ES2201177T3

ES2201177T3 - Sistema de presentacion de antigenos y activacion de celulas-t.

Info

Publication number: ES2201177T3
Application number: ES96909631T
Authority: ES
Inventors: Zeling Cai; Jonathan Sprent; Anders Brunmark; Michael Jackson; Per A. Petterson; Alain M. D. Ph. D. Luxembourg; Didier Jean Leturcq; Ann M. Moriarty
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1995-03-08
Filing date: 1996-03-08
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2016-03-08
Also published as: JP3926842B2; US6461867B1; WO1996027392A1; DE69628154D1; JP2007161719A; CA2214649C; JPH11501516A; JP4629650B2; US20030138946A1; PT814838E; DE69628154T2; EP0814838B1; US6255073B1; US20030077708A1; AU5306096A; US6828150B2; US6225042B1; US20030077318A1; US20050152916A1; EP0814838A4

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE MATRICES QUE PRESENTAN ANTIGENOS SINTETICOS, LOS PROCEDIMIENTOS DE SU FABRICACION Y LOS PROCEDIMIENTOS DE SU USO. UNA DE ESTAS MATRICES SON CELULAS QUE SE HAN TRANSFECTADO PARA PRODUCIR MOLECULAS QUE PRESENTAN EL ANTIGENO MHC Y MOLECULAS AUXILIARES, TALES COMO MOLECULAS COESTIMULANTES. LAS MATRICES PUEDEN UTILIZARSE PARA ACTIVAR CELULAS T CD8+ PARA PRODUCIR CITOCINAS Y TRANSFORMARSE EN CITOTOXICAS.

Description

Sistema de presentación de antígenos y activación de celulas-T.

Esta invención se realizó con la ayuda del Gobierno de los Estados Unidos de América, y el Gobierno de los Estados Unidos de América tiene ciertos derechos en la invención.

Campo técnico

La presente invención está relacionada con materiales activadores de células T con especificidad por determinados péptidos antigénicos, y con el empleo de dichos materiales para la creación de medicamentos activadores de células T, para el tratamiento de una variedad de estados patológicos.

Antecedentes

La eficacia con la cual el sistema inmune cura o protege a los individuos de las enfermedades infecciosas siempre ha intrigado a los científicos, y se ha creído que podría ser posible activar el sistema inmune para combatir otros tipos de enfermedades. Tales enfermedades incluyen cáncer, SIDA, hepatitis y enfermedades infecciosas en pacientes con inmunosupresión. Mientras que varios procedimientos que involucran el uso de anticuerpos han sido aplicados en esos tipos de enfermedades, han sido registrados pocos intentos positivos utilizando células T citotóxicas.

Las células T citotóxicas, o células CD8^{+} (es decir, células que expresan la molécula CD8), según los conocimientos actuales, representan la principal línea de defensa contra las infecciones víricas. Los linfocitos CD8^{+} reconocen específicamente y eliminan células que se encuentran infectadas por un virus. Así, el coste de la eliminación de una infección viral es la pérdida aparejada de las células infectadas. Los receptores de células T en la superficie de las células CD8^{+} no pueden reconocer los antígenos ajenos al organismo directamente. En contraste con los anticuerpos, los antígenos deben primero ser presentados a los receptores.

La presentación del antígeno a las células T CD8^{+} es efectuada por el complejo mayor de histocompatibilidad (abreviadamente CMH) en referencia a un gran locus genético que codifica para una extensa familia de glicoproteínas que juega un importante papel en la respuesta inmune. Los genes del CMH, a los cuales también se hace referencia como el complejo ALH (antígeno leucocitario humano), están localizados en el cromosoma 6 en humanos. Las moléculas codificadas por los genes del CMH están presentes en las superficies celulares y son en gran parte responsables del reconocimiento de tejidos transplantados como "no propios". Así, las moléculas de CMH unidas a membrana están íntimamente implicadas en el reconocimiento de antígenos por parte de las células T.

Los productos CMH están agrupados en tres clases principales, a las que nos referimos como I, II, y III. Las células T que sirven principalmente como células ayudantes expresan CD4 e interactúan en primer término con moléculas de Clase II, mientras que las células que expresan CD8^{+}, que mayoritariamente representan células efectoras citotóxicas, interaccionan con moléculas de Clase I.

Las moléculas de Clase I son glicoproteínas de membrana con la habilidad de unir péptidos derivados primariamente de la degradación intracelular de proteínas endógenas. Los complejos formados por las moléculas de CMH con los péptidos derivados de virus, bacterias y otras proteínas ajenas al organismo incluyen el ligando que dispara la capacidad de respuesta al antígeno de las células T. En contraste, los complejos formados por moléculas de CMH con péptidos derivados de productos celulares normales juegan un papel en "enseñar" a las células T a tolerar los péptidos propios del organismo en el timo. Las moléculas de Clase I no presentan antígenos enteros, intactos; antes bien, presentan fragmentos peptídicos de los mismos, "cargados" en su "hendidura de unión a péptidos".

Durante muchos años, los inmunólogos han esperado incrementar las células citotóxicas dirigidas contra virus, retrovirus y células cancerosas. Mientras que dirigir una respuesta contra enfermedades víricas es algo que generalmente puede ser llevado a cabo in vivo mediante vacunación con vacunas vivas o atenuadas, no se ha logrado un éxito similar con retrovirus o células cancerígenas. Por otra parte, el método de las vacunas no ha tenido la eficacia deseada en los pacientes que presentan inmunosupresión. Al menos un investigador ha tomado la aproximación bastante inespecífica de "elevar" las células CD8^{+} existentes incubándolas in vitro con IL-2, un factor de crecimiento para células T. Aún así, este protocolo (conocido como la terapia celular LAK) sólo permitirá la expansión de aquellas células CD8^{+} que ya estuvieran activadas. Como el sistema inmune siempre está activo por alguna razón u otra, la mayoría de las células activadas por la IL-2 serán irrelevantes para el propósito de combatir la enfermedad. De hecho, no se ha documentado que este tipo de terapia active alguna célula con la especificidad deseada. Así, los beneficios de la terapia celular LAK son controvertidos en el mejor de los casos, y los efectos colaterales son típicamente tan severos que muchos estudios han sido suspendidos.

Algunas moléculas recién descubiertas, las cuales parecen estar implicadas en los procesos de carga de los péptidos han sido reciente mente identificadas. También ha sido notado que las moléculas de Clase I sin péptido unido (también conocidas como moléculas "vacías") pueden ser producidas bajo ciertas circunstancias restrictivas. Estas moléculas "vacías" son con frecuencia incapaces de alcanzar la superficie celular, aún así, como las moléculas de Clase I sin péptido anclado son muy termolábiles, de esta manera, las moléculas "vacías" de Clase I se desmontan durante su transporte del interior de la célula a su superficie.

La presentación de las moléculas de CMH de Clase I unidas a un sólo péptido es generalmente inefectiva en la activación de las células CD8^{+}. En la naturaleza, las células CD8^{+} son activadas por células presentadoras de antígeno las cuales no sólo presentan un péptido unido a una molécula CMH de Clase I, sino que también presentan una molécula coestimulatoria. Tales moléculas coestimulatorias incluyen B7, la cual se reconoce ahora por ser dos subgrupos designados B7.1 y B7.2. También se ha hallado que las moléculas de adhesión celular tales como las integrinas ayudan en este proceso.

Cuando la célula T CD8^{+} interactúa con una célula presentadora de antígeno que tiene el péptido unido a un CMH de Clase I y una molécula coestimulatoria, la célula T CD8^{+} es activada para proliferar y llega a ser una célula T efectora armada. Véase, en general, Inmunobiology, de Janeway y Travers, publicado por Current Biology Limited, London (1994), incorporado mediante referencia.

De acuerdo con esto, lo que es necesario es un medio para activar las células T y que así proliferen y lleguen a ser citotóxicas. Sería útil si la activación pudiera ser hecha in vitro y las células T citotóxicas activadas fueran reintroducidas en el paciente. También sería deseable si la activación pudiera ser realizada mediante una matriz presentadora de antígeno sintética compuesta de un material tal que presentara a las células no sólo el péptido seleccionado, sino también otros factores coestimulatorios, los cuales incrementen la efectividad de la activación.

También sería ventajoso si ello fuera posible seleccionar el péptido de tal forma que sólo aquellas células CD8^{+} que sean citotóxicas para las células que presenten dicho péptido pudieran ser activadas de manera sustancial.

La técnica anterior en este campo incluye los artículos de Paul y col., Fundamental Inmunology, (1993), 133-135, Chen, L. y col., Inmunology Today, (1993), 14(10), 483-486 el cual revela el hallazgo de que la activación eficiente de las células T requiere coestimulación del receptor CD28 vía la molécula B7 en células presentadoras de antígenos, Mottez, E. y col., Journal of Experimental Medicine, (1995), 181(2), 493-502 el cual revela que las células que expresan moléculas de CMH de Clase I unidas a un único péptido antigénico son reconocidas por células T específicas para ese complejo péptido-CMH particular y que el cocultivo de células indiferenciadas del bazo con células que expresan estas proteínas de fusión péptido-CMH y el antígeno B7.1 permite la inducción de linfocitos T citotóxicos primarios in vitro, Kishimoto H., y col., Journal of Experimental Medicine, (1996), 184(2), 531-7 el cual revela los diferentes roles de B7 e ICAM-I en la selección negativa de timocitos, Galvin y col., Journal of Immunology, (1992), 149(12), 3802-3808 el cual revela la generación de líneas celulares CHO que expresan CMH murino de Clase II tanto sólo como conjuntamente con moléculas B7 murinas, Madsen y col., Nature (1988), 332, 161-164 el cual revela el hallazgo de que la capacidad de un particular antígeno CMH donante para inducir falta de capacidad de respuesta es el producto de su inmunogenicidad intrínseca y de la cantidad de antígeno distribuido durante el pretratamiento y Chen y col., Cell (1992), 71, 1093-1102 el cual revela que la expresión de B7 induce una respuesta de las células CD8^{+}.

Breve sumario de la invención

La presente invención es relativa a un sistema sintético de presentación de antígeno para presentar una molécula de CMH formando un complejo con un péptido y una molécula coadyuvante a una célula T para activar la citada célula.

En una realización, el sistema pone en conexión a una matriz sintética presentadora de antígeno que cuenta con un soporte y al menos con la porción extracelular de una molécula de CMH de Clase I con capacidad de unión con un péptido seleccionado operativamente unido al soporte. La matriz también incluye una molécula coadyuvante unida al soporte de forma operativa. La molécula coadyuvante actúa como un receptor en la célula T CD8^{+}. El CMH y las moléculas coadyuvantes están presentes en números suficientemente elevados para activar una población de linfocitos T contra el péptido cuando dicho péptido está unido a la porción extracelular de la molécula de CMH.

Se ha descubierto que una matriz presentadora de antígeno que tenga una molécula CMH o bien una porción de dicha molécula conjuntamente con una molécula coadyuvante, da lugar a una reacción sinérgica en la activación de los linfocitos T contra el péptido. Los ejemplos de moléculas coadyuvantes son moléculas coestimulatorias tales como B7.1 y B7.2 o moléculas de adhesión tales como ICAM-1 y LFA-3. La porción extracelular de tales moléculas coestimulatorias también puede ser usada. Otro tipo de molécula coestimulatoria es aquella que reacciona con la molécula CD28, tal como los anticuerpos anti-CD28 o las partes funcionales de los mismos, por ejemplo las porciones Fab.

Se ha encontrado que una reacción sinérgica específicamente efectiva resulta de una matriz presentadora de antígeno, la cual posee moléculas de CMH unidas con un péptido, una molécula coestimulatoria y una molécula de adhesión. En particular, una generación sinérgica altamente efectiva de actividad de células T citotóxicas resulta de la combinación de B7.1 e ICAM-1.

El soporte empleado para la matriz puede tomar varias formas diferentes. Los ejemplos de soporte incluyen soportes sólidos como metales o plásticos, materiales porosos tales como columnas de resina o de celulosa modificada, microperlas, placas de microvaloración, glóbulos rojos y liposomas.

Otro tipo de soporte es un fragmento celular, tal como un fragmento de membrana celular o una célula completa. En esta realización, la matriz está formada actualmente por células que han sido transfectadas para que presenten moléculas de CMH y moléculas coadyuvantes en la superficie celular para crear una célula presentadora de antígeno (abreviadamente CPA). Esto se ha hecho produciendo una línea celular que contiene al menos una secuencia de nucleótidos expresable para CMH de Clase I que codifique para la cadena pesada del CMH, preferiblemente una secuencia de cDNA, unida operativamente a un primer promotor y una secuencia de nucleótidos expresable que codifique para microglobulina \beta-2 unida oparativamente a un segundo promotor. La cadena pesada CMH y la microglobulina \beta-2 forman juntas la molécula CMH que se une al péptido. La proteína CMH se une al péptido antigénico y lo presenta en la superficie de la célula. La célula también incluye un gen formado por una secuencia nucleotídica de una molécula coadyuvante unida operativamente a un tercer promotor. La molécula coadyuvante también está presente en la superficie de la célula en cantidades suficientes para activar una población de linfocitos T contra el péptido cuando éste está unido a los complejos. Otras moléculas en la superficie de la célula o fragmento celular tales como motivos carbohidrato pueden también proporcionar cierta coestimulación de las células T.

La línea celular es sintética en que al menos uno de los genes descritos arriba no está presente de forma natural en las células de las cuales deriva la línea celular. Es preferible utilizar una línea celular de poiquilotermos porque las moléculas de CMH son termolábiles. Un cierto grupo de especies son útiles para este propósito. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.º 5.314.813 de Petersen y col., la cual trata de numerosas especies para este uso y está incorporada mediante referencia. Es preferible emplear células eucariotas y, en particular, células de insectos.

En una realización, es preferible en particular tener al menos dos moléculas coadyuvantes, siendo una de ellas una molécula coestimulatoria y la otra una molécula de adhesión. Se ha visto que esta combinación tiene un efecto sinérgico, dando incluso mayor activación celular que si combinamos los resultados de cada una de las moléculas individuales. Se ha encontrado también ser ventajoso y preferible tener al menos uno de los genes transfectados bajo el control de un promotor inducible.

Utilizando la presente invención, es posible introducir el péptido a la célula mientras ésta está produciendo moléculas de CMH y permitir al péptido unirse a las moléculas de CMH cuando estas aún permanecen dentro de la célula. Alternativamente, las moléculas de CMH pueden ser expresadas como moléculas vacías en la superficie celular y el péptido introducido a las células después de que las moléculas estén expresadas en la superficie celular. En este último procedimiento, el uso de células de poiquilotermos es particularmente ventajoso porque las moléculas de CMH vacías, aquellas que todavía no han formado un complejo ni se han unido a péptidos, son termolábiles.

Las moléculas de CMH de Clase I han sido expresadas en células de insectos tales como las de Drosophila melanogaster (la mosca de la fruta). Dado que Drosophila no tiene todos los componentes de un sistema inmune de mamífero, las diversas proteínas involucradas en la maquinaria de unión del péptido estarían ausentes de tales células. La falta de la maquinaria de carga del péptido permite a las moléculas de Clase I ser expresadas como moléculas vacías en la superficie celular.

Otra ventaja del uso de células de insectos tales como el sistema Drosophila es que las células de Drosophila prefieren una temperatura de 28ºC antes que de 37ºC. Este hecho es muy importante, porque las moléculas vacías de Clase I son termolábiles y tienden a desintegrarse a 37ºC. Mediante incubación de las células de Drosophila que expresan moléculas de Clase I con péptidos que pueden unirse a las moléculas de dicha clase, es posible lograr virtualmente que todas y cada una de las moléculas de Clase I contengan un péptido que sea el mismo en todos los casos. Las células son, por consiguiente, muy diferentes a las de mamífero, donde las moléculas de Clase I contienen muy diferentes tipos de péptidos, la mayoría de los cuales derivan de nosotros mismos, son proteínas celulares inocuas.

La presente invención también es relativa a los métodos para producir células CD8^{+} activadas in vitro. Un método incluye el contacto, in vitro, de las células CD8^{+} con una de las matrices descritas anteriormente por un periodo de tiempo suficiente para activar, de una forma antígeno-específica, a las células CD8^{+}. El método debe incluir además (1) la separación de las células CD8^{+} activadas de la matriz presentadora de antígeno y (2) la suspensión de las células CD8^{+} activas en un portador o excipiente aceptable. La suspensión es adecuada para su administración a un individuo necesitado de tratamiento. Los antígenos pueden constar de proteínas o polipéptidos en estado nativo o no degradado, o pueden constar de polipéptidos antigénicos que han sido divididos en fragmentos peptídicos formados al menos por 8 residuos aminoácidos previamente a su incubación con las moléculas de Clase I del CMH humano.

La invención también usa su matriz presentadora de antígenos en una suspensión apropiada para la elaboración de un medicamento con el fin de curar una situación médica. En varios casos esa situación puede consistir en cáncer, tumores, neoplasia, infección viral o retroviral, situaciones autoinmunes o de tipo autoinmune. En algún caso, el medicamento puede estar en una forma adecuada para su inyección intravenosa.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1-3 esquematizan la construcción de los plásmidos de expresión pRmHa-2 y pRmHa-3. En la figura 1, se muestra la construcción de pRmHa-3; y en la figura 3, el vector pRmHa-3 es ilustrado, mostrando los sitios de restricción, polianclaje, poliadenilación y el promotor, de la misma forma que un sitio en el cual una secuencia nucleotídica puede ser insertada para su expresión;

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las figuras 4 y 5 muestran termoestabilización inducida por péptidos de HLA B27 y HLA A2.1 expresadas en la superficie de las células de Drosophila mediante péptidos HIV. La significativa fluorescencia de cada población celular se muestra en una gráfica frente a las condiciones de incubación;

la figura 6 ilustra los datos de un experimento diseñado para determinar si las células de insecto pueden procesar el antígeno y cargarlo en las moléculas de Clase I, y si estas últimas pueden presentar tanto endógena como exógenamente los antígenos derivados a las células T. Las células Schneider 2 (abreviadamente SC2) o las 3T3 transfectadas con K^{b}/\beta2 fueron incubadas con la proteína ovoalbúmina (abreviadamente OvPro) o el péptido ovoalbumínico, OVA 24 (abreviadamente OvPep) en medios isotónicos (abreviadamente Iso) o hipertónicos (abreviadamente Hyp). (La línea celular murina BALB/3T3 está disponible desde el ATCC bajo el número de acceso CCL 163). Tras el tratamiento, las células fueron cocultivadas con el hibridoma de células T B3/C8. B3/C8 es un hibridoma de células T entre B3 (Carbone, y col., J. Exp Med. 169: 603-12 (1989)), la célula T citotóxica específica para el péptido ovoalbumínico 253-276 presentado por moléculas de Clase I H-2K^{b}, y la línea celular secretora de IL-2 portadora de antígeno CD8^{-}. Sometido a estimulación antigénica, la línea celular B3/CD8 produce IL-2, cuantificada por incorporación de ^{3}H-timidina en la línea celular, dependiente de IL-2, CTLL (ATCC N.º TIB 214). El total de ^{3}H-timidina incorporada se representa frente a los tratamientos celulares iniciales;

la figura 7 ilustra la expresión de B7.1, ICAM-1 y CMH en la superficie de las células transfectadas de (la mosca) Drosophila de acuerdo con la presente invención;

la figura 8 es un gráfico que muestra los resultados de un experimento con clasificador de células activadas fluorescentemente [citómetro de flujo] usando el CMH de un ratón recombinante L^{d} unido a glóbulos rojos;

la figura 9 es un gráfico que muestra los resultados de un experimento con citómetro de flujo usando el CMH de un ratón unido a glóbulos rojos;

la figura 10 es un gráfico que demuestra la unión de CMH recombinante K^{h} a placas de microvaloración mediante el empleo de anticuerpos marcados;

la figura 11 es una serie de gráficas que muestran los resultados de los experimentos con citómetro de flujo demostrando la expresión de CD69 y CD25 en las células 2C CD8^{+} estimuladas con células transfectadas de Drosophila;

la figura 12 consiste en un par de gráficos de barras mostrando respuestas proliferativas de células 2C CD8^{+} conseguidas mediante péptidos presentados por células de Drosophila transfectadas sólo con L^{d};

la figura 13 es un gráfico que muestra la influencia de la concentración de péptido al tercer día de las respuestas proliferativas, de células 2C CD8^{+} provocadas mediante péptidos presentados por células transfectadas de Drosophila;

la figura 14 consiste en un par de gráficas que muestran la influencia de dosis de células presentadoras de antígeno en el tercer día de respuesta proliferativa y producción de IL-2 de células 2C CD8^{+} provocadas mediante péptidos presentados por células transfectadas de Drosophila;

la figura 15 está constituida por una serie de gráficos que muestran la influencia de la concentración de péptido en la respuesta proliferativa de las células 2C CD8^{+} provocada por células de Drosophila transfectadas con L^{d}.B7, L^{d}.ICAM y L^{d}.B7.ICAM;

la figura 16 consiste en una serie de gráficos que muestran la cinética de la respuesta proliferativa de las células 2C CD8^{+} y CD8^{-} provocada por células de Drosophila transfectadas con L^{d}, L^{d}.B7, L^{d}.ICAM y L^{d}.B7.ICAM más péptido QL9;

la figura 17 consiste en una serie de gráficos que muestran la actividad CTL de las células 2C CD8^{+} estimuladas por células de Drosophila transfectadas con L^{d}.B7, L^{d}.B7.ICAM o células presentadoras de antígeno L^{d}.ICAM más péptido QL9 (10 \muM) en la ausencia de citoqinas exógenas;

la figura 18 consiste en un par de gráficos que muestran la actividad CTL de células 2C CD8^{+} estimuladas por células de Drosophila transfectadas con L^{d}.ICAM o células presentadoras de antígeno L^{d}.ICAM más péptido QL9 (10 \muM), en la ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de IL-2 exógena (20 u/ml);

la figura 19 está formada por un par de gráficas que muestran la respuesta proliferativa de las células T CD8^{+} frente a péptidos presentados por células transfectadas de Drosophila (panel izquierdo) y la respuesta provocada por dosis graduadas de células N B6 y 2C B6 CD8^{+} cultivadas con 5 x 10^{5} de células de bazo B10.D2 (L^{d}) en ausencia de péptidos por 3 días sin la adición de citoquinas exógenas (panel derecho);

la figura 20 es una gráfica que muestra la mitogénesis estimulada de células 2C+ purificadas cultivadas (50.000 células por pocillo) en placas revestidas con moléculas inmovilizadas con el péptido Q9 (línea continua = L^{d} y anticuerpo anti-CD28, línea discontinua = L^{d} sólo);

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la figura 21 es un gráfico de barras que muestra la mitogénesis estimulada de células T 2C^{+} purificadas en el quinto día de su cultivo, con varios péptidos indicados, cultivados en placas de 96 pocillos revestidos con L^{d} y anticuerpo anti-CD28 (barras rayadas = sin IL-2, barras negras = IL-2 añadidas);

la figura 22 es una representación gráfica de los resultados del análisis citofluorimétrico de las células recuperadas tras 12 días de cultivo en placas revestidas con L^{d} y anticuerpo anti-CD28 y expuestas al péptido QL9, teñidas utilizando el anticuerpo 1B2 específico del receptor de las células T 2C (M2 = células teñidas positivamente, M1 = células teñidas negativamente);

la figura 23 es una representación gráfica de los resultados del análisis citofluorimétrico de células recuperadas tras 12 días de cultivo en placas revestidas con L^{d} y anticuerpo anti-CD28 y expuestas al péptido p2Ca, teñidas utilizando el anticuerpo 1B2 específico del receptor de las células T 2C (M2 = células teñidas positivamente, M1 = células teñidas negativamente);

la figura 24 es una representación gráfica de los resultados del análisis citofluorimétrico de células recuperadas tras 12 días de cultivo en placas revestidas con L^{d} y anticuerpo anti-CD28 y expuestas al péptido SL9, teñidas utilizando el anticuerpo 1B2 específico del receptor de las células T 2C (M2 = células teñidas positivamente, M1 = células teñidas negativamente);

la figura 25 es una gráfica que muestra la citolisis de las células diana mediante células T activadas (línea continua = péptido QL9, línea discontinua = péptido control LCMV);

la figura 26 es una representación gráfica de la lisis citotóxica resultante de la activación de las células humanas CD8^{+} con células presentadoras de antígeno cargadas con una matriz de péptido gripal;

la figura 27 es una representación gráfica de la lisis citotóxica resultante de la activación de las células T CD8^{+} humanas con células presentadoras de antígeno cargadas con el péptido HIV-RT; y

la figura 28 es una representación gráfica de la lisis citotóxica resultante de la activación de las células humanas CD8^{+} con células presentadoras de antígeno cargadas con el péptido tirosinasa.

Descripción detallada de la invención

La presente invención hace referencia a un sistema sintético de presentación de antígenos el cual puede ser usado para activar linfocitos T. Las células T CD8^{+} activadas proliferan, liberan citoquinas, llegan a ser citotóxicas o presentan alguna combinación de esos resultados. En una realización preferida, el sistema activa las células CD8^{+} citotóxicas, las cuales entonces proliferan y son activadas para dirigirse hacia las células diana y destruirlas. La presente invención puede ser usada para activar células T in vitro y las células T activadas son entonces devueltas al paciente del cual se derivaron originalmente, o bien la invención puede ser empleada para la elaboración de un medicamento destinado a la activación in vivo de las células T.

El sistema sintético de presentación de antígenos de la presente invención tiene dos componentes principales. El primer componente consiste en al menos la porción extracelular de la molécula CMH de Clase I la cual es capaz de unirse a un péptido seleccionado. El segundo componente principal es una molécula coadyuvante la cual ayuda en la activación de las células T. En cada caso, una porción extracelular de una molécula mayor puede emplearse, pero en ciertas realizaciones, son usadas las moléculas enteras.

Para facilitar la descripción, las moléculas de CMH son tratadas en general, entendiéndose que una porción extracelular de la molécula CMH debe ser usada. La porción de la molécula CMH necesaria para la presente invención es la parte que se une al péptido seleccionado y presenta el péptido a la célula T.

El péptido es seleccionado para activar la célula T apropiada, dependiendo del tratamiento a ser dirigido. Por ejemplo, en el tratamiento de determinados cánceres, ciertos péptidos antigénicos son presentados en la superficie de las células cancerosas las cuales reaccionan con células T activadas. Así, es apropiado usar un péptido seleccionado para activar las células T apropiadas que entonces se unirán con y destruirán a las células cancerosas.

La presente invención permite a las moléculas de CMH ser producidas por células con el péptido ya acomplejado con la molécula de CMH o producir moléculas de CMH vacías con el péptido aún no acomplejado con ellas. Esta última realización es particularmente útil desde el momento en que permite al péptido ser elegido después de que las moléculas de CMH están preparadas.

Una molécula de CMH de Clase I incluye una cadena pesada, a la cual muchas veces se hace referencia como una cadena alfa, y una microglobulina \beta-2. Como se discute aquí, la porción extracelular de la molécula de CMH está compuesta de una porción extracelular de una cadena de CMH conjuntamente con la microglobulina \beta-2.

En el proceso de preparación para unirse a un soporte, las moléculas solubles son preparadas como se trató más arriba. Estas moléculas generalmente carecen de los dominios transmembrana y citoplásmico de la molécula de CMH.

La molécula coadyuvante ayuda a facilitar la activación de la célula T cuando ésta es presentada con un complejo péptido/molécula CMH. La presente invención incluye dos categorías principales de moléculas coadyuvantes. La primera categoría se compone de moléculas coestimulatorias tales como B7.1 (conocida previamente como B7 y también conocida como CD80) y B7.2 (también conocida como CD86) la cual se une al receptor CD28 en las células T. Otras moléculas coestimulatorias son los anticuerpos anti-CD28 o las porciones funcionales de tales anticuerpos, por ejemplo las porciones Fab que se unen a CD28.

La otra categoría principal de moléculas coadyuvantes en la presente invención son las moléculas de adhesión. Éstas incluyen las diversas moléculas ICAM, las cuales incluyen ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 y LFA-3. Se ha descubierto que la combinación de un péptido unido a una molécula CMH usado conjuntamente con una de estas moléculas coadyuvantes activa las células T a un nivel no visto previamente.

Una reacción sinérgica incluso mayor ha sido lograda mediante el uso de una molécula CMH unida a un péptido en conjunción con una molécula coestimulatoria y otra de adhesión. Se ha demostrado que esto es particularmente efectivo en la producción de células citotóxicas CD8^{+}.

De acuerdo con la presente invención, la molécula CMH y la molécula coadyuvante están ligadas operativamente a un soporte tal que las moléculas de CMH y coadyuvantes están presentes en cantidades suficientes para activar una población de linfocitos T contra el péptido cuando éste está unido s la porción extracelular de la molécula CMH. El péptido puede estar unido a la molécula CMH antes o después de que ésta esté ligada al soporte.

El soporte puede tomar diferentes formas. Puede ser un soporte sólido tal como un material plástico o metálico, puede ser un material poroso tal como el empleado comúnmente en columnas de separación, puede ser un liposoma o un glóbulo rojo, o puede ser incluso una célula o fragmento celular. Como se discute con mayor detalle más adelante, en el caso en que una célula sirve como un soporte, las moléculas de CMH y coadyuvantes pueden ser producidas por la célula. La molécula CMH es entonces unida a la célula mediante al menos el dominio transmembrana, si no también por el dominio citoplásmico, el cual no estaría presente en una forma soluble del CMH.

Las porciones extracelulares de la moléculas de CMH y coadyuvante pueden estar unidas a un soporte suministrando un epítopo el cual reacciona con un anticuerpo inmovilizado en el soporte. En suma, las moléculas de CMH o coadyuvantes pueden ser producidas con o unidas a (His)^{6} el cual reacciona con níquel formando parte del soporte. Otros medios de inmovilizar o unir moléculas de CMH a un soporte son bien conocidos actualmente.

Como se discutió más arriba, el soporte puede ser una membrana celular o una célula entera. En tal caso, una línea celular eucariota es modificada para llegar a ser una línea sintética presentadora de antígenos para su empleo con linfocitos T. Para facilitar la descripción, las células presentadoras de antígeno (APC) pueden también ser llamadas células estimuladoras. Dado que las moléculas de CMH vacías son termolábiles, es preferible que el cultivo celular sea de un animal poiquilotermo y varias líneas celulares son analizadas en detalle más abajo.

Un cultivo de células es establecido primero. El cultivo es entonces transfectado con un gen expresable de cadena pesada de CMH de Clase I el cual está ligado operativamente a un promotor. El gen es elegido de tal forma que sea capaz de expresar la cadena pesada de la molécula de CMH de Clase I. La línea celular es también transfectada con un gen expresable de microglobulina \beta-2 el cual está ligado operativamente a un segundo promotor. El gen es escogido de tal forma que sea capaz de expresar microglobulina \beta-2, la cual forma las moléculas de CMH con la cadena pesada de CHM. El caso de porciones extracelulares solubles de moléculas de CMH para ser usadas con soportes sólidos y el similar, una cadena pesadas de molécula de CMH truncada es empleado y comentado con mayor detalle más abajo.

El cultivo también es transfectado con el gen de una molécula coadyuvante unido operativamente a un tercer promotor. La molécula coadyuvante es capaz de expresarse como una molécula colaboradora la cual interactúa con la molécula en los linfocitos T. Como se discute más adelante, cada uno de esos genes puede ser transfectado utilizando varios métodos, pero el método preferido es usar más de un plásmido.

La línea celular transfectada es escogida porque carece al menos de uno de los genes a ser introducidos. Se ha descubierto que las células de insecto son ventajosas no sólo por que son poiquilotermicas, sino también porque carecen de estos genes y de los mecanismos por los cuales, de otra manera, producirían moléculas de CMH unidas a péptidos. Esto permite un mayor control sobre la producción de moléculas de CMH vacías. La cadena pesada del CMH es preferiblemente de una especie diferente, más preferiblemente de homeotermos como los mamíferos, y, óptimamente, humanos.

La línea celular preferida es una línea celular poiquiloterma estable que tiene el primer promotor siendo inducible para controlar la expresión de la cadena pesada del CMH. Es preferible que la célula ensamble moléculas de CMH y las presente en la superficie celular de tal forma que los péptidos puedan ser elegidos como se desee.

Las moléculas de CMH resultantes se unen al péptido y son presentadas, conjuntamente con las moléculas coadyuvantes, en la superficie celular, en cantidades suficientes para activar una población de linfocitos T contra el péptido cuando éste está ligado a las células CMH.

En otra realización, una segundo gen de molécula coadyuvante es también transfectado en el cultivo celular. En este caso, el primer gen de molécula coadyuvante puede ser el de una molécula coestimulatoria y el segundo puede ser el de una molécula de adhesión.

Es preferible que al menos uno de los genes y, en particular, el gen de la cadena pesada del CMH esté unido a un promotor inducible. Esto permite ejercer control sobre la producción de moléculas de CMH de tal forma que sólo son producidas en el momento en que el péptido de interés está disponible y presentado en el cultivo para reaccionar con las moléculas CMH producidas. Esto minimiza los complejos indeseables molécula CMH/péptidos.

Cuando la línea celular produce ya una o más de las moléculas deseadas, sólo es necesario transfectar el cultivo con un gen expresable del gen faltante en las células. Por ejemplo, si las células presentan ya las moléculas de CMH en su superficie, sólo es necesario transfectar el cultivo con un gen expresable de la molécula auxiliar.

El péptido puede introducirse en el cultivo celular en el momento en el que las células están produciendo moléculas de CMH. Mediante procedimientos tales como shock osmótico, los péptidos pueden introducirse en la célula y unirse a las moléculas de CMH producidas. Como alternativa, particularmente en el caso de líneas celulares poiquilotermas, las moléculas de CMH se presentarán vacías en la superficie celular. El péptido puede añadirse al cultivo y unirse a las moléculas de CMH como se desee.

Después de producir células con moléculas de CMH y auxiliares en su superficie, pueden liofilizarse y utilizarse los fragmentos de las células para activar la población de linfocitos de células T.

Los cultivos transfectados de células pueden utilizarse para producir porciones extracelulares de moléculas de CMH y moléculas auxiliares. El uso de porciones extracelulares junto con soportes tales como soportes sólidos tiene ciertas ventajas de producción. Cuando se utilizan células vivas para proporcionar una célula sintética presentadora de antígeno, deben introducirse en la célula al menos tres genes, dos para producir la molécula de CMH y uno para la molécula auxiliar. A menudo, se transfectan también genes adicionales tales como para resistencia a antibióticos.

Cuando se utiliza un sistema de soporte sólido, una línea celular puede producir las porciones extracelulares de las moléculas de CMH, mientras que otra línea celular produce la porción extracelular de la molécula auxiliar. Las porciones de molécula de CMH y las porciones de molécula auxiliar pueden recogerse después a partir de sus respectivos cultivos. Las moléculas se ligan después a un soporte adecuado en número suficiente para activar una población de linfocitos de células T frente a un péptido cuando el péptido se une a la porción extracelular de la molécula de CMH. Desde un punto de vista de producción, pueden utilizarse dos cultivos diferentes, pero también es posible utilizar el mismo cultivo, requiriendo sin embargo que el cultivo se transfecte con el gen adicional de la porción extracelular de la molécula auxiliar.

Una modificación adicional de esta realización es proporcionar un tercer cultivo de células que se transfecta con un segundo gen expresable de molécula auxiliar. En este ejemplo, el segundo cultivo de células produce porciones extracelulares de la molécula coestimulatoria, mientras que el tercer cultivo de células produce una porción extracelular de una molécula de adhesión. Las porciones de la molécula de adhesión se recogen y se ligan al soporte.

La presente invención se refiere también a un procedimiento para activar células T CD8^{+} frente a un péptido seleccionado. El procedimiento se refiere a proporcionar una línea celular que presenta moléculas de CMH unidas a un péptido y moléculas auxiliares en sus superficies. Las células T CD8^{+} no tratadas pueden obtenerse mediante la extracción de un paciente a tratar. Las células cultivadas se ponen después en contacto con las células T CD8^{+} durante un periodo de tiempo suficiente para activar los linfocitos de células T CD8^{+}, dando como resultado la proliferación y transformación de células T en células efectoras cargadas.

Las células T CD8^{+} activadas pueden separarse después de la línea celular y ponerse en una suspensión en un vehículo aceptable, y son adecuadas para administrar a un paciente. Un procedimiento alternativo implica el uso de la matriz sintética presentadora de antígeno para activar las células CD8^{+} in vitro.

Se prefiere utilizar genes humanos y, por lo tanto, se producen análogos de moléculas humanas. Como se muestra en la patente de EE.UU. nº 5.314.813 anterior, los sistemas murinos proporcionan modelos particularmente útiles para ensayar la operación de activación de células T y demuestran la aplicabilidad del proceso para sistemas humanos. Véase también Sykulev et al., Immunity 1: 15-22 (1994).

1. Moléculas de CMH de clase I humano

Las moléculas de CMH de clase I comprenden una cadena pesada y una proteína \beta-microglobulina. Se selecciona una cadena pesada de CMH de clase I humana de la presente invención del grupo que comprende HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F y HLA-G, y más preferiblemente del grupo que comprende HLA-A, HLA-B y HLA-C. Las cadenas pesadas son útiles en forma soluble o insoluble. En la forma soluble ("sol"), se introduce por ingeniería genética un codón de detención en la secuencia nucleotídica que codifica la molécula de HLA de elección antes del dominio transmembrana.

Aunque es posible aislar secuencias nucleotídicas que codifican cadenas pesadas de CMH de clase I humano a partir de líneas celulares conocidas establecidas que llevan las variantes apropiadas, por ejemplo líneas celulares transformadas JY, BM92, WIN, MOC y MG, es más práctico sintetizar la secuencia nucleotídica a partir de una porción del gen mediante reacción de cadena con polimerasa (PCR), utilizando los cebadores apropiados. Este procedimiento se ha utilizado con éxito para clonar ADNc de HLA completo; por ejemplo las secuencias para HLA-A25, HLA-A2, HLA-B7, HLA-B57, HLA-B51 y HLA-B37 están depositadas en la base de datos GenBank con nº de acceso M32321, M32322, M32317, M32318, M32319 y M32320, respectivamente. Están publicadas secuencias aminoacídicas y nucleotídicas conocidas parciales y supuestas de HLA, incluyendo la secuencia consenso (véase, por ejemplo, Zemmour y Parham, Immunogenetics 33: 310-320 (1991)), y son conocidas líneas celulares que expresan variantes de HLA y están generalmente disponibles también, muchas en la "American Type Culture Collection" ("ATCC"). Por lo tanto, utilizando PCR, es posible sintetizar secuencias nucleotídicas que codifican CMH de clase I humana que pueden ligarse después operativamente a un vector y utilizarse para transformar una célula apropiada y expresarse en la misma.

Los procedimientos particularmente preferidos para producir la cadena pesada de CMH de clase I, proteínas \beta-2 microglobulina y moléculas auxiliares de la presente invención se basan en el uso de oligonucleótidos preseleccionados como cebadores en una reacción de cadena con polimerasa (PCR) para formar productos de reacción PCR como se describen en la presente memoria. La preparación génica se consigue típicamente mediante una extensión de cebador, preferiblemente mediante extensión de cebador en una reacción en cadena con polimerasa (PCR).

Si los genes se van a producir mediante amplificación (PCR), deben utilizarse dos cebadores, concretamente un par cebador de PCR para cada cadena de codificación de ácido nucleico a amplificar. (Con fines de simplicidad, se discutirá la síntesis de una secuencia variante de cadena pesada de HLA ilustrativa, pero ha de entenderse expresamente que el procedimiento de amplificación PCR descrito es igualmente aplicable a la síntesis de \beta-2 microglobulina, moléculas coestimulatorias, moléculas de adhesión y todas las variantes de HLA, incluyendo aquellas cuyas secuencias completas son actualmente desconocidas).

El primer cebador entra a formar parte de la cadena sin sentido (menos o complementaria) e hibrida con una secuencia nucleotídica conservada entre las cadenas de HLA (más o codificantes). Para producir homólogos de ADN codificante, se eligen los primeros cebadores por lo tanto para hibridar con (concretamente para ser complementarios con) regiones conservadas en los genes de CMH, preferiblemente la secuencia consenso o similar, regiones conservadas en cada grupo de HLA, concretamente las secuencias consenso en HLA-A, HLA-B, HLA-C y los grupos menos polimórficos HLA-E, HLA-F y HLA-G.

Los segundos cebadores entran a formar parte de la cadena codificante (más) e hibridan con una secuencia nucleotídica conservada entre las cadenas menos. Para producir los homólogos de ADN codificantes de HLA, los segundos cebadores se eligen por lo tanto para hibridar con una secuencia nucleotídica conservada en el extremo 5' del gen codificante de HLA de tal modo que esa área codifique la región líder o primera región marco. En la amplificación de los homólogos de ADN codificante, la secuencia nucleotídica 5' conservada del segundo cebador puede ser complementaria de una secuencia añadida exógenamente utilizando desoxinucleotidiltransferasa terminal como describen Loh et al., Science 243: 217-220 (1989). Uno o ambos de los primero y segundo cebadores pueden contener una secuencia nucleotídica que define un sitio de reconocimiento de endonucleasa. El sitio puede ser heterólogo del gen de inmunoglobulina que se está amplificando y aparece típicamente en o cerca del extremo 5' del cebador.

La alta velocidad de recambio de la ARN polimerasa amplifica el polinucleótido de partida como han descrito Chamberlin et al., The Enzymes, Ed. P. Boyer, pág. 87-108, Academic Press, Nueva York (1982). Otra ventaja de la ARN polimerasa T7 es que pueden introducirse mutaciones en la síntesis de polinucleótido reemplazando una porción del ADNc por uno o más oligodesoxinucleótidos mutagénicos (polinucleótidos) y transcribiendo el molde parcialmente desapareado directamente como se han descrito anteriormente Joyce et al., Nuc. Acid Res. 17: 711-722 (1989). Han descrito sistemas de amplificación basados en la transcripción Gingeras et al., en PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, pág. 245-252, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990).

Los procedimientos de amplificación por PCR se describen con detalle en las patentes de EE.UU. nº 4.683.192, 4.683.202, 4.800.159 y 4.965.188, y al menos en diversos textos, incluyendo "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", H. Erlich, Ed., Stockton Press, Nueva York (1989); y "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, California (1990). Se describen a continuación en la presente memoria varios procedimientos y cebadores preferidos utilizados en la presente memoria y se describen también en Nilsson et al., Cell 58: 707 (1989), Ennis et al., PNAS USA 87: 2833-2837 (1990), y Zemmour, et al., Immunogenetics 33: 310-320 (1991), por ejemplo. En particular, se prefiere diseñar cebadores a partir de la comparación de regiones 5' y 3' no traducidas de alelos de HLA (por ejemplo alelos A, B, C, E, F o G), con selección de las secuencias conservadas. Los sitios de restricción pueden incorporarse también a cebadores 5' y 3' para posibilitar que los productos de amplificación se subclonen en vectores de secuenciación o expresión. También puede ser de ayuda disponer una secuencia espaciadora de 4 bases próxima al sitio de restricción para mejorar la eficacia de la escisión de los productos de amplificación con enzimas.

Se prefieren los siguientes cebadores para amplificación de ADNc de HLA-A, B, C, E, F y G, preferiblemente en reacciones separadas. Los ADNc resultantes pueden clonarse después y secuenciarse como se describe en la presente memoria. Estos cebadores son apropiados para uso en la amplificación de todos los tipos conocidos y actualmente desconocidos de HLA:

HLA A

Cebador 5': 5' CC ACC ATG GCC GTC ATG GCG CCC 3' (SEC Nº ID 1)

Cebador 3': 5' GG TCA CAC TTT ACA AGC TCT GAG 3' (SEC Nº ID 2)

HLA B

Cebador 5': 5' CC ACC ATG CTG GTC ATG GCG CCC 3' (SEC Nº ID 3)

Cebador 3': 5' GG ACT CGA TGT GAG AGA CAC ATC 3' (SEC Nº ID 4)

HLA C

Cebador 5': 5' CC ACC ATG CGG GTC ATG GCG CCC 3' (SEC Nº ID 5)

Cebador 3': 5' GG TCA GGC TTT ACA AGC GAT GAG 3' (SEC Nº ID 6)

HLA E

Cebador 5': 5' CC ACC ATG CGG GTA GAT GCC CTC C 3' (SEC Nº ID 7)

Cebador 3': 5' GG TTA CAA GCT GTG AGA CTC AGA 3' (SEC Nº ID 8)

HLA F

Cebador 5': 5' CC ACC ATG GCG CCC CGA AGC CTC 3' (SEC Nº ID 9)

Cebador 3': 5' GG TCA CAC TTT ATT AGC TGT GAG A 3' (SEC Nº ID 10)

HLA G

Cebador 5': 5' CC ACC ATG GCG CCC CGA ACC CTC 3' (SEC Nº ID 11)

Cebador 3': 5' GG TCA CAA TTT ACA AGC CGA GAG 3' (SEC Nº ID 12).

En realizaciones preferidas, se utiliza sólo un par de cebadores primero y segundo por reacción de amplificación. Los productos de la reacción de amplificación obtenidos de una pluralidad de diferentes amplificaciones, utilizando cada una de ellas una pluralidad de diferentes pares cebadores, se combinan después. Sin embargo, la presente invención se refiere también a la producción de homólogos de ADN mediante coamplificación (utilizando dos pares de cebadores) y amplificación múltiple (utilizando hasta 8, 9 ó 10 pares cebadores).

En realizaciones preferidas, el proceso PCR se utiliza no sólo para producir una variedad de moléculas de ADN que codifican clase I humana, sino también para inducir mutaciones que pueden simular las observadas en los locis de HLA altamente polimórficos, o para crear diversidad a partir de un solo clon original y proporcionar así una "biblioteca" de ADN codificante de moléculas de CMH de clase I que tenga una mayor heterogeneidad. Además de las variaciones inductoras de mutación descritas en la patente de EE.UU. nº 4.683.195 anteriormente indicada, tales como las discutidas en la patente de EE.UU. nº 5.314.813.

2. Vectores de expresión de ADN

Un vector de la presente invención es una molécula de ácido nucleico (preferiblemente ADN) capaz de replicación autónoma en una célula y a la que puede ligarse operativamente un segmento de ADN, por ejemplo un gen o polinucleótido, de modo que dé lugar a la replicación del segmento unido. Uno de los segmentos nucleotídicos a ligar operativamente a las secuencias de vector codifica al menos una porción de una cadena pesada de CMH de clase I de mamífero. Preferiblemente, la secuencia codificante de péptido completa de la cadena pesada de CMH se inserta en el vector y se expresa; sin embargo, también es factible construir un vector que incluya también algunas secuencias de CMH no codificantes. Preferiblemente, las secuencias no codificantes de CMH se excluyen. Como alternativa, puede utilizarse una secuencia nucleotídica para una forma soluble ("sol") de una cadena pesada de CMH de clase I; la forma "sol" difiere de la forma no sol en que contiene un codón de paro insertado al final del dominio alfa 3 o antes del dominio transmembrana. Otro vector preferido incluye una secuencia nucleotídica que codifica al menos una porción de una molécula de \beta-2 microglobulina de mamífero ligada operativamente al vector para expresión. Aún otro vector preferido incluye una secuencia nucleotídica que codifica al menos una porción de una molécula auxiliar de mamífero ligada operativamente al vector para expresión. También es factible construir un vector que incluya secuencias nucleotídicas que codifiquen una cadena pesada de CMH de clase I y una \beta-2 microglobulina y una molécula auxiliar, o alguna combinación de éstas.

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Un vector preferido comprende un módulo que incluye una o más secuencias de ADN traducibles ligadas operativamente para expresión a través de una secuencia de nucleótidos adaptada para ligamiento direccional. El módulo incluye preferiblemente secuencias de control de la expresión de ADN para expresar el polipéptido o proteína que se produce cuando se inserta direccionalmente una secuencia de ADN traducible en el módulo a través de la secuencia de nucleótidos adaptada para ligamiento direccional. El módulo incluye preferiblemente también una secuencia promotora cadena arriba de la secuencia de ADN traducible, y una secuencia de poliadenilación cadena abajo de la secuencia de cadena pesada de CMH de mamífero. El módulo puede incluir también un marcador de selección, aunque se prefiere que dicho marcador esté codificado en una secuencia nucleotídica ligada operativamente a otra secuencia del vector de expresión.

La elección del vector al que se liga operativamente un módulo de esta invención depende directamente, como es bien conocido en la técnica, de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, la replicación del vector y la expresión de la proteína, y de la célula hospedadora a transformar, siendo estas limitaciones inherentes a la técnica de construir moléculas de ADN recombinante.

En diversas realizaciones, se utiliza un vector para la producción de polipéptidos útiles en la presente invención, incluyendo variantes de CMH y péptidos antigénicos. Los vectores ilustrativos incluyen los plásmidos pUC8, pUC9, pUC18, pBR322 y pBR329 disponibles en BioRad Laboratories (Richmond, CA), pPL y pKK223 disponibles en Pharmacia (Piscataway, NJ), y pBS y M13mp19 (Stratagene, La Jolla, CA). Otros vectores ilustrativos incluyen pCMU (Nilsson et al., Cell 58: 707 (1989)). Pueden sintetizarse también otros vectores apropiados, según procedimientos conocidos; por ejemplo, los vectores pCMU/K^{b} y pCMUII utilizados en diversas aplicaciones en la presente memoria son modificaciones de pCMUIV (Nilsson et al., supra).

Además, hay preferiblemente una secuencia cadena arriba de la secuencia nucleotídica traducible que codifica una secuencia promotora. Preferiblemente, el promotor es condicional (por ejemplo inducible). Un promotor condicional preferido utilizado en la presente memoria es un promotor de metalotioneína o un promotor de shock térmico.

Los vectores pueden construirse utilizando cualquiera de las técnicas de construcción de vectores bien conocidas. Estas técnicas, sin embargo, se modifican en la medida en que la secuencia nucleotídica traducible a insertar en el genoma de la célula hospedadora está flanqueada "cadena arriba" de la secuencia por un promotor apropiado y, en algunas variaciones de la presente invención, la secuencia nucleotídica traducible está flanqueada "cadena abajo" por un sitio de poliadenilación. Esto es particularmente preferido cuando la célula "hospedadora" es una célula de insecto y la secuencia nucleotídica se transmite mediante transfección. La transfección puede conseguirse mediante numerosos procedimientos, incluyendo el procedimiento de fosfato de calcio, el procedimiento de DEAE-dextrano, el procedimiento de transferencia estable, la electroporación o mediante el procedimiento de mediación por liposoma. Están disponibles numerosos textos que indican los procedimientos de transfección conocidos y otros procedimientos para introducir nucleótidos en células, véase por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1991).

El vector mismo puede ser de cualquier tipo adecuado, tal como un vector viral (ARN o ADN), ADN de cadena lineal o circular desnudo o una vesícula o cubierta que contiene el material ácido nucleico y cualquier polipéptido que se hayan de insertar en la célula. Con respecto a las vesículas, son bien conocidas las técnicas de construcción de vesículas lipídicas, tales como liposomas. Dichos liposomas pueden dirigirse a células particulares utilizando otros técnicas convencionales, tales como proporcionar un anticuerpo u otra molécula de unión específica al exterior del liposoma. Véase por ejemplo, A. Huang et al., J. Biol. Chem. 255: 8015-8018 (1980). Véase por ejemplo, Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 487-511 (1990).

En una realización preferida, el vector contiene también un marcador detectable. Después de la expresión, el producto de la secuencia nucleotídica traducible puede purificarse después utilizando anticuerpos frente a esa secuencia. Un ejemplo de un marcador detectable es la resistencia a neomicina. Puede incluirse en cada transfección un plásmido que codifica la resistencia a neomicina, tal como phshsneo, phsneo o pcopneo, de tal modo que puede evaluarse una población de células que expresan el gen o genes de elección haciendo crecer los transfectantes en medio de selección.

Un vector preferido para uso según la presente invención es un plásmido; más preferiblemente es un plásmido de alto número de copias. También es deseable que el vector contenga una secuencia promotora inducible, ya que los promotores inducibles tienden a limitar la presión de selección frente a células en las que se han introducido dichos vectores (que a menudo se construyen para llevar secuencias nucleotídicas no nativas o quiméricas). También es preferible que el vector de elección se elija adecuadamente para expresión en el hospedador elegido. Si la población de células hospedadoras es un cultivo celular de Drosophila, entonces un vector compatible incluye vectores funcionalmente equivalentes a aquellos tales como p25-lacZ (véase Bello y Couble, Nature 346: 480 (1990)) o pRmHa-1, -2 ó -3 (véase Bunch et al., Nucl. Acids. Res. 16: 1043-1061 (1988)). En la realización preferida, el vector es pRmHa-3, que se muestra en la Figura 3. Este vector incluye un promotor de metalotioneína, que está preferiblemente cadena arriba del sitio en el que se inserta la secuencia de CMH, y el sitio de poliadenilación está preferiblemente cadena abajo de la citada secuencia de CMH. Las células de insecto y, en particular, las células de Drosophila, son hospedadoras preferidos según la presente invención. Las células de Drosophila tales como células Schneider 2 (S2) tienen los factores de transacción necesarios requeridos para la activación del promotor, y por tanto son aún más preferidos.

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El vector de expresión pRmHa-3 está basado en el plásmido bacteriano pRmHa-1 (Figura 2), estando basado este último en el plásmido pUC18 y depositado en la "American Type Culture Collection" (ATCC; Rockville, MD), con el número de acceso 37253. El vector pRmHa-3 contiene el promotor, la secuencia líder no traducida 5' del gen de metalotioneína (secuencias 1-421, SEC Nº ID 13) con los sitios R1 y Stu eliminados; véase la Figura 3). Contiene también la porción 3' del gen ADH de Drosophila (nº de secuencia 6435-7270, SEC Nº ID 14) incluyendo el sitio de poliadenilación. Por lo tanto, el ADN clonado se regulará transcripcionalmente por el promotor de metalotioneína y se poliadenilará. La construcción del plásmido pRmHa-1 se describe en Bunch et al., Nucl. Acids. Res. 16: 1043-1061 (1988). La construcción de los plásmidos pRmHa-3 y pRmHa-2 (el último de los cuales tiene una secuencia promotora de metalotioneína que puede eliminarse en forma de un fragmento Eco RI) se ilustra en las figuras 1, 2 y 3. Con respecto a pRmHa-3, un plásmido preferido para uso según la presente invención, Pst I, SphI e Hind III están en el fragmento promotor y por tanto no son únicos. Xba está en el fragmento de ADH (4 bases desde su extremo 3') y tampoco es único. Sin embargo, los siguientes sitios de restricción son sin embargo únicos en pRmHa-3: Eco RI, Sac I, Kpn I, Sma I, Bam HI, Sal I, Hinc 2 y Acc I.

Un módulo en un vector de expresión de ADN de esta invención es la región del vector que forma, tras la inserción de una secuencia traducible de ADN, una secuencia de nucleótidos capaz de expresar, en un hospedador apropiado, una proteína de fusión de esta invención. La secuencia competente de expresión de nucleótidos se designa como un cistrón. Por tanto, el módulo comprende preferiblemente elementos de control de la expresión de ADN ligados operativamente a una o más secuencias de ADN traducibles. Un cistrón se forma cuando una secuencia de ADN traducible se inserta direccionalmente (se liga direccionalmente) entre los elementos de control a través de la secuencia de nucleótidos adaptada con ese fin. La secuencia de ADN traducible resultante, es decir la secuencia insertada, está prefriblemente ligada operativamente al marco de lectura apropiado.

Las secuencia de control de la expresión de ADN comprenden un conjunto de señales de expresión de ADN para expresar un producto génico estructural, e incluyen tanto los extremos 5' como 3', como es bien conocido, ligados operativamente al cistrón de tal modo que el cistrón sea capaz de expresar un producto génico estructural. Las secuencias de control 5' definen un promotor para iniciar la transcripción y un sitio de unión a ribosoma ligado operativamente al extremo 5' de la secuencia de ADN traducible cadena arriba.

Por tanto, un vector de expresión de ADN de esta invención proporciona un sistema para clonar secuencias de ADN traducibles en la porción del módulo del vector para producir un cistrón capaz de expresar una proteína de fusión de esta invención.

3. Líneas celulares

Una línea celular preferida de la presente invención es capaz de crecimiento continuo en cultivo y es capaz de expresar moléculas de CMH de clase I de mamífero y moléculas auxiliares en la superficie de sus células. Cualquiera de una variedad de células o líneas celulares transformadas y no transformadas es apropiada con este fin, incluyendo líneas celulares bacterianas, de levadura, insecto y mamífero. (Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1991), para resúmenes y procedimientos de cultivo y uso de una variedad de líneas celulares, por ejemplo E. coli y S. cerevisiae).

Preferiblemente, la línea celular es una línea celular eucariótica. Más preferiblemente, la línea celular es poiquilotérmica (concretamente menos sensible a la exposición a la temperatura que las líneas celulares de mamífero). Más preferiblemente, es una línea celular de insecto. Están disponibles diversas líneas celulares de insecto para uso según la presente invención, incluyendo de polilla (ATCC CL 80), gardama (ATCC CRL 1711), larvas de mosquito (líneas ATCC CCL 125, CCL 126, CRL 1660, CRL 1591, CRL 6585, CRL 6586) y gusano de seda (ATCC CRL 8851). En una realización preferida, la línea celular es una línea celular de Drosophila tal como una línea celular Schneider (véase Schneier, J. Embryol. Exp. Morph. 27: 353-365 (1972)); preferiblemente la línea celular es una línea celular Schneider 2 (S2) (S2/M3) adaptada para crecimiento en medio M3 (véase Lindquist et al.), Drosophila Information Service 58: 163 (1982)).

Las células de Schneider pueden prepararse sustancialmente de la siguiente manera. Se recogen huevos de Drosophila melanogaster (Oregon-R) durante aproximadamente un intervalo de 4 horas, se descloran en hipoclorito de sodio acuoso al 2,5% y se esteriliza su superficie mediante inmersión en etanol al 70% durante 20 minutos, seguido de 20 minutos adicionales en HgCl_{2} al 0,05% en etanol al 70%. Después de aclarar concienzudamente con agua estéril destilada, los huevos se transfieren a placas Petri que contienen filtros negros Metricel estériles reforzados con prefiltros Millipore, ambos previamente humedecidos con medio de cultivo. Los huevos se disponen durante una noche en un incubador a 22ºC y se retiran del cultivo a las 20-24 horas. Los embriones se cortan cada uno en mitades o en tercios, después se disponen en tripsina al 0,2% (1:250, Difco) en solución salina de Rinaldini (Rinaldini, Nature (Londres), 173: 1134-1135 (1954)) durante 20-45 minutos a temperatura ambiente. Se utilizan de 100 a 300 embriones para iniciar cada cultivo.

Después de la adición de suero fetal bovino (SFB), los fragmentos se centrifugan a 100 x g durante 2-3 minutos, se resuspenden en 1,25 ml de medio de cultivo y se siembran en matraces de vidrio T-9. Los cultivos se mantienen aproximadamente a 22-27ºC \pm 0,5ºC con una fase gaseosa de aire ambiental. Se utiliza preferiblemente medio de cultivo Schneider (Schneider, J. Exp. Zool. 156: 91-104 (1964); Schneider, J. Embryol. Exp. Morph. 15: 271-279 (1966)) que contiene 500 mg adicionales de una peptona bacteriológica por 10 ml de medio y suplementado con SFB al 15% inactivado. El pH (preferiblemente 6,7- 6,8) se controla con rojo de fenol al 0,01%. Las líneas celulares se mantienen preferiblemente mediante subcultivo cada 3-7 días. Las células se adhieren rápidamente al vidrio, pero no tan fuertemente como para requerir tratamiento con tripsina; típicamente el simple pipeteo es adecuado para limpiar la mayoría de las células del fondo de los matraces. La apariencia morfológica de las células se describe en Schneider, J. Embryol. Exp. Morph. 27: 353-365 (1972). Son esencialmente de apariencia de tipo epitelial y en el intervalo de 5-11 \mum de diámetro y 11-35 \mum de longitud. Pueden dispersarse aleatoriamente en pequeñas bolsas que contienen células redondeadas entre las demás células.

Preferiblemente, las células Schneider 2 (S2) se mantienen en medio de Drosophila Schneider™ más SFB al 10% incluyendo penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 mg/ml). Es preferible mantener las células a una densidad de más de 0,5 x 10^{5}/ml, y hacerlas crecer en el intervalo de temperatura de 24-30ºC. Las células tienden a duplicarse en menos de 24 horas y crecen hasta una alta densidad celular, concretamente aproximadamente 2 x 10^{7}/ml o mayor. Las células pueden congelarse también en 90% de SFB al 90% y 10% de DMSO para uso o análisis posterior. Pueden disponerse las células a -70ºC y después almacenarse en nitrógeno líquido.

Una línea celular preferida según la presente invención, identificada como células de Schneider 2 (S2), se ha depositado según los requisitos del Tratado de Budapest en la "American Type Culture Collection" (ATCC), Rockville, MD, el 18 de febrero de 1992, y se le asignó el número de acceso CRL 10974.

Las células de la presente invención se transfectan con ADNc que codifican cadenas pesadas de CMH (humano), \beta-2 microglobulina y una o más moléculas auxiliares, que se han insertado en (concretamente ligado operativamente a) un vector de expresión. En una realización más preferida, el vector comprende el plásmido de expresión de Drosophila pRmHa-3, en el que se han insertado secuencias nucleotídicas expresables que codifican cadenas pesadas de CMH de clase I humano, \beta-2 microglobulina humana o moléculas auxiliares humanas utilizando las técnicas descritas en la presente memoria. Preferiblemente, los ADNc que codifican cadenas pesadas de CMH, los que codifican \beta-2 microglobulina y los que codifican moléculas auxiliares se ligan operativamente a plásmidos de expresión separados y se cotransfectan en las células cultivadas. Como alternativa, los ADNc que codifican cadenas pesadas de CMH, \beta-2 microglobulina y moléculas auxiliares pueden ligarse operativamente al mismo plásmido de expresión y cotransfectarse a través de ese mismo plásmido. En otra variación, los ADNc que codifican cadenas pesadas de CMH, \beta-2 microglobulina, moléculas auxiliares y una citoquina tal como IL-2 se ligan operativamente a plásmidos de expresión y se cotransfectan en una línea celular de la presente invención. La selección de los genes HLA, la construcción de los vectores apropiados y la selección de cebadores se describe con más detalle anteriormente.

Las células exitosamente transformadas, concretamente células que contienen una secuencia nucleotídica humana expresable según la presente invención, pueden identificarse mediante técnicas bien conocidas. Por ejemplo, las células resultantes de la introducción de un ADNc o ADNr de la presente invención pueden clonarse para producir colonias monoclonales. Las células de estas colonias pueden recogerse, lisarse y examinarse en su contenido de ADN la presencia de ADNr utilizando un procedimiento tal como el descrito por Southern, J. Mol. Biol. 98: 503 (1975). Además de ensayando directamente la presencia de ADNr, la transformación o transfección exitosa puede confirmarse mediante procedimientos inmunológicos bien conocidos cuando el ADNr es capaz de dirigir la expresión de un polipéptido quimérico objeto. Por ejemplo, las células transformadas exitosamente con un vector de expresión pueden producir proteínas que presentan propiedades antigénicas particulares que se determinan fácilmente utilizando los anticuerpos apropiados. Además, la transformación/transfección exitosa puede determinarse mediante el uso de un vector adicional que lleve una secuencia marcadora, tal como resistencia a neomicina, como se describe anteriormente en la presente memoria.

También es preferible que el cultivo sea estable y capaz de un crecimiento sostenido a temperaturas reducidas. Por ejemplo, se prefiere que el cultivo se mantenga aproximadamente a temperatura ambiente, por ejemplo aproximadamente 24-27ºC. En otras realizaciones, el cultivo se mantiene a temperaturas mayores, particularmente durante el proceso de activación de células CD8^{+}. Se prefiere por tanto que un cultivo según la presente invención sea capaz de soportar una exposición térmica de aproximadamente 30ºC a aproximadamente 37ºC. La adición de \beta-2 microglobulina a un cultivo estabiliza el CMH de clase I al menos ante una exposición a 30ºC; la adición de \beta-2 microglobulina y péptidos da como resultado una mayor termoestabilidad a mayores temperaturas, concretamente a 37ºC.

Para preparar el cultivo para la expresión de moléculas de CMH vacías, o más preferiblemente cargadas con péptido, el cultivo puede requerir primero estimulación, por ejemplo mediante inducción con CuSO_{4}, durante un periodo predeterminado de tiempo. Después de un periodo de inducción adecuado, por ejemplo aproximadamente 12-48 horas, los péptidos pueden añadirse a una concentración predeterminada (por ejemplo aproximadamente 100 \mug/ml). Los péptidos pueden prepararse como se discute a continuación. Después de un periodo de incubación adicional, por ejemplo durante aproximadamente 12 horas a 27ºC, el cultivo está preparado para uso en la activación de células CD8^{+}. Aunque este periodo de incubación adicional puede acortarse o quizás omitirse, el cultivo tiende a hacerse cada vez más estable ante la exposición térmica si se permite incubar durante un tiempo antes de la adición de células CD8^{+} en reposo o no tratadas. Por ejemplo, los cultivos según la presente invención a los que se ha añadido péptido son capaces de expresar cantidades significativas de moléculas de CMH de clase I cargadas con péptido incluso cuando se incuban durante periodos extensos de tiempo a 37ºC.

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Los medios nutrientes útiles en el cultivo de células hospedadoras transformadas son bien conocidos en la técnica y pueden obtenerse a partir de numerosas fuentes comerciales. En realizaciones en las que la célula hospedadora es de mamífero, se utiliza preferiblemente un medio "exento de suero".

4.\beta-2 microglobulina humana y moléculas auxiliares

Para establecer una línea celular capaz de producir cantidades terapéuticamente útiles de moléculas de CMH de clase I humano es preferible cotransfectar una línea celular de la presente invención con un vector ligado operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica \beta-2 microglobulina, para alcanzar niveles apropiados de expresión de moléculas de CMH humano en la línea celular. Aunque la secuencia nucleotídica que codifica \beta-2 microglobulina de mamífero, tal como \beta-2 microglobulina de ratón, aumenta la estabilidad de las moléculas de CMH de clase I humano expresadas en las líneas celulares de la presente invención, es preferible cotransfectar la línea celular con un vector ligado operativamente a una secuencia nucleotídica expresable que codifica una \beta-2 microglobulina humana.

Como se discutió anteriormente, un vector preferido según la presente invención incluye una secuencia nucleotídica que codifica al menos una porción de la molécula de \beta-2 microglobulina de mamífero ligada operativamente al vector para expresión. El gen de las moléculas auxiliares puede estar ligado el mismo o a otro vector. Es también factible construir un vector que incluya secuencias nucleotídicas que codifiquen tanto una cadena pesada de CMH de clase I como una \beta-2 microglobulina.

La secuenciación y los cebadores utilizados para las moléculas auxiliares se discuten con más detalle a continuación. Sin embargo, los protocolos son similares.

Se ha publicado una secuencia de ADNc de microgloblulina \beta-2 humana (véase Suggs, et al., PNAS 78: 6613-6617, 1981) y la secuencia se utilizó como molde para una reacción en cadena con polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores:

Cebador 5': 5' GCTTGGATCCAGATCTACCATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTC GCGCTACTCTC 3' (SEC Nº ID 15)

Cebador 3': 5' GGATCCGGATGGTTACATGTCGCGATCCCACTTAAC 3' (SEC Nº ID 16)

Los cebadores se utilizan en una reacción PCR estándar (véase anteriormente y las referencias citadas en la presente memoria). Los productos de reacción se extraen con fenol, se purifican utilizando un kit Geneclean™ (Bio 101, San Diego, CA), se digieren con Bam HI y se clonan en el sitio Bam HI de pBS (Stratagene, La Jolla, CA). Después de la verificación de la secuencia, este fragmento de Bam HI se clona en el sitio Bam HI de un vector de expresión apropiado. En la realización preferida, el ADNc de \beta-2 microglobulina humana se sintetiza y se liga operativamente al vector de expresión pRmHa-3.

5. Péptidos

Puede utilizarse virtualmente cualquier proteína celular además de antígenos virales para generar fragmentos peptídicos relevantes que sirven como ligando potencial de CMH de clase I. En la mayoría de las células de mamífero, entonces, cualquier complejo peptídico de CMH particular representaría sólo una pequeña proporción de las moléculas codificadas de CMH total encontradas en la superficie celular. Por lo tanto, para producir moléculas de CMH de clase I humano expresadas en superficie que tengan una capacidad aumentada de activar específicamente células CD8^{+}, es preferible aislar y cargar fragmentos peptídicos de tamaño y características antigénicas apropiados en moléculas de clase I.

Los péptidos de la presente invención se unen a moléculas de CMH de clase I. La unión ocurre en condiciones biológicas que pueden crearse in vivo así como in vitro. La naturaleza exacta de la unión de los péptidos no necesita conocerse para la práctica de esta invención.

En una realización preferida, los péptidos a cargar en las moléculas de CMH de clase I son antigénicos. También es preferible que los péptidos sean de tamaño uniforme, preferiblemente octámeros o nonámeros, y lo más preferiblemente octámeros. También es preferible que los péptidos preparados para cargar en las moléculas de CMH sean de una sola especie; concretamente que todos los péptidos cargados en el CMH sean idénticos en tamaño y secuencia. De esta manera, es posible producir moléculas de CMH cargadas con péptido monoantigénicas.

Los péptidos pueden presentarse a las células mediante diversos medios. Preferiblemente, los péptidos se presentan en una manera que les permita entrar en una agrupación intracelular de péptidos. Por ejemplo, los péptidos pueden presentarse mediante carga osmótica. Típicamente, los péptidos pueden añadirse al medio de cultivo. Los péptidos pueden añadirse al cultivo en forma de un polipéptido o proteína intacto que se degrada subsiguientemente mediante procesos celulares, por ejemplo mediante degradación enzimática. Como alternativa, el polipéptido o proteína intacto puede degradarse mediante algún otro medio tal como digestión química (por ejemplo bromuro de cianógeno) o proteasas (por ejemplo quimotripsina) antes de su adición al cultivo celular. En otras realizaciones, los péptidos se presentan en segmentos menores que pueden comprender o no secuencias aminoacídicas epitópicas.

En una realización preferida, se añade una cantidad suficiente de proteína o proteínas o péptido o péptidos al cultivo celular para permitir que se unan a moléculas de CMH de clase I y que presenten subsiguientemente una gran densidad de péptido, preferiblemente con el mismo tipo de péptido unido a cada CMH, en la superficie de células que expresan CMH de clase I humano de la presente invención. También es preferible permitir que las cadenas pesadas de CMH de clase I humano y \beta-2 microglobulina humana se unan, concretamente para formar heterodímeros, antes de presentar el péptido a las moléculas de CMH intracelularmente.

En otra realización de la invención, los péptidos se añaden a células transfectadas de la presente invención para potenciar la termoestabilidad de las moléculas de CMH expresadas por las células. Como se observó anteriormente, los péptidos se añaden preferiblemente al medio de cultivo.

Los péptidos antigénicos que se unen a moléculas de clase I sirven para termoestabilizar las moléculas de CMH y también aumentan la expresión en la superficie celular. Los cultivos con péptidos añadidos que se unen a moléculas de CMH son por tanto significativamente menos sensibles a la exposición térmica que los cultivos sin péptido añadido.

En una realización de la presente invención, los péptidos antigénicos se presentan en la línea celular transformada/transfectada en diversas formas. Por ejemplo, puede degradarse química o enzimáticamente una proteína entera u otro polipéptido antigénico, por ejemplo, y añadirse a la línea celular en esta forma. Por ejemplo, se degrada una proteína de interés con quimotripsina y la mezcla resultante de "fragmentos" peptídicos se añade a un cultivo celular transformado o transfectado; estas células se permiten "elegir" después los péptidos apropiados (que son a menudo péptido menores, preferiblemente octámeros o nonámeros) a cargar en las moléculas de CMH de clase I. Como alternativa, puede clonarse una proteína o secuencia polipeptídica entera en un vector apropiado e insertarse en una célula procariótica, con lo que la célula genera cantidades significativas del polipéptido antigénico que se recogen después, se purifican y se digieren en péptidos, que se añaden después al cultivo celular eucariótico transformado/transfectado. Las células se permitirían de nuevo "elegir" los péptidos a cargar en el CMH expresado.

6. Aislamiento de células CD8^{+} en reposo o precursoras

Las células CD8^{+} en reposo (o no tratadas o precursoras), concretamente células T que no se han activado para dirigirse a un antígeno específico, se extraen preferiblemente del paciente antes de la incubación de las células CD8^{+} con los cultivos transformados de la presente invención. Se prefiere también que las células CD8^{+} precursoras se recojan de un paciente antes del inicio de su tratamiento o terapia, que puede interferir con la capacidad de las células CD8^{+} de activarse específicamente. Por ejemplo, si se pretende tratar un individuo con una neoplasia o tumor, es preferible obtener una muestra de células o cultivar la misma antes del inicio del tratamiento de quimioterapia o radiación.

Los procedimientos de extracción y cultivo de linfocitos son bien conocidos. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.690.915 de Rosenberg describe un procedimiento de obtención de grandes cantidades de linfocitos mediante linfocitoféresis. Las condiciones de cultivo apropiadas utilizadas son para células de mamífero, que se llevan a cabo típicamente a 37ºC.

Están también disponibles diversos procedimientos para separar y/o enriquecer cultivos de células CD8^{+} precursoras. Algunos ejemplos de procedimientos generales para la separación de células incluyen la unión indirecta de células a superficies recubiertas específicamente. En otro ejemplo, los linfocitos de sangre periférica humana (PBL), que incluyen células CD8^{+}, se aíslan mediante centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque™ (Pharmacia, Piscataway, NJ). Los linfoblastos de PBL pueden utilizarse inmediatamente después de ello o pueden almacenarse en nitrógeno líquido después de congelar en PBS que contiene DMSO al 10% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), lo que conserva la viabilidad celular y las funciones del linfocito.

Los procedimientos alternativos de separar y/o enriquecer cultivos de células precursoras incluyen tanto procedimientos de selección positiva como negativa. Para selección positiva, después de preparar poblaciones de PBL enriquecidas con linfocitos a partir de sangre completa, se aíslan a partir de ellas subpoblaciones de linfocitos CD8^{+} mediante técnicas de separación basadas en la afinidad dirigidas a la presencia de antígeno de receptor CD8. Estas técnicas basadas en la afinidad incluyen microfluorimetría de flujo, incluyendo citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS), adhesión celular y procedimientos similares. (Véase por ejemplo Scher y Mage en Fundamental Immunology, W.E. Paul, Ed., pág. 767-780, River Press, NY (1984)). Los procedimientos de afinidad pueden utilizar anticuerpos anti-receptor CD8 como fuente del reactivo de afinidad. Como alternativa, el ligando natural, o análogos de ligando, del receptor CD8 puede utilizarse como reactivo de afinidad. Están disponibles diversos anticuerpos monoclonales anti-células T y anti-CD8 para uso en estos procedimientos de una variedad de fuentes comerciales, incluyendo la "American Type Culture Collection" (Rockville, MD) y Pharmingen (San Diego, CA).

Los procedimientos de selección negativa se utilizan para efectuar la retirada de no CD8 de la población de CD8^{+}. Esta técnica da como resultado el enriquecimiento de células CD8^{+} de la población de células T y B de pacientes sometidos a leucoforesis. Dependiendo de la designación de antígeno, pueden ser apropiados diferentes anticuerpos. (Para una discusión y revisión de la nomenclatura, la designación de antígenos y los anticuerpos asignados para leucocitos humanos, incluyendo células T, véanse Knapp et al., Immunology Today 10: 253-258 (1989) y Janeway et al., Immunobiology, supra). Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales OKT4 (anti-CD4, ATCC nº CRL 8002), OKT 5 (ATCC nº CRL 8013 y 8016), OKT 8 (anti-CD8, ATCC nº CRL 8104) y OKT 9 (ATCC nº CRL 8021) se identifican en el catálogo ATCC de líneas celulares e hibridomas (ATCC, Rockville, MD) como reactivos con linfocitos T humanos, subconjuntos de células T humanas y células T activadas, respectivamente. Diversos otros anticuerpos están disponibles para identificar y aislar especies de células T.

En una realización adicional, las células CD8^{+} pueden aislarse combinando tanto procedimientos de selección negativos como positivos. (Véase, por ejemplo, Cai y Sprent, J. Exp. Med. 179: 2005-2015 (1994)).

Preferiblemente, los PBL se purifican después. Por ejemplo pueden utilizarse gradientes de Ficoll™ con este fin. Los PBL purificados se mezclarían después con células de Drosophila singénicas preincubadas con los péptidos antigénicos apropiados.

7. Activación in vitro de células CD8^{+}

Para optimizar las condiciones in vitro para la generación de células T citotóxicas específicas, el cultivo de células presentadoras de antígeno se mantiene en un medio apropiado. En la realización preferida, las células presentadoras de antígeno son células de Drosophila, que se mantienen preferiblemente en medio exento de suero (por ejemplo Excell 400).

Antes de la incubación de las células presentadoras de antígeno con las células a activar, por ejemplo células CD8^{+} precursoras, se añade una cantidad de péptido antigénico al cultivo de células que presentan antígeno en suficiente cantidad para cargarse en las moléculas de clase I humana a expresar en la superficie de las células presentadoras de antígeno. Según la presente invención, una cantidad suficiente de péptido es una cantidad que permitirá que aproximadamente 200 a aproximadamente 500.000 y preferiblemente aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 o más moléculas de CMH de clase I humano cargadas con péptido se expresen en la superficie de cada célula que presenta antígeno. Preferiblemente, las células presentadoras de antígeno se incuban con > 20 \mug/ml de péptido.

Las células CD8^{+} en reposo o precursoras se incuban después en cultivo con las células presentadoras de antígeno apropiadas durante un periodo de tiempo suficiente para activar y enriquecer adicionalmente una población de células CD8^{+}. Preferiblemente, las células CD8^{+} se activarán por tanto de manera específica de antígeno. La relación de células CD8^{+} en reposo o precursoras (efectoras) a células presentadoras de antígeno puede variar de individuo a individuo, y puede depender adicionalmente de variables tales como la sensibilidad de los linfocitos de un individuo a las condiciones de cultivo y la naturaleza y la gravedad del estado patológico u otro para el que se utiliza la modalidad de tratamiento descrita. Preferiblemente, sin embargo, la relación linfocito:célula presentadora de antígeno (por ejemplo célula de Drosophila) está preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 30:1 a 300:1. Por ejemplo, en una realización, se mezclaron 3 x 10^{7} PBL humanos y 1 x 10^{6} células de Drosophila vivas y se mantuvieron en 20 ml de medio de cultivo RPMI 1640.

El cultivo efector/presentador de antígeno puede mantenerse durante el tiempo necesario para activar y enriquecer una población de un número de células CD8^{+} terapéuticamente utilizable o eficaz. En términos generales, el tiempo óptimo es entre aproximadamente uno y cinco días, con una "meseta", concretamente un nivel de activación específico de CD8^{+} "máximo", observado generalmente después de cinco días de cultivo. En una realización de la presente invención, la activación in vitro de células CD8^{+} se detecta en un breve periodo de tiempo después de la transfección de una línea celular. En una realización, la expresión transitoria en una línea celular transfectada capaz de activar células CD8^{+} es detectable a las 48 horas de la transfección. Esto indica claramente que tanto cultivos estables como transitorios de células transformadas que expresan moléculas de CMH de clase I humano son eficaces para activar células CD8^{+}.

Preferiblemente, el enriquecimiento y la consiguiente activación de células CD8^{+} es óptimo a una semana de exposición a células presentadoras de antígenos. Después de ello, en una realización preferida, las células CD8^{+} enriquecidas y activadas se purifican adicionalmente mediante procedimientos de aislamiento incluyendo restricción de sitio, formación de rosetas con preparaciones de anticuerpos-glóbulos rojos, cromatografía en columna y similares. Después de la purificación, la preparación de células CD8^{+} resultante se extiende adicionalmente mediante el mantenimiento en cultivo durante un periodo de tiempo para obtener una población de 10^{9} células CD8^{+} activadas. Este periodo puede variar dependiendo del tiempo de replicación de las células, pero puede ser generalmente de 14 días. La activación y expansión de células CD8^{+} se ha descrito en Riddel et al., Curr. Opin. Immunol. 5: 484-491 (1993).

8. Separación de células CD8^{+} de células de Drosophila

Las células CD8^{+} activadas pueden separarse eficazmente de las células estimuladoras (por ejemplo, Drosophila) utilizando uno de una serie de procedimientos conocidos. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales específicos de las células estimuladoras, de los péptidos cargados en las células estimuladoras o de las células CD8^{+} (o un segmento de las mismas) para unir su ligando complementario apropiado. Las células marcadas con anticuerpo pueden extraerse después de la mezcla de células estimuladoras- efectoras mediante medios apropiados, por ejemplo mediante procedimientos de inmunoprecipitación o inmunoensayo bien conocidos.

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9. Administración de células CD8^{+} activadas

Las cantidades citotóxicas eficaces de células CD8^{+} activadas pueden variar entre los usos in vitro e in vivo, así como con la cantidad y el tipo de células que son la diana última de estas células asesinas. La cantidad variará también dependiendo del estado del paciente y debe determinarse mediante la consideración de todos los factores apropiados por el médico. Preferiblemente, sin embargo, se utilizan aproximadamente 1 x 10^{6} a aproximadamente 1 x 10^{12}, más preferiblemente aproximadamente 1 x 10^{8} a aproximadamente 1 x 10^{11} y, aún más preferiblemente, aproximadamente 1 x 10^{9} a aproximadamente 1 x 10^{10} células CD8^{+} activadas para adultos humanos, en comparación con las 5 x 10^{4} a 5 x 10^{7} células utilizadas en ratones.

Preferiblemente, como se discute anteriormente, las células CD8^{+} activadas se recogen del cultivo de células de Drosophila antes de la administración de las células CD8^{+} al individuo que se esté tratando. Resulta importante observar, sin embargo, que al contrario de otras modalidades de tratamiento presentes y propuestas, la presente invención utiliza un sistema de cultivo celular (concretamente de células de Drosophila) que no es tumorigénico. Por lo tanto, si no se consigue la separación completa de células de Drosophila y células CD8^{+} activadas, no existe un peligro inherente conocido que esté asociado a la administración de un pequeño número de células de Drosophila, mientras que la administración de células promotoras de tumores en mamíferos puede ser extremadamente peligrosa.

Los procedimientos de reintroducción de componentes celulares son conocidos en la técnica e incluyen procedimientos tales como los ilustrados en la patente de EE.UU. nº 4.844.893 de Honsik et al., y la patente de EE.UU. nº 4.690.915 de Rosenberg. Por ejemplo, la administración de células CD8^{+} activadas mediante infusión intravenosa es apropiada.

10. Tipificación de HLA

Como se observó anteriormente, los haplotipos/alotipos de HLA varían de individuo en individuo y, aunque no es esencial para la práctica de la presente invención, a menudo es de ayuda determinar el tipo individual de HLA. El tipo de HLA puede determinarse mediante procedimientos de tipificación estándar y los PBL purificarse mediante gradientes de Ficoll™. Los PBL purificados se mezclarían después con células de Drosophila singénicas preincubadas con los péptidos antigénicos apropiados, por ejemplo en aplicaciones terapéuticas relacionadas con infecciones virales, cánceres o malignidades, péptidos derivados de proteínas específicas virales o cancerosas.

Continuando con el uso de estados patológicos virales o malignos como ejemplo, en aquellos casos en que se han caracterizado péptidos específicos de un antígeno específico viral o canceroso particular, se utilizarán preferiblemente los péptidos sintetizados que codifican estos epítopos. En casos en que no se han determinado precisamente los péptidos antigénicos preferidos, pueden utilizarse digestiones de proteínas específicas virales o cancerosas. Como fuente de dicho antígeno, se clona ADNc que codifica proteínas específicas virales o cancerosas en un plásmido de expresión bacteriana y se utiliza para transformar bacterias, por ejemplo mediante los procedimientos descritos en la presente memoria.

Después de la tipificación de HLA, si no están disponibles células de Drosophila que expresen el HLA preferido, pueden clonarse ADNc que codifiquen en HLA preferido mediante el uso de la reacción en cadena con polimerasa. Los cebadores descritos en la sección B.1 anterior (SEC Nº ID 1 a SEC Nº ID 12) pueden utilizarse para amplificar los ADNc de HLA-A, -B, -C, -E, -F o -G apropiados en reacciones separadas, que pueden clonarse después y secuenciarse como se describe en los procedimientos descritos para HLA A2.1 a continuación. Las líneas celulares estables que expresan el HLA clonado pueden establecerse después en células de Drosophila. Como alternativa, puede utilizarse una población de células de insecto que expresan transitoriamente una población bruta de moléculas recombinantes clonadas a partir de la reacción PCR para la activación in vitro de CD8^{+}.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se pretende que ilustren, pero no que limiten, la presente invención.

Ejemplo 1 Expresión de moléculas de CMH de clase I humano A. Preparación del vector de expresión pRmHa-3

El vector de expresión pRmHa-3 para uso en la expresión de proteínas de CMH en células Schneider 2 (S2) de Drosophila como se describe en esta invención se construyó ligando un vector de expresión de ADN pRmHa-1 linealizado con Sph I con un fragmento de ADN resultante de una digestión de restricción con Sph I de un vector de expresión pRmHa-2 como se describe a continuación. El ligamiento de pRmHa-1 con el fragmento de pRmHa-2 de esta manera se realizó para eliminar uno de los dos sitios de clonación de endonucleasa de restricción Eco RI presentes en pRmHa-1. Por tanto, el vector de expresión pRmHa-3 resultante contenía sólo un sitio de restricción Eco RI en el sitio de clonación múltiple (poliengarce) en el que se insertaron varios fragmentos de ADN que codificaban CMH como se describe en los ejemplos.

1. Preparación del vector de expresión pRmHa-1

El vector de expresión pRmHa-1, que contiene un promotor de metalotioneína, secuencias de consenso de respuesta a metal (designadas como MT) y un gen de alcohol deshidrogenasa (ADH) que contiene una señal de poliadenilación aislada de Drosophila melanogaster, se construyó como se describe en Bunch et al., Nucl. Acids Res. 16: 1043-1061 (1988). Se muestra un esquema del constructo pRmHa-1 final en la Figura 2. El plásmido vector de expresión, pUC18, que tiene el número de acceso ATCC 37253, se utilizó como vector fuente del que se derivaron los subsiguientes vectores descritos en la presente memoria. El plásmido pUC18 contiene los siguientes sitios de restricción de 5' a 3' en el sitio de clonación múltiple, no todos los cuales están ilustrados en las representaciones esquemáticas de vectores derivados de pUC18 en la Figura 1: Eco RI, Sac I, Kpn I, Sma I y Sma I localizados en la misma posición, Bam HI, Xba I, Sal I, Acc I y Hinc II localizados en la misma posición, Pst I, Sph I y Hind III. El vector pUC18 se digirió primero con Hind III para formar un pUC18 linealizado. Se crearon después extremos romos mediante relleno de los extremos Hind III con el fragmento grande de ADN polimerasa I como se describe en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1982).

El vector resultante pUC18 de extremos romos linealizado se ligó con un fragmento Hinf I de 740 pares de bases (pb) del gen ADH de Drosophila melanogaster que contenía una señal de poliadenilación. El alelo de ADH ligado se aisló en primer lugar del plásmido pSACI, descrito por Goldberg et al., PNAS USA 77: 5794-5798 (1980) mediante digestión con Hinf I seguida de formación de extremos romos con Klenow, dando como resultado la secuencia nucleotídica enumerada en la SEC Nº ID 14. El vector pSACI que contenía el alelo de ADH se construyó subclonando en pBR322 (número de acceso ATCC 31344) un fragmento Eco RI de 4,7 kilobases (kb) de ADN de Drosophila seleccionado de una biblioteca de bacteriófago lambda que contenía fragmentos aleatorios de alto peso molecular (mayor de 15 kb). El sitio de restricción Hinf I 5' aparecía naturalmente en el gen ADH en la posición 1770 como describe Kreitman, Nature 304: 412-417 (1983). El sitio Hinf I 3' derivaba del vector pUC18 en el que se había clonado el gen ADH. Esta posición estaba 4 pares de bases 3' del sitio Xba I en la posición 2500 del gen ADH. El segmento de ADH se extendía desde las 35 pb cadena arriba de la secuencia de poliadenilación/escisión en la porción no traducida 3' del ARNm de ADH hasta 700 pb cadena abajo de la señal de poliadenilación. El vector derivado de pUC18 resultante que contenía el fragmento de gen ADH se designó pHA-1 como se muestra en la Figura 1.

El fragmento génico MT Eco RI/Stu I de 421 pb se obtuvo a partir de un clon que contenía ADN de aproximadamente 15,3 kb en una biblioteca de ADN genómico de Drosophila melanogaster. La biblioteca, preparada con una digestión parcial con Mbo I de ADN imagen, se clonó en el derivado lambda EMBL4. El fragmento contenía el promotor MT y los elementos de consenso de respuesta a metal del gen MT de Drosophila (Maroni et al., Genetics 112: 493-504 (1986)). Esta región, que contenía el promotor y el sitio de inicio de la transcripción en el nucleótido 1+, correspondía a la posición -370 a la posición de nucleótido +54 del gen MT (SEC Nº ID 13). El fragmento resultante se ligó después en el vector de expresión pHA-1 preparado anteriormente que se había linealizado previamente con Eco RI y Sma I. El extremo romo 3' de MT creado por la digestión con Stu I era compatible con el extremo romo en pHA-1 creado por la digestión con Sma I. El vector derivado de pUC18 resultante que contenía un fragmento génico MT de Drosophila 5' y un fragmento génico de ADH 3' se designó pRmHa-1. El vector de expresión pRmHa-1, mostrado en la Figura 2, contenía el origen de replicación (ori) y el gen beta lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina (Amp') de pUC18 como se muestra en la Figura 1 en el vector pHa-1. El diagrama de pRmHa-1 muestra también las posiciones 5' a 3' contiguas del fragmento génico de MT, el sitio de clonación múltiple y el fragmento del gen ADH. El vector pRmHa-1 se utilizó como se describe en c a continuación en la construcción del vector de expresión pRmHa-3.

2. Preparación del vector de expresión pRmHa-2

La construcción de pRmHa-2 se muestra en la Figura 1. Para la construcción del vector de expresión pRmHa-2, el fragmento de MT preparado anteriormente se insertó en el vector pHA-1 derivado de pUC18 como se describe para la construcción de pRmHa-1 anteriormente con unas pocas modificaciones. Se añadió un engarce Eco RI al sitio Stu I del fragmento Eco RI/Stu I aislado del gen MT preparado anteriormente para formar un fragmento de metalotioneína que tiene sitios de restricción Eco RI en ambos extremos. El fragmento resultante se ligó después al vector de expresión pUC18 que contiene el fragmento de ADH que se había linealizado previamente con Eco RI. El vector derivado de pUC18 resultante que contenía un fragmento del gen MT de Drosophila 5' y un fragmento del gen ADH 3' que tenía dos sitios de restricción Eco RI 5' al sitio de clonación múltiple, se designó pRmHa-2. El vector de expresión pRmHa-2, mostrado en la Figura 1, contenía el origen de replicación (ori) y el gen beta-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina (Amp') de pUC18. El diagrama de pRmHa-2 muestra también las posiciones 5' a 3' contiguas del fragmento del gen MT, el sitio de clonación múltiple y el fragmento del gen ADH. El vector pRmHa-2 se utilizó junto con pRmHa-1 como se describe en c a continuación en la construcción del vector de expresión pRmHa-3.

3. Preparación del vector de expresión pRmHa-3

Para preparar el vector de expresión pRmHa-3 que tenía sólo un sitio de restricción Eco RI, se ligó un fragmento de pRmHa-2 a pRmHa-1. Para esta construcción, se digirió primero pRmHa-2, preparado en b anteriormente, con Sph I. El fragmento Sph I resultante que empieza a mitad del gen MT y se extiende hasta el sitio Sph I en el sitio de clonación múltiple, se aisló en primer lugar del vector pRmHa-2 y después se ligó en pRmHa-1 preparado en A.1 anteriormente. El vector pRmHa-1 se modificó previamente para eliminar el sitio de restricción Eco RI 5' del fragmento del gen MT y después se linealizó con Sph I. Este proceso se ilustra esquemáticamente en la Figura 2. Para eliminar el sitio Eco RI en pRmHa-1, el vector se digirió primero con Eco RI para formar un vector linealizado, después se formaron extremos romos con nucleasa de judía Mung y se religó.

El vector pRmHa-1 que carece de un sitio Eco RI se digirió después con Sph I para eliminar la región correspondiente al inserto del fragmento Sph I de pRmHa-2 y formar un vector pRmHa-1 linealizado. El fragmento Sph I de pRmHa-2 se ligó después en el pRmHa-1 linealizado con Sph I para formar el vector de expresión pRmHa-3. Se muestra un esquema del vector pRmHa-3 en la Figura 3. Las posiciones relativas de los diversos sitios de restricción del vector pUC18 del que deriva pRmHa-3 se indican en la figura. Además, se indican en la figura las posiciones y longitudes relativas de los fragmentos de los genes MT y ADH separados por el sitio de clonación múltiple (poliengarce) en el que se clona el gen CMH de interés. El vector pRmHa-3, al ser derivado de pUC18, contiene el origen de replicación de pUC18 y el gen beta lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina. Por tanto, los fragmentos de ADN que codifican MHA como se preparan en esta invención y se clonan en el sitio múltiple de clonación de pRmHa-3 se regularon transcripcionalmente mediante el promotor MT y se poliadenilaron mediante el gen ADH.

B. Síntesis de ADNc

Pueden encontrarse descripciones detalladas del ADNc de moléculas de CMH de clase I de diversos grupos HLA en la patente de EE.UU. nº 5.314.813 de Peterson et al., que se ha incorporado como referencia.

Los ADNc que codifican cualquier HLA preferido pueden clonarse mediante el uso de reacción en cadena con polimerasa. Los cebadores descritos en la sección B.1 anterior (SEC Nº ID 1 a SEC Nº ID 12) pueden utilizarse para amplificar los ADNc de HLA-A, -B, -C, -E, -F o -G apropiados en reacciones separadas que pueden clonarse después y secuenciarse como se describe en los procedimientos descritos para HLA A2.1 anteriormente. La preparación de ADNc a partir de células humanas se lleva a cabo como se describe en Ennis et al., PNAS USA 87: 2833-2837 (1990). Brevemente, se obtiene una muestra de sangre del individuo y se recogen células después de centrifugación y se utilizan para preparar ARN total. La primera cadena de ADNc se sintetiza utilizando oligo(dT) y transcriptasa inversa de virus de mieloblastosis aviar. El ADNc resultante se utiliza en una reacción de amplificación con PCR utilizando el cebador o cebadores adecuados como se observa en la sección B.1 anterior, y un kit GeneAmp™ y un ciclador térmico (Perkin-Elmer/Cetus). Las condiciones de reacción son preferiblemente las siguientes: se utilizan 100 ng de ADNc molde y 50 picomoles de cada cebador oligonucleótido. Se realizan treinta ciclos de la manera siguiente: (a) un minuto a 94ºC, (b) un minuto a 60ºC; y (c) un minuto 30 segundos a 72ºC. La reacción PCR se calienta después a 100ºC durante 10 minutos para inactivar la polimerasa Taq y los extremos del ADN se hacen romos mediante T4 polimerasa (Stratagene, San Diego, CA).

Para sintetizar HLA A2.2, se clona ADNc que codifica A2.2 completo (véase Holmes et al., J. Immunol. 139: 936-941 (1987), para la secuencia publicada) en un plásmido M13mp19, un vector bacteriófago comercialmente disponible (Stratagene, La Jolla, CA). El ADNc se sintetiza mediante PCR utilizando cebadores derivados de la secuencia publicada de A2. El ADNc se libera de un clon M13mp19 en forma de un fragmento Not I (saliente rellenado con Klenow)/Eco RI. (Los fragmentos Klenow son parte de la molécula ADN polimerasa I de E. coli, producidos mediante el tratamiento de ADN pol I de E. coli con subtilisina. Se utilizan para "rellenar" salientes 5' ó 3' en los extremos de moléculas de ADN producidos por nucleasas de restricción). El fragmento Not I/Eco RI se inserta en pSP64T digerido con Bg III (extremos rellenados con Klenow) y Eco RI. El pSP64T es un vector de clonación SP6 diseñado para proporcionar regiones flanqueantes 5' y 3' de un ARNm que se traduce eficazmente (\beta-globina) a cualquier ADNc que contenga su propio codón de iniciación. Este vector de traducción SP6 se construyó digiriendo pSP64-X\betam con Bal I y Bst EII, rellenando los extremos escalonados con ADN polimerasa T4 y añadiendo un engarce Bgl II por ligamiento. Bal I corta el ADNc de \beta-globina dos bases cadena arriba del ATG (codón de inicio) y Bst EII corta ocho bases cadena arriba del TAA (codón de paro). Existe sólo un sitio Bgl I en pSP64T, de modo que las enzimas de restricción que cortan en el fragmento de poliengarce, de Pst I a Eco RI, pueden seguir utilizándose para linealizar el plásmido para transcripción. (Véase Kreig y Melton, Nucleic Acid Res. 12: 7057-7070 (1984), que describe también la construcción del plásmido pSP64-X\betam). El plásmido resultante se escinde con Eco RI (extremo rellenado con Klenow) e Hind III, que se clona en el poliengarce pCMUII entre Hind III (5') y Stu I (3'). (Véase Paabo et al., EMBO J. 5: 1921-1927 (1986)). El ADNc entero se elimina en forma de un fragmento Hind III (extremo rellenado con Klenow)-Bam HI, que se clona en pRmHa-3 escindido con Sma I y Bam HI.

Se preparó la forma soluble de HLA A2.2 introduciendo por ingeniería genética un codón de paro en el ADNc de A2.2 anteriormente descrito inmediatamente antes del dominio transmembana. La modificación se consigue escindiendo el ADNc de A2.2 clonado en el vector de expresión eucariótico pCMUII entre Hind III 5' y Stu I 3' (véase anteriormente) con Mbo II y Bam HI insertando los siguientes oligonucleótidos:

Cebador 5': 5' GGAGCCGTACTGACTGAG 3' (SEC Nº ID 17)

Cebador 3': 5' CCCTCGGCACTGACTGACTCCTAG 3' (SEC Nº ID 18)

El plásmido recombinante resultante se escinde con Hind III, se rellena el extremo saliente con Klenow, después se corta con Bam HI liberando un fragmento de restricción que se clona en pRmHa-3 del mismo modo que A2.2 completo.

1. Construcción del vector de expresión ICAM-1 murino

Se aislaron células de bel azo de ratones Balb/C. Las células de bazo se estimularon con conA; se aisló ARNm utilizando el kit FastTrack™ (Invitrogen, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADNc a partir del ARNm utilizando el kit de transcriptasa inversa AMV (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. Basándose en la secuencia nucleotídica de ADNc publicada (Siu, G. et al., J. Immunol. 143, 3813-3820 (1989), se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos como cebadores de PCR:

5': TTTAGAATTCAC CATGGCTTCA ACCCGTGCCA AG

3': TTTAGTCGACTC AGGGAGGTGG GGCTTGTCC

El ADNc sintetizado se sometió a PCR utilizando estos cebadores. El producto se escindió con las enzimas de restricción Eco RI y Sal I y se ligó a pRmHa-3, que se había digerido con las enzimas de restricción Eco RI y Sal I.

2. Construcción del vector de expresión B7.1 murino

Se aislaron células de bazo de ratones Balb/C y se estimularon con conA. Se aisló el ARN mensajero utilizando el kit FastTrack™ (Invitrogen, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADNc a partir del ARNm utilizando el kit de transcriptasa inversa AMV (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante.

Basándose en la secuencia nucleotídica de ADNc publicada (Freeman, et al., J. Exp. Med. 174: 625-631 (1991)), se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos como cebadores de PCR:

5': TTTAGAATTCAC CATGGCTTGC AATTGTCAGT TG

3': TTTAGTCGACCT AAAGGAAGAC GGTCTGTTC

3. Construcción del vector de expresión B7.2 murino

Se propagaron células IC-21 (obtenidas de la ATCC) en medio RPMI 1640 que contenía suero fetal bovino al 10%. Se aisló el ARNm a partir estas células utilizando el kit FastTrack™ (Invitrogen, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizó a partir del ARNm utilizando el kit de transcriptasa inversa de AMV™ (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. Basándose en la secuencia nucleotídica de ADNc publicada (Freeman et al., J. Exp. Med. 178: 2185-2192 (1993)), se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos como cebadores de PCR:

5': TTTAGAATTCAC CATGGACCCC AGATGCACCA TGGG

3': TTTAGTCGACTC ACTCTGCATT TGGTTTTGCT GA

Los constructos de expresión anteriores se transfectaron en células S2 de Drosophila utilizando el procedimiento de fosfato de calcio como se enumera en la Tabla 1. Las líneas celulares estables se seleccionaron incluyendo Geneticin™ 500 \mug/ml en el medio de cultivo celular.

TABLA 1

Células		CMH I	\beta2 \mug	B7.1 (CD	B7.2 \mug	ICAM-1	phsneo \mug
transfectadas		(L^{d}) \mug		80) \mug		(CD 54) \mug
1	A	12	12				1
2	B	8	8	8			1
3	C	8	8		8		1
4	C	8	8			8	1
5	D	6	6	6		6	1
6	E	6	6		6	6	1
7	F	6	6	6	6		1
8	G	4,8	4,8	4,8	4,8	4,8	1

Se clonaron moléculas auxiliares y coestimulatorias humanas a partir de líneas celulares humanas que se demostró que expresaban estas proteínas por análisis FACS con anticuerpos monoclonales específicos de las proteínas particulares. Las moléculas de adhesión que pertenecen a la familia de la integrina ICAM-1 (CD54) y LFA-3 (CD58) se clonaron a partir de las líneas celulares K562 y HL60, respectivamente. Las células K562, originadas a partir de leucemia mielógena crónica humana, se obtuvieron de la ATCC (CCL-243) y se cultivaron en las condiciones recomendadas (concretamente RPMI con 10% de suero fetal bovino a 37ºC con 5% de CO_{2}). Las células HL60, originadas a partir de leucemia promielocítica humana y obtenidas de la ATCC (CCL-240), se cultivaron según las recomendaciones de la ATCC. Las moléculas coestimulatorias B7.1 y B7.2 se clonaron también a partir de células K562 y HL60, respectivamente.

4. ADNc

Se prepararon muestras de ARN mensajero a partir de cada línea celular de ARN aislado mediante el procedimiento de tiocianato de guanidinio modificado (Chromczynski et al., Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987) seguido por selección de ARN poli A^{+} en columnas de oligo(dt) celulosa (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Segunda edición 6.22-6.34, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, NY). La inducción de células HL60 con vitamina D3 (habitualmente necesaria para expresar algunas moléculas de superficie celular) no se requirió para obtener las moléculas B7.2 y LFA-3, las proteínas se expresaron en ausencia de inducción. Se preparó ADNc utilizando el kit de transcriptasa inversa AMV según las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI).

5. Cebadores de PCR

Los cebadores de PCR se diseñaron y sintetizaron después de obtener copias de las secuencias conocidas a partir de la base de datos GENEWORKS™ (Intelligenetics) y considerando los extremos necesarios para clonar en los vectores apropiados. Son los siguientes, siendo la secuencia superior de cada proteína el cebador 5' y la inferior el cebador 3':

B7.1	5'-ACCCTTGAAT CCATGGGCCA CACACGGAGG CAG 3'
	5'-ATTACCGGAT CCTTATACAG GGCGTACACT TTCCCTTCT-3'
B7.2	5'-ACCCTTGAGC TCATGGATCC CCAGTGCACT ATG-3'
	5'-ATTACCCCCG GGTTAAAAAC ATGTATCACT TTTGTCGCAT GA-3'
LFA-3	5'-ACCCTTGAGC TCATGGTTGC TGGGAGCGAC GCGGGG-3'
	5'-ATTACCGGAT CCTTAAAGAA CATTCATATA CAGCACAATA CA-3'
ICAM-1	5'- ACCCTTGAAT TCATGGCTCC CAGCAGCCC CGGCCC-3'
	3'-ATTACCGGAT CCTCAGGGAG GCGTGGCTTG TGTGTTCGG-3'

6. Expresión del fragmento de ADN

Se utilizaron las preparaciones de ADNc de cada una de las líneas celulares para clonar las proteínas deseadas. La reacción en cadena con polimerasa se utilizó para generar fragmentos de ADNc que utilizan el cebador de PCR apropiado (véase anteriormente). Se clonaron los fragmentos apropiados de ADN en el vector pRMHA-3 de la mosca Drosophila. Las preparaciones de plásmido se han preparado a partir de todas las preparaciones y están ahora preparadas para transfección en las células de mosca.

Se prepara ADNc de \beta-2 microglobulina humana utilizando una secuencia de ADNc parcial publicada (véase Suggs et al., PNAS 78: 6613-6617, 1981) como molde para una reacción en cadena con polimerasa (PCR) con los siguientes cebadores:

Cebador 5' 5' GCTTGGATCCAGATCTACCATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTC GCGCTACTCTC 3' (SEC Nº ID 15)

Cebador 3' 5' GGATCCGGATGGTTACATGTCGCGATCCCACTTAAC 3' (SEC Nº ID 16)

Los cebadores se utilizan en una reacción PCR estándar (véase Nilsson et al., Cell 58: 707 (1989)). Los productos de reacción se extraen con fenol, se purifican utilizando un kit Geneclean™ (Bio 101, San Diego, CA), se digieren con Bam HI y se clonan en el sitio Bam HI de pBS (Stratagene, La Jolla, CA). Después de la verificación de la secuencia, se clona este fragmento Bam HI en el sitio Bam HI de pRmHa-3.

Como se observa en los ejemplos, se utilizó ADNc de clase I murino en diversos casos. El ADNc de clase I murino se preparó de la siguiente manera.

H-2K^{b}: se obtiene ADNc que codifica una molécula de K^{b} completa a partir de un plásmido de expresión pCMU/K^{b} construido de la siguiente manera. Se prepara un ADNc de H-2K^{b} parcial que carece de la secuencia líder y de la mayoría del dominio alfa I según el procedimiento de Reyes et al., PNAS 79: 3270-3274 (1982), produciendo pH202. Este ADNc se utiliza para generar una molécula completa. La secuencia faltante se proporciona utilizando un clon genómico que codifica H-2K^{b} (Caligan et al., Nature 291: 35-39, 1981) como molde en una reacción PCR, utilizando un cebador 5' flanqueado por un sitio Not I, seguido de 21 nucleótidos que codifican los últimos siete aminoácidos de la secuencia líder y 18 nucleótidos complementarios del inicio del dominio alfa I y un cebador 3' complementario con la región que comprende el sitio Sty I. El fragmento resultante se liga con pH202 en el sitio Sty I. La secuencia 5' que codifica el resto de la secuencia señal se obtiene a partir del ADN de D^{b} (véase a continuación) en forma de un fragmento Bam HI/Not I. La secuencia de codificación completa se escinde del plásmido de expresión en forma de un fragmento Bam HI y se clona en pRmHa-3 escindido con Bam HI.

H-2L^{d}: Se obtiene el ADNc que codifica una molécula L^{d} completa a partir de un plásmido de expresión pCMUIV/
L^{d} (véase Joly y Oldstone, Gene 97: 213, 1991). El ADNc completo se escinde a partir de un vector de expresión eucariótico pCMU IV/L^{d} en forma de un fragmento Bam HI y se clona en pRmHa-3 en forma de K^{h}.

Como se observa anteriormente, el vector pCMU (pCMUIV) deriva del vector de expresión eucariótico pC81G como se describe en Nilsson et al., supra. El vector pC81G, a su vez, deriva de pA81G (Paabo et al., Cell 33: 445-453 (1983)) según el procedimiento descrito en Paabo et al., EMBO J. 5: 1921-1927 (1986).

H-2D^{b}: Se obtiene el ADNc que codifica una molécula de D^{b} completa a partir del plásmido de expresión pCMUIV/
D^{b} (véase Joly y Oldstone, Science 253: 1283-1285, 1991). El ADNc completo se escinde a partir de un vector de expresión eucariótico pCMUIV/D^{b} en forma de un fragmento Bam HI y se clona en pRmHa-3 en forma de K^{b}.

\beta-2 microglobulina murina: El ADNc de \beta-2 microglobulina murino completo se obtiene en forma de un fragmento Hind III (5') (rellenado con Klenow)/Bgl II (3') a partir de ADNc de \beta-2 microglobulina de ratón de pSV2neo (nº ATCC 37149) y se clona en pRmHa-3 escindido con Sma I y Bam HI.

El vector phshsneo confiere resistencia a la neomicina (G418) y es un derivado de phsneo (pUChsneo) con una secuencia promotora de shock térmico adicional (hs), que puede sintetizarse a partir de pUC8 comercialmente disponible como se describe en Steller et al., EMBO J. 4: 167 (1985). El promotor de shock térmico contenido en estos vectores es el promotor hsp70, Otros vectores útiles que confieren resistencia a la neomicina (resistencia a G418) incluyen el vector cósmido smart2 (ATCC 37588), que se expresa bajo el control del promotor hsp70 de Drosophila, y el vector plásmido pcopneo (ATCC 37409).

C. Inserción de genes en vectores de expresión

Los productos de restricción se someten a electroforesis en un gel de agarosa al 1% (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Los fragmentos de restricción que codifican los ADNc se escinden del gel y se purifican de la agarosa utilizando "Geneclean™" según las instrucciones del fabricante (Bio 101, San Diego, CA). El plásmido de expresión pRmHa-3 (figura 3) se escinde con las enzimas de restricción apropiadas en un tampón One Phor All™ según las instrucciones del fabricante (Pharmacia, Piscataway, NJ) y se trata con fosfatasa alcalina como se describe en la bibliografía del fabricante (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). Se mezclan 100 ng de vector pRmHa-3 escindido y sometido a fosfatasa con 300 ng de ADNc de cadena pesada de CMH de clase I purificado en gel de agarosa o ADNc de \beta-2 microglobulina y se liga utilizando ADN ligasa T4 y tampón One Phor All™ como se describe en la bibliografía de los fabricantes. Después de incubación a 16ºC durante cinco horas, la mezcla de ligamiento se utiliza para transformar JM83 de E. coli competentes (Maniatis et al., supra (1982)).

Los procedimientos descritos en Maniatis et al., supra, se utilizan para preparar el ADNc necesario. La presencia de ADNc de cadena pesada de CMH y su orientación en el vector se determinan mediante cartografía de restricción. Las bacterias que contienen el vector con el ADNc en la orientación correcta respecto al promotor de metalotioneína se utilizan para la preparación a gran escala de ADN utilizando el procedimiento de lisis alcalina y purificación en gradiente de cloruro de cesio. La cantidad de ADN obtenida se determina espectrofotométricamente.

D. Transfección y marcaje de células S2

Se hacen crecer células S2 en medio Schneider™ (Gibco/BRL, Grand Island, NY) suplementado con suero fetal bovino al 10% (tratado térmicamente durante 1 hora a 55ºC), 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina y glutamina 1 mM. (Por conveniencia, este medio suplementado se designa en adelante en la presente memoria como medio Schneider™). Las células se hacen crecer a 27ºC y se hacen pasadas típicamente cada siete días mediante dilución 1:17 en medio fresco. Las células se hacen crecer en medio exento de suero (Excell™ 400 ó 401 suplementado con 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, glutamina 1 mM y G418 500 \mug/ml (JRH Biosciences, Lenexa, KS) mediante dilución inicial con 50% de Schneider™/50% de Excell™ 401. Una semana después, pueden hacerse pasadas con las células en 10% de medio Schneider™/90% de Excell™ 401 y una semana después en 100% de Excell™ 401. Las células se mantienen en este medio y se hacen pasadas cada siete días mediante dilución 2:17 en medio fresco.

Se siembran 15 x 10^{4} células S2 a una concentración de 10^{6} células por ml en placas Petri de 85 mm. Doce horas después, se añade gota a gota a las células precipitado de fosfato de calcio/ADN, preparado como se describe anteriormente (1 ml). Después de 48 horas, el sobrenadante se retira cuidadosamente y las células se transfieren a un matraz de 175 cm^{2} en un volumen total de 50 ml en medio Schneider™ que contiene Geneticin 500 \mug/ml (G418) (Gibco/BRL, Grand Island, NY). Después de 21 días, se retiran 20 ml del cultivo a un matraz nuevo que contiene 30 ml de medio Schneider™ que contiene G418 500 \mug/ml. Diez días después, se obtiene una población estable de células se adherían débilmente al matraz y crecían con un tiempo de duplicación de aproximadamente 24 horas, y estas células se cultivan subsiguientemente y se someten a pasadas en medio de selección como se describe anteriormente. Se preparan alícuotas congeladas de estas células recogiendo 5-20 x 10^{6} células mediante centrifugación y resuspendiéndolas en 1 ml de medio de congelación celular (93% de suero fetal bovino/7% de dimetilsulfóxido). Se disponen después las alícuotas a -70ºC durante 1 semana y subsiguientemente se transfieren a almacenamiento en nitrógeno líquido.

Los precipitados de fosfato de calcio se preparan como se describe por Paabo et al. (EMBO J. 5: 1921-1927 (1986)), excepto que se utilizan 25 \mug de ADN por transfección. Se utilizan las siguientes combinaciones de ADN para preparar el transfectante indicado:

(a) cadena pesada de CMH de clase I sola: 23 \mug de ADN de vector de expresión de cadena pesada + 2 \mug de ADN de phshsneo.

(b) cadena pesada de CMH de clase I + \beta-2 microglobulina: 11,5 \mug de ADN de vector de expresión de cadena pesada + 11,5 \mug de ADN de vector de expresión de \beta-2 microglobulina (humana o de ratón) + 2 \mug de ADN de phshsneo.

Se presentan otras combinaciones de genes de ratón en la Tabla 1.

Veinticuatro horas antes del marcaje metabólico, se siembran células a una densidad celular de 3-5 x 10^{6} células/ml (10 ml/placa Petri de 85 mm) en medio Schneider™ que contiene CuSO_{4} 1 mM. Treinta minutos antes del marcaje, el medio se aspira de las placas y las células se lavan con 2 x 10 ml de PBS y después se incuban en medio de insecto Graces™ menos metionina y cisteína (pedido especial a Gibco/BRL, Grand Island, NY) durante 20 minutos, y después en 1 ml de este medio que contiene 0,1 mCi de ^{35}S Trans label (New England Nuclear; duPont, Boston, MA). Después del periodo de marcaje, la solución de marcaje se aspira y las células se lisan inmediatamente en hielo, con PBS enfriado con hielo/1% de Triton™ X100 (1 ml) o después de un periodo de captura en presencia de medio Schneider™ que contiene metionina o Excell™ 400 (5 ml) (JRH Biosciences). El medio de captura se recoge si se están analizando moléculas de CMH de clase I solubles.

Todas las siguientes operaciones se llevan a cabo con los lisados mantenidos fríos (menos de 8ºC). Los lisados se recogieron en tubos Eppendorf, se centrifugaron en un tubo de microcentrífuga durante 15 minutos a 13.000 x g, se transfirieron a un tubo nuevo que contenía 100 \mul de una suspensión al 10% de sepharose con proteína A y se dispusieron en una mezcladora de tambor vertical durante dos horas. Después de una centrifugación adicional en la microcentrífuga durante 15 minutos, los lisados celulares están preparados para análisis.

En experimentos que utilizan CMH murino, se transfectaron células S2 con los recombinantes CMH murino descritos anteriormente utilizando el procedimiento de precipitación con CaPO_{4}; cada cadena pesada se transfecta sola o en forma de una mezcla 50:50 con el vector que codifica la \beta-2 microglobulina. Se incluye un plásmido que codifica la resistencia a la neomicina, ADN de phshsneo, en cada transfección de tal modo que podría obtenerse una población de células que expresara establemente la clase I de CMH haciendo crecer los transfectantes en medio de selección (Geneticin™ G418-sulfato, Gibco/BRL, Grand Island, NY).

E. Generación de péptidos

Pueden obtenerse péptidos antigénicos según la presente invención a partir de fuentes de origen natural o pueden sintetizarse utilizando procedimientos conocidos. En diversos ejemplos descritos en la presente memoria, los péptidos se sintetizan en un sintetizador de Applied Biosystems, ABI 431A (Foster City, CA) y subsiguientemente se purifican por HPLC.

El aislamiento o síntesis de péptidos "aleatorios" puede ser también apropiado, particularmente cuando se intenta determinar un epítopo particular para cargar una molécula de CMH vacía con el péptido más probable para estimular células CD8^{+} precursoras. Puede producirse una mezcla de péptidos "aleatorios" mediante el uso de proteosomas (véase por ejemplo el ejemplo 2.B.6) o sometiendo una proteína o un polipéptido a un proceso degradativo, por ejemplo digestión con quimotripsina, o pueden sintetizarse péptidos. Aunque los inventores han observado que las líneas celulares de la presente invención son capaces de degradar proteínas y polipéptidos a péptidos menores capaces de cargarse en moléculas de CMH de clase I humano, es preferible introducir péptidos menores, por ejemplo octámeros y nonámeros, directamente en el cultivo celular para facilitar una carga más rápida y el proceso de expresión.

Si se está sintetizando péptidos, por ejemplo péptidos aleatorios de 8, 9 y 18 aminoácidos, todas las variedades de aminoácidos se incorporan preferiblemente durante cada ciclo de la síntesis. Debe observarse, sin embargo, que diversos parámetros, por ejemplo incompatibilidad del disolvente con ciertos aminoácidos, pueden dar como resultado una mezcla que contiene péptidos que carecen de ciertos aminoácidos. El proceso debe ajustarse entonces según sea necesario, concretamente alterando los disolventes y las condiciones de reacción, para producir la mayor variedad de péptidos.

Como se observó anteriormente en la presente memoria, las cadenas pesadas murino complejadas con \beta-2 microglobulina humana eran estables a temperaturas aproximadamente 6-8 grados mayores que si se acomplejaban con \beta2 murina. Se observó también que las estabilidades conferidas por péptido y \beta-2 microglobulina xenogénica son aditivas. Aparece un gran aumento de la termoestabilidad de las moléculas de clase I si se utilizan octámeros-nonámeros, en comparación con 12-25-meros; es más, la diferencia entre la estabilización conferida por los octámeros-nonámeros en comparación con péptidos mayores podría ser incluso mayor de lo observado anteriormente, porque aunque los péptidos se han purificado por HPLC, es probable que exista cierta contaminación de los péptidos mayores con octámeros-nonámeros.

La termoestabilidad de una molécula de clase I depende aparentemente de: (1) el origen de la \beta-2 microglobulina; (2) la presencia de péptido; y (3) la longitud y secuencia de este péptido.

Un trabajo anterior (patente de EE.UU. nº 5.314.813 de Peterson et al.; Jackson et al., PNAS USA 89: 12117-12121 (1992)) ha mostrado que las cadenas pesadas de CMH de clase I pueden unirse a péptido solas o cuando están asociadas a \beta-2 microglobulina. La expresión en superficie de CMH de clase l humano cargado con péptido, sin embargo, parece facilitarse más por la carga de las moléculas con péptido después de haber complejado las cadenas pesadas con \beta-2 microglobulina.

1. Expresión de CMH humano

Una vez determinado que la termoestabilidad de una molécula de clase I depende del origen de la \beta-2 microglobulina, de la presencia de péptido y de la longitud y secuencia de este péptido, los inventores utilizaron esta información en la creación de líneas celulares capaces de activar específicamente células CD8^{+} mediante la expresión de moléculas de CMH de clase I cargadas con péptido.

La termolabilidad parece ser una propiedad inherente a las moléculas de clase I; ha evolucionado presuntamente para asegurar que las moléculas de clase I que no contienen péptido o un péptido con malas propiedades de unión (que confiere poca termoestabilidad) se autodestruyan. De este modo, la célula minimiza el número de moléculas de clase I vacías en su superficie, ya que dicha situación sería presumiblemente peligrosa porque péptidos derivados exógenamente podrían unirse y presentarse. Las moléculas de clase I humana expresadas en células de insecto con \beta2 humana no son estables ante incubación extendida a 37ºC; tampoco lo son moléculas de clase I humana expresadas en la línea celular T2, que se ha mostrado deficiente en la carga de péptidos en moléculas de clase I (Hosken y Bevan, Science 248: 367-370 (1990); Cerundolo et al., Nature 345: 449-452 (1990)). Por tanto, parece que la afinidad entre la cadena pesada y la \beta-2 microglobulina se ha conservado cuidadosamente a lo largo de la coevolución de las moléculas de tal modo que las moléculas de clase I vacías, o aquellas que llevan péptidos de baja unión, se autodestruyen a la temperatura corporal del organismo "hospedador".

Se expresaron moléculas de CMH de clase I humano en células S2. Las líneas celulares que coexpresan \beta-2 microglobulina humana y HLA A2.2Y, HLA A2.1, HLA B7 o HLA B27 se establecieron utilizando procedimientos descritos anteriormente. Brevemente, los ADNc que codifican las proteínas anteriores se clonaron en el vector de expresión pRmHa-3 de Drosophila y se cotransfectaron con un plásmido que contenía \beta-2 microglobulina y plásmido pshshneo en células S2 mediante procedimientos descritos en la presente memoria. Tres a cuatro semanas después, la población de células T resistentes a G418 se diluyó 1:5 con medio de selección fresco. Una vez se obtuvo una población de células de crecimiento sano, se añadió CuSO_{4} a una alícuota de células y, 24 horas después, se analizaron las células mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo monoclonal W6/32 (ATCC HB95, Bethesda, MD) que reconoce un determinante monomórfico de cadenas pesadas de clase I humana cuando están asociadas a \beta-2 microglobulina. (Véase Barnstable et al., Cell 14: 9 (1978)). Se indujeron altos niveles de expresión en superficie de cada una de las moléculas de clase I humana mediante la adición de CuSO^{4} (datos no mostrados). Estas poblaciones estables se clasificaron como células de alta expresión utilizando citofluorimetría como se describe a continuación. Son estas poblaciones clasificadas de células las que se utilizaron para todos los experimentos subsiguientes.

Veinticuatro horas antes del análisis FACS, se añade CuSO_{4} a las células S2 transfectadas establemente (3-4 x 10^{6} células/ml) a una concentración final de 1 mM, "activando" así la expresión de los genes transfectados. Las células se siembran en placas agrupadas de 24 pocillos (2 ml por pocillo). Ocho horas antes del análisis FACS, se reemplazó el medio CuSO_{4} por medio fresco (1 ml) con o sin péptido a una concentración de 50 \mug/ml. Se llevaron a cabo exposiciones a 37ºC de temperatura transfiriendo las placas a una superficie plana en una sala a 37ºC a diversos intervalos de tiempo antes de recoger las células para análisis.

Para analizar la expresión en la superficie de CMH de clase I en las células S2, se transfieren alícuotas de células (5 x 10^{5}) a tubos en hielo, se recogen por centrifugación (1.000 x g durante 4 minutos), se resuspenden en 3 ml de PBS/1% de BSA, 0,02% de azida de sodio, se recogen por centrifugación y se resuspenden en PBS/BSA (0,5 ml) que contiene el anticuerpo primario adecuado (fluidos ascíticos Y3, 28:14:8S, 30.5.7, W6/32, diluido 1:200). Se diluyen anticuerpos de conejo 1:500 y se utiliza directamente sobrenadante de hibridoma B22.293. Después de una hora de incubación en hielo, las células se lavan dos veces con 3 ml de PBS/BSA y se resuspenden en 0,5 ml de PBS/BSA que contiene anticuerpo secundario marcado con FITC (Cappell, Durham, NC) y yoduro de propidio 1 ng/ml. Después de 30 minutos de incubación en hielo, las células se lavan una vez con PBS/BSA y se resuspenden en este tampón a una concentración de 1 x 10^{6}/ml. Las muestras se analizan después por FACS 440 (Becton Dickinson). Las células muertas teñidas con yoduro de propidio se excluyen incluyendo una compuerta viva en el análisis.

Para la clasificación celular, se utiliza el mismo procedimiento descrito anteriormente, excepto que todas las operaciones de tinción se llevan a cabo en una campana estéril. Las soluciones, incluyendo los anticuerpos, se esterilizan por filtración, y se utiliza medio Schneider™ o Excell™ 400 en lugar de PBS/BSA. Las células que se unieron específicamente al anticuerpo primario se clasifican utilizando un citómetro Becton Dickinson. Las células clasificadas (2-8 x 10^{5}) se lavan una vez en medio antes de sembrar a una concentración de 2 x 10^{5} células/ml.

F. Carga de moléculas de CMH vacías unidas a membrana mediante incubación in vitro con péptidos

Para demostrar que las moléculas de clase I humana expresadas en la superficie de células de Drosophila estaban vacías, las células se incubaron a 37ºC durante 2 horas y se analizó la expresión en la superficie celular mediante citofluorimetría. La expresión en superficie tanto de HLA B27 como A2.1 se reduce en gran medida si las células se incuban a 37ºC durante 2 horas; sin embargo, preincubar las células en péptidos de VIH conocidos por unirse a moléculas de clase I, proporciona una estabilidad térmica significativa a la clase I, mientras que los péptidos que no se unen tienen poco efecto (véase la Figura 4). (Un péptido de 9 aminoácidos ILKEPVHGV (SEC Nº ID 42) de la proteína POL de VIH se une y estabiliza HLA A2.1. Un péptido de nueve aminoácidos de la proteína Vpr de VIH se une y estabiliza B27 (FRIGCRHSR; SEC Nº ID 41). Estos datos muestran que las moléculas de clase I humana expresadas en la superficie de células de Drosophila están vacías y pueden estabilizarse mediante la unión de péptidos de VIH específicos.

Las Figuras 4 y 5 muestran la termoestabilización inducida por péptidos de HLA B27 y HLA A2.1 expresados en la superficie de células de Drosophila por péptidos de VIH. Las células de Drosophila que expresan HLA B27 o A2.1 se incubaron con péptidos cuando se indica, y después se mantuvieron a 28ºC o bien se incubaron a 37ºC durante dos horas antes del análisis de la expresión en superficie de las moléculas de clase I mediante el uso del anticuerpo W6/32 (de ATCC HB95) y citofluorimetría. La fluorescencia media de cada población celular se muestra representada frente a las condiciones de incubación. El péptido POL de VIH (ILKEPVHGV, SEC Nº ID 42) estabiliza A2.1, pero no B27 (Figura 4), mientras que el péptido Vpr de VIH (FRIGCRHSR, SEC Nº ID 41) estabiliza B27 pero no A2.1

\hbox{(Figura 5)}

. Ejemplo 2 Preparación de células presentadoras de antígeno sintéticas A. Carga osmótica

Se llevó a cabo la carga osmótica de células SC2 y 3T3 con proteína ovoalbúmina como se describe en Moore et al., Cell 54: 777-785 (1988). El procedimiento de ensayo es como sigue. En una placa de 96 pocillos, se cocultivaron 1 x 10^{5} células de Drosophila (con o sin péptido/proteína cargado) o células 3T3 con 1 x 10^{5} células de hibridoma de células T B3/CD8 en 200 \mul de medio RMPI suplementado con suero fetal bovino al 10%. Después de 24 horas de incubación, se añadieron 100 \mul del sobrenadante de estos cultivos a 100 \mul de RPMI que contenía 5.000 células CTLL. Las células se cocultivaron durante 24 horas a 37ºC, cuando se añadió 1 \muCi de ^{3}H-timidina (Amersham). Después de una incubación adicional de 15 horas a 37ºC, se determinó la incorporación de radiomarcaje a las células CTLL mediante recuento de centelleo.

Los ensayos realizados con CMH murino verificaron también que las células de insecto son capaces de cargar péptido en moléculas de clase I. Las células que expresan tan pocas como 200-500 moléculas de CMH que contienen un antígeno particular pueden detectarse por una célula T. Ya que las células de Drosophila no acumulan cromo, se utilizó un ensayo de presentación antigénica basado en B3/CD8, un hibridoma de células T. El B3/CD8 es un hibridoma entre B3, célula T citotóxica específica del péptido 253-276 de ovoalbúmina presentado por moléculas de clase I H-2K^{b}, y la línea celular que lleva CD8 secretora de IL-2 (véase Carbone et al., supra, 1989). Tras la estimulación antigénica, el B3/CD8 produce IL-2, medido por la incorporación de ^{3}H-timidina a la línea celular CTLL de células T dependiente de IL-2 (Gillis et al., J. Immunol. 120: 2027, 91978)). Por tanto, al medir la cantidad de IL-2 producida, puede ensayarse el reconocimiento de células T.

Para proporcionar una agrupación intracelular de proteína ovoalbúmina de la que pueden derivarse péptidos OVA, se cargó osmóticamente ovoalbúmina (Sigma Chem. Co., MO) en las células como describen Moore et al., supra (1988). Inmediatamente después de cargar, las células se mezclaron con el hibridoma de células T. Después de dos días de incubación, el medio se retiró y se ensayó el IL-2. La cantidad de IL-2 se determinó por la capacidad del medio de soportar el crecimiento de la línea celular CTLL de células T dependiente de IL-2 (Gillis et al., supra. 1978) y el crecimiento se cuantificó mediante la cantidad de timidina radiactiva incorporada a las células.

Se incubaron células S2 o 3T3 transfectadas con K^{b}/\beta2 con proteína de ovoalbúmina (OvPro) o péptido de ovoalbúmina, OVA 24 (OvPep) en medio isotónico (Iso) o hipertónico (Hyp). (La línea celular murina BALB/3T3 está disponible en la ATCC con el número de acceso CCL 163). Después del tratamiento, las células se cocultivaron con el hibridoma de células T B3/CD8. El B3/CD8 es un hibridoma de células T entre B3 (Carbone et al.,. J. Exp. Med. 169: 603-612 (1989)), células T citotóxicas específicas del péptido de ovoalbúmina 253-276 presentado por moléculas de clase I H-2K^{b} y la línea celular que porta CD8 secretora de IL-2. Tras la estimulación antigénica, el B3/CD8 produce IL-2, medida mediante la incorporación de ^{3}H-timidina en la línea celular CTLL dependiente de IL-2 (Gillis et al., J. Immunol. 120: 2027, 91978)). Por tanto, al medir el contenido de IL-2 producido, puede ensayarse el reconocimiento de células T. El sobrenadante de los cocultivos se analizó en busca de IL-2 mediante la incorporación de ^{3}H-timidina por la línea celular CTLL dependiente de IL-2 (ATCC nº TIB 214).

La cantidad de ^{3}H-timidina incorporada se representa frente a los tratamientos celulares iniciales.

Puede observarse en la Figura 6 que las células T respondían bien a las células de Drosophila si el péptido de ovoalbúmina se añadía al medio de cultivo, pero no aparecía reconocimiento si las células se cargaban con la proteína ovoalbúmina. Las moléculas de clase I expresadas en la superficie celular de la célula de insecto son completamente funcionales porque pueden unir péptido si se añade al medio de cultivo, y pueden presentarlo en el contexto correcto para que sea reconocido por una célula T.

B. Optimización de las condiciones in vitro

Para la optimización de las condiciones in vitro para la generación de células T citotóxicas específicas, el cultivo de células estimuladoras de Drosophila se mantiene preferiblemente en medio exento de suero (por ejemplo Excell 400). Las células estimuladoras de Drosophila se incuban preferiblemente con > 20 \mug/ml de péptido. La relación efector:estimulador (relación linfocito:célula de Drosophila) está preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 30:1 a 300:1. El CD8^{+} específico máximo se observa generalmente después de cinco días de cultivo. El cultivo de las células diana para el ensayo de eliminación se mantiene preferiblemente en medio exento de suero.

Ejemplo 3 Estimulación de la proliferación y diferenciación de células T efectoras cargadas

Los inventores han encontrado que las células S2 de Drosophila transfectadas con moléculas de CMH de clase I y moléculas auxiliares específicas son capaces de estimular respuestas primarias a partir de células T in vitro. Presentan los datos siguientes en este ejemplo a partir de un sistema de modelo de ratón. En este ejemplo, se utilizaron los constructos que codifican CMH de clase I de ratón (L^{d}), \beta-2 microglobulina, moléculas auxiliares específicas y se ensayaron con receptor de células T de células CD8^{+} de nódulos linfáticos de ratones transgénicos.

Los datos de la figura 7 proporcionan evidencias de que las células S2 de Drosophila transfectadas expresan los productos proteicos de los genes murino transfectados. Se utilizaron citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo activado por fluorescencia (FACS) y anticuerpos marcados fluorescentemente para demostrar la expresión de L^{d} (molécula de CMH que incluye cadena pesada y \beta2) y las moléculas auxiliares específicas B7.1 (CD80) e ICAM-1 (CD54) mediante células S2 de Drosophila transfectadas. Las células transfectadas se separaron con FACS para obtener células que expresaran moléculas de L^{d} y se mantuvieron después in vitro.

La transfección de células S2 de Drosophila se resume en la Tabla 2. Los datos muestran la expresión de L^{d}, B7.1 e ICAM-1 medida por citometría de flujo en las líneas celulares después de la inducción con CuSO_{4}. Resulta evidente que, respecto al anticuerpo de control (ctr Ab), todos los transfectantes expresan moléculas de L^{d} en la superficie celular. Igualmente, las células cotransfectadas con L^{d} y B7.1 (L^{d}\cdotB7) expresan B7.1 pero no ICAM-1, mientras que las células contransfectadas con L^{d} e ICAM-1 (L^{d}\cdotICAM) expresan ICAM-1 pero no B7.1; la transfección triple con L^{d}, B7.1 e ICAM-1 (L^{d}\cdotB7\cdotICAM) condujo a la expresión de las tres moléculas.

Utilizando un sistema de cultivo de tejido estándar (Cai, Z. y Sprent, J. (1994) J. Exp. Med. 179: 2005-2015), se cultivaron dosis de 5 x 10^{4} células CD8^{+} 2C de nódulo linfático (LN) a 37ºC con dosis de 3 x 10^{5} células de mosca transfectadas \pm péptidos (concentración final 10 \muM). Los péptidos se sintetizaron por el R.W. Johnson Pharmaceutical Research Institute (Sykulev et al. (1994) Immunity 1: 15-22. Las respuestas proliferativas se midieron añadiendo ^{3}HTdR (1 \muCi/pocillo) 8 horas antes de recoger. La producción de IL-2 se midió retirando los sobrenadantes de los cultivos a las 48 horas y añadiendo 50 \mul de sobrenadante a una línea celular indicadora sensible a IL-2 (CTLL); la proliferación de la línea indicadora se midió mediante la adición de ^{3}HTdR. Los datos mostrados en la Tabla 2 son las medias de cultivos por triplicado. Las células S2 de Drosophila transfectadas mueren rápidamente a 37ºC y no consiguen incorporar ^{3}HTdR a esta temperatura.

Los datos en la Tabla 2 demuestran que los transfectantes son capaces de estimular las respuestas primarias de células T de ratón.

Tabla 2. Capacidad de las células de mosca transfectadas de estimular las respuestas proliferativas primarias y la producción de IL-2 mediante células CD8^{+} de nódulo linfático a partir de ratones transgénicos de receptor de células T 2C.

TABLA 2 Incorporación de ^{3}HTdR (cpm x 10^{3}) con células de mosca transfectadas que expresan:

Ensayo	Péptidos	L^{d}	L^{d} +	L^{d} +	L^{d} +	L^{d} + B7.1
	añadidos		B7.1	ICAM-1	B7.1 +	combinado con
					ICAM-1	L^{d} + ICAM-1
Proliferación	-	0,2	0,1	0,3	0,2	-
(día 3)	p2Ca	0,2	0,3	1,5	142,0	1,5
	QL9	0,2	60,9	73,9	263,7	132,9
Producción de	-	0,3	0,2	0,1	1,2	-
IL-2 (día 2)	p2Ca	0,2	0,2	0,1	64,6	0,3
	QL9	0,1	0,4	0,2	158,6	0,5

El receptor de células T 2C (TCR) es fuertemente reactivo con moléculas L^{d} complejadas con ciertos péptidos, por ejemplo p2Ca (SEC Nº ID 46) o QL9 (SEC Nº ID 47). Estos dos péptidos tienen una afinidad moderada a alta por moléculas L^{d} solubles, 4 x 10^{4} M^{-1} para p2Ca y 4 x 10^{4} M^{-1} para QL9 (Sykulev et al.). Cuando se complejan con moléculas de L^{d} solubles, los dos péptidos tienen también una alta afinidad de unión por moléculas TCR 2C solubles. Sin embargo, tanto en la unión a TCR como en la unión a L^{d}, el péptido QL9 tiene claramente una mayor afinidad que el péptido p2Ca.

La Tabla 2 muestra que las respuestas proliferativas y la producción de IL-2 por las células 2C sensibles al péptido más débil, p2Ca, requiere que las células transfectadas con L^{d} estimuladoras coexpresen tanto B7.1 como ICAM-1; una mezcla de células que expresa L^{d} + B7.1 o L^{d} + ICAM-1 no es estimulatoria. En contraposición, con el péptido más fuerte, QL9, las células de mosca L^{d} que expresan B7 o ICAM desencadenan respuestas claramente significativas, aunque la expresión combinada de B7 e ICAM genera respuestas mucho mayores. En contraposición con estos descubrimientos en la proliferación de células T, la producción de IL-2 en respuesta al péptido QL9 requiere la expresión conjunta de B7 e ICAM; la expresión de estas moléculas en células separadas es ineficaz.

Los resultados muestran que las células de Drosophila transfectadas con moléculas de clase I murinas y moléculas coestimulatorias inducen a las células T murinas a aumentar las respuestas proliferativas primarias y la producción de linfoquina (IL-2) en respuesta a antígenos peptídicos. El sistema es también aplicable a células T humanas y podría utilizarse para estimular células T no cebadas (o cebadas) específicas de antígenos específicos de tumor in vitro; la infusión in vivo de células T expandidas por clonación específicas de antígenos específicos de tumor podría ser terapéutica para pacientes con cáncer. La infusión de células T específicas de antígenos virales sería útil en pacientes con infecciones virales, por ejemplo VIH.

Ejemplo 4 Inmovilización de moléculas de CMH biotiniladas sobre glóbulos rojos recubiertos con avidina

Se adquirieron NHS-LC-biotina, neutravidina y biotina-BMCC en Pierce (Rockford, IL). Se obtuvieron glóbulos rojos de oveja de Colorado Serum Company (Denver, CO). Las células S2 de Drosophila que expresan L^{d} y L^{d} recombinante se prepararon como se describe en los ejemplos 1 y 2. Los anticuerpos monoclonales 30.5.7 (anti-L^{d}) y 1B2 (anticuerpo anti-clonotípico del receptor de células T 2C) se utilizaron en forma de sobrenadantes de cultivo celular de hibridoma.

El protocolo utilizado se describe en Muzykantov y Taylor (Anal. Biochem. (1994), 223, 142-148). Brevemente, se lavaron SRBC 4 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se biotinilaron utilizando NHS-LC-biotina, se lavaron de nuevo 4 veces con PBS, se incubaron con neutravidina y finalmente se lavaron 4 veces y se almacenaron a 4ºC en PBS que contenía 3% de suero fetal bovino y 0,02% de azida de sodio.

Se biotiniló L^{d} recombinante utilizando biotina-BMCC, una biotina acoplada a maleimida que reacciona con grupos tiol. L^{d} presenta un grupo tiol libre, la cadena lateral de la cisteína 121, que no está en el sitio de unión al péptido. La biotinilación se realizó como se recomienda por el fabricante. La biotina no reaccionada se retiró utilizando Centricon 10.

Se inmovilizó L^{d} biotinilada mediante incubación a una concentración final de 0,2 mg/ml con SRBC recubiertos con avidina durante 30 minutos, seguido de lavado en DMEM que contiene suero fetal bovino al 10%. Se utilizó inmediatamente los SRBC con L^{d} unida.

\newpage

Las células T que expresan el transgén TCR 2C de nódulos linfáticos de ratón se purificaron mediante vaciado magnético. Las células T purificadas eran consistentemente 97-98% positivas de tinción en citofluorimetría de flujo utilizando el anticuerpo anti-clonotípico 1B2.

La inmovilización de L^{d} biotinilada en SRBC recubiertos con avidina se realizó como se indica anteriormente. La unión se evaluó utilizando citofluorimetría de flujo utilizando el anticuerpo anti-L^{d} 30.5.7.

Se representa un experimento típico en la Figura 8. Se muestra un control negativo (células menos anticuerpo) en líneas de puntos. El pico relleno comprende células marcadas con anticuerpo fluorescente. Se marcaron un 99,78% de las células. La intensidad de fluorescencia estuvo en el mismo intervalo que los niveles más altos de intensidad que observaron los inventores para L^{d} en células presentadoras de antígeno sintéticas.

Se biotiniló también K^{b} (molécula de CMH que incluye cadena pesada y \beta2) utilizando el mismo procedimiento. Pudieron inmovilizar K^{b} biotinilada en SRBC recubiertos con avidina como se evaluó por citofluorometría de flujo (Figura 9). Se marcaron un 99,88% de las células.

Los experimentos de formación de rosetas verificaron que las moléculas de CMH adheridas interaccionaban funcionalmente con células T. Las células S2 de Drosophila que expresan L^{d}, SRBC recubiertos con L^{d}, se incubaron con péptido QL9 (0,02 mM) o un péptido irrelevante (MCMV, 0,02 mM) durante 30 minutos en hielo; se añadieron después células T 2C+, siendo la proporción 10 células T 2C^{+} por 1 célula S2 de Drosophila, o 10 SRBC por 1 célula T 2C^{+}; la mezcla se sedimentó y se mantuvo en hielo durante al menos 30 minutos. Las células se resuspendieron después cuidadosamente y se contaron las rosetas, siendo una roseta una célula S2 de Drosophila unida al menos a 3 células T 2C^{+} o una célula T 2C^{+} unida al menos a 3 SRBC. Las rosetas se observaron en todos los casos. Típicamente, se incluyeron un 30-40% de los linfocitos en rosetas cuando se añadió el péptido QL19. No se observaron rosetas en presencia del péptido irrelevante, aunque se observó una unión ocasional de unas pocas células individuales.

Estos ejemplos describen un nuevo procedimiento para inmovilizar altas cantidades de moléculas de CMH de clase I sobre diversas superficies (células de mosca, glóbulos rojos, perlas de látex) en conformación nativa a juzgar por los experimentos de unión de anticuerpo monoclonal y de formación de rosetas (unión de receptor de células T). Este procedimiento puede extenderse a otras superficies sintéticas incluyendo membranas fosfolipídicas artificiales. La fosfatidiletanolamina, así como los fosfolípidos acoplados a avidina son particularmente relevantes para los estudios. Estos fosfolípidos están comercialmente disponibles en Lipex Biomembrane Inc., Vancouver, BC, Canadá.

Ejemplo 5 Inmovilización de moléculas de CMH biotinilado sobre perlas de látex recubiertas con avidina

Se adquirieron perlas de sulfato de látex de seis micrómetros de diámetro en Interfacial Dynamics Corporation (Portland, OR) y se biotinilaron según el protocolo descrito en el ejemplo 4.

Se prepararon perlas de látex recubiertas con avidina utilizando una suspensión al 1% de las perlas de látex incubadas en PBS que contiene 1 mg/ml de neutravidina durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió después un volumen igual de PBS que contenía suero fetal bovino al 10%. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, las perlas se lavaron 3 veces y se utilizaron para unir L^{d} biotinilada recombinante.

Se inmovilizó L^{d} biotinilado recombinante mediante incubación a una concentración final de 0,2 mg/ml con perlas de látex basadas en avidina durante 30 minutos, seguido de lavado en DMEM que contenía suero fetal bovino al 10%. Se utilizaron inmediatamente SRBC con L^{d} unido.

Los experimentos de roseteado verificaron que las moléculas de CMH unidas a perlas de látex interaccionaban funcionalmente con células T. Se incubaron células S2 de Drosophila que expresaban L^{d} recombinante y perlas de látex recubiertas con L^{d} con péptido QL9 (0,02 mM) o un péptido irrelevante (MCMV, 0,02 mM) durante 30 minutos en hielo; se añadieron después células T 2C+, siendo la proporción de 10 células T 2C^{+} por 1 célula S2 de Drosophila, o perlas de látex recubiertas con L^{d} por 1 célula T 2C+; la mezcla se sedimentó y se mantuvo en hielo durante al menos 30 minutos. Las células se resuspendieron después y las rosetas se contaron, siendo una roseta una célula S2 de Drosophila unida al menos a 3 célula T 2C^{+}, o una célula T 2C^{+} unida al menos a 3 perlas de látex. Las rosetas se observaron en todos los casos. Típicamente, un 30-40% de los linfocitos se incluyó en rosetas cuando se añadió péptido QL9. No se observaron rosetas en presencia del péptido irrelevante, aunque se observó la unión ocasional de unas pocas células individuales.

Ejemplo 6 Inmovilización y detección de proteína recombinante unida a diversos soportes sólidos tales como placas de micropocillos de plástico

Se inmovilizaron moléculas de CMH mediante unión directa a placas de microvaloración (Corning) y se detectaron de la manera siguiente:

Se diluyeron moléculas de K^{b} de CMH a la concentración deseada en PBS, por ejemplo 0,001 mg/ml para 100 ng/pocillo. Se añadieron 100 \mul de K^{b} diluida a cada pocillo de la placa de microvaloración plástica. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, la placa se lavó una vez con PBS y se añadieron 200 \mul de seroalbúmina bovina al 2% (BSA) en PBS + (0,05%) y Tween™ (PBST), y se incubó durante otra hora a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces con PBST y se añadió mAb anti-K^{b} biotinilado (1:2500) en 2% de BSA en PBS. La placa se incubó otra hora a temperatura ambiente y se lavó tres veces con PBST. Se añadió HRP conjugado a avidina (1:2500) en 2% de BSA en PBS. Después de otra hora de incubación a temperatura ambiente, la placa se lavó tres veces con PBST y se añadieron H_{2}O_{2} o tofenildiamina. La reacción se paró con H_{2}SO_{4}. El producto de reacción se detectó colorimétricamente a 490 nm.

La Figura 10 muestra los resultados de detectar la presencia de moléculas de K^{b} de CMH utilizando tres anticuerpos monoclonales diferentes.

Las moléculas de K^{b} de CMH recombinantes pueden unirse como alternativa a través de interacciones biotina-avidina ligadas con el sustrato. En esta realización, las placas de microvaloración se recubrieron con 100 \mul de avidina diluida en PBS a una concentración de 0,001 mg/ml. La avidina en exceso se retiró mediante un lavado con PBS. Se siguió el procedimiento anterior para presentar y detectar la unión de K^{b}.

Las moléculas de CMH recombinante pueden inmovilizarse como alternativa mediante un enlace basado en una cola de polihistidina añadida al CMH que interacciona con el níquel unido al sustrato.

Se siguió el procedimiento anterior para la unión y detección utilizando placas de micropocillos recubiertos con quelato de níquel (Xenopore) y moléculas de CMH recombinantes con una cola de polihistidina expresada utilizando el vector pRmHa/His utilizado anteriormente.

Ejemplo 7 Unión directa de péptido a moléculas de CMH de clase I vacías solubles in vitro A. Procedimientos

H-2K^{b}: preparado como se describe anteriormente en el ejemplo 1.B.

H-2K^{b} sol: El ADNc de K^{b} sol es un derivado de K^{b} que codifica la porción extracelular de la molécula de CMH de clase I. El ADNc de K^{b} sol puede producirse mediante PCR según procedimientos conocidos, tales como los descritos en Ennis et al., PNAS USA 87: 2833-2837 (1990) y Zemmour et al., Immunogenetics 33: 310-320 (1991). Específicamente, el ADNc que codifica una molécula truncada de K^{d} con un codón de paro insertado al final del dominio alfa 3 en la posición aminoacídica +275 se escinde del plásmido de expresión pCMU en forma de un fragmento Bam HI y se clona en pRmHa-3 en forma de ADNc de K^{b}. El ADNc de K^{b} sol es un derivado de ADNc de K^{b} completo (véase anteriormente) que se utiliza como molde en una reacción PCR utilizando un oligonucleótido 5' que comprende el sitio Sty I y el siguiente oligonucleótido 3':

5' ATATGGATCCTCACCATCTCAGGGTGAGGGGC 3' (SEC Nº ID 43)

El fragmento de PCR resultante se clona con extremos romos en el sitio Sma I de pBS (Stratagene, La Jolla, CA), se secuencia y la secuencia 5' restante de K^{b} se clona en el sitio Sty I. Podría obtenerse un ADNc que codificara la proteína K^{b} sol completa en forma de un fragmento de restricción Bam HI.

H-2D^{b} y H-2L^{d} se preparan como se discute en el ejemplo 1.B anterior.

Los ADNc que codifican los dominios \alpha1\alpha2\alpha3 de K^{b} (274 residuos) y \beta-2 microglobulina murina (99 residuos) se clonaron respectivamente en el único sitio Bam HI de un vector de expresión que aloja al promotor de metalotionína, pRMHa-3 (Bunch et al., Nucleic Acid Res. 16: 1043-1061 (1988). Las células S2/M3 de Drosophila se transformaron con estos plásmidos recombinantes además del plásmido phshsneo (que contiene el gen de resistencia a la neomicina) mediante el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio descrito anteriormente. Las células transformadas seleccionadas frente a antibióticos G418 análogos a neomicina se hicieron crecer a 27ºC en medio exento de suero y se coexpresaron K^{b} de cadena pesada soluble y \beta-2 microglobulina mediante la adición de CuSO_{4} 0,7 mM.

El heterodímero ensamblado soluble de K^{b} se purificó a partir de los sobrenadantes de cultivo mediante cromatografía de afinidad utilizando anticuerpo monoclonal anti-K^{b} Y3, seguido de cromatografía de intercambio iónico en una columna de FPLC de Pharmacia Mono Q™ según las instrucciones del fabricante (Pharmacia, Piscataway, NJ). La electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) de la preparación de K^{b} seguida de tinción con azul de Coomasie mostró sólo una banda de masa molecular relativa (Mr) aproximadamente a 32.000 y una banda de Mr a aproximadamente 12.000 sin impurezas detectables. La K^{b} altamente purificada se dializó frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS), se esterilizó por filtración y se utilizó para estudios adicionales. El coeficiente de extinción de la proteína K^{b} soluble ("K^{b} sol") (43,2 kDa) es de 69.200 M^{-1}cm^{-1} a 280 nm.

La K^{b} sol purificada (0,3 \muM) en PBS con o sin 1% de TX-100 se expuso a temperaturas variables (concretamente 4ºC, 23ºC, 32ºC, 37ºC, 42ºC y 47ºC) durante una hora. Las proteínas se inmunoprecipitaron después incubando con el anticuerpo monoclonal Y3 y perlas de sepharose con proteína A (Pharmacia, Piscataway, NJ) a 4ºC durante dos horas, respectivamente. Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE al 12,5%, seguida de tinción con azul de Coomasie. Las dos bandas densas en el gel son las cadenas pesada y ligera del anticuerpo Y3. En otro procedimiento, se incubaron K^{b} sol (0,3 \muM) con 50 \muM de péptidos en PBS a 23ºC durante 2 horas para permitir la formación del complejo K^{b} sol-péptido. Después de la adición de 1% de TX-100, las muestras se expusieron a temperaturas de 12ºC, 37ºC o 47ºC durante 1 hora. Los complejos se inmunoprecipitaron y se analizaron por SDS-PAGE como se describe anteriormente. En un tercer procedimiento, se incubaron K^{b} sol (2,7 \muM) con 50 \muM de péptidos OVA-8, VSV-8 o SEV-9, respectivamente a 23ºC durante dos horas. Las muestras se aplicaron a un gel IEF con poliacrilamida al 5%. El IEF se corrió a pH 5-7 y el gel se tiñó con plata.

A continuación, se radioyodó el péptido VSV-8 utilizando el procedimiento de cloramina-T (Hunter et al., Nature 194: 495-196 (1962) y se retiró el ^{125}I libre de la columna C_{18} (cartucho OPC, Applied Biosystems, Foster City, CA). El péptido marcado se purificó adicionalmente por HPLC C_{18} en fase inversa. Después de la elución, el péptido marcado se liofilizó y suspendió en PBS.

Se determinó espectrofotométricamente la actividad específica de [^{125}I] VSV-8 (aproximadamente 250 Ci/mmol) utilizando el coeficiente de extinción de la tirosina a 274 nm (1420 M^{-1}cm^{-1}). En primer lugar, se mezcló K^{b} sol (0,5 \muM) con [^{125}I] VSV-8 (1,5 nM) y VSV-8 no marcado (50 nM) a 23ºC durante 16 horas para permitir la formación de complejo. Se analizó una porción de la muestra mediante filtración en gel (Superose 12, Pharmacia, Piscataway, NJ) en PBS. Después de la elución, se midió la radiactividad contenida en cada fracción (0,05 ml). La proteína se controló por absorbancia a 280 nm.

En un segundo procedimiento, se mezcló [^{125}I] VSV-8 (0,39 nM) con diversas concentraciones de K^{b} sol en PBS que contenía 1% de seroalbúmina bovina (BSA). Después de la incubación a 23ºC durante 2-16 horas, se separaron los complejos de K^{b} sol-péptido del péptido libre mediante filtración en gel pequeño (Bio-Gel™ P30, BioRad, Richmond, CA) en PBS. La filtración en gel P30 permitió una separación de más de un 95% del péptido unido y libre en aproximadamente 5 minutos. Se midió la radiactividad de los péptidos unidos y libres y los datos se analizaron por regresión lineal. A los niveles máximos de K^{b} sol ofrecidos, se unieron aproximadamente un 65% de los péptidos marcados totales. Esta capacidad máxima de unión de péptido marcado a proteína K^{b} sol se deterioró con el tiempo, presuntamente debido a la radiación del ^{125}I unido a VSV-8.

En un tercer procedimiento, cada muestra contenía [^{125}I] VSV-8 0,39 nM (aproximadamente 18.000 cpm), péptidos sin marcar a la concentración indicada y K^{b} sol 30 nM que proporciona aproximadamente un 50% de la unión de [^{125}I] VSV-8 en ausencia del péptido sin marcar a un volumen final de 72 \mul. Todos los componentes se disolvieron y diluyeron en PBS que contenía un 1% de BSA. Después de la incubación durante 2-16 horas a 23ºC, se analizaron 50 \mul de muestra por filtración en gel P30 como se describe anteriormente. Las constantes de disociación para los péptidos no marcados se determinaron a partir de las concentraciones molares de [^{125}I] VSV-8 y péptidos no marcados, proporcionando una inhibición de un 50% de la unión de [^{125}I] VSV-8 a K^{b} sol como se describe. (Véase Muller et al., Meth. Enzymol. 92: 589-601 (1983)).

Se incubaron después K^{b} sol (0,3 \muM) y [^{125}I] VSV-8 (0,39 nM) a 4ºC, 23ºC y 37ºC, y se determinó la asociación en diversos momentos mediante filtración en gel P30.

Se añadió \beta-2 microglobulina murina, cuando fue necesario, antes de la incubación a la concentración indicada. La \beta-2 microglobulina murina se preparó mediante cromatografía de afinidad utilizando anticuerpo policlonal anti-\beta-2 microglobulina K355 de sobrenadantes de cultivo de células Drosophila recombinantes. (Véase también Logdberg et al., Molec. Immun. 14: 577-587 (1979)). En otro experimento, se incubaron K^{b} sol (0,3 \muM o 1,8 \muM) y [^{125}I] VSV-8 (2,4 nM) a 23ºC durante 2 horas, y los complejos péptido-K^{b} sol se aislaron por filtración en gel P30. Las muestras contenían cantidades muy pequeñas de complejos [^{125}I] VSV-8 y K^{b} sol (como máximo 2,4 nM) y K^{b} sol vacía a una concentración final de aproximadamente 50 a 300 nM. A algunas muestras se añadieron \beta-2 microglobulina 3 \muM, \beta-2 microglobulina 3 \muM más VSV-8 20 \muM no marcado, VSV-8 20 \muM no marcado o 1% de TX-100. Las muestras se incubaron durante diversos tiempos a 37ºC y se determinó el grado de disociación mediante pasada sobre columnas P30.

B. Discusión

Las moléculas de CMH de clase I presentan péptidos antigénicos ante linfocitos T citotóxicos. La unión directa del péptido a moléculas de clase I in vitro se ha evitado por la presencia de péptidos unidos previamente al sitio de unión (Chen y Perham, Nature 337: 743-745 (1989)) o la falta de especificidad de unión. (Véanse, por ejemplo, Frelinger et al., J. Exp. Med. 172: 827-834 (1990); Choppin et al., J. Exp. Med. 172: 889-899 (1990); Chen et al., J. Exp. Med. 172: 932-936 (1990)). El análisis in vitro de la unión de péptido a moléculas de clase I vacías solubles purificadas de células de Drosophila transformadas con los genes H-2K^{b} sol y \beta-2 microglobulina murina truncados se describe en la presente memoria. Los resultados demuestran que la unión peptídica es muy rápida y los péptidos procesados naturalmente (octapéptidos; véanse por ejemplo Van Bleek et al., Nature 348: 213-216 (1990); Falk et al., Nature 351: 290-296 (1991)) tienen las afinidades mayores por K^{b} sol en el intervalo nanomolar, e indican que las K^{b} sol complejadas con octapéptidos son estables, mientras que las complejadas con péptidos ligeramente más cortos o más largos son de vida corta. Las interacciones entre la cadena pesada libre y la \beta-2 microglobulina son básicamente reversibles en ausencia de detergente. Los péptidos se unen espontáneamente a moléculas de clase I vacías sin disolución de \beta-2 microglobulina. Sin embargo, la \beta-2 microglobulina en exceso aparentemente promueve la unión de péptido a clase I vacía como consecuencia de la reasociación de la cadena pesada libre con \beta-2 microglobulina en condiciones en que los heterodímeros son inestables.

Las moléculas de H-2K^{b} solubles (compuestos por el dominio \alpha1\alpha2\alpha3 de la cadena pesada) y \beta-2 microglobulina murina se purificaron a partir de los sobrenadantes de cultivo de células de Drosophila que se transformaron concomitantemente con los genes de cadena pesada y \beta-2 microglobulina truncados. Los exámenes preliminares sugirieron que las células de Drosophila expresan moléculas de CMH de clase I desprovistas de péptidos endógenos sobre la superficie celular. Algunas de las propiedades de las moléculas de clase I vacías incluyen la observación de que son menos estables a 37ºC y de que su estructura se estabiliza mediante la unión de péptido. (Véase, por ejemplo, Schumacher et al., Cell 62: 563-567 (1990); Ljunggren et al., Nature 346: 476-480 (1990)). Para confirmar que las K^{b} solubles purificadas están también vacías, se examinó su estabilidad térmica en solución exenta de detergente. Sorprendentemente, las proteínas calentadas durante 1 hora a 47ºC se recuperaron bien mediante inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo conformacional Y3. Este resultado inesperado condujo a los inventores a añadir detergente, 1% de Triton™ X-100 (TX100; polioxietilen-(9)-octilfeniléter) a la solución proteica, puesto que experimentos similares para ensayar la estabilidad de moléculas de clase I se han realizado siempre en lisados de detergente (véase Schumacher et al., citado supra). Los resultados obtenidos en presencia de detergente muestran que la K^{b} sol purificada es ahora inestable a 37ºC. Esta y otras líneas de evidencia sugieren que el heterodímero K^{b} sol se desensambla en la cadena pesada y la \beta-2 microglobulina a temperaturas elevadas, y que el detergente puede evitar que la \beta-2 microglobulina se reasocie con la cadena pesada libre disociada (véase a continuación). En segundo lugar, se estudió la posibilidad de estabilizar la K^{b} sol purificada con péptidos. Los resultados del examen descrito primero demostraron que las proteínas pueden estabilizarse sólo cuando se mezclan con octapéptido (proteína de nucleocápsida del virus de la estomatitis vesicular [VSV-8], véase la tabla 3 a continuación) que se muestra que es un péptido procesado naturalmente (véase van Bleek et al., citado supra). Estas observaciones son consistentes con las características de las moléculas de clase I vacías citadas anteriormente.

Proporciona un apoyo independiente de que las moléculas de K^{b} sol purificadas están vacías el enfoque isoeléctrico (IEF) en condiciones nativas (datos no mostrados). La K^{b} soluble purificada de células de Drosophila exhibieron un patrón mucho más simple que las moléculas HLA-A2 purificadas a partir de líneas celulares de linfoblastoide humano (véase la figura 3 en Silver et al., Nature 350: 619-622 (1991)). El patrón complicado de HLA-A2 en IEF se supone que es el resultado de la presencia de péptidos heterogéneos unidos a las moléculas. La banda simple de K^{b} sol purificada indica la ausencia de péptidos endógenos. Además, la incubación de K^{b} sol con péptidos antigénicos causó los distintos desplazamientos de banda en el gel IEF, reflejando el cambio del punto isoeléctrico de la K^{b} sol debido a la unión del péptido. Debe observarse que dicho desplazamiento de banda no se observó en moléculas HLA-A2 cuando se mezclaron simplemente con péptidos, a menos que se incubara HLA-A2 con péptidos en "condiciones reconstituyentes" después de la retirada de péptidos endógenos unidos anteriormente. Tomadas en conjunto, estas observaciones sobre el IEF nativo indican también que las K^{b} solubles purificadas a partir de células de Drosophila están vacías.

La asociación de VSV-8 marcado con ^{125}I con K^{b} sol se demostró mediante filtración en gel (no mostrada). La radiactividad de los materiales de alto peso molecular corresponde a complejos péptido-K^{b} sol, mientras que la de los materiales de bajo peso molecular representa péptidos libres. Los péptidos VSV no marcado y ovoalbúmina (OVA) podrían competir con el VSV-8 marcado (véase a continuación), discutiendo que el [^{125}I] VSV-8 se una específicamente a moléculas de K^{b} sol. La HPLC en fase inversa reveló que el [^{125}I] VSV-8 unido a K^{b} tiene un tiempo de retención idéntico al péptido de inicio. La unión de K^{b} sol del VSV-8 marcado era saturable, exhibiendo una constante de disociación (K_{D}) de aproximadamente 33 nM (no mostrado). A partir del eje x de la gráfica de Scatchard, se observó que aproximadamente un 65% del VSV-8 marcado puede unirse a K^{b}.

Para determinar las afinidades de diversos péptidos con K^{b}, se llevaron a cabo radioinmunoensayos competitivos (RIA) utilizando [^{125}I] VSV-8 (datos no mostrados). Los péptidos inhibidores utilizados para los RIA se enumeran en la Tabla 3. La K^{D} para cada péptido se resume en la Tabla 3 también.

TABLA 3 Diversos péptidos* antigénicos utilizados en los presentes estudios

Código	Secuencia	K_{D} (M)
VSV-7	GYVYQGL	5,3 x 10^{-8}
VSV-8	RGYVYQGL	3,7 x 10^{-9}
VSV-9N	LRGYVYQGL	7,3 x 10^{-9}
VSV-10N	DLRGYVYQGL	3,9 x 10^{-7}
VSV-9C	RGYVYQGLK	6,9 x 10^{-9}
VSV-10C	RGYVYQGLKS	2,1 x 10^{-8}
OVA-8	SIINFEKL	4,1 x 10^{-9}
OVA-9N	ESIINFEKL	8,9 x 10^{-8}
OVA-10N	LESIINFEKL	2,8 x 10^{-7}
OVA-9C	SIINFEKLT	1,1 x 10^{-8}
OVA-10C	SIINFEKLTE	1,4 x 10^{-8}
OVA-24	EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER	7,1 x 10^{-5}
SEV-9	FAPGNYPAL	2,7 x 10^{-9}

VSV-8: proteína de nucleocápsida del virus de la estomatitis vesicular 52-59 (Van Bleek et al., Nature 348: 213-216 (1990)) OVA-8: Ovoalbúmina 257-264 (Carbone et al., J. Exp. Med. 169: 603-612 (1989)); SEV-9: nucleoproteína del virus Sendai 324-332 (Schumacher et al., Nature 350: 703-706 (1991)) * Todos los péptidos se purificaron por HPLC C_{18} en fase inversa para excluirpéptidos más cortos contaminantes con diferentes propiedades de unión. Las dsignaciones de código de tres letras y SEC Nº ID para cada péptido se dan a continuación

VSV-7:	GlyTyrValTyrGlnGlyLeu (SEC N^{o} ID 40, residuos n^{o} 4-10)
VSV-8:	ArgGlyTyrValTyrGlnGlyLeu (SEC N^{o} ID 40, residuos n^{o} 3-10)
VSV-9N:	LeuArgGlyTyrValTyrGlnGlyLeu (SEC N^{o} ID 40, residuos n^{o} 2-10)
VSV-10N:	AspLeuArgGlyTyrValTyrGlnGlyLeu (SEC n^{o} ID 40)
VSV-9C:	ArgGlyTyrValTyrGlnGlyLeuLys (SEC N^{o} ID 44, residuos n^{o} 1-9)
VSV-10C:	ArgGlyTyrValTyrGlnGlyLeuLysSer (SEC N^{o} ID 44)
OVA-8:	SerIleIleAsnPheGluLysLeu (SEC N^{o} ID 39, residuos n^{o} 5-12)
OVA-9N:	GluSerlleIleAsnPheGluLysLeu (SEC N^{o} ID 39, residuos n^{o} 4-12)
OVA-10N:	LeuGluSerIleIleAsnPheGluLysLeu (SEC N^{o} ID 39, residuos n^{o} 3-12)
OVA-9C:	SerIleIleAsnPheGluLysLeuThr (SEC N^{o} ID 39, residuos n^{o} 5-13)
OVA-10C:	SerIleIleAsnPheGluLysLeuThrGlu (SEC N^{o} ID 39, residuos n^{o} 5-14)
OVA-24:	GluGlnLeuGluSerIleIleAsnPheGluLysLeuThrGluTrpThrSerSerAsnValMetGluGluArg
	(SEC N^{o} ID 39)
SEV-9:	PheAlaProGlyAsnTyrProAlaLeu (SEC N^{o} ID 45).

Los péptidos de tamaño procesado naturalmente (octámero para VSV y OVA y nonámero para nucleoproteína de virus Sendai [SEV]) tenían las afinidades mayores y notablemente similares en el intervalo de 2,7 a 4,1 nM; esta afinidad extremadamente alta de los péptidos naturales es consistente con las observaciones recientes. (Véanse, por ejemplo, Schumacher et al., Nature 350: 703-706 (1991); Christnik et al., Nature 352: 67-70 (1991)). Sin embargo, los péptidos que eran más cortos o más largos por tan poco como uno o dos residuos redujeron la afinidad por un factor de 2 a 100. Esta reducción de la afinidad es aún más drástica para un péptido mucho más largo, concretamente, la afinidad del péptido 24-mero (OVA-24) es más de 10.000 veces menor que la del OVA-8. Estos resultados ayudan a explicar por qué los informes iniciales utilizando péptidos más largos reivindicaban una afinidad en el intervalo micromolar. (Véase, por ejemplo, Frelinger et al. y Choppin et al., ambos citados supra). Es de particular interés que la extensión de los péptidos en el extremo carboxilo es mucho menos destructiva de la afinidad que la extensión del extremo amino. Según la estructura tridimensional de HLA-A2, el surco de unión del péptido se forma por dos \alpha-hélices largas en las cadenas \beta antiparalelas, y la hendidura es de aproximadamente 25 angstroms de largo, que se propone que acomoda una cadena peptídica extendida de aproximadamente ocho residuos (véase, por ejemplo Bjorkman et al., Nature 329: 506-512 (1987)). En un extremo de la hendidura, las hélices \alpha1 y \alpha2 se ponen estrechamente en contacto, mientras que en el otro extremo la hendidura está bastante abierta. Se especula ahora que tanto el péptido VSV como OVA se unen al surco en la misma orientación y el extremo carbonilo de los péptidos podría interactuar con el extremo relativamente abierto del surco de modo que la extensión del péptido por el extremo terminal no cause un severo impedimento estérico.

Se realizaron después exámenes para determinar la velocidad de unión de péptido a K^{b} a 4ºC y 23ºC, respectivamente (no mostrado). La unión fue muy rápida, especialmente a 23ºC, con un tiempo medio de aproximadamente 5 minutos incluso a concentraciones extremadamente bajas de péptidos marcados (aproximadamente 0,4 nM). Esto contrasta con las observaciones anteriores, que muestran un tiempo medio de asociación de aproximadamente dos horas. (Véase, por ejemplo, Choppin et al., citado supra). De nuevo, sólo un 65% del péptido marcado total fue capaz de unirse. La adición de \beta-2 microglobulina en exceso no afectó a la cinética de unión de péptido a temperaturas bajas tales que el heterodímero de K^{b} es estable (queda por ensamblar). Esto implica que el intercambio de \beta-2 microglobulina no es un prerrequisito para la unión de péptido; concretamente, los péptidos pueden unirse espontáneamente a moléculas de clase I vacías sin disociación de la \beta-2 microglobulina. En contraposición, el exceso de \beta-2 microglobulina libre promueve aparentemente la unión de péptido a 37ºC (datos no mostrados). A medida que aumentaba la concentración de \beta-2 microglobulina añadida, se unían más péptidos a las moléculas de K^{b}. Puesto que las K^{b} vacías son inestables a 37ºC, debe disociarse una fracción de los heterodímeros en la cadena pesada y la \beta-2 microglobulina y así el heterodímero debe estar en equilibrio con la cadena pesada libre y la \beta-2 microglobulina libre. Después, la adición de
\beta-2 microglobulina debería desplazar el equilibrio hacia la formación que heterodímero que puede unir péptidos. Este punto de vista es apoyado por observaciones recientes de que existen números sustanciales de cadenas pesadas libres de clase I sobre la superficie de células normales, y la \beta-2 microglobulina añadida exógenamente facilita la unión de péptidos a moléculas de clase I vacías sobre células como consecuencia de la reasociación de la \beta-2 microglobulina con la cadena pesada libre. (Véanse, por ejemplo, Rock et al., Cell 65: 611-620 (1991); Kozlowski et al., Nature 349: 74-77 (1991); Vitiello et al., Science 250: 1423-1426 (1990)).

Se observó después la cinética de disociación del péptido a 37ºC. Inmediatamente después de aislar complejos de [^{125}I] VSV-8 y K^{b} mediante filtración en gel, las muestras que contenían K^{b} 50 ó 300 nM se expusieron a temperaturas de 37ºC. Algunas muestras se suplementaron con \beta-2 microglobulina 3 \muM y/o VSV-8 sin marcar 20 \muM o 1% de TX-100. La disociación de los péptidos marcados de K^{b} se midió en diversos momentos (no mostrado). En presencia de un gran exceso de péptidos no marcados, la velocidad de disociación de péptido siguió una cinética de primer orden con un tiempo medio de disociación de aproximadamente 36 minutos (una velocidad de disociación constante de 3,2 x 10^{-4} s^{-1}). Esta disociación relativamente rápida inesperada del péptido marcado no concuerda con algunos puntos de vista actuales sobre los complejos péptido-clase I estables. De hecho, los resultados evaluados (no mostrados) demostraron que los complejos de K^{b} y VSV-8 son estables. Esta discrepancia debe surgir de la afinidad 10 veces menor del VSV-8 marcado radiactivamente (33 nM) en comparación con la del VSV-8 no marcado (3,7 nM).

La cinética de primer orden se observó también cuando se añadió detergente en lugar de péptido no marcado, indicando que el detergente hace irreversible el proceso de disociación del péptido. En contraposición, el perfil de disociación del péptido no siguió la cinética de primer orden en ausencia de péptido marcado o detergente. Esto sugiere que la asociación/disociación del péptido es reversible y la unión del péptido depende de la concentración de heterodímero (comparar la cinética entre 50 nM y 300 nM de K^{b}). Esto se hizo más evidente cuando se añadió \beta-2 microglobulina en exceso. Estos resultados apoyan el argumento anterior de que la interacción entre la cadena pesada, \beta-2 microglobulina y péptido es básicamente reversible a 37ºC, si no enteramente, en ausencia de detergente. Es probable que un detergente tal como TX-100 pueda evitar que la microglobulina \beta-2 se reasocie con la cadena pesada libre a 37ºC. Esto podría explicar razonablemente por qué la K^{b} una vez calentada a temperaturas elevadas en ausencia de detergente puede inmunoprecipitar eficazmente mediante anticuerpo conformacional (no mostrado). De forma interesante, la adición de \beta-2 microglobulina no suprimió la disociación del péptido en presencia de péptidos no marcados en exceso, indicando que los péptidos marcados se liberan de los complejos sin disociación de la \beta-2 microglobulina. Debe recordarse, sin embargo, que la afinidad del [^{125}I] VSV-8 es aproximadamente 8 veces menor que la de los péptidos naturales. Por lo tanto, no es este necesariamente el caso para los péptidos naturales.

El estudio utilizando sistemas de ensayo de unión de péptido in vitro sugiere que la unión de péptido a moléculas de clase I es una simple acción de masas y una interacción ligando-receptor. El enfoque utilizado en la presente memoria permite la caracterización de la especificidad de unión a péptido de moléculas de clase I y de la interacción de complejos péptido-clase I con el receptor de células T.

Ejemplo 8 Aplicaciones terapéuticas A. Banco de moléculas de clase I

Puede establecerse y mantenerse un depósito o "banco" de líneas celulares de insecto, expresando cada línea celular una de las 50 a 100 cadenas pesadas de CMH de clase I más comunes, una molécula de \beta-microglobulina, así como al menos una molécula auxiliar. Los ADNc que codifican estas proteínas pueden clonarse basándose en variantes de HLA obtenidas a partir de líneas celulares que contienen las mismas, por ejemplo mediante la reacción en cadena con polimerasa (véase Ennir et al., PNAS USA 87: 2833-2837 (1990)), e insertarse en el vector apropiado, tal como un vector de expresión de insecto, para generar líneas celulares que expresan cada variante de HLA.

\newpage

El ensayo según el siguiente protocolo, por ejemplo, puede utilizarse para determinar cuáles péptidos derivados del virus de elección se unen mejor a las diferentes moléculas de CMH de clase I. Los diversos cultivos pueden marcarse o catalogarse apropiadamente para indicar cuáles moléculas de CMH de clase I son mejores para uso con péptidos particulares. Como alternativa, pueden establecerse cultivos transitorios según sea necesario. Como se discute en la presente memoria, después de aproximadamente 48 horas de incubación de un cultivo de células de insecto con un vector, ese cultivo es aparentemente capaz de expresar moléculas de CMH vacías que pueden cargarse con el péptido o péptidos de elección con los fines de activar las células CD8^{+}.

B. Preparación de líneas celulares "especiales"

Después de tipificar el HLA, si las líneas celulares de insecto que expresan el HLA preferido no están disponibles, pueden clonarse los ADNc que codifican el HLA y moléculas auxiliares preferidos mediante el uso de la reacción en cadena con polimerasa. Los cebadores descritos en la sección B.1 anterior (SEC Nº ID 1 a SEC Nº ID 12) pueden utilizarse para amplificar los ADNc de HLA-A, -B, -C, -E, -F o -G apropiados en reacciones separadas que pueden clonarse y secuenciarse después como se describe en los procedimientos descritos en el ejemplo 1, sección 1 anterior. El ADN se purifica después a partir de la reacción PCR utilizando un kit Geneclean™ (Bio 101, San Diego, CA) y se liga directamente al sitio Sma I de pRmHa-3. Se aislan clones individuales, se verifican las secuencias y se establecen líneas celulares estables de Drosophila que expresan el HLA. Como alternativa, puede hacerse crecer una población bruta de plásmidos recombinantes a gran escala y purificarse el ADN mediante gradientes de cloruro de cesio. El ADN purificado se utiliza después para transfectar células S2 utilizando técnicas de precipitación con fosfato de calcio. Después de 24 horas, el precipitado se lava de las células y se reemplaza por medio Schneider fresco que contiene CuSO_{4} 1 mM. Cuarenta y ocho horas después, la población bruta de células transfectadas transitoriamente se utiliza para la activación in vitro de CD8^{+} después de incubación con péptidos singénicos o digestiones con proteasa de proteínas específicas.

Pueden establecerse después líneas celulares estables que expresen el HLA clonado. Como alternativa, puede utilizarse una población de células de insecto que expresen transitoriamente una población bruta de moléculas recombinantes clonadas a partir de la reacción PCR para activación in vitro de CD8^{+}.

También es posible activar CD8 específicos de haplotipo in vitro utilizando células de insecto que expresan CMH de clase I incubados con péptidos cuando el CMH expresado por la línea celular no es el elemento expresado in vivo. Esto proporciona una oportunidad única de proliferar células CD8^{+} que reconocen un antígeno específico asociado a un CMH particular que no sería posible in vivo debido a la restricción alélica. Por ejemplo, un péptido de la proteína nuclear (NP) del virus de la gripe se restringe habitualmente a la molécula D^{b}; sin embargo, los inventores han encontrado que dicho péptido puede unirse a K^{b} (aunque más débilmente que a D^{b}) y puede generar un grado de estabilidad térmica en K^{b} (véase la figura 3). Además, las células de Drosophila que expresan K^{b} preincubadas con el péptido NP y cocultivadas con esplenocitos de un ratón B6 dan como resultado la activación in vitro de CD8^{+} que reconocen específicamente la molécula de K^{b} asociada al péptido NP. Además, el experimento recíproco utilizando un péptido restringido a K^{b} (OVA) derivado de ovoalbúmina y células de Drosophila que expresan D^{b} da como resultado la proliferación de CD8^{+} que reconocen específicamente D^{b} que contiene el péptido OVA. Dichas CD8 son capaces de eliminar células (EL4 OVA) transfectadas con ADNc que codifica la proteína ovoalbúmina, indicando que, in vivo, algunas moléculas de D^{b} están cargadas con el péptido OVA.

Este sistema proporciona por lo tanto una oportunidad única de proliferar CD8^{+} frente a antígenos específicos presentados por una molécula de clase I que, in vivo, no es el elemento de restricción para ese péptido. Aunque se presenta suficiente antígeno in vivo por la citada clase I para que la célula sea reconocida y eliminada por CD8^{+}, no es suficiente para proliferar dichas CD8 in vivo. Al cargar moléculas de clase I vacías expresadas por células de Drosophila con péptido, los inventores son capaces de superar la restricción in vivo proporcionando un exceso de péptido antigénico a la molécula de clase I en un entorno no competitivo tal que se presenta suficiente antígeno por la clase I para activar las CD8^{+} específicas que reconocen este complejo.

C. Tratamiento del SIDA

Las células activadas in vitro pueden utilizarse en la fabricación de un medicamento para terapia in vivo. Preferiblemente, se determina primero el genotipo de CMH de clase I (haplotipo) del individuo. La tipificación de tejido convencional es apropiada con este fin, y puede realizarse en el centro de tratamiento o mediante alguna operación comercial apropiada. Una vez se determina el tipo o tipos de HLA del individuo, se evalúa la mejor combinación de péptidos y moléculas de CMH de clase I adecuada para el paciente individual, se prepara como se observó anteriormente y se proporcionan las líneas celulares de insecto y péptidos apropiados. Se estimulan después células T CD8^{+} en reposo o precursoras de la sangre del paciente con el CMH cargado con el péptido adecuado producido por el cultivo de células de insecto. Después de la activación, las células CD8^{+} se reintroducen en la corriente sanguínea del paciente, y el proceso patológico en el paciente se sigue controlando. Los procedimientos de retirada y reintroducción de componentes celulares son conocidos en la técnica e incluyen procedimientos tales como los ilustrados en la patente de EE.UU. nº 4.844.893 de Honsik et al. y la patente de EE.UU. nº 4.690.915 de Rosenberg.

Pueden administrarse tratamientos adicionales según sea necesario hasta que la enfermedad se cure suficientemente. Son apropiados protocolos de tratamiento similares para uso con otros individuos inmunosuprimidos, incluyendo pacientes de trasplante, pacientes ancianos y similares.

D. Tratamiento del cáncer

En pacientes con cáncer, se utiliza un procedimiento de tratamiento similar al descrito anteriormente. Sin embargo, en dichos pacientes debe preverse que la terapia convencional para reducir la masa tumoral puede preceder a la terapia inmune descrita en la presente memoria. Por lo tanto, se prefiere que las muestras de sangre del supuesto paciente se obtengan y almacenen (por ejemplo por congelación) antes del inicio de la terapia convencional tal como radiación o quimioterapia, que tiende a destruir las células inmunes. Puesto que pocas, si es que alguna, formas de cáncer surgen en respuesta directa a la infección viral, los péptidos diana para el tratamiento inmune se observan menos fácilmente. Sin embargo, estudios recientes indican que las mutaciones en los oncogenes ras, neu y p53 contribuyen al cáncer tanto como en un 50% de todos los casos de cáncer. Por tanto, los péptidos derivados de estas regiones mutadas de las moléculas son importantes candidatos como dianas para la presente terapia. Siguiendo los protocolos descritos en la presente memoria, puede determinarse y administrarse la mejor combinación de péptidos y moléculas de clase I para el paciente individual.

Por ejemplo, muchos tumores expresan antígenos que se reconocen in vitro por células CD8^{+} derivadas del individuo afectado. Dichos antígenos que no se expresan en células normales pueden identificarse por tanto, así como el tipo de HLA que les presenta a las células CD8^{+}, para inmunoterapia dirigida con precisión utilizando los procedimientos de la presente invención. Por ejemplo, van der Bruggen et al. han descrito un antígeno cuya expresión está dirigida por un gen específico y cuyo gen parece que se presenta por HLA A1 (Science 254: 1643-1647 (1991)). A medida que se aíslan y describen diversos antígenos tumorales humanos, se vuelven buenos candidatos para aplicaciones inmunoterapéuticas como las descritas en la presente memoria.

En otro modo terapéutico alternativo, puede ser factible administrar las células CD8^{+} activadas in vitro de la presente invención junto con otros inmunógenos. Por ejemplo, el inmunógeno multivalente grande descrito en la patente de EE.UU. nº 5.045.320 puede administrarse junto con células CD8^{+} activadas.

También es posible poder administrar citoquinas tales como IL-2 e IL-4, que median la diferenciación y activación de células T, ya que las citoquinas son capaces de estimular la respuesta de células T frente a células tumorales in vivo. Se cree que IL-2 desempeña un papel importante en el crecimiento y diferenciación de precursores de CD8^{+} y en la proliferación de CD8^{+}. La administración de IL-2 a pacientes con cáncer está asociada frecuentemente a una respuesta antitumoral mejorada que se relaciona probablemente con la inducción de células T específicas de tumor. Sin embargo, los mejores efectos terapéuticos de IL-2 podrían obtenerse mediante la administración continua en lugar de sistémica de IL-2, minimizando así la toxicidad de la IL-2 y prolongando su actividad biológica. Puede conseguirse la liberación local mediante la transfección de células tumorales con un constructo del gen IL-2.

El ADNc de IL-2 se construye como describen Karasuyama y Melchers en Eur. J. Immunol. 18: 97-104 (1988). La secuencia de ADNc completa de IL-2 se obtiene en forma de un fragmento Xho I a partir del plásmido pBMGneo IL-2 (véase Karasuyama y Melchers, supra) y se liga directamente al sitio Sal I en pRmHa-3. El plásmido pRmHa-3 recombinante con el inserto en la orientación correcta (determinado mediante cartografía de restricción con Hind III) se purifica mediante gradientes de cesio y se utiliza para cotransfectar células S2 utilizando la técnica del fosfato de calcio. (Se preparó una mezcla de ADN de plásmido con este fin: 10 \mug de pRmHa-3 que contiene ADNc de IL-2, 6 \mug de cada uno del plásmido pRmHa-3 que contiene cadena pesada de CMH de clase I o \beta-2 microglobulina y 2 \mug de ADN de phshsneo). Se obtuvieron líneas celulares estables que son inducibles mediante CuSO^{4} para expresar la cadena pesada, \beta-2 microglobulina e IL-2 haciendo crecer los transfectantes en medio G418. Estas líneas celulares estables se recubrieron con péptido y se utilizaron en el ensayo in vitro como se describe anteriormente. Se observa que células tumorales transfectadas con IL-2 potencian la actividad CTL (CD8) frente a las células tumorales originales y evitan la función CD4 y auxiliar de células T en la inducción de una respuesta antitumoral o citotóxica in vivo. Por lo tanto, se sugiere en la presente memoria aumentar el potencial del sistema de Drosophila mediante cotransfección con el gen IL-2.

Ejemplo 9 Dependiencia de la dosis de la producción de células T activadas utilizando el sistema presentador de antígeno

Se produjeron células presentadoras de antígeno (APC) transfectando células de Drosophila como se describe en el ejemplo 3, y después se ensayó su capacidad de presentar antígeno ante células T a partir de la línea 2C de ratones transgénicos. Con células de ratón como células presentadoras de antígeno, esta línea presenta una fuerte alorreactividad por moléculas L^{d} complejadas con un péptido octámero endógeno, p2Ca (Leu-Ser-Pro-Phe-Pro-Phe-Asp-Leu, SEC Nº ID 46) derivado de una enzima del ciclo de Krebs, 2-oxoglutarato deshidrogenasa (OGDH). El péptido p2Ca se expone naturalmente unido a L^{d} en la superficie de células H-2^{d} tales como células B10-D2. El péptido p2Ca tiene una afinidad de unión intermedia por moléculas de L^{d} solubles (4 x 10^{6} M^{-1}) y una alta afinidad por moléculas TCR 2 C (2 x 10^{6} M^{-1} a 1 x 10^{7} M^{-1}).

Un péptido nonamérico estrechamente relacionado, QL9 (Gln-Leu-Ser-Pro-Phe-Pro-Phe-Asp-Leu, SEC Nº ID 47) tiene una afinidad aún mayor por estas moléculas (2 x 10^{8} M^{-1} por L^{d} y 2 x 10^{7} M^{-1} por TCR 2C). Excepto por un aminoácido adicional (glutamina) en el extremo N, QL9 tiene una secuencia idéntica a p2Ca y, como p2Ca, forma parte de la secuencia nativa de OGDH.

Con los péptidos p2Ca y QL9 (preparados en forma sintética), se estudiaron in vitro los requisitos de las células presentadoras de antígeno para las células CD8^{+} 2C maduras no cebadas. Las células CD8^{+} sensibles se purificaron a partir de nódulos linfáticos agrupados (LN) de ratones 2C en un fondo C57BL/6 (B6, H-2^{b}), retirando primero las células CD4^{+}, las células positivas de clase II y las células B mediante tratamiento con mAb + complemento seguido por inmunopurificación positiva.

Se prepararon suspensiones celulares a partir de LN cervicales, axilares, inguinales y mesentéricos agrupados de ratones jóvenes adultos utilizando un triturador de tejido. Para la purificación celular, se trataron células de LN en primer lugar con un cóctel de mAb (anti-CD4, anti-HSA, anti-I-A^{b}) más complemento durante 45 minutos a 37ºC. Las células supervivientes se separaron adicionalmente en células CD8^{+} y CD8^{-} (CD4^{-}) mediante inmunopurificación a 4ºC durante 60-90 minutos en placas Petri recubiertas con mAb anti-CD8. Las células CD8^{+} adheridas se recuperaron mediante incubación a 37ºC durante 5 minutos, seguida de un vigoroso pipeteo. Las células no adheridas se eluyeron y se trataron con mAb anti-CD8 y complemento para obtener células 2C CD8^{-} 1B2^{+}. Más de un 95% de las células CD8^{+} obtenidas se clonotipificaron positivamente (IB2^{+}) y un 98% de estas células presentó un fenotipo no tratado (CD44^{lo}).

La estimulación TCR desencadenó un complejo patrón de eventos intracelulares que condujo a una estimulación temprana de CD69 y CD25 (receptor de IL-2 o IL-2R) en la superficie celular. Estos cambios resultan evidentes en unas pocas horas de estimulación y están seguidos por la síntesis de citoquina y la proliferación celular. Las células de Drosophila se transfectaron con genes de L^{d}, L^{d} y B7.1 (L^{d}\cdotB7), L^{d} e ICAM-1 (L^{d}\cdotICAM) o L^{d}, B7.1 e ICAM-1 (L^{d}\cdotB7\cdotICAM). La Figura 11 muestra la expresión de CD69 y CD25 en células 2C CD8^{+} no tratadas purificadas estimuladas durante 12 horas con células de Drosophila transfectadas y péptido p2Ca frente a QL9 a una concentración 10 \muM. Se incubaron células 2C CD8^{+} purificadas con diversas células de Drosophila más un péptido (p2Ca o bien QL9, 10 \muM) en cultivo bruto (2 ml) durante 12 horas y después se sometieron a tinción por CD69 o CD25. p2Ca o bien QL9 presentados por células de Drosophila transfectadas con L^{d}\cdotB7, L^{d}\cdotICAM o L^{d}\cdotB7\cdotICAM fueron eficaces para potenciar la estimulación de CD69 y CD25. Sin embargo, las células 2C no cultivadas sin péptido o células de Drosophila no mostraron estimulación de CD69 y CD25 (panel superior).

En presencia de células de Drosophila que expresan sólo L^{d}, la inducción de la expresión de CD69 y CD25 en células 2C CD8^{+} fue baja, pero significativa, con el péptido QL9 fuerte, pero apenas detectable con el péptido p2Ca más débil. Con células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7 o L^{d}\cdotICAM, ambos péptidos desencadenaron una pronunciada estimulación de CD69 y CD25. Sin embargo, las células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM indujeron la expresión aún mayor de estas moléculas.

Las células de Drosophila transfectadas sólo con L^{d} no consiguieron causar la proliferación de células 2C CD8^{+} frente a péptido p2Ca o QL9 en ausencia de linfoquinas exógenas, consistente con la capacidad mínima de estas células como células presentadoras de antígeno de inducir la expresión de CD69 y CD25. Los resultados se muestran en la Figura 12. Se midieron las respuestas a p2Ca (superior) y QL9 (inferior) cultivando 5 x 10^{4} células 2C CD8^{+} purificadas con 2 x 10^{5} células de Drosophila en presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de péptidos durante 3 días. Se añadió [^{3}H] TdR durante las últimas 8 horas de cultivo; se añadió rIL-2 a una concentración final de 20 unidades/ml. Los datos son la media de cultivos por triplicado. Cuando se suplementaron con IL-2 exógena, sin embargo, ambos péptidos estimularon respuestas proliferativas significativas a altas dosis (10 \muM). Las respuestas proliferativas desencadenadas por QL9 fueron mucho más fuertes que para p2Ca (obsérvese la gran diferencia entre las escalas de los ejes x del panel superior e inferior).

Las relaciones sensibles a la dosis para la proliferación el día 3 desencadenada por células de Drosophila transfectadas con L^{d}\cdotB7\cdotICAM y que presentan péptido p2Ca se compararon con las desencadenadas por células de Drosophila transfectadas con L^{d}\cdotB7, L^{d}\cdotICAM o L^{d}\cdotB7\cdotICAM que presentan péptido QL9. Los resultados (media de cultivos por triplicado) se muestran en la Figura 13. Las APC de Drosophila (2 x 10^{5} células) se cultivaron con 5 x 10^{4} células 2C CD8^{+} durante tres días en presencia o ausencia de péptidos. Se añadió [^{3}H] TdR durante al menos 8 horas de cultivo; no se añadió IL-2 a los cultivos.

Las respuestas proliferativas óptimas desencadenadas por células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM el día 3 requirieron altas concentraciones de péptido p2Ca, por ejemplo 10 \muM (10^{-5} M) (Figura 13). Los resultados para péptido QL9 fueron diferentes. Las curvas de respuesta a la dosis para células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7 más QL9 y células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotICAM más QL9 se aproximaron a los resultados para células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM más p2Ca (Figura 13). Sin embargo, con células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM, las respuestas proliferativas frente a QL9 el día 3 fueron máximas con 100 nM (10^{-7} M) y fueron claramente evidentes con dosis tan bajas como de 10 pM (10^{-11} M) (Figura 13). A dosis altas, por ejemplo 10 \muM (10^{-5} M), QL9 inhibió la respuesta proliferativa el día 3 (Figura 13, obsérvese la escala logarítmica).

La inhibición de la proliferación por células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM y péptido QL9 no se aplicó a la producción de IL-2 (Figura 14, derecha), y se observó sólo con dosis altas de células presentadoras de antígeno (Figura 14, izquierda). Se encontró de nuevo que las células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM más péptido QL9 eran más eficaces para desencadenar la producción de IL-2 que las células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM más péptido p2Ca (Figura 14, derecha). Los datos indican que las células presentadoras de antígeno sin péptidos fueron ineficaces para desencadenar respuesta alguna en el intervalo de 100 veces de densidad de células presentadoras de antígeno ensayadas (Figura 14, "-pep", cuadrados blancos).

Se examinaron los cambios en las relaciones de dosis-respuesta de las respuestas de células 2C CD8^{+} el día 3, el día 4 y el día 5 utilizando péptido QL9 con células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7, L^{d}\cdotICAM o L^{d}\cdotB7\cdotICAM. Los resultados se muestran en la Figura 15. Las respuestas se midieron con 5 x 104 células 2C CD8^{+} y 3 x 10^{9} células presentadoras de antígeno a las concentraciones de péptido indicadas. Los datos son los resultados medios de cultivos por triplicado.

Con una dosis intermedia de 100 nM (10^{-7} M) de péptido QL9, las respuestas proliferativas frente a células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM fueron altas el día 3 (Figura 15, izquierda), alcanzaron un pico el día 4 (Figura 15, centro) y después descendieron a niveles bajos el día 5 (Figura 15, derecha). Con una dosis alta de 10 \muM (10^{-5} M) de péptido QL9, sin embargo, la respuesta fue baja el día 3 (Figura 15, izquierda), pero después aumentó pronunciadamente para alcanzar un pico alto el día 5 (Figura 15, derecha).

La inhibición transitoria de la proliferación inducida por QL9 el día 3 se observó sólo cuando la avidez de la interacción célula T/APC era muy alta. La reducción de la avidez de la interacción célula T/APC utilizando dosis menores de APC (Figura 14, izquierda) o dosis menores de péptido QL9 (Figura 15, izquierda) aumentó la respuesta proliferativa el día 3. La reducción de la avidez de la interacción célula T/APC potenció la respuesta proliferativa temprana (día 3) pero redujo la respuesta tardía (día 5) y redujo también la producción de IL-2 (Figura 16, derecha). En la Figura 16, se comparan los resultados obtenidos utilizando células 2C CD8^{+} y 2C CD8^{-} los días 2, 3, 4 y 5.

Las observaciones se aplican a las células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM altamente inmunogénicas. Sin embargo, con las células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7 o L^{d}\cdotICAM menos inmunogénicas, las respuestas proliferativas frente al péptido QL9 requirieron altas dosis de péptido (Figura 13, Figura 15) y fueron crucialmente dependientes de la expresión de CD8 por las células sensibles (Figura 16). Estas respuestas con células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7 y L^{d}\cdotICAM alcanzaron un pico los días 3 ó 4 (en lugar del día 5) y fueron mucho menores que con células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM. Con dosis bajas de QL9, por ejemplo 1 nM (10^{-9} M), las respuestas proliferativas con células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7 y L^{d}\cdotICAM fueron completamente indetectables (< 100 cpm) (Figura 13). Esto estaba en marcado contraste con los resultados observados utilizando células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM, en que QL9 1 nM condujo a altas respuestas (> 10.000 cpm) (Figura 13). En contraposición con los resultados con dosis altas de péptido QL9 (10 \muM, Tabla 2), la interacción sinérgica entre B7 e ICAM para las respuestas proliferativas se hizo pronunciada a dosis bajas de péptido.

Como puede observarse, las células L^{d}\cdotB7\cdotICAM actúan como células presentadoras de antígeno extremadamente potentes para células 2C no tratadas. La elevación de la avidez de la interacción célula T/APC a un alto nivel inhibe la respuesta proliferativa temprana, pero potencia la respuesta tardía y potencia la producción de IL-2. Para los péptidos de alta afinidad tales como QL9, la sinergia entre B7 e ICAM es pronunciada a bajas dosis de antígeno.

Ejemplo 10 Producción de células T citotóxicas utilizando el sistema presentador de antígeno

Se produjeron células presentadoras de antígeno (APC) transfectando células de Drosophila como se describe en el ejemplo 3, y después se ensayó su capacidad de inducir actividad CTL. La actividad CTL se ensayó en dianas RMA.S-L^{d} marcadas con ^{51}Cr sensibilizadas con péptido QL9, sin péptido o con un péptido irrelevante (MCMV). Las células 2C CD8^{+} (5 x 10^{5}) se cultivaron con 2 x 10^{6} células de Drosophila transfectadas en un volumen de 2 ml en una placa de cultivo de 24 pocillos. Cai, Z. y J. Sprent (1994). Los péptidos estuvieron presentes durante el cultivo a una concentración de 10 mM. Después de 4 días, las células se agruparon y se ajustaron al número requerido. Para preparar las dianas, se marcaron células RMA-S.L^{d} con ^{51}Cr (100 mCi/1-2 x 10^{6} células) a 37ºC durante 90 minutos en presencia o ausencia de péptidos. Después de marcar, las células se lavaron concienzudamente y se resuspendieron en medio con o sin péptidos. La liberación específica de ^{51}Cr se calculó según un procedimiento establecido. Id.

Se muestra la capacidad de células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7, L^{d}\cdotB7\cdotICAM y L^{d}\cdotICAM de inducir la actividad CTL frente a péptido QL9 10 \muM en cultivos brutos en la Figura 17. Las células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM fuertemente inmunogénicas fueron eficaces para generar CTL específica de QL9 (Figura 17, centro). Significativamente, las células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7 fueron también eficaces para generar CTL frente a QL9 (Figura 17, izquierda). El descubrimiento sorprendente, sin embargo, fue que las células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotICAM fueron totalmente incapaces de estimular la generación de CTL (Figura 17, derecha). Este resultado (representativo de tres experimentos diferentes) fue inesperado, porque las células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotICAM no eran menos eficaces que las células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7 en la inducción de respuestas proliferativas frente a QL9 (Figuras 13 y 15). Los cultivos estimulados por L^{d}\cdotICAM en la Figura 17 contenían grandes números de blastocitos, y los rendimientos celulares totales fueron aproximadamente 3 veces mayores que el número de partida.

El descubrimiento sorprendente de que las células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotICAM eran totalmente incapaces de estimular la generación de CTL se aplicó a cultivos no suplementados con linfoquinas exógenas. Sin embargo, cuando se añadió IL-2 exógena a los cultivos, las células presentadoras de antígeno L^{d}-ICAM indujeron una fuerte actividad CTL frente a QL9 (Figura 18, derecha, 20 u/ml IL-2 exógena).

Ejemplo 11 Proliferación de células T normales inducidas por el sistema presentador de antígeno

Se produjeron células presentadoras de antígeno (APC) transfectando células de Drosophila como se describe en el Ejemplo 3 y después se ensayó su capacidad de inducir la proliferación en células T murinas normales (no transgénicas).

La capacidad de las células de Drosophila L^{d}\cdotB7\cdotICAM de inducr una fuerte respuesta primaria de células 2C TCR CD8^{+} transgénicas planteó la cuestión de si las células de Drosophila podrían actuar como células presentadoras de antígeno para células CD8^{+} normales (no transgénicas). Puesto que los ratones 2C estaban en un fondo B6 (H-2^{b}), se ensayó la respuesta de las células B6 CD8^{+} normales. Se cultivaron dosis graduadas de células CD8^{+} de ratones B6 normales con péptido QL9 10 \muM presentado por células presentadoras de antígeno de Drosophila L^{d}\cdot7\cdotICAM, concretamente una situación en la que se expuso un diverso repertorio de células T a un solo aloantígeno individual (L^{d} + QL9) pero a una alta concentración. Como se muestra en la Figura 19 (izquierda), la presentación de QL9 por células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM fue muy inmunogénica para células B8 CD8^{+} normales y condujo a respuestas proliferativas apreciables el día 3 (80.000 cpm) con altas dosis de células sensibles (1 x 10^{6}) en ausencia de citoquinas añadidas; las respuestas frente a un péptido no relacionado, MCMV, fueron mucho menores (aunque significativas) y no apareció respuesta en ausencia de péptido. Como se esperaba, la respuesta de células B6 CD8^{+} normales frente a QL9 más células presentadoras de antígeno L^{d}\cdotB7\cdotICAM fue sustancialmente menor que con células de bazo B10.D2 normales como células presentadoras de antígeno (en las que el aloestímulo se proporcionó mediante una multiplicidad de autopéptidos unidos a L^{d}, K^{d} y D^{d}, pero a baja concentración) (Figura 19, derecha. Obsérvese la diferencia entre las escalas del eje Y).

Ejemplo 12 Activación de células T citotóxicas utilizando moléculas de CMH de clase I recombinantes purificadas inmovilizadas y moléculas auxiliares

Excepto cuando se observa, las células, materiales y reactivos se prepararon como se describe en el ejemplo 4. Se adquirió el anticuerpo monoclonal CD28 anti-ratón biotinilado (clon 37.51) en Pharmingen (San Diego, CA). Este anticuerpo está también disponible en Caltag (South San Francisco, CA). Este anticuerpo, que se une a receptor coestimulatorio de CD28, un ligando de B7.1 y B7.2 sobre la superficie de células T, aumenta la proliferación de células T (Gross et al., J. Immunol. 149, 380-388, 1992). Se utilizó IL-2 como sobrenadante de concavalina A (concentración final 10%).

Se prepararon los sustratos como sigue: se añadieron 50 \mul de PBS que contenía 1 \mug/ml de neutravidina a cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos (nº de catálogo Corning 25860). Después de 2 horas a temperatura ambiente, los pocillos se lavaron 3 veces con PBS antes de incubación con moléculas biotiniladas. Se prepararon glóbulos rojos de ratón recubiertos con avidina como se describe para los glóbulos rojos de oveja recubiertos con avidina en el ejemplo 4. Las perlas de látex recubiertas con avidina se prepararon como se describe en el ejemplo 4.

La biotinilación de L^{d} recombinante se realizó como se describe en el ejemplo 4. Se inmovilizó L^{d} recombinante biotinilada sobre el sustrato junto con anticuerpo anti-CD28 biotinilado. Se incubaron glóbulos rojos o perlas de látex recubiertos con avidina con L^{d} biotinilada 0,2 mg/ml, anti-CD28 biotinilado 0,025 mg/ml o una mezcla de los mismos durante 30 minutos a temperatura ambiente, después se lavaron 3 veces con DMEM que contenía 10% de FCS y se utilizaron inmediatamente. Las placas de 96 pocillos recubiertas con avidina se incubaron con 50 \mul por pocillo de L^{d} biotinilada 2 \mug/ml, anti-CD28 0,25 \mug/ml o mezclas de los mismos durante 30 minutos a temperatura ambiente, después se lavaron 3 veces utilizando DMEM que contenía 10% de FCS y se utilizaron inmediatamente.

Se prepararon células T 2C+ como se describe en el ejemplo 4. Se prepararon células CD8^{+} a partir de ratones C57BL/6 a partir de nódulos linfáticos de estos ratones mediante vaciado magnético. Las células purificadas eran consistentemente positivas a un 90-92% para la expresión de CD8, evaluado por citofluorometría de flujo.

La activación de células T se realizó en placas de cultivo recubiertas con moléculas de L^{d} purificadas y anticuerpo anti-CD28. Se añadieron células T y péptido (0,02 M de concentración final) a placas de 96 pocillos recubiertas con L^{d} y/o anti-CD28 en un volumen final de 0,2 ml/pocillo, y se cultivaron durante el tiempo apropiado a 37ºC en atmósfera húmeda que contenía 5% de CO_{2}.

La activación de células T utilizando glóbulos rojos o perlas de látex recubiertas con moléculas de L^{d} purificadas y anticuerpo anti-CD28 se realizó en placas de cultivo no recubiertas. Se añadieron células T y péptido (0,02 mM) a cada pocillo, junto con 100.000 glóbulos rojos o perlas de látex. El volumen final fue de 0,2 ml. Las condiciones de cultivo fueron como se describe anteriormente.

Se ensayó la mitogénesis de células T mediante la incorporación de un pulso de 1 \muCi de timidina tritiada por pocillo por cultivos celulares por triplicado. Las células se recogieron 8 horas después y se determinó la incorporación de timidina mediante recuento de los filtros en un contador de centelleo.

Se incubaron células RMA.S (células diana) que expresaban L^{d} con cromo radiomarcado durante 90 minutos a 37ºC, se lavaron 3 veces y se distribuyeron en una placa con fondo en U de 96 pocillos (nº de cat. Costar 3799) (5.000-10.000 células por pocillo) en presencia del péptido apropiado a 0,01 mM. Se añadieron diversas cantidades de células T activadas (células efectoras) para alcanzar relaciones de efector/diana (relaciones E/T) en el intervalo entre 150 y 1. Después de 5 horas de incubación a 37ºC, se recogió 0,1 ml de sobrenadante de cada pocillo y se contó en un contador gamma. Se determinó el porcentaje de lisis mediante un procedimiento estándar (Coligan et al., Current Protocols in Immunology, sección 3.11, Wiley, Nueva York (1991)).

La L^{d} purificada inmovilizada y el anticuerpo anti-CD28 eran mitogénicos para células T 2C+. Cuando se utilizó el péptido QL9, se midió consistentemente una incorporación de timidina superior a 100.00 cpm por pocillo el día 3-5 de cultivo (Figura 20). Se obtuvo la incorporación máxima de timidina en ese mismo intervalo utilizando cualquiera de los tres procedimientos de activación (moléculas inmovilizadas sobre plástico, sobre glóbulos rojos o sobre perlas de látex). Cuando se inmovilizaron las moléculas de activación sobre plástico, la L^{d} sola inmovilizada sobre plástico indujo una mitogénesis transitoria (Figura 20, línea quebrada), mientras que la L^{d} más anticuerpo anti-CD28 indujeron un mitogénesis mayor y más sostenida (Figura 20, línea sólida). Se requirió anticuerpo anti-CD28 además de L^{d} para la inducción de cualquier mitogénesis en el modelo que utiliza glóbulos rojos. Sin embargo, el anticuerpo anti-CD28 solo no indujo ninguna mitogénesis.

Los complejos QL9-L^{d} se reconocen por el receptor de células T 2C con una alta afinidad. Los complejos de otros péptidos y L^{d} reconocidos por este receptor con una menor afinidad fueron capaces de activar células T 2C+; estos péptidos incluían péptidos p2Ca y SL9 (Figura 21). Sin embargo, fue necesario IL-2 añadida el día 2 de cultivo para observar mitogénesis utilizando estos péptidos. La activación fue específica de péptido, puesto que el péptido LCMV, un péptido de control que no es reconocido por el receptor de células T 2C, no indujo activación. La mitogénesis fue mensurable a partir de tan poco como 700 células T por pocillo (placa de 96 pocillos), demostrando que el procedimiento activaba un número muy pequeño de células T de manera específica de péptido.

Las células T 2C+ se mezclaron con las células CD8^{+} totales a partir de ratones C57BL/6 a una relación 1/99, y las células se cultivaron con L^{d} inmovilizada y anticuerpo anti-CD28 en presencia de péptido QL9. Se añadió IL-2 el día 2 del cultivo, y subsiguientemente cada día. Se observó la activación y proliferación celular, evidenciadas por la formación de aglomerados, la presencia de células aumentadas que progresivamente se extendían por el pocillo. El día 12 de cultivo, las células se recogieron y se evaluó el porcentaje de células que expresaban el receptor de celulas T 2C mediante tinción con el anticuerpo anticlonotípico 1B2 y análisis por citofluorometría de flujo: un 43% de las células cultivadas inicialmente en presencia del péptido QL9 fueron 2C-. (Figura 22), mientras que un 49% de las células expresaron 2C después de la estimulación con péptido p2Ca (Figura 23), y un 22% con el péptido SL9 (Figura 24). Esto muestra un enriquecimiento considerable (43, 49 y 22 veces) de las células T específicas después de 12 días de cultivo. Se observó el enriquecimiento incluso con SL9, un péptido que proporciona un complejo de baja afinidad con el receptor de células T 2C. Este procdimiento puede activar por tanto específicamente y enriquecer una pequeña subpoblación de células T específicas de antígeno de una mezcla heterogénea de células T.

Se cultivaron durante 5 días células T 2C+ activadas utilizando L^{d} y anticuerpo anti-CD28 en presencia de péptido QL9, despué se ensayó su capacidad citotóxica. Los resultados, mostrados en la Figura 25, demostraron que las moléculas de activación inmovilizadas inducían a las células a diferenciarse en células citotóxicas efectoras. La lisis era específica, puesto que se observó en presencia de péptido QL9 pero no en presencia de un péptido de control (LCMV). Las células T en reposo se activaron por tanto utilizando moléculas inmovilizadas para diferenciar las células T citotóxicas capaces de eliminar dianas específicamente.

Como puede observarse, las moléculas de CMH de clase I purificadas inmovilizadas y moléculas auxiliares pueden utilizarse para activar específicamente células T en reposo no tratadas a células T citotóxicas. Las moléculas de CMH de clase I y moléculas auxiliares son suficientes para la acivación; no es necesaria ninguna señal adicional originada por las células presentadoras de antígeno. Las moléculas de CMH de clase I y auxiliares inmovilizadas sobre sustratos, tales como placas de cultivo celular, proporcionan una herramienta apropiada para la activación de células T. Se ofrecen diversas ventajas por dichos sustratos recubiertos. Son fáciles de preparar y de manipular, pueden recubrirse con cantidades bien controladas de moléculas, asegurando condiciones de activación reproducibles.

Ejemplo 13 Activación de células T citotóxicas humanas

Se obtuvo una unidad de sangre humana (450 ml) recogida en heparina (10 \mu/ml) del General Clinical Research Center (GCRC) en Scripps Clinic, La Jolla, CA. La sangre se procesó en primer lugar en un gradiente de densidad Ficoll-Hypaque™ en una centrífuga cónica de 50 cc (Histopaque™ 1077, Sigma) según las instrucciones del fabricante. Una vez se obtuvo la linfa cuajada, la muestra se lavó con tampón 1 (D-PBS sin Ca^{++} ni Mg^{++}) y después tampón 2 (RPMI con 4% de suero fetal bovino (SFB)) y un lavado final en tampón 3 (D-PBS + 1% de seroalbúmina humana (HSA, 25% de buminato/Baxter-Hyland y 0,2% de citrato de sodio (p/v)).

Se contó la preparación de células mononucleares sanguíneas periféricas totales (PBMC) a partir de las células lavadas. Esta preparación se pasó después a través de un procedimiento de aislamiento MaxSep™ (Baxter), en el que las células CD8^{+} se seleccionaron por selección negativa. Se preparó un cóctel de mAb para células dirigidas a la eliminación (CD19-Pharmingen, CD4-Ortho-mune, CD-15 Pharmingen, CD56-Pharmingen, CD14-PRI) a 2 \mug/ml de células. El recuento de células PBMC totales se diluyó a 20 x 10^{6}/ml en tampón 3 y se añadieron los anticuerpos.

La mezcla (aproximadamente 40 ml) se agitó en un agitador rotatorio (4 rpm) a 4ºC, de modo que el tubo mezclara la muestra de arriba abajo, durante un total de 30 minutos. Después de la fase de sensibilización, las células se lavaron con tampón 3 y se resuspendieron en el mismo tampón con perlas Dynal™ magnéticas recubiertas con IgG de oveja anti-ratón (SAM) (Dynabeads™ M450, nº 110.02). La solución madre de perlas es habitualmente 4 x 10^{8} perlas/ml. La relación perla/célula diana final es 10:1.

Para determinar el volumen final de perlas para uso, se siguieron las fórmulas siguientes:

(Células totales sensibilizadas) x (% de población de células diana) = número de células diana teórico total.

Número de células diana teórico total x 10= perlas totales requeridas.

Perlas totales requeridas/concentración de perlas de la solución madre = volumen de perlas requerido,

El volumen final de la mezcla de células sensibilizadas:perlas fue de aproximadamente 50 ml. La mezcla se puso en un Fenwal™ Transfer Pack (nº 4R2001) de 150 ml, se añadió aire con una aguja y la mezcla se agitó en condiciones similares a las anteriores (30 minutos, 4ºC, 4 rpm, agitado de arriba a abajo). Al final del periodo de incubación, las células diana se eliminaron con un dispositivo de separación MaxSep™ según las especificaciones del fabricante. Las células separadas se transfirieron desde la bolsa y se contaron para determinar la recuperación. Se realizó un análisis FACS para determinar la pureza de la muestra.

Las células CD8^{+} separadas resultantes se estimularon con células presentadoras de antígeno de Drosophila (mosca) que se transfectaron, y mostraron que expresaban HLA A2.1, B7.1 y/o LFA-3 humanas. Las células de mosca se diluyeron a 10^{6}/ml en medio de Schneider con 10% de suero SFB. El día siguiente, se añadió CuSO_{4} a las células cultivadas, que se incubaron durante 24 horas a 27ºC y se recogieron. Las células recogidas se lavaron y suspendieron en medio Insect X-press con una concentración peptídica final de 100 \mug/ml y se incubaron durante 3 horas a 27ºC.

Los péptidos utilizados fueron RT de VIH (ILKEPVHGV) (SEC Nº ID 48), tirosinasa (YMNGTMSQV) (SEC Nº ID 49) y matriz de la gripe (GILGFVFTL) (SEC Nº ID 50).

El péptido de control derivaba del núcleo del virus de la hepatitis y tenía la secuencia FLPSDFFPSV (SEC Nº

\hbox{ID 51)}

.

Las células presentadoras de antígeno de mosca se añadieron a las células CD8^{+} a una relación de 1:10 (células APC:CD8^{+}). Las células se incubaron en pocillos de fondo plano (48 pocillos) durante cuatro días a 37ºC. El día 5, se añadieron IL-2 (10 \mu/ml) e IL-7 (10 \mu/ml) (Genzyme) con un cambio de medio. El día 11, se realizó un ensayo CTL.

Se utilizó JY, una línea de células B humanas transformadas con EBV que expresa HLA 2.1, B7 como célula diana en el ensayo de liberación de cromo. Vissereu, M.J.W. et al., J. Immunol., 154: 3991-3998 (1995). Se sembraron células JY a 3 x 10^{5} células/ml en RPMI con 10% de SFB, 24 horas antes del ensayo. Las células JY se contaron y se lavaron una vez en solución de lavado RPMI (4% de SFB Rehautin, 1% de HEPES, 0,025% de gentamicina en RPMI) para proporcionar 5 x 10^{6} células por muestra. El sedimento celular se resuspendió suavemente en 100 \mul de solución madre de ^{51}cromo (0,1 mCi, NEN) y se dispuso en un baño de agua a 37ºC con agitación cada 15 minutos. Se lavaron células JY marcadas cuatro veces durante 6 minutos cada vez a 1400 rpm con 10 ml de solución de lavado RPMI. Las células se ajustaron a 1 x 10^{5} células/ml en RPMI/10% de Hyclone. La eficacia del marcaje de las células diana se confirma por técnicas de contador gamma estándar.

Para la carga peptídica de células diana, se incubaron 2 ml de células JY marcadas (2 x 10^{5} células) con 10 \mug/ml de péptido durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se almacenaron las soluciones madre de péptido (1 mg/ml) a -70ºC. En una placa de fondo redondo de 96 pocillos, se combinaron 100 \mul de células efectoras y 100 \mul de células diana cargadas con péptido a relaciones de 84:1, 17:1 y 3,4:1 (efector:diana). Los controles para medir la liberación espontánea y la liberación máxima de ^{51}Cr se incluyeron por duplicado. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 6 horas.

Se añadieron células K562 a una concentración de 10^{7}/ml en RPMI con 10% de FCS a una relación de 20:1 (K562 no marcada:JY marcada). Esta línea celular eritroleucémica se utilizó para reducir la lisis celular de fondo de NK en el ensayo de liberación de cromo. Las placas se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos y se transfirieron 100 \mul de sobrenadante de cada muestra a tubos de recogida de 96 tubos. El análisis de la lisis celular se determina mediante técnicas de recuento gamma estándar (Gammacell™ 1000, Nordion).

\newpage

La actividad CTL producida activando células T CD8^{+} con células presentadoras de antígeno cargadas con péptido matriz de la gripe (SEC Nº ID 50) se muestra en la Figura 26. La exposición anterior al virus de la gripe indica que esta actividad CTL era una respuesta secundaria. Los puntos de datos son la media de valores de cultivos por triplicado. Las células presentadoras de antígeno que expresan A2.1, B7.1 e ICAM-1 fueron más eficaces que las células presentadoras de antígeno que expresan A2.1 y B7.1 o las células presentadoras de antígeno que expresan A2.1, B7.1 y LFA-3.

Los resultados de la activación de células T CD8^{+} con células presentadoras de antígeno cargadas con péptido RT de VIH (SEC Nº ID 48) se presentan en la Figura 27. Puesto que el análisis de la sangre de este paciente no había indicado ninguna exposición anterior a VIH, estos resultados indican que la actividad CTL estaba basada en una respuesta primaria. En este caso, sólo las células presentadoras de antígeno que expresan A2.1, B7.1 e ICAM-1 produjeron actividad CTL que fuera significativamente mayor que los niveles de control.

La Figura 28 muestra la actividad CTL de células T CD8^{+} humanas activadas con células presentadoras de antígeno cargadas con péptido tirosinasa (SEC Nº ID 49). La tirosinasa es una enzima de origen natural que se sobreexpresa en células tumorales de melanoma. De nuevo, las células presentadoras de antígeno que expresan las tres moléculas, ICAM-1 así como A2.1 y B7.1, fueron las más eficaces, especialmente a la relación de efector:diana más baja ensayada.

Estos resultados muestran que el sistema presentador de antígeno es capaz de producir actividad CTL eficaz en células T CD8^{+} humanas dirigidas hacia un péptido que deriva de una proteína endógena que está sobreexpresada en células tumorales. Esto demuestra también que esta estimulación in vitro de células T CD8^{+} utilizando tanto B7 como ICAM generará células T CD8^{+} citotóxicas incluso frente a péptidos que serían reconocidos por lo demás como propios. Esto es contrario al presente conocimiento de que dichos péptidos "propios" no podrían utilizarse para crear células T citotóxicas. Este procedimiento expande en gran medida el número de posibles antígenos específicos tumorales que pueden utilizarse para activar células T CD8^{+} frente al tumor.

Lo anterior se pretende que sea ilustrativo de la presente invención, pero no limitante.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE: Cai, Zeling

\hskip3,2cm

Sprent, Jonathan

\hskip3,2cm

Brunmark, Anders

\hskip3,2cm

Jackson, Michael

\hskip3,2cm

Peterson, Per A

\hskip3,2cm

Luxembourg, Alain

\hskip3,2cm

Leturcq, Didier Jean

\hskip3,2cm

Moriarty, Ann M.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SISTEMA PRESENTADOR DE ANTÍGENO Y PROCEDIMIENTOS PARA LA ACTIVACIÓN DE CÉLULAS T

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 51

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Olson & Hierl, Ltd.

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(B): CALLE: 20 North Wacker Drive, Suite 3600

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: Chicago

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(D): ESTADO: Illinois

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: Estados Unidos

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(F): CÓDIGO POSTAL: 60606

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(v): FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA

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(A): TIPO DE MEDIO: disquete

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(B): ORDENADOR: Compatible con PC IBM

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión 1.25

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 8 de marzo de 1996

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/400.338

\vskip0.333000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 8 de marzo de 1995

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Olson, ARNE M.

\vskip0.333000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 30.203

\vskip0.333000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: TSRI4711

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (312) 580-1180

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TELEFAX: (312) 580-1189

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 1:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCACCATGGC CGTCATGGCG CCC

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGTCACACTT TACAAGCTCT GAG

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCACCATGCT GGTCATGGCG CCC

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGACTCGATG TGAGAGACAC ATC

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCACCATGCG GGTCATGGCG CCC

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGTCAGGCTT TACAAGCGAT GAG

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCACCATGCG GGTAGATGCC CTC

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGTTACAAGC TGTGAGACTC AGA

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCACCATGGC GCCCCGAAGC CTC

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGTCACACTT TATTAGCTGT GAG

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCACCATGGC GCCCCGAACC CTC

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGTCACAATT TACAAGCCGA GAG

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 427 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 13:

3

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 740 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 14:

4

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCTTGGATCC AGATCTACCA TGTCTCGCTC CGTGGCCTTA GCTGTGCTCG CGCTACTCTC

\hfill

60

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGATCCGGAT GGTTACATGT CGCGATCCCA CTTAAC

\hfill

36

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGAGCCGTGA CTGACTGAG

\hfill

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCCTCGGCAC TGACTGACTC CTAG

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GATCCTTATT AGATCTCACC ATCACCATCA CCATTGAG

\hfill

38

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCGACTCAAT GGTGATGGTG ATGGTGAGAT CTAATAAG

\hfill

38

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3875 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 21:

5

6

60

7

70

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GATCCTTATT AGATCTTACC CATACGACGT CCCAGATTAC GCTCGATCTC ACCATCACCA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCACCATTGA G

\hfill

71

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCGACTCAAT GGTGATGGTG ATGGTGAGAT CGAGCGTAAT CTGGGACGTC GTATGGGTAA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GATCTAATAA G

\hfill

71

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3908 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 24:

8

9

90

10

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GATCCTTATT AGATCTCACC ATCACCATCA CCATTGTTGA G

\hfill

41

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCGACTCCAAC AATGGTGATG GTGATGGTGA GATCTAATAA G

\hfill

41

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3878 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 27:

11

12

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GATCCTTATT AGATCTGCTT GGCGCCATCC TCAATTTGGG GGTTGAG

\hfill

47

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCGACTCAAC CCCCAAATTG AGGATGGCGC CAAGCAGATC TAATAAG

\hfill

47

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3883 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 30:

14

15

150

16

160

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 879 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 31:

17

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 32:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 738 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 32:

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 33:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1002 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 33:

\vskip1.000000\baselineskip

19

190

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 34:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 751 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 34:

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 35:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1611 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 35:

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 36:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1452 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 36:

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 37:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 726 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 37:

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 38:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 657 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 38:

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 39:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr}

\sac{Ser Ser Asn Val Met Glu Glu Arg}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 40:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Leu Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 41:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Ile Gly Cys Arg His Ser Arg}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 42:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 43:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATATGGATCC TCACCATCTC AGGGTGAGGG GC

\hfill

32

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 44:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu Lys Ser}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 45:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 46:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Pro Phe Pro Phe Asp Leu}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 47:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Leu Ser Pro Phe Pro Phe Asp Leu}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 48:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 49:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 50:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 51:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: Aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): SIN SENTIDO: No

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val}

Claims

1. Fragmentos de células de una línea celular sintética presentadora de antígeno para uso con linfocitos de células T que comprenden:

a) un gen de cadena pesada de CMH de clase I ligado operativamente a un primer promotor y capaz de expresar una cadena pesada de CMH de clase I;

b) un gen de \beta-2 microglobulina ligado operativamente a un segundo promotor y capaz de expresar una \beta-2 microglobulina que, con la cadena pesada de CMH, forma moléculas de CMH; y

c) un gen de una molécula auxiliar ligado operativamente a un tercer promotor y capaz de expresar una molécula auxiliar que interactúa con una molécula sobre los linfocitos de células T, siendo la molécula auxiliar B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 o LFA-3;

no estando presente al menos uno de entre el gen de CMH, el gen de \beta-2 microglobulina y los genes de moléculas auxiliares en las células de las que deriva la línea celular, de tal modo que las moléculas de CMH se unen a un péptido, y las moléculas de CMH y las moléculas auxiliares se presentan sobre la superficie de la célula y los citados fragmentos tienen moléculas de CMH y moléculas auxiliares ligadas operativamente de tal modo que activan la población de linfocitos de células T.

2. Fragmentos de células de una línea celular poiquiloterma estable utilizados para estimular linfocitos de células T que comprenden:

a) un gen de CMH de clase I ligado opertivamente a un primer promotor y capaz de expresar una cadena pesada de CMH de clase I;

b) un gen de \beta-2 microglobulina ligado operativamente a un segundo promotor y capaz de expresar una \beta-2 microglobulina que forma moléculas CMH con la cadena pesada de CMH;

c) un gen de una molécula coestimulatoria ligado operativamente a un tercer promotor y capaz de expresar una molécula coestimulatoria que interactúa con una molécula sobre los linfocitos de células T, siendo la molécula coestimulatoria B7.1 o B7.2; y

d) un gen de una molécula de adhesión ligada operativamente a un cuarto promotor y capaz de expresar una molécula de adhesión que interacciona con una molécula de adhesión cooperativa sobre los linfocitos de células T, siendo la molécula de adhesión ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 o LFA-3; de tal modo que la célula es capaz de ensamblar la cadena pesada de CMH y la \beta-2 microglobulina en moléculas de CMH que se unen a un péptido, y de transportar las moléculas de CMH, las moléculas coestimulatorias y las moléculas de adhesión a la superficie de la célula, y los citados fragmentos tienen moléculas de CMH, moléculas coestimulatorias y moléculas de adhesión ligadas operativamente de tal modo que activan la población de linfocitos de células T.

3. Fragmentos de células de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en los que al menos uno de los promotores es inducible.

4. Fragmentos de células de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en los que el péptido se une a las moléculas de CMH en la célula.

5. El fragmento de célula de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que las moléculas de CMH están vacías.

6. El fragmento de célula de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el péptido está unido a las moléculas de CMH.

7. Un procedimiento de producción de fragmentos de célula a partir de una línea celular presentadora de antígeno sintética que comprende:

a) establecer un cultivo de células;

b) transfectar el cultivo con un gen de cadena pesada de CMH de Clase I expresable ligado operativamente a un primer promotor;

c) transfectar el cultivo con un gen de \beta-2 microglobulina expresable ligado operativamente a un segundo promotor;

d) transfectar el cultivo con un gen de molécula auxiliar expresable ligado operativamente a un tercer promotor, en el que la molécula auxiliar es B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 o LFA-3 y

\newpage

e) fragmentar las células después de que han presentado moléculas CMH y auxiliares sobre la superficie de la célula.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la línea celular deriva de una primera especie y el gen de cadena pesada de CMH es de una segunda especie.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la primera especie es un poiquilotermo y la segunda especie es un homeotermo.

10. El procedimiento de la reivindicación 7, que incluye la etapa de transfectar el cultivo con un gen de una segunda molécula auxiliar.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la primera molécula auxiliar es una molécula coestimulatoria y la segunda molécula auxiliar es una molécula de adhesión.

12. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que al menos uno de los promotores es inducible.

13. Un procedimiento de producción de fragmentos de células a partir de una línea celular presentadora de antígeno sintética que comprende:

(a) establecer un cultivo de células que carece de un gen de al menos uno de: cadena pesada de CMH de clase I,
\beta-2 microglobulina y molécula auxiliar, siendo la molécula auxiliar B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 o LFA-3; y

(b) transfectar el cultivo con un gen expresable para cada uno de los genes de (a) faltantes en el cultivo de células, estando el gen ligado operativamente a un promotor.

14. Un procedimiento de producción de una línea celular presentadora de antígeno sintética que activará específicamente una célula T por un péptido, que comprende:

a) establecer un cultivo de células;

b) transfectar el cultivo con un gen de cadena pesada de CMH de clase I expresable ligado operativamente a un promotor;

d) transfectar el cultivo con un gen de molécula auxiliar ligado operativamente a un tercer promotor; en el que la molécula auxiliar se selecciona de B7.1, ICAM-1 y una combinación de las mismas; y en el que el péptido tiene una afinidad de unión por moléculas de L^{d} solubles de al menos 4 x 10^{9} M^{-1}.

15. Un procedimiento de producción de una línea celular presentadora de antígeno sintética que activará específicamente una célula T por un péptido, que comprende:

a) establecer un cultivo de células que carece de un gen de al menos uno de cadena pesada de CMH de clase I, \beta-2 microglobulina y molécula coestimulatoria;

b) transfectar el cultivo con un gen expresable para cada uno de los genes de (a) faltantes en el cultivo de células, estando ligado operativamente el gen a un primer promotor; y

c) transfectar el cultivo con un gen de molécula de adhesión expresable; estando ligado el gen a un segundo promotor operable;

en el que la molécula coestimulatoria es B7.1 y la molécula de adhesión es ICAM-1, y en el que el péptido tiene una afinidad de unión por moléculas de L^{d} solubles de al menos 4 x 10^{6} M^{-1}.

16. Un procedimiento para activar células T CD8^{+} frente a un péptido seleccionado in vitro, comprendiendo el procedimiento:

a) proporcionar la línea celular de las reivindicaciones 14 ó 15;

b) cultivar la línea celular en condiciones tales que las moléculas de CMH se produzcan sobre la superficie de la línea celular y estén unidas al péptido seleccionado; y

c) poner en contacto las células cultivadas con las células T CD8^{+} frente al péptido seleccionado.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la línea celular es un poiquilotermo.

18. El procedimiento de la reivindicación 16, que comprende adicionalmente la etapa de separar las células T CD8^{+} activadas de la línea celular.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, que comprende adicionalmente la etapa de añadir las células T CD8^{+} activadas a un vehículo o excipiente aceptable para formar una suspensión.

20. Una matriz sintética presentadora de antígeno que comprende:

(a) un soporte no celular;

(b) una porción extracelular de una molécula de CMH capaz de unirse a un péptido seleccionado y ligada operativamente al soporte; y

(c) una molécula auxiliar ligada operativamente al soporte de tal modo que las porciones extracelulares de las moléculas de CMH y auxiliares están presentes en números suficientes para activar una población de linfocitos de células T frente al péptido cuando el péptido está unido a la porción extracelular de la molécula de CMH, siendo la molécula auxiliar B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 o LFA-3.

21. La matriz de la reivindicación 20, en la que el soporte es un fragmento de célula.

22, La matriz de la reivindicación 20, en la que la porción extracelular de la molécula de CMH es parte de una molécula de CMH completa.

23. La matriz de la reivindicación 20, en la que el soporte es un liposoma.

24. La matriz de la reivindicación 20, en la que el soporte es una superficie sólida.

25. La matriz de la reivindicación 20, en la que la porción extracelular de la molécula de CMH se liga a un epítopo que reacciona con un anticuerpo para ligar la porción al soporte.

26. La matriz de la reivindicación 20, en la que la porción extracelular de la molécula de CMH se liga a (His)6, que reacciona con níquel para ligar la porción al soporte.

27. La matriz de la reivindicación 20, en la que el soporte es un material poroso.

28. La matriz de la reivindicación 20, en la que la molécula auxiliar es una molécula coestimulatoria.

29. La matriz de la reivindicación 28, en la que la molécula coestimulatoria es al menos una porción de un anticuerpo anti-CD80.

30. La matriz de la reivindicación 20 que tiene dos moléculas auxiliares, siendo la primera molécula auxiliar una molécula coestimulatoria y siendo la segunda molécula auxiliar una molécula de adhesión.

31. La matriz de la reivindicación 20, en la que la porción extracelular de la molécula de CMH está vacía.

32. La matriz de la reivindicación 20, en la que el péptido está unido a la porción extracelular de la molécula de CMH.

33. Una matriz presentadora de antígeno sintética que comprende:

(a) un soporte;

(b) una porción extracelular de moléculas de CMH capaz de unirse a un péptido seleccionado, y estando ligada operativamente al soporte;

(c) moléculas B-7.1 o B-7.2 o una combinación de las mismas ligadas operativamente al soporte; y

(d) moléculas de ICAM-1 ligadas operativamente al soporte de tal modo que las moléculas se presentan en cantidad suficiente para activar una población de linfocitos de células T frente al péptido cuando el péptido está unido a la porción extracelular de la molécula de CMH.

34. Un procedimiento de producción de matriz sintética activadora de antígeno de linfocitos de células T que comprende:

a) establecer un primer cultivo de células;

b) transfectar el cultivo con un gen de cadena pesada de CMH de clase I expresable por al menos la porción extracelular de la cadena pesda ligado operativamente a un promotor;

d) recoger las porciones de molécula de CMH producidas;

e) establecer un segundo cultivo de células;

f) transfectar el segundo cultivo con un gen de molécula auxiliar expresable por al menos la porción extracelular de la molécula auxiliar ligado operativamente a un tercer promotor;

g) recoger las porciones de molécula auxiliar; y

h) ligar las porciones de molécula de CMH y porciones de moléculas auxiliares a un soporte en números suficientes para activar una población de linfocitos de células T frente a un péptido cuando el péptido se une a la porción extracelular de la molécula de CMH.

35. Un procedimiento in vitro para activar células T CD8^{+} frente un péptido seleccionado, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar la matriz de la reivindicación 28;

(b) poner en contacto las células de matriz con las células T CD8^{+}.

36. Uso de la matriz de la reivindicación 28 para la fabricación de un medicamento para activar células T CD8^{+} frente a un péptido seleccionado poniendo en contacto las células de matriz con las células T CD8^{+} anteriormente citadas.

37. Un procedimento para generar células T CD8^{+} citotóxicas frente a un péptido seleccionado, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar la matriz de la reivindicación 28, en la que el péptido está unido a la porción extracelular de la molécula de CMH;

(b) poner en contacto células T CD8^{+} no tratadas con la matriz in vivo.

38. La matriz de la reivindicación 31, en la que el soporte es una célula.