ES2278390T3

ES2278390T3 - Sistema de presentacion de antigenos de clase ii de cmh y procedimientos de activacion de linfocitos t cd4+.

Info

Publication number: ES2278390T3
Application number: ES97927709T
Authority: ES
Inventors: Susan R. Webb; Ola Winqvist; Lars Karlsson; Michael R. Jackson; Per A. Peterson
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1996-05-23
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2017-05-22
Also published as: PT969865E; CA2254975A1; WO1997046256A1; CA2254975C; EP0969865B1; US7074617B1; AU723355B2; DE69737070D1; AU3210397A; US7439335B2; JP2012143245A; IL126843A0; IL126843A; DK0969865T3; US20050054090A1; US7402430B2; US20050059144A1; JP2000511898A; US6355479B1; DE69737070T2

Abstract

La invención se refiere a matrices sintéticas para presentación de antígenos, sus procedimientos de fabricación y sus procedimientos de utilización. Una de estas matrices está constituida por células que han sido modificadas para producir moléculas de presentación de antígenos de CMH con una o más moléculas accesorias. Estas matrices se utilizan para activar los linfocitos T a CD4{sup,+} nativo así como para transformar el estado de activación permanente en una población preferida diferenciada de células Th1 o Th2.

Description

Sistemas de presentación de antígenos de clase II de CMH y procedimientos de activación de linfocitos TCD4^{+}.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud provisional de los Estados Unidos con número de serie 60/018.175 en tramitación como la presente presentada el 23 de mayo de 1996, que tiene el mismo título.

Campo técnico

La presente invención se refiere a materiales y procedimientos para la activación de células TCD4^{+} con especificidad para péptidos antagonistas concretos, al uso de células T activadas in vivo para el tratamiento de una variedad de estados de enfermedad, y a las composiciones apropiadas para dichos usos.

Antecedentes

A pesar de que el catálogo de células T se conforma ampliamente durante el desarrollo de células T en el timo, las células TCD4^{+} maduras se regulan también fuera del timo. Así, algunos estados de activación llevan a la tolerancia que refleja tanto falta de reacción al antígeno como eliminación clonal, otros estados conllevan un cambio en el tipo de respuesta observada. Para las células TCD4^{+}, este cambio en el fenotipo funcional demuestra un modelo más restrictivo de producción de múltiples citoquinas. Por ejemplo, los clones de células T mantenidos mediante estimulación repetida in vitro tienen definidas dos categorías principales de células TCD4^{+} denominadas como los tipos celulares Th1 y Th2. El tipo celular Th1 principalmente interleuquina-2 (IL-2), interferón-\gamma (IFN-\gamma) y factor de necrosis tumoral (TNF), todos estos se denominan citoquinas inflamatorias. Por el contrario, las células tipo Th2 producen normalmente produce IL-4, IL-5, e IL-10 y son importantes para la producción de anticuerpos y para regulas la respuesta de las células tipo Th1.

Aunque esta marcada segregación en la producción de citoquinas no se ve a menudo durante la respuesta de las células T in vivo, la recuperación de cierto tipo de infecciones, como Leishmania, está asociada con una producción preferente de IL-2/IFN-\gamma). Los ratones que superan una respuesta Th2 a Leishmania no pueden contener la infección, y finalmente mueren. La producción incorrecta de citoquinas de las respuestas tipo Th2 se ha relacionado frecuentemente con las enfermedades de tipo alérgico tales como asma y sensibilidad por contacto. Para una revisión de la activación de las células TCD4^{+} y su papel en la enfermedad alérgica, véase Hetzel y Lamb, Clinical Immunol. Immunopath., 73:1-10 (1994).

Quizás, la asociación más fuerte entre enfermedad humana y distorsiones en el modelo de producción de citoquinas en la asociación de las respuestas Th1 y de las citoquinas tipo Th1 con la enfermedad autoinmune. Fuertes evidencias en modelos experimentales indican que muchos tipos de autoinmunidad, incluyendo diabetes, modelos experimentales de la esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, y similares, se median por células TCD4^{+} tipo Th1. La expresión de citoquinas asociadas a Th2, tales como IL-4, en estos modelos, interfiere con el desarrollo de la enfermedad autoinmune. Las citoquinas del tipo Th2 enmascaran la respuesta de las de las células del tipo mientras que las citoquinas del tipo Th1 antagonizan el desarrollo de las respuestas del tipo Th2.

En vista de la asociación de los subconjuntos de células T activados en estados de enfermedad concretos, sigue existiendo necesidad de ser capaz de dirigir la proliferación y activación de las citoquinas tipo Th1 a un subconjunto de células T deseado, un procedimiento que es extremadamente beneficioso para alterar el curso de la enfermedad. Una solución potencial es activar las células TCD4^{+} in vitro, aisladas en cebador lugar de un sujeto que pueda tener de forma opcional, bien un estado de falta de respuesta al anticuerpo o autoinmune para producir células que excreten un determinado perfil de citoquina. Las células T resultantes activadas se reintroducen posteriormente en el sujeto para alterar el curso de la enfermedad y quizás, para proporcionar una cura a largo plazo.

El desafío de este enfoque, ahora resuelto mediante la presente invención, es la dificultad de definir las condiciones de activación que permiten generar de forma reproducible subconjuntos de células TCD4^{+} que produzcan el perfil de citoquina terapéutico deseado. La expresión de citoquinas concretas está relacionada con una célula concreta que presenta un antígeno (APC) y sus moléculas ayudantes (asistentes) asociadas. Para una revisión de las proteínas superficiales que ayudan como moléculas ayudantes y están implicadas en la co-estimulación de células T, véase Mondino y Jenkins, J. Leukocyte Biol., 55:805-815 (1994). Puesto que ambas citoquinas producidas por la APC y por la expresión coordinada de las moléculas ayudantes están a la vez reguladas por múltiples factores, entre los que se incluyen el tipo de antígeno, la afinidad de la interacción entre el receptor de las células T y el antígeno, la concentración del antígeno y similar, la predicción del resultado de la activación de las células T tras la presentación del antígeno ha sido históricamente muy difícil. Por tanto, aunque se han propuesto otras moléculas ayudantes adicionales para el procedimiento de activación in vivo, es cada vez más evidente que muchas moléculas diferentes están implicadas en la regulación de las respuestas de las células T, y actúan en forma combinada para llevar a cabo la activación de las células T.

Antes de la presente invención, no había sido posible la co-expresión de moléculas MHC de tipo II seleccionadas junto con una o más moléculas ayudantes. La presente invención presenta ahora una solución para generar de manera predecible un fenotipo de célula T mediante la activación reproducible de células T para generar células T del tipo Th1 o Th2. La invención describe la generación de APC sintéticas que presentan, en un entorno neutro, moléculas MHC de tipo II en combinación con moléculas ayudantes definidas. Las MHC de tipo II y moléculas ayudantes definidas se expresan en una célula de insecto no mamífero, y pueden estar presente en una variedad de formas de APC sintético, incluyendo células de insecto que muestran las moléculas.

La ventaja de usar células de insecto como los vehículos de expresión y presentación de composiciones de moléculas MHC tipo II/ayudante es que las células no producen de forma endógena citoquinas reguladoras, y no expresan las moléculas ayudantes de mamífero. Esto supera la no predictibilidad inherente del uso de un APC de mamífero que exprese muchas moléculas que son capaces de alterar la respuesta de la célula T. Además, la expresión en un sistema de célula de insecto descrito en la presente invención proporciona la expresión de moléculas MHC de tipo II sin enlace peptídico (es decir, moléculas "vacías") que se pueden producir en ciertas condiciones restrictivas, tales como necesidades de temperatura. A temperaturas fisiológicas, estas moléculas "vacías" son normalmente incapaces de alcanzar la superficie celular de células como las de tipo II porque el enlace peptídico es muy termolábil. La invención utiliza la capacidad de las composiciones de MHC tipo II "vacías" para permitir la carga exógena de péptidos seleccionada junto con la capacidad de proporcionar contrapartes cargadas de forma endógena.

Se generó una molécula MHC de tipo I recombinante modificada con glicosil-fofatidilinositol (GPI) (HLA-A2.1:
GPI/\beta_{2}m) en el sistema de célula de insecto descrito más arriba para producir células que presentan antígenos tal como se describe en el Documento de Publicación Internacional WO 96/12009 de Tykocinski. En dicha publicación, las moléculas de MHC tipo I modificadas con GPI se aíslan a partir de la célula de insecto mediante purificación por afinidad para reincorporación posterior a membranas celulares. En otros aspectos, la publicación describe la preparación de una molécula de MHC tipo I modificadas con GPI co-anclada en una membrana celular con una molécula co-estimulante modificada con GPI B7.1. Aunque la publicación define que las moléculas de MHC tipo II modificadas con GPI se pueden preparar tal como se ha descrito para las MHC tipo I, la publicación no presenta detalles de dicha preparación.

Por el contrario, la presente invención proporciona y describe un medio único basado en la co-expresión de un haplotipo de MHC tipo II concreto junto con una o más moléculas ayudantes, tales como B7.1, para activar células TCD4^{+} dando como resultado la diferenciación de un conjunto particular de células T, Th1 o Th2, que consigan un perfil de citoquina preferido. La invención proporciona la ventaja de activar de manera selectiva las células TCD4^{+} in vitro hasta un subconjunto de células T para después permitir la reintroducción de las células T activadas en el paciente. La presente invención por tanto proporciona la capacidad de combinar la presentación individual de moléculas con moléculas ayudantes concretas para expresión en combinaciones seleccionadas que permitan la predicibilidad y la reproducibilidad de activar selectivamente las células TCD4^{+} a un subconjunto de células T deseado que no estaba disponible en otros enfoques.

Breve resumen de la invención

Se ha descubierto ahora que las moléculas MHC de tipo II recombinantes expresadas junto con moléculas ayudante seleccionadas, incluyendo moléculas co-estimulantes y moléculas de adhesión, son efectivas en la activación de células TCD4^{+} para convertirse en células T efectoras que reconocen células diana en las que se expresa el heterodímero MHC tipo II por complejación con el péptido. La activación se caracteriza por la proliferación y diferenciación en subconjuntos de células T efectoras, Th1 y Th2, que secretan citoquinas concretas. Las células T de tipo Th1 y Th2 se denominan células inflamatorias y células T-ayudantes, de manera respectiva.

Así, la presente invención se refiere a antígenos sintéticos presentes en células de insecto, denominadas también APC, para la producción y presentación a un mamífero, de manera preferible un ser humano, de una molécula de MHC tipo II en combinación con una o más moléculas ayudante para activar las células TCD4^{+}. La APC es como se define en la reivindicación 1.

La invención se refiere también a una matriz sintética de presentación del antígeno, tal como se define en la reivindicación 25. La matriz comprende un soporte y al menos una porción extracelular de una molécula MHC tipo II heterodímera enlazada de forma operativa al soporte y capaz de enlazarse con un péptido seleccionado. La matriz incluye también una molécula ayudante enlazada de forma operativa al soporte. La molécula ayudante interactúa con un receptor específico presente en la célula TCD4^{+}. Las moléculas MHC tipo II y ayudantes están presentes en cantidad suficiente para activar una población de células TCD4^{+} específicas de la combinación MHC tipo II/péptido cuando el péptido está enlazado a la parte extracelular de la molécula MHC.

Se ha encontrado que una matriz de presentación del antígeno que tenga tanto un heterodímero MHC tipo II o al menos una parte extracelular del mismo cargado con un péptido específico para dicho MHC, junto con un molécula ayudante, proporciona una reacción sinérgica para la activación de células TCD4^{+}. Entre los ejemplos de moléculas ayudante se encuentran moléculas co-estimulantes, que incluyen B7.1 y B7.2, moléculas de adhesión tales como al molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM-1) y el antígeno asociado a la función del linfocito (LFA-3), y moléculas de supervivencia tales como el ligando Fas (FasL) y CD70. En algunas formas de realización, se puede usar también la porción extracelular de dichas moléculas ayudante en la presente invención.

El soporte usado en la matriz puede tomar diferentes formas. Entre los ejemplos de soporte se incluyen soportes sólidos tales como metales o plásticos, materiales porosos tales como columnas de resina o celulosa modificada, microperlas, placas de microvaloración, glóbulos rojos, y liposomas.

Otro tipo de soporte es un fragmento de célula de insecto, tal como un fragmento de membrana celular. En esta forma de realización, las células se han transformado con uno o más vectores de expresión que contienen genes para la expresión de \alpha- y \beta-cadenas MHC tipo II junto con al menos una molécula ayudante. Las proteínas expresadas se transportan a continuación lasta la membrana celular, en el que la región transmembrana de las cadenas de tipo II proporcionan anclaje, permitiendo que el dominio extracelular se muestra en la superficie celular externa, creando de esta forma una matriz sintética de presentación del antígeno Los vectores de expresión contienen los genes seleccionados, de forma preferible en forma de secuencia de ADNc, enlazada de forma operativa a un promotor que puede ser tanto constitutivo como inducible.

Las \alpha- y \beta-cadenas MHC asociadas conjuntamente forman un heterodímero MHC tipo II que se enlaza con un péptido específico de dicho heterodímero. En la presente invención se contemplan dos procedimientos de cargar péptidos en los heterodímeros MHC tipo II. En una forma de realización, el péptido se carga de manera intracelular tras un procesado proteolítico de la proteína intacta internalizada en fragmentos de péptido. Los péptidos se cargan a continuación en moléculas MHC de tipo II nuevamente generadas mientras que permanecen en el interior de la célula. Alternativamente, las moléculas MHC de tipo II se expresan como moléculas vacías sobre la superficie celular y a continuación se cargan externamente los reactivos de péptido sintéticos o procesados, en el heterodímero MHC tipo II.

Se introducen también en la célula secuencias de nucleótido para codificar al menos un gen de molécula ayudante enlazado de forma operativa con un promotor en un vector. Tras la expresión, la molécula ayudante se ancla de manera coordinada sobre la superficie de la célula junto con el heterodímero MHC tipo II en número suficiente para activar una población de linfocitos TCD4^{+} específicos del complejo MHC tipo II/péptido. Se contemplan también otras moléculas denominadas como moléculas ayudantes al procesado del antígeno, para uso en la generación del APC recombínate. Estas moléculas se proporcionan bien por la célula usada como APC o exógenamente mediante un sistema de vector de expresión como el que se ha descrito más arriba. Entre estas moléculas ayudantes al procesado del antígeno se incluyen enzimas lisozimas de cadena invariante, y moléculas H2-M y H2-O.

La línea celular es sintética en que al menos uno de los genes descritos más arriba no está presente de manera natural en las células a partir de las que la línea se deriva. Se puede usar a este efecto un intervalo de especies. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 5.314.813 de Petersen y col., que describe numerosas especies para este uso. Las células de insecto preferidas incluyen Drosophila (mosca de la fruta) y Spodoptera (mariposa).

Las moléculas HMC tipo II se han expresado en células de insecto tales como células de Drosophila y Spodoptera. Puesto que estas células no tienen todos los componentes de un sistema inmunitario de mamífero, las diferentes proteínas implicadas en la maquinaria de carga del péptido están ausentes de dichas células. La falta de maquinaria de carga del péptido de mamífero permite que las moléculas MMC tipo II de mamífero introducidas se expresen en forma de células vacías en la superficie celular cuando las células se cultivan en condiciones restrictivas de temperatura termoestable, tal como a 28ºC. Por el contrario, a 37ºC, las moléculas de Tipo I vacías son termolábiles y tienden a desintegrarse. Así, incubando las células de Drosophila que expresan MMC tipo II con péptidos que se enlazan de manera específica con la molécula MMC tipo II anclada, virtualmente cada molécula de tipo II se carga con uno y solo un péptido. Más aún, la invención proporciona el medio para introducir cualquier tipo conocido de cadenas \alpha- y \beta- MMC tipo II en un vector de expresión superando de esta manera el límite inherente del número de moléculas MMC tipo II que se pueden expresar en un mamífero.

En la presente invención, una reacción sinérgica especialmente efectiva para impulsar las células TCD4^{+} en una respuesta de tipo Th1 caracterizada por un aumento en la citoquina interleuquina-2 (IL-2) da como resultado una célula de Drosophila presentadora de antígeno que tiene moléculas MMC tipo II enlazadas con un péptido, una molécula co-estimulante, y una molécula de adhesión. En particular, una reacción sinérgica muy efectiva de producción de IL-2 acoplada con la proliferación de CD4^{+} da como resultado la combinación de B7.2 y ICAM-1. Por el contrario, sin ICAM-1 pero con cualquiera de B7.1 o B7.2, el sistema APC de Drosophila cargado con péptido indujo una respuesta tipo Th2 caracterizada por un aumento en IL-4. Así, ICAM-1 antagoniza la respuesta tipo Th2 dando como resultado un fenotipo tipo Th1.

Un fenotipo tipo Th1 caracterizado por una producción de IL-2 acoplada con respuestas proliferativas es también el resultado de una célula de presentación de antígeno sintético que tiene CD70 expresado de manera simultánea con ICAM-1 con o sin B7.2.

Por tanto, la selección de los genes de MMC tipo II en combinación con al menos una molécula ayudante para la expresión del mismo en un APC de esta invención se puede hacer a medida dependiendo del resultado deseado para efectuar la proliferación y activación fenotípica de las células TCD4^{+}.

La presente invención se refiere también a los procedimientos para fabricar los sistemas APC sintéticos tal como se describe más arriba en el que se introduce al menos un vector de expresión que contiene genes de un heterodímero MMC tipo II y una molécula ayudante.

Se contemplan también procedimientos para producir células TCD4^{+} activadas in vitro. Un procedimiento preferido comprende poner en contacto, in vitro, células TCD4^{+} con un MMC tipo II sintético/molécula ayudante que soporta APC descrito más arriba durante un tiempo suficiente para activar, de forma específica para el antígeno, una población de células TCD4^{+}. El procedimiento puede adicionalmente comprender: (1) separar las células TCD4^{+} activadas de la matriz de presentación del antígeno, (2) suspender las células TCD4^{+} activadas en un vehículo o excipiente aceptable; y (3) administrar la suspensión a un individuo necesitado de tratamiento. Tal como se ha descrito más arriba, los antígenos puede comprender proteínas o polipéptidos nativos o no degradados o pueden comprender polipéptidos antigénicos que se han roto o sintetizado en fragmentos de péptido que comprenden al menos 8 residuos de aminoácido antes de la incubación en las moléculas MMC tipo II heterodiméricas de mamífero.

Además de la utilidad de ser capaz de dirigir la activación de células TCD4^{+} frente a un subconjunto de células T deseado tal como se ha descrito más arriba, la capacidad de expresar cualquier molécula de MHC tipo II proporciona el medio para identificar péptidos activadores de CD4^{+} específicos de esta moléculas MMC tipo II molécula MMC tipo II concreta. Como tal, la presente invención contempla la activación de moléculas MMC tipo II mediante la selección de una biblioteca de péptidos con un APC sintético que expresa un heterodímero MHC tipo II concreto.

En otra forma de realización, el sistema sintético descrito en el presente documento es útil para el aislamiento de células TCD4^{+} reactivas a partir de una población heteróloga de celular. Dicho aislamiento proporciona la capacidad de controlar las respuestas mediadas por las células TCD4^{+} que aparecen en los estados de enfermedad de un paciente.

En otra variación de lo anterior, a la vista de la capacidad de activar de manera selectiva las células TCD4^{+} en un subconjunto particular de células T para producir un perfil de citoquina preferido, la invención se refiere a los procedimientos para tratar dolencias en pacientes, mediadas por una respuesta CD4^{+} indeseada. Entre estas dolencias caracterizadas por una respuesta de tipo Th1- o Th2- se incluyen enfermedades autoinmunes, alergia y cáncer. La meta terapéutica es introducir células TCD4^{+} activadas respecto de un subconjunto de células T preferido para antagonizar una respuesta mediada por las células TCD4^{+}. De esta forma, el procedimiento comprende (1) obtener una muestra de fluido que contiene células TCD4^{+} latentes o inmaduras del paciente; (2) poner en contacto, in vitro, las células CD4^{+} con un APC sintético cargado con péptido de esta invención durante un periodo de tiempo suficiente para activar, de manera específica para el antígeno, las células TCD4^{+}; y (3), administrar al paciente las células TCD4^{+} activadas.

Otras formas de realización son evidentes para una persona experta en la técnica.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1C esquematizan la construcción de los plásmidos de expresión de expresión pRmHa-2 y pRmHa-3. En la Figura 1A se muestra la construcción de pRmHa-2; en la Figura 1A se muestra la construcción de pRmHa-3; y en la Figura 1A se muestra la construcción del vector pRmHa-3 mostrando los emplazamientos de restricción, polienlace, promotor y poliadenilación, así como el emplazamiento en el que se inserta la secuencia de nucleótidos para su expresión.

La Figura 2 muestra la respuesta proliferativa del receptor celular DO10 T (TCR) de una línea de celular de ratón transgénico (células Tg) cuando se cultiva en presencia de líneas celulares de Drosophila con o sin péptido ovoalbúmina (OVA) cargado en el heterodímero MHC tipo II expresado en la superficie. Se ensayó la proliferación tal como se describe en el Ejemplo 5. La proliferación se mide en cuantas por minuto (cpm) X 1000 tal como se representa en el eje Y aumentando las concentraciones de péptido OVA en mM en el eje X. La línea T-S (marcada con rombos) muestra las respuestas con un APC esplénico de control. Se muestran las respuestas proliferativas con MHC tipo II recombinante en solitario (línea con círculos cerrados). Aquellos con MHC tipo II combinados con cualquiera de las moléculas coestimulantes B7.1 o B7.2 se muestran con líneas de cuadrados abiertos y cerrados.

La Figura 3 muestra respuestas proliferativas frente al MHC tipo II recombinante en solitario (línea con círculos cerrados) con MHC tipo II más B7.2 (línea de cuadrado cerrado), con MHC tipo II más ICAM-1 (línea de triángulo abierto) y con MHC tipo II más B7.2 y ICAM-1 (línea de rombo abierto). Para otros detalles, ver la leyenda de la Figura 2.

Las Figuras 4A-4D muestran respectivamente el perfil de citoquina producido en respuesta a la activación de células TCD4^{+} cuando se cultivan en presencia de APC de Drosophila con MHC tipo II recombinante en solitario o en combinación con moléculas coestimulante B7.1 o B7.2. El APC esplénico (marcado como T-S) son los ensayos de control. Los ensayos se llevaron a cabo tal como se describe en el Ejemplo 5. Las Figuras 4A-4D respectivamente muestran las citoquinas I1-2, I1-4, IFN-y I1-10 tal como se representa en el eje Y. Se evaluaron los perfiles de citoquina a lo largo de tres días entre los días 3 y 5 de cultivo.

Las Figuras 5A-5D muestran el perfil de citoquina en respuesta a la activación de las células TCD4^{+} cuando se cultivan en presencia de APC de Drosophila con MHC tipo II recombinante en solitario o en combinación con la molécula coestimulante B7.2; ICAM-1 y con B7.2 y ICAM-1. Las Figuras 5A-5D respectivamente muestra las citoquinas I1-2, I1-4, IFN-y 1-10 en ng/ml tal como se representa en el eje Y. Para otros detalles, ver la leyenda de la Figura 4.

Descripción detallada de la invención A. Definiciones

Residuo de aminoácido: un aminoácido formado por la digestión química de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Los residuos de aminoácido descritos en el presente documento están preferiblemente en la forma isómera "L". Sin embargo, los residuos en la forma isómera "D" pueden sustituir cualquier residuo de L-aminoácido, siempre que la propiedad ad funcional deseada quede retenida en el polipéptido. NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en el término amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxílico libre en el término carbociclo del polipéptido. Para mantener la nomenclatura convencional de polipéptidos (descrita en J. Biol. Chem., 243:3552-3559 (1969) y adoptada en el Documento 37 CFR \NAK1.822(b) (2)), las abreviaturas de los residuos de aminoácido se muestran en la siguiente Tabla de Correspondencia.

TABLA DE CORRESPONDENCIA

1

Debe notarse que todas las secuencias de residuo de aminoácido representadas en el presente documento mediante fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional desde el término amino al término carbonilo. Además, la frase "residuo de aminoácido" se define ampliamente para incluir los aminoácidos relacionados en la Tabla de Correspondencia y aminoácidos modificados y no usuales, tales como los que se relacionan en 37 CFR 1.822(b) (4). Además, debe notarse que un punto al inicio y final de la secuencia de residuos de aminoácido indica un enlace peptídico a otra secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácido o un enlace covalente a un grupo amino-terminal tal como NH_{2} o acetilo, o con un grupo carboxi-terminal tal como COOH.

Molécula de ADN recombinante (ADNr): Una molécula de ADN producida mediante enlace operativo de dos fragmentos de ADN. Así, una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN híbrido que comprende al menos dos secuencias de nucleótido que no se encuentran habitualmente en la naturaleza. Los ADNr que no tienen un origen biológico común, es decir, diferentes desde el punto de vista de la evolución, se denominan "heterólogos".

Vector: una molécula de ADNr capaz de replicación autónoma en una célula, y al que se puede enlazar de forma operativa un segmento de ADN, por ejemplo, un gen o polinucleótido, de forma que proporcione la replicación de dicho segmento. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes que codifican uno o más polipéptidos se denominan en el presente documento como vectores de expresión.

Corriente arriba: en dirección opuesta a la dirección de transcripción de ARN, y por tanto va de 5' a 3' en la cadena no codificante o de 3' a 5' en el ARNm.

Corriente abajo: adicionalmente en una secuencia de ADN en la dirección de la transcripción o lectura de la secuencia, esto es, viajando en dirección 3' a 5' en la cadena no codificante del ADN y en dirección de 3' a 5' a lo largo del transcripto de ARNm.

Marco de lectura: una secuencia concreta de tripletes de nucleótidos contiguos (codones) empleado en la traducción que defina la porción del gen que codifica la estructura de proteína, o gen estructural. El marco de lectura depende de la localización del codón de inicio de traducción.

Polipéptido: Una serie lineal de residuos de aminoácido conectados entre sí con enlaces peptídicos entre el grupo alfa-amino y el grupo carboxilo de los residuos de aminoácido contiguos.

Proteína: Una serie línea de más de 50 residuos de aminoácido conectados entre sí con enlaces peptídicos.

Receptor: un receptor es una molécula, como una proteína, glicoproteína y similar, que se enlaza de manera específica (no aleatoria) con otra molécula.

Sustancialmente puro o aislado: cuando se usa en el contexto de polipéptidos o proteínas, el término describe estas moléculas que se han separado de los componentes que normalmente les acompañan. Normalmente, una proteína monomérica es sustancialmente pura cuando al menos entre aproximadamente 60% y 75% de una muestra presenta un único esqueleto de polipéptido. Variantes menores o modificaciones químicas comparten normalmente la misma secuencia de polipéptido. Una proteína sustancialmente purificada comprenderá entre aproximadamente 85% y 90% de una muestra de proteína, más usualmente aproximadamente 95%, y preferiblemente sobre aproximadamente 99% pura. La pureza de la proteína o polipéptido o la homogeneidad se puede indicar mediante varios medio bien conocidos en la técnica, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra, seguido por visualización de la misma por tinción. Para algunos propósitos, se necesita alta resolución y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), o un medio similar de purificación.

Péptido sintético: una cadena químicamente producida de residuos de aminoácido conectados entre sí con enlaces peptídicos que está libre de proteínas de aparición natural y fragmentos de las mismas.

B. Heterodímeros MHC Tipo II, Moléculas ayudantes y Moléculas que ayudan al procesado de antígenos

La presente invención se refiere a un sistema sintético de presentación de antígeno para uso en la activación de células TCD4^{+}. A pesar de que el catálogo de células T se conforma ampliamente durante el desarrollo de células T en el timo, las células TCD4^{+} maduras se regulan también fuera del timo. Así, algunos estados de activación llevan a la tolerancia que refleja tanto falta de reacción al antígeno como eliminación clonal, otros estados conllevan un cambio en el tipo de respuesta observada. Para las células TCD4^{+}, este cambio en el fenotipo funcional demuestra un modelo más restrictivo de producción de múltiples citoquinas. Por ejemplo, los clones de células T mantenidos mediante estimulación repetida in vitro tienen definidas dos categorías principales de células TCD4^{+} denominadas como los tipos celulares Th1 y Th2. El tipo celular Th1 principalmente interleuquina-2 (IL-2), interferón-\gamma (IFN-\gamma) y factor de necrosis tumoral (TNF), todos estos se denominan citoquinas inflamatorias. Como tal, las células TH1 se denominan a veces células T inflamatorias que a continuación activan macrófagos para matar los patógenos intravesiculares que albergan tal como se media mediante péptidos generados a partir del procesamiento de proteínas patogénicas presentes en las células TCD4^{+}. Por el contrario, las células tipo Th2 producen normalmente produce IL-4, IL-5, e IL-10 y son importantes para la producción de anticuerpos y para regular la respuesta de las células tipo Th1. Como tal, las células TH2 se denominan a veces como células ayudantes T que activan las células B para fabricar anticuerpos en respuesta a los péptidos derivados de patógenos y toxinas extracelulares que están presentes en las células TCD4^{+}.

Se define una célula TCD4^{+} como una célula T o un linfocito T que tiene el co-receptor CD4^{+} en su superficie junto con la presencia de cualquiera de los receptores heterodiméricos \alpha:\beta o \gamma:\Delta asociados con las proteínas del complejo CD3.

La activación de subconjuntos de células TCD4^{+} se caracteriza por la proliferación de la población de células T de respuesta coordinada con la producción seleccionada de citoquinas tal como se describe más arriba dependiendo del tipo de estimulación inducida por una célula presentadora de antígeno Esto último se define como una célula muy especializada que procesa antígenos y presenta sus fragmentos de péptido sobre la superficie celular junto con las moléculas necesarias para la activación de los linfocitos. La especificidad de la activación de las células TCD4^{+} está basada en el reconocimiento que realiza el receptor del antígeno de la célula T (TCR) de los péptidos antígenos enlazados con los heterodímeros MCH de Tipo II sobre la superficie de las células que presentan el antígeno (APC). El APC principal de las células T son células dendríticas, macrófagos y células B. Además, las señales co-estimulantes no antigénicas derivadas de APC tienen un papel en la activación de las células TCD4^{+}.

La presente invención utiliza un sistema sintético de presentación de antígenos basado en los mecanismos de respuesta inmune natural descritos más arriba para manipular la activación de células TCD4^{+} mediante moléculas recombinantes MHC de tipo II junto con uno o más moléculas ayudantes que se denominan ampliamente como moléculas co-estimulantes. Esto último incluye moléculas co-estimulantes específicas, moléculas de adhesión y moléculas de supervivencia, y similares. En otros aspectos de la invención, el sistema sintético de presentación de antígenos contiene además una molécula ayudante del procesado de antígenos que son útiles para generar las moléculas MHC de tipo II cargadas con péptido. En el contexto de esta invención, el sistema sintético de presentación de antígenos es útil para la activación de células TCD4^{+} in vitro e in vivo. Estos aspectos se describen en el Apartado E de Procedimiento de alterar las respuestas de las células TCD4^{+}.

Así, como se ha mencionado más arriba, el sistema sintético de presentación de antígenos de la presente invención tiene al menos dos componentes principales. El cebador componente es al menos las partes extracelulares de un heterodímero recombinante MHC tipo II que es capaz de enlazarse con un péptido que proporciona la especificidad de la activación de la activación de las células CD4^{+} mediante un sistema por reconocimiento del TCR. El segundo componente principal es al menos la porción extracelular de al menos una molécula ayudante que proporciona una señal co-estimulante no antigénica en la activación de las células TCD4^{+}. En otras formas de realización, se usan las moléculas completas del sistema de presentación de antígenos y las señales co-estimulantes no antigénicas.

Para facilidad de la descripción, los heterodímeros MHC tipo II de describirán de manera general, con la comprensión de que se puede usar una porción extracelular de la molécula MHC en algunos aspectos de la invención. La porción de la molécula MHC necesaria para la presente invención es la parte que se enlaza con el péptido antigénico para la presentación a las células TCD4^{+}.

La presente invención permite que los heterodímeros recombinantes MHC tipo II se produzcan mediante células de presentación del antígeno sintético transformadas por vectores con el péptido ya complejado con el heterodímero MHC tipo II. Alternativamente, los heterodímeros MHC tipo II vacíos se producen de forma que ya no tengan con ellos el péptido complejado. Esta última forma de realización resulta particularmente útil puesto que permite la complejación con un péptido particular o para selección de una biblioteca de péptidos tras la expresión de los heterodímeros MHC tipo II.

1. Genes y heterodímeros codificados MHC Tipo II

Las moléculas MHC de tipo II son glicoproteínas de la superficie celular que consisten de un complejo no covalente de dos cadenas, \alpha y \beta, ambas de las cuales atraviesas la membrana. Se forma una clave de enlace peptídico que enlaza las cadenas cooperativas. Los péptidos que se enlazan con las moléculas MHC de tipo II tienen longitud variable y tienen residuos ancla que permanecen a diferentes distancias a partir del pliegue que no están fuertemente enlazados con la clave de enlace peptídico del pliegue. Consultar Janeway y Travers, Immunobiology, Sección 4-4, Current Biology LTD, 2ª ed., 1996. Otros aspectos de los péptidos antigénicos presentes se describen en el Apartado D.

In vivo, los heterodímeros MHC tipo II permanecen desestabilizados, y por tanto se eliminar posteriormente de la superficie celular, evitando de esta forma que las moléculas MHC capten péptidos del fluido extracelular de alrededor que afectarían de manera perjudicial la especificidad de la célula T. En la presente invención, el sistema celular que presenta el antígeno sintético permite la producción de heterodímeros MHC tipo II vacíos sobre la superficie celular que no son sujeto de episodios de desestabilización. Como consecuencia, la carga de un péptido antigénico sobre un heterodímero recombinante MHC tipo II que se expresa sobre la superficie celular se facilita por el uso posterior den la manipulación de la activación de CD4^{+} y producción de citoquina.

La presente invención, se facilitan las combinaciones concretas de una molécula de MHC tipo II seleccionada con un antígeno coordenado mediante las secuencias de nucleótido de consenso en los genes MHC tipo II. Estas regiones, que se describen en detalle más adelante, permiten la recuperación y uso de múltiples genes MHC tipo II del complejo MHC en mamíferos así como en los múltiples alelos de cada gen. En otras palabras, MHC es ala vez poligénico y polimórfico, teniendo varios genes y múltiples alelos de cada gen.

En seres humanos, el MHC se denomina HLA, mientras que en ratón se denomina como H-2. Se han diseñado tres pares de \alpha y \beta-cadenas de MHC tipo II en seres humanos que se han designado HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR. El cluster HLA-DR contiene un gen extra a la \beta-cadenas. Así, los tres conjuntos de genes dan lugar cuatro tipos de moléculas MHC de tipo II. Se dice que los genes MHC tipo II y las \alpha y \beta-cadenas codificadas que se obtienen a partir de genes humanos tienen origen humano En los ratones, los genes de tipo MHC se denominan H2-M, H2-A y H2-E. Como cada molécula de MHC tipo II se enlaza con un intervalo distinto de péptidos, la presencia de múltiples loci de gen proporciona a un individuo la capacidad de presentar un amplio intervalo de péptidos diferentes de los que sólo uno de cada clase de moléculas MHC de tipo II se expresa en la superficie celular.

Aunque los genes polimórficos MHC tipo II codifican proteínas correspondientes que varían únicamente en uno o pocos aminoácidos, las diferentes variantes alélicas difieren en hasta 20 aminoácidos. Como resultado, los MHC tipo II expande diversamente la capacidad de reconocimiento de antígenos mediante las células T. Más aún, mediante restricción MHC, se ha demostrado que las células T reconocen péptidos en el contexto de una molécula MHC concreta, pero no cuando está presente en otra. Así, la especificidad del receptor de la célula T se consigue tanto mediante el péptido como mediante la molécula MHC que se enlaza con él.

Los heterodímeros MHC tipo II de esta invención que contienen \alpha y \beta-cadenas seleccionadas se obtienen por amplificación de los genes que codifican MHC tipo II y las variantes alélicas de los mismos con especificación de dejadores de oligonucleótido. Las secuencias de nucleótido de los cebadores permiten la amplificación de de la diversidad de genes MHC tipo II y las variantes alélicas de los mismos basándose en las secuencias de nucleótido de consenso 5' y 3' presentes en los mismos genes dentro de la categoría de genes. Las secuencias de nucleótido específicas de los pares de cebadores para amplificar las cadenas \alpha y \beta de los genes HLA-DP, -DQ y -DR humanos, así como los que amplifican los heterodímeros que codifican murina IA^{d} se presentan en el Ejemplo 2A.

Los genes que codifican MHC tipo II se pueden amplificar a partir de una variedad de fuentes celulares que incluyen células B, macrófagos y células dendríticas, todas ellas presentes en la sangre. Las condiciones de amplificación para obtener genes que codifican MHC tipo II con los cebadores se describen en el Apartado C.

Las \alpha y \beta cadenas que comprenden los heterodímeros MHC de esta invención son útiles en forma tanto anclada como soluble. En la forma anclada, el heterodímero recombinante MHC se ancla al sistema celular que presenta el antígeno sintético a partir del cual se expresa. De manera alternativa, un heterodímero recombinante MHC se ancla a una matriz que comprende un soporte tal como se describe en esta invención tras su secreción en forma soluble. Esto último se genera cuando se diseña un codón de detención durante el procedimiento de amplificación, o posterior a este en la secuencia de nucleótidos que clonifica las \alpha y \beta cadenas del MHC tipo II que preceden la región transmembrana.

2. Genes ayudantes y moléculas codificadas

Las moléculas ayudante de esta invención, incluyendo moléculas co-estimulantes, moléculas de adhesión y moléculas de supervivencia son efectivas en concierto con el heterodímero MHC tipo II complejado con el péptido en la activación de las células TCD4^{+} que reconocen células diana. Las células T inmaduras se activan para proliferar y diferenciarse en células T efectoras armadas cuando se encuentran su antígeno específico cuando se presenta mediante un heterodímero MHC tipo II cargado con péptido en la superficie de un APC. La activación no solo requiere el reconocimiento de un fragmento de péptido extraño enlazado con un heterodímero MHC tipo II, sino que también necesita la liberación simultánea de una señal co-estimulante expresada concurrentemente en el APC.

Así, el APC sintético o las matrices de esta invención se caracterizan no solo por la presencia de un heterodímero MHC tipo II particular, sino también por la presencia de una o más moléculas co-estimulantes que se definen ampliamente como moléculas ayudante. Se contemplan al menos tres tipos de moléculas ayudante, incluyendo moléculas co-estimulantes, moléculas de adhesión y moléculas de supervivencia para uso en la preparación del APC sintético o las matrices de esta invención.

A. Moléculas co-estimulantes

Un cebador tipo de molécula ayudante está compuesto por moléculas co-estimulantes tales como B7.1 (anteriormente conocidas como B7 y también conocidas como CD80) y B7.2 (también conocidas como CD86) que se enlazan con CD28 en las células T. B7.1 y B7.2 son glicoproteínas estructuralmente relacionadas que son miembros homodiméricos de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Otras moléculas co-estimulantes son anticuerpos anti-CD28 o las porciones funcionales que se enlazan con CD28. El enlace de las CD28 con las moléculas anteriores se ha demostrado que co-estimula el crecimiento de las células T inmaduras. Tras la activación de las células T, un receptor adicional, CTLA-4, se enlaza con las moléculas B7 con mayor afinidad que con CD28.

Las moléculas co-estimulantes B7 recombinantes para uso con el APC sintético o las matrices de esta invención se obtienen mediante PCR tal como se ha descrito para las moléculas MHC de tipo II. Los cebadores oligonucleótidos preferidos y las fuentes celulares para la amplificación a partir de los anteriores se describen en el Ejemplo 2C.

b. Moléculas de adhesión

Otro tipo principal de molécula ayudante de la presente invención es una molécula de adhesión que funciona también en la activación de las células T. Las moléculas de adhesión ayudantes incluyen las diferentes moléculas ICAM que incluyen las moléculas de adhesión intercelulares (ICAM) ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, antígeno asociado a la función del leucocito (LFA) LFA-1 y LFA-3. Todas estas moléculas son miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Todos los miembros relacionados con ICAM se enlazan con la integrina de la célula T, LFA-1. Además de expresarse en APC que incluye células dendríticas, macrófagos y células B, las ICAM-1 y ICAM-2 se expresan también en el endotelio, mediando de esta manera la adhesión celular y la posterior extravasación entre los leucocitos circulantes y el endotelio. El ICAM-3, sin embargo, solo se expresa en leucocitos y se cree que juega un papel importante en la adhesión entre las células T y el APC.

La interacción entre ICAM-1, -2 y -3 sinergiza con una segunda interacción adhesiva entre LFA-3 (CD58) y LFA-2 (CD2) que se expresan de forma respectiva en un APC y la superficie de la célula T.

Las moléculas de adhesión recombinantes para uso con el APC sintético o las matrices de esta invención se obtiene mediante PCR tal como se ha descrito para las moléculas MHC de tipo II. Los cebadores oligonucleótidos preferidos y las fuentes celulares para la amplificación a partir de los anteriores se describen en el Ejemplo 2C.

c. Moléculas de supervivencia

Una molécula de supervivencia es otro tipo de molécula ayudante que juega un papel en las respuestas metabólicas que oscilan entre estimulantes e inductoras de la muerte celular. Así, una molécula de supervivencia puede denominarse también como una molécula reguladora de la muerte celular. Una molécula de supervivencia es habitualmente una proteína, pero puede incluir otros tipo de macromoléculas tales como carbohidratos, lípidos y similares. Las moléculas de supervivencia para uso en las composiciones y procedimientos de esta invención incluye el ligando Fas, el receptor TNF, TNF, CD70, una proteína transmembrana de Tipo II que es un miembro de la familia TNF que se enlaza con CD27, un miembro de la familia de los receptores TNF. El ligando Fasse enlaza con el recepto denominado Fas, y la ocupación del receptor da como resultado la inducción de muerte celular apoptótica de la célula que expresa el receptor Fas. CD27 se expresa sobre células T y células B latentes, mientras que CD70 se expresa sobre células T y células B activadas. En enlace de CD70 con su receptor, CD27, induce la coestimulación de células T y la interacción puede ser importante para el reclutamiento de células T desde el conjunto de células T no cebadas. En otras condiciones, la activación del receptor TNF mediante TNF da como resultado una respuesta similar.

Las moléculas de supervivencia recombinantes descritas más arriba para uso con el APC sintético o las matrices de esta invención se obtiene mediante PCR tal como se ha descrito para las moléculas MHC de tipo II. Los cebadores oligonucleótidos preferidos y las fuentes celulares para la amplificación a partir de los anteriores se describen en el Ejemplo 2C.

Tal como se muestra en los Ejemplos, las combinaciones concretas de un péptido enlazado con una molécula recombinante de MHC tipo II usado en conjunto con una o más de las moléculas ayudante recombinantes descritas más arriba activa las células T en células T efectoras armadas que se pueden clasificar entre células T inflamatorias Th1 y células T ayudantes Th2.

3. Antígenos que procesas genes asistentes y moléculas codificadas a. HLA-DM

Las HLA-DM en seres humanos y H2-M en ratones son moléculas simulares a MHC tipo II que se codifican también mediante clústeres de genes MHC tipo II. HLA-DM, al igual que MHC tipo II, contiene ambas cadenas génicas \alpha y \beta que forman un Sin embargo, a diferencia de las moléculas MHC tipo II, no se necesitan cargas de péptido para estabilizar la molécula. HLA-DM facilita la carga de péptidos sobre los heterodímeros MHC tipo II recientemente formados tras la eliminación de la cadena invariante como se describe en detalle más adelante. HLA-DM recombinantes se contempla para uso en las composiciones y procedimientos de esta invención para ayudar en la carga de péptidos internamente procesados.

b. Cadena invariante

La cadena invariante es una proteína especializada que se enlaza con los heterodímeros MHC tipo II recientemente formados formando un trímero con cada subunidad de heterodímero MHC tipo II. La molécula trimerizada evita la carga de péptidos intracelulares presentes en el retículo endoplasmático, pero también facilita la salida de la molécula desde dicho compartimento. Después, la cadena invariante se rompe a través de múltiples etapas dando como resultado un heterodímero MHC tipo II que se puede complejar con péptidos procesados.

Así, la cadena invariante se contempla para uso en el APC sintético o las matrices de esta invención para ayudar en la carga de péptidos procesados internamente.

C. Ácidos nucleicos y polinucleótidos 1. PCR para obtener genes que codifican mhc tipo ii y moléculas ayudantes

Las secuencias de ácido nucleico que codifican moléculas MHC de tipo II, moléculas ayudantes y moléculas ayudantes al procesado de antígenos de esta invención se obtiene en un número de formas familiares para las personas normalmente expertas en la técnica, incluyendo la síntesis directa, clonado, purificación de ADN a partir de células que contienen dichos genes, y similar. Un medio expeditivo de obtener genes para dosificar las usadas en las composiciones y los procedimientos descritos en el presente documento es la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de plantillas de ácidos nucleicos seleccionados con pares de cebadores de oligonucleótido como se describe con más detalle a continuación.

Está publicado el antígeno del leucocito humano (HLA) (conocido, parcial y putativo), la designación genética del MHC humano, aminoácidos y secuencias de nucleótido, incluyendo la secuencia de consenso (véase, por ejemplo, Zemmour y Parham, Immunogenetics 33: 310-320 (1991)), y se conocen las líneas celulares que expresan variantes de HLA y por lo general están disponibles, muchas de ellas del American Type Culture Collection ("ATCC"). Por tanto, usando la PCR, las secuencias de nucleótido que codifican MHC tipo II se pueden enlazar de manera operativa fácilmente en un vector de expresión de esta invención que a continuación se usa para transformar una célula apropiada para su expresión en la misma.

Los procedimientos particularmente preferidos para producir las moléculas recombinantes de la presente invención se basan en el uso de oligonucleótidos preseleccionados como cebadores PCR para formar productos de reacción PCR tal como se describe en el presente documento.

Si se va obtener un gen mediante amplificación PCR, en general, se usan dos cebadores que comprenden un par de cebadores PCR para cada cadena de ácido nucleico a amplificar. Por causa de simplicidad, se describe la síntesis de los genes que codifican un heterodímero MHC tipo II de ejemplo, pero debe entenderse expresamente que el procedimiento de amplificación PCR descrito se puede aplicar de forma análoga a la síntesis de variantes alélicas de MHC tipo moléculas ayudantes y moléculas ayudantes al procesado de antígenos, incluyendo aquellas secuencias completas que sean desconocidas en la actualidad.

Por lo general, un cebador se refiere al cebador hacia adelante o cebador 5', ya que tiene la misma secuencia de la cadena superior de la plantilla de ADN, y por tanto se híbrida hasta la cadena complementaria del fondo.

Un segundo cebador se refiere al cebador hacia atrás o cebador 3', ya que tiene la misma secuencia de la cadena del fondo de la plantilla de ADN, y por tanto se híbrida hasta la cadena complementaria de la parte superior. Habitualmente, en otras palabras, un cebador es complementario de la cadena negativa (-) o del fondo de la secuencia de nucleótidos y el otro es complementario de la cadena positiva (+) o cadena superior.

En aspectos preferidos, tanto el cebador como es segundo se eligen para hibridarse con (es decir, ser complementario a) regiones conservadas en los genes MHC tipo II. Sin embargo, se pueden diseñar cebadores para amplificar determinados genes específicos MHC tipo II y variantes alélicos de la misma hibridando unas secuencia única en lugar de la secuencia de consenso. Para este aspecto, la secuencia plantilla se conoce preferiblemente para el diseño de estos dos cebadores pares.

Uno o ambos de los cebadores y segundo se pueden diseñar para introducir en el producto amplificado una secuencia de nucleótidos que define un emplazamiento de reconocimiento de la endonucleasa. El emplazamiento puede ser heterólogo para el gen MHC tipo II que está siendo amplificado, y habitualmente aparece en, o cerca de, extremo 5' del cebador. Puede ser también una ayuda colocar una secuencia separadora de 4 bases próxima al emplazamiento de restricción para mejorar la eficiencia de los procuctos de amplificación cortados con enzimas.

Los cebadores de la invención para aislar secuencias de nucleótido específicas incluyen oligonucleótidos de longitud suficiente y secuencia apropiada de manera que proporcione una iniciación especifica de la polimerización en un número significativo de ácidos nucleicos con la correspondiente secuencia de nucleótido. Específicamente, el término oligonucleótido cebador tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres, y más preferiblemente alrededor de 20, la secuencia del cual es capaz de inicial la síntesis de un producto de extensión del cebador.

Las condiciones experimentales que llevan a la síntesis incluyen la presencia de trifosfatos de nucleósido y un agente para la polimerización y extensión, tal como polimerasas termoestables, y un tampón, temperatura y pH adecuados. El cebador es, de forma preferible, de cadena sencilla para una máxima eficiencia en la amplificación pero puede ser de doble cadena. Si es de doble cadena, en primer lugar el cebador se trata para separar las dos cadenas antes de usarse en la preparación de productos de amplificación. Preferiblemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser lo suficientemente largo y sustancialmente complementario para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor de la polimerización y extensión de los nucleótidos. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, que incluyen temperatura, tampón y composición de nucleótidos. El oligonucleótido cebador contiene habitualmente 15-22 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos. Alternativamente, tal como se conoce bien en la técnica, la mezcla de trifosfatos de nucleósido se puede sesgar para influenciar la formación de mutaciones para obtener una biblioteca de moléculas que codifican MHC tipo II recombinante para uso en la presentación de péptidos únicos a las células TCD4^{+}.

Los oligonucleótidos cebadores de la invención se emplean en el procedimiento de amplificación PCR, que es una reacción enzimática en cadena que produce cantidades exponencialmente crecientes de una secuencia de nucleótidos. Templando los cebadores a ácidos nucleicos desnaturalizados seguidos por la extensión con una polimerasa termoestable tal como Thermophilus aquaticus (tag) y Pyrococcus furiosus (Pfu) (Hoffman La-Roche, Basal, Suiza), y nucleótidos, da como resultado cadenas (+) y (-) sintetizadas de nuevo. Puesto que estas secuencias recientemente sintetizadas son también plantillas, los ciclos repetidos de desnaturalización, templado de cebadores y extensión da como resultado la producción exponencial de in fragmento de ADN definido por los cebadores. El producto de la reacción en cadena es un duplex discreto de ácido nucleico con términos correspondientes a los finales de los cebadores específicos empleados. Aquellas personas expertas en la técnica conocerán otras metodologías de amplificación que se pueden también utilizar para incrementar el número de copias de los ácidos nucleicos diana. Estos pueden incluir, por ejemplo, transcripción activada por el ligando (LAT), reacción en cadena de la ligasa (LCR) y activación por desplazamiento de cadena (SDA), aunque la PCR es procedimiento preferido tal como se describe en las Patentes de los Estados Unidos citadas más adelante.

Los oligonucleótidos cebadores de la invención se puede preparar usando cualquier procedimiento convencional, tal como los procedimientos convencionales del fofotriester y fofodiester tal como se han descrito más arriba para la síntesis de oligonucleótidos complementarios, o formas de realización automatizadas de las mismas. Un procedimiento para sintetizar oligonucleótidos en un soporte sólido modificado se describe en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.458.066.

Los cebadores preferidos para amplificar los genes MHC tipo II, los genes de moléculas ayudantes, y genes de moléculas que ayuda al procesado de antígenos se describen en el Ejemplo 2.

Los procedimientos de amplificación PCR se describen en detalle en las Patentes de los Estados Unidos con números 4.683.192, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188 y 5.395.750, y en al menos varios textos entre los que se incluyen "PCR Technology: Principles and Applications for DNA amplificación", H. Erlich, ed., Stockton Press, Nueva York (1989); y "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis y col., eds., Academic Press, San Diego, California (1990). Varios de los procedimientos y cebadores usados en el presente documento se describen en Zemmour, y col., Immunogenetics, 33:310-20 (1991), por Ausebel, y col., en Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, Nueva York (1993) y por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989). Los procedimientos concretos de PCR que incluyen PCR anidado, PCR solapante, PCR de transcriptasa reversa y similares, son bien conocidos por una persona experta en la técnica, y se contempla para uso en la obtención de las moléculas recombinantes de esta invención.

En formas de realización alternativas, el procedimiento PCR usado no solo produce una variedad de moléculas que codifican MHC tipo II, sino que también pueden inducir mutaciones que pueden emular las observadas en los loci MHC muy polimórficos, o para crear diversidad a partir de un único clon parental y producir de esta manera una "biblioteca" de ADN que codifica un MHC tipo II que tenga una mayor heterogeneidad.

2. Vectores de expresión

La presente invención contempla vectores de expresión de plásmidos de expresión en forma sustancialmente pura capaz de dirigir la expresión de los genes que codifican MHC tipo II, genes de moléculas ayudante y genes que asisten al procesado de los antígenos para producir las correspondientes proteínas recombinantes. Por simplicidad, los genes anteriores se denominan colectivamente en el presente documento como secuencias de nucleótido que codifican polipéptidos. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados de forma operativa se denominan en el presente documento como " vectores de expresión" o "plásmidos de expresión de expresión", y ambos, como "plásmidos".

Tal como se usa en el presente documento, el término "vector" o "plásmido" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar entre diferentes entornos genéticos otro ácido nucleico al que está enlazado de forma operativa. Los vectores preferidos son aquellos capaces de una replicación y expresión autónoma de los productos de gen estructural presentes en los segmentos de ADN a los cuales están enlazados de forma operativa. Los vectores, por tanto, contienen preferiblemente los replicones y marcadores que se pueden seleccionar que son compatibles con el sistema de selección del huésped. Un tipo de vector preferido es un episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación extracromosómica.

Un plásmido de esta invención es un plásmido circular de doble cadena que contiene al menos una región de regulación que tiene elementos capaces de activar la transcripción de las secuencias de nucleótido que codifican el polipéptido traducible de esta invención. El plásmido contiene además una secuencia de nucleótidos traducible a partir de la cual se expresas los polipéptidos codificados deseados de esta invención. Así, se supone que los vectores son capaces de dirigir la expresión de los polipéptidos recombinantes descritos en el presente documento, codificados mediante los correspondientes genes que se pueden expresar.

Un vector preferido para uso de acuerdo con la presente invención plásmido; más preferiblemente, se trata de un plásmido de número elevado de copias. Se prefiere también que el vector de elección esté bien adecuado para la expresión en el huésped elegido.

Dichos vectores de expresión contienen una secuencia promotora en la región de regulación que facilita la transcripción eficiente de una secuencia genética insertada en el huésped. Preferiblemente, el vector contiene una secuencia promotora inducible, ya que los promotores inducibles tienden a limitar la presión de selección contra las células en las cuales se han introducido dichos vectores (que a menudo están construidos para transportar secuencias de nucleótidos no nativos o quiméricos). El vector de expresión también contiene habitualmente un origen de replicación así como genes específicos que permiten la selección fenotípica de las células transformadas. El segmento de ADN puede estar presente en el vector enlazado de forma operativa (también se dice operable) con elementos de regulación, por ejemplo, un promotor (por ejemplo, T7, metalotioneína I, o promotores de polihedrina).

En una forma de realización distinta, un plásmido contiene también un gen, la expresión del cual confiere una ventaja selectiva, tal como la resistencia a fármacos, a una célula huésped cuando se introduce o transforma en el interior de la célula. Los genes típicos de resistencia a los fármacos en eucariota o procariotas confieren resistencia a la ampicilina o tetraciclina y a la neomicina (G418 o Geneticina). Otros marcadores de resistencia a fármacos incluyen cloranfenicol, kanamicina, estreptomicina, carbenicilina, mercurio, rifampcina, rifampicina, ácido fusárico, y similares.

La elección del vector al que las región de regulación y las secuencias de nucleótido para codificar polipéptidos de la presente invención están enlazados de forma operativa depende directamente, como se conoce bien en la técnica, de las proteínas funcionales deseadas, siendo estas limitaciones inherentes a la técnica de construcción de moléculas de ADN recombinante.

Enlace operativo se refiere a la unión covalente de secuencias de nucleótido, preferiblemente mediante enlaces fosfodiéster convencionales, en única cadena de ADN, ya sea de cadena sencilla o doble. Más aún, la unión de secuencias de nucleótido da como resultado la unión de elementos funcionales, tales como elementos de respuesta en regiones de regulación con promotores y secuencias de nucleótido corriente abajo que codifican polipéptidos tal como se describe en el presente documento.

Uno de los procedimientos habituales para enlazar de forma operativa insertos en los plásmidos de expresión es la ligadura direccional. Esto se lleva a cabo mediante una secuencia de nucleótidos que se adapta a ligadura direccional. Dicha secuencia se denomina habitualmente como un polienlazante, que una región del vector de expresión de ADN que (1) enlaza de forma operativa secuencias de ADN que se pueden traducir que están corriente arriba y corriente abajo para su replicación y transporte y (2) proporciona un emplazamiento o un medio de ligadura direccional de una secuencia de ADN en el vector. Normalmente, un polienlazante direccional es una secuencia de nucleótidos que define dos o más secuencias de reconocimiento de una endonucleasa de restricción, o emplazamientos de restricción. Tras la rotura por restricción, los dos emplazamientos producen términos cohesivos a las que se puede ligar una secuencia de ADN que se puede traducir en el vector de expresión de ADN. Preferiblemente, los dos emplazamientos de restricción proporcionan, tras la rotura por restricción, términos cohesivos que no son complementarios y, por tanto, permiten la inserción direccional de una secuencia de ADN que se puede traducir en el cassette.

Se puede usar cualquiera de estos sistemas de expresión de un vector en el huésped para expresar un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos. Estos incluyen, pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias transformadas mediante vectores de expresión con ADN recombinante de bacteriófago, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido; levadura transformada mediante vectores de expresión de levadura recombinante que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido; sistemas celulares de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido; o sistemas de células animales infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, virus vaccinia) que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, o sistemas de células animales transformadas diseñadas mediante ingeniería genética para una expresión estable. En los casos en los que la glicosación puede ser importante, se pueden usar sistemas de expresión que proporcionan modificaciones traduccionales y post-traduccionales: por ejemplo sistemas de expresión de mamífero, insecto, levadura o planta.

Cualquiera de estos sistemas es útil para llevar a la práctica los procedimientos de esta invención. Con cualquiera de los sistemas de expresión anteriores, el huésped seleccionado se usa a continuación para la expresión de al menos un heterodímero MHC tipo II, solo o en unión de al menos una molécula ayudante además de con o sin una molécula ayudante al procesado del antígeno, dependiendo del mecanismo real de carga de péptidos, es decir, internamente o externamente.

Dependiendo del sistema huésped/vector utilizado, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos de mejora de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., en un vector de expresión (véase por ejemplo, Bitter, y col., Methods in Enzymology, 153:516-544, (1987)). Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles tales como P1 del bacteriófago \lambda, Plac, Ptrp, Sac (promotor híbrido Ptrp-lac) y similares. Cuando se clona en sistemas de mamíferos, se pueden usar promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el repetidor terminal largo del retrovirus; el promotor tardío del adenovirus; el promotor del virus vaccinia de 7,5K) Se pueden usar también promotores producidos mediante ADN recombinante o técnicas sintéticas para conseguir la transcripción de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido.

En sistemas bacterianos se puede seleccionar ventajosamente numerosos vectores de expresión para la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de acuerdo con los procedimientos de esta invención. Por ejemplo, cuando deben producirse cantidades elevadas, se prefieren los vectores que dirigen la expresión de elevados niveles de productos de proteína de fusión que se purifican con facilidad. Se prefieren aquellos que se diseñan mediante ingeniería para contener un emplazamiento de rotura para ayudar a la recuperación de la proteína. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan al vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther, y col., EMBO J., 2:1791, (1983)), en el que la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido se puede enlazar al vector en el marco con la región de codificación LacZ de forma que se produzca una proteína con el híbrido polipéptido-LacZ; pIN (Inouye & Inouye, Nuc. Ácidos Res., 13:3101-3109, (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem., 264:5503-5509, (1989)); y similares.

En una forma de realización, el vector utilizado incluye secuencias procariotas que facilitan la propagación del vector en la bacteria, es decir, una secuencia de ADN que tiene la capacidad de dirigir la replicación y el mantenimiento autónomo de la molécula de ADN recombinante extracromosómica cuando se introduce en un huésped celular bacteriano. Dichos replicones son bien conocidos en la técnica.

Aquellos vectores que incluyen un replicón procariota incluyen típicamente emplazamientos de restricción convenientes para la inserción de una molécula de ADN recombinante de la presente invención. Algunos vectores plásmidos típicos de este tipo son pUC8, pUC9, pBR322, y pBR329 disponibles de BioRad Laboratories, (Richmond, CA) y pPL disponibles de Pharmacia, (Piscataway, NJ), y pBLUESCRIPT y pBS disponibles de Stratagene, (La Jolla, CA). Un vector de la presente invención puede ser también un vector de fago Lambda que incluye los vectores Lambda descritos en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edition, Maniatis y col., eds., Cold Spring Harbor, NY (1989).

En otra forma de realización preferida, los vectores plásmidos para uso en la presente invención son también compatibles con células eucariotas. Los vectores de expresión de células eucariotas son bien conocidos en la técnica, y están disponibles en varias fuentes comerciales. Normalmente, dichos vectores proporcionan emplazamientos de restricción convenientes para la inserción de la molécula de ADN recombinante deseada, y además contiene promotores para la expresión de los genes codificados, que son capaces de expresión en la célula eucariota, tal como se ha descrito más arriba. Algunos vectores plásmidos típicos de este tipo son pSVO y pKSV-10 (Pharmacia), y pPVV-1/PML2d (International Biotechnology, Inc.), y pTDT1 (ATCC, Nº 31255).

Además, en plásmidos eucariotas, están presentes una o más unidades de transcripción que se expresan únicamente en células eucariotas. La unidad de transcripción eucariota consiste de secuencias no codificantes y secuencias que codifican marcadores que se pueden seleccionar. Los vectores de expresión de esta invención contienen también distintos elementos de secuencia que se necesitan para una poliadenilación precisa y eficiente. Además, se incluyen en el vector señales de separación para generar ARNm maduro. Los vectores de expresión de plásmidos pueden contener replicones virales, la presencia de los cuales proporciona el aumento en el nivel de expresión de los genes clonados. Se proporciona una secuencia de replicación preferida mediante el virus de simio 40 o SV40 o el papovavirus.

Un sistema de expresión preferido para producir las moléculas recombinantes para uso en esta invención es un sistema de insecto. En uno de esto sistema se usa el virus de la polihedrosis nuclear de la Autographa californica como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda (Sf9). Las secuencias de nucleótidos que codifica un polipéptido nucleótido de esta invención se pueden clonar en las regiones no esenciales (en Spodoptera frugiperda por ejemplo el gen de la polihedrina) del virus, y colocarse bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo el promotor de la polihedrina). La inserción con éxito de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido dará como resultado la inactivación del gen de la polihedrina y la producción de virus recombinantes no ocluidos (es decir, virus que carecen del recubrimiento proteináceo codificado por el gen de la polihedrina). Estos virus recombinantes se usan a continuación para infectar células en las que se expresa el gen insertado Véase Smith, y col., J. Biol. Chem., 46:584, (1983); Smith, Patente de los Estados Unidos Nº 4.215.051.

En formas de realización preferidas, la población de células huésped es un cultivo celular de Drosophila que requiere un vector compatible, que incluye aquellos como p25-lacZ (véase Bello y Couble, Nature, 346:480 (1990)) o pRmHa-1, -2, o -3 (véase Bunch, y col., Nucl. Acid Res. 16:1043-1061 (1988)). En la forma de realización preferida, el vector es pRmHa-3, que se muestra en la Figura 1C. Este vector incluye un promotor de metalotioneína, que está preferiblemente corriente arriba del emplazamiento en el que se ha insertado la secuencia MHC, y el emplazamiento de poliadenilación se encuentra preferiblemente corriente debajo de dicha secuencia MHC. Las células de insectos y, en particular, las células de Drosophila son huéspedes preferidos de acuerdo con la presente invención. Las células de Drosophila, tales como las células Schneider-2 (S2) se describen con más detalle en el Apartado D, tienen los factores trans-actuación necesarios para la activación del promotor, e incluso son más preferidas.

El vector de expresión pRmHa-3 está basado en el plásmido bacteriano pRmHa-1 (Figura 1A), este último está basado en el plásmido pUC18 y está depositado en el American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), con el número de acceso 37253. El vector pRmHa-3 contiene el promotor, la secuencia líder no traducida 5', del gen de la metalotioneína con los emplazamientos Eco RI y Stu I eliminados como muestra la Figura 1C. También contiene la porción 3' del gen ADH de la Drosophila, incluyendo el emplazamiento de poliadenilación. La construcción del plásmido pRmHa-1 se describe en Bunch, y col., Nucl. Acid Res. 16: 1043-1061 (1988). La construcción de los plásmidos pRmHa-3 y pRmHa-2 (el último de los cuales tiene una secuencia del promotor de la metalotioneína que se puede eliminar mediante un fragmento Eco RI) se describe en los Ejemplos. Con respecto a pRmHa-3, un plásmido preferido para uso de acuerdo con la presente invención, Pst I, Sph I y Hind III están en el fragmento promotor y por tanto no son únicos. Xba I está fragmento ADH (4 bases de su extremo 3') y tampoco es único. Sin embargo, los siguientes emplazamientos de restricción son únicos en pRmHa-3 para facilitar la clonación de los genes recombinantes de esta invención: Eco RI, Sac I, Kpn I, Sma I, Bam HI, Sal I, Hinc 2, y Acc I.

Se pueden diseñar mediante ingeniería sistemas de células de mamífero que utilizan virus recombinantes o elementos virales para la expresión directa. Por ejemplo, cuando se utilizan vectores de expresión de adenovirus, se puede enlazar la secuencia que codifica un polipéptido con un complejo de control transcripción/traducción del adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede a continuación insertarse en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar el polipéptido en huéspedes infectados (por ejemplo, véase Logan & Shenk, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:3655-3659, (1984)). Alternativamente, se puede usar el promotor de 7,5K del virus vaccinia (por ejemplo, véase, Mackett, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7415-7419, (1982); Mackett, y col., J. Virol., 49:857-864, (1984); Panicali, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:4927-4931, (1982)). De particular interés son los vectores basados en el papiloma virus bovino que tiene la capacidad de replicarse como un elemento extracromosómico (Sarver, y col., Mol. Cell. Biol., 1:486, (1981)).Poco después tras la entrada de este ADN en células de ratón, el plásmido se replica en aproximadamente 100 a 200 copias por célula. La transcripción del ADNc insertado no requiere la integración del plásmido en el cromosoma del huésped, proporcionando por tanto un elevado nivel de expresión. Se pueden usar estos vectores para la expresión estable incluyendo un marcador que se puede seleccionar en el plásmido, tal como el neo gen. Alternativamente, se puede modificar el genoma retrovírico para uso como un vector capar de introducir y dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de esta invención en células huésped (Cone & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6349-6353, (1984)). Se puede conseguir también un elevado nivel de expresión usando promotores inducibles, que incluyen pero no se limitan a, el promotor metalotionina IIA y los promotores del shock térmico.

Para una producción a largo plazo con alto rendimiento de proteínas recombinantes se prefiere la expresión estable. Más que usar vectores de expresión que contienen orígenes víricos de replicación, se pueden transformar las células huésped mediante un ADNc controlado por lo elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, secuencias promotoras y mejoradoras, terminadores de transcripción, emplazamientos de poliadenilación, etc.), y un marcador que se puede seleccionar. Tal como se ha mencionado más arriba, el marcador que se puede seleccionar en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección, y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas, y crezca para formar foci, que a su vez se pueden clonar y expandir en líneas
celulares.

Por ejemplo, tras la introducción de ADN extraño, las células diseñadas mediante ingeniería genética pueden dejarse crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y a continuación se cambian a un medio de selección. Se pueden usar numerosos sistemas de selección, que incluyen pero no se limitan a los genes timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler, y col., Cell, 11:223, (1977)), hipoxantina-guanina foforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:2026, (1962)), y adenina foforribosiltransferasa (Lowy, y col., Cell, 22:817, (1980)) que se emplean respectivamente en las células tk-, hgprt- o aprt-. Igualmente, se pueden usar genes que confieren resistencia a los antimetabolitos como base de selección; por ejemplo, los genes de dhfr, que confieren resistencia al metotrexato (Wigler, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:3567, (1980); O'Hare, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527, (1981)); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072, (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, y col., J. Mol. Biol., 150:1, (1981)); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre, y col., Gene, 30:147, (1984)). Recientemente, se han descrito genes que se pueden seleccionar adicionales, más exactamente trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano hisD, que permite a las células usar histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:804, (1988)); y ODC (ornitina decarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina decarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue L., en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed., (1987).

Los vectores de expresión tanto procariotas como eucariotas son familiares para una persona normalmente experta en la técnica de construcción de vectores, y se describen en Ausebel, y col., en Current Protocols in Molecular Biology, Wiley y Sons, Nueva York (1993) y por Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989).

Para producir las \alpha y \beta-cadenas del MHC tipo II recombinante, moléculas ayudantes y moléculas ayudantes al procesado de antígenos para uso en las composiciones y procedimientos de esta invención, las regiones de nucleótidos respectivas se insertan de forma operativa en un vector de expresión de esta invención tal como se describe en el presente documento. Tal como se describe en el Apartado B, se obtienen los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos recombinantes de esta invención de diferentes formas, una de las cuales es mediante amplificación PCR. Uno de los segmentos de nucleótidos a enlazar de forma operativa con las secuencias de vector codifica al menos una parte de las \alpha y \beta-cadenas del MHC tipo II. Preferiblemente, las respectivas secuencias de nucleótido para codificar las \alpha y \beta-cadenas completas se insertan de manera separada en un vector de expresión para su expresión a partir del anterior, sin embargo, es factible también construir un vector que incluya también algunas secuencias no codificantes de MHC. Las secuencias que codifican las moléculas ayudante y moléculas ayudantes al procesado de antígenos se insertan de manera similar en vectores de expresión diferentes.

Alternativamente, la invención contempla la presencia de más de un gen que codifica un polipéptido presente en el mismo vector, la expresión del cual se impulsa por elementos reguladores diferentes, tales como un promotor. En otras palabras, los ácidos nucleicos que codifican ambas \alpha y \beta-cadenas se pueden enlazar de forma operativa en el mismo vector de expresión con o sin una o más secuencias de ácido nucleico que codifican moléculas ayudantes. Así, se contemplan todas las posibles combinaciones para la construcción de un vector de expresión para producir las proteínas recombinantes de esta invención.

Además de las secuencias de nucleótidos codificantes concretas que se describen más arriba, se contemplan formas solubles de los polipéptidos recombinantes de esta invención. La forma soluble se diferencia de la forma no soluble en que contiene un codón "de parada" insertado antes de la región transmembrana u otra localización funcional para generar proteínas solubles no membrana que se puede anclar.

D. Células para la presentación de antígeno sintéticas y matrices para la presentación de péptidos 1. Células y matrices para la presentación de antígeno sintéticas

De acuerdo con la presente invención, los heterodímeros recombinantes MHC tipo II y al menos una molécula ayudante están enlazados de forma operativa a una matriz que comprende un soporte tal que el MHC tipo II y las moléculas ayudantes están presentes en un número suficiente para activar una población de células linfocito TCD4^{+} cuando se presentan con un péptido complejado con la parte extracelular de la molécula MHC. El péptido puede enlazarse con el heterodímero MHC tipo II antes o después de su enlace con el soporte.

El soporte puede tomar diferentes formas. Puede ser un soporte sólido tal como un material de plástico o metal, puede ser un material poroso como el que se emplea normalmente en columnas de separación, puede ser un liposoma o glóbulo rojo sanguíneo, o incluso puede ser una célula de insecto o un fragmento celular. Tal como se describe con mayor detalle más adelante, en el caso en que una célula actúe como soporte, el MHC tipo II y las moléculas ayudantes se pueden producir por la célula para la presentación en dicha célula, o para presentación sobre otro soporte que puede incluir una célula diferente.

En la primera situación, la molécula MHC se enlaza a continuación a la célula mediante al menos la región transmembrana, si no es a la región citoplasmática que no estaría presente en una forma soluble de la MHC tipo II. En la última situación, las porciones extracelulares de la molécula MHC tipo II y molécula ayudante se pueden enlazar con el soporte, proporcionando un epitope que reacciona con un anticuerpo inmovilizado en el soporte. Además, el MHC o molécula ayudante se puede producir con, o enlazarse con (His)_{6}, que reaccionaría con níquel que forma parte del soporte. Otras formas de inmobilizar o enlazar las moléculas MHC a un soporte son bien conocidas en la
técnica.

Tal como se ha descrito más arriba, el soporte puede ser una membrana de célula de insecto o una célula completa. En este caso, se modifica una línea celular de insecto para que se Transform. En una línea celular de presentación de antígeno sintética para uso en la presentación del péptido en el contexto de MHC tipo II a los linfocitos células T. Puesto que las moléculas MHC vacías son termolábiles, se prefiere que el cultivo celular sea poiquilotermo, y se describen varias líneas celulares con más detalle a continuación.

Una línea celular preferida de la presente invención es capaz de crecer de manera continua en cultivo, y es capaz de expresar moléculas MHC tipo II y moléculas ayudante sobre la superficie celular. Resultan apropiadas a este efecto cualquiera de las diferentes células o líneas celulares transformadas y no transformadas, incluyendo líneas celulares de bacteria, levadura, insecto y mamífero. (Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1991), para resúmenes y procedimientos para cultivar y usar una variedad de líneas celulares, por ejemplo, E. coli y Sacaromyces cerevisiae).

Están disponibles varias líneas celulares de insecto para uso de acuerdo con la presente invención, incluyendo polilla (ATCC CCL 80), oruga militar (ATCC CRL 1711), larvas de mosquito (ATCC líneas CCL 125, CCL 126, CRL 1660, CRL 1591, CRL 6585, CRL 6586), gusanos de seda (ATCC CRL 8851) y mariposa (Spodoptera frugiperda (células Sf9, ATCC CRL 1711). En una forma de realización preferida, la línea celular es una línea celular de Drosophila tal como la línea celular Schneider (véase Schneider, J. Embryol. Exp. Morph., 27:353-365 (1972)); preferiblemente, la línea celular es una línea celular Schneider 2 (S2) (S2/M3) adaptada para crecimiento en medio M3 (véase Lindquist, y col., Drosophila Information Service, 58:163 (1982)). Las células Schneider 2 (S2) se han depositado según los requisitos del Tratado de Budapest en el American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, el 18 de Febrero de, 1992, y se le ha asignado el número de acceso CRL 10974.

Para generar una célula de presentación de antígeno sintética de esta invención, se introducen en una célula huésped uno o más vectores de expresión para dirigir la expresión de un heterodímero MHC tipo II seleccionado junto con una o más moléculas ayudantes. Además en formas de realización alternativas, los vectores que expresan moléculas ayudantes al procesado de antígenos incluyendo HLA-DM y cadena invariante se introducen también en las células receptoras. Se han descrito en los Apartados B y C. Los genes para realizar lo anterior.

Así, con el fin de preparar células o matrices de presentación de antígeno sintéticas, los vectores de expresión que codifican los polipéptidos recombinante de esta invención transfectan, es decir, se introducen, en una célula huésped seleccionada. La selección de los vectores de expresión, así como la introducción de los mismos, es dependiente del resultado deseado de la activación CD4^{+} tal como se ha descrito más arriba y se reitera más adelante. La transfección, también denominada, transformación, se puede llevar a cabo mediante numerosos procedimiento, incluyendo el procedimiento del fosfato de calcio, el procedimiento DEAE-dextrano, el procedimiento de transferencia estable, electroporación, o mediante el procedimiento de mediación de liposoma. Hay disponibles numerosos textos que establecen los procedimientos de transfección conocidos y otros procedimientos para introducir nucleótidos en las células véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1991). Tras la introducción de uno o más vectores, se supone que la célula receptora está transformada, la selección de la cual puede ser tanto transitoria como estable.

Se establece en primer lugar un cultivo de células. Se escoge una línea celular para transfección debido a que carece de al menos uno de los genes que se introduce. Se ha encontrado que las células de insecto son ventajosas no solo porque son poiquilotermas, sino porque también carecen de dichos genes y mecanismos que producirían de otra forma moléculas MHC enlazadas con péptidos. Esto permite un mayor control sobre la producción de moléculas MHC enlazadas a péptidos, y la producción de moléculas MHC vacías.

Las células seleccionadas se transforman a continuación mediante la introducción de un vector de expresión que contiene un gen de cadena \alpha de MHC tipo II que se puede expresar enlazado de forma operativa con un primer promotor y un gen de cadena \beta de MHC tipo II que se puede expresar enlazado de forma operativa con un segundo promotor. Se introduce también en la célula anterior un gen de molécula ayudante que se puede expresar enlazado de forma operativa con un tercer promotor. En otra forma de realización, se introduce mediante un vector en la célula anterior un gen de que asiste al procesado de los antígenos que se puede expresar enlazado de forma operativa con un cuarto promotor.

En una forma de realización, más preferida, el vector comprende el plásmido de expresión de Drosophila pRmHa-3, descrito en el Apartado C, en el que se han insertado secuencias de nucleótido que se pueden expresar y que codifican las proteínas recombinantes anteriores usando técnicas descritas en el presente documento. Preferiblemente, las secuencias de nucleótido que las cadenas MHC tipo II, las que codifican que codifican al menos una molécula ayudante y las que codifican moléculas ayudantes al procesado de antígenos están enlazada de forma operativa a plásmidos de expresión diferentes que se co-transfectan de manera individual en las células cultivadas. Alternativamente, las secuencias de nucleótido pueden estar enlazadas de forma operativa a promotores diferentes en el mismo plásmido de expresión y se co-transfectan en el mimo plásmido. Las \alpha y \beta-cadenas MHC tipo II proceden preferiblemente de especies diferentes, más preferiblemente, un homeotermo como un mamífero y, óptimamente, un ser humano.

Se prefiere que al menos uno de los genes, y en particular los genes de las cadenas MHC tipo II estén enlazados a un promotor inducible. Este proporciona control sobre la producción de moléculas MHC, de forma que estas se produzcan únicamente en el momento en que está disponible el péptido de interesa, ya sea de forma interna o externa, y presentada en el cultivo para reaccionar con las moléculas MHC producidas. Esto minimiza los complejos indeseables molécula MHC/péptido.

Así, la línea celular preferida es una línea celular poiquiloterma que tiene vectores diferentes, cada uno contiene un gen de \alpha y \beta-cadenas MHC tipo II enlazado de forma operativa con un primer y segundo promotor. Preferiblemente, los promotores son inducibles para controlar la expresión de las cadenas MHC tipo II. Además, la célula contiene un tercer vector que contiene al menos un primer gen de molécula ayudante que se puede expresar enlazado de forma operativa a un tercer promotor. En otra forma de realización, la célula también contiene un cuarto vector que contiene un gen que asiste al procesado de los antígenos que se puede expresar enlazado de forma operativa a un cuarto promotor. Se prefiere que la célula ensamble moléculas MHC vacías y las presente sobre la superficie celular de forma que se pueda seleccionar según se desee los péptidos específicos de un haplotipo concreto de MHC tipo II o una variante alélica.

La selección de los genes compatibles de \alpha y \beta-cadenas MHC tipo II para uso junto con uno o más genes que codifican moléculas ayudantes particulares depende del perfil deseado de activación de células T. Por ejemplo, tal como se describe en los Ejemplos, B7.1 o B7.2 recombinante en solitario o junto con IA^{d} MHC tipo II recombinante de murina expresado sobre la superficie de APC de Drosophila da como resultado la proliferación de células TCD4^{+} que tienen un perfil Th2 de producción aumentada de IL-4 e IL-10. Por el contrario, cuando B7.1 o B7.2 se expresan sobre la superficie de APC de Drosophila con ICAM-1 junto con las mismas moléculas MHC, la activación de las células TCD4^{+} da como resultado un perfil Th1 de producción aumentada de IL-2 y disminuida de IL-4 e IL-10.

Así, la invención contempla la producción de APC sintético que tiene sobre la superficie celular cualquier combinación de un heterodímero con haplotipo MHC tipo II con cualquiera de las moléculas ayudante de esta invención. Las combinaciones particularmente preferidas incluyen MHC tipo II con cualquiera de las moléculas co-estimulantes, incluyendo B7.1 o B7.2, una molécula de adhesión incluyendo ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 o LFA-3, o una molécula de supervivencia incluyendo el ligandos Fas (FasL). Tal como se ha descrito más arriba, se puede co-expresar más de una categoría de moléculas ayudante tal como por ejemplo B7.1 y B7.2. Las formas de realización preferidas alternativas incluyen las permutaciones en las que dos moléculas ayudantes de categorías diferentes se co-expresan sobre la superficie celular. En otras palabras, una molécula de adhesión con una molécula co-estimulante, y una molécula de adhesión con una molécula de supervivencia, a una molécula co-estimulante con una molécula de supervivencia. En otra forma de realización tres moléculas ayudante de las diferentes categorías descritas en el presente documento se co-expresan en la superficie de APT. Se contempla que en todas estas formas de realización, se puede expresar más un miembro de una categoría concreta junto con más de un miembro del resto de categorías. Las combinaciones seleccionadas concretas son efectivas sobre la superficie de las células a partir de las cuales se expresan, o cuando se anclan sobre la superficie de una matriz de esta invención. Las combinaciones reales preparadas se seleccionan sobre la base del resultado de la activación de las células T, en vista de las moléculas MHC de tipo II complejadas con el péptido antigénico. Así, dependiendo del complejo MHC de tipo II/péptido, el resultado de la activación de las células T puede ser diferente a pesar de tener las mismas moléculas ayudante expresadas.

En otra forma de realización, los genes que asisten al procesado de los antígenos se co transfectan con cualquiera de las combinaciones descritas más arriba para proporcionar un procesado y carga internos del péptido mejorados. Este aspecto por tanto no implica la generación de moléculas MHC tipo II vacías sobre la superficie celular para posterior complejación con el péptido. En su lugar, la expresión de la cadena invariante HLA-DM o enzimas lisosomiales se utiliza para permitir un procesado óptimo y caga de los fragmentos proteolíticos de péptido tras la internalización celular. El APC de esta invención así puede funcionar en cualquiera de los motivos de tener los heterodímeros recombinantes MHC tipo II tanto intracelular como extracelularmente.

Las células transformadas con éxito, es decir, las células que contienen al menos un vector de expresión capaz de dirigir la expresión de las secuencias de nucleótido de acuerdo con la presente invención, se pueden identificar mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, se pueden clonar las células resultantes de la introducción de un ADNc o ADNr de la presente invención para producir colonias individuales. Las células procedentes de dichos clones se pueden cosechar y lisar, y se puede examinar su contenido en ADN para buscar la presencia de ADNr usando un procedimiento como el descrito por Southern, J. Mol. Biol. 98: 503 (1975). Además de ensayar directamente la presencia de ADNr la transformación o transfección con éxito se puede confirmar mediante procedimientos de inmunoensayo bien conocidos cuando el ADNr es capaz de dirigir la expresión de una proteína sujeto MHC tipo II de molécula ayudante. Por ejemplo, las células transformadas con éxito con uno o más un vectores de expresión pueden producir proteínas que presente propiedades antigénicas particulares que se pueden determinar con facilidad usando los anticuerpos apropiados, tales como los anti-tipo II de haplotipos concretos. Además, se puede comprobar la transformación/transfección mediante el uso de un vector adicional que soporta una secuencia de marcador, como el de la resistencia a la neomicina, tal como se describe más arriba en el presente documento.

Se prefiere también que el cultivo sea estable y sea capaz de un crecimiento sostenido a baja temperatura. Por ejemplo, se prefiere que el cultivo se mantenga a aproximadamente temperatura ambiente, por ejemplo, aproximadamente 24-27ºC. En otras formas de realización, el cultivo se mantiene a temperaturas más elevadas, particularmente durante el procedimiento de activación de las células CD4^{+}. Por tanto se prefiere que el cultivo de acuerdo con la presente invención sea capaz se soportar una variación de temperatura de aproximadamente 30ºC a aproximadamente
37ºC.

Con el fin de preparar el cultivo para la expresión de moléculas MHC tipo II vacías junto con al menos una molécula ayudante de esta invención y opcionalmente moléculas que ayuden al procesado del antígeno, el cultivo puede necesitar estimulación en primer lugar, por ejemplo, mediante la inducción con CuSO_{4}, durante un periodo de tiempo predeterminado. Tras un periodo de inducción adecuado, por ejemplo aproximadamente 12-48 horas, se pueden añadir los péptidos a una concentración predeterminada (por ejemplo, aproximadamente 0,2 \mug/ml hasta 20 \mug/ml). Las proteínas y péptidos de carga tanto interna como externa se preparan como se describe más adelante. Tras un periodo de incubación adicional, por ejemplo de aproximadamente 12 horas a 37ºC, el cultivo está listo para uso en la activación de las células CD4^{+}. Aunque este periodo de incubación adicional se puede acortar o quizás omitir, el cultivo tiende a ser cada vez más estable a los cambios de temperatura si se deja incubar durante un tiempo antes de la adición de las células CD4^{+} latentes o inmaduras. Por ejemplo, los cultivos de acuerdo con la presente invención a los que se ha añadido péptido son capaces de expresar cantidades significativas de moléculas MHC tipo II cargadas con péptido, incluso cuando se incuban a 37ºC durante periodos prolongados de tiempo.

El medio nutriente útil en el cultivo de las células huésped transformadas son bien conocidos en la técnica, y se pueden obtener de numerosas fuentes. En las formas de realización en las que la célula huésped es de mamífero, se usa preferiblemente un medio "libre de suero".

Las moléculas MHC tipo II recombinantes expresadas resultantes se enlazan con un péptido particular y están presentes en número suficiente de APC para activar una población de linfocitos células T frente al complejo MHC tipo II/péptido.

Cuando la línea celular ya produce una o más de las moléculas deseada, solo es necesario transfectar el cultivo con un gen que se puede expresar para el gen del que carecen las células. Por ejemplo, si las células ya presentan moléculas MHC en su superficie, solo es necesario transfectar el cultivo con un vector que contenga un gen que se puede expresar para la molécula ayudante.

Tal como se ha descrito más arriba, se puede introducir una proteína o péptido en el cultivo celular en el momento en que las células están produciendo moléculas MHC tipo II para procesado entero. A través de procedimientos tales como el choque osmótico, los péptidos se pueden introducir en la célula y enlazarse con las moléculas MHC producidas. Alternativamente, en particular en el caso de líneas celulares poiquilotermas, las moléculas MHC se presentarán vacías en la superficie celular. A continuación, el péptido puede añadirse al cultivo y enlazarse con las moléculas MHC según se desee. Por simplicidad, aunque se describe un péptido en el presente documento, los procedimientos de esta invención contemplan la selección de bibliotecas de péptidos para identificar nuevos péptidos antigénicos para uso en los procedimientos terapéuticos de esta invención.

Una vez que se han producido las células conteniendo un heterodímero MHC tipo II y al menos una molécula ayudante en la superficie celular, las células se pueden liofilizar para generar fragmentos celulares para uso en la activación de una población de células linfocito TCD4^{+}.

Los cultivos de células transfectadas también se pueden usar para producir porciones extracelulares de moléculas MHC tipo II y moléculas ayudante. El uso de porciones extracelulares junto con soportes tales como soportes sólidos tiene ciertas ventajas de producción. Cuando se usan células vivas para proporcionar una célula de presentación de antígeno sintética, se deben introducir en la célula al menos tres genes, dos para producir el heterodímero MHC tipo II y uno para producir la molécula ayudante. A menudo, se transfectan también genes adicionales, tales como para conferir resistencia a los antibióticos.

Cuando se está usando un sistema soporte sólido, se usa una línea celular para producir las porciones extracelulares de moléculas MHC tipo II mientras que se usa otra línea celular para producir para producir la porción extracelular de la molécula ayudante. Las porciones de la molécula MHC y de la molécula ayudante se cosechan a continuación de sus respectivos cultivos. Las moléculas se enlazan a continuación a un soporte apropiado en número suficiente para activar la población de células T. Desde un punto de vista de la producción, se pueden usar dos cultivos diferentes, pero también es posible usar el mismo cultivo, sin embargo, el cultivo necesita transfectarse con un gen adicional para expresar la porción extracelular de una molécula ayudante.

Otra modificación de esta forma de realización es proporcionar un tercer cultivo de células que se transfecte con un tercer gen de una segunda molécula ayudante que se puede expresar. Por ejemplo, el segundo cultivo de células produce porciones extracelulares de la molécula co-estimulante, mientras que el tercer cultivo de células produce una porción extracelular de una molécula de adhesión. Las porciones de la una molécula de adhesión se cosechan y enlazan al soporte. En la preparación de las porciones extracelulares de un heterodímero MHC tipo II a enlazar con el soporte, las moléculas solubles se preparan como se ha descrito más arriba. Estas moléculas generalmente carecen de las regiones transmembrana y citoplasmática de la molécula MHC.

2. Péptidos

Virtualmente, todas las proteínas celulares, además de los antígenos virales, son capaces de usarse para generar fragmentos de péptido relevantes que actúan como potenciales péptidos específicos MHC tipo II. Los procedimientos y composiciones de esta invención proporcionan moléculas MHC tipo II que tienen una capacidad aumentada para células específicas de células CD4^{+}.

Los péptidos de la presente invención se enlazan con moléculas MHC tipo II. El enlace se produce en condiciones biológicas que se pueden crear tanto in vivo como in vitro. La naturaleza exacta del enlace de los péptidos no necesita conocerse para la práctica de la invención.

Los péptidos que se enlazan con moléculas MHC tipo II tienen longitud variable en longitud y sus residuos de anclaje permanecen a varias distancias desde los extremos del péptido. En un aspecto, los péptidos preparados para carga sobre las moléculas MHC son de una única especia; es decir, que todos los péptidos cargados en el MHC son idénticos en tamaño y secuencia, de forma que se produzca moléculas MHC tipo II moléculas MHC tipo II cargadas con péptido monoantigénico. En formas de realización alternativas, los péptidos son heterogéneos y pueden comprender una biblioteca aleatoria de péptidos para permitir la selección de miembros únicos que dan como resultado la activación de los perfiles de células T tal como se ha descrito más arriba. La producción y selección de bibliotecas de péptidos sintéticos aleatorios es familiar a una persona experta en la técnica, y se describe en las Patentes de los Estados Unidos con nros. 5.556.762; 5.510.240; 5.498.530; 5.432.018; 5.382.513; 5.338.665 y 5.270.170;

Los péptidos pueden presentarse a las células de diferentes formas. Preferiblemente, los péptidos se presentan de forma que se les permita entrar en una combinación intracelular de péptidos. Por ejemplo, los péptidos se pueden presentar por carga osmótica. Normalmente, los péptidos se añaden al medio de cultivo. Los péptidos se pueden añadir al medio de cultivo en forma de polipéptido o proteína intacto que posteriormente se degrada mediante procesos celulares, por ejemplo, mediante degradación enzimática. Alternativamente, el polipéptido o proteína intacto se puede degradar por otros medios tales como digestión química (por ejemplo, bromuro de cianógeno o proteasas (por ejemplo, quimiotripsina) antes de su adición al cultivo celular. En otras formas de realización, loa péptidos se presentan en segmentos más pequeños que pueden comprender o no secuencias de aminoácidos antigénicos en conjunción con un determinado haplotipo MHC tipo II.

Preferiblemente, se añade una cantidad suficiente de proteína(s) o péptido(s) al cultivo celular o matriz sintética para permitir que las moléculas MHC tipo II se enlacen y posteriormente presenten una elevada densidad de péptido, preferiblemente con el mismo tipo de péptido enlazado con cada heterodímero MHC, sobre la superficie desde los APC o matrices sintéticos de esta invención.

En otra forma de realización de la invención, los péptidos se añaden a células transfectadas de la presente invención con el fin de mejorar la termoestabilidad de las moléculas MHC expresadas por las células. Tal como se ha reseñado más arriba, los péptidos se añaden preferiblemente al medio de cultivo. Los péptidos antigénicos que se enlazan con las moléculas MHC tipo II sirven para termoestabilizar las moléculas MHC y aumentar también la expresión en la superficie celular. Los cultivos con péptidos añadidos que se enlazan con moléculas MHC son por tanto significativamente menos susceptibles al cambio de temperatura sin péptido añadido.

E. Procedimientos de alterar las respuestas de las TCD4^{+} 1. Enfermedades mediadas por células CD4^{+} T Th1 y Th2

Inducir una célula T inmadura en un tipo de célula T activada deseada, o desviar la función efectora de una célula T activada desde un tipo Th1 a un tipo Th2 y viceversa es uno de los objetivos de la presente invención, especialmente en delación a los procedimientos terapéuticos para el tratamiento de varios estados de afección mediadas por células TCD4^{+}.

La diferenciación de una célula TCD4^{+} proliferativa en tanto una célula T inflamatoria o una célula T ayudante depende de las citoquinas producidas por los agentes infecciosos, principalmente IL-12 y IL-4, la influencia de moléculas ayudantes y de la naturaleza de del complejo MHC tipo II/péptido. Como se ha descrito más arriba, la inmunidad mediada por células implica la destrucción de patógenos intracelulares por macrófagos activados mediante las células inflamatorias Th1 dirigidas principalmente a los parásitos intracelulares, incluyendo dichos parásitos Mycobacterium, Leishmania, Pneumocystis y similares. Por el contrario, la inmunidad humoral depende de la producción de anticuerpos mediante células B activadas por las células T ayudantes dirigidas principalmente a los patógenos extracelulares entre los que se incluye Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, virus Polio, Pneumocystis y similares.

Por ejemplo, la recuperación de ciertos tipos de infecciones tales como Leishmania, está asociada con la producción preferente de IL-2/IFN-\gamma. Los ratones que despiertan una respuesta Th2 frente a Leishmania no consiguen contener la infección y finalmente mueren. La producción incorrecta de citoquinas de respuesta tipo Th2 se ha relacionado frecuentemente con enfermedades de tipo alérgico tales como asma y sensibilidad por contacto.

Quizás, la asociación más fuerte entre enfermedad humana con modelos sesgados de producción de citoquinas es la asociación entre respuestas Th1 y citoquinas del tipo Th1 con enfermedades autoinmunes. La fuerte evidencia en modelos experimentales indica que muchos tipos de autoinmunidad, incluyendo diabetes, modelos experimentales de esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, y similares, están mediadas por células TCD4^{+} tipo Th1. La expresión de citoquinas asociadas a Th2, tales como IL-4, en estos modelos interfiere con el desarrollo de la enfermedad autoinmune. Las citoquinas del tipo Th2 disminuyen la respuesta de las células del tipo Th1 mientras que las citoquinas del tipo Th1 antagonizan el desarrollo de las respuestas del tipo Th2.

A la vista de la asociación entre los subconjuntos particulares de células T activadas con estados particulares de enfermedad, sigue existiendo una necesidad de ser capaz de dirigir la proliferación y activación de las células CD4^{+} T a un subconjunto deseado de células T, un procedimiento que es extremadamente beneficioso para alterar el curso de la enfermedad. Una solución potencial es activar in vitro células TCD4^{+} que se han aislado en primer lugar a partir de un sujeto que de forma opcional tenga una enfermedad tanto alérgica como autoinmune para producir células secretoras de un perfil de citoquina preferido. Las células T activadas resultantes se reintroducen a continuación en el sujeto para alterar el curso de la enfermedad y quizás, proporcionar incluso una curación a largo plazo.

Las formas de realización alternativas se dirigen a la capacidad de "vacunar" una respuesta potencial individual frente al desarrollo de una respuesta tanto Th1 o Th2, que es aplicable a dicho individuo. En otras palabras, la inducción de un conjunto concreto de células T se puede conseguir inhibiendo el desarrollo de células inmaduras hacia el fenotipo indeseado. Por ejemplo, en un individuo potencialmente atópico, la prevención de una respuesta Th2 perjudicial sería beneficiosa, tal como se describe por Hetzel y Lamb, Clinical Immunol. Immunopath., 73:1-10 (1994).

En otra forma de realización adicional, las composiciones y los procedimientos de esta invención son útiles para estimular activamente el desarrollo de células T inmaduras hacia el fenotipo deseado. Los modelos terapéuticos existentes incluyen el uso de anticuerpos anticitoquina como moléculas vehículo, el uso de cadenas de proteína de fusión idiotipo/GM-CSF para prolongar los efectos de citoquinas exógenas, el uso de adyuvantes selectivos, el uso de alérgenos encapsulados en liposomas, el uso de análogos de péptido y similares tal como revisan Hetzel y Lamb, id. Los autores, sin embargo, constatan que para las respuestas Th2 crónicas in vivo hay pocos datos experimentales respecto de la posibilidad de llevar a cabo una regulación a la baja deseada de la respuesta Th2.

En vista de lo anterior, las composiciones y los procedimientos de esta invención proporcionan un medio valioso de llevar a cabo las intervenciones terapéuticas descritas más arriba. La presente invención permite definir las condiciones de activación que reproducen los conjuntos generados de células TCD4^{+} que producen el perfil de citoquinas deseado. La expresión de citoquinas concretas está relacionado con una célula de presentación de antígeno (APC) particular, y sus moléculas ayudantes asociadas. Puesto que dos de las citoquinas producidas por el APC y las moléculas ayudantes expresadas de manera coordinada están ellas mismas reguladas por múltiples factores, entre los que se incluye el tipo de antígeno, la afinidad de la interacción entre el receptor de la células T (TCR) con el antígeno, la concentración del antígeno y similar, predecir la respuesta de la activación de las células T tras la presentación del antígeno ha sido históricamente muy difícil. Por tanto, se han propuesto moléculas ayudantes adicionales para el proceso de activación in vivo, resulta cada vez más claro que están implicada muchas moléculas diferentes en la regulación de las respuestas de la célula T, y actúan de forma combinada para llevar a cabo la activación de las células T.

La presente invención proporciona la generación de APC sintético que presenta, en un entorno neutro moléculas MHC tipo II en combinación con moléculas ayudantes definidas que se expresan preferiblemente en una célula de insecto no mamífero. La ventaja de usar las células de insecto como los vehículos de exposición y presentación para las composiciones MHC tipo II/molécula ayudante de esta invención es que las células no producir de forma endógena citoquinas reguladora, y no expresan moléculas ayudantes de mamífero. Esto resuelve la falta de predicción de usar APC de mamífero que expresa muchas moléculas que son capaces de alterar la respuesta de las células T. La presente invención así proporciona la capacidad de aislar las moléculas de presentación individuales y las moléculas ayudantes para expresión en combinaciones seleccionadas que permitan la reproducibilidad y predicibilidad no disponible en otros enfoques.

2. Procedimientos terapéuticos

Como se ha descrito más arriba, la presente invención se refiere a un procedimiento para activar células TCD4^{+}en subtipos de células T efectoras armadas. El procedimiento se refiere a proporcionar un APC o matriz sintética que tenga anclada en su superficie externa un heterodímero recombinante MHC tipo II que es capaz de enlazar un péptido. La composición tiene también al menos una molécula ayudante presentada en la superficie celular. Las células TCD4^{+} inmaduras o activadas se pueden obtener sacándolas del individuo que se va a tratar. Las células que presentan el antígeno se ponen posteriormente en contacto con células TCD4^{+} durante un periodo de tiempo suficiente para activar las células T para que proliferen y se diferencien en un fenotipo deseado de células T.

Las células TCD4^{+} activadas se separan de la línea celular y se ponen en suspensión en un vehículo aceptable y se administran al individuo.

Se prefiere el uso de genes humanos y, por tanto, se producen análogos de genes humanos Como se muestra en la Patente de los Estados unidos Nº 5.314.813 anterior, los sistemas de murina proporcionar modelos particularmente útiles para ensayar el funcionamiento de la activación de las células T y demostrar la aplicabilidad del procedimiento en sistemas humanos. Véase también Sykulev y col., Immunity, 1:15-22 (1994).

a. Aislamiento de células TCD4^{+} inmaduras o activadas

Las células TCD4^{+} latentes (o inmaduras), así como las activadas que no se han activado para hacer diana en un antígeno específico presentado en el contexto de MHC tipo II se extraen de un individuo para su incubación o exposición a los cultivos transformados de la presente invención. Las células inmaduras se pueden distinguir de las células cebadoras basándose principalmente en los marcadores superficiales CD455RA y CD45.

Se prefiere también que las células TCD4^{+} se obtengan de un individuo antes del inicio de otros tratamientos o terapias que puedan interferir con la capacidad de las células CD4^{+} a activar de manera específica. Por ejemplo, si se pretende tratar a un individuo que padece una enfermedad autoinmune, es preferible obtener una muestra de células y cultivarlas antes del inicio de la terapia adjunta tal como tratamiento con esteroides, o en una ventana de tiempo cuando el paciente no se trata en forma alguna.

Cuando se activan las células TCD4^{+} para alterar la respuesta inmune mediada por células T en un paciente, el paciente se analiza en primer lugar buscando un perfil específico del paciente para evaluar el estado de la enfermedad fenotípica de las células T para instituir una contraterapia adecuada que implica la producción de las citoquinas y células T de fenotipo contrario. Los perfiles de citoquina se establecen con anticuerpos anti-citoquina que están disponibles de ATCC y mediante los procedimientos descritos en las Patentes de los Estados Unidos con nros. 5.405.751; 5.322.787 y 5.209.920. Los análisis de citoquina preferidos incluyen interleuquina-2 (IL-2), interferón-\gamma (IFN-\gamma), factor de necrosis tumoral (TNF), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-10 (IL-10) y similares. Como se ha descrito más arriba, los perfiles de citoquina particulares se asocian con fenotipos de células T y estados de enfermedad.

En particular, cuando la dolencia es una enfermedad autoinmune que incluye esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, lupus eritromatoso sistémico, miastenia gravis, enfermedad de Crohn y enfermedad del intestino inflamatorio, el perfil de citoquina se produce mediante una respuesta tipo Th1 caracterizada por un amento en IL-2, IFN-\gamma y TNF. Por el contrario, cuando la dolencia es una alergia, el perfil de citoquina se produce mediante una respuesta tipo Th2 caracterizada por un amento en IL-4 e IL10.

Tras analizar el perfil de citoquina del paciente y el estado de su dolencia, las células TCD4^{+} aisladas del paciente se ponen en contacto in vitro con el APC sintético, fragmentos de células o matrices de esta invención tal como se describe más adelante en cantidad suficiente durante un tiempo suficiente para inducir que las células contactadas proliferen y se diferencian en células TCD4^{+} activadas que producen un perfil de citoquina funcionalmente opuesto. Es decir, si el paciente se caracteriza fundamentalmente como un respondedor de tipo TH1, el antígeno a presentar a las células TCD4^{+} del paciente debería ser el necesario para inducir a las células a proliferar y diferenciarse con una respuesta de tipo Th2. Así, una vez se devuelven al paciente las células opuestas tal como se describe más adelante, se ha conseguido el fin terapéutico de realizar la alteración en el fenotipo de respuesta de la célula T.

Los procedimientos para extraer y cultivar linfocitos son bien conocidos. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº 4.690.915 de Rosenberg describe un procedimiento para obtener un gran número de linfocitos mediante linfocitoferesis. Las condiciones de cultivo apropiadas se usan para células de mamíferos, que se llevan a cabo habitualmente a 37ºC.

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Están disponibles diferentes procedimientos para separar y/o enriquecer cultivos de células CD4^{+}. Algunos ejemplos de procedimiento generales de separación de células incluye el enlace indirecto de células con superficies específicamente recubiertas. En otro ejemplo, los linfocitos de la sangre periférica del cuerpo (PBL), que incluye células CD4^{+}, se aíslan mediante centrifugación en gradiente Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ). Los linfoblastos PBL se pueden usar inmediatamente después de lo anterior, o se pueden almacenar en nitrógeno líquido en FSB que contiene DMSO al 10% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), que conserva la viabilidad células y las funciones de linfocito.

Los procedimientos alternativos para separar y/o enriquecer cultivos de células CD4^{+} incluyen procedimientos de selección tanto positiva como negativa. Para la selección positiva, las poblaciones PBL tras el enriquecimiento en linfocitos se preparan a partir de sangre completa, se aíslan subpoblaciones de linfocitos CD4^{+} a partir de lo anterior mediante procedimientos basados en afinidad dirigidos a la presencia del antígeno co-receptor CD4. Estas técnicas basadas en afinidad son clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), adhesión celular, separación por perla magnética y procedimientos similares. (Véase, por ejemplo, Scher y Mage, en Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., pp.767-780, River Press, NY (1984).) Los procedimientos de afinidad pueden usar anticuerpos co-receptor anti-CD4 como fuente del agente de afinidad. Alternativamente, se puede usar el ligando natural, o análogos de ligando, del receptor CD_{4} como el agente de afinidad. Están generalmente disponibles diferentes anticuerpos monoclonales anti-célula T y anti-CD4 para uso los procedimientos de una variedad de fuentes comerciales, incluyendo la American Type Culture Collection (Rockville, MD) y Pharmingen (San Diego, CA).

Los procedimientos de selección negativa se usan para efectuar la eliminación de células no CD4 de la población CD4^{+}. Esta técnica da como resultado el enriquecimiento en células CD4^{+} procedentes de la población celular T y B de pacientes sometidos a leucoforesis. Dependiendo de la denominación del antígeno, pueden resultar apropiados diferentes anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonal OKT4 (anti-CD4, ATCC Nº CRL 8002) OKT 5 (ATCC Nros. CRL 8013 y 8016), OKT 8 (anti-CD8, ATCC Nº CRL 8014), y OKT 9 (ATCC Nº CRL 8021) se identifican en el Catalogue ATCC de Líneas celulares e Hibridomas (ATCC, Rockville, MD) como reactivos con los linfocitos T humanos, subconjunto de células T humanas, y células T activadas, respectivamente. Están disponibles también otros anticuerpos para identificar y aislar especies de células T, incluyendo precursores y células T inmaduras y periféricas maduras de memoria activada.

b. Activación In vitro de células CD4^{+}

Con el fin de optimizar las condiciones in vitro para generar fenotípicos específicos de células CD4^{+} T, el cultivo de células que presentan el antígeno se mantiene en un medio apropiado. Preferiblemente, cuando se usa un soporte de esta invención que es una célula intacta, las células que presentan el antígeno son células de Drosophila, que se mantienen preferiblemente en medio libre de suero (por ejemplo, Excell 400). En formas de realización alternativas, sin embargo, cuando el soporte celular es un fragmento de célula o matriz de un soporte artificial tal como se ha descrito más arriba, el medio de cultivo se selecciona para mantener la viabilidad de las células diana.

Antes de la incubación del APC sintético, fragmentos celulares o matrices de esta invención con las células T a activar, se proporciona una cantidad de péptido antihigiénico al APC o matrices en cantidad suficiente para resultar cargado en las moléculas MHC tipo II humanas para la expresión en la superficie de las APC o matrices. Como se ha descrito más arriba, la carga de péptido se puede producir intracelular o extracelularmente. Ambos aspectos se abarcan, de acuerdo con ello, en el proceso de activación descrito en el presente documento por simplicidad, la carga de péptidos se describe como el detalle de la presentación del péptido a los heterodímeros MHC tipo II y la carga se ha descrito más arriba. Más aún, los péptidos individuales así como las bibliotecas de péptidos se contemplan para uso en la preparación de células TCD4^{+} activas, lo que también se ha descrito más arriba. De acuerdo con la presente invención, una cantidad suficiente de péptido es una cantidad que permita entre aproximadamente 200 y aproximadamente 500,000 y preferiblemente entre aproximadamente 200 y 1.000 o más, moléculas MHC tipo II cargadas en el péptido a expresar en la superficie de cada APC o matriz sintético. Preferiblemente, las composiciones anteriores se incuban con entre 0,2 \mug/ml y 20 \mug/ml de péptido.

Las células CD4^{+} aisladas se incuban a continuación en cultivo con los heterodímeros MHC tipo II cargados con péptido apropiados expresado en las APC o matrices sintéticas durante un periodo de tiempo suficiente para activar las células CD4^{+}. Preferiblemente, las células CD4^{+} deberían activarse de manera específica del antígeno. La relación de células CD4^{+} a células que presentan el antígeno puede variar de individuo a individuo, y además puede depender de variables tales como la posibilidad de llevar a cultivo los linfocitos de un individuo y la naturaleza y la gravedad de la enfermedad o dolencia para la que se usa la modalidad de tratamiento descrita. Preferiblemente, sin embargo, la célula o matriz que presentan el linfocito:antígeno está comprendida preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1:1 y 300:1.

El cultivo de presentación efector/antígeno se puede mantener durante tanto tiempo como sea necesario para activar y enriquecer una población de células TCD4^{+} terapéuticamente útil o numerosas. En términos generales, el tiempo óptimo está comprendido entre aproximadamente uno y cinco días, con un nivel máximo específico que por lo general se observa tras tres a cinco días de cultivo. En una forma de realización de la presente invención, la activación de in vitro de células CD4^{+} se detecta en un periodo de tiempo corto tras la transfección de una línea celular.

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Preferiblemente, la activación de células CD4^{+} es óptima en usa semana de exposición a las células que presentan el antígeno. Además de lo anterior, en una forma de realización preferida, las células CD4^{+} activadas se purifican de forma adicional mediante procedimientos de aislado que incluyen gradientes de densidad, ajuste con preparaciones de anticuerpos y glóbulos rojos, cromatografía en columna y similares. Tras la purificación, la preparación resultante de células CD4^{+} se expande de forma adicional por mantenimiento en cultivo durante un periodo de tiempo para obtener una población de 10^{9} células CD4^{+} activadas. Este periodo puede cariar dependiendo del tiempo de replicación de las células, pero por lo general será de 14 días.

c. Separación de células CD4^{+} a partir de APC o Matrices Sintéticas

Las células CD4^{+} activadas pueden separarse de manera efectiva de las composiciones que presentan el antígeno de esta invención mediante uno de una variedad de procedimientos conocidos. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos monoclonal específicos para los heterodímeros MHC tipo II, para los péptidos localizados en los anteriores, o para las células CD4^{+} (o fragmento de la mismas) para enlazar su ligando complementario. Las células ligadas a los anticuerpos se pueden extraer de la premezcla estimulador/efector mediante procedimientos apropiados tales como procedimientos de separación por citometría o perla magnética. También se pueden usar los gradientes de densidad para separar los residuos celulares.

d. Tratamiento terapéutico con células CD4^{+} activadas

Las cantidades efectivas de las células CD4^{+} activadas pueden variar entre los usos in vitro e in vivo, así como con la cantidad y tipo de células diana que expresan el péptido antigénico que se usa para activar la población de CD4^{+}. La cantidad dependerá también del estado del paciente, y el médico deberá determinarla teniendo en cuenta todos los factores apropiados. Preferiblemente, sin embargo, se usarán entre aproximadamente 1 X 10^{6} y aproximadamente 1 X 10^{12}, más preferiblemente entre aproximadamente 1 X 10^{8} y aproximadamente 1 X 10^{11}, e incluso más preferiblemente, entre aproximadamente 1 X 10^{9} y aproximadamente 1 X 10^{10} células CD4^{+} activadas para seres humanos adultos, en comparación con entre 5 X 10^{6} - 5 X 10^{7} células usadas en ratones.

Preferiblemente, como se ha descrito más arriba, las células CD4^{+} activadas se cosechan a partir del APC o matriz sintético en el cultivo antes de la administración de las células CDr^{+} al individuo que está siendo tratado. Es importante, notar, son embargo, que a diferencia de otras modalidades de tratamiento propuestas y presentes, en una forma de realización, el presente procedimiento usa un sistema de cultivo celular de APC de Drosophila o matrices acelulares que nos son tumorigénicas. Por tanto, si no se consigue la separación completa entre células y células CD4^{+} activadas, no existe peligro inherente conocido que se asocie con la administración de un número pequeño de APC o matrices sintético, mientras que la administración de células promovedoras de tumores en mamíferos puede ser extremadamente peligrosa.

Los procedimientos de reintroducir componentes celulares son conocidos en la técnica, e incluyen los que se ejemplifican en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.844.893 de Honsik, y col., y en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.690.915 de Rosenberg. Por ejemplo, es apropiada la administración de células CD4^{+} activadas por infusión intravenosa.

Ejemplos

Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren, pero no limiten, la presente invención.

1. Preparación del vector de expresión pRmHa-3

Se preparó el vector de expresión pRmHa-3 un para uso en la expresión de proteínas MHC en células de Drosophila Schneider 2 (S2) tal como se describe en esta invención, enlazando un vector de expresión de ADN pRmHa-1 linealizado con Sph con un fragmento de ADN que resulta de la digestión con restricción Sph I de un vector de expresión pRmHa-2 para formar el vector de expresión pRmHa-3 tal como se describe más adelante. La ligadura del pRmHa-1 linearizado con el fragmento pRmHa-2 de esta forma se llevó a cabo eliminando uno de los emplazamientos de clonación de la endonucleasa de presente en pRmHa-1. Así, vector de expresión pRmHa-3 resultante contiene un solo emplazamiento de restricción Eco RI en el emplazamiento de multiclonación (polienlazante) en el que se han insertado varios fragmentos de ADN que codifican diferentes MHC tipo II como se describen en los Ejemplos.

A. Preparación del vector de expresión pRmHa-1

El vector de expresión, pRmHa-1 que contiene un promotor de la metalotioneína, secuencias de consenso de respuesta a metal (denominada MT) y un gen de la alcohol deshidrogenasa (ADH) que contiene una señal de poliadenilación aislada a partir de Drosophila melanogaster, se construyó tal como se describe en Bunch y col.,Nucl. Acid. Res., 16:1043-61 (1988). El vector de expresión de plásmido, pUC18, que tiene el número de acceso ATCC 37253, se usó como vector fuente a partir del cual se derivan los vectores posteriores descritos en el presente documento. El plásmido pUC18 contiene los siguientes emplazamientos de restricción desde 5' a 3' en el emplazamiento de clonación múltiple, no todos ellos se muestran en las representaciones esquemáticas de los vectores derivados de pUC18 de las la Figura 1: Eco RI; Sac I; Kpn I; Sma I y Sma I localizados en la misma posición; Bam HI; Xba I; Sal I, Acc I y Hinc II localizados en la misma posición; Pst I; Sph I y Hind III. El vector pUC18 se digirió en primer lugar con Hind III para formar un pUC18 linearizado. Se crearon a continuación los extremos enromados rellenando los extremos Hind III con un fragmento grande de ADN polimerasa I tal como se describe en Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, eds. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1982).

El vector pUC18 resultante linearizado de extremos enromados se ligó con un fragmento Hinf I de 740 pares de bases (pb) procedente de un gen ADH de Drosophila melanogaster que contiene una señal de poliadenilación. El alelo ligado ADH se aisló por primera vez a partir del plásmido pSACI, descrito por Goldberg y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5794-5798 (1980), por mediante digestión con Hinf I seguido por enromado de los extreme con Klenow dando como resultado la secuencia de nucleótidos relacionada en SEC DE ID Nº 1. El vector pSACI que contiene el alelo ADH se construyó mediante subclonación en pBR322 (número de acceso ATCC 31344), un fragmento Eco RI de 4,7 kilobases (kb) de ADN de Drosophila seleccionado a partir de una biblioteca de bacteriófago lambda que contiene aleatorios de alto peso molecular (más de 15kb). El emplazamiento de restricción Hinf I 5' se produce de manera natural en el gen ADH en la posición 1770, tal como se describe por Kreitman, Nature, 304:412-417 (1983). El emplazamiento Hinf I 3' se derivó del vector pUC18 en el que se ha clonado el gen ADH. Esta posición se encuentra a cuatro bases 3' del emplazamiento Xba I en la posición 2.500 del gen ADH. El segmento de ADH se extiende desde 35 pb corriente debajo de la secuencia de poliadenilación/rotura en la porción 3' no traducida del ARNm de ADH hasta 700 pb corriente abajo de la señal de poliadenilación. El vector derivado de pUC18 resultante que contiene el fragmento de gen ADH se designó como pHa-1 como se muestra en la Figura 1A.

Se obtuvo un fragmento de gen Eco RI/Stu I MT de 421 pb para la inserción en pHa-1 a partir de un clon que contenía aproximadamente 15.3 kb en una biblioteca genómica de ADN de Drosophila melanogaster. La biblioteca, tratada con una digestión parcial con Mbo I de un ADN imaginario, se clonó en el derivado lambda EMBL4. El fragmento de 421 pb contiene el promotor MT y los elementos de consenso de respuesta a metal del gen MT de Drosophila (Maroni y col., Genetics, 112:493-504 (1986)). Esta región, que contiene el promotor y la región de inicio de transcripción en la posición del nucleótido +1, que se corresponde con la posición -370 a la posición del nucleótido +57 del gen MT (SEC. de ID. Nº 2). El fragmento resultante se ligó a continuación con el vector de expresión pHa-1 preparado más arriba que se linearizó previamente con Eco RI y Sma I. El extremo romo 3' en MT creado mediante digestión con Stu I era compatible con el extremo romo de pHa-1 creado por digestión con Stu I El vector derivado pUCl8 resultante que contiene un fragmento 5' del gen MT de Drosophila y un fragmento 3' del gen ADH se denominó como pRmHa-1. El vector de expresión pRmHa-1 contiene un origen de replicación (ori) y el gen de la beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina (Amp^{r}) desde pUC18 como se muestra en la Figura 1A en el vector pHa-1. El pRmHa-1 contiene desde 5' a 3' fragmento de gen MT, el emplazamiento de clonación múltiple y el fragmento de gen ADH. El vector pRmHa-1 se usa tal como se describe más adelante en la construcción del vector de expresión pRmHa-3.

B. Preparación del vector de expresión pRmHa-2

Para construir el pRmHa-2 mostrado en la Figura 1A, el fragmento MT preparado más arriba se insertó en el vector pHa-1 derivado de pUC18 tal como se describe para la construcción del pRmHa-1 anterior con pocas modificaciones. Se añadió un enlazante Eco RI en el emplazamiento Stu I del fragmento de gen MT aislado con Eco RI/Stu I preparado más arriba para formar una fragmento metalotioneína que tiene emplazamientos de restricción Eco RI en ambos extremos. El fragmento resultante se ligó a continuación en el fragmento ADH que contiene el vector de expresión pUC18 previamente linearizado con Eco RI.

El vector derivado de pUC18 resultante que contiene un fragmento de gen MT 5' Drosophila y un fragmento del gen ADH 3' que tiene dos emplazamientos de restricción Eco RI 5' en el emplazamiento de clonación múltiple se denominó pRmHa-2. El vector de expresión pRmHa-2 contiene un origen de replicación (ori) y el gen de la beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina (Amp^{r}) desde pUC18. El diagrama de pRmHa-2 muestra también las posiciones contiguas desde 5' a 3'en el fragmento de gen MT, el emplazamiento de clonación múltiple y el fragmento de gen ADH. El vector pRmHa-2 se usó junto con pRmHa-1 tal como se describe más adelante para la construcción del vector de expresión pRmHa-3.

C. Preparación del vector de expresión pRmHa-3

Para preparar el vector de expresión pRmHa-3 que tiene un único emplazamiento de restricción Eco RI, se ligó un fragmento procedente de pRmHa-2 en el pRmHa-1. Para esta construcción, el pRmHa-2, preparado más arriba, se digirió en primer lugar con Sph I. El fragmento Sph I resultante que se iniciaba en la mitad del gen MT y se extendía hacia el emplazamiento Sph I en el emplazamiento de clonación múltiple se aisló por vez primera a partir del vector pRmHa-2 y se ligó a continuación en el pRmHa-1 que se había modificado previamente para eliminar el emplazamiento de restricción Eco RI 5' en el fragmento de gen MT y a continuación se linearizó con Sph I. Este procedimiento se ilustra esquemáticamente en la Figura 1B. Para elimina el emplazamiento de restricción Eco RI, el vector se digirió en primer lugar con Eco RI para formar un vector linearizado, a continuación se enromó en la nucleasa Mung Bean y se volvió a enlazar.

Se muestra en la Figura 1C un esquema del vector pRmHa-3. Las posiciones relativas de los diferentes emplazamientos de restricción del vector pUC18 del que se deriva pRmHa-3 se indican en la figura. El vector pRmHa-3, que se deriva de pUC18, contiene un origen de replicación desde pUC18 y el gen de la beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina. Así, los fragmentos de ADN que codifican MHC tipo II se preparan en esta invención y se clonan en el emplazamiento de clonación múltiple de pRmHa-3 se regulan transcripcionalmente mediante el promotor MT y se poliadenilan mediante el gen ADH.

2. Preparación y expresión de los genes MHC tipo II A. Amplificación y expresión de los genes MHC tipo II

Los genes o ADNc que codifican que codifican cualquier MHC tipo II de mamífero preferidos se clonan usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Los cebadores descritos en el presente documento se usan para amplificar los ADNc apropiados de Tipo II en reacciones diferentes, que se clonan y secuencia. Para crear las proteínas MHC tipo II, se obtuvieron en premier lugar \alpha- y \beta-cadenas de ADNc de IA^{d} de murina de longitud completa mediante amplificación y modificación por PCR. Las secuencias de nucleótido completas de la \alpha-cadena de IA^{d} de murina se describieron por Benoist y col., Cell, 34:169-177 (1983) y también está relacionada en Genebank con el Número de Acceso K01923. Las secuencias de nucleótido completas de la \beta-cadena de IA^{d} de murina se describieron por Malissen y col., Science, 221:750-754 (1983) y también está relacionada en Genebank con los Números de Acceso K00007 y K00008. Para amplificar cada cadena, se usaron esplenocitos de ratón como fuente de ARN total. Al primera cadena de ADNc se sinterizó usando oligo(dT) y transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar. El ADNc resultante se usó en la reacción de amplificación por PCR usando los cebadores apropiados descritos más adelante, y un GeneAmp kit y un ciclador térmico (Perkin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT). Las condiciones de reacción preferiblemente contuvieron 1 \mug de plantilla ADNc y 200 nM de cada cebador oligonucleótido. Se realizaron treinta ciclos como sigue: (a) 1 minuto a 92ºC; (b) 1 minuto a 60ºC; y (c) 1 minuto a 72ºC. La reacción PCR se calentó a continuación a 99ºC durante 10 minutos para inactivar la polimerasa Taq y los extremos del ADN se enromaron con polimerasa T4 (Stratagene, La Jolla, CA).

Para todos los cebadores oligonucleótidos indicados en los Ejemplos, el cebador 5' se denomina también como cebador hacia delante o cebador sentido, ya que tiene la misma secuencia que la cadena superior del ADNc para hibridar con la cepa complementaria del fondo. Por el contrario, el cebador 3' se denomina también como hacia atrás o cebador antisentido, ya que tiene la misma secuencia que la cadena inferior del ADNc para hibridar con la cepa complementaria de la parte superior. Se amplificó el ADNc de la \alpha-cadena de IA^{d} de murina con el cebador 5' que tiene la secuencia de nucleótidos 5'CTTGAATTCCACCATGCCGTGCAGCAGAGCTCTGA3' (SEC DE ID Nº 3). El cebador 5' se diseñó también mediante un emplazamiento de restricción Eco RI para permitir la ligadura direccional de los productos amplificados en los vectores de expresión del receptor. El cebador 3' 5'TTTGGATCCTCATAAAGGCCCTGGGTGTC3' (SEC DE ID Nº 4) también se diseño para contener un emplazamiento de restricción Bam HI.

El ADNc \beta IA^{d} de longitud completa se amplificó con el cebador 5' hacia delante que tiene la secuencia de nucleótidos 5'CTTGAATTCCACCATGGCTCTGCAGATCCCCA3' (SEC DE ID Nº 5). El cebador 5' se diseñó también con un emplazamiento de restricción Eco RI para permitir la ligadura direccional de los productos amplificados en los vectores de expresión del receptor. El cebador 3' 5'TTTGGATCCTCACTGCAGGAGCCCTGCT3' (SEC DE ID Nº 6) también se diseño para contener un emplazamiento de restricción Bam HI. Los ADNc modificados que codifican las \alpha- y \beta-cadenas de ADNc de IA^{d} de murina en primer lugar se clonaron direccionalmente de manera separada en el polienlazante en los emplazamientos de restricción Eco RI y Bam del vector pRmHa-3 impulsado por el promotor de la metalotioneína, y a continuación se secuenció mediante técnicas de terminación de matriz en un secuenciador automático Applied Biosystem 373ª.

Las secuencias de nucleótido completas de las \alpha- y \beta-cadenas de ADNc de IA^{d} de murina clonadas en pRmHa-3 se relacionan respectivamente en las SEC DE ID Nros 7 y 8.

A continuación, los plásmidos separados se transfectaron en células de Drosophila melanogaster Schneider-2 (ATCC CRL 10974, Rockville, MD) tal como se describe en todas partes (Jackson y col., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 89;12117-21 1992). Cantidades iguales de las dos cadenas de plásmidos que codifican las dos cadenas de tipo II se con-transfectaron conjuntamente con un gen de Resistencia a la neomicina, plásmido phshsneo (Bunch y col., Nuc. Acid Res., 16:1043-1061 (1988)) en una relación de 1: para producir líneas celulares estables que se derivaron por selección de G418 en medio de Drosophila de Schneider (Gibco/BRL, Grand Island, NY) suplementado con suero de feto de ternera al 10% (tratado térmicamente durante 1 hora a 55ºC), 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y glutamina 1 mM durante un periodo de 4 semanas. Específicamente, tras la transfección, el sobrenadante se retiró cuidadosamente, y las células se transfirieron a un recipiente de 75 cm^{2} en un volumen total de medio de Schneider que contenía 500 \mug/ml de Geneticin (G418) (Gibco/BRL, Grand Island, NY). Tras 4 días, se transfirieron 4 ml de cultivo a un recipiente nuevo que contenía 6 ml de medio de Schneider que contenía 500 \mug/ml de G418. Este procedimiento se repitió cada 4-7 días hasta que apareció una población estable de células que se adherían débilmente al recipiente, y crecían con un tiempo de doblado de aproximadamente 24 horas. Estas células se cultivaron posteriormente y se pasaron al medio de selección como se describe más arriba. Se prepararon alícuotas congeladas recogiendo 5-20 x 10^{6} células mediante centrifugación, y se resuspendieron en 1 ml de medio de congelación celular (suero de feto de ternera al 93%/dimetilsulfóxido al 7%) A continuación, las alícuotas se colocaron a -70ºC durante 1 semana y posteriormente se transfirieron a almacenamiento en nitrógeno liquido. La expresión de los genes de \alpha- y \beta-cadenas de MHC tipo II transfectadas de forma estable se indujo con sulfato cúprico durante 24 horas a 27ºC.

La expresión de los heterodímeros MHC tipo II IA^{d} en la superficie celular de las células de Drosophila transfectadas se evaluó mediante citometría de flujo tras tinción con MKD6, un anticuerpo monoclonal específico de IA^{d} (Kappler y col., J. Exp. Med., 153:1198 (1981). En breve, alícuotas de células (5 X 10^{5}) se transfectaron en el interior de tubos sobre hielo, se recogieron por centrifugación(1.000 X g durante 5 minutos), se resuspendieron en 0,1 ml de medio Drosophila con suero de caballo al 5% que contiene el anticuerpo primario adecuado (MKD6). Tras una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, las células se lavaron dos veces en 3 ml de medio de Schneider con suero de caballo y se resuspendieron en 0,1 ml de medio que contiene anticuerpo secundario marcado con FITC (Cappell, Durham, NC). Tras 20 minutos de incubación sobre hielo, las células se lavaron dos veces en medio de Schneider con suero de caballo y se resuspendieron en el mismo tampón a una concentración de 1 X 10^{6}/ml. Se añadió bromuro de propidio para permitir la exclusión de células muertas para el análisis. A continuación, las muestras se analizaron con un instrumento FACScan o FACSort (Becton Dickinson). Las células que presentan el antígeno sintético de esta invención que expresan el haplotipo de murina IA^{d} MHC tipo II, descrito en el presente documento y bien conocido en la técnica se produjeron tal como se describe más adelante.

Se amplificaron las \alpha- y \beta-cadenas humanas de MHC tipo II de los haplotipos DR, DQ y DP a partir de glóbulos rojos de la sangre periférica que incluye células B, macrófados y células dendríticas. Los cebadores 5' y 3' usados para amplificar cada uno de los haplotipos tiene las siguientes secuencias:

DR \alpha: cebador 5' = 5'CCACCATGGCCATTAGTGGAGTC3 (SEC DE ID Nº 9)

cebador 3' = 5'TTTGGATCCTTACAGAGGCCCCCTGCGTT3 (SEC DE ID Nº10);

DR \beta: 5' cebador = 5'CCACCATGGTGTGTCTGAGGCTCC3' (SEC DE ID Nº 11)

3' cebador = 5'TTTGGATCCTCAGCTCAGGAATCCTCTTG3' (SEC DE ID Nº 12);

DQ \alpha: 5' cebador = 5'CCACCATGGTCCTAAACAAAGCTCTGAT3' (SEC DE ID Nº 13)

3' cebador = 5'TTTGGATCCTCACAAGGGCCCTTGGTGTCT3' (SEC DE ID Nº 14);

DQ \beta: 5' cebador = 5'CCACCATGGCTTGGAAGAAGGCCTTT3' (SEC DE ID Nº 15)

3' cebador = 5'TTTAGATCTCAGTGCAGAAGCCCTTT3' (SEC DE ID Nº 16);

DP \alpha: 5' cebador = 5'CCACCATGGGCCCTGAAGACAGAAT3' (SEC DE ID Nº 17)

3' cebador = 5'TTTGGATCCTCACAGGGTCCCCTGGGC3 (SEC DE ID Nº 18);

DP \beta: 5' cebador = 5'CCACCATGGTTCTGCAGGTTTCTGCG3' (SEC DE ID Nº 19)

3 cebador = 5'TTTGGATCCTTATGCAGATCCTCGTTGAA3' (SEC DE ID Nº 20).

Las condiciones de amplificación para obtener los haplotipos humanos anteriores son idénticos a los descritos más arriba para las contrapartes de murina.

Las células que presentan el antígeno sintético de esta invención que expresan haplotipos humanos MHC tipo II, descritos en el presente documento y bien conocidos en la técnica, con uno o más moléculas ayudante se produjeron tal como se describe más adelante.

B. Amplificación de ADNc de las cadenas invariante y HLA-DM

Para algunos aspectos de la presente invención tal como se describe en el Apartado B de la descripción detallada, la cadena invariante y HLA-DM a y HLA-DM se co-expresan con un heterodímero MHC tipo II seleccionado y al menos una molécula ayudante descritos más arriba. En este caso, las \alpha- y \beta-cadenas de MHC tipo II, cadena invariante y \alpha- y \beta-cadenas de HLA-DM se transfectan en las células que presentan el antígeno extraño en relaciones molare de 5:5:8:1:1. La relación de moléculas ayudante a la relación molar de otros genes es 1:1. Las células resultantes transfectadas se indujeron a continuación para la expresión de los genes exógenos tal como se ha descrito más arriba para generar una célula que presentan el antígeno sintético de esta invención.

1) Cadena invariante

El ADNc de cadena invariante de murina se genera a partir de células de bazo de ratón. La cadena invariante de longitud completa se amplifica a partir de esta fuente con el par de cebadores de un cebador 5' y 3' que tienen las secuencias de nucleótidos respectivas 5'AAGAATTCACTAGAGGCTAGAGCCAT3' (SEC DE ID Nº 21) y 5'AAG
GATCCTCACAGGGTGACTTGACC3' (SEC DE ID Nº 22).Tal como se ha descrito más arriba, los cebadores 5' y 3' se diseñaron para incorporar de forma respectiva los emplazamientos de restricción Eco RI y Bam HI. Tras la clonación de la cadena invariante amplificada en el vector pRmHa-3 digerido con Eco RI/Bam HI, se secuenció el clon resultante y se determinó que tenía la secuencia relacionada en la SEC DE ID Nº 23.

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El ADNc de cadena invariante humana usada en esta invención se generó usando ARN procedente de células HeLa inducidas por \gamma-interferón (Número de Acceso ATCC CCL 2). El ADNc resultante se usa a continuación como plantilla de PCR con los cebadores oligonucleótidos 5' y 3' que tienen las secuencias de nucleótido respectivas 5'AAGAATTCACCATGGATGATCAGCGCGACCTT3' (SEC DE ID Nº 24) y 5'AAAGGATCCTCACATGGG
GACTGGGCCCAGA3' (SEC DE ID Nº 25). Los fragmentos PCR resultantes se rompieron con Eco RI y Bam HI antes de la ligadura en pRmHa-3 digerido de manera similar.

2) HLA-DM

El ARN mensajero procedente de células HeLa inducidas por \gamma-interferón se usó también para sintetizar las \alpha- y \beta-cadenas de ADNc de HLA DM que se usó a continuación como plantilla de PCR. La cadena a se amplificó con el par de cebadores 5' y 3' que tienen las secuencias de nucleótido respectivas 5'AAACCATGGGTCATGAACAGAAC
CA3' (SEC DE ID Nº 26) y 5'TTTGTCGACTCAGTCACCTGAGCAAGG3' (SEC DE ID Nº 27). La cadena b se amplificó con el par de cebadores 5' y 3' que tienen las secuencias de nucleótido respectivas 5'AAACCATGGTCT
CATTCCTGCC3' (SEC DE ID Nº 28) y 5'TTTGTCGACCTAGGAAATGTGCCATCC3''(SEC DE ID Nº 29). Los fragmentos PCR resultantes se rompieron con Nco I y Sal antes de la ligadura en pRmHa-3 digerido de manera similar.

C. amplificación de genes que codifican moléculas ayudantes 1) Moléculas de adhesión a. ICAM-1. ICAM-2, y ICAM-3

Para aislar ICAM-1 de murina, se aislaron células de bazo de ratones Balb/c. Las células de bazo se estimularon en primer lugar con conA antes del aislamiento del ARNm usando el kit FastTrack (Invitrogen, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizó a partir del ARNm tal como se ha descrito más arriba. El ADNc resultante se sometió a continuación a PCR con los cebadores respectivos 5' y 3' que se designaron basándose en la secuencia de nucleótidos de ADNc publicada (Siu, G. y col., J. Immunol., 143:3813-3820 (1989)): 5'TTTAGAATTCACCATGGCTTCAACCCGTGCCAAG3' (SEC DE ID Nº 30) y 5'TTTAGTCGACT
CAGGGAGGTGGGGCTTGTCC3' (SEC DE ID Nº 31). Los productos PCR resultantes se rompieron a continuación con los enzimas de restricción Eco RI y Sal I y se ligaron en un pRmHa-3 digerido de manera similar.

El constructo de expresión anterior se con-transfectó en células de Drosophila S2 con los genes de \alpha- y \beta-cadenas IA^{d} preparados más arriba usando el procedimiento del fosfato de calcio tal como se ha descrito más arriba en la relación molar de 1:1:1 ICAM-1: \alpha-cadena:\beta-cadena. Se obtuvieron células transfectadas de forma estable tal como se ha descrito más arriba. Las células Drosophila S2 que presentan el antígeno sintético que expresan la molécula ayudante ICAM-1 con las de \alpha- y \beta-cadenas IA^{d} sobre la superficie de la célula se produjeron a continuación incluyendo la expresión como se ha descrito previamente.

En otras formas de realización, las células que presentan el antígeno sintético contienen genes que codifican ICAM-1, B7.1 y/o B7.2 junto con las moléculas IA^{d} de murina se produjeron también para generar células que presentan el antígeno sintético tal como se usa en los ensayos de activación descritos en el Ejemplo 5.

La ICAM-1 humana se amplifica de manera similar a partir de ARNm asilado de la línea celular humana K562, originada a partir de leucemia mielogénica crónica humana (Número de acceso ATCC CCL-243) y cultivada en condiciones recomendadas (es decir, RPMI con suero de feto de ternera al 10% a 37ºC con CO_{2} al 5%). Los cebadores PCR para amplificar las moléculas ayudante humanas se diseñan basándose en las secuencias conocidas disponibles, y en consideración de los emplazamientos de clonación 5' y 3' necesarios para clonar en los vectores apropiados. La secuencia de nucleótidos del ADNc ICAM-1 está disponible mediante el Número de Acceso GenBank GB J03132. Los cebadores 5' y 3' de ICAM-1 tienen las secuencias de nucleótido respectivas 5'ACCCTTGAATTCATGGCTCCCAG
CAGCCCCCGGCCC3' (SEC DE ID Nº 32) y 5'ATTACCGGATCCTCAGGGAGGCGTGGCTTGTGTGTTCGG3' (SEC DE ID Nº 33).

La PCR se lleva a cabo con estos cebadores tal como se ha descrito más arriba para obtener la ICAM-1 humana amplificada. Los productos PCR resultantes se clonan a continuación en pRmHa-3 cebadores tal como se ha descrito más arriba seguido por transfección a células receptoras, igualmente tal como se ha descrito más arriba.

De manera similar, las ICAM-2 y ICAM-3 humanas, las secuencias de las cuales están disponibles con los respectivos Números de Acceso Genbank GB X15606 y GB S50015, se amplificaron con pares de cebadores comparables. Los respectivos cebadores 5' y 3' para amplificar ICAM-2 tienen las secuencia de nucleótidos 5'AAGGTACCCGTG
GAGACTGCCAGAGAT3' (SEC DE ID Nº 34) y 5'TTTGGATCCCTATGGCCGGAAGGCCTG3' (SEC DE ID Nº 35). Los respectivos cebadores 5' y 3' respectivas para amplificar ICAM-3 tienen las secuencias de nucleótidos 5'AA
GAATTCCTGTCAGAATGGCCACCAT3' (SEC DE ID Nº 36) y 5'TTTAGATCTTCACTCAGCTCTGGACGGT' (SEC DE ID Nº 37). Los productos amplificados ICAM resultantes se enlazaron separadamente en pRmHa-3 y se transfectaron separadamente en células de Drosophila S2.

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Las células de Drosophila S2 que presentan el antígeno sintético expresan la molécula ayudante ICAM-1 con un haplotipo MHC tipo II humano seleccionado sobre la superficie de la célula se producen a continuación incluyendo la expresión tal como se describe más arriba.

En otras formas de realización, las células que presentan el antígeno contienen genes que codifican ICAM-1, ICAM-2 o ICAM-3 en combinación con B7.1 y/o B7.2 y un haplotipo humano se producen también para generar células que presentan el antígeno sintético tal como se usa en los ensayos de activación que se describen en el Ejemplo 5. Las permutaciones adicionales contempladas para uso en esta invención incluye las combinaciones anteriores con LFA-3 y/o ligando Fas (FasL), ambas son otras moléculas ayudante que se describen más adelante.

b. LFA-3

La LFA-3 humana se aísla a partir de linfocitos sanguíneos. La secuencia de nucleótidos del ADNc de LFA-3 humano es accesible mediante el Número de Acceso GenBank GB I09083. La LFA-3 humana se amplifica de acuerdo con ello con un cebador 5' y 3' que tienen las secuencias de nucleótidos respectivas 5'ACCCTTGAGCT
CATGGTTGCTGGGAGCGACGCGGGG3' (SEC DE ID Nº 38) y 5'ATTACCGGATCCTTAAAGAACATTCATA
TACAGCACAATACA3' (SEC DE ID Nº 39).

Tal como se describe más arriba, las células que presentan el antígeno sintético contienen genes que codifican la LFA-3 humana sola o en diferentes combinaciones con el resto de moléculas ayudante descrito en el presente documento junto con un haplotipo humano se producen también para generar células que presentan el antígeno sintético tal como se usa en los ensayos de activación que se describen en el Ejemplo 5.

2) Moléculas Co-estimulantes a. B7.1

Se generó el ADNc a partir de ARNm aislado a partir de ratones tal como se ha descrito más arriba para ICAM-1. El ADNc resultante se sometió a continuación a PCR con los siguientes cebadores oligonucleótidos 5' y 3' respectivos mostrados en la dirección desde 5' a 3' que se diseñaron basándose en la secuencia de nucleótidos publicada del ADNc (Freeman, y col., J. Exp. Med., 174:625-631 (1991)): 5'TTTAGAATTCACCATGGCTTGCAATTGT
CAGTTG3' (SEC DE ID Nº 40) y 5'TTTAGTCGACCTAAAGGAAGACGGTCTGTTC3' (SEC DE ID Nº 41). Los productos PCR se rompieron con los enzimas de restricción Eco RI y Sal I y se enlazaron en un pRmHa-3 digerido de manera similar.

El constructo de expresión anterior se con-transfectó en células de Drosophila S2 con los genes de \alpha- y \beta-cadenas IA^{d} preparados más arriba usando el procedimiento del fosfato de calcio tal como se ha descrito más arriba en la relación molar de 1:1:1 ICAM-1: \alpha-cadena:\beta-cadena. Se obtuvieron células transfectadas de forma estable tal como se ha descrito más arriba. Las células Drosophila S2 que presentan el antígeno sintético que expresan la molécula ayudante B7.1 con las de \alpha- y \beta-cadenas IA^{d} sobre la superficie de la célula se produjeron a continuación incluyendo la expresión como se ha descrito previamente.

En otras formas de realización, las células que presentan el antígeno sintético contienen genes que codifican ICAM-1, B7.1 y/o B7.2 de murina junto con las moléculas IA^{d} de murina se produjeron también para generar células que presentan el antígeno sintético tal como se usa en los ensayos de activación descritos en el Ejemplo 5.

La B7.1 humana se aísla de manera similar a partir de células K562 y se clonaron en pRmHa-3 tal como se ha descrito más arriba. La secuencia de nucleótidos del ADNc de B7.1 está disponible mediante el Número de Acceso GenBank GB M83071. Los cebadores 5' y 3' tienen las secuencias de nucleótido respectivas 5'ACCCTT
GAATCCATGGGCCACACACGGAGGCAG3' (SEC DE ID Nº 42) y 5'ATTACCGGATCCTTATACAGGGCGTA
CACTTTCCCTTCT3' (SEC DE ID Nº 43).

Los productos PCR resultantes se insertaron a continuación en el pRmHa-3 que se con-transfectó a continuación con genes de haplotipo humano clonado y amplificado en células de Drosophila S2.

Las células Drosophila S2 que presentan el antígeno sintético que expresan la molécula ayudante B7.1 con un haplotipo MHC tipo II humano seleccionado sobre la superficie celular se produjeron a continuación induciendo la expresión tal como se ha descrito más arriba.

En otras formas de realización, las células que presentan el antígeno sintético contienen genes que codifican B7.humana en varias combinaciones con el resto de moléculas ayudante descritas en el presente documento junto con un haplotipo humano se produjeron también para generar células que presentan el antígeno sintético tal como se usa en los ensayos de activación que se describen en el Ejemplo 5.

b. B7.2

Las células IC-21 de murina (Número de acceso ATCC TIB 186) se propagaron en medio RPMI 1640 que contiene suero de ternera fetal al 10%. El ADNc se sintetizó a partir de ARNm aislado a partir de estas células tal como se ha descrito más arriba. El ADNc resultante se sometió a PCR con los siguientes cebadores oligonucleótidos 5' y 3' mostrados en la dirección desde 5' a 3' que se diseñaron basándose en la secuencia de nucleótidos publicada del ADNc (Freeman, y col., J. Exp. Med., 178:2185-2192 (1993)): 5'TTTAGAATTCACCATGGACCCCAGATGCAC
CATGGG3' (SEC DE ID Nº 44) y 5'TTTAGTCGACTCACTCTGCATTTGGTTTTGCTGA3' (SEC DE ID Nº 45). Los productos PCR se rompieron con los enzimas de restricción Eco RI y Sal I y se enlazaron en un pRmHa-3 digerido de manera similar.

El constructo de expresión anterior se con-transfectó en células de Drosophila S2 con los genes de \alpha- y \beta-cadenas IA^{d} preparados más arriba usando el procedimiento del fosfato de calcio tal como se ha descrito más arriba en la relación molar de 1:1:1 B7.2: \alpha-cadena:\beta-cadena. Se obtuvieron células transfectadas de forma estable tal como se ha descrito más arriba. Las células Drosophila S2 que presentan el antígeno sintético que expresan la molécula ayudante B7.2 con las de \alpha- y \beta-cadenas IA^{d} sobre la superficie de la célula se produjeron a continuación incluyendo la expresión como se ha descrito previamente.

En otras formas de realización, las células que presentan el antígeno sintético contienen genes que codifican B7.2 de murina junto con las moléculas ICAM-1 y IA^{d} de murina se produjeron también para generar células que presentan el antígeno sintético tal como se usa en los ensayos de activación descritos en el Ejemplo 5.

La B7.2 humana se aísla a partir de la línea celular humana HL60, que se origina a partir de leucemia promielocítica humana (Número de Acceso ATCC CCL-240). La secuencia de nucleótidos del ADNc de B7.2 humano está disponible mediante el Número de Acceso GenBank GB M83071. Los cebadores 5' y 3' para amplificar la B7.2 humana tienen las respectivas secuencias de nucleótido 5' ACCCTTGAGCTCATGGATCCCCAGTGCACTATG3' (SEC DE ID Nº 46) y 5'ATTACCCCCGGGTTAAAAACATGTATCACTTTTGTCGCATGA3' (SEC DE ID Nº 47).

Los productos amplificados de B7.2 se clonaron a continuación en pRmHa-3 como se ha descrito más arriba para la transfección en células Drosophila S2 junto con constructos para un haplotipo humano seleccionado. La expresión de los genes transfectados se induce tal como se ha descrito más arriba.

En otras formas de realización, las células que presentan el antígeno sintético contienen genes que codifican B7.2 humano en varias combinaciones con el resto de moléculas ayudantes descritas en el presente documento junto con un haplotipo humano se producen también para generar células que presentan el antígeno sintético tal como se usa en los ensayos de activación que se describen en el Ejemplo 5.

3. Moléculas de supervivencia

El ligando Fas humano se aisló de células T activadas humana. La secuencia de nucleótidos del ADNc del ligando Fas humano está disponible mediante el Número de Acceso GB GenBank U08137. El ligando Fas humano se amplificó de acuerdo con un par de cebadores 5' y 3' que tienen las respectivas secuencias de nucleótido 5'AAAGGATCCACCATGCAGCAGCCCTTCAATT3' (SEC DE ID Nº 48) y 5'TTTGGATCCTTAGAGCTTATATAAGCCGA3' (SEC DE ID Nº 49).

El CD70 humano, el ligando de CD27 que se expresa en células T, se amplifica tal como se describe más arriba con un par de cebadores 5' y 3' que tienen las respectivas secuencias de nucleótido 5'AAAGAATTCGGTACCATGCCG
GAGGAGGGTTCGG3' (SEC DE ID Nº 50) y 5'TTTGGATCCTCAGGGGCGCACCCACTGCA3' (SEC DE ID Nº 51).

Tal como se describe más arriba, las células que presentan el antígeno sintético que contiene genes que codifican el ligando Fas humano en solitario o en diferentes combinaciones con el resto de moléculas ayudantes descritas en el presente documento junto con un haplotipo humano se producen también para generar células que presentan el antígeno sintético tal como se usa en los ensayos de activación que se describen en el Ejemplo 5.

3. Preparación de MHC Tipo II anclada en soportes sintéticos

Los ejemplos descritos en el presente documento presentan un procedimiento nuevo para inmovilizar grandes cantidades de moléculas MHC tipo II y moléculas ayudante sencillas o diferentes combinaciones de las mismas en varias superficies (células de mosca, glóbulos rojos, perlas de látex) en conformación nativa, tal como se juzga por enlace de anticuerpos monoclonales y experimentos de rosetización (enlace con el recepto de células T). Este procedimientos se pueden aplicar a otras superficies sintética, incluyendo membranas de fosfolípido. La fosfatidiletanolamina, así como los fosfolípidos acoplados con avidina son particularmente relevantes en esta invención. Estos fosfolípidos están comercialmente disponibles de Lipex Biomembrane Inc., Vancouver, BC, Canadá.

A. Inmovilización de MHC Tipo II biotinilada sobre glóbulos rojos recubiertos con avidina

NHS-LC-biotina, neutravidina y biotina-BMCC se obtuvieron de Pierce (Rockford, IL). Se obtuvieron glóbulos rojos de oveja de la Colorado Serum Company (Denver, CO). Las células Drosophila S2 que expresan MHC tipo II se prepararon tal como se ha descrito más arriba. Se usaron los anticuerpos monoclonales MKD6 y M5-114 (ATCC de Acceso Número TIB 120 para el hibridoma que secreta MKD6) como sobrenadantes de cultivo de células de hibridoma. El protocolo usado se describe en Muzykantov y Taylor (Anal. Biochem., 223:142-148 (1994)). En resumen, SRBC se lavó cuatro veces en PBS, se biotiniló con NHS-LC-biotina, se lavó cuatro veces más en PBS, se incubó con neutavidina, y finalmente se lavó cuatro veces más en PBS, y se almacenó a 4ºC en PBS que contenía suero de feto de ternera al 3%, y azida de sodio al 0,02%. Las \alpha- y \beta-cadenas de MHC tipo II recombinantes expresadas se biotinilaron usando biotina-BMCC, una biotina acoplada con maleimida que reacciona con grupos tiol. Se llevó a cabo la biotinilación tal como recomienda el fabricante. La biotina sin reaccionar se elimina usando Centricon
10.

Las \alpha- y \beta-cadenas de MHC tipo II biotiniladas se inmovilizaron por incubación a una concentración final de 0,2 mg/ml de SRBM recubierto con avidina durante 30 minutos, seguido por lavado en DMEM que contiene suero de feto de ternera al 10%. El SRBC con MHC tipo II enlazadas se usaron inmediatamente.

La inmovilización de las \alpha- y \beta-cadenas de MHC tipo II biotiniladas sobre SRBM recubierto con avidina se realizó como se indica más arriba. Se evaluó la ligadura usando citofluorometría de flujo usando los anticuerpos descritos más arriba. Para los ensayos de rosetización, se usaron tanto células de Drosophila S2 que expresaban MHC tipo II o SRBC recubiertos con MHC tipo II se incuban con el péptido específico (véase Ejemplo 4) (0,02 mM) o un péptido irrelevante péptido (0,02 mM) durante 30 minutos sobre hielo; a continuación se añadieron las células TCD4^{+}, siendo la proporción de 10 células T por una célula Drosophila S2 o SRBC por 1 célula T. La mezcla se aglomeró y se mantuvo en hielo durante al menos 30 minutos. A continuación, las células se resuspendieron cuidadosamente y se contaron las rosetas, siendo una roseta una célula de Drosophila S2 enlazada con al menos 3 células TCD4^{+}, o una célula TCD4^{+} enlazada con al menos 3 SRBC.

B. Inmovilización de MHC Tipo II biotinilada sobre perlas de látex recubiertas con avidina

Se consiguieron perlas de sulfato de látex de 6 micrómetros de diámetro de Dynamics Corporation (Portland, O) y se biotinilaron de acuerdo con el protocolo descrito más arriba. La perlas de látex recubiertas con avitina se prepararon usando una suspensión de perlas de látex al 1% incubadas en PBS que contenía 1 mg/ml de neutravidina durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió a continuación el mismo volumen de suero de feto de ternera al 10%. Tras 1 hora de incubación a temperatura ambiente, las perlas se lavaron 3 veces se usaron para enlace con MHC tipo II recombinante biotinilado.

El MHC tipo II recombinante biotinilado se inmovilizó por incubación hasta una concentración final de 0,2 mg/ml con perlas de látex recubiertas de avidita durante 30 minutos, seguido por lavado con DMEM que contiene suero de feto de ternera al 10%. Se usó inmediatamente el SRBC con MHC tipo II unido. Se realizaron los experimentos de reseteado tal como se ha descrito más arriba.

C. Inmovilización y Detección de MHC Tipo II enlazado a varios soportes sólidos como placas de microvaloración de plástico

Las moléculas MHC de tipo II se inmovilizaron mediante enlace directo a placas de microvaloración (Corning) y se detectaron como sigue: se diluyó MHC tipo II hasta la concentración deseada en PNS, por ejemplo 1 mg/ml para 100 ng/pocillo, y se añadió a continuación a cada pocillo de la placa de microvaloración de plástico. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras la incubación, la placa se lavó una vez con PBS y 200 ml de albúmina de suero bovino al 2% (BSA) en PBS + (0,05%) y se añadió Tween (PBST) seguido por incubación durante otra hora a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con PBST y se añadió anticuerpo monoclonal biotinilado anti-MHC tipo II (1:2500) en BSA al 2% en PBS. La placa se incubó otra hora a temperatura ambiente y se lavó 3 veces con PBST. Se añadió HRP conjugado con avidina (1:2500) en BSA al 2% en PBS. Tras incubación durante otra hora a temperatura ambiente, la placa se lavó 3 veces con PBST y se añadió H_{2}O_{2} o tofenildiamina. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4}. El producto de la reacción se detectó colorimétricamente a 490 nm. Las moléculas MHC tipo II recombinantes pueden enlazarse alternativamente a través de interacciones enlazadas biotina-avidina con el sustrato. En esta forma de realización, la placa de microvaloración está recubierta con 100 ml de avidita diluida en PBS hasta una concentración de 0,001 mg/ml. El exceso de avidita se elimina mediante lavado con PBS. Se sigue el procedimiento anterior para presentar y detectar el enlace MHC tipo II.

Las moléculas MHC recombinantes se inmovilizan alternativamente mediante un enlace basado en una marca de polihistidina añadida al MHC que interactúa con el níquel enlazado al sustrato.

El procedimiento anterior para enlace y detección se sigue usando placas de microvaloración recubiertas con quelato de níquel (Xenopore), y expresaron las moléculas MHC recombinantes con una marca de polihistidina.

4. Generación del péptido

Los péptidos antigénicos de acuerdo con la presente invención se obtienen de fuentes naturales, incluyendo las que se describen en la memoria, o se pueden sintetizar usando procedimientos conocidos. En los diferentes ejemplos descritos en el presente documento, todos los péptidos se sintetizaron separadamente de manera química mediante química T-BOC en un equipo Applied Biosystem instrument, ABI 431A (Foster City, CA), y se purificaron en una columna de fase reversa C18. El asilamiento o síntesis de péptidos generados a partir de un mezclado aleatorio de residuos de aminoácidos también puede ser apropiado, particularmente cuando se intenta comprobar un epitope concreto con el fin de cargar una molécula MHC vacía con un péptido que más probablemente estimule las células CD4. Se obtienen mezclas de péptidos aleatorizados usando proteosomas, sometiendo la proteína o polipéptido a un procedimiento degradativo, tal como digestión con quimiotripsina, o mediante síntesis.

Aunque la líneas celulares de la presente invención son capaces de degradar proteínas y polipéptidos en péptidos más pequeños capaces de cargarse en moléculas MHC tipo II humanas, se prefiere introducir los péptidos directamente en el cultivo celular para facilitar una carga y procedimiento de expresión más rápidos.

Si los péptidos se sintetizan con residuos de aminoácido incorporados de manera aleatoria, todas las variedades de aminoácidos, conformaciones L o D así como aminoácidos modificados, se incorporan preferiblemente durante cada ciclo de síntesis. Debe notarse, sin embargo, que diferentes parámetros, por ejemplo, la incompatibilidad entre solventes, puede dar lugar a una mezcla que contienen péptidos que carecen de ciertos aminoácidos. El procedimiento por tanto debería ajustarse según necesidad, alterando solventes y condiciones de reacción, para producir la mayor variedad de péptidos. Un péptido usado para carga de péptido tal como se describe en el Ejemplo 5 con MHC tipo II de murina es la ovoalbúmina_{323-339} (OVA), que tiene la secuencia de residuos de aminoácido ISQAVHAAHAEINEAGR (SEC DE ID Nº 52). Los péptidos específicos preferidos para los haplotipos MHC tipo II humanos incluye los siguientes péptidos: 1) hemaglutinina_{306-318} de la gripe PKYVKQNTLKLAT (SEC DE ID Nº 53) que se enlaza con HLDRB1*0101; 2) HSP65_{2-12} de M. tuberculosis KTIATDEEARR (SEC DE ID Nº 54) que se enlaza con HLA-DRB1*0301; 3) proteína externa mitocondrial (MOMP) de C. trachomatis QASLALSYRLNMFTP (SEC DE ID Nº 55) que se enlaza con HLA-DRB1*0301; y 4) HLA-A2_{33-45} FVRFDSDAASQRM (SEC DE ID Nº 56) que se enlaza con HLA-DRB1*0401. Un listado extenso de péptidos conocidos enlazante de tipo II, así como la descripción de cómo se definen los ligandos de péptido se presenta en Rammensee y col., Immunogenetlcs, 41:178-228 (1995). Los péptidos para uso en la práctica de los procedimientos de esta invención están disponibles también de Chiron Mimetopes. En otras formas de realización, las bibliotecas de péptidos, producidas fácilmente por una persona experta en la técnica, se contempla para uso en la práctica de los procedimientos de esta invención con las células que presentan el antígeno sintético tal como se describen en el presente documento.

5. Carga de moléculas MHC tipo II vacías mediante incubación In vitro con péptidos

Tal como se muestra mediante los resultados presentados más adelante, las moléculas MHC de tipo II de murina junto con las moléculas ayudante seleccionadas expresadas en la superficie de las líneas celulares de Drosophila, que se han transfectado con diferentes combinaciones de plásmidos que codifican MHC tipo II y moléculas ayudante, se enlazan a péptidos específicos en forma dependiente de la dosis, y son capaces de presentar estos péptidos a células T específicas de antígenos dando como resultado la activación de células T.

Para los ensayos de proliferación y activación realizados más adelante, se transfectaron células Schneider 2 (SC2) de Drosophila melanogaster (Número de Acceso ATCC CRL 10974) con genes que codifican las \alpha- y \beta-cadenas de MHC tipo II de H2-A^{d} tal como se describe en el Ejemplo 2. Para otros ensayos, en los que las células ayudante seleccionadas se expresan en combinación con las moléculas MHC de tipo II, los genes de B7.1, B7.2 y ICAM-1, se introdujeron también en las células que contienen el gen MHC, tal como se ha descrito más
arriba.

Las moléculas ayudantes se expresaron a concentraciones y combinaciones seleccionadas tal como se define más adelante para permitir la activación reproducible y consistente de células CD4^{+}. Tras la expresión, inducida por tratamiento con sulfato de cobre, se controlaron las concentraciones de las moléculas expresadas. La selección de células que expresan los noveles deseados de moléculas se llevó a cabo mediante clasificación de líneas celulares con citometría de flujo- La Tabla I relaciona las líneas celulares de Drosophila que expresan moléculas MHC tipo II de murina IA^{d}, solas o en combinación con diferentes moléculas ayudantes. La tabla presenta también un resumen de los resultados de los efectos proliferativos, descritos con más detalle más adelante, tal como se indica mediante "-" para sin efecto y con "+" para un efecto proliferativo positivo. Se indica también un resumen de los tipos de citoquinas producidas por cada tipo de células que presentan el antígeno sintético, y se describe con más detalle más adelante, con la notación adicional con flechas de si la producción de una citoquina concreta se regulaba al alza o a la
baja.

TABLA 1

3

Para evaluar el efecto de la presentación del antígeno y finalmente la respuesta de células T, las células T específicas del antígeno fueron células CD4^{+} obtenidas a partir del receptor de células T del ratón transgénico. La línea transgénica tal como se usa en el presente documento fue D01 que expresa un receptor de células T específico del péptido ovoalbúmina 323-339. La línea de ratón D01 se obtuvo del Dr. Dennis Lo. Para ensayar la respuesta de las moléculas MHC tipo II recombinantes expresadas en la superficie, las células CD4 se purificaron en primer lugar a partir de nódulos linfáticos usando una combinación de técnicas diseñadas para eliminar todos el APC huésped de la población de respuesta. Cantidades pequeñas (5 x 10^{4}) de estas células CD4^{+} altamente purificadas se cultivaron en las líneas celulares de Drosophila en presencia o ausencia del péptido ova.

El efecto de la presentación del péptido en presencia de MHC tipo II con y sin las moléculas ayudantes B7.1, B7.2 o B7.2 más ICAM-1, se evaluó en primer lugar mediante un ensayo de proliferación realizado tal como se describe en Webb y col., Cell, 63:1249 (1990). En resumen, 5 x 10^{4} células TCD4^{+} se cultivaron en pocillos de microvaloración con 5 x 10^{4} células de Drosophila en 300 ml de medio de cultivo. Dieciocho horas antes del cosechado se retiraron 100 ml de sobrenadante para análisis de citoquina y se añadió 1 \muCi de ^{3}H-timidina a cada pocillo. En los tiempos indicados. (3, 4 ó 5 días), los pocillos se cosecharon individualmente sobre filtros de fibra de vidrio y se contaron en un contador de centelleo en medio líquido.

Como se ve en la Figura 2, las líneas celulares que expresan las moléculas MHC tipo II en solitario no consiguieron estimular las respuestas proliferativas de células T, tal como indica la baja incorporación de timidina radioactiva, mayores conteos indican mayor proliferación representada frente a la cantidad de péptido estimulante, en mM. Sin embargo, la coexpresión de cualquiera de las moléculas co-estimulantes B7.1 o B7.2 proporcionó la capacidad del péptido ova presentado en MHC tipo II para estimular fuertes respuestas proliferativas. Por comparación, los resultados con APC esplénico (marcado T-S) se muestran en la Figura 2.

Como se muestra en la Figura 3, las líneas celulares de Drosophila que expresan moléculas MHC de tipo II con la molécula de adhesión ICAM-1 no resultaron estimulantes. Sin embargo, la expresión de ICAM-1 junto con B7.2 origino una línea celular APC sintética que estimuló las repuestas proliferativas a concentraciones menores del antígeno péptido. Estos resultados demuestran que las líneas celulares de Drosophila que expresan las moléculas MHC tipo II H2-A^{d} de murina y las moléculas co-estimulantes, B7.1, B7.2 y B7.2 más ICAM-1, son capaces de de activar células TCD4^{+} inmaduras tal como se determina por un incremento en la proliferación.

Además de la proliferación, se desea la activación reproducible de las células TCD4^{+} para producir citoquinas concretas. Así, las citoquinas producidas en los cultivos descritos más arriba se evaluaron también procedimientos convencionales ELISA con anticuerpos específicos de la citoquina a medir. Los datos representados en las Figuras 4A-4D y 5A-5D indican la cantidad de citoquina producida en concentraciones de ng/ml frente a moléculas estimulantes en el APC.

Los resultados en estos ensayos indican que diferentes combinaciones de moléculas ayudante en APC de Drosophila que expresa MHC tipo II recombinante lleva a la producción de diferentes citoquinas como se muestra en las Figuras 4A-4D y Las Figuras 5A-5D. Para la producción de IL-2, una respuesta tipo Th1, las líneas celulares que expresan MHC tipo II con B7.1 o B7.2 fueron poco estimulantes como se muestra en la Figura 4A. Con el fin de alcanzar niveles significativos de IL-2, las líneas celulares de Drosophila requieren la co-expresión de ICAM-1, B7 y tipo II (Figura 5A). La producción de \gamma-interferón fue también poco inducido por las líneas celulares de Drosophila que expresan B7.1 y B7.2 (Figura 4D). En contraste con los resultados con IL-2, sin embargo, la co-expresión de ICAM-1 no restaura la producción de \gamma-IFN (Figura 5C). El APC esplénico (marcado T-S), introduce fuerte producción de \gamma-IFN sugiriendo que otras moléculas regulan la producción de esta citoquina.

La producción de IL-4, una respuesta de tipo Th2, no se observa generalmente durante la estimulación primaria de las células TCD4^{+} inmaduras. Para mantener estas observaciones, las esplénicas (T-S) no consiguen inducir IL-4 significativamente tras el cultivo con células D01 y ova-péptido (Figura 5B). Sin embargo, las células de Drosophila que co-expresan las moléculas MHC tipo II con cualquiera de B7.1 o B7.2 o ambas indujeron fuerte producción de IL-4 durante el cultivo (Figuras 4B y 5B). De forma interesante, la adición de ICAM-1 tuvo una influencia antagonista sobre la producción de esta citoquina (Figura 5B). IL-10 fue regulada de manera similar que IL-4 como se muestra en las Figuras 4D y 5D.

Tal como se ha descrito más arriba, los resultados con un perfil de citoquina del tipo de respuesta Th2, en lugar de un tipo de respuesta Th1, se obtuvieron con líneas celulares que expresan B7 y MHC tipo II. Por el contrario, la co-expresión de MHC tipo II en combinación con B7 y ICAM-1 antagonizó la producción de IL-4 e IL-10 a la vez que promovían fuertemente IL-2, induciendo de esta forma un tipo de respuesta Th1 que aporta la presente invención en la capacidad de impulsar la activación de las células TCD4^{+} en los subconjuntos deseados de células T. Estos resultados muestran definitivamente que las líneas celulares de Drosophila se pueden hacer a medida para expresar las combinaciones definidas de las moléculas ayudante para uso en conseguir una población deseada de células TCD4^{+} que produce diferentes modelos de citoquinas. Así, las composiciones y los procedimientos descritos en el presente documento validan las composiciones y los procedimientos de uso en la presente invención.

(0) INFORMACIÓN GENERAL

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(i).: SOLICITANTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A).: NOMBRE: THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE

\vskip0.500000\baselineskip

(B).: CALLE: 10550 North Torrey Pines Road

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(C).: CIUDAD: La Jolla

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(D).: ESTADO: California

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(E).: PAÍS: Estados Unidos

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(F).: ZIP: 92037

\vskip0.500000\baselineskip

(G).: TELÉFONO: (619) 784-2937

\vskip0.500000\baselineskip

(H).: TELEFAX: (619) 784-9399

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(ii).: TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SISTEMAS DE PRESENTACIÓN DE ANTÍGENOS MHC TIPO II Y PROCEDIMIENTOS PARA ACTIVAR CÉLULAS TCD4^{+}

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(iii).: NÚMERO DE SECUENCIAS: 56

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(iv).: FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A).: TIPO DE MEDIO: Floppy disk

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(B).: ORDENADOR IBM PC compatible

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(C).: SISTEMA OPERATIVO PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D).: SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Version Nº 1.25

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(v).: DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL

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(A).: NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/

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(B).: FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-MAY-1997

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(C).: CLASIFICACIÓN:

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(vi).: DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR

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(A).: NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/018.175

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(B).: FECHA DE PRESENTACIÓN: 23-MAY-1996

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(1) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 1

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(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

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(A).: LONGITUD: 740 pares de bases

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(B).: TIPO: ácido nucleico

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(C).: TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D).: TOPOLOGÍA: lineal

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(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(iii).: HIPOTÉTICA: NO

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(iv).: ANTISENTIDO: NO

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(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 1:

4

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 2

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(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A).: LONGITUD: 427 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B).: TIPO: ácido nucleico

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(C).: TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D).: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(iii).: HIPOTÉTICA: NO

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(iv).: ANTISENTIDO: NO

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(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

5

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 3

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(vi).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A).: LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B).: TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C).: TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D).: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(vii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(viii).: HIPOTÉTICA: NO

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(ix).: ANTISENTIDO: NO

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(x).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 3:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGAATTCC ACCATGCCGT GCAGCAGAGC TCTGA

\hfill

35

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A).: LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B).: TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C).: TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D).: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT CATAAAGGCC CTGGGTGTC

\hfill

29

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 5

\vskip0.800000\baselineskip

(vi).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A).: LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B).: TIPO: ácido nucleico

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(C).: TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D).: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(vii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(viii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix).: ANTISENTIDO: NO

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(x).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGAATTCC ACCATGGCTC TGCAGATCCC CA

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A).: LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B).: TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C).: TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D).: TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT CACTGCAGGA GCCCTGCT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4713 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: circular

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(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

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(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 8

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(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4724 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

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(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

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(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACCATGGC CATTAGTGGA GTC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT TACAGAGGCC CCCTGCGTT

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACCATGGT GTGTCTGAGG CTCC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT CAGCTCAGGA ATCCTCTTG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACCATGGT CCTAAACAAA GCTCTGAT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT CACAAGGGCC CTTGGTGTCT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACCATGGC TTGGAAGAAG GCCTTT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTAGATCTC AGTGCAGAAG CCCTTT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACCATGGG CCCTGAAGAC ACAAT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT CACAGGGTCC CCTGGGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACCATGGT TCTGCAGGTT TCTGCG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT TATGCAGATC CTCGTTGAA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGAATTCAC TAGAGGCTAG AGCCAT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTC ACAGGGTGAC TTGACC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2580 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 23

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGAATTCAC CATGGATGAT CAGCGCGACC TT

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGGATCCT CACATGGGGA CTGGGCCCAG A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAACCATGGG TCATGAACAG AACCA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGTCGACT CAGTCACCTG AGCAAGG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAACCATGGT CTCATTCCTG CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGTCGACC TAGGAAATGT GCCATCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTAGAATTC ACCATGGCTT CAACCCGTGC CAAG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTAGTCGAC TCAGGGAGGT GGGGCTTGTC C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCTTGAAT TCATGGCTCC CAGCAGCCCC CGGCCC

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACCGGAT CCTCAGGGAG GCGTGGCTTG TGTGTTCGG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGTACCCG TGGAGACTGC CAGAGAT

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCC TATGGCCGGA AGGCCTG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGAATTCCT GTCAGAATGG CCACCAT

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTAGATCTT CACTCAGCTC TGGACGGT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCTTGAGC TCATGGTTGC TGGGAGCGAC GCGGGG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACCGGAT CCTTAAAGAA CATTCATATA CAGCACAATA CA

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTAGAATTC ACCATGGCTT GCAATTGTCA GTTG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTAGTCGAC CTAAAGGAAG ACGGTCTGTT C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCTTGAAT CCATGGGCCA CACACGGAGG CAG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACCGGAT CCTTATACAG GGCGTACACT TTCCCTTCT

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCTTGAGC TCATGGTTGC TGGGAGCGAC GCGGGG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTAGTCGAC TCACTCTGCA TTTGGTTTTG CTGA

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCTTGAGC TCATGGATCC CCAGTGCACT ATG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTACCCCCG GGTTAAAAAC ATGTATCACT TTTGTCGCAT GA

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGGATCCA CCATGCAGCA GCCCTTCAAT T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT TAGAGCTTAT ATAAGCCGA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGAATTCG GTACCATGCC GGAGGAGGGT TCGG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGATCCT CAGGGGCGCA CCCACTGCA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 52

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 53

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 54

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Thr Ile Ala Thr Asp Glu Glu Ala Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 55

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ala Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Arg Leu Asn Met Phe Thr Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. DE ID Nº 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i).: CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii).: TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii).: TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(iv).: DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE ID Nº 56

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met}

Claims

1. Una célula de insecto que presentan el antígeno sintético (APC) para activar células TCD4^{+} que comprende:

a): Un gen \alpha de MHC tipo II enlazado de forma operativa a un primer promotor en un vector capaz de expresar una \alpha-cadena de MHC tipo II;

b): Un gen de \beta-cadena de MHC tipo II enlazado de forma operativa a un segundo promotor, en un vector capaz de expresar una \beta-cadena de MHC tipo II; en el que tras la expresión de los genes de la \alpha-cadena y \beta-cadena, la \alpha-cadena y la \beta-cadena forman un heterodímero MHC tipo II capaz de cargar un péptido; y

c): Al menos un gen de molécula ayudante enlazada de forma operativa a un tercer promotor en un vector capaz de expresar una molécula ayudante, en el que antes de la transformación al menos uno de los genes de Tipo II y gen de molécula ayudante carecen de APC.

2. El APC de la reivindicación 1 en el que los genes de la \alpha-cadena y la \beta-cadena son de origen humano.

3. El APC de la reivindicación 1 en el que al menos un promotor es inducible.

4. El APC de la reivindicación 1 en el que los genes de la molécula \alpha- y \beta- y ayudante están presentes en el mismo vector.

5. El APC de la reivindicación 1 en el que los genes de la molécula \alpha- y \beta- y ayudante están presentes en vectores diferentes.

6. El APC de la reivindicación 1 en el que el APC es una célula de insecto seleccionada entre el grupo constituido por Spodoptera y Drosophila.

7. El APC de la reivindicación 1 que comprende además un gen de resistencia a la neominicina enlazado de forma operativa a un vector.

8. El APC de la reivindicación 1 en el que el que el gen de la molécula ayudante codifica una molécula co-estimulante preferiblemente B7.1 o B7.2.

9. El APC de la reivindicación 1 en el que el que el gen de la molécula ayudante codifica una molécula de adhesión, preferiblemente ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, o LFA-3.

10. El APC de la reivindicación 1 en el que el que el gen de la molécula ayudante codifica una molécula de supervivencia, preferiblemente un ligando FAS o CD70.

11. El APC de la reivindicación 11 que tiene un gen para una primera molécula ayudante y un gen para una segunda molécula ayudante.

12. El APC de la reivindicación 11 en el que la primera molécula ayudante es una molécula co-estimulante (preferiblemente B7.1 o B7.2) y la segunda molécula ayudante es una molécula de adhesión (de preferencia ICAM-1).

13. El APC de la reivindicación 11 en el que la primera molécula ayudante es una molécula co-estimulante y la segunda molécula ayudante es una molécula de supervivencia.

14. El APC de la reivindicación 11 en el que la primera molécula ayudante es una molécula de supervivencia y la segunda molécula ayudante es una molécula de adhesión (preferiblemente ICAM-1).

15. El APC de la reivindicación 11 en el que la primera y segunda moléculas ayudante son moléculas co-estimulantes, preferiblemente B7.1 o B7.2.

16. El APC de la reivindicación 1 que tiene un gen de una primera molécula ayudante, un gen de una segunda molécula ayudante, y un gen de una tercera molécula ayudante.

17. El APC de la reivindicación 16 en el que la primera molécula ayudante es una molécula co-estimulante (de preferencia B7.2), la segunda molécula ayudante es una molécula de adhesión (de preferencia ICAM-1) y la tercera molécula ayudante es una molécula de supervivencia (de preferencia CD70).

18. El APC de la reivindicación 1 en el que el heterodímero MHC tipo II y la molécula ayudante están presentes en la superficie externa del APC en número suficiente para activar las células TCD4^{+}, cuando se carga un péptido en el heterodímero.

19. El APC de la reivindicación 18 en el que el péptido se carga extracelularmente.

20. El APC de la reivindicación 18 en el que el péptido se carga intracelularmente.

21. El APC de la reivindicación 1 que comprende de manea adicional un gen de ayuda al procesado del antígeno que está enlazado de forma operativa a un cuarto promotor en un vector capaz de expresar una molécula de ayuda al procesado del antígeno.

22. Un fragmento de célula derivado del APC de la reivindicación 1 que tiene el heterodímero MHC tipo II y al menos una molécula ayudante asociada de forma operativa sobre el fragmento para activar las células TCD4^{+}.

23. El fragmento de célula de la reivindicación 22 en el que el heterodímero MHC tipo II está vacío.

24. El fragmento de célula de la reivindicación 22 en el que un péptido está cargado en el heterodímero MHC tipo II.

25. Una matriz de presentación de un agentes sintético para activar las células TCD4^{+} que comprende:

a): Un soporte, en el que el soporte se selecciona entre el grupo constituido por:

: Un metal, un plástico, una resina, una columna de celulosa modificada, una microperla, una placa de microvaloración, un glóbulo rojo, un liposoma, o un fragmento de célula de insecto.

b): Una porción extracelular de un heterodímero MHC tipo II enlazado de forma operativa con el soporte y capaz de cargar un péptido seleccionado; y

c): Una porción extracelular de al menos una molécula ayudante enlazada de forma operativa con el soporte de manera que las porciones extracelulares del heterodímero MHC tipo II y de la molécula ayudante estén presenten en la matriz en número suficiente para activar las células TCD4^{+} cuando se carga un péptido en la parte extracelular del heterodímero

26. La matriz de la reivindicación 25, en la que el soporte es un fragmento de célula de insecto.

27. La matriz de la reivindicación 25, en la que el soporte es un liposoma.

28. La matriz de la reivindicación 25, en la que el soporte es una superficie sólida.

29. La matriz de la reivindicación 25, en la que la porción extracelular del heterodímero MHC tipo II está enlazada a un epitope que reacciona con un anticuerpo para enlazar la porción al soporte.

30. La matriz de la reivindicación 25, en la que la porción extracelular del heterodímero MHC tipo II está enlazada a (His)_{6} que reacciona con níquel para enlazar la porción al soporte.

31. La matriz de la reivindicación 25, en la que el soporte es un material poroso.

32. La matriz de la reivindicación 25, en la que el péptido se carga en la porción extracelular del heterodímero MHC tipo II.

33. La matriz de la reivindicación 25, en la que la porción extracelular del heterodímero MHC tipo II está vacía.

34. La matriz de la reivindicación 25, en la que la molécula ayudante es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

35. La matriz de la reivindicación 25, que tiene una primera molécula ayudante y una segunda molécula ayudante.

36. La matriz de la reivindicación 35, en la que la primera y segunda moléculas ayudante son como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.

37. La matriz de la reivindicación 35 que comprende además una tercera molécula ayudante.

38. La matriz de la reivindicación 37, en la que la primera, segunda y tercera moléculas ayudantes son como se definen en la reivindicación 17.

39. Un procedimiento para producir una célula de insecto que presenta el antígeno sintético (APC) que comprende transformar una célula de insecto con:

a): Un gen de cadena a de MHC tipo II que se puede expresar enlazado de forma operativa a un primer promotor en un vector capaz de expresar una \alpha-cadena de MHC tipo II;

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b): Un gen de \beta-cadena de MHC tipo II que se puede expresar enlazado de forma operativa a un segundo promotor, en un vector capaz de expresar una \beta-cadena de MHC tipo II; y

c): una primera molécula ayudante que se puede expresar enlazada de forma operativa a un tercer promotor en un vector capaz de expresar una molécula ayudante.

40. El procedimiento de la reivindicación 39, en el que la célula carece de un gen que codifica al menos uno de los genes de la \alpha-cadena, \beta-cadena y molécula ayudante.

41. El procedimiento de la reivindicación 39, que comprende además la etapa de transformar la célula con un gen que ayuda al procesado del antígeno que se puede expresar enlazado de forma operativa a un cuarto promotor en un vector capaz de expresar una molécula que ayuda al procesado del antígeno.

42. El procedimiento de la reivindicación 39 en el que el APC es según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

43. El procedimiento de la reivindicación 39 que comprende además la etapa de transformar la célula con un gen de resistencia a la neomicina que se puede expresar enlazado de forma operativa a un vector.

44. El procedimiento de la reivindicación 39 que comprende además la etapa de transformar la célula con un gen de una segunda molécula ayudante.

45. El procedimiento de la reivindicación 44 en el que la primera y segunda moléculas ayudante son como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.

46. El procedimiento de la reivindicación 44 que comprende además la etapa de transformar la célula con un gen de una tercera molécula ayudante.

47. El procedimiento de la reivindicación 46, en el que la primera, segunda y tercera moléculas ayudantes son como se definen en la reivindicación 17.

48. Un procedimiento para producir una célula de insecto que presenta el antígeno sintético (APC) que comprende:

a): proporcionar una célula de insecto que carece de un gen que codifica al menos uno de entre una \alpha-cadena de MHC tipo II; una \beta-cadena de MHC tipo II; y una molécula ayudante; y

b): transformar la célula con un gen que se puede expresar para cada uno de los genes de (a) de los que carece la célula, estando el gen enlazado de forma operativa con un promotor en un vector capaz de expresar el gen.

49. Un procedimiento para producir una célula de insecto que presenta el antígeno sintético (APC) que comprende:

a): proporcionar una célula de insecto que carece de un gen que codifica al menos uno de entre una \alpha-cadena de MHC tipo II; una \beta-cadena de MHC tipo II; una molécula ayudante; y

50. Un procedimiento para producir una matriz de antígeno sintético que comprende:

a): proporcionar una porción extracelular del heterodímero MHC de tipo II recombinante;

b): proporcionar una porción extracelular de al menos una molécula ayudante recombinante; y

c): enlazar el heterodímero MHC de tipo II y la molécula ayudante a un soporte en número suficiente para activar las células TCD4^{+} cuando se carga un péptido en la parte extracelular del heterodímero, en el que el soporte se selecciona entre el grupo constituido por un metal, un plástico, una resina, una columna de celulosa modificada, una microperla, una placa de microvaloración, un glóbulo rojo, un liposoma, o un fragmento de célula de insecto.

51. El procedimiento de la reivindicación 50, en el que la molécula ayudante es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

52. Un procedimiento para activar células TCD4^{+} in vitro, procedimiento que comprende

a): proporcionar el APC de la reivindicación 18, el fragmento celular de la reivindicación 22 o la matriz de la reivindicación 25 en el que el heterodímero MHC de tipo II del fragmento celular y la matriz se han cargado con péptido;

b): poner en contacto el APC de la tapa a), el fragmento celular cargado con péptido o la matriz celular cargada con péptido con las células TCD4^{+}, induciendo de esta forma que las células TCD4^{+} contactadas proliferen y se diferencien en células TCD4^{+} activadas.

53. El procedimiento de la reivindicación 52 que comprende además separar las células TCD4^{+} activadas del APC, fragmento celular o matriz celular.

54. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 53, que comprende además la etapa de añadir las células TCD4^{+} activadas a un vehículo o excipiente aceptable para formar una suspensión.

55. Un procedimiento para activar células TCD4^{+} in vitro, el procedimiento comprende:

a): Poner en contacto el APC de la reivindicación 1, el fragmento celular de la reivindicación 22 o la matriz de la reivindicación 25 en cantidad suficiente con una biblioteca de péptidos in vitro durante un tiempo suficiente para generar un heterodímero MHC de tipo II cargado con péptido;

b): Poner en contacto el heterodímero MHC de tipo II cargado con péptido de la etapa b) con células TCD4^{+}, induciendo de esta forma que las células TCD4^{+} proliferen y se diferencien en células TCD4^{+} activadas.

56. Un procedimiento para preparar una suspensión de células TCD4^{+} activadas para alterar una respuesta inmune mediada por células TCD4^{+} para tratar una afección en un paciente, que comprende:

a): Analizar el paciente in vitro respecto de un perfil de citoquina específico del paciente

b): Poner en contacto las células TCD4^{+} recogidas del paciente con el APC de la reivindicación 18 in vivo en cantidad suficiente y tiempo suficiente, induciendo de esta forma que las células TCD4^{+} contactadas proliferen y se diferencien en células TCD4^{+} activadas que producen un perfil de citoquina funcionalmente opuesto al perfil que se obtiene en la etapa a).

57. El uso del APC de la reivindicación 18 en la preparación de una suspensión de células CD4^{+} T activadas para tratar una afección mediada por células TCD4^{+} en un paciente.

58. El uso de la reivindicación 57 en la que la afección es una enfermedad autoinmune.

59. El uso de la reivindicación 58, en el que la una enfermedad autoinmune se selecciona entre el grupo constituido por diabetes, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, lupus eritromatoso sistémico, miastenia gravis, enfermedad de Crohn y enfermedad del intestino inflamatorio.

60. El uso de la reivindicación 58, en el que el paciente muestra un perfil de citoquina que es el producido por una respuesta de CD4^{+} Tipo Th1.

61. El uso de la reivindicación 60, en el que el perfil de citoquina específico del paciente comprende la citoquina seleccionada entre el grupo constituido por interleuquina-2, interferón-\gamma, y factor de necrosis tumoral.

62. El uso de la reivindicación 56, en el que la afección es una alergia.

63. El uso de la reivindicación 62, en la que la alergia se selecciona entre el grupo constituido por asma y sensibilidad por contacto.

64. El uso de la reivindicación 62, en el que el perfil de citoquina específico del paciente se produce por una respuesta de CD4^{+} Tipo Th2.

65. El procedimiento de la reivindicación 64 en el que el perfil de citoquina específico del paciente comprende la citoquina seleccionada entre el grupo constituido por interleuquina-4 , e interleuquina-10.