JP3926842B2 - 抗原提示系およびt−細胞の活性化方法 - Google Patents
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Description
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、1995年3月8日に出願され、同一の発明の名称を有する米国特許出願第08/400,338号の一部継続出願である。
技術分野
本発明は、特定の抗原性ペプチドに特異性を有する、T−細胞を活性化する物質および方法、種々の疾病状態の治療のためのイン・ビボでの活性化T−細胞の使用、およびこれらの使用に適した組成物に関する。
発明の背景
免疫系を活性化して感染症以外のタイプの病気を克服することが可能であろうと考えられていたので、免疫系が個体を感染症から救済しまたは保護する効率は常に科学者の興味をそそるものであった。かかる病気は、免疫抑制された患者における癌、AIDS、肝炎および感染性疾病を含む。抗体の使用を含めた種々の手法がこれらのタイプの病気で使用されてきたが、もしあったとしても細胞傷害性T−細胞を用いて成功した試みはほとんど記録されていない。理論的には、細胞傷害性T−細胞は、前記したタイプの病気を治療する好ましい手段であろう。しかしながら、特異的に細胞傷害性T−細胞を活性化する手法は利用しうるものがなかった。
現在知られている細胞傷害性T−細胞、またはCD8+細胞(すなわち、分子CD8を発現する細胞)はウイルス感染に対して主要な系列の防御を示す。CD8リンパ球はウイルスによって感染された細胞を特異的に認識し、それを殺す。かくして、ウイルス感染を排除せんとする失費は、感染細胞の随伴する喪失である。CD8+細胞の表面上のT−細胞受容体は外来性抗原を直接認識することができない。抗体とは対照的に、抗原がまず受容体に対して提示されなければならない。
抗原のCD8+T−細胞への提示には、クラスIタイプの主要組織適合性複合体(MHC)分子が関与する。主要組織適合性複合体(MHC)とは、免疫応答で重要な役割を演じる糖蛋白質の広範なファミリーをコードする大きな遺伝子座をいう。HLA(ヒト白血球抗原)複合体ともいうMHC遺伝子はヒトでは第6番染色体に位置する。MHC遺伝子によってコードされる分子は細胞表面に存在し、組織移植における「非自己」としての認識の大きな原因である。このように、膜結合MHC分子は、T−細胞による抗原の認識に密接に関与する。
MHC産物はI、IIおよびIIIという3つの主要なクラスにグループ分けされる。主としてヘルパー細胞として働くT−細胞はCD4を発現し、主としてクラスII分子と相互作用し、他方、ほとんどは細胞傷害性エフェクター細胞を表すCD8−発現細胞はクラスI分子と相互作用する。
クラスI分子は膜糖蛋白質であり、内因性蛋白質の細胞内分解から主として由来するペプチドに結合する能力を持つ。MHC分子と、ウイルス、細菌および他の外来性蛋白質に由来するペプチドとの複合体は、T−細胞の抗原応答性をトリガーするリガンドを含む。対照的に、MHC分子と通常の細胞産物に由来するペプチドとの複合体は、胸腺において、自己ペプチドを寛容するようにT−細胞を「教示する」役割を演じる。クラスI分子は全部の完全な抗原を提示せず、むしろ、それらは、それらの「ペプチド結合グローブ」に「ロードされた」そのペプチド断片を提示する。
長年の間、免疫学者は、ウイルス、レトロウイルスおよび癌細胞を標的化する特異的細胞傷害性細胞を生起させることを望んでいた。一般に、ウイルス病に対する標的化は生ワクチンまたは弱毒化ワクチンの接種によってイン・ビボで達成することができるが、レトロウイルスまたは癌細胞では同様の成功は達成されていない。さらに、ワクチン法は免疫抑制された患者では所望の効率を有していなかった。少なくとも1人の研究者が、IL−2、T−細胞成長因子と共にイン・ビトロでインキュベートすることによって、存在するCD8+細胞を「ブーストする(boosting)」という非特異的アプローチを採用した。しかしながら、(LAK細胞療法として知られている)このプロトコルは、すでに活性化されたCD8+細胞の増殖を可能とするに過ぎないであろう。ある1つの理由または別の理由で、免疫系は常に活性であるので、IL−2で刺激された細胞のほとんどは病気を克服する目的では重要でないであろう。事実、このタイプの療法が所望の特異性でもっていずれかの細胞を活性化するということはこれまで記載されていない。したがって、LAK細胞療法の利点はせいぜい議論を呼ぶもので、副作用が典型的にはかなりひどくて多くの研究は中断された。
ペプチドローディング法に関与すると思われるいくつかの新規な分子が最近同定されている。また、結合ペプチドをもたないクラスI分子(すなわち、「空の」分子)がある種の制限的状況下で産生され得ることも注目されている。しかしながら、これらの「空の」分子は、結合ペプチドをもたないクラスI分子が非常に熱不安定なので、しばしば細胞表面に到達できない。かくして、「空の」クラスI分子は細胞の内部から細胞表面へのその輸送の間に分解する。
ペプチドに結合したクラスI MHC分子の提示のみでは一般にCD8+細胞を活性化するのに効果的でない。天然では、CD8+細胞は、ペプチドが結合したクラスI MHC分子のみならず共刺激性分子(costimulatory molecule)を提示する抗原提示細胞によって活性化される。かかる共刺激性分子には、今日B7.1およびB7.2と命名された2つのサブグループであると認識されているB7が含まれる。また、インテグリンのごとき細胞接着分子がこのプロセスを助けることが見い出されている。
CD8+T−細胞がクラスI MHCおよび共刺激性分子によって結合されたペプチドを有する抗原−提示細胞と相互作用する場合、CD8+T−細胞は活性化されて増殖し、アームの付いたエフェクターT−細胞となる。一般に、参考として本明細書に含めるCurrent Biology Limited,London(1994)によって発行されたJanewayおよびTraversのImmunobiology参照のこと。
従って、必要とされているのは、T−細胞が増殖し、細胞傷害性となるようにT−細胞を活性化する手段である。もし活性化がイン・ビトロでなされ、活性化された細胞傷害性T−細胞を患者に再導入できれば有用であろう。また、もし活性化が、選択されたペプチドを提示するのみならず活性化の有効性を増大させる他の共刺激性因子を提示する細胞のごとき物質からなる合成抗原−提示マトリックスによってなされ得るならば望ましいであろう。
また、そのペプチドを提示する細胞に対して細胞傷害性である実質的にCD8+細胞のみが活性されるようにペプチドを選択するのが可能であれば有利であろう。
発明の概要本
発明は、ペプチドと複合体化されたMHC分子、およびT−細胞の活性化を助けるT細胞援助分子(assisting molecule)を提示する合成抗原−提示系に関する。
1の実施態様において、該系は、支持体および該支持体に作動可能に結合した選択ペプチドに結合できるクラスI MHC分子の少なくとも細胞外部分を有する合成抗原−提示マトリックスに関する。また、該マトリックスは該支持体に作動可能に結合した援助分子を含む。MHCおよび援助分子は、ペプチドがMHC分子の細胞外部分に結合した場合に該ペプチドに対するT−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数存在させる。
援助分子と共にMHC分子またはMHC分子の一部を共に有する抗原−提示マトリックスは、ペプチドに対してT−細胞リンパ球を活性化する際に相乗的反応を提供することが判明した。援助分子の例はB7.1およびB7.2のごとき共刺激性分子、またはICAM−1およびLFA−3のごとき接着分子である。かかる共刺激性分子の細胞外部分も使用できる。もう1つのタイプの共刺激性分子は、抗−CD28抗体またはその機能性部分、例えばFab部分のごときCD28分子と反応するものである。
特に効果的な相乗的反応は、ペプチドと結合したMHC分子、共刺激性分子、および接着分子を有する抗原−提示マトリックスに起因する。特に、細胞傷害性T−細胞活性の高度に効果的な相乗的作用はB7.1およびICAM−1の組合せに依拠する。
マトリックスに使用する支持体はいくつかの異なる形態を採り得る。支持体についての例は金属またはプラスチックのごとき個体支持体、樹脂または修飾されたセルロースカラムのごとき多孔性物質、マイクロビーズ、マイクロタイタープレート、赤血球細胞およびリポソームを含む。
別のタイプの支持体は、細胞膜断片のごとき細胞断片、または完全細胞である。この実施態様において、マトリックスは、実際には、MHC分子および援助分子を細胞表面に提示して抗原−提示細胞(APC)を生成するようにトランスフェクトされた細胞である。これは、第1のプロモーターに作動可能に連結したMHC重鎖をコードする少なくとも1つの発現可能クラスI MHCヌクレオチド配列、好ましくはcDNA配列、および第2のプロモーターに作動可能に連結した発現可能β−2ミクログロブリンヌクレオチド配列、を含有する細胞系を産生することによってなされる。MHC重鎖およびβ−2ミクログロブリンは一緒に会合してペプチドに結合するMHC分子を形成する。MHC蛋白質は抗原性ペプチドと結合し、それを細胞の表面に提示する。また、該細胞は第3のプロモーターに作動可能に連結した援助分子のヌクレオチド配列についての遺伝子を含む。また、援助分子も細胞表面に提示される。これらの分子は、ペプチドが複合体に結合した場合に、該ペプチドに対してT−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数にて細胞の表面に提示される。細胞の表面または炭水化物部分のごとき細胞断片上の他の分子はT−細胞に対していくらかの共刺激も付与する。
該細胞系は、少なくとも1つの前記遺伝子が、該細胞系が由来する細胞に天然では存在しない点で合成的である。MHC分子は熱不安定であるので変温性細胞系を用いるのが好ましい。ある範囲の種がこの目的で有用である。例えば、参考として本明細書に取り込む、この使用のための多数の種を議論するPetersenらに対する米国特許第5,314,813号参照のこと。真核生物細胞特に昆虫細胞を使用するのが好ましい。
1の実施態様において、少なくとも2つの援助分子(1つは共刺激性分子であり、他は接着分子である)を有するのが特に好ましい。この組合せは相乗効果を有し、組み合わせた個々の分子の各々よりも大きなT−細胞活性化を与えることが判明した。また、誘導可能なプロモーターの制御下にある少なくとも1つのトランスフェクトされた遺伝子を有するのが有利であって好ましいことも判明した。
本発明を用い、MHC分子を産生しつつペプチドを細胞に導入し、MHC分子が依然細胞内にありつつそれに該ペプチドを結合させることが可能である。あるいは、MHC分子を細胞表面に空の分子として発現させ、該分子が細胞表面で発現された後にペプチドを細胞に導入することができる。この後者の手法において、変温性細胞の使用が特に有利である。何故ならば、空のMHC分子(まだ複合体化していないかペプチドと結合していないもの)は熱不安定だからである。
クラスI MHC分子はDrosophila melanogaster(果実ハエ)細胞のごとき昆虫細胞で発現された。Drosophilaは哺乳動物免疫系の全ての成分を有しないので、ペプチドローディング機構に関与する種々の蛋白質をかかる細胞に存在させないべきである。ペプチドローディング機構の欠如はクラスI分子が細胞表面で空の分子として発現されるのを可能とする。
Drosophila系のごとき昆虫細胞の使用のもう1つの利点は、Drosophila細胞が37℃よりもむしろ28℃を好むことである。この事実は、空のクラスI MHC分子が熱不安定であって37℃で崩壊する傾向にあるので非常に重要である。クラスI分子に結合できるペプチドと共にクラスI−発現Drosophila細胞をインキュベートすることによって、実質的に各クラスI分子が1つの同一のペプチドを含有するようにすることが可能である。従って、クラスI分子が多くの異なるタイプのペプチドを含有し、そのほとんどが自分自身の無害細胞蛋白質に由来する場合、細胞は哺乳動物細胞とは非常に異なる。
また、本発明は、イン・ビトロで活性化されたCD8+細胞を生産する方法に関する。1つの方法は、イン・ビトロで、CD8+細胞を前記した抗原−提示マトリックスの1つと、CD8+細胞を抗原特異的に活性化するのに十分な時間接触させることよりなる。該方法は、さらに、(1)活性化CD8+細胞を抗原−提示マトリックスから分離し;(2)活性化CD8+細胞を許容される担体または賦形剤に懸濁させ;次いで、(3)該懸濁液を治療を必要とする個体に投与することよりなることができる。該抗原は天然または未分解蛋白質もしくはポリペプチドよりなることができるか、あるいはそれらは、ヒト・クラスI MHC分子とのインキュベーションに先立ってペプチド断片に切断された抗原性ポリペプチドよりなることができる。
別の変形において、本発明は、患者において疾患を治療し、ヒト患者において標的細胞を特異的に殺す方法に関する。該方法は、(1)患者から休止または天然CD8+細胞を含有する流体試料を得、(2)イン・ビトロで、CD8+細胞を抗原−提示マトリックスと、CD8+細胞を抗原−特異的に活性化するのに十分な時間接触させ;次いで、(3)活性化CD8+細胞を患者に投与することよりなる。例えば、腫瘍特異的ペプチドの使用は、細胞傷害性活性化CD8+T−細胞を生産することによって、腫瘍関連病の治療を可能とする。また、本発明は、適当な懸濁液中の抗原−提示マトリックスを投与することによって医療疾患を治療する方法に関する。種々の実施態様において、該疾患は癌、腫瘍、新形成物(neoplasia)、ウイルスまたはレトロウイルス感染、自己免疫または自己免疫型疾患を含み得る。1の実施態様において、マトリックスを投与する方法は静脈内注射を包含する。
【図面の簡単な説明】
図1−図3は、発現プラスミドpRmHa−2およびpRmHa−3を示す図である。図1において、pRmHa−2構築を示す;図2において、pRmHa−3の構築を示す;および図3において、pRmHa−3ベクターを示し、制限、ポリリンカー、プロモーターおよびポリアデニル化、ならびにヌクレオチド配列を発現のために挿入できる部位を示す。
図4および5は、HIVペプチドによるDrosophila細胞の表面に発現されたHLA B27およびHLA A2.1のペプチド−誘導熱安定化を示す。各細胞集団の平均蛍光をインキュベーション条件に対してプロットして示す。
図6は、昆虫細胞が抗原をプロセスし、それをクラスI分子にロード(load)できるか否か、および後者が内因的にまたは外因的に由来する抗原をT−細胞に提示できるか否かを判断するために設計した実験からのデータを示す。Kb/β2でトランスフェクトされたSchneider 2(SC2)または3T3細胞を等張(Iso)または低張(Hyp)媒体中、オボアルブミン蛋白質(OvPro)またはオボアルブミンペプチド、OVA24(OvPep)と共にインキュベートした。(マウス細胞系BALB/3T3は受託番号CCL 163下でATCCから入手可能である)。処理の後、細胞をT−細胞ハイブリドーマB3/CD8と共に培養した。B3/CD8は、B3(Carboneら,J.Exp.Med.169:603−12(1989)、H−2KbクラスI分子によって提示されたオボアルブミンペプチド253−276に特異的な細胞傷害性T−細胞と、CD8担持IL−2分泌細胞系との間のT−細胞ハイブリドーマである。抗原刺激に際して、B3/CD8は、IL−2−依存性細胞系CTLLへの3Hチミジン取り込みによって測定されるIL−2を産生する(Gillisら,J.Immunol.120:2027(1978))。かくして、産生されたIL−2の量を測定することによって、T−細胞認識についてアッセイすることができる。共培養からの上清を、IL−2−依存性細胞系CTLL(ATCC番号TIB 214)による3Hチミジン取り込みによって分析した。取り込まれた3Hチミジンの量を初期細胞処理に対してプロットする。
図7は、本発明による、トランスフェクトされたDrosophila(ハエ)細胞の表面でのB7.1、ICAM−1およびMHCの発現を示す。
図8は、赤血球細胞に結合した組換えLdマウスMHCを用いる蛍光−活性化細胞選別(sorter)実験の結果を示すグラフである。
図9は、赤血球細胞に結合した組換えKbマウスMHCを用いる蛍光−活性化細胞選別実験の結果を示すグラフである。
図10は、標識抗体の使用による組換えKbのマイクロタイタープレートへの結合を示すグラフである。
図11は、トランスフェクトされたDrosophila細胞で刺激されたCD8+2C細胞上でのCD69およびCD25の発現を示す蛍光−活性化細胞選別実験からの結果を示す一連のグラフである。
図12は、LdのみでトランスフェクトされたDrosophila細胞によって提示されたペプチドによって誘導されたCD8+2C細胞のIL−2−依存性増殖応答を示す一対の棒グラフである。
図13は、トランスフェクトされたDrosophila細胞によって提示されたペプチドによって誘導されたCD8+2C細胞の第3日目の増殖応答に対するペプチド濃度の影響を示すグラフである。
図14は、トランスフェクトされたDrosophila細胞によって提示されたペプチドにより誘導されたCD8+2C細胞の第3日目の増殖応答およびIL−2産生に対する抗原−提示細胞用量の影響を示す一対のグラフである。
図15は、Ld.B7、Ld.ICAMおよびLd.B7.ICAMでトランスフェクトされたDrosophila細胞により誘導されたCD8+2C細胞の増殖応答に対するペプチド濃度の影響を示す一連りグラフである。
図16は、Ld、Ld.B7、Ld.ICAMおよびLd.B7.ICAM+QL9ペプチドでトランスフェクトされたDrosophila細胞により誘導されたCD8+およびCD8+2C細胞の増殖応答の動力学を示す一連のグラフである。
図17は、外因性サイトカインの不在下、Ld.B7、Ld.B7.ICAMまたはLd.ICAM抗原−提示細胞+QL9ペプチド(10μM)でトランスフェクトされたDrosophila細胞により刺激されたCD8+2C細胞のCTL活性を示す一連のグラフである。
図18は、外因性IL−2(20u/ml)の不在下(左)または存在下(右)、Ld.ICAM抗原−提示細胞+QL9ペプチド(10μM)でトランスフェクトされたDrosophila細胞により刺激されたCD8+2C細胞のCTL活性を示す一対のグラフである。
図19は、トランスフェクトされたDrosophila細胞によって提示されたペプチドに対する正常(非−トランスジェニック)CD8+T−細胞の増殖応答(左側パネル)および外因性サイトカインの添加なくして、3日間、ペプチドの不在下で5×105 B10.D2(Ld)脾臓細胞(2000cGy)と共に培養したN B6および2C B6 CD8+細胞の等級分けした用量によって誘導された応答(右側パネル)を示す一対のグラフである。
図20は、ペプチドQL9で固定化された分子で被覆したプレートにおいて培養した精製2C+T−細胞(ウェル当たり50,000細胞)の刺激された分裂促進を示すグラフである(実線=Ldおよび抗−CD28抗体、破線=Ldのみ)。
図21は、Ldおよび抗−CD28抗体で被覆した96−ウェルプレートにおいて培養した、種々の示したペプチドでの、培養5日目における精製2C+T−細胞の刺激された分裂促進を示す棒グラフである(ハッチングを施した棒=IL−2無し、黒色棒=IL−2添加)。
図22は、Ldおよび抗−CD28抗体で被覆したプレート中での12日間の培養後に回収し、ペプチドQL9に暴露し、2C T−細胞受容体特異的抗体1B2を用いて染色した細胞のフローサイトメトリー分析の結果のグラフ表示である(M2=陽性染色細胞、M1=陰性染色細胞)。
図23は、Ldおよび抗−CD28抗体で被覆したプレート中での12日間の培養後に回収し、ペプチドp2Caに暴露し、2C T−細胞受容体特異的抗体1B2を用いて染色した細胞のフローサイトメトリー分析の結果のグラフ表示である(M2=陽性染色細胞、M1=陰性染色細胞)。
図24は、Ldおよび抗−CD28抗体で被覆したプレート中での12日間の培養後に回収し、ペプチドSL9に暴露し、2C T−細胞受容体特異的抗体1B2を用いて染色した細胞のフローサイトメトリー分析の結果のグラフ表示である(M2=陽性染色細胞、M1=陰性染色細胞)。
図25は、活性化されたT−細胞による標的細胞の細胞溶解を示すグラフである(実線=ペプチドQL9、破線=対照ペプチドLCMV)。
図26は、インフルエンザマトリックスペプチドをロードした抗原−提示細胞でのヒトCD8+T−細胞の活性化に起因した細胞傷害性溶解のグラフ表示である。
図27は、HIV−RTペプチドをロードした抗原−提示細胞でのヒトCD8+T−細胞の活性化に起因した細胞傷害性溶解のグラフ表示である。
図28は、チロシナーゼペプチドをロードした抗原−提示細胞でのヒトCD8+T−細胞の活性化に起因した細胞傷害性溶解のグラフ表示である。
発明の詳細な説明
本発明は、T−細胞リンパ球を活性化するのに用いることができる合成抗原−提示系に関する。活性化されたCD8+T−細胞は増殖し、サイトカインを産生し、細胞傷害性となるか、あるいはこれらの結果の組合せとなる。1つの好ましい実施態様において、該系は細胞傷害性CD8+細胞を活性化し、これは次いで増殖し、次いで活性化されて標的細胞を探し、それを破壊する。本発明を用いて、イン・ビトロでT−細胞を活性化し、次いで活性化されたT−細胞を、元来それが由来する患者に戻すことができるか、あるいはT−細胞のイン・ビボ活性化に用いることができる。
本発明の合成抗原−提示系は2つの主要な成分を有する。最初の成分は、選択されたペプチドに結合できるクラスI MHC分子の少なくとも細胞外部分である。第2の主要成分はT−細胞の活性化を助ける援助分子である。各場合において、より大きい分子の細胞外部分を用いることができるが、ある具体例では、分子全体を用いる。
説明を容易にするため、一般にMHC分子について記載するが、MHC分子の細胞外部分を用いることもできることが理解される。本発明で必要なMHC分子の部分は選択されたペプチドに結合し、T−細胞にペプチドを提示する部分である。
ペプチドは、実施すべき処理に応じて、適当なT−細胞を活性化するように選択される。例えば、特定の癌の治療において、活性化されたT−細胞と反応する癌細胞の表面に、ある抗原性ペプチドが提示される。かくして、次いで、癌細胞と結合し、それを破壊する適当なT−細胞を活性化するように選択されたペプチドを用いるのが適当である。
本発明は、MHC分子と既に複合体化されたペプチドでもって、MHC分子が細胞により産生され、あるいはMHC分子が、それらで複合体化されたペプチドをまだ有しない空のMHC分子を産生させることができる。この後者の具体例は特に有用である。というのは、それはペプチドが、MHC分子が調製された後に選択されるのを可能とするからである。
クラスI MHC分子は時々アルファ鎖と呼ばれる重鎖、およびβ−2ミクログロブリンを包含する。ここに議論するごとく、クラスI MHC分子の細胞外部分はβ−2ミクログロブリンと共にMHC重鎖の細胞外部分よりなる。
支持体に結合させるべきMHCの細胞外部分を調製することにおいて、可溶性分子を後記するごとく調製する。これらの分子は一般にMHC分子中に膜貫通および細胞質ドメインを欠く。
援助分子は、それがペプチド/MHC分子複合体と共に提示された場合にT−細胞の活性化を容易とする。本発明は援助分子の2つの主要なカテゴリーを含む。第一のカテゴリーは(従前B7として知られ、またCD80としても知られている)B7.1およびT−細胞上のCD28に結合する(CD86としても知られている)B7.2のごとき共刺激性分子よりなる。他の共刺激性分子は抗−CD28抗体またはかかる抗体の機能的部分、例えばCD28に結合するFab部分である。
本発明の援助分子の他の主要なカテゴリーは接着分子である。これらは、ICAM−1、ICAM−2、ICAM−3およびLFA−3を含めた種々のICAM分子を含む。結合で用いるMHC分子に結合したペプチドと、これらの援助分子のうちの1つとの組合せは、従来見られなかった程度までT−細胞を活性化する。
共刺激性分子および接着分子双方と組み合わせたペプチド−結合MHC分子を用いることによって、より大きな相乗的反応さえ達成された。これは細胞傷害性CD8+細胞を生産するにおいて特に効果的であることが判明した。
本発明によると、MHC分子および援助分子が、ペプチドがMHC分子の細胞外部分に結合した場合に該ペプチドに対してT−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数にて存在するように、MHC分子および援助分子を支持体に作動可能に結合させる。該ペプチドはMHC分子が支持体に結合される前または後にMHC分子に結合させることができる。
支持体は多くの異なる形態を採り得る。それはプラスチックまたは金属材料のごとき固体支持体であり得、それは分離カラムで通常使用されるごとき多孔性材料であり得、それはリポソームまたは赤血球細胞であり得、あるいはそれは細胞または細胞断片でさえあり得る。後記にてより詳細に議論するごとく、細胞が支持体として働く場合、MHCおよび援助分子は細胞によって産生され得る。次いで、MHC分子は、少なくとも膜貫通ドメイン、もしなければMHCの可溶性形態で存在しないであろう細胞質ドメイン、によって細胞に結合される。
MHC分子および援助分子の細胞外部分は、支持体上に固定化された抗体に反応するエピトープを供することによって支持体に結合できる。加えて、MHCまたは援助分子は、支持体の部分を形成することにおいてニッケルと反応する(His)6と共にまたはそれに結合して産生され得る。MHC分子を支持体に固定化するまたは結合する他の手段は当該分野でよく知られている。
前記で議論したごとく、支持体は細胞膜または細胞全体であり得る。かかる場合、T−細胞リンパ球で用いる合成抗原−提示細胞系となるように真核生物細胞系を修飾する。説明を容易にするため、抗原−提示細胞(APC)を刺激体細胞(stimulatorcells)とも呼ぶ。空のMHC分子は熱不安定である故に、培養細胞は変温性であるのが好ましく、種々の細胞系を後記にて詳細に議論する。
細胞の培養をまず確立する。次いで、培養を、プロモーターに作動可能に連結した発現可能クラスI MHC重鎖遺伝子でトランスフェクトする。遺伝子は、それがクラスI MHC重鎖を発現できるように選択する。また、細胞系を、第2のプロモーターに作動可能に連結した発現可能β−2ミクログロブリン遺伝子でトランスフェクトする。遺伝子は、それがMHC重鎖と共にMHC分子を形成するβ−2ミクログロブリンを発現できるように選択する。後記にて詳細に議論するごとく固体支持体等と共に使用されるMHC分子の可溶性細胞外部分の場合、トランケート型MHC重鎖遺伝子を用いる。
また、培養を、第3のプロモーターに作動可能に連結された発現可能援助分子遺伝子でトランスフェクトする。援助分子遺伝子は、T−細胞リンパ球上の分子と相互作用する援助分子として発現され得る。後記するごとく、各これらの遺伝子は種々の方法を用いてトランスフェクトできるが、好ましい方法は2以上のプラスミドを用いることである。
トランスフェクトされた細胞系は導入されるべき遺伝子のうちの少なくとも1つを欠くので、それを選択する。昆虫細胞は、それが変温性であるのみならずこれらの遺伝子、およびペプチドに結合したMHC分子を産生するメカニズム、を欠くので有利である。これは、ペプチド−結合MHC分子の産生、および空のMHC分子の産生におけるより大きな制御を可能とする。MHC重鎖は、好ましくは、異なる種、より好ましくは哺乳動物のような恒温動物、最適にはヒトからのものである。
好ましい細胞系は、MHC重鎖の発現を制御するように誘導可能な第1のプロモーターを有する安定な変温性細胞系である。細胞が空のMHC分子を組み立て、それらをペプチドが所望ならば選択されるように細胞表面上に提示するのが好ましい。
得られたMHC分子はペプチドに結合し、ペプチドがMHC分子に結合した場合に該ペプチドに対してT−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数にて細胞表面上の援助分子と共に存在させる。
さらなる実施態様において、第2の援助分子遺伝子も培養細胞にトランスフェクトする。この場合、第1の援助分子遺伝子は共刺激性分子の代わりになり得、第2の援助分子遺伝子は接着分子の代わりになり得る。
少なくとも1つの遺伝子、特にMHC重鎖は誘導性プロモーターに連結されているのが好ましい。これは、MHC分子が、注目するペプチドが利用可能であって、産生されたMHC分子と反応するように培養中に提示された場合にのみ産生されるようにMHC分子の産生を制御することを可能とする。これは望まないMHC分子/ペプチド複合体を最小化する。
細胞系が既に1以上の所望の分子を産生する場合、細胞で欠失する遺伝子の代わりに発現可能遺伝子で培養をトランスフェクトすることが必要なだけである。例えば、もし細胞がそれらの表面上にMHC分子を既に提示していれば、援助分子に代えて発現可能遺伝子で培養をトランスフェクトすることのみ必要である。
ペプチドは、細胞がMHC分子を産生しつつある時点で培養細胞に導入することができる。浸透圧ショックのごとき方法を通じて、ペプチドを細胞に導入し、産生されたMHC分子に結合させることができる。別法として、特に変温性細胞系の場合、MHC分子を細胞表面上に空で提示することもできる。次いで、ペプチドを培養に添加し、所望のMHC分子に結合することができる。
細胞はその表面にMHCおよび援助分子を有するものとして産生された後、それらを凍結乾燥し、細胞の断片を用いてT−細胞リンパ球の集団を活性化することができる。
トランスフェクトされた培養細胞を用いて、MHC分子および援助分子の細胞外部分を産生することができる。固体支持体のごとき支持体と結合させた細胞外部分の使用は、産生のある利点を有する。生細胞を用いて合成抗原−提示細胞を提供する場合、少なくとも3種の遺伝子、すなわちMHC分子を産生するための2つの遺伝子および援助分子のための1つの遺伝子が細胞に導入されなければならない。しばしば、抗生物質耐性のためのごとき付加的遺伝子もトランスフェクトされる。
固体支持体系を使用すべき場合、1の細胞系は、もう1つの細胞系が援助分子の細胞外部分を産生しつつMHC分子の細胞外部分を産生できる。次いで、MHC分子部分および援助分子部分をそれらの各培養から収穫することができる。次いで、該分子を、ペプチドがMHC分子の細胞外部分に結合した場合に該ペプチドに対してT−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数で適当な支持体に結合させる。産生の観点より、2つの異なる培養を用いることができるが、同一培養を用いることも可能である。しかしながら、該培養は援助分子の細胞外部分のためのさらなる遺伝子でトランスフェクトされる必要がある。
この実施態様のさらなる変形は、発現可能な第2の援助分子遺伝子でトランスフェクトされた第3の培養細胞を提供することである。この例においては、第2の培養細胞は共刺激性分子の細胞外部分を産生し、一方、第3の培養細胞は接着分子の細胞外部分を産生する。接着分子部分を収穫し、支持体に結合させる。
また、本発明は、選択されたペプチドに対してCD8+T−細胞を活性化する方法に関する。該方法はそれらの細胞表面上にペプチドを結合するMHC分子および援助分子を提示する細胞系を提供することに関する。天然CD8+T−細胞は、治療すべき患者から取り出すことによって得ることができる。次いで、培養細胞をCD8+T−細胞リンパ球を活性化するのに十分な時間、CD8+T−細胞と接触させ、その結果、T−細胞が増殖し、形質転換してアーム付きのエフェクター細胞となる。
次いで、活性化されたCD8+T−細胞を細胞系から分離し、許容される担体中に懸濁し、患者に投与することができる。別法はCD8+細胞を活性化するための合成抗原−提示マトリックスの使用を含む。
ヒト遺伝子を用い、従って、ヒト分子アナログが産生されるのが好ましい。先行米国特許第5,314,813号に示されているごとく、マウス系はT−細胞活性化の作動をテストする特に有用なモデルを提供し、ヒト系のためのプロセスの適用可能性を示す。また、Sykulevら,Immunity 1:15−22(1994)参照のこと。
1.ヒト・クラスI MHC分子
クラスI MHC分子は重鎖およびβ−ミクログロブリン蛋白質よりなる。本発明のヒト・クラスI MHC重鎖はHLA−A、HLA−B、HLA−C、HLA−E、HLA−FおよびHLA−Gよりなる群から、より好ましくはHLA−A、HLA−BおよびHLA−Cよりなる群から選択される。重鎖は可溶性または不溶性いずれの形態にても有用である。可溶性(「sol」)形態において、停止コドンを、膜貫通ドメインに先行させて選択されたHLA分子をコードする核酸配列に入れる。
適当な変異体を有する公知の確立された細胞系、例えば、形質転換細胞系JY、BM92、WIN、MOCおよびMGからヒト・クラスI MHC重鎖をコードするヌクレオチド配列を単離することが可能であるが、適当なプライマーを用い、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)を介して遺伝子の部分からヌクレオチド配列を合成するのがより現実的である。この方法は、全長HLA cDNAをクローンするのに首尾よく用いられており;例えば、HLA−A25、HLA−A2、HLA−B7、HLA−B57、HLA−B51、およびHLA−B37についての配列は各々受託番号M32321、M32322、M32317、M32318、M32319およびM32320の下でGenBankデータベースに寄託されている。コンセンサス配列を含めた公知の部分的かつ推定的HLAアミノ酸および核酸配列は公表されており(例えば、ZemmourおよびParham、Immunogenetics 33:310−320(1991)参照)、HLA変異体を発現する細胞系は公知であって、同様に一般に入手可能であり、多くはAmerican Type Culture Collection(「ATCC」)から入手可能である。従って、PCRを用い、ヒト・クラスI MHCをコードするヌクレオチド配列を合成し、次いで、これをベクターに作動可能に連結させ、これを用いて適当な細胞を形質転換し、それで発現させることができる。
本発明のクラスI MHC重鎖、β−2ミクログロブリン蛋白質および助力分子(assisting molecules)を産生する特に好ましい方法は、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)でプライマーとして予め選択されたオリゴヌクレオチドを使用してここに記載するごとくPCR反応産物を形成させることに依拠する。遺伝子調製は、典型的には、プライマー伸長、好ましくはポリメラーゼ鎖反応(PCR)フォーマットにおけるプライマー伸長によって達成される。
もし遺伝子を(PCR)増幅によって産生させるべきならば、2種のプライマー、すなわちPCRプライマー対を増幅すべき核酸の各暗号鎖用に用いなければならない。(簡単のために、例示的HLA重鎖変異体配列の合成を議論するが、記載するPCR増幅方法はβ−2ミクログロブリン、共刺激性分子、接着分子、およびその完全な配列が現在知られていないものを含めた全てのHLA変異体の合成に同等に適用されることをはっきりと理解すべきである。)
第1のプライマーはアンチセンス(マイナスまたは相補的)鎖の部分となり、HLA(プラスまたは暗号)鎖の間で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする。暗号DNA相同体を産生するには、従って、第1のプライマーを選択してMHC遺伝子内の保存された領域、好ましくはコンセンサス配列または各HLA群内の同様の保存された領域、すなわち、HLA−A、HLA−B、HLA−C、および低ポリマー群HLA−E、−Fおよび−G内のコンセンサス配列にハイブリダイズさせる(すなわち、それらに相補的である)。
第2のプライマーは暗号(プラス)鎖の一部となり、マイナス鎖内の保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする。HLA−暗号DNA相同体を産生するには、従って、第2のプライマーを選択して、リーダーまたは最初のフレームワーク領域につきコードするその領域におけるごとくHLAをコードする遺伝子の5’末端の保存されたヌクレオチド配列とハイブリダイズさせる。コーディングDNA相同体の増幅において、第2のプライマーの保存された5’ヌクレオチド配列は、Lohら,Science 243:217−220(1989)によって記載されているターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて外因的に付加された配列と相補的とし得る。第1および第2プライマーの一方または双方は、エンドヌクレアーゼ認識部位を規定するヌクレオチド配列を含有できる。該部位は増幅すべき免疫グロブリン遺伝子に対して異種とでき、典型的には、プライマーの5’末端にまたはその近くにあるようである。
RNAポリメラーゼの高代謝回転速度は、Chamberlinら,The Enzymes,P.Boyer編,87−108頁,Academic Press,New York(1982)によって記載されているごとく出発ポリヌクレオチドを増幅させる。T7 RNAポリメラーゼのもう1つの利点は、Joyceら,Nuc.Acid Res.,17:711−722(1989)によって従前に記載されているごとく、cDNAの一部を1以上の突然変異誘発性オリゴデオキシヌクレオチド(ポリヌクレオチド)で置き換え、部分的にミスマッチの鋳型を直接転写させることによって、突然変異をポリヌクレオチド合成に導入することができる。転写に基づく増幅系はGingerasら,PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,245−252頁,Academic Press,Inc.,San Diego,CA(1990)によって記載されている。
PCR増幅方法は米国特許第4,683,192号、第4,683,202号、第4,800,159号および第4,965,188号ならびに「PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification」,H.Erhlich編,Stockton Press,New York(1989);および「PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications」,Innisら編,Academic Press,San Diego,California(1990)を含めた少なくとも数種のテキストに詳細に記載されている。ここに使用される種々の好ましい方法およびプライマーを以後記載し、また例えばNilssonら,Cell 58:707(1989),Ennisら,PNAS USA 87:2833−7(1990)、およびZemmourら,Immunogenetics 33:310−20(1991)に記載されている。特に、保存された配列を選択し、HLA対立遺伝子(例えば、−A、−B、−C、−E、−Fまたは−G対立遺伝子)の5’および3’非翻訳領域の比較からプライマーを設計するのが好ましい。また、制限部位を5’および3’プライマーに取り込んで、増幅産物が配列決定または発現ベクターにサブクローンされるのを可能とすることもできる。また、4−塩基スペーサー配列を制限部位の基部側に位置させて、酵素での増幅産物の切断の効率を改良するのが有用であろう。
以下のプライマーが、好ましくは別々の反応において、HLA−A、−B、−C、−E、−F、および−G cDNAの増幅で好ましい。次いで、得られたcDNAをクローンし、ここに記載するごとく配列決定することができる。これらのプライマーは、全ての公知のおよび現在知られていないタイプのHLAを増幅するのに用いるのに適する。
好ましい具体例において、第1および第2プライマーのただ一対を増幅反応当たりに用いる。各々複数の異なるプライマー対を用いる、複数の異なる増幅から得られた増幅反応産物を次いで合わせる。しかしながら、また、本発明は、共−増幅(2対のプライマー使用)、および多重増幅(約8、9または10プライマー対を使用)を介するDNA相同体生産に関する。
好ましい具体例において、PCRプロセスは、種々のヒト・クラスIをコードするDNA分子を生産するのみならず、高度に多形のHLA遺伝子座で観察されるものに匹敵し得る突然変異を誘導し、あるいは単一の親クローンから多様性を創製し、それによりより大きな異種性を有するクラスI MHC分子をコードするDNA「ライブラリー」を供するために用いる。前記した変形を含めた突然変異に加えて、米国特許第4,683,195号に引用されており、米国特許第5,314,813号に議論されている。
2.DNA発現ベクター
本発明のベクターは、細胞中で自律複製可能な核酸(好ましくは、DNA)分子であり、それに、DNAセグメント、例えば遺伝子またはポリヌクレオチドを作動可能に連結させて、付着セグメントの複製を実行させることができる。ベクター配列に作動可能に連結させるべきヌクレオチドセグメントの1つは、哺乳動物クラスI MHC重鎖の少なくとも一部をコードする。好ましくは、MHC重鎖の全ペプチド暗号配列をベクターに挿入し、発現させる;しかしながら、いくつかの非暗号MHC配列も同様に含むベクターを構築することも可能である。好ましくは、MHCの非暗号配列は排除される。別法として、クラスI MHC重鎖の可溶性(「sol」)形態についてのヌクレオチド配列を利用することができ;「sol」形態は、それがアルファ3ドメインの末端または膜貫通ドメインの前に挿入された「停止」コドンを含有する点で非−sol形態とは異なる。もう1つの好ましいベクターは、発現用のベクターに作動可能に連結した哺乳動物β−2ミクログロブリン分子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む。さらにもう1つの好ましいベクターは、発現用のベクターに作動可能に連結した哺乳動物助力分子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む。また、クラスI MHC重鎖およびβ−2ミクログロブリンおよび助力分子、またはこれらのいくつかの組合せをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを構築することも可能である。
好ましいベクターは、方向性連結に適合したヌクレオチドの配列を介して発現するために作動可能に連絡した1以上の翻訳可能なDNA配列を含むカセットよりなる。該カセットは、好ましくは、翻訳可能DNA配列が、方向性連結に適したヌクレオチドの配列を介してカセットに方向性よく挿入された場合に産生されるポリペプチドまたは蛋白質を発現するためのDNA発現制御配列を含む。また、カセットは、好ましくは、翻訳可能DNA配列の上流のプロモーター配列、および哺乳動物MHC重鎖配列から下流のポリアデニル化配列を含む。また、該カセットは選択マーカーを含むこともできるが、かかるマーカーはもう1つの発現ベクター配列に作動可能に連結したヌクレオチド配列にコードされるのが好ましい。
本発明のカセットが作動可能に連結されるベクターの選択は、当業者によく知られているごとく、所望の機能的特性、例えば、ベクター複製および蛋白質発現、および形質転換すべき宿主細胞に直接依存し、これらは組換えDNA分子を構築する分野に固有の限定である。
種々の具体例において、MHC変異体および抗原性ペプチドを含めた、本発明で有用なポリペプチドの生産用にベクターを利用する。例示的ベクターは、BioRad Laboratories(Richmond,CA)から入手可能なプラスミドpUC8、pUC9、pUC18、pBR322およびpBR329、Pharmacia(Piscataway,NJ)から入手可能なpPLおよびpKK223、およびpBSおよびM13mp19(Stratagene,La Jolla,CA)を含む。他の例示的ベクターはpCMUを含む(Nilssonら、Cell 58:707(1989))。他の適当なベクターは公知の方法に従って合成することもできる;例えば、ここに種々の適用で使用されるベクターpCMU/KhおよびpCMUIIはpCMUIV(Nilsonら,前掲)の修飾である。
加えて、好ましくは、プロモーター配列をコードする翻訳可能ヌクレオチド配列の上流に配列がある。好ましくは、プロモーターは条件的である(例えば、誘導性)。ここに使用される好ましい条件的プロモーターはメタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターである。
ベクターはよく知られたベクター構築技術のいずれかを利用して構築することができる。しかしながら、これらの技術は、宿主細胞のゲノムに挿入されるべき翻訳可能ヌクレオチド配列が適当なプロモーターによって本発明の変形と配列の「上流で」隣接する程度に修飾され、ある本発明の変形例では翻訳可能ヌクレオチド配列はポリアデニル化部位により「下流で」隣接される。これは、「宿主」細胞が昆虫細胞であって、ヌクレオチド配列がトランスフェクションを介して伝達される場合に特に好ましい。トランスフェクションは、リン酸カルシウム方法、DEAE−デキストラン法、安定な導入方法、エレクトロポレーションを含めた多数の方法を介して、あるいはリポソーム媒介法を介して達成できる。公知のトランスフェクション方法およびヌクレオチドを細胞に導入する他の手法を記載する多数のテキストが利用できる;例えば、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1991)参照。
ベクターそれ自体は、ウイルスベクター(RNAまたはDNA)、裸の直鎖または環状DNA、または核酸物質および細胞に挿入されるべきいずれかのポリペプチドを含有する小胞またはエンベロープのごときいずれの適当なタイプのものであってもよい。小胞に関しては、リポソームのごとき脂質小胞の構築のための技術がよく知られている。かかるリポソームは、リポソームの外部上の抗体または他の特異的結合性分子を提供するごとき他の常法技術を用いて特定の細胞に対して標的化することができる。例えば、A,Huangら,J.Biol.Chem.255:8015−8018(1980)参照。例えば、Kaufman,Meth.Enzymol.185:487−511(1990)参照。
好ましい具体例において、ベクターは選択マーカーも含有する。発現の後、翻訳可能ヌクレオチド配列の産物を、次いで、その配列に対する抗体を用いて精製することができる。選択マーカーの1つの例はネオマイシン耐性である。phshneo、phsneo、またはpcopneoのごときネオマイシン耐性をコードするプラスミドを、選択遺伝子(類)を発現する細胞の集団が選択培地でトランスフェクタントを増殖させることによって確認できるように各トランスフェクションに含ませることができる。
本発明で用いる好ましいベクターはプラスミドである;より好ましくは、それは高コピー数プラスミドである。また、誘導性プロモーターは、(しばしば非天然またはキメラヌクレオチド配列を担持するように構築された)ベクターが導入された細胞に対する選択圧を限定する傾向にあるので、該ベクターは誘導性プロモーター配列を含有するのも望ましい。また、選択ベクターは選択宿主での発現に最良に適合するのが好ましい。もし宿主細胞集団がDrosophila細胞培養物であれば、適合するベクターはp25−lacZ(BelloおよびCouble,Nature 346;480(1990)参照)またはpRmHa−1、−2、または−3(Bunchら,Nucl.Acids Res.16:1043−1061(1988)参照)のごときものと機能的に同等のベクターを含む。好ましい具体例において、該ベクターはpRmHa−3であり、これは図3に示す。このベクターはメタロチオネインプロモーターを含み、これは好ましくは、MHC配列が挿入される部位の上流にあり、ポリアデニル化部位は好ましくは該MHC配列の下流にある。昆虫細胞、特にDrosophila細胞が本発明で好ましい宿主である。Schneider2(S2)のごときDrosophila細胞はプロモーターの活性化に必要なトランス−作用因子を有し、かくして、なおさらに好ましい。
発現ベクターpRmHa−3は細菌プラスミドpRmHa−1(図2)に基づき、その後者はプラスミドpUC18をベースとし、受託番号37253を有し、American Type Culture Collection(ATCC、Rockville,MD)に寄託されている。pRmHa−3ベクターはプロモーター、R1およびStu部位が除去されたメタロチオネイン遺伝子の5’非翻訳リーダー配列(配列1−421、配列番号13)を含有する。また、それはポリアデニル化部位を含めたDrosophila ADH遺伝子(配列#6435−7270、配列番号14)の3’部分も含有する。従って、クローン化DNAはメタロチオネインプロモーターによって転写的に調節され、ポリアデニル化されている。pRmHa−1プラスミドの構築はBunchら,Nucl.Acids Res.16:1043−1061(1988)に記載されている。pRmHa−3およびpRmHa−2プラスミド(その後者はEcoRI断片として除去し得るメタロチオネインプロモーター配列を有する)の構築は図1、2および3に示す。本発明で使用するのに好ましいプラスミドpRmHa−3に関しては、PstI、SphIおよびHindIIIがプロモーター断片中にあり、従って、ユニークではない。XbaはADH断片中にあり(その3’末端から4塩基)、またユニークでない。しかしながら、以下の制限部位はpRmHa−3でユニークである:EcoRI、SacI、KpnI、SmaI、BamHI、SalI、Ninc2、およびAccI。
本発明のDNA発現ベクターにおけるカセットは、翻訳可能DNA配列の挿入に際して、適当な宿主において、本発明の融合蛋白質を発現できるヌクレオチドの配列を形成するベクターの領域である。ヌクレオチドの発現−コンピテント配列をシストロンという。かくして、カセットは、好ましくは、1以上の翻訳可能DNA配列に作動可能に連結したDNA発現制御エレメントよりなる。翻訳可能DNA配列がその目的に適合したヌクレオチドの配列を介して、制御エレメントの間に方向性よく挿入された(方向性よく連結された)場合にシストロンが形成される。得られた翻訳可能DNA配列、すなわち挿入配列は、好ましくは、適当なリーディングフレームに作動可能に連結される。
DNA発現制御配列は、構造遺伝子産物用のDNA発現シグナルの一組よりなり、よく知られているように、シストロンが構造遺伝子産物を発現できるように、該シストロンに作動可能に連結された5’および3’エレメント双方を含む。5’制御配列は転写を開始するためのプロモーターおよび上流の翻訳可能DNA配列の5’末端に作動可能に連結されたリボソーム結合部位を規定する。
かくして、本発明のDNA発現ベクターは、カセット部分に翻訳可能DNA配列をクローンして、本発明の融合蛋白質を発現できるシストロンを得るための系を提供する。
3.細胞系
本発明の好ましい細胞系は培養中で連続的に増殖でき、その細胞の表面に哺乳動物クラスI MHC分子および助力分子を発現できる。細菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞系を含めた種々の形質転換および非形質転換細胞または細胞系のいずれもこの目的に適する。(例えば、種々の細胞系、他えば、E.coliおよびS.cerevisiaeを培養しそれを使用する要約および手法については、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY(1991)参照)。
好ましくは、細胞系は真核細胞系である。より好ましくは、細胞系は変温性である(すなわち、哺乳動物細胞系よりも温度攻撃に対して感受性が低い)。より好ましくは、それは昆虫細胞系である。ガ(ATCC CCL80)、アワヨトウ(ATCC CRL 1711)、カ幼虫(ATCC系CCL 125、CCL 126、CRL 1660、CRL 1591、CRL6585、CRL 6586)およびカイコ(ATCC CRL 8851)を含めた種々の昆虫細胞系が本発明の使用に入手できる。好ましい具体例において、細胞系はSchneider2(S2)細胞系(S2/M3)のごときDrosophila細胞系であり(Schneider,J Embryl.Exp.Morph.27:353−365(1972)参照。);好ましくは、細胞系はM3培地での増殖に適したSchneider2(S2)細胞系(S2/M3)である(Lindquistら,Drosophila Information Service 58:163(1982)参照)。
Schneider細胞は実質的には以下のごとくに調製できる。Drosophila melanogaster(Oregon−R)卵を約4時間間隔にわたって収集し、2.5%水性次亜塩素酸ナトリウム中で脱塩素化し、70%エタノール中に20分間浸漬することによって表面滅菌し、続いて70%エタノール中の0.05%HgCl2中でさらに20分間浸漬することによって表面滅菌する。滅菌蒸留水中で徹底的にすすいだ後、予め共に培地で湿らせたMilliporeプレフィルターで裏打ちした滅菌Metricel黒色フィルターを含有するペトリ皿に卵を移す。卵を一晩22℃のインキュベーターに入れ、20−24時間経ってから培養のために取り出す。胚を各半分または1/3に切断し、次いでRinaldini塩溶液(Rinaldini,Nature(London)173:1134−1135(1954))中の0.2%トリプシン(1:250、Difco)に室温で20−45分間入れる。100−300の胚を用いて各培養を開始する。
胎児ウシ血清(FBS)の添加の後、断片を100×gにて2−3分間遠心し、1.25ml培養培地に再懸濁し、ガラスT−9フラスコに接種する。雰囲気空気のガス相にて、培養を約22−27℃±0.5℃に維持する。さらに100ml培地当たり500mgの細菌学的ペプトンを含有し、15%不活化FBSを補足したSchneiderの培養基(Schneider,J.Exp.Zool.156:91−104(1964);Schneider,J.Embryol.Exp.Morph.15:271−279(1966))が好ましく使用される。pH(好ましくは、6.7−6.8)を0.01%フェノールレッドでモニターする。細胞系は、好ましくは、3−7日ごとに継代培養することによって維持する。細胞はガラスに容易に付着するが、トリプシン処理が必要なほどはしっかりとは付着しない;典型的には、単純なビペッティングがほとんどの細胞をフラスコの底から流すのに適する。細胞の形態学的外観はSchneider,J.Embryol.Exp.Morph.27:353−365(1972)に記載されている。それらは、外観が実質的に上皮細胞様であり、直径が5−11μm、長さが11−35μmの範囲である。丸い細胞を含有する小さなポケットを他の細胞全体にランダムに分配させることができる。
好ましくは、Schneider2(S2)細胞はSchneiderのDrosophila培地+ペニシリン(100ユニット/ml)およびストレプトマイシン(100mg/ml)含有する10%FBS中に維持する。細胞を0.5×105/mlを超える密度で維持し、それを24−30℃の温度範囲で増殖させるのが好ましい。細胞は24時間未満で倍化し、増殖して高細胞密度、すなわち約2×107/mlまたはそれ以上となる傾向がある。また、細胞を後の使用または分析のために90%FBSおよび10%DMSO中で凍結することもできる。細胞を−70℃に置き、次いで、液体窒素中で保存することができる。
Schneider2(S2)と確認される本発明による好ましい細胞系は、ブダペスト条約に基づき、1992年2月18日にAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託し、受託番号CRL10974が付与された。
本発明の細胞は、各々発現ベクターに挿入された(すなわち、作動可能に連結された)、(ヒト)MHC重鎖、β−2ミクログロブリンおよび1以上の助力分子をコードするcDNAでトランスフェクトする。より好ましい具体例において、ベクターは、ヒト・クラスI MHC重鎖、ヒトβ−2ミクログロブリンまたはヒト助力分子をコードする発現可能ヌクレオチド配列がここに開示する技術を用いて挿入されたDrosophila発現プラスミドpRmHa−3よりなる。好ましくは、MHC重鎖をコードするcDNA、β−2ミクログロブリンをコードするcDNA、および助力分子をコードするcDNAは別の発現プラスミドに作動可能に連結し、培養細胞に共トランスフェクトする。別法として、MHC重鎖、β−2ミクログロブリンおよび助力分子をコードするcDNAは同一発現プラスミドに作動可能に連結させ、その同一プラスミドを介して共トランスフェクトすることもできる。もう1つの変形において、MHC重鎖、β−2ミクログロブリン、助力分子、およびIL−2のごときサイトカインをコードするcDNAを発現プラスミドに作動可能に連結し、本発明の細胞系に共トランスフェクトする。HLA遺伝子の選択、適当なベクターの構築およびプライマー選択は前記により詳しく記載されている。
うまく形質転換された細胞、すなわち本発明の発現可能ヒトヌクレオチド配列を含有する細胞はよく知られた技術を介して同定できる。例えば、本発明のcDNAまたはrDNAの導入から得られる細胞をクローン化して、モノクローナルコロニーを得ることができる。それらのコロニーから細胞を収穫し、溶解し、それらのDNA含有量をSouthern,J.Mol.Biol.98:503(1975)によって記載されているもののごとき方法を用いて、rDNAの存在につき調べる。rDNAの存在についての直接的アッセイに加えて、形質転換またはトランスフェクションの成功は、rDNAが対象キメラポリペプチドを直接発現できる場合はよく知られた免疫学的方法によって確認することができる。例えば、発現ベクターで首尾よく形質転換された細胞は、適当な抗体を用いて容易に測定される特定の抗原特性を呈する蛋白質を産生することができる。加えて、成功した形質転換/トランスフェクションは前記したごときネオマイシン耐性のごときマーカー配列を担持するさらなるベクターの使用を介して確認することができる。
また、培養物は安定で低温で保持された増殖が可能であるのが好ましい。例えば、培養物をほぼ室温で、例えば24−27℃で維持するのが好ましい。他の具体例において、特にCD8+細胞を活性化するプロセスの間、培養物を高温に維持するのが好ましい。かくして、本発明による培養物は約30℃ないし約37℃の温度攻撃に耐えることができるのが好ましい。β−2ミクログロブリンの培養物への添加はクラスI MHCを少なくとも30℃の攻撃まで安定化させ;β−2ミクログロブリンおよびペプチドの添加の結果、より高い温度、すなわち37℃でより大きな熱安定性となる。
空の、より好ましくはペプチド−結合したMHC分子の発現のための培養物を調製するには、培養物は、例えば、CuSO4誘導を介して、所定の時間の刺激をまず要するであろう。適当な誘導時間、例えば、約12−48時間の後、ペプチドを所定の濃度(例えば、約100μg/ml)で添加することができる。後記するごとくペプチドを調製することができる。さらなるインキュベーション時間、例えば27℃における約12時間の後に、培養物はCD8+細胞の活性化で使用される。このさらなるインキュベーション時間は短縮化あるいは恐らくは省略することができるが、もし休止または天然CD8+細胞の添加に先立った時間の間、インキュベートさせれば、培養物は温度攻撃に対して益々安定となる傾向がある。例えば、ペプチドが添加された本発明による培養物は、37℃で延長された時間インキュベートした場合でさえ、かなりの量のペプチド−負荷クラスI MHC分子を発現できる。
形質転換宿主細胞を培養するにおいて有用な栄養培地は当該分野でよく知られているか、あるいは多数の商業的入手源から得ることができる。宿主細胞が哺乳動物である具体例においては、「無血清」培地が好ましくは使用される。
4.ヒトβ−2ミクログロブリンおよび助力分子
治療上有用な量の表面発現されたヒト・クラスI MHC分子を産生できる細胞系を確立するためには、β−2ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したベクターで本発明による細胞系を共トランスフェクトして、該細胞系においてヒトMHC分子の適当なレベルの発現を行うのが好ましい。マウスβ−2ミクログロブリンのごとき哺乳動物β−2ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列は本発明の細胞系において発現されるヒト・クラスI MHC分子の安定性を増大させるが、ヒトβ−2ミクログロブリンをコードする発現可能ヌクレオチド配列に作動可能に連結したベクターで細胞系を共トランスフェクトするのが好ましい。
前記したごとく、本発明による好ましいベクターは、発現用のベクターに作動可能に連結した哺乳動物β−2ミクログロブリン分子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む。助力分子のための遺伝子を同一またはもう1つのベクターに連結させることができる。また、クラスI MHC重鎖およびβ−2ミクログロブリンを共にコードするヌクレオチド配列を含むベクターを構築することもできる。
助力分子で使用される配列決定およびプライマーは後記にてより詳しく記載する。しかしながら、プロトコルは同様である。
ヒトβ−2ミクログロブリンcDNA配列は公表されており(Suggsら,PNAS 78:6613−17、1981参照)、以下のプライマーを用い、該配列をポリメラーゼ鎖反応(PCR)用の鋳型として用いた。
プライマーは標準的なPCR反応で使用される(前記およびそれで引用された文献参照)。反応産物をフェノールで抽出し、Genecleanキット(Bio 101、San Diego,CA)を用いて精製し、BamHIで消化し、pBS(Stratagene,La Jolla,CA)のBamHI部位にクローン化する。配列の確認の後、このBamHI断片を適当な発現ベクターのBamHI部位にクローン化する。好ましい具体例において、ヒトβ−2ミクログロブリンcDNAを合成し、発現ベクターpRmHa−3に作動可能に連結させる。
5.ペプチド
ウイルス抗原に加えて実質的に全ての細胞蛋白質を用いて、可能なクラスI MHCリガンドとして働く関連ペプチド断片を生成することができる。従って、ほとんどの哺乳動物細胞において、いずれの特定のMHCペプチド複合体も、細胞表面に見い出される全MHCコード分子の小さな割合しか表さないであろう。従って、CD8+細胞を特異的に活性化させる増大した能力を有する表面発現されたヒト・クラスI MHC分子を生成させるためには、適当なサイズでクラスI分子への抗原性特性を持つペプチド断片を単離し負荷するのが好ましい。
本発明のペプチドはクラスI MHC分子に結合する。結合はイン・ビトロと同様にイン・ビボで作成できる生物学的条件下で起こる。ペプチドの結合の正確な性質は本発明の実施では知られている必要はない。
好ましい具体例において、クラスI MHC分子に負荷されるべきペプチドは抗原性である。また、ペプチドは均一サイズ、好ましくは8−量体または9−量体、最も好ましくは8−量体であるのが好ましい。また、MHC分子へ負荷するために調製したペプチドは単一の種であるのが、すなわち、MHCに負荷される全てのペプチドはサイズおよび配列が同一であるのが好ましい。このようにして、モノ抗原性ペプチドを負荷したMHC分子を産生することができる。
ペプチドは種々の手段を介して細胞に提示することができる。好ましくは、ペプチドはそれをペプチドの細胞内プールに侵入させるように提示する。例えば、ペプチドを浸透圧負荷を介して提示することができる。典型的には、ペプチドを培養基に添加する。ペプチドは完全なポリペプチドまたは蛋白質の形態で培地に添加することができ、これを引き続いて細胞プロセスを介して、例えば酵素的分解を介して分解させる。別法として、完全なポリペプチドまたは蛋白質は、細胞培養物へのその添加に先立って、化学分解(例えば、臭化シアノゲン)またはプロテアーゼ(例えば、キロトリプシン)のごときいくつかの他の手段を介して分解することもできる。他の具体例において、ペプチドは、エピトープアミノ酸配列よりなるものでも、あるいはなるものでないものでもよいより小さいセグメントにて提示される。
好ましい具体例において、十分量の蛋白質(類)またはペプチド(類)を細胞培養物に添加して、クラスI MHC分子を結合させ、引き続いて、本発明のヒト・クラスI MHC−発現細胞の表面に、好ましくは各MHCに付着した同一種のペプチドと共に、高密度のペプチドを提示する。また、MHC分子にペプチドを細胞内で提示する前に、ヒト・クラスI MHC重鎖およびヒトβ−2ミクログロブリンを結合させる、すなわちヘテロダイマーを形成させるのが好ましい。
本発明のもう1つの具体例において、ペプチドを本発明のトランスフェクトされた細胞に添加して、細胞によって発現されるMHC分子の熱安定性を増強させる。前記したごとく、ペプチドは、好ましくは、培養基に添加する。クラスI分子に結合する抗原性ペプチドはMHC分子を熱安定化させ、また細胞表面発現を増加させるように働く。MHC分子に結合するペプチドが添加された培養物は、かくして、ペプチド無添加の培養物よりも温度攻撃に対してかなり感受性が低い。
本発明の1の具体例において、抗原性ペプチドを種々の形態で形質転換/トランスフェクト細胞系に提示する。例えば、全蛋白質または他の抗原性ポリペプチドを化学的にまたは酵素的に分解させることができ、例えば、この形態で細胞系に添加することができる。例えば、当該蛋白質をキモトリプシンで分解し、得られたペプチド「断片」の混合物を形質転換またはトランスフェクトされた細胞培養物に添加する;次いで、これらの細胞により(しばしば、より小さいペプチド、好ましくは8−量体または9−量体である)適当なペプチドを「選択」せしめて、クラスI MHC分子に負荷する。別法として、全蛋白質またはポリペプチド配列を適当なベクターにクローン化し、真核細胞に挿入し、それにより細胞は有意量の抗原性ポリペプチドを生成し、このポリペプチドを次いで収穫し、精製し、ペプチドへと消化し、次いで、ペプチドを形質転換/トランスフェクト真核細胞培養物に添加する。細胞により再度、発現されたMHCに負荷すべきペプチドを「選択」させる。
6.休止または前駆体CD8 + 細胞の単離
休止(または天然もしくは前駆体)CD8+細胞、すなわち特定の抗原を標的化するように活性化されていないT−細胞を、好ましくは、本発明の形質転換培養物と共にCD8+細胞インキュベートする前に患者から抽出する。また、前駆体CD8+細胞は、特異的に活性化されるCD8+細胞の能力に干渉し得る他の治療または療法の開始に先立って患者から採取するのが好ましい。例えば、もし新生物または腫瘍を持つ個体を治療しようと意図するならば、化学療法または照射処置の開始に先立って細胞および培養物を得るのが好ましい。
リンパ球を抽出し、培養する方法はよく知られている。例えば、Rosenbergに対する米国特許第4,690,915号は、リンホサイトフォレシスを介する多数のリンパ球を得る方法を記載している。使用する適当な培養条件は哺乳動物細胞についてのものであり、これは典型的には37℃で行う。
また、種々の方法が前駆体CD8+細胞の培養を分離しおよび/または富化させるのに適する。細胞分離のための一般的方法のいくつかの例は、特異的被覆表面への細胞の間接的結合を含む。もう1つの例において、CD8+細胞を含むヒト末梢血液リンパ球(PBL)を、Ficoll−Hypaque勾配遠心(Pharmacia,Piscataway,NJ)によって単離する。しかる後直ちにPBLリンパ芽球を用いることができるか、あるいは10%DMSOを含有するPBS(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)中で凍結した後、液体窒素中で貯蔵することができ、これは細胞の生存性およびリンパ球の機能を保存する。
前駆体細胞の培養物を分離しおよび/または富化させる別の方法は、陽性および陰性選択手法を共に含む。陽性選択では、リンパ球−富化PBL集団を全血から調製した後、CD8+リンパ球の亜集団をCD8受容体抗原の存在に向けられるアフィニティー−ベースの分離技術によってそれから単離する。これらのアフィニティー−ベースの技術はフロレスサンス−活性化細胞ソーティング(FACS)等のフローミクロフルオロメトリー、細胞接着および同様の方法を含む。(例えば、ScherおよびMage,Fundamental Immunolgy,W.E.Paul編,767−780頁,River Press,NY(1984)参照)。アフィニティー方法はアフィニティー試薬ソースとして抗−CD8受容体抗体を利用することができる。別法として、CD8受容体の天然リガンド、またはリガンド類似体をアフィニティー試薬として用いることもできる。これらの方法で用いる種々の抗−T−細胞および抗−CD8モノクローナル抗体は、American Type Culture Collection(Rockville,MD)およびPharmingen(San Diego,CA)を含めた種々の商業的入手源から一般に入手できる。
陰性選択手法は、CD8+集団から非−CD8の除去を行うのに利用される。この技術の結果、ロイコフォレシス処理した患者のT−およびB−細胞集団からCD8+細胞が富化される。抗原提示に応じて、異なる抗体が適当であろう。(命名法の議論およびレビュー、抗原命名、およびT−細胞を含めたヒト初血球についての割り当てられた抗体については、Knappら,Immunology Today 10:253−258(1989)およびJanewayら,Immunobiology,前掲参照)。例えば、モノクローナル抗体OKT4(抗−CD4、ATCC番号CRL 8002)、OKT5(ATCC番号CRL 8013および8016)、OKT8(抗−CD8、ATCC番号CRL 8014)、およびOKT9(ATCC番号CRL 8021)は細胞系およびハイブリドーマのATCCカタログ(ATCC,Rockville,MD)中、各々、ヒトTリンパ球、ヒトT−細胞サブセット、および活性化T−細胞と反応性であることで同定される。種々の他の抗体がT−細胞種を同定し単離するのに入手できる。
さらなる具体例において、CD8+細胞は陽性および陰性両選択手法を組み合わせることによって単離できる。(例えば、CaiおよびSprent,J.Exp.Med.179:2005−2015(1994)参照)
好ましくは、次いで、PBLを精製する。例えば、Ficoll勾配をこの目的で利用できる。精製されたPBLを、次いで、適当な抗原性ペプチドと共にプレインキュベートした同系Drosophila細胞と混合する。
7.CD8 + 細胞のイン・ビトロ活性化
特異的細胞毒性T−細胞の生成のためのイン・ビトロ条件を最適化するために、抗原−提示細胞の培養物を適当な培地中に維持する。好ましい具体例において、抗原−提示細胞はDrosophila細胞であり、これは好ましくは無血清培地(例えば、Exell 400)中に維持する。
活性化すべき細胞、例えば前駆体CD8+細胞と共に抗原−提示細胞をインキュベートするに先立って、一定量の抗原ペプチドを、抗原−提示細胞の表面で発現させるべきヒト・クラスI分子に負荷させるのに十分な量抗原−提示細胞培養物に添加する。本発明によると、十分量のペプチドは、約200ないし約500,000、好ましくは約200ないし1,000またはそれ以上の、ペプチドが負荷させたヒト・クラスI MHC分子が各抗原−提示細胞の表面で発現されることを可能とする量である。好ましくは、抗原−提示細胞を>20μg/mlペプチドと共にインキュベートする。
次いで、休止または前駆体CD8+細胞を、CD8+細胞の集団を活性化し、それにつきさらに富化させるのに十分な時間、適当な抗原−提示細胞と共に培養物中でインキュベートする。好ましくは、かくして、CD8+細胞は抗原−特異的に活性化されるはずである。抗原−提示細胞に対する休止または前駆体CD8+(エフェクター)細胞の比は個体間で変化し得、培養条件に対する個体のリンパ球の受容可能性ならびに記載内の処置様式が用いられる病気状態または他の条件の種類および重症度のごとき変数にさらに依存し得る。しかしながら、好ましくは、リンパ球:抗原−提示細胞(例えば、Drosophila細胞)比は好ましくは約30:1ないし300:1の範囲である。例えば、1の具体例において、3×107ヒトPBLおよび1×106生Drosophila細胞を混合し、20mlのRPMI 1640培養基中で維持した。
エフェクター/抗原−提示培養を、治療上使用するまたは有効な数のCD8+細胞の集団につき、活性化し富化させるのに必要なだけの長さの時間維持する。一般に、最適時間は約1日および5日の間であり、「プラトー」、すなわち「最大」特異的CD8+活性化レベルは一般に培養の5日後に観察される。本発明の1の具体例において、CD8+細胞のイン・ビトロ活性化は細胞系のトランスフェクション後短時間内に検出される。1の具体例において、CD8+細胞を活性化できるトランスフェクト細胞における一過性発現はトランスフェクションから48時間内に検出可能である。これは、ヒト・クラスI MHCを発現する形質転換細胞の安定なまたは一過性培養物はCD8+細胞を活性化するにおいて効果的であることを明らかに示す。
好ましくは、CD8+細胞の富化および合致した活性化は抗原−提示細胞への暴露の1週間内に最適である。しかる後、好ましい具体例において、富化され活性化させたCD8+細胞を、部位制限、抗体−赤血球細胞調製物の再セッティング、カラムクロマトグラフィー等によってさらに精製する。精製に続き、得られたCD8+細胞調製物を109活性化CD8+細胞の集団を得るのに十分な時間、培養中に維持することによってさらに増殖させる。この時間は細胞の複製時間に依存して変化し得るが、一般に14日である。CD8+細胞の活性化および増殖はRiddellら,Curr.Opin.Immunol.,5:484−491(1993)によって記載されている。
8.CD8 + 細胞のDrosophila細胞からの分離
活性化CD8+細胞は種々の公知の方法のうちの1つを用いて刺激体(例えば、Drosophila)細胞から効果的に分離することができる。例えば、刺激体細胞に、刺激体細胞上に負荷させたペプチドに、またはCD8+細胞(またはそのセグメント)に特異的なモノクローナル抗体を利用して、それらの適当な相補的リガンドに結合させることができる。次いで、適当な手段を介して、例えばよく知られた免疫沈降またはイムノアッセイ法を介して、抗体標識細胞を刺激体−エフェクター細胞混合物から抽出することができる。
9.活性化CD8 + 細胞の投与
有効・細胞毒性の量の活性化CD8+細胞は、イン・ビトロおよびイン・ビボ使用の間で変化し得、同様に、これらのキラー細胞の最終標的である細胞の量およびタイプで変化し得る。また、該量は患者の状態に応じて変化し、実行者による全ての適当なファクターの考慮を介して決定されるべきである。しかしながら、マウスで使用される約5×106−5×107細胞と比較して、好ましくは、約1×106ないし約1×1012、より好ましくは約1×108ないし約1×1011、さらにより好ましくは約1×109ないし約1×1010の活性化されたCD8+細胞を成人ヒトで利用する。
好ましくは、前記したごとく、活性化CD8+細胞は処置されるべき個体へのCD8+細胞の投与に先立ってDrosophila細胞培養から収穫される。しかしながら、他の現存の提案されている処置方法とは異なり、本方法は腫瘍形成性でない細胞培養系(すなわち、Drosophila細胞)を用いることに注意するのは重要である。従って、哺乳動物腫瘍−促進性細胞の投与は極端に有害であるが、もしDrosophila細胞およびかつ成果CD8-細胞の完全な分離が達成されなくても、少数のDrosophila細胞の投与に伴うことが知られている固有の危険はない。
細胞成分を再導入する方法は当該分野で知られており、Honsikらに対する米国特許第4,844,893号およびRosenbergに対する米国特許第4,690,915号に例示されているもののごとき手法を含む。例えば、静脈内注入を介する活性化CD8+細胞の投与が適当である。
10.HLAタイプ分け
前記したごとく、HLAハプロタイプ/アロタイプは個体間で変化し、他方、本発明の実施には個体のHLAタイプを決定するのは必須ではないが、それはしばしば助けとなる。HLAタイプは標準的なタイプ分け手法およびFicoll勾配によって精製されたPBLを介して決定できる。次いで、精製したPBLを、適当な抗原性ペプチド、例えばウイルス感染、癌、または悪性疾患に関連する治療適用における、ウイルス−または癌−特異的蛋白質に由来するペプチドと共にプレインキュベートした同系Drosophila細胞と混合する。
特定のウイルス−または癌−特異的抗原のペプチドが特徴付けられている場合において、例えばウイルスまたは悪性を継続して使用して、これらのエピトープをコードする合成ペプチドが好ましく使用される。好ましい抗原性ペプチドが正確に決定されていない場合において、ウイルス−または癌−特異的蛋白質のプロテアーゼ消化物を使用できる。かかる抗原のためのソースとして、ウイルス−または癌−特異的蛋白質をコードするcDNAを細菌発現プラスミドにクローン化し、それを用いて、例えばここに開示する方法を介して細菌を形質転換する。
HLAのタイプ分けの後、もし好ましいHLAを発現するDrosophila細胞が得られない場合、ポリメラーゼ鎖反応の使用を介して、好ましいHLAをコードするcDNAをクローン化できる。前記B.1節に記載したプライマー(配列番号1ないし配列番号12)を用いて、別々の反応にて適当なHLA−A、−B、−C、−E、−F、または−GcDNAを増幅し、次いで、後記A2.1につ開示した方法にて記載するごとく、これをクローン化し、配列決定する。次いで、クローン化HLAを発現する安定な細胞系をDrosophila細胞で確立することができる。別法として、PCR反応からクローン化組換え分子の大集団を一過的に発現する昆虫細胞の集団をイン・ビトロCD8+活性化で用いることができる。
実施例
以下の実施例は本発明を説明するもので、それを限定するものではない。
実施例1
ヒト・クラスI MHC分子の発現
A.pRmHa−3発現ベクターの調製
本発明で記載されたDrosophila Schneider2(S2)細胞でMHC蛋白質を発現させるのに用いられるpRmHa−3発現ベクターは、SphI線状化pRmHa−1 DNA発現ベクターと、後記するpRmHa−2発現ベクターのSphI制限消化物から得られたDNA断片を連結することによって構築された。pRmHa−1とpRmHa−2断片とのこのような連結を行って、pRmHa−1に存在する2つのEcoRI制限エンドヌクレアーゼクローニング部位のうちの1つを除去した。かくして、得られたpRmHa−3発現ベクターは、種々のMHC−コーディングDNA断片が実施例に記載されるごとくに挿入された多重クローニング部位(ポリリンカー)中に1つのEcoRI制限部位のみを含有した。
1.pRmHa−1発現ベクターの調製
メタロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列(MTと命名)およびDrosophila melanogasterから単離されたポリアデニル化シグナルを含有するアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)遺伝子を含むpRmHa−1発現ベクターはBunchら,Nucl.Acids Res.16:1043−61(1988)によって記載されているごとくに構築した。最終pRmHa−1構築体の概略を図2に示す。ATCC受託番号37253を有するプラスミド発現ベクターpUC18を、それから続いてのここに記載するベクターが得られる源ベクターとして用いた。pUC18プラスミドは多重クローニング部位に5’から3’にかけて以下の制限部位を含有し、その全ては図1のpUC18−由来ベクターの模式的表示に示していない:EcoRI;SacI;KpnI;同一位置に存在するSmaIおよびSmaI;BamHI;XbaI;SalI、同一位置に存在するAccIおよびHincII;PstI;SphIおよびHindIII。まず、pUC18ベクターをHindIIIで消化して線状化pUC18を形成させた。次いで、Maniatisら編,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1982)によって記載されているごとく、HindIII末端をDNAポリメラーゼI大断片で満たすことによって平滑末端を生成させた。
得られた線状化平滑末端pUC18ベクターを、ポリアデニル化シグナルを含有するDrosophila melanogasterADH遺伝子からの740塩基対(bp)HinfI断片と連結した。HinfIでの消化、続いてのクレノウでの末端平滑化によって、連結したADH対立遺伝子をまずGoldbergら,PNAS USA 77:5794−5798(1980)によって記載されているプラスミドpSACIから単離し、配列番号14にリストされたヌクレオチド配列が得られた。ランダムな高分子量(15kbを超える)を含有するバクテリオファージラムダライブラリーから選択されたDrosophila DNAの4.7キロベース(kb)EcoRI断片をpBR322(ATCC受託番号31344)にサブクローンすることによって、ADH対立遺伝子を含有するpSACIベクターを構築した。5’HinfI制限部位が、Kreitman,Nature 304:412−417(1983)によって記載されているごとく、1770位にADH遺伝子で天然に生じた。3’HinfI部位は、ADH遺伝子がクローン化されたpUC18ベクターから得られた。この位置はADH遺伝子の2500位のXbaI部位から4塩基3’側であった。ADHセグメントは、ADH mRNAの3’非翻訳部分におけるポリアデニル化/切断配列の35bp上流からポリアデニル化シグナルの700bp下流まで伸びた。AHD遺伝子断片を含有する得られたpUC18−由来ベクターを図1に示すごとくpHA−1と命名した。
421 bp EcoRI/StuI MT遺伝子断片は、Drosophila melanogasterのゲノムDNAライブラリー中のほぼ15.3kbのDNAを含有するクローンから得られた。成熟DNAのMboI部分消化で調製された該ライブラリーをラムダ誘導体EMBL4にクローン化した。該断片はDrosophila MT遺伝子のMTプロモーターおよび金属応答コンセンサスエレメントを含有した(Maroniら,Genetics 112:493−504(1986))。プロモーターおよびヌクレオチド+1の転写開始部位を含有するこの領域は、MT遺伝子の位置−370ないしヌクレオチド位置+54に対応していた(配列番号13)。次いで、得られた断片を、予めEcoRIおよびSmaIで線状化してある前記調製のpHA−1発現ベクターに結んだ。StuI消化によって生成したMTの3’末端はSmaI消化によって生成したpHA−1における平滑末端に適合した。5’Drosophila MT遺伝子断片および3’ADH遺伝子断片を含有する得られたpUC18−由来ベクターをpRmHa−1と命名した。図2に示されたpRmHa−1発現ベクターは、pHa−1ベクターについての図1に示されるごとく、pUC18からの複製起点(ori)およびアンピシリンに対する耐性(Ampr)を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含有した。また、pRmHa−1のダイアグラムはMT遺伝子断片の5’ないし3’隣接部分、多重クローニング部位およびADH遺伝子断片を示す。pRmHa−1ベクターをc.で後記するごとくpRmHa−3発現ベクターの構築で用いた。
2.pRmHa−2発現ベクターの調製
pRmHa−2の構築は図1に示す。pRmHa−2発現ベクターを構築するために、少し修飾した前記pRmHa−1の構築で記載したごとく、前記調製のMT断片をpUC18−由来ベクターpHA−1に挿入した。EcoRIリンカーを前記調製のEcoRI/StuI−単離したMT遺伝子断片のStuI部位に負荷して、EcoRI制限部位を両末端に有するメタロチオネイン断片を形成させた。次いで、得られた断片を、予めEcoRIで線状化してあるADH断片含有pUC18発現ベクターに連結した。5’Drosophila MT遺伝子および多重クローニング部位の5’側にEcoRI制限部位を有する3’ADH遺伝子断片を含有する得られたpUC18−由来ベクターをpRmHa−2と命名した。図1に示すpRmHa−2発現ベクターは複製起点(ori)およびpUC18からのアンピシリンに対する耐性(Ampr)を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含有した。pRmHa−2のダイアグラムはMT遺伝子断片の5’ないし3’隣接位置、多重クローニング部位およびADH遺伝子断片も示す。pRmHa−2ベクターは後記c.に記載するごとくpRmHa−2発現ベクターの構築でpRmHa−1と共に使用した。
3.pRmHa−3発現ベクターの調製
ただ1つのEcoRI制限部位を有するpRmHa−3発現ベクターを調製するために、pRmHa−2からの断片をpRmHa−1に連結した。この構築のために、前記b.で調製したpRmHa−2をまずSphIで消化した。MT遺伝子の中央で始まり、多重クローニング部位のSphI部位で終わる得られたSphI断片をまずpRmHa−2ベクターから単離し、次いで、前記A.1で調製したpRmHa−1に連結した。pRmHa−1ベクターは予め修飾して、MT遺伝子の5’側のEcoRI制限部位を除去し、次いでSphIで線状化してあったものである。このプロセスを図2に模式的に示す。pRmHa−1中のEcoRI部位を除去するために、該ベクターをEcoRIで消化して線状化ベクターを形成させ、次いでマングビーンヌクレアーゼで平滑末端化し、再度連結した。
EcoRI部位を欠くpRmHa−1ベクターを次いでSphIで消化して、pRmHa−2からのSphI断片インサートに対応する領域を除去し、線状化pRmHa−1ベクターを形成させた。次いで、pRmHa−2からのSphI断片をSphI線状化pRmHa−1に連結してpRmHa−3発現ベクターを形成させた。pRmHa−3ベクターの概略を図3に示す。pRmHa−3がそれから誘導されたpUC18ベクターからの種々の制限部位の相対的位置を図に示す。加えて、注目するMHC遺伝子がクローン化される多重クローニング部位(ポリリンカー)によって隔てられたMTおよびADH遺伝子断片の相対的位置および長さを図に示す。pUC18に由来するpRmHa−3ベクターは複製起点およびアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含有する。かくして、本発明におけるごとく調製され、pRmHa−3の多重クローニング部位にクローン化されたMHCをコードするDNA断片を、MTプロモーターによって転写調節され、ADH遺伝子を経てポリアデニル化された。
B.cDNA合成
種々のHLAグループのクラスI MHC分子の詳細な記載は、ここに出典明示して本明細書の一部とみなすPetersonらに対する米国特許第5,314,813号中に見い出すことができる。
いずれかの好ましいHLAをコードするcDNAを、ポリメラーゼ鎖反応の使用を介してクローン化することができる。前記B.1節に開示したプライマー(配列番号1ないし配列番号12)を用いて、別々の反応にて適当なHLA−A、−B、−C、−E、−Fまたは−GcDNAを増幅することができ、次いで、前記HLA A2.1につき開示した方法に記載されたごとくに、これをクローン化し、配列決定することができる。ヒト細胞からのcDNAの調製はEnnisら,PNAS USA 87:2833−2837(1990)に記載されているごとくに行われる。略言すると、個体から血液試料を得、遠心後に細胞を収集し、これを用いて全RNAを調製する。オリゴ(dT)および鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を使用することによって、第1鎖cDNAを合成する。得られたcDNAを、前記B.1節で記載した適当なプライマー、およびGeneAmpキットおよびサーマルサイクラー(Perkin−Elmer/Cetus)を利用するPCR増幅反応で用いる。反応条件は、好ましくは、以下の通りである。100ngのcDNA鋳型および50ピコモルの各オリゴヌクレオチドプライマーを用いる。30サイクルを以下のごとくに行う:(a)94℃における1分間;(b)60℃における1分間;および(c)72℃における1分、30秒間。次いで、PCR反応物を10分間100℃まで加熱してTaqポリメラーゼを破壊し、T4ポリメラーゼ(Stratage、ne,San Diego,CA)によってDNAの末端を平滑とする。
HLA A2.2を合成するために、完全なA2.2をコードするcDNA(公表された配列として、Holmesら,J.Immunol.,139:936−41(1987)参照)をM13mp19プラスミド(商業的に入手可能なバクテリオファージベクター(Stratagene,La Jolla,CA)にクローン化する。cDNAはA2の公表された配列に由来するプライマーを用いるPCRによって合成される。該cDNAはNotI(クレノウで満たされた突出)/EcoRI断片としてM13mp19クローンから放出される。(クレノウ断片は、E.coli DNA pol Iをスブチリシンで処理することによって生成された、E.coli DNAポリメラーゼI分子の一部である。それを用いて、制限ヌクレアーゼによって生じたDNA分子の末端の5’または3’突出を「満たす」)。NotI/EcoRI断片を、BgIII(クレノウで満たされた末端)およびEcoRIで消化したpSP64Tに挿入する。pSP64Tは、効率的に翻訳される(β−グロビン)mRNAからの5’および3’フランキング領域を、それ自体の開始コドンを含有するいずれかのcDNAに供するように設計されたSP6クローニングベクターである。この翻訳SP6ベクターは、pSP64−XβmをBalIおよびBstEIIで消化し、互い違いになった末端をT4 DNAポリメラーゼで満たし、連結によってBglIIリンカーを付加することによって構築した。BalIはATG(開始コドン)の2塩基上流でβ−グロビンcDNAを切断し、BstIEIIはTAA(停止コドン)の8塩基上流で切断する。PstIないしEcoRIにかけて、ポリリンカー断片において切断する制限酵素を更に用いて転写のためにプラスミドを線状化することができるように、pSP64Tにはただ1つのBglII部位がある。(やはりプラスミドpSP64−Xβmの構築を記載するKreigおよびMelton,Nucleic Acid Res.12:7057−7070,(1984)参照)。得られたプラスミドをEcoRI(クレノウで満たした末端)およびHindIIIで切断し、これをHindIII(5’)およびStuI(3’)の間のpCMUIIポリリンカーにクローン化する。(Paaboら,EMBO J.5:1921−1927(1986)参照)。全cDNAをHindIII(クレノウで満たした末端)およびBamHI断片として取り出し、これをSmaIおよびBamHIで切断したpRmHa−3にクローン化する。
HLA A2.2可溶性形態は、膜貫通ドメインに直ぐ先行する前記A2.2cDNAに停止コドンを作成することによって調製した。修飾は、真核生物発現ベクターpCMUIIにクローン化したA2.2cDNAを、MboIIおよびBamHIで、HindIII5’およびStuI3’(前記参照)の間で切断することによって達成し、以下のオリゴヌクレオチドを挿入した。
得られた組換えプラスミドをHindIIIで切断し、突出末端をクレノウで満たし、次いで、BamHIで切断して制限断片が放出され、これをA2.2全長におけるごとくにpRmHa−3にクローン化する。
1.ネズミICAM−1発現ベクターの構築
脾臓細胞をBalb/cマウスから単離した。脾臓細胞をconAで刺激し;製造業者の指示に従って、FastTrackキット(Invitrogen;San Diego,CA)を用いてmRNAを単離した。製造業者の指示に従い、AMV逆転写酵素キット(Promega,Madison,WI)を用い、cDNAをmRNAから合成した。公表されたcDNAヌクレオチド配列(Siu,G.ら,J.Immunol.143,3813−3820(1989))に基づき、以下のオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして合成した。
合成したcDNAを、これらのプライマーを用いるPCRに付した。産物を制限酵素EcoRIおよびSalIで切断し、制限酵素EcoRIおよびSalIで消化してあるpRmHa−3に連結した。
2.ネズミB7.1発現ベクターの構築
Balb/cマウスから脾臓細胞を単離し、conAで刺激した。製造業者の指示に従い、メッセンジャーRNAをFastTrackキット(Invitrbgen,San Diego,CA)を用いて単離した。製造業者の指示に従い、AMV逆転写酵素キット(Promega,Madison,WI)を用いてcDNAをmRNAから合成した。
公表されたcDNAヌクレオチド配列(Freemanら,J.Exp.Med.174:625−631(1991))に基づき、以下のオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして合成した。
これらのプライマーを用い、合成したcDNAをPCRに付した。産物を制限酵素EcoRIおよびSalIで切断し、制限酵素EcoRIおよびSalIで切断してあるpRmHa−3に連結した。
3.ネズミB7.2発現ベクターの構築
(ATCCから入手した)IC−21細胞を、10%胎児ウシ血清を含有するRPMI 1640培地中で増殖させた。製造業者の指示に従い、FastTrackキット(Invitrogen,San Diego,CA)を用いて、mRNAをこれらの細胞から単離した。製造業者の指示に従い、AMV逆転写酵素キット(Promega,Madison,WI)を用いてcDNAをmRNAから合成した。公表されているcDNAヌクレオチド配列(Freemanら,J.Exp.Med.178:2185−2192(1993))に基づき、以下のオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして合成した。
合成したcDNAをこれらのプライマーを用いるPCRに付した。産物を制限酵素EcoRIおよびSalIで切断し、制限酵素EcoRIおよびSalIで切断してあるpRmHa−3に連結した。
表1にリストしたリン酸カルシウム方法を用い、前記発現構築体をDrosophilaS2細胞にトランスフェクトした。500μg/ml Geneticinを細胞培養基に含ませることによって、安定な細胞系が選択された。
ヒト・アクセサリーおよび共刺激性分子を、特定の蛋白質に特異的なモノクローナル抗体でのFACS分析によってこれらの蛋白質を発現することが示されているヒト細胞系からクローン化した。インテグリンファミリーに属する接着分子ICAM−I(CD54)およびLFA−3(CD58)を、各々、ヒト細胞系K562およびHL60からクローン化した。ヒト慢性骨髄性白血病に由来するK562細胞をATCC(CCL−243)から入手し、推奨される条件(すなわち、5%CO2、37℃にて10%胎児ウシ血清を含有するRPMI)下で培養した。ヒト前骨髄細胞白血病に由来するHL60細胞をATCC(CCL−240)から入手し、ATCCの推奨に従って培養した。共刺激性分子B7.1およびB7.2も、各々、K562およびHL60細胞からクローン化した。
4.cDNA
修飾されたチオシアン酸グアニジニウム法(Chromczynskiら,Anal.Biochem.162:156−159、1987)、続いて、オリゴ(dt)−セルロースカラム(Sambrook,J.ら,Molecular Cloning;A Laboratory Manual,第2版,6.22−6.34,Cold Spring Harbor Laboratory,CSH,NY)上のポリA+ RNA選択によって単離されたRNAからの各細胞系から、メッセンジャーRNA試料を調製した。(通常いくらかの細胞表面分子を発現させる必要がある)ビタミンD3でのHL60細胞の誘導はB7.2およびLFA−3分子を得るのに必要ではなく、蛋白質を誘導不存在下で発現させた。cDNAは製造業者の指示(Promega,Madison,WI)に従ってAMV逆転写酵素を用いて調製した。
5.PCRプライマー
PCRプライマーを設計し、GENEWORKSデータベース(Intelligenetics)から既知の配列のコピーを得、適当なベクターにクローン化するために必要である末端を考慮した後に、合成した。それらは以下の通りであり、各蛋白質の頂部配列は5’プライマーおよび底部は3’プライマーであった。
6.DNA断片の発現
各細胞系からのcDNA調製物を用いて、所望の蛋白質をクローンした。ポリメラーゼ鎖反応を用い、適当なPCRプライマー(前記参照)を利用してcDNA断片を生成させた。適当なDNA断片をDrosophila ハエ・ベクターpRMHA−3にクローン化した。プラスミド調製物は全調製物から調製し、今やハエ細胞へのトランスフェクションの準備ができている。
公表された部分的cDNA配列(Suggsら,PNAS78:6613−17,1981)を用いてヒトβ−2ミクログロブリンを調製し、これを以下のプライマーにてのポリメラーゼ鎖反応(PCR)用の鋳型として用いる。
プライマーを標準的なPCR反応(Nilssonら,Cell 58:707(1989))で使用する。反応生成物をフェノールで抽出し、Genecleanキット(Bio 101,San Diego,CA)を用いて精製し、BamHIで消化し、pBS(Stratagene,La Jolla,CA)のBamHI部位にクローン化した。配列の確認後、このBamHI断片をpRmHA−3のBamHI部位にクローン化する。
実施例に示すごとく、ネズミ・クラスI cDNAを種々の例で用いた。ネズミ・クラスI cDNAは以下のごとくに調製した。
H−2Kb:完全なKb分子をコードするcDNAは以下のごとくに構築した発現プラスミドpCMU/Kbから得られる。リーダー配列およびほとんどのアルファIドメインを欠く部分的H−2KbcDNAは、Reyesら,PNAS 79:3270−74(1982)の方法に従って調製し、pH202を得る。このcDNAを用いて、全長分子を得る。H−2Kb(Caliganら,Nature 291:35−39,1981)をコードするゲノムクローンを鋳型として用いて、NotI部位が隣接する5’プライマー、続いてリーダー配列の最後の7つのアミノ酸をコードする21ヌクレオチドおよびアルファIドメインの始まりに相補的に18ヌクレオチドおよびStyI部位を含む領域に相補的な3’プライマーを用いるPCR反応にて、失われた配列を供する。得られた断片をStyI部位にてpH202で連結する。シグナル配列の残りをコードする5’配列は、BamHI/NotI断片としてのDbcDNA(後記参照)から得られる。全暗号配列をBamHI断片として発現プラスミドから切断し、BamHIで切断したpRmHa−3にクローン化する。
H−2Ld:完全なLd分子をコードするcDNAは発現プラスミドpCMUIV/Ld(JolyおよびOldstone,Gene 97:213,1991)から得られる。完全なcDNAはBamHI断片として真核生物発現ベクターpCMUIV/Ldから切断し、KbとしてpRmHa−3にクローン化する。
前記したごとく、pCMUベクター(pCMUIV)はNilssonら,前掲に記載されているごとくに真核生物ベクターpC81Gから誘導される。今度は、ベクターpC81Gは、Paaboら,EMBO J.5:1921−7(1986)に開示されている方法に従って、pA81G(Paaboら,Cell 33:445−453(1983))から誘導される。
H−2Db:完全なDb分子をコードするcDNAは真核生物プラスミドpCMUIV/Db(JolyおよびOldstone,Science 253:1283−85,1991)から得られる。完全なcDNAをBamHI断片として真核生物発現ベクターpCMUIV/Dbから切断し、KbとしてpRmHa−3にクローン化する。
ネズミβ−2ミクログロブリン:全長ネズミβ−2ミクログロブリンcDNAはHindIII(5’)(クレノウで満たされる)/BglII(3’)断片としてpSV2neo(ATCC番号37149)マウスβ−2ミクログロブリンcDNAから得られ、SmaIおよびBamHIで切断したpRmHa−3にクローン化する。
ベクターphshsneoはネオマイシン(G418)耐性を与え、さらなる熱ショックプロモーター(hs)を持つphsneoの誘導体(pUChsneo)であり、これはStellerら,EMBO J.4:167(1985)に記載されているごとくに商業的に入手可能なpUC8から合成できる。これらのベクターに含有された熱ショックプロモーターはhsp70プロモーターである。ネオマイシン耐性(G418耐性)を与える他の有用なベクターはコスミドベクターsmart2(ATCC 37588)(これはDrosophila hsp70プロモーターの制御下にある)およびプラスミドベクターpcopneo(ATCC 37409)を含む。
C.遺伝子の発現ベクターへの挿入
制限産物を1%アガロースゲル上の電気泳動に付す(Maniatisら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1982))。制限産物をコードするcDNAをゲルから切り出し、製造業者の指示(Bio 101,San Diego,CA)に従い、「Geneclean」を用いてアガロースから精製する。製造業者の指示(Pharmacia,Piscataway,NJ)に従い、発現プラスミドpRmHa−3(図3)を、One Phor All緩衝液中の適当な制限酵素で切断し、製造業者の文献(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)に記載されているごとくにアルカリ性ホスファターゼで処理する。100ngの切断されリン酸化されたpRmHa−3ベクターを300ngのアガロース精製クラスI MHC重鎖cDNAまたはβ−2ミクログロブリンcDNAと混合し、製造業者の文献に従い、T4 DNAリガーゼおよびOne Phor All緩衝液を用いて連結する。16℃における5時間のインキュベーションの後、連結混合物を用いて、コンピテントE.coli JM83(Maniatisら,前掲(1982))を形質転換する。
Maniatisら,前掲に開示されている方法を用いて、必要なcDNAを調製する。MHC重鎖cDNAの存在およびベクター中での向きを制限マッピングによって決定する。メタロチオネインプロモーターに対して正しい向きにあるcDNAと共にベクターを含有する細菌を、アルカリ溶解方法および塩化セシウム勾配精製を用いる大規模なDNAの調製で用いる。得られたDNAの量は分校光度法によって測定する。
D.S2細胞のトランスフェクションおよび標識
10%胎児ウシ血清(55℃で1時間熱処理)、100ユニット/mlのペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシン、および1mMグルタミンを補足したSchneider培地(Gibco/BRL、Grand Island,NY)中でS2細胞を増殖させる。(便宜のため、この補足培地を以後Schneider培地という)。細胞を27℃で増殖させ、典型的には、新鮮な培地中に1:17希釈することによって7日毎に継代する。50%Schneider/5−%Excell 401での最初の希釈によって、無血清培地(100ユニット/mlペニシリン、100mg/mlのストレプトマイシン、1mMグルタミン、および500μg/ml G418(JRH Biosciences,Lenexa,KS)を補足したExcell 400または401)中で、細胞を増殖に転じさせる。1週間後、細胞を10%Schneider培地/90%Excell 401に継代でき、1週間後100%Excell 401に継代できる。細胞をこの培地中に維持し、新鮮な培地中に2:17希釈することによって7日毎に継代する。
ml当たり106細胞の濃度の15×106 S2細胞を85mmペトリ皿中で平板培養する。12時間後、後記するごとくに調製したリン酸カルシウム/DNA沈殿(1ml)を細胞に滴下する。48時間後、上清を注意深く除去し、細胞を、500μg/ml Geneticin(G418)(Gibco/BRL,Grand Island,NY)を含有するSchneider培地50mlの全容量にての175cm2フラスコに移す。21日後、500μg/ml G418を含有するSchneider培地30mlを含有する新鮮なフラスコに、20mlの培養を取り出す。10日後、弱くフラスコに接着し、ほぼ24時間の倍加時間で増殖した細胞の安定な集団が得られ、これらの細胞を引き続いて培養し、前記したごとくに選択培地中で継代する。これらの細胞の凍結したアリコットを、遠心により5−20×106細胞を収集し、それを1mlの細胞凍結培地(93%胎児ウシ血清/7%ジメチルスルホキシド)中に再懸濁することによって調製する。次いで、アリコットを−70℃に1週間置き、引き続いて液体窒素貯蔵に移す。
25μgのDNAをトランスフェクション当たりに使用する以外は、Paaboら(EMBO J.,5:1921−27(1986))によってリン酸カルシウム沈殿を記載されているごとくに調製する。DNAの以下の組合せを用いて、示されたトランスフェクタントを調製する。
(a)MHCクラスI重鎖単独:23μg重鎖発現ベクターDNA+2μgのphshsneo DNA
(b)MHCクラスI重鎖+β−2ミクログロブリン:11.5μg重鎖発現ベクターDNA+11.5μgのβ−2ミクログロブリン(ヒトまたはマウス)発現ベクターDNA+2μgのphshsneo DNA
マウス遺伝子の他の組合せは表1に示す。
代謝標識に24時間先立って、1mM CuSO4を含有するSchneider培地中、3−5×106細胞/ml(10ml/85mmペトリ皿)の細胞密度で細胞を平板培養する。標識に30分先立って、培地を皿から吸引し、細胞を2×10mlのPBSで洗浄し、次いで、メチオニンおよびシステインを除いたGraceの昆虫培地(Gibco/BRL,Grand Island,NYから特別注文)中で20分間、次いで、0.1mCi 35S Trans標識(New England Nuclear;duPont,Boston,MA)を含有するこの培地1ml中でインキュベートする。標識時間の後、標識溶液を吸引し、氷冷PBS/1%トリトンX100(1ml)で細胞を氷上で直ちに溶解させるか、あるいはSchneiderまたはExcell 400培地(5ml)(JRH Biosciences)を含有するメチオニンの存在下での追跡時間の後に溶解する。もし可溶性クラスI MHC分子を分析すべきならば、追跡培地を収集する。
溶解物を冷たく保ちつつ(8℃未満)以下の操作を全て行う。溶解物をエッペンドルフ試験管に収集し、13,000×gにて15分間ミクロ遠心管中で遠心し、プロテインAセファロースの10%スラリー100μlを含有する新鮮な試験管に移し、エンド・オーバー・エンドローター上に2時間置いた。ミクロ遠心管中での15分間のさらなる遠心に続き、細胞溶解物は分析の準備ができている。
ネズミMHCを利用する実験において、CaPO4沈殿法を用い、S2細胞を前記ネズミMHC組換体でトランスフェクトし;各重鎖を単独で、あるいはβ−2ミクログロブリンをコードするベクターとの50:50ミックスとしてトランスフェクトする。ネオマイシン耐性をコードするプラスミド、phshsneoDNAを各トランスフェクションに含めて、選択培地(Geneticin G418−硫酸塩,Gibco/BRL,Grand Island,NY)中でトランスフェクタントを増殖させることによってHCクラス Iを安定に発現した細胞の集団が得られようにした。
E.ペプチド生成
本発明による抗原性ペプチドは天然に存在する源から得ることができるか、あるいは公知の方法を用いて合成することができる。ここに開示する種々の例において、ペプチドはApplied Biosystems合成器,ABI 431A(Foster city,CA)で合成し、引き続いてHPLCによって精製する。
「ランダム」ペプチドの単離または合成も、特に、特定のエピトープを確認して空のMHC分子に前駆体CD8-細胞をもっとも刺激するらしいペプチドを負荷する場合には適当であり得る。「ランダム」ペプチドの混合物はプロテアソーム(例えば、実施例2.B.6参照)の使用を介して、あるいは蛋白質またはポリペプチドを分解プロセス、例えばキモトリプシンでの分解に付すことによって生成させることができるか、あるいはペプチドを合成することができる。我々は本発明の細胞系が蛋白質およびポリペプチドをヒト・クラスI MHC分子に負荷できるより小さなペプチドに分解できることを観察したが、より小さなペプチド、例えば8−量体および9−量体を直接細胞培養に導入して、より迅速な負荷および発現プロセスを容易とするのが好ましい。
もしペプチド、例えばランダム8−、9−および18−アミノ酸ペプチドを合成するのならば、全ての種々のアミノ酸を好ましくは合成の各サイクルの間に取り込む。しかしながら、種々のパラメーター、例えばあるアミノ酸の溶媒不適合性の結果、あるアミノ酸を欠くペプチドを含有する混合物となる。かくして、該プロセスは要すれば、溶媒および反応条件を変更することによって調整して最大種類のペプチドを得るべきである。
前記したごとく、ヒトβ−2ミクログロブリンと複合体化したネズミ重鎖は、もしネズミβ−2ミクログロブリンと複合体化した場合よりもほぼ6−8度高い温度で安定であった。また、ペプチドおよび異種β−2ミクログロブリンによって与えられた安定性は相加的であることが観察された。もし8−9量体を用いれば、12−25量体と比較して、クラスI分子の熱安定性の大きな増加が起こり;事実、より大きなペプチドと比較して8−9量体によって与えられた安定化の間の差異は、従前に観察されたものよりも大きいであろう。というのは、ペプチドはHPLCによって精製されたが、8−9量体によるより大きなペプチドのいくらかの汚染があるからである。
クラスI分子の熱安定性は見かけ上、(1)β−2ミクログロブリンの起源;(2)ペプチドの存在;および(3)このペプチドの長さおよび配列に依存する。
従前の研究(Petersonらに対する米国特許第5,314,813号;Jacksonら,PNAS USA 89:12117−12121(1992))は、クラスI MHC重鎖が単独で、あるいはそれらがβ−2ミクログロブリンと会合した場合にペプチドに結合できることを示している。しかしながら、ペプチド−負荷ヒト・クラスI MHCの表面発現は、重鎖をβ−2ミクログロブリンと複合体化させた後に、分子にペプチドを負荷することによって最高に助長されるようである。
1.ヒトMHCの発現
一旦我々がクラスI分子の熱安定性がβ−2の起源、ペプチドの存在、およびこのペプチドの長さおよび配列に依存すると判断したので、我々は、ペプチド−負荷ヒト・クラスI MHC分子の発現を介して、CD8-細胞を特異的に活性化できる細胞系の生成でこの情報を利用した。
熱不安定性はクラスI分子の固有の特性のようであり;それは、恐らくは、ペプチドを含有しないかまたは貧弱な結合特性(これは、熱安定性をほとんど与えない)のペプチドを含有するクラスI分子が自己破壊することを確実にするように展開している。このようにして、細胞はその表面上の空のクラスI分子の数を最小化する。というのは、かかる状況は、恐らくは、外因的に誘導されたペプチドは結合され提示される点で危険だからである。ヒトβ2と共に昆虫細胞で発現されたヒト・クラスI分子は37℃での延長されたインキュベーションに対して安定ではなく;クラスI分子へのペプチド負荷に欠陥があるこれが示された突然変異体細胞系T2で発現されたヒト・クラスI分子もそうでなかった(HoeskenおよびBevan,Science 248:367−70(1990);Cerundoloら,Nature 345:449−452(1990))。かくして、重鎖とβ−2ミクログロブリンとの間の親和性は分子の共−進化を通じて注意深く保存され、従って、空のクラスI分子、または貧弱に結合するペプチドを担持するものは、「宿主」生物の体温で自己破壊するようである。
ヒト・クラスI MHC分子をS2細胞で発現させた。従前に記載されている方法を用い、ヒトβ−2ミクログロブリンおよびHLA A2.2Y、HLA A2.1、HLA B7、またはHLA B27を共発現する細胞系を確立した。略言すると、前記蛋白質をコードするcDNAをDrosophila発現ベクターpRmHa−3にクローン化し、ここに開示する方法を介して、ヒトβ−2ミクログロブリン含有プラスミドphshsneoプラスミドでS2細胞に共トランスフェクトした。3週間または4週間後、G418−耐性T−細胞の集団を新鮮な選択培地で1:5希釈した。一旦健康に増殖する細胞集団が得られたならば、CuSO4を細胞のアリコットに添加し、24時間後、β−2ミクログロブリンと会合した場合にヒト・クラスI重鎖の単形決定基を認識するモノクローナル抗体W6/32(ATCC HB95、Bethesda,MD)を用いるフローサイトメトリーを介して細胞を分析した。(Barnstableら,Cell 14:9(1978)参照)。CuSO4の添加によって、ヒト・クラスI分子の各々の高レベルの発現が誘導された(データは示さず)。これらの安定な集団を、後記するサイトフロメトリーを用いる高発現細胞のために貯蔵した。全ての引き続いての実験で用いたのは細胞のこれらの分けた集団である。
FACS分析に24時間先立って、CuSO4を安定にトランスフェクトされたS2細胞(3−4×106細胞/ml)に1mMの最終濃度まで添加し、それによりトランスフェクトされた遺伝子からの発現に「スイッチを入れた」。細胞を24−ウェル培養皿中で平板培養した(ウェル当たり2ml)。FACS分析に8時間先立って、CuSO4培地を、50μg/mlの濃度のペプチドを含むまたは含まない新鮮な培地(1ml)で置き換える。分析のために細胞を収穫するに先立って、種々の時間間隔にて37℃の室内で皿を平坦な表面に移すことによって、37℃の温度攻撃を行う。
S2細胞でのクラスI MHCの表面発現を分析するために、細胞のアリコット(5×105)を氷上の試験管に移し、遠心(1,000×g、4分間)によって収集し、3mlのPBS/1%BSA、0.02%アジ化ナトリウムに再懸濁し、遠心によって収集し、適当な一次抗体(腹水Y3、28:14:8S、30.5.7.,W6/32,1:200希釈)を含有するPBS/BSA(0.5ml)に再懸濁する。ウサギ抗血清を1:500希釈し、B22.293ハイブリドーマ上清を直接用いる。氷上での1時間のインキュベーションの後、細胞を3mlのPBS/BSA中で2回洗浄し、FITC標識二次抗体(Cappell,Durham,NC)および1ng/mlヨウ化プロピジウムを含有するPBS/BSA0.5mlに再懸濁する。氷上での30分のインキュベーションの後、細胞をPBS/BSAで1回洗浄し、1×106/mlの濃度のこの緩衝液中に再懸濁する。次いで、FACS 440(Becton Dickinson)によって試料を分析する。ヨウ化プロピジウムで染色された死滅細胞を、分析に生ゲートを含ませることによって排除する。
細胞ソーティングのために、全ての染色操作を滅菌フード中で行う以外は、前記で概説したのと同一の手法を用いる。抗体を含む溶液を濾過滅菌し、PBS/BSAの代わりにSchneider培地またはExcell 400を用いる。一次抗体に特異的に結合する細胞を、Becton Dickinsonセルソーターを用いて分ける。分けた細胞(2−8×105)を、2×105細胞/mlの濃度で平板培養する前に培地中で1回洗浄する。
F.ペプチドとのイン・ビトロインキュベーションによる膜−結合した空のMHC分子の負荷
Drosophila細胞の表面で発現されるヒト・クラスI分子が空の場合、細胞を37℃で2時間インキュベートし、細胞表面発現をサイトフルオリメトリーによって分析した。HLA B27およびA2.1双方の表面発現は、もし細胞を37℃で2時間インキュベートすると大いに低下する;しかしながら、クラスI分子に結合することが知られているHIVペプチド中で細胞をプレインキュベートすると、クラスIに対して有意な熱安定性が与えられ、他方、結合しないペプチドはほとんど効果を有しない(図4参照)。(HIVのPOL蛋白質からの9−アミノ酸ペプチドILKEPVHGV(配列番号42)はHLA A2.1に結合し、それを安定化する。HIVのVpr蛋白質からの9−アミノ酸ペプチドはB27(FRIGCRHSR;配列番号41)に結合しそれを安定化させる)。これらのデータは、Drosophila細胞の表面で発現されたヒト・クラスI分子が空であり、結合特異的HIVペプチドによって安定化できることを示す。
図4および5は、HIVペプチドによるDrosophila細胞の表面に発現されたHLA B27およびHLA A2.1のペプチド−誘導熱安定化を示す。HLA B27またはA2.1いずれかを発現するDrosophila細胞を示したペプチドと共にインキュベートし、次いで、(ATCC HB95からの)抗体W6/32およびサイトフルオリメトリーの使用によるクラスI分子の表面発現の分析に先立って、2時間28℃で維持するか、あるいは37℃でインキュベートした。各細胞集団の平均蛍光をインキュベーション時間に対してプロットして示す。HIV POLペプチド(ILKEPVHGV,配列番号42)はA2.1を安定化させるがB27を安定化させず(図4)、他方、HIV Vprペプチド(FRIGCRHSR、配列番号41)はB27を安定化させるがA2.1を安定化させない(図5)。
実施例2
合成抗原−提示細胞の調製
A.浸透圧負荷
オボアルブミン蛋白質でのSC2および3T3細胞の浸透圧負荷はMoorseら,Cell 54:777−785(1988)によって記載されているごとくに行った。アッセイ手法は以下の通りである。96−ウェルの皿中、1×105Drosophila細胞(負荷したペプチド/蛋白質を含むまたは含まない)または3T3細胞を、10%胎児ウシ血清を補足したRPMI培地200μl中の1×105 B3/CD8T−細胞ハイブリドーマ細胞と共に培養した。インキュベーションの24時間後、これらの培養からの上清100μlを5,000のCTLL細胞を含有するRPMIの100μlに添加した。1μCiの3Hチミジン(Amersham)を添加すると、細胞を37℃で24時間共培養した。37℃における15時間のさらなるインキュベーションの後、放射性同位体標識のCTLL細胞への取り込みをシンチレーションカウンティングによって測定した。
また、ネズミMHCで行ったアッセイにより、昆虫細胞はペプチドをクラスI分子に負荷することができることが確認された。特定の抗原を含有する200−500と少ないMHC分子を発現する細胞はT−細胞によって検出できる。Drosophila細胞はクロムを蓄積しないので、B3/CD8、T−細胞ハイブリドーマに基づく抗原提示アッセイを用いた。B3/CD8はB3(H−2KbクラスI分子によって提示されるオボアルブミンペプチド253−276に特異的な細胞傷害性T−細胞)、およびCD8−を担持するIL−2分泌細胞系の間のハイブリドーマである(Carboneら,前掲,1989参照)。抗原刺激に際して、IL−2−依存性T−細胞系CTLLへの3Hチミジン取り込みによって測定するとB3/CD8はIL−2を産生する(Gillisら,J.Immunol.120:2027(1978))。かくして、産生されたIL−2の量を測定することによって、T−細胞認識についてのアッセイをすることができる。
OVAペプチドが由来するオボアルブミン蛋白質の細胞内プールを供するために、オボアルブミン(Sigma Chem.Co.,MO)をMooreら,前掲(1988)によって記載されているごとくに浸透圧により細胞に負荷した。負荷の直後、細胞をT−細胞ハイブリドーマと混合した。2日間のインキュベーションの後、培地を取り出し、IL−2につき検定した。IL−2の量は、IL−2−依存性T−細胞系CTLLの増殖を支持する培地の能力によって測定し(Gillisら,前掲,1978)、増殖は、細胞へ取り込まれた放射性チミジンの量によって定量した。
Kb/β2でトランスフェクトしたS2または3T3細胞を、等張(Iso)または高張(Hyp)培地中、オボアルブミン蛋白質(OvPro)またはオボアルブミンペプチド、OVA24(OvPep)と共にインキュベートした。(ネズミ細胞系は受託番号CCL163でATCCから入手可能である。)処理後、細胞をT−細胞ハイブリドーマB3/CD8と共培養した。B3/CD8は、B3(Carboneら,J.Exp.Med.169:603−12(1989))、H−2KbクラスI分子によって提示されたオボアルブミンペプチド253−276に特異的な細胞傷害性T−細胞、およびCD8を担持するIL−2分泌細胞系との間のT−細胞ハイブリドーマである。抗原刺激に際して、IL−2−依存性細胞系CTLLへの3Hチミジンの取り込みによって測定して、B3/CD8はIL−2を産生する(Gillisら,J.Immunol.120:2027(1978))。かくして、産生されたIL−2の量を測定することによって、T−細胞認識につき検定できる。共培養からの上清は、IL−2−依存性細胞系CTLL(ATCC番号 TIB214)による3HチミジンによってIL−2につき分析した。取り込まれた3Hチミジンの量を最初の細胞処理に対してプロットする。
図6より、もしオボアルブミンペプチドを培養基に添加したならば、T−細胞はDrosophila細胞によく応答し、もし細胞にオボアルブミンペプチドを負荷すれば、認識は起こらないことが分かる。昆虫細胞の細胞表面に発現されたMHCクラスI分子は、もしペプチドを培養基に添加したならば該ペプチドに結合できる点で十分に機能的であり、T−細胞によってそれが認識されるよう正しい意味でそれを提示できる。
B.イン・ビトロ条件の最適化
特異的細胞傷害性T−細胞の生成のためのイン・ビトロ条件の最適化のために、Drosophila細胞刺激体細胞の培養を好ましくは無血清培地(例えば、Excell 400)中で維持する。Drosophila細胞刺激体細胞を好ましくは>20μg/mlペプチドと共にインキュベートする。エフェクター:刺激体比率(リンパ球:Drosophila細胞比率)は好ましくは約30:1ないし300:1の範囲である。最大特異的CD8+は一般に5日間の培養の後に観察される。
アッセイを殺すための標的細胞の培養は好ましくは無血清培地に維持する。
実施例3
アーム付きエフェクターT−細胞の増殖および分化の刺激
我々は、MHCクラスI分子および特異的助力(assisting)分子でトランスフェクトしたDrosophila S2細胞がイン・ビトロでT−細胞からの一次応答を刺激できることを見い出した。我々はマウスモデル系から本実施例において以下のデータを示す。本実施例では、マウスMHCクラスI(Ld)、β2ミクログロブリン、特異的助力分子をコードする構築体を用い、T−細胞受容体導入マウスのリンパ節からのCD8+細胞でテストした。
図7のデータは、トランスフェクトされたDrosophila S2細胞がトランスフェクトされたネズミ遺伝子の蛋白質産物を発現する証拠を提供する。蛍光活性化セルソーター(FACS)および蛍光的に標識した抗体を用いるフローサイトメトリーを用いて、トランスフェクトされたDrosophila S2細胞によるLd(重鎖およびβ2を含むMHC分子)および特異的助力分子B7.1(CD80)およびICAM−1(CD54)の発現を示した。トランスフェクトされた細胞をFACSで分離して、Ld分子を発現する細胞が得られ、次いで、イン・ビトロで維持した。
Drosophila S2細胞のトランスフェクションを表2にまとめる。該データは、CuSO4での誘導後における細胞系でのフローサイトメトリーによって測定されたLd、B7.1およびICAM−1発現を示す。対照抗体(ctrAb)に対し、トランスフェクタントの全ては細胞表面でLd分子を発現することが明らかである。同様に、LdおよびB7.1で共トランスフェクトされた細胞(Ld.B7)はICAM−1ではなくB7.1を発現し、他方、LdおよびICAM−1で共トランスフェクトされた細胞(Ld.ICAM)はB7.1ではなくICAM−1を発現し;Ld、B7.1およびICAM-1での三重トランスフェクション(Ld.B7.1.ICAM)は3種の分子全ての発現に導いた。
標準的な組織培養系(Cai,Z.およびSprent,J.(1994)J.Exp.Med.179:2005−2015)を用い、5×104用量の精製CD8+2Cリンパ節(LN)細胞を、3×105用量のトランスフェクトされたハエ細胞±ペプチド(10μM最終濃度)と共に37℃で培養した。ペプチドはR.W.Johnson Pharmaceutical Research Institute(Sykulevら,(1994)Immunity 1:15−22によって合成した。増殖応答は、収穫の8時間前に3HTdR(1μCi/ウェル)を添加することによって測定した。IL−2産生は、48時間に培養から上清を取り出し、50μlの上清をIL−2応答インジケーター細胞系(CTLL)に添加することによって測定した;インジケーター系の増殖は3HTdRの添加によって測定した。表2に示されるデータは三連の培養の平均値である。トランスフェクトされたDrosophila S2細胞は37℃で迅速に死滅し、この温度では3HTdRを取り込まなかった。
表2におけるデータは、トランスフェクタントがマウスT−細胞の一次応答を刺激できることを示す。
表2
2C T−細胞受容体導入マウスからのCD8+リンパ節細胞による一次増殖応答およびIL−2産生を刺激するトランスフェクトされたハエ細胞の能力
2C T−細胞受容体(TCR)は、ある種のペプチド、例えばp2Ca(配列番号46)またはQL9(配列番号47)と複合体化したLd分子に対して強力に反応性である。これらの2種のペプチドは、可溶性Ld分子に対して中程度ないし高い親和性を有する(p2Caにつき4×106M-1、およびQL9につき4×109M-1(Sykulevら))。可溶性Ld分子に複合体化させた場合、2種のペプチドは可溶性2CTCR分子に対して高い結合親和性を有する。しかしながら、TCR結合およびLd結合双方において、QL9ペプチドはp2Caペプチドよりも高い親和性を明らかに有する。
表2は、より弱いペプチドp2Caに対する応答体2C細胞による増殖応答およびIL−2産生が、刺激体Ld−トランスフェクト細胞がB7.1およびICAM−1双方を発現すること;Ld+B7.1またはLd+ICAM−1いずれかを発現する細胞の混合物は非刺激性であるを要することを示す。対照的に、より強いペプチドQL9に関しては、B7またはICAMを発現するLd.ハエ細胞は明らかに有意な応答を誘導するが、B7およびICAMの組合せ発現はかなり高い応答を生成する。T−細胞増殖についてのこれらの発見とは対照的に、QL9ペプチドに応答してのIL−2産生はB7およびICMAの同時発現を要し;別々の細胞でこれらの分子の発現は効果的でない。
結果は、ネズミ・クラスI分子および共刺激性分子でトランスフェクトされたDrosophila細胞がペプチド抗原に応答してT−細胞を誘導して、一次増殖応答およびリンホカイン(IL−2)産生を上昇させることを示す。また、該系はヒトT−細胞に適用でき、これを用いて、イン・ビトロで腫瘍−特異的抗原に特異的な非感作(または感作)T−細胞を刺激することができ;腫瘍−特異的抗原に特異的なクローン的に増殖したT−細胞のイン・ビボ融合は癌を持つ患者を治療するであろう。ウイルス抗原に特異的なT−細胞の融合はウイルス感染、例えばHIVを持つ患者で有用であろう。
実施例4
アビジン−被覆赤血球細胞に対するビオチニル化MHC分子の固定化
NHS−LC−ビオチン、ニュートラアビジンおよびビオチン−BMCCはpierce(Rockford,IL)から購入した。ヒツジ赤血球細胞はColorado Serum Company(Denver,CO)から得た。Ldおよび組換えLdを発現するDrosophila S2細胞は実施例1および2に記載したごとくに調製した。モノクローナル抗体30.5.7(抗−Ld)および1B2(2C T−細胞受容体に対する抗−クロノタイプ抗体)はハイブリドーマ細胞培養上清として用いた。
使用したプロトコルはMuzykantovおよびTaylor(Anal.Biochem.(1994)223,42−148)によって記載されている。略言すると、SRBCをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で4回洗浄し、NHS−LC−ビオチンを用いてビオチン化し、PBS中で再度4回洗浄し、ニュートアビジンと共にインキュベートし、最後に4回洗浄し、3%胎児ウシ血清および0.02%アジ化ナトリウムを含有するPBS中、4℃で保存した。
ビオチン−BMCC、チオール基と反応するマレイミドにカップリングしたビオチンを用い組換えLdをビオチン化した。Ldは遊離チオール基、システイン121の側鎖(これは、ペプチド結合部位にはない)を呈する。ビオチン化は製造業者によって推奨されるごとくに行った。未反応ビオチンをCentricon10を用いて除去した。
アビジン−被覆SRBCと共に0.2mg/mlの最終濃度で30分間インキベートし、続いて、10%胎児ウシ血清を含有するDMEM中で洗浄することによって、ビオチン化Ldを固定化した。Ldが付着したSRBCを直ちに使用した。
マウスのリンパ節からの2C TCRトランスジーンを発現するT−細胞を、磁性枯渇(magnetic depletion)によって精製した。精製したT−細胞は、抗−クロノタイプ抗体1B2を用いるサイトフルオロメトリーにおける染色に終始97−98%陽性であった。
ビオチン化Ldのアビジン−被覆SRBCへの固定化は前記したごとくに行った。付着は、抗−Ld抗体30.5.7を用いるフローサイトフルオロメトリーを用いて評価した。
典型的な実験は図8に示す。陰性対照(細胞マイナス抗体)は点線で示す。塗られたピークは蛍光抗体で標識された細胞よりなる。細胞の99.78%が標識された。蛍光強度は、我々が合成抗原−提示細胞上のLdにつき観察した強度の最高レベルと同一範囲であった。
同一手法を用い、Kb(重鎖およびβ2を含むMHC分子)もビオチン化した。我々は、フローサイトフルオロメトリーによって評価してアビジン−被覆SRBC上にビオチン化Kbを固定化することができた(図9)。細胞の99.88%が標識された。
ロゼッティング実験により、付着MHC分子がT−細胞と機能的に相互作用することが確認された。Ld、Ld−被覆SRBCを発現するDrosophila S2細胞を氷上でQL9ペプチド(0.02mM)または無関係ペプチド(MCMV、0.02mM)と共に30分間インキベートし;次いで、2C+T−細胞を添加し、1Drosophila S2細胞につき2C+T−細胞であり、あるいは1 2C+T−細胞につき10SRBCであり;混合物をペレット化し、氷上に少なくとも30分間保持した。次いで、細胞を注意深く再懸濁し、ロゼットをカウントし、ロゼットは少なくとも3つの2C+T−細胞に結合したDrosophila S2細胞、または少なくとも3つのSRBCに結合した2C+T−細胞である。ロゼットは全ての場合に観察された。典型的には、QL9ペプチドを添加した場合、リンパ球の30−40%がロゼットに含まれた。無関係ペプチドの存在下ではロゼットは観察されなかったが、場合により少数の単細胞の付着が観察された。
これらの例は、大量のMHCクラスI分子を、モノクローナル抗体結合およびロゼッティング実験(T−細胞受容体結合)によって判断して、天然のコンフォメーションにて、種々の表面(ハエ細胞、赤血球細胞、ラテックスビーズ)に固定化する新しい方法を記載する。この方法は人工リン脂質膜を含めた他の合成表面へ拡大させることができる。ホスファチジルエタノールアミンならびにアビジンがカップリングしたリン脂質は我々の研究に特に関係がある。これらのリン脂質はLipex Biomembrane Inc.,Vancouver,BC,カナダ国から商業的に入手可能である。
実施例5
アビジン−被覆ラテックスビーズへのビオチン化MHC分子の固定化
6ミクロン直径ラテックススルフェートビーズはInterfacial Dynamics Corporation(Portland,OR)から購入し、実施例4に記載したプロトコルに従ってビオチン化した。
アビジン−被覆ラテックスビーズは、室温で1mg/mlのニュートラアビジンを含有するPBS中にて1時間インキュベートしたラテックスビーズの1%懸濁液を用いて調製した。次いで、10%胎児ウシ血清を含有する等容量のPBSを添加した。室温でのインキュベーションの1時間後、ビーズを3回洗浄し、組換えビオチン化Ldの結合に用いた。
組換えビオチン化Ldは、アビジン−被覆ラテックスビーズと共に0.2mg/mlの最終濃度でインキュベートし、続いて10%胎児ウシ血清を含有するDMEM中で洗浄することによって固定化した。Ldが付着したSRBCを直ちに使用した。
ロゼッティング実験により、ラテックスビーズ上に付着したMHC分子はT−細胞と機能的に相互作用することが確認された。組換えLdおよびLd−被覆ラテックスビーズを発現するDrosophila S2細胞を氷上でQL9ペプチド(0.02mM)または無関係ペプチド(MCMV、0.02mM)と共に30分間インキュベートし;次いで、2C+T−細胞を添加し、割合は1Drosophila S2細胞につき10の2C+T−細胞、または1の2C+T−細胞につきLd−ラテックスビーズであり;混合物をペレット化し、氷上に少なくとも30分間保持した。次いで、細胞を注意深く再懸濁し、ロゼットをカウントし、ロゼットは少なくとも3つの2C+T−細胞に結合したDrosophila S2細胞、または少なくとも3つのラテックスビーズに結合した2C+T−細胞であった。ロゼットは全ての場合に観察された。典型的には、QL9ペプチドを添加した場合、リンパ球の30−40%がロゼットに含まれた。無関係ペプチドの存在下ではロゼットは観察されなかったが、場合によってし少数の単細胞の付着が観察された。
実施例6
プラスチックマイクロウェルプレートのごとき種々の固体支持体に結合させた組換え蛋白質の固定化および検出
MHC分子はマイクロタイタープレート(Corning)への直接結合によって固定化し、以下のごとくに検出した。
MHC Kb分子をPBS中に所望の濃度まで、例えば、100ng/ウェルに対して0.001g/mlまで希釈した。100μlの希釈したKbをプラスチックマイクロタイタープレート上の各ウェルに添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをPBSで1回洗浄し、PBS+(0.05%)およびTween(PBST)中の200μlの2%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加し、室温でさらに1時間インキュベートした。プレートをPBSTで3回洗浄し、ビオチン化抗−KbmAbをPBS中の2%BSAに添加した(1:2500)。プレートを室温でさらに1時間インキュベートし、PBSTで3回洗浄した。アビジン−コンジュゲーテッドHRPをPBS中の2%BSAに添加した(1:2500)。室温でのさらに1時間後、プレートをPBSTで3回洗浄し、H2O2またはトフェニルジアミンを添加した。H2SO4で反応を停止させた。反応生成物を490nmで比色法により検出した。
図10は、3つの異なるモノクローナル抗体を用いる、MHC Kb分子の存在の検出結果を示す。
別法として、組換えMHC Kb分子はビオチン−アビジン連結相互作用を介して基質と結合することができる。この具体例では、マイクロウェルプレートをPBS中に0.001mg/mlの濃度に希釈した100μlアビジンで被覆した。過剰のアビジンをPBS洗浄によって除去した。Kbを提示しその結合を検出する前記手法を次に行った。
別法として、基質に結合したニッケルと相互作用するMHCに付加されたポリヒスチジンタグに基づく結合によって組換えMHC分子を固定化することもできる。
ニッケルキレート被覆マクイロウェルプレート(Xenopore)を用いて、結合および検出についての前記手法を行い、前記ベクターpRmHa/His6を用いて、ポリヒスチジンタグを持つ組換えMHC分子を発現させた。
実施例7
可溶性の空のクラスI MHC分子へのイン・ビトロでのペプチドの直接結合
A.手法
H−2Kb:実施例1.Bに記載したごとくに調製。
H−2Kb Sol:Kb sol cDNAは、クラスI MHC分子の細胞外部分をコードする、Kbの誘導体である。Kb sol cDNAは、Ennisら,PNAS USA87:2833−7(1990)およびZemmourら,Immunogenetics 33:310−20(1991)に記載されているもののごとき、公知方法に従ってPCRによって生成させることができる。具体的には、アミノ酸位置+275のアルファ3ドメインの末端に挿入された停止コドンを持つ切形Kb分子をコードするcDNAをBamHI断片としてpCMU発現プラスミドから切り出し、Kb cDNAとしてpRmHa−3にクローン化する。Kb sol cDNAは完全なKb cDNAの誘導体であり(前記参照)、これはStyI部位を含む5’オリゴヌクレオチド、および以下の3’オリゴヌクレオチドを用いるPCR反応において鋳型として用いる。
得られたPCR断片を平滑末端とし、pBS(Stratagene,La Jolla,CA)のSmaI部位にクローン化し、配列決定し、Kbの残りの5’配列をStyI部位にクローン化する。完全なKb蛋白質をコードするcDNAはBamHI制限断片として得ることができた。
H−2DbおよびH−2Ldは前記実施例1.Bに記載したごとくに調製する。
Kb α1α2α3ドメイン(274残基)およびネズミβ−2ミクログロブリン(99残基)をコードするcDNAを、各々、メタロチオネインプロモーターpRMHa−3(Bunchら,Nucleic Acid Res.16:1043−1061(1988))を保有する発現ベクターの唯一のBamHI部位にクローン化した。前記したリン酸カルシウム沈殿法によって、プラスミドphshsneo(ネオマイシン耐性遺伝子を含有)に加えてこれらの組換えプラスミドでDrosophila S2/M3細胞を形質転換した。ネオマイシン−アナログ抗生物質G418に対し曙択された形質転換細胞を無血清培地中で27℃にて増殖させ、0.7mM CuSO4の添加によって可溶性重鎖Kbおよびβ−2ミクログロブリンを共発現させた。
製造業者(Pharmacia,Piscataway,NJ)の指示に従い、抗−Kbモノクローナル抗体Y3を用いるアフィニティークロマトグラフィー、続いてPharmacia Mono Q FPLCカラム上のイオン交換クロマトグラフィーによって、Kbの組み立てられたヘテロダイマーを培養上清から精製した。Kb調製物のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)、続いてのクーマシーブルーでの染色は、約32,000における相対的分子量(Mr)のただ1つのバンドおよび約12,000におけるMrの1つのバンドを示し、検出可能な不純物はなかった。高度に精製されたKbをリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に対して透析し、濾過滅菌し、さらなる実験の使用した。可溶性Kb(「Kbsol」)蛋白質(43.2kDa)の吸光係数は280nmにおいて69,200M-1cm-1である。
1%TX−100を含有するまたは含有しないPBS中の精製されたKbsol(0.3μM)を種々の温度(すなわち、4℃、23℃、32℃、37℃、42℃および47℃)に1時間暴露した。次いで、4℃にて、モノクローナル抗体Y3およびプロテインAセファロースビーズ(Pharmacia,Piscataway,NJ)と共にインキュベートすることによって、蛋白質を2時間で各々免疫沈降させた。12.5%SDS−PAGE、続いてのクーマシーブルーでの染色によって試料を分析した。ゲル上の2つの濃厚なバンドは抗体Y3の軽鎖および重鎖である。もう1つの手法において、Kbsol(0.3μM)を23℃にてPBS中の50μMペプチドと共に2時間インキュベートして、Kbsol−ペプチド複合体を形成させた。1%TX−100の添加の後、試料を12℃、37℃または47℃の温度に1時間暴露した。複合体を免疫沈降させ、前記したごとくにSDS−PAGEによって分析した。第3の手法において、23℃にて、Kbsol(2.7μM)を、各々、50μMのOVA−8、VSV−8またはSEV−8ペプチドと共に2時間インキュベートした。試料を5%ポリアクリルアミドIEFゲルに適用した。IEFをpH5−7から流し、ゲルを銀で染色した。
次に、クロラミン−T方法(Hunterら,Nature194:495−6(1962))を用いてVSV−8ペプチドを放射性ヨウ素標識し、C18カラム(OPC cartridge,Applied Biosystems,Foster City,CA)によって遊離125Iを除去した。標識したペプチドをC18逆相HPLCによってさらに精製した。溶出の後、標識ペプチドを凍結乾燥し、PBS中に再懸濁した。
274nmにおけるチロシンの吸光係数(1420M-1cm-1)を用いることによって、[125I]VSV−8の特異的活性(約250Ci/ミリモル)を分光光度法によって測定した。まず、23℃にてKbsol(0.5μM)を[125I]VSV−8(1.5nM)および未標識VSV−8(50nM)と16時間で混合して、複合体形成を行った。試料の一部をPBS中のゲル濾過(Superose12,Pharmacia,Piscataway,NJ)によって分析した。溶出後、各画分(0.05ml)に含まれる放射能を測定した。280nmにおける吸光度によって蛋白質をモニターした。
第2の手法において、[125I]VSV−8(0.39nM)を、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBS中の種々の濃度のKbsolと混合した。23℃における2−16時間のインキュベーションの後、PBS中の小ゲル濾過(Bio−Gel P30,BioRad,Richmond,CA)によって、Kb−ペプチド複合体を遊離ペプチドから分離した。P30ゲル濾過は約5分以内に結合および遊離ペプチドの95%を越える分離を可能とした。結合および遊離ペプチドの放射能を測定し、データを直線回帰によって解析した。供されたKbsolの最大レベルにおいて、全標識ペプチドの約65%が結合した。Kbsol蛋白質への標識ペプチドのこの最大結合能力は、恐らくは、VSV−8に結合した125Iによる放射のため、時間と共に低下した。
第3の手法において、各試料は0.39nMの[125I]VSV−8(約18,000cpm)、示した濃度の未標識ペプチド、および72μlの最終容量で未標識ペプチドの不存在下で[125I]VSV−8結合の約50%を与える30nMのKbsolを含有した。全ての成分を溶解させ、1%BSAを含有するPBSに希釈した。23℃における2−16時間のインキュベーションの後、前記したP3Oゲル濾過によって50μl試料を分析した。未標識ペプチドについての解離定数を[125I]VSV−8および未標識ペプチドのモル濃度から決定し、前記したKbsolへの[125I]VSV−8結合の50%阻害を与えた。(Mullerら,Meth.Enzymol.92,589−601(1983)参照)。
次いで、4℃、23℃および37℃で、Kbsol(0.3μM)および[125I]VSV−8(0.39nM)をインキュベートし、P30ゲル濾過によって種々の時点で会合を測定した。示した濃度でのインキュベーションの前に、要すれば、ネズミβ−2ミクログロブリンを添加した。組換えDrosophila細胞の培養上清から抗−β−2ミクログロブリンポリクローナル抗体K355を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、ネズミβ−2ミクログロブリンを調製した。(Logdbergら,Molec.Immun.14:577−587(1979)も参照)。もう1つの実験において、23℃にて、Kbsol(0.3μMまたは1.8μM)および[125I]VSV−8(2.4nM)を2時間インキュベートし、P30ゲル濾過によってペプチド−Kbsol複合体を単離した。試料は非常に少量の[125I]VSV−8およびKbsol複合体(最大で2.4nM)ならびに約50ないし300nMの最終濃度の空のKbsolを含有した。いくらかの試料に、3μMのβ−2ミクログロブリン、3μMのβ−2ミクログロブリン+20nMの未標識VSV−8、20μMの未標識VSV−8、または1%TX−100を添加した。37℃で試料を種々の時間インキュベートし、P30カラムを通すことによって解離を測定した。
B.考察
クラスI MHC分子は抗原性ペプチドを細胞傷害性T−リンパ球に提示する。イン・ビトロでのペプチドのクラスI分子への直接結合は、結合部位における先に結合したペプチドの存在(ChenおよびPerham,Nature 337:743−5(1989))または結合特異性の欠如によって妨害された。(例えば、Frelingerら,J.Exp.Med.172:827−34(1990);Choppinら,J.Exp.Med.172:889−99(1990);Chenら,J.Exp.Med.172:931−6(1990)参照)。切形H−2Kbsolおよびネズミβ−2ミクログロブリン遺伝子で形質転換したDrosophila細胞から精製された可溶性の空のクラスI分子へのペプチド結合のイン・ビトロ分析はをここに開示する。結果は、ペプチド結合が非常に迅速で、天然でプロセッシングされたペプチド(オクタペプタド;例えば、Van Bleakら,Nature348:213−6(1990);Falkら,Nature351:290−6(1991)参照)はナノモル範囲のKbsolに対する最高の親和性を有することを示し、オクタペプタドと複合体化したKbsolは安定であるが、他方、わずかに短いまたは長いペプチドと複合体化したものは寿命が短いことを示す。遊離重鎖およびβ−2ミクログロブリンとの間の相互作用は、界面活性剤の不存在では基本的に可逆的である。ペプチドは、β−2ミクログロブリンの解離なくして、自然発生的に空のクラスI分子の結合する。しかしながら、過剰のβ−2ミクログロブリンは、ヘテロダイマーが不安定である条件下での遊離重鎖とβ−2ミクログロブリンとの再会合の結果として、空のクラスIへのペプチドの結合を明らかに促進する。
(重鎖のα1α2α3ドメインよりなる)可溶性H−2Kb分子およびネズミβ−2ミクログロブリンを、切形重鎖およびβ−2ミクログロブリン遺伝子で同時に形質転換されたDrosophila細胞の培養上清から精製した。予備的実験は、Drosophila細胞が細胞表面の内因性ペプチドを欠くクラスI MHC分子を発現することを示唆した。空のクラスI分子の特性のいくつかは、それらが37℃で安定性が低く、それらの構造はペプチドの結合によって安定化されるという観察を含む。(例えば、Schumacherら,Cell 62:563−7(1990);Ljunggrenら,Nature 346:476−80(1990)参照)。精製された可溶性Kbも空であることを確認するために、界面活性剤を含まない溶液中でのそれらの熱安定性を調べた。驚くべきことに、47℃で1時間加熱された蛋白質は、コンフォメーション抗体Y3を用いる免疫沈降によって十分回収された。この予期せぬ結果は我々をして界面活性剤、1%トリトンX−100(ポリオキシエチレン(9)オクチルフェニルエーテル)を蛋白質溶液に添加せしめた。というのは、クラスI分子の安定性をテストするための同様の実験は界面活性剤溶解物中で常に行われてきたからである(Schumacherら,前掲参照)。界面活性剤の存在下で得られた結果は、精製されたKbsolが今や37℃で不安定であることを示す。このおよび他の系列の証拠は、Kbsolヘテロダイマーが高温で重鎖およびβ−2ミクログロブリンに解離し、β−2ミクログロブリンが解離した遊離重鎖と再会合するのを界面活性剤が妨げることを示唆する(後記参照)。第2に、ペプチドで精製されたKbsolを安定化させる可能性を調べた。最初に記載した実験の結果は、ペプチドは、それが天然にプロセッシングされたペプチドであることが示された(Van Bleekら,前掲引用)オクタペプタド(水泡性口内炎ウイルスヌクレオキャプシド蛋白質[VSV−8]、後記表3参照)と混合された場合のみ安定化できることを示唆する。これらの観察は前記した空のクラスI分子の特性と合致する。
精製されたKbsol分子は空であるという独立したサポートは、天然条件下での等電点電気泳動(IEF)によって供される(データは示さず)。Drosophila細胞から精製された可溶性Kbはヒト・リンパ芽球細胞系から精製されたHLA−A2分子よりもかなり単純なパターンを呈した(Silverら,Nature 350:619−22(1991)の図3参照)。IEFでのHLA−A2の複雑なパターンは、分子に結合した異種ペプチドの存在の結果と推定される。精製されたKbsolの単純なバンドは内因性ペプチドの不存在を示す。加えて、Kbsolと抗原性ペプチドとのインキュベーションはIEFゲルでのバンドの顕著なシフトを引き起こし、これはペプチド結合によるKbsolの等電点の変化を反映する。先に結合した内因性ペプチドの除去後に、HLA−A2を「復元条件」にペプチドと共にインキュベートするのでなければ、かかるバンドのシフティングは、HLA−A2分子をペプチドと単純に混合した場合は該分子では観察されなかったことに注意すべきである。考え併せると、天然IEF上でのこれらの観察も、Drosophila細胞から精製された可溶性Kbが空であることを示す。
125I−標識VSV−8とKbsolとの会合がゲル濾過によって示された(示さず)。高分子量物質の放射能はペプチド−Kbsol複合体に対応し、他方、低分子量物質のそれは遊離ペプチドに対応する。未標識VSVおよびオボアルブミン(OVA)ペプチドは標識VSV−8と競合でき(後記参照)、[125I]VSV−8はKbsol分子に特異的に結合していることを証明する。逆相HPLCは、Kb−結合[125I]VSV−8が入力ペプチドと同一の保持時間を有することを明らかとした。標識VSV−8へのKbsolの結合は飽和性であり、約33nMの解離定数(KD)を示す(示さず)。Scatchardプロットのx−軸から、標識VSV−8の約65%がKbに結合し得ることが分かった。
種々のペプチドのKbに対する親和性を測定するために、[125I]VSV−8を用いる競合ラジオイムノアッセイ(RIA)を行った(データは示さず)。RIAで用いた阻害性ペプチドを表3にリストする。各ペプチドについてのKDを同様に表3にまとめる。
天然にプロセッシングされたサイズのペプチド(VSVおよびOVAについては8量体、およびセンダイウイルス核蛋白質(SEV)については9量体)は2.7ないし4.1nMの範囲からの最高で顕著に類似の親和性を有した。天然ペプチドのこの過度に高い親和性は最近の観察と合致する。(例えば、Schumacherら,Nature350:703−6(1991);Christnickら,Nature 352:67−70(1991)参照)。しかしながら、1または2残基のように少しだけ短いまたは長いペプチドは2ないし100のファクターだけ親和性を低下させた。親和性のこの低下はかなり長いペプチドでより顕著である;すなわち、24量体ペプチド(OVA−24)の親和性はOVA−8のそれよりも10,000倍低い。これらの結果は、より長いペプチドを用いる初期の報告がマクイロモル範囲の親和性を主張しているのが何故であるのかを説明する助けとなる。例えば、FrelingerらおよびChoppinら,共に前掲にて引用参照)。カルボキシル末端におけるペプチドの伸長はアミノ末端における伸長よりも親和性の破壊がかなり低いことは特に興味深い。HLA−A2の三次元構造によると、ペプチド結合溝(groove)は反平行β鎖上の2つの長いαラセンによって形成され、窪み(cleft)は約25オングストローム長であり、これは約8残基の伸長ペプチドペプチド鎖を収容すると提案されている(例えば、Bjorkmanら,Nature329:506−12(1987))。窪みの一方の端部において、α1およびα2ラセンは密に接近し、他方、他の端部においては、窪みはかなり解放されている。今や、VSVおよびOVAペプチドは同一方向で窪みに結合し*、ペプチドのカルボキシル末端は、カルボキシル末端におけるペプチドの伸長がひどい立体障害を引き起こさないように、窪みの比較的解放された端部と相互作用をするらしいと推定される。
次いで、実験を行って、各々、4℃および23℃におけるKbへのペプチド結合の速度を測定した(示さず)。結合は特に23℃で非常に迅速で、標識ペプチドの極端に低い濃度においてさえ(約0.4nM)約5分の半減期であった。これは、約2時間の会合の半減期を示す従前の観察とは対照的である。(例えば、Choppinら、前掲にて引用参照)。再度、全標識ペプチドの65%のみが結合することができた。過剰のβ−2ミクログロブリンの添加は、Kbヘテロダイマーが安定であるような(会合したまま)低温でのペプチド結合反応速度に影響しなかった。これは、β−2ミクログロブリンの変化がペプチド結合の前提要件ではない、すなわち、ペプチドは、β−2ミクログロブリンの解離なくして自然に空のクラスI分子に結合できることを意味する。対照的に、過剰の遊離β−2ミクログロブリンは見かけ上37℃においてペプチド結合を促進する(データは示さず)。添加したβ−2ミクログロブリンの濃度が増加するに従い、より多くのペプチドがKb分子に結合した。空のKbは37℃で不安定であるので、ある分率のヘテロダイマーは重鎖およびβ−2ミクログロブリンに解離し、それにより、ヘテロダイマーは遊離重鎖および遊離β−2ミクログロブリンと平衡している。そこで、β−2ミクログロブリンの付加は平衡を、ペプチドに結合できるヘテロダイマーの形成の方向にシフトするはずである。この見解は、通常の細胞表面にはかなりの数のクラスI遊離重鎖があり、外因的に付加されたβ−2ミクログロブリンは、β−2ミクログロブリンと遊離重鎖との再会合の結果として細胞表面の空のクラスI分子へのペプチドの結合を容易とするという最近の観察によって裏付けられる。例えば、Rockら,Cell 65:611−620(1991);Kozlowskiら,Nature 349:74−77(1991);Vitielloに,Science250:1423−6(1990)参照)。
次いで、37℃におけるペプチドの解離速度が観察された。ゲル濾過によって[125I]VSV−8およびKb複合体を単離した直後、50または300nMのKbを含有する試料を37℃の温度に暴露した。いくらかの試料には3μMのβ−2ミクログロブリンおよび/または20μMの未標識VSV−8、または1%TX−100を補足した。Kbからの標識ペプチドの解離を種々の時点で測定した(示さず)。大過剰の未標識ペプチドの存在下では、ペプチドの解離速度は一次反応に従い、解離半減期は約36分であった(3.2×10-4s-1の解離速度定数)。この予期せぬ標識ペプチドの比較的速い解離は、安定なペプチド−クラスI複合体のいくつかの現在の見解と適合しない。事実、確認された結果(示さず)は、KbおよびVSV−8複合体が安定であることを示す。この矛盾は、未標識VSV−8(3.7nM)と比較して、放射性同位体標識VSV−8の10−倍低い親和性(33nM)から生起するに違いない。
未標識ペプチドの代わりに界面活性剤を添加した場合にも一次反応が観察され、これは界面活性剤はペプチド解離プロセスを不可逆なものとすることを示す。対照的に、ペプチド解離プロフィールは、未標識ペプチドまたは界面活性剤の不存在下では一次反応には従わなかった。これは、ペプチドの会合/解離が可逆的で、ペプチドの結合はヘテロダイマーの濃度に依存することを示唆する(Kbの50nMおよび300nMの間の速度論を比較されたし)。これは、過剰のβ−2ミクログロブリンを添加した場合により明らかとなった。これらの結果は、重鎖、β−2ミクログロブリンおよびペプチドの間の相互作用が、界面活性剤の不存在下では、基本的には37℃において全くではないにせよ可逆的であるという従前の議論を支持する。恐らくは、TX−100のごとき界面活性剤はβ−2ミクログロブリンが37℃で遊離重鎖と再会合するのを妨げるであろう。これは、界面活性剤の不存在下で一旦高温まで加熱されたKbが何故コンフォメーション抗体によって効果的に免疫沈降されるかを合理的に説明し得る(示さず)。興味深いことには、過剰の未標識ペプチドの存在下でβ−2ミクログロブリンの添加がペプチド解離を抑制せず、これは、未標識ペプチドはβ−2ミクログロブリンの解離なくして複合体から放出されることを示す。しかしながら、[125I]VSV−8の親和性は天然ペプチドのそれよりも約10倍低いことを思い出すべきである。従って、これは天然ペプチドの場合には必ずしも当てはまらない。
イン・ビトロのペプチド−結合アッセイ系を用いる実験は、クラスI分子へのペプチド結合が単純な質量作用かつリガンド−受容体相互作用であることを示唆する。ここに使用したアプローチは、クラスI分子のペプチド結合特異性、およびT−細胞受容体とのペプチド−クラスI複合体の相互作用の特徴付けを可能とする。
実施例8
治療的適用
A.クラスI分子バンク
50ないし100の最も通常のクラスI MHC重鎖のうちの1つ、β−ミクログロブリン、ならびに少なくとも1つの助力分子(assisting molecule)を発現する各細胞系でもって、昆虫細胞系の貯蔵器または「バンク」を確立し、維持できる。これらの蛋白質をコードするcDNAを、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を介して、それを含有する細胞系から得られたHLA変異体に基づいてクローン化し(Ennieら,PNAS USA 87:2833−7(1990)参照)、昆虫発現ベクターのごとき適当なベクターに挿入して、各HLA変異体を発現する細胞系を得ることができる。
例えば、以下のプロトコルに従うテストを用いて、選択したウイルスに由来するいずれのペプチドが種々のクラスI MHC分子に最良に結合するかを判断することができる。種々の培養を適当に標識しまたはカタログを付して、いずれのクラスI MHC分子が特定のペプチドでの使用に最良であるかを示すことができる。別法として、要すれば、一過性培養を確立することができる。ここに議論するごとく、昆虫細胞とベクターとの培養のぼ48時間のインキュベーションの後に、その培養は、CD8+細胞を活性化する目的で選択されたペプチド(類)を負荷できる空のMHC分子を明らかに発現できる。
B.「特異的」細胞系の調製
HLAのタイプ分けの後、もし好ましいHLAを発現する昆虫細胞系が入手できなければ、好ましいHLAおよび助力分子をコードするcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応の使用を介してクローン化できる。前記B.1節に開示したプライマー(配列番号1ないし配列番号12)を用いて、別々の反応において、適当なHLA−A、−B、−C、−E、−Fまたは−G cDNAを増幅でき、次いで、実施例1に開示した方法に記載したごとくに、これをクローン化し配列決定できる。次いで、Gene Cleanキット(Bio 101、San Diego,CA)を用いてDNAをPCR反応から精製し、pRmHa−3のSmaI部位に直接連結することができる。個々のクローンを単離し、配列を確認し、HLAを発現する安定なDrosophila細胞系を確立した。別法として、組換えプラスミドの大集団を大規模に増殖させ、塩化セシウム勾配によってDNAを精製することができる。次いで、精製したDNAを用いて、リン酸カルシウム沈殿法を用い、S2細胞をトランスフェクトする。24時間後、沈殿を細胞から洗い去り、1mM CuSO4を含有する新鮮なSchneider培地で置き換える。48時間後、一過的にトランスフェクトされた細胞の大集団を、同系ペプチドまたは特異的蛋白質のプロテアーゼ消化物とのインキュベーションの後に、CD8+のイン・ビトロ活性化で用いる。
次いで、クローン化HLAを発現する安定な細胞系を確立することができる。別法として、PCR反応からのクローン化組換え分子の大集団を一過的に発現する昆虫細胞の集団をイン・ビトロCD8+活性化で用いることができる。
また、細胞系で発現されたI MHCがイン・ビボで発現されたエレメントではない場合、ペプチドと共にインキュベートされたクラスI MHCを発現する昆虫細胞を用い、ハプロタイプ−特異的CD8を活性化することが可能である。これは、対立遺伝子制限のためにイン・ビボでは可能でない、特定のMHCと会合した特異的抗原を認識するCD8+細胞を増殖させるユニークな機会を提供する。例えば、インフルエンザウイルスの核蛋白質からのペプチド(NP)は通常Db分子に制限されている;しかしながら、我々は、かかるペプチドはKb(Dbよりも弱いにも拘わらず)に結合でき、Kbに対するある程度の熱安定性を生じさせることができることを見い出した(図3参照)。さらにNPペプチドと共にプレインキュベートし、B6マウスからの脾臓細胞と共培養したKb−発現Drosophila細胞により、NPペプチドと会合したKb分子を特異的に認識するCD8+がイン・ビトロで活性化される。加えて、オボアルブミンに由来するKb−制限ペプチド(OVA)およびDb−発現Drosophila細胞を用いる逆実験の結果、OVAペプチドを含有するDbを特異的に認識するCD8+が増殖される。かかるCD8は、オボアルブミンをコードするcDNAでトランスフェクトされた細胞(EL4 OVA)を殺すことができ、これは、イン・ビボで、いくらかのDb分子にOVAペプチドが負荷されることを示す。
従って、この系は、イン・ビボでは、そのペプチドに対して制限的エレメントではないクラスI分子によって提示された特異的抗原に対してCD8+を増殖させるユニークな機会を提供する。十分な抗原が、CD8+によって認識され殺されるべき細胞に対して該クラスIによってイン・ビボで提示され、かかるCD8をイン・ビボで増殖させるのは十分ではない。Drosophila細胞によって発現される空のクラスI分子にペプチドを負荷させることにより、我々は、十分な抗原がクラスIによって提示されて、この複合体を認識する特異的CD8+を活性化するように、非競合的環境において過剰の抗原性ペプチドをクラスI分子に供することによってイン・ビボ制限をなくすることができる。
C.AIDS−治療
イン・ビボ療法のために、イン・ビトロ活性化細胞を患者に投与することができる。好ましくは、個体のクラスI MHC遺伝子型(ハプロタイプ)をまず決定する。慣用的な組織タイプ分けがこの目的に適し、治療センターによって、あるいはある適当な商業的操作によって行うことができる。一旦個体のHLAタイプ(類)が決定されたならば、個々の患者に適したペプチドおよびクラスI MHC分子の最良の組合せを確認し、前記したごとくに調製し、適当な昆虫細胞系およびペプチドを供する。次いで、患者の血液からの休止中のまたは前駆体CD8+T−細胞を、昆虫細胞培養によって生成された適当なペプチド−負荷MHCで刺激する。活性化の後、CD8+細胞を患者の血流に再度導入し、患者における病気のプロセスを継続してモニターする。細胞成分を取り出し、再度導入する方法は当該分野で公知であり、Honsikらに対する米国特許第4,844,893号およびRosenbergに対する米国特許第4,690,915号に例示されているもののごとき手法を含む。
要すれば、病気が十分に治癒されるまで、さらなる治療を加えることができる。同様の治療プロトコルは、移植患者、老人等を含めた他の免疫抑制された個体での使用に適する。
D.癌治療
癌患者において、前記したのと同様の治療手法が利用される。しかしながら、かかる患者においては、腫瘍塊を減少させる通常の療法をここに記載する免疫療法に先行させることができることは予期される。従って、免疫細胞を破壊する傾向にある、照射または化学療法のごとき通常の療法の開始に先立って、推定患者からの血液試料を得て、(例えば、凍結を介して)それを保存するのが好ましい。もしあってもウイルス感染に応答して生起する癌の形態は少ないので、免疫治療のための標識ペプチドは容易には観察されない。しかしながら、最近の研究は、オンコジーンras、neu、およびp53における突然変異が癌の全ケースのうち50%までにおいて癌に寄与することを示している。かくして、これらの突然変異した分子領域に由来するペプチドは本療法のための標的として第一の候補である。ここに開示するプロトコルに従い、個々の患者のためのペプチドおよびクラスI分子の最良の組合せを決定し、投与することができる。
例えば、多くの腫瘍は冒された個体に由来するCD8+細胞によってイン・ビトロで認識される抗原を発現する。本発明の方法を用いる正確に標的化された免疫治療のために、通常の細胞では発現されないかかる抗原はかくして同定でき、ならびにそれをCD8+細胞に提示するHLAタイプも同様である。例えば、van der Bruggenらは、その発現が特異的遺伝子によって指示される抗原を記載しており、その抗原はHLA A1によって提示されるようである(Science254:1643−16471(1991))。種々のヒト腫瘍抗原が単離され、記載されているので、それらはここに記載するごとく免疫治療適用のための良好な候補となる。
もう1つの別の治療様式において、他の免疫原と組み合わせて、本発明のイン・ビトロで活性化したCD8+細胞を投与することも可能である。例えば、米国特許第5,045,320号に開示されている大きな多価免疫原を活性化CD8+細胞と組み合わせて投与できる。
また、T−細胞の分化および活性化を媒介するIL−2およびIL−4のごときサイトカインも同様に投与できる。というのは、サイトカインはイン・ビボで腫瘍細胞に対するT−細胞応答を刺激できるからである。IL−2はCD8+前駆体の増殖および分化ならびにCD8+増殖で主要な役割を演じていると考えられている。IL−2の癌患者への投与は、しばしば、腫瘍−特異的T−細胞の誘導に関連するようである改良された抗−腫瘍応答と関連する。しかしながら、IL−2の最良の治療効果は、IL−2の全身的ではなくむしろ継続的な局所投与によって得られ、かくして、IL−2の毒性を最小化し、その生物学的活性を延ばす。IL−2遺伝子構築体で腫瘍細胞をトランスフェクトすることによって局所的送達を達成することができる。
IL−2 cDNAはEur.J.Immunol.18:97−104(1988)においてKarasuyamaおよびMelchersによって記載されているごとくに構築される。IL−2の完全なcDNA配列はプラスミドpBMGneo IL−2からXhoI断片として得られ(KarasuyamaおよびMelchers,前掲参照)、pRmHa−3中のSalI部位に直接連結される。(HindIIIでの制限マッピングを介して決定して)正しい向きのインサートを持つ組換えpRmHa−3プラスミドはセシウム勾配によって精製され、これを用いて、リン酸カルシウム技術を用い、S2細胞を共トランスフェクトする。(プラスミドDNAの混合物をこの目的で調製した;IL−2 cDNAを含有する10μgのpRmHa−3、MHCクラスI重鎖またはβ−2ミクログロブリンを含有する各々6μgのpRmHa−3プラスミドおよび2μgのphshsneoDNA)。CuSO4を介して誘導できて、重鎖、β−2ミクログロブリンおよびIL−2を発現する安定な細胞系は、トランスフェクタントをG418培地で増殖させることによって得た。これらの安定な細胞系をペプチドで被覆し、前記したごとくイン・ビトロアッセイで用いた。IL−2でトランスフェクトした腫瘍細胞は、親腫瘍細胞に対するCTL(CD8)活性を増給し、イン・ビボでの抗腫瘍または細胞傷害性応答の誘導におけるCD4およびT−ヘルパー機能を逸らすことが観察されている。従って、IL−2遺伝子との共トランスフェクションを介するDrosophila系の可能性を増大させることをここに提案する。
実施例9
抗原−提示系を用いる活性化T−細胞の産生の用量依存性
抗原−提示細胞(antigen-presenting cells:APC)は、実施例3に記載したごとくにDrosophila細胞をトランスフェクトすることによって生成させ、次いで、トランスジェニックマウスの2C系からのT−細胞に抗原を提示するその能力につきテストした。抗原−提示細胞としてのマウス細胞に関しては、この系は、クレブス回路酵素、2−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ(OGDH)に由来する内因性8−量体ペプチド,p2Ca(Leu−Ser−Pro−Phe−Pro−Phe−Asp−Leu、配列番号46)で複合体化したLd分子につき強力なアロ反応性を呈する。該p2CaペプチドはB10.D2細胞のごときH−2d細胞の表面のLdに暴露されて天然でそれに結合する。該p2Caペプチドは可溶性Ld分子に対して中程度の結合親和性(4×106M-1)および2C TCR分子に対して高親和性(2×106M-1ないし1×107M-1)を有する。
密接に関連する9−量体ペプチド、QL9(Gln−Leu−Ser−Pro−Phe−Pro−Phe−Asp−Leu、配列番号47)はこれらの分子に対して高親和性(Ldに対して2×108M-1および2C TCRに対して2×107M-1)を有する。N末端の1つの付加的アミノ酸(グルタミン)を除き、QL9はp2Caと同一の配列を有し、p2Caと同様に、OGDHの天然配列の一部を形成する。
(合成形態で調製した)p2CaおよびQL9ペプチドを用いて、成熟非感作2C CD8+細胞に対する抗原−提示細胞要件をイン・ビトロで調べた。まず、mAb+補体処理、続いて陽性パニングにより、CD4+細胞、クラスII−陽性細胞およびB細胞を除去することによって、C57BL/6(B6、H−2b)バックグラウンド上の2Cマウスのプールしたリンパ節(LN)から応答体CD8+細胞を精製した。
組織グラインダーを用い、若い成体マウスのプールした頸部、腋窩、鼠蹊および腸間膜LNから細胞懸濁液を調製した。細胞の精製には、LN細胞をまず37℃でmAb(抗−CD4、抗−HSA、抗−I−Ab)+補体のカクテルで45分間処理した。生き残った細胞を、抗−CD8mAbで被覆したペトリ皿上で4℃で60〜90分間パニングすることで、更にCD8+細胞とCD8-(CD4-)細胞に分けた。付着されたCD8+細胞を、37℃で5分間インキュベートし、続いて激しくピペッティングすることによって回収した。非付着細胞を溶出させ、抗−CD8 mAbおよび補体で処理してCD8- 1B2+2C細胞を得た。得られたCD8+細胞の95%より多くがクロノタイプ−陽性(IB2+)であって、これらの細胞の98%がナイーブな(CD44lo)表現型を呈した。
TCR刺激は細胞内事象の複合体パターンを誘導し、これは細胞表面のCD69およびCD25(IL−2受容体またはIL−2R)の初期上昇調節に導いた。これらの変化は刺激から数時間内に明白であり、続いて、サイトカイン合成および細胞増殖が起こる。Drosophila細胞をLd、LdおよびB7.1(Ld,B7)、LdおよびICAM−1(Ld.ICAM)またはLd,B7,1およびICAM−1(Ld.B7.ICAM)についての遺伝子でトランスフェクトした。図11は、トランスフェクトされたDrosophila細胞およびp2Ca対QL9ペプチド、濃度10μMで12時間刺激した精製ナイーブCD8+2C細胞上のCD69およびCD25発現を示す。精製CD8+2C細胞を、バルク(2ml)培養中の種々のDrosophila細胞+ペプチド(p2CaまたはQL9いずれか、10μM)と共に12時間インキュベートし、次いで、CD69またはCD25につき染色した。Ld.B7、Ld.ICAMまたはLd.B7,ICAMでトランスフェクトしたDrosophila細胞によって提示されたp2CaまたはQL9はCD69およびCD25の上昇調節を刺激するにおいて効果的であった。しかしながら、ペプチドまたはDrosophila細胞なくしての非培養2C細胞はCD69およびCD25の上昇調節を示さなかった(頂部パネル)。
Ld単独を発現するDrosophila細胞の存在下において、CD8+2C細胞上のCD69およびCD25の誘導は、強力なQL9ペプチドに関しては、低いものの有意であったが、弱いp2Caペプチドではかろうじて検出可能であった。Ld.B7またはLd.ICAM抗原−提示細胞に関しては、両ペプチドはCD69およびCD25の顕著な上昇調節を誘導した。しかしながら、Ld.B7.ICAM抗原−提示細胞はこれらの分子のより高い発現を誘導した。
Ld単独でトランスフェクトしたDrosophila細胞は外因性リンホカインの不存在下で2C CD8+細胞のp2CaまたはQL9ペプチドいずれかへの増殖を引き起こさず、CD69およびCD25発現を誘導する抗原−提示細胞としてのこれらの細胞の最小能力と合致する。結果を図12に示す。示した濃度のペプチドの存在下または不存在下で、5×106の精製CD8+ 2C細胞を2×105のDrosophila細胞と共に3日間培養することによって、p2Ca(上方)およびQL9(下方)に対する応答を測定した。培養の最後の8時間の間に[3H]TdRを添加し;rIL−2を20ユニット/mlの最終濃度で添加した。データは三連の培養の平均値である。しかしながら、外因性IL−2を補足した場合、両ペプチドは高用量(10μM)で有意な増殖応答を刺激した。QL9によって誘導された増殖応答はp2Caよりもはるかに強力であった(上方および下方パネルのx−軸の縮尺の間の大きな差異に注意されたし)。
p2Caペプチドペプチドを提示し、Ld.B7.ICAMでトランスフェクトされたDrosophila細胞によって誘導された第3日における増殖についての用量−依存的関係を、QL9ペプチドを提示するLd.B7.、Ld.ICAMまたはLd.B7.ICAMでトランスフェクトしたDrosophila細胞によって誘導されたものと比較した。結果(三連培養の平均)を図13に示す。Drosophila APC(2×106細胞)をペプチドの存在下または不存在下で5×104CD8+ 2C細胞と共に3日間培養した。[3H]TdRを培養の最後の8時間の間に添加し;IL−2は培養に添加しなかった。
第3日におけるLd.B7.ICAM抗原−提示細胞によって誘導された最適増殖応答は高濃度のp2Caペプチド、例えば10μM(10-5M)を要した(図13)。QL9ペプチドについての結果は異なっていた。Ld.B7抗原−提示細胞+QL9およびLd・ICAM抗原−提示細胞+QL9についての用量−応答曲線を、Ld.B7.ICAM抗原−提示細胞+p2Caについての結果に近似した(図13)。しかしながら、Ld.B7.ICAM抗原−提示細胞に関しては、第3日におけるQL9に対する増殖応答は100nM(10-7M)で最大であり、10pMと低い用量(10-11M)で明らかに明白であった(図13)。高用量、例えば10μM(10-5M)では、QL9は第3日において増殖応答を阻害した(図13、対数スケールに注意されたし)。
Ld.B7.ICAM抗原−提示細胞およびQL9ペプチドによる増殖の阻害はIL−2産生については当てはまらず(図14、右)、それは高用量の抗原−提示細胞で観察されたに過ぎなかった(図14、左)。Ld.B7.ICAM抗原−提示細胞+QL9ペプチドは、再度、Ld.B7.ICAM抗原−提示細胞+p2CaペプチドよりもIL−2産生を誘導するにおいてより効果的であることが判明した(図14、右)。データは、ペプチドなくしての抗原−提示細胞がテストした抗原−提示細胞密度の100倍の範囲にわたっていずれかの応答を誘導するにおいて効果が無かったことを示している(図14、「−pep」開いた四角)。
QL9ペプチドとLd.B7、Ld.ICAMまたはLd・B7.ICAM抗原−提示細胞を用い、第3日、第4日および第5日におけるCD8+ 2C細胞の応答の用量−応答関係における変化を調べた。結果を図15に示す。示したペプチド濃度にて5×106CD8+ 2C細胞および3×105抗原−提示細胞にて応答を測定した。データは三連の培養の平均結果である。
100nM(10-7M)QL9ペプチドの中間的用量に関しては、Ld.B7.ICAM抗原−提示細胞に対する増殖応答は第3日には高く(図15、左)、第4日にはピークに達し(図15、中央)、次いで、第5日には低レベルまで減衰した(図15、右)。しかしながら、10μM(10-5M)QL9ペプチドの高用量に関しては、応答は第3日には低く(図15、左)、しかし次いで第5日には高ピークまで顕著に増加した(図15、右)。
T−細胞/APC相互作用の親和性が非常に高い場合には、第3日にQL9によって誘導された増殖の一過性阻害が観察されたに過ぎなかった。低用量のAPC(図14、左)または低用量のQL9ペプチド(図15、左)を用いることによって、T−細胞/APC相互作用の親和性を低下させると、第3日の増殖応答を増大させた。T−細胞/APC相互作用の親和性を低下させると、初期(第3日)増殖応答を増強させたが、後期(第5日)応答を低下させ、また、IL−2産生(図16、右)を低下させた。図16において、第2日、第3日、第4日および第5においてCD8+ 2CおよびCD8-細胞を用いて得られた結果を比較する。
観察は高度に免疫原性のLd.B7.ICAM抗原−提示細胞に適用される。しかしながら、免疫原性のより低いLd.B7またはLd.ICAM抗原−提示細胞に関しては、QL9ペプチドに対する増殖応答には高用量のペプチドを要し(図13、図15)、応答体細胞によるCD8発現に大きく依存した(図16)。Ld.B7およびLd.ICAM抗原−提示細胞でのこれらの応答は(第5日ではなくむしろ)第3日または第4日にピークに達し、Ld.B7.ICAM抗原−提示細胞でのものよりもはるかに低かった。低用量のQL9、例えば1nM(10-9M)では、Ld.B7およびLd.ICAM抗原−提示細胞での増殖応答は全く検出できなかった(<100cpm)(図13)。これは、1nM QL9が高応答に導いた(>10,000cpm)、Ld.B7.ICAM抗原−提示細胞を用いて観察された結果と顕著に対照的であった(図13)。高用量のQL9ペプチド(10μM、表2)での結果とは対照的に、増殖応答についてのB7およびICAMの間の相乗的相互作用が低ペプチド用量で顕著となった。
理解されるごとく、Ld.B7.ICAM細胞はナイーブ2C細胞に対して極度に優れた抗原−提示細胞として作用する。T−細胞/APC相互作用の親和性を高レベルまで上昇させると、初期の増殖応答を阻害するが、後期応答を増強し、IL−2産生は増強される。QL9のごとき高親和性ペプチドについては、B7およびICAMの間の共働が低用量の抗原で顕著である。
実施例10
抗原提示系を用いる細胞傷害性T−細胞の産生
実施例3に記載したごとくにDrosophila細胞をトランスフェクトすることによって抗原−提示細胞(APC)を生産し、次いで、CTL活性を誘導するその能力につきテストした。CTL活性は、QL9ペプチド、ペプチドは無しかまたは無関係ペプチト(MCMV)で感作した51Cr−標識RMA.S−Ld標的でテストした。24−ウェル培養プレート(Cai,Z.およびJ.Sprent(1994))中、2mlの容量にて、CD8+ 2C細胞(5×106)を2×106トランスフェクトDrosophila細胞と共に培養した。10mMの濃度にて培養の間にペプチドを存在させた。4日後、細胞をプールし、所要数に調整した。標的を調製するために、ペプチドの存在下または不存在下でRMA−S.Ld細胞を37℃にて51Cr(100mCi/1−2×106細胞)で90分間標識した。標識の後、細胞を徹底的に洗浄し、ペプチドを含むまたは含まない培地に再懸濁した。特異的51Cr放出を確立された手法によって計算した(前掲)。
バルク培養中、10μMQL9ペプチドに対してCTL活性を誘導するLd.B7、Ld.B7.ICAMおよびLd.ICAM抗原−提示細胞の能力を図17に示す。強力に免疫原性のLd.B7.ICAM抗原−提示細胞はQL9−特異的CTLを生成するのに効果的であった(図17、中央)。有意には、Ld.B7抗原−提示細胞もQL9に対してCTLを生成するのに効果的であった(図17、左)。しかしながら、驚くべき発見は、Ld.ICAM抗原−提示細胞が全くCTL生成を刺激できなかったことである(図17、右)。この結果(3つの異なる実験の代表)は予期せぬことであった。何故ならば、Ld.ICAM抗原−提示細胞はQL9に対する増殖応答を誘導するにおいてLd.B7抗原−提示細胞ほど低くはなかったからである(図13および15)。図17におけるLd.ICAM−刺激培養は多数の芽細胞を含有し、合計細胞収量は入力数よりも3倍高かった。
驚くべき発見は、Ld.ICAM抗原−提示細胞が外因性リンホカインを補足しなかった培養に対して適用されたCTL生成を全く刺激できなかったことである。しかしながら、外因性IL−2を培養に添加すると、Ld.ICAM抗原−提示細胞はQL9に対して強力なCTL活性を誘導した(図18、右;20μ/ml外因性IL−2)。
実施例11
抗原−提示系によって誘導された通常T−細胞の増殖
抗原−提示細胞(APC)は、実施例3に記載されたごとくにDrosophila細胞をトランスフェクトすることによって生成させ、次いで、正常(非トランスジェニック)ネズミT−細胞において増殖を誘導するそれらの能力につきテストした。
2C TCRトランスジェニックCD8-細胞の強力な一次応答を誘導するLd.B7.ICAM Drosophila細胞の能力は、Drosophila細胞が正常(非トランスジニック)CD8+細胞について抗原−提示細胞として作用し得るか否かという議論を生じた。2CマウスはB6(H−2b)バックグラウンド上にあったので、正常B6 CD8+細胞の応答をテストした。通常B6マウスからのCD8+細胞の段階移行用量を、Ld.B7.ICAM Drosophila抗原−提示細胞によって提示された10μM QL9ペプチドと共に培養した。すなわち、発散レパートリーのT−細胞を高濃度ではあるが単一のアロ抗原(Ld+QL9)のみに暴露した状況であった。図19(左)に示すごとく、Ld.B7.ICAM抗原−提示細胞によるQL9の提示は、事実、正常B6 CD8+細胞に対して免疫原性であって、添加されたサイトカインの不存在下で、大用量の応答体細胞(1×106)にて第3日に認識され得る増殖応答に導いた;無関係ペプチドMCMVに対する応答はかなり低く(しかし有意)、ペプチドの不存在下では応答は起こらなかった。予期されたごとく、正常B6 CD8+細胞のQL9+Ld.B7.ICAM抗原−提示細胞に対する応答は抗原提示細胞としての正常B10.D2脾臓細胞についてのものよりも実質的に低かった(ここに、アロ刺激体は、低濃度ではあるが、Ld、KdおよびDdに結合した多数の自己抗原によって供した)(図19、右、Y軸の縮尺に注意)。
実施例12
固定化精製組換えMHCクラスI分子および助力分子を用いる細胞傷害性T−細胞の活性化
断りのある場合を除き、細胞、材料および試薬は実施例4に記載したごとくに調製した。ビオチン化抗−マウスCD28モノクローナル抗体(クローン37.51)はPharmingen(San Diego,CA)から購入した。また、この抗体はCaltag(South San Francisco,CA)からも入手可能である。CD28共刺激性受容体、T−細胞の表面のB7.1およびB7.2のリガンドに結合するこの抗体はT−細胞の増殖を増加させる(Grossら,J.Immunol.149,380−388,1992)。IL−2をコンカナバリンA上清として用いた(10%最終濃度)。
基材は以下のごとく調製した:1マイクログラム/mlのニュートラビジンを含有する50マイクロリットルのPBSを96ウェル細胞培養プレート(Corning カタログ#25860)の各ウェルに添加した。室温での2時間後、ビオチン化分子とのインキュベーションに先立って、ウェルをPBSで3回洗浄した。実施例4でアビジン−被覆ヒツジ赤血球細胞につき記載したごとくに、アビジン−被覆マウス赤血球細胞を調製した。アビジン−被覆ラテックスビーズは実施例4に記載したごとくに調製した。
組換えLdのビオチン化は実施例4に記載したごとくに行った。ビオチン化組換えLdを、ビオチン化抗−CD28抗体と共に基材上に固定化した。アビジン−被覆赤血球細胞またはラテックスビーズを0.2mg/mlのビオチン化Ld、0.025mg/mlビオチン化抗−CD28、またはその混合物と共に室温にて30分間インキュベートし、次いで、10%FCSを含有するDMEM中で3回洗浄し、直ちに使用した。アビジン−被覆96ウェルプレートをウェル当たり50マイクロリットルの2マイクログラム/mlビオチン化Ld、0.25マイクログラム/ml抗−CD28、またはその混合物と共に室温で30分間インキュベートし、次いで、10%FCSを含有するDMEMを用いて3回洗浄し、直ちに使用した。
2C+T−細胞は実施例4に記載したごとくに調製した。C57BL/6マウスからのCD8+細胞は磁気涸渇によってこれらのマウスのリンパ節から調製した。精製した細胞は、フローサイトフルオロメトリーで測定して、CD8発現につき一貫して90−92%陽性であった。
T−細胞活性化は精製Ld分子および抗−CD28抗体で被覆した培養プレートで行った。T−細胞およびペプチド(0.02mM最終濃度)を、0.2ml/ウェルの最終容量にて、Ldおよび/または抗−CD28で被覆した96ウェルプレートに添加し、5%CO2を含有する湿潤雰囲気中、37℃にて適当な時間培養した。
精製Ld分子および抗−CD28抗体で被覆した赤血球細胞またはラテックスビーズを用いるT−細胞活性化は、非被覆培養プレートで行った。T−細胞およびペプチド(0.02mM)を、100,000赤血球細胞またはラテックスビーズと共に各ウェルに添加した。最終容量は0.2mlであった。培養条件は前記した通りである。
T−細胞分裂促進は、三連の培養により、ウェル当たり1μCiのトリチウム化チミジンのパルスの取り込みによってアッセイした。8時間後に細胞を収穫し、チミジン取り込みをシンチレーションカウンター中の濾液をカウントすることによって測定した。
Ldを発現するRMA.S細胞(標識細胞)を37℃にて放射性標識クロムと共に90分間インキュベートし、3回洗浄し、0.01mMの適当なペプチドの存在下、96ウェルU−底プレート(Coaster カタログ番号3799)中に分配した(ウェル当り5000〜10000細胞)。種々の量の活性化T−細胞(エフェクター細胞)を、150および1の間の範囲のエフェクター/標的比率(E/T比率)に到達するように添加した。37℃での5時間のインキュベーション後、0.1mlの上清を各ウェルから収集し、ガンマカウンターでカウントした。パーセント溶解を標準的方法(Coliganら,Current Protocols in Immunology,3.11節,Wiley,New York(1991))によって測定した。
固定化精製Ldおよび抗−CD28抗体は2C+T−細胞に対して分裂促進的であった。QL9ペプチドを用いる場合、ウェル当たり100,000cpmを超えるチミジン取り込みが一貫して3−5日の培養によって測定された(図20)。3つの活性化方法(プラスチック上、赤血球細胞上またはラテックスビーズ上に固定化された分子)のうちいずれを用いてもその同一範囲の最大チミジン取り込みが得られた。活性化分子をプラスチックに固定化した場合、プラスチック上の固定化したLd単独は一過性分裂促進を誘導し(図20、破線)、他方、Ld+抗−CD28抗体はより高くより持続した分裂促進を誘導した(図20、実線)。Ldに加えて、抗−CD28抗体が、赤血球細胞を用いるモデルにおいて、いずれの分裂促進の誘導にも必要であった。しかしながら、抗−CD28抗体単独ではいずれの分裂促進も誘導しなかった。
QL9−Ld複合体は高親和性をもって2C T−細胞受容体によって認識される。低い親和性をもってこの受容体によって認識される他のペプチドおよびLdの複合体は2C+T−細胞を活性化させることができた;これらはペプチドp2CaおよびSL9を含んだ(図21)。しかしながら、培養の第2日に添加したIL−2がこれらのペプチドを用いる分裂促進を観察するのに必要であった。LCMVペプチド(2C T−細胞受容体によって認識されない対照ペプチド)は活性化を誘導しなかったので、活性化はペプチド特異的であった。ウェル(96プレートウェル)当たり700と少ないT−細胞で開始して、分裂促進は測定可能であり、これは該方法がペプチド特異的に非常に少数のT−細胞を活性化したことを示す。
2C+T−細胞をC57BL/6マウスからの全CD28-細胞と1/99の比率で混合し、ペプチドQL9の存在下で、細胞を固定化Ldおよび抗−CD28抗体と共に培養した。IL−2は培養の第2日に添加し、引き続いて1日置きに添加した。集団の形成、徐々にウェルで拡大した拡大細胞の存在によって示されるごとき、細胞の活性化および増殖が認められた。培養の第12日に、細胞を収穫し、抗クロノタイプ抗体で染色し、フローサイトフルオロメトリーによって分析することによって、2C T−細胞受容体を発現する細胞のパーセントを評価した;ペプチドQL9の存在下で最初に培養した細胞の43%が2C+であり(図22)、他方、ペプチドp2Caでの刺激の後に細胞の49%が2Cを発現し(図23)、ペプチドSL9での刺激の後に22%が発現した(図24)。これは、培養12日後における特異的T−細胞のかなりの富化(43倍、49倍および22倍)を示す。富化はSL9(2C T−細胞受容体とで低親和性複合体を形成するペプチド)でも観察された。かくして、この方法はT−細胞の異種混合物から抗原特異的T−細胞の小亜集団を活性化し、富化させることができる。
QL9ペプチドの存在下でLdおよび抗−CD28抗体を用いて活性した2C+T−細胞を5日間培養し、次いで、それらの細胞傷害性能力を評価した。図25に示す結果は、固定化活性化分子が細胞を誘導してエフェクター細胞傷害性T−細胞に分化させたことを示す。溶解はQL9ペプチドの存在下で観察されたが、対照ペプチド(LCMV)の存在下では観察されなかったので、特異的であった。かくして、休止T−細胞は固定化分子によって活性化されて、標的を特異的に殺すことができる細胞傷害性T−細胞に分化した。
理解されるごとく、固定化精製MHCクラスIおよび助力分子を用いて、ナイーブ休止T−細胞を特異的に活性化して、細胞傷害性T−細胞とすることができる。MHCクラスIおよび助力分子は活性化に十分であり;抗原−提示細胞起源のさらなるシグナルは必要ない。細胞培養プレートのごとき基材上に固定化されたMHCクラスIおよび助力分子は、T−細胞活性化のための適当なツールを提供する。かかる被覆基材によっていくつかの利点が提供される。それらは調製したり操作するのが容易であり、それらはよく制御された量の分子で被覆することができ、再現可能な活性化条件を保証する。
実施例13
ヒト細胞傷害性T−細胞の活性化
ヘパリン(10μ/ml)中に収集したヒト血液(450ml)のユニットを、Scripps Clinic,La Jolla,CAのGeneral Clinical Research Center(GCRC)を介して入手した。製造業者の仕様に従い、血液をまず50cc円錐遠心管内のFicoll−Hypaque密度勾配中で加工した、一旦バッフィコートが得られたならば、試料を緩衝液1(Ca++またはMG++を含まないD−PBS)、次いで、緩衝液2(4%胎児ウシ血清(FCS)を含むPRMI)および緩衝液3中の最終洗液(D−PBS+1%ヒト血清アルブミン(HSA、25%Bumiate/Baxter−Hyland)および0.2%クエン酸ナトリウム(w/v))中で洗浄した。
全末梢血液単核細胞(PBMC)調製物を洗浄した細胞からカウントした。次いで、この調製物をMaxSepTM単離手法(Baxter)を介して採取し、ここに、CD8+細胞は陰性選択によって選択した。除去するための標的化細胞に対するmAbのカクテル(CD19−PharMingen,CD4−Ortho−mune,CD15−PharMingen,CD56−PharMingen,CD14−PRI)を2μg/ml細胞にて調製した。合計PBMC細胞カウントを緩衝液3中で20×106/mlまで希釈し、抗体を添加した。
混合物(ほぼ40ml)を4℃にて回転振盪機で回転させ(4rpm)、合計30分間、チューブが試料を上下にして混合するようにした。感作相の後、細胞を緩衝液3で洗浄し、ヒツジ−抗−マウスIgG(SAM)で被覆した磁性Dynalビーズ(Dynabeads M450 #110.02)と共に同緩衝液に再懸濁した。ビーズのストックは通常4×108ビーズ/mlであった。最終ビーズ:標的細胞比率は10:1である。
使用するビーズの最終容量を測定するために、以下の式に従った:
(感作合計細胞)×(標的細胞の集団の%)=合計理論標的細胞数
合計理論標的細胞数×10=所要合計ビーズ
所要合計ビーズ/ストックのビーズ濃度=所要ビーズの容量
最終感作細胞:ビーズ混合物の容量はほぼ50mlであった。混合物を150mlのFenwal Transfer Pack(#4R2001)に入れ、ニードルで空気を加え、前記と同様の条件下で混合物を回転させた(30分間、4℃、4rpm、上下に撹拌)。インキュベーション時間の最後に、製造業者の仕様に従い、標的細胞をMaxSepTM分離デバイスで取り出した。分離した細胞をバッグから移し、カウントして回収を測定した。FACS分析を行って、試料の純度を測定した。
トランスフェクトされ、ヒトHLA A2.1、B7.1および/またはLFA−3を発現することが示されているDrosophila(ハエ)抗原−提示細胞で、得られた分離されたヒトCD8+細胞を刺激した。ハエ細胞を、10%FCS血清を含むSchneiderの培地中、106/mlに希釈した。翌日、CuSO4を培養細胞に添加し、これを27℃で24時間インキュベートし、収穫した。収穫した細胞を洗浄し、100μg/mlの最終ペプチド濃度にて昆虫X−press培地中に懸濁し、27℃で3時間インキュベートした。
使用したペプチドはHIV−RT(ILKEPVHGV)(配列番号48)、チロシナーゼ(Tyrosinase)(YMNGTMSQV)(配列番号49)、およびインフルエンザ・マトリックス(Influenza matrix)(GILGFVFTL)(配列番号50)であった。
対照ペプチドは肝炎ウイルスのコアに由来し、配列FLPSDFFPSV(配列番号51)を有していた。
ハエ抗原−提示細胞を1:10(APC:CD8+T−細胞)の比率でCD8+細胞に添加した。37℃にて、細胞を平坦底ウェル(48ウェル)中、4日間インキュベートした。第5日、IL−2(10μ/ml)およびIL−7(10μ/ml)(Genzyme)を培地の交換と共に添加した。第11日に、CTLアッセイを行った。
クロム放出アッセイにおいて、JY(HLA2.1、B7を発現するEBV−形質転換ヒトB細胞系)を標的細胞として使用した。Vissereu,M.J.W.ら,J.Immunol.154:3991−3998(1995)。アッセイの24時間前に、JY細胞を3×105細胞/mlにて、10%FCSを含むRPMI中に接種した。JY細胞をカウントし、RPMI洗浄溶液(RPMI中4%Rehautin FCS、1%HEPES、0.025%ゲンタマイシン)中で1回洗浄して、試料当たり5×106細胞を得た。細胞ペレットを100μlの51クロムストック(0.1mCi,NEN)中に温和に再懸濁し、37℃の水浴に1時間入れ、15分毎に撹拌した。標識されたJY溶液を、10mlのRPMI洗液中、各1400rpmにて6分間4回洗浄した。細胞をRPMI/10%Hyclone中、1×105細胞/mlに調整した。標的細胞標識化の効率は、標準的なガンマカウンター技術によって確認する。
標識細胞のペプチド負荷については、2mlの標識JY細胞(2×106細胞)を室温にて10μg/mlのペプチドと共に30分間インキュベートした。ペプチドストック溶液(1mg/ml)を−70℃で保存した。96ウェル丸底プレート中、100μlのエフェクター細胞および100μlのペプチド負荷標的細胞を84:1、17:1および3.4:1(エフェクター:標的)の比率で合わせた。自然放出および51Crの最大放出を測定するための対照を二連で含ませた。試料を37℃で6時間インキュベートした。
10%FCSと共にRPMI中の107/mlの濃度のK562細胞を20:1の比率(未標識K562:標識JY)で添加した。この赤白血病細胞系を用いて、クロム放出アッセイにおいて、NKバックグラウンド細胞溶解を低下させた。プレートを1000rpmで5分間遠心し、各試料からの100μlの上清を96チューブの収集チューブに移した。細胞溶解の分析は、標準的なガンマカウンティング技術(Gammacell 1000,Nordion)によって決定する。
インフルエンザマトリックスペプチド(配列番号50)を負荷した抗原−提示細胞でヒトCD8+T−細胞を活性化することによって生成したCTL活性を図26に示す。インフルエンザウイルスへの先の暴露は、このCTL活性が二次的応答であることを示す。データ点は三連培養からの値の平均である。A2.1、B7.1およびICAM−1を発現する抗原−提示細胞は、A2.1およびB7.1を発現する抗原−提示細胞またはA2.1、B7.1およびLFA−3を発現する抗原−提示細胞よりもより効果的であった。
HIV−RTペプチド(配列番号48)を負荷した抗原−提示細胞でヒトCD8+T−細胞を活性化する結果を図27に示す。この患者の血液のスクリーニングはHIVへの先行暴露を示さなかったので、これらの結果はCTL活性は一次応答に基づくものであったことを示す。この場合、A2.1、B7.1およびICAM−1を発現する抗原−提示細胞のみが、対照レベルよりも有意に大きいCTL活性を生じた。
図28は、チロシナーゼペプチド(配列番号49)を負荷した抗原−提示細胞によって活性化されたヒトCD8+T−細胞のCTL活性を示す。チロシナーゼはメラノーマ腫瘍細胞で過剰発現される通常に生じる酵素である。再度、すべての3種の分子、ICAM−1ならびにA2.1およびB7.1を発現する抗原−提示細胞が、特にテストした低いエフェクター:標的比率において最も効果的であった。
これらの結果は、抗原提示系が、腫瘍細胞で過剰発現される内因性蛋白質に由来するペプチドに対して向けられたヒトCD8+T−細胞において効果的なCTL活性を生じることができることを示す。また、これは、B7およびICAMを共に用いるCD8+T−細胞のこのイン・ビトロ刺激が、さもなければ自己として認識されるペプチドに対してさえ細胞傷害性CD8+T−細胞を生じることを示す。これは、かかる「自己」ペプチドを用いて細胞傷害性T−細胞を生じさせることができないという現在の知識とは対照的である。この方法は、腫瘍に対してCD8+T−細胞を活性化させるのに使用できる可能な腫瘍特異的抗原の数を大いに増やす。
前記したのは本発明を説明する意図のもので、限定的なものではない。本発明の精神および範囲を逸脱することなく、多数の変形および修飾を行うことができる。
【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:2
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:3
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:4
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:5
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:6
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:7
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:8
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:9
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:10
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:11
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:12
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:13
配列の長さ:427
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:14
配列の長さ:740
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:15
配列の長さ:60
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:16
配列の長さ:36
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:17
配列の長さ:19
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:18
配列の長さ:24
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:19
配列の長さ:38
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:20
配列の長さ:38
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:DNA(genomic)
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:21
配列の長さ:3875
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロギー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:NO
アンチセンス:NO
配列
配列番号:22
配列の長さ:71
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:23
配列の長さ:71
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:24
配列の長さ:3908
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:25
配列の長さ:41
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:26
配列の長さ:41
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:27
配列の長さ:3878
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:28
配列の長さ:47
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:29
配列の長さ:47
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:30
配列の長さ:3883
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:31
配列の長さ:879
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:32
配列の長さ:738
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:33
配列の長さ:1002
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:34
配列の長さ:751
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:35
配列の長さ:1611
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:36
配列の長さ:1452
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:37
配列の長さ:726
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:38
配列の長さ:657
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:39
配列の長さ:24
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
フラグメント型:中間部フラグメント
配列
配列番号:40
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
フラグメント型:中間部フラグメント
配列
配列番号:41
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
フラグメント型:中間部フラグメント
配列
配列番号:42
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
フラグメント型:中間部フラグメント
配列
配列番号:43
配列の長さ:32
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
配列
配列番号:44
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
フラグメント型:中間部フラグメント
配列
配列番号:45
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
フラグメント型:中間部フラグメント
配列
配列番号:46
配列の長さ:8
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
フラグメント型:中間部フラグメント
配列
配列番号:47
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
フラグメント型:中間部フラグメント
配列
配列番号:48
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
フラグメント型:中間部フラグメン
配列
配列番号:49
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
フラグメント型:中間部フラグメント
配列
配列番号:50
配列の長さ:9
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
フラグメント型:中間部フラグメント
配列
配列番号:51
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
ハイポセティカル:No
アンチセンス:No
フラグメント型:中間部フラグメント
配列
Claims (56)
- T−細胞リンパ球と共に用いる合成抗原提示細胞系であって、
a)第1のプロモーターに作動可能に連結されており、かつクラスI MHC重鎖を発現できるクラスI MHC重鎖遺伝子;
b)第2のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ該MHC重鎖と共にMHC分子を形成するβ−2ミクログロブリンを発現できるβ−2ミクログロブリン遺伝子;および
c)第3のプロモーターに作動可能に連結されており、かつT−細胞リンパ球上の分子と相互作用する補助分子(assisting molecule)を発現できる補助分子遺伝子;
よりなり、
MHC遺伝子、β−ミクログロブリン遺伝子および補助分子遺伝子のうちの少なくとも1つは該細胞系の由来となった細胞に存在せず、該MHC分子がペプチドに結合し、該MHC分子および補助分子が、該ペプチドと該MHC分子が結合した場合に該ペプチドに対するT−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数で細胞表面に存在する細胞系。 - 該補助分子がコスティミュラトリー分子である請求項1記載の細胞系。
- 該コスティミュラトリー分子がB7.1またはB7.2である請求項2記載の細胞系。
- 該細胞系が第1の種に由来し、該MHC重鎖遺伝子が第2の種に由来する請求項1記載の細胞系。
- 該第1の種が変温動物であり、第2の種が恒温動物である請求項4記載の細胞系。
- 該補助分子が接着分子である請求項1記載の細胞系。
- 該接着分子がICAM−1、ICAM−2、ICAM−3またはLFA−3である請求項6記載の細胞系。
- 第1の補助分子の遺伝子および第2の補助分子の遺伝子を有する請求項1記載の細胞系。
- 第1の補助分子がコスティミュラトリー分子であって、第2の補助分子が接着分子である請求項8記載の細胞系。
- 少なくとも1つのプロモーターが誘導性である請求項1記載の細胞系。
- 第1のプロモーターが誘導性である請求項10記載の細胞系。
- 該ペプチドが細胞内でMHC分子に結合する請求項1記載の細胞系。
- 該MHC分子が細胞の表面に空で(empty)提示される請求項1記載の細胞系。
- ヒトT−細胞リンパ球を刺激するのに使用される安定な変温動物細胞系であって、
a)第1の誘導性プロモーターに作動可能に連結されており、かつクラスI MHC重鎖を発現できるクラスI MHC遺伝子;
b)第2のプロモーターに作動可能に連結されており、かつMHC重鎖と共にMHC分子を形成するβ−2ミクログロブリンを発現できるβ−2ミクログロブリン遺伝子;および
c)第3のプロモーターに作動可能に連結されており、かつT−細胞リンパ球上の分子と相互作用する補助分子を発現できる補助分子遺伝子;
よりなり、
MHC遺伝子、β−2ミクログロブリン遺伝子及び補助分子遺伝子のうち少なくとも1つは該細胞系の由来となった細胞に存在せず、
該細胞はペプチドに結合できる空のMHC分子を組み立て、MHC分子および補助分子は、該ペプチドとMHC分子が結合した場合に該ペプチドに対してT−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数で細胞の表面に提示されるようになっている細胞系。 - 該補助分子がコスティミュラトリー分子である請求項14記載の細胞系。
- 該コスティミュラトリー分子がB7.1またはB7.2である請求項15記載の細胞系。
- 該補助分子が接着分子である請求項14記載の細胞系。
- 該接着分子がICAM−1である請求項17記載の細胞系。
- 第1の補助分子の遺伝子および第2の補助分子の遺伝子を有する請求項14記載の細胞系。
- 第1の補助分子がコスティミュラトリー分子であって、第2の補助分子が接着分子である請求項19記載の細胞系。
- ヒトT−細胞リンパ球を刺激するのに使用される安定な変温動物細胞系であって、
a)第1のプロモーターに作動可能に連結されており、かつクラスI MHC重鎖を発現できるクラスI MHC遺伝子;
b)第2のプロモーターに作動可能に連結されており、かつMHC重鎖と共にMHC分子を形成するβ−2ミクログロブリンを発現できるβ−2ミクログロブリン遺伝子;
c)第3のプロモーターに作動可能に連結されており、かつT−細胞リンパ球上の分子と相互作用するコスティミュラトリー分子を発現できるコスティミュラトリー分子遺伝子;および
d)第4のプロモーターに作動可能に連結されており、かつT−細胞リンパ球上の共働的接着分子と相互作用する接着分子を発現できる接着分子遺伝子;
よりなり、
MHC遺伝子、β−2ミクログロブリン遺伝子、コスティミュラトリー分子遺伝子及び接着分子遺伝子のうち少なくとも1つは該細胞系の由来となった細胞に存在せず、
該細胞はMHC重鎖およびβ−2ミクログロブリンからペプチドに結合するMHC分子を組み立てることができ、MHC分子、コスティミュラトリー分子および接着分子を、ペプチドとMHC分子が結合した場合に該ペプチドに対してT−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数で細胞の表面に輸送できるようになっている細胞系。 - 該コスティミュラトリー分子がB7.1またはB7.2である請求項21記載の細胞系。
- 該接着分子がICAM−1、ICAM−2、ICAM−3またはLFA−3である請求項21記載の細胞系。
- 少なくとも1つのプロモーターが誘導性である請求項21記載の細胞系。
- 該ペプチドが細胞内でMHC分子に結合する請求項21記載の細胞系。
- 該MHC分子が細胞の表面に空で提示される請求項21記載の細胞系。
- T−細胞リンパ球と共に用いる合成抗原提示細胞系の断片であって、該細胞が、
a)第1のプロモーターに作動可能に連結されており、かつクラスI MHC重鎖を発現できるクラスI MHC重鎖遺伝子;
b)第2のプロモーターに作動可能に連結されており、かつ該MHC重鎖と共にMHC分子を形成するβ−2ミクログロブリンを発現できるβ−2ミクログロブリン遺伝子;および
c)第3のプロモーターに作動可能に連結されており、かつT−細胞リンパ球上の分子と相互作用する補助分子を発現できる少なくとも1つの補助分子の遺伝子;
よりなり、
該補助分子蛋白質は、B7.1、B7.2、ICAM−1、ICAM−2、ICAM−3及びLFA−3の群から選択される膜結合コスティミュラトリー分子又は接着分子であり、MHC遺伝子、β−ミクログロブリン遺伝子および補助分子遺伝子のうちの少なくとも1つは該細胞系の由来となった細胞に存在せず、該MHC分子がペプチドに結合し、該MHC分子および該少なくとも1つの補助分子が、該ペプチドと該MHC分子が結合した場合に該ペプチドに対するT−細胞リンパ球を活性化するのに十分な数で細胞表面に存在し、該MHC分子および該補助分子を同じ細胞断片上に有する、合成抗原提示細胞系の断片。 - MHC分子が空である請求項27記載の細胞断片。
- ペプチドがMHC分子に結合している請求項27記載の細胞断片。
- MHC分子および少なくとも2つの異なった補助分子を有し、該補助分子が同じ細胞断片上の膜結合コスティミュラトリー分子又は接着分子である、T−細胞リンパ球を活性化する請求項27記載の細胞断片。
- a)細胞の培養物を樹立し;
b)第1のプロモーターに作動可能に連結した発現可能なクラスI MHC重鎖遺伝子で該培養物をトランスフェクトし;
c)第2のプロモーターに作動可能に連結した発現可能なβ−2ミクログロブリン遺伝子で該培養物をトランスフェクトし;
d)第3のプロモーターに作動可能に連結した発現可能な補助分子遺伝子で該培養物をトランスフェクトする;
ことからなる合成抗原提示細胞系の製法。 - 該補助分子がコスティミュラトリー分子である請求項31記載の方法。
- 該コスティミュラトリー分子がB7.1またはB7.2である請求項32記載の方法。
- 該細胞系が第1の種に由来し、該MHC重鎖遺伝子が第2の種に由来する請求項31記載の方法。
- 該第1の種が変温動物であって、該第2の種が恒温動物である請求項34記載の方法。
- 該補助分子が接着分子である請求項31記載の方法。
- 該接着分子がICAM−1、ICAM−2、ICAM−3またはLFA−3である請求項36記載の方法。
- 第2の補助分子の遺伝子で培養物をトランスフェクトする工程を含む請求項31記載の方法。
- 該第1の補助分子がコスティミュラトリー分子であって、該第2の補助分子が接着分子である請求項38記載の方法。
- プロモーターの少なくとも1つが誘導性である請求項31記載の方法。
- a)クラスI MHC重鎖、β−2ミクログロブリンおよび補助分子のうちの少なくとも1つに対する遺伝子を欠く細胞の培養物を樹立し;
b)細胞の培養物中で欠如しているa)の遺伝子の各々の発現可能な遺伝子で培養物をトランスフェクトする(該遺伝子はプロモーターに作動可能に連結している);
ことからなる合成抗原提示細胞系の製法。 - a)細胞の培養物を樹立し;
b)プロモーターに作動可能に連結した発現可能なクラスI MHC重鎖遺伝子で培養物をトランスフェクトし;
c)第2のプロモーターに作動可能に連結した発現可能なβ−2ミクログロブリン遺伝子で培養物をトランスフェクトし;
d)第3のプロモーターに作動可能に連結した発現可能なコスティミュラトリー分子遺伝子で培養物をトランスフェクトし;
e)第3のプロモーターに作動可能に連結した発現可能な接着分子遺伝子で培養物をトランスフェクトする;
ことからなる合成抗原提示細胞系の製法。 - a)クラスI MHC重鎖、β−2ミクログロブリンおよびコスティミュラトリー分子のうちの少なくとも1つに対する遺伝子を欠く細胞の培養物を樹立し;
b)細胞の培養物中で欠如しているa)の遺伝子の各々の発現可能な遺伝子で培養物をトランスフェクトし(該遺伝子は第1の作動可能なプロモーターに連結している);
c)発現可能な接着分子遺伝子で培養物をトランスフェクトする(該遺伝子は第2の作動可能なプロモーターに連結している);
ことからなる合成抗原提示細胞系の製法。 - a)請求項1記載の細胞系を提供し;
b)選択されたペプチドに結合したMHC分子が細胞系の表面に産生されるような条件下で細胞系を培養し;
c)培養細胞を選択されたペプチドに対するCD8+T−細胞と接触させる;
ことからなる選択されたペプチドに対するCD8+T−細胞をイン・ビトロで活性化させる方法。 - 該細胞系が変温動物のものである請求項44記載の方法。
- さらに、活性化されたCD8+T−細胞を細胞系から分離する工程を含む請求項44記載の方法。
- さらに、活性化されたCD8+T−細胞を許容される担体または賦形剤に添加して懸濁物を形成する工程を含む請求項46記載の方法。
- a)細胞の第1の培養物を樹立し;
b)プロモーターに作動可能に連結した、クラスI MHC重鎖の少なくとも細胞外部分に対する発現可能な重鎖遺伝子で培養物をトランスフェクトし;
c)第2のプロモーターに作動可能に連結した発現可能なβ−2ミクログロブリン遺伝子で培養物をトランスフェクトし;
d)産生されたMHC分子部分を収穫し;
e)細胞の第2の培養物を樹立し;
f)第3のプロモーターに作動可能に連結した、補助分子の少なくとも細胞外部分に対する発現可能な補助力分子遺伝子で第2の培養物をトランスフェクトし;
g)補助分子部分を収穫し;
h)ペプチドがMHC分子の細胞外部分と結合した場合に該ペプチドに対してT−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数で、MHC分子部分および補助分子部分を支持体と結合する;
ことからなる合成T−細胞リンパ球抗原活性化用マトリックスの製法。 - 第1の細胞培養物と第2の細胞培養物が同一である請求項48記載の方法。
- 細胞の第3の培養物を樹立し、第4のプロモーターに作動可能に連結した少なくとも細胞外部分に対する第2の発現可能な補助分子遺伝子で第3の培養物をトランスフェクトし、第2の補助分子部分を収穫し、第2の補助分子部分を該支持体と結合することを含む請求項48記載の方法。
- 該補助分子がコスティミュラトリー分子である請求項48記載の方法。
- 該コスティミュラトリー分子がB7.1またはB7.2である請求項51記載の方法。
- 該補助分子が接着分子である請求項48記載の方法。
- 該接着分子がICAM−1、ICAM−2、ICAM−3またはLFA−3である請求項53記載の方法。
- 該ペプチドを、細胞の第1の培養物中のMHC分子部分に導入し、それと結合する請求項48記載の方法。
- MHC分子部分を支持体と結合した後に該ペプチドを該分子部分と結合する請求項48記載の方法。
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