KR20170075785A - 유전자 변형된 면역 효과기 세포 및 면역 효과기 세포의 증식용 가공된 세포 - Google Patents

유전자 변형된 면역 효과기 세포 및 면역 효과기 세포의 증식용 가공된 세포 Download PDF

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로렌스 제이.엔. 쿠퍼
하짓 싱
헬렌 휼스
사이먼 올리바레스
비풀렌두 제나
크리나 파텔
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Abstract

변형된 힌지 도메인 서열을 포함하는, 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드 (및 상기 CAR을 발현하는 면역 효과기 세포)가 제공된다. 또한 표적 항원 및 인간 백혈구 항원 (HLA)을 암호화하는 이식유전자를 발현하는 가공된 항원 제시 세포 (APC)가 제공된다. 추가 양태에서, 상승된 미토콘드리아 예비 호흡 용량 (SRC)에 대해 선택된 면역 효과기 세포가 제공된다.

Description

유전자 변형된 면역 효과기 세포 및 면역 효과기 세포의 증식용 가공된 세포 {GENE MODIFIED IMMUNE EFFECTOR CELLS AND ENGINEERED CELLS FOR EXPANSION OF IMMUNE EFFECTOR CELLS}
본 출원은 하기의 이점을 주장한다: 미국 가특허원 제 62/075,642 (2014년 11월 5일 출원됨); 미국 가특허 출원 제 62/075,561 (2014년 11월 5일 출원됨); 미국 가특허 출원 제 62/075,667 (2014년 11월 5일 출원됨); 및 미국 가특허 출원 제 62/169,979 (2015년 6월 2일 출원됨) (이의 전체가 참조로서 본 출원에 통합됨).
서열 목록의 도입
파일명 UTFCP125WO_ST25.txt으로 포함된 서열 목록은 2015년 11월 5일 목요일자로 생성된 크기가 48 KB (Microsoft Windows?에서 측정된 크기)이며, 전자적으로 제출되어 본 명세서에 통합된다.
1. 발명의 분야
키메라 항원 수용체 (CAR), CAR-발현 면역 효과기 세포 및 CAR 및 CAR T 세포의 제조 및 이용 방법이 본원에서 기재된다. 향상된 치료 특성을 갖는 면역 효과기 세포 조성물 및 항원 제시 세포가 또한 제공된다.
2. 관련 기술의 설명
임상 등급 T 세포의 효능은 우수한 (i) 종양 관련 항원(TAA)의 인식, (ii) 주입 후 지속성, (iii) 종양 부위로 이동할 가능성, 및 (iv) 종양 미세 환경 내에서 효과기 기능을 재활용하는 능력에 대한 잠재력을 갖는 생물학적 샘플을 유전자 가공하기 위해 유전자 요법을 면역요법과 조합함으로써 개선될 수 있다. T 세포의 상기 유전적 가공은 세포의 특이성을 재유도하기 위해 및 항원-표적된 세포독성 활성을 갖는 치료적 조성물을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이들 가공된 T-세포 조성물은, 예를 들어, 암 환자에서 치료적 개입에 유효함이 보여지고 있다 (Jena et al., 2010; Till et al., 2008; Porter et al., 2011; Brentjens et al., 2011; Cooper and Bollard, 2012; Kalos et al., 2011; Kochenderfer et al., 2010; Kochenderfer et al., 2012; Brentjens et al., 2013). 하지만, 생체내 지속성의 조절를 허용하는 개선된 T-세포 및 CAR 작제물의 필요성이 남아 있다.
본 발명의 요약
제1 구현예에서 항원 결합 도메인; 힌지 도메인; 막투과성 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인(들)을 포함한 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드가 제공된다. 일부 양태에서, 힌지 도메인은 Fc 수용체, 예컨대 FcγR2a 또는 FcγR1a에 결합하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 힌지 서열은 Fc 수용체에 결합하는 인간 면역글로불린 (예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 또는 IgE)으로부터 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 힌지 도메인 (및/또는 CAR)은 야생형 인간 IgG4 CH2 및 CH3 서열을 포함하지 않는다.
추가 양태에서, 구현예의 CAR의 힌지 도메인은 Fc 수용체 (예컨대 FcγR2a 및/또는 FcγR1a Fc 수용체)에 감소된 또는 본질적으로 무 결합을 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 힌지 도메인은 (i) 서열 번호: 1에 동일한 적어도 8 연속 아미노산을 갖는 인간 IgG4-Fc 서열 (돌연변이체 IgG4-Fc 서열) (상기 서열은 전장 야생형 IgG4-Fc에 대하여 감소된 Fc-수용체 결합을 갖는다); 또는 (ii) 인간 CD8a 세포외 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 힌지 도메인은 서열 번호: 1에 동일한 적어도 8 연속 아미노산을 갖는 인간 IgG4-Fc 서열 (돌연변이체 IgG4-Fc 서열) (상기 서열은 전장 야생형 IgG4-Fc에 대하여 감소된 Fc-수용체 결합을 갖는다)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 힌지 도메인은 서열 번호: 3 에 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다 (12-aa 스페이서). 일 양태에서, 힌지 도메인은 서열 번호: 3에 동일한 서열을 포함할 수 있다 (12-aa 스페이서). 추가의 추가 양태에서, 힌지 도메인은 서열 번호: 3에 대하여 1, 2, 또는 3 이하 아미노산 결실 또는 치환을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 힌지 도메인은 IgG4-Fc 서열을 포함할 수 있고, 상기 서열은 Fc-수용체 결합을 감소시키는 야생형 IgG4-Fc에 대하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. IgG4 Fc 서열은, 서열 번호: 1에 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 일부 양태에서, IgG4-Fc 서열은 야생형 서열과 비교하여, L235E 또는 N297Q 돌연변이를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, IgG4-Fc 서열은 야생형 서열에 대하여, L235E 및 N297Q 돌연변이를 포함할 수 있다. 일 양태에서, IgG4-Fc 서열은 서열 번호: 1과 동일할 수 있거나, 또는 서열 번호: 1에 대하여 1, 2, 또는 3 이하의 아미노산 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, IgG4-Fc 서열 I 은 서열 번호: 1과 동일하다.
일부 양태에서, 힌지 도메인은 CD8a 세포외 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 힌지 도메인은 서열 번호: 2의 세포외 부분에 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 추가 양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 세포외 부분과 동일한 서열을 포함할 수 있거나, 또는 서열 번호: 2의 세포외 부분에 대하여 1, 2, 또는 3 이하의 아미노산 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 추가의 추가 양태에서, CAR 폴리펩티드의 힌지 도메인은 서열 번호: 20에 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다. 추가 양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열 번호: 20과 동일한 서열을 포함할 수 있거나, 또는 서열 번호: 20에 대하여 1, 2, 또는 3 이하의 아미노산 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 막투과성 도메인은 CD8a 막투과성 도메인을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 막투과성 부분에 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일 양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 막투과성 부분과 동일한 서열을 포함할 수 있거나, 또는 서열 번호: 2의 막투과성 부분에 대하여 1, 2, 또는 3 이하의 아미노산 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 막투과성 도메인은 CD28, CD8a 또는 CD137의 막투과성 도메인을 포함할 수 있다. 추가의 추가 양태에서, 막투과성 도메인은 서열 번호: 19에 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 CD8a 막투과성 도메인을 포함할 수 있다. 추가의 추가 양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열 번호: 19와 동일한 막투과성 서열을 포함할 수 있거나, 또는 서열 번호: 19에 대하여 1, 2, 또는 3 이하의 아미노산 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 세포내 세포 신호전달 도메인은 CD3ζ 유래의 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 구현예의 CAR 폴리펩티드는 서열 번호: 13에 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 CD3ζ 서열을 포함할 수 있다. 추가의 추가 양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열 번호: 13과 동일한 CD3ζ 서열을 포함할 수 있거나, 또는 서열 번호: 13에 대하여 1, 2, 또는 3 이하의 아미노산 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 추가의 추가 양태에서, 세포내 세포 신호전달 도메인은 CD28 또는 CD137 (4-1BB) 유래의 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 구현예의 CAR 폴리펩티드는 서열 번호: 15 또는 서열 번호: 17에 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 세포내 세포 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 추가의 추가 양태에서, CAR 폴리펩티드는 서열 번호: 15 또는 서열 번호: 17과 동일한 서열을 포함하는 세포내 세포 신호전달 도메인을 포함할 수 있거나, 또는 서열 번호: 15 또는 17에 대하여 1, 2, 또는 3 이하의 아미노산 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
다양한 양태에서, 구현예의 CAR의 항원 결합 도메인은 scFv 또는 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함할 수 있다. 추가 양태에서, 항원 결합 도메인은 제1 scFv 도메인 및 제2 scFv 도메인을 포함할 수 있고, 여기에서 제1 또는 제2 scFv 도메인 중 하나는 제1 항원에 결합하고 다른 도메인은 제2 항원에 결합한다. 일부 양태에서, VL 도메인은 VH 도메인에 대하여 N-말단에 배치될 수 있다. 특정 양태에서, VH 도메인은 VL 도메인에 대하여 N-말단에 배치될 수 있다. 특정 양태에서, CAR 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 및/또는 제1과 제2 scFv 도메인 사이에서 링커 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 링커 서열은 생인손 링커일 수 있다 (서열 번호: 7).
다양한 양태에서, 항원 결합 도메인은 감염성 질환 항원 또는 암-세포 항원에 결합시킬 수 있다. 암 세포 항원의 예시는 하기를 포함한다: CD19, CD20, ROR1, CD22 암 배아 항원, 알파태아단백질, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피성 종양 항원, 전립선-특이적 항원, 흑색종-관련 항원, 돌연변이 p53, 돌연변이 ras, HER2/Neu, 엽산 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD33, CD138, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, VEGFR2, HER2-HER3 조합, HER1-HER2 조합, 또는 HER1-HER3 조합. 일부 양태에서, 암 세포 항원은 CD19일 수 있고 CAR은 CD19-표적된 CAR일 수 있다.
추가 구현예에서 구현예에 따라 CAR 폴리펩티드를 암호화한 핵산 분자가 제공된다. 일부 양태에서, CAR을 암호화한 서열은 트랜스포손 반복부 또는 바이러스 LTRs에 의해 측접된다.
또 다른 추가 구현예에서, 구현예에 따라 CAR 폴리펩티드 또는 핵산을 포함한 단리된 면역 효과기 세포 (예를 들면, T-세포, NK 세포 또는 NK T-세포)가 제공된다. 일부 양태에서 세포는 T-세포 또는 T-세포 전구체이다. 추가 양태에서, 세포는 인간 세포이다. 특정 양태에서, 세포 조성물은 100 또는 1,000 만큼 적은 세포를 포함할 수 있다. 하지만, 일부 양태에서, 세포 조성물은 적어도 약 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 이상의 CAR-발현 면역 효과기 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 세포는 본질적으로 동일한 유전적 물질을 가질 수 있다. 추가 양태에서, 세포는, 공여체 또는 환자일 수 있는, 단일 대상체로부터 유도된 인간 세포일 수 있다. 추가 구현예는 약제학적으로 허용가능한 담체에서 구현예에 따라 CAR-발현 세포의 집단을 포함한 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 추가 구현예에서, 구현예에 따라 CAR 폴리펩티드를 발현하는 면역 효과기 세포의 유효량 투여를 포함하는 대상체 (예를 들면, 암 또는 감염성 질환을 갖는 대상체)의 치료 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 대상체는 암을 가질 수 있다. 특정 양태에서, 암은 혈액학적 또는 고형암, 예컨대 T-세포 ALL, B-ALL, CML, 결장암, 난소암, 신경모세포종, 뇌 종양(들) 또는 췌장암일 수 있다. 일부 양태에서, 환자는 사전 항암 요법을 받을 수 있다. 일 양태에서, 환자는 관해에 있을 수 있다. 또 다른 양태에서, 환자는 암의 증상이 없을 수 있지만, 검출가능한 암 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 대상체는 바이러스 감염(예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV))를 가질 수 있다. 추가의 또 다른 양태에서, 대상체는 박테리아 감염을 가질 수 있다. 일 양태에서, 질환은 패혈증일 수 있다.
특정 양태에서, 대상체의 치료 방법은 인간 Fc 수용체에 결합시키는 폴리펩티드 서열을 갖는 힌지 도메인을 포함하는 CAR을 발현한 면역 효과기 세포 (예를 들면, T-세포) 투여를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 면역 효과기 세포는, 예를 들면, 이환 조직의 부위에 국소로 투여된다. 특정 양태에서, 국부 전달의 부위는 감소된 수의 (또는 본질적으로 무) 세포 발현 Fc 수용체를 갖는다. 예를 들어, 투여 부위는 대상체의 중추신경계 (예를 들면, 뇌), 눈 또는 고환일 수 있다.
일부 양태에서, CAR 폴리펩티드는 암 세포 항원에 결합시키는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 암은 유방암, 난소암, 흑색종, 비소 세포 폐암, 위암, 결장직장암 또는 췌장암일 수 있다. 추가 양태에서, 암은 CAR의 항원 결합 도메인에 의해 결합되는 암 세포 항원을 발현시킨다. 추가의 추가 양태에서, 대상체는 CAR 폴리펩티드가 결합하는 암 세포 항원을 발현하는 암을 가짐으로서 식별되었다. 추가의 추가 양태에서, 면역 효과기 세포 (예를 들면, T-세포)는 대상체로부터 이전에 단리되었다.
일부 추가 양태에서, 면역 효과기 세포 (예를 들면, T 세포)는 환자에 동종이계일 수 있다. 다양한 양태에서, 동종이계 세포는 환자와 HLA를 공유할 수 있거나 공유하지 않을 수 있다. 또 다른 양태에서, 면역 효과기 세포는 환자에 자가조직일 수 있다.
또 다른 추가 구현예에서, 면역 효과기 세포 또는 이의 전구체 (예를 들면, T-세포 또는 T-세포 전구체)를 포함한 세포의 샘플의 수득 단계, 형질전환 CAR-발현 세포의 집단을 제공하기 위해, 구현예에 따라 CAR 폴리펩티드를 암호화한 DNA로 세포의 형질감염 단계, 및 CAR-발현 면역 효과기 세포 (예를 들면, CAR-발현 T-세포)의 증식을 임의로 향상시키는 배지에서 생체외 형질전환 CAR 세포의 집단의 배양 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 상기 방법은 추가로 세포의 게놈에 DNA 암호화 CAR을 통합시키는데 유효한 트랜스포사제 및 트랜스포손-측접된 CAR로 세포의 형질감염을 포함한다. 추가 양태에서, 방법은 형질감염에 앞서 샘플에서 T-세포의 정제 또는 농축을 포함한다. 특정 경우에서 면역 효과기 세포 (예를 들면, T-세포 또는 T-세포 전구체)는 유도된 만능 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포로부터 유도된다. 추가 양태에서, 샘플에서 세포의 농축은 단핵 세포 분획의 수집을 포함한다. 세포의 샘플은 일부 경우에서 대상체로부터 제대혈, 림프양 장기 또는 말초 혈액 샘플 출신일 수 있다. 세포의 샘플은 일부 경우에서 분리반출법 또는 정맥천자에 의해 수득될 수 있다. 추가의 추가 양태에서, 세포의 샘플은 면역 세포의 아집단, 예컨대 T-세포의 아집단이다. 일부 양태에서, 형질전환 CAR 세포는 내인성 T-세포 수용체 및/또는 내인성 HLA의 발현을 위하여 비활성화된다. 추가 양태에서, 세포의 샘플 수득은 제3 당사자로부터 세포 수득을 포함한다.
일부 양태에서, 형질감염의 (예를 들면, CAR 작제물의) 방법은 세포 (예를 들면, T-세포)에 CAR을 암호화한 DNA 전기천공을 포함한다. 추가 양태에서, CAR 작제물은 바이러스 벡터를 이용하여 세포에 형질도입될 수 있다. 일부 양태에서, 형질감염은 바이러스로 세포의 감염 또는 형질도입을 포함하지 않을 수 있다. 추가의 추가 양태에서, 세포는 막-결합된 Cγ 시토카인을 암호화한 핵산으로 추가 형질감염된다. 막-결합된 Cγ 시토카인은 일부 사례에서 막 결합된 IL-7, IL-15 또는 IL-21일 수 있다. 특정 양태에서, 막-결합된 Cγ 시토카인은 IL-15-IL-15Rα 융합 단백질 (예를 들면, 예컨대 서열 번호: 4의 mIL-15 폴리펩티드)이다.
추가의 추가 양태에서, CAR을 암호화한 DNA는 플라스미드이다. 추가 양태에서, CAR은 세포에 도입되는 RNA에 의해 암호화될 수 있다. 트랜스포사제는 일부 양태에서 DNA 발현 벡터, mRNA, 폴리펩티드, 또는 발현성 RNA로서 제공될 수 있다. 특정 양태에서, 트랜스포사제는 연어과-유형 Tc1-형 트랜스포사제(SB)이다. 추가 특이적 양태에서, 트랜스포사제는 SB11 또는 SB100x 트랜스포사제이다.
구현예의 추가의 추가 양태에서, 본원에서 상세한 방법에 따라 형질전환 CAR 세포의 배양은 수지상 세포의 존재하에 형질전환 CAR 세포 또는 CAR-발현 면역 효과기 세포의 증식을 자극시키는 활성화 및 전파 세포 (AaPC)의 배양을 포함한다. 추가의 추가 양태에서, AaPC는 AaPC의 표면상에 발현된 CAR-결합 항체 또는 그의 단편을 포함한다. AaPC는 일부 경우에서 T-세포를 활성화 또는 공자극시키는 추가의 분자를 포함할 수 있다. 추가의 분자는, 일부 경우에서, 막-결합된 Cγ 시토카인을 포함할 수 있다. 더욱 또 다른 추가 양태에서, AaPC는 비활성화 또는 조사되거나, 또는 감염성 물질이 없도록 식별되었고 이를 위하여 시험되었다. 추가의 추가 양태에서, AaPC의 존재하에 형질전환 CAR 세포의 배양은 가용성 시토카인, 예컨대 IL-21 및/또는 IL-2를 포함한 배지에서 형질전환 CAR 세포의 배양을 포함한다. 세포는 약 10:1 내지 약 1:10; 약 3:1 내지 약 1:5; 약 1:1 내지 약 1:3 (면역 효과기 세포 대 AaPC)의 비; 또는 본 명세서에서 유도가능한 임의의 범위로 배양될 수 있다. 예를 들어, T 세포와 aAPC의 공동 배양은 약 1:1, 약 1:2 또는 약 1:3의 비일 수 있다.
추가 양태에서, 형질전환 CAR 세포의 집단은 7, 14, 21, 28, 35 또는 42 일 이하 동안 배양된다. 일부 경우에서, 형질전환 세포는 AaPC의 존재하에 생체외 배양되지 않는다. 일부 특이적 경우에서, 구현예의 방법은 추가로 형질감염 및/또는 배양 단계 이후 CAR-발현 면역 효과기 세포 (예를 들면, T-세포)용 세포 집단의 농축을 포함한다. 농축은 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 및 CAR-발현 세포용 분류를 포함할 수 있다. 추가 양태에서, CAR-발현 세포용 분류는 CAR-결합 항체의 사용을 포함한다. 농축은 또한 CD56+ 세포의 고갈을 포함할 수 있다. 구현예의 또 다른 추가의 추가 양태에서, 방법은 추가로 형질전환 CAR 세포의 집단의 샘플의 저온보존을 포함한다.
추가 구현예에서, 구현예의 임의의 하나의 방법으로 제조된 CAR-발현 면역 효과기 세포 (예를 들면, T-세포) 집단이 제공된다.
추가 구현예에서, 본 구현예의 방법에 따른 세포 조성물의 생산 및 유효량의 상기 세포 조성물의 이를 필요로 하는 환자에 투여를 포함하는 환자에서 질환의 치료 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 일부 양태에서 1회 이상, 예컨대 별도로 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상을 포함하는 본 명세서에 기재된 세포 집단으로부터의 유효량의 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 의학적 병태를 지니는 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 추가 구현예에서 표적 항원을 암호화한 제1 이식유전자 및 인간 백혈구 항원 (HLA)을 암호화한 제2 이식유전자를 포함한 가공된 항원 제시 세포 (APC)가 제공되고, 상기 HLA는 표적 항원의 에피토프와 착물로 APC의 표면상에 발현된다. 가공된 APC는 불멸화될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 일부 양태에서, 가공된 APC는 1차 세포 또는 T-세포 또는 T-세포 전구체이다. 일부 추가 양태에서, 가공된 APC는 αβTCR 또는 γδTCR을 발현하는 T-세포이다. 특정 특이적 양태에서, 가공된 APC에서 발현된 HLA는 HLA-A2이다. 추가의 추가 양태에서, 가공된 APC는 감염성 물질이 없도록 식별되었고 이를 위하여 시험되었다.
일부 양태에서, 구현예의 가공된 APC는 공자극 분자를 암호화한 적어도 제3 이식유전자를 추가로 포함할 수 있다. 공자극 분자는 막-결합된 Cγ 시토카인일 수 있는 공자극 시토카인일 수 있다. 특정 양태에서, 공자극 시토카인은 막-결합될 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 IL-15이다.
추가 양태에서, 구현예의 가공된 APC는 비활성화 또는 조사된다. 일부 양태에서, 가공된 APC는 억제 유전자의 발현을 감소 또는 제거시키기 위해 편집된 유전자를 포함할 수 있다. 특이적 양태에서, 억제 유전자는 PD-1, LIM-3, CTLA-4 또는 TCR일 수 있다.
추가의 추가 양태에서, 구현예의 가공된 APC에서 발현된 표적 항원은 감염성 질환 항원 또는 종양-관련된 항원 (TAA)일 수 있다. 표적 항원은 세포내 또는 세포 표면 항원일 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 표적 항원은 TAA 예컨대 종양 세포의 세포하 구획으로부터 유도된 TAA이다. TAA는 막-결합, 세포질성, 핵-국지화, 또는 심지어 종양 세포에 의해 분비될 수 있다. 바람직하게는, TAA는 상응하는 정상 조직에 비교하여 차별적으로 발현되고 그렇게 함으로써 면역 효과기 세포에 의해 종양 세포의 우선적인 인식을 허용한다. 종양 항원은 (전형적으로 태아 조직 및 암성 체세포에서 단지 발현된) 종양태아성인, (종양형성 형질전환 바이러스에 의해 암호화된) 종양바이러스성인, (신조직형성에서 크게 상승된 발현의 수준으로, 양쪽 정상 및 신생물성 조직에 의해 발현된) 과발현된/축적된, (암 세포 및 성인 재생산적인 조직 예컨대 고환 및 태반에 의해 단지 발현된) 암-정소인, (단일 암 조직유형에 의해 크게 발현된) 계대-제한된, (전사에서 유전적 돌연변이 또는 변경의 결과로서 암에 의해 단지 발현된) 돌연변이된, (글리코실화, 등에서 종양-관련된 변경) 후번역으로 변경된, 또는 유전형 (종양 세포가, 예를 들면, 클론성 일탈에서 비롯한 B 세포, T 세포 림프종/백혈병에서와 같이 특이적 "클로노타입(clonotype)"을 발현하는 고 다형성 유전자)인 것으로서 막연히 분류될 수 있고, 임의의 상기 TAA는 구현예에 따라 표적 항원으로서 작용할 수 있다. 표적 항원의 특이적 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: WT1, MUC1, LMP2, HPV E6 E7, EGFRvIII, HER-2/neu, 유전형, MAGE A3, p53 비돌연변이체, NY-ESO-1, PSMA, GD2, CEA, MelanA/MART1, Ras 돌연변이체, gp100, p53 돌연변이체, 프로테이나제3 (PR1), bcr-abl, 티로시나제, 서바이빈, PSA, hTERT, 육종 전좌 중단점, EphA2, PAP, ML-IAP, AFP, EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알산, MCN, RhoC, TRP-2, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔린, PSCA, MAGE A1, sLe(a), CYP1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, 탄산탈수소효소 IX, PAX5, OT-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구마인, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PDGFR-β, MAD-CT-2, 및 Fos-관련된 항원 1. 다른 양태에서, 표적 항원은 감염성 질환 항원이다.
더욱 또 다른 추가 양태에서, 구현예의 가공된 APC는 인간 세포이다. 일부 양태에서, 가공된 APC의 제1 및/또는 제2 이식유전자는 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 추가로, 특정 양태에서, 제1 및/또는 제2 이식유전자는 트랜스포손 반복부 또는 바이러스 LTR에 의해 측접될 수 있다. 추가 양태에서, 제1 및/또는 제2 이식유전자는 재조합 mRNA에 의해 암호화된다.
추가 구현예에서 구현예에 따른 가공된 APC의 집단 및 APC에서 발현된 HLA와 착물에서 표적 항원의 에피토프에 특이성을 갖는 면역 효과기 세포 (예를 들면, T-세포)의 집단을 포함한 세포 배양물이 제공된다. 특정 양태에서, 배양액의 면역 효과기 세포는 가공된 APC로서 동일한 유전적 배경을 갖는다. 특이적 양태에서, 면역 효과기 세포는 가공된 APC에서 발현된 HLA와 착물에서 표적 항원의 에피토프에 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현시킨다. 특정 양태에서, TCR은 αβTCR이다. 특정 양태에서, 표적 항원은 NY-ESO-1이다. 일부 특정 양태에서, TCR은 항-NY-ESO-1-αβTCR (서열 번호: 28)과 동일하거나, 이에 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
추가 양태에서, 세포 배양물의 면역 효과기 세포 (상기 구현예의 가공된 APC 포함)는 가공된 APC 내 발현된 HLA를 갖는 착물 내에서 표적 항원의 에피토프와 결합하는 키메라 T 세포 수용체 (CAR)를 발현한다. CAR은 APC에서 발현된 HLA와 착물에서 표적 항원의 에피토프에 결합하는 항체 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 특정 양태에서, 표적 항원은 NY-ESO-1이다. 특정 양태에서, CAR 폴리펩티드는 하기와 동일하거나, 이에 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다: NY-ESO-1R-CD28Tm-CD137-Z CAR (서열 번호: 22); NY-ESO-1R-CD8a-CD28-Z CAR (서열 번호: 24); 또는 NY-ESO-1R-CD8a-CD137-Z CAR (서열 번호: 26).
일부 양태에서, 구현예의 가공된 APC의 세포 배양물은 면역 효과기 세포 (예를 들면, T-세포) 증식을 자극시키는 배지를 포함할 수 있다. 배지는 IL-21 및/또는 IL-2를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 배양액은 약 10:1 내지 약 1:10 (면역 효과기 세포 대 가공된 APC)의 비를 포함한다.
또 다른 추가 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 담체에서 본원에서 기재된 구현예에 따라 가공된 APC의 집단을 포함한 약제학적 조성물이 제공된다.
추가의 추가 구현예에서, 대상체에 구현예에 따라 가공된 APC의 유효량 투여를 포함하는 질환을 가진 대상체의 치료 방법이 제공되고, 여기서 상기 APC는 질환과 관련된 표적 항원을 발현시킨다. 일부 양태에서, 대상체는 가공된 APC에 의해 암호화된 표적 항원을 발현하는 암을 갖는다. 암은 골수종 또는 활막 육종일 수 있다. 특정 양태에서, 암은 NY-ESO-1 양성 암이고 표적 항원은 NY-ESO-1이다.
구현예의 일부 양태에서, 가공된 APC는 대상체로부터 이전에 단리되었다. 추가 양태에서, 방법은 대상체에 항원-특이적 면역 효과기 세포의 집단 투여를 추가로 포함하고, 상기 면역 효과기 세포는 가공된 APC에서 발현된 HLA와 착물에서 표적 항원의 에피토프에 특이성을 갖는다. 면역 효과기 세포는 대상체로부터 이전에 단리되었을 수 있다. 추가 양태에서, 면역 효과기 세포는 가공된 APC에서 발현된 HLA와 착물에서 표적 항원의 에피토프에 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 가공되었다. 특이적 양태에서, TCR은 αβTCR이다. 일부 특정 양태에서, 표적 항원은 NY-ESO-1이다. 특정 양태에서, TCR은 항-NY-ESO-1-αβTCR (서열 번호: 28)과 동일하거나, 이에 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다.
상기 구현예의 추가 양태에서, 면역 효과기 세포는 가공된 APC에서 발현된 HLA와 착물에서 표적 항원의 에피토프에 결합하는 키메라 T-세포 수용체 (CAR)를 발현시킨다. CAR은 가공된 APC에서 발현된 HLA와 착물에서 표적 항원의 에피토프에 결합하는 항체 가변 도메인을 포함할 수 있다. 일부 특정 양태에서, 표적 항원은 NY-ESO-1이다. 추가 양태에서, CAR 폴리펩티드는 하기와 동일하거나, 이에 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함한다: NY-ESO-1R-CD28Tm-CD137-Z CAR (서열 번호: 22); NY-ESO-1R-CD8a-CD28-Z CAR (서열 번호: 24); 또는 NY-ESO-1R-CD8a-CD137-Z CAR (서열 번호: 26).
추가 구현예에서, 하기와 동일하거나, 이에 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 재조합 CAR 폴리펩티드가 제공된다: NY-ESO-1R-CD28Tm-CD137-Z CAR (서열 번호: 22); NY-ESO-1R-CD8a-CD28-Z CAR (서열 번호: 24); 또는 NY-ESO-1R-CD8a-CD137-Z CAR (서열 번호: 26). 추가의 추가 구현예에서, 하기와 동일하거나, 이에 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 CAR 폴리펩티드를 포함하는 면역 효과기 세포 (예를 들어, T 세포)가 제공된다: NY-ESO-1R-CD28Tm-CD137-Z CAR (서열 번호: 22); NY-ESO-1R-CD8a-CD28-Z CAR (서열 번호: 24); 또는 NY-ESO-1R-CD8a-CD137-Z CAR (서열 번호: 26).
추가의 추가 양태에서, 구현예의 방법은 항원-발현 가공된 APC용 세포 집단의 농축을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 농축은 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 포함한다. 특이적 양태에서, 농축은 항원 발현용 분류를 포함한다.
추가 구현예로 APC를 포함한 세포의 샘플 수득 단계 및 표적 항원을 암호화한 이식유전자 및 인간 백혈구 항원 (HLA)을 암호화한 이식유전자를 포함한 핵산으로 세포 형질감염 단계를 포함하는 구현예의 가공된 APC 제조 방법이 제공되고, 이로써 상기 HLA는 가공된 APC의 집단을 생산하기 위해 표적 항원의 에피토프와 착물에서 APC의 표면 상에 발현된다. 특정 양태에서, APC는 T-세포 또는 T-세포 전구체이다. 추가 양태에서, 방법은 형질감염에 앞서 샘플에서 APC의 정제 또는 농축을 추가로 포함한다. 특이적 양태에서, T-세포 또는 T-세포 전구체는 유도된 만능 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 조혈 줄기 세포로부터 유도된다. 추가 양태에서, 샘플에서 T-세포의 농축은 단핵 세포 분획의 수집을 포함한다. 일부 양태에서, 세포의 샘플은 대상체로부터 제대혈, 림프양 장기 또는 말초 혈액 샘플 출신일 수 있다. 특정 양태에서, 세포의 샘플은 분리반출법 또는 정맥천자에 의해 수득될 수 있다. 추가의 추가 양태에서, 세포의 샘플은 T-세포의 아집단이다. 일부 특이적 양태에서, 형질전환 CAR 세포는 내인성 T-세포 수용체 및/또는 내인성 HLA의 발현을 위하여 비활성화된다. 특정 양태에서, 세포의 샘플 수득은 제3 당사자로부터 세포 수득을 포함한다.
일부 양태에서, APC의 형질감염은 가공된 APC를 발생시키기 위해 APC에 DNA 암호화 이식유전자의 전기천공을 포함한다. 추가 양태에서, APC는 바이러스 벡터를 이용하여 형질도입될 수 있다. 일부 양태에서, 형질감염은 바이러스로 세포의 감염 또는 형질도입을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 추가 양태에서, 세포는 막-결합된 Cγ 시토카인을 암호화한 핵산으로 추가로 형질감염된다. 특정 양태에서, 막-결합된 Cγ 시토카인은 막 결합된 IL-7, IL-15 또는 IL-21일 수 있다. 특이적 양태에서, 막-결합된 Cγ 시토카인은 IL-15-IL-15Rα 융합 단백질이다.
추가 양태에서, APC의 형질감염은 세포에 트랜스포사제의 형질도입을 추가로 포함하고 여기서 적어도 하나의 이식유전자는 트랜스포손 반복부에 의해 측접된다. 일부 양태에서, 트랜스포사제는 DNA 발현 벡터, mRNA, 폴리펩티드, 또는 발현성 RNA로서 제공될 수 있다. 특정 양태에서, 트랜스포사제는 연어과-유형 Tc1-형 트랜스포사제(SB)이다. 추가 특이적 양태에서, 트랜스포사제는 SB11 또는 SB100x 트랜스포사제이다.
구현예의 추가의 추가 양태에서, 가공된 APC의 생산 방법은 APC의 증식을 향상시키는 배지에서 생체외 가공된 APC 세포의 집단의 추가의 배양 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 가공된 APC의 배양은 항원-특이적 면역 효과기 세포, 예컨대 T-세포의 존재하에 세포의 배양을 포함할 수 있고, 상기 세포는 APC에서 발현된 HLA와 착물에서 표적 항원의 에피토프에 특이성을 갖는다. 특정 양태에서, 면역 효과기 세포는 APC로서 동일한 대상체로부터 수득될 수 있다. 추가 양태에서, 면역 효과기 세포는 APC에서 발현된 HLA와 착물에서 표적 항원의 에피토프에 결합하는 T-세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 가공되었다. 특이적 양태에서, TCR은 αβTCR이다. 추가의 추가 양태에서, 면역 효과기 세포는 APC에서 발현된 HLA와 착물에서 표적 항원의 에피토프에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 가공되었다. 일부 양태에서, CAR은 APC에서 발현된 HLA와 착물에서 표적 항원의 에피토프에 결합하는 항체 가변 도메인을 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 구현예의 가공된 APC는 감염성 물질이 없도록 식별되었고 이를 위하여 시험되었다. 일부 양태에서, 면역 효과기 세포의 존재하에 가공된 APC의 배양은 IL-21 및/또는 IL-2를 포함한 배지에서 세포의 배양을 포함할 수 있다. 추가 양태에서, 면역 효과기 세포의 존재하에 가공된 APC의 배양은 약 10:1 대 약 1:10 (면역 효과기 세포 대 APC)의 비로 세포의 배양을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 가공된 APC의 배양은 7, 14, 21, 28, 35 또는 42 일 이하 동안이다.
추가의 추가 구현예로 본원에서 기재된 임의의 구현예의 방법으로 제조된 가공된 APC 집단이 제공된다.
추가 구현예에서, 가공된 APC 및/또는 항원 특이적 면역 효과기 세포를 포함한 세포 조성물이 제공된다. 세포 조성물은 100 또는 1,000 만큼 적은 세포를 포함할 수 있다. 하지만, 일부 양태에서, 세포 조성물은 적어도 약 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 이상의 가공된 APC 및 또는 항원 특이적 면역 효과기 세포를 포함한다. 일 양태에서, 세포는 본질적으로 동일한 유전적 물질을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 세포는, 공여체 또는 환자일 수 있는, 단일 대상체로부터 유도된 인간일 수 있다.
추가의 추가 구현예에서, 본 실시형태의 가공된 APC를 포함하는 세포 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
또 다른 추가 구현예에서, 가공된 APC를 포함한 세포 집단 또는 가공된 APC를 포함한 약제학적 조성물의 유효량 투여를 포함하는 환자에서 질환의 치료 방법이 제공된다. 일 양태에서, 환자는 인간 환자일 수 있다. 특정 양태에서, 질환은 암일 수 있다. 추가 양태에서, 암은 혈액 또는 고형 암, 예컨대 T-세포 ALL, B-ALL, CML, 결장암, 난소암, 신경교세포종, 뇌 종양(들), 또는 췌장암일 수 있다. 일부 양태에서, 환자는 사전 항암 요법을 받을 수 있다. 일 양태에서, 환자는 관해에 있을 수 있다. 또 다른 양태에서, 환자는 암의 증상이 없을 수 있지만, 검출가능한 암 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 질환은 바이러스 감염(예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바르 바이러스(EBV), 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV))일 수 있다. 또 다른 양태에서, 질환은 박테리아 감염일 수 있다. 일 양태에서, 질환은 패혈증일 수 있다.
일부 양태에서, 가공된 APC를 포함한 세포 조성물은 환자에 동종이계일 수 있다. 다양한 양태에서, 동종이계 세포 조성물은 환자와 HLA를 공유할 수 있거나, 또는 공유하지 않을 수도 있다. 또 다른 양태에서, 가공된 APC를 포함한 세포 조성물은 환자에 자가조직일 수 있다.
추가 구현예에서, 본 구현예의 가공된 APC를 포함한 세포 조성물의 생산 및 유효량의 상기 세포 조성물의 이를 필요로 하는 환자에 투여를 포함하는 환자에서 질환의 치료 방법이 제공된다.
일부 양태에서, 일부 양태에서 1회 이상, 예컨대 별도로 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상을 포함하는 상기 구현예의 가공된 APC의 유효량의 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 의학적 병태를 지니는 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 추가 구현예에서 치료적 목적을 위하여 유전자 변형 이후 고-에너지 면역 효과기 세포 (예를 들면, CAR+ T 세포)의 식별 및 선택 방법이 본원에서 제공된다. 따라서, 일 구현예에서, 미토콘드리아 예비 호흡 용량을 갖는 CAR-변형된 면역 효과기 세포의 선택 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 방법은 미토콘드리아 리포터 유전자의 발현 수준의 검출 및 미토콘드리아 리포터 유전자의 상승된 발현 수준을 갖는 면역 효과기 세포의 선택을 포함하고, 그렇게 함으로써 미토콘드리아 예비 호흡 용량을 갖는 면역 효과기를 선택한다. 일부 양태에서, 면역 효과기 세포는 인간 세포, 예컨대 CAR-변형된 인간 T 세포일 수 있다.
일부 양태에서, 구현예에 따라 사용을 위한 미토콘드리아 리포터 유전자는 내인성 유전자일 수 있다. 일부 양태에서, 미토콘드리아 리포터 유전자는 외인성 유전자, 예컨대 형광성 리포터 단백질을 암호화한 유전자일 수 있다. 일부 양태에서, 형광성 리포터 단백질은 미토콘드리아 국지화 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, SRC를 갖는 면역 효과기 세포의 선택 방법은 유세포측정 또는 FACS를 포함할 수 있다.
특정 양태에서, SRC를 갖는 면역 효과기 세포 식별을 위한 리포터 유전자의 발현은 핵 프로모터 (예를 들면, hEF1a)의 관리 하일 수 있다. 특정 양태에서, 리포터 유전자의 발현은 미토콘드리아 프로모터의 관리 하일 수 있다. 특정 양태에서, 발현된 리포터 단백질은 미토콘드리아 국지화 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 발현된 리포터 단백질은 세포 표면에 관련될 수 있다. 특정 양태에서, 리포터 유전자의 발현은 미토콘드리아 프로모터의 관리 하일 수 있고 발현된 리포터 단백질은 세포 표면에 관련될 수 있다. 일부 양태에서, 외인성 리포터 유전자는 트랜스포손 반복부 또는 바이러스 LTR에 의해 측접될 수 있다. 일부 양태에서, 외인성 리포터 유전자는 염색체외 핵산, 예컨대 mRNA 또는 에피솜 벡터에서 포함될 수 있다.
일부 양태에서, SRC로 선택된 면역 효과기 세포 (예를 들면, CAR-변형된 T 세포)는 일정한 기간 동안 생체외 증식될 수 있고, 이는 일부 양태에서, 공급 세포, 예컨대 CAR (예를 들면 2D3 scFv)에 결합하는 CAR 리간드 또는 항체를 함유한 활성화 및 전파 세포 (AaPC)로 세포의 배양을 포함할 수 있다. 일 양태에서, AaPC는 유전자 이식 K562 세포일 수 있다. 일 양태에서, AaPC는 CD137L을 발현시킬 수 있다. 다른 양태에서, AaPC는 CD19, CD64, CD86 또는 mIL15를 추가로 발현시킬 수 있다. 특정 양태에서, AaPC는 적어도 하나의 항-CD3 항체 클론, 예를 들어, OKT3 및/또는 UCHT1을 발현시킬 수 있다. 일 양태에서, AaPC는 비활성화될(예를 들어, 조사될(irradiated)) 수 있다. 일 양태에서, AaPC는 감염성 물질이 없도록 식별되었을 수 있고 이를 위하여 시험되었을 수 있다. 이러한 AaPC를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일 양태에서, AaPC로 CAR-변형된 T 세포 집단의 배양은 약 10:1 내지 약 1:10; 약 3:1 내지 약 1:5; 약 1:1 내지 약 1:3 (T 세포 대 AaPC)의 비; 또는 본 명세서에서 유도가능한 임의의 범위로 세포의 배양을 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포와 AaPC의 공동 배양은 약 1:1, 약 1:2 또는 약 1:3의 비일 수 있다. 일 양태에서, 배양시키는 단계는 아미노비스포스포네이트(예를 들어, 졸레드론산)와 함께 배양시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
추가 구현예에서, 미토콘드리아 예비 호흡 용량 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 갖는 면역 효과기 세포 (예를 들면, CAR-변형된 T 세포)의 집단이 제공된다. 세포의 집단은 본 구현예의 방법에 따라 선택될 수 있다. 일부 양태에서, 세포는 치료적으로 실행가능할 수 있다. 일부 양태에서, 세포의 집단은 적어도 10, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 또는 1 x 106 세포, 또는 그안에서 추론가능한 세포의 임의의 수를 포함할 수 있다. 다양한 양태에서, 세포는 NK-세포, 자연 킬러 T 세포, αβ T 세포, 또는 γδ T 세포일 수 있다. 일 양태에서, 면역 효과기 세포는 본질적으로 동일한 유전적 물질을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 면역 효과기 세포는 인간 CAR-변형된 T 세포일 수 있다. 일부 양태에서, 세포는, 공여체 또는 환자일 수 있는, 단일 대상체로부터 유도될 수 있다.
추가의 추가 구현예에서, 치료가 필요한 환자에서 질환의 치료 방법이 제공되고, 상기 방법은 미토콘드리아 예비 호흡 용량을 갖는 또는 상기로 선택된 면역 효과기 세포 (예를 들면, CAR-변형된 T 세포)의 집단의 유효량 투여를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 약 100 내지 약 1 x 106 세포, 또는 그 안에서 추론가능한 세포의 임의의 수의 환자에 투여를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 환자는 인간 환자일 수 있다. 특정 양태에서, SRC를 갖는 면역 효과기 세포의 집단은 환자에 동종이계일 수 있다. 다양한 양태에서, 동종이계 세포 조성물은 환자와 HLA를 공유할 수 있거나, 또는 공유하지 않을 수도 있다. 특정 양태에서, SRC를 갖는 면역 효과기 세포의 집단은 환자에 자가조직일 수 있다. 다양한 양태에서, 방법은 환자에 제2 요법의 투여를 추가로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, SRC를 갖는 (또는 이로 선택된) 면역 효과기 세포를 이용한 치료용 질환은 암일 수 있다. 특정 양태에서, 암은 혈액학적 또는 고형암, 예컨대 T-세포 ALL, B-ALL, CML, 결장암, 난소암, 신경모세포종, 뇌 종양(들) 또는 췌장암일 수 있다. 일부 양태에서, 환자는 사전 항암 요법을 받을 수 있다. 일 양태에서, 환자는 관해에 있을 수 있다. 또 다른 양태에서, 환자는 암의 증상이 없을 수 있지만, 검출가능한 암 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, SRC를 갖는 면역 효과기 세포를 이용한 치료용 질환은 바이러스 감염 (예를 들면, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡슈타인-바 바이러스 (EBV), 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV))일 수 있다. 또 다른 양태에서, 질환은 박테리아 감염일 수 있다. 일 양태에서, 질환은 패혈증일 수 있다.
하나의 구현예에서, 구현예에 따라 SRC를 갖는 면역 효과기 세포를 포함한 세포 조성물의 생산 및 유효량의 상기 세포 조성물의 이를 필요로 하는 환자에 투여를 포함하는 환자에서 질환의 치료 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 일부 양태에서 1회 이상, 예컨대 별도로 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상을 포함하는 SRC를 갖는 면역 효과기 세포의 유효량의 세포를 제공하는 단계를 포함하는, 의학적 병태를 지니는 개체를 치료하는 방법이 제공된다.
하나의 구현예에서, 환자에서 질환의 치료에 사용을 위한, 본 구현예의 세포 집단을 포함한 조성물이 제공된다.
본 구현예의 방법 및/또는 조성물과 관련하여 논의된 구현예는 본원에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 방법 또는 조성물에 관한 실시형태는 본 구현예의 다른 방법 및 조성물에 대해 마찬가지로 적용될 수 있다.
본 구현예의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 본 구현예의 취지 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당해 기술 분야의 숙련가에게 자명해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는 단지 예시로써 제공된다는 것이 이해되어야 한다.
도 1: 키메라 항원 수용체의 예 도식은 CD19 수용체에 표적화하였다. CAR 작제물 (CD19RCD28)은 CD19 결합 도메인 (VL/VH); 힌지 도메인 (IgG4-Fc); 막투과성 도메인 (CD28 TM) 및 세포내 신호전달 도메인 (CD28-CD3ζ)을 포함한다.
도 2a- b: A, 도는 전기천공 1 일후 및 K562 aAPC와 공동-배양 28 일후 T 세포에서 CD19RCD28 CAR의 발현을 보여주는 유세포측정에 의해 수득된 산포도를 보여준다. B, 도는 CD19RCD28 CAR T-세포에 의해 Fc 수용체 (CD32 (FcγR2a), CD64 (FcγR1a))의 시험관내 결합을 보여주는 유세포측정에 의해 수득된 산포도이다.
도 3a- b: FcR 결합으로 인한 제한된 생체내 지속성은 효능을 감소시킬 수 있다. NSG 마우스는 hRLuc+ NALM6 종양으로 주사되었고 그 다음 CD19RCD28 T 세포의 단일 주사 (또는 대조군 주사) 되었다. A, 종양과 관련된 생물발광은 경시적으로 이미지화를 통해 측정되었다. B, 그래프는 평가 발광 수준에 기반하여 경시적으로 치료된 또는 대조군 동물에서 종양 부하를 보여준다.
도 4a-h: 도는 작제되었고 시험되었던 다양한 CAR의 도식을 보여준다. 선택된 CAR 도메인의 서열이 또한 제공된다. 인간 IgG4 힌지 영역에 대하여, 힌지는 하기로부터 돌연변이화된다: 아미노산 CPSC (서열 번호: 9로서 제공된 전장 서열) 내지 CPPC (서열 번호: 10으로서 제공된 전장 서열) (이량체화된 IgG4 중쇄의 안정성을 증진시키기 위함). 인간 IgG4 Fc (아미노산 변화 L235E, 및 N297Q를 갖는 EQ 돌연변이체)는 서열 번호: 1로서 제공된다. 인간 CD8a 쇄 힌지 및 막투과성 도메인은 서열 번호: 3으로서 제공된다. 인간 IgG4 Fc 유래의 12 아미노산 스페이서는 하기로부터 돌연변이화된다: 아미노산 CPSC (서열 번호: 18로서 제공됨) 및 CPPC (서열 번호: 2로서 제공됨) (서열 번호: 2로서 제공된 이량체화된 IgG4 중쇄의 안정성을 증진시키기 위함). 인간 CD28 막투과성 세포질 도메인에 대하여, 인간 CD28 막투과성 및 엔도도메인은 하기로부터 변형되었다: RLLH (서열 번호: 11로서 제공된 전장 서열) 내지 RGGH (서열 번호: 12로서 제공된 전장 서열) (CAR의 발현을 개선시키기 위함). 인간 CD28 세포질 도메인에 대하여, 인간 CD28 엔도도메인은 하기로부터 변형되었다: RLLH (서열 번호: 16으로서 제공된 전장 서열) 내지 RGGH (서열 번호: 17로서 제공된 전장 서열) (CAR의 발현을 개선시키기 위함).
도 5: 도는 전기천공 1 일후 및 K562 aAPC를 이용한 공동-배양의 28 일후 T 세포에서 CAR의 다양한 CAR의 발현을 보여주는 유세포측정에 의해 수득된 산포도를 보여준다.
도 6: 상기 도면은 CD19R*CD28 CAR T 세포에 의해 Fc 수용체 (CD32 (FcγR2a), CD64 (FcγR1a))의 감소된 시험관내 결합을 보여주는 유세포측정에 의해 수득된 산포도를 보여준다.
도 7: 도는 K562 aAPC를 이용한 공동-배양의 28 일에 걸쳐 다양한 CAR T 세포의 증식 동력학을 도시하는 그래프를 보여준다.
도 8: 도는 CD19EL-4 및 NALM-6 표적 세포에 대하여 다양한 CAR T 세포에 의해 보여진 CD19-특이적 세포독성을 도시하는 그래프를 보여준다.
도 9: 도는 상이한 표적 세포와 접촉된 경우 다양한 CAR T 세포에 의한 CD19-특이적 IFN-감마 생산을 도시하는 그래프를 보여준다.
도 10: 도는 종양 (hRLuc+ NALM-6)으로 주사된 (i.v.) 다음 다음 날 ffLuc+ CAR+ T 세포로 주사된 (i.c.) NSG 마우스의 발광 이미지화를 보여준다. 종양 및 T 세포 이미지화는 Xenogen IVIS 100 시리즈 시스템을 각각 이용하는 EnduRen 또는 루시페린의 주사 이후 수행되었다. T 세포는 심장내 주사 (상부 행)를 식별하기 위해 직후 이미지화되었다. 그늘진 이미지는 종양-유도된 hRLuc 활성으로부터 광자 속도가 보여지는 것을 나타낸다.
도 11: 질환을 조절하기 위한 CAR+ T 세포의 개선된 생체내 효능. 상기 도면은 도 10에서 생물발광 측정에 기반하여 종양 부하를 나타내는 그래프를 보여준다. 상기 상세한 바와 같이, NSG 마우스는 hRLuc+ NALM-6 종양으로 주사된 다음 CAR T 세포의 단일 주사되었다. 종양 관련된 생물발광은 경시적으로 측정되었고 보여진다. (*)는 종양 단독 그룹에 대해 적어도 p<0.05 유의성을 나타낸다.
도 12: 상기 도면은 다양한 CAR T 세포로 치료된 NSG 마우스에 대한 생존 곡선을 도시하는 그래프를 보여준다. 유의성 (p 값)은 종양 단독 (무 치료) 그룹에 비교된 경우 계산된다.
도 13a-d: CAR+ T 세포의 특성화 PBMCs는 CD19R*CD28 또는 CD19RCD8CD28 트랜스포손 & SB11 트랜스포사제로 전기천공되었고 7-일 자극 사이클로 28 일 동안 IL-2 및 IL-21과 함께 조사된 K562 항원 제시 세포에 공동-배양되었다. 세포는 각 자극 사이클의 마지막에 열거 및 및 표현형화 (CD3, CAR)되었다. (A) 전기천공 다음 날 (제1일) 및 공동-배양의 28 일 후 CD3+ T 세포 상에서 CAR의 발현. (B) 추론된 세포는 증식 동력학을 보여주는 CD3 및 CAR+ T 세포로 포함한다. (C) CD19-특이적 세포독성은 CD19POS 표적 (CD19+ EL-4, NALM-6, Daudiβ2m)에 대해 표준 크로뮴 방출 검정을 이용하여 측정되었다. 바탕 용해는 CD19neg EL-4의 용해에 의해 묘사된다. (D) 다양한 효과기로 자극된 경우 CAR+ T 세포에 의한 IFN-γ의 세포내 생산은 CD19 발현을 표적한다.
도 14a-d: NSG (NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ, NOD scid 감마) 마우스에서 CD19+ NALM-6 세포주에 대한 CAR+ T 세포의 생체내 효능. (a-b) 최소 잔류 질환 모델에서, NSG 마우스 (n=5/그룹)는 제0일에서 hRluc+mKate+NALM-6의 104 세포로 주사되었고, 그 다음 제1일에서 심장내로 T-세포 (107/마우스)의 주사되었다. 종양 부하는 경시적으로 EnduRen Live Cell Substrate를 이용하여 hRluc+NALM-6으로부터 유도된 생물발광 이미지화에 의해 평가되었다. (C-D) 확립된 종양 모델에 대하여, NSG 마우스 (n=6/그룹)는 제0일에서 1.5x104 ffLuc+EGFP+NALM-6으로 주사되었고 종양은 5 일 동안 접목하게 되었고, 종양 부하가 평가되었고 T 세포 (107/마우스)는 제6일에서 심장내로 주사되었다. 종양 속도는 경시적으로 D-루시페린 기질을 이용한 ffLuc+NALM-6으로부터 생물발광 이미지화를 이용하여 계산되었다. 경시적으로 광자 유동 및 종양-유동을 나타내는 위색 이미지가 보여진다.
도 15: 도는 CAR T-세포에 대한 추가의 신호전달 분자를 보여준다. 상부 패널은 막-결합된 IL-15/IL-15 수용체 (mIL15) 작제물을 보여준다 (작제물용 폴리펩티드 서열은 서열 번호: 4)로서 제공된다. 하부 패널은 막-결합된 IL-15/IL-15 수용체 (좌측 패널) 및 CAR 작제물 (우측 패널)에 의해 제공된 신호전달의 도식이다.
도 16: mIL15 및 CAR의 안정한 공동-발현. 좌상측 패널은 24-시간 후-전기천공 또는 자극 4 (Stim 4)로부터 mIL15+CAR+ T 세포의 대표적인 유동 도표를 보여준다. 좌하측 패널은 CAR 또는 CAR 및 mIL15를 발현하는 전기천공된 세포의 백분율을 보여주는 그래프이다. 우상측 패널, 그래프는 항원 배출 이후 배양액내 CAR T-세포 수의 변화를 보여준다. 연구는 IL-15 없이, 부가된 IL-15 착물과 또는 세포 공동-발현 mIL-15 및 CAR와 함께 완료되었다. 우하측 패널은 mIL-15를 발현하는 CAR T-세포내 다양한 전사 조절물질에 대한 발현 수준의 그래프를 보여준다.
도 17a- b: A, 도는 CAR을 단독으로 또는 mIL-15와 병용하여 발현하는 ffLuc+ T 세포로 주사되었던 마우스의 발광 이미지화를 보여준다. T 세포 이미지화는 Xenogen IVIS 100 시리즈 시스템을 이용하여 각각 루시페린의 주사 이후 수행되었다. 그늘진 이미지는 경시적으로 ffLuc+ T 세포 활성으로부터 광자 속도를 나타낸다. B, 좌측 패널, 그래프는 항원의 존재하에 또는 항원 배출 (WD) 이후 배양 mIL-15-CAR T-세포내 인자의 발현 수준을 보여준다. 우측 패널은 자극으로 및 자극 없이 CAR T 세포 및 mIL-15-CAR T-세포의 히스토그램을 보여준다.
도 18: CAR T-세포에 의한 종양 성장의 생체내 조절. 상기 도면은 hRLuc+ 종양 세포로 주사되었던 마우스의 발광 이미지화 (상부 패널) 및 정량화 (하부 패널, 그래프)를 보여준다. 지시된 바와 같이, 특정 마우스는 CAR 또는 CAR 및 mIL-15를 발현한 T 세포로 또한 주사되었다.
도 19: 항원-제시 세포로서 기능한 T 세포 (T-APC)를 예시하는 개략도. 후 자가조직의 T 세포는 양쪽 직접 및 교차-프라이밍을 통해 내인성 장기간 면역력을 이식 뿐만 아니라 개선한다.
도 20: 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 플라스미드의 그래픽 표현은 종양 항원 NY-ESO-1을 발현하기 위해 인간 T-세포를 유전자 상으로 변형하는데 사용하였다. 구성적 발현은 hEF1-알파 프로모터에 의해 유도되고 선택은 0.2 mg/mL 하이그로마이신하에 T-세포 전파에 의해 달성된다.
도 21: aAPC로서 사용을 위하여 K562에서 T 세포 공자극 분자의 발현.
도 22: SB 플라스미드 공동-발현 FLAG-태그된 NY-ESO-1 및 HyTK의 전기-이동후 OKT3-aAPC에서 공동-배양의 제28일에서 인간 T-APC의 유세포측정.
도 23: PBMC는 NY-ESO-1+T-APC (상부) 대 K562 aAPC (하부)에서 증식하였다.
도 24: NY-ESO-1+ CAR T 세포는 NY-ESO-1+T-APC 대 K562 aAPC에서 증식하였다.
도 25: 3 자극후 NY-ESO-1+T-APC에서의 억제 분자.
도 26: NY-ESO-1+mIL-15+HLA-A2+T-APC는 aAPC의 존재하에 전파하였다.
도 27: T-APC 증식. T-APC는 CAR T 세포 뿐만 아니라 양성 대조군, K562-유도된 aAPC를 성공적으로 증식시킬 수 있었다.
도 28: NY-ESO-1 특이적 TCR+ 및 CAR+ T 세포에 의해 NY-ESO-1+ U266 인간 다발성 골수종 세포주의 사멸을 보여주는 크로뮴 방출 검정. T-세포는 K562로부터 유도된 인공 활성화 및 전파 세포 (AaPC)에서 증식되었고 HLA-A02 및 NY-ESO-1+를 발현시킨다. 데이터는 AaPC K562로 2 자극 및 HLA-A2/NY-ESO-1 T-APC로 3 자극 동안 전파된 9-2-15의 NY-ESO-1 특이적 CAR T-세포가 유도하였던 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. 9-2-15 CAR은 CD8α 줄기를 함유하고 반면에 이전의 하나는 IgG4 줄기를 함유하였다.
도 29a-29b: 도 29a. 조사된 K562 AaPC의 존재하에 생체외 성장된 대조군 T 세포와 함께 유전자 변형된 T 세포의 TEM (투과 전자 현미경검사) 이미지. 미토콘드리아의 수 증가는 유사한 조건하에 활성화된 비변형된 대조군 세포 (좌측 패널)에 비교된 경우 CAR 변형된 세포 (우측 패널)에서 보여진다. 도 29b. 제35일에서 배양액에 전파하는 CAR-변형된 T 세포내 미토콘드리아의 응축된 상태에 비교된 경우 비변형된 대조군 T 세포내 미토콘드리아의 규칙적 정통 구조를 보여주는 투과 전자 현미경검사 (TEM) 이미지 (축척 500 nm, 50,000 X 배율).
도 30: 공자극 없이 HER1-3 이중-특이적 CAR-T 세포의 생체외 증식. 세포는 CD28 및/ 또는 CD137 T-세포 신호전달 엔도도메인으로 CAR 변형되거나 또는 비변형되었다. CD137 T-세포 신호전달 엔도도메인을 이용한 세포는 배양액에서 무 공자극이 제공된 경우 CD28 신호전달 도메인을 함유한 CAR T 세포와는 대조적으로 배양액에서 더 양호하게 생존하였다. 더 양호하게 작업된 비변형된 대조군 세포에 대한 OKT3 자극은 CD3z를 통해 유도된 더 높은 신호전달 강도 때문일 수 있다. K562 AaPC의 존재하에 생체외 전파된 종양 항원 HER1-3을 표적한 CAR-T 세포의 TEM 이미지가 보여진다. 이는 다른 종양 항원 표적화된 CAR, 예컨대 ROR1, CD123, 및 C19에 대하여 또한 시험되었다. 실행가능한 절대적인 T-세포 수는 트리판 블루 생/사 배제 방법을 이용하여 Nexcelom Cellometer?에 의해 계수되었다.
도 31: 형광성 단백질 리포터용 SB 플라스미드 작제물. GRX2는 GLRX2 (펍메드 ID# NP_932066.1)로부터 유도된 미토콘드리아 국지화 서열이다. NLS는 핵 국지화 서열 (펍메드 ID# NM_017921)이다.
도 32: CAR 내 EYFP의 내인성 발현의 유세포측정 분석이 세포를 변형시켰다. CD137-CAR T 세포에서 높은 EYFP를 갖는 CAR+ T 세포의 발생은 배양의 제35일에서 공자극 없이 성장하였다. CD28-T 세포는 보다 소수의 또는 보다 어두운 EYFP-양성 T 세포를 보여주었다. 유세포측정은 CAR 발현에 대하여 Fc 염색 및 미토콘드리아 강도에 대하여 내인성 EYFP에 기반하였다.
도 33a-33b: HER1-3 이중-특이적 CAR-T 세포의 미토콘드리아 바이오매스는 T-세포 공자극 없이 조사된 공급 세포 (K562 AaPC)로 증식시켰다. 도 33a. 비변형된 T 세포 및 T 세포에서 미토콘드리아의 분포를 보여주는 투과 전자 현미경검사 (TEM) 이미지 (축척 500 nm, 15,000X 배율)는 (CD28-CD3z 또는 CD137-CD3z T 세포 신호전달 엔도도메인으로 이루어진) 원형 CAR 표적화 HER1-HER3을 발현하기 위해 변형하였다. 도 33b. 세포 당 미토콘드리아의 평균 수는 막대 그래프로 나타난다. CD137 T 세포 신호전달 도메인을 갖는 전체 CAR-T 세포는 CD28 신호전달 도메인을 함유한 CAR-T 세포와 비교된 경우 배양의 제21일 후 바이오매스의 증가를 보여주었다.
도 34: 고 에너지 T 세포 (eT)의 시험관내 세포독성. 높은 미토콘드리아 질량으로 분류된 고-에너지 T 세포는 종양 항원 양성 유방암 세포의 특이적 사멸에 의해 입증됨에 따라 세포독성 능력을 보유하는 것으로 발견되었다. 데이터는, 높은 EYFP/미토콘드리아 강도를 갖는 CAR T 세포에 의해 용해된, 특이적 항원에 양성인 유방 종양 계통에 대해 Cr-표지된 HER1-3+ T 세포 상에서 수행된 크로뮴 방출 검정 유래의 것이다.
도 35: 비변형된 및 CAR-변형된 T 세포의 형광 현미경검사 이미지는 최소 활성화를 갖는 조사된 공급 세포 (K562 AaPC)의 존재하 및 공자극의 완벽한 부재하에 생체외 증식하였다. CD137 T 세포 신호전달 엔도도메인을 함유한 CAR-T 세포는 리포터 단백질 (EYFP-GRX2)로부터 내인성으로 나오는 형광 신호 세기로부터 관측된 경우 미토콘드리아 질량의 더 높은 분포를 보여주었다. 대사작용으로 활성 T 세포의 수는 CD28 신호전달 도메인을 함유한 CAR-T 세포와 비교된 경우 CD137 T 세포 신호전달 엔도도메인을 함유한 CAR-T 세포에서 유의미하게 더 높았다. 이는 공여체 또는 CAR 유형과 무관하게 일관되었다.
도 36: 생체외 증식된 CAR-변형된 T 세포내 미토콘드리아 분포의 패턴은 조사된 공급 세포 (K562 AaPC)의 존재하에 성장하였다.
도 37a-37b: 형광 현미경검사 이미지의 통합된 형태계측 분석은 특정한 신호전달 엔도도메인을 나타내는 유전자 변형된 T-세포 그룹 (HER1-HER3 CD137-CD3z T 세포) 내에서 미토콘드리아 강도에 기반하여 CAR-변형된 T 세포의 이종 집단을 보여준다. 도 37a. HER1-3 CD137 CAR+ T 세포 중에서 EYFP-Mito의 집단 변화. 도 37b. HER1-3 CD137 CAR+ T 세포 중에서 EYFP-Mito의 평균 세기.
도 38: 범용 K562-AaPC에서 성장된 CAR+T 세포의 투과 전자 현미경검사 (TEM) 이미지. 이미지는 실시예 8에서 기재된 연구의 제14일 유래의 것이다.
도 39: 범용 K562-AaPC에서 ROR1-CAR T 세포의 성장 동력학. CD28 신호전달을 함유한 CAR-T 세포는 세포자멸사를 빠르게 경험하였고 (좌측 차트), 반면에 CD137z 신호전달을 함유한 CAR-T 세포는 더 오래 지속하였다 (우측 차트).
임상시험은 유전자 상으로 변형된 T-세포를 수용하였던 환자에서 항-종양 효과를 입증하였다. 예를 들어, CAR-T 세포 요법은 진전된 B-세포 악성종양으로 괴로운 인간 환자에서 유의미한 관해를 전달하는 것으로 나타났다 (Maude et al., 2014). CAR-T 세포는 신체에서 종양 세포를 찾고 파괴하기 위한 세포독성 능력 및 필수 특이성을 갖고 재발을 예방하기 위해 충분히 오래 지속할 수 있다. 일련의 사멸의 상기 고전적 상황 (무력증 경험 없이 다중 종양 세포의 한 T-세포 사멸)은 다양한 단계 I 시도하에 치료된 몇 명의 환자에서 최근에 나타났다 (Corrigan-Curay et al., 2014). 하지만, 균일한 및 명백한 임상적으로 관련된 결과는 CAR 설계, CAR T-세포 엔도도메인, 스페이서 길이 용법, scFv의 친화도, 등등을 거쳐 아직 출현하지 않는다 (Jena et al., 2014). 이는 CAR-T 세포 주입을 통해 치료를 찾는 환자 집단 중에서 가변 종양 부하 및 종양 유형에 의해 재차 화합된다. 종양 유형, 종양 단계, 및 환자 집단의 전체 범위에 걸쳐 (유의미한 독성 없이) 임상적으로 관련된 결과를 면제할, 치료적으로 유효한 CAR 작제물, 및 궁극적으로 유전자-변형된 T-세포 집단을 설계하는 것이 중요한 문제이다.
본원에서 상세한 연구는, (예를 들면, 오프-표적 세포독성 활성으로부터) T-세포 및 잠재적 독성의 효능에 영향을 미칠 수 있는, CAR T-세포 지속성에서 역할을 하는 중요 요소를 식별한다. 특히, Fc 수용체에 의해 결합되기 위한 CAR 폴리펩티드의 능력이 T-세포의 지속성 및 항-종양 효능을 조절한다는 것이 보여진다. 따라서, CAR T-세포 효능 (및 생체내 지속성)은 T-세포에서 발현된 CAR 폴리펩티드의 Fc 수용체 결합 특성의 변화에 의해 변경될 수 있다. 예를 들어, 예컨대 인간 면역글로불린 불변 영역으로부터, Fc 수용체 결합 서열은 지속성을 감소시키기 위해 및 T-세포의 잠재적 독성을 조절하기 위해 CAR에서 포함될 수 있다. 반대로, CAR 폴리펩티드는 생체내 지속성을 증가시키기 위해 및 CAR T-세포의 효능을 향상시키기 위해 Fc 수용체-결합 요소를 제거하도록 변형될 수 있다. 따라서, 본원에서 상세한 CAR 폴리펩티드, CAR T-세포 및 방법은 CAR T-세포 요법의 효능 및 독성을 조절하기 위해 (Fc 수용체 결합을 조정함으로써) CAR T-세포 지속성의 미세-조율(fine-tuning)을 허용한다.
추가 구현예에서, 표적 항원을 암호화한 이식유전자 및 인간 백혈구 항원 (HLA)을 암호화한 이식유전자를 포함하는 가공된 항원 제시 세포 (APC)가 제공된다. 일부 양태에서, 가공된 APC는 공자극 인자 (예컨대 IL-15)를 암호화한 하나 이상의 이식유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 가공된 APC는 예를 들어 T-세포 (예를 들면, CAR T-세포)의 생체외 증식 방법에서 사용될 수 있거나 또는 생체내 항원-특이적 T-세포의 성장을 자극시키기 위해 대상체에 투여될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공된 세포는 질환 (예를 들면, 암)의 치료를 위하여 항원-특이적 T-세포의 성장을 자극시키도록 사용될 수 있다.
본원에서 개시된 추가 구현예는, 향상된 치료 특성을 제공할 수 있는, SRC를 갖는 또는 상기로 선택된 면역 효과기 세포를 제공한다. 높은 미토콘드리아 바이오매스를 갖는 세포는 본원에서, 예를 들어, "에너지 T 세포" 또는 "eT 세포"로서 지칭된다. 유전자-변형된 면역 효과기 세포의 증가된 지속성이 개선된 치료적 잠재성과 양성으로 상관하기 때문에, 면역 세포 예컨대 에너지 T 세포는 벌크 유전자-변형된 T 세포보다 더 양호하게 수행한다고 예상된다. 또한, 장기간 생존한 CAR-T 세포가 미토콘드리아 강도 (즉, 예비 호흡 용량 또는 SRC)에 기반된 사전-주입으로 식별될 수 있으면 CAR 설계에 관한 다수의 변수의 영향, 및 따라서 CAR 효능은 활용될 수 있다. 따라서, 미토콘드리아 강도는 CAR 엔도도메인 용도, CAR 작제물 설계, 스페이서 길이, 및 scFv의 친화도와 무관한 최상의 일련의 T-세포 킬러의 선택/분류, 그렇게 함으로써 특정한 종양 항원 및 종양 유형에 적합한 CAR 설계를 최적화하기 위해 번역 장애의 감소에 도움을 줄 수 있다. 최상의 T 세포 (예를 들면, 종양 미세환경에서 최대 생존 잠재성을 갖는 것) 사전-주입의 채집은 다중 상황에서 유리할 수 있다. 이와 같이, 정량화가능하고 미토콘드리아 SRC와 상관하고, 차례로 낮은 산소, 당분해용 특이적 영양소의 부재 및 고 부담 종양 항원에 의해 야기된 활성화 유도된 세포 사망의 비호의적인 조건에서 생존하기 위해 유전자 상으로-변형된 T 세포의 대사성 능력을 지시하는, 리포터 형광성 단백질 (예를 들면, EYFP-GRX2)을 이용하는 CAR+ T 세포의 "적응도" 평가 방법이 제공된다.
더욱이, 보다 소수의, 보다 강한 주입용 CAR+ T 세포의 선택이 주입후 T 세포-관련된 독성의 감소 또는 심지어 폐지에 도움을 줄 수 있다. 주입에 필요한 세포의 수 제한은 유전적 변형에 대하여 증가하는 상당수의 성장하기 어려운, 환자-유도된 자가조직 T 세포의 부담을 줄일 것이다. 예를 들어, 입양 세포 요법의 방법에서, 불법 고 항-종양 사멸에 대한, 면역 효과기 세포, 예컨대 T 세포의 낮은 수의 사용이 바람직할 수 있다. T 세포의 낮은 수의 사용은 CAR-변형된 T 세포 주입 외부로 발생하는 주입-관련된 독성을 최소화할 수 있다. 더욱이, 주입된 세포가 생체내 더 오래 생존하고 그렇게 함으로써 종양 재발을 예방하면 바람직할 수 있다. 이들 상황의 모두에서, 고 에너지 CAR-변형된 T 세포의 본 식별, 선택, 및 주입 방법은 유익할 것이다.
임의의 특정한 배치용 CAR-변형된 T 세포 중에서 미토콘드리아 분포 뿐만 아니라 SRC에서 이종성이 있다. 따라서, 주의하여 선택되면, 더 적은 세포가 벌크 집단과 비교된 경우 생체내 유사한 결과를 달성할 수 있다. 이는 (i) CAR이 정상 대 종양 관련된 항원 사이에서 식별할 수 없고 따라서 더 적은 세포의 주입이 바람직한, (ii) 환자-유도된 자가조직 T 세포의 증식이 최초 세포 집단에서 고유한 기형 때문에 어려운, (iii) 주입 이후 생체내 CAR-변형된 T 세포의 제한된 지속성이 요구되는 종양에 도움이 될 것이다. SRC/미토콘드리아 강도의 측정 방법은 미토-트랙커 염료 (Invitrogen) 또는 임상 적용을 위한 세포의 회수가 가능하지 않은 유사한 후-변형 방법을 이용하여 표지화 세포에 기반될 수 있다. 미토콘드리아 강도의 다른 측정 방법, 예컨대 산소 소비 또는 세포외 산성화 평가 방법은, 또한 임상 적용이 부족한, 개별적인 세포의 강도 보다는 벌크 세포의 강도를 평가한다. 본원에서 제공된 바와 같이, 비-바이러스 DNA 전기천공 방법은 동시에 CAR 발현 및 SRC 식별을 위하여 효과기 세포, 예컨대 T 세포를 변형시키도록 사용될 수 있다. 특이적으로, eT 세포를 선택하기 위해, CAR 분자와 함께 세포내 형광성 미토콘드리아-지향된 리포터 단백질의 발현은, 임상 번역에 적응된 비-바이러스 DNA 기반 유전자 전달 시스템인, 슬리핑 뷰티-매개된 전위에 의해 달성될 수 있다. 유전자 변형 및 리간드-자극된 K562-기반 공동-배양 이후 eT 세포의 유세포측정-기반 분류화는 GMP 조건하에 수행될 수 있고, 번역에 잘 받아들이고, 병상에서 쉽게 적응될 수 있다. 요약하면, 바람직한 항-종양 효능을 전달할 수 있는 대사작용으로 활성 T 세포 (eT 세포)는 T 세포를 유전자 상으로 변형시키기 위해 임상적으로 관련된 접근법을 조합시킴으로써 생성될 수 있고, 최소 활성화를 갖는 조사된 K562-기반 공동-배양을 이용하여 다수로 증식될 수 있고, 형광성 리포터 단백질의 발현에 기반하여 식별될 수 있다.
I. 정의
본원 명세서에 사용되는 바와 같이, "일" 또는 "하나"는 1개 또는 그 이상을 의미할 수 있다. "포함하는"이라는 단어와 함께 사용될 때, 본원 특허 청구의 범위에 사용된 바의 단어 "일" 또는 "하나"는 1개 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 본 개시내용이 유일한 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침하더라도, 유일한 대안을 지칭하거나 또는 대안이 상호 배타적인 것으로 달리 명확하게 표시되지 않는 한 "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "또 하나"는 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 장치의 오차의 고유 변동을 포함함을 나타내기 위해 사용되고, 방법은 그 값, 또는 연구 대상체 사이에 존재하는 변이를 측정하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 항체 또는 T-세포 수용체에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 항원은 체액성 호르몬 반응 및/또는, B 및/또는 T 림프구의 생산을 가져오는 세포 면역반응을 추가로 유도할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "항-종양 유효량"은 암 세포 또는 종양 성장을 축소시키기 위한 또는 대상체에서 종양 용적 또는 종양 세포의 수를 감소시키기 위한 CAR-발현 면역 효과기 세포의 유효량을 지칭한다. "항-종양 유효량"은 기대 수명을 증가시키기 위한 또는 종양 또는 암과 관련된 생리적 효과를 완화시키기 위한 CAR-발현 면역 효과기 세포의 유효량을 또한 지칭할 수 있다.
II. 키메라 항원 수용체 및 성분
키메라 항원 수용체 분자는 재조합 융합 단백질이고, 둘 모두 항원 (예컨대, HER1 HER3)에 결합하고 이들의 세포질 테일에 존재하는 면역수용체 활성화 모티프(ITAM's)를 통해 활성화 신호를 형질도입하는 이들의 능력에 의해 구별된다. 항원-결합 모이어티(예를 들면, 단일 쇄 항체(scFv)로부터 생성됨)를 이용하는 수용체 작제물은, 이들이 HLA-독립된 양식으로 표적 세포 표면 상에 천연의 항원에 결합한다는 점에서 "보편적"인 추가의 장점을 제공한다.
본 구현예에 따른 키메라성 항원 수용체는 본 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 제조될 수 있고, 한편 바람직하게는 이는 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조된다. 키메라 항원 수용체의 몇몇 영역을 암호화하는 핵산 서열이 준비되며, 분자 클로닝의 표준 기법(게놈 라이브러리 선별, PCR, 프라이머-보조 결찰, 효모 및 박테리아로부터의 scFv 라이브러리, 부위-지정 돌연변이생성 등)에 의해 완전한 암호화 서열 내로 조립될 수 있다. 수득한 암호화 영역은 발현 벡터에 삽입될 수 있고 적합한 발현 숙주 동종이계 또는 자가조직 면역 효과기 세포를 변형하도록 사용될 수 있다.
본원에서 기재된 CAR의 구현예는, 세포내 신호전달 도메인, 막투과성 도메인, 및 하나 이상의 신호전달 모티프를 포함한 세포외 도메인을 포함하는, 항원-특이적 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드를 암호화한 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 하나 이상의 항원 사이의 공유된 공간을 포함하는 에피토프를 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 하기를 포함한다: a) 세포내 신호전달 도메인, b) 막투과성 도메인, 및 c) 항원 결합 도메인을 포함한 세포외 도메인. 임의로, CAR은 막투과성 도메인과 항원 결합 도메인 사이에서 배치된 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 구현예의 CAR은 세포 표면에 CAR의 발현을 유도하는 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, CAR은 GM-CSF로부터 신호 펩티드를 포함할 수 있다 (참고, 예를 들면, 서열 번호: 5).
특정 구현예에서, CAR은 막-결합된 시토카인과 동시-발현되어 적은 양의 종양-관련된 항원이 존재하는 경우 지속성을 또한 증진시킬 수 있다. 예를 들면, CAR은 막-결합된 IL-15과 함께 동시-발현될 수 있다.
CAR의 도메인의 배열 및 도메인에서 사용된 특이적 서열에 따라, CAR을 발현하는 면역 효과기 세포는 표적 세포에 대하여 상이한 수준 활성을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 상이한 CAR 서열은 최대의 치료적 효능을 갖는 것으로 예상된 CAR 작제물을 식별하기 위해 형질전환 세포, 상승된 SRC로 선택된 형질전환 세포 및 활성으로 시험된 선택된 세포를 생성하도록 면역 효과기 세포에 도입될 수 있다.
A. 항원 결합 도메인
특정 구현예에서, 항원 결합 도메인은 단클론성 항체의 상보성 결정 영역, 단클론성 항체의 가변 영역, 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이러한 특이성은 수용체에 결합하는 펩티드(예를 들면, 시토카인)으로부터 기원한다. 상보성 결정 영역(CDR)는 항원을 보완하고, 따라서 그 특정 항원에 대한 이의 특이성을 갖는 수용체를 제공하는 항원 수용체(예: 면역글로불린 및 T-세포 수용체) 단백질의 가변 도메인에서 발견된 짧은 아미노산 서열이다. 항원 수용체의 각 폴리펩티드 쇄는 3개의 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 함유한다. 항원 수용체는 전형적으로 두 개의 폴리펩티드 쇄로 구성되기 때문에, 항원과 접촉될 수 있는 각 항원 수용체에 대해 6개의 CDR이 존재하고 - 각각의 중쇄 및 경쇄는 3개의 CDR을 함유한다. 면역글로불린 및 T-세포 수용체와 관련된 대부분의 서열 변이는 CDR내에서 발견되므로, 이들 영역은 때때로 초가변성 도메인으로 지칭된다. 이들 중에서, CDR3은 VJ (중쇄 및 TCR αβ 쇄의 경우 VDJ) 영역의 재조합에 의해 암호화될 때 최대 가변성을 나타낸다.
CAR 핵산, 특히 scFv 서열이 인간 환자를 위하여 세포성 면역요법을 향상시키기 위한 인간 유전자인 것이 고려된다. 특정 구현예에서, 전장 CAR cDNA 또는 암호화 영역을 포함이 제공된다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 특정한 마우스, 또는 인간 또는 인간화된 단클론성 항체로부터 유도된 단일-쇄 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편을 포함할 수 있다. 단편은 또한 항원-특이적인 항체의 어떠한 수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 보다 특이적인 구현예에서, 단편은 인간 세포내에서 발현용의 인간 코돈 용도를 위해 최적화된 서열에 의해 암호화된 항원-특이적인 scFv이다. 특정 양태에서, CAR의 VH 및 VL 도메인은 링커 서열, 예컨대 생인손 링커에 의해 분리된다 (참고, 예를 들면, 서열 번호: 20). 구현예에 따라 변형 또는 사용될 수 있는 CAR 작제물은, 본원에서 참고로 편입된, 국제 (PCT) 특허 공개 번호 WO/2015/123642에 또한 제공된다.
일부 특정 예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 HER2/Neu (Stancovski et al., 1993), ERBB2 (Moritz et al., 1994), 폴레이트 결합 단백질 (Hwu et al., 1995), 신장 세포 암종 (Weitjens et al., 1996), 및 HIV-1 외피 당단백질 gp120 및 gp41 (Roberts et al., 1994)에 대한 결합에 특이적이다. CAR에 의하여 결합될 수 있는, 기타 세포-표면 표적 항원은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: CD20, 암종배아 항원, 메소텔린, ROR1, c-Met, CD56, GD2, GD3, α태아단백질, CD23, CD30, CD123, IL-11Rα, κ 쇄, λ 쇄, CD70, CA-125, MUC-1, EGFR 및 변이체, 상피성 종양 항원 등.
키메라 항원 수용체의 특정 구현예에서, (항원 결합 영역을 포함한 세포외 도메인으로 지칭될 수 있는) 수용체의 항원-특이적 부분은 상기 본원에서 상세한 바와 같이 HER1/HER3 결합 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 예를 들어, HER1/HER3 결합 도메인은 본원에서 참고로 편입된 미국 특허 공개 번호 2012/0121596에서 제공된 서열 중 하나를 포함한다.
B. 힌지 도메인
특정 양태에서, 구현예의 CAR 폴리펩티드는 항원 결합 도메인과 막투과성 도메인 사이에서 배치된 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 힌지 도메인은 항원 결합 도메인과 세포 표면 사이에서 적절한 거리를 제공하기 위해 또는 CAR-유전자 변형된 T 세포의 효과기 기능 또는 항원 결합에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 가능한 입체 장애를 완화시키기 위해 CAR 폴리펩티드에 포함될 수 있다.
일부 경우에서 CAR 힌지 도메인은 Ig 힌지를 포함한 인간 면역글로불린 (Ig) 불변 영역 또는 이의 부분, 또는 인간 CD8 α 막투과성 도메인 및 CD8a-힌지 영역으로부터 유도될 수 있다. 일 양태에서, CAR 힌지 도메인은 항체 아이소타입 IgG4의 힌지-CH2-CH3 영역을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 점 돌연변이는 CAR-T 세포 또는 임의의 다른 CAR-변형된 세포의 글리코실화 및 비-특이적 Fc 감마 수용체 결합을 감소시키기 위해 항체 중쇄 CH2 도메인에 도입될 수 있다.
특정 양태에서, 구현예의 CAR 힌지 도메인은 Fc-수용체 결합을 감소시키는 야생형 Ig Fc 도메인에 대하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 Ig Fc 도메인을 포함한다. 예를 들어, CAR 힌지 도메인은 Fc-수용체 결합을 감소시키는 야생형 IgG4-Fc 도메인에 대하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 IgG4-Fc 도메인을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, CAR 힌지 도메인은 야생형 IgG4-Fc 서열에 대하여 L235 및/또는 N297에 상응하는 위치에서 돌연변이 (예컨대 아미노산 결실 또는 치환)을 갖는 IgG4-Fc 도메인을 포함한다. 예를 들어, CAR 힌지 도메인은 야생형 IgG4-Fc 서열에 대하여 L235E 및/또는 N297Q 돌연변이를 갖는 IgG4-Fc 도메인을 포함할 수 있다. 추가 양태에서, CAR 힌지 도메인은 친수성, 예컨대 R, H, K, D, E, S, T, N 또는 Q인 또는 "E" 예컨대 D와 유사한 특성을 갖는 아미노산에 대하여 위치 L235에서 아미노산 치환을 갖는 IgG4-Fc 도메인을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, CAR 힌지 도메인은 "Q" 예컨대 S 또는 T와 유사한 특성을 갖는 아미노산에 대하여 위치 N297에서 아미노산 치환을 갖는 IgG4-Fc 도메인을 포함할 수 있다. 추가 양태에서, CAR 힌지 도메인은 야생형 IgG4 Fc 서열에 대하여 L235 및 또는 N297에 상응하는 위치에서의 돌연변이를 포함하고, 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 10에 약 90% 동일하다.
특정 특이적 양태에서, 힌지 도메인은 하기에 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다: 서열 번호: 1 또는 서열 번호: 10의 IgG4 Fc 도메인, 서열 번호: 20의 CD8α 세포외 도메인 또는 서열 번호: 3의 합성 힌지 서열.
C. 막투과성 도메인
항원-특이적 세포외 도메인 및 세포내 신호전달-도메인은 막투과성 도메인에 의해 연결될 수 있다. 막투과성 도메인의 부분으로서 사용될 수 있는 폴리펩티드 서열은 비제한적으로 하기를 포함한다: 인간 CD4 막투과성 도메인, 인간 CD28 막투과성 도메인, 막투과성 인간 CD3ζ 도메인, 또는 시스테인 돌연변이된 인간 CD3ζ 도메인, 또는 다른 인간 막투과성 신호전달 단백질, 예를 들면, CD16 및 CD8 및 에리스로포이에틴 수용체로부터의 다른 막투과성 도메인. 일부 양태에서, 예를 들어, 막투과성 도메인은 모두 본원에서 참고로 편입된 미국 특허 공개 번호 2014/0274909 또는 미국 특허 번호 8,906,682에서 제공된 서열 중 하나를 포함한다. 특정 특이적 양태에서, 막투과성 도메인은 서열 번호: 19의 CD8 α 막투과성 도메인 또는 서열 번호: 12의 CD28 막투과성 도메인과 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다.
D. 세포내 신호전달 도메인
본 구현예의 키메라 항원 수용체의 세포내 신호전달 도메인은, 키메라 수용체를 발현하도록 가공된 면역 세포의 정상의 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화에 관여한다. 용어 "효과기 기능"은 분화된 세포의 특수화된 기능을 말한다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 시토카인의 분비를 포함하는 세포분해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 천연의, 기억, 또는 기억-형 T 세포내 효과기 기능은 항원-의존성 증식을 포함한다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 형질유도하여 세포가 특수화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 일부를 말한다. 일부 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 천연 수용체의 세포내 신호전달 도메인으로부터 유도된다. 상기 천연 수용체의 예는 T-세포 수용체의 제타 쇄 또는 이의 동족체 중 어느 것(예를 들면, 에타, 델타, 감마, 또는 엡실론), MB1 쇄, B29, Fc RIII, Fc RI, 및 신호전달 분자의 조합, 예를 들면, CD3ζ 및 CD28, CD27, 4-1BB, DAP-10, OX40, 및 이의 조합, 및 또한 다른 유사한 분자 및 단편을 포함한다. 활성화 단백질 패밀리의 다른 구성원의 세포내 신호전달 부분, 예를 들면, FcγRIII 및 FcεRI이 사용될 수 있다. 참고: Gross et al. (1992), Stancovski et al. (1993), Moritz et al. (1994), Hwu et al. (1995), Weijtens et al. (1996), 및 Hekele et al. (1996) (이들 대안적인 막투과성 및 세포내 도메인을 이용하여 T-세포 수용체의 개시내용에 대한 것임). 일반적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 것이지만, 많은 경우에 이는 전체 세포내 폴리펩티드를 사용하는데 필수적이지 않을 것이다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부위가 용도를 찾을 수 있을 정도까지, 이러한 절단된 부위가 효과기 기능 신호를 여전히 형질유도하는 한, 이를 완전한 쇄 대신에 사용할 수 있다. 따라서, 용어 세포내 신호전달 도메인은 표적에 결합하는 CAR 상에서, 효과기 기능 신호를 형질유도하는데 충분한 세포내 신호전달 도메인의 어떠한 절단된 부위도 포함함을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 인간 CD3ζ 세포내 도메인은 구현예의 CAR용 세포내 신호전달 도메인으로서 사용된다.
구체적인 구현예에서, CAR내 세포내 수용체 신호전달 도메인은 T 세포 항원 수용체 착물의 것, 예를 들면, CD3의 ζ 쇄, 또한 Fcγ RIII 공자극 신호전달 도메인, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2을 단독으로 또는 예를 들면, CD3ζ와 병행하여 포함한다. 구체적인 구현예에서, 세포내 도메인(이는 세포질성 도메인으로서 지칭될 수 있다)는 하나 이상의 TCR ζ 쇄, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL-2Rβ/CD122, IL-2Rα/CD132, DAP10, DAP12, 및 CD40 중 일부 또는 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인내 내인성 T 세포 수용체 착물 중 어느 부분을 사용한다. 하나 또는 다수의 세포질성 도메인을 사용할 수 있으며, 소위 제3 세대 CAR은 예를 들면, 부가 또는 상승 효과와 함께 융합된 적어도 2개 또는 3개의 신호전달 도메인을 갖는다.
일부 구현예에서, CAR은 추가의 다른 공자극 도메인을 포함한다. 다른 공자극성 도메인은 CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, 및 4-1BB (CD137) 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. CD3ζ 에 의해 개시되는 1차 신호에 추가적으로, 인간 CAR 내에 삽입되는 인간 공자극 수용체에 의해 제공되는 추가적인 신호는 T 세포의 전체 활성화에 중요하며, 양자 면역요법의 생체내 지속 및 치료적 성공을 개선시킬 수 있었다.
특정 특이적 양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 하기에 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다: 서열 번호: 13의 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인, 서열 번호: 17의 CD28 세포내 도메인, 또는 서열 번호: 15의 CD137 세포내 도메인.
III. 벡터 및 세포 가공
특정한 구현예에서, 이식유전자를 암호화하는 단리된 핵산 분절 및 발현 카세트 편입 DNA 서열이 제공된다. 예를 들어, 이식유전자는 CAR 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 추가 양태에서, 이식유전자는 표적 항원 (또는 이의 에피토프) 및/또는 HLA 폴리펩티드를 암호화한다. 추가 양태에서, 이식유전자는 미토콘드리아 리포터 이식유전자를 암호화하고, 그와 같은 리포터 폴리펩티드 (예를 들면, 형광성 리포터)는 미토콘드리아 국지화 신호를 포함한다.
당해 분야의 숙련가에 의해 인정될 바와 같이, 일부 사례에서, 암호화된 이식유전자의 마지막에 몇몇의 아미노산용 암호화 서열이 결실될 수 있다. 예를 들어, CAR을 암호화한 이식유전자의 경우에서, CAR내 항원 결합 도메인의 몇몇 아미노산용 암호화 서열은 분자, 예를 들어, 일반적으로 10 이하, 더욱 일반적으로 5 이하 잔기의 특이성 또는 효과기 결합 친화도 영향 없이 결실될 수 있다. 또한, 이식유전자 암호화 서열의 경계에서 아미노산의 작은 수, 일반적으로 10 이하, 더욱 일반적으로 5 이하 잔기를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 아미노산의 결실 또는 삽입은 편리한 제한 부위, 가공의 용이함, 발현 수준의 개선 등을 제공하는 구성의 필요의 결과일 수 있다. 또한, 상이한 아미노산으로 하나 이상의 아미노산의 치환은, 일반적으로 이식유전자 암호화 서열에서 (예를 들면, CAR의 임의의 도메인에서) 약 5 초과 아미노산을 치환하지 않는, 유사한 이유로 발생할 수 있다.
구현예에 따른 형질전환 작제물은 종래의 방식으로 제조될 수 있다. 대부분에 대해 천연 서열이 사용될 수 있기 때문에, 적절하다면 다양한 성분을 적절하게 결합시키기 위해 천연 유전자는 단리 및 가공될 수 있다. 예를 들어, CAR의 경우에서, 키메라 항원 수용체의 N-말단 및 C-말단 단백질 성분용 핵산 서열 암호화는, 유전자의 원하지 않는 일부의 결실을 초래하는 적절한 프라이머를 이용하여, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용함으로써 단리될 수 있다. 대안적으로, 클로닝된 유전자의 제한 소화는 키메라 작제물을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 두 경우 중 하나에서, 평활말단(blunt-ended)이거나 또는 상보적 중복을 갖는 제한 부위를 제공하도록 서열이 선택될 수 있다.
형질전환 작제물의 제조를 위한 다양한 조종은 시험관내 수행될 수 있고 특정한 구현예에서 키메라성 작제물은 표준 형질전환 또는 형질감염 방법을 이용한 적절한 숙주에서 클로닝 및 발현용 벡터에 도입된다. 따라서, 각 조종 이후, DNA 서열의 연합으로부터 수득한 작제물은 클로닝되고, 벡터는 단리되고, 그리고 서열이 원하는 이식유전자 (예를 들면, 키메라 항원 수용체) 및 발현 조절 서열을 암호화하는 것을 식별하기 위해 서열은 스크리닝된다. 서열은 제한 분석, 서열분석 등에 의해 선별될 수 있다.
구현예의 벡터는, 조절된 진핵 프로모터의 조절하에, 주로, 면역 세포, 바람직하게는 면역 효과기 세포 (예를 들면, T 세포) 또는 APC에 원하는 유전자를 전달하도록 설계되었다. 구현예에 따라 사용될 수 있는 프로모터는, 예를 들어, MNDU3 프로모터, CMV 프로모터, EF1α 프로모터, 또는 유비퀴틴 프로모터를 포함한다. 또한, 벡터는 다른 이유가 없는 경우, 선택가능한 마커를 함유함으로써 시험관내에서 이들의 가공을 촉진할 수 있다. 다른 구현예에서, 이식유전자 (예컨대, CAR)은 DNA 주형으로부터 시험관내에서 전사된 mRNA로부터 발현될 수 있다.
구현예에 따라 이용된 예시적인 핵산 작제물 (폴리뉴클레오티드)에서, 프로모터는 구현예의 이식유전자를 암호화한 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다, 즉, 이들은 이식유전자를 암호화한 DNA로부터 메신저 RNA의 전사를 촉진시키기 위해 배치된다. 프로모터는 게놈 유래이거나 또는 합성적으로 생성될 수 있다. T 세포에서 사용하기 위한 다양한 프로모터(예를 들어, 하기에 기술된 바와 같은 CD4 프로모터)는 당업계에 잘 공지되어 있다: Marodon et al. (2003)). 프로모터는, 유도가, 예를 들어 특이적 세포 유형 또는 특이적 수준의 성숙과 관련될 때, 구성적 또는 유도성일 수 있다. 대안적으로, 다수의 잘 공지된 바이러스 프로모터가 또한 적합하다. 관심 대상의 프로모터는 β-액틴 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 및 프렌드 비장 병소 형성 바이러스 프로모터를 포함한다. 프로모터는 인핸서와 관련될 수도 있고 또는 관련되지 않을 수도 있되, 인핸서는 특정 프로모터와 자연적으로 관련될 수도 있고 또는 상이한 프로모터와 관련될 수도 있다.
이식유전자를 암호화한 열린 판독 프레임의 서열은 게놈 DNA 공급원, cDNA 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 또는 (예를 들면, PCR을 통해) 합성될 수 있거나, 또는 이들의 조합일 수 있다. 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 수에 따라, 인트론이 mRNA를 안정화시키거나 또는 T 세포-특이적 발현을 제공하는 것이 발견됨에 따라 cDNA 또는 이들의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다 (Barthel and Goldfeld, 2003). 또한, mRNA를 안정화시키기 위해 내인성 또는 외인성 비-암호화 영역을 사용하는 것이 더 유리할 수 있다.
구현예의 이식유전자의 발현을 위하여, 핵산 서열 암호화 이식유전자의 자연 발생 또는 내인성 전사 개시 영역은 표적 숙주에서 키메라 항원 수용체를 생성하도록 사용될 수 있다. 대안적으로, 구성적 또는 유도성 발현 (예를 들면, 테트-온(tet-on) 또는 테트-오프(tet-off) 프로모터 시스템)을 허용하는 외인성 전사 개시 영역이 사용될 수 있고, 여기서 발현은 표적 숙주, 원하는 발현의 수준, 표적 숙주의 성질 등등에 따라 조절될 수 있다.
마찬가지로, 일부 경우에서, 세포 표면에 이식유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드를 유도하는 신호 서열은 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 신호 서열은 이식유전자의 천연 버전에 존재하는 신호 서열이다. 임의로, 일부 예에서, 이 서열을 상이한 신호 서열로 교환하는 것이 바람직할 수 있다. 하지만, 선택된 신호 서열은 이식유전자 (예를 들면, T 세포)의 발현에 사용된 세포의 분비성 경로와 양립가능할 수 있어서 이로써 이식유전자는 세포의 표면에서 존재한다.
유사하게, 종료 영역은 이식유전자의 천연 버전용 자연 발생 또는 내인성 전사 종료 영역에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로, 종결 영역은 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 대부분에 대해, 종결 영역의 공급원은 일반적으로 재조합 단백질의 발현에 중요한 것으로 고려되지 않으며, 매우 다양한 종결 영역이 발현에 유해하게 영향을 미치는 일 없이 사용될 수 있다.
이식유전자 작제물, 예컨대 CAR 발현 작제물이 노출된 DNA로서 또는 적합한 벡터에서 대상체의 자체 세포에 (또는 상이한 공여체 대상체로부터 세포에) 도입될 수 있음이 고려된다. 노출된 DNA를 사용하는 전기천공에 의해 세포, 예컨대 T 세포를 적합하게 형질감염시키는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어 다음을 참조: 미국 특허 번호 6,410,319 (본원에 참고로 인용됨). 네이키드 DNA는 일반적으로 발현에 적절한 배향으로 플라스미드 발현 벡터에 함유된 본 구현예의 이식유전자(예컨대, 키메라 항원 수용체)를 암호화하는 DNA를 의미한다. 유리하게는, 네이키드 DNA의 사용은 본 구현예의 이식유전자를 발현하는 세포를 생산하는데 요구되는 시간을 감소시킬 수 있다.
추가 양태에서, 이식유전자 작제물은 세포의 게놈 DNA에 이식유전자 (예를 들면, CAR) 작제물의 통합을 매개하기 위해 트랜스포손-기반 시스템을 이용하여 세포에 도입될 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 세포에 (i) 트랜스포사제 (또는 트랜스포사제 폴리펩티드)를 암호화한 제1 벡터 및 (ii) 트랜스포손 반복부에 의해 측접되는 원하는 이식유전자 발현 요소를 암호화한 제2 벡터의 도입을 포함할 것이다. 트랜스포손 또는 트랜스포손성 요소는 이의 말단 반복 서열 업스트림 및 다운스트림을 갖는 (짧은) 핵산 서열을 포함하고 표적 DNA 서열에 핵산의 절개 및 삽입을 용이하게 하는 효소를 암호화한다. 몇 개의 트랜스포손/트랜스포사제 시스템은, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) (SB), 다양한 척추동물 배양된 세포주, 배아 줄기 세포 및 생체내에서 전위적 활성을 나타내는 생식선으로부터 Tc1/마리너-유사 요소를 포함한, 이종성 DNA 서열의 유전적 삽입에 적응되었다 (Ivics et al., 1997). 추가 트랜스포사제 및 트랜스포손 시스템은 하기에 제공된다: 미국 특허 번호 6,489,458; 7,148,203; 8,227,432; 미국 특허 공보 번호 2011/0117072; Mates et al., 2009 및 Ivics et al., 1997 (이의 각 내용은 그 전체가 본원에 참고로 인용됨).
또는, 바이러스 벡터(예: 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)는 이식유전자를 세포에 도입하기 위해 사용될 수 있다. 본 구현예의 방법에 따라 사용하기에 적합한 벡터는 대상체의 T 세포 내에서 복제하지 않는다. 바이러스를 기반으로 하는 다수의 벡터가 공지되어 있으며, 여기서 세포 내에 유지된 바이러스의 카피 수는 세포의 생존능을 유지하기에 충분히 낮다. 예시적인 벡터는 본원에 개재된 pFB-neo 벡터(STRATAGENE?) 및 HIV, SV40, EBV, HSV, 또는 BPV계 벡터를 포함한다.
IV. 면역 효과기 세포
특정 양태에서, 본원에 기재된 구현예는 T 세포를 CAR을 암호화하는 DNA (또는 RNA) 작제물을 함유하는 발현 벡터로 형질감염시킨 다음, 임의로, 세포를 공급(feeder) 세포, 재조합 항원 또는 세포 증식을 일으키는 수용체에 대한 항체로 자극함을 포함하는 항원-특이적 전향 면역 효과기 세포 (예컨대, T-세포, NK-세포 또는 NK T-세포)를 제조하고/하거나 확대시키는 방법을 포함한다. 특정 양태에서, CAR을 발현하기 위해 가공된 세포 (또는 세포 집단)은 줄기 세포, iPS 세포, 면역 세포 또는 이들 세포의 전구체이다. 아래 기재된 방법은 CAR 발현용 T-세포 (또는 다른 면역 세포) 가공의 특이적 예를 다룬다.
면역 효과기 세포의 공급원은 모두 동종이계 및 자가조직 공급원을 포함한다. 일부 경우에서 면역 효과기 세포는 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 분화될 수 있다. 따라서, 구현예에 따른 가공용 세포는 제대혈, 말초 혈액, 인간 배아 줄기 세포, 또는 iPSC로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 동종이계 T 세포는 키메라 항원 수용체를 포함하도록 (및 임의로, 기능성 TCR이 결핍되도록) 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 인간 효과기 세포는 1차 인간 T 세포, 예를 들면, 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC), G-CSF로 자극 후 수집된 PBMC, 골수 또는 제대혈로부터 유래된 T 세포이다. (예를 들면, CAR 발현 작제물로) 형질감염 또는 형질도입 이후, 세포는 즉시 주입될 수 있거나 또는 보관될 수 있다. 특정 양태에서, 형질감염 후, 세포는 세포로 유전자 전송 후 약 1, 2, 3, 4, 5일 이상 이내에 벌크 집단으로서 수일, 수주 또는 수 개월 동안 생체외 증식될 수 있다. 추가의 양태에서, 형질감염 후, 형질감염체는 클로닝되고, 클론은 단일 통합되거나 에피솜 유지된발현 카세트 또는 플라스미드의 존재를 입증하고, 키메라 항원 수용체의 발현은 생체외 확대된다. 확대용으로 선택된 클론은 항원-발현 표적 세포를 특이적으로 인식하고 용해시키는 능력을 입증한다. 재조합 T 세포는 IL-2, 또는 통상적인 감마-쇄에 결합하는 다른 시토카인에 의한 자극으로 확대될 수 있다(예: IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, 및 기타). 재조합 T 세포는 인공 항원 제시 세포에 의한 자극으로 확대될 수 있다. 재조합 T 세포는 인공 항원 제시 세포 상에서 또는 T 세포 표면 상에서 CD3를 교차 연결하는 OKT3과 같은 항체로 확대될 수 있다. 재조합 T 세포의 서브세트는 인공 항원 제시 세포 상에서 또는 T 세포 표면 상에서 CD52에 결합하는 Campath와 같은 항체로 확대될 수 있다. 추가의 양태에서, 유전적으로 변형된 세포는 동결보존될 수 있다.
추가 양태에서, 구현예의 면역 효과기 세포는 높은 미토콘드리아 예비 호흡 용량 (SRC)으로 선택되었다. 본원에서 사용된 바와 같이 "높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 면역 효과기 세포"는 상응하는 평균 면역 효과기 세포 (예를 들면, T-세포)보다 더 높은 미토콘드리아 활성 또는 미토콘드리아 수를 갖는 면역 효과기 세포 (예를 들면, T-세포)를 지칭한다. 따라서, 일부 양태에서, 구현예의 세포 조성물은 높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 면역 효과기 세포의 집단, 예를 들어 높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 CAR-발현 T-세포의 집단을 포함한다.
높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 면역 효과기 세포, 예컨대 CD8+ T 세포는 스트레스 상태 동안 더 낮은 SRC, 예컨대 높은 종양 부하, 저산소증, 당분해용 영양소의 부족, 또는 억제성 시토카인 환경을 갖는 세포에 대하여 향상된 생존을 나타낼 수 있다. 또한, 높은 미토콘드리아 SRC로 선택된 면역 효과기 세포는 심지어 스트레스 상태하에 세포독성 활성을 보유할 수 있다. 따라서, 높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 면역 효과기 세포를 선택함으로써 모든 요법을 위한 및 CAR 작제물의 시험을 위한 개선된 세포 조성물이 생산될 수 있다.
일 양태에서, 형질전환 면역 효과기 세포는 제공되고 이는 형질전환 효과기 세포의 미토콘드리아 SRC를 측정하도록 사용될 수 있는 리포터를 포함한다. 예를 들어, 형질전환 세포는 미토콘드리아 국지화 신호에 연결되는 리포터 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 리포터는 형광성 폴리펩티드 예컨대 향상된 황색 형광 단백질 (YFP) 또는 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)일 수 있고 미토콘드리아 국지화 신호는 글루타레독신 (Grx2)으로부터 선택될 수 있다. 상기 맥락에서 형광 리포터는 높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 CAR+ T 세포를 식별한다. 예를 들어, 리포터를 발현하는 형질전환 세포는 세기 형광에 기반하여 분류될 수 있고 생체내 종양 사멸을 위하여 주입될 수 있다. 마찬가지로, 형질전환 세포는, 예를 들어, 후보자 CAR 폴리펩티드의 치료적 유효성을 측정하기 위해 표적 세포의 생체외 사멸에 대하여 시험될 수 있다.
일부 양태에서, 구현예에 따라 사용을 위한 미토콘드리아 리포터 유전자는 내인성 유전자일 수 있다. 추가 양태에서, 미토콘드리아 리포터 유전자는 외인성 유전자, 예컨대 형광성 리포터 단백질을 암호화한 유전자일 수 있다. 일부 양태에서, 형광성 리포터 단백질은 미토콘드리아 국지화 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 높은 SRC를 갖는 면역 효과기 세포의 선택 방법은 유세포측정 또는 FACS를 포함할 수 있다.
특정 양태에서, SRC를 갖는 면역 효과기 세포 식별을 위한 리포터 유전자의 발현은 핵 프로모터 (예를 들면, hEF1a)의 관리 하일 수 있다. 특정 양태에서, 리포터 유전자의 발현은 미토콘드리아 프로모터의 관리 하일 수 있다. 특정 양태에서, 발현된 리포터 단백질은 미토콘드리아 국지화 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 발현된 리포터 단백질은 세포 표면에 관련될 수 있다. 특정 양태에서, 리포터 유전자의 발현은 미토콘드리아 프로모터의 관리 하일 수 있고 발현된 리포터 단백질은 세포 표면에 관련될 수 있다. 일부 양태에서, 외인성 리포터 유전자는 트랜스포손 반복부 또는 바이러스 LTR에 의해 측접될 수 있다. 일부 양태에서, 외인성 리포터 유전자는 염색체외 핵산, 예컨대 mRNA 또는 에피솜 벡터에서 포함될 수 있다.
V. 면역 효과기 세포의 전파 방법
일부 경우에서, 구현예의 면역 효과기 세포 (예를 들면, T-세포)는 세포 증식에 도움을 주기 위해 활성화 및 전파 세포 (AaPC)로 공동-배양된다. 예를 들어, 항원 제시 세포 (APC)는 구현예의 치료적 조성물 및 세포 요법 생성물의 제조에서 유용하다. 항원 제시 시스템의 제조 및 용도에 관한 일반적인 안내사항에 대해, 하기를 참고한다: 예컨대, 미국 특허 번호 6,225,042, 6,355,479, 6,362,001 및 6,790,662; 미국 특허 출원 공보 번호 2009 0017000 및 2009 0004142; 및 국제 공보 번호 WO2007 103009 (이의 각각은 참고로 편입됨).
일부 경우에서, AaPC는 추가의 가공 없이 MHC 분자에 대해 펩티드를 직접적으로 결합시킬 수 있는 최적의 길이의 펩티드와 함께 배양된다. 대안적으로, 세포는 (즉, MHC-독립적인 항원 인식의 경우) 관심대상의 항원을 발현시킬 수 있다. 더욱이, 일부 경우에서, APC는 일반적으로 특이적 CAR 폴리펩티드 또는 CAR 폴리펩티드에 결합하는 항체 (예를 들면, 범용 활성화 및 전파 세포 (uAPC)를 발현시킬 수 있다. 상기 방법은 본원에서 참고로 편입된 국제 (PCT) 특허 공개 번호 WO/2014/190273에서 개시된다. 관심대상의 펩티드-MHC 분자 또는 항원 이외, AaPC 시스템은 또한 적어도 1종의 외인성 보조 분자를 포함할 수 있다. 보조 분자의 임의의 적합한 수 및 조합이 사용될 수 있다. 보조 분자는 공자극 분자 및 접착 분자와 같은 보조 분자로부터 선택될 수 있다. 예시적인 공자극 분자는 CD70 및 B7.1 (B7.1는 B7로서 선행하여 공지되어 있고 또한 CD80으로서 공지되어 있음)을 포함하고, 이는 무엇보다도, T 세포의 표면 상에서 CD28 및/또는 CTLA-4 분자를 결합시켜, 이에 의해 예들 들면, T-세포 팽창, Th1 분화, 단기 T-세포 생존, 및 시토카인 분비 예컨대 인터류킨 (IL)-2에 영향을 준다 (문헌 [Kim et al., 2004)]을 참조한다). 접착 분자는, 예를 들면, 세포-대-세포 또는 세포-대-매트릭스 접촉을 촉진하는 셀렉틴과 같은 탄수화물 결합 당단백질, 인테그린과 같은 막관통 결합 당단백질, 캐드헤린과 같은 칼슘 의존성 단백질, 및 단일-통과 막관통 면역글로불린 (Ig) 상과 단백질, 예를 들면, 세포내 접착 분자 (ICAM)를 포함할 수 있다. 예시적인 접착 분자는 LFA-3 및 ICAM, 예를 들면, ICAM-1을 포함한다. 공자극 분자 및 접착 분자를 포함하는 예시적 보조 분자의 선택, 클로닝, 제조 및 발현에 유용한기술, 방법 및 시약은 다음에 예시되어 있다: 예를 들면, U.S. 특허 번호 6,225,042, 6,355,479, 및 6,362,001(본원에 참고로 인용됨).
AaPC로 되도록 선택된 세포는 바람직하게는 세포내 항원-처리, 세포내 펩티드 수송, 및/또는 세포내 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자-펩티드 부하에 있어 결핍을 갖거나, 변온성(즉, 포유동물 세포주보다 온도 도전에 덜 민감함)이거나, 또는 결핍 및 변온 특성 둘 다를 포함한다. 바람직하게는, AaPC로 되도록 선택된 세포는 또한 세포에 도입된 분자 성분을 보조하는, 외인성MHC 부류 I 또는 부류 II 분자에 대한 적어도 하나의 내인성 대응물 (예: 상기한 바와 같은 내인성 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자 및/또는 내인성 보조 분자)을 발현하는 능력이 부족하다. 또한, AaPC는 바람직하게 AaPC를 생성하기 위해 이들의 변형 전에 세포에 의해 포함된 결핍 및 변온 특성을 유지시킨다. 예시적인 AaPC는 항원 처리와 관련된 수송체(TAP)-결핍 세포주, 예를 들면, 곤충 세포주를 구성하거나 이로부터 유도된다. 예시적인 변온 곤충 세포주는 드로소필라 세포주, 예컨대 슈나이더 2 세포주이다 (참고, 예를 들면, Schneider 1972) 슈나이더 2 세포의 제조, 성장, 및 배양은 하기에 제공된다: 미국 특허 번호 6,225,042, 6,355,479 및 6,362,001.
일 구현예에서, AaPC는 또한 동결-해동 주기에 적용시킨다. 예시적인 동결-해동 주기에서, AaPC는 AaPC를 함유하는 적합한 용기를 적절한 양의 액체 질소, 고체 이산화탄소(즉, 드라이 아이스), 또는 유사한 저-온 물질과 접촉시켜 동결시킴으로써, 동결이 신속하게 일어나도록 할 수 있다. 이어서, 동결된 APC는 저온 재료로부터 AaPC의 제거 및 주위 실온 상태에의 노출에 의해 또는 미지근한 수욕 또는 따뜻한 손이 짧은 해동 시간을 촉진하기 위해 사용되는 촉진된 해동 공정에 의해 해동시킨다. 추가로, AaPC는 동결시키고 해동 전 연장된 시간 동안 저장할 수 있다. 동결된 AaPC는 또한 해동시킨 다음, 추가로 사용하기 전에 동결 건조시킬 수 있다. 바람직하게는, 동결-해동 과정에 치명적으로 영향을 미칠 수 있는 방부제, 예를 들면, 디메틸설폭사이드(DMSO), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 다른 방부제를 동결-해동 주기를 겪는 AaPC를 함유하는 매질로부터 제거하거나, AaPC를 이러한 방부제가 필수적으로 제거된 매질로 이전시킴으로써 필수적으로 제거한다.
추가 구현예에서, 이종 핵산 및 AaPC에 내인성인 핵산은 본질적으로 비활성화 후 핵산의 어떠한세포 성장, 복제 또는 발현이 발생되지 않도록 가교결합에 의해 비활성화될 수 있다. 일 구현예에서, AaPC는 외인성 MHC 및 보조 분자의 발현, AaPC의 표면 상에서의 이러한 분자의 제시, 및 선택된 펩티드 또는 펩티드들과 발현된 MHC 분자의 로딩에 대해 후속적인 시점에서 비활성화된다. 따라서, 이러한 비활성화되고 선택된 펩티드 로딩된 AaPC는, 필수적으로 증식 또는 복제할 수 없도록 하면서, 선택된 펩티드 제시 기능을 보유한다. 바람직하게는, 가교결합은 또한 AaPC의 항원-제시 세포 기능을 실질적으로 감소시키지 않으면서, 오염시키는 미생물, 예를 들면, 세균 및 바이러스가 필수적으로 들어있지 않은 AaPC를 수득한다. 따라서, 가교결합은 중요한 AaPC 기능을 유지하면서 AaPC를 사용하여 개발된 세포 치료요법 생성물의 안전성에 대한 관심을 완화시키는데 도움을 준다. 가교결합 및 AaPC에 관련된 방법에 대해, 예를 들면, 다음을 참조한다: U.S. 특허 출원 공보 제 20090017000호, 이는 본원에 참조로 인용된다.
특정 경우에서, CAR 변형된 세포는 치료제로서 사용에 앞서 FACS를 이용한 형광성 리포터 단백질을 사용함으로써 그의 미토콘드리아 강도 (또는 세포의 총 미토콘드리아 함량)에 기반하여 분류될 수 있다.
VI. 가공 항원 제시 세포
특정 구현예에서 가공된 항원 제시 세포 (APC)가 추가로 제공된다. 상기 세포는, 예를 들어, 상기에서 기재된 바와 같이, 생체외 면역 효과기 세포를 전파시키도록 사용될 수 있다. 추가 양태에서, 가공된 ACP는, 환자에 자체 투여될 수 있고 그렇게 함으로써 생체내 면역 효과기 세포의 증식을 자극시킨다. 구현예의 가공된 APC는 치료적 제제로서, 자체, 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 가공된 APC는 표적 항원에 특이적인 내인성 면역 효과기 세포의 활성화를 자극시킬 수 있는 및/또는 표적 항원에 특이적인 입양으로 전달된 면역 효과기 세포의 활성 또는 지속성을 증가시키기 위한 치료적 제제로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "가공된 APC"는 인간 백혈구 항원 (HLA)을 암호화한 적어도 제1 이식유전자를 포함하는 세포(들)을 지칭한다. 상기 가공된 APC는 항원의 발현용 제2 이식유전자를 추가로 포함할 수 있고, 이로써 항원은 HLA와 착물에서 APC의 표면에서 제시된다. 일부 양태에서, 가공된 APC는 항원 (예를 들면, 수지상 세포)을 제시한 세포 유형일 수 있다. 추가 양태에서, 가공된 APC는 항원, 그와 같은 T-세포 또는 T-세포 전구체 ("T-APC"로 칭함)를 정상적으로 제시하지 않는 세포 유형으로부터 생산될 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 구현예의 가공된 APC는 표적 항원을 암호화한 제1 이식유전자 및 HLA를 암호화한 제2 이식유전자를 포함하고, 이로써 HLA는 표적 항원의 에피토프와 착물로 가공된 APC의 표면에서 발현된다. 특정 특이적 양태에서, 가공된 APC에서 발현된 HLA는 HLA-A, HLa-b, HLA-C 또는 HLA-DRB1이다. 추가 양태에서, 가공된 APC에서 발현된 HLA는 HLA-A2이다.
일부 양태에서, 구현예의 가공된 APC는 공자극 분자를 암호화한 적어도 제3 이식유전자를 추가로 포함할 수 있다. 공자극 분자는 막-결합된 Cγ 시토카인일 수 있는 공자극 시토카인일 수 있다. 특정 양태에서, 공자극 시토카인은 IL-15, 예컨대 막-결합된 IL-15이다. 일부 추가 양태에서, 가공된 APC는 편집된 (또는 결실된) 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 억제 유전자, 예컨대 PD-1, LIM-3, CTLA-4 또는 TCR은 유전자의 발현을 감소 또는 제거하도록 편집될 수 있다.
구현예의 가공된 APC는 관심 임의의 표적 항원을 암호화한 이식유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 항원은 감염성 질환 항원 또는 종양-관련된 항원 (TAA)일 수 있다. 표적 항원은 세포내 또는 세포 표면 항원일 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 표적 항원은 TAA 예컨대 종양 세포의 세포하 구획으로부터 유도된 TAA이다. TAA는 막-결합, 세포질성, 핵-국지화, 또는 심지어 종양 세포에 의해 분비될 수 있다. 일부 양태에서, TAA는 상응하는 정상 조직에 비교하여 차별적으로 발현되고 그렇게 함으로써 면역 효과기 세포에 의해 종양 세포의 우선적인 인식을 허용한다. 표적 항원의 특이적 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: WT1, MUC1, LMP2, HPV E6 E7, EGFRvIII, HER-2/neu, 유전형, MAGE A3, p53 비돌연변이체, NY-ESO-1, PSMA, GD2, CEA, MelanA/MART1, Ras 돌연변이체, gp100, p53 돌연변이체, 프로테이나제3 (PR1), bcr-abl, 티로시나제, 서바이빈, PSA, hTERT, 육종 전좌 중단점, EphA2, PAP, ML-IAP, AFP, EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알산, MCN, RhoC, TRP-2, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔린, PSCA, MAGE A1, sLe(a), CYP1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, 탄산탈수소효소 IX, PAX5, OT-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구마인, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FAP, PDGFR-β, MAD-CT-2, 및 Fos-관련된 항원 1.
일부 특이적 양태에서, 구현예의 가공된 APC는 항원 제시 세포 ("T-APC"로 칭함)로서 기능하도록 가공된 T 세포이다. 특히, 구현예의 T-APC는 표적 항원을 암호화한 제1 이식유전자 및 HLA를 암호화한 제2 이식유전자를 포함한다. 따라서, T-APC는 암호화된 항원, 예컨대 TAA를 제시할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 예시된 T-APC는 NY -ES0-1 항원 및 HLA-A2를 암호화한 이식유전자를 포함한다. 따라서, 이들 세포는 (환자에 투여된 이후) 생체외 또는 생체내 NY-ESO-1-특이적 면역 효과기 세포를 전파시키도록 사용될 수 있다. 또한, 본원에서 예시된 T-APC는 추가의 공자극 분자, 특이적으로 막-결합된 IL-15 (miL-15)를 발현하도록 추가로 가공되었다. 추가의 공자극 분자는 표적 항원 특이적 면역 효과기 세포의 생성을 추가로 개선시키고 이들 세포의 지속성을 증가시킨다.
VII. 치료적 적용
일부 양태에서, 구현예의 키메라 항원 수용체 작제물 및 세포는 종양의 크기 감소 또는 이들 대상체에서 종양의 성장 또는 재-성장 예방에 의해 암을 갖거나 이를 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 적용을 찾는다. 따라서, 본원에서 제공된 구현예는 추가로 본 구현예의 키메라 항원 수용체 작제물의 대상체의 단리된 T 세포에 도입 및 대상체에 전환 T 세포의 재도입에 의해 대상체에서 성장 감소 또는 종양 형성 예방 방법에 관한 것이고, 그렇게 함으로써 대상체에서 종양을 감소 또는 제거하기 위해 항-종양 반응에 영향을 미친다. 사용될 수 있는 적합한 T 세포는 세포독성 림프구(CTL) 또는 붕괴가 필요한 T 세포 수용체를 갖는 임의의 세포를 포함한다. 당업자에게 잘 공지되어 있는 바와 같이, 대상체로부터 이들 세포를 단리시키기 위한 다양한 방법을 용이하게 이용가능하다. 예를 들어, 세포 표면 마커 발현을 이용하거나 또는 상업적으로 입수가능한 키트(예를 들어, Pierce, Rockford, Ill.에 소재한 피어스사(Pierce)로부터의 아이소셀(ISOCELL)™)를 이용함.
형질감염되거나 형질도입된 면역 효과기 세포 (예컨대, T 세포)가 목적 조절을 갖고, 그리고 목적 수준에서의 표면 막 단백질로서의 키메라 항원 수용체를 발현하는 것으로 확립되면, 키메라 항원 수용체가 숙주 세포내에서 작용성이어서 목적한 신호 유도를 제공할 수 있는지 여부가 결정될 수 있다. 후속적으로, 형질도입된 면역 효과기 세포를 대상체에게 재도입시키거나 투여하여 대상체 내에서 항-종양반응을 활성화시킨다. 투여를 촉진하기 위하여, 본 구현예에 따른 형질도입된 T 세포를 또한 약제학적으로 허용될 수 있는, 적절한 담체와 함께 약제학적 조성물로 제조하거나 생체내에서 투여하기에 적절한 인플란트(implant)로 제조할 수 있다. 이러한 조성물 또는 이식물의 제조 수단은 당업계에 기재되었다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack, ed. (1980)] 참조). 경우에 따라, 형질도입된 T 세포를 반고체 또는 액체형의 제제, 예를 들면, 캅셀제, 액제, 주사제, 흡입제, 또는 에어로졸로 이들 각각의 투여 경로를 위한 일반적인 방법으로 제형화할 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 수단은 표적 조직 또는 기관에 도달할 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 방지하거나 최소화하기 위해 또는 조성물의 시간 제한 방출을 보장하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포를 무효화시키지 않는 약제학적으로 허용되는 형태를 사용한다. 따라서, 바람직하게는 절단된 T 세포를 균형을 이룬 염 용액, 바람직하게는 행크스 균형을 이룬 염 용액(Hanks' balanced salt solution), 또는 정상의 염수로 제조할 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 구현예의 CAR 발현 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들면, 암 또는 감염을 앓는 개체에 전달된다. 이어서, 세포는 각각의 암 또는 병원체 감염된 세포를 공격하도록 개체의 면역계를 향상시킨다. 일부 경우에, 개체는 항원-특이적 CAR 세포의 1회 이상의 용량이 제공된다. 개체에 항원-특이적 CAR 세포의 2회 이상의 용량이 제공되는 경우, 투여 사이의 지속 기간은 개체에서 전파를 위한 시간을 허용하기에 충분해야 하고, 특정 구현예에서, 투여 사이의 지속 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상이다. 치료 효과를 윈한 적합한 용량은, 예를 들면, 바람직하게는 일련의 투여 주기로 용량당 적어도 105 또는 약 105 내지 약 1010 세포일 것이다. 예시적인 투여 섭생은 0일째에 적어도 약 105 세포에서 시작하여, 예를 들면, 환자내 용량 점증 방식 개시의 수주 이내에 약 1010 세포의 표적 용량까지 점증적으로 증가시키는 점증 용량의 4개의 1주 투여 주기로 이루어진다. 적합한 투여 방식은 정맥내, 피하, 강내(예를 들면, 저장소-접근 장치에 의해), 복강내, 및 종양 괴상에 직접 주사를 포함한다
구현예의 약제학적 조성물(예컨대, CAR 발현 T 세포 포함)은 단독으로 또는 암을 치료하는데 유용한 다른 충분히 확립된 제제와 함께 사용될 수 있다. 단독으로 또는 다른 제제와 병용하여 전달되는지와 무관하게 본 구현예의 약제학적 조성물은 다양한 경로를 통해 포유동물, 특히 인간, 신체에서의 다양한 부위에 전달되어 특정한 효과를 달성할 수 있다. 당업자는, 하나 이상의 경로가 투여에 사용될 수 있지만, 특정 경로가 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들면, 진피내 전달은 흑색종의 치료에 대해 사용될 수 있다. 국소 또는 전신 전달은 체강으로의 제형의 적용 또는 점적도입, 에어로졸의 흡입 또는 취입을 포함하는 투여에 의해, 또는 근육내, 정맥내, 문내, 간내, 복막, 피하, 또는 진피내 투여를 포함하는 비경구 도입에 의해 달성될 수 있다.
구현예의 조성물은 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 여기서 각 투여 단위, 예를 들면, 주사액은 소정량의 조성물을 단독으로 또는 다른 활성제와 적합한 조합으로 함유한다. 본원에 사용된 용어 단위 투여 형태는 인간 및 동물 대상체를 위한 단일 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하고, 각 단위는 단독으로 또는 다른 활성제와 함께, 적절한 경우, 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 비히클과 조합하여 목적하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된, 구현예의 조성물의 소정량을 함유한다. 구현예의 신규 단위 투여 형태는 특정 대상체에서 약제학적 조성물과 관련된 약력학에 의존한다.
바람직하게는, 단리된 형질도입 T 세포의 유효량 또는 충분한 수가 조성물에 존재하고, 장기간 특이적 항종양 반응이 이러한 치료 부재시 다르게 발생하는 것보다 종양의 크기를 감소시키거나 종양 성장 또는 재성장을 제거하기 위해 확립되도록 대상체에 도입된다. 바람직하게는, 대상체에 재도입된 형질도입 T 세포의 양은 형질도입된 T 세포가 존재하지 않는 다른 동일한 조건과 비교하는 경우 종양 크기에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 감소를 유발한다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "항-종양 유효량"은 대상체에서 암 세포 또는 종양 성장을 감소시키기 위한 CAR-발현 면역 효과기 세포의 유효량을 지칭한다.
따라서, 투여된 형질도입 면역 효과기 세포 (예컨대, T 세포)의 양은 투여 경로를 고려해야 하고, 형질도입된 면역 효과기 세포의 충분한 수가 목적하는 치료 반응을 달성하기 위해 도입되도록 할 정도여야 한다. 또한, 본원에 기재된 조성물에 포함된 각 활성제의 양(예: 접촉되는 각 세포당 양 또는 특정 체중당 양)은 상이한 적용에서 가변될 수 있다. 일반적으로, 형질도입된 T 세포의 농도는 바람직하게는 치료될 대상체에서 적어도 약 1 × 106 내지 약 1 × 109 의 형질도입된 T 세포, 더욱 더 바람직하게는 약 1 × 107 내지 약 5 × 108 의 형질도입된 T 세포를 제공하기에 충분해야 하지만, 그 이상, 예를 들면, 5 × 108 세포 초과, 또는 그 이하, 예를 들면, 1 × 107 세포 미만의 임의의 적합한 양이 사용될 수 있다. 투약 스케줄은 웰-확립 세포 기반 요법에 기반할 수 있거나(예를 들어, Topalian and Rosenberg, 1987; 미국 특허 제4,690,915호), 또는 교대 연속적 주입 전략이 사용될 수 있다.
이러한 값들은 구현예의 방법을 최적화할 때 의사에 의해 사용되는 형질도입된 T 세포의 범위의일반적인 지침을 제공한다. 본원에서 이러한 범위의 열거는 특정 적용에서 보증된 바와 같이, 성분의 보다 많거나 보다 적은양의 사용을 결코 배제하지 않는다. 예를 들면, 실제 용량 및 계획은 조성물이 다른 약제학적 조성물과 병용하여 투여되는지 여부에 좌우되거나, 또는 약동학, 약물 성향, 및 대사에 있어서의 개별적 차이에 좌우된다. 당업자는 특정 상황의 긴급성에 따라서 임의의 필요한 조정을 용이하게 수행할 수 있다.
VII. 구현예의 키트
본원에 기재된 임의의 조성물은 키트에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 동종이계 CAR T-세포는 세포를 확대하기에 적합한 시약, 예를 들면, 배지, APC, 가공된 APC, 성장 인자, 항체(예를 들면, CAR T-세포를 분류하거나 특성화하기 위해) 및/또는 이식유전자, 예컨대 표적 항원, HLA, 미토콘드리아 리포터, CAR 또는 트랜스포사제를 암호화하는 플라스미드를 또한 포함할 수 있는 키트에 제공된다.
비제한적인 예에서, 키메라 항원 수용체 발현 작제물, 키메라 항원 수용체 발현 작제물을 생성하기 위한 하나 이상의 시약, 발현 작제물의 형질감염을 위한 세포, 및/또는 발현 작제물의 형질감염을 위한 동종이계 세포를 수득하기 위한 하나 이상의 기기(이러한 기기는 주사기, 피펫, 겸자 및/또는 임의의 이러한 의학적으로 승인된 장치일 수 있다).
일부 구현예에서, 내인성 TCR α/β 발현을 제거하기 위한 발현 작제물, 작제물을 생성하기 위한 하나 이상의 시약 및/또는 CAR+ T 세포가 키트에 제공된다. 일부 구현예에서, 아연 핑거 뉴클레아제(들)를 암호화하는 발현 작제물이 포함된다.
일부 양태에서, 키트는 세포의 전기천공을 위한 시약 또는 장치를 포함한다.
키트는 구현예의 하나 이상의 적합하게 분액화된 조성물 또는 구현예의 조성물을 생성하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매질 중 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 성분이 배치되고, 바람직하게는 적절하게 분액화될 수 있는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 수 있다. 키트에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우, 키트는 또한 일반적으로 추가의 성분이 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 용기를 함유할 것이다. 그러나, 성분의 다양한 조합이 바이알에 포함될 수 있다. 구현예의 키트는 또한 전형적으로 키메라 항원 수용체 작제물 및 상업적인 판매를 위해 근접하게 밀폐되는 임의의 다른 시약 용기를 포함할 것이다. 이러한 용기는, 예를 들면, 목적하는 바이알이 유지되는 사출 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
VIII. 실시예
본 발명의 구현예는 추가로 하기 실시예를 참고로 상세히 기재된다. 이들 실시예는 단지 실례의 목적으로 제공되고, 달리 구체화되지 않는 한 제한될 의도는 아니다. 따라서, 본 발명은 다음 실시예에 한정되는 것으로 결코 해석되지 않고, 오히려 본원에서 제공된 교시의 결과로서 분명해지는 임의의 모든 변이를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1 - Fc 수용체에 의한 CAR의 결합은 급속 CAR T-세포 청소능과 관련된다
CAR T-세포 지속성에서 CAR 폴리펩티드에 Fc 수용체 결합의 역할은 조사되었다. 초기 연구 동안, CD19 수용체에 표적화된 CAR 작제물은 연구되었다. CAR T-세포는, CD19 결합 도메인 (VL/VH); 힌지 도메인 (IgG4-Fc); 막투과성 도메인 (CD28 TM) 및 세포내 신호전달 도메인 (CD28- CD3ζ) (참고 도 1)을 포함하는, CD19RCD28 작제물을 발현시켰다. CAR 작제물은, 작제물의 게놈 통합을 매개하기 위한 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)-기반 트랜스포손 시스템을 이용하여, 전기천공을 통해 세포에 도입되었다 (참고, 예를 들면, 국제 (PCT) 출원 번호 PCT/US14/38005, 본원에서 참고로 편입됨). 생산된 CAR T-세포는 그 다음 CAR 폴리펩티드 발현을 평가하기 위해 유세포측정에 의해 분석되었다. CAR 폴리펩티드는 효율적으로 발현된 후 형질감염에 발견되었고 수득한 세포 집단의 높은 분율은 K562 aAPC를 이용한 공동-배양의 28 일후 CAR 발현에 양성이었다 (도 2a). 유세포측정 연구는 또한 CAR T-세포의 분율이 시험관내 FcγR2a에 의해 결합되었음을 보여주었고, Fc 수용체의 결합이 유사하게 생체내 CASR T-세포에 영향을 미침 및 지속성 CAR T-세포에서 역할을 할 수 있음을 나타낸다.
연구는 CD19 양성 종양을 가진 마우스에서 또한 완료되었다. 간단히, NSG 마우스는 레닐라 루시퍼라아제 (hRLuc)+ NALM6 종양 세포로 주사 그 다음 CD19RCD28 T 세포의 단일 주사 (또는 대조군 주사)되었다. 종양 세포와 관련된 생물발광은 경시적으로 이미지화를 통해 측정되었다. 도 3a-b에 나타난 바와 같이, CAR T-세포가 초기에 종양 성장을 조절할 수 있는 반면 (제21일 시점), 제28일까지는 주사 후 종양 제거-성장은 심지어 치료된 동물에서 명확히 분명하다. 상기 효과는 예를 들면, FcR 결합 때문에 T-세포의 제한된 생체내 지속성과 관련될 수 있다. 따라서, Fc 수용체 결합 요소를 포함시킴으로써 CAR 폴리펩티드 생체내 지속성 (및 잠재적 독성)은 제한될 수 있다.
실시예 2 - 감소된 Fc 수용체 결합을 갖는 CAR 폴리펩티드
상이한 CAR T-세포 작제물의 배열은 CAR T-세포에 Fc 수용체 결합을 조절하도록 생산되었다. 시험된 작제물은 도 4에서 보여진다. 특히, 상이한 힌지 서열은 수많은 상이한 막투과성 및 세포내/신호전달 도메인의 맥락에서 시험되었다. 도 5에서 나타난 유세포측정 연구는 모든 시험된 작제물이 형질감염된 T-세포에서 효율적으로 발현되었음을 보여준다 (형질감염은 CAR 수용체 작제물의 통합용 슬리핑 뷰티-기반 트랜스포손 시스템을 이용하여 전기천공에 의해 상기와 같이 완료되었다). 마찬가지로, 수득한 T-세포의 높은 분율은 K562 aAPC를 이용한 공동-배양의 28 일후 CAR 수용체 양성이었다 (도 5). K562 aAPC를 이용한 공동-배양에서 CAR T-세포 증식의 동력학은 도 7에서 보여지고 모든 CAR T-세포가 유사한 효율로 증식하였음을 입증한다.
다음으로, CAR T-세포는 유세포측정에 의해 시험관내 Fc 수용체 결합에 대하여 시험되었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 인간 IgG4 힌지 서열을 포함한 CAR T-세포가 Fc 수용체에 의해 (특히 FcγR2a에 의해) 결합되었던 반면, L235E 및 N297Q 치환을 갖는, 돌연변이체 IgG4 힌지를 발현하는 세포는 Fc 수용체에 유의미하게 적은 결합을 보여주었다.
각각의 시험된 CAR 작제물을 발현하는 CAR T-세포는 그 다음 표적 CD19 양성 종양 세포에 대한 능력에 대하여 평가되었다. 도 8-9에서 제시된 연구에서, 표적 세포를 용해하기 위한 (도 8) 또는 표적 세포에 대한 반응에서 IFNγ를 생산하기 위한 (도 9) CAR T-세포의 능력은 생체외 실험에서 시험되었다. 이들 연구는 그 다음 생체내 실험되어 마우스에서 외식편된 종양 제거-성장을 조절하기 위한 다양한 CAR T-세포의 효능을 측정하였다. 간단히, 상기에서와 같이, 그 NSG 마우스는 종양 (hRLuc+ NALM-6)으로 주사된 다음 (i.v.) 다음 날 P. 피랄리스 루시퍼라아제 (ffLuc)+ CAR+ T-세포로 주사 (i.c.)되었다. 종양 및 T-세포 이미지화는 Xenogen? IVIS 100 시리즈 시스템을 이용하여 각각 EnduRen 또는 루시페린의 주사 이후 수행되었다. 마우스의 이미지화는 도 10에서 보여진다. 각 경우에, T-세포는 투여 직후 이미지화되어 심장내 주사를 식별하였다 (상부 행). 그늘진 이미지는 경시적으로 종양-유도된 hRLuc 활성으로부터 광자 유동을 나타낸다. 이들 연구로부터 발광 데이터는 또한 그래프화되었고 도 11에서 보여진다. 최종적으로, 도 12는 다양한 CAR T 세포로 치료된 NSG 마우스에 대한 생존 곡선을 도시하는 그래프를 보여준다. 이들 연구의 결과는 Fc 수용체 결합을 감소시키는 각각의 CAR T-세포 발현 작제물 (즉, EQ 돌연변이체 IgG4 힌지, CD8a 힌지 또는 12-aa 스페이서 힌지)이 야생형 IgG4 힌지 서열을 가진 CAR T-세포와 비교된 경우 더 큰 효능을 가졌음을 보여준다. 특히, 이들 작제물은 마우스에서 종양 세포 성장의 개선된 조절 및 치료된 동물의 늘어난 생존 시간 모두를 보여주었다. 따라서, 이들 연구는, Fc 수용체 결합을 감소시킴으로써, CAR T-세포의 생체내 지속성 및 항-종양 효능이 유의미하게 향상될 수 있음을 지시한다.
실시예 3 - 추가의 CAR 작제물 연구
추가의 연구는 CD19 수용체에 표적화된 CAR 작제물을 이용하여 수행되었다. 초기 연구와 유사하게, PBMCs는 CD19R*CD28 또는 CD19RCD8CD28 트랜스포손 & SB11 트랜스포사제로 전기천공되었고 7-일 자극 사이클에서 28 일 동안 IL-2 및 IL-21과 함께 조사된 클론 1에서 공동-배양되었다. 세포는 각 자극 사이클의 마지막에 열거 및 표현형 (CD3, CAR)되었다 (도 13a-d).
이들 연구는 그 다음 생체내 실험되어 NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ, NOD scid 감마) 마우스에서 CD19+ NALM-6 세포주에 대해 다양한 CAR T-세포의 효능을 측정하였다. 모든 최소 잔류 질환 (MRD) 모델 및 확립된 종양 모델은 연구되었다. MRD 모델에서, NSG 마우스는 제0일에서 hRluc+mKate+NALM-6의 104 세포로 주사되었고, 그 다음 제1일에서 심장내로 T-세포 (107/마우스)의 주사되었다. 종양 부하는 경시적으로 EnduRen Live Cell Substrate를 이용하여 hRluc+NALM-6으로부터 유도된 생물발광 이미지화에 의해 평가되었다 (도 14a). 확립된 종양 모델에서, NSG 마우스는 제0일에서 1.5x104 ffLuc+EGFP+NALM-6으로 주사되었고 종양은 5 일 동안 합체하도록 허용되었고, 종양 부하는 평가되었고 T 세포 (107/마우스)는 제6일에서 심장내로 주사되었다. 종양 유동은 경시적으로 D-루시페린 기질을 이용한 ffLuc+NALM-6으로부터 생물발광 이미지화를 이용하여 계산되었다. 경시적으로 광자 유동 및 종양-속도를 나타내는 위색채 이미지는 보여진다 (도 14c). 이들 연구로부터 발광 데이터는 또한 그래프화되었고, 각 모델에 대하여 각각 도 14b 및 도 14d에 나타난다.
실시예 4 - mIL -15 공동-발현 CAR T-세포 효능 및 지속성의 효과
자가조직 또는 동종 마우스 모델에서 CAR T-세포 주입 이후, 시토카인 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-15의 수준은 모니터링되었다. 추가의 신호전달 작제물은 지속성을 개선하도록 탐구되었다. 도 15는 막-결합된 IL-15/IL-15 수용체 (mIL15) 작제물을 보여준다. mIL-15 작제물은 T-세포에서 CAR로 공동-발현되었다. 도 16에서의 데이터 (참고, 예를 들면, 좌측 패널)는 대다수의 전기천공된 세포에서 CAR 및 mIL15의 공동-발현을 입증한다. 도 16에서 제시된 추가 데이터는, CAR로 공동-발현된 경우 mIL-15가 항원 배출 이후 배양액내 감소로부터 CAR T-세포를 보호할 수 있었음을 보여준다 (참고 도 16, 우상측 패널).
CAR-mIL-15 T-세포의 향상된 지속성을 지시하는 세포 배양 결과는 그 다음 생체내 식별되었다. 이들 연구를 위하여, 마우스는 CAR 단독 또는 mIL-15와 조합으로 CAR을 발현하는 ffLuc+ T 세포로 주사되었다. T 세포 이미지화는 루시페린의 주사 이후 수행되었다. 도 17b에 나타난 바와 같이, mIL-15-CAR T-세포는 생체내 증식된 지속성을 나타냈다. 추가로 생체내 연구는 종양 성장 조절에서 CAR T-세포 발현 mIL-15의 유효성을 조사하였다. 이들 연구는 확립된 종양 모델을 이용하여 완료되었고 유전자 상으로-변형된 T 세포는, 지시된 바와 같이, 종양 생착의 6 일후 (i.v. 주사됨), 주사되었다 (i.c.).
실시예 5 - T 세포의 유전적 변형
T 세포는 종양 관련된 항원 (TAA) NY-ESO-1을 나타내기 위해 항원 제시 세포 (T-APC)로서 기능하도록 생체외 전파되었다. 슬리핑 뷰티 (SB) 시스템 (Hackett et al., 2010)은 T 세포를 유전자 상으로 변형시키도록 적응되었다 (도 20) (Cooper et al., 2005). 이는 2 단계를 포함하였다: (i) T-세포 특이성 (Jin et al., 2011; Kebriaei et al., 2012)]을 재유도하기 위한 SB 트랜스포손 [즉, 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 SB 트랜스포사제를 발현하는 DNA 플라스미드의 전기-이동 단계 및 (ii) CD64 (Fc 수용체), CD86, CD137L 및 인터류킨 (IL)-15 (mIL-15, 도 21)의 막-결합된 뮤테인을 공동-발현하는 K562 세포주로부터 유도된 설계자 인공 항원-제시 세포 (aAPC)에서 구성부분을 안정되게 발현하는 T 세포의 전파 및 증식 단계. NY-ESO-1 면역원의 발현을 시행하기 위해, 플라스미드 SB 발현 카세트가 티미딘 키나제 (HyTK)와 하이그로마이신 인산전달효소 (Hy)의 융합을 공동-발현함에 따라, 배양액내 T-APC은 하이그로마이신을 이용하여 선택되었다 (도 20). 유전자 상으로 변형된 T 세포는 하이그로마이신 B의 세포파괴 농도의 존재하에 γ-조사된 OKT3-로딩된 aAPC를 이용한 시리즈 자극에 의해 전파되었다 (도 20). T 세포는, 바이러스 항원 인플루엔자 A MP1 (Cooper et al., 2005)을 이용하여, 시험관내 및 생체내 T-APC로서 기능할 수 있다. 본 실시예에서, T 세포는 SB 시스템 (Hackett et al., 2010)을 이용하여 (FLAG-태그된 HyTK에 융합된) NY-ESO-1 (도 22) 및 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 존재하에 전파된 NY-ESO-1+mIL-15+HLA-A2+T-APC (도 26)를 발현하도록 가공되었다.
실시예 6 - 가공된 T 세포의 평가
본원에서 기재된 구현예의 mIL15+NY-ESO-1+T-APC는 PBMC로 공동-배양된 경우 NY-ESO-1 오량체 양성 T 세포를 생성할 수 있고 시험관내 골수종 세포를 사멸시킬 수 있는 NY-ESO-1+ CAR T 세포를 증식시킬 수 있다 (도 23 및 24). 하지만, T-APC로부터 CD137L 활성화의 부재 뿐만 아니라 LAG3 발현으로부터 증가된 억제는 공동-배양액에서 3 주후 관측된 줄어든 반응을 초래할 수 있었다 (도 25). LAG3 발현은 T-APC의 각 자극으로 증가하였고 소진의 대체일 수 있다.
도 28은 NY-ESO-1 특이적 TCR+ 및 CAR+ T 세포에 의한 NY-ESO-1+ U266 인간 다발성 골수종 세포주의 사멸을 보여주는 상기 결과를 예시한다. T-세포는 K562로부터 유도된 인공 활성화 및 전파 세포 (AaPC)에서 증식되었고 HLA-A02 및 NY-ESO-1+를 발현시킨다. 보여진 데이터는 HLA-A2/NY-ESO-1 T-APC로 3 자극 및 AaPC K562로 2 자극 동안 전파된 9-2-15의 NY-ESO-1 특이적 CAR T-세포가 유도된 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. 9-2-15 CAR은 CD8α 줄기를 함유하고 반면에 이전의 하나는 IgG4 줄기를 함유하였다. 증가된 자극은 골수종 세포의 증가된 용해를 초래한다.
NY-ESO-1+mIL-15+HLA-A2+T-APC는 TAA를 나타내는 그의 능력에 대하여 또한 평가되었다. 이는 NY-ESO-1 특이적 αβTCR을 발현하도록 연역적으로 유전자 상으로 변형된 자가조직 T 세포를 이용한 PBMC의 공동-배양에 의해 달성되었다. T-APC는 NY-ESO-1 오량체+ T 세포를 성공적으로 수치상 증식하도록 사용되었다. 유사하게, K562-유도된 aAPC는 NY-ESO-1을 나타내도록 또한 변형되었고 양성 대조군으로서 NY-ESO-1-특이적 유전자 상으로 변형된 T 세포를 임의로 활성화 및 전파하도록 사용되었다. T-APC가 할 수 있음에 따라 상기 양성 대조군은 PBMC에서 면역력을 유발할 수 없었다. NY-ESO-1-유도된 펩티드를 인식하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 이용한 T 세포의 특이성 재유도는 HLA의 맥락에서 또한 연구되었다. T-APC는 CAR T 세포 뿐만 아니라 양성 대조군, K562-유도된 aAPC를 성공적으로 증식시킬 수 있었다 (도 27).
실시예 7 - SRC/미토콘드리아 강도의 측정
모든 세포 (둘 모두는 암성 및 1차)는 이용가능한 대사물에 반응으로 정통 입체배치로부터 응축된 상태 및 그 반대로 그의 미토콘드리아를 대체하는 능력을 갖는다 (Krauss et al., 2001). 미토콘드리아 형상은 유사한 생체외 배양 조건에서 성장된 모의-전기천공된 대조군 T 세포와 비교된 경우 CAR-변형된 T 세포에서 상이하다 (도 29a 및 29b). 특정 CAR-변형된 T 세포가 응축된 상태 미토콘드리아를 갖는 상기 관찰은 공자극의 부재하에 CD137 T-세포 신호전달 도메인으로 변형된 세포와 CD28 신호전달 도메인으로 변형된 T 세포를 비교한 경우 현저해진다 (도 30). 따라서, 세포가 특이적 공자극의 부재하에 생체외 전파된 경우 생체외 성장된 비변형된 및 변형된 T 세포의 대사성 요구 및 소비 패턴은 상이하고 두드러진다. 이와 비슷하게, 마우스 모델에서 CD8+ T 세포내 미토콘드리아 기능 및 SRC (예비 호흡 용량)의 유지가 감염 이후 안정한 CD8+ 기억 T 세포 형성에 중요함이 보여졌다 (Pearce et al., 2013; van der Windt et al., 2012). SRC는 증가된 작업 또는 스트레스의 조간하에 에너지를 생산하기 위해 세포에서 이용가능한 추가의 미토콘드리아 수용력으로서 기재되고 장기간 세포성 생존 및 기능에 중요한 것으로 생각된다. 일련의 실험은 시험관내 수행되어 높은 미토콘드리아 강도를 갖는 T 세포가 더 양호하게 생존할 수 있는지, 및 그렇게 함으로써 규칙적 미토콘드리아 질량을 갖는 T 세포와 비교된 경우 생체내 더욱 유효한지를 측정하였다.
형광성 리포터 단백질을 발현하기 위한 T 세포의 유전적 변형. 형광성 리포터 단백질 EYFP-GRX2 (도 31)는 이전에 기재된 바와 같이 슬리핑 뷰티-매개된 전위를 이용하여 T 세포에서 개발 및 발현되었다 (Rushworth et al., 2014). 플라스미드 EYFP-GRX2-SB는, 슬리핑 뷰티 (SB) 벡터 골격에서 모두 포매되는, hEF1a 프로모터의 관리 하에 발현된 융합 단백질 EYFP-Mito에 대하여 암호화한다. SB 벡터 IR/DR 서열은 제2 플라스미드 pCMV-Kan-SB11로부터 발현된 효소 SB11 (트랜스포사제)에 의해 유도된 미토콘드리아 국지화 서열 (GRX2)을 갖는 형광성 단백질을 암호화한 이식유전자의 전위에 도움을 준다. 형광성 단백질 리포터 및 SB11과 함께, 2 이상의 플라스미드, 종양-관련된 항원 (예컨대, HER1-3, ROR1, CD19, 또는 CD123)에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)에 대하여 암호화하는 것 및 세포 핵에 형광성 단백질을 안내하는 핵 국지화 서열 (NLS)로 융합된 제2 형광성 단백질, mCherry (즉, mCherry-NLS-SB)를 함유하는 것이 발현된다. 조합된 모두 4개의 플라스미드는 인간 T-세포 뉴클레오펙터 키트 (Amaxa/Lonza) 및 전기천공 장치 (Lonza)를 이용하여 전기천공에 의해 세포에 전달되었다. 형광성 단백질 플라스미드를 발현하기 위한 벡터 다이어그램의 도식은 도 31에서 묘사된다.
CAR + T 세포의 생성. 특이적 종양-관련된 항원을 표적한 키메라 항원 수용체-양성 T 세포는 PBMC-유도된 T 세포에 전기천공으로 SB-매개된 전위 및 DNA 이동의 유사한 방법으로 생성되었다. B-세포 악성종양에 관하여 CD19 및/또는 ROR1, 백혈병성 줄기 세포 (급성 골수 백혈병)에 관하여 CD123, 또는 EGFR-양성 유방암에 관하여 HER1-3에 표적한 특이성을 갖는 CAR+ T 세포는 전기천공의 유사한 방법으로 T 세포에서 설계 및 발현되었다. 각 CAR은 CD3z와 함께 T-세포 공자극 엔도도메인 CD28 또는 4-1BB (CD137)를 함유하도록 설계되었다. 각 CAR은, T-세포 신호전달 엔도도메인에 융합된, 세포의 표면에서 scFv를 돌출시키기 위해 스캐폴드로서 작용하는, 변형된 IgG4-Fc 줄기를 함유한다. T-세포 표면에서 CAR의 발현은 Fc-줄기 특이적 항체를 이용하여 식별되었다.
CAR 종 (참고, 예를 들면, 국제 (PCT) 특허 공개 번호 WO/2015/123642, 본원에서 참고로 편입됨)의 설계 및 생성 방법은 공지되지만, 인간내 주입된 경우 시험관내 또는 동물 시험(들)이 우수한 치료적 잠재성을 갖는 CAR 설계를 식별할 예상은 문제로 남아있다. 현재, 조사자는 전형적으로 CAR 구조를 임상에 융통하기 위한 하기 시험의 배열에 의존한다: 활성화-유도된 세포 사망 (AICD) 및 CAR-매개된 증식에 대한 내성, 사멸, 및 시토카인 생산. 개선된 치료적 잠재성을 가질 수 있는 CAR 설계를 식별하기 위한 단일 시험이 본원에서 교시된다. CD8+ 기억 T 세포 (CD8+ 효과기 T 세포 제외)는 실질적인 미토콘드리아 예비 호흡 용량 (SRC)을 보유한다. 효과기 세포와 달리, 기억 세포는 대사성 요구의 독특한 세트를 갖는다. 높은 종양 부하 동안 증가된 스트레스의 경우에서, 유전자 상으로 변형된 T 세포의 미토콘드리아는 정통 구조로부터 응축된 형태로 전환시킨다 (도 29b 및 33a-33b). 하지만, 단지 일부 세포는 최초 정통 미토콘드리아 구조로 역으로 대체하기 위한 가요성, T 효과기 세포의 독특한 특징을 보유한다. 높은 미토콘드리아 SRC를 갖는 T 세포는 높은 종양 부하와 관련된 부정적인 조건, 예컨대 저산소증, 당분해용 영양소의 부족, 및 억제성 시토카인 환경을 생존하지만, 여전히 그의 세포독성 능력을 보유할 수 있다 (도 34). 그와 같은 세포독성 T 세포는 생체내 종양의 최상의 시리즈 킬러일 수 있는 "고 에너지 세포"로서 본원에서 정의된다.
CAR + T 세포의 생체외 증식. CAR-T 세포는 CAR-특이적 리간드 (2D3 scFv, 참고, 예를 들면, PCT 출원 번호 PCT/US2014/039365)를 발현하는 조사된 K562 HLA Cneg 세포 및 IL2의 외인성 부가 그러나 공자극 (Rushworth et al., 2014)의 부재와 함께 공동-배양되었다. CAR-T 세포의 유전적 변형 이후, 조사된, 활성화된, 및 전파된 (AaPC) 공급 세포는 1:2 (1 CAR-T 세포 : 2 AaPC)의 비로 부가되었다 (도 30).
인간 시험에서 생체내 장기간 생존할 수 있는 대사작용으로 활성 고-에너지 CAR+ T 세포가 식별되었고 수치로 증식되었다. 이는 유전자 이동을 매개하기 위한 슬리핑 뷰티 (SB) 시스템을 사용함으로써 달성되었다. SB 시스템으로부터 2개 DNA 플라스미드의 전기-이동 (CAR 및 SB 트랜스포사제에 대한 암호화)을 경험한 T 세포는 조사된 "범용" 활성화 및 전파 세포 (K562-uAPC)에서 공동-배양되었다. "고 에너지" 대사에 참여하는 능력을 갖는 유전자 상으로-변형된 T 세포를 식별하기 위해, 제3 SB DNA 종, 지정된 EYFP-GRX2-SB는 병렬적으로 또한 전기천공되었다. 상기 SB 트랜스포손은 융합 단백질 EYFP-2A-GRX2를 발현하고 미토콘드리아-국지화 서열을 함유한다. 형광 리포터는 추가의 미토콘드리아 예비 호흡 용량 (SRC)을 갖는 CAR+ T 세포를 식별한다. 이들 세포는 EYFP 형광의 세기에 기반하여 분류될 수 있고 생체내 종양 사멸을 위하여 주입될 수 있다.
유동 세포계측. CAR-T 세포는 표준 분류 절차 당 임의의 염색 마커 없이 LSR-Fortessa 흐름 세포측정기 (BD)에서 EYFP의 내인성 발현에 기반된 높은 미토콘드리아 강도로 분류되었다 (도 32).
현미경검사. CAR 변형된 세포는 1% 파라포름알데하이드 용액에 고정되었고 표준 절차를 이용한 투과 전자 현미경검사로 분석되었다. CAR 변형된 및 비변형된 T 세포의 형광 세기는 높은 미토콘드리아 강도 CAR-변형된 T 세포 (eT-세포)가 추가의 미토콘드리아 예비 호흡 용량을 보유하는지를 측정하기 위해 Leica DMI 6000 역전된 형광 현미경 및 Metamorph 이미지화 소프트웨어 (버전 7.8)를 이용하여 정량화되었다 (도 35, 36, 37a, 및 37b).
높은 EYFP 발현을 갖는 CAR는 세포자멸사를 무시하기 위한, CAR+ T 세포에서 항-세포자멸적 유전자를 상향조절하기 위한, 및 임상적으로 관련된 항-종양 효과를 달성하도록 생체내 지속하기 위한 필수 특징을 가질 수 있다. 전기-이동된 시험관내-전사된 mRNA 종으로부터 리포터 유전자를 일시적으로 발현하는 것 및/또는 상자성 비드-기반 선택에 사용될 수 있는 세포-표면 분자 (예를 들면, 절단된 신경 성장 인자 수용체)를 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 CAR 설계의 인간 적용을 위한 분류 대신에, 방법은 이로써 (예를 들면, EZ-CAR 시스템에 의해 생산된 바와 같이) 다수의 상이한 CAR 분자가 리포터 유전자 (예를 들면, EYFP)의 공동-발현을 위하여 시험관내 스크리닝될 수 있고 따라서 원하는 미토콘드리아 SRC에 기반하여 선택될 수 있는 접근법을 제공한다.
실시예 8 - 4- 1BB (CD137) 매개된 T-세포 신호전달
CAR+ T 세포의 유전자 변형 및 생체외 전파는 변경된 미토콘드리아 대사를 일으키고 그 4-1BB 매개된 T-세포 신호전달은 도전적 배양 환경에서 CAR+ T 세포의 더 양호한 생존을 촉진시킨다.
ROR1 또는 HER1-3을 표적한 2개의 상이한 CAR는 제한 배양 조건에서 CAR-T 세포의 성장에 관하여 신호전달 도메인의 효과를 측정하기 위해 비교되었다. CAR 작제물은 이전에 기재된 바와 같이 슬리핑 뷰티 (SB) 벡터 골격에서 작성되었다. CAR는 각각의 벡터 작제물에서 CD28-CD3z 신호전달 또는 CD137 (4-1BB)-CD3z 신호전달 도메인을 이용하였다. 표적한 별도의 종양 항원 이외에, CAR 골격은 막투과성 및 신호전달 도메인과 CAR을 연합하기 위해 마우스 scFv 표적한 종양 항원 및 인간 IgG4 Fc 유도된 줄기를 사용하는 CD19-특이적 CAR에 대하여 초기에 기재된 바와 같이 일정하게 남아 있다. 표적 항원 즉 CLL 상의 ROR1 (Deniger et al., PLoS One, 2015), 및 유방 종양에 관하여 HER1-3 (Jena et al., ASH, 2014)은 이전에 기재되었다. SB-매개된 유전자 변형 이후, CAR-T 세포는 조사된 범용 활성화 및 전파 세포에서 전파되었다 (uAPC; Rushworth et al., J Immunothrer. 2014). CAR-T 세포 성장 동력학, 미토콘드리아 구조 및 미토콘드리아 형태학은 실시예 7에서 기재된 바와 같이 연구되었다.
CD28-CD3z 신호전달을 함유한 CAR-T 세포의 성장 및 생존은 이용된 트랜스포손 부담 또는 표적 항원과 무관하게 CD137-CD3z 신호전달과 비교된 경우 열등하다 (도 38 및 39). 전체로, 3개의 상이한 CAR, 즉, CD28z 또는 CD137z 신호전달을 함유한 CD19-CAR, HER1-3 CAR, ROR1+ CAR은 본 연구에서 시험되었다. 모든 CAR는 범용 AaPC에서 활성화 및 증식되었고, 여기에서 T 세포는 K562 세포에서 포매된 scFv 리간드를 통한 CAR-줄기를 통해서만 신호전달하였다. 특이적 공자극의 부재하에 CD28 신호전달을 함유한 CAR-T 세포는 세포자멸사를 빠르게 경험하였고, 반면에 CD137z 신호전달을 함유한 CAR-T 세포는 더 오래 지속하였고 (공초점 현미경검사에 의해 높은 EYFP 강도로 관측된 바와 같이) 증가된 미토콘드리아 질량을 일관되게 보여주었다.
미토콘드리아 수는 소수이었고 CD28z-CAR-T 세포에서 부족하게 분포되었고 반면에 CD137z-CAR-T 세포는 EYFP 신호의 더 선명한 및 더 높은 수준을 나타냈다. 이는 미토콘드리아의 높은 예비 호흡 용량 (SRC)을 증명하고 제한 배양 환경에서 생존한 CD137z-CAR T 세포의 기계론적인 증거를 제공한다.
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본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 도시되고 기재되었지만, 이러한 구현예가 단지 예로써 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 이제 당해 분야의 숙련가라면 본 발명을 벗어나지 않고 수많은 변형, 변화 및 치환을 생각할 수 있다. 이제, 기술분야에서 숙련된 자는, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 수 많은 변형예, 변경예, 및 치환예를 떠올릴 것이다. 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 범위를 규정하기 위한 것이며, 이러한 특허청구범위 내의 방법 및 구조, 및 이들의 균등물은 이에 포함되는 것으로 의도된다.
참고문헌
다음 참고 문헌들은 본원에 기재된 것들에 대한 예시적, 절차적 또는 다른 세부 사항들을 제공하는 정도까지 본원에 참고 문헌으로서 특별히 인용된다.
미국 특허 제4,690,915호
미국 특허 제6,225,042호
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미국 특허 제6,362,001호
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미국 특허 제7,109,304호
미국 특허 출원 공보 번호 제2009/0017000호
미국 특허 출원 공보 제2009/0004142호
국제특허출원 공개 WO2007/103009
PCT 출원번호 번호 PCT PCT/US2014/039365
PCT 출원번호 번호 PCT PCT/US14/39365
PCT 출원번호 번호 PCT PCT/US14/38005
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1440 gccaccaagg atacctacga cgccctgcac atgcaggccc tgccccccag a 1491 <210> 26 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CAR polypeptide <400> 26 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val 20 25 30 Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Glu 35 40 45 Arg Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro 50 55 60 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Ile His Asp Val Ile Glu Arg Ser Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 100 105 110 Trp Ser Phe Ala Gly Gly Tyr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Asp Val 115 120 125 Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu 130 135 140 Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu 145 150 155 160 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 165 170 175 Thr Phe Ser Thr Tyr Gln Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 180 185 190 Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Val Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ala 195 200 205 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 210 215 220 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 225 230 235 240 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Glu Leu Leu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp 245 250 255 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Pro Thr Thr 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln 275 280 285 Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala 290 295 300 Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala 305 310 315 320 Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr 325 330 335 Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 340 345 350 Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 355 360 365 Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 370 375 380 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 385 390 395 400 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 405 410 415 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 420 425 430 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 435 440 445 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 450 455 460 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 465 470 475 480 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 485 490 495 Arg <210> 27 <211> 1836 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CAR oligonucleotide <400> 27 atggaaaccc tgctgggcct gctgatcctg tggctgcagc tccagtgggt gtcctccaag 60 caggaagtga cccagatccc agccgccctg tccgtgccag agggcgagaa cctggtgctg 120 aactgctcct tcaccgactc cgccatctac aacctgcagt ggttcaggca ggaccccggc 180 aagggcctga cctccctgct gctgatccag tcctcccaga gagagcagac ctccggcagg 240 ctgaacgcct ccctggacaa gtcctccggc agatccaccc tgtatatcgc cgcctcccag 300 cccggcgaca gcgccacata tctgtgtgcc gtgcgccccc tgtacggcgg ctcctacatc 360 ccaaccttcg gcaggggcac ctccctgatc gtgcacccct acatccagaa ccccgacccc 420 gccgtgtacc agctgaggga ctccaagtcc agcgacaagt ccgtgtgcct gttcaccgac 480 ttcgactccc agaccaacgt gtcccagtcc aaggactccg acgtgtacat caccgacaag 540 accgtgctgg acatgagatc catggacttc aagtccaact ccgccgtggc ctggtccaac 600 aagtccgact tcgcctgcgc caacgccttc aacaactcca tcatccccga ggacacattc 660 ttcccatccc ccgagtccag ctgcgacgtg aagctggtgg aaaagtcctt cgaaaccgac 720 accaacctga acttccagaa cctgtccgtg atcggcttca ggattctgct gctgaaggtg 780 gccggcttca acctgctgat gaccctgagg ctgtggtcct ccagagccaa gagatccggc 840 tccggcgcca ccaacttcag cctgctgaaa caggccggcg acgtggaaga gaacccaggc 900 cccatgtcca tcggcctgct gtgctgcgcc gctctgtctc tgctgtgggc cggaccagtg 960 aacgctggcg tgacccagac ccccaagttc caggtgctga aaaccggcca gtccatgacc 1020 ctgcagtgcg cccaggacat gaaccacgag tacatgtcct ggtacagaca ggaccctgga 1080 atgggactga ggctgatcca ctactccgtg gccatcggca tcaccgacca gggcgaggtg 1140 cccaacggct acaacgtgtc caggtccacc accgaggact tcccactgag gctgctgtct 1200 gccgccccat cccagacctc cgtgtacttc tgcgcctcct cctacgtggg caacaccggc 1260 gagctgttct tcggcgaggg ctccaggctg acagtgctgg aagatctgaa gaacgtgttc 1320 cccccagagg tggccgtgtt cgagccctcc gaggccgaga tctcccacac ccagaaagcc 1380 accctggtct gcctggccac cggcttctac cctgaccacg tggaactgtc ttggtgggtg 1440 aacggcaaag aggtgcactc cggcgtctcc accgaccccc agcccctgaa agagcagccc 1500 gccctgaacg actccagata ctgcctgtcc tccagactga gggtgtccgc caccttctgg 1560 cagaacccca gaaaccactt caggtgccag gtgcagttct acggcctgtc cgagaacgac 1620 gagtggaccc aggacagggc caagcccgtg acacagatcg tgtctgccga ggcctggggc 1680 agggccgact gcggattcac ctccgagtcc taccagcagg gcgtgctgag cgccaccatc 1740 ctgtacgaga tcctgctggg caaggccacc ctgtacgccg tgctggtgtc cgctctggtg 1800 ctgatggcca tggtgaaaag aaaggactcc aggggc 1836 <210> 28 <211> 612 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CAR polypeptide <400> 28 Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 20 25 30 Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 35 40 45 Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile 85 90 95 Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg 100 105 110 Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser 115 120 125 Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln 130 135 140 Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp 145 150 155 160 Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr 165 170 175 Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser 180 185 190 Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn 195 200 205 Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro 210 215 220 Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp 225 230 235 240 Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu 245 250 255 Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp 260 265 270 Ser Ser Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu 275 280 285 Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Ile 290 295 300 Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala Gly Pro Val 305 310 315 320 Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr Gly 325 330 335 Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr Met 340 345 350 Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr 355 360 365 Ser Val Ala Ile Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr 370 375 380 Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu Ser 385 390 395 400 Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Val 405 410 415 Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val 420 425 430 Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu 435 440 445 Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys 450 455 460 Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val 465 470 475 480 Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu 485 490 495 Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg 500 505 510 Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg 515 520 525 Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln 530 535 540 Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly 545 550 555 560 Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu 565 570 575 Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr 580 585 590 Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys 595 600 605 Asp Ser Arg Gly 610

Claims (35)

  1. 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드로서,
    항원-결합 도메인;
    힌지 도메인;
    막투과성 도메인 및 하나 이상 세포내 신호전달 도메인(들)을 포함하고,
    상기 힌지 도메인은 IgG4 Fc 서열을 포함하며, 상기 IgG4 Fc 서열은 Fc 수용체 결합을 감소시키는 야생형 IgG4 Fc에 대하여 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 IgG4-Fc 서열은 서열 번호: 1에 적어도 약 90% 동일한, CAR 폴리펩티드.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 IgG4-Fc 서열은 상기 야생형 서열에 대하여 위치 L235 또는 N297에서의 돌연변이를 포함하는, CAR 폴리펩티드.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 IgG4-Fc 서열은 상기 야생형 서열에 대하여 위치 L235 및 N297에서의 돌연변이를 포함하는, CAR 폴리펩티드.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 IgG4-Fc 서열은 상기 야생형 서열에 대하여 L235E 및 N297Q 돌연변이를 포함하는, CAR 폴리펩티드.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 IgG4-Fc 서열은 상기 야생형 서열에 대하여 L235E 및 N297Q 돌연변이를 포함하는, CAR 폴리펩티드.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 IgG4-Fc 서열은 서열 번호: 1과 동일한, CAR 폴리펩티드.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 항원-결합 도메인은 scFv를 포함하는, CAR 폴리펩티드.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 세포내 세포 신호전달 도메인은 CD3ζ 유래의 도메인을 포함하는, CAR 폴리펩티드.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 세포내 세포 신호전달 도메인은 CD28 또는 CD137 (4-1BB) 유래의 세포내 도메인을 추가로 포함하는, CAR 폴리펩티드.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 막투과성 도메인은 CD28, CD8a 또는 CD137의 막투과성 도메인을 포함하는, CAR 폴리펩티드.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 항원-결합 도메인은 감염성 질환 항원 또는 암 세포 항원에 결합하는, CAR 폴리펩티드.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 항원-결합 도메인은 암 세포 항원에 결합하는, CAR 폴리펩티드.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 암 세포 항원은 CD19이고, 그리고 상기 CAR은 CD19-표적 CAR인, CAR 폴리펩티드.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
  16. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드 및 청구항 15의 핵산을 포함하는, 단리된 면역 효과기 세포.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 세포는 T-세포인, 세포.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인, 세포.
  19. 약제학적으로 허용가능한 담체 내 청구항 16의 세포 집단을 포함하는, 약제학적 조성물.
  20. 대상체를 치료하는 방법으로서,
    청구항 1 내지 14 중 어느 한 항의 CAR 폴리펩티드를 발현하는 유효량의 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 가공된 항원 제시 세포 (APC)로서,
    표적 항원을 암호화한 제1 이식유전자 및 인간 백혈구 항원 (HLA)을 암호화한 제2 이식유전자를 포함하고,
    상기 HLA는 상기 표적 항원의 에피토프와 착화된 상기 APC의 표면상에 발현되는, 가공된 항원 제시 세포 (APC).
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 APC가 불멸화되지 않은, 가공된 항원 제시 세포 (APC).
  23. 청구항 21에 있어서, 상기 APC가 1차 세포인 가공된 항원 제시 세포 (APC).
  24. 청구항 21에 있어서, 상기 APC가 T-세포 또는 T-세포 전구체인, 가공된 항원 제시 세포 (APC).
  25. 청구항 21에 있어서, 상기 APC가 TCRαβ 또는 TCRγδ를 발현하는 T-세포인, 가공된 항원 제시 세포 (APC).
  26. 청구항 21에 있어서, 공자극 분자를 암호화한 적어도 제3 이식유전자를 추가로 포함하는, 가공된 항원 제시 세포 (APC).
  27. 청구항 21에 있어서, 상기 표적 항원은 NY-ESO-1인, 가공된 항원 제시 세포 (APC).
  28. 대상체를 치료하는 방법으로서,
    청구항 21 내지 26 중 어느 한 항의 가공된 APC의 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 APC는 상기 질환과 관련된 표적 항원을 발현하는, 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 대상체는 상기 APC에 의해 암호화된 상기 표적 항원을 발현하는 암을 갖는, 방법.
  30. 청구항 28에 있어서, 상기 표적 항원은 NY-ESO-1인, 항원.
  31. 높은 미토콘드리아 예비 호흡 용량(spare respiratory capacity)을 갖는 CAR 변형 T 세포를 선택하는 방법으로서,
    미토콘드리아 리포터 유전자의 발현 수준을 검출하는 단계, 및
    상기 미토콘드리아 리포터 유전자의 상승된 발현 수준을 갖는 CAR 변형 T 세포를 선택하여, 이로써 미토콘드리아 예비 호흡 용량을 갖는 CAR 변형 T 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 미토콘드리아 리포터 유전자가 내인성 유전자인, 방법.
  33. 청구항 31에 있어서, 상기 미토콘드리아 리포터 유전자가 외인성 유전자인, 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 외인성 유전자는 형광 리포터 단백질을 암호화하는, 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 형광 리포터 단백질은 미토콘드리아 국지화 서열을 포함하는, 방법.


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