况下，将药物组合物配制成输注剂。在一些情况下，将药物组合物配制成注射剂。
本文所述的药物固体剂型任选地包含本文所述的化合物和一种或多种药学上可接受的添加剂，如相容的载剂、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透增强剂、湿润剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或其一种或多种组合。
在其它方面，使用标准包衣程序，如Remington's Pharmaceutical Sciences,第20版(2000)中所述的标准包衣程序，在组合物周围提供膜包衣。在一些实施方案中，将组合物配制成颗粒(例如用于通过胶囊施用)并且对一些或所有颗粒进行包衣。在一些实施方案中，将组合物配制成颗粒(例如用于通过胶囊施用)并且将一些或所有颗粒制成微胶囊。在一些实施方案中，将组合物配制成颗粒(例如用于通过胶囊施用)并且一些或所有颗粒未制成微胶囊且未包衣。
在某些实施方案中，本文提供的组合物还可包含一种或多种防腐剂以抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞物质，如硼酸苯汞(merfen)和硫柳汞(thiomersal)；稳定化的二氧化氯；以及季铵化合物，如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵和西吡氯铵。
如本文所提及的“增殖性疾病”是指统一的概念，即细胞的过度增殖和细胞基质的更新对包括癌症在内的若干疾病的发病机理有显著贡献。
如本文所用的“患者”是指被诊断为患有或怀疑患有或发展为生理状况，例如癌症或自身免疫性病况或感染的哺乳动物受试者。在一些实施方案中，术语“患者”是指具有高于平均的发生癌症可能性的哺乳动物受试者。示例性患者可以是人、猿、狗、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿动物和其它可以受益于本文公开的疗法的哺乳动物。示例性的人类患者可以是男性和/或女性。
“施用”在本文中是指向患者提供本公开的组合物。作为实例而非限制的，组合物施用(例如，注射)可通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射或肌肉内(i.m.)注射进行。可以采用一种或多种这样的途径。肠胃外施用可以是，例如，通过推注或通过随时间平缓灌注。备选地地或同时地，可通过口服途径施用。此外，还可以通过手术沉积细胞团或细胞丸或放置医疗装置来施用。
“有需要的患者”或“有需要的受试者”在本文中是指被诊断为患有或怀疑患有疾病或病症，例如但不限于增殖性疾病如癌症的患者或受试者。在一个实施方案中，该患者或受试者患有或可能发展为实体瘤或白血病。在一些实施方案中，白血病可以是例如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓样白血病(CML)。
本公开的组合物可包含有效治疗或预防增殖性疾病的量的表达本发明核酸序列的宿主细胞或包含本发明核酸序列的载体。如本文所用的，术语“治疗”、“处理”及类似用语是指获得所需的药理学和/或生理学效果。在实施方案中，该效果是治疗性的，即该效果部分或完全地治愈疾病和/或由该疾病引起的不良症状。为此，本发明的方法包括施用“治疗有效量”的组合物，该组合物包含表达本发明的核酸序列的宿主细胞，或包含本发明核酸序列的载体。
“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段上有效获得所需治疗结果的量。治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及本发明核酸序列在个体中引发所需反应的能力而变化。
或者，药理学和/或生理学效果可以是“预防性的”，即该效果完全或部分地预防疾病或其症状。
“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段上有效获得所需预防结果(例如，疾病发作的预防)的量。
“消泡剂”减少加工过程中的起泡，这种起泡可以造成水性分散体的凝聚、成品膜中的气泡或通常受损的加工。示例性的消泡剂包括硅乳剂或失水山梨醇倍半油酸酯(sorbitan sesquoleate)。
“抗氧化剂”包括例如丁羟甲苯(BHT)、抗坏血酸钠、抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠和生育酚。在某些实施方案中，如需要，抗氧化剂增强化学稳定性。
本文所述的制剂可受益于抗氧化剂、金属螯合剂、含巯基的化合物和其它普通稳定剂。这类稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v甘油；(b)约0.1％至约1％w/v甲硫氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v一硫代甘油，(d)约1mM至约10mM EDTA，(e)约0.01％至约2％w/v抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v聚山梨醇酯80，(g)0.001％至约0.05％w/v聚山梨醇酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)硫酸葡聚糖，(k)环糊精，(l)多硫酸戊聚糖酯和其它类肝素类，(m)二价阳离子，如镁和锌；或(n)其组合。
“粘合剂”赋予粘结性质，并且包括例如藻酸及其盐；纤维素衍生物，如羧甲基纤维素、甲基纤维素(例如
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)、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如
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)、乙基纤维素(例如
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)和微晶纤维素(例如
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)；微晶右旋糖；直链淀粉；硅酸镁铝；多糖酸；膨润土；明胶；聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯聚吡咯烷酮；聚维酮；淀粉；预胶化淀粉；黄蓍胶、糊精、糖，如蔗糖(例如
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)、葡萄糖、右旋糖、糖蜜、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇(例如
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)和乳糖；天然或合成树胶，如阿拉伯胶、黄蓍胶、茄替胶、车前籽胶、聚乙烯吡咯烷酮(例如
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CL、
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CL、
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XL-10)、落叶松阿拉伯半乳聚糖、
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聚乙二醇、蜡、藻酸钠等。
“载剂”或“载剂材料”包括任何在制药学中常用的赋形剂，并且应根据与本文公开的化合物如依鲁替尼和抗癌剂化合物的相容性以及所需剂型的释放谱性质而选择。示例性的载剂材料包括，例如，粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、润湿剂、稀释剂等。药学上相容的载剂材料可包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸氢二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:MackPublishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编著,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第七版(LippincottWilliams&Wilkins1999)。
“分散剂”和/或“粘度调节剂”包括通过液体介质或造粒方法或混合方法控制药物的扩散和均匀性的材料。在一些实施方案中，这些药剂还有助于包被或侵蚀基质的有效性。示例性扩散促进剂/分散剂包括例如亲水性聚合物、电解质、
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60或80、PEG、聚乙烯吡咯烷酮(PVP；商品名为
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)和基于碳水化合物的分散剂，如羟丙基纤维素(例如，HPC、HPC-SL和HPC-L)、羟丙基甲基纤维素(例如，HPMC K100、HPMC K4M、HPMC K15M和HPMC K100M)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酸羟丙基甲基纤维素硬脂酸酯(HPMCAS)、非结晶纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇(PVA)、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯酚聚合物与环氧乙烷和甲醛(也称为泰洛沙泊)、泊洛沙姆(例如，
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和
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它们是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)；以及泊洛沙胺(例如，Tetronic
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也称为Poloxamine
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它是由将环氧丙烷和环氧乙烷依次添加至乙二胺而得到的四官能嵌段共聚物(BASF Corporation,Parsippany,N.J.))、聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S-630)、聚乙二醇例如可具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量的聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、树胶如黄蓍树胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原树胶)、糖、纤维素制品如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮、卡波姆、聚乙烯醇(PVA)、藻酸盐、壳聚糖及其组合。增塑剂如纤维素或三乙基纤维素也可用作分散剂。在脂质体分散体和自乳化分散体中特别有用的分散剂是二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、来自蛋类的天然磷脂酰胆碱、来自蛋类的天然磷脂酰甘油、胆固醇和豆蔻酸异丙酯。
一种或多种蚀解促进剂与一种或多种扩散促进剂的组合也可以在本发明的组合物中使用。
术语“稀释剂”是指用来在递送前稀释感兴趣的化合物的化学化合物。稀释剂也可用来稳定化合物，因为它们可提供更稳定的环境。本领域中利用溶解在缓冲溶液(其也可提供pH控制或维持)中的盐作为稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。在某些实施方案中，稀释剂增加组合物的体积，以便于压缩或者产生用于均匀掺合以供胶囊填充的足够体积。这类化合物包括例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、微晶纤维素如
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磷酸氢钙、磷酸二钙二水合物；磷酸三钙、磷酸钙；无水乳糖、喷雾干燥的乳糖；预胶化淀粉、可压缩糖，如Di-
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(Amstar)；甘露醇、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、基于蔗糖的稀释剂、糖果糖；一碱式硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物；乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂(dextrate)；水解谷物固体、直链淀粉；粉状纤维素、碳酸钙；甘氨酸、高岭土；甘露醇、氯化钠；肌醇、膨润土等。
“填充剂”包括诸如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等化合物。
“润滑剂”和“助流剂”是防止、减少或抑制材料粘附或摩擦的化合物。示例性的润滑剂包括例如硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂酰富马酸钠，烃如矿物油，或氢化植物油如氢化大豆油
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高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐，如铝、钙、镁、锌盐，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡，
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硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如，PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇如CarbowaxTM，油酸钠，苯甲酸钠，山萮酸甘油酯，聚乙二醇，十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠，胶体二氧化硅如SyloidTM，Cab-O-
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淀粉如玉米淀粉，硅油，表面活性剂，等等。
“增塑剂”是用来软化微胶囊化材料或膜包衣以使其更不易碎的化合物。合适的增塑剂包括例如聚乙二醇如PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450、PEG 3350和PEG 800、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三醋精。在一些实施方案中，增塑剂也可用作分散剂或润湿剂。
“增溶剂”包括诸如三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆汁盐、聚乙二醇200-600、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、二乙二醇单乙基醚(transcutol)、丙二醇、二甲基异山梨醇等化合物。
“稳定剂”包括诸如任何抗氧化剂、缓冲液、酸、防腐剂等化合物。
“悬浮剂”包括诸如聚乙烯吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30、乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)、聚乙二醇(例如，聚乙二醇可具有约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400的分子量)、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟甲基纤维素、聚山梨醇酯-80、羟乙基纤维素、藻酸钠、树胶如黄蓍胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶(包括黄原树胶)、糖、纤维素如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚山梨醇酯-80、藻酸钠、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、聚维酮等化合物。
“表面活性剂”包括诸如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或80、三醋精、维生素ETPGS、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(polaxomer)、胆汁盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物如
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(BASF)等化合物。一些其它表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；以及聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯昔醇(octoxynol)10、辛苯昔醇40。在一些实施方案中，可包含表面活性剂以增强物理稳定性或用于其它目的。
“粘度增强剂”包括例如甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸硬脂酸羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
“润湿剂”包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三醋精、吐温80、维生素E TPGS、铵盐等化合物。
试剂盒/制品
在某些实施方案中，本文公开了与一种或多种本文所述的方法一起使用的试剂盒和制品。这样的试剂盒包括载具、包装或被区室化为接纳一个或多个容器如小瓶、管等的容器，每个容器包含将在本文所述的方法中使用的一个单独要素。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，容器由诸如玻璃或塑料等各种材料形成。
本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、袋、容器、瓶以及适于所选制剂及预期的给药和治疗方式的任何包装材料。
例如，容器包括编码表达本文所述的一种或多种截短的非免疫原性多肽的多肽构建体的细胞(例如，CD20或CD52)。任选地，细胞可以另外包含一个或多个异源基因，例如编码CAR，T细胞受体和/或细胞因子的基因。这样的试剂盒任选地包含关于其在本文所述方法中的使用的标识性描述或标签或说明。
试剂盒通常包括列出内容物的标签和/或使用说明书，以及具有使用说明的包装插页。通常也将会包括一套说明书。
在一些实施方案中，标签处于容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当构成标签的字母、数字或其它字符附着、模制或蚀刻在容器本身上时，标签处于容器上；当标签存在于也容纳容器的接纳器或载具内(例如作为包装插页)时，标签与容器相关联。在一个实施方案中，标签用来指示内容物将用于具体治疗应用。标签也指示关于内容物诸如在本文所述方法中的使用的指导。
序列
以下提供了本文提供的实施方案中包括的某些序列的代表性列表。
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实施例
提供这些实施例仅仅是为了说明目的，并非限制本文提供的权利要求的范围。
实施例1.截短的CD20(CD20t)多肽构建体作为细胞标签的表达和活性
用野生型CD20、截短的CD20细胞标签以及抗CD20抗体利妥昔单抗的阳性对照转染HEK-293T细胞。使用利妥昔单抗通过流式细胞术测量表达。如图1所示，当通过利妥昔单抗检测时，相对于变体CD20t4(SEQ ID NO:115)，CD20截短变体CD20t1(SEQ ID NO:109)表现出稳定的表达。这些数据表明，仅CD20内源多肽中的特定截短可能与CD20t作为细胞标签的应用相容。
使用编码CAR和CD20t1细胞标签的Sleeping Beauty转座子以及Sleeping Beauty转座酶质粒对人PBMC进行核转染。使用流式细胞术测量CAR和CD20t的共表达。图2显示与了未转染的细胞相比，从CAR-CD20t1构建体共表达CD20t1(SEQ ID NO:109；y轴)和CAR(x轴)。
特异性抗CD20抗体诱导截短CD20细胞标签的ADCC
修饰Jurkat报道细胞系以稳定表达CD20t1细胞标签。使用流式细胞术通过利妥昔单抗染色确认CD20t1的表达。在体外细胞毒性测定中测量了利妥昔单抗特异性消除表达CD20t1的Jurkat靶细胞的能力。图3显示了利妥昔单抗诱导的表达CD20t1的细胞系的ADCC活性。相比之下，采用抗EGFR西妥昔单抗的治疗对ADCC活性没有影响。
实施例2.截短的HER1(HER1t)多肽构建体作为细胞标签的表达
嵌合细胞标签的表达
通过使用HER1基因的结构域III和HER2、3或4基因的结构域IV生成了新型嵌合细胞标签。HER1-ErBB4嵌合细胞标签在人原代细胞中表达。将HER1基因的结构域III与ErbB4基因变体JM-a或JM-b的结构域IV和ErbB4基因的TM结构域遗传融合，以生成嵌合细胞标签。使用GMCSFα信号肽作为将嵌合细胞标签引导至细胞表面的信号肽。将HER1-ErbB4细胞标签(对应于SEQ ID NO:101的截短的EGFR-ErbB4(JM-a)和对应于SEQ ID NO:105的截短的EGFR-ErbB4(JM-b))与对照HER1t细胞标签一起克隆到pCDNA3.1载体骨架中，并通过电穿孔转染到原代人PBMC中。通过使用抗HER1特异性抗体西妥昔单抗的流式细胞术在CD3+ T细胞中证实了HER1-ErbB4细胞标签的表达。如图4D所示，转染后，转导的T细胞表达高水平的嵌合细胞标签。同种型抗体染色以及未转染的模拟细胞显示了西妥昔单抗染色对细胞标签的特异性。
截短的HER1t细胞标签的表达
如图4A所示的示意图所述，构建了各种截短的细胞标签。将截短的HER1t变体(对应于SEQ ID NO:57的HER1t1，对应于SEQ ID NO:59的HER1t2，对应于SEQ ID NO:61的HER1t3，对应于SEQ ID NO:63的HER1t4，对应于SEQ ID NO:65的HER1t5，对应于SEQ ID NO:67的HER1t6，和对应于SEQ ID NO:69的HER1t7)与HER1t对照细胞标签一起克隆到pCDNA3.1载体骨架中以测试表达。这些表达载体通过电穿孔转染到原代人PBMC中。通过使用抗HER1特异性抗体西妥昔单抗的流式细胞术在CD3+ T细胞中证实了截短的细胞标签的表达。如图4E所示，T细胞在转染后表达高水平的细胞标签。同种型抗体染色以及未转染的模拟细胞显示了西妥昔单抗染色对细胞标签的特异性。
产生了编码单独的CAR或CAR以及截短HER1t1细胞标签的自灭活慢病毒载体，以评价两种基因的共表达。用慢病毒载体转导活化的人pan T细胞，并在转导后分别使用CAR特异性抗原-Fc融合蛋白和抗HER1抗体西妥昔单抗通过流式细胞术测量CAR和HER1t1的表达。如图5A和图5B的右图所示，转导的T细胞共表达CAR(x轴)和HER1t(y轴)。图5A的左图显示了在未转导的T细胞中观察到的最小背景染色。图5B的左图证明了当用仅编码CAR的慢病毒载体转导T细胞时，CAR表达但HER1t不表达。
表达截短HER1t细胞标签的细胞系的Western印迹分析
对SUP-T1细胞系进行了遗传修饰，以表达HER1t1(SUP-T1/HER1t1)。针对通过流式细胞术检测的高(高)或低(低)水平的HER1t1表达，通过FACS对SUP-T1/HER1t1细胞系进行分选。通过Western印迹分析在SUP-T1/HER1t1(高)和SUP-T1/HER1t1(低)细胞系中证实了截短的HER1t细胞标签的表达。将抗-HER1抗体西妥昔单抗与SUP-T1/CAR/HER1t1或对照(Jurkat和A431)细胞系提取物一起孵育，以使抗体能够与HER1衍生的细胞标签蛋白质结合。然后使用蛋白A/G偶联的琼脂糖珠沉淀抗体/抗原复合物。然后通过SDS-PAGE分离该样品，以供使用抗HER1抗体进行Western印迹分析。图8所示的Western印迹证实了HER1t1在SUPT1/HER1t1细胞系中的表达。与SUP-T1/HER1t1(高)细胞系相比，SUP-T1/HER1t1(低)细胞系中HER1t1的强度较低。在A431阳性对照细胞系中检测到全长HER1。在未修饰的Jurkat细胞系中未检测到HER1的表达。图8：泳道1：仅IP抗体。泳道2：仅Jurkat细胞；泳道3：SUPT1/HER1t1(高水平的HER1t1)；泳道4：SUPT1/HER1t1(较低水平的HER1t1)；泳道5：表达全长HER1的A431细胞；泳道6：分子量标准。粗箭头指向西妥昔单抗在除泳道5之外的泳道中沉淀的蛋白质，在泳道5中指全长HER1。
实施例3.抗HER1抗体对表达截短HER1t细胞标签的细胞的ADCC和CDC
使用NK细胞系评估了HER1t1细胞标签在ADCC测定中的功能。修饰亲本NK细胞系以表达CD16受体变体以诱导ADCC。进一步修饰CD16+NK细胞系以共表达CAR和HER1t1细胞标签。在能够结合NK细胞上的CD52的抗HER1西妥昔单抗或阳性对照阿仑珠单抗的存在下，分析亲本NK、CD16+NK和CD16+/CAR+/HER1t1+NK细胞系的ADCC。如图6所示，仅当NK细胞表达CD16时，才观察到ADCC，正如抗体与CD16的结合诱导效应子功能所预期的。此外，无论这些细胞是否表达HER1t细胞标签，只要表达了CD16，阿仑珠单抗就能够诱导NK细胞的ADCC。相反，西妥昔单抗仅在HER1t1和CD16都表达时才诱导ADCC，从而证实了特异性。
对SUP-T1(人T淋巴细胞细胞系)和报道细胞系进行了遗传修饰，以共表达CAR和HER1t1(SUP-T1/CAR/HER1t1)。针对通过流式细胞术检测的高(高)或中等(中)水平的HER1t1表达，通过FACS对SUP-T1/CAR/HER1t1细胞系进行筛选，以评价细胞表面上的细胞标签密度对使用抗HER1抗体的ADCC的影响。图7A显示了在分选的SUP-T1/CAR/HER1t1群体中CAR和HER1t1的表达水平。通过流式细胞术，图7A的左图显示仅同种型抗体染色，中图显示高HER1t表达，右图显示中等HER1t表达。由于CAR和HER1t1基因是从同一转录物表达的，因此基于HER1t1分选细胞也以类似的方式影响了CAR的表达。使用西妥昔单抗或非特异性利妥昔单抗(作为对照)，在ADCC测定中测试了SUP-T1/CAR/HER1t1高和中细胞系。该测定使用5:1的效应细胞(E):HER1+靶细胞(T)比。将ADCC量化为报道基因表达的诱导倍数。如图7B所示，西妥昔单抗以剂量依赖性方式特异性诱导表达HER1t1的细胞系的ADCC。此外，ADCC的诱导取决于细胞表面上HER1t1表达的水平。
通过电穿孔用两种Sleeping Beauty转座子载体转染人类供体PBMC，以表达CD19CAR和HER1t1细胞标签以及SB11转座酶，以重引导T细胞特异性。转染次日(第1天)对细胞进行计数，并通过流式细胞术测量CAR表达。CAR T细胞用γ-照射的(100Gy)或丝裂霉素C处理的AaPC以1:1的比例刺激4个刺激周期。使用的AaPC细胞是表达CD19抗原的K562-AaPC。培养物仅对于第一轮刺激补充IL-21(30ng/ml)，随后对于剩余的刺激补充重组人IL-2(50IU/ml)和IL-21(30ng/ml)(Pepro Tech)。在每个刺激周期结束时对T细胞培养物进行表型分型，该周期通常持续7天。使用蛋白L或识别CD19 CAR的抗独特型抗体，通过多参数流式细胞术根据CAR表达对培养物进行表型分型。在ADCC和补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中测试了西妥昔单抗在体外特异性清除CD19 CAR+/HER1t1+ T细胞的能力。将CSFE标记的CD19 CAR+/HER1t1+ T靶细胞(T)(5e4个细胞/孔)与CD16+NK效应细胞系(E)(2.5e5个细胞/孔)以5:1的E:T比与5μg/ml西妥昔单抗或利妥昔单抗一式三份孵育2-24小时。对于CDC测定，使用10％进行和未进行热灭活(HI)的兔血清，以及30％进行和未进行热灭活(HI)的人血清。细胞用DAPI染色，并用iQUE Screener plus仪器采集数据。报告每种情况下的活细胞计数。如图9(左图)所示，西妥昔单抗诱导CD19 CAR+/HER1t1+ T细胞的特异性细胞毒性，如ADCC测定中的低活细胞计数所表明的。如图9(右图)所示，当人或兔血清未被热灭活时，西妥昔单抗诱导CD19 CAR+/HER1t1+ T细胞的特异性细胞毒性，如CDC测定中的低活细胞计数所表明的。
实施例4.下一代杀伤开关/细胞标签构建体增强ADCC和CDC
图10是比较包含截短的细胞标签的第一代和下一代多肽构建体的设计的示意图。第一代截短的细胞标签(上图)包含通过可选的肽连接体连接的截短的变体和非二聚化的跨膜结构域(TM)。下一代截短的细胞标签(下图)包含多聚化结构域，以生成能够在细胞表面上多聚化的细胞标签。在图10的下图中描绘的示例利用能够进行同二聚化的跨膜结构域(TM-A)来诱导细胞表面上的细胞标签二聚体。尽管示出了细胞表面多肽的同二聚化，但是如果对细胞进行工程改造以共表达具有不同细胞表面多肽的多肽构建体，则在细胞表面形成异二聚体也是可能的。在第一代和下一代多肽构建体中，抗截短变体抗体或另一种结合结构域识别并结合截短的变体。对于这类下一代构建体，细胞表面多肽的二聚化可以增加亲合力，并放大由抗体结合诱导的信号传导作用，超过第一代构建体，并改善使用多聚体细胞标签的细胞的纯化和分选。
通过电穿孔用Sleeping Beauty转座子载体转染人类供体PBMC(第0天)，该转座子载体被设计为共表达CD19 CAR和第一代或下一代HER1t细胞标签以及SB11转座酶，以重引导T细胞特异性。转染次日(第1天)对细胞进行计数，并通过流式细胞术测量CAR表达。CAR T细胞用γ-照射的(100Gy)或丝裂霉素C处理的AaPC以1:1的比例刺激4个刺激周期。使用的AaPC细胞是表达CD19抗原的K562-AaPC。培养物仅对于第一轮刺激补充IL-21(30ng/ml)，随后对于剩余的刺激补充重组人IL-2(50IU/ml)和IL-21(30ng/ml)(Pepro Tech)。在每个刺激周期结束时对T细胞培养物进行表型分型，该周期通常持续7天。使用蛋白L或识别CD19CAR的抗独特型抗体以及识别各种截短HER1t细胞标签的抗HER1抗体西妥昔单抗，通过多参数流式细胞术根据CAR表达对培养物进行表型分型。图11证明了与第一代多肽构建体(对应于SEQ ID NO:57的HER1t1)和不表达HER1t的对照细胞系相比，在包含HER1t变体(例如，对应于SEQ ID NO:71的HER1t8，对应于SEQ ID NO:75的HER1t9，和对应于SEQ ID NO:79的HER1t10)的下一代多肽构建体中，CD19 CAR表达不随时间变化。表4显示了表达CD19 CAR的CD3+T细胞在各种培养物中的百分比。
表4.图11中的CD19 CAR表达的定量。
第1天 第14天 第21天 第28天
仅CAR 40.45 72.07 86.87 91.56
CAR/HER1t1 24.54 66.22 77.51 87.66
CAR/Her1t8 24.02 60.75 66.26 86.27
CAR/HER1t9 24.41 58.43 72.51 83.7
CAR/HER1t10 20.34 59.57 73.56 83.03
图12显示，表达包含具有跨膜二聚化结构域的HER1t变体(对应于SEQ ID NO:71的变体HER1t8，对应于SEQ ID NO:75的HER1t9，和对应于SEQ ID NO:79的HER1t10)的下一代多肽构建体的细胞系随时间具有与表达第一代HER1t多肽构建体(对应于SEQ ID NO:57的HER1t1)的细胞系相似的HER1t表达水平。在用仅CAR转座子转染的培养物中未检测到HER1t表达。表5显示了表达HER1t变体的CD3+T细胞在各种培养物中的百分比，而表6则显示了图12在第14、21和28天时HER1t的平均荧光强度(MFI)。
表5.图12中的HER1t表达的定量。
第1天 第14天 第21天 第28天
仅CAR 0.98 4.79 0.38 0.99
CAR/HER1t1 19.1 75.63 95 97.69
CAR/Her1t8 31.27 76.91 95.04 98.67
CAR/HER1t9 24.68 70.75 95.56 98.31
CAR/HER1t10 27.72 76.8 96.53 98.58
表6.图12在第14、21和28天时HER1t变体的平均荧光强度。
Figure BDA0002380901660001731
在体外测定中测试了表达下一代HER1t变体的CD19 CAR-T细胞的西妥昔单抗诱导的ADCC，并与第一代HER1t设计进行了功效比较。CD19 CAR-T靶细胞(T)用CFSE标记，对表达HER1t变体的CAR-T细胞采用0.0005μM，而对不具有HER1t的CAR-T细胞采用0.01μM。将靶细胞以0.8×106个细胞/ml悬浮，以1:1比例混合，并以4×104个细胞/50μl/孔接种(各自以2×104个细胞/50μl/孔)。接下来，收集CD16+NK效应细胞(E)，洗涤，并以0.2×106个细胞/ml重悬浮。然后将细胞以2×104个细胞/100μl/孔接种(E:T＝0.5:1)。与不含抗体的对照溶液一起，以0.4μg/ml制备利妥昔单抗或西妥昔单抗抗体，并将溶液按以下方式添加至孔中：(i)利妥昔单抗(抗CD20)对照：50μl/孔，每个孔中的终浓度为0.1μg/ml；(ii)西妥昔单抗(抗HER1)：50μ1/孔，每个孔中的终浓度为0.1μg/ml；(iii)对照溶液(无抗体)：50μl/孔，每个孔中的终浓度为0μg/ml。将每个孔中的最终体积调节至200μl。将溶液充分混合并培养4、8、16和24小时。孵育后，洗涤细胞，并在人Fc Block的存在下用CD3-BV786染色。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于50μl含有7AAD的FAC缓冲液中10分钟，然后进行分析。图13A-B证明，在西妥昔单抗的存在下，相对于包含非二聚化跨膜结构域的多肽构建体(HER1t对照)，在细胞表面多肽(HER1t8、HER1t9和HER1t10)上包含潜在二聚化HER1t变体的下一代HER1t多肽构建体介导了改善的ADCC。
进行了体外研究，以确认西妥昔单抗诱导针对CD19CAR-mbIL15-T细胞的ADCC的能力。CD19CAR-mbIL15-T细胞是通过CD19 CAR和mbIL15-HER1t转座子以及SB 11转座酶的电转移产生的。将遗传修饰的T细胞在经辐照的CD19+饲养细胞上离体扩充，以供ADCC测定。由于mbIL15-HER1t转座子的双顺反子设计，当表达mbIL15时，CD19CAR-mbIL15-T细胞共表达HER1t1。使用相同的CD19+饲养细胞，对通过转染CD19 CAR转座子和SB11转座酶生成的缺少mbIL15-HER1t表达的阴性对照CD19 CAR+mbIL15-HER1tneg T细胞进行离体数量扩充。经扩充的表达内源性FcR的同种异体NK细胞用作效应细胞，并在10μg/mL西妥昔单抗或充当阴性对照的抗CD20抗体(利妥昔单抗)的存在下与标记的CAR+ T细胞以10:1的E:T比共培养过夜。通过流式细胞术确定抗体处理后残留在培养物中的mbIL15-HER1t+ T细胞，以计算杀伤百分比。西妥昔单抗的添加导致消除了CD19-mbIL15-CAR T细胞的mbIL15-HER1t+群体中的超过90％(图14)。利妥昔单抗显示较低水平的CD19-mbIL15-CAR-T细胞的非特异性消除。西妥昔单抗未能显示出显著水平的CAR+mbIL15-HER1tneg T细胞的裂解，从而证实了HER1t特异性作用机理。本实验中使用的西妥昔单抗浓度10μg/mL在先前报道的西妥昔单抗患者给药剂量的范围内。这些数据支持西妥昔单抗在因发生不良临床效果而需要时消耗CD19CAR-mbIL15-T细胞的用途。
在NSG小鼠中进行了体内研究。在第0天，将5E6 CAR-HER1t1T细胞和5E6 KHYG-1-CD16high细胞腹膜内(IP)注射到每只小鼠中。在同一天，将小鼠随机分组，并用盐水或西妥昔单抗(0.5mg：IP)处理。在第1天收获腹膜灌洗液，并进行流式细胞术评估，以评估两组小鼠的CAR-HER1t1 T细胞的频率。还进行了CAR-HER1t1 T细胞的绝对细胞计数。数据(未示出)证明了与盐水处理的小鼠相比，西妥昔单抗特异性消除表达HER1t1标签的CAR T细胞的能力。
尽管本文中已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本公开内容的情况下现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，本文所述的实施方案的各种替代方案，或者这里描述的这些实施方案或方面中的一个或多个的组合，可用于实施本发明。旨在以下述权利要求书限定本公开的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
序列表
<110> 英特拉克森公司
<120> 新型细胞标签的表达
<130> 50471-708.601
<140>
<141>
<150> 62/516,639
<151> 2017-06-07
<160> 240
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：GMCSFR alpha信号序列
<400> 1
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：GMCSFR alpha信号序列
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：Ig Kappa信号序列
<400> 3
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtcccagg atccagtggg 60
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：Ig Kappa信号序列
<400> 4
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly
20
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：免疫球蛋白E信号序列
<400> 5
atggattgga cctggattct gtttctggtg gccgctgcca caagagtgca cagc 54
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：免疫球蛋白E信号序列
<400> 6
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：CD8-alpha信号序列
<400> 7
atggcgctgc ccgtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：CD8-alpha信号序列
<400> 8
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：TVB2(T21A)信号序列
<400> 9
atgggcacca gcctcctctg ctggatggcc ctgtgtctcc tgggggcaga tcacgcagat 60
gct 63
<210> 10
<211> 21
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：TVB2(T21A)信号序列
<400> 10
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp Ala
20
<210> 11
<211> 72
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：CD52信号序列
<400> 11
atgaagcgct tcctcttcct cctactcacc atcagcctcc tggttatggt acagatacaa 60
actggactct ca 72
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：CD52信号序列
<400> 12
Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser
20
<210> 13
<211> 84
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：低亲和力神经生长因子受体(LNGFR, TNFRSF16)信号序列
<400> 13
atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt 60
ctgggggtgt cccttggagg tgcc 84
<210> 14
<211> 28
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：低亲和力神经生长因子受体(LNGFR, TNFRSF16)信号序列
<400> 14
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala
20 25
<210> 15
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 15
ggaagcgga 9
<210> 16
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 16
Gly Ser Gly
1
<210> 17
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 17
agtggcagcg gc 12
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 18
Ser Gly Ser Gly
1
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 19
ggcggaggcg gaagcggagg cggaggctcc ggcggaggcg gaagc 45
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 21
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 23
ggcagcacct ccggcagcgg caagcctggc agcggcgagg gcagcaccaa gggc 54
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 24
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 25
<211> 78
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：血型糖蛋白A (E91-R116)序列
<400> 25
gagataacac tcattatttt tggggtgatg gctggtgtta ttggaacgat cctcttaatt 60
tcttacggta ttcgccga 78
<210> 26
<211> 26
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：血型糖蛋白A (E91-R116)序列
<400> 26
Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr
1 5 10 15
Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg
20 25
<210> 27
<211> 69
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：血型糖蛋白A (I92-I114)序列
<400> 27
ataacactca ttatttttgg ggtgatggct ggtgttattg gaacgatcct cttaatttct 60
tacggtatt 69
<210> 28
<211> 23
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：血型糖蛋白A (I92-I114)序列
<400> 28
Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile
1 5 10 15
Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile
20
<210> 29
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 29
ataacactca ttatttttgg ggtgatggct ggtgttattg gaacgatcct cttagccctg 60
ctcatctgg 69
<210> 30
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 30
Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile
1 5 10 15
Leu Leu Ala Leu Leu Ile Trp
20
<210> 31
<211> 63
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：CD3 zeta (CD247)跨膜结构域序列
<400> 31
ctctgctacc tgctggatgg aatcctcttc atctatggtg tcattctcac tgccttgttc 60
ctg 63
<210> 32
<211> 21
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：CD3 zeta (CD247)跨膜结构域序列
<400> 32
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ala Leu Phe Leu
20
<210> 33
<211> 84
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：CD8-alpha跨膜结构域序列
<400> 33
atctacatct gggcccctct ggccggcacc tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtcatc 60
accctgtact gcaaccaccg gaat 84
<210> 34
<211> 28
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：CD8-alpha跨膜结构域序列
<400> 34
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
20 25
<210> 35
<211> 81
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：CD28跨膜结构域序列
<400> 35
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 36
<211> 27
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：CD28跨膜结构域序列
<400> 36
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 37
<211> 63
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：细胞毒性T-淋巴细胞蛋白4跨膜结构域序列
<400> 37
ttcctcctct ggatccttgc agcagttagt tcggggttgt ttttttatag ctttctcctc 60
aca 63
<210> 38
<211> 21
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：细胞毒性T-淋巴细胞蛋白4跨膜结构域序列
<400> 38
Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr
1 5 10 15
Ser Phe Leu Leu Thr
20
<210> 39
<211> 66
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：低亲和力神经生长因子受体(LNGFR, TNFRSF16)跨膜结构域序列
<400> 39
ctcatccctg tctattgctc catcctggct gctgtggttg tgggccttgt ggcctacata 60
gccttc 66
<210> 40
<211> 22
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：低亲和力神经生长因子受体(LNGFR, TNFRSF16)跨膜结构域序列
<400> 40
Leu Ile Pro Val Tyr Cys Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu
1 5 10 15
Val Ala Tyr Ile Ala Phe
20
<210> 41
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 41
gcaacgaact tctctctcct aaaacaggct ggtgatgtgg aggagaatcc tggtcca 57
<210> 42
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 42
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 43
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 43
cagtgtacta attatgctct cttgaaattg gctggagatg ttgagagcaa ccctggacct 60
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 44
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 45
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 45
gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg acct 54
<210> 46
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 46
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 47
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 47
gtcaaacaga ccctaaactt tgatctgcta aaactggccg gggatgtgga aagtaatccc 60
ggcccc 66
<210> 48
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 48
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 49
<211> 570
<212> DNA
<213> 脑心肌炎病毒
<400> 49
ccccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatc 570
<210> 50
<211> 1210
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：表皮生长因子受体 (EGFR)同种型a前体序列
<400> 50
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385 390 395 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465 470 475 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625 630 635 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
645 650 655
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His
660 665 670
Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu
675 680 685
Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu
690 695 700
Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser
705 710 715 720
Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu
725 730 735
Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser
740 745 750
Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser
755 760 765
Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser
770 775 780
Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp
785 790 795 800
Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn
805 810 815
Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg
820 825 830
Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro
835 840 845
Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala
850 855 860
Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp
865 870 875 880
Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp
885 890 895
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser
900 905 910
Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu
915 920 925
Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr
930 935 940
Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys
945 950 955 960
Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln
965 970 975
Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro
980 985 990
Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp
995 1000 1005
Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe
1010 1015 1020
Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu
1025 1030 1035
Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn
1040 1045 1050
Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg
1055 1060 1065
Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp
1070 1075 1080
Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro
1085 1090 1095
Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln
1100 1105 1110
Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro
1115 1120 1125
His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln
1130 1135 1140
Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala
1145 1150 1155
Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln
1160 1165 1170
Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys
1175 1180 1185
Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln
1190 1195 1200
Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala
1205 1210
<210> 51
<211> 1255
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：受体酪氨酸-蛋白激酶 ErbB2 (HER2)同种型a前体序列
<400> 51
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690 695 700
Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
785 790 795 800
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
805 810 815
Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly
820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
835 840 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915 920 925
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
930 935 940
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
980 985 990
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu
995 1000 1005
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr
1010 1015 1020
Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly
1025 1030 1035
Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg
1040 1045 1050
Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu
1055 1060 1065
Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser
1070 1075 1080
Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu
1085 1090 1095
Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser
1100 1105 1110
Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val
1115 1120 1125
Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro
1130 1135 1140
Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro
1145 1150 1155
Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu
1160 1165 1170
Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly
1175 1180 1185
Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala
1190 1195 1200
Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp
1205 1210 1215
Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro
1220 1225 1230
Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1250 1255
<210> 52
<211> 1342
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：受体酪氨酸-蛋白激酶 ErbB3 (HER3)同种型1序列
<400> 52
Met Arg Ala Asn Asp Ala Leu Gln Val Leu Gly Leu Leu Phe Ser Leu
1 5 10 15
Ala Arg Gly Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr
20 25 30
Leu Asn Gly Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr
35 40 45
Leu Tyr Lys Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu
50 55 60
Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile
65 70 75 80
Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr
85 90 95
Leu Pro Leu Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp
100 105 110
Gly Lys Phe Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser
115 120 125
His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser
130 135 140
Gly Gly Val Tyr Ile Glu Lys Asn Asp Lys Leu Cys His Met Asp Thr
145 150 155 160
Ile Asp Trp Arg Asp Ile Val Arg Asp Arg Asp Ala Glu Ile Val Val
165 170 175
Lys Asp Asn Gly Arg Ser Cys Pro Pro Cys His Glu Val Cys Lys Gly
180 185 190
Arg Cys Trp Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gln Thr Leu Thr Lys Thr
195 200 205
Ile Cys Ala Pro Gln Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn
210 215 220
Gln Cys Cys His Asp Glu Cys Ala Gly Gly Cys Ser Gly Pro Gln Asp
225 230 235 240
Thr Asp Cys Phe Ala Cys Arg His Phe Asn Asp Ser Gly Ala Cys Val
245 250 255
Pro Arg Cys Pro Gln Pro Leu Val Tyr Asn Lys Leu Thr Phe Gln Leu
260 265 270
Glu Pro Asn Pro His Thr Lys Tyr Gln Tyr Gly Gly Val Cys Val Ala
275 280 285
Ser Cys Pro His Asn Phe Val Val Asp Gln Thr Ser Cys Val Arg Ala
290 295 300
Cys Pro Pro Asp Lys Met Glu Val Asp Lys Asn Gly Leu Lys Met Cys
305 310 315 320
Glu Pro Cys Gly Gly Leu Cys Pro Lys Ala Cys Glu Gly Thr Gly Ser
325 330 335
Gly Ser Arg Phe Gln Thr Val Asp Ser Ser Asn Ile Asp Gly Phe Val
340 345 350
Asn Cys Thr Lys Ile Leu Gly Asn Leu Asp Phe Leu Ile Thr Gly Leu
355 360 365
Asn Gly Asp Pro Trp His Lys Ile Pro Ala Leu Asp Pro Glu Lys Leu
370 375 380
Asn Val Phe Arg Thr Val Arg Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Asn Ile Gln
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Ser Trp Pro Pro His Met His Asn Phe Ser Val Phe Ser Asn Leu Thr
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Thr Ile Gly Gly Arg Ser Leu Tyr Asn Arg Gly Phe Ser Leu Leu Ile
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Met Lys Asn Leu Asn Val Thr Ser Leu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu
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Ile Ser Ala Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Ala Asn Arg Gln Leu Cys Tyr
450 455 460
His His Ser Leu Asn Trp Thr Lys Val Leu Arg Gly Pro Thr Glu Glu
465 470 475 480
Arg Leu Asp Ile Lys His Asn Arg Pro Arg Arg Asp Cys Val Ala Glu
485 490 495
Gly Lys Val Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro
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545 550 555 560
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565 570 575
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Leu His Pro Met Pro Arg Gly Cys Leu Ala Ser Glu Ser Ser Glu
1085 1090 1095
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1325 1330 1335
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1340
<210> 53
<211> 1308
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：受体酪氨酸-蛋白激酶 ErbB4 (HER4)同种型JM-a/CVT-1 前体序列
<400> 53
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805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu
850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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1280 1285 1290
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1295 1300 1305
<210> 54
<211> 1298
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：受体酪氨酸-蛋白激酶 ErbB4 (HER4)同种型JM-b (同种型X7)前体序列
<400> 54
Met Lys Pro Ala Thr Gly Leu Trp Val Trp Val Ser Leu Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Thr Val Gln Pro Ser Asp Ser Gln Ser Val Cys Ala Gly Thr
20 25 30
Glu Asn Lys Leu Ser Ser Leu Ser Asp Leu Glu Gln Gln Tyr Arg Ala
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Phe Gln Leu Glu His Asn Phe Asn Ala Lys Tyr Thr Tyr Gly Ala Phe
275 280 285
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340 345 350
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705 710 715 720
Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Val Pro Glu Gly Glu Thr Val Lys Ile
725 730 735
Pro Val Ala Ile Lys Ile Leu Asn Glu Thr Thr Gly Pro Lys Ala Asn
740 745 750
Val Glu Phe Met Asp Glu Ala Leu Ile Met Ala Ser Met Asp His Pro
755 760 765
His Leu Val Arg Leu Leu Gly Val Cys Leu Ser Pro Thr Ile Gln Leu
770 775 780
Val Thr Gln Leu Met Pro His Gly Cys Leu Leu Glu Tyr Val His Glu
785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
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885 890 895
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900 905 910
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965 970 975
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980 985 990
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1055 1060 1065
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1070 1075 1080
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1085 1090 1095
Gly Thr Leu Arg Lys Pro Val Ala Pro His Val Gln Glu Asp Ser
1100 1105 1110
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1115 1120 1125
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1130 1135 1140
Met Arg Asp Lys Pro Lys Gln Glu Tyr Leu Asn Pro Val Glu Glu
1145 1150 1155
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1160 1165 1170
Asp Asn Pro Glu Tyr His Asn Ala Ser Asn Gly Pro Pro Lys Ala
1175 1180 1185
Glu Asp Glu Tyr Val Asn Glu Pro Leu Tyr Leu Asn Thr Phe Ala
1190 1195 1200
Asn Thr Leu Gly Lys Ala Glu Tyr Leu Lys Asn Asn Ile Leu Ser
1205 1210 1215
Met Pro Glu Lys Ala Lys Lys Ala Phe Asp Asn Pro Asp Tyr Trp
1220 1225 1230
Asn His Ser Leu Pro Pro Arg Ser Thr Leu Gln His Pro Asp Tyr
1235 1240 1245
Leu Gln Glu Tyr Ser Thr Lys Tyr Phe Tyr Lys Gln Asn Gly Arg
1250 1255 1260
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1265 1270 1275
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1280 1285 1290
Arg Asn Thr Val Val
1295
<210> 55
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 55
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65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 56
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 56
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctctggtg gcggtggctc gggcggtggt 600
gggtcgggtg gcggcggatc tggtggcggt ggctcgtttt gggtgctggt ggtggttggt 660
ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg 720
agtaagagga gc 732
<210> 57
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 57
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
210 215 220
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
225 230 235 240
Ser Lys Arg Ser
<210> 58
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 58
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
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aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600
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<210> 59
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 59
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
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Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
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Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
225 230 235 240
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
245 250 255
Ser
<210> 60
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 60
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
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<210> 61
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 61
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115 120 125
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145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
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Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
260 265 270
Ser Lys Arg Ser
275
<210> 62
<211> 885
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 62
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
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<210> 63
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 63
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
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Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
290 295
<210> 64
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 64
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
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<210> 65
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 65
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<210> 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 66
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<210> 67
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 67
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
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Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
290 295 300
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 68
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctcttgcc ggaatgtcag ccgaggcagg 600
gaatgcgtgg acaagtgcaa ccttctggag ggtgagccaa gggagtttgt ggagaactct 660
gagtgcatac agtgccaccc agagtgcctg cctcaggcca tgaacatcac ctgcacagga 720
cggggaccag acaactgtat ccagtgtgcc cactacattg acggccccca ctgcgtcaag 780
acctgcccgg caggagtcat gggagaaaac aacaccctgg tctggaagta cgcagacgcc 840
ggccatgtgt gccacctgtg ccatccaaac tgcacctacg gatgcactgg gccaggtctt 900
gaaggctgtc caggtggcgg tggcggcgga tctttttggg tgctggtggt ggttggtgga 960
gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 1020
aagaggagct aa 1032
<210> 69
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 69
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
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260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
305 310 315 320
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
325 330 335
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
340
<210> 70
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 70
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtcccagg atccagtggg 60
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 120
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 180
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 240
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 300
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 360
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 420
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 480
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 540
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 600
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctctggtg gcggtggctc gggcggtggt 660
gggtcgggtg gcggcggatc tggtggcggt ggctcggaga taacactcat tatttttggg 720
gtgatggctg gtgttattgg aacgatcctc ttaatttctt acggtattcg ccgaggaggt 780
ggaagc 786
<210> 71
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 71
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe
20 25 30
Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn
35 40 45
Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg
50 55 60
Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp
65 70 75 80
Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala
85 90 95
Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile
100 105 110
Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val
115 120 125
Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser
130 135 140
Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn
145 150 155 160
Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys
165 170 175
Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val
180 185 190
Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg
195 200 205
Asp Cys Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly
225 230 235 240
Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile
245 250 255
Arg Arg Gly Gly Gly Ser
260
<210> 72
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 72
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
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aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
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ggaagc 726
<210> 73
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 73
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
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Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
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Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
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Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
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Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
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Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
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Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly
210 215 220
Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser
<210> 74
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 74
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtcccagg atccagtggg 60
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 120
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acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 540
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<210> 75
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 75
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe
20 25 30
Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn
35 40 45
Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg
50 55 60
Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp
65 70 75 80
Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala
85 90 95
Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile
100 105 110
Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val
115 120 125
Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser
130 135 140
Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn
145 150 155 160
Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys
165 170 175
Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val
180 185 190
Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg
195 200 205
Asp Cys Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val
225 230 235 240
Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Gly
245 250 255
Gly Gly Ser
<210> 76
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 76
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
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attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
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<210> 77
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 77
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
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180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val
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Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Gly Gly Gly Ser
225 230 235
<210> 78
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 78
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtcccagg atccagtggg 60
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 120
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<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 79
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe
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Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg
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Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp
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Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val
115 120 125
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Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn
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165 170 175
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Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg
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Asp Cys Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val
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245 250 255
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<210> 80
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 80
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
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attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
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<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 81
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
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Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
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210 215 220
Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ala Leu Leu Ile Trp Gly Gly Gly Ser
225 230 235
<210> 82
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 82
atgaggctcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct gggtcccagg atccagtggg 60
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 120
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 83
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145 150 155 160
Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys
165 170 175
Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val
180 185 190
Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg
195 200 205
Asp Cys Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile
225 230 235 240
Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Gly Gly Gly
245 250 255
Ser
<210> 84
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 84
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtctgcc atgccttgtg ctcccccgag 540
ggctgctggg gcccggagcc cagggactgc gtctctggtg gcggtggctc gggcggtggt 600
gggtcgggtg gcggcggatc tggtggcggt ggctcgctct gctacctgct ggatggaatc 660
ctcttcatct atggtgtcat tctcactgcc ttgttcctgg gaggtggaag c 711
<210> 85
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 85
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr
210 215 220
Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu Gly Gly Gly Ser
225 230 235
<210> 86
<211> 1077
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 86
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120
aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180
ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240
ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300
gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360
caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420
tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480
gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540
agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg cctgccacca gctgtgcgcc 600
cgagggcact gctggggtcc agggcccacc cagtgtgtca actgcagcca gttccttcgg 660
ggccaggagt gcgtggagga atgccgagta ctgcaggggc tccccaggga gtatgtgaat 720
gccaggcact gtttgccgtg ccaccctgag tgtcagcccc agaatggctc agtgacctgt 780
tttggaccgg aggctgacca gtgtgtggcc tgtgcccact ataaggaccc tcccttctgc 840
gtggcccgct gccccagcgg tgtgaaacct gacctctcct acatgcccat ctggaagttt 900
ccagatgagg agggcgcatg ccagccttgc cccatcaact gcacccactc ctgtgtggac 960
ctggatgaca agggctgccc cgccgagcag agagccagcc ctctgacgtc catcatctct 1020
gcggtggttg gcattctgct ggtcgtggtc ttgggggtgg tctttgggat cctcatc 1077
<210> 87
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 87
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly
195 200 205
Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys
210 215 220
Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn
225 230 235 240
Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly
245 250 255
Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala
260 265 270
His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val
275 280 285
Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu
290 295 300
Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp
305 310 315 320
Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr
325 330 335
Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly
340 345 350
Val Val Phe Gly Ile Leu Ile
355
<210> 88
<211> 1011
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 88
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggcctgcc accagctgtg cgcccgaggg 540
cactgctggg gtccagggcc cacccagtgt gtcaactgca gccagttcct tcggggccag 600
gagtgcgtgg aggaatgccg agtactgcag gggctcccca gggagtatgt gaatgccagg 660
cactgtttgc cgtgccaccc tgagtgtcag ccccagaatg gctcagtgac ctgttttgga 720
ccggaggctg accagtgtgt ggcctgtgcc cactataagg accctccctt ctgcgtggcc 780
cgctgcccca gcggtgtgaa acctgacctc tcctacatgc ccatctggaa gtttccagat 840
gaggagggcg catgccagcc ttgccccatc aactgcaccc actcctgtgt ggacctggat 900
gacaagggct gccccgccga gcagagagcc agccctctga cgtccatcat ctctgcggtg 960
gttggcattc tgctggtcgt ggtcttgggg gtggtctttg ggatcctcat c 1011
<210> 89
<211> 337
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 89
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Ala Cys His Gln Leu
165 170 175
Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn
180 185 190
Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val
195 200 205
Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly
225 230 235 240
Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro
245 250 255
Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr
260 265 270
Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys
275 280 285
Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys
290 295 300
Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val
305 310 315 320
Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu
325 330 335
Ile
<210> 90
<211> 1029
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 90
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120
aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180
ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240
ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300
gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360
caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420
tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480
gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540
agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg cctgccacca gctgtgcgcc 600
cgagggcact gctggggtcc agggcccacc cagtgtgtca actgcagcca gttccttcgg 660
ggccaggagt gcgtggagga atgccgagta ctgcaggggc tccccaggga gtatgtgaat 720
gccaggcact gtttgccgtg ccaccctgag tgtcagcccc agaatggctc agtgacctgt 780
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tccatcatct ctgcggtggt tggcattctg ctggtcgtgg tcttgggggt ggtctttggg 1020
atcctcatc 1029
<210> 91
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 91
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly
195 200 205
Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys
210 215 220
Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn
225 230 235 240
Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly
245 250 255
Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala
260 265 270
His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val
275 280 285
Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu
290 295 300
Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Pro Leu Thr
305 310 315 320
Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly
325 330 335
Val Val Phe Gly Ile Leu Ile
340
<210> 92
<211> 963
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 92
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggcctgcc accagctgtg cgcccgaggg 540
cactgctggg gtccagggcc cacccagtgt gtcaactgca gccagttcct tcggggccag 600
gagtgcgtgg aggaatgccg agtactgcag gggctcccca gggagtatgt gaatgccagg 660
cactgtttgc cgtgccaccc tgagtgtcag ccccagaatg gctcagtgac ctgttttgga 720
ccggaggctg accagtgtgt ggcctgtgcc cactataagg accctccctt ctgcgtggcc 780
cgctgcccca gcggtgtgaa acctgacctc tcctacatgc ccatctggaa gtttccagat 840
gaggagggcg catgccagcc ttgccccatc aactgcaccc actcccctct gacgtccatc 900
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atc 963
<210> 93
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 93
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Ala Cys His Gln Leu
165 170 175
Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn
180 185 190
Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val
195 200 205
Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly
225 230 235 240
Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro
245 250 255
Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr
260 265 270
Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys
275 280 285
Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val
290 295 300
Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu
305 310 315 320
Ile
<210> 94
<211> 1080
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 94
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120
aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180
ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240
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caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420
tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480
gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540
agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tgtgtgaccc actgtgctcc 600
tctgggggat gctggggccc aggccctggt cagtgcttgt cctgtcgaaa ttatagccga 660
ggaggtgtct gtgtgaccca ctgcaacttt ctgaatgggg agcctcgaga atttgcccat 720
gaggccgaat gcttctcctg ccacccggaa tgccaaccca tggagggcac tgccacatgc 780
aatggctcgg gctctgatac ttgtgctcaa tgtgcccatt ttcgagatgg gccccactgt 840
gtgagcagct gcccccatgg agtcctaggt gccaagggcc caatctacaa gtacccagat 900
gttcagaatg aatgtcggcc ctgccatgag aactgcaccc aggggtgtaa aggaccagag 960
cttcaagact gtttaggaca aacactggtg ctgatcggca aaacccatct gacaatggct 1020
ttgacagtga tagcaggatt ggtagtgatt ttcatgatgc tgggcggcac ttttctctac 1080
<210> 95
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 95
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Cys Arg Pro Cys His Glu Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly Pro Glu
305 310 315 320
Leu Gln Asp Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val Leu Ile Gly Lys Thr His
325 330 335
Leu Thr Met Ala Leu Thr Val Ile Ala Gly Leu Val Val Ile Phe Met
340 345 350
Met Leu Gly Gly Thr Phe Leu Tyr
355 360
<210> 96
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 96
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtgtgtg acccactgtg ctcctctggg 540
ggatgctggg gcccaggccc tggtcagtgc ttgtcctgtc gaaattatag ccgaggaggt 600
gtctgtgtga cccactgcaa ctttctgaat ggggagcctc gagaatttgc ccatgaggcc 660
gaatgcttct cctgccaccc ggaatgccaa cccatggagg gcactgccac atgcaatggc 720
tcgggctctg atacttgtgc tcaatgtgcc cattttcgag atgggcccca ctgtgtgagc 780
agctgccccc atggagtcct aggtgccaag ggcccaatct acaagtaccc agatgttcag 840
aatgaatgtc ggccctgcca tgagaactgc acccaggggt gtaaaggacc agagcttcaa 900
gactgtttag gacaaacact ggtgctgatc ggcaaaaccc atctgacaat ggctttgaca 960
gtgatagcag gattggtagt gattttcatg atgctgggcg gcacttttct ctac 1014
<210> 97
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 97
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys Asp Pro Leu
165 170 175
Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Gly Gln Cys Leu Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Tyr Ser Arg Gly Gly Val Cys Val Thr His Cys Asn Phe
195 200 205
Leu Asn Gly Glu Pro Arg Glu Phe Ala His Glu Ala Glu Cys Phe Ser
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Met Glu Gly Thr Ala Thr Cys Asn Gly
225 230 235 240
Ser Gly Ser Asp Thr Cys Ala Gln Cys Ala His Phe Arg Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Ser Ser Cys Pro His Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Pro
260 265 270
Ile Tyr Lys Tyr Pro Asp Val Gln Asn Glu Cys Arg Pro Cys His Glu
275 280 285
Asn Cys Thr Gln Gly Cys Lys Gly Pro Glu Leu Gln Asp Cys Leu Gly
290 295 300
Gln Thr Leu Val Leu Ile Gly Lys Thr His Leu Thr Met Ala Leu Thr
305 310 315 320
Val Ile Ala Gly Leu Val Val Ile Phe Met Met Leu Gly Gly Thr Phe
325 330 335
Leu Tyr
<210> 98
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 98
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120
aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180
ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240
ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300
gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360
caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420
tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480
gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540
agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tgtgcaacca tctgtgttcc 600
agtgatggct gttggggacc tgggccagac caatgtctgt cgtgtcgccg cttcagtaga 660
ggaaggatct gcatagagtc ttgtaacctc tatgatggtg aatttcggga gtttgagaat 720
ggctccatct gtgtggagtg tgacccccag tgtgagaaga tggaagatgg cctcctcaca 780
tgccatggac cgggtcctga caactgtaca aagtgctctc attttaaaga tggcccaaac 840
tgtgtggaaa aatgtccaga tggcttacag ggggcaaaca gtttcatttt caagtatgct 900
gatccagatc gggagtgcca cccatgccat ccaaactgca cccaagggtg taacggtccc 960
actagtcatg actgcattta ctacccatgg acgggccatt ccactttacc acaacatgct 1020
agaactcccc tgattgcagc tggagtaatt ggtgggctct tcattctggt cattgtgggt 1080
ctgacatttg ctgtttatgt t 1101
<210> 99
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 99
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys Asn His Leu Cys Ser Ser Asp Gly Cys Trp Gly Pro Gly
195 200 205
Pro Asp Gln Cys Leu Ser Cys Arg Arg Phe Ser Arg Gly Arg Ile Cys
210 215 220
Ile Glu Ser Cys Asn Leu Tyr Asp Gly Glu Phe Arg Glu Phe Glu Asn
225 230 235 240
Gly Ser Ile Cys Val Glu Cys Asp Pro Gln Cys Glu Lys Met Glu Asp
245 250 255
Gly Leu Leu Thr Cys His Gly Pro Gly Pro Asp Asn Cys Thr Lys Cys
260 265 270
Ser His Phe Lys Asp Gly Pro Asn Cys Val Glu Lys Cys Pro Asp Gly
275 280 285
Leu Gln Gly Ala Asn Ser Phe Ile Phe Lys Tyr Ala Asp Pro Asp Arg
290 295 300
Glu Cys His Pro Cys His Pro Asn Cys Thr Gln Gly Cys Asn Gly Pro
305 310 315 320
Thr Ser His Asp Cys Ile Tyr Tyr Pro Trp Thr Gly His Ser Thr Leu
325 330 335
Pro Gln His Ala Arg Thr Pro Leu Ile Ala Ala Gly Val Ile Gly Gly
340 345 350
Leu Phe Ile Leu Val Ile Val Gly Leu Thr Phe Ala Val Tyr Val
355 360 365
<210> 100
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 100
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtgtgca accatctgtg ttccagtgat 540
ggctgttggg gacctgggcc agaccaatgt ctgtcgtgtc gccgcttcag tagaggaagg 600
atctgcatag agtcttgtaa cctctatgat ggtgaatttc gggagtttga gaatggctcc 660
atctgtgtgg agtgtgaccc ccagtgtgag aagatggaag atggcctcct cacatgccat 720
ggaccgggtc ctgacaactg tacaaagtgc tctcatttta aagatggccc aaactgtgtg 780
gaaaaatgtc cagatggctt acagggggca aacagtttca ttttcaagta tgctgatcca 840
gatcgggagt gccacccatg ccatccaaac tgcacccaag ggtgtaacgg tcccactagt 900
catgactgca tttactaccc atggacgggc cattccactt taccacaaca tgctagaact 960
cccctgattg cagctggagt aattggtggg ctcttcattc tggtcattgt gggtctgaca 1020
tttgctgttt atgtt 1035
<210> 101
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 101
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys Asn His Leu
165 170 175
Cys Ser Ser Asp Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Asp Gln Cys Leu Ser
180 185 190
Cys Arg Arg Phe Ser Arg Gly Arg Ile Cys Ile Glu Ser Cys Asn Leu
195 200 205
Tyr Asp Gly Glu Phe Arg Glu Phe Glu Asn Gly Ser Ile Cys Val Glu
210 215 220
Cys Asp Pro Gln Cys Glu Lys Met Glu Asp Gly Leu Leu Thr Cys His
225 230 235 240
Gly Pro Gly Pro Asp Asn Cys Thr Lys Cys Ser His Phe Lys Asp Gly
245 250 255
Pro Asn Cys Val Glu Lys Cys Pro Asp Gly Leu Gln Gly Ala Asn Ser
260 265 270
Phe Ile Phe Lys Tyr Ala Asp Pro Asp Arg Glu Cys His Pro Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Gln Gly Cys Asn Gly Pro Thr Ser His Asp Cys Ile
290 295 300
Tyr Tyr Pro Trp Thr Gly His Ser Thr Leu Pro Gln His Ala Arg Thr
305 310 315 320
Pro Leu Ile Ala Ala Gly Val Ile Gly Gly Leu Phe Ile Leu Val Ile
325 330 335
Val Gly Leu Thr Phe Ala Val Tyr Val
340 345
<210> 102
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 102
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120
aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180
ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240
ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300
gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360
caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420
tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480
gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540
agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tgtgcaacca tctgtgttcc 600
agtgatggct gttggggacc tgggccagac caatgtctgt cgtgtcgccg cttcagtaga 660
ggaaggatct gcatagagtc ttgtaacctc tatgatggtg aatttcggga gtttgagaat 720
ggctccatct gtgtggagtg tgacccccag tgtgagaaga tggaagatgg cctcctcaca 780
tgccatggac cgggtcctga caactgtaca aagtgctctc attttaaaga tggcccaaac 840
tgtgtggaaa aatgtccaga tggcttacag ggggcaaaca gtttcatttt caagtatgct 900
gatccagatc gggagtgcca cccatgccat ccaaactgca cccaagggtg cataggctca 960
agtattgaag actgcatcgg cctgatggat agaactcccc tgattgcagc tggagtaatt 1020
ggtgggctct tcattctggt cattgtgggt ctgacatttg ctgtttatgt t 1071
<210> 103
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 103
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys Asn His Leu Cys Ser Ser Asp Gly Cys Trp Gly Pro Gly
195 200 205
Pro Asp Gln Cys Leu Ser Cys Arg Arg Phe Ser Arg Gly Arg Ile Cys
210 215 220
Ile Glu Ser Cys Asn Leu Tyr Asp Gly Glu Phe Arg Glu Phe Glu Asn
225 230 235 240
Gly Ser Ile Cys Val Glu Cys Asp Pro Gln Cys Glu Lys Met Glu Asp
245 250 255
Gly Leu Leu Thr Cys His Gly Pro Gly Pro Asp Asn Cys Thr Lys Cys
260 265 270
Ser His Phe Lys Asp Gly Pro Asn Cys Val Glu Lys Cys Pro Asp Gly
275 280 285
Leu Gln Gly Ala Asn Ser Phe Ile Phe Lys Tyr Ala Asp Pro Asp Arg
290 295 300
Glu Cys His Pro Cys His Pro Asn Cys Thr Gln Gly Cys Ile Gly Ser
305 310 315 320
Ser Ile Glu Asp Cys Ile Gly Leu Met Asp Arg Thr Pro Leu Ile Ala
325 330 335
Ala Gly Val Ile Gly Gly Leu Phe Ile Leu Val Ile Val Gly Leu Thr
340 345 350
Phe Ala Val Tyr Val
355
<210> 104
<211> 1005
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 104
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc caggtgtgca accatctgtg ttccagtgat 540
ggctgttggg gacctgggcc agaccaatgt ctgtcgtgtc gccgcttcag tagaggaagg 600
atctgcatag agtcttgtaa cctctatgat ggtgaatttc gggagtttga gaatggctcc 660
atctgtgtgg agtgtgaccc ccagtgtgag aagatggaag atggcctcct cacatgccat 720
ggaccgggtc ctgacaactg tacaaagtgc tctcatttta aagatggccc aaactgtgtg 780
gaaaaatgtc cagatggctt acagggggca aacagtttca ttttcaagta tgctgatcca 840
gatcgggagt gccacccatg ccatccaaac tgcacccaag ggtgcatagg ctcaagtatt 900
gaagactgca tcggcctgat ggatagaact cccctgattg cagctggagt aattggtggg 960
ctcttcattc tggtcattgt gggtctgaca tttgctgttt atgtt 1005
<210> 105
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 105
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys Asn His Leu
165 170 175
Cys Ser Ser Asp Gly Cys Trp Gly Pro Gly Pro Asp Gln Cys Leu Ser
180 185 190
Cys Arg Arg Phe Ser Arg Gly Arg Ile Cys Ile Glu Ser Cys Asn Leu
195 200 205
Tyr Asp Gly Glu Phe Arg Glu Phe Glu Asn Gly Ser Ile Cys Val Glu
210 215 220
Cys Asp Pro Gln Cys Glu Lys Met Glu Asp Gly Leu Leu Thr Cys His
225 230 235 240
Gly Pro Gly Pro Asp Asn Cys Thr Lys Cys Ser His Phe Lys Asp Gly
245 250 255
Pro Asn Cys Val Glu Lys Cys Pro Asp Gly Leu Gln Gly Ala Asn Ser
260 265 270
Phe Ile Phe Lys Tyr Ala Asp Pro Asp Arg Glu Cys His Pro Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Gln Gly Cys Ile Gly Ser Ser Ile Glu Asp Cys Ile
290 295 300
Gly Leu Met Asp Arg Thr Pro Leu Ile Ala Ala Gly Val Ile Gly Gly
305 310 315 320
Leu Phe Ile Leu Val Ile Val Gly Leu Thr Phe Ala Val Tyr Val
325 330 335
<210> 106
<211> 891
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：全长CD20序列
<400> 106
atgacaacac ccagaaattc agtaaatggg actttcccgg cagagccaat gaaaggccct 60
attgctatgc aatctggtcc aaaaccactc ttcaggagga tgtcttcact ggtgggcccc 120
acgcaaagct tcttcatgag ggaatctaag actttggggg ctgtccagat tatgaatggg 180
ctcttccaca ttgccctggg gggtcttctg atgatcccag cagggatcta tgcacccatc 240
tgtgtgactg tgtggtaccc tctctgggga ggcattatgt atattatttc cggatcactc 300
ctggcagcaa cggagaaaaa ctccaggaag tgtttggtca aaggaaaaat gataatgaat 360
tcattgagcc tctttgctgc catttctgga atgattcttt caatcatgga catacttaat 420
attaaaattt cccatttttt aaaaatggag agtctgaatt ttattagagc tcacacacca 480
tatattaaca tatacaactg tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc 540
caatactgtt acagcataca atctctgttc ttgggcattt tgtcagtgat gctgatcttt 600
gccttcttcc aggaacttgt aatagctggc atcgttgaga atgaatggaa aagaacgtgc 660
tccagaccca aatctaacat agttctcctg tcagcagaag aaaaaaaaga acagactatt 720
gaaataaaag aagaagtggt tgggctaact gaaacatctt cccaaccaaa gaatgaagaa 780
gacattgaaa ttattccaat ccaagaagag gaagaagaag aaacagagac gaactttcca 840
gaacctcccc aagatcagga atcctcacca atagaaaatg acagctctcc t 891
<210> 107
<211> 297
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：全长CD20序列
<400> 107
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
275 280 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295
<210> 108
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 108
atgaccacac cacggaactc tgtgaatggc accttcccag cagagccaat gaagggacca 60
atcgcaatgc agagcggacc caagcctctg tttcggagaa tgagctccct ggtgggccca 120
acccagtcct tctttatgag agagtctaag acactgggcg ccgtgcagat catgaacgga 180
ctgttccaca tcgccctggg aggactgctg atgatcccag ccggcatcta cgcccctatc 240
tgcgtgaccg tgtggtaccc tctgtggggc ggcatcatgt atatcatctc cggctctctg 300
ctggccgcca cagagaagaa cagcaggaag tgtctggtga agggcaagat gatcatgaat 360
agcctgtccc tgtttgccgc catctctggc atgatcctga gcatcatgga catcctgaac 420
atcaagatca gccacttcct gaagatggag agcctgaact tcatcagagc ccacacccct 480
tacatcaaca tctataattg cgagcctgcc aacccatccg agaagaattc tccaagcaca 540
cagtactgtt attccatcca gtctctgttc ctgggcatcc tgtctgtgat gctgatcttt 600
gccttctttc aggagctggt catcgccggc atcgtggaga acgagtggaa gaggacctgc 660
agccgcccca agtccaatat cgtgctgctg tccgccgagg agaagaagga gcagacaatc 720
gagatcaagg aggaggtggt gggcctgacc gagacatcta gccagcctaa gaatgaggag 780
gatatcgag 789
<210> 109
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 109
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu
260
<210> 110
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 110
atgataatga attcattgag cctctttgct gccatttctg gaatgattct ttcaatcatg 60
gacatactta atattaaaat ttcccatttt ttaaaaatgg agagtctgaa ttttattaga 120
gctcacacac catatattaa catatacaac tgtgaaccag ctaatccctc tgagaaaaac 180
tccccatcta cccaatactg ttacagcata caatctctgt tcttgggcat tttgtcagtg 240
atgctgatct ttgccttctt ccaggaactt gtaatagctg gcatcgttga gaat 294
<210> 111
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 111
Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser Gly Met Ile
1 5 10 15
Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys
20 25 30
Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile
35 40 45
Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr
50 55 60
Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Val
65 70 75 80
Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile Ala Gly Ile Val
85 90 95
Glu Asn
<210> 112
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 112
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgaaaattt cccatttttt aaaaatggag agtctgaatt ttattagagc tcacacacca 120
tatattaaca tatacaactg tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc 180
caatactgtt acagcataca atctatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 240
gtccttctcc tgtcactggt tatcacc 267
<210> 113
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 113
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu
20 25 30
Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu
35 40 45
Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr
50 55 60
Ser Ile Gln Ser Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
85
<210> 114
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 114
atgacaacac ccagaaattc agtaaatggg actttcccgg cagagccaat gaaaggccct 60
attgctatgc aatctggtcc aaaaccactc ttcaggagga tgtcttcact ggtgggcccc 120
acgcaaagct tcttcatgag ggaatctaag actttggggg ctgtccagat tatgaatggg 180
ctcttccaca ttgccctggg gggtcttctg atgatcccag cagggatcta tgcacccatc 240
tgtgtgactg tgtggtaccc tctctgggga ggcattatgt atattatttc cggatcactc 300
ctggcagcaa cggagaaaaa ctccaggaag tgtttggtca aaggaaaaat gataatgaat 360
tcattgagcc tctttgctgc catttctgga atgattcttt caatcatgga catacttaat 420
attaaaattt cccatttttt aaaaatggag agtctgaatt ttattagagc tcacacacca 480
tatattaaca tatacaactg tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc 540
caatactgtt acagcataca atctctgttc ttgggcattt tgtcagtgat gctgatcttt 600
gccttcttcc aggaacttgt aatagctggc atcgttgaga at 642
<210> 115
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 115
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn
210
<210> 116
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 116
gtgactgtgt ggtaccctct ctggggaggc attatgtata ttatttccgg atcactcctg 60
gcagcaacgg agaaaaactc caggaagtgt ttggtcaaag gaaaaatgat aatgaattca 120
ttgagcctct ttgctgccat ttctggaatg attctttcaa tcatggacat acttaatatt 180
aaaatttccc attttttaaa aatggagagt ctgaatttta ttagagctca cacaccatat 240
attaacatat acaactgtga accagctaat ccctctgaga aaaactcccc atctacccaa 300
tactgttaca gcatacaatc tctgttcttg ggcattttgt cagtgatgct gatctttgcc 360
ttcttccagg aacttgtaat agctggcatc gttgagaat 399
<210> 117
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 117
Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu Val
20 25 30
Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser
35 40 45
Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser His
50 55 60
Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr
65 70 75 80
Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser
85 90 95
Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile
100 105 110
Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile Ala
115 120 125
Gly Ile Val Glu Asn
130
<210> 118
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 118
gtgactgtgt ggtaccctct ctggggaggc attatgtata ttatttccgg atcactcctg 60
gcagcaacgg agaaaaactc caggaagtgt ttggtcaaag gaaaaatgat aatgaattca 120
ttgagcctct ttgctgccat ttctggaatg attctttcaa tcatggacat acttaatatt 180
aaaatttccc attttttaaa aatggagagt ctgaatttta ttagagctca cacaccatat 240
attaacatat acaactgtga accagctaat ccctctgaga aaaactcccc atctacccaa 300
tactgttaca gcata 315
<210> 119
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 119
Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu Val
20 25 30
Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser
35 40 45
Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser His
50 55 60
Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr
65 70 75 80
Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser
85 90 95
Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile
100 105 110
Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile Ala
115 120 125
Gly Ile Val Glu Asn
130
<210> 120
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 120
ccatatatta acatatacaa ctgtgaacca gctaatccct ctgagaaaaa ctccccatct 60
acccaatact gttacagcat acaatcgggt ggcggcggat ctattgaagt tatgtatcct 120
cctccttacc tagacaatga gaagagcaat ggaaccatta tccatgtgaa agggaaacac 180
ctttgtccaa gtcccctatt tcccggacct tctaagccct tttgggtgct ggtggtggtt 240
ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 300
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gac 333
<210> 121
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 121
Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys
1 5 10 15
Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys
35 40 45
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
50 55 60
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
65 70 75 80
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
85 90 95
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
100 105 110
<210> 122
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 122
ccatatatta acatatacaa ctgtgaacca gctaatccct ctgagaaaaa ctccccatct 60
acccaatact gttacagcat acaatcgggt ggcggcggat ctccatatat taacatatac 120
aactgtgaac cagctaatcc ctctgagaaa aactccccat ctacccaata ctgttacagc 180
atacaatcgg gtggcggcgg atctattgaa gttatgtatc ctcctcctta cctagacaat 240
gagaagagca atggaaccat tatccatgtg aaagggaaac acctttgtcc aagtccccta 300
tttcccggac cttctaagcc cttttgggtg ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc 360
tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg 420
ctcctgcaca gtgac 435
<210> 123
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 123
Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys
1 5 10 15
Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser
35 40 45
Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn
65 70 75 80
Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
85 90 95
Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val
100 105 110
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
115 120 125
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
130 135 140
Asp
145
<210> 124
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 124
ccatatatta acatatacaa ctgtgaacca gctaatccct ctgagaaaaa ctccccatct 60
acccaatact gttacagcat acaatcgggt ggcggcggat ctccagcgcc gcgaccacca 120
acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca 180
gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg 240
gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc 300
aaccacagga accgaagacg tgtttgcaaa tgtccccggc ctgtggtc 348
<210> 125
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 125
Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys
1 5 10 15
Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
35 40 45
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
50 55 60
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
65 70 75 80
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
85 90 95
Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro
100 105 110
Arg Pro Val Val
115
<210> 126
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 126
tgtgaaccag ctaatccctc tgagaaaaac tccccatcta cccaatactg ttcgggtggc 60
ggcggatcta ttgaagttat gtatcctcct ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga 120
accattatcc atgtgaaagg gaaacacctt tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct 180
aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta 240
acagtggcct ttattatttt ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac 300
<210> 127
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 127
Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr
1 5 10 15
Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
20 25 30
Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys
35 40 45
His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp
50 55 60
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
65 70 75 80
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
85 90 95
Leu His Ser Asp
100
<210> 128
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 128
tgtgaaccag ctaatccctc tgagaaaaac tccccatcta cccaatactg ttcgggtggc 60
ggcggatctt gtgaaccagc taatccctct gagaaaaact ccccatctac ccaatactgt 120
tcgggtggcg gcggatctat tgaagttatg tatcctcctc cttacctaga caatgagaag 180
agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc 240
ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 300
ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 360
cacagtgac 369
<210> 129
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 129
Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr
1 5 10 15
Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys
20 25 30
Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Glu
35 40 45
Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr
50 55 60
Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
65 70 75 80
Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
85 90 95
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
100 105 110
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
115 120
<210> 130
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 130
tgtgaaccag ctaatccctc tgagaaaaac tccccatcta cccaatactg ttcgggtggc 60
ggcggatctc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 120
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 180
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 240
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac cacaggaacc gaagacgtgt ttgcaaatgt 300
ccccggcctg tggtc 315
<210> 131
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 131
Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr
1 5 10 15
Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
20 25 30
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
35 40 45
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
50 55 60
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
65 70 75 80
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg
85 90 95
Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
100 105
<210> 132
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 132
atgaccacac cccggaactc cgtgaatggc accttccctg ccgagccaat gaagggccct 60
atcgccatgc agtctggccc aaagcccctg tttcggagaa tgagctccct ggtgggcccc 120
acccagagct tctttatgag ggagtccaag acactgggcg cctgcctggt gaagggcaag 180
atgatcatga actctctgag cctgttcgcc gccatctccg gcatgatcct gtctatcatg 240
gacatcctga acatcaagat ctctcacttc ctgaagatgg agagcctgaa cttcatccgg 300
gcccacaccc catacatcaa catctataat tgcgagcccg ccaaccctag cgagaagaat 360
tccccctcta cacagtactg ttatagcatc cagtccctgt tcctgggcat cctgtccgtg 420
atgctgatct ttgccttctt tcaggagctg gtcatcgccg gcatcgtgga gaacgagtgg 480
aagaggacct gttctcgccc taagagcaat atcgtgctgc tgagcgccga ggagaagaag 540
gagcagacaa tcgagatcaa ggaggaggtg gtgggcctga ccgagacatc tagccagcct 600
aagaatgagg aggatatcga gatcatccca atccaggagg aggaggagga ggagaccgag 660
acaaactttc cagagccccc tcaggaccag gagtcctctc caatcgagaa tgatagctcc 720
ccctgataa 729
<210> 133
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 133
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Cys Leu Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn
50 55 60
Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met
65 70 75 80
Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu
85 90 95
Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu
100 105 110
Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr
115 120 125
Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe
130 135 140
Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp
145 150 155 160
Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala
165 170 175
Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly
180 185 190
Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile
195 200 205
Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro
210 215 220
Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser
225 230 235 240
<210> 134
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 134
atgaccacac cacggaacag cgtgaatggc accttcccag cagagccaat gaagggacca 60
atcgcaatgc agtccggacc caagcctctg tttcggagaa tgagctccct ggtgggcccc 120
acccagtctt tctttatgag ggagagcaag acactgggcg cctgcctggt gaagggcaag 180
atgatcatga actccctgtc tctgttcgcc gccatcagcg gcatgatcct gtccatcatg 240
gacatcctga acatcaagat ctcccacttc ctgaagatgg agagcctgaa cttcatccgg 300
gcccacaccc cttacatcaa catctataat tgcgagcctg ccaacccatc tgagaagaat 360
agcccatcca cacagtactg ttattctatc cagagcctgt tcctgggcat cctgtccgtg 420
atgctgatct ttgccttctt tcaggagctg gtcatcgccg gcatcgtgga gaacgagtgg 480
aagaggacct gttcccgccc caagtctaat atcgtgctgc tgagcgccga ggagaagaag 540
gagcagacaa tcgagatcaa ggaggaggtg gtgggcctga ccgagacatc tagccagccc 600
aagaacgagg aggatatcga gatcatccct atccaggagg aggaggagga ggagaccgag 660
acaaattttc ctgagtgata a 681
<210> 135
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 135
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Cys Leu Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn
50 55 60
Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met
65 70 75 80
Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu
85 90 95
Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu
100 105 110
Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr
115 120 125
Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe
130 135 140
Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp
145 150 155 160
Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala
165 170 175
Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly
180 185 190
Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile
195 200 205
Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro
210 215 220
Glu
225
<210> 136
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 136
atgaccacac cccggaacag cgtgaatggc accttcccag ccgagcccat gaagggccct 60
atcgccatgc agtccggccc caagcctctg tttcggagaa tgagctccct ggtgggcccc 120
acccagtctt tctttatgag ggagagcaag acactgggcg cctgcctggt gaagggcaag 180
atgatcatga actccctgtc tctgttcgcc gccatcagcg gcatgatcct gtccatcatg 240
gacatcctga acatcaagat ctcccacttc ctgaagatgg agagcctgaa cttcatccgg 300
gcccacaccc catacatcaa catctataat tgcgagcctg ccaacccatc tgagaagaat 360
agcccctcca cacagtactg ttattctatc cagagcctgt tcctgggcat cctgtccgtg 420
atgctgatct ttgccttctt tcaggagctg gtcatcgccg gcatcgtgga gaacgagtgg 480
aagaggacct gttcccgccc taagtctaat atcgtgctgc tgagcgccga ggagaagaag 540
gagcagacaa tcgagatcaa ggaggaggtg gtgggcctga ccgagacatc tagccagcca 600
aagaatgagg aggatatcga gtgataa 627
<210> 137
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 137
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Cys Leu Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn
50 55 60
Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met
65 70 75 80
Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu
85 90 95
Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu
100 105 110
Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr
115 120 125
Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe
130 135 140
Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp
145 150 155 160
Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala
165 170 175
Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly
180 185 190
Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu
195 200 205
<210> 138
<211> 522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 138
atgaccacac cccggaactc cgtgaatggc accttcccag ccgagcccat gaagggccct 60
atcgccatgc agtctggccc caagcctctg tttcggagaa tgagctccct ggtgggccct 120
acccagagct tctttatgag ggagtccaag acactgggcg cctgcctggt gaagggcaag 180
atgatcatga actctctgag cctgttcgcc gccatctccg gcatgatcct gtctatcatg 240
gacatcctga acatcaagat ctctcacttc ctgaagatgg agagcctgaa cttcatccgg 300
gcccacaccc catacatcaa catctataat tgcgagcctg ccaacccaag cgagaagaat 360
tccccctcta cacagtactg ttatagcatc cagtccctgt tcctgggcat cctgtccgtg 420
atgctgatct ttgccttctt tcaggagctg gtcatcgccg gcatcgtgga gaacgagtgg 480
aagaggacat gttctcgccc caagagcaat atcgtgtgat aa 522
<210> 139
<211> 172
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 139
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Cys Leu Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn
50 55 60
Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met
65 70 75 80
Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu
85 90 95
Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu
100 105 110
Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr
115 120 125
Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe
130 135 140
Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp
145 150 155 160
Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys Ser Asn Ile Val
165 170
<210> 140
<211> 591
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 140
atgaccacac ccaggaacag cgtgtgcctg gtgaagggca agatgatcat gaatagcctg 60
tccctgttcg ccgccatctc tggcatgatc ctgagcatca tggacatcct gaacatcaag 120
atctcccact tcctgaagat ggagagcctg aacttcatcc gggcccacac cccatacatc 180
aacatctata attgcgagcc agccaacccc agcgagaaga attctcccag cacacagtac 240
tgttattcca tccagtctct gttcctgggc atcctgtccg tgatgctgat ctttgccttc 300
tttcaggagc tggtcatcgc cggcatcgtg gagaacgagt ggaagcggac ctgtagcaga 360
cctaagtcca atatcgtgct gctgtccgcc gaggagaaga aggagcagac aatcgagatc 420
aaggaggagg tggtgggcct gaccgagaca agctcccagc ccaagaacga ggaggatatc 480
gagatcatcc ctatccagga ggaggaggag gaggagaccg agacaaactt tccagagccc 540
cctcaggacc aggagtctag ccctatcgag aatgattcct ctccatgata a 591
<210> 141
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 141
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Cys Leu Val Lys Gly Lys Met Ile
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser Gly Met Ile Leu Ser
20 25 30
Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu
35 40 45
Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn
50 55 60
Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Val Met Leu
85 90 95
Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile Ala Gly Ile Val Glu Asn
100 105 110
Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys Ser Asn Ile Val Leu Leu
115 120 125
Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile Glu Ile Lys Glu Glu Val
130 135 140
Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro Lys Asn Glu Glu Asp Ile
145 150 155 160
Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Thr Glu Thr Asn
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser Ser Pro Ile Glu Asn Asp
180 185 190
Ser Ser Pro
195
<210> 142
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 142
ggacaaaacg acaccagcca aaccagcagc ccctca 36
<210> 143
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 143
Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ser
1 5 10
<210> 144
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 144
atgaagcgct tcctcttcct cctactcacc atcagcctcc tggttatggt acagatacaa 60
actggactct caggacaaaa cgacaccagc caaaccagca gcccctcagg cagcacctcc 120
ggcagcggca agcctggcag cggcgagggc agcaccaagg gcggcggagg cggaagcgga 180
ggcggaggct ccaagccctt ctgggtgctg gtcgtggtcg gcggagtgct ggcctgttac 240
agcctgctgg tcaccgtggc cttcatcatc ttttgggtc 279
<210> 145
<211> 93
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 145
Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr
20 25 30
Ser Ser Pro Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
35 40 45
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
65 70 75 80
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
85 90
<210> 146
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 146
atgaagcgct tcctcttcct cctactcacc atcagcctcc tggttatggt acagatacaa 60
actggactct caggacaaaa cgacaccagc caaaccagca gcccctcagg cagcacctcc 120
ggcagcggca agcctggcag cggcgagggc agcaccaagg gcggccagaa tgatacatct 180
cagacttcat ctcctagcgg atccacttct ggttccggta aaccaggttc tggggaaggt 240
agtacaaaag gaggcggagg cggaagcgga ggcggaggct ccaagccctt ctgggtgctg 300
gtcgtggtcg gcggagtgct ggcctgttac agcctgctgg tcaccgtggc cttcatcatc 360
ttttgggtc 369
<210> 147
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 147
Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr
20 25 30
Ser Ser Pro Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
35 40 45
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser
50 55 60
Pro Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
65 70 75 80
Ser Thr Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Pro
85 90 95
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
100 105 110
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
115 120
<210> 148
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 148
atgaagcgct tcctcttcct cctactcacc atcagcctcc tggttatggt acagatacaa 60
actggactct caggacaaaa cgacaccagc caaaccagca gcccctcagg cagcacctcc 120
ggcagcggca agcctggcag cggcgagggc agcaccaagg gcggccagaa tgatacatct 180
cagacttcat ctcctagcgg atccacttct ggttccggta aaccaggttc tggggaaggt 240
agtacaaaag gaggtcagaa cgacacttca cagacatcta gtccatccgg cagtacaagc 300
ggaagtggaa agcccggaag tggtgaggga tcaactaagg gtggcggagg cggaagcgga 360
ggcggaggct ccaagccctt ctgggtgctg gtcgtggtcg gcggagtgct ggcctgttac 420
agcctgctgg tcaccgtggc cttcatcatc ttttgggtc 459
<210> 149
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 149
Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr
20 25 30
Ser Ser Pro Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
35 40 45
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser
50 55 60
Pro Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
65 70 75 80
Ser Thr Lys Gly Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ser
85 90 95
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Pro Phe Trp
115 120 125
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
130 135 140
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
145 150
<210> 150
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 150
Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr
20 25 30
Ser Ser Pro Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
35 40 45
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser
50 55 60
Pro Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
65 70 75 80
Ser Thr Lys Gly Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ser
85 90 95
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala
130 135 140
Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser
<210> 151
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 151
Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr
20 25 30
Ser Ser Pro Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
35 40 45
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser
50 55 60
Pro Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
65 70 75 80
Ser Thr Lys Gly Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ser
85 90 95
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly
130 135 140
Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ala Leu Leu Ile Trp Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
<210> 152
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 152
Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr
20 25 30
Ser Ser Pro Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
35 40 45
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser
50 55 60
Pro Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
65 70 75 80
Ser Thr Lys Gly Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ser
85 90 95
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly
130 135 140
Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ala Leu Leu Ile Trp Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
<210> 153
<211> 1284
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：低亲和力神经生长因子受体 (LNGFR, TNFRSF16)序列
<400> 153
atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt 60
ctgggggtgt cccttggagg tgccaaggag gcatgcccca caggcctgta cacacacagc 120
ggtgagtgct gcaaagcctg caacctgggc gagggtgtgg cccagccttg tggagccaac 180
cagaccgtgt gtgagccctg cctggacagc gtgacgttct ccgacgtggt gagcgcgacc 240
gagccgtgca agccgtgcac cgagtgcgtg gggctccaga gcatgtcggc gccgtgcgtg 300
gaggccgacg acgccgtgtg ccgctgcgcc tacggctact accaggatga gacgactggg 360
cgctgcgagg cgtgccgcgt gtgcgaggcg ggctcgggcc tcgtgttctc ctgccaggac 420
aagcagaaca ccgtgtgcga ggagtgcccc gacggcacgt attccgacga ggccaaccac 480
gtggacccgt gcctgccctg caccgtgtgc gaggacaccg agcgccagct ccgcgagtgc 540
acacgctggg ccgacgccga gtgcgaggag atccctggcc gttggattac acggtccaca 600
cccccagagg gctcggacag cacagccccc agcacccagg agcctgaggc acctccagaa 660
caagacctca tagccagcac ggtggcaggt gtggtgacca cagtgatggg cagctcccag 720
cccgtggtga cccgaggcac caccgacaac ctcatccctg tctattgctc catcctggct 780
gctgtggttg tgggccttgt ggcctacata gccttcaaga ggtggaacag ctgcaagcag 840
aacaagcaag gagccaacag ccggccagtg aaccagacgc ccccaccaga gggagaaaaa 900
ctccacagcg acagtggcat ctccgtggac agccagagcc tgcatgacca gcagccccac 960
acgcagacag cctcgggcca ggccctcaag ggtgacggag gcctctacag cagcctgccc 1020
ccagccaagc gggaggaggt ggagaagctt ctcaacggct ctgcggggga cacctggcgg 1080
cacctggcgg gcgagctggg ctaccagccc gagcacatag actcctttac ccatgaggcc 1140
tgccccgttc gcgccctgct tgcaagctgg gccacccagg acagcgccac actggacgcc 1200
ctcctggccg ccctgcgccg catccagcga gccgacctcg tggagagtct gtgcagtgag 1260
tccactgcca catccccggt gtga 1284
<210> 154
<211> 427
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：低亲和力神经生长因子受体 (LNGFR, TNFRSF16)序列
<400> 154
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn
35 40 45
Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys
50 55 60
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
85 90 95
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
130 135 140
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
145 150 155 160
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
165 170 175
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
180 185 190
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
210 215 220
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln
225 230 235 240
Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys
245 250 255
Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe
260 265 270
Lys Arg Trp Asn Ser Cys Lys Gln Asn Lys Gln Gly Ala Asn Ser Arg
275 280 285
Pro Val Asn Gln Thr Pro Pro Pro Glu Gly Glu Lys Leu His Ser Asp
290 295 300
Ser Gly Ile Ser Val Asp Ser Gln Ser Leu His Asp Gln Gln Pro His
305 310 315 320
Thr Gln Thr Ala Ser Gly Gln Ala Leu Lys Gly Asp Gly Gly Leu Tyr
325 330 335
Ser Ser Leu Pro Pro Ala Lys Arg Glu Glu Val Glu Lys Leu Leu Asn
340 345 350
Gly Ser Ala Gly Asp Thr Trp Arg His Leu Ala Gly Glu Leu Gly Tyr
355 360 365
Gln Pro Glu His Ile Asp Ser Phe Thr His Glu Ala Cys Pro Val Arg
370 375 380
Ala Leu Leu Ala Ser Trp Ala Thr Gln Asp Ser Ala Thr Leu Asp Ala
385 390 395 400
Leu Leu Ala Ala Leu Arg Arg Ile Gln Arg Ala Asp Leu Val Glu Ser
405 410 415
Leu Cys Ser Glu Ser Thr Ala Thr Ser Pro Val
420 425
<210> 155
<211> 666
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：LNGFR胞外结构域(K29-N250)序列
<400> 155
aaggaggcat gccccacagg cctgtacaca cacagcggtg agtgctgcaa agcctgcaac 60
ctgggcgagg gtgtggccca gccttgtgga gccaaccaga ccgtgtgtga gccctgcctg 120
gacagcgtga cgttctccga cgtggtgagc gcgaccgagc cgtgcaagcc gtgcaccgag 180
tgcgtggggc tccagagcat gtcggcgccg tgcgtggagg ccgacgacgc cgtgtgccgc 240
tgcgcctacg gctactacca ggatgagacg actgggcgct gcgaggcgtg ccgcgtgtgc 300
gaggcgggct cgggcctcgt gttctcctgc caggacaagc agaacaccgt gtgcgaggag 360
tgccccgacg gcacgtattc cgacgaggcc aaccacgtgg acccgtgcct gccctgcacc 420
gtgtgcgagg acaccgagcg ccagctccgc gagtgcacac gctgggccga cgccgagtgc 480
gaggagatcc ctggccgttg gattacacgg tccacacccc cagagggctc ggacagcaca 540
gcccccagca cccaggagcc tgaggcacct ccagaacaag acctcatagc cagcacggtg 600
gcaggtgtgg tgaccacagt gatgggcagc tcccagcccg tggtgacccg aggcaccacc 660
gacaac 666
<210> 156
<211> 222
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：LNGFR胞外结构域(K29-N250)序列
<400> 156
Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys
1 5 10 15
Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn
20 25 30
Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val
35 40 45
Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu
50 55 60
Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala
85 90 95
Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp
100 105 110
Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp
115 120 125
Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp
130 135 140
Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys
145 150 155 160
Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly
165 170 175
Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu
180 185 190
Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met
195 200 205
Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn
210 215 220
<210> 157
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 157
gagccctgcc tggacagcgt gacgttctcc gacgtggtga gcgcgaccga gccgtgcaag 60
ccgtgcaccg agtgcgtggg gctccagagc atgtcggcgc cgtgcgtgga ggccgacgac 120
gccgtgtgcc gctgcgccta cggctactac caggatgaga cgactgggcg ctgcgaggcg 180
tgccgcgtgt gcgaggcggg ctcgggcctc gtgttctcct gccaggacaa gcagaacacc 240
gtgtgcgagg agtgccccga cggcacgtat tccgacgagg ccaaccacgt ggacccgtgc 300
ctgccctgca ccgtgtgcga ggacaccgag cgccagctcc gcgagtgcac acgctgggcc 360
gacgccgagt gcgaggagat ccctggccgt tggattacac ggtccacacc cccagagggc 420
tcggacagca cagcccccag cacccaggag cctgaggcac ctccagaaca agacctcata 480
gccagcacgg tggcaggtgt ggtgaccaca gtgatgggca gctcccagcc cgtggtgacc 540
cgaggcacca ccgacaac 558
<210> 158
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 158
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
20 25 30
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
35 40 45
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
50 55 60
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
65 70 75 80
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
85 90 95
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
100 105 110
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
115 120 125
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
130 135 140
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
145 150 155 160
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln
165 170 175
Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn
180 185
<210> 159
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 159
cgctgcgcct acggctacta ccaggatgag acgactgggc gctgcgaggc gtgccgcgtg 60
tgcgaggcgg gctcgggcct cgtgttctcc tgccaggaca agcagaacac cgtgtgcgag 120
gagtgccccg acggcacgta ttccgacgag gccaaccacg tggacccgtg cctgccctgc 180
accgtgtgcg aggacaccga gcgccagctc cgcgagtgca cacgctgggc cgacgccgag 240
tgcgaggaga tccctggccg ttggattaca cggtccacac ccccagaggg ctcggacagc 300
acagccccca gcacccagga gcctgaggca cctccagaac aagacctcat agccagcacg 360
gtggcaggtg tggtgaccac agtgatgggc agctcccagc ccgtggtgac ccgaggcacc 420
accgacaac 429
<210> 160
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 160
Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu
1 5 10 15
Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln
20 25 30
Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser
35 40 45
Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu
50 55 60
Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu
65 70 75 80
Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu
85 90 95
Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro
100 105 110
Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val
115 120 125
Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn
130 135 140
<210> 161
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 161
aaggaggcat gccccacagg cctgtacaca cacagcggtg agtgctgcaa agcctgcaac 60
ctgggcgagg gtgtggccca gccttgtgga gccaaccaga ccgtgtgtga gccctgcctg 120
gacagcgtga cgttctccga cgtggtgagc gcgaccgagc cgtgcaagcc gtgcaccgag 180
tgcgtggggc tccagagcat gtcggcgccg tgcgtggagg ccgacgacgc cgtgtgccgc 240
tgcgcctacg gctactacca ggatgagacg actgggcgct gcgaggcgtg ccgcgtgtgc 300
gaggcgggct cgggcctcgt gttctcctgc caggacaagc agaacaccgt gtgcgaggag 360
tgccccgacg gcacgtattc cgacgaggcc aaccacgtgg acccgtgcct gccctgcacc 420
gtgtgcgagg acaccgagcg ccagctccgc gagtgcacac gctgggccga cgccgagtgc 480
gaggagatcc ctggccgttg gattacacgg tccacacccc cagagggctc ggacagcaca 540
gcccccagca cccaggagcc tgaggcacct ccagaacaag acctcatagc cagcacggtg 600
gcaggtgtgg tgaccacagt gatgggcagc tcccagcccg tggtgacccg aggcaccacc 660
gacaacctca tccctgtcta ttgctccatc ctggctgctg tggttgtggg ccttgtggcc 720
tacatagcct tc 732
<210> 162
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 162
Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys
1 5 10 15
Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn
20 25 30
Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val
35 40 45
Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu
50 55 60
Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala
85 90 95
Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp
100 105 110
Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp
115 120 125
Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp
130 135 140
Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys
145 150 155 160
Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly
165 170 175
Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu
180 185 190
Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met
195 200 205
Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile
210 215 220
Pro Val Tyr Cys Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala
225 230 235 240
Tyr Ile Ala Phe
<210> 163
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 163
Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys
1 5 10 15
Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn
20 25 30
Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val
35 40 45
Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu
50 55 60
Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala
85 90 95
Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp
100 105 110
Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp
115 120 125
Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp
130 135 140
Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys
145 150 155 160
Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly
165 170 175
Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu
180 185 190
Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met
195 200 205
Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
245 250 255
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
260 265 270
Arg Ser
<210> 164
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 164
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
20 25 30
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
35 40 45
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
50 55 60
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
65 70 75 80
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
85 90 95
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
100 105 110
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
115 120 125
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
130 135 140
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
145 150 155 160
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln
165 170 175
Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
180 185 190
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp
195 200 205
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
210 215 220
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
225 230 235
<210> 165
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 165
Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu
1 5 10 15
Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln
20 25 30
Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser
35 40 45
Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu
50 55 60
Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu
65 70 75 80
Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu
85 90 95
Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro
100 105 110
Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val
115 120 125
Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
165 170 175
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
180 185 190
Lys Arg Ser
195
<210> 166
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 166
Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu
1 5 10 15
Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln
20 25 30
Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser
35 40 45
Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu
50 55 60
Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu
65 70 75 80
Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu
85 90 95
Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro
100 105 110
Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val
115 120 125
Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Glu Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val
165 170 175
Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr Gly Ile Arg Arg Gly Gly Gly
180 185 190
Ser
<210> 167
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 167
Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu
1 5 10 15
Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln
20 25 30
Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser
35 40 45
Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu
50 55 60
Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu
65 70 75 80
Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu
85 90 95
Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro
100 105 110
Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val
115 120 125
Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile
165 170 175
Gly Thr Ile Leu Leu Ala Leu Leu Ile Trp Gly Gly Gly Ser
180 185 190
<210> 168
<211> 190
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 168
Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu
1 5 10 15
Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln
20 25 30
Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser
35 40 45
Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu
50 55 60
Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu
65 70 75 80
Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu
85 90 95
Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro
100 105 110
Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val
115 120 125
Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile
165 170 175
Gly Thr Ile Leu Leu Ala Leu Leu Ile Trp Gly Gly Gly Ser
180 185 190
<210> 169
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 169
atggcgctgc ccgtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caatttggag 300
caggaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgt agaccggctg caggtggagc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgccgcg tcaagttcag caggagcgca 1020
gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1080
agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1140
ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1200
gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1260
ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1320
ctgccccctc gc 1332
<210> 170
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 170
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Val Lys Phe
325 330 335
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
340 345 350
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
355 360 365
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
370 375 380
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
385 390 395 400
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
405 410 415
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
420 425 430
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
435 440
<210> 171
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 171
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggcagc acctccggca gcggcaagcc tggcagcggc 420
gagggcagca ccaagggcga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc 480
tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta 540
agctggattc gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt 600
gaaaccacat actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc 660
aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac 720
tgtgccaaac attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg ccaaggaacc 780
tcagtcaccg tctcctcaac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca 900
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 960
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag 1020
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1080
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1140
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac aagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1467
<210> 172
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 172
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro
145 150 155 160
Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro
165 170 175
Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala
195 200 205
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
210 215 220
Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 173
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 173
atggcgctgc ccgtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caatttggag 300
caggaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
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ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
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tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgt agaccggctg caggtggagc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcagga gtaagaggag caggctcctg 1020
cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1080
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cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1260
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1320
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1380
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1440
gccctgcccc ctcgc 1455
<210> 174
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 174
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg
325 330 335
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
340 345 350
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
355 360 365
Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
370 375 380
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
385 390 395 400
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
405 410 415
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
420 425 430
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
435 440 445
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
450 455 460
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
465 470 475 480
Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 175
<211> 2031
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 175
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120
gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240
cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gagcaggagg acatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360
ggcggcggaa caaagctgga gatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420
ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaga gcggccctgg cctggtggcc 480
cccagccaga gcctgagcgt gacctgtacc gtgtccggcg tgtccctgcc cgactacggc 540
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agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660
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accagcgtga ccgtgtccag cgagagcaag tacggccctc cctgcccccc ttgccctgcc 840
cccgagttcc tgggcggacc cagcgtgttc ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg 900
atgatcagcc ggacccccga ggtgacctgt gtggtggtgg acgtgtccca ggaggacccc 960
gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc 1020
cgggaggagc agttcaatag cacctaccgg gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag 1080
gactggctga acggcaagga atacaagtgt aaggtgtcca acaagggcct gcccagcagc 1140
atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc cagcctcggg agccccaggt gtacaccctg 1200
ccccctagcc aagaggagat gaccaagaat caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc 1260
ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcccga gaacaactac 1320
aagaccaccc cccctgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caggctgacc 1380
gtggacaaga gccggtggca ggagggcaac gtctttagct gctccgtgat gcacgaggcc 1440
ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg tccctgagcc tgggcaagat gttctgggtg 1500
ctggtcgtgg tgggtggcgt gctggcctgc tacagcctgc tggtgacagt ggccttcatc 1560
atcttttggg tgaggagcaa gcggagcaga ggcggccaca gcgactacat gaacatgacc 1620
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gccgcctacc ggagccgggt gaagttcagc cggagcgccg acgcccctgc ctaccagcag 1740
ggccagaacc agctgtacaa cgagctgaac ctgggccgga gggaggagta cgacgtgctg 1800
gacaagcgga gaggccggga ccctgagatg ggcggcaagc cccggagaaa gaaccctcag 1860
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gccaccaagg atacctacga cgccctgcac atgcaggccc tgccccccag a 2031
<210> 176
<211> 677
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 176
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
275 280 285
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
290 295 300
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
305 310 315 320
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
325 330 335
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
340 345 350
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
355 360 365
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
370 375 380
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
385 390 395 400
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
405 410 415
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
420 425 430
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
435 440 445
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
450 455 460
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
465 470 475 480
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
485 490 495
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
500 505 510
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
515 520 525
Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
530 535 540
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
545 550 555 560
Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
565 570 575
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
580 585 590
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
595 600 605
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
610 615 620
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
625 630 635 640
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
645 650 655
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
660 665 670
Ala Leu Pro Pro Arg
675
<210> 177
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 177
aactgggtga atgtgatcag cgacctgaag aagatcgagg atctgatcca gagcatgcac 60
attgatgcca ccctgtacac agaatctgat gtgcacccta gctgtaaagt gaccgccatg 120
aagtgttttc tgctggagct gcaggtgatt tctctggaaa gcggagatgc ctctatccac 180
gacacagtgg agaatctgat catcctggcc aacaatagcc tgagcagcaa tggcaatgtg 240
acagagtctg gctgtaagga gtgtgaggag ctggaggaga agaacatcaa ggagtttctg 300
cagagctttg tgcacatcgt gcagatgttc atcaatacaa gctctggcgg aggatctgga 360
ggaggcggat ctggaggagg aggcagtgga ggcggaggat ctggcggagg atctctgcag 420
attacatgcc ctcctccaat gtctgtggag cacgccgata tttgggtgaa gtcctacagc 480
ctgtacagca gagagagata catctgcaac agcggcttta agagaaaggc cggcacctct 540
tctctgacag agtgcgtgct gaataaggcc acaaatgtgg cccactggac aacacctagc 600
ctgaagtgca ttagagatcc tgccctggtc caccagaggc ctgcccctcc atctacagtg 660
acaacagccg gagtgacacc tcagcctgaa tctctgagcc cttctggaaa agaacctgcc 720
gccagctctc ctagctctaa taataccgcc gccacaacag ccgccattgt gcctggatct 780
cagctgatgc ctagcaagtc tcctagcaca ggcacaacag agatcagcag ccacgaatct 840
tctcacggaa caccttctca gaccaccgcc aagaattggg agctgacagc ctctgcctct 900
caccagcctc caggagtgta tcctcagggc cactctgata caacagtggc catcagcaca 960
tctacagtgc tgctgtgtgg actgtctgcc gtgtctctgc tggcctgtta cctgaagtct 1020
agacagacac ctcctctggc ctctgtggag atggaggcca tggaagccct gcctgtgaca 1080
tggggaacaa gcagcagaga tgaggacctg gagaattgtt ctcaccacct g 1131
<210> 178
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 178
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln Ile Thr Cys Pro
130 135 140
Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser
145 150 155 160
Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys
165 170 175
Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn
180 185 190
Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala
195 200 205
Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val Thr Thr Ala Gly
210 215 220
Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly Lys Glu Pro Ala
225 230 235 240
Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Ile
245 250 255
Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro Ser Thr Gly Thr
260 265 270
Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr Pro Ser Gln Thr
275 280 285
Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser His Gln Pro Pro
290 295 300
Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile Ser Thr
305 310 315 320
Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu Ala Cys
325 330 335
Tyr Leu Lys Ser Arg Gln Thr Pro Pro Leu Ala Ser Val Glu Met Glu
340 345 350
Ala Met Glu Ala Leu Pro Val Thr Trp Gly Thr Ser Ser Arg Asp Glu
355 360 365
Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu
370 375
<210> 179
<211> 841
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 179
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
260 265 270
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
275 280 285
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
290 295 300
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
305 310 315 320
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
325 330 335
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
340 345 350
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
355 360 365
Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
370 375 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385 390 395 400
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
420 425 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
435 440 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
450 455 460
Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
465 470 475 480
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu
485 490 495
Leu Met Leu Trp Val Pro Gly Ser Ser Gly Arg Lys Val Cys Asn Gly
500 505 510
Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn
515 520 525
Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile
530 535 540
Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu
545 550 555 560
Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly
565 570 575
Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala
580 585 590
Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln
595 600 605
Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg
610 615 620
Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys
625 630 635 640
Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr
645 650 655
Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys
660 665 670
Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys
675 680 685
Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg
690 695 700
Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg
705 710 715 720
Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu
725 730 735
Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys
740 745 750
Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys
755 760 765
Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala
770 775 780
Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly
785 790 795 800
Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile
805 810 815
Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val
820 825 830
Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
835 840
<210> 180
<211> 750
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 180
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
260 265 270
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
275 280 285
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
290 295 300
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
305 310 315 320
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
325 330 335
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
340 345 350
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
355 360 365
Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
370 375 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385 390 395 400
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
420 425 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
435 440 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
450 455 460
Leu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val
465 470 475 480
Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu
485 490 495
Leu Met Leu Trp Val Pro Gly Ser Ser Gly Arg Lys Val Cys Asn Gly
500 505 510
Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn
515 520 525
Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile
530 535 540
Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu
545 550 555 560
Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly
565 570 575
Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala
580 585 590
Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln
595 600 605
Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg
610 615 620
Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys
625 630 635 640
Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr
645 650 655
Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys
660 665 670
Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys
675 680 685
Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
690 695 700
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp
705 710 715 720
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
725 730 735
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
740 745 750
<210> 181
<211> 2814
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 181
gacatccaaa tgacacagac aaccagcagc ctctctgcca gtctgggaga tcgtgtgacc 60
atcagttgta gagcctcaca agatatttcc aaatacctaa actggtatca gcaaaaacca 120
gatggtacag tgaagttact gatctaccat actagccgtc ttcattccgg tgtgccttct 180
cgctttagcg ggtctggatc aggaacagat tacagtctca ccatcagcaa cctcgaacaa 240
gaagatatag ctacctattt ctgccagcag ggtaacactt tgccatatac cttcggagga 300
ggcacaaaac tggagatcac tggttctacc agtggaagcg gcaagcctgg ctccggtgaa 360
ggaagtacca aaggcgaagt gaagctgcaa gagtcaggtc caggtttggt agctcccagc 420
caatccctat ctgttacctg tacagtgtct ggtgtgtcac ttccagatta tggcgtgtca 480
tggataaggc agcccccacg aaaaggcctg gaatggttgg gggtgatctg gggatctgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaaaagt cggctcacca tcatcaaaga caactccaag 600
tcacaagtgt ttcttaagat gaactcactt cagaccgacg acacagccat atactactgt 660
gctaaacatt actactatgg cggtagctat gccatggatt actggggtca aggtactagt 720
gtgacagtat catctgaatc aaagtatggc ccaccctgcc ccccttgtcc cgctcctgag 780
ttcctgggtg gtccctccgt attcctgttt ccacctaagc caaaagacac tctcatgatc 840
agcagaacac ctgaggtgac atgcgtcgta gttgatgtta gccaggagga ccccgaagtg 900
caatttaact ggtacgtaga cggtgtggaa gtgcataacg caaagaccaa gccacgtgaa 960
gagcagttta actccaccta ccgagtggtg tctgtgctca cagtcttaca tcaagattgg 1020
ctgaacggaa aagagtataa atgtaaagta tccaataagg gccttccctc tagcatcgaa 1080
aagactatct ccaaagccaa gggacagcca cgcgaaccac aggtgtatac tttacctcct 1140
tctcaagaag agatgaccaa gaaccaagta tctctgacgt gtttggtgaa ggggttctac 1200
ccctctgaca tcgcagtgga atgggaatca aacggtcaac ctgagaacaa ttacaaaacc 1260
accccacctg tgctggatag cgacggcagc ttctttctgt atagcaggct cacagtggat 1320
aaaagtcggt ggcaggaagg aaacgtattt agttgcagtg tgatgcacga ggccctccat 1380
aaccattata cccagaagtc actctcactt agtctgggta agatgttctg ggtgctcgtg 1440
gtcgtaggtg gagtgctggc ttgctactcc ctcttagtga ccgtggcttt tatcatcttc 1500
tgggtacgtt ccaaaaggtc ccgtggtggc cattcagatt acatgaatat gacccccaga 1560
cgaccaggcc caacaaggaa gcattatcaa ccttacgccc ctccccgaga ttttgcagct 1620
tatcgaagta gggtgaagtt cagccggtct gctgacgctc ctgcatacca gcaaggtcag 1680
aatcagttat acaatgagct aaatctagga cgacgcgaag aatatgatgt gctggacaaa 1740
cgacgtggca gggaccctga aatgggtggc aagccaagaa ggaagaaccc acaagagggt 1800
ctgtacaacg agttgcagaa agacaagatg gcagaggcct actccgagat cggaatgaaa 1860
ggagagaggc ggaggggtaa aggacatgac ggtctttacc agggcctgag cacagctact 1920
aaagatacct acgacgccct ccacatgcag gctttgcccc cacgagctac caattttagt 1980
ctgttgaaac aagctggaga tgtcgaggaa aatccaggcc caatgcgact tcctgctcaa 2040
ctgctgggtc tgctcatgct gtgggttcct ggaagcagtg gccgaaaggt ctgcaacggc 2100
atcggtatcg gcgaatttaa ggatagtcta tctatcaacg ctaccaatat taagcatttt 2160
aagaactgca cgtctatttc cggcgacttg cacatcctcc ctgttgcatt tcggggtgat 2220
agtttcaccc ataccccccc tctcgatcca caagaactgg acattcttaa aaccgttaaa 2280
gaaataacag gttttctcct catccaggca tggcccgaga ataggacaga tcttcacgca 2340
tttgaaaacc tcgaaatcat cagagggagg accaaacagc atggtcagtt tagtctcgca 2400
gtggtgtctc tgaacatcac ttctttaggg cttcgatcac ttaaggaaat ctctgacggt 2460
gatgtaatca tcagcggtaa caagaacctg tgctacgcta acacgatcaa ctggaagaag 2520
ctgtttggca caagcggcca gaaaaccaag atcattagta ataggggcga gaatagctgt 2580
aaagcaaccg ggcaagtgtg tcacgctctg tgttctcccg agggatgttg gggacctgaa 2640
ccaagagact gcgttagtgg aggggggggc tctggtggcg gaggatctgg cggaggcgga 2700
agcggaggcg gggggagctt ctgggtgctc gtggtcgtag gaggggtgct ggcctgttac 2760
tctctactcg taactgttgc tttcatcata ttctgggtcc gaagtaagcg tagc 2814
<210> 182
<211> 938
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 182
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
370 375 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val
465 470 475 480
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
485 490 495
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser
500 505 510
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
515 520 525
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
530 535 540
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
545 550 555 560
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
565 570 575
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
580 585 590
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
595 600 605
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
610 615 620
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
625 630 635 640
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Ala
645 650 655
Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
660 665 670
Gly Pro Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp
675 680 685
Val Pro Gly Ser Ser Gly Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
690 695 700
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
705 710 715 720
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
725 730 735
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
740 745 750
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
755 760 765
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
770 775 780
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
785 790 795 800
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
805 810 815
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
820 825 830
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
835 840 845
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
850 855 860
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
865 870 875 880
Pro Arg Asp Cys Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
885 890 895
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val
900 905 910
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
915 920 925
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
930 935
<210> 183
<211> 959
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 183
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe
20 25 30
Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn
35 40 45
Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg
50 55 60
Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp
65 70 75 80
Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala
85 90 95
Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile
100 105 110
Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val
115 120 125
Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser
130 135 140
Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn
145 150 155 160
Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys
165 170 175
Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val
180 185 190
Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg
195 200 205
Asp Cys Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
225 230 235 240
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
245 250 255
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
260 265 270
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val
275 280 285
Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro
290 295 300
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
305 310 315 320
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
325 330 335
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
340 345 350
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
355 360 365
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
370 375 380
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
385 390 395 400
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
405 410 415
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
420 425 430
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
435 440 445
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
450 455 460
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
465 470 475 480
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
485 490 495
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
500 505 510
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
515 520 525
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
530 535 540
Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
545 550 555 560
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
565 570 575
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
580 585 590
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
595 600 605
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
610 615 620
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
625 630 635 640
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
645 650 655
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660 665 670
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
675 680 685
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
690 695 700
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
705 710 715 720
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
725 730 735
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
740 745 750
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
755 760 765
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val
770 775 780
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
785 790 795 800
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser
805 810 815
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
820 825 830
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
835 840 845
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
850 855 860
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
865 870 875 880
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
885 890 895
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
900 905 910
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
915 920 925
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
930 935 940
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
945 950 955
<210> 184
<211> 763
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 184
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
245 250 255
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
260 265 270
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
275 280 285
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
290 295 300
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
305 310 315 320
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
325 330 335
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
340 345 350
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
355 360 365
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
370 375 380
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
385 390 395 400
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
405 410 415
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
420 425 430
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
435 440 445
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
450 455 460
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser
465 470 475 480
Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn
485 490 495
Pro Gly Pro Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu
500 505 510
Trp Val Pro Gly Ser Ser Gly Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile
515 520 525
Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His
530 535 540
Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val
545 550 555 560
Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln
565 570 575
Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu
580 585 590
Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn
595 600 605
Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu
610 615 620
Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys
625 630 635 640
Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys
645 650 655
Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln
660 665 670
Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr
675 680 685
Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro
690 695 700
Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
705 710 715 720
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val
725 730 735
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
740 745 750
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
755 760
<210> 185
<211> 2553
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 185
gacatacaga tgactcagac aacaagtagc ttgtccgcat ccctgggcga tagagtgacc 60
atcagttgtc gagcatccca agatatatcc aagtacttaa actggtatca gcagaagcca 120
gatggcaccg tcaagctgct aatctaccac acaagtaggc tccacagcgg agtgcctagc 180
cgattctctg gttctggttc tggcacagac tattccctaa ccatcagcaa cctggagcaa 240
gaggacattg caacatattt ttgccagcag ggcaacacac tgccatatac ctttggaggc 300
gggaccaagc tggaaatcac cggtagtacg agtggttctg gaaaacctgg ttctggcgaa 360
ggtagtacta aaggagaggt gaaacttcaa gagagtggcc ctggcttggt ggccccttct 420
caaagtttga gcgtgacctg cacagtaagt ggcgtcagcc tgccagatta cggagtcagt 480
tggattcgcc agcctccaag gaagggcctt gaatggctgg gcgtaatctg ggggtccgaa 540
accacctatt acaactccgc acttaagagc cgtttaacca tcatcaaaga caacagcaag 600
agtcaggtct ttctcaaaat gaatagtctg caaacggacg acaccgctat ctactattgt 660
gccaagcact actactatgg tggctcctac gctatggatt actggggaca aggaacaagc 720
gtgacagtgt caagtactac cacacctgct ccccgtcctc caacccccgc tcctactatt 780
gccagtcaac cactgtctct taggcccgag gcatgtaggc cagcagcagg cggggctgtg 840
catacccgag gtctcgactt cgcctgcgac atatatatct gggcccctct ggctggcact 900
tgtggggtcc tcctcctgag tctcgtgatc actctgtatt gtaaacgtgg gcgaaagaag 960
ctcctttaca tcttcaagca acccttcatg aggcctgtac agaccacgca ggaggaggac 1020
gggtgtagtt gccgattccc cgaagaggaa gaaggcggtt gcgagcttcg agtgaaattc 1080
agtaggagtg ctgacgcacc agcatataag cagggccaga accaattata caacgagctg 1140
aacctcggac gaagggaaga gtatgatgtg ctggataagc gcagaggccg tgatccagaa 1200
atgggcggca aacctcgtcg gaaaaatcca caagaggggc tatacaacga attgcagaaa 1260
gacaaaatgg cagaggccta ttctgaaatc ggcatgaagg gcgaacgacg aagaggtaag 1320
ggtcatgacg gcctgtatca aggtctctct accgccacaa aggacactta cgatgcttta 1380
cacatgcagg ctctccctcc cagacaatgc accaactacg ctctattgaa gttggcagga 1440
gatgtggaat ccaaccccgg tcctatgcgt ctacctgccc agctgcttgg gctcctgatg 1500
ctgtgggtcc ccggcagcag tggtagaaaa gtatgtaacg gcataggtat cggtgaattt 1560
aaggactcac taagcatcaa cgccacaaac atcaagcact ttaagaactg tacctctatt 1620
agcggagact tacacatcct gccagtcgca tttcgaggag acagtttcac ccacactcca 1680
cctctcgatc ctcaggaatt agacattctt aaaacagtta aggaaatcac tggatttctt 1740
cttatccagg cctggccaga aaatagaaca gacctgcacg ctttcgagaa ccttgaaata 1800
atacgaggca ggaccaaaca gcatggccaa tttagtttgg ctgtagtctc cttgaacatc 1860
acttcccttg gcctaaggtc tttgaaggaa atcagtgacg gagacgtgat tatcagcggg 1920
aacaagaacc tctgttacgc aaacacaatc aactggaaga agctctttgg caccagcggc 1980
cagaagacaa agatcatttc taaccgagga gagaacagtt gtaaggcaac aggacaagtg 2040
tgccacgctt tgtgcagccc cgagggatgt tggggtcctg agccacgtga ttgtgtctct 2100
tgccggaacg tcagcagagg tagagaatgt gtggataagt gcaacctcct ggaaggggag 2160
cctcgtgagt tcgtggagaa ctccgaatgt atccagtgtc atccagaatg cctgccccag 2220
gccatgaaca taacatgtac aggacgcggc ccagacaact gcatacagtg cgcccactac 2280
attgatggcc cccattgcgt aaagacttgt cctgctggag tcatgggcga aaataacacc 2340
ctggtgtgga agtacgccga cgctggccat gtatgtcatc tgtgtcatcc taattgcacc 2400
tatggctgca ctggccccgg ccttgaagga tgccccggcg gtggaggagg aggctctttc 2460
tgggtcctcg tggtggtggg aggcgtgctg gcctgctatt ccttgctggt cacggtcgcc 2520
ttcattattt tctgggtgag atctaaaaga agc 2553
<210> 186
<211> 851
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 186
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
260 265 270
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
275 280 285
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
290 295 300
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
305 310 315 320
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
325 330 335
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
340 345 350
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
355 360 365
Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
370 375 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385 390 395 400
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
420 425 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
435 440 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
450 455 460
Leu Pro Pro Arg Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly
465 470 475 480
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu
485 490 495
Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro Gly Ser Ser Gly Arg Lys Val Cys
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515 520 525
Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu
530 535 540
His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro
545 550 555 560
Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly
625 630 635 640
Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe
645 650 655
Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn
660 665 670
Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu
675 680 685
Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val
690 695 700
Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu
705 710 715 720
Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu
725 730 735
Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp
740 745 750
Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys
755 760 765
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770 775 780
Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr
785 790 795 800
Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Gly Gly Gly Gly
805 810 815
Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
820 825 830
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
835 840 845
Lys Arg Ser
850
<210> 187
<211> 761
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 187
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
245 250 255
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
260 265 270
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
275 280 285
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
290 295 300
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
305 310 315 320
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
325 330 335
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
340 345 350
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
355 360 365
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
370 375 380
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
385 390 395 400
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
405 410 415
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
420 425 430
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
435 440 445
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450 455 460
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<220>
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<400> 188
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<220>
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<220>
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<211> 758
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 191
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<210> 192
<211> 747
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 192
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Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu
530 535 540
His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro
545 550 555 560
Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile
565 570 575
Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu
580 585 590
His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His
595 600 605
Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly
610 615 620
Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly
625 630 635 640
Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe
645 650 655
Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn
660 665 670
Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu
675 680 685
Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
705 710 715 720
Ile Thr Leu Ile Ile Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile
725 730 735
Leu Leu Ala Leu Leu Ile Trp Gly Gly Gly Ser
740 745
<210> 193
<211> 666
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 193
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
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Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
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65 70 75 80
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115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln Ile Thr Cys Pro
130 135 140
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145 150 155 160
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr Val Ala Ile Ser Thr
305 310 315 320
Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser Leu Leu Ala Cys
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Asp Leu Glu Asn Cys Ser His His Leu Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly
370 375 380
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
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405 410 415
Val Pro Gly Ser Ser Gly Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
420 425 430
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435 440 445
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
565 570 575
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
580 585 590
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
595 600 605
Pro Arg Asp Cys Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
610 615 620
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val
625 630 635 640
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645 650 655
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<210> 194
<211> 971
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 194
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
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<210> 195
<211> 937
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 195
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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930 935
<210> 196
<211> 888
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 196
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690 695 700
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705 710 715 720
Arg Glu Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe
725 730 735
His Ile Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala
740 745 750
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755 760 765
Ile Ile Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys
770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His
820 825 830
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835 840 845
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885
<210> 197
<211> 848
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 197
Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr
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Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro
165 170 175
Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg
180 185 190
Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu
195 200 205
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys
210 215 220
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu
225 230 235 240
Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
245 250 255
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu
260 265 270
Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser
290 295 300
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
305 310 315 320
Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu
325 330 335
Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val
340 345 350
Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val
355 360 365
Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg
370 375 380
Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met
385 390 395 400
Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His
405 410 415
Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
420 425 430
Ser Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
435 440 445
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
450 455 460
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
465 470 475 480
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
485 490 495
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
500 505 510
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
515 520 525
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
530 535 540
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
565 570 575
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
580 585 590
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
595 600 605
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
610 615 620
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
625 630 635 640
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
645 650 655
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu
660 665 670
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
675 680 685
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His
690 695 700
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
705 710 715 720
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
725 730 735
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
740 745 750
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
755 760 765
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
770 775 780
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
785 790 795 800
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
805 810 815
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
820 825 830
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
835 840 845
<210> 198
<211> 910
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 198
Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gly Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr
20 25 30
Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val
35 40 45
Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp
50 55 60
Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys
65 70 75 80
Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp
85 90 95
Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser
100 105 110
Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro
115 120 125
Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val
130 135 140
Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr
145 150 155 160
Thr Asp Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
180 185 190
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
195 200 205
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln
210 215 220
Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr
225 230 235 240
Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp
245 250 255
Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp
260 265 270
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
275 280 285
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
290 295 300
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
305 310 315 320
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
325 330 335
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
340 345 350
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser
355 360 365
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu
370 375 380
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
385 390 395 400
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
405 410 415
Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
420 425 430
Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
435 440 445
Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser
450 455 460
Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr
465 470 475 480
Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
485 490 495
Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
500 505 510
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
515 520 525
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
530 535 540
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
545 550 555 560
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
565 570 575
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
580 585 590
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
595 600 605
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
610 615 620
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
625 630 635 640
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
645 650 655
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
660 665 670
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
675 680 685
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
690 695 700
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
705 710 715 720
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val
725 730 735
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
740 745 750
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp
755 760 765
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
770 775 780
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val
785 790 795 800
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
805 810 815
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
820 825 830
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
835 840 845
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
850 855 860
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
865 870 875 880
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
885 890 895
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
900 905 910
<210> 199
<211> 513
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 199
cgcaaagtgt gtaacggaat aggtattggt gaatttaaag actcactctc cataaatgct 60
acgaatatta aacacttcaa aaactgcacc tccatcagtg gcgatctcca catcctgccg 120
gtggcattta ggggtgactc cttcacacat actcctcctc tggatccaca ggaactggat 180
attctgaaaa ccgtaaagga aatcacaggg tttttgctga ttcaggcttg gcctgaaaac 240
aggacggacc tccatgcctt tgagaaccta gaaatcatac gcggcaggac caagcaacat 300
ggtcagtttt ctcttgcagt cgtcagcctg aacataacat ccttgggatt acgctccctc 360
aaggagataa gtgatggaga tgtgataatt tcaggaaaca aaaatttgtg ctatgcaaat 420
acaataaact ggaaaaaact gtttgggacc tccggtcaga aaaccaaaat tataagcaac 480
agaggtgaaa acagctgcaa ggccacaggc cag 513
<210> 200
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 200
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln
165 170
<210> 201
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 201
gtctgccatg ccttgtgctc ccccgagggc tgctggggcc cggagcccag ggactgcgtc 60
tcttgccgga atgtcagccg aggcagggaa tgcgtggaca agtgcaacct tctggagggt 120
gagccaaggg agtttgtgga gaactctgag tgcatacagt gccacccaga gtgcctgcct 180
caggccatga acatcacctg cacaggacgg ggaccagaca actgtatcca gtgtgcccac 240
tacattgacg gcccccactg cgtcaagacc tgcccggcag gagtcatggg agaaaacaac 300
accctggtct ggaagtacgc agacgccggc catgtgtgcc acctgtgcca tccaaactgc 360
acctacggat gcactgggcc aggtcttgaa ggctgtccaa cgaatgggcc taagatcccg 420
tcc 423
<210> 202
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 202
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
20 25 30
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
35 40 45
Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn
50 55 60
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His
65 70 75 80
Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met
85 90 95
Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
100 105 110
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly
115 120 125
Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser
130 135 140
<210> 203
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 203
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Cys Val Ser
20
<210> 204
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 204
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
20 25 30
Asp Lys
<210> 205
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 205
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
20 25 30
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
35 40 45
Ser Glu Cys Ile Gln
50
<210> 206
<211> 77
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 206
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
20 25 30
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
35 40 45
Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn
50 55 60
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln
65 70 75
<210> 207
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 207
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
20 25 30
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
35 40 45
Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn
50 55 60
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His
65 70 75 80
Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr
85 90
<210> 208
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 208
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
20 25 30
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
35 40 45
Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn
50 55 60
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His
65 70 75 80
Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met
85 90 95
Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
100 105 110
Cys His Leu
115
<210> 209
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 209
Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro
1 5 10 15
Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val
20 25 30
Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn
35 40 45
Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn
50 55 60
Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His
65 70 75 80
Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met
85 90 95
Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
100 105 110
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly
115 120 125
Leu Glu Gly Cys Pro
130
<210> 210
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 210
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser
305 310
<210> 211
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 211
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
<210> 212
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 212
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys
195 200 205
<210> 213
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 213
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
<210> 214
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 214
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln
245
<210> 215
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 215
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr
260
<210> 216
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 216
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu
275 280 285
<210> 217
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 217
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
<210> 218
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 218
Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala
1 5 10 15
His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser
20 25 30
Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser
35 40 45
<210> 219
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 219
Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys
1 5 10 15
Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser
20 25
<210> 220
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 220
Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr
1 5 10 15
Cys
<210> 221
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 221
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 222
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(25)
<223> 该区域可包含1-5个"Gly Gly Gly Gly Ser"重复单元
<400> 222
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 223
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 223
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 224
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 224
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 225
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 225
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 226
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 226
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Gln
20 25
<210> 227
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 227
Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 228
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 228
Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 229
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Val or Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 任意氨基酸
<400> 229
Asp Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 230
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 230
Arg Ala Lys Arg
1
<210> 231
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 231
agagctaaga gg 12
<210> 232
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 232
cgtgcaaagc gt 12
<210> 233
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 233
Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu
1 5 10 15
Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 234
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 234
agagccaaga gggcaccggt gaaacagact ttgaattttg accttctgaa gttggcagga 60
gacgttgagt ccaaccctgg gccc 84
<210> 235
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 235
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 236
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 236
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 237
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 237
Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
1 5 10 15
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25 30
<210> 238
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 238
cgtgcaaagc gtgcaccggt gaaacaggga agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag 60
caggctggag acgtggagga gaaccctgga cct 93
<210> 239
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 该区域可包含2-5个"Xaa Pro"重复单元
<400> 239
Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro
1 5 10
<210> 240
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(26)
<223> 该区域可包含2-5个"Glu Ala Ala Ala Lys"重复单元
<400> 240
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
20 25

Claims (138)

1.一种多核苷酸，其编码：
至少由HER1结构域III或其片段和截短的HER1结构域IV组成的截短的非免疫原性HER1多肽，其中所述HER1多肽结合抗HER1抗体，并且
其中所述HER1多肽在工程化细胞中表达。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述截短的HER1结构域IV包含所述HER1结构域IV的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的截短。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述截短的HER1结构域IV包含与SEQ ID NO:203、204、205、206、207、208和209所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中所述截短的HER1结构域IV包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID No:203、204、205、206、207、208和209所示的序列。
5.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述HER1结构域III或其片段包含与SEQ IDNO:200所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述HER1结构域III包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:200所示的序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸进一步编码CD28跨膜结构域和用于将所述HER1多肽偶联至所述CD28跨膜结构域的肽连接体。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含以下多肽序列的多肽构建体，该多肽序列包含如SEQ ID NO:57所示的序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸，其中所述抗HER1抗体包括利妥昔单抗、西妥昔单抗、futuximab、depatuxizumab、imgatuzumab、laprituximab、马妥珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、帕木单抗和扎芦木单抗中的至少一种。
10.一种多核苷酸，其编码：
结合抗CD20抗体的截短的非免疫原性CD20多肽，其中所述截短的非免疫原性CD20多肽不结合内源性受体。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述CD20多肽包含与SEQ ID NO:109所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
12.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中所述CD20多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:109的序列。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸，其中所述CD20多肽与天然CD20相比以至少50％、60％、70％、80％或90％的结合效率结合所述抗CD20抗体。
14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其中所述抗CD20抗体包括利妥昔单抗、托西莫单抗、维妥珠单抗、阿托珠单抗、blontuvetmab和obinutuzumab中的至少一种。
15.一种多核苷酸，其编码：
结合抗CD52抗体的截短的非免疫原性CD52多肽，
其中所述截短的非免疫原性CD52多肽不结合内源性受体，并且
其中所述非免疫原性CD52多肽在工程化细胞中表达。
16.根据权利要求15所述的多核苷酸，其中所述CD52多肽包含与SEQ ID NO:143所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中所述CD52多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含如SEQ ID NO:143所示的序列。
18.根据权利要求10-17中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸在细胞中表达，该细胞进一步包含编码至少一种异源基因的至少一个序列。
19.根据权利要求18所述的多核苷酸，其中所述至少一种异源基因被诱导型启动子调节。
20.根据权利要求18所述的多核苷酸，其中所述至少一种异源基因包含嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和细胞因子中的至少一种。
21.根据权利要求20所述的多核苷酸，其中所述至少一种异源基因包含CAR，并且其中所述CAR结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
22.根据权利要求18-20中任一项所述的多核苷酸，其中所述至少一种异源基因包含细胞因子。
23.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述细胞因子包括IL-15、IL-2、IL-12、IL-21以及IL-15与IL-15Rα的融合体中的至少一种。
24.根据权利要求23所述的多核苷酸，其中所述细胞因子为分泌形式。
25.根据权利要求23所述的多核苷酸，其中所述细胞因子为膜结合形式。
26.一种载体，其包含根据权利要求10-25中任一项所述的多核苷酸。
27.根据权利要求26所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
28.根据权利要求27所述的载体，其中所述非病毒载体是Sleeping Beauty转座子。
29.根据权利要求10-25中任一项所述的多核苷酸，其中通过基因组编辑将所述多核苷酸引入工程化细胞中。
30.根据权利要求29所述的多核苷酸，其中所述基因组编辑包括至少使用位点特异性丝氨酸重组酶系统。
31.一种工程化细胞，其包含根据权利要求10-25和29-30中任一项所述的多核苷酸。
32.根据权利要求31所述的工程化细胞，其为T细胞或NK细胞。
33.一种多肽构建体，其包含：
细胞表面多肽和跨膜二聚化结构域，
其中所述跨膜二聚化结构域诱导所述细胞表面多肽的二聚化，并且
其中所述细胞表面多肽结合预定的抗体或其变体或片段。
34.根据权利要求33所述的多肽构建体，其中所述细胞表面多肽包括HER1多肽、LNGFR多肽、CD20多肽或CD52多肽中的至少一种。
35.根据权利要求34所述的多肽构建体，其中所述细胞表面多肽包括HER1多肽，并且其中所述HER1多肽包含与SEQ ID NO:211、212、213、214、215、216或217所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
36.根据权利要求35所述的多肽构建体，其中所述HER1多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:211、212、213、214、215、216或217所示的序列。
37.根据权利要求34所述的多肽构建体，其中所述细胞表面多肽包括CD20多肽，并且其中所述CD20多肽包含与SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219或SEQ ID NO:220所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
38.根据权利要求37所述的多肽构建体，其中所述CD20多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219或SEQ ID NO:220所示的序列。
39.根据权利要求34所述的多肽构建体，其中所述细胞表面多肽包括LNGFR多肽，并且其中所述LNGFR多肽包含与SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158或SEQ ID NO:160所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
40.根据权利要求34所述的多肽构建体，其中所述细胞表面多肽包括LNGFR多肽，并且其中所述LNGFR多肽包含与SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:158或SEQ ID NO:160所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
41.根据权利要求33-40中任一项所述的多肽构建体，其中所述细胞表面多肽不结合内源性受体。
42.根据权利要求33-41中任一项所述的多肽构建体，其中所述跨膜二聚化结构域可以形成具有互补二聚化结构域的同二聚体或异二聚体。
43.根据权利要求33-42中任一项所述的多肽构建体，其中所述跨膜二聚化结构域包含至少一个半胱氨酸残基。
44.根据权利要求33-43中任一项所述的多肽构建体，其中所述跨膜二聚化结构域包含血型糖蛋白A跨膜结构域或其片段或变体，血型糖蛋白A-整联蛋白β3嵌合跨膜结构域或其片段或变体，或CD3ζ跨膜结构域。
45.根据权利要求44所述的多肽构建体，其中所述细胞表面多肽至少包含HER1多肽。
46.根据权利要求33-45中任一项所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体在工程化细胞中表达。
47.根据权利要求46所述的多肽构建体，其中所述工程化细胞是动物细胞。
48.根据权利要求47所述的多肽构建体，其中所述动物细胞是人细胞。
49.根据权利要求48所述的多肽构建体，其中所述人细胞是T细胞或NK细胞。
50.根据权利要求46-49中任一项所述的多肽构建体，其中所述工程化细胞进一步包含Sleeping Beauty转座酶。
51.根据权利要求46-50中任一项所述的多肽构建体，其中所述工程化细胞进一步表达至少一种另外的外源多肽。
52.根据权利要求46-50中任一项所述的多肽构建体，其中所述工程化细胞进一步表达至少一种外源受体多肽或其片段。
53.根据权利要求46-50中任一项所述的多肽构建体，其中所述工程化细胞进一步表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和细胞因子中的至少一种。
54.根据权利要求53所述的多肽构建体，其中所述工程化细胞进一步表达至少一种CAR，并且其中所述CAR结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
55.根据权利要求52-53中任一项所述的多肽构建体，其中所述工程化细胞进一步表达至少一种重组细胞因子。
56.根据权利要求55所述的多肽构建体，其中所述重组细胞因子是IL-15、mbIL-15、IL-2、IL-12或IL-21。
57.根据权利要求46-56中任一项所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体由通过基因组编辑引入到所述工程化细胞中的多核苷酸编码。
58.根据权利要求57所述的多肽构建体，其中所述基因组编辑包括至少使用位点特异性丝氨酸重组酶系统。
59.根据权利要求33-58中任一项所述的多肽构建体，其包含将所述细胞表面多肽融合至所述跨膜二聚化结构域的连接体。
60.一种多肽同二聚体或异二聚体，其包含根据权利要求33-59中任一项所述的多肽构建体。
61.一种编码多肽构建体的多核苷酸，该多肽构建体包含：
与跨膜二聚化结构域融合的非免疫原性细胞表面多肽，其中所述跨膜二聚化结构域诱导所述细胞表面多肽的二聚化。
62.根据权利要求61所述的多核苷酸，其中所述细胞表面多肽不结合内源性受体。
63.根据权利要求61所述的多核苷酸，其中所述细胞表面多肽不包含任何内源性信号传导或运输功能。
64.根据权利要求61-63中任一项所述的多核苷酸，其在进一步包含编码至少一种异源基因的至少一个序列的细胞中表达。
65.根据权利要求64所述的多核苷酸，其中所述至少一种异源基因由诱导型启动子调节。
66.根据权利要求64所述的多核苷酸，其中所述至少一种异源基因包含嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和细胞因子中的至少一种。
67.根据权利要求66所述的多核苷酸，其中所述至少一种异源基因包含所述CAR，并且其中所述CAR结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
68.根据权利要求66-67中任一项所述的多核苷酸，其中所述至少一种异源基因包含细胞因子。
69.根据权利要求68所述的多核苷酸，其中所述细胞因子包括IL-15、IL-2、IL-12、IL-21以及IL-15与IL-15Rα的融合体中的至少一种。
70.根据权利要求68所述的多核苷酸，其中所述细胞因子为分泌形式。
71.根据权利要求68所述的多核苷酸，其中所述细胞因子为膜结合形式。
72.根据权利要求61-71中任一项所述的多核苷酸，其包含至少一个编码多肽连接体的序列，该多肽连接体包括2A、GSG-2A、GSG连接体(SEQ ID NO:16)、SGSG连接体(SEQ ID NO:18)、furinlink变体及其衍生物。
73.根据权利要求72所述的多核苷酸，其中所述2A连接体是p2A连接体、T2A连接体、F2A连接体或E2A连接体。
74.根据权利要求61-73中任一项所述的多核苷酸，其中所述多肽构建体充当标签，以在表达所述细胞表面多肽的细胞中富集细胞、选择细胞或诱导细胞死亡。
75.根据权利要求61-74中任一项所述的多核苷酸，其中所述细胞表面多肽包括HER1多肽、LNGFR多肽、CD20多肽和CD52多肽中的至少一种。
76.根据权利要求61-75中任一项所述的多核苷酸，其中所述跨膜二聚化结构域包含血型糖蛋白A跨膜结构域或其片段或变体，血型糖蛋白A-整联蛋白β3嵌合跨膜结构域或其片段或变体，或CD3ζ跨膜结构域。
77.一种载体，其包含根据权利要求61-76中任一项所述的多核苷酸。
78.根据权利要求77所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体、逆转录病毒载体或非病毒载体。
79.根据权利要求78所述的载体，其中所述非病毒载体是Sleeping Beauty转座子。
80.根据权利要求61-76中任一项所述的多核苷酸，其中通过基因组编辑将所述多核苷酸引入工程化细胞中。
81.根据权利要求80所述的多核苷酸，其中所述基因组编辑包括至少使用位点特异性丝氨酸重组酶系统。
82.一种调节遗传工程化细胞在受试者中的活性的方法，其包括：
向所述受试者提供一定量的遗传工程化细胞，该遗传工程化细胞编码包含与跨膜二聚化结构域融合的细胞表面多肽的多肽构建体，其中所述跨膜二聚化结构域诱导所述细胞表面多肽的二聚化，并且其中所述细胞表面多肽结合预定的结合配偶体或其变体或片段；以及
以足以结合并由此调节所述遗传工程化细胞的活性的量，向所述受试者提供所述预定的结合配偶体。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述细胞表面多肽是非免疫原性多肽。
84.根据权利要求82-83中任一项所述的方法，其中所述细胞表面多肽包括HER1多肽、LNGFR多肽、CD20多肽和CD52多肽中的至少一种。
85.根据权利要求82-84中任一项所述的方法，其中所述细胞表面多肽不结合内源性受体。
86.根据权利要求82-85中任一项所述的方法，其中所述跨膜二聚化结构域可以形成具有互补二聚化结构域的同二聚体或异二聚体。
87.根据权利要求82-85中任一项所述的方法，其中所述跨膜二聚化结构域包含至少一个半胱氨酸残基。
88.根据权利要求82-85中任一项所述的方法，其中所述跨膜二聚化结构域包含血型糖蛋白A跨膜结构域或其片段或变体，血型糖蛋白A-整联蛋白β3嵌合跨膜结构域或其片段或变体，或CD3ζ跨膜结构域。
89.根据权利要求82-88中任一项所述的方法，其中所述结合配偶体包含抗体或其细胞表面多肽结合区。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述抗体包括以下至少一种：单克隆抗体、scFv、scFab、双抗体和骆驼科抗体。
91.根据权利要求89所述的方法，其中所述抗体包括利妥昔单抗、西妥昔单抗、阿仑珠单抗、帕木单抗和奈昔木单抗中的至少一种。
92.根据权利要求82-91中任一项所述的方法，其中所述遗传工程化细胞包含T细胞和NK细胞中的至少一种。
93.根据权利要求82-92中任一项所述的方法，其中所述遗传工程化细胞中的至少一种进一步表达至少一种另外的外源多肽。
94.根据权利要求82-92中任一项所述的方法，其中所述遗传工程化细胞中的至少一种进一步表达嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和细胞因子中的至少一种。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述遗传工程化细胞中的至少一种进一步表达至少一种CAR，并且其中所述CAR结合CD19、CD33、BCMA、CD44、α-叶酸受体、CAIX、CD30、ROR1、CEA、EGP-2、EGP-40、HER2、HER3、叶酸结合蛋白、GD2、GD3、IL-13R-a2、KDR、EDB-F、间皮素、CD22、EGFR、MUC-1、MUC-16、MAGE-A1、h5T4、PSMA、TAG-72、EGFRvIII、CD123和VEGF-R2中的至少一种。
96.根据权利要求94所述的方法，其中所述遗传工程化细胞中的至少一种进一步表达至少一种重组细胞因子。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述重组细胞因子包括IL-15、mbIL-15、IL-2、IL-12和IL-21中的至少一种。
98.根据权利要求82-97中任一项所述的方法，其中以足以引起与细胞因子风暴或全身性炎症反应相关的至少一种症状减轻的量提供所述预定的结合配偶体。
99.根据权利要求82-98中任一项所述的方法，其中以足以引起与肿瘤溶解综合征相关的至少一种症状减轻的量提供所述预定的结合配偶体。
100.根据权利要求82-99中任一项所述的方法，其中所述多肽构建体由通过基因组编辑引入到所述工程化细胞中的多核苷酸编码。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述基因组编辑包括至少使用位点特异性丝氨酸重组酶系统。
102.由根据权利要求1-25、29-30、61-76和80-81中任一项所述的多核苷酸编码的多肽。
103.一种治疗癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的包含根据权利要求1-25、29-30、61-76和80-81中任一项所述的多核苷酸的工程化细胞。
104.根据权利要求103所述的方法，其进一步包括施用至少一种能够与所述工程化细胞上表达的多肽结合的结合配偶体。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述结合配偶体是抗体。
106.一种调节遗传工程化细胞在受试者中的活性的方法，其包括：
向所述受试者提供一定量的遗传工程化细胞，该遗传工程化细胞编码包含细胞表面多肽的多肽构建体，该细胞表面多肽是包含第一截短的非免疫原性多肽和第二截短的非免疫原性多肽的嵌合多肽，并且其中所述细胞表面多肽结合至少一种预定的结合配偶体或其变体或片段；以及
以足以结合并由此调节所述遗传工程化细胞的活性的量，向所述受试者提供所述预定的结合配偶体。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述第一截短的非免疫原性多肽包含EGFR家族成员的片段或衍生物。
108.根据权利要求106或107所述的方法，其中所述第二截短的非免疫原性多肽包含EGFR家族成员的片段或衍生物。
109.根据权利要求106-108中任一项所述的方法，其中所述第一截短的非免疫原性多肽包括HER1多肽。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述HER1多肽包含与SEQ ID NO:211、212、213、214、215、216或217所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述HER1多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:211、212、213、214、215、216或217所示的序列。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述HER1多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:211所示的序列。
113.根据权利要求109-112中任一项所述的方法，其中所述第二截短的非免疫原性多肽包括HER2多肽、ErbB3多肽或ErbB4多肽。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述多肽构建体包含与SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:105所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
115.根据权利要求109所述的方法，其中所述至少一种预定的结合配偶体结合所述HER1多肽。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述至少一种预定的结合配偶体包括利妥昔单抗、西妥昔单抗、futuximab、depatuxizumab、imgatuzumab、laprituximab、马妥珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、帕木单抗和扎芦木单抗中的至少一种。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述至少一种预定的结合配偶体进一步包括与所述第二截短的非免疫原性多肽结合的第二预定的结合配偶体。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述第二截短的非免疫原性多肽是HER2多肽，并且所述第二预定的结合配偶体是帕妥珠单抗。
119.根据权利要求106所述的方法，其中所述多肽构建体进一步包含信号肽。
120.根据权利要求106所述的方法，其中所述多肽构建体进一步包含跨膜结构域。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述跨膜结构域包含跨膜二聚化结构域。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述跨膜二聚化结构域包含血型糖蛋白A跨膜结构域、血型糖蛋白A-整联蛋白β3嵌合跨膜结构域或CD3ζ跨膜结构域。
123.根据权利要求121所述的方法，其中所述跨膜二聚化结构域包含与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述跨膜二聚化结构域包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32所示的多肽序列。
125.根据权利要求106所述的方法，其中所述第一截短的非免疫原性多肽包括CD20多肽。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述CD20多肽包含与SEQ ID NO:218、SEQ IDNO:219或SEQ ID NO:220所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％同一性的多肽序列。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述CD20多肽包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219或SEQ ID NO:220所示的序列。
128.根据权利要求125-127中任一项所述的方法，其中所述至少一种预定的结合配偶体包括以下至少一种：利妥昔单抗、托西莫单抗、维妥珠单抗、阿托珠单抗、blontuvetmab和obinutuzumab。
129.一种多肽构建体，其包含：
由HER1结构域III和截短的HER1结构域IV组成的截短的非免疫原性HER1多肽，其中所述HER1多肽结合抗HER1抗体；
CD28跨膜结构域；以及
用于将所述HER1多肽偶联至所述CD28跨膜结构域的肽连接体；
其中所述多肽构建体在工程化细胞中表达。
130.根据权利要求129所述的多肽构建体，其中所述HER1结构域III包含含有SEQ IDNO:200所示序列的多肽序列，并且所述HER1结构域IV包含含有SEQ ID NO:203所示序列的多肽序列。
131.根据权利要求130所述的多肽构建体，其中所述CD28跨膜结构域包含含有SEQ IDNO:36所示序列的多肽序列，并且所述肽连接体包含G4S肽连接体(SEQ ID NO:221)。
132.根据权利要求131所述的多肽构建体，其中所述G4S肽连接体(SEQ ID NO:221)包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:22所示的序列。
133.根据权利要求132所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:57所示的序列。
134.根据权利要求129-133中任一项所述的多肽构建体，其中所述抗HER1抗体包括利妥昔单抗、西妥昔单抗、futuximab、depatuxizumab、imgatuzumab、laprituximab、马妥珠单抗、奈昔木单抗、尼妥珠单抗、帕木单抗和扎芦木单抗中的至少一种。
135.一种多肽构建体，其包含：
截短的非免疫原性CD20多肽，其中所述CD20多肽结合抗CD20抗体；
其中所述多肽构建体在工程化细胞中表达。
136.根据权利要求135所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体与SEQ ID NO:109所示序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99.5％的同一性。
137.根据权利要求136所述的多肽构建体，其中所述多肽构建体包含以下多肽序列，该多肽序列包含SEQ ID NO:109所示的序列。
138.根据权利要求135-137中任一项所述的多肽构建体，其中所述抗CD20抗体包括利妥昔单抗、托西莫单抗、维妥珠单抗、阿托珠单抗、blontuvetmab和obinutuzumab中的至少一种。
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