ES2900151T3

ES2900151T3 - Un dispositivo de dos partes para la síntesis del receptor de linfocitos T0 e integración genómica estable en células presentadoras del TCR

Info

Publication number: ES2900151T3
Application number: ES17800760T
Authority: ES
Inventors: Reagan Micheal Jarvis; Ryan Edward Hill; Luke Benjamin Pase
Original assignee: Genovie AB
Current assignee: Genovie AB
Priority date: 2016-11-07
Filing date: 2017-11-07
Publication date: 2022-03-16
Anticipated expiration: 2037-11-07
Also published as: CN110023497A; CA3039420A1; KR102614328B1; AU2017352591A1; EP3535393A1; JP2019534048A; WO2018083318A1; EP3535393B1; US20190283017A1; CN110023497B; JP6803480B2; NZ752583A; US11274309B2; KR20190076995A; DK3535393T3

Abstract

Un dispositivo de dos partes, en donde una primera parte es un sistema de diseño por ingeniería genética y reconstitución del ORF del TCR (TORES) multicomponente, y una segunda parte es un sistema de células presentadoras de TCR diseñado por ingeniería genética (eTPCS) multicomponente, en donde el TORES comprende dos componentes separados, en donde el primer componente 1A es un vector que lleva segmentos génicos variables y constantes (V-C) del receptor de linfocitos T (TCR), y el segundo componente 1B es un vector que lleva segmentos génicos de unión (J) del TCR, y en donde la operación de un TORES proporciona uno o más vectores de integración genética, componentes 2C y/o 2E, codificando cada uno un ORF del TCR analito seleccionado de a. una cadena del TCR nativo b. una cadena del TCR diversificada por secuencia c. una cadena del TCR sintética y en donde la eTPCS comprende un primer componente eTPC, designado como componente 2A, en donde el componente 2A a. Carece de expresión endógena de las cadenas alfa, beta, delta y gamma del TCR, y b. Expresa proteínas CD3 que se presentan de forma condicionada en la superficie de la célula solo cuando la célula expresa un par complementario de cadenas del TCR y c. Contiene componentes adicionales designados como 2B y 2D, sitios del receptor genómico, cada uno para la integración de un único ORF que codifica una cadena de TCR analito de alfa, beta, delta o gamma, y en donde cada uno de los sitios del receptor genómico 2B y 2D se selecciona de a. Una construcción sintética diseñada para el intercambio de casete mediado por recombinasa (RMCE) b. Una construcción sintética diseñada para recombinación homóloga dirigida; y en donde los componentes 2C y 2E, se hacen coincidir con los componentes 2B y 2D, respectivamente, y en donde los componentes 2C y 2E están diseñados para suministrar un único ORF que codifica una cadena alfa, beta, delta y/o gamma del TCR analito, y en donde 2C y/o 2E codifican opcionalmente un marcador de selección de integración, de modo que las cadenas del TCR analito pueden expresarse como proteína de superficie del TCR en complejo con el CD3 (TCRsp) en el componente 2A.

Description

DESCRIPCIÓN

Un dispositivo de dos partes para la síntesis del receptor de linfocitos T0 e integración genómica estable en células presentadoras del TCR

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la medicina, diagnóstico, investigación y desarrollo. En particular, la invención se refiere a un dispositivo para identificar, caracterizar y diseñar receptores de linfocitos T (TCR) y a componentes para sistemas de inmunodiagnóstico analíticos y clínicos

Antecedentes de la invención

Hamana y col. (Biochem and Biophys. Res. Comm. 474(2016)709-714) describen un método para clonar receptores de linfocitos T funcionales específicos de antígeno a partir de un único linfocito T humano y de ratón.

Xi-Zhi y col. (Molecular Therapy - Methods and Clinical Development 3(2016)15054) describen la clonación, expresión y caracterización funcional de cadenas de receptores de linfocitos T alfa/beta y gamma/delta emparejadas a partir del análisis de una sola célula.

Yi Zhang y col. (PLOS Pathogens 6(2010)e1001018) describen que la transducción de linfocitos T humanos con un novedoso receptor de linfocitos T confiere reactividad anti-VHC.

Eiji Kobayashi y col. (Nature Medicine 19(2013)1542-1546) describen un sistema de clonación y expresión que produce y valida los TCR procedentes de linfocitos en sangre de pacientes con cáncer en un plazo de 10 días.

EP 2899269 describe un método para clonar receptores de linfocitos T.

Introducción a la invención

La vigilancia inmunitaria por linfocitos T (células T) es una función básica de la inmunidad adaptativa de todos los vertebrados provistos de mandíbulas. La vigilancia inmunitaria de los linfocitos T se logra a través de una rica diversidad funcional entre subtipos de linfocitos T, que sirve para eliminar células neoplásicas e infectadas por patógenos y coordinan respuestas inmunitarias adaptativas a patógenos invasores, microorganismos comensales, factores no propios comensales, tales como componentes moleculares de productos alimenticios e incluso mantener la autotolerancia inmunitaria. Para responder a diversos factores extraños y factores propios, los linfocitos T deben poder detectar específicamente constituyentes moleculares de estos factores extraños y factores propios. Por lo tanto, los linfocitos T deben poder detectar una parte importante de moléculas propias y extrañas con la que una persona se encuentre, con especificidad suficiente para desencadenar respuestas eficientes contra organismos patógenos y células propias enfermas, al tiempo que se evita desencadenar dichas respuestas contra células propias sanas. La naturaleza altamente compleja de esta tarea resulta evidente cuando se considera la diversidad prácticamente ilimitada de moléculas tanto extrañas como propias, y considerando que dichos organismos patógenos están bajo presión evolutiva para evadir la detección por parte de los linfocitos T.

Receptor de linfocitos T (TCR)

Los linfocitos T se definen principalmente por la expresión de un receptor de linfocitos T (TCR). El TCR es el componente del linfocito T que es responsable de interactuar con, y detectar, las dianas de la inmunidad adaptativa de los linfocitos T. En términos generales, el TCR se compone de un complejo proteico heterodimérico presentado en la superficie celular. Cada una de las dos cadenas del TCR se compone de dos dominios extracelulares, que son la región variable (V) y la región constante (C), perteneciendo ambas al dominio de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF), y formando láminas p antiparalelas. Estos están fijados a la membrana celular mediante un dominio transmembrana Tipo I, que incorpora una cola citoplásmica corta. La cualidad de los linfocitos T para adaptarse y detectar diversos constituyentes moleculares surge de la variación en las cadenas de TCR que se genera durante la génesis de los linfocitos T. Esta variación se genera por recombinación somática de forma similar a la génesis de anticuerpos en los linfocitos B.

Diversidad de cadenas del TCR

El grupo de linfocitos T consiste en varias subpoblaciones funcional y fenotípicamente heterogéneas. Sin embargo, los linfocitos T pueden clasificarse a grandes rasgos como ap o yS según la isoforma del TCR reordenado somáticamente que expresan en su superficie. Existen dos isoformas de pares de cadenas del TCR; pares del TCR alfa (TRA) y TCR beta (TRB); y pares TRC gamma (TRG) y TCR delta (TRD). Las linfocitos T que expresan pares TRA:TRB se denominan linfocitos T ap, mientras que los linfocitos T que expresan pares TRG:TRD se denominan frecuentemente linfocitos T y5.

Los TCR de ambas formas ap y yS son responsables del reconocimiento de diversos ligandos, o 'antígenos', y cada linfocito T genera cadenas del receptor ap o yS de novo durante la maduración de los linfocitos T. Estos pares de cadenas de novo del TCR logran diversidad de reconocimiento a través de la generación de diversidad de secuencias del receptor en un proceso denominado recombinación somática V(D)J por el cual cada linfocito T expresa copias de un único TCR reordenado de forma distinta. En los loci de TRA y t Rg , hay disponibles varios segmentos génicos variables (V) y funcionales (J) distintos para su recombinación y yuxtapuestos a segmentos génicos constantes (C), que por tanto se denomina recombinación VJ. La recombinación en los loci de TRB y TRD incluye de forma adicional un segmento génico de diversidad (D), y esto se denomina recombinación VDJ.

Cada TCR recombinado tiene potencial de especificidad para un único ligando, determinada por la estructura del sitio de unión al ligando formado por las cadenas a y p en el caso de los linfocitos T ap o por las cadenas y y S en el caso de los linfocitos T yS. La diversidad estructural de los TCR está limitada principalmente a tres bucles en horquilla cortos en cada cadena, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Tres CDR proceden de cada cadena del par de cadenas del receptor y, colectivamente, estos seis bucles CDR se asientan en el extremo distal a la membrana del dominio extracelular del TCR para formar el sitio de unión al antígeno.

La diversidad de secuencias de cada cadena del TCR se obtiene de dos formas. Primero, la selección aleatoria de segmentos génicos para recombinación proporciona diversidad inicial de secuencias. Por ejemplo, la recombinación de TRB se produce entre 47 segmentos génicos V únicos, 2 segmentos génicos D únicos y 13 segmentos génicos J únicos de la línea germinal. De forma general, el segmento génico V contribuye a los bucles CDR1 y CDR2 y, por lo tanto, están codificados por la línea germinal. El segundo modo para generar diversidad de secuencia se produce en los bucles CDR3 hipervariables, que se generan por deleción aleatoria de nucleótidos de patrón y adición de nucleótidos no del patrón en las uniones entre los segmentos génicos V, (D) y J recombinantes.

Complejo TCR:CD3

Los pares de cadenas ap y yS maduras del TCR se presentan en la superficie celular en un complejo con varias subunidades de CD3 auxiliares, denominadas £, y, S y Z Estas subunidades se asocian con los TCR ap o yS en forma de tres dímeros (ey, eS, Z). Este complejo TCR:CD3 forma la unidad para iniciar las respuestas de señalización celular después de la unión de un TCR ap o yS con el antígeno afín. Los CD3 auxiliares asociados como complejo TCR:CD3 aportan motivos de señalización denominados motivos de activación del inmunorreceptor basados en tirosina (ITAM). Cada uno de CD3e, CD3y y CD3S contribuye con una única ITAM mientras que el homodímero CD3 contiene 3 ITAM. Los tres dímeros de CD3 (ey, eS, Z) que se ensamblan con el TCR contribuyen, por lo tanto, con 10 ITAM. Tras la unión del TCR con su antígeno afín, la fosforilación de los restos de tirosina en tándem crea sitios de acoplamiento emparejados para proteínas que contienen dominios de homología Src 2 (SH2), tales como la esencial proteína asociada a la cadena Z de 70 kDa (ZAP-70). El reclutamiento de tales proteínas inicia la formación de complejos de señalización TCR:CD3 que en última instancia son responsables de la activación y diferenciación de los linfocitos T.

Linfocitos T ap

Los linfocitos T ap son generalmente más abundantes en los seres humanos que sus contrapartes los linfocitos T yS. La mayoría de los linfocitos T ap interactúan con antígenos peptídicos presentados por complejos en la superficie celular. Estos complejos se denominan complejos de histocompatibilidad mayor (MHC), codificados por la familia de genes del antígeno leucocitario humano (HLA): por simplicidad, tanto el gen como el MHC se denominarán colectivamente en la presente memoria HLA. Los linfocitos T que reconocen el péptido-HLA (pHLA) fueron los primeros en ser descritos y, con diferencia son los mejor caracterizados. También se han descrito formas menos frecuentes de linfocitos T ap. Al parecer, los linfocitos T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT) parecen tener una diversidad de cadena a y p relativamente limitada, y reconocen metabolitos bacterianos en vez de fragmentos de proteína. Los linfocitos T natural killer invariables (linfocitos T iNK) y los linfocitos T reactivos a micolilo codificados por la línea germinal (linfocitos T GEM) se limitan al reconocimiento de glicolípidos presentados de forma cruzada por moléculas no HLA. Se considera que los linfocitos T iNK interactúan en gran medida con glicolípidos presentados por CD1d mientras que los linfocitos T GEM interactúan con glicolípidos presentados por CD1b. Se cree que otras formas de linfocitos T interactúan con glicolípidos en el contexto de CD1a y CD1c; sin embargo, dichas células aún deben caracterizarse con un detalle significativo.

Linfocitos T ap convencionales

La característica clave de la mayoría de los linfocitos T ap es el reconocimiento de antígenos peptídicos en el contexto de moléculas HLA. Se denominan con frecuencia linfocitos T ap 'convencionales'. En un individuo, las moléculas propias de HLA presentan péptidos de proteínas propias y extrañas a los linfocitos T, proporcionando la base esencial de la inmunidad adaptativa contra neoplasias y patógenos extraños, tolerancia adaptativa hacia organismos comensales, alimentos y el propio organismo. El locus del HLA que codifica para las proteínas HLA es la región más polimórfica y densa en genes del genoma humano, y se han descrito más de 12.000 alelos en humanos. El elevado grado de polimorfismo en el locus del HLA asegura una diversidad de presentación de antígenos peptídicos entre individuos, que es importante para la inmunidad a nivel de población.

HLA de clase I y II

Existen dos formas de complejos clásicos de HLA: HLA de clase I (HLAI) y HLA de clase II (HLAII). Existen tres genes de HLAI clásicos: HLA-A, HLA-B, HLA-C. Estos genes codifican una cadena a que abarca la membrana, que se asocia con una cadena invariante de p2-microglobulina (p2M). La cadena a de HLAI se compone de tres dominios con un pliegue de inmunoglobulina: a1, a2 y a3. El dominio a3 es proximal a la membrana y en gran medida invariante, mientras que los dominios a1 y a2 forman juntos la hendidura de unión al antígeno distal a la membrana polimórfica. Existen seis genes de HLAII clásicos: HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, y HLA-DRB1. Estos genes codifican complejos DP, DQ y DR heterodiméricos de HLA que comprenden una cadena a y una cadena p. Cada cadena tiene dos dominios estructurales principales con un pliegue de inmunoglobulina, donde el dominio a2 y p2 comprende módulos proximales a la membrana y en gran medida invariantes similares a los del dominio a3 de HLAI. Los dominios a2 y p2 de HLAII forman juntos la hendidura de unión al antígeno distal a la membrana y son regiones de elevado polimorfismo.

La hendidura de unión al antígeno de HLAI y HLAII comprende dos hélices a antiparalelas sobre una plataforma de ocho láminas p antiparalelas. En esta hendidura, el antígeno peptídico se une y presenta en una conformación extendida. Los restos de contacto con péptidos en HLAI y HLAII son el lugar de la mayor parte del polimorfismo de secuencias, que constituye la base molecular de los diversos repertorios de péptidos presentados por distintos alelos de HLA. El péptido tiene un amplio contacto con la hendidura de unión al antígeno y, como resultado, cada alelo de HLA impone restricciones y preferencias de secuencia distintas sobre los péptidos presentados. Por lo tanto, un péptido dado se unirá únicamente a un número limitado de HLA y, a la inversa, cada alelo admite únicamente una fracción particular de la colección de péptidos de una proteína determinada. El conjunto de alelos de HLAI y HLAII que está presente en cada individuo se denomina haplotipo de HLA. El polimorfismo de los genes de HLAI y HLAII y la expresión codominante de alelos heredados dan lugar a una diversidad muy grande de haplotipos de HLA en la población humana, que cuando se une a la enorme diversidad de secuencias del TCR ap, supone un importante problema para la estandarización del análisis de estas interacciones HLA-antígeno-TCR.

Acoplamiento del TCR ap de HLAI y HLAII

El TCR ap reconoce péptidos como parte de una interfase de unión a pHLA mixta formada por restos tanto de1HLA como del antígeno peptídico (autoalterado). Los complejos de HLAI se presentan en la superficie de casi todas las células nucleadas y generalmente se considera que presentan péptidos derivados de proteínas endógenas. Por lo tanto, los linfocitos T pueden interrogar el proteoma celular endógeno de una célula presentadora de HLAI mediante el muestreo de los complejos de pHLAI de una célula interactuante. El acoplamiento de HLAI requiere la expresión del correceptor CD8 del TCR por el linfocito T interactuante; por lo tanto, el muestreo de HLAI está limitado a los linfocitos T CD8+ ap. Por el contrario, la presentación superficial de los complejos HLAII está restringida en gran medida al APC profesional y de forma general se considera que presentan péptidos derivados de proteínas exógenas a la célula presentadora. Por lo tanto, un linfocito T interactuante puede interrogar al proteoma del microambiente extracelular en el que reside la célula presentadora. El acoplamiento de HLAII requiere la expresión del correceptor CD4 del TCR por el linfocito T interactuante; por lo tanto, el muestreo de HLAII está limitado a los linfocitos T CD4+ ap.

Selección tímica del TCR ap

La función del TCR ap, como se ha descrito anteriormente, es la detección de complejos de pHLA, de forma que el linfocito T presentador de TCR pueda suscitar respuestas relacionadas con la función de dicho linfocito T para establecer inmunidad. Debe tenerse en cuenta que el repertorio de TCR ap generado dentro de un individuo debe dar cuenta de la inmensa e imprevista diversidad de todos los antígenos extraños que probablemente se encuentren en el contexto de un haplotipo específico y antes de su aparición real. Este resultado se logra en un entorno donde se generan numerosos TCR ap extremadamente diversos de una forma casi aleatoria con el potencial de reconocer complejos de pHLA no especificados al tiempo que solo se instruyen específicamente para evitar interacciones fuertes con los pHLA propios. Esto se coordina cuidadosamente durante la maduración de los linfocitos T en un proceso denominado selección tímica de los linfocitos.

Durante la primera etapa de maduración de linfocitos T en el timo, los linfocitos T que portan TCR ap que no pueden interactuar con complejos auto-pHLA con suficiente afinidad, son despojados de una señal de supervivencia y se eliminan. Esta etapa, denominada selección positiva, asegura que los linfocitos T supervivientes porten un repertorio de TCR que sea al menos potencialmente capaz de reconocer péptidos extraños o alterados presentados en el contexto correcto de HLA. Posteriormente, los TCR ap que interactúan fuertemente con pHLA propios y, por lo tanto, tienen el potencial de activar la autoinmunidad se eliminan activamente a través de un proceso de selección negativa. Esta combinación de selección positiva y negativa da lugar a que solo sean los linfocitos T los que solamente llevan TCR ap con baja afinidad por el pHLA propio que puebla la periferia. Esto establece un repertorio de linfocitos T ap que está autorrestringido pero que no es autorreactivo. Esta naturaleza altamente individualizada de la génesis de linfocitos T frente al haplotipo de HLA subraya las dificultades existentes en el análisis normalizado de las interacciones TCR ap-HLA. Además, forma la base tanto del rechazo de injertos como de la enfermedad de injerto contra hospedador, y del principio general de que los TCR ap identificados en un individuo pueden tener un efecto completamente diferente en un segundo individuo, lo que tiene claras implicaciones para estrategias terapéuticas y de diagnóstico basadas en TCR y basadas en linfocitos T que surgen en la práctica clínica.

Linfocitos T ap no convencionales

Las formas no restringidas por HLA, o 'no convencionales', de linfocitos T ap tienen dianas de antígeno molecular muy diferentes. Estos linfocitos T ap no convencionales no se acoplan a los complejos de HLA clásicos, sino que se acoplan a proteínas similares a HLA conservadas tales como la familia CD1 o MR1. La familia CD1 comprende cuatro formas implicadas en la presentación de antígenos cruzada (Cd1a, b, c y d). Estos complejos de superficie celular tienen una cadena a que se asemeja a HLAI, que forma heterodímeros con p2M. Un bolsillo hidrófobo pequeño presentado en la superficie distal de la membrana de la cadena a forma un sitio de unión para antígenos basados en lípidos derivados de patógenos. Linfocitos T innatos como los linfocitos NK (linfocitos T iNK) son el ejemplo mejor comprendido de reconocimiento de lípidos/familia CD1 siendo los linfocitos T GEM otro ejemplo destacado. Se sabe que los linfocitos T iNK 'Tipo I' interactúan fuertemente con el lípido a-GalCer en el contexto de Cd1d. Estos linfocitos T iNK muestran una diversidad de TCR muy limitada con una cadena a del TCR fija (Va10/Ja18) y un número limitado de cadenas p (con uso restringido de vp ) y se han asimilado a receptores de reconocimiento de patrones moleculares innatos asociados a patógenos (PAMPS) tales como los receptores similares a Toll y a Nod. Por el contrario, los linfocitos T NK 'Tipo II' presentan un repertorio de TCR más diverso, y parecen tener un modo más diverso de acoplamiento al complejo CD1dlípido. Las linfocitos T GEM reconocen los glicolípidos derivados de micobacterias presentados por CD1b, sin embargo, solo están empezando a comprenderse los detalles moleculares de la presentación de antígenos por CD1a, b y c así como su reconocimiento de linfocitos T.

Las células MAIT expresan principalmente una cadena a invariante del TCR (TRAV1-2 ligado a TRAJ33, TRAJ20 o TRAJ12), que puede emparejarse con una serie de cadenas p del TCR. En vez de péptidos o lípidos, los TCR MAIT pueden unirse a metabolitos del folato y de la riboflava derivados de patógenos presentados por la molécula análoga a HLAI, MR1. La diversidad limitada pero significativa en los TCR observados en los TCR MAIT parece permitir el reconocimiento de metabolitos diversos pero relacionados en el contexto del MR1 conservado.

No se entiende bien cómo se seleccionan en el timo los TCR de linfocitos T ap no clásicos restringidos por HLA durante la maduración. Sin embargo, parece probable que se siga aplicando el proceso fundamental de selección negativa y positiva descrito anteriormente y algunas pruebas sugieren que esto ocurre en nichos especializados dentro del timo.

Linfocitos T yS

A diferencia de la comprensión mecanística detallada de la génesis de los TCR ap y de la unión a pHLA, se sabe relativamente poco acerca de los antígenos diana y el contexto de sus contrapartes los linfocitos T yS. Esto se debe en parte a su abundancia relativamente baja en el compartimiento de linfocitos T circulantes. Sin embargo, se considera en general que los linfocitos T yS no están limitados estrictamente por HLA y parecen reconocer el antígeno de superficie más libremente, de forma similar a los anticuerpos. Se ha apreciado más recientemente que los linfocitos T yS pueden dominar el compartimiento de linfocitos T residente de tejidos epiteliales, el sitio de interacción principal del sistema inmunitario con el antígeno extraño. Además, están empezando a aparecer en la bibliografía diversos mecanismos de inmunovigilancia de tumores y de vigilancia de otras formas de células propias desreguladas para linfocitos T yS. Las dianas de antígeno específicas de los linfocitos T yS de Tipo tanto innato como adaptativo siguen estando poco definidas, pero la distribución en los tejidos y el reconocimiento rápido de los PAMP sugieren un papel fundamental de los linfocitos T yS tanto en la respuesta temprana a antígenos extraños como también temprano en la vida cuando el sistema inmunitario adaptativo aún está madurando.

Las diversas funciones de los linfocitos T yS parecen estar basadas en el uso de distintos segmentos génicos Vy VS, y pueden clasificarse a grandes rasgos en dos categorías principales en las que los linfocitos T yS con TCR en gran medida invariables median el reconocimiento similar al innato de los PAMP muy tempranamente en la infección. Además de los PAMP, se cree que este tipo de linfocitos T yS reconocen además moléculas propias, incluidos fosfoantígenos que podrían proporcionar señales muy tempranas de estrés celular, infección y desarrollo potencialmente neoplásico. El reconocimiento de los PAMP y los denominados patrones moleculares asociados a peligro (DAMPS), así como las grandes cantidades de linfocitos T yS similares a los innatos con restringidos a tejidos sugieren fuertemente que estos linfocitos son adecuados para responder rápidamente a la exposición de antígenos sin necesidad de activación, migración selectiva y expansión clonal previas.

Se considera que una segunda forma de linfocitos T yS son de naturaleza más adaptativa, con un repertorio de TCR yS muy diverso y la capacidad de circular periféricamente y de acceder a los tejidos linfoides directamente. Se han descrito dichos linfocitos T yS específicos de antígeno para patógenos humanos comunes tales como el CMV, y parecen constituir una respuesta con memoria. Sin embargo, también se ha observado que los linfocitos T YS muestran únicamente proliferación clonal relativamente limitada después de la activación y hay pocos datos disponibles sobre el grado de diversidad del TCR y las respuestas específicas de los linfocitos T yS en circulación periférica, o en tejidos. Además, aun cuando se considera de forma general que los TCR yS no interactúan con los complejos de pHLA y, por lo tanto, no se unen a los antígenos peptídicos en este contexto, solo se han caracterizado algunas dianas de antígeno de los linfocitos T yS y la comprensión del marco molecular subyacente es muy limitada.

La baja frecuencia de los linfocitos T yS periféricos y la dificultad para estudiar los linfocitos T residentes en tejidos de seres humanos han limitado nuestro conocimiento de cómo este tipo importante y diverso de linfocitos T participa en las respuestas inmunitarias adaptativas. Esta área emergente de investigación requeriría tecnologías más fiables con las que capturar y caracterizar linfocitos T yS poco frecuentes, aislar sus pares de TCR e identificar sus antígenos afines.

Antígenos y células presentadoras de antígeno

En el contexto de los linfocitos T y los TCR, los antígenos pueden definirse como cualquier molécula que puede unirse a un TCR dando lugar a una señal que se transduce dentro del linfocito T. Los antígenos de linfocitos T mejor caracterizados son péptidos presentados en un complejo con HLAI y HLAII y unidos a linfocitos T ap convencionales. Sin embargo, en los últimos años se ha hecho evidente que los linfocitos T ap no convencionales y los linfocitos T yS son capaces de unirse a una amplia variedad de biomoléculas como antígenos, incluidos lípidos, lipopéptidos, glicopéptidos, glicolípidos y a varios metabolitos y catabolitos. Además, se ha observado que los linfocitos T yS pueden unirse a proteínas completamente plegadas directamente de forma similar a los anticuerpos. Por lo tanto, el punto de vista de que los antígenos de linfocitos T se limitan en gran medida a péptidos presentados por HLA se ha ampliado en las dos últimas décadas para incluir casi cualquier biomolécula. Con este concepto en mente, es relevante definir qué puede considerarse una célula presentadora de antígeno (APC).

Como se ha definido en las secciones anteriores, HLAI y HLAII tienen perfiles de expresión dispares entre los diversos tipos de células. Se acepta ampliamente que casi todas las células nucleadas presentan complejos HLAI en la superficie celular y, por lo tanto, son competentes para presentar antígenos peptídicos para el muestreo de linfocitos T. Sin embargo, el HLAII tiene un perfil de expresión restringido, y al menos en condiciones de estado estacionario se expresa únicamente en la superficie de células que tienen una función especializada de presentación de antígenos, incluidas las células dendríticas (DC), macrófagos y linfocitos B. Estos tipos de células especializadas se denominan frecuentemente APC profesionales. Para los propósitos de este documento, el término APC se utiliza para describir cualquier célula nucleada con capacidad de presentar un antígeno para el muestreo de linfocitos T ap o yS. Tales antígenos no se limitan a los presentados como 'carga' en complejos presentadores de antígeno específicos, tales como HLA y moléculas similares a HLA, sino que también pueden incluir cualquier resto presentado en la superficie celular que pueda unirse a un linfocito con TCR ap o yS.

Uso terapéutico de los TCR

La transferencia adoptiva de linfocitos T primarias se ensayó primero en un entorno clínico a principios de la década de los 90 del siglo pasado, partiendo de linfocitos T expandidos ex vivo polarizados hacia antígenos víricos para conferir inmunidad viral en pacientes inmunocomprometidos. Se han ensayado enfoques similares utilizando linfocitos T primarios expandidos ex vivo contra antígenos específicos de cáncer poco después para el tratamiento de neoplasias malignas. Una limitación en estos enfoques tempranos que sigue constituyendo un desafío hoy día es no comprender la naturaleza y diversidad de linfocitos T enfrentados a la necesidad de optimizar finamente su composición en el producto terapéutico. Actualmente, el uso de linfocitos T primarios expandidos ex vivo ha sido abandonado en gran medida por la industria farmacéutica con excepción de unas pocas iniciativas que utilizan linfocitos T primarios con especificidad para antígenos víricos.

En los últimos años, la capacidad de introducir material genético de forma fiable en células humanas primarias ha sido testigo del surgimiento de una serie de agentes terapéuticos de linfocitos T experimentales genéticamente modificados. Dichos productos celulares terapéuticos tienen como propósito aprovechar la potencia de las respuestas de linfocitos T y redirigir la especificidad de los linfocitos T hacia un antígeno diana asociado a una enfermedad, por ejemplo, un antígeno expresado únicamente por células cancerosas. Estos han dependido en gran medida de la transferencia de un receptor de antígeno quimérico (CAR) a linfocitos T receptores, en vez de pares de cadenas del TCR reales. Un CAR representa un resto de direccionamiento (con mayor frecuencia, un elemento de anticuerpo monocatenario dirigido a una proteína expresada en la superficie de células cancerosas) injertada en elementos receptores de señal tales como la cadena Z del complejo CD3, para producir un receptor quimérico sintético que imita la función del CD3-TCR. Estos denominados productos de linfocitos T CAR (CAR-T) han tenido un éxito mixto en ensayos clínicos hasta la fecha y a pesar de su potencial no es fácil de llevarlos más allá de tumores con dianas moleculares únicas inherentes tales como neoplasias malignas de linfocitos B. De forma alternativa, la transferencia del par de cadenas de TCR de longitud completa a los linfocitos T presenta un interés creciente. Actualmente, dichos agentes terapéuticos de linfocitos T con TCR manipulado genéticamente están limitados por procesos de fabricación complicados y, como sucede con los productos CAR-T, por una escasez de antígenos diana y de construcciones de direccionamiento validadas. Hasta la fecha se ha centrado en el uso de los TCR ap para el reconocimiento de antígenos peptídicos presentados por HLAI en células cancerosas, y un desafío fundamental de este enfoque es la necesidad de que los antígenos sean específicos de células cancerosas.

Se ha considerado que dado que la interacción TCR-pHLA tiene afinidad relativamente baja, es probable que los TCR nativos sean subóptimos para terapias de linfocitos T con TCR manipulados genéticamente. Se han diseñado varios enfoques para TCR madurados por afinidad in vitro, de forma muy parecida a la maduración por afinidad de anticuerpos monocatenarios. Estos enfoques de maduración por afinidad de los TCR también utilizan de forma general formatos monocatenarios, en donde la región V de una cadena se fusiona a la región V de otra cadena para producir una construcción polipeptídica única. Dichos polipéptidos únicos pueden utilizarse después en sistemas de presentación en fagos o levaduras adaptados a partir de flujos de trabajo de ingeniería de anticuerpos y pasados por rondas de selección basadas en la unión a la diana. Existen dos limitaciones inherentes en dicho enfoque del TCR monocatenario en términos de producir pares funcionales de cadenas del TCR. En primer lugar, la selección se basa en la afinidad de unión a la diana. Sin embargo, se ha documentado bien que la afinidad del TCR no siempre está correlacionada con la intensidad o la competencia de la salida de señalización del TCR. En segundo lugar, la selección de construcciones monocatenarias basada en afinidad no siempre se traduce en afinidades equivalentes una vez que se reconstituyen como receptores de longitud completa.

En un contexto terapéutico, existe una limitación adicional y fundamental en los pares del TCR madurados por afinidad. Es decir, considerando que sus secuencias se han alterado, las construcciones resultantes por definición ya no están sometidas a selección tímica, en donde los TCR que reaccionan fuertemente con los antígenos propios se eliminan del repertorio. Por lo tanto, estos TCR modificados conllevan el riesgo inherente de ser autorreactivos, lo que es muy difícil de descartar in vitro utilizando los métodos actuales. Por la misma razón, debe individualizarse cualquier TCR seleccionado o diseñado genéticamente para la aplicación terapéutica. Si los TCR son TCR modificados artificialmente o TCR nativos aplicados entre individuos, deben descartarse las reactividades cruzadas sobre la base del haplotipo de HLA y el repertorio de péptidos presentado de cada individuo específico para evitar una autoinmunidad potencialmente letal. Esto se debe al hecho de que la selección tímica se hace en un fondo de todas las moléculas HLA disponibles específicas únicamente para dicho individuo dado. La probabilidad de dicha reactividad cruzada no está clara. Sin embargo, la capacidad de nuestro repertorio de TCR para reconocer los complejos de pHLA de otros individuos de la misma especie como extraños es una propiedad fundamental de la inmunidad adaptativa y es la base del rechazo a los injertos y de la enfermedad de injerto contra hospedador. Ensayos clínicos recientes que utilizan un par de cadenas de TCR maduradas frente al antígeno asociado a melanoma específico de cáncer (MAGE) señalaban el problema potencial de evitar la selección tímica. Cuando los linfocitos T autólogos que contenían los TCR madurados se volvieron a infundieron a dos pacientes con cáncer, estos pacientes desarrollaron rápidamente una cardiopatía mortal. Estudios posteriores determinaron que los TCR madurados específicos de MAGE tuvieron reactividad cruzada con un péptido presentado por HLAI de la proteína cardíaca titina. Esto sugiere fuertemente que la reactividad cruzada es una posibilidad clara en el uso terapéutico de los TCR.

Una forma distinta de utilizar los TCR con fines terapéuticos es su uso como reactivos de afinidad de una forma muy parecida a las sustancias terapéuticas de anticuerpos. Se han utilizado moléculas del TCR monocatenario en ensayos clínicos para administrar sustancias de fármacos conjugados a poblaciones celulares que expresan antígenos específicos de HLA. Este enfoque se considera en general más seguro que los agentes terapéuticos de linfocitos T CAR o con TCR manipulados, ya que la administración de la sustancia farmacológica puede simplemente retirarse. Sin embargo, el potencial de reactividad cruzada y los efectos no buscados que son difíciles de prever siguen suponiendo una limitación potencial en este escenario.

Detección del repertorio de TCR en el diagnóstico clínico

En un aspecto relacionado, existe un creciente interés en utilizar la detección de la abundancia de secuencias específicas del TCR con fines de diagnóstico clínico. Con el aumento de los métodos de secuenciación profunda en particular, es posible capturar de forma global toda la diversidad del TCR en un individuo y de pares ap coincidentes en contextos específicos. Esto supone potencialmente un medio para diagnosticar dolencias y patologías específicas simplemente detectando la abundancia de clones de linfocitos T expandidos, como lectura indirecta de la respuesta inmunitaria establecida contra un antígeno asociado a enfermedad en el paciente. Sin embargo, dichos enfoques globales están limitados actualmente a respuestas inmunitarias muy intensas con puntos temporales clínicos establecidos y presentan la dificultad subyacente de identificar el antígeno diana específico de cualquier TCR particular identificado mediante secuenciación.

Uso terapéutico y de diagnóstico de antígenos de linfocitos T

El punto fuerte fundamental de aprovechar las respuestas inmunitarias adaptativas se traduce en un desafío técnico fundamental ya que la exquisita especificidad de la interacción TCR-antígeno requiere un conocimiento detallado de los antígenos asociados específicamente a cada patógeno, célula cancerosa o enfermedad autoinmune. Además, cada antígeno puede presentarse mediante un complejo presentador de antígeno específico, o alelo del mismo, de forma que el descubrimiento del antígeno debe hacerse para cada gen HLA y alelo correspondientes. Para varias enfermedades infecciosas como el VIH, la gripe y el CMV que están asociadas con respuestas inmunitarias adaptativas fuertes y que muestran generalmente jerarquías de respuesta de epítopos conservadas, se han cartografiado los epítopos más importantes en el contexto de algunos HLA comunes. De forma similar, se han hecho esfuerzos crecientes y sistemáticos en los campos del cáncer, de la alergia y de la autoinmunidad para mapear los antígenos asociados a linfocitos T. Sin embargo, son procedimientos complicados y los esfuerzos para describir de forma sistemática los antígenos de linfocitos T asociados a distintos contextos clínicos se ven obstaculizados por la ausencia de protocolos eficientes, sólidos, rápidos y escalables.

Específicamente, las células cancerosas suponen un aspecto importante y difícil, ya que la mayoría de los péptidos presentados en la superficie de las células cancerosas son antígenos propios o muy similares a los propios. Por lo tanto, la selección tímica habrá eliminado los TCR que podrían reconocer fuertemente estos péptidos, al tiempo que el tumor evoluciona para evadir el reconocimiento inmunitario. Esto significa que las respuestas inmunitarias potentes contra tumores establecidos son relativamente poco frecuentes y dianas difíciles de predecir o descubrir. Sin embargo, estas respuestas existen y, lo que es importante, se asocian generalmente con un mejor resultado. En la mayoría de casos, los antígenos asociados a tumores (TAA) tendrán características distintivas de los antígenos propios y se derivarán de proteínas que se sobreexpresan durante el desarrollo del cáncer, que de lo contrario estarían ausentes del tipo celular en esta etapa del desarrollo o alteradas específicamente por mutación genética o modificaciones postraduccionales tales como la fosforilación.

Cuando está disponible, el conocimiento de dichos epítopos permite interrogar la respuesta de los linfocitos T asociados para realizar descubrimientos fundamentales, con fines de diagnóstico y, por ejemplo, como una prueba de eficacia de una vacuna. Es importante destacar que también proporcionan dianas muy específicas para la tolerización de linfocitos T en alergia y autoinmunidad y, de forma crucial, apuntan a dianas valiosas para inmunoterapia específica y contra células cancerosas. Las neoplasias representan una diana especialmente valiosa ya que la promesa de inmunoterapias celulares y el progreso en las manipulaciones de linfocitos T se ven ralentizadas por una falta de TAA diana validadas más allá de los pocos casos donde se dispone de marcadores específicos para el tipo de cáncer. A la vista del potencial de la terapia celular y de la falta de dianas validadas, la identificación de antígenos de TCR prometedores sigue siendo uno de los cuellos de botella más acuciantes de la inmunoterapia basada en TCR, especialmente en el esfuerzo para tratar el cáncer.

Aspectos tecnológicos de los análisis de TCR y antígenos de linfocitos T

En general, el desarrollo de terapias basadas en TCR sigue estando en sus primeras etapas y el éxito ha sido limitado. Los enfoques de diagnóstico, si bien tienen un inmenso potencial, rara vez se han aplicado en estudios clínicos controlados que pretendan evaluar patologías o respuestas a terapia en pacientes. Unas técnicas no suficientemente desarrolladas para la captura fiable de pares de cadenas del TCR nativas y el análisis sistemático estandarizado de interacciones TCR-antígeno con elevado rendimiento y en un contexto funcional de comunicación intercelular, ha sido el principal obstáculo para el desarrollo de terapias y diagnósticos basados en TCR.

Los enfoques de secuenciación profunda han llevado a una mejor comprensión de la diversidad de los receptores de los linfocitos T en la salud y en la enfermedad. Sin embargo, estos enfoques se han centrado generalmente en tramos cortos que abarcan las regiones CDR3, principalmente de la cadena p del TCR. La mayoría de los estudios han ignorado la contribución de la cadena a del TCR, y pocos han buscado analizar las cadenas ap emparejadas así como la especificidad de antígeno de los TCR considerados de interés. Los flujos de trabajo recientes utilizando encapsulación de células únicas y codificación genética ha permitido el emparejamiento de pares de cadenas ap o yS del TCR nativo y el análisis de secuencias de longitud completa; sin embargo, dichos flujos de trabajo siguen siendo experimentales.

Los pares de cadenas del TCR aislados pueden analizarse en términos de especificidad de antígeno en modos biofísico o funcional. El análisis biofísico requiere la producción recombinante tanto del TCR como del antígeno analito en forma soluble. En el caso de los TCR restringidos al HLA, esto requeriría por lo tanto la generación de todos los TCR individuales así como de los complejos pHLA afines. Esto supone un desafío técnico muy considerable, es lento y con muy bajo rendimiento. Además, dicho análisis solo proporcionaría afinidades de interacción, que no están bien correlacionadas con características funcionales de formas predecibles.

Hasta hace poco, el análisis funcional detallado de secuencias del TCR aisladas en un contexto celular se ha limitado a laboriosos protocolos de transfección de pares de cadenas del TCR analito a linfocitos T primarios o a líneas de linfocitos T inmortales, y la detección de respuestas celulares mediante análisis por citometría de flujo tradicional de la activación celular, o detección de factores secretados desde células transfectadas en la exposición con antígeno. En una publicación reciente de Guo y col., se comunicó la clonación rápida, expresión y caracterización funcional de cadenas de TCR emparejadas procedentes de células individuales (Molecular Therapy - Methods and clinical development (2016) 3: 15054). En este estudio, se expresaron parejas de analitos de TCR ap humanos en una línea celular indicadora que carecía de expresión de TCR ap, y que contenía un sistema indicador de proteína fluorescente verde (GFP) unido al promotor Nur77 que se activa en la estimulación del TCR. Este sistema sigue siendo ineficiente debido a la falta de integración estandarizada del TCR en el genoma de la línea celular indicadora, y no proporciona una forma sistemática para la exposición con antígeno unido a células por un elemento APC.

De forma similar a los flujos de trabajo para identificar los TCR contra antígenos de linfocitos T conocidos, el descubrimiento de novo de antígenos de linfocitos T novedosos para la salud y la enfermedad sigue suponiendo un desafío considerable. La mayoría de los enfoques siguen siendo de naturaleza biofísica, y tienen como propósito producir antígenos candidatos que puedan ensayarse en protocolos de inmunización, o a través de la identificación de TCR afines como se ha tratado anteriormente. Existe poca o ninguna estandarización en el campo del descubrimiento de antígenos de linfocitos T, y el campo está restringido en gran medida al estudio académico.

Aun con el interés creciente en los TCR y su antígeno afín para uso tanto terapéutico como diagnóstico, y con la aparición de medios para capturar cantidades significativas de pares de cadenas ap y y5 nativas, todavía se carece de tecnologías fiables de alto rendimiento y estandarizadas para el análisis sistemático de interacciones TCR-antígeno. Debe señalarse que existe una falta de sistemas estandarizados para el análisis funcional de pares de cadenas de TCR en el contexto nativo de la comunicación celular en donde tanto el TCR como el antígeno son presentados por una célula viable. Además, existe una falta de sistemas que puedan lograr la selección de candidatos de TCR, y/o la maduración por afinidad/funcional de pares de cadenas de TCR, en el contexto relevante de la comunicación intercelular.

Como se describe, existe actualmente una falta de tecnologías estandarizadas para la generación y expresión de cadenas de TCR de alto rendimiento, así como para su expresión en un contexto celular nativo. Es muy deseable disponer de un sistema en el cual puedan generarse rápidamente TCR de longitud completa, e insertarse como copias únicas en el genoma de una célula presentadora de TCR de forma que dichos TCR se presenten en un complejo en la superficie de células CD3 nativas para su análisis. Un par de TCR presentado en el complejo CD3 asegura que el análisis de afinidad refleje la composición real del TCR nativo, lo que no es el caso para el TCR monocatenario ni para otras tecnología de expresión de TCR no nativo. Además, la presentación de los pares del TCR en un complejo CD3 es un requisito absoluto para el análisis funcional de pares de TCR. El análisis funcional, que significa el análisis de la producción de señalización del TCR, es de importancia crítica en los flujos de trabajo diseñados por ingeniería del TCR, donde la producción de señalización es el parámetro que de forma general tiene la mayor importancia para el uso terapéutico, y no está bien correlacionado con la afinidad de un TCR con antígeno afín/HLA.

Descripción detallada de la invención

La presente invención aborda las necesidades anteriormente mencionadas.

La presente invención se refiere a la construcción, ensamblado y uso de un dispositivo de dos partes para la síntesis rápida de los marcos de lectura abiertos (ORF) del receptor de linfocitos T (TCR) nativos y diversificados por secuencia, y la integración de estos ORF del TCR en el genoma de células presentadoras de TCR. Debido al elevado grado de diversidad generado en el proceso natural de génesis del TCR mediante recombinación somática, es difícil proporcionar marcos de lectura abiertos (ORF) del TCR dentro de construcciones genéticas con alto rendimiento y rentable para someter a ensayo y manipular la función del TCR. La primera parte de la presente invención proporciona un sistema de genoteca de vectores bicomponente preensamblados que consiste en vectores de entrada variable-constante (entrada V-C) y vectores donantes de unión (donante J) que comprenden partes de segmentos génicos del TCR. El sistema bicomponente se diseña de modo que cuando un vector de entrada V-C seleccionado de la genoteca de vectores de entrada V-C se combina con un vector donante J seleccionado de la genoteca de vectores donantes J, junto con un dúplex de oligonucleótidos de ADN sintético que codifica la región determinante de la complementariedad del TCR 3 (odeCDR3) en una reacción de ciclo de digestión con enzima de restricción/ligasa, se crea un único vector que reconstituye el ORF del TCR de longitud completa. Dicho sistema de genoteca de vectores permite métodos independientes de la PCR para la generación rápida y económica de los ORF del TCR en un contexto de vectores seleccionados. Además, este sistema permite nuevos flujos de trabajo para generar secuencias sintéticas del TCR para los flujos de trabajo de maduración por afinidad y/o funcional. Este sistema de reconstitución y ingeniería genética del ORF del TCR (TORES) es, por lo tanto, una herramienta potente para el análisis funcional y el diseño del TCR, cuando se combina con la segunda parte de la presente invención, que representa una célula presentadora de TCR (eTPC) de diseño. Estas células eTPC contienen un par de sitios sintéticos del receptor genómico que se emparejan con los vectores que codifica TCR de TORES. Por lo tanto, los ORF del TCR generados dentro de TORES se someten directamente a integración en el genoma de una eTPC, de modo que la eTPC puede utilizarse para la generación rápida y con alto rendimiento de células derivadas estables que presentan pares de TCR (eTPC-t) para diversos fines analíticos. Es importante destacar que la eTPC expresa constitutivamente todos los componentes del complejo CD3, pero carece de la expresión endógena de las cadenas alfa, beta, gamma y delta del TCR. En general, este dispositivo de dos partes puede utilizarse para generar rápidamente eTPC-t como componentes centrales para sistemas de inmunodiagnóstico analítico y clínico. Además, la presente invención se refiere al uso del dispositivo de dos partes para identificar, caracterizar y diseñar los TCR para diagnóstico, medicina, investigación y desarrollo.

La presente invención proporciona un dispositivo de dos partes, en donde una primera parte es un sistema de ingeniería y reconstitución del ORF del TCR (TORES) multicomponente, y una segunda parte es un sistema multicomponente de células presentadoras de TCR diseñado (eTPCS), en donde el TORES comprende dos componentes separados, en donde el primer componente 1A es un vector que lleva segmentos génicos variables y constantes (V-C) del receptor de linfocitos T (TCR), y el segundo componente 1B es un vector que lleva segmentos génicos de unión (J) del TCR, y en donde la acción de un TORES proporciona uno o más vectores de integración genética, cofdificando cada uno de los componentes 2C y/o 2E, un ORF del TCR analito seleccionado de

a. una cadena del TCR nativo

b. una cadena del TCR diversificada por secuencia

c. una cadena del TCR sintética

y en donde la eTPCS comprende un primer componente eTPC, designado como componente 2A, en donde el componente 2A

a. Carece de expresión endógena de las cadenas alfa, beta, delta y gamma del TCR, y

b. Expresa proteínas CD3 que se presentan de forma condicionada en la superficie de la célula solo cuando la célula expresa un par complementario de cadenas del TCR y

c. Contiene componentes adicionales designados como 2B y 2D, sitios del receptor genómico, cada uno para la integración de un único ORF que codifica una cadena de TCR analito de alfa, beta, delta o gamma,

y en donde cada uno de los sitios del receptor genómico 2B y 2D se selecciona de

a. Una construcción sintética diseñada para el intercambio de casete mediado por recombinasa (RMCE)

b. Una construcción sintética diseñada para recombinación homóloga dirigida al sitio;

y en donde los componentes 2C y 2E se hacen coincidir con los componentes 2B y 2D, respectivamente, y en donde los componentes 2C y 2E están diseñados para proporcionar un único ORF que codifica una cadena alfa, beta, Delta y/o gamma del TCR analito, y en donde 2C y/o 2E codifican opcionalmente un marcador de selección de integración, de modo que las cadenas del TCR analito pueden expresarse como proteína de superficie del TCR en complejo con el CD3 (TCRsp) en el componente 2A.

Este dispositivo de dos partes es adecuado para la reconstitución genética y/o diversificación de secuencia de los ORF del TCR, y posteriormente la inserción de estos ORF en células presentadoras de TCR diseñadas (eTPC) para el análisis y/o selección funcional. Tal dispositivo es adecuado para obtener pares de cadenas nativas y/o diversificadas por secuencia que pueden analizarse y seleccionarse rápidamente en el contexto de la superficie celular nativa de un complejo CD3.

La primera parte del dispositivo de dos partes contiene un sistema de vectores bicomponente que comprende genotecas preensambladas de vectores que contienen secuencias variables (V), de unión (J) y constantes (C) para cadenas de TCR. El primer componente del sistema comprende un vector de entrada V-C que contiene secuencias V y C (componente 1A). El segundo componente del sistema comprende un vector donante J que contiene la secuencia J (componente 1B). El sistema de vectores bicomponente está preensamblado en genotecas de vectores de entrada V-C y vectores donantes J con todas las combinaciones de secuencias V-C y secuencias J deseables, respectivamente. El sistema de vectores bicomponente se diseña de modo que un único vector de entrada V-C y un único vector donante J con las secuencias deseadas pueden combinarse con un tercer componente, un dúplex corto de oligonucleótidos de ADN que codifica una secuencia CDR3 (odeCDR3) (componente 1C) para reconstituir un ORF del TCR de longitud completa in vitro, en una reacción en un único tubo de ensayo, dependiente de una enzima de restricción y una ligasa e independiente de PCR. Este sistema tricomponente de reconstitución e ingeniería del ORF del TCR (TORES) es idealmente adecuado para generar rápidamente grandes genotecas de ORF de TCR nativos, diversificados por secuencia o sintéticos, para flujos de trabajo de maduración por afinidad o funcional.

La primera parte de la presente invención, definida como TORES, se resume en la Figura 1, Parte 1. Un vector de entrada V-C seleccionado que contiene los segmentos génicos V y C del TCR necesarios para un ORF del TCR de longitud completa diana se combina con un vector donante J que contiene el segmento génico J del TCR necesario. El ORF del TCR de longitud completa se completa mediante la adición de un odeCDR3 que representa la secuencia no perteneciente a la línea germinal generada durante la recombinación V(D)J e interpuesta por la secuencia de V y J fija codificada por la línea germinal codificada por el vector de entrada V-C y el vector donante J, respectivamente. El sistema de vectores bicomponente y el tercer componente de odeCDR3 se diseñan de forma que, cuando se combinan en una reacción de enzima de restricción y de ligasa, se reconstituye el ORF del TCR deseado completo V-CDR3-J-C. Por lo tanto, esta primera parte del dispositivo de dos partes se utiliza para ensamblar los ORF de TCR en contextos de vectores específicos, de modo que estos vectores que codifican el TCR representan vectores de integración para el funcionamiento de la segunda parte del dispositivo de dos partes.

La segunda parte del dispositivo de dos partes comprende un sistema celular multicomponente diseñado definido como un sistema diseñado de células que presentan el receptor de linfocitos T (eTPCS). El sistema multicomponente, que comprende al menos tres componentes, se resume en la Figura 1, Parte 2. En primer lugar, una célula presentadora de TCR diseñada (eTPC) (componente 2A), en segundo lugar que contiene un par de sitios diseñados del receptor genómico (componente 2B y 2D). En tercer lugar, vectores de integración genética que codifican TCR derivados de la primera parte, TORES, del dispositivo de dos partes, que coinciden con los sitios del receptor genómico contenidos dentro de la eTPC (componentes 2C y 2E). El sitio del receptor genómico coincidente y el vector de integración (denominado par de integración) se utilizan para la integración rápida y estable del material genético que codifica pares de TCR. La eTPC puede incluir también un cuarto componente opcional, un elemento de respuesta a la estimulación del TCR (componente 2F), para la detección y caracterización in vitro de la respuesta de señalización del TCR.

En una realización, el dispositivo de dos partes comprende uno o más vectores de integración genética, los componentes 2C y/o 2E, que se utilizan como entrada en la segunda parte del dispositivo de dos partes.

En otra realización, el dispositivo de dos partes, eTPCS proporciona una o más eTPC analito en la que se presentan una o más cadenas del TCR analito derivadas del TORES, y la una o más eTPC analito se seleccionan de

a. Una eTPC que expresa un par del TCR (eTPC-t) y/o

b. Una eTPC que expresa una cadena del TCR (eTPC-x) y/o

c. una o más genotecas de las mismas.

En otra realización, el dispositivo de dos partes, un par de cadenas de TCR analito se expresan como proteínas de superficie del TCR en complejo con CD3 (TCRsp) por una eTPC analito.

El dispositivo de dos partes puede utilizarse para obtener ORF de TCR nativos o diversificados por secuencia en un contexto específico de vector de integración, o genotecas de los mismos y, mediante la combinación de estos vectores de integración con una eTPC coincidente, obtener una eTPC analito que expresa un único par de TCR (eTPC-t), o genoteca de los mismos.

La presente invención se utiliza para la generación rápida con alto rendimiento de células analito derivadas estables que presentan pares de TCR de longitud completa (eTPC-t). Este dispositivo de dos partes se adapta bien para generar entradas celulares centradas en el TCR para un sistema analítico que puede utilizarse directamente en centros de investigación y procedimientos de inmunodiagnóstico clínico. Por lo tanto, el dispositivo de dos partes se emplea de forma general para obtener ORF de TCR y preparar posteriormente una o más eTPC-t analito. A continuación, estas eTPC-t analito se combinan con uno o más antígenos analito (colectivamente, el sistema eTPC:antígeno, eTPC:A) para obtener una o más productos (Figura 24). El antígeno analito se proporciona mediante células presentadoras de antígeno analito (APC) y/o como antígeno analito soluble o inmovilizado y/o presentado en partículas no basadas en células (NCBP).

La presente invención proporciona un dispositivo de dos partes estandarizado, flexible y sistematizable para generar ORF de TCR (TORES) y líneas celulares diseñadas que expresan de forma estable pares del TCR en la superficie celular (eTPCS). Pueden presentarse pares de ORF del TCR únicos con células diseñadas dentro del dispositivo de dos partes, para análisis detallados, al igual que las genotecas de ORF del TCR. La generación de genotecas de células presentadoras de TCR nativas o diversificadas por secuencia puede utilizarse con fines analíticos o de cribado para identificar o diseñar nuevas especificidades del TCR o identificar un antígeno afín para pares de TCR particulares. La estandarización, algo fundamental para la presente invención, es una mejora significativa respecto de las metodologías existentes en términos de aumento de la reproducibilidad, disminución de los tiempos de ciclo de producción y, por lo tanto, disminución de los costes de generación de dicho material de analito. Esta estandarización se logra a través de subsistemas sólidos de vector de integración/sitio del receptor genómico que permiten la integración fiable del ORF con número de copias controlado en una ubicación genómica controlada; una mejora significativa con respecto a los anteriores enfoques víricos e integrativos aleatorios para lograr células presentadoras de TCR similares.

TORES: primera parte del dispositivo de dos partes

La primera parte del dispositivo de dos partes se denota como TORES, que comprende un sistema de vectores bicomponente ensamblado en una genoteca que contiene todos los segmentos génicos V, C y J necesarios para la reconstitución de los ORF del TCR diana (Figura 1, Parte 1). Por ejemplo, puede construirse una genoteca que contenga todos los segmentos génicos que codifican las secuencias de los loci TRA y TRB humanos como se describe en el Ejemplo 1.

Es suficiente reconstituir un ORF del TCR de longitud completa con el TORES, utilizando información de secuencia que define el uso de segmentos génicos V, J y C del TCR diana junto con la secuencia de CDR3 no perteneciente a la línea germinal. A partir de esta información, primero se seleccionan el vector de entrada V-C y el vector donante J que corresponden al uso de V/C y J del ORF del TCR diana. También se genera una odeCDR3, que representa un tercer componente de la primera partes, que corresponde a la secuencia de CDR3 no perteneciente a la línea germinal necesaria para completar el ORF del TCR de longitud completa. Los tres componentes se combinan con una enzima de restricción de Tipo IIS y una enzima ADN ligasa en una reacción para generar el ORF del TCR de longitud completa diana y los subproductos, como se describe en la Figura 2. El TCR de longitud completa reconstituido resultante está contenido dentro de la cadena principal del vector de entrada V-C, por lo tanto contiene todas las características del vector contenidas dentro de esta construcción parental.

La acción de la enzima de restricción de Tipo IIS de los tres componentes combinados (Figura 2 b, c) en una reacción con enzima de restricción/ligasa da lugar a dos subproductos de reacción y a dos productos intermedios de reacción. El subproducto de reacción derivado del vector de entrada V-C es el marcador de selección nativo escindido y los sitios de unión de Tipo IIS (Figura 2d). La cadena principal del vector donante J de la cual se ha escindido la parte del segmento J representa un segundo subproducto de reacción (Figura 2e). La parte de segmento J escindida del vector donante J representa un producto de reacción intermedio, y contiene tanto una parte de segmento J, una parte C pequeña del segmento C, como salientes monocatenarios necesarios para la ligación (Figura 2f). El segundo intermedio de reacción es la cadena principal de entrada V-C parental que contiene los segmentos V y C, y salientes monocatenarios necesarios para la ligación (Figura 2g). El producto final de la reacción representa un ORF del TCR de longitud completa reconstituido dentro de la cadena principal del vector de entrada V-C parental, que comprende la ligación de odeCDR3 (Figura 2c), la parte escindida del segmento J (Figura 2f) y la cadena principal de entrada V-C que contiene los segmentos génicos V y C (Figura 2g).

Componentes del vector de entrada V-C y del vector donante J de la primera parte

En una realización, la primera parte del dispositivo de dos partes incluye uno o más vectores de entrada V-C (componente 1A) que contiene

a. origen de replicación,

b. un primer marcador de selección positiva,

c. elemento o elementos genéticos 5',

d. secuencia de Kozak,

e. segmento génico variable del TCR,

f. una primera secuencia de Tipo IIS, para el reconocimiento y escisión específicos de sitio mediante una enzima de restricción de Tipo IIS,

g. un marcador de selección negativa,

h. una segunda secuencia de Tipo IIS

i. segmento génico constante del TCR, y

j. elemento o elementos genéticos 3'.

a) y b) se utilizan para la propagación y selección tanto del vector de entrada V-C parental como del vector que contiene el OCR del TCR reconstituido en un hospedador bacteriano; c) y j) se utilizan para definir el modo de integración de un sitio del receptor genómico integrado (componente 2B o 2D) de la segunda parte del dispositivo de dos partes, y cualesquiera rasgos adicionales necesarios para la aplicación posterior; d) asegura el inicio eficiente de la traducción en células eucariotas; e) representa el segmento génico variable (V) procedente del codón de iniciación hasta un motivo en el extremo 5' de la región CDR3 conservada en todos los segmentos V de un sistema de vectores bicomponente determinado; f) representa una secuencia de reconocimiento de Tipo IIS que dirige el corte de una enzima de restricción de Tipo IIS en dirección 5' para crear un saliente monocatenario estandarizado en el extremo 3' del segmento génico V; g) representa un marcador de selección negativa para eliminar el vector de entrada V-C parental durante el funcionamiento del sistema para reconstituir un ORF del TCR de longitud completa; h) representa una secuencia de reconocimiento de Tipo IIS que dirige el corte de una enzima de restricción de Tipo IIS en la dirección 3' dirección para crear un saliente monocatenario estandarizado en el extremo 5' del segmento génico C; i) representa el segmento génico C procedente de un motivo en el extremo 5' del segmento génico C conservado en todos los segmentos C, o una parte del segmento génico C que carece de una parte del extremo 5' del segmento génico C en un sistema vectorial bicomponente dado, y que define el límite con el segmento J (véase la Figura 2a).

En una realización, la primera parte del dispositivo de dos partes comprende un componente designado como 1B, incluye uno o más vectores donantes J que contienen

a. origen de replicación,

b. un segundo marcador de selección positiva,

c. una segunda secuencia de Tipo IIS,

d. segmento génico de unión al TCR,

e. una parte C, que corresponde a una pequeña parte 5' de un segmento génico constante, y

c. una cuarta secuencia de Tipo IIS.

a) y b) se utilizan para propagación y selección del vector donante J; c) representa una secuencia de reconocimiento de Tipo IIS que dirige el corte de una enzima de restricción de Tipo IIS en la dirección 3' y para crear un saliente monocatenario estandarizado en el extremo 5' del segmento génico J; d) representa el segmento génico de unión (J) que comienza en un motivo 5' que define el borde 3' de la región CDR3 conservada para la totalidad de segmentos J en un sistema de vectores bicomponente dado, a una secuencia 3' que incorpora la parte C, que representa una parte 5' del segmento C codificado por uno o más vectores de entrada V-C contenidos dentro del sistema bicomponente; f) representa una secuencia de reconocimiento de Tipo IIS que dirige el corte de una enzima de restricción de Tipo IIS en la dirección 5' para crear un saliente monocatenario estandarizado en el extremo 3' del segmento génico J, y contenido dentro de la parte de la parte C de la secuencia (véase la Figura 2b).

Un vector donante J no tiene estrictamente que llevar una secuencia de parte C, codificando una pequeña parte 5' del segmento génico C. Esta parte C se utiliza para optimizar y estandarizar salientes para la reacción de reconstitución durante el funcionamiento de un TORES. Esto se debe a la mayor variación de secuencia observada en el extremo 3' de los segmentos génicos J, de modo que la inclusión de una parte C permite por lo tanto la estandarización por generación de salientes dentro del segmento génico C menos diverso. En el caso de construir un TORES para un locus del TCR procedente de otro organismo que no tenga diversidad de segmentos J 3', o utilizando segmentos génicos J sintéticos, esta parte C puede omitirse a favor de la estandarización de salientes dentro de dichos segmentos J. Esto reduciría la complejidad de la construcción de la genoteca de donantes J.

Cada una de la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de Tipo IIS codificadas en el uno o más vectores de entrada V-C y uno o más vectores donantes J, puede ser igual o distinta. Preferiblemente, son iguales. Esto garantiza que cada uno de los sitios de restricción dentro del sistema de vectores bicomponente sea compatible con la misma enzima de Tipo IIS, y solo se necesita una única enzima para la reacción de enzima de restricción/ligasa durante la reconstitución del o Rf del TCR de longitud completa que utiliza el TORES. Las enzimas de Tipo IIS no cortan dentro de su secuencia de reconocimiento y, por lo tanto, los salientes monocatenarios se generan extrínsecos a la secuencia de reconocimiento. Por lo tanto, la naturaleza del saliente generado después de la acción de la enzima de restricción de Tipo IIS depende tanto de la orientación de la secuencia de reconocimiento como, de hecho, de la secuencia adyacente (véase el Ejemplo 1).

De forma alternativa, cada una de las secuencias de restricción de Tipo IIS pueden ser distintas entre sí. Sin embargo, con la adición de cada secuencia de reconocimiento única, debe incorporarse una enzima de Tipo IIS adicional en la reacción de enzima de restricción/ligasa. Esto aumentaría la complejidad y el coste de una reacción de reconstitución para ensamblar un ORF del TCR de longitud completa.

El primer y segundo marcadores de selección positiva dentro del vector de entrada V-C y del vector donante J, respectivamente, son preferiblemente distintos. Esto es para asegurar que el vector de entrada V-C, que proporciona la cadena principal del producto ORF del TCR de longitud completa final, pueda seleccionarse independientemente del vector donante J, y así eliminar los transformantes que llevan vectores donantes J no digeridos o recirculados que contribuirían de cualquier otro modo a la reacción de reconstitución (véase la Figura 2).

Los marcadores de selección positiva pueden seleccionarse de

a. un gen de resistencia a antibióticos,

b. un gen complementario auxótrofo,

c. un gen indicador

en donde la selección, el formato y la aplicación de dichos marcadores de selección positiva son bien conocidos por los expertos en la técnica.

El elemento genético 5' incorpora un vector de entrada V-C (componente 1A) que comprende uno o más elementos seleccionados de

a. elemento génico cis actuante,

b sitio de reconocimiento heteroespecífico para las enzimas recombinasas,

c. un brazo de recombinación homóloga 5' para un sitio genómico de interés

d. un sitio aceptor de corte y empalme de ARNm,

e. un sitio interno de entrada al ribosoma, y

f. secuencia del aislante epigenético

en donde se incluyen al menos uno de b) y c).

b) y c) se hacen coincidir con los sitios del receptor genómico incluidos para el componente 2B y 2D del dispositivo de dos partes; a) dirige la expresión del transcrito codificado por el producto ORF del TCR de longitud completa reconstituido dentro de la cadena principal del vector de entrada V-C; b) representa una secuencia que dirige la recombinación dirigida en presencia de enzimas recombinasas para insertar el producto ORF del TCR de longitud completa reconstituido dentro de la cadena principal del vector de entrada V-C en un contexto genómico específico; c) representa una secuencia que dirige la recombinación homóloga dirigida para insertar el producto ORF del TCR de longitud completa reconstituido dentro de la cadena principal del vector de entrada V-C en un contexto genético específico de la eTPC de la parte dos del dispositivo de dos partes; d) permite enfoques del dominio de fusión diseñado por ingeniería genética para manipular la forma de la proteína expresada a partir del ORF del TCR de longitud completa reconstituido en la cadena principal del vector de entrada V-C e) permite el inicio de la traducción del ARNm expresado a partir del ORF del TCR de longitud completa reconstituido independiente de protección en la cadena principal del vector de entrada V-C f) permite el aislamiento de la actividad transcripcional afectada de cualquier otra forma por los elementos potenciadores en un contexto genómico donde puede insertarse el ORF del TCR de longitud completa reconstituido en la cadena principal del vector de entrada V-C.

Puede incluirse un elemento actuante en cis para dirigir la expresión de los TCR reconstituidos en una cadena principal del vector de entrada V-C una vez insertada en los sitios del receptor genómico de la eTPC. Sin embargo, esto permitiría la expresión transitoria de cadenas del TCR proporcionando los vectores de integración generados a la eTCP durante la integración. Por lo tanto, es preferible que el uno o más elementos actuantes en cis se incluyan dentro del propio sitio del receptor genómico, de modo que las cadenas del TCR solo puedan expresarse una vez integradas en el contexto genómico correcto.

Una cadena principal del vector de entrada V-C puede codificar un sitio de reconocimiento heteroespecífico para enzimas recombinasa que permiten el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE) del ORF del TCR de longitud completa reconstituido, Ejemplo 1, cuando dicho vector que contiene un ORF del TCR reconstituido se transfecta a células de mamífero en presencia de la enzima recombinasa adecuada.

Una primera secuencia de reconocimiento de Tipo IIS que se incluye en el vector de entrada V-C está orientada para cortar 5' de dicha secuencia de reconocimiento y dentro del segmento génico variable del TCR (Figura 2a) para producir un saliente de ADN monocatenario en el extremo 3' del segmento génico variable (Figura 2g) que es complementario al del extremo 5' del odeCDR3 sintetizado (Figura 2c). Para más detalles sobre cómo se diseña esta secuencia de reconocimiento de primer Tipo IIS, véanse los Ejemplos 1 y 2.

Un vector de entrada V-C contiene un marcador de selección negativa entre la primera secuencia de reconocimiento de Tipo IIS y la segunda secuencia de reconocimiento de Tipo IIS (véase más abajo la Figura 2a). Este marcador de selección negativa se selecciona de uno o más de

a. un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción no contenido en otro sitio del primer componente o dentro del segmento génico de unión del TCR,

b. un gen que codifica un agente bactericida,

c. un elemento indicador.

El marcador de selección negativa se utiliza para eliminar las células hospedadoras transformadas con el vector de entrada V-C parental y, por lo tanto, reducir el fondo de una reacción de reconstitución cuando se utiliza el primer marcador de selección positiva para seleccionar transformantes que contienen el ORF del TCR diana dentro de la cadena principal del vector de entrada V-C (véase el Ejemplo 3).

Con la excepción del propio marcador de selección negativa, todas las demás secuencias del sistema de dos partes deben estar desprovistas de dicha secuencia para no transmitir una selección negativa indebida sobre la base de la inclusión de esta secuencia en otra parte del sistema.

En el presente contexto, una segunda secuencia de reconocimiento de Tipo IIS que se incluye en el vector de entrada V-C se orienta para escindir 3' de dicha secuencia de reconocimiento y dentro del segmento génico constante del TCR (Figura 2a) para producir un saliente de ADN monocatenario en el extremo 5' del segmento génico constante (Figura 2g) que es complementario del que está en el extremo 3' del intermedio de reacción del fragmento donante J (Figura 2f). Para más detalles sobre cómo se diseña esta segunda secuencia de reconocimiento de Tipo IIS, véanse los Ejemplos 1 y 2.

El elemento genético 3' incorpora un vector de entrada V-C (componente 1A) que comprende uno o más elementos seleccionados de

a. un elemento terminador,

b sitio de reconocimiento heteroespecífico para las enzimas recombinasas,

c. un brazo de recombinación homóloga 3' para un sitio genómico de interés,

d. un sitio donador de corte y empalme de ARNm,

e. un sitio interno de entrada al ribosoma, y

f. secuencia del aislante epigenético.

en donde se incluyen al menos uno de b) y c).

b) y c) se hacen coincidir con los sitios del receptor genómico incluidos para el componente 2B y 2D del dispositivo de dos partes; a) representa una secuencia que dirige la terminación transcripcional para una producción eficaz de ARNm del ORF del TCR in situ y puede codificar una señal de poli-A; b) representa una secuencia que dirige la recombinación dirigida al sitio en presencia de enzimas recombinasas para insertar el producto ORF del TCR de longitud completa reconstituido dentro de la cadena principal del vector de entrada V-C en un contexto genómico específico; c) representa una secuencia que dirige la recombinación homóloga dirigida al sitio para insertar el producto ORF del TCR de longitud completa reconstituido dentro de la cadena principal del vector de entrada V-C en un contexto genético específico de la eTPC de la parte dos del dispositivo de dos partes; d) permite la fusión de un ORF del TCR a una unidad transcripcional tras la integración en un locus genómico que codifica un sitio aceptor de corte y empalme de ARNm posterior para manipular la intensidad de los niveles de expresión de TCR o la forma de la proteína expresada a partir del ORF del TCR de longitud completa reconstituido dentro de la cadena principal del vector de entrada V-C e) permite el inicio de la traducción del ARNm expresado a partir del ORF del TCR de longitud completa reconstituido independiente de protección en la cadena principal del vector de entrada V-C; f) evita la interacción inadecuada entre dominios de cromatina adyacentes o la diseminación de la heterocromatina en un contexto genómico donde se puede insertar el ORF del TCR reconstituido dentro de la cadena principal del vector de entrada V-C

Puede incluirse un elemento terminador para garantizar la finalización de la transcripción durante la expresión de los TCR reconstituidos en una cadena principal del vector de entrada V-C e integrada en los sitios del receptor genómico de la eTPC. La secuencia del terminador también puede incluirse dentro del propio sitio del receptor genómico como se detalla en el Ejemplo 1.

En una realización, el primer y segundo marcador de selección positiva de la primera parte son distintos y se seleccionan de un gen de resistencia a antibióticos y/o de un gen complementario auxótrofo.

Una cadena principal del vector de entrada V-C puede codificar un sitio de reconocimiento heteroespecífico para enzimas recombinasa que permiten el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE) del ORF del TCR de longitud completa reconstituido, Ejemplo 1, cuando dicho vector que contiene un ORF del TCR reconstituido se transfecta a eTPC con sitios receptores genómicos coincidentes en presencia de enzima recombinasa adecuada, como se detalla en los Ejemplos 3, 4 y 5.

Un vector donante J contiene un segmento génico J con una secuencia de parte C que representa un fragmento 5' del segmento génico C al 3' del segmento génico J (Figura 2b).

La secuencia de la parte C está diseñada para estandarizar los salientes monocatenarios generados por la acción de la enzima de Tipo IIS dentro del extremo 3' del intermedio de reacción del fragmento J derivado del vector donante J (Figura 2f), y el que está en el extremo 5' del segmento génico C dentro del intermedio de reacción del vector de entrada V-C abierto digerido con el Tipo IIS (Figura 2g).

Una tercera secuencia de reconocimiento de Tipo IIS que se incluye en el vector donante J se orienta para escindir 3' de dicha secuencia de reconocimiento y dentro del segmento génico de unión del TCR (Figura 2b) para producir un saliente de ADN monocatenario en el extremo 5' del segmento génico de unión (Figura 2f) que es complementario del extremo 5' del odeCDR3 sintetizado (Figura 2c). Para ver más detalles sobre cómo se diseña esta secuencia de reconocimiento de tercer Tipo IIS, véanse los Ejemplos 1 y 2

Una cuarta secuencia de reconocimiento de Tipo IIS que se incluye en el vector donante J está orientada para cortar 5' de dicha secuencia de reconocimiento y dentro de la parte C del TCR (Figura 2b) para producir un saliente de ADN monocatenario en el extremo 3' de la parte C (Figura 2f) que es complementario del que tiene el intermedio de reacción del vector de entrada V-C abierto digerido 5' con el Tipo IIS (Figura 2g). Para más detalles sobre cómo se diseña esta secuencia de reconocimiento del tercer Tipo IIS, véanse los Ejemplos 1 y 2.

Dentro del sistema de vectores de dos partes, ninguna secuencia de vector debe contener secuencias de reconocimiento de Tipo IIS adicionales para la enzima de restricción de Tipo IIS utilizada en las reacciones de ensamblado de TORES. La inclusión de dichas secuencias daría como resultado la acción de la enzima de restricción de Tipo IIS dentro de los segmentos o partes génicas codificadas, y daría como resultado la interrupción del proceso de reconstitución del TCR. De forma similar, las secuencias de reconocimiento de Tipo IIS no deben incluirse en el odeCDR3 que representa un tercer componente del sistema (ver más abajo).

Puede construirse un sistema vectorial bicomponente del TORES para cualquier colección de cadenas del TCR. En el ejemplo 1 que sigue se construyen sistemas de vectores bicomponente para los loci TRA y TRB humanos que codifican las cadenas alfa y beta del TCR humano, respectivamente. La construcción de tal TORES es igualmente aplicable en el contexto de los loci de TRD y TRG que codifican el par de cadenas delta y gamma del TCR, respectivamente, o de hecho para cualquier sistema de pares de cadenas TRA/TRB, TRD/TRG o variante del TCR que se encuentra en los vertebrados con mandíbulas. Dicho sistema TORES también puede incorporar fragmentos génicos de TCR sintéticos para permitir el ensamblado de variantes sintéticas de los OFR del TCR y diseñar los TCR expresados en células o proteínas del TCR recombinante.

Tercer componente odeCDR3 de la primera parte del sistema de dos partes

Para reconstituir un ORF del TCR de longitud completa utilizando cualquiera del TORES dado, se requiere un pequeño fragmento del ORF no codificado por el vector de entrada V-C bicomponente y el sistema del vector donante J como tercer componente. Este tercer componente toma la forma de un dúplex de oligonucleótidos que codifica CDR3 (odeCDR3), designado componente 1C.

Dicho tercer componente 1C, odeCDR3, comprende

a. una primera secuencia de saliente monocatenario complementaria al saliente generado por la enzima de restricción de Tipo IIS que se une al primer sitio de reconocimiento de Tipo IIS dentro del segmento génico variable del TCR del vector de entrada V-C,

b. un segmento bicatenario que codifica una región CDR3 del TCR y desprovisto de elemento de selección negativo, donde el elemento de selección negativa es como se define en la reivindicación 10, y también está desprovisto de cualquier secuencia de restricción de Tipo IIS para la una o más enzimas de restricción de Tipo IIS añadidas a la mezcla de las reacciones del TORES.

c. una segunda secuencia de saliente monocatenario complementaria al saliente generado por la enzima de restricción de Tipo IIS que se une al tercer sitio de reconocimiento de Tipo IIS dentro del segmento génico de unión del TCR del vector donante J.

De forma alternativa,

d. el odeCDR3 puede estar compuesto de una molécula de ADNbc que codifica el CDR3 flanqueado por dos enzimas de Tipo IIS consistentes con el primer o segundo componente, orientado de forma que cuando se digiere, se genera un producto digerido que comprende los a, b y c descritos anteriormente y dos subproductos que codifican fragmentos de ADNbc cortos flanqueados por los sitios de Tipo IIS. Este ADNbc de odeCDR3 alternativo es compatible con la reacción enzima de restricción/ligasa, que no requiere digestión previa.

En una realización, el componente de dispositivo de dos partes 1C comprende

a. una primera secuencia de saliente monocatenario complementaria al primer sitio de reconocimiento y escisión con enzimas de restricción de Tipo IIS en 1A,

b. un segmento bicatenario que codifica una región CDR3 del TCR y desprovisto de un elemento de selección negativo en 1A, en donde un elemento de selección negativo está desprovisto de cualquier secuencia de restricción de Tipo IIS del componente 1A o 1B, y

c. una segunda secuencia de saliente monocatenario complementaria al tercer sitio de reconocimiento y corte con enzimas de restricción de Tipo IIS en 1B;

o 1C comprende

d. una molécula de ADN monocatenario que codifica una CDR3 del TCR flanqueado por sitios de enzimas de restricción de Tipo IIS de modo que cuando se escinde genera la molécula definida anteriormente en los puntos a-c.

Métodos para utilizar un TORES para reconstituir un ORF del TCR de longitud completa

Puede utilizarse un TORES, la primera parte del dispositivo de dos partes, para reconstituir un ORF del TCR de longitud completa en un contexto de vector genético, a partir de la información de secuencias, como se presenta para un par de cadenas TRA/TRB humanas en el Ejemplo 3.

Para que TORES reconstituya un ORF del TCR de longitud completa a partir de la información de secuencia, dado el recurso de un sistema de vectores bicomponente para una cadena TCR dada, el método comprende

a. seleccionar un vector de entrada V-C,

b. seleccionar un vector donante J,

c. seleccionar un odeCDR3,

d. combinar a, b y c para reaccionar con i) una o varias enzimas de restricción de Tipo IIS para escindir todos los sitios de reconocimiento y escisión con enzimas de restricción de Tipo IIS presentes en el vector de entrada V-C y en el vector donante J y ii) enzima ADN-ligasa y iii) someter la mezcla combinada a una reacción a temperatura controlada,

e. transformar el producto de reacción obtenido en la etapa d en un organismo hospedador seleccionable competente para la propagación del vector de ADN, y

f. realizar una selección del organismo hospedador para obtener el marco de lectura abierto del TCR reconstituido de longitud completa en la cadena principal del vector de entrada V-C.

en donde, a) y b) se seleccionan sobre la base del vector seleccionado que codifica los segmentos génicos V, J y C en el ORF del TCR de longitud completa diana; c) se selecciona sobre la base de completar la secuencia ORF del TCR de longitud completa no codificada por los vectores de entrada V-C o donante J seleccionados en a) y b), y unidos por los segmentos variable y de unión codificados en los mismos; d) combinar los tres componentes seleccionados en una mezcla de reacción junto con una enzima de restricción que cortará la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo IIS en los vectores de entrada V-C y donante J; e) representa, de forma general, bacterias competentes para transformación; f) la selección del hospedador se basa en el primer marcador de selección positiva proporcionado por la cadena principal del vector de entrada V-C.

De forma general, un flujo de trabajo para seleccionar y definir los elementos genéticos de un ORF del TCR de longitud completa para la reconstitución implica la secuenciación de novo de cadenas TCR procedentes de tejidos del organismo diana. Un flujo de trabajo generalizado incorporaría transcripción inversa y amplificación basada en PCR de pares de cadenas de TCR procedentes de células individuales clasificadas con secuenciación de Sanger posterior. Pueden aplicarse métodos de secuenciación alternativos; el parámetro generalmente crítico es mantener el emparejamiento del ORF del TCR. Además, hay un requisito para la información de secuencia de alta calidad que abarca los segmentos V, CDR3, J y C del o Rf del TCR, que dicta el uno o varios enfoques de secuenciación específicos asumidos.

Por lo tanto, un método para seleccionar y reconstituir un marco de lectura abierto del TCR comprende

a. Obtener una secuencia de marco de lectura abierto del TCR en donde dicha información de secuencia es suficiente para identificar i) el uso de un segmento génico variable ii) el uso de un segmento génico constante iii) el uso de segmento génico de unión iv) una secuencia CDR3 completa que abarca el límite de segmento génico variable hasta el límite de segmento génico de unión, y

b. seleccionar un vector de entrada V-C correspondiente a los segmentos génicos variables y constantes identificados en la etapa a. i) y a. ii), respectivamente, y

c. seleccionar un vector donante J correspondiente al segmento génico de unión identificado en la etapa a, iii), y

d. generar un odeCDR3 que corresponde a la secuencia de CDR3 identificada en la etapa a. iv), y

e. combinar b, c y d para reaccionar con i) una o varias enzimas de restricción de Tipo IIS para escindir todos los sitios de reconocimiento y escisión con enzimas de restricción de Tipo IIS presentes en el vector de entrada V-C y en el vector donante J y ii) enzima ADN-ligasa, iii) someter la mezcla combinada a una reacción de temperatura controlada, y

f. transformar el producto de reacción obtenido de la etapa e. en un organismo hospedador seleccionable competente para la replicación del plásmido, y

g. realizar una selección del organismo hospedador para obtener el ORF del TCR reconstituido de longitud completa en la cadena principal del vector de entrada V-C.

en donde, a) se lleva a cabo con métodos de secuenciación bien conocidos para el experto en la técnica que pueden obtener una secuencia de suficiente longitud y calidad como para identificar los cuatro elementos genéticos requeridos; b) y c) se seleccionan de una genoteca de TORES que contiene vectores necesarios; d) se sintetiza de novo o se selecciona de una genoteca de odeCDR3; e) se lleva a cabo en un solo recipiente de reacción.

Para seleccionar el vector de entrada V-C apropiado, el vector donante J y el odeCDR3, las secuencias diana del TCR se alinearon respecto a una genoteca de segmentos génicos V, C y J para buscar sus cadenas del TCR correspondientes para determinar el uso de los segmentos V, C y J de la cadena diana. Esta etapa de alineación y análisis de secuencia también debe permitir la definición de la secuencia codificante CDR3 y, por lo tanto, la definición de la secuencia odeCDR3. Por lo tanto, de forma general, dicho análisis de secuencia permite la selección de vectores de entrada V-C y vectores donantes J para la reconstitución de cadenas de TCR. El análisis también permite la síntesis de odeCDR3 para cada reacción de reconstitución en cadena.

Es deseable llevar a cabo la digestión de Tipo IIS y la ligación dependiente de ADN-ligasa (etapa e) en una reacción única. Esto minimiza las etapas de procesamiento y el diseño del sistema lo hace posible, donde las enzimas de restricción de Tipo IIS cortan fuera de sus secuencias de reconocimiento, de forma que pueden generarse varios salientes únicos con una sola enzima, manteniendo así una clonación direccional eficiente del producto intermedio de reacción del vector donante J y odeCDR3 en la cadena principal del vector de entrada V-C.

De forma alternativa, la digestión por restricción de Tipo IIS y la ligación de ADN pueden hacerse en procedimientos secuenciales.

Se ilustra un ejemplo de una aplicación común del TORES en el contexto de la clasificación de células activada por fluorescencia de células individuales (FACS) de linfocitos T= específicos de antígeno a partir de tejido humano para transcripción inversa y amplificación basada en PCR de pares de cadenas TRA/TRB del TCR, seguido por secuenciación de Sanger. Este es un flujo de trabajo generalmente aplicable, en donde cualquier tejido puede ser la fuente de linfocitos T de cualquier vertebrado mandibulado, y las células pueden clasificarse basándose en cualquier característica fenotípica. No es necesario teñir las células individuales clasificadas por especificidad del antígeno utilizando reactivos de multímeros de HLA.

El enfoque de secuenciación del TCR utilizado no se limita a ningún método o tecnología particular, siempre que se obtenga suficiente información de secuencia de alta calidad para que las características genéticas definidas anteriormente del uno o más ORF de TCR puedan definirse basándose en la dicha información de secuencia.

El uso de FACS para separar células individuales de forma que los pares de cadenas del TCR nativos puedan secuenciarse e identificarse es un método potente gracias a la información fenotípica precisa y detallada que puede recogerse con paneles de anticuerpos multiespecíficos. Sin embargo, existen otros métodos para repartir células, que incluyen: PCR en emulsión; enfoques de PCR digital que utilizan encapsulación de células en microfluidos; PCR digital de gotículas que utiliza sustratos de reparto físico.

En general, es deseable obtener pares del TCR nativos a partir de un material fuente, ya que ambas cadenas de un par de TCR contribuyen al acoplamiento y reconocimiento de HLA-antígeno. Sin embargo, existen casos en los que puede ser deseable la recuperación de una sola cadena, tal como el análisis de alto rendimiento de una sola cadena frente a una especificidad establecida. En tal caso, los TCR pueden amplificarse y/o secuenciarse a partir de células no separadas.

Métodos para utilizar un TORES para generar ORF del TCR de longitud completa con secuencia diversificada Un sistema TORES está idealmente adaptado para generar ORF del TCR de longitud completa diversificados en varios modos sistemáticos. Dicha diversificación sistemática puede aplicarse a flujos de trabajo de maduración por afinidad y/o funcional para cadenas del TCR. Dicha diversificación de secuencias diana de la cadena del TCR se describe bien en el Ejemplo 5.

Dichos métodos de diversificación de secuencias ORF del TCR siguen el mismo esquema general que en una reacción de reconstitución. La diversificación puede realizarse en múltiples reacciones de reconstitución paralelas, donde se genera una única variante del ORF del TCR por reacción. Sin embargo, en la mayoría de escenarios, es deseable generar un conjunto de variantes de ORF del TCR en una sola reacción. Cada uno de estos enfoques se logra proporcionando múltiples variantes de uno o más de cada componente genético (vector de entrada V-C, vector donante J, odeCDR3) en una reacción de reconstitución.

Como se describe en el Ejemplo 5, puede diversificarse sistemáticamente un ORF del TCR en la región CDR3 añadiendo un grupo de odeCDR3 con diversidad de secuencia posicional definida (Figura 3).

Un método para seleccionar y reconstituir un marco de lectura abierto de TCR para lograr la diversidad de ORF del TCR en la región CDR3, comprende por lo tanto

d. generar dos o más odeCDR3 que corresponden a la secuencia de CDR3 identificada en la etapa a. iv), con una composición de secuencia variante, y

g. realizar una selección del organismo hospedador para obtener el marco de lectura abierto del TCR reconstituido de longitud completa en la cadena principal del vector de entrada V-C.

en donde, a) se lleva a cabo con métodos de secuenciación bien conocidos para el experto en la técnica que pueden obtener una secuencia de suficiente longitud y calidad como para identificar los cuatro elementos genéticos requeridos; b) y c) se seleccionan de una genoteca de TORES que contiene vectores necesarios; d) se sintetiza de novo o se selecciona de una genoteca de odeCDR3; e) se lleva a cabo en un solo recipiente de reacción

Dicho método puede lograrse mediante la agrupación de todas las variantes de odeCDR3 en una reacción única para generar un grupo de secuencias diversificadas, pero puede lograrse igualmente proporcionando cada variante de odeCDR3 a una reacción paralela.

La odeCDR3 variante puede generarse mediante una variedad de métodos muy conocidos por los expertos en la técnica. La selección de la posición y el alcance de la degeneración/diversidad de odeCDR3 pueden variar de un solo cambio de resto en una sola posición a una secuencia completamente redundante de toda la longitud del odeCDR3.

Un ORF del TCR puede diversificarse sistemáticamente manteniendo la región CDR3 proporcionando un solo odeCDR3, pero diversificando el uso de los segmentos V, C y J proporcionando dos o más del vector de entrada V-C y/o el vector donante J a la reacción de reconstitución (Figuras 4, 5 y 6).

Un método para seleccionar y reconstituir un marco de lectura abierto del TCR utilizando segmentos V, C y/o J diversificados comprende, por lo tanto

b. seleccionar dos o más vectores de entrada V-C no correspondientes a los segmentos génicos variables y constantes identificados en la etapa a. i) y a. ii), respectivamente, y

c. seleccionar dos o más vectores donantes J que no corresponden al segmento génico de unión identificado en la etapa a, iii), y

d. generar un odeCDR3 que corresponde a la secuencia de CDR3 identificada en la etapa a. iv), y e. combinar b, c y d para reaccionar con i) una o varias enzimas de restricción de Tipo IIS para escindir todos los sitios de reconocimiento y escisión con enzimas de restricción de Tipo IIS presentes en el vector de entrada V-C y en el vector donante J y ii) enzima ADN-ligasa, iii) someter la mezcla combinada a una reacción de temperatura controlada, y f. transformar el producto de reacción obtenido de la etapa e. en un organismo hospedador seleccionable competente para la replicación del plásmido, y

Dicho método puede lograrse combinando todos los vectores de entrada V-C y/o variantes de vector donante J en una reacción única para generar un grupo de secuencias diversificadas, pero puede lograrse igualmente proporcionando cada variante de vector a una reacción paralela.

Cada vector entrada V-C y donante J de una genoteca dada podría seleccionarse para proporcionar una cobertura completa de los segmentos génicos V, C y J.

Cualquier combinación de diversificación de CDR3 y V, C y J descrita anteriormente podría utilizarse para generar grupos o genotecas de ORF del TCR diversificados.

Este sistema puede utilizarse para generar genotecas completamente sintéticas de ORF con cobertura completa del uso de segmentos génicos V, C y J nativos y características del CDR3 definidas.

Características de un TORES con respecto a los métodos de reconstitución y diversificación

Como se ha mencionado anteriormente, es deseable llevar a cabo la reacción de ensamblado con una sola enzima de restricción de Tipo IIS. Esto economiza el uso de enzima, de restricción y esto es posible por la naturaleza de la acción de Tipo IIS, y el diseño de salientes monocatenarios únicos en el sistema de vectores bicomponente y odeCDR3. De forma alternativa, hasta cuatro secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo IIS a través de los cuatro sitios de reconocimiento de Tipo IIS del vector de entrada V-C y el vector donante J.

Para una clonación eficiente de los productos ORF del TCR, se ejecuta al menos una etapa de selección negativa durante el ensamblado de un ORF del TCR de longitud completa mediante el uso del TORES, seleccionada de a. realizar la digestión con enzima de restricción del producto de reacción para eliminar el vector de entrada V-C parental

b. realizar una selección con agente bactericida condicional para eliminar hospedadores competentes transformados con vector de entrada V-C parental y/o

c. realizar la selección de células hospedadoras transformadas con el vector de entrada V-C parental mediante la identificación de un indicador.

en donde, la selección negativa se utiliza para eliminar el vector de entrada V-C parental que sigue sin digerir mediante la una o varias enzimas de Tipo IIS o que se ha religado a la forma parental después de la digestión.

La eliminación del vector de entrada V-C parental es crítica, considerando que la cadena principal del vector de entrada V-C y, por lo tanto, el marcador de selección positiva portado en esta cadena principal, se utiliza para la selección positiva del vector que contiene el producto de reacción ORF del TCR de longitud completa.

En el presente contexto, la selección negativa se hace utilizando un sitio de enzima de restricción que se ha diseñado dentro del subproducto de reacción escindido del vector de entrada V-C (Figura 2d). Este procedimiento de selección negativa se describe en el Ejemplo 3.

Uno cualquiera, o una combinación de los métodos de selección negativa mencionados anteriormente, pueden utilizarse para eliminar el vector de entrada V-C parental de los productos clonados finales. Dicho procedimiento de selección negativa puede omitirse si la eficiencia de la clonación se considera lo suficientemente alta para una recuperación eficiente de los productos de reacción clonados.

Se requiere la selección de los vectores que contienen el ORF del TCR de longitud completa clonado en el organismo hospedador transformado para obtener el producto clonado final. Dichas selecciones son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Un organismo hospedador representa una bacteria competente para transformación tanto de forma natural como inducida y una selección de transformantes que contienen el ORF del TCR de longitud completa contenido en una cadena principal del vector de entrada VC comprende la selección con antibióticos. Esto implica añadir antibiótico al sistema de cultivo en el que se introducen las células transformadas, y la resistencia a este antibiótico está codificada por el gen representado como el primer marcador de selección positiva en la cadena principal del vector de entrada V-C.

De forma alternativa, la eliminación de factores auxotróficos del sistema de cultivo en el que se introducen los transformantes puede ser una forma de selección positiva, en donde la complementación auxotrófica es conferida por un producto génico codificado en la cadena principal del vector de entrada V-C. Puede utilizarse una combinación de las selecciones positivas descritas anteriormente.

Genotecas del vector de entrada V-C y del vector donante J

Para que un TORES realice eficientemente la operación de reconstitución o diversificación de los ORF del TCR seleccionados, se requiere la construcción previa de una genoteca de vectores de entrada V-C y de vectores donantes J. A partir de esta genoteca, que es específica de cada forma de cadena del TCR, se realizan selecciones para completar el uso de V/J/C de la secuencia de ORF del TCR diana, cuando se complementa con la secuencia odeCDR3.

Las genotecas de vectores de entrada V-C y donantes J pueden construirse para contener todos los segmentos génicos V/J/C y de unión del TCR de la línea germinal de un organismo que tiene dichos TCR. Dicha genoteca puede incluir también todas las combinaciones del vector de entrada V-C, así como para el TORES específico de locus de TRB presentado en el Ejemplo 1, en donde la genoteca se replica con ambos segmentos génicos constantes frente a cada segmento variable.

Una genoteca de vectores de entrada V-C y donantes J pueden contener segmentos génicos V/J/C, de forma que la secuencia de aminoácidos traducida de la proteína codificada no esté modificada en relación con la secuencia de proteínas codificada por los segmentos génicos de la línea germinal.

Dicha genoteca permite el cambio en la secuencia de ácido nucleico subyacente para generar una genoteca desprovista por lo demás de secuencias de reconocimiento de Tipo IIS no deseadas, o de elementos de selección positivos y negativos. Los cambios en la secuencia de ácido nucleico subyacente también pueden utilizarse para la optimización de codones, para la expresión óptima de las cadenas del TCR reconstituidas.

De forma alternativa, una genoteca de vectores de entrada V-C y donantes J pueden contener segmentos génicos V/J/C, de forma que la secuencia de aminoácidos traducida de la proteína codificada esté modificada en relación con la secuencia de proteínas codificada por los segmentos génicos de la línea germinal.

Dicha genoteca puede utilizarse para construir TCR con características optimizadas para distintos usos de diagnóstico o terapéuticos. Podrían utilizarse cambios en los restos o regiones del marco dentro de los segmentos génicos V/J/C para aumentar la expresión o estabilidad en varios escenarios, tales como la expresión de TCR como reactivos solubles. De forma similar, las alteraciones en las regiones marco que no están implicadas en los contactos directos de HLA-antígeno pueden utilizarse para alterar la capacidad de señalización de los TCR reconstituidos producidos por el TORES. También pueden codificarse etiquetas de afinidad o secuencias inmunogénicas en regiones marco para ayudar en la purificación y/o detección de los TCR reconstituidos en aplicaciones posteriores.

Las genotecas de vectores de entrada V-C y donantes J pueden ensamblarse en el kit que comprende una combinación de

a. uno o más vectores de entrada V-C que codifican combinaciones de segmentos génicos variables y constantes, y

b. uno o más vectores donantes J que codifican los segmentos génicos J, y opcionalmente

c. uno o más odeCDR3, o una o más genotecas combinadas de odeCDR3, con salientes monocatenarios, preexpuestos o flanqueados por sitios de restricción de Tipo IIS para la liberación durante la reacción de digestión con restricción/ligación, coincidentes con los salientes monocatenarios del vector de entrada V-C y del vector donante J, y opcionalmente

d. uno o más odeCDR3 estandarizados con salientes monocatenarios, preexpuestos o flanqueados por sitios de restricción de Tipo IIS para la liberación durante la reacción de digestión con restricción/ligación, coincidentes con los salientes monocatenarios del vector de entrada V-C y del vector donante J como odeCDR3 de control positivo y, opcionalmente

e. un ORF del TCR de longitud completa como referencia, en donde a) y b) cubren la diversidad genética requerida de segmentos génicos de un organismo diana, con una secuencia de aminoácidos no modificada o modificada relevante para la aplicación prevista; c) se utiliza para la reconstitución de las cadenas del TCR con CDR3 definidas o diversificadas; d) se utiliza como control positivo en las reacciones de reconstitución, e) se utiliza como control positivo en aplicaciones posteriores de ORF del TCR de longitud completa reconstituido con las genotecas de vector de entrada V-C y vector donante J proporcionadas en dicho kit.

Definición de los productos de la Parte 1 del dispositivo como entradas de la Parte 2 del dispositivo

Durante el funcionamiento del dispositivo de dos partes general, la primera parte (TORES) se utiliza para generar una o más cadenas del TCR dentro del contexto definido del vector de integración. El TCR representa complejos heterodiméricos, de modo que un TORES comprenderá generalmente dos subsistemas de ensamblado paralelo para cada cadena de un par de cadenas del TCR. Por lo tanto, un TORES, como primera parte del dispositivo de dos partes generará dos productos que comprenden dos vectores de integración codificando cada uno de ellos una cadena de un par de cadenas del TCR, o genotecas de los mismos. Los componentes 2C y 2E del sistema TORES representan vectores de integración que se presentan en la cadena principal de entrada V-C del componente 1A.

Estos productos de la parte 1 del dispositivo de dos partes se utilizan como entradas directas para la segunda parte del dispositivo de dos partes (Figura 1). Estos productos del vector de la primera parte y las entradas a la segunda parte se designan como los componentes 2C y 2E . Cada una de estas entradas está emparejada con los componentes 2B y 2D del sitio del receptor genómico, respectivamente, codificados dentro de la eTPC (componente 2A), para formar dos pares de integración independientes.

El par de pares de integración se aíslan independientemente entre sí para garantizar que cada evento de integración suministra solamente un único ORF de TCR para cada cadena de un par de TCR y, de este modo, preferiblemente se obtiene una eTPC estandarizada que presenta una sola especie de proteína superficial de TCR (TCRsp), designada como eTPC-t.

eTPCS: segunda parte del dispositivo de dos partes

El sistema de eTPC multicomponente (eTPCS) se representa en la Figura 1, parte 2. El eTPCS multicomponente comprende un primer componente eTPC, designado como componente 2A , que contiene dos sitios del receptor genómico, los componentes 2B y 2D , que están emparejados con dos vectores de integración que codifican TCR obtenidos de la primera parte del dispositivo, los componentes 2Cy 2E . En general, la introducción de un par complementario de cadenas del TCR en los sitios del receptor genómico (componentes 2B y 2D) a través de vectores de integración (componentes 2C y 2E), convierte la eTPC (componente 2A) en una eTPC variante que expresa la proteína superficial del TCR (TCRsp), designada como eTPC-t (Figura 8).

Una eTPC, componente 2A, representa el componente base del sistema multicomponente, con el que están relacionados el resto de componentes del sistema. Por lo tanto, la eTPC contiene ciertas características, que son nativas o diseñadas que convierte la eTPC en adecuada para su uso en la creación de poblaciones eTPC-t analito, y en su uso.

La eTPC, componente 2A,

i. Carece de expresión endógena de las cadenas alfa, beta, delta y gamma del TCR, y

ii. Expresa proteínas CD3 que se presentan de forma condicionada en la superficie de la célula solo cuando la célula expresa un par complementario de cadenas del TCR y

iii. Contiene componente 2B y 2D diseñados mediante ingeniería genética modificados adicionales como sitios del receptor genómico para la integración de un único ORF que codifica una cadena alfa, beta, delta o gamma del TCR analito en cada sitio

en donde i) puede obtenerse mediante la selección de una población de células de origen natural que carezca de dicha expresión o puede modificarse para que carezca de dicha expresión; ii) puede obtenerse mediante la selección de una población de células de origen natural que comprenda dicha expresión, o puede modificarse para comprender dicha expresión; iii) puede lograrse utilizando secuencias intrínsecas al genoma de la eTPC o introducirse mediante ingeniería genética.

La selección de una célula eTPC candidata que carezca de las cadenas alfa, beta, delta y gamma de poblaciones de células de origen natural puede lograrse con métodos bien conocidos en la técnica. La tinción de células diana con reactivos de afinidad específicamente para las cadenas alfa, beta, delta y gamma del TCR, y la selección de las cadenas alfa, beta, delta y gamma del TCR pueden lograr esto directamente.

El diseño por ingeniería genética de una eTPC que carezca de la expresión de las cadenas alfa, beta, delta y gamma del TCR puede lograrse mediante medios dirigidos y no dirigidos. La mutagénesis no dirigida de la célula puede lograrse proporcionando una sustancia química, radiológica u otro mutágeno a la célula y, a continuación, seleccionar células que carecen de expresión de las cadenas alfa, beta, delta y gamma del TCR diana. La mutación dirigida de los loci genómicos puede lograrse por diversos medios que incluyen, aunque no de forma limitativa, mutagénesis dirigida mediante

i. nucleasas de dedo de cinc

ii. Direccionamiento mediado por CRISPR/Cas9

iii. Nucleasas efectoras análogas a un activador de transcripción (TALEN) sintéticas en donde dichas nucleasas dirigidas inducen roturas en el ADN bicatenario específicas de sitio que aumentan la probabilidad de reparación del ADN con propensión a errores en los loci diana, después de lo cual se obtienen células mutadas seleccionando células que carecen de expresión de alfa, beta, delta y gamma del TCR.

Las opciones para la integración de CD3 y los componentes 2B y/o 2D son bien conocidas para los expertos en la técnica pero pueden incluir métodos de recombinación dirigida por homología (HDR) y/o integración aleatoria, en donde la HDR puede fomentarse mediante mutación dirigida de los loci genómicos en los que se producirá la HDR, y pueden lograrse por diferentes medios entre los que se incluyen, aunque no de forma limitativa, mutagénesis dirigidamediante

i. nucleasas de dedo de cinc

ii. Direccionamiento mediado por CRISPR/Cas9

iii. Nucleasas efectoras análogas a un activador de transcripción (TALEN) sintéticas en do dnidcehas nucleasas dirigidas al sitio inducen la reparación de ADN específica de sitio mediante HDR en los di laoncia.

Después de dichos eventos, una proporción de células habrá incorporado el vector HDR, y puede seleccionarse y/o determinarse a través de cualquier combinación de lo siguiente,

iv. Análisis de expresión fenotípica no destructivo

v. Análisis de expresión fenotípica destructivo

vi. Análisis genético

En donde iv y vi son los métodos preferidos para la selección y determinación de eventos de integración genómica exitosa.

De forma alternativa, se podrían utilizar vectores víricos para suministrar los componentes necesarios de modo dirigido o no dirigido.

Considerando que el componente 2A de la eTPC está diseñado para su uso junto con los antígenos analito dentro de flujos de trabajo analíticos; en el aspecto preferido, la eTPC contiene características que minimizan los factores de presentación en la eTPC que interferirían en tales análisis.

El componente 2A de eTPC carece opcionalmente de expresión de superficie endógena de al menos una familia de complejos que presentan el antígeno analito (aAPX) y/o moléculas antigénicas analito (aAM), en donde la falta de expresión de superficie se selecciona para minimizar la interferencia en análisis coincidentes de antígenos analito diana.

La familia de aAPX puede ser cualquiera de las siguientes

i. HLA de clase I

ii. HLA de clase II

iii. complejo presentador de antígeno no HLA.

En una realización, el dispositivo de dos partes comprende el componente 2A, que

c. Contiene un componente adicional designado 2B , un sitio del receptor genómico para la integración de un único ORF que codifica al menos una cadena del TCR analito de alfa, beta, delta o gamma, y/o dos ORF que codifican el par de cadenas del TCR analito,

y el componente 2C comprende un vector de integración genética que se hace coincidir con el componente 2B, y en donde el componente 2C está diseñado para proporcionar

a. Un único ORF que codifica al menos una cadena de TCR analito de alfa, beta, delta y/o gamma y/o b. Dos ORF que codifican un par de cadenas de TCR analito,

y en donde a y/o b codifica opcionalmente un marcador de selección de integración, de modo que las cadenas del TCR analito pueden expresarse como proteína superficial del TCR en complejo con la CD3 (TCRsp) en el componente 2A.

En otra realización, la aAM se selecciona de

i. un polipéptido o complejo de polipéptidos traducidos a partir del uno o más ORF de la molécula antigénica analito ii. un péptido derivado de un polipéptido traducido a partir del uno o más ORF de la molécula antigénica analito

iii. un péptido obtenido por alteración el proteoma del componente A

iv. un péptido obtenido por alteración el proteoma del componente A

v. un péptido derivado por alteración del metaboloma del componente A

Adicionalmente, el componente 2A de eTPC puede incluir opcionalmente correceptores de linfocitos T, en donde dichas características permiten formas sólidas o variables de comunicación de la eTPC analito al APC analito, en donde la comunicación adaptable sea relevante para la identificación o caracterización de TCRsp analitos específicos de y/o de antígenos analito.

En el presente contexto, el componente 2A de eTPC puede expresar opcionalmente CD4 y/o CD8. La expresión de CD4 o CD8 restringe el acoplamiento de la eTPC con aAPX de tipo HLAII y HLAI, respectivamente.

El componente 2A de eTPC puede expresar opcionalmente CD28 y/o CD45. CD28 y CD45 contribuyen a la sensibilidad de la señal a través de efectos de prealimentación positiva en la señalización, mientras que también pueden contribuir a la especificidad de la señal a través de efectos de retroalimentación negativa en la señalización, ya que se esto se relaciona con la señalización a través de una TCRsp analito expresada.

El componente 2A puede expresar correceptores adicionales del TCR.

Además, el componente 2A de eTPC puede incluir opcionalmente componentes introducidos de molécula de adhesión a la superficie celular o la eliminación de moléculas de adhesión a la superficie celular endógenas, para fomentar el acoplamiento de la eTPC al APC analito y la formación de la sinapsis inmunitaria, o para evitar la unión estrecha y la formación de agrupaciones celulares perjudiciales en flujos de trabajo analíticos que implican APC, respectivamente. Dichas moléculas de adhesión que pueden introducirse como ORF adicionales en el componente 2A, o extirparse genéticamente del componente 2A, pueden seleccionarse de la familia de proteínas de adhesión integrinas.

Una eTPC se diseña para someter a ensayo la unión de antígeno analito afín, ya sea a través del acoplamiento detectable de reactivos de antígeno analito o a través de una respuesta céntrica de eTPC nativa o diseñada por ingeniería genética a la estimulación del antígeno afín, dentro de flujos de trabajo analíticos mediante el uso de un sistema eTPC:A (ver abajo). Por lo tanto, es deseable tener una lectura indicadora estandarizada para la respuesta de señalización a partir de la estimulación del TCRsp expresado.

El componente 2A de eTPC puede contener además un componente designado 2F, un elemento sintético de respuesta a la estimulación del TCR genómico seleccionado de

i. Una construcción sintética de un solo componente que contiene al menos un promotor nativo y/o al menos un promotor sintético y al menos un indicador

ii. Una construcción sintética multicomponente diseñada con al menos un promotor nativo y/o al menos un promotor sintético y al menos un indicador

en donde la activación de i y/o ii depende de al menos una ruta de transducción de señales seleccionada de una ruta sintética, una ruta nativa o una combinación de las mismas.

Los vectores de integración que codifican TCR que forman pares con el sitio del receptor genómico como parte de la eTPC se designan como Componentes 2C y 2E .

Cada uno de estos componentes 2C y 2E codifica un único ORF de la cadena de TCR, y son necesarios para convertir una eTPC en una eTPC-t que expresa TCRsp.

Cada uno de los vectores, componentes 2C o 2E, que llevan elementos genéticos 5 ' y 3 ' que flanquean el ORF del TCR codificado, se diseña para dirigirse a cualquier sitio del receptor genómico 2B o 2D, respectivamente. Estos pares de integración deben aislarse razonablemente entre sí para garantizar que solo se inserta un ORF del TCR en cada sitio del receptor genómico según lo determinado por la relación de acoplamiento de integración 2B-2C o 2D-2E.

Como se ha descrito anteriormente, los Componentes 2C y 2E se derivan del TORES, que representan la primera parte del dispositivo. Por lo tanto, las características de la arquitectura de cadena principal del vector de la primera parte coinciden con los sitios del receptor genómico, componentes 2B y 2D, del componente 2A de eTPC.

La pareja de pares de integración contenida dentro de la eTPC, como se ha descrito anteriormente, tiene preferiblemente una o más características que permiten la reutilización del sitio para eliminar una sola cadena del TCR de un sitio del receptor genómico una vez integrado.

Dicho ciclado entre el ORF de TCR y una construcción que no expresa TCRsp puede permitir el intercambio de un solo ORF de TCR expresado en una eTPC-t, para generar y expresar un intermedio con una sola cadena de TCR y, por lo tanto, sin expresión de TCRsp. Este intermedio se designa como eTPC-x (véase la Figura 7). Dicho reciclado se puede lograr con enzimas recombinasa, para ejecutar RCME.

El reciclado del sitio del receptor genómico también puede lograrse utilizando otras enzimas similares a la recombinasa, el uso de elementos transponibles y/o el uso de recombinación dirigida homóloga con o sin el uso de endonucleasas dirigidas.

Los sitios del receptor genómico, componentes 2B y 2D, pueden seleccionarse de los siguientes

i. Una construcción sintética diseñada para el intercambio de casete mediado por recombinasa (RMCE) ii. Una construcción sintética diseñada para recombinación homóloga dirigida al sitio en donde i) es la forma preferida de un sitio del receptor genómico para RMCE. El método de RMCE puede emplear sitios heteroespecíficos seleccionados que son específicos de enzimas recombinasa individuales, de modo que cada componente 2B y 2d tenga especificidad aislada.

Los sitios del receptor genómico, componentes 2B y 2D, comprenden al menos uno de los siguientes elementos genéticos

i. Sitios de recombinasa heteroespecíficos

ii. Brazos homólogos

iii. Promotor eucariótico

iv. Elemento regulador condicional eucariota

v. Terminador eucariota

vi. Marcador de selección

vii. Sitio aceptor de corte y empalme

viii. Sitio donante de corte y empalme

ix. Gen no codificante de proteínas

x. Aislante

xi. Elemento genético móvil

xii. Sitio de reconocimiento de meganucleasa

xiii. Sitio interno de entrada al ribosoma (IRES)

xiv. Elemento de péptido vírico autoescindible

xv. Una secuencia de consenso de Kozak.

En una realización debe incluirse al menos i) o ii).

Un sitio del receptor genómico preferido comprendería dos disposiciones distintas utilizando los siguientes elementos seleccionados de la lista de elementos anteriormente citados.

La primera disposición es para recibir un solo ORF que codifica una cadena de TCR y un marcador de selección de integración, mediante la integración de RMCE, en donde la disposición es

5'-[A][B][C][D][E][F]-3'

en donde

A) es el elemento iii) un promotor eucariota constitutivo o inducible

B) es el elemento i) sitio 1 de recombinasa heteroespecífico

C) es el elemento xv) una secuencia de consenso de Kozak

D) es el elemento vi) un marcador proteínico codificado compatible con FACS y/o MACS

E) es el elemento i) sitio 2 de recombinasa heteroespecífico

F) es el elemento v) terminador eucariota

La segunda disposición es para recibir dos ORF que codifican una o más cadenas del TCR y un marcador de selección de integración, mediante la integración de RMCE, en donde la disposición es

5'-[A][B][C][D][E][F][G][H][I]-3'

en donde

A) es el elemento iii) un promotor eucariota constitutivo o inducible

B) es el elemento i) sitio 1 de recombinasa heteroespecífico

C) es el elemento xv) una secuencia de consenso de Kozak

D) es el elemento vi) un marcador proteínico codificado 1 compatible con FACS y/o MACS

E) es el elemento v) un terminador de la transcripción bidireccional eucariota

F) es el elemento vi) un marcador proteínico codificado 2 compatible con FACS y/o MACS

G) es el elemento xv) una secuencia de consenso de Kozak

H) es el elemento i) sitio 2 de recombinasa heteroespecífico

I) es el elemento iii) un promotor eucariota constitutivo o inducible

además, en esta segunda disposición, los elementos F, G, e I se codifican en dirección antisentido.

Los componentes 2C y 2E comprenden al menos uno de los siguientes elementos genéticos

i. Sitios de recombinasa heteroespecíficos

ii. Brazos homólogos

iii. Promotor eucariótico

iv. Elemento regulador condicional eucariota

v. Terminador eucariota

vi. Marcador de selección

vii. Sitio aceptor de corte y empalme

viii. Sitio donante de corte y empalme

ix. Gen no codificante de proteínas

x. Aislante

xi. Elemento genético móvil

xii. Sitio de reconocimiento de meganucleasa

xiii. Sitio interno de entrada al ribosoma (IRES)

xiv. Elemento de péptido vírico autoescindible

xv. Una secuencia de consenso de Kozak

xvi. Marcador de selección de integración

xvii. Un casete de resistencia a antibióticos

xviii. Origen de replicación bacteriano

xix. Origen de replicación de levadura

xx. Un sitio de clonación

Un vector de integración genética preferido, el componente 2C y componente 2E, comprendería dos posibles disposiciones distintas que utilizan los siguientes elementos seleccionados de la lista previamente especificada de elementos.

La primera disposición es para recibir un único ORF que codifica una o más cadenas del TCR y un marcador de selección de integración, mediante la integración de RMCE, en donde la disposición es

5'-[A][B][C][D][E]-3'

en donde

A) es el elemento i) sitio 1 de recombinasa heteroespecífico

B) es el elemento xv) una secuencia de consenso de Kozak

C) es el elemento xx) un sitio de clonación de un único ORF que codifica una cadena del TCR y/o el elemento xvi) un marcador de selección de integración

D) es el elemento i) sitio 2 de recombinasa heteroespecífico

E) es el elemento xvii) Un casete de resistencia a antibióticos y el elemento xviii) un origen de replicación bacteriano, sin orientación específica

además, los elementos viii y/o xiv pueden utilizarse para unir múltiples cadenas del TCR y/o el elemento xvi entre sí.

La segunda disposición es para recibir uno o más ORF que codifican una cadena de TCR y/o un marcador de selección de integración, mediante la integración de RMCE, en donde la disposición es

5'-[A][B][C][D][E][F]-3'

en donde

A) es el elemento i) sitio 1 de recombinasa heteroespecífico

B) es el elemento xv) una secuencia de consenso de Kozak

C) es el elemento xx) un sitio de clonación para la introducción de dos o más ORF, con terminadores eucariotas, que codifican al menos una cadena del TCR y/o el elemento xvi) un marcador de selección de integración

D) es el elemento xv) una secuencia de consenso de Kozak bidireccional)

E) es el elemento i) sitio 2 de recombinasa heteroespecífico

F) es el elemento xvii) Un casete de resistencia y/o a antibióticos y el elemento xviii) y/o un origen de replicación bacteriano, sin orientación específica

además, los elementos viii y/o xiv pueden utilizarse para unir múltiples cadenas del TCR y/o el elemento xvi entre sí dentro de cada ORF.

En una realización, el dispositivo de dos partes incluye los componentes 2B y 2D para la integración del RMCE de un único ORF y comprende:

a. Un promotor eucariótico

b. Un par de sitios de recombinasa heteroespecíficos coincidentes con los de 2C y 2E

c. Una secuencia de consenso de Kozak

d. Un marcador de selección

d. Un terminador eucariótico.

En otra realización, el dispositivo de dos partes comprende los componentes 2C y 2E , cada uno de los cuales es para la integración del RMCE de un solo ORF y comprenden los siguientes elementos genéticos contribuidos por el componente 1A:

a. Un par de sitios de recombinasa heteroespecíficos coincidentes con los de 2B y 2D

b. Una secuencia de consenso de Kozak

c. Un ORF del TCR reconstituido por la operación de la Parte 1 TORES.

En otra realización, el dispositivo de dos partes comprende los componentes 2C y 2E que son producto del funcionamiento del TORES para proporcionar un único par de cadenas del TCR analito.

En otra realización, el dispositivo de dos partes comprende los componentes 2C y/o 2E que son producto del funcionamiento del TORES para proporcionar una genoteca de cadenas del TCR analito 2C y/o 2E .

Un vector de integración genética preferido, el componente 2Y y componente 2Z, para la conversión de eTPC-t a eTPC-x (véanse las Figuras 7 y 10) comprendería los mismos requisitos del vector de integración que 2C y 2E anteriores, aunque no codifica ningún ORF de la cadena del TCR y, preferiblemente, codifica un marcador de integración.

Uso de pares de integración para compilar eTPC-x y eTPC-t

El sistema multicomponente descrito anteriormente puede utilizarse de múltiples modos para preparar distintas formas de poblaciones eTPC analito, o genotecas de las mismas, que sirven para presentar la TCRsp analito al antígeno analito en flujos de trabajo analíticos o preparativos del sistema eTPC:A.

La integración eficaz de un número de copias predecible de uno o más ORF en el sitio del receptor genómico es muy ventajosa para el funcionamiento de un eTPCS estandarizado, donde las poblaciones de eTPC-t analito pueden prepararse y caracterizarse rápidamente. Por lo tanto, el uno o más sitios del receptor genómico y el uno o más vectores de integración acoplados son fundamentales para la función del eTPCS. También es deseable que el componente 2B y el componente 2D sean adecuados para un método de preparación de una eTPC-t, como se ha descrito anteriormente, en donde, la introducción de un solo par de cadenas complementarias del TCR es rápida, repetible, con una alta probabilidad de integración correcta y provisión de un solo par. La combinación de los vectores de integración genética con una eTPC para producir eTPC-x y/o eTPC-t puede lograrse de varias formas (Figura 7). Las poblaciones de eTPC-t que se crean necesitan obtener cadenas de TCR analito a partir de determinadas fuentes con las que analizar los antígenos candidatos.

Las fuentes de información de secuencias de cadena del TCR analito para definir los componentes utilizados en la reacción del TORES se pueden obtener de

i. Clonación emparejada de secuencia(s) de ORF de la cadena del TCR a partir de linfocitos T primarios

ii. Clonación no emparejada de secuencia(s) de ORF de la cadena del TCR a partir de linfocitos T primarios

iii. Secuencia(s) de ORF de la cadena del TCR sintéticas

en donde i) es preferible para el descubrimiento de TCRsp nativo que no sea probable que tenga de forma general reactividad cruzada contra cargas propias de aAPX y/o aAPX debido a la selección tímica; ii) puede utilizarse para identificar reactivos de afinidad de TCR candidatos; iii) puede utilizarse en la maduración por afinidad de reactivos de afinidad de TCR o en la creación de novo de cadenas del TCR.

En una realización, el dispositivo de dos partes tiene las secuencias codificantes de la cadena del TCR analito obtenida de

a. Secuenciación emparejada de secuencia(s) de ORF de la cadena del TCR a partir de linfocitos T primarios y reconstitución en la parte 1 TORES

b. Secuenciación no emparejada de secuencia(s) de ORF de la cadena del TCR a partir de linfocitos T primarios y reconstitución en la parte 1 TORES

c. Secuencia(s) de ORF de la cadena del TCR sintético generada(s) por el funcionamiento del TORES.

Puede utilizarse un sistema multicomponente que comprende dos pares de integración para preparar una eTPC-t a partir del componente 2A, proporcionando cada uno de los componentes 2C y 2E combinado con un ORF que codifica una cadena de un par complementario de cadenas del TCR, de modo que ambas cadenas del TCR analito se integran en el sitio del receptor genómico, componente 2B o 2D, para crear 2B' y 2D'. La línea celular resultante expresa el par del TCR proporcionado, y se presenta en la superficie celular como una TCRsp. eTPC-t puede prepararse por integración simultánea de dos cadenas del TCR complementarias para formar una TCRsp (Figura 8). eTPC-t puede prepararse por integración gradual de dos cadenas del TCR complementarias para formar una TCRsp, a través de un intermedio eTPC-x (Figura 9).

eTPC-x puede prepararse a partir de eTPC-t proporcionando cualquiera de los vectores de integración adicionales, componentes 2Y o 2Z, que codifican marcadores de integración o ningún ORF (Figura 10). La combinación del componente 2Y o 2Z con una eTPC-t intercambiaría cualquiera de los sitios para obtener una sola cadena del TCR que expresa eTPC-x.

En los ejemplos mencionados anteriormente para preparar poblaciones de eTPC-x y/o eTPC-t analitos a partir de eTPC, el sistema multicomponente (eTPCS) se utiliza para proporcionar cadenas conocidas de TCR analito de un modo definido para preparar poblaciones discretas de eTPC analito que expresan TCRsp definida. Un proceso de ese tipo puede repetirse muchas veces para construir genotecas de eTPC-x y/o eTPC-t como entrada para flujos de trabajo analíticos o preparativos. Un enfoque alternativo es tomar genotecas agrupadas de cadenas de TCR analito combinadas con vectores de integración genética e integrarlas al azar para obtener genotecas agrupadas de eTPC-t analito, en donde cada eTPC-t expresa una sola especie de TCRsp, pero colectivamente como agrupación presenta múltiples especies de TCRsp (véanse las Figuras 11 a 14). Esto es especialmente útil cuando se analizan grandes genotecas de TCRsp candidatos contra antígenos analito.

Un eTPCS que comprende dos pares de integración puede utilizarse para preparar una combinación de eTPC-t a partir del componente 2A en una etapa, proporcionando el componente 2C combinado con una genoteca de múltiples ORF que codifican un grupo de cadenas individuales del TCR analito de modo que cada par se integra en el sitio 2B, para crear 2B ', dentro de cada célula. Al mismo tiempo, proporcionar el componente 2E combinado con una genoteca de ORF múltiples que codifican una mezcla de cadenas individuales del TCR analito complementario a la primera genoteca proporcionada en el componente 2C, de modo que cada cadena complementaria del TCR analito se integra en el sitio 2D, para crear 2D ' dentro de cada célula. Cada célula resultante en la agrupación de eTPC-t tiene una selección única aleatorizada de cadenas del TCR analito complementarias, de modo que cada célula de la agrupación expresa una única TCRsp aleatorizada. Dicha genoteca agrupada contendría todas las combinaciones posibles de cadenas del TCR complementarias proporcionadas procedentes de los conjuntos realizados en C' y E' (Figura 11).

Por lo tanto, en una realización, el dispositivo de dos partes tiene uno o más componentes 2C y/o 2E combinados con el componente 2A, para integrar dos cadenas del TCR analito complementarias codificadas en los componentes 2C y/o 2E en los componentes 2B y/o 2D para obtener una célula, designada eTPC-t, en donde los componentes 2B y/o 2D se convierten en los componentes 2B'y/o 2D' de tal modo que expresa una TCRsp analito en la superficie del componente 2A.

Se puede utilizar un eTPCS que comprende dos pares de integración para preparar un grupo de eTPC-t a partir de una e-TPC-x obtenida anteriormente en una etapa, en donde el sitio 2B se ha convertido en 2B ' y contiene la única cadena del TCR analito. Se prepara una eTPC-t proporcionando el componente 2E combinado con una genoteca de ORF múltiples que codifican un conjunto de cadenas individuales del TCR analito complementarias a la cadena ya integrada, de modo que cada cadena del TCR de la genoteca del componente 2E proporcionado se integra singularmente al sitio 2D, para crear 2D '. Cada célula resultante en la agrupación de eTPC-t tiene la cadena del TCR analito proporcionada por la eTPC-x inicial, y una selección única aleatoria de la cadena del TCR analito complementaria, de modo que cada célula de la agrupación exprese una TCRsp única. Se utiliza un enfoque de ese tipo cuando se analiza el efecto de variar una cadena sencilla frente a una cadena fija en un par de cadenas del TCR complementarias (Figura 12).

Se puede utilizar un eTPCS que comprende dos pares de integración para preparar un grupo de eTPC-x. Se prepara una eTPC-x proporcionando el componente 2C combinado con una genoteca de ORF múltiples que codifican un conjunto de cadenas individuales del TCR analito en donde se ha omitido la cadena complementaria, de modo que cada cadena del TCR de la genoteca del componente 2E proporcionada se integra en el sitio 2B, para crear 2B ' dentro de cada célula. Cada célula resultante en la eTPC-x tiene una única selección aleatoria de cadena del TCR analito complementaria, de modo que cada célula de la agrupación expresa una única cadena del TCR (Figura 13). Se utiliza tal enfoque cuando se prepara una genoteca de eTPC-x para ensayar contra cadenas del TCR únicas o múltiples complementarias integradas mediante el segundo par de integración como en el ejemplo anterior (Figura 14).

En una realización, el dispositivo de dos partes tiene uno del componente 2C o 2E combinado con el componente A, para integrar una cadena del TCR analito codificada en el componente 2C o 2E, en los componentes 2B o 2D, para obtener una célula, designada eTPC-x, en donde los componentes B o D se convierten en los componentes 2B' o 2D' de modo que la eTPC-x expresa una única cadena del TCR.

En otra realización, el dispositivo de dos partes tiene uno del componente 2C o 2E combinado con una eTPC-x para integrar una cadena del TCR analito codificada en el componente 2C o 2E que es complementaria de la cadena del TCR expresada en la eTPC-x, en los componentes 2B o 2D, de la eTPC-x, para obtener una eTPC-t, en donde los componentes 2B o 2D se convierten en los componentes 2B' o 2D' de tal modo que expresa una TCRsp en la superficie de la eTPC-t.

En otra realización, el dispositivo de dos partes es para su uso en la generación de al menos una eTPC-t analito.

Puede utilizarse una eTPC-x, o genotecas de la misma para la transfección transitoria de un ORF de la cadena del TCR que es complementario del ORF del TCR integrado en 2B' en la eTPC-x, para evaluar rápidamente los derivados de TCRsp en un ensayo diana.

Poner en contacto la eTPC-t analito con el antígeno analito

La presente invención se refiere a la provisión de dos sistemas multicomponente que forman un dispositivo de dos partes para su uso en la obtención de poblaciones de eTPC-t analíticas para compilación de dispositivos analíticos que se denominan colectivamente sistemas eTPC:antígeno (eTPC:A) (Figura 24). Dentro del dispositivo de dos partes, la primera parte se utiliza para obtener los ORF del TCR en contextos de vector de integración, que a continuación se insertan en una eTPC coincidente que comprende la segunda parte. Por lo tanto, el funcionamiento del dispositivo de dos partes implica el uso de uno o más de cada componente 1A, 1B y 1C para derivar uno o más componentes 2C y 2E, que se utilizan junto con el componente 2A, que contiene al menos los componentes 2B y 2D, para compilar una o más eTPC-t. Después, estas eTPC-t analito se combinan con uno o más antígenos analito dentro de un sistema eTPC:A analítico para obtener una o más salidas. El antígeno analito se proporciona mediante células presentadoras de antígeno analito (APC) y/o como reactivo de afinidad soluble o inmovilizado y/o presentado en partículas no basadas en células (NCBP).

Un antígeno analito representa cualquier entidad que un TCR pueda posiblemente implicar en el sistema eTPC:A, y puede representarse por;

i. aAPX (complejo presentador de antígeno analito) y/o

ii. aAM (molécula antigénica analito) y/o

iii. aAPX:aAM (complejo presentador de antígeno analito que presenta una molécula antigénica analito) y/o iv. CM (una molécula de carga no analito) y/o

v. aAPX:CM (complejo presentador de antígeno analito que presenta una molécula de carga) en donde aAPX representa un complejo con capacidad de presentar una aAM; una aAM es cualquier molécula reconocida directamente por un TCR o cuando está cargada en un aAPX; un aAPX:aAM es un aAPX con una aAM cargada; un CM es una molécula de carga que puede cargarse en el aAPX pero que no es un analito, por lo tanto puede obtenerse de una célula presentadora de antígeno analito (APC) o del propio sistema de ensayo; un aAPX:CM es un aAPX con una CM cargada.

Estas formas de antígenos analito pueden presentarse a la eTPC de diversas formas dentro de un sistema eTPC:A, representado como;

i. una célula presentadora de antígeno (APC) analito y/o

ii. un reactivo de afinidad soluble o inmovilizado y/o

iii. una partícula no basada en células (NCBP),

en donde una célula presentadora de antígeno (APC) analito se considera cualquier APC que pueda presentar un antígeno a la eTPC-t; un reactivo de afinidad se considera cualquier reactivo que se prepara como analito para sondear la unión a TCRsp y/o estimulación en la superficie celular de la eTPC-t en un sistema eTPC:A. Este tipo de reactivos representarán frecuentemente moléculas antigénicas analito (aAM), complejos presentadores de antígeno analito (aAPX) o aAPX cargados con aAM (aAPX:aAM). Un ejemplo típico de un aAPX:aAM es un reactivo multímero pHLA-(p. ej. 'tetrámeros') utilizado para teñir los TCR. En este contexto, los reactivos de afinidad también podrían representar anticuerpos o entidades similares; una partícula no basada en células (NCBP) actúa de modo similar a un reactivo de afinidad, en tanto que la partícula presenta un antígeno analito u otra entidad a evaluar para determinar el acoplamiento de la TCRsp a la superficie de una eTPC-t dentro de un sistema eTPC:A. Sin embargo, se considera que una NCBP es una entidad más grande que puede también llevar información genética u otra información que actúe como identificador, bien directamente o mediante un intermediario, del antígeno analito presentado u otra entidad de unión. Un ejemplo típico de una NCBP sería un bacteriófago en un escenario de presentación en fago, en donde el fago puede presentar unión al antígeno del fragmento de anticuerpo (FAB). La eTPC-t marcada positivamente puede recuperarse junto con el fago y secuenciarse para identificar Fab específicos de la TCRsp en la superficie de una eTPC-t.

Una eTPC analítica: Un sistema comprende una selección de uno o más antígenos analito con una o más poblaciones de eTPC-t (Figura 24). Las poblaciones de eTPC-t analito se preparan utilizando el sistema multicomponente que se ha descrito anteriormente (Figurasl a 14).

El sistema eTPC:A se proporciona en un formato que permite el contacto físico entre los antígenos analito y las poblaciones de eTPC-t analito, en donde dicho contacto permite la formación del complejo entre uno o más antígenos analito y la TCRsp de una o más eTPC-t analito, en donde el antígeno analito es cualquiera de los siguientes

vi. aAPX (complejo presentador de antígeno analito) y/o

vii. aAM (molécula antigénica analito) y/o

viii. aAPX:aAM (complejo presentador de antígeno analito que presenta una molécula antigénica analito) y/o ix. CM (una molécula de carga no analito) y/o

x. aAPX:CM (complejo presentador de antígeno analito que presenta una molécula de carga)

en donde el antígeno analito bien es presentado por una APC analito o es presentado por un reactivo de afinidad soluble y/o inmovilizado, o una NCBP de modo que la formación del complejo puede llevar a la estabilización de dicho complejo y en donde dicha formación del complejo lleva a un marcado observable de la eTPC-t y/o la inducción de la señalización dentro de la eTPC analito a través del componente 2F, si está incluido y/o a una señal observable en la APC analito, que puede medirse.

En el presente contexto, un sistema eTPC:A comprende:

i. una entrada de una sola eTPC-t analito; o

ii. una entrada de una genoteca agrupada de eTPC-t analito

y combinada con una de los siguientes:

iii. una entrada de una sola APC analito; o

iv. una entrada de un solo reactivo de afinidad analito; o

v. una entrada de una sola NCBP analito; o

vi. una entrada de una genoteca agrupada de APC analito; o

vii. una entrada de una genoteca agrupada de un reactivo de afinidad analito

viii. una entrada de una genoteca agrupada de NCBP analito

Puesta en contacto de un sistema tampón

El contacto entre una APC analito y una eTPC-t analito se realiza en un cultivo celular permisivo o sistema tampón, en donde dicho sistema comprende un medio que permite la función tanto de APC analito como de células eTPC-t analito. Se hace un contacto entre un reactivo de afinidad de analito soluble, reactivo de afinidad inmovilizado y/o NCBP analito y una eTPC-t analito en un sistema permisivo tamponado, en donde dicho sistema comprende un medio tamponado permisivo a la función tanto del antígeno analito como de las células eTPC-t analito.

Etiquetado de eTPC-t con reactivos de afinidad o NCBP

Una eTPC-t analito obtenida del dispositivo de dos partes puede utilizarse para caracterizar una TCRsp presentada por la eTPC-t. Dicha caracterización puede llevarse a cabo de modo en el que la eTPC-t analito se pone en contacto con un reactivo de afinidad insoluble o soluble o partícula no basada en células (NCBP) de modo que marque la eTPC-t (Figura 15).

Puede considerarse que el marcado se detecta por observación directa de la marca por métodos tales como citometría de flujo, microscopía, espectrometría o luminometría o, de forma alternativa, mediante captura con un reactivo de afinidad inmovilizado o NCBP. De modo similar, el reactivo de afinidad o NCBP puede estimular el elemento indicador, componente 2F , si está incluido. La estimulación del componente 2F permitiría la selección de eTPC-t y/o del reactivo de afinidad o del NCBP para identificación (Figura 16).

Definición de respuestas de señal

Se utiliza una eTPC-t analito obtenida del dispositivo de dos partes para caracterizar una respuesta de señal de la eTPC-t analito que expresa la TCRsp analito, a un antígeno analito, en donde dicha respuesta de señal puede ser binaria o gradual y puede medirse como intrínseca de la eTPC-t (Figuras15, 16 y 17) y/o intrínseca de la APC, si se ha incluido (Figura 18). Dichas señales pueden detectarse por métodos tales como citometría de flujo, microscopía, espectrometría o luminometría u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Puesta en contacto con una APC con respuestas de señal

Una APC analito también puede ponerse en contacto con la eTPC-t dentro de un sistema eTPC:A. De forma general, la respuesta se medirá por la señal comunicada dentro de la eTPC-t (Figura 17), pero también puede medirse por la señal comunicada dentro de la APC (Figura 18).

Método General - Selección de una eTPC-t

Método para seleccionar una o más eTPC-t analito a partir de una eTPC-t analito de entrada o una genoteca de eTPC-t analito, a partir del sistema eTPC:A combinado para obtener una o más eTPC-t analitos, en donde la TCRsp expresada se une a uno o más antígenos analito comprende

i. Combinar una o más eTPC-t analito con uno o más antígenos analito dando lugar a un contacto entre una TCRsp analito con un antígeno analito y al menos uno de

ii. Medir la formación, si la hay, de un complejo entre uno o más TCRsp analito con uno o más antígenos analito y/o iii. Medir una señal de un antígeno analito marcado y/o

iv. Medir una respuesta de señal mediante la eTPC-t analito, si la hay, inducida por la formación de un complejo entre una o más TCRsp analito con uno o más antígenos analito y/o

v. Medir una respuesta de señal con la APC analito, si la hay, inducida por la formación de un complejo entre uno o más analitos TCRsp con uno o más antígenos analito y

vi. Seleccionar una o más eTPC-t analito basándose en la etapa ii, iii, iv y/o v, en donde la selección se realiza mediante una medición positiva y/o negativa

en donde i, iv y vi o i, v y vi comprenden las disposiciones preferidas.

Método General - Selección de un antígeno analito

Método para seleccionar uno o más antígenos analito a partir de un antígeno analito de entrada o de una genoteca de antígeno analito para obtener uno o más antígenos analito, en donde el antígeno analito expresado se une a una o más TCRsp analito presentadas en la eTPC-t comprende

i. Combinar uno o más antígenos analito con una o más eTPC-t analito, dando lugar a un contacto entre un antígeno analito presentado por el antígeno analito con la TCRsp analito de una o más eTPC-t analito y ii. Medir la formación, si la hay, de un complejo entre uno o más antígenos analito con una o más TCRsp y/o iii. Medir una señal de un antígeno analito marcado y/o

iv. Medir una respuesta de señal en la una o más eTPC-t analito, si la hay, inducida por la formación de un complejo entre la TCRsp analito con el antígeno analito y/o

v. Medir una respuesta de señal, si la hay, por la APC analito inducida por la formación de un complejo entre una o más TCRsp analito con uno o más antígenos analito y

vi. Seleccionar uno o más antígenos analito en la etapa ii, iii, iv y/o v, en donde la selección se realiza mediante una medición positiva y/o negativa

en donde i, iv y vi o i, v y vi comprenden las disposiciones preferidas.

Método General para la respuesta de señal

Método para seleccionar una eTPC-t analito y/o una APC analito y/o reactivos de afinidad y/o NCBP de la eTPC combinada: Un sistema basado en una respuesta de señal indicada comprende

i. Determinar una respuesta de señalización nativa y/o

ii. Determinar una respuesta de señalización sintética, si la eTPC-t contiene el componente 2F, o si la APC contiene un elemento indicador sintético equivalente.

Se mide una respuesta de señal nativa o sintética inducida que sea intrínseca de la APC y/o eTPC-t por la detección de un aumento o disminución en uno o más de los siguientes

i. una biomolécula secretada

ii. una sustancia química secretada

iii. una biomolécula intracelular

iv. una sustancia química intracelular

v. una biomolécula expresada en la superficie

vi. una acción citotóxica de la eTPC-t analito sobre la APC analito

vii. una acción paracrina de la eTPC-t analito sobre la APC analito de modo que se induce una respuesta de señal en la APC analito que se determina por detección de un aumento o disminución de uno cualquiera de los puntos i a v viii. una proliferación de la eTPC-t analito

ix. una sinapsis inmunitaria entre la eTPC-t analito y la APC analito

en donde dichas respuestas de señal detectadas se comparan con el estado de respuesta de señal no inducida intrínseca de la APC analito y/o de la eTPC-t analito antes del ensamblado del sistema eTPC:A combinado y/o un sistema combinado ensamblado paralelo, en donde la APC analito y/o la eTPC-t analito pueden presentar un antígeno analito de control y/o especies de TCR analito y/o antígeno analito soluble conocidos por no inducir una respuesta de señal dentro del sistema combinado eTPC:A en uso.

Método de selección por marcado y/o respuesta de señal

Un método para seleccionar una eTPC-t analito y/o reactivos de afinidad de analito y/o NCBP analito en el sistema eTPC:A combinado basado en la medición de una marca en una eTPC-t de dicho reactivo de afinidad o NCBP comprende;

i. Determinar un marcado de la eTPC-t con un reactivo de afinidad o NCBP y también puede comprender ii. Determinar una respuesta de señalización nativa y/o

iii. Determinar una respuesta de señalización sintética, si la eTPC-t contiene el componente 2F.

en donde seleccionar una eTPC-t y/o reactivo de afinidad y/o NCBP detectando el marcado de la eTPC-t puede comprender la detección del marcado superficial de la eTPC-t con un reactivo de afinidad y/o NCBP incluyendo una etiqueta detectable en el reactivo de afinidad y/o NCBP. Dichas marcas detectables pueden ser restos fluorescentes, luminiscentes, espectrométricos, químicos, radioquímicos o de afinidad. Por lo tanto, dicha selección de eTPC-t puede realizarse por FACS, MACS o metodologías de selección y análisis de alta productividad equivalentes.

Resumen

Dentro del sistema eTPC:A combinado, es crítico medir una respuesta de señal en la una o más eTPC-t analito o en la una o más APC analito o el marcado de una eTPC-t, que puede estar mediado por la formación de un complejo entre la TCRsp analito y el antígeno analito, para la selección de los productos del sistema primario (Figura 24 etapa v), en donde los productos del sistema primario son células individuales o grupos de células, y/o un reactivo de afinidad único o grupos de reactivos de afinidad y/o NCBP única o grupos de NCBP. La selección de células o reactivos puede llevarse a cabo en presencia o ausencia de una respuesta de señal indicada en cualquiera y/o ambos de la APC analito o de la eTPC-t analito en contacto, o mediante el marcado medible de una eTPC-t con un reactivo de afinidad o NCBP. Obtención de productos del sistema primario desde el sistema eTPC:A

La presente invención se refiere a la provisión de un dispositivo de dos partes a partir del cual se obtiene la eTPC-t analito. A continuación, esta eTPC-t analito se combina con uno o más antígenos analito mediante el sistema eTPC:A como se ha descrito anteriormente para obtener uno o más productos. El antígeno analito se proporciona mediante células presentadoras de antígeno analito (APC) y/o como antígeno analito soluble o inmovilizado y/o presentado en partículas no basadas en células (NCBP). El sistema comprende una selección de uno o más antígenos analito con una o más poblaciones de eTPC-t (Figura 24). La eTPC: Se proporciona un sistema en un formato que permite el contacto físico entre los antígenos analito y las poblaciones de eTPC-t analito, en donde dicho contacto permite la formación del complejo entre uno o más antígenos analito y la TCRsp de una o más eTPC-t analito, en donde el antígeno analito es cualquiera de los siguientes

i. aAPX y/o

ii. aAM y/o

iii. aAPX:aAM y/o

iv. CM y/o

v. aAPX:CM

en donde el antígeno analito se proporciona, es presentado por una APC analito, o se presenta mediante un reactivo de afinidad de analito soluble y/o inmovilizado o NCBP analito de modo que la formación de complejo puede llevar a la estabilización de dicho complejo y en donde lleva al marcado de la eTPC-t y/o a la inducción de la señalización dentro de la eTPC analito, si está incluido y/o la APC analito puede comunicarse y medirse.

Los modos de indicación de la respuestas de señal inducida y/o de la eTPC-t se han descrito anteriormente, y son estas respuestas y/o marcado indicados los que deben medirse para obtener el producto primario del dispositivo de dos partes compilado en un sistema eTPC:A. Los productos primarios del sistema eTPC:A son poblaciones de células seleccionadas y/o reactivos de afinidad seleccionados o NCBP seleccionadas, en donde la selección se realiza sobre la base de;

i. un marcador de eTPC medible mediante un reactivo de afinidad o NCBP y/o

ii. una respuesta de señal detectada en una eTPC-t y/o

iii. falta de una respuesta de señal detectada en una eTPC-t y/o

iv. una respuesta de señal detectada en una APC analito y/o

v. falta de respuesta de señal detectada en una APC analito;

en donde un producto primario puede representarse como una sola célula, o un grupo de células y/o uno o más reactivos de afinidad asociados a eTPC-t o NCBP.

Selección del reactivo de afinidad de analito, NCBP o APC analito y/o eTPC-t analito de la eTPC combinada: Puede fabricarse un sistema sobre la base de una respuesta en la célula de contacto. Es decir, una APC analito puede seleccionarse sobre la base de una respuesta indicada, o la falta de la misma, durante el contacto con la eTPC-t analito. Al contrario, una eTPC-t analito puede seleccionarse sobre la base de una respuesta indicada, o la falta de la misma, durante el contacto con el antígeno analito, o cuando el antígeno analito es un reactivo de afinidad o NCBP analito, el reactivo de afinidad o NCBP analito puede seleccionarse a partir de la respuesta de eTPC-t.

Los productos primarios de APC del sistema son células seleccionadas en donde la selección se realiza basándose en la presencia o ausencia de una respuesta de señal indicada en la APC analito o eTPC-t, y estas células pueden comprender una o más APC y/o eTPC-t, en donde las células seleccionadas pueden comprender una única célula, un grupo de células de la misma identidad, un grupo de células de diferentes identidades (Figura 24 etapa V).

Los productos primarios de eTPC-t del sistema son células seleccionadas en donde la selección se realiza basándose en la presencia o ausencia de una respuesta de señal indicada, y estas células pueden comprender una eTPC-t, en donde las células seleccionadas pueden comprender una única célula, un grupo de células de la misma identidad, un grupo de células de diferentes identidades (Figura 24 etapa V).

Los productos primarios de reactivos de afinidad o NCBP analito del sistema son células seleccionadas con o sin reactivo de afinidad o NCBP asociado, en donde la selección se realiza basándose en la presencia o ausencia de un marcador o respuesta de señal indicada por la eTPC-t analito, en donde el reactivo de afinidad o NCBP seleccionado puede comprender un reactivo de afinidad o NCBP simple, un conjunto de reactivo de afinidad o NCBP de la misma identidad, un conjunto de reactivo de afinidad o NCBP de identidades distintas (Figura 24 etapa V).

Las señales indicadas en la APC analito y/o eTPC-t analito en un sistema eTPC:A combinado pueden utilizarse para seleccionar poblaciones de células analito o reactivos de afinidad de analito o NCBP para proporcionar las productos primarios.

Puede obtenerse un producto primario de tipo APC y/o eTPC-t en un caso en donde el sistema eTPC:A combinado sea de tipo de cultivo binario (p. ej. Figuras 15 a 18) seleccionando la población deseada de APC analito y/o eTPC-t analito del sistema binario.

Puede obtenerse un producto primario de una eTPC-t en un caso en donde el sistema eTPC:A combinado es de composición binaria de una o más eTPC-t analito con un antígeno analito (p. ej. Figuras19 a 21) seleccionando la población deseada de eTPC-t analito marcada con el reactivo de afinidad o NCBP analito, o activada por el reactivo de afinidad o NCBP analito o APC del analito dentro del sistema eTPC:A.

Puede obtenerse un producto primario de un reactivo de afinidad o NCBP analito en un caso en donde el sistema eTPC:A combinado sea de composición binaria de una o más eTPC-t analitos con un reactivo de afinidad o NCBP analito (p. ej. Figura 21) seleccionando la población deseada de eTPC-t que se ha marcado con, y/o tiene una señal inducida por, el reactivo de afinidad o NCBP analito del sistema eTPC:A.

Puede obtenerse un producto primario de APC en un caso en donde el sistema eTPC:A combinado es de eTPC-t analito fijo y APC analito de genoteca agrupado (p. ej. Figura 22) seleccionando una APC analito según la detección de una respuesta, o falta de la misma, dentro del APC analito.

Modos para obtener productos del sistema eTPC:A

Existen varios modos distintos en los que pueden obtenerse las productos primarios, en donde cada modo implica una etapa de clasificación. La clasificación puede lograrse a través de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) y/o clasificación de células activada magnéticamente (MACS) y/o distintos métodos de clasificación de células activada por afinidad.

Puede obtenerse un producto primario de células APC y/o eTPC-T y/o de reactivos de afinidad asociados con eTPC-t o NCBP, clasificando células únicas para obtener una célula única y/o clasificando células en un grupo para obtener un grupo de células.

Puede obtenerse un producto primario de células APC y/o eTPC-T mediante clasificación de célula única para obtener una única célula, y opcionalmente el recultivo posterior de las células únicas para obtener un conjunto monoclonal de células APC o eTPC-t seleccionadas.

Puede obtenerse un producto primario de células APC y/o eTPC-T clasificando las células en un grupo para obtener un grupo de células, y opcionalmente el recultivo posterior del grupo de células para obtener un conjunto monoclonal de células APC o eTPC-t seleccionadas.

Obtención de productos finales del sistema finales del sistema eTPC:A

Con posterioridad a los métodos anteriormente descritos para obtener productos primarios, en donde las productos primarios son APC analito y/o eTPC-t analito seleccionadas, que se han seleccionado según una respuesta de señal medida o la formación de complejo estable, de modo que pueden obtenerse productos finales del sistema eTPC:A mediante procesamiento adicional de los productos primarios de APC y/o eTPC seleccionados.

En el presente contexto, los productos finales del sistema multicomponente son las identidades de

i. aAPX y/o

ii. aAM y/o

iii. aAPX:aAM y/o

iv. CM y/o

v. aAPX:CM y/o

vi. TCRsp

presentado por la APC analito o eTPC-t analito o un reactivo de afinidad o NCBP analito, y obtenidas como productos primarios del sistema multicomponente por su selección del sistema eTPC:A combinado.

Dentro del sistema eTPC:A, se da frecuentemente el caso de que las moléculas de analito presentadas por la APC analito y la eTPC analito están codificadas genéticamente. También puede suceder que una NCBP analito tenga una identidad codificada genéticamente, por ejemplo, en el caso de NCBP presentadas por bacteriófagos. Por lo tanto, para identificar las moléculas analito presentadas por la APC analito o la eTPC-t analito, puede realizarse la secuenciación genética de la APC analito, eTPC-t y NCBP analito preparadas.

La APC puede procesarse de modo que se obtenga la secuencia genética del genoma o transcriptoma de las células APC clasificadas y/o expandidas para determinar la identidad de

i. aAPX y/o

ii. aAM y/o

iii. aAPX:aAM

iv. CM y/o

v. aAPX:CM y/o

en donde las identidades obtenidas representan productos finales del sistema eTPC:A. En el presente contexto, la NCBP analito que posee un componente genético puede procesarse de modo que se obtenga la secuencia genética del genoma o transcriptoma de la NCBP analito clasificada y/o expandida para determinar la identidad de la NCBP analito, en donde las identidades obtenidas representan los productos finales del sistema eTPC:A.

Una eTPC-t puede procesarse de modo que se obtenga la secuencia genética del componente 2B ' y/o el componente 2D ' de las células eTPC-t clasificadas y/o expandidas para determinar la identidad de la TCRsp, en donde la identificación obtenida de la TCRsp generada por el TORES representa un producto final del sistema eTPC:A. eTPC puede procesarse de modo que se obtenga la secuencia genética del genoma o transcriptoma de las células eTPC-t clasificadas y/o expandidas para determinar la identidad de la TCRsp, en donde la identificación obtenida de TCRsp representa un producto final del sistema eTPC:A.

La secuenciación genética puede lograrse por diversos modos, y a partir de diversas fuentes de material genético, con y sin procesamiento específico.

En el presente contexto, la etapa de secuenciación puede estar precedida por

i. Extracción de ADN genómico y/o

ii. Extracción de los componentes 2B ' y/o 2D ' del transcrito de ARN y/o

iii. Amplificación mediante PCR del ADN que codifica el componente 2B ' y/o 2D '

iv. Amplificación mediante RT-PCR del transcrito de ARN derivado del componente 2B ' y/o 2D\

La etapa de secuenciación puede ser destructiva para la APC o eTPC-t o NCBP analito, o un grupo de las mismas, obtenidos como productos primarios del sistema multicomponente.

Si se desean obtener productos primarios del sistema eTPC:A en donde la etapa de secuenciación ha sido destructiva para la eTPC-t del producto primario, la información de la secuencia obtenida como producto final del dispositivo de dos partes puede utilizarse para preparar una eTPC-t de producto equivalente como eTPC-t analito.

En los escenarios descritos anteriormente de moléculas de analito codificadas genéticamente, pueden obtenerse productos finales del sistema eTPC:A obteniendo información de secuencia a partir del componente2B' y/o 2D ' y/o a partir del genoma de la célula y/o transcriptoma. Sin embargo, en algunas realizaciones, la información del antígeno no estará codificada genéticamente. Existe la posibilidad de que antígenos modificados postraduccionalmente, antígenos proporcionados al sistema eTPC:A combinado por medios no genéticos, antígenos que surgen de un estado inducido o modificado del proteoma o metabolito del APC analito, CM intrínseco del sistema eTPC:A y reactivos de afinidad o NCBP sin un elemento genético, no se identifiquen razonablemente por medios de secuenciación genética.

En el caso importante de un aAM que puede proporcionarse al sistema eTPC:A por medios no genéticos, existen dos modos distintos mediante los cuales una APC puede presentar una aAM proporcionada como un complejo aAPX:aAM. En el primer escenario, la aAM se proporciona en una forma que puede unirse directamente al aAPX y formar un complejo aAPX:aAM en la superficie celular. Un ejemplo de sistema eTPC:dicha aAM sería un antígeno peptídico de un complejo HLA.

En el segundo escenario, la aAM se proporciona en una forma que la APC analito puede captar y procesarse de modo que se lleva como carga en el aAPX y forma un complejo aAPX:aAM en la superficie celular.

Un método para seleccionar e identificar una carga de aAM o una carga de CM, en donde la carga es un metabolito y/o un péptido, cargada en un aAPX de una APC seleccionada y que se obtiene como producto primario del sistema multicomponente; comprendiendo el método

i. aislar un aAPX:aAM o un aAPX:CM o la carga aM o la carga CM e

ii. identificar la carga llevada

en donde la carga llevada identificada (CM o aAM) representa los productos finales del dispositivo de dos partes.

De forma general hay dos modos mediante los que puede identificarse una molécula de carga a partir de una APC seleccionada. Primero, una liberación forzada de la carga del aAPX:aAM o aAPX:CM da lugar a aislamiento de la aAM o CM que queda disponible para su posterior identificación. Un ejemplo de esto es el lavado ácido de la APC para liberar el péptido aAM de los complejos de HLA. En segundo lugar, la captura del aAPX:aAM o aAPX:CM, por ejemplo, mediante la liberación del complejo y métodos de aislamiento por inmunoafinidad, da lugar al aislamiento del aAPX:aAM o aAPX:CM, de modo que la aAM o CM puedan identificarse.

Los métodos para identificar directamente aAM y/o CM aisladas o procedentes de complejos aAPX:aAM o aAPX:CM aislados pueden comprender

i. Análisis por espectrometría de masas

ii. Análisis de secuenciación de péptidos

en donde las identidades de aAM y/o CM contenidas son productos finales del dispositivo de dos partes. Determinar la afinidad del TCRsp con el antígeno analito utilizando el del dispositivo de dos partes como sistema eTPC:A

Después de los métodos descritos anteriormente para obtener productos primarios, en donde las productos primarios son células eTPC-t analito seleccionadas que se seleccionan sobre la base de una respuesta de señal medida, las productos primarios de eTPC-T pueden someterse a un análisis de afinidad para determinar la afinidad de la TCRsp con un antígeno analito afín en donde el antígeno analito es cualquiera de los siguientes i. aAPX y/o

ii. aAM y/o

iii. aAPX:aAM y/o

iv. CM y/o

v. aAPX:CM

y en donde el antígeno analito se proporciona como reactivo de afinidad soluble o se presenta por una APC analito, o NCBP analito de modo que la afinidad de la TCRsp analito se determina según el siguiente método i. Marcado de la eTPC-t analito seleccionada con el antígeno analito en el intervalo de concentraciones ii. Realizar un análisis FACS de las eTPC-t teñidas con analito de la etapa a

iii. Determinar la intensidad del marcado fluorescente de la eTPC-t analito en el intervalo de concentraciones de antígeno analito

iv. Calcular la afinidad de la TCRsp con el antígeno analito

La afinidad de la TCRsp analito también puede determinarse mediante el método descrito anteriormente, pero en donde también puede incluirse una referencia etiquetada, de modo que la afinidad se calcula utilizando la relación entre la intensidad de fluorescencia del antígeno analito y la intensidad de fluorescencia de referencia, en donde la referencia marcada se selecciona de

i. La eTPC-t analito marcada con un reactivo de afinidad a una de las cadenas del TCR analito o a ambas cadenas del TCR analito

ii. El eTPC-t analito marcado con un reactivo de afinidad con una o más de las proteínas CD3

iii. una célula o partícula que presenta una única cadena de TCR de referencia marcada o par de referencia marcado de cadenas de TCR

Leyendas de las Figuras

Figura 1. Un dispositivo de dos partes que comprende un sistema de reconstitución y diseño del ORF del TCR (TORES) y un sistema celular que presenta TCR (eTPCS) diseñado por ingeniería genética.

Una parte del dispositivo de dos partes representa un sistema de reconstitución e ingeniería del TCR del ORF (TORES, panel superior). Este sistema representa un sistema de vectores bicomponente basado en genotecas de secuencia fija, que cuando se combina con un tercer componente de secuencia no fija se utiliza para reconstituir y diversificar los ORF de TCR. Se ilustra la función de la característica general de la genoteca del sistema de reconstitución del ORF del TCR en el panel superior. Se selecciona un único vector de entrada V-C de una genoteca de vectores de entrada V-C con combinaciones V-C variables (Componente 1A). Esta selección se basa en las secuencias de combinación V-C necesarias para una cadena del TCR seleccionada. Un único vector de entrada J se selecciona de una genoteca de vectores donantes J con segmentos génicos J codificados variables (Componente 1B). Esta selección se basa en las secuencias de combinación J necesarias para la misma cadena del TCR seleccionada que la del vector de entrada V-C. Por último, se selecciona un dúplex oligomérico que codifica CDR3 (odeCDR3) para completar el ORF de longitud completa de la cadena diana del TCR (Componente 1C). Estos tres componentes (1A, 1B y 1C) se combinan en una sola reacción junto con las enzimas de restricción y ligasa adecuadas. El ciclo de reacción produce un ORF del TCR reconstituido en una sola etapa en el contexto de la cadena principal del vector de entrada V-C (Producto de reacción). Estos ORF de TCR representan componentes del vector de integración 2C y 2E de la segunda parte del dispositivo de dos partes.

La parte dos del dispositivo de dos partes representa un sistema de células presentadoras de TCR (eTPCS) diseñado mediante ingeniería genética, que comprende cinco o seis componentes. El primer componente 2a es la propia línea eTPC con todas las características diseñadas requeridas para esa célula. El 2A eTPC contiene tres componentes adicionales, dos de los cuales son 2B y 2D, que son sitios del receptor genómico para la integración de un par de cadenas del TCR analito. Un tercer componente opcional incluido en la eTPC, 2A, es una construcción indicadora sintética que se induce tras la ligación del TCR, 2F. Dos componentes independientes adicionales, 2C y 2E, representan vectores de integración genética para la integración dirigida de los ORF en los sitios 2B y 2D, respectivamente, en donde las flechas indican especificidad acoplada. Cada uno de los componentes 2C y 2E representa un producto de reacción de la primera parte del dispositivo de dos partes.

Figura 2. Descripción genérica de la entrada genética, subproductos, intermedios y producto del sistema de vectores bicomponente para ensamblar un ORF del TCR utilizando un TORES.

Se ilustran los dos componentes del sistema vectorial (a y b), el dúplex de oligonucleótido (c); cuando estos tres componentes se combinan en una sola reacción con la enzima de restricción de Tipo IIS y ligasa, se generan dos subproductos de reacción (d y e), dos productos intermedios de reacción (f y g) y un producto de reacción (h). Los vectores de entrada y el producto del sistema bicomponente se representan como esquemas de plásmidos circularizados donde los elementos genéticos están representados como cuadros marcados; los vectores plasmídicos abiertos que representan el subproducto o producto intermedio son esquemas de plásmidos no circularizados donde los elementos genéticos están representados como cuadros marcados; y el ADN lineal se representa como una serie de cuadros marcados que describen elementos genéticos.

a) Representa un esquema de plásmido circularizado de un vector de entrada V-C con los elementos genéticos mínimamente necesarios representados como cuadros marcados. Kozak se refiere a la secuencia consenso que desempeña un papel en el inicio eficiente de la traducción. Segmento V se refiere a una secuencia seleccionada que codifica una parte del ORF de la línea germinal variable del TCR, u ORF mutante/sintético. Tipo IIS^ se refiere a un sitio de unión de enzimas de restricción de Tipo IIS orientado de forma que la enzima corta en la dirección 5'. Tipo IIS^ se refiere a un sitio de unión de enzimas de restricción de Tipo IIS orientado de forma que la enzima corta en la dirección 3'. Selección - se refiere a un elemento de selección negativo diseñado para ser perjudicial para el plásmido que contiene la secuencia durante la reacción de reconstrucción del TCR de longitud completa, o en etapas de selección posteriores. Segmento C se refiere a una secuencia seleccionada que codifica una parte del ORF de la línea germinal constante del TCR, o ORF mutante/sintético. Selección + n.° 1 se refiere a un primer marcador de selección positiva del TORES utilizado para transmitir una ventaja selectiva al organismo que aloja el vector, y que es diferente del marcador de selección positiva del segundo componente vectorial (b). Ori se refiere a un origen de replicación utilizado para la propagación del plásmido dentro de un hospedador compatible. Elemento genético 5 ' se refiere a cualquier elemento genético deseado que proporciona atributos requeridos para la aplicación posterior del TCR de longitud completa reconstruido, y debe situarse 5' del TCR de longitud completa reconstruido, incluyendo al menos una secuencia que guía la integración directa de los sitios del receptor genómico contenidos dentro del eTPCS. Elemento genético 3 ' se refiere a cualquier elemento genético deseado que proporciona atributos requeridos para la aplicación posterior del TCR de longitud completa reconstruido, y debe situarse 3' del ORF del TCR de longitud completa, incluyendo al menos una secuencia que guía la integración directa de los sitios del receptor genómico contenidos dentro del eTPCS.

b) Representa un esquema de plásmido circularizado de un vector donante J con las características genéticas mínimamente necesarias representadas como cuadros marcados. La parte del segmento J se refiere a una secuencia de ADN que codifica una parte de un ORF de la línea germinal de unión a TCR, o segmento génico J mutante/sintético. La Parte C se refiere a una pequeña parte 5' del segmento génico constante del TCR. Tipo IIS^ se refiere a un sitio de unión de enzimas de restricción de Tipo IIS orientado de forma que la enzima corta en la dirección 5'. Tipo IIS^ se refiere a un sitio de unión de enzimas de restricción de Tipo IIS orientado de forma que la enzima corta en la dirección 3'. Selección + n.° 2 se refiere al segundo marcador de selección positiva del TORES utilizado para transmitir una ventaja selectiva al organismo que aloja el vector, y que es diferente del marcador de selección positiva del primer componente vectorial (a).

Ori se refiere a un origen de replicación utilizado para la propagación del plásmido dentro de un hospedador compatible.

c) Representa un tercer componente que completa la secuencia de ORF de TCR diana como un dúplex de oligonucleótidos que codifica la región CDR3 (odeCDR3). Este dúplex de oligonucleótido de ADN que contiene la secuencia de CDR3 flanqueada por dos salientes de ADN monocatenario, saliente £ 1-5' y el saliente £ 1-3'. El saliente £ 1-5' es compatible con el saliente £ 1-3' en el intermedio del vector de entrada V-C abierto (g). El saliente £2-3' es compatible con el saliente £ 2-5' en el intermedio del vector de entrada V-C abierto (f).

d) La digestión del vector de entrada V-C (a) con la enzima de restricción de Tipo IIS da lugar a un subproducto de reacción del vector de entrada V-C de ADN lineal que contiene el elemento de selección - y los elementos de Tipo IIS^ y de Tipo IIS^ .

e) La digestión del vector donante J (b) con la enzima de restricción de Tipo IIS da lugar a un subproducto plasmídico circularizado que contiene todos los elementos genéticos del plásmido parental excepto los que lleva el intermedio del fragmento donante J escindido (f).

f) La digestión del vector donante J (b) con la enzima de restricción de Tipo IIS da lugar a un fragmento de ADN lineal que contiene la parte del segmento J y la parte C flanqueadas por salientes de ADN monocatenario, salientes £ 2- 5' y salientes £ 3-3'. El saliente £2-5' es compatible con el saliente £2-3' en el dúplex de oligonucleótido de ADN de CDR3 (c). El saliente £3-3' es compatible con el saliente £3-5' en el intermedio del vector de entrada V-C abierto (g).

g) La digestión del vector de entrada V-C (a) con la enzima de restricción de Tipo IIS da lugar a un intermedio de plásmido no circularizado que contiene todos los elementos genéticos del plásmido parental excepto los que tiene el subproducto de la reacción del vector de entrada V-C del ADN lineal escindido (d). La digestión crea adicionalmente dos salientes de ADN monocatenario, saliente £ 1-3' y saliente £3-5'. El saliente £ 1-3' es compatible con el saliente £ 1-5' en el dúplex de oligonucleótidos de ADN de CDR3 (c). El saliente £ 3-5' es compatible con el saliente £ 3-3' en el intermedio del vector de entrada V-C abierto (f).

h) La ligación de los tres salientes compatibles de ADN monocatenario da lugar al vector ORF de longitud completa del TCR como plásmido circularizado (h). Este plásmido contiene todos los elementos genéticos del vector de entrada V-C parental (a) con excepción del subproducto de reacción del vector de entrada V-C escindido (d). Además, el vector ORF del TCR de longitud completa incorpora la secuencia de CDR3 del dúplex de oligonucleótidos de ADN de CDR3 (c) y la parte del segmento J y la parte C del intermedio de reacción del fragmento donante J (f). Las flechas indican los puntos aproximados de ligación entre los salientes de ADN monocatenario compatibles £ 1, £ 2 y £ 3. El punto de ligación £ 1 comprende los elementos £ 1-3' y £ 1-5' donados por el intermedio de reacción del vector de entrada V-C (g) y el dúplex de oligonucleótidos ADN (c) de CDR3, respectivamente. El punto de ligación £2 comprende los elementos £2-3' y £2-5' donados por el dúplex de oligonucleótidos de ADN CDR3 (c) y el intermedio de reacción del fragmento donante J (f), respectivamente. El punto de ligación £3 comprende los elementos £3-3' y £3-5' donados por el intermedio de reacción del fragmento donante J (f) y el intermedio de reacción del vector de entrada V-C (g), respectivamente.

Figura 3 Funcionamiento del TORES para generar cadenas del TCR diversificadas en CDR3

Se muestra una representación esquemática del TORES cuando se utiliza para generar cadenas del TCR de longitud completa con inserciones de CDR3 diversificadas. Se define un TCR parental utilizando V-J-C, y se define la secuencia de la región CDR3. Se introdujeron en el tubo de reacción el vector de entrada V-C único correspondiente (cuadro i) y el único vector donante J (cuadro ii). Se sintetizó un conjunto de odeCDR3 con degeneración de nucleótidos posicional y/o mutagénesis puntual definida que cambia la secuencia de aminoácidos codificada (Cuadro iii). Dicho grupo de CDR3 podría incluir secuencias de CDR3 completamente aleatorizadas dentro de los límites del marco de odeCDR3 definido para crear ORF del TCR de longitud completa 'sintéticos' que contienen CDR3 utilizando V-J-C la de línea germinal. Estos tres componentes (Cuadro i, ii y iii) se combinan en una sola reacción junto con las enzimas de restricción y ligasa adecuadas. El ciclo de reacción produce numerosos ORF del TCR de longitud completa reconstituidos variantes, proporcional al número de odeCDR3 variantes incluidas, en una sola etapa en el contexto de la cadena principal del vector de entrada V-C (Cuadro iv).

Figura 4 Actuación del TORES para generar cadenas del TCR diversificadas en segmentos V

Se muestra una representación esquemática del TORES cuando se utiliza para generar cadenas del TCR de longitud completa con usos del segmento V diversificados. Se define un TCR parental utilizando V-J-C, y se define la secuencia de la región CDR3. El único vector donante J correspondiente (cuadro ii) se introdujo en el tubo de reacción, al igual que el único odeCDR3 sintetizado para corresponder con la secuencia de la región CDR3 parental (cuadro iii). Se añade también al tubo de reacción una selección de vectores de entrada V-C, que corresponde a los segmentos V y C deseados en el producto ORF del TCR de longitud completa diversificado del segmento V del producto (Cuadro i). Estos tres componentes (Cuadro i, ii y iii) se combinan en una sola reacción junto con las enzimas de restricción y ligasa adecuadas. El ciclo de reacción produce numerosos ORF del TCR de longitud completa reconstituidos variantes, proporcional al número de vectores de entrada V-C variantes incluidos, en una sola etapa en el contexto de la cadena principal del vector de entrada V-C (Cuadro iv).

Figura 5 Funcionamiento del TORES para generar cadenas del TCR diversificadas en el segmento J

Se muestra una representación esquemática del TORES cuando se utiliza para generar cadenas del TCR de longitud completa con uso diversificado del segmento J. Se define un TCR parental utilizando V-J-C, y se define la secuencia de la región CDR3. El único vector de entrada V-C correspondiente (cuadro i) se introdujo en el tubo de reacción, al igual que el único odeCDR3 sintetizado para que corresponda a la secuencia de la región CDR3 parental (cuadro iii). También se añade al tubo de reacción una selección de donantes J, que corresponde a los segmentos J deseados en el producto ORF del TCR de longitud completa diversificado del segmento J del producto (Cuadro ii). Estos tres componentes (Cuadro i, ii y iii) se combinan en una sola reacción junto con las enzimas de restricción y ligasa adecuadas. El ciclo de reacción produce una serie de ORF de TCR de longitud completa reconstituidos variantes, proporcional al número de vectores de entrada donantes J incluidos, en una sola etapa en el contexto de la cadena principal del vector de entrada V-C (Cuadro iv).

Figura 6 Funcionamiento del TORES para generar cadenas del TCR diversificadas en segmentos V/J

Se muestra una representación esquemática del TORES cuando se utiliza para generar cadenas del TCR de longitud completa con uso diversificado de segmentos V y J. Se define un TCR parental utilizando V-J-C, y se define la secuencia de la región CDR3. El odeCDR3 único correspondiente se sintetizó para que corresponda a la secuencia de la región CDR3 parental (Cuadro iii). Se añadió al tubo de ensayo una selección de vectores de entrada V-C y vectores donantes J, que corresponde a la combinación de los segmentos V(C) y J deseados en el producto ORF del TCR de longitud completa diversificado para el segmento V/J (Cuadro ii). Estos tres componentes (Cuadro i, ii y iii) se combinan en una sola reacción junto con las enzimas de restricción y ligasa adecuadas. El ciclo de reacción produce numerosos ORF del TCR de longitud completa reconstituidos variantes, proporcional al número de combinaciones de vectores donantes V-C y J posibles a partir de los incluidos, en una sola etapa en el contexto de la cadena principal del vector de entrada V-C (Cuadro iv).

Figura 7 Compilación de poblaciones de eTPC-x intermedias y eTPC-t analito a partir de eTPC.

El funcionamiento del dispositivo de dos partes implica la inserción de vectores preparados dentro del TORES en el eTPCS para preparar poblaciones de eTPC analito para crear células que expresan la TCRsp analito o un intermedio que expresa cadenas individuales de TCR analito. Una eTPC que presenta TCRsp se denomina eTPC-t, y puede crearse mediante la introducción de dos ORF que codifican cadenas del TCR complementarias para la eTPC (etapa i). Una eTPC que expresa solamente una única cadena de TCR analito se denomina eTPC-x, y puede crearse mediante la introducción de uno o varios un (os) ORF que codifican una sola cadena del TCR para la eTPC (etapa ii). De forma alternativa, una eTPC-t puede crearse a partir de una eTPC-x, en donde un o Rf que codifica una segunda cadena complementaria del TCR se introduce en una eTPC-x existente (etapa iii). En algunos casos, puede crearse una eTPC-x a partir de una eTPC-t mediante la eliminación de una única cadena de TCR analito (etapa iv).

Figura 8 Compilación de una eTPC-t en una etapa.

La eTPC 2A contiene sitios del receptor genómico distintos, 2B y 2D. La eTPC 2A puede contener además un elemento 2F de respuesta a la señal del TCR. Los distintos vectores de integración genética 2C y 2E generados dentro del TORES se acoplan independientemente a 2B y 2D, respectivamente. El vector de integración 2C codifica una sola cadena del TCR, y el vector de integración 2E codifica una segunda cadena del TCR complementaria. La eTPC 2A se combina con los vectores de integración 2C y 2E. La célula resultante tiene la inserción 2C intercambiada al sitio del receptor genómico 2B para crear el sitio 2B' y suministrar un ORF para una primera cadena de TCR. Además, la línea celular resultante tiene la inserción 2E intercambiada al sitio del receptor genómico 2D para crear el sitio 2D' y suministrar un ORF para una segunda cadena de TCR. Esta célula es capaz de presentar una TCRsp en la superficie y, por lo tanto, se designa una eTPC-t.

Figura 9 Compilación de una eTPC-t en dos etapas a través de un intermedio eTPC-x.

La eTPC 2A contiene sitios del receptor genómico distintos, 2B y 2D. La eTPC 2A puede contener además un elemento 2F de respuesta a la señal del TCR. Los distintos vectores de integración genética 2C y 2E generados dentro del TORES se acoplan independientemente a 2B y 2D, respectivamente. El vector de integración 2C codifica una sola cadena del TCR, y el vector de integración 2E codifica una segunda cadena del TCR recíproca. En la ETAPA 1, se combina una eTPC 2A con el vector de integración 2C. La célula resultante tiene el ORF de TCR de 2C intercambiado al sitio del receptor genómico de 2B para crear el sitio 2B' y suministrar un ORF para una primera cadena del TCR. Esta célula expresa únicamente una única cadena del TCR y, por lo tanto, se designa eTPC-x. El sitio del receptor genómico 2D queda sin usar. En la ETAPA 2, la eTPC-x se combina con el vector de integración 2E. La célula resultante tiene la inserción 2E intercambiada al sitio del receptor genómico 2D para crear el sitio 2D' y suministrar un ORF para una segunda cadena de TCR complementaria. Esta célula es capaz de presentar una TCRsp en la superficie y, por lo tanto, se designa una eTPC-t.

Figura 10 Reversión de una eTPC-t a una eTPC-x

La célula representada en el panel superior es capaz de presentar una TCRsp en la superficie y, por lo tanto, se designa una eTPC-t. Esta eTPC-t tiene sitios del receptor genómico 2B y 2D ocupados por los ORF del TCR, lo que los convierte en las formas 2B ' y 2D '. Vectores de integración genética que contienen uno o más marcadores del sitio del receptor genómico y acoplados a sitios 2B ' o 2D ', designados 2Y y 2Z. La adición de 2Y o 2Z a la eTPC-t intercambiará el marcador del sitio del receptor genómico para la cadena del TCR codificada por 2B ' o 2D '. La célula resultante expresa solamente una única cadena del TCR, y por lo tanto se designa eTPC-x.

Figura 11. Recopilación aleatoria de un grupo eTPC-t de una eTPC para expresar combinaciones aleatorias de TCRsp a partir de una genoteca de cadenas del TCR.

La eTPC 2A contiene sitios de receptor genómico distintos, 2B y 2D. Los distintos vectores de integración genética 2C y 2E se acoplan independientemente a 2B y 2D, respectivamente. Cada uno de los vectores de integración 2C i y 2C ii codifica una única cadena del TCR, y cada uno de los vectores de integración 2E i y 2E ii codifica una única cadena del TCR complementaria. La eTPC 2A puede contener además un elemento 2F de respuesta a la señal del TCR. La eTPC 2A se combina con los vectores de integración 2C i, 2C ii, 2E i y 2E ii. El grupo de células resultante tiene ORF de TCR de 2C i o 2C ii intercambiados al sitio del receptor genómico 2B, en múltiples casos independientes para crear los sitios 2B ' i y 2B ' ii, cada uno suministra un solo ORF para una cadena del TCR. El grupo de células resultante tiene, además, la inserción 2E i o 2E ii intercambiada con el sitio del receptor genómico 2Dl, en múltiples casos independientes para crear los sitios 2D' i y 2D ' ii, cada uno suministra un solo ORF para una cadena del TCR complementaria de los que se encuentran en los sitios 2C ' i y 2C' ii. El grupo de células eTPC-t resultante comprende una población mixta de cuatro cohortes celulares distintas, expresando cada una de ellas unaTCRsp aleatoria discreta en la superficie que comprende una de cada cadena de TCR complementaria contenida en la genoteca de vectores inicial. Este proceso puede escalarse a diferente número de variantes 2C y 2E para lograr genotecas celulares con presentación aleatoria de TCRsp a diversas escalas.

Figura 12. Recopilación aleatoria de un grupo de eTPC-t de una eTPC-x con cadenas de TCR analito no emparejadas para expresar combinaciones aleatorias de pares de cadenas de TCR emparejadas a partir de una genoteca de cadenas del TCR.

Una eTPC-x precompilada contiene el sitio de receptor genómico intercambiado 2B ' que expresa una sola cadena del TCR y el sitio de receptor genómico distinto 2D. Los vectores de integración genética 2e i y 2E ii distintos se acoplan a 2D. Cada uno de los vectores de integración 2E i y 2E ii codifica una sola cadena del TCR. La eTPC-x puede contener además,un elemento 2F de respuesta a la señal del TCR. La eTPC-x se combina con los vectores de integración 2E i y 2E ii. El grupo de células resultante tiene la inserción 2E i o 2E ii intercambiada al sitio del receptor genómico 2D, en múltiples casos independientes para crear los sitios 2E i y 2E ii, cada uno suministra un solo ORF para una cadena del TCR. El grupo de células eTPC-t resultante comprende una población mixta de cohortes celulares distintas que expresan una TCRsp independiente en la superficie comprendida de la cadena del TCR expresada a partir de 2B ' emparejado con una única cadena de TCR complementaria aleatorizada contenida en la genoteca de vectores inicial.

Figura 13. Recopilación aleatoria de un grupo eTPC-x de una eTPC para expresar miembros aleatorios de una genoteca de cadena del TCR.

La eTPC 2A contiene sitios del receptor genómico distintos, 2B y 2D. Los distintos vectores de integración genética 2C y 2E se acoplan independientemente a 2B y 2D, respectivamente. Cada uno de los vectores de integración 2C i, 2C ii y 2C ii codifica una sola cadena del TCR. La eTPC 2A puede contener además un elemento 2F de respuesta a la señal del TCR. La eTPC 2A se combina con los vectores de integración 2C i, 2C ii y 2C iii. El grupo de células resultante tiene ORF de TCR de 2C i, 2C ii o 2C iii intercambiados al sitio del receptor genómico 2B, en múltiples casos independientes para crear los sitios 2B ' i y 2B' ii o 2B' iii, cada uno suministra un solo ORF para una cadena del TCR. El grupo de células eTPC-x resultante comprende una población mixta de distintas cohortes celulares, expresando cada una de ellas una cadena de TCR aleatorizada discreta contenida en la genoteca del vector inicial. Este proceso puede escalarse a diferente número de variantes 2C para lograr genotecas celulares con presentación aleatoria de cadenas del TCR a diversas escalas.

Figura 14. Recopilación aleatoria de un grupo de eTPC-t de un grupo de eTPC-x con cadenas de TCR analito no emparejadas para expresar combinaciones aleatorias de TCRsp emparejadas a partir de una genoteca de cadenas del TCR.

Un grupo de eTPC-x contiene el sitio de receptor genómico intercambiado 2B ' i, 2B ' ii o 2B ' iii, expresando cada uno una sola cadena del TCR, y el sitio del receptor genómico distinto 2D. Los vectores de integración genética 2E i distintos se acoplan a 2D. Los vectores de integración 2E codifican una sola cadena del TCR. La eTPC-x puede contener además, un elemento 2F de respuesta a la señal del TCR. La eTPC-x se combina con los vectores de integración 2E. El grupo de células resultante tiene ORF de TCR de 2E intercambiado al sitio del receptor genómico 2D, en múltiples casos independientes para crear el sitio 2D', que suministra un solo ORF para una cadena del TCR. El grupo de células eTPC-t resultante comprende una población mixta de cohortes celulares distintas que expresan una TCRsp independiente en la superficie comprendida de la cadena del TCR expresada a partir de una combinación de las cadenas del TCR codificadas por 2B ', emparejadas con la cadena de TCR contenida en 2D'. Este proceso puede escalarse a un número distnto de variantes 2E para obtener genotecas celulares con presentación aleatoria de TCRsp a diversas escalas.

Figura 15 Funcionamiento de un sistema eTPC:A analito combinado que muestra posibles estados de resultado de eTPC-t analito unida al reactivo de afinidad o NCP.

La eTPC-t analito contiene los sitios 2B ' y 2D ', cada uno integrado con un ORF que codifica una TCRsp recíproca en la superficie. Cuando se ponen en contacto la eTPC-t analito y el reactivo de afinidad o NCBp analito, pueden lograrse diferentes estados de marcado eTPC-t; en este ejemplo, uno negativo y tres positivos. El estado negativo es el estado de reposo de la entrada eTPC-t, sin unión detectable del reactivo de afinidad o NCBP analito, lo que denota el fallo del reactivo de afinidad o NCBP analito para formar un complejo estable con el TCRsp presentado eTPC-t. Tres estados positivos muestran un intervalo hipotético del grado de unión del reactivo de afinidad o NCBP analito, como se indica con un sombreado más oscuro de las células. Esto indica una unión gradual del reactivo de afinidad analito o NCBP analito a la población de TCRsp expresada por la población eTPC-T.

Figura 16 Funcionamiento de un sistema eTPC:A analito combinado que muestra posibles estados de salida eTPC-t indicados por la señal en respuesta al reactivo de afinidad o NCBP analito.

La eTPC-t analito contiene los sitios 2B' y 2D', cada uno integrado con un ORF que codifica una TCRsp recíproca en la superficie. La eTPC-t contiene además un elemento 2F de respuesta a la señal del TCR. Cuando se ponen en contacto la eTPC-t analito y el reactivo de afinidad o NCBP analito, pueden lograrse diferentes estados de respuesta de eTPC-t, en este ejemplo, uno negativo y tres positivos. El estado negativo es el estado de reposo de la entrada eTPC-t, sin intensidad de la señal en el elemento 2F, lo que denota el fallo del reactivo de afinidad o NCBP analito para formar un complejo y estimular la TCRsp presentada a la eTPC-t. Tres estados positivos muestran una intensidad de señal creciente a partir de 2F. Los estados 2F'+, 2F'++ y 2F'+++ indican intensidad de señal baja, media y alta, respectivamente. El producto génico de 2F denotado como hexágonos se acumula para indicar la intensidad de la señal de cada estado celular, como lo indica el sombreado más oscuro de las células. Esto indica una respuesta graduada de TCRsp analito expresada por la población de eTPC-t hacia el reactivo de afinidad o NCBP analito, dando como resultado la transducción de señal al elemento 2F.

Figura 17 Funcionamiento de un sistema eTPC:A analito combinado que muestra posibles estados de resultado eTPC-t indicados por la señal en respuesta a la APC analito.

La eTPC-t analito contiene los sitios 2B ' y 2D ', cada uno integrado con un ORF que codifica una TCRsp recíproca en la superficie. La eTPC-t contiene además un elemento 2F de respuesta a la señal del TCR. Cuando se ponen en contacto la eTPC-t analito y APC analito, pueden lograrse diferentes estados de respuesta de eTPC-t, en este ejemplo, uno negativo y tres positivos. El estado negativo es el estado de reposo de eTPC-t, sin intensidad de señal en el elemento 2F , lo que indica el fracaso del analito aAPX:aAM/CM presentado por APX o aAM para estimular la TCRsp presentada a la eTPC-t. Tres estados positivos muestran una intensidad de señal creciente a partir de 2F . Los estados 2F '+, 2F '++ y 2F '+++indican intensidad de señal baja, media y alta, respectivamente. El producto génico de 2F denotado como hexágonos se acumula para indicar la intensidad de la señal de cada estado celular, como lo indica el sombreado más oscuro de las células. Esto indica una respuesta graduada de TCRsp analito expresada por la población eTPC-t hacia el analito aAPX:aAM/CM o aAM presentado por la APC analito.

Figura 18 Funcionamiento de un sistema eTPC:A analito combinado que muestra posibles estados de resultado de APC analito.

La eTPC-t analito contiene los sitios 2B ' y 2D ', cada uno integrado con un ORF que codifica una TCRsp recíproca en la superficie. La eTPC-t contiene además un elemento 2F de respuesta a la señal del TCR . Cuando se ponen en contacto la eTPC-t analito y APC analito, pueden lograrse diferentes estados de respuesta de APC, en este ejemplo, uno negativo y tres positivos. El estado negativo es el estado de reposo del APC analito, que denota el fracaso del par de cadenas de TCRsp para estimular el complejo aAPX:aAM/CM o aAM presentado por la APC analito. Tres estados positivos muestran una intensidad de señal creciente a partir de los aAPX:aAM/CM o aAM contactados. La intensidad de la señal comunicada de cada estado de la célula se indica con *, **, *** y también se denota mediante un sombreado más oscuro de las celdas. Esto indica una respuesta graduada del aAPX:aAM/CM o aAM analito hacia el par de cadenas de TCRsp analito presentado por la eTPC-t analito.

Figura 19 Funcionamiento de un sistema eTPC:a combinado para identificar pares de cadenas de TCRsp que se unen al reactivo de afinidad o NCBP analito de un grupo de eTPC-t.

El grupo de eTPC-t contiene células que contienen sitios 2B ' i, ii o iii y 2D ' i, ii o iii, en donde cada eTPC-t está integrada por un par de ORF que codifican un par de cadenas de TCR complementarias y, por lo tanto, cada cohorte celular de la población expresa una TCRsp independiente en la superficie. Un reactivo de afinidad o NCBP analito se pone en contacto con la mezcla de eTPC-T analito. En el presente ejemplo, solo el par de cadenas de TCR expresadas a partir de 2B ' i/2D ' i (TCRspi) es específico del reactivo de afinidad o NCBP analito, de modo que solo la cohorte celular de la eTPC-t que contiene TCRspi (eTPC-t*) es capaz de unirse de modo detectable con el antígeno o NCBP analito (*). La eTPC-t* unida al reactivo de afinidad analito (o NCBP) puede seleccionarse del grupo sobre la base del reactivo de afinidad (o NCBP) marcado. Posteriormente, los ORF que codifican TCRsp de las eTPC-t* seleccionadas y aisladas pueden identificarse por secuenciación de ADN de 2B ' y 2D ' directa o indirectamente mediante PCR con transcriptasa inversa de los transcritos expresados de 2B ' y 2D'.

Figura 20 Funcionamiento de un sistema eTPC:A combinado para identificar pares de cadenas de TCRsp a partir de una mezcla de eTPC-t mediante la inducción de una respuesta indicador-señal a través de la estimulación con reactivo de afinidad o NCBP analito.

El grupo de eTPC-t contiene células que contienen sitios 2B' i, ii o iii y 2D ' i, ii o iii, en donde cada eTPC-t está integrada por un par de ORF que codifican un par de cadenas de TCR complementarias y, por lo tanto, cada cohorte celular de la población expresa una TCRsp independiente en la superficie. La eTPC-t contiene además un elemento 2F de respuesta a la señal del TCR. Un antígeno o NCBP analito se pone en contacto con la mezcla de eTPC-T analito. En el presente ejemplo, solo el par de cadenas de TCR expresadas a partir de 2B' i/2D' i (TCRspi) es específico del reactivo de afinidad o NCBP analito, de modo que solo la cohorte celular de la eTPC-t que contiene TCRspi (eTPC-t*) es capaz de inducir una respuesta de señal indicada mediante el elementos 2F (*). La eTPC-t* unida al reactivo de afinidad analito (o NCBP) puede seleccionarse del grupo de eTPC-t* sobre la base de la marcación del reactivo de afinidad (o NCBP). Posteriormente, los ORF que codifican TCRsp de las eTPC-t* seleccionadas y aisladas pueden identificarse por secuenciación de ADN de 2B' y 2D' directa o indirectamente mediante PCR con transcriptasa inversa de los transcritos expresados de 2B' y 2D'.

Figura 21 Funcionamiento de un sistema eTPC:A combinado para identificar pares de cadenas de TCRsp a partir de un grupo eTPC-t mediante la inducción de una respuesta de señal indicada a través de la estimulación con APC analito

El grupo de eTPC-t contiene células que contienen sitios 2B' i, ii o iii y 2D ' i, ii o iii, en donde cada eTPC-t está integrada por un par de ORF que codifican una cadena del TCR recíproca y, por lo tanto, cada cohorte celular de la población expresa una TCRsp independiente en la superficie. La eTPC-t contiene además un elemento 2F de respuesta a la señal del TCR. La APC analito expresa en la superficie un aAPX:aAM/CM o aAM. En el presente ejemplo, solo el par de cadenas de TRC expresado a partir de 2B' i/2D' i (TCRspi) es específico del aAPX:aAM/CM o aAM presentado por la APC analito, de modo que cuando se ponen en contacto el grupo de eTPC-t y la población APC analito, solo la cohorte celular de la eTPC-t que contiene TCRspi (eTPC-t*) indica el acoplamiento de la TCRsp a través del estado 2F\ La eTPC-t* estimulada con la APC analito puede seleccionarse del grupo sobre la base de la respuesta de señal indicada. Posteriormente, los ORF que codifican TCRsp de las eTPC-t* seleccionadas y aisladas pueden identificarse por secuenciación de ADN de 2B' y 2D' directa o indirectamente mediante PCR con transcriptasa inversa de los transcritos expresados de 2B' y 2D'.

Figura 22 Funcionamiento de un sistema eTPC:A combinado para identificar antígenos analito presentados por APC analito, a través de la inducción de una respuesta de señal-indicador centrada en APC

El grupo de APC analito contiene células que expresan aAPX:aAM/CM o aAM variados en su superficie. La eTPC-t analito contiene el sitio del receptor genómico intercambiado 2B ' y 2D ' que estimula la expresión de una TCRsp en la superficie. En el presente ejemplo, solo el complejo aAPX:aAM/CM o aAMi es específico del TCRsp presentado por la eTPC-t analito, de modo que cuando se ponen en contacto el grupo de APC analito y la población de eTPC-t analito, solo responde la cohorte celular que expresa aAPX:aAM/CMi (*). Esta respuesta puede ser una respuesta de señal intrínseca señal al acoplamiento con eTPC-t, tal como un cambio en el fenotipo superficial, abundancia de transcritos o muerte celular. La APC analito sensible puede seleccionarse para determinar el aAPX:aAM/CM o aAM que ha entrado en contacto con la TCRsp analito presentada por la eTPC-t analito.

Figura 23 Funcionamiento de un sistema eTPC:A combinado para identificar un reactivo de afinidad o NCBP a partir de un grupo de dichas entidades mediante la captura del reactivo de afinidad o reactivo NCBP por una eTPC-t

La eTPC-t analito contiene el sitio del receptor genómico intercambiado 2B ' y 2D ' que estimula la expresión de una TCRsp en la superficie. Un grupo de reactivo de afinidad o NCBP se pone en contacto con la eTPC-t analito, lo que permite la unión del reactivo de afinidad o NCBP analito específico de TCRsp presentado por la eTPC-t analito. En la presente descripción, la TCRsp se une específicamente solo al a reactivo de afinidad o NCBPi y, por lo tanto, la eTPC-t analito se marca solo con reactivo de afinidad o NCBPi. Por lo tanto, un reactivo de afinidad o NCBP puede seleccionarse del grupo por asociación con la eTPC-t para identificar aquellos reactivos de afinidad o NCBP específicos de TCRsp analito presentada por la eTPC-t analito.

Figura 24 Funcionamiento del dispositivo de dos partes TORES/eTPCS para preparar eTPC-t para el ensamblado de un sistema eTPC:A combinado

El sistema analítico general en el que el dispositivo de dos partes TORES/eTPCS se utiliza para preparar células presentadoras de TCR analito (eTPC-t) modificadas, con diversos antígenos analito o células presentadoras de antígeno o partículas en un sistema eTPC:A combinado. Es del sistema eTPC:A combinado de donde se derivan los productos primarios, y de estos productos primarios se derivan los productos finales. El funcionamiento del sistema global comprende dos fases, la fase de preparación y la fase analítica.

En un aspecto de la Fase 1, se preparan antígenos analito proporcionados como reactivos de afinidad analito, APC y/o NCBP. Dichos antígenos analito expresan antígenos en diversas formas de restos antigénicos; complejos presentadores de antígeno analito (aAPX); moléculas antigénicas analito (aAM); aAPX con carga de aAM (aAPX:aAM); una molécula de carga (CM); una aAPX cargada con CM (aAPX:CM); en donde los antígenos analito representan los que se van a someter a ensayo para determinar la afinidad o inducción de señal contra la eTPC-t analito (etapa i). En otro aspecto de la Fase 1, el dispositivo TORES/eTPCS de dos partes se utiliza para preparar células que expresan pares de cadenas del TCR analito (TCRsp) en la superficie celular (etapa ii). Un eTPC que presenta una TCRsp en la superficie celular se denomina eTPC-t, en donde la eTPC-t presenta la TCRsp a los antígenos analito para analizar la afinidad o inducción de señal contra los antígenos analito. El contacto de eTPC-t y los antígenos analito dan como resultado el ensamblado de un sistema eTPC:A combinado (etapa iii).

La Fase 2 del sistema global es el contacto de eTPC-t y los antígenos analito preparados en la Fase 1, dando como resultado el ensamblado de un sistema eTPC:A combinado (etapa iii). Los reactivo de afinidad, APC y NCBP analitos contactados presentan restos de antígeno analito a la eTPC-t analito y potencialmente se unen a la eTPC-t basándose en la formación de un complejo con la TCRsp presentada. Dentro del sistema eTPC:A combinado, las salidas de los antígenos analito o eTPC-t analito pueden cambiar su estado de señal (denotado con *, y sombreado más oscuro) de modo que dichas especies sensibles puedan identificarse (etapa iv). Basándose en estados de señal alterados dentro del sistema eTPC:A se puede seleccionar un reactivo de afinidad, APC y/o NCBP analitos específicos según su capacidad para inducir una respuesta en una eTPC-t, o la capacidad de una eTPC-t para inducir una respuesta en ellos. Una respuesta puede ser cualquier cambio detectable en el estado de cualquier analito, que incluye una respuesta indicadora basada en la señal activa procedente de un analito incluido en la célula, o la unión de un analito a otro. De forma similar, una eTPC-t analito puede seleccionarse según la capacidad de inducir una respuesta en los antígenos analito con los que entra en contacto, o con dichos analitos para inducir una respuesta de señal en la eTPC-t. La selección basada en esta sensibilidad proporciona los productos primarios del sistema eTPC:A combinado (etapa v). Al obtener las células analito, los reactivos de afinidad o NCBP de la etapa v, el analito presentado aAPX, aAM, aAPX:aAM, CM, aAPX:CM y/o TCRsp, pueden identificarse como el producto final del funcionamiento del dispositivo (etapa vi).

Figura 25 Disposición de los fragmentos de clonación V para la construcción de vectores de entrada V-C

Se muestra una representación de los fragmentos de clonación V utilizados para ensamblar vectores de entrada V-C de un TORES para cadenas TRA y TRB del TCR humano como se describe en el Ejemplo 1.

El fragmento de clonación V está flanqueado por secuencias únicas de unión de cebadores en los extremos 5' y 3' para facilitar la amplificación mediada por PCR de los fragmentos de clonación. Los sitios Bbsl representan sitios de unión de enzimas de restricción de Tipo IIS específicos usados en el ensamblado del vector de entrada V-C, donde ^ indica que el sitio de reconocimiento está orientado para cortar en la dirección 3' del sitio y ^ indica que el sitio está orientado para cortar en la dirección 5'. El sitio B bs l^ corta 5' de la secuencia de Kozak codificada para crear el Saliente*1. El sitio B sa l^ corta para crear el saliente Notl 5' que sobresale dentro del fragmento Notl 5'. El Saliente*1 y el saliente Notl 5' se ligan finalmente con el Saliente*1' de la cadena principal del vector de entrada V-C digerido y el saliente Notl 3' del fragmento de clonación C digerido, respectivamente, durante el ensamblado del vector de entrada V-C. El fragmento NotI 5' representa un fragmento 5' de 6 nucleótidos de la secuencia de reconocimiento Notl, en donde Notl actúa como marcador de selección negativa para eliminar el vector de entrada V-C parental durante el funcionamiento de TORES. El sitio de reconocimiento Notl completo se reconstituye con el fragmento Notl 3' proporcionado por el fragmento de clonación C. El segmento V representa el segmento génico V del TCR que debe codificar el vector de entrada V-C final, y codifica desde el codón de iniciación ATG del segmento V específico hasta el último codón Cys del segmento V que define el límite de la región CDR3. El s itios Bsal es la secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo IIS utilizada durante el funcionamiento del sistema TORES para reconstituir un ORF del TCR de longitud completa. La acción de la enzima Bsal, en donde el sitio está orientado para cortar en la dirección 5', da lugar a la creación de un saliente £1 en el extremo 3' del segmento V que abarca los tres nucleótidos del último codón Cys de cada segmento V y el tercer nucleótido del codón que precede a ese codón Cys. Este saliente se estandariza entre todos los segmentos V en un conjunto de TORES dado. Por último, el saliente *1 en el extremo 3' del segmento V se liga con el saliente * 1 en el odeCDR3 5' durante el funcionamiento del sistema TORES para reconstituir un ORF del TCR de longitud completa. Todos los sp denotan la adición de uno o más nucleótidos para crear la separación correcta entre las secuencias de reconocimiento de Tipo IIS y las secuencias salientes diana, o para separar el sitio de reconocimiento y corte de Notl para una acción eficiente.

Figura 26 Disposición de los fragmentos de clonación C para la construcción de vectores de entrada V-C

Se muestra una representación de los fragmentos de clonación C utilizados para ensamblar vectores de entrada V-C de un TORES para cadenas TRA y TRB del TCR humano como se describe en el Ejemplo 1.

El fragmento de clonación C está flanqueado por secuencias únicas de unión de cebadores en los extremos 5' y 3' para facilitar la amplificación mediada por PCR de los fragmentos de clonación. Los sitios Bbsl representan sitios de unión de enzimas de restricción de Tipo IIS específicos usados en el ensamblado del vector de entrada V-C, donde ^ indica que el sitio de reconocimiento está orientado para cortar en la dirección 3' del sitio y ^ indica que el sitio está orientado para cortar en la dirección 5'. El sitio Bbsl ^ corta para crear el saliente Notl 3' que sobresale dentro del fragmento Notl 3'. El sitio Bsal ^ corta 3' del codón de terminación del segmento C para crear un saliente*2 en el extremo 3' del segmento C. El Saliente*2 y el saliente Notl 3' se ligan en última instancia con el Saliente*2' de la cadena principal del vector de entrada V-C digerido y el saliente Notl 5' del fragmento de clonación V digerido, respectivamente, durante el ensamblado del vector de entrada V-C. El fragmento NotI 3' representa un fragmento 3' de 6 nucleótidos de la secuencia de reconocimiento Notl, en donde Notl actúa como marcador de selección negativa para eliminar el vector de entrada V-C parental durante la actuación de TORES. El sitio de reconocimiento Notl completo se reconstituye con el fragmento Notl 5' proporcionado por el fragmento de clonación C.

El segmento C representa el segmento génico C del TCR que debe codificar el vector de entrada V-C final y codifica desde el resto de citosina 5' del primer codón Glu del segmento génico C hasta el codón de terminación. El sitio ^ Bsal es la secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción de Tipo IIS utilizada durante el funcionamiento del sistema TORES para reconstituir un ORF del TCR de longitud completa. La acción de la enzima Bsal, en donde el sitio está orientado para cortar en la dirección 3', da como resultado la creación de un saliente £ 3 en el extremo 5' del segmento C. Este saliente se estandariza entre todos los segmentos C en un conjunto de TORES dado. Por último, el saliente £3 en el 5' del segmento C se liga con el saliente £3 de la parte C 3' del vector donante J durante la actuación del sistema TORES para reconstituir un ORF del TCR de longitud completa. Todos los sp denotan la adición de uno o más nucleótidos para crear la separación correcta entre las secuencias de reconocimiento de Tipo IIS y las secuencias salientes diana, o para separar el sitio de reconocimiento y corte de Notl para una acción eficiente.

Figura 27 Disposición de la cadena principal del vector de entrada V-C para la construcción de vectores de entrada V-C

Se muestra una representación de la cadena principal del vector de entrada V-C utilizada para ensamblar vectores de entrada V-C de un TORES para cadenas TRA y TRB del TCR humano como se describe en el Ejemplo 1.

El ADN plasmídico circular contiene un origen de replicación (Ori) y un marcador de selección positiva n.° 1. Este marcador de selección se utiliza para la selección de hospedadores transformados cuando se aíslan clones de la cadena principal del vector de entrada V-C y vectores de entrada V-C durante el ensamblado, y también para la selección de vectores que contienen un ORF del TCR de longitud completa durante la actuación del TORES. Los elementos genéticos 5' y 3' codifican los elementos diana que flanquean el ORF del TCR final después de la generación del ORF de TCR final de longitud completa después de su generación durante la actuación del TORES. Un elemento génico 5' podría representar un elemento promotor de mamífero para dirigir la expresión de transcritos de TCR, y un elemento genético 3' podría representar una secuencia terminadora de la transcripción. El sitio ACC65I representa una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción, en donde la acción de la enzima Acc65 l da como resultado la creación de un Saliente*1'. Este Saliente*1' se liga con el Saliente*1 del fragmento de clonación V digerido durante el ensamblado del vector de entrada V-C. El sitio Xbal representa una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción, en donde la acción de la enzima Xbal da como resultado la creación de un Saliente*2'. Este Saliente*2' se liga con el Saliente*2 en el fragmento de clonación C digerido durante el ensamblado del vector de entrada V-C. Sp denota la adición de nucleótidos para separar los sitios de reconocimiento Acc65 l y Xbal para una acción eficiente de ambas enzimas.

Figura 28 Disposición del fragmento del casete de recepción J

Se muestra una representación de un fragmento del casete de recepción J utilizado en el ensamblado de vectores donantes J de un TORES para cadenas de TRA y TRB del TCR humano como se describe en el Ejemplo 1. Se inserta un fragmento del casete de recepción J en una cadena principal donante J para generar un vector del casete de recepción J.

Se genera un fragmento del casete de recepción J por hibridación de dos oligonucleótidos complementarios para crear una construcción de ADN bicatenario lineal con salientes monocatenarios de 4 nucleótidos en los extremos 5' y 3' que se utilizan para la inserción del fragmento en la cadena principal del vector donante J. El Saliente*3 del extremo 5' del fragmento del casete de recepción J se liga con el Saliente*3' de la cadena principal del vector donante J digerido, mientras que el Saliente*4 del extremo 3' se liga con el Saliente*4' de la cadena principal del vector donante J digerido.

Los sitios Bsal representan los sitios de reconocimiento de restricción de Tipo IIS utilizados durante el funcionamiento del TORES para ensamblar un ORF del TCR de longitud completa. El sitio Bsal ^ está orientado para cortar en la dirección 5' y actúa sobre la secuencia de la parte C para generar un saliente £ 3 en la parte C 3'. El sitio Bsal ^ actúa en último término en la parte del segmento J del vector donante J para crear el saliente £ 2 en el extremo 5' de la parte del segmento J. El elemento Bsal ^ también contiene el Saliente*5, que se genera por acción de Bbsl ^ en el sitio Bbsl durante el ensamblado del vector donante J.

Los sitios Bbsl representan los sitios de reconocimiento de restricción de Tipo IIS utilizados para ensamblar el vector donante J. El sitio Bbsl ^ corta el elemento Bsal ^ para generar un Saliente*5, mientras que el sitio Bbsl ^ corta el extremo 5' de la parte C para generar un Saliente*6. El Saliente*5 y el Saliente*6 se ligan en último término con el Saliente*5' y con el Saliente*6' de la parte del segmento J, respectivamente. La parte C representa una pequeña parte del segmento génico C diana para permitir la generación estandarizada de salientes no palindrómicos durante la actuación del TORES. Esta parte C se inserta finalmente en el extremo 3' de la parte del segmento J, y forma parte de la secuencia que se liga al segmento C contenida en el vector de entrada V-C digerido durante la actuación del TORES para generar un ORF del TCR de longitud completa. El sitio Notl representa un marcador de selección negativa utilizado para eliminar el vector del casete de recepción J parental durante la generación del vector donante J. Todos los sp denotan la adición de uno o más nucleótidos para crear la separación correcta entre las secuencias de reconocimiento de Tipo IIS y las secuencias salientes diana, o para separar el sitio de reconocimiento y corte de Notl para una acción eficiente.

Figura 29 Disposición de la cadena principal del donante J

Se muestra una representación de la cadena principal del donante J utilizado en el ensamblado de vectores donantes J de un TORES para cadenas TRA y TRB del TCR humano como se describe en el Ejemplo 1. Se inserta un fragmento del casete de recepción J en una cadena principal donante J para generar un vector del casete de recepción J.

El ADN plasmídico circular contiene un origen de replicación (Ori) y un marcador de selección positiva n.° 2. Este marcador de selección se utiliza para la selección de huéspedes transformados cuando se aíslan clones de cadena principal del vector donante J y vectores donantes J durante el ensamblado. Es importante señalar que este marcador de selección positiva es distinto del marcador de selección positiva n.° 1 dentro de los vectores de entrada V-C, de forma que los vectores donantes J parentales se eliminan con selección positiva en n.° 1 durante la actuación del TORES para generar un ORF del TCR de longitud completa en el contexto de la cadena principal del vector de entrada V-C.

El sitio EcoRI representa una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción, en donde la acción de la enzima EcoRI da como resultado la creación de un Saliente*3'. Este Saliente*3' se une al Saliente*3 del fragmento del casete de recepción J hibridado durante el ensamblado del vector del casete de recepción J. El sitio Xbal representa una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción, en donde la acción de la enzima Xbal da como resultado la creación de un Saliente*4'. Este Saliente*4' se liga con el Saliente*4 del fragmento del casete de recepción J hibridado durante el ensamblado del vector del casete de recepción J. Sp denota la adición de nucleótidos para separar los sitios de reconocimiento Acc65 l y Xbal para una acción eficiente de ambas enzimas.

Figura 30 Disposición del vector del casete de recepción J

Se muestra una representación de la cadena principal de un donante J utilizado en el ensamblado de vectores donantes J de un TORES para cadenas TRA y TRB del TCR humano como se describe en el Ejemplo 1. Se crea un vector del casete de recepción J mediante la inserción de un fragmento del casete de recepción J en una cadena principal donante J.

Los sitios Bbsl representan los sitios de reconocimiento de restricción de Tipo IIS utilizados para ensamblar el vector donante J. El sitio Bbsl ^ corta el elemento Bsal ^ para generar un Saliente*5, mientras que el sitio Bbsl ^ corta el extremo 5' de la parte C para generar un Saliente*6. El Saliente*5 y el Saliente*6 se ligan en último término con el Saliente*5' y con el Saliente*6' de la parte del segmento J, respectivamente.

La parte C representa una pequeña parte del segmento génico C diana para permitir la generación estandarizada de salientes no palindrómicos durante la actuación del TORES. Esta parte C se inserta finalmente en el extremo 3' de la parte del segmento J, y forma parte de la secuencia que se liga al segmento C contenida en el vector de entrada V-C digerido durante la actuación del TORES para generar un ORF del TCR de longitud completa. El sitio Notl representa un marcador de selección negativa utilizado para eliminar el vector del casete de recepción J parental durante la generación del vector donante J.

Todos los sp denotan la adición de uno o más nucleótidos para crear la separación correcta entre las secuencias de reconocimiento de Tipo IIS y las secuencias salientes diana, o para separar el sitio de reconocimiento y corte de Notl para una acción eficiente.

Figura 31 Disposición de una parte de segmento J

Se muestra una representación de una parte del segmento J utilizada en el ensamblado de segmento J de un TORES para cadenas TRA y TRB del TCR humano como se describe en el Ejemplo 1. Una parte del segmento J se inserta en un vector del casete de recepción J para crear un vector donante J.

La hibridación de oligonucleótidos monocatenarios complementarios para formar una construcción de ADN bicatenario lineal con salientes monocatenarios en cualquier extremo genera una parte del segmento J. El Saliente*5' del extremo 5' se hibrida con el Saliente*5 generado dentro del vector del casete de recepción J digerido con Bbsl. El Saliente*6' del extremo 3' se hibrida con el Saliente*6 generado dentro del vector del casete de recepción J digerido con Bbsl.

La parte del segmento J representa la secuencia diana del segmento del gen J. Dependiendo del estilo del vector donante J en construcción (es decir, corto o largo), el límite 5' de la parte del segmento J se define de forma distinta. Para los vectores donantes J cortos, el límite 5' de la parte del segmento J se define como los motivos Phe-Ala/Gly o Trp-Gly que se utilizan para definir el límite canónico entre las partes J y CDR3 de un ORF del TCR de longitud completa. Para vectores donantes J largos, el límite 5' de la parte del segmento J se extiende diez a doce nucleótidos 5' del motivo Phe-Ala/Gly o Trp-Gly. Esto extiende la parte del ORF de TCR global codificado por el vector donante J, y acorta por el contrario la longitud del odeCDR3 necesaria para construir un ORF del TCR de longitud completa durante la actuación del TORES. En el extremo 3' de la parte del segmento J hay codificado un único resto de adenina (A) que representa el primer nucleótido del fragmento C. Esta adenina se excluye del vector del casete de recepción J.

Figura 32 Validación de vectores TRA y TRB de TORES reconstituidos por integración con eTPC

El sistema TORES se utilizó para generar un par de alfa/beta de TCR modelo (JG9-TCR), que tiene una especificidad conocida por un antígeno del CMVH presentado en HLA-A*02:01. El TORES produjo cada cadena en un contexto del Componente 2C o del Componente 2E (véase el Ejemplo 3). Se creó una eTPC-t a través de RMCE por transfección de plásmidos de los componentes 2C y 2e y una construcción que codificaba la recombinasa Flp en la línea de eTPC ACL-488, que contiene dos sitios de integración genómica, 2B y 2D, que codifican los indicadores BFP y RFP, respectivamente. 10 días después de la transfección, las células individuales con disminución en las señales de BFP y RFP, codificadas por los marcadores de selección de los Componentes 2B y 2D, se clasificaron como células individuales. La eTPC-t monoclonal resultante ACL-851, se analizó en paralelo con la eTPC parental, y se presentó un solo ejemplo. a) y b) la línea celular eTPC parental ACL-488 y un ejemplo monoclonal se analizaron por citometría de flujo para determinar las señales BFP y RFP. El gráfico muestra células individuales vivas como BFP frente a RFP, mostrando que la línea celular eTPC es positiva para los marcadores de selección presentes en los componentes 2B y 2D (a), y que el monoclón resultante ha perdido estos marcadores como se esperaba para los eventos de par de integración entre 2B/2C y 2D/2E (B). Los valores porcentuales representan el porcentaje de células doble positivas en a) y de células doble negativas en b). c) a f) ACL-488 de eTPC y el monoclón ACL-851 de eTPC-t se tiñeron con anticuerpos contra CD3 y alfa/beta de Tc R (TCRab) y reactivo multímero HLA específico de JG9-TCR (Dex HLA-A*02:01-NlVP) y se analizaron por citometría de flujo y se seleccionaron para determinar células individuales vivas. La línea eTPC parental no mostró tinción positiva para CD3 o TCR en la superficie celular (c) y, además, fue negativa para tinción con reactivo multímero HLA (d). En contraste, el monoclón resultante mostró tinción positiva tanto para CD3 como para TCR en la superficie celular (e) y mostró tinción positiva con el reactivo multímero específico del JG9-TCR expresado. Los valores porcentuales representan el porcentaje de células doble positivas CD3/TCRab en c) y e), y células doble positivas CD3/HLA-multímero en d) y f). g) El ADN genómico se preparó a partir de ACL-851 de eTPC-t monoclonal y se sometió a PCR con cebadores específicos de la cadena alfa de JG9-TCR codificada por el componente 2D' o la cadena beta de JG9-TCR codificada por el componente 2B\ Los productos de la PCR se resolvieron con gel de agarosa y se observaron como tamaño de banda esperado. h) El ADN genómico se preparó a partir de ACL-851 de eTPC-t monoclonal y se sometió a PCR de gota digital con cebadores y sondas específicos de la cadena alfa de JG9-TCR codificada por el componente 2D' o la cadena beta de JG9-TCR codificada por el componente 2B'. Se incluyó un par de cebadores/sondas de un amplicón de referencia para un intrón de TCR alfa constante (TRAC). La tabla presenta relaciones de referencia para TCR alfa y TCR beta. Una relación cercana a 0,33 indica que una sola copia de cada cadena alfa y beta del TCR está presente en la línea ACL-851 de eTPC-t, que es una línea triploide.

Figura 33. Demostración de la reversión de eTPC-x a partir de eTPC-t

Una línea celular parental de eTPC-t, ACL-851, que expresa una cadena alfa y beta del TCR en el sitio D' y B', respectivamente, se revertió a una línea de eTPC-x intercambiando el componente D' con un vector donante que codifica GFP (Componente Z). El componente Z contenía sitios F14/F15 heteroespecíficos de recombinasa que flanquean el ORF de GFP y que por lo tanto eran compatibles con el componente D'. La línea ACL-851 de eTPC-t se transfectó con el componente Z junto con una construcción que codificaba la recombinasa flp. 7 días después de la transfección, las células individuales positivas para las señales GFP se clasificaron y cultivaron como monoclonales. Las líneas eTPC-x monoclonales resultantes se analizaron por citometría de flujo en paralelo con la eTPC-t parental, y se presentó un solo ejemplo. a) y b) el monoclón ACL-987 de eTPC-x derivado de ACL-851 de eTPC-t parental se analizó por citometría de flujo para determinar la expresión de GFP junto con la línea parental. La representación muestra los parámetros de SSC frente a GFP de células individuales vivas clasificadas. La línea celular parental no tiene expresión de GFP (a), mientras que el monoclón ACL-987 ha ganado GFP como se esperaba (b), lo que indica el intercambio del ORF del TCR alfa por un ORF de GPF. c) y d) El monoclón ACL-987 de eTPC-x derivado de ACL-851 parental junto con la ACL-851 de eTPC-t parental se tiñeron con anticuerpos contra CD3 y TCRab y se analizaron por citometría de flujo. La representación muestra los parámetros CD3 frente a TCRab clasificados en células individuales vivas. La célula parental mostró tinción positiva para CD3 y TCRab (c), mientras que el monoclón derivado mostró tinción negativa para ambos (d); lo que confirma la pérdida del ORF de TCR alfa en la línea eTPC-x derivada.

Figura 34: Demostración de la integración aleatoria en eTPC-x para crear un grupo de eTPC-t

Se creó un grupo eTPC-t a partir de una línea parental de eTPC-x que expresa una sola cadena beta del TCR en el componente B'. La línea eTPC-x expresó GFP como el indicador en el sitio disponible 2D. Se construyó un grupo de 64 variantes de cadena del TCR alfa, que incluyen la cadena parental, con el sistema TORES para representar un grupo del Componente 2E (véase el Ejemplo 5). El par de cadenas del TCR parentales representa el JG9-TCR con especificidad conocida por un antígeno del CMVH presentado en HLA-A*02:01. El grupo del Componente 2E se transfectó a la eTPC-x ACL-987 parental junto con una construcción que codificaba la recombinasa Flp. Se seleccionó una línea policlonal mediante la clasificación de células positivas para GFP 10 días después de la transfección. La eTPC-t policlonal resultante, ACL-988, se clasificó posteriormente sobre la base de la tinción negativa para GFP y la tinción positiva o negativa para el reactivo multímero HLA (DEX HLA-A*02:01-NLVP). Las células individuales recuperadas se secuenciaron para identificar las cadenas de TCR-alfa codificadas y se compararon con un análisis paralelo de cada una de las variantes de la cadena alfa del TCR emparejada con la cadena de beta del TCR nativa en términos de tinción con un reactivo multímero HLA específico del par de cadenas del TCR parental. a) y b) la línea parental ACL-987 de eTPC-x y la línea policlonal resultante ACL-988 de eTPC-t se analizaron por citometría de flujo para determinar la expresión de GFP. La representación muestra los parámetros de SSC frente a GFP de células individuales vivas. La línea celular parental muestra la señal positiva para GFP, que indica el componente 2D intacto (a). La línea policlonal derivada se muestra mitad positiva y mitad negativa para GFP (b), lo que indica que la mitad de las células en la población policlonal han cambiado potencialmente el ORF de GFP en 2D por el ORF del TCR alfa para formar el componente 2D'. c) y d) la línea ACL-987 de eTPC-x parental y la línea policlonal ACL-988 de eTPC-t resultante se tiñeron con un anticuerpo de CD3 y multímero HLA con especificidad para la TCR-JG9 parental (DEX HLA-A*02:01-NLVP), y se analizaron por citometría de flujo. La representación muestra los parámetros de CD3 frente al multímero HLA de células individuales vivas. La línea celular parental es negativa para la tinción tanto de CD3 como del multímero HLA (c). El panel izquierdo de d) muestra eventos clasificados como negativos para GFP, y los eventos positivos para GFP a la derecha. Solo los eventos negativos para GFP, donde el componente 2D se convierte en 2D', muestran tinción positiva para CD3, de los que un subconjunto muestra tinción positiva para el multímero HLA. Se clasificaron células individuales procedentes de la puerta negativa y positiva para el multímero HLA, y el ORF integrado en el componente 2D' se secuenció para determinar la identidad del ORF de TCR alfa.

e) Las 64 variantes JG9-TCR-alfa se clonaron en una construcción de expresión que permitió transfectar cada una independientemente a la eTPC-x parental (ACL-987). Para cada una se determinaron las unidades de tinción relativa (UTR) frente al reactivo tetrámero HLA-A*02:01-NLVP. La UTR se calcula como la relación entre la intensidad de fluorescencia media (IFM) de la señal de tetrámero NLVP HLA-A*02:01-NLVP para la población positiva para CD3 y la de la población negativa para CD3, y es indicativa de la fuerza de unión de cada variante de par de cadenas del TCR al reactivo multímero HLA. Cada punto representado en la Figura e) representa la UTR observada para cada una de las 64 variantes. Los círculos blancos se correlacionan con las células secuenciadas recuperadas de la puerta negativa para GFP/positiva para el multímero HLA. Los triángulos blancos se correlacionan con las células secuenciadas recuperadas de la puerta negativa para GFP/negativa para el multímero HLA.

Figura 35: Demostración funcional del componente 2F

La línea celular eTPC-t que lleva un componente 2F (ACL-1277), en donde las cadenas de TCR del componente 2B' y 2D' codifican un par de TCR que es específico del péptido antigénico NLVPMVATV del CMVH presentado en HLA-A*02:01. El indicador del componente 2F fue RFP. Esta eTPC-t se puso en contacto durante 24 horas con diversas líneas de APC con diferentes características de HLA en presencia y ausencia de antígenos peptídicos modelo, y los cultivos en contacto se analizaron mediante citometría de flujo. Los gráficos del histograma de citometría de flujo muestran los recuentos de eventos contra la señal de RFP de linfocitos T únicos viables identificados por tinción de anticuerpos para un marcador de superficie específico que no presentaban las APC. a) y b) células APC que expresan solo HLA-A*02:01 (ACL-209) se pulsaron con péptidos NLVPMVATV (a) o VYALPLKML (b) y posteriormente se cocultivaron con eTPC-t durante 24 h. c) y d) células APC que expresan solamente HLA-A*24:02 (ACL-963) se pulsaron con péptidos NLVPMVATV (c) o VYALPLKML (d) y posteriormente se cocultivaron coneTPC-t durante 24 h. e) células APC que expresan solo HLA-A*02:01 (ACL-209) se dejaron sin pulso de péptido y posteriormente se cocultivaron con eTPC-t durante 24 h. f) células APC que no expresan HLA en la superficie celular (ACL-128) se pulsaron con NLVPMVATV y posteriormente se cocultivaron con eTPC-t durante 24 h. La señal RFP aumentó significativamente para ACL-1277 de eTPC-t solo en presencia de células que expresan HLA-A*02:01 pulsado con NLVPMVATV, que representa la diana conocida del TCR expresado. Las puertas y los valores del histograma reflejan el porcentaje de eventos en las puertas positivas para RFP y negativas para r Fp . Esto indica la respuesta específica del Componente 2F al acoplamiento del TCRsp expresado en eTPC-t con HLA/antígeno afín (aAPX:aAM).

Materiales y métodos

Secuenciación de ADN

Toda la secuenciación mencionada en los ejemplos presentados se realizó mediante el método de Sanger, y fue realizada por GATC Biotec AB, Suecia.

Síntesis de ADN

Todas las síntesis de ADN mencionadas en los ejemplos presentados fueron realizadas por Integrated DNA Technologies BVBA, Bélgica.

Los fragmentos de ADN >125 pb se sintetizaron como moléculas de ADN bicatenarias lineales como un producto de '‘gBlock Gene Fragments'.

Los fragmentos de ADN de 15-60 nt se sintetizaron como moléculas de ADN monocatenario como un producto Custom Oligonucleotide Fragment'.

Los fragmentos de ADN de 61-124 nt se sintetizaron como moléculas de ADN monocatenario como un producto ‘Ultramer DNA oligonucleotide Fragment.

Ensamblado y clonación de la genoteca de vectores

La construcción de vectores descrita en los ejemplos comprende una variedad de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, y las composiciones de reacción específicas se describen detalladamente en los Ejemplos 1 a 3. En los procedimientos descritos se utilizaron los siguientes materiales clave:

Tabla 1: Reactivos para ensamblado y clonación de la genoteca de vectores

Dúplex de oligonucleótidos que codifica el ensamblado de CDR3 (odeCDR3)

odeCDR3 se ensambló rutinariamente por hibridación de oligonucleótidos monocatenarios parcialmente complementarios. En el Ejemplo 2 se proporciona una descripción detallada de la composición y las condiciones de reacción. En los procedimientos descritos se utilizaron los siguientes materiales clave:

Tabla 2: Reactivos de ensamblado del dúplex de oligonucleótidos

Reconstitución del TCR

En el Ejemplo 3 se proporciona una descripción detallada de la composición y las condiciones de reacción. En los procedimientos descritos se utilizaron los siguientes materiales clave.

Tabla 3: Reactivos de reconstitución del TCR

Transfección de células

Todas las células utilizadas en esta solicitud se obtuvieron de células HEK293. Un día antes de la transfección, las células se sembraron a una densidad de 1,2-1,4 x106 células/en placas de 60 mm en 90 % de DMEM+2 mML-glutamina+10 % de HI-FBS (Life Technologies).

Al día siguiente, las células al 65 % de confluencia se transfectaron con una cantidad total de 5 ug de ADN y jetPEI® (reactivo de transfección Polyplus, Life Technologies) en una relación N/P de 6. Las soluciones madre de ADN y jetPEI® se diluyeron en NaCl 1 M estéril y NaCl 150 mM, respectivamente. El volumen final de cada solución fue equivalente al 50 % del volumen total de mezcla. Después, la solución de PEI se añadió al ADN diluido y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. Por último, las mezclas de ADN/PEI se añadieron a las placas de 60 mm, con cuidado de no romper la película celular. Las células se incubaron durante 48 horas a (37 °C, 5 % de CO2, 95 % de humedad relativa) antes del análisis de expresión del marcador de provisión de ADN. El medio se sustituyó antes de la transfección.

RMCE entre un par de integración emparejado

Para la integración de RMCE, las células se transfectaron con 0,6 pg de vectores de ADN que codifican FLP, (V4.I.8), 2 pg del Componente 2C/2Y, 2 pg del Componente 2E/2Z, 0,4 pg de ADN que codifica un marcador para rastrear la provisión de ADN. 2 días después de la transfección, las células positivas para el marcador de provisión de ADN, positivas para uno de GFP o RFP, se clasificaron por FACS. 4-10 días después de la transfección, las células individuales que mostraban una disminución en la señal de proteína fluorescente, codificada por los marcadores de selección Componentes 2D y 2B , se clasificaron mediante FACS. La excepción fue la generación de ACL-987 donde las células individuales que mostraban positividad para GFP se clasificaron por FACS.

Expresión transitoria de pares de cadenas del TCR para la caracterización de su UTR

Para la expresión transitoria, las células se transfectaron con vectores de ADN que codifican FLP, (V4.I.8), la variante jG9-TCR-alfa (VP.7751.RC1.A1 a VP.7751.RC1 .H8), cadena JG9-TCR-beta WT (V3.C.5) y vehículo del vector de ADN (V1.C.2). 2 días después de la transfección, todas las células se tiñeron con el tetrámero HLA-A*02:01-NLVP y anticuerpos anti-CD3. Las UTR se calcularon como la relación entre la intensidad de fluorescencia media (IFM) de la señal de tetrámero NLVP HLA-A*02:01-NLVP para la población positiva para CD3 y la de la población negativa para CD3, y es indicativa de la fuerza de unión de cada variante de par de cadenas del TCR.

Clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)

La clasificación de células individuales se logró utilizando metodologías estandarizadas de clasificación celular utilizando un instrumento BDInflux. En resumen, las células ACL se recogieron con Try-pLE™ Express Trypsin (ThermoFisher Scientific) y se resuspendieron en un volumen adecuado de DPBS 1X (Life Technologies) antes de la clasificación celular, en medio DMEM 1X que contenía 20 % de HI-FBS y Anti-Anti 100X (Life Technologies). Las células se tiñeron con el reactivo de HLA multímero en hielo durante 10 minutos, y a continuación con anticuerpos de CD3 y/o TCRab. La detección de propiedades fluorescentes celulares específicas con el instrumento BDInflux se define en la Tabla 4.

La clasificación de células individuales para la generación monoclonal, las células que muestran el fenotipo de interés se depositaron en placas de 96 pocillos, que contenían 200 ul de medio de cultivo. Se clasificaron una a dos placas por muestra. Las clasificaciones de células policlonales se llevaron a tubos FACS que contenían medio, utilizando la configuración de clasificación de dos vías en el clasificador de células Influx™ (BD Biosciences).

Las células individuales clasificadas para caracterización molecular de su variante JG9-TCR alfa se clasificaron en placas de PCR precargadas con 5 pl de agua exenta de nucleasa. Las muestras se congelaron rápidamente hasta el procesamiento posterior.

Tabla 4

Vectores

VP.7751.RC 1-A1 to H8 64 vectores individuales, cada uno codifica un miembro distinto del conjunto de 64 variantes CDR3 de JG9-TRA

Tabla 5

Filtros BD Influx

Extracción del ADN genómico para la caracterización genética

El ADN se extrajo de las células 5x106 utilizando el QlAamp DNA Minikit (Qiagen). El ADN se guardó en 1xTE (Tris 10 mM, pH 8,0 y EDTA 0,1 mM)

Reacciones de PCR para evaluar la integración de RMCE del ORF de TRA-y ORF de TRB en el componente 2B o 2D

Los cebadores usados para evaluar la integración del ORF de TRA, hibridados con el segmento TRA-C (cebador directo 1.F.7) y el terminador sv40pA (cebador inverso 15.H.2) que es una parte preexistente de los sitios del receptor genómico. Tamaño esperado 566 pb

Los cebadores utilizados para evaluar la integración del ORF de TRB, hibridados con el segmento TRB-C (cebador directo 1.F.9) y el terminador sv40pA (cebador inverso 15.H.2) que es una parte preexistente de los sitios del receptor genómico. Tamaño esperado 610 pb.

Tabla 6 Reactivos de PCR para evaluar la integración del ORF de TRA u ORF de TRB

Tabla 7: Condiciones de ciclado de la PCR

Los productos de la PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1 % en tampón 1XTAE, utilizando PowerPac Basic (Bio-Rad), se tiñeron con una dilución de 10.000 de sybersafe y se analizaron con Fusion SL (Vilber Lourmat).

Reacciones de PCRdd para evaluar el número de copias de ORF de TRA-y ORF de TRB en el genoma después de la provisión de ADN.

El ADN de los monoclones ACL-851 seleccionados se analizó utilizando cebadores específicos y se sondearon con localización específica en el segmento de interés del segmento C del TCR_ORF de interés

Los cebadores y la sonda utilizados para evaluar el número de copias del ORF de TRA, hibridados con el segmento TRA-C (cebador directo 1.F.7, cebador inverso 1.F.8 y sonda 1.G.1)

Los cebadores y la sonda utilizados para evaluar el número de copias del ORF de TRB, hibridados con el segmento TRB-C (cebador directo 1.F.9, cebador inverso 1.F.10 y sonda 1.G.2)

En todos los casos, se cribó simultáneamente un gen de referencia (TRAC) para determinar los números de copias del cromosoma mediante los cebadores 10.A.9 y 10.A.10 junto con la sonda fluorescente 10.B.6 conjugada con HEX. El número de copias de integración consideró que las células HEK293 eran triploides para el gen de referencia (TRAC).

Antes de la PCR de gotícula digital (PCRdd), el ADN se digirió con Mfel (NEB) para separar integraciones en tándem. La configuración de la reacción y las condiciones de ciclado seguidas fueron según el protocolo para sondas ddPCRTM Supermix (sin dUTP) (Bio-Rad) utilizando el lector de gotículas y el generador de gotículas QX200™ y el ciclador térmico para pocillos profundos C1000 Touch™ (Bio-Rad).

Tabla 8

Los datos se obtuvieron mediante el software QuantaSoft™, utilizando Ch1 para detectar FAM y Ch2 para HEX. Tabla 9

Cebadores y sondas de la PCRdd

ID Nombre Secuencia

1.F.7 TRAC-GT-F1 ATGTGCAAACGCCTTCAAC

1.F.8 TRAC-GT-R1 TTCGGAACCCAATCACTGAC

1.G.1 TRAC-sonda-FAM TTTCTCGACCAGCTTGACATCACAGG

1.F.9 TRBC2-GT-F1 GCTGTCAAGTCCAGTTCTACG

1.F.10 TRBC2-GT-R1 CTTGCTGGTAAGACTCGGAG

1.G.2 TRBC2-sonda-FAM CAAACCCGTCACCCAGATCGTCA

10.A.9 TRAC-TCRA-ex1-F1 CTGATCCTCTTGTCCCACAGATA

10.A.10 TRAC-TCRA-ex1-F1 GACTTGTCACTGGATTTAGAGTCTCT

10.B.6 TRAC-sonda (HEX) ATCCAGAACCCTGACCCTGCCG

Tabla 10. Líneas celulares ACL

ID

Componentes Comentarios

ACL-488 2B, 2D 2B codifica BFP, 2D codifica RFP

ACL-851 2B', 2D' eTPC-t, 2B' codifica wtJG9-TCRb, 2D' codifica wtJG9-TCRa

ACL-987 2B', 2D eTPC-x, 2B' codifica wtJG9-TCRb, 2D' codifica GFP

ACL-988 2B', 2D' Policlon eTPC-t, 2B' codifica wtJG9-TCRb, 2D' codifica 64 variantes de JG9-TCRa

ACL-1063 2B, 2D, 2F eTPC con elemento respondedor, 2B y 2D codifican marcadores de selección ACL-1277 2B', 2D', 2F eTPC-t con elemento respondedor, 2B' y 2D' codifica pares de cadenas de TCR ACL-209 eAPC-p, que expresa HLA-A*02:01

ACL-963 eAPC-p, que expresa HLA-A*24:02

ACL-128 eAPC, HLA-ABC nulo

Secuenciación de cadenas alfa y beta de TCR a partir de linfocitos T individuales

Las células individuales eTPC-t clasificadas por FACS se sometieron a un proceso de amplificación en dos etapas que implica la recogida de cebadores específicos de la región V de cada TRA y TRB, seguido por reacciones de PCR anidadas emparejadas que crean amplicones de TRA y TRB para el análisis de secuencias. Este procedimiento se ha descrito anteriormente (Han y col. Nat Biotechnol. 2014 32(7): 684-692). En los procedimientos descritos se utilizaron los siguientes materiales:

Tabla 11: RT-PCR de célula única y reactivos de PCR anidada

Demostración del componente funcional 2F

Las células eTPC-t y APC se cultivaron rutinariamente en RPMI+10 % de suero fetal de ternero térmicamente inactivado (medio completo) entre 0,2 x 10A6-1,5 x 10A6 células/ml, a 37 90 % de humedad relativa y 5 % de CO2. Los péptidos NLVPMVATV y VYALPLKML fueron sintetizados por Genescript y se recibieron liofilizados. Las soluciones madre peptídicas primarias se suspendieron en DMSO al 10 % y se clasificaron en soluciones madre de trabajo a -80 °C en el momento de la administración, a 50 pM en medio completo (50x concentrado). Se utilizaron las siguientes APC que presentan HLA-A*02:01 (ACL-209) o HLA-A*24:02 (ACL-963) o HLA-nulo (ACL-128). La línea celular eTPC-t (ACL-1277, Componente 2A) se modificó con dos sitios del receptor genómico únicos (Componentes 2B, 2D), diseñados mediante ingeniería genética para ser HLA nulo, utilizando la expresión de CD3 nativa, y que contiene un elemento de respuesta sintética de dos componentes (Componente 2F). Además, ACL-1277 tenía Componentes B, D convertidos a B'/D ' en con la integración del ORF de TCR alfa/beta que codifica una TCRsp específica de pHLA:HLA-A*02:01-NLVPMVATV (véase el Ejemplo 8).

Procedimiento de pulsado de antígeno

Los cultivos en crecimiento activo de células APC (0,5-1,0 x 10A6 células/ml) se suspendieron, se tomaron muestras y se contaron para determinar la concentración celular. Posteriormente, se recogieron 1 millón de células, se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, Gibco) seguido por suspensión en medio completo con péptido 1 pM o sin péptido a una concentración celular entre 1 y 2 x 10a6 células/ml. Las células se incubaron durante 2 h en condiciones de cultivo estándar, en una placa de cultivo de 24 pocillos. Después de 2 h las células se recogieron, se sedimentaron por centrifugación (400 rcf, 3 min), seguido de 3 x 10 ml lavados con DPBS. Posteriormente, las células se suspendieron a 0,2 x 10A6 células/ml en medio completo.

Recogida de eTPC-t

Los cultivos en crecimiento activo de células eTPC-t (0,5-1,0 x 10A6 células/ml) se suspendieron, se tomaron muestras y se contaron para determinar la concentración celular. Las células se recogieron, se lavaron una vez con PBS y, a continuación, se suspendieron a una concentración de 0,6 x 10A6 células/ml en medio completo.

Puesta en contacto de eTPC-t y APC en un sistema eTPC:A

A cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo se añadieron 50 pl de medio completo, 50 pl de APC, seguido de 50 pl de eTPC-t. Esto equivale a aproximadamente 10.000 APC y 30.000 eTPC-t en una relación 1:3, a una concentración celular total de aproximadamente 0,27 x 10A6 células/ml. La mezcla de células se incubó a continuación durante aproximadamente 24 horas en condiciones de cultivo estándar.

Tinción y análisis

Después de 24 horas de incubación, las células se recogieron y trasplantaron a tubos Micronic de fondo en V de 0,75 ml, se lavaron una vez con 500 pl de DPBS y posteriormente se tiñeron con marcador de células muertas (DCM-APC-H7) del siguiente modo; se añadieron a cada pocillo 25 pl de solución de tinción, las células se suspendieron por mezclado y a continuación se incubaron durante 15-20 min. La solución de tinción comprendía 0,5 pl de DCM-APC-H7 por 100 pl de solución de tinción. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con 500 pl de DPBS+FCS al 2 % (tampón de lavado). A continuación las células se tiñeron para detectar marcadores de superficie únicos para la eTPC-t; se añadieron a cada pocillo 30 pl de solución de tinción, las células se suspendieron por mezclado y a continuación se incubaron durante 30-45 min. La solución de tinción comprendía 2,5 pl de anti-myc-AF647 por 100 pl de solución de tinción (clon 9E10, Santa Cruz Biotech). Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con 500 pl de tampón de lavado, después, se suspendieron en 200 pl de tampón de lavado y a continuación se analizaron mediante FACS en un equipo LSR-Fortessa (BD Biosciences).

Ejemplos

Ejemplo 1 Diseño y ensamblado de un sistema de TORES para TRA y TRB humanos

Un TORES consiste en una genoteca de vectores de entrada V-C y una genoteca de vectores donantes J para una cadena del TCR dada. Cuando se combina con una secuencia diana de odeCDR3 a introducir en un contexto V-J-C seleccionado, puede reconstituirse un ORF del TCR de longitud completa. Variando las características de la secuencia odeCDR3 y/o de la selección de V/J/C, esta etapa de reconstitución también puede representar una etapa de diversificación de secuencia de un ORF del TCR en flujos de trabajo de ingeniería de etapas de diversificación de secuencia de un ORF del TCR. En el presente ejemplo se describe el diseño y ensamblado de un sistema TORES completo para cadenas TRA y TRB humanas.

Diseño y ensamblado de una genoteca de vectores de entrada V-C de TRA para un repertorio de TRA humana natural

En el presente ejemplo se describe el diseño y ensamblado de una genoteca de vectores de entrada V-C de TRA que contiene el repertorio de secuencias V-C de TRA humanas nativas. Se utiliza un método de ensamblado modular, de modo que la construcción de genotecas de vectores de entrada V-C puede ciclarse rápidamente para otras cadenas del TCR humano, otros organismos o cadenas del TCR sintéticas.

Los componentes de ADN necesarios para una genoteca de vectores V-C de TRA son:

I. Un fragmento de clonación V de TRA para cada segmento génico V de TRA funcional codificado en el genoma humano II. Fragmento de clonación C único de TRA

III. Una cadena principal del vector de entrada V-C

En el presente ejemplo, los fragmentos de clonación V de TRA y C de TRA se sintetizaron y utilizaron para su ensamblado en una cadena principal del vector de entrada V-C diana en una sola reacción de enzima de restricción y ligasa.

En el presente ejemplo se utiliza un par de cadenas principales heteroespecíficas del vector de entrada V-C FRT para ensamblar genotecas del vector de entrada V-C de TRA y TRB. Cada genoteca de vectores de entrada V-C de TRA y TRB se construye con cadenas principales de vector que contienen secuencias diana de reconocimiento de flipasa (FRT) distintas que representan los elementos genéticos 5' y 3' incluidos en el sistema de entrada V-C, componentes 2C y 2E . Por lo tanto, los pares de producto TRA/TRB generados en el funcionamiento de estos TORES pueden someterse a integración genómica rápida en las células eTPC que contienen sitios del receptor genómico (componentes 2B y 2D) que incluyen sitios FRT compatibles dentro de sus elementos genéticos 5' y 3'.

En el presente ejemplo, el vector de entrada V-C de TRA contiene secuencias FRT, F14 y F15, como elementos genéticos 5' y 3', respectivamente. Esta secuencia de cadena principal del vector de entrada V-C de F14/F15 se presenta como SEQ0688.

En el presente ejemplo, la genoteca de vectores de entrada V-C de TRA se construye con la enzima de restricción de Tipo IIS Bbsl. La enzima de restricción de Tipo IIS utilizada en el funcionamiento del TORES completo para reconstituir los ORF del TRA de longitud completa es Bsal.

Diseño de fragmentos de clonación V de TRA sintéticos

La disposición de los elementos genéticos de los fragmentos de clonación V de TRA en el presente ejemplo se representa en la Figura 25.

Cada extremo del fragmento de clonación V de TRA codifica una secuencia estandarizada de ADN de unión al cebador 5' y 3' de 20 nucleótidos para la propagación del fragmento general por PCR.

Proximal a la unión del cebador 5 ' se codifica un sitio de unión de la enzima de restricción Bbsl de Tipo IIS, en donde la dirección del sitio de unión Bbsl guía la enzima Bbsl para cortar el ADN 3' de su secuencia de reconocimiento. Los salientes generados por la actividad enzimática de Bbsl se codifican como Saliente*1. Este saliente está diseñado para permitir la clonación dependiente de ligasa dirigida con un brazo de la cadena principal del vector de entrada V-C. Una secuencia consenso de Kozak se codifica 5' del codón de iniciación ATG dentro del segmento génico V de TRA para el inicio eficaz de la traducción del ARNm de TRA reconstituido y expresado final. En el presente ejemplo, cada segmento V de TRA codifica todos los aminoácidos desde el resto de metionina inicial hasta la última cisteína (Cys) del segmento V de TRA. Este residuo Cys se reconoce generalmente como un límite de los segmentos génicos TRA variables, cuya deleción es rara en cadenas TRA recombinadas y funcionales de origen natural. Cuando es necesario, las secuencias de consenso nativas de V de TRA humanas se han editado para eliminar las secuencias de reconocimiento de cualquier enzima de restricción utilizada en las operaciones de ensamblado o reconstitución con el TORES, y también de cualquier enzima utilizada en aplicaciones posteriores. Hacia el extremo 3' del segmento V de TRA se codifica un sitio de unión de enzima de restricción Bsal de Tipo IIS, Bsal ^ . La dirección del sitio de unión de Bsal guía la enzima Bsal para cortar el ADN 5' de su secuencia de reconocimiento. La secuencia del saliente resultante se diseña para abarcar el último codón de cisteína del elemento de segmento V y el 3er nucleótido del codón de aminoácidos que precede a la cisteína. Por lo tanto, la acción de Bsal en la secuencia diseñada crea un Cys-Saliente$1 de V de TRA en el extremo 3' del segmento V de TRA. En el presente ejemplo, este Saliente Cys £1 se estandariza entre todos los segmentos V de TRA incluidos para simplificar y unificar la estrategia de clonación. Cuando fue necesario, se cambiaron los nucleótidos que codifican el elemento genético V de TRA para codificar este saliente estandarizado pero sin cambiar la secuencia de aminoácidos traducida. Este sitio Bsal ^ se utiliza durante la reacción de reconstitución TRA de longitud completa.

En este ejemplo actual, el marcador de selección negativa del vector de entrada V-C es un sitio de unión de enzimas de restricción NotI. Para construir un sitio de unión NotI, dos mitades del sitio se combinan cuando el fragmento de clonación V de TRA y el fragmento de clonación C de TRA se ligan entre sí. El fragmento de clonación V de TRA codifica el segmento NotI 5 ' de seis nucleótidos.

El extremo 5' de la secuencia de unión del cebador 3' codifica un segundo sitio de restricción Bbsl, que dirige la enzima Bbsl para cortar el ADN 5' a su secuencia de reconocimiento, BbsI ^ . La acción de Bbsl en la secuencia diseñada crea por lo tanto un saliente de 4 nucleótidos, saliente Notl 5', diseñado para ser complementario del saliente generado en el fragmento de ADN C de TRA y reconstituye un sitio de unión Notl después de la ligación.

Sp denota adiciones de nucleótidos en puntos específicos del fragmento de clonación V de TRA para lograr la separación correcta del sitio de unión de enzimas de restricción de Tipo IIS y el sitio de corte, cuando está adyacente a dichos sitios. Los bloques Sp que flanquean la secuencia del sitio de unión de enzimas de restricción Notl se han utilizado para separar el sitio de unión y corte Notl adecuadamente para una acción eficiente. La selección de nucleótidos tuvo en cuenta el impacto potencial de la metilación de DAM en el sitio de unión a Bsal.

Las secuencias completas de ADN para los fragmentos de clonación V de TRA en el presente ejemplo de cadenas TRA humanas nativas se proporcionan como SEQ0001 a SEQ0046. Estas secuencias incluyen las secuencias de unión al iniciador 5' y las secuencias de unión al iniciador 3'.

Diseño del fragmento de clonación C de TRA sintético

La disposición de los elementos genéticos de los fragmentos de clonación C de TRA en el presente ejemplo se representa en la Figura 26.

Cada extremo del fragmento de clonación C de TRA codifica una secuencia estandarizada de ADN de unión al cebador 5' y 3' de 20 nucleótidos para la propagación del fragmento general por PCR.

Proximal a la secuencia de unión al cebador 5 ' se codifica un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Bbsl, de modo que la enzima Bbsl cortará el ADN 3' a su secuencia de reconocimiento, BbsI ^ .

El fragmento de clonación C de TRA codifica el segmento NotI 3' de seis nucleótidos, que completa un sitio de reconocimiento NotI que constituirá el marcador de selección negativa del vector de entrada V-C. El sitio de restricción BbsI ^ adyacente actúa sobre el elemento NotI 3' para crear el saliente Notl 3' de cuatro nucleótidos. Este saliente se diseña para ser complementario del saliente Notl 5' generado en el fragmento de ADN V de TRA y reconstituir un sitio de unión Notl completo después del ensamblado de vectores de entrada V-C.

Hacia el extremo 3' del elemento NotI 3', el fragmento de clonación C de TRA codifica un sitio de unión de enzimas de restricción Bsal, BsaI ^ . La dirección del sitio de unión de Bsal guía la enzima Bsal para cortar el ADN 5' de su secuencia de reconocimiento. La secuencia del saliente resultante se diseña para comenzar desde la primera citosina del fragmento genético C de TRA, saliente C de TRA £3. Este sitio BsaI ^ se utiliza durante la reacción de reconstitución TRA de longitud completa. La enzima B sa l^ actúa sobre el segmento C de TRA codificado en el vector de entrada V-C para crear el Saliente de C de TRA necesario £3 durante las reacciones de reconstitución. En el presente ejemplo, se incluye una secuencia de C de TRA de consenso desde el resto de citosina 5' del primer codón de glutamina hasta el codón de terminación en el fragmento de clonación C de TRA

El extremo 5' de la unión al cebador 3' codifica una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción Bbsl, Bbsl ^ . La dirección del sitio de unión de Bbsl guía a la enzima Bbsl para cortar el ADN 5' de su secuencia de reconocimiento. Los salientes generados por la actividad enzimática de Bbsl son codificados por el Saliente*2. El diseño de este saliente permite la clonación dependiente de ligasa dirigida con un brazo de la cadena principal del vector de entrada V- C durante el ensamblado.

Sp denota las adiciones de nucleótidos en puntos específicos del fragmento de clonación C de TRA para lograr la separación correcta del sitio de unión de enzimas de restricción de Tipo IIS y el sitio de corte, cuando está adyacente a dichos sitios. Los bloques Sp que flanquean la secuencia del sitio de unión de enzimas de restricción Notl se han utilizado para separar el sitio de unión y corte Notl adecuadamente para una acción eficiente. La selección de nucleótidos tuvo en cuenta el impacto potencial de la metilación de DAM en el sitio de unión a Bsal

La secuencia completa de ADN para el fragmento de clonación C de TRA del presente ejemplo de cadenas TRA humanas nativas se presenta como SEQ0047. Esta secuencia incluye las secuencias de unión al iniciador 5' y las secuencias de unión al iniciador 3'.

Diseño de la cadena principal del vector de entrada V-C para la expresión transitoria del ORF del TRA reconstituido en células de mamífero

En el presente ejemplo, la cadena principal del vector de entrada V-C se deriva del plásmido pMA. Codifica un origen de replicación Col E1, ori, junto con el gen de la beta-lactamasa de resistencia a antibióticos, selección positiva n.° 1. La beta-lactamasa confiere resistencia al grupo de antibióticos betalactámicos de la penicilina, tales como ampicilina y carbenicilina.

La cadena principal del vector, como se representa en la Figura 27, codifica los elementos genéticos necesarios que confieren la funcionalidad adecuada para aplicaciones posteriores del ORF del TRA completamente reconstituido. En este ejemplo, el elemento genético 5 ' codifica el promotor constitutivo mamífero de CMV y el elemento genético 3 ' codifica la señal de poliadenilación de SV40pA para permitir la expresión transitoria del ORF del TRA completamente reconstituido en una célula de mamífero.

En el presente ejemplo, la cadena principal del vector codifica sitios de unión de enzimas de restricción Acc65 l y XbaI que generan el saliente *1 ' y el saliente *2 ', respectivamente. El Saliente*1' es complementario del Saliente*1 dentro del fragmento de clonación V de TRA (Figura 25). El Saliente*2' es complementario del Saliente*2 dentro del fragmento de clonación C de TRA (Figura 26). Estos salientes complementarios permiten la clonación dirigida de los fragmentos de clonación V de TRA y C de TRA en la cadena principal del vector de entrada V-C.

La característica Sp denota nucleótidos añadidos entre los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción Acc65 l y XbaI necesarios para separar los dos sitios para una acción eficiente.

La secuencia de ADN de la cadena principal del vector procedente del elemento genético 5 ' que codifica el sitio F14 del FRT hasta el elemento genético 3 ' que codifica el F15 del FRT se presenta como SEQ0688.

Método para ensamblar la genoteca de vectores de entrada V-C de TRA

Este método utiliza técnicas estandarizadas de biología molecular para ensamblar el fragmento de clonación V de TRA seleccionado (Figura 25) y el fragmento de clonación C de t Ra (Figura 26) en una cadena principal del vector de entrada V-C dada (Figura 2) para crear un vector de entrada V-C de TRA (Componente 1A, Figura 2a). En este ejemplo, el método lleva a cabo la digestión con enzimas de restricción y la reacción de ligación en una sola reacción. Reacción de digestión y ligación de RE

100 ng de cadena principal del vector lineal (linealizado por digestión con ACC65I y Xbal)

10 ng del fragmento genético V de TRA

20 ng del fragmento genético C de TRA

2 pl de tampón de ligasa NEB 10x

0,5 pl de Bbsl

1 pl de ADN-ligasa de T4

Hasta 20 pl de H²O

Condiciones de reacción

Etapa 1; 2 minutos a 37 0C

Etapa 2; 3 min a 16 0C

Repetir las etapas 1 y 2, 20 veces

5 min a 50 0C

5 min a 80 0C

Volver a la temperatura ambiente

El producto resultante se transforma en células de E. coli competentes que se seleccionan por colonias resistentes a carbenicilina. Los plásmidos aislados de colonias seleccionadas se secuencian para determinar las construcciones ensambladas correctamente. El procedimiento se repite para cada fragmento de clonación del segmento V independiente. Las construcciones resultantes componen la genoteca de vectores de entrada V-C de TRA para su uso en la reconstitución de ORF de longitud completa para su uso posterior en la expresión transitoria de dicho TRA reconstituido en células de mamífero. La secuencia de los fragmentos V-C clonados que componen la genoteca del vector de entrada V-C de TRA se presenta como las SEQ0049 a SEQ0094. Las secuencias presentadas incluyen toda la secuencia Kozac que precede al codón de iniciación del segmento variable, hasta el codón de terminación del segmento C.

Diseño y ensamblado de una genoteca de vectores de donantes J de TRA para un repertorio de TRA humana nativa

En el presente ejemplo, un fragmento del casete de recepción J de TRA se construye y se inserta en la cadena principal del vector donante J para crear un vector del casete de recepción J . Posteriormente, pueden ensamblarse partes sintéticas de segmento J de TRA en un vector del casete de recepción J de TRA para crear la genoteca de vectores donantes J . Este método flexible de ensamblado multietapa permite un diseño rápido y económico de las características del segmento donante J, tales como variaciones en la longitud del segmento J.

Los componentes de ADN necesarios para una genoteca de vectores donantes J de TRA son:

I. Fragmento del casete de recepción J de TRA

II. Cadena principal del vector donante J

III. Vector del casete de recepción J de TRA

IV. Parte del segmento J de TRA

Diseño del fragmento sintético del casete de recepción J de TRA

La hibridación de dos oligonucleótidos de ADN monocatenarios se usa para generar el fragmento del casete del sitio receptor que, por diseño, contiene salientes monocatenarios de 4 nucleótidos a cada extremo del fragmento de ADN; el Saliente*3 y el Saliente*4. Los salientes de 4 nucleótidos permiten la clonación dependiente de ligasa dirigida a una cadena principal del vector donante J para crear el vector del casete de recepción J de TRA, representado en la Figura 28.

El par de sitios de restricción de Tipo IIS, BsaI ^ y Bsal ^ está situado en el extremo 5' y 3' del fragmento de ADN del casete del sitio de recepción. La instrucción del sitio de reconocimiento de Bsal es guiar a la enzima Bsal para cortar el ADN hacia el centro de la construcción. Estos sitios se utilizan durante el protocolo de reconstitución del ORF de TRA generando un saliente $2-5 ' y un saliente $3-3 '. El Saliente $3 es un componente de la parte C de TRA codificada en el fragmento del casete de recepción, mientras que el Saliente $2 se define después de clonar la parte del segmento J de TRA (más adelante).

El par Bbsl de los sitios de reconocimiento de Tipo IIS Bbsl ^ y Bbsl ^ está codificado cerca del centro del casete y se utiliza para ensamblar el vector donante J de TRA, durante la creación de salientes complementarios incluidos en las partes del segmento J de TRA sintetizadas (véase más abajo).

El sitio Bbsl 5', Bbsl ^ , corta el sitio Bsal para crear el Saliente*5 en el extremo 3' de esta característica. El sitio Bbsl 3', Bbsl ^ , corta el elemento de parte C de TRA, para crear un Saliente*6 en el extremo 5' de este elemento. Estos salientes están codificados dentro de las características de la parte Bsal y C de TRA de esta construcción para evitar la adición de nucleótidos no nativos que se incorporarían al ORF del TRA reconstituido final.

La región entre el saliente generado por la enzima Bbsl ^ y el saliente generado por la enzima Bsal ^ codifica una proporción de la región C de TRA que comienza a partir del segundo nucleótido del fragmento genético C de TRA, parte C de TRA. El motivo para comenzar a partir del segundo nucleótido del fragmento genético C de TRA es porque, en el presente ejemplo de un locus de TRA humano TORES, el saliente resultante es TATC y no un saliente palindrómico, lo que sería el caso si se incluyera el comienzo del fragmento genético C de TRA (saliente resultante ATAT). Debe evitarse un saliente palindrómico, ya que permitiría que dos extremos de vector se uniesen sin la inserción de la parte del segmento J requerida. La orientación del sitio Bbsl ^ permite la clonación dependiente de ligasa dentro del marco de todos los fragmentos J de TRA del extremo 3' hasta el comienzo de la región C de TRA 5' del casete del sitio receptor. La orientación del sitio Bsal ^ permite la clonación dependiente de ligasa dentro del marco del comienzo de la región C de TRA con los fragmentos C de TRA restantes en la etapa final del protocolo de reconstitución del ORF de longitud TRA completa utilizando un TORES completo.

Entre los dos sitios de unión de Bbsl hay una secuencia de reconocimiento de 8 nucleótidos de la enzima Notl. Este sitio de restricción se utiliza como un marcador de selección negativa para reducir el fondo de colonias del plásmido parental. Esto se logra cuando la enzima NotI se añade después de realizar la inserción del fragmento génico J de TRA. Por lo tanto, los plásmidos que clonan correctamente un fragmento de gen J de TRA permanecerían circulares en presencia de la enzima Notl pero los plásmidos parentales que no intercambiaron su sitio Notl por un fragmento de gen J de TRA se linealizarán, desviando a su vez la transformación bacteriana para propagar un plásmido que contiene el fragmento J de TRA circular completo.

Sp denota las adiciones de nucleótidos en puntos específicos del fragmento del casete de recepción J de TRA para lograr la separación correcta del sitio de unión de enzimas de restricción de Tipo IIS y el sitio de corte, cuando está adyacente a dichos sitios. Los bloques Sp que flanquean la secuencia del sitio de unión de enzimas de restricción Notl se han utilizado para separar el sitio de unión y corte Notl adecuadamente para una acción eficiente. Se han incluido nucleótidos adicionales para mantener el marco de lectura correcto dentro del TRA de longitud completa reconstituido final. La selección de nucleótidos tuvo en cuenta el impacto potencial de la metilación de DAM en el sitio de unión a Bsal.

La secuencia completa de ADN para el fragmento del casete de recepción J de TRA del presente ejemplo de cadenas TRA humanas nativas se presenta como SEQ0095 y SEQ0096. Se especifican ambas secuencias de oligonucleótidos directa (F1) e inversa (R1).

Diseño de la cadena principal del vector donante J

La cadena principal del vector donante J se utiliza para insertar el fragmento del casete de recepción J de TRA para crear el vector del casete de recepción J de TRA. Por tanto se lleva la cadena principal en la genoteca de vectores donantes J. En la reacción final para crear los ORF de TRA longitud completa, esta cadena principal es un subproducto de reacción (Figura 2e) y, por lo tanto, tiene características mínimas como se ilustra en la Figura 29. En el presente ejemplo, la cadena principal del vector donante J codifica para un origen de replicación Col E1, ori. La resistencia a antibióticos es el gen de la aminoglicósido 3'-fosfotransferasa, selección positiva n.° 2. La aminoglicósido 3'-fosfotransferasa confiere resistencia a sustratos antibióticos tales como canamicina, estreptomicina, neomicina y gentamicina. Esta selección positiva alternativa se utiliza para asegurar que los vectores donantes J no se seleccionen después de la reconstitución del ORF del TCR de longitud completa, que se seleccionan en la selección positiva n.° 1. En el presente ejemplo, los sitios de unión de la enzima de restricción EcoRI y XhoI del vector generan salientes complementarios, el saliente *3 ' y el saliente *4 ', respectivamente. El Saliente*3' es complementario del Saliente*3 contenido dentro del fragmento del casete de recepción J de TRA. El Saliente*4' es complementario del Saliente*4 contenido dentro del fragmento del casete de recepción J de TRA. Estos salientes permiten la clonación dirigida del fragmento del casete de recepción J de TRA.

El bloque Sp denota nucleótidos añadidos entre los sitios de unión de enzimas de restricción EcoRI y XhoI para separar los dos sitios para asegurar una acción eficiente.

En el presente ejemplo, la cadena principal del donante J se presenta como SEQ0097.

Método para ensamblar el vector del casete de recepción J de TRA

Este método utiliza técnicas estándar de biología molecular para ensamblar los fragmentos del casete de recepción J de TRA dado (Figura 28) en una cadena principal del vector donante J dado (Figura 29) para crear un vector del casete de recepción J de TRA (Figura 30). El vector del casete de recepción J de TRA resultante se utiliza para insertar partes del segmento J de TRA (Figura 31) para construir vectores donantes J de TRA (Componente 1B, Figura 2b).

Primero, los dos oligonucleótidos que forman el fragmento de ADN del casete de recepción J de TRA deben fosforilarse e hibridarse.

Mezcla de reacción

Oligonucleótido (cadena sentido) (100 pm) 1 pl Oligonucleótido (cadena antisentido) (100 pm) 1 pl Tampón de ligasa de T4 10x 1 pl T4 PNK 1 pl H²O 6 pl Condiciones de reacción

Incubar a 37 0C durante 1 hora

Desnaturalizar a 95 0C durante 5 min

Hibridar los oligonucleótidos sentido y antisentido enfriando lentamente la reacción a 25 0C a 3 0C por min Ligación de ensamblado de fragmentos del casete de recepción J de TRA y de la cadena principal del vector donante J.

Mezcla de reacción

Cadena principal del vector lineal 100 ng Fragmento de ADN del casete del sitio receptor (0,5 pM) 2 pl

Tampón de ligasa de T4 10x 2 pl

Ligasa de T4 0,5 pl

H²O hasta 20 pl

Condiciones de reacción

Incubar durante 1 hora a 25 0C

Inactivar térmicamente a 65 durante 10 min

El producto resultante se transforma en células E. coli competentes y se selecciona por colonias resistentes a la kanamicina. Las colonias resistentes se seleccionan para determinar las construcciones correctamente ensambladas. El plásmido resultante es el vector del casete de recepción J de TRA. En el presente ejemplo, el vector del casete de recepción J de TRA se presenta como SEQ0098 y se ilustra en la Figura 30.

Diseño de partes sintéticas de segmentos J de TRA

Después de haber generado el vector del casete de recepción J de TRA sintético, deben generarse las partes del segmento J de TRA sintéticas a introducir en este vector. Cada secuencia J de TRA se inserta en un contexto del vector receptor J de TRA independiente para generar la genoteca de vectores donantes J de TRA como parte del TORES de TRA humana.

La genoteca de vectores donantes J viene en dos formas distintas, que comprenden una parte larga o corta del segmento J. La parte del segmento J de TRA corta codifica para todos los aminoácidos desde el inicio del codón de límite de CDR3. Sin embargo, teniendo en cuenta que la mayoría de los segmentos J de TRA se recortan en menos de 10 nucleótidos durante el reordenamiento del TCR, se diseña una genoteca de donantes J de TRA que contiene un segmento de línea germinal J de TRA más largo, la parte del segmento J de TRA larga. El motivo de una genoteca de fragmentos de genes J de TRA más largos es que se necesitaría un dúplex de oligonucleótidos que codifica para CDR3 más corto (odeCDR3) para la reconstitución de un TRA de longitud completa, que si se utilizara el fragmento J de TRA corto. Dado que se proporcionan secuencias altamente variables como dúplex de oligonucleótidos cortos, odeCDR3, es menos probable que una síntesis de oligonucleótidos de CDR3 más corto contenga contaminantes de oligonucleótidos truncados o mutados y, por lo tanto, se reduce la probabilidad de clonar el dúplex de oligonucleótidos con errores de secuencia durante la reconstrucción del TRA de longitud completa. Además, las síntesis de odeCDR3 más cortos ahorra costes.

Las partes de los segmentos J de TRA se construyen por hibridación de dos oligonucleótidos de ADN monocatenarios diseñados para contener salientes monocatenarios de 4 nucleótidos en cada extremo del fragmento de ADN. La parte resultante del segmento J de TRA se ilustra en la Figura 31.

El saliente 5' designado Saliente*5' es complementario del Saliente*5' generado dentro del vector del casete de recepción del donante J por acción de Bbsl. El saliente 3' designado Saliente*6' es complementario del Saliente*6' generado dentro del vector del casete de recepción del donante J por acción de Bbsl. Este par de salientes complementarios permite la clonación direccional de las partes del segmento J de TRA en el vector del casete de recepción J de TRA.

La parte de segmento J de TRA corto codifica para todos los aminoácidos desde el inicio del codón Phe del límite CDR3-J. La CDR3 se define como la secuencia flanqueada por la Cys conservada C terminal de la región V y la Phe en la región J que forma parte del motivo conservado Phe-Gly/Ala. Este motivo Phe-Gly/Ala conservado se utiliza para estandarizar los salientes 5' de los fragmentos J de TRA hasta TTTG para la reconstitución de TRA posterior. Las excepciones a esta estandarización en el presente ejemplo son TRAJ33 y TRAJ38 humanas que limitan la región CDR3 con Trp y Gly. Los salientes 5' son TGGG para TRAJ33 y TRAJ38 en el presente ejemplo.

La parte de segmento J largo está diseñada para codificar más aminoácidos en el extremo N terminal de los aminoácidos límite de CDR3. El punto de inicio de cada fragmento de gen largo está en el primer nucleótido de un codón de aminoácidos situado a 10-12 nt del extremo 5' del elemento de unión del TCR codificado por la línea germinal. El extremo 5' de cada parte del segmento J largo sigue siendo idéntico al de la parte del segmento J de TRA corto.

En ambas partes del segmento J de TRA corto y largo, se añade una adenina, representada como bloque A en la Figura 11, al extremo 3' de cada parte de segmento J de TRA. Esta adenina representa el primer nucleótido del fragmento C de TRA que se excluye del casete de recepción J de TRA.

Las secuencias de las partes cortas de los segmentos J de TRA del presente ejemplo de segmentos J humanos nativos se presentan como SEQ0099 a SEQ0210 y las partes largas de los segmentos J de TRA como SEQ0211 a SEQ0322. En ambos casos se especifican las secuencias de oligonucleótidos directa (F1) e inversa (R1).

Método para ensamblar la genoteca de vectores de donante J corto o largo

Este método usa técnicas estandarizadas de biología molecular para clonar el segmento J de TRA corto o la parte del segmento J de TRA largo (Figura 31) en el vector del casete de recepción J de TRA (Figura 30) para crear los vectores donantes J de TRA (Componente 1B, Figura 2b) que contienen los segmentos J de TRA cortos o largos. En este ejemplo, el método lleva a cabo la digestión con enzimas de restricción y la reacción de ligación en una sola reacción.

Los componentes de ADN necesarios para una genoteca de vectores donantes J son los siguientes:

I. Parte corta de segmento J de TRA o parte larga de segmento J de TRA

II. Vector del casete de recepción de donante J

Fosforilación e hibridación de dos oligonucleótidos para formar el fragmento de ADN de la parte del segmento J Mezcla de reacción

Incubar a 37 0C durante 1 hora

Desnaturalizar a 95 0C durante 5 min

Hibridar los oligonucleótidos sentido y antisentido enfriando lentamente la reacción a 25 0C a 3 0C por min Reacción de digestión y ligación de RE

Estructura principal del casete de recepción J de TRA 100 ng

Fragmento de ADN TRA J (0,5 pM) 2 pl

Tampón de ligasa de T4 NEB 10x 2 pl

Bbsl 0,5 pl

ADN-ligasa de T4 0,5 pl

H²O hasta 20 pl

Condiciones de reacción

Etapa 1; 2 minutos a 37 0C

Etapa 2; 3 min a 16 0C

Repetir las etapas 1 y 2, 20 veces

5 min a 50 0C

5 min a 80 0C

Volver a la temperatura ambiente

Se añaden 0,5 pl de enzima Notl y se incuba durante 30 min a 37 0C para linealizar el vector parental. El producto de reacción se transforma en células E. coli competentes y se selecciona por resistencia a la kanamicina. Las colonias resistentes seleccionadas se secuencian para determinar las construcciones ensambladas correctamente. Las construcciones resultantes componen la genoteca de vectores donante J de TRA que codifica un fragmento génico J largo o corto.

La secuencia de las genotecas resultantes, excluyendo la secuencia de la cadena principal no incluida en los sitios de reconocimiento Bsal, se presenta como SEQ0323 a SEQ0378 para la genoteca donante J de TRA corta y SEQ0379 a SEQ0434 para la genoteca donante J de TRA larga.

Diseño y ensamblado del vector de entrada V-C de TRB y genotecas del vector donante J de TRB para el repertorio de TRB humano nativo

En las secciones anteriores se ha descrito detalladamente el diseño y ensamblado del vector de entrada V-C y las genotecas del vector donante J para el repertorio de TRA humano nativo. El diseño y ensamblado general de dichas genotecas vectoriales que codifican secuencias del repertorio de TRB es esencialmente el mismo. En el presente ejemplo, el diseño y ensamblado del vector de entrada V-C de TRB y las genotecas del vector donante J de TRB se esbozarán brevemente para construir un TORES o el locus del TRB del TRC humano nativo.

Es importante señalar que las cadenas principales del vector de entrada V-C para las cadenas TRA y TRB contienen sitios FRT distintos, para emparejar los productos del vector resultante del funcionamiento del sistema (Componentes 2C y 2E), con los sitios del receptor genómico de la eTPC-t (Componentes 2B y 2D). Esto significa que solo se integrará una única cadena TRA o TRB en cada célula eTPC a través del par de integración emparejado. En el presente ejemplo, aunque las cadenas TRA se han introducido en un contexto de vector de entrada V-C limitado por los sitios F14 y F15 de FRT, las cadenas TRB están limitadas por los sitios FRT y F3 de FRT.

Diseño y ensamblado de una genoteca de vectores de entrada V-C de TRB para un repertorio de TRB humana nativa

En el presente ejemplo, el diseño y ensamblado de una genoteca de vectores de entrada V-C de TRB que contiene el repertorio de secuencias V-C de TRB humanas nativas.

Los componentes de ADN requeridos para una genoteca de vectores V-C de TRB son:

I. Un fragmento de clonación V de TRB para cada segmento génico V de TRB funcional codificado en el genoma humano

II. Fragmento de clonación C1 de TRB o C2 de TRB

III. Una cadena principal del vector de entrada V-C

A diferencia del locus de TRA humano, el locus de TRB humano codifica dos segmentos constantes distintos, C1 y C2 de TRB. Por lo tanto, para capturar ambas regiones constantes, se construyen dos conjuntos de vectores de entrada V-C para emparejar cada uno de los segmentos V con cada uno de los segmentos C1 y C2.

En el presente ejemplo, los fragmentos de clonación V de TRB y C de TRB se sintetizaron y utilizaron para ensamblarse en una cadena principal del vector de entrada V-C diana en una sola reacción de enzima de restricción y ligasa. En el presente ejemplo, la cadena principal de entrada V-C diana se diseñó para permitir la expresión transitoria de los ORF del TRB reconstituidos en células de mamífero.

En el presente ejemplo, la genoteca de vectores de entrada V-C de TRB se construye con la enzima de restricción Bbsl de Tipo IIS. La enzima de restricción de Tipo IIS utilizada en el funcionamiento del biblioteca para reconstituir los ORF del TRB de longitud completa es Bsal.

Diseño de fragmentos de clonación V de TRB sintéticos

La disposición de los elementos genéticos de los fragmentos de clonación V de TRB es idéntica a la de los fragmentos de clonación V de TRA descritos anteriormente en 1, como se ilustra en la Figura 25.

Las secuencias completas de ADN para los fragmentos de clonación V de TRB en el presente ejemplo de cadenas TRB humanas nativas se presentan como SEQ0435 a SEQ481.

Diseño del fragmento de clonación C de TRB sintético

La disposición de los elementos genéticos de los fragmentos de clonación V de TRB es idéntica a la de los fragmentos de clonación C de TRA descritos anteriormente, como se ilustra en la Figura 26.

El locus de TRB codifica dos segmentos C distintos, y ambos se incluyen en el diseño de la genoteca de vectores de entrada V-C de TRB.

La secuencia completa de ADN para los fragmentos de clonación C de TRB en el presente ejemplo de cadenas TRB humanas nativas se presentan como SEQ0482 y SEQ0483.

Método para ensamblar la genoteca de vectores de entrada V-C de TRB

El método para ensamblar los fragmentos de clonación V de TRB y C de TRB dados en una cadena principal del vector de entrada V-C dada para crear un vector de entrada V-C de TRB es idéntico al descrito anteriormente para el sistema TRA. La cadena principal del vector de entrada V-C utilizada para el vector de entrada V-C de TRB en el presente ejemplo contiene secuencias FRT y FRT F3 como los elementos genéticos 5' y 3', respectivamente. Esta secuencia de cadena principal del vector de entrada V-C de FRT/F3 se presenta como SEQ0689. El diferente contexto del sitio FRT entre los sistemas TORES TRA y TRB aísla los vectores de integración entre sí y los empareja con los sitios del receptor genómico de la eTPC como pareja de pares de integración.

La secuencia de los fragmentos V-C clonados que componen la genoteca del vector de entrada V-C de TRA se presenta como SEQ0484 a SEQ0577.

Diseño y ensamblado de una genoteca de vectores de donantes J de TRB para un repertorio de TRB humana nativa

En el presente ejemplo, el diseño y ensamblado de una genoteca de vectores donantes J de TRB que contiene el repertorio de secuencias V-C de TRB humanas nativas.

En el presente ejemplo, un fragmento del casete de recepción J de TRB se construye y se inserta en la cadena principal del vector donante J para crear un vector del casete de recepción J de TRB.

Posteriormente, puede ensamblarse una parte sintética de segmento J de TRB en un vector del casete de recepción J de TRB para crear la genoteca de vectores donantes J de TRB. Este método flexible de ensamblado multietapa permite un diseño rápido y económico de las características del segmento donante J, tales como variaciones en la longitud del segmento J.

Este procedimiento sigue el mismo patrón que el ensamblado del vector donante J de TRA descrito en el Ejemplo 2. Sin embargo, cabe señalar que dado que los fragmentos del casete de recepción J contienen partes del segmento C, los fragmentos del casete de recepción de J de TRA y J de TRB difieren con respecto a la secuencia de la parte C, que debe corresponder a los segmentos génicos C respectivos. Además, a diferencia del escenario para J de TRA que solo requiere un único fragmento del casete de recepción J, el J de TRB requiere dos fragmentos distintos del casete de recepción J para dar cuenta del uso de segmentos de C1 y C2 alternativos.

Los componentes de ADN necesarios para una genoteca de vectores donantes J de TRB son:

I. Fragmento del casete de recepción J de C1 de TRB o J de C2 de TRB

II. Cadena principal del vector donante J

III. Vector de casete de recepción J de C1 de TRB o J de C2 de TRB

IV. Parte del segmento J de TRB

Diseño del fragmento sintético del casete de recepción J de TRA

La hibridación de dos oligonucleótidos de ADN monocatenarios se utiliza para generar los fragmentos del casete receptor, que contienen salientes monocatenarios de 4 nucleótidos a cada extremo del fragmento de ADN, ilustrado en la Figura 28. Los salientes de 4 nucleótidos permiten la clonación dirigida dependiente de ligasa en una cadena principal del vector donante J para crear el vector del casete de recepción J de TRB.

Los dos fragmentos del casete receptor necesarios para el uso alternativo de los segmentos C1 y C2 se presentan como SEQ0578 y SEQ0581. Para cada fragmento se proporcionan las secuencias de oligonucleótidos directa (F1) e inversa (R1).

Método para ensamblar los vectores de casete de recepción J de TRB

El método para ensamblar los vectores del casete de recepción J de TRB es idéntico al del método para ensamblar los vectores del casete de recepción J de TRA descrito en el Ejemplo 2. Se utiliza la misma cadena principal del vector donante J (SEQ0097) para generar dos vectores del casete de recepción J de TRB, conteniendo cada uno una parte de C1 o C2 que corresponde a los segmentos C alternativos del locus de TRB. Los dos vectores de casete de recepción de J de TRB resultantes se utilizan para insertar partes del segmento J de TRB para construir vectores de donante J de TRB.

Los vectores del casete de recepción J de TRB resultantes se presentan como SEQ0582 y SEQ0583.

Diseño de partes sintéticas de segmentos J de TRB

Las partes de los segmentos J de TRB se construyen anillando dos oligonucleótidos de ADN monocatenario diseñados para contener salientes monocatenarios de 4 nucleótidos en cada extremo del fragmento de ADN. La disposición de esta parte y método de ensamblado son idénticos a los de las partes del segmento J de TRA, y se ilustra en la Figura 31. En el caso de la parte de segmento J de TRB corto, codifica para todos los aminoácidos desde el inicio del codón de Phe del límite de CDR3-J. La CDR3 se define como la secuencia flanqueada por la Cys conservada en el extremo C de la región V y la Phe en la región J que forma parte del motivo Phe-Gly conservado para todos los segmentos J de TRB nativos. Este motivo Phe-Gly conservado se utiliza para estandarizar los salientes 5' de los fragmentos J de TRB hasta TTTG para la reconstitución de TRA posterior. A diferencia de los segmentos J de TRA, no hay excepciones a este saliente estandarizado en las partes de los segmentos J de TRA del presente ejemplo.

Se añade una adenina a ambas partes del segmento J de TRB corto y largo, representada como bloque A en la Figura 11, al extremo 3' de cada parte de segmento J de TRB. Esta adenina representa el primer nucleótido del fragmento C de TRB que se excluye de los casetes de recepción J de TRB.

Las secuencias de las partes cortas de los segmentos J de TRB del presente ejemplo de segmentos J humanos nativos se presentan como SEQ0584 a SEQ0609 y las partes largas de los segmentos J de TRB como SEQ0610 a SEQ0635. En ambos casos se especifican las secuencias de oligonucleótidos directa (F1) e inversa (R1).

Método para ensamblar la genoteca de vectores de donante J de TRB corto o largo

El procedimiento para ensamblar las genotecas donantes J de TRB es idéntico al de las genotecas TRA descritas anteriormente. Sin embargo, en el caso de las genotecas de TRB, deben generarse cuatro genotecas, a diferencia de las genotecas cortas y largas para los segmentos del locus de TRA.

En el caso de genotecas de TRB, puede construirse cada genoteca corta y larga para contener cada uno de los segmentos alternativos de C C1 y C2, lo que da como resultado cuatro subconjuntos dentro de la genoteca donante J de TRB.

I. Parte corta de segmento J de TRB o parte larga de segmento J de TRB

II. Vector de casete de recepción J de C1 de TRB o J de C2 de TRB

Siguiendo el mismo procedimiento que se ha descrito anteriormente, se generan los cuatro subconjuntos resultantes dentro de la genoteca donante de J de TRB. Se presenta la secuencia de las genotecas resultantes, que excluye la secuencia de la cadena principal fuera de los sitios de reconocimiento Bsal.

Genoteca de donantes J cortos C1 de TRB presentada como SEQ0636 a SEQ0648

Genoteca de donantes J cortos C2 de TRB presentada como SEQ0649 a SEQ0661

Genoteca de donantes J largos C1 de TRB presentada como SEQ0662 a SEQ0674

Genoteca de donantes J largos C2 de TRB presentada como SEQ0675 a SEQ0687

Ejemplo 2 Diseño y generación del dúplex de oligonucleótidos que codifica CDR3 (odeCDR3)

En el ejemplo anterior, se ha descrito el diseño y construcción del TORES como genotecas de vectores de entrada V-C y vectores donantes J y cadenas humanas TRA y TRB para producir cadenas humanas del TCR de longitud completa como componentes 2C y 2E del dispositivo global de dos partes.

El uso de estas genotecas de vectores de entrada V-C y vectores donantes J para la reconstitución en una etapa de marcos de lectura abiertos de TCR de longitud completa requiere la provisión de un dúplex de oligonucleótidos que codifique la construcción CDR3 (odeCDR3) para completar la secuencia diana de la cadena del TCR de longitud completa (Figura 2c). Una vez generadas las genotecas del vector de entrada V-C y vectores donantes J, estos vectores representan los elementos de reserva a los que se puede recurrir indefinidamente para seleccionar las combinaciones V-J-C deseadas de las secuencias de las cadenas del TCR de longitud completa diana. Sin embargo, el odeCDR3 representa una secuencia corta única específica del ORF del TCR de longitud completa diana.

El presente ejemplo describe el diseño y la generación de odeCDR3 para su uso en las plataformas de vectores nativos de TRA y TRB humanos.

Diseño del odeCDR3 de TRA

el anillado de dos oligonucleótidos de ADN monocatenarios genera un odeCDR3 que contiene salientes monocatenarios de 4 nucleótidos a cada extremo del fragmento de ADN, como se representa en la Figura 2c. Los salientes de 4 nucleótidos están diseñados para permitir la clonación dependiente de ligasa dirigida al extremo 3' del segmento V de TRA codificado en el vector de entrada, (Saliente $1-5') y al extremo 5' del fragmento J de TRA durante la reconstitución de TRA (Saliente $2-3'). El Saliente $1-5' se estandariza a CTGC, complementario del Saliente $1-5 estandarizado codificado en el segmento V del vector de entrada V-C de TRA. En el caso del Saliente $2-3', este puede tomar dos formas de secuencia, determinado por la divergencia de secuencias entre los segmentos J del locus de TRA humano. Para los segmentos J de TRA humanos nativos TRAJ33 y TRAJ38, el Saliente $2-3' se estandariza a TGGG, complementario del Saliente $2-3 codificado en el vector donante J de estos dos segmentos J. Para el resto de segmentos J de TRA humanos el Saliente $2-3' se estandariza a TTTG, complementario del Saliente $2-3 codificado en el vector donante J de estos segmentos J (véase el Ejemplo 1).

Diseño del odeCDR3 de TRB

En cuanto al odeCDR3 de TRB, el anillado de dos oligonucleótidos de ADN monocatenarios genera un odeCDR3 que contiene salientes monocatenarios de 4 nucleótidos en cada extremo del fragmento de ADN, como se representa en la Figura 4c. Los salientes de 4 nucleótidos están diseñados para permitir la clonación dependiente de ligasa dirigida al extremo 3' del segmento V de TRB codificado en el vector de entrada, Saliente $1-5 ', y al extremo 5' del fragmento J de TRB durante la reconstitución de TRB Saliente $2-3 '. El Saliente $1-5' se estandariza a TTGC, complementario del Saliente $1-5 estandarizado codificado en el segmento V de los vectores de entrada V-C de TRB. A diferencia del odeCDR3 de TRA, en donde se necesitan dos formas alternativas del Saliente $2-3, para odeCDR3 de TRB el Saliente $2-3 se estandariza a TTTG, complementario del Saliente $2-3 codificado en el vector donante J de todos los segmentos J de TRB (véase el Ejemplo 1).

Diseño general del odeCDR3

En general, el diseño de odeCDR3 debe hacer que los salientes coincidan con los salientes de 4 nucleótidos diseñados para permitir la clonación dependiente de ligasa dirigida al extremo 3' del segmento V codificado en el vector de entrada (Saliente $1-5 ') y el extremo 5' del fragmento J durante la reconstitución, (Saliente $2-3 ').

Método para generar el dúplex de oligonucleótidos de ADN de CDR3 fosforilado

Fosforilación e hibridación de dos oligonucleótidos para formar el odeCDR3

Mezcla de reacción

Oligonucleótido (cadena sentido) (100 pM) 1 pl Oligonucleótido (cadena antisentido) (100 pM) 1 pl Tampón de ligasa de T4 10x 1 pl T4 PNK 1 pl H²O 6 pl

Condiciones de reacción

Incubar a 37 0C durante 1 hora

Desnaturalizar a 95 0C durante 5 min

Hibridar los oligonucleótidos sentido y antisentido enfriando lentamente la reacción a 25 0C a 3 0C por min Ejemplo 3. Demostración del dispositivo de dos partes que comprende TORES y eTPCS para generar una eTPC-t

Este ejemplo describe las etapas utilizadas para definir los componentes de la genoteca de vectores y odeCDR3 necesarios para reconstituir los ORF del TCR de longitud completa de TRA y TRB dada la información de secuencia de los TCR diana. El presente ejemplo demuestra el proceso TORES para ensamblar un par de cadenas de TRA y TRB del TCR modelo de longitud completa. El presente ejemplo también demuestra el eTPCS mediante la integración de dichos vectores en una eTPC a través de RMCE tp para generar una eTPC-t y, posteriormente, confirmar su especificidad de par del TCR mediante la tinción del TCR presentado en la superficie con reactivo multímero específico de HLA.

Selección del vector de entrada V-C, vector donante J y odeCDR3

Las secuencias de todos los fragmentos posibles de la línea germinal que se representan en la genoteca de clonación se alinean con las secuencias t Ra o TRB de interés. Los fragmentos génicos con la identidad más alta con la secuencia TRA o TRB determinan qué elemento genético V, J y C constituirán las secuencias de clonotipo de TRA o TRB deseadas. Para TRA, el vector de entrada V-C apropiado se selecciona según la determinación del uso de V de la TRA deseada. Para TRB, cuando la cobertura de secuencias es suficiente para determinar el uso de V y C, se seleccionará el vector de entrada de V-C adecuado que corresponda al uso de V del clonotipo de TRB deseado, además de si dicho clonotipo utiliza TRBC1 o TRBC2.

Cuando la versión tanto corta como larga del elemento genético J de TRA o J de TRB específico se alinean con la secuencia TRA y TRB, respectivamente, se utilizarán los plásmidos correspondientes que codifican los elementos genéticos más largos para la reconstrucción de TRA.

La secuencia odeCDR3 necesaria para sintetizar la TRA se determina como la región entre el extremo 3' del fragmento genético V de TRA alineado y el extremo 5' del fragmento genético TRAJ alineado. La cadena sentido del oligonucleótido requiere el saliente adicional de 4 nucleótidos 5', el Saliente $1-5', CTGC que es universal respecto al saliente generado en el vector de entrada V de TRA cuando se digiere con Bsal, el Saliente $ 1-3'. La cadena antisentido del oligonucleótido complementario requiere el saliente de 4 nucleótidos adicional 5', el Saliente $2-3', que es único para el saliente específicamente para el vector TRAJ añadido a la reacción de reconstrucción de TRA, el Saliente $2-5'.

La secuencia CDR3 necesaria para sintetizar la TRB se determina como la región entre el extremo 3' del fragmento genético V de TRB alineado y el extremo 5' del fragmento genético J de TRB alineado. La cadena sentido del oligonucleótido requiere el saliente adicional de 4 nucleótidos 5', el Saliente $1-5', TTGC que es universal respecto al saliente generado en el vector de entrada V de TRB cuando se digiere con Bsal, el Saliente $ 1-3'. La cadena antisentido del oligonucleótido complementario requiere el saliente adicional de 4 nucleótidos 5', el Saliente $2-3', que es único para el saliente específicamente para el J vector TRB añadido a la reacción de reconstrucción de TCR, el Saliente $2-5'.

En el presente ejemplo se utiliza un par TRA/TRB del TCR modelo (JG9-TCR) con una especificidad conocida por un antígeno del citomegalovirus humano (CMVH) presentado en HLA-A2*01. Este péptido antigénico se deriva de la proteína pp65 del CMVH, y la secuencia completa de aminoácidos del antígeno peptídico que se presenta en HLA-A*02:01 es NLVPMVATV. Las secuencias de las cadenas TRA (JG9-TCR-alfa) y TRB (JG9-TCR-beta) se presentan como SEQ701 y SEQ702, respectivamente.

Basándose en esta secuencia de longitud completa, fue sencillo seleccionar los vectores de entrada V-C y donantes J adecuados y partir de las genotecas de TRA y TRB.

En el presente ejemplo se seleccionaron el vector de entrada V-C de TRA SEQ0088 (0049 a 0094 de la lista), en la cadena principal de la SEQ0698, y del vector donante J SEQ0371 ( 0323 a 0378 de la lista).

En el presente ejemplo se seleccionaron el vector de entrada V-C de TRB SEQ0563 (0484 a 0577 de la lista), en la cadena principal de la SEQ0688 y el vector donante J SEQ0637 ( 0636 a 0687 de la lista).

El odeCDR3 sintetizado para la cadena TRA se presenta en SEQ703 y SEQ704 como sentido y antisentido, respectivamente.

El odeCDR3 sintetizado para la cadena TRB se presenta en SEQ705 y SEQ706 como sentido y antisentido, respectivamente.

Método para la reconstitución de longitud completa

Para cada uno de los componentes TRA y TRB seleccionados anteriormente, se realizaron ciclos de reacción con enzima de restricción/ligasa como se describe a continuación.

Reacción de digestión y ligación de RE

Vector de entrada V-C 100 ng

Vector donante J 60 ng

dúplex de oligonucleótidos odeCDR3 (0,5 pM) 2 pl

Tampón de ligasa de T4 10x 2 pl

Bsal 0,5 pl

ADN-ligasa de T4 0,5 pl

H²O hasta 20 pl

Condiciones de reacción

Etapa 1; 2 minutos a 37 0C

Etapa 2; 3 min a 16 0C

Repetir las etapas 1 y 2, 20 veces

5 min a 50 0C

5 min a 80 0C

Volver a la temperatura ambiente

Se añaden 0,5 pl de enzima Notl y se incuba durante 30 min a 37 0C

El producto de reacción resultante se transformó en células E. coli competentes y se sembró en placas que contenían carbenicilina.

Se realizó el análisis y secuenciación de colonias resistentes a carbenicilina para determinar las construcciones ensambladas correctamente. El análisis de colonias se realizó mediante digestión diagnóstica con enzimas de restricción del ADN plasmídico aislado, y los tamaños esperados de los fragmentos de ADN se observaron mediante electroforesis de a Dn . Las construcciones resultantes codifican las secuencias de clones de TCR alfa y beta de longitud completa.

Validación de los vectores TRA y TRB reconstituidos

Para verificar la especificidad del par TRA/TRB del TCR reconstituido anterior, se generó una eTPC-t en con dicho par, en donde la eTPC parental contiene distintos sitios de receptor genómico sintético Componente 2B y 2D . Los sitios Componente 2B y 2D diseñados para coincidir con los sitios RMCE en los vectores de integración, Componente 2C y 2E generados, cada uno de los cuales codifica una sola cadena de un par del TCR (JG9-TCR) Este ejemplo utiliza una línea de células eTPC parental ACL-488, que es TCR nula, HLA nula, CD4 nula y CD8 nula, y que contiene, además, los Componentes 2B y 2D . El Componente 2B comprende dos sitios recombinasa heteroespecíficos únicos, FRT y F3, que flanquean una secuencia de Kozak y un ORF que codifica el marcador de selección, la proteína fluorescente azul (BFP). Codificado 5' del sitio FRT, hay un promotor EF1 a y 3' del sitio F3 hay un terminador de señal de poliadenilación SV40. El Componente 2D comprende dos sitios de recombinasa heteroespecíficos únicos, F14 y F15, que eran distintos del Componente 2B. Estos sitios flanquean una secuencia de Kozak y un ORF que codifica el marcador de selección, la proteína fluorescente roja (RFP). Codificado 5' del sitio F14, hay un promotor EF1 a y 3' del sitio F15 hay un terminador de señal de poliadenilación SV40.

Los componentes 2C y 2E descritos anteriormente generados con el TORES comprenden dos sitios de recombinasa heteroespecíficos, FRT/F3 (2C) y F14/F15 (2E), por lo tanto coinciden con los Componentes 2B y 2D, respectivamente. El Componente 2C comprende además, entre los sitios FRT/F3, una secuencia de Kozak, un codón de iniciación y un ORF del TCR que codifica la cadena JG9-TCR-beta. El Componente 2E comprende además, entre los sitios F14/F15, una secuencia de Kozak, un codón de iniciación y un ORF del TCR que codifica la cadena JG9-TCR-alfa.

Se creó una eTPC-t mediante RMCE por electroporación de ACL-488 (eTPC). Cuatro a diez días después de la electroporación, las células individuales que mostraban una disminución en la señal de proteína fluorescente, BFP y RFP, codificada por los marcadores de selección, Componentes 2D y 2B , se clasificaron mediante FACS. Los monoclones individuales se cultivaron y a continuación se evaluaron fenotípicamente. El monoclón resultante, ACL-851, fue negativo para BFP y RFP (Figuras 32 a y b). ACL-851 también mostró expresión superficial de TCR y CD3 mientras que la línea celular parental no lo hizo (Figuras 32 c y e). Además, el JG9-TCR introducido mostró tinción específica con el tetrámero HLA-A*02:01-NLVP, lo que indica que es una TCRsp funcional en la superficie de la eTPC-t (Figura 32 d a f). Se confirmó mediante PCR que ACL-851 contenía la TCRsp codificada por el Componente 2B ' y el Componente 2D ' integrados en el genoma (Figura 32 g y h).

En resumen, una eTPC se convirtió en una eTPC-t utilizando un método de integración basado en RMCE para integrar el ORF de TCR proporcionado en los COMPONENTES 2C y 2E, generados en el TORES, de modo que los Componentes 2B y 2D se convirtieron en los Componentes 2B ' y 2D ', y por lo que esta eTPC-t expresó una TCRsp funcional en la superficie de la célula. Además, este ejemplo demuestra el funcionamiento de un sistema eTPC:A simple, en donde se combinaron una composición binaria de una eTPC-t y antígeno analito, y la eTPC-t se seleccionó según la formación de un complejo entre el antígeno analito soluble (multímero HLA: HLA-A*02:01-NLVPMVATV).

Ejemplo 4: Demostración de la reversión de eTPC-x a partir de eTPC-t

El presente ejemplo describe la conversión de una eTPC-t a una eTPC-x, en donde la eTPC-x tiene el componente 2B' que codifica un ORF de la cadena del TCR y el Componente 2D está disponible para la integración del ORF complementario de la cadena del TCR. La conversión de Componente 2D' de la eTPC-t al Componente D de la eTPC-x se consigue utilizando un vector donante genético (Componente 2Z) que coincide con el Componente 2D.

En este ejemplo, se utilizó la línea de células eTPC-t parental ACL-851 generada en el Ejemplo 3. El componente 2Z es un vector plasmídico que comprende dos sitios de recombinasa heteroespecíficos, F14/F15, coincidentes con el componente 2D', una secuencia de Kozak, codón de iniciación y un ORF que codifica una proteína fluorescente verde (GFP) como marcador de selección de integración. El eTPC-t se combinó con el Componente 2Z y un vector que codifica la enzima recombinasa RMCE por electroporación, después de lo cual las células se seleccionaron posteriormente por la pérdida de la presentación de CD3 y la ganancia del marcador de selección GFP de integración. El monoclón ACL-987 se caracterizó fenotípicamente mediante FACS, y se observó que la ACL-987 había ganado GFP y perdido CD3 y TCRab (Figura 33 b, d), lo que indica el intercambio correcto de JG9-TCR-alfa por el ORF de GFP y la conversión del Componente D' al Componente D y, por lo tanto, la generación de una eTPC-x. En comparación, la eTPC-t parental ACL-851 carece de expresión de GFP y tiene expresión superficial de CD3 y TCRab (Figuras 33a a c).

En resumen, este ejemplo demuestra la conversión de una eTPC-t a una eTPC-x, con la eliminación del ORF del TCR JG9-TCR-alfa en el Componente 2D' intercambiado por el marcador de selección de integración GFP, creando de este modo el Componente 2D, para eventos de acoplamiento de integración adicionales del ORF alternativo complementario de la cadena del TCR. Esta conversión se realizó utilizando el método RMCE para la integración genómica.

Ejemplo 5: Demostración de la generación de un grupo de variantes del TCR de secuencia diversificada en una etapa mediante TORES, e integración aleatoria en eTPC-x para crear un grupo de eTPC-t

El presente ejemplo describe cómo se generó un grupo de vectores que codificaban 64 variantes únicas de JG9-TCR-alfa (como Componente 2E) y se integraron en una línea de células eTPC-x parental que contiene una sola JG9-TCR-beta (descrita en el Ejemplo 4) para crear una genoteca de eTPC-t agrupada donde cada célula individual integraba una sola cadena del TRA para presentar una genoteca de eTPC-t donde cada célula expresa una sola TCRsp discreta en la superficie. Un método de ese tipo se denomina integración 'aleatoria'. Las 64 variantes de JG9-TCRa se han creado modificando la secuencia CDR3 comprendida en la unión de los fragmentos V y J según un método descrito en la Figura 3. Esta diversificación de reacción única se muestra para producir un conjunto de TCR con una amplia gama de afinidades para un reactivo multímero específico de HLA cuando se presenta en la superficie de células de mamífero con su par de cadena de TRB natural. Este enfoque es idealmente adecuado para un diseño rápido del TCR por ingeniería genética utilizando los ORF del TCR de longitud completa que pueden presentarse y seleccionarse en un contexto funcional de células de mamífero viables.

Diversificación rápida de la cadena del TCR a través de la degeneración del odeCDR3

La diversificación y selección de los ORF del TCR es deseable para diseñar por ingeniería genética pares de cadenas de TCR con especificidades, afinidades y/o capacidad de señalización alteradas. El sistema TORES es adecuado para la generación rápida de colecciones de cadenas TCR que se alteran sistemáticamente a partir de la secuencia diana original. En el presente ejemplo se presenta un enfoque para diversificar un par de cadenas del TCR modelo mediante la inclusión de un odeCDR3 en una reacción de reconstitución con una degeneración de nucleótidos definida y limitada en posiciones seleccionadas del codón. Este enfoque se utilizó para diversificar la cadena JG9-TCR del par JG9-TCR modelo presentado en el Ejemplo 3.

Generación de la diversa colección de cadenas TRA

La Figura 3 presenta la estrategia general para generar una colección diversificada por secuencias de cadenas de TCR en una reacción única utilizando una mezcla de odeCDR3. Un único vector de entrada C-V y vector donante J se seleccionan para representar los segmentos génicos V, J y C diana en el producto final del TCR de longitud completa (Figura 3, cuadro i y cuadro ii). Se genera una combinación de odeCDR3 con diversidad seleccionada, de forma que haya un número de secuencias de CDR3 distintas representadas en la combinación de odeCDR3 (Figura 3, Cuadro iii). Cuando todos los componentes se combinan en un ciclo de reacción con enzima de restricción/ligasa, el producto resultante es una colección de construcciones que contienen cadenas de TCR de longitud completa con uso definido de los segmentos génicos V, J C, y una diversidad definida en la región CDR3 (Figura 3, Cuadro iv). El número de cadenas del TCR de longitud completa diversificada en el producto final es directamente proporcional al número de variantes de odeCDR3 en la combinación inicial de odeCDR3 agregada a la reacción.

En el presente ejemplo, la cadena JG9-TCR fue el objetivo de la diversificación de la secuencia, y esto se logró a través de la síntesis de oligos codificantes y no codificantes de odeCDR3 con degeneración de nucleótidos en 3 posiciones distintas, cada una alterando un codón independiente para dar como resultado la posibilidad de 4 aminoácidos diferentes en cada uno de los tres codones. Los codones seleccionados para degeneración se separaron a través del bucle CDR3. Los oligonucleótidos de odeCDR3 se presentan como SEQ0743 y SEQ0744, en donde los codones degenerados se denotan como N.

Los oligonucleótidos de odeCDR3 se hibridaron por el método descrito en el Ejemplo 2, con la degeneración de aminoácidos 4 veces en 3 posiciones codónicas independientes, dando como resultado un grupo de productos de odeCDR3 con 64 secuencias únicas, que incluyen la secuencia codificante original (es decir, SEQ0701).

odeCDR3 se utilizó para ensamblar los ORF del TRA de longitud completa siguiendo el método descrito en el Ejemplo 3 para crear 64 ORF del TRA únicos con una degeneración de aminoácidos 4 veces en 3 posiciones distintas del codón. En el presente ejemplo, el odeCDR3 se sintetizó utilizando nucleótidos degenerados en las posiciones indicadas y, por lo tanto, la reconstitución se realizó en un solo tubo para generar las 64 variantes de cadena.

En paralelo, cada cadena JG9-TCR-alfa variante y la cadena JG9-TCR-beta también se clonaron en una cadena principal de entrada V-C (SEQ0048) separada, lo que permite la transfección transitoria para caracterización paralela. Todos los clones esperados se prepararon como vectores aislados y secuencia confirmada.

Caracterización de cadenas JG9-TCR-alfa diversificadas con un par de cadenas TRB

En este ejemplo, se usó la línea de células eTPC-x parental ACL-987, que expresa cadenas de JG9-TCR-beta (en el Componente 2B ') y CD3 (la construcción de la línea celular se describe en el ejemplo 4). El Componente 2D codifica el marcador de selección GFP y se describe en el ejemplo 6. En este ejemplo se generaron las 64 variantes de JG9-TCR-alfa, creando un grupo del Componente 2e , flanqueado por sitios F14/F15.

Se creó un grupo de eTPC-t mediante RMCE por electroporación de los 64 Componentes 2E en ACL-987. Los policlones se seleccionaron sobre la base de la expresión de GFP. El policlon resultante, ACL-988, comprendía poblaciones de células positivas para GFP y negativas para GFP, a diferencia de la línea parental que comprendía solamente células positivas para GFP (Figuras 34 a y B). Sin embargo, solo la población negativa para GFP mostró una expresión de CD3 consistentemente intensa, lo que indica la conversión correcta del Componente 2d en el Componente 2D' y, por lo tanto, que la eTPC-x se había convertido en la eTPC-t (Figuras 34 c y d). Además, las poblaciones de ACL-988 negativas para GFP mostraron dos intensidades distintas cuando se tiñeron con el reactivo tetrámero específico de JG9-TCR (HLA-A*02:01 -NLVP), lo que sugiere que esta población comprende células que expresan variantes de TCR con eficiencia de unión variable.

En paralelo, la caracterización de las 64 variantes de JG9-TCR-alfa junto con JG9-TCR-beta WT se expresaron transitoriamente en una eTPC parental (ACL-987). Con este ensayo transitorio se determinaron las unidades de tinción relativa (UTR) contra el reactivo tetrámero NLVP HLA-A*02:01-NLVP frente a una referencia para cada par de TCR presentado en la variante de expresión agrupada de eTPC, JG9-TCR, anteriormente descrita. Las UTR se calcularon como la relación entre la intensidad de fluorescencia media (IFM) de la señal de tetrámero NLVP HLA-A*02:01-NLVP para la población positiva para CD3 y la de la población negativa para CD3, y es indicativa de la fuerza de unión de cada variante de par de cadenas del TCR. Después de la transfección independiente de la línea parental ACL-987 con cada variante JG9-TCR-alfa, las células se tiñeron con anticuerpos contra CD3 y con un reactivo tetrámero HLA-A*02:01-NLVP y se analizaron por citometría de flujo. Cada punto representado en la Figura 34e representa la UTR observada para cada una de las 64 variantes.

Para confirmar que las células ACL-988 que eran positivas para HLA-A*02:01 NLVP codifican variantes de TRA con UTR elevada y las que eran negativas par HLA-A*02:01 NLVP codifican variantes de TRA con UTR baja, se secuenciaron y se representaron gráficamente las células individuales para cada población y TRA en la Figura 34e. De hecho, las células ACL-988 individuales que eran positivas para HLA-A*02:01 NLVP codificaban variantes de TRA que mostraban predominantemente resultados de UTR altos en las variantes ensayadas individualmente (Figura 34e, círculos blancos). Además, las células ACL-988 individuales que eran negativas para HLA-A*02:01 NLVP codificaban variantes de TRA que mostraban predominantemente resultados de UTR bajos (Figura 34e triángulos blancos).

En resumen, el presente ejemplo genera la generación de una genoteca agrupada de vectores que codifican ORF de TCR diversificados por CDR3 en una sola reacción. Esta genoteca agrupada está codificada en un contexto de vector que se hace coincidir con un sitio del receptor genómico de eTPC. Se generó correctamente una genoteca de eTPC-t agrupada que contenía múltiples TCR en una sola etapa utilizando integración aleatoria en una eTPC-x que codificaban ORF de TCR recíproco nativo. La línea celular policlonal modificada genéticamente, ACL-988 generada presentó una genoteca de TCRsp que podría seleccionarse funcionalmente para un intervalo de intensidades de tinción contra un reactivo tetrámero específico de HLA para el par nativo. Esto representa un enfoque potente y rápido para la modificación selectiva de pares de TCR que se seleccionan en el contexto nativo de un complejo CD3 presentado en la superficie de una célula humana.

Ejemplo 6: Demostración funcional del componente 2F

En la presente descripción se describe una línea de células eTPC (ACL-1063, Componente 2A) diseñada con dos sitios del receptor genómico únicos (Componentes 2B y 2D), diseñados para que sea nula para la expresión de HLA utilizando la expresión de CD3 nativa y que contiene un elemento de respuesta sintética de dos componentes (Componente 2F).

Los elementos de respuesta comprenden un componente actuador-activador y un componente amplificador-indicador, en donde ambas unidades utilizaban potenciadores sintéticos. El actuador es un potenciador sintético sensible a las rutas de señalización del TCR nativo, y codifica tres conjuntos de sitios de unión del factor de transcripción en tándem para NFAT-AP1-NFkB (3xNF-AP-NB). Tras la activación transcripcional, el actuador induce la expresión de la proteína activadora, un factor de transcripción sintético diseñado derivado de la fusión del dominio de activación VP16 de1Herpes, el dominio de unión al ADN GAL4 y dos señales de localización nuclear en los extremos N y C (NV16G4N), en los que la secuencia de reconocimiento del ADN afín está presente 6 veces en tándem en la región potenciadora del amplificador. Tanto el actuador como el amplificador utilizaron la secuencia promotora núcleo (elemento de reconocimiento B (BRE), secuencia TATA, cebador (INR) y sitio de inicio de transcripción (TSS) del promotor IE1 de CMV, inmediatamente 3' de los respectivos sitios de unión del factor de transcripción. El amplificador, tras la activación transcripcional, dirige la expresión del indicador, RFP.

En este experimento, la línea de células eTPC se convirtió en una línea de células eTPC-t (ACL-1277) como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 3, en donde las cadenas del TCR del Componente 2B ' y 2D ' codifican un par de TCR que es específico de HLA-A*02:01 -NLVPMVATV del CMVH.

Después, la línea de células eTPC-t se estimuló contra APC que presentan HLA-A*02:01 (ACL-209) o HLA-A*24:02 (ACL-963) o eran nulas para HLA (ACL-128). En donde las APC se pulsaron con el péptido NLVPMVATV o VYALPLKML o sin péptido. Posteriormente, 30.000 eTPC-t se cultivaron simultáneamente con 10.000 APC durante 24 h. Después de 24 h, las células se recogieron, se lavaron, se tiñeron con marcadores específicos de eTPC y APC para distinguir las poblaciones, y se analizaron por citometría de flujo. Únicamente se observó una fuerte activación de las eTPC-t, Componente 2F (RFP+ expresión >80 %) en la eTPC-t estimulada con el antígeno diana afín conocido, es decir, APC con A*02:01-NLVPMATV (Figura 35).

Como conclusión, se diseñó una línea de células eTPC que contiene un componente funcional 2F que posteriormente se utilizó para crear una eTPC-t. Tras la interacción de la eTPC-t con la APC que presentaba su antígeno de linfocitos T diana correspondientes, pudo medirse una respuesta como aumento en la expresión de RFP. Por el contrario, cuando se pone en contacto una APC que presenta un antígeno de linfocitos T no afín y HLA, o ningún alelo HLA, la eTPC-t no mostró un aumento mensurable en la expresión de RFP superior al valor inicial. Por lo tanto, la eTPC-t con un componente funcional 2F puede utilizarse para la identificación y caracterización de la interacción funcional entre receptores de linfocitos T y antígenos de linfocitos T afines presentados por APC.

Secuencias

A continuación se proporciona una tabla que muestra las secuencias mencionadas en la presente descripción.

<210> 745 <223> vector pcDNA3.1_GFP V1.A.4 <210> 746 <223> vector pcDNA3.1_RFP V1.A.6 <210> 747 <223> vector pMA-SV40pA V1.C.2 <210> 748 <223> vector pMA-CS-JG9-TCRbeta V3.C.5

<210> 749 <223> vector pMA-F14-GFP-F15 V4.H9

<210> 750 <223> vector pMA-F14-TCR-JG9-alfa-F15 V7.A.3

<210> 751 <223> vector pMA-FRT-TCR-JG9-beta-F3 V7.A.4

<210> 752 <223> vector F14-TCRaF15 CDR3degen.64mix V8.F.8

<210> 753 <223> vector CMVpro-Flp-sv40pA-V2 V4.I.8

<210> 754 <223> vectores cadena principal de CDR3 de JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1-A1 a H8 <210> 755 Secuencia de CDR3 de unJG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1_ A1

<210> 756 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._A2

<210> 757 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._A3

<210> 758 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._A4

<210> 759 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._A5

<210> 760 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._A6

<210> 761 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._A7

<210> 762 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._A8

<210> 763 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._B1

<210> 764 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._B2

<210> 765 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._B3

<210> 766 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._B4

<210> 767 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._B5

<210> 768 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._B6

<210> 769 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._B7

<210> 770 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._B8

<210> 771 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._C1

<210> 772 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._C2

<210> 773 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._C3

<210> 774 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._C4

<210> 775 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._C5

<210> 776 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._C6

<210> 777 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._C7

<210> 778 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._D1

<210> 779 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._D2

<210> 780 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1 _D3

<210> 781 Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._D4 <210> 782 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._D5 <210> 783 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._D6 <210> 784 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._D7 <210> 785 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._D8 <210> 786 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._E1 <210> 787 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._E2 <210> 788 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._E3 <210> 789 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._E4 <210> 790 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._E5 <210> 791 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._E6 <210> 792 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._E7 <210> 793 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._E8 <210> 794 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._F1 <210> 795 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._F2 <210> 796 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._F3 <210> 797 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._F4 <210> 798 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._F5 <210> 799 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._F6 <210> 800 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._F7 <210> 801 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._F8 <210> 802 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._G1 <210> 803 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._G2 <210> 804 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._G3 <210> 805 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._G4 <210> 806 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._G5 <210> 807 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._G6 <210> 808 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._G7 <210> 809 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._G8 <210> 810 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._H1 <210> 811 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._H2 <210> 812 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1._H3 <210> 813 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1 H4 <210> 814 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1_H5

<210> 815 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1_H6

<210> 816 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1_H7

<210> 817 <223> Secuencia de CDR3 de un JG9-TRA de 64 variantes VP.7751.RC1 H8

Abreviaturas

aAM Molécula antigénica analito

aAPX Complejo presentador de antígeno analito

a-GalCer Alfa-galactosilceramida

aT TCR analito

APC Célula presentadora de antígeno diseñada por ingeniería genética

APX Complejo presentador de antígeno

Célula B Linfocito B

P2M Beta 2 microglobulina

BFP Proteína fluorescente azul

C (región) Región constante

CAR Receptor de antígeno quimérico

CAR-T Linfocito T CAR

CD1b Cluster de diferenciación 1b

CD1d Cluster de diferenciación 1d

CD3 Cluster de diferenciación 3

CDR regiones determinantes de la complementariedad

CM Moléculas de carga

CMV Citomegalovirus

Región C Región constante

CRISPR Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente intercaladas

D (región) Región de diversidad

DAMPS Patrones moleculares asociados con peligros

DC Células dendríticas

ADN Ácido desoxirribonucleico

ADNbc ADN bicatenario

eAPC Célula presentadora de antígeno diseñada por ingeniería genética

Célula presentadora de antígeno diseñada por ingeniería genética que expresa una molécula eAPC-a antigénica analito

Célula presentadora de antígeno diseñada por ingeniería genética que presenta un complejo eAPC-p presentador de antígeno analito diseñado por ingeniería genética que presenta una presentación de antígeno analito

eAPC-pa complejo y molécula antigénica analito

eAPCS Sistema de célula presentadora de antígeno diseñada por ingeniería genética

eTPC Célula presentadora de TCR diseñada por ingeniería genética

Célula presentadora de TCR diseñada por ingeniería genética que presenta pares del TCR de eTPC-t longitud completa

eTPCS Sistema de célula presentadora de TCR diseñada por ingeniería genética

FAB Fragmento de anticuerpo de unión al antígeno

FACS Clasificación de células activadas por fluorescencia

FRT Diana de reconocimiento de flipasa

Linfocitos T

GEM Linfocitos T reactivos a micolilo codificados por la línea germinal

GFP Proteína fluorescente verde

ARNg ARN guía de Cas9

CMVH Citomegalovirus humano

HDR Recombinación dirigida por homología

VIH Virus de la inmunodeficiencia humana

HLA Antígeno leucocitario humano

HLAI HLA de clase I

HLAII HLA de clase II

IgSF Superfamilia de las inmunoglobulinas

Linfocitos T iNK Linfocitos T natural killer invariantes

IRES Sitio interno de entrada al ribosoma

ITAM Motivo de activación basado en tirosina del inmunorreceptor

Donante J Donante de unión

Región J Región de unión

MACS Clasificación celular activada magnéticamente

MAGE Antígeno asociado a melanoma

MAIT Linfocitos T invariantes asociados a la mucosa

MHC Complejo de histocompatibilidad mayor

MR1 Proteína génica relacionada con el complejo de histocompatibilidad mayor de clase I ARNm Ácido ribonucleico mensajero

NCBP Partículas no basadas en células

Linfocitos T NK Linfocitos T natural killer

CDR3 Dúplex de oligonucleótidos que codifica CDR3

ORF Marco de lectura abierto

PAMPS Patrones moleculares asociados a patógenos

PCR reacción en cadena de la polimerasa

pHLA Péptido HLA

RFP Proteína fluorescente roja

RMCE Intercambio de casete mediado por recombinasa

ARN Ácido ribonucleico

RT Transcripción inversa

SH2 Homología Src 2

Células T Linfocitos T

TAA Antígenos asociados a tumores

TALEN Nucleasas efectoras análogas a un activador de transcripción

TCR Receptor de linfocitos T

TCRsp Proteína de superficie del TCR en complejo con CD3

TORES Sistema de ingeniería y reconstitución del ORF del TCR bidireccional

TRA TCR alfa

TRB TCR beta

TRD TCR delta

TRG TCR gamma

Vector de

entrada V-C Vector de entrada variable-constante

V (región) Región variable

ZAP-70 Proteína asociada a la cadena Z de 70 kDa

Definiciones

Inmunidad adaptativa: Subsistema del sistema inmunitario global que está compuesto de células sistémicas altamente especializadas y procesos que eliminan patógenos o evitan su crecimiento.

Par de cadenas complementarias del TCR: Dos cadenas del TCR, en donde las proteínas traducidas pueden formar una TCRsp en la superficie de una célula presentadora de TCR

Afinidad: Parámetro cinético o de equilibrio de la interacción entre dos o más moléculas o proteínas

Reactivo de afinidad: Cualquier reactivo que se prepara como analito para sondear la unión a TCRsp y/o estimulación en la superficie celular en un sistema eTPC:A

Alelo: Forma variante de un gen específico

aAM: Molécula antigénica analito. De forma general, una proteína, pero también podría ser un metabolito que expresa una célula a partir de su ADN genómico y/o una secuencia genética introducida específica. La AM se expresa en la célula y a continuación un APX puede presentar un fragmento en la superficie celular como carga o por sí solo. Ya sea como carga o no, la AM puede ser entonces diana de células que llevan el receptor de linfocitos T o reactivos de afinidad relacionados.

Amplicón: una fragmento de ADN o ARN que es el origen y/o un producto de amplificación artificial utilizando diversos métodos, que incluyen PCR.

Analito: entidad cuya identificación/medición y/o investigación es de interés en el sistema combinado

Anticuerpo: Molécula de afinidad expresada por células especializadas del sistema inmunitario denominadas linfocitos B y que contiene dos cadenas.

Antígeno: cualquier molécula que puede unirse a un TCR dando lugar a una señal que se transduce dentro del linfocito T

Antígeno analito: colectivamente el sistema eTPC:antígeno (eTPC:A) que representa cualquier entidad que presenta un antígeno para su determinación analítica

Hendidura de unión al antígeno: surco o hendidura larga que es el sitio en el que los antígenos peptídicos se unen a la molécula MHC-I.

APC: Célula presentadora de antígeno. Una célula que puede presentar un antígeno en su superficie celular, generalmente en el contexto de un HLA.

aAPX: Complejo presentador de antígeno analito. Una proteína que se expresa y presenta en la superficie celular de células nucleadas a partir de genes/ORF que codifican ADN genómico y/o una secuencia genética introducida específica. El APX presenta una carga que puede ser tanto un péptido como otras moléculas de metabolitos.

Autoinmunidad: es el sistema de respuestas inmunitarias de un organismo contra sus propias células y tejidos sanos.

(Región) C: segmento génico constante. Uno de los segmentos génicos que se utiliza para ensamblar el receptor de linfocitos T. La región c es un segmento distinto que en vez de dirigir la diversidad del TCR, define su función general en el sistema inmunitario.

Fragmento de clonación C: Fragmento de clonación constante. También denominado fragmento de clonación de segmento génico C. Construcción que lleva una parte de un segmento génico C utilizado para construir un vector de entrada V-C.

Maquinaria de soporte de carga: Conjunto de proteínas celulares que generan y cargan moléculas de carga en APX procedentes de proteínas u otras moléculas presentadas que se encuentran en la célula.

Elemento cis actuante: regiones de ADN antisentido que regulan la transcripción de ORF cercanos.

Parte C: Parte constante. Una pequeña parte de la secuencia constante del segmento génico llevada por un fragmento del casete de recepción J, el casete de recepción J y el vector donante J para estandarizar las secuencias salientes para la actuación del TORES para reconstituir los ORF del TCR.

CDR: regiones determinantes de la complementariedad. Secuencias cortas en el extremo orientado hacia el antígeno de los TCR y anticuerpos que desempeñan la mayor parte de la función de unión a dianas. Cada anticuerpo y TCR contiene seis CDR y generalmente son la parte más variable de las moléculas, que permiten la detección de un gran número de diversas moléculas diana.

CM: Moléculas de carga. Péptido o metabolito que se presenta mediante un complejo presentador de antígeno, por ejemplo, un HLA I o HLA II. La CM puede ser expresada por la célula intrínsecamente a partir del ADN genómico, introducirse en el medio de cultivo o expresarse a partir de una secuencia genética introducida específicamente.

Antígeno afín: Un antígeno, presentado frecuentemente por un HLA, que reconoce un TCR particular. El TCR y el antígeno son objetos afines.

Número de copia: Número total de apariciones de una secuencia definida codificada dentro del genoma de una célula.

Citogenética: El estudio de herencia en relación con la estructura y función de los cromosomas, es decir, determinar el cariotipo de una célula

Citotóxico/citotoxicidad: Proceso en el cual un linfocito T libera factores que dañan directa y específicamente una célula diana.

D (región): Segmento génico de diversidad. Uno de los segmentos génicos que se utiliza para ensamblar el receptor de linfocitos T. Cada individuo tiene un gran número de variaciones diferentes de estas regiones, lo que permite armar linfocitos T con una variedad muy grande de TCR diferentes.

Dímero: es un oligómero que consiste en dos monómeros estructuralmente similares unidos por enlaces que pueden ser fuertes o débiles, covalentes o intermoleculares.

ADN: Ácido desoxirribonucleico. Nombre químico de la molécula que forma el material genético que codifica genes y proteínas.

Endógeno: Sustancia que se origina dentro de una célula

Sistema eTPC:A: Sistema eTPC:antígeno. El sistema mediante el cual una eTPC-t se pone en contacto con el antígeno analito

Elemento regulador condicional eucariota: Secuencia de ADN que puede alterar la actividad de un promotor, que puede inducirse o reprimirse bajo condiciones definidas.

Promotor eucariótico: Una secuencia de ADN que codifica un sitio de unión a la ARN polimerasa y elementos de respuesta. La secuencia de la región promotora controla la unión de la ARN polimerasa y de los factores de transcripción; por lo tanto, los promotores tienen gran importancia en la determinación del lugar y el momento en que se expresará el gen de interés.

Terminador eucariota/terminador de señal: Secuencia de ADN reconocida por factores proteicos que se asocian con la ARN polimerasa II y que desencadenan el proceso de terminación de la transcripción. También codifica la señal poli-A Célula diseñada: Una célula donde el genoma se ha diseñado mediante modificación genética.

Epítopo: Un epítopo, también conocido como determinante antigénico, es la parte de un antígeno que reconoce el sistema inmunitario, específicamente los anticuerpos, linfocitos B o linfocitos T. Por ejemplo, el epítopo es la pieza específica del antígeno a la que se une un antígeno.

Secuencia del aislante epigenético: Elemento de ADN que interrumpe la comunicación entre una secuencia reguladora, tal como un potenciador o un silenciador, y un promotor.

sistema eTPC: eTPCS, el sistema mediante el cual se preparan células eTPC-t, o genotecas de las mismas, para su combinación en el sistema eAPC:eTPC

FACS/citometría de flujo: Clasificación de células activadas por fluorescencia. La citometría de flujo es una técnica por la cual las células individuales pueden analizarse en masa para determinar la expresión de marcadores intracelulares y de superficie celular específicos. Una variación de esa técnica, la clasificación celular, permite recuperar las células que llevan un conjunto definido de marcadores para un análisis posterior.

Familia de APX: Un conjunto de varios genes similares que codifican proteínas funcionalmente relacionadas que constituyen un complejo de presentación de antígeno

Recombinasa Flp: Una recombinasa (Flipasa, Flp) derivada del plásmido de 2 pm de la levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae.

Marcador fluorescente (proteína): Molécula que tiene características específicas de extinción y emisión y puede detectarse por microscopía, FACS y técnicas relacionadas.

Segmentos génicos de la línea germinal: (TCR) Segmentos génicos de origen natural en seres humanos.

Elementoscis actuantes del gen: están presentes en la propia misma molécula de ADN que el gen que regulan, mientras que los elementos reguladores en trans pueden regular genes distantes del gen a partir del cual se han transcrito. Los elementos reguladores en cis son frecuentemente sitios de unión de uno o más factores trans actuantes.

Código de barras genético: El código de barras genético es un método taxonómico que usa un marcador genético corto en el ADN de un organismo para identificarlo como perteneciente a una especie particular.

Sitio del receptor genómico: Un sitio dentro del genoma para la integración dirigida de material genético donante codificado dentro de un vector donante genético.

Reciclado del sitio del receptor genómico: La reversión de un sitio del receptor genómico ocupado a la conformación en donde puede integrarse un nuevo ORF de analito (TCR)

Haplotipo: un conjunto de determinantes genéticos ubicados en un solo cromosoma.

Haplotipo de HLA: un conjunto de alelos HLAI y HLA II que están presentes en todos los individuos.

Sitios de recombinasa heteroespecíficos: Una secuencia de ADN reconocida por una enzima recombinasa para estimular el entrecruzamiento de dos moléculas de ADN.

HLA I: Antígeno leucocitario humano de clase I. Un gen que se expresa en todas las células nucleadas humanas y se exporta a la superficie celular donde presenta como carga fragmentos cortos, péptidos o proteínas internas a los receptores de linfocitos T. De este modo presenta fragmentos de infecciones potenciales en curso junto con proteínas intrínsecas. El HLA I puede presentarse además en forma de péptidos de carga que se añaden al medio de cultivo, generados a partir de proteínas expresadas a partir de elementos génicos introducidos o generados a partir de proteínas captadas por la célula. Los genes HLA de clase I son polimórficos, lo que significa que es probable que diferentes individuos tengan variaciones en el mismo gen, dando lugar a una variación en la presentación. Relacionado con e1HLA de clase II.

HLA II: Antígeno leucocitario humano de clase II. Gen que se expresa en células específicas humanas que coordinan y ayudan a la respuesta inmune adaptativa, por ejemplo, en células dendríticas. Relacionado con e1HLA de clase I. Las proteínas HLA de clase II se exportan a la superficie celular, donde presenta como carga fragmentos cortos, péptidos, proteínas externas a receptores de linfocitos T. De este modo presenta fragmentos de infecciones potenciales en curso junto con proteínas intrínsecas. El HLA II puede presentarse además en forma de péptidos de carga que se añaden al medio de cultivo, generados a partir de proteínas expresadas a partir de elementos génicos introducidos o generados a partir de proteínas captadas por la célula. Los genes HLA de clase II son polimórficos, lo que significa que es probable que diferentes individuos tengan variaciones en el mismo gen, dando lugar a una variación en la presentación.

Brazos homólogos: Tramo de ADN que tiene una identidad de secuencia casi idéntica a un brazo homólogo del complemento y que, por lo tanto, favorece el intercambio de dos moléculas de ADN por el proceso celular de la reparación dirigida por homología.

Vigilancia inmunitaria: Proceso en el que el sistema inmunitario detecta, y es activado por, infecciones, neoplasias malignas u otras alteraciones potencialmente patógenas.

Inmunoterapia: tipo de tratamiento que potencia las defensas naturales del cuerpo para combatir una enfermedad. Utiliza sustancias elaboradas por el cuerpo o en un laboratorio para mejorar o restaurar la función del sistema inmunitario.

Aislante: Secuencia de ADN que evita que un gen se vea influido por la activación o represión de genes cercanos. Los aislantes también impiden la descondensación de la heterocromatina de un gen silenciado a un gen transcrito activamente.

Integración: Ligación física de una secuencia de ADN en un cromosoma de una célula

Vector de integración: El producto de TORES que contiene los ORF del TCR y que coincide con los sitios del receptor genómico que contienen elementos genéticos en los extremos 5' y 3' para permitir la integración.

Par de integración: vector de integración coincidente y sitio del receptor genómico

Sitio interno de entrada al ribosoma (IRES): Secuencia de ADN que, una vez transcrita, codifica un elemento de ARN que permite el inicio de la traducción de una forma independiente de la protección

Isoforma: cualquiera de dos o más proteínas funcionalmente similares que tienen una secuencia de aminoácidos similar, pero no idéntica, y están codificadas por genes diferentes o por transcritos de ARN del mismo gen del que se han eliminado exones diferentes.

J (región): Segmento de unión. Uno de los segmentos génicos que se utiliza para ensamblar el receptor de linfocitos T. Cada individuo tiene un gran número de variaciones diferentes de estas regiones, lo que permite armar linfocitos T con una variedad muy grande de TCR diferentes.

Cadena principal del donante J: Se une a la cadena principal del donante. La cadena principal del vector en la que se inserta un fragmento del casete de recepción J para crear un vector del casete de recepción J.

Vector donante J: Vector del sistema de vectores bicomponente que lleva el segmento J del TCR, y dona este segmento al vector de entrada V-C durante la reconstitución de un ORF del TCR de longitud completa.

Fragmento del casete de recepción J: Fragmento del casete de recepción de unión. Un fragmento de clonación que lleva una parte C utilizada para construir un vector del casete de recepción J.

Vector del casete de recepción J: Unión al vector del casete de recepción. El vector, que lleva una parte C, en la que se inserta una parte de segmento J para crear un vector donante J.

Parte del segmento J: Parte del segmento de unión. Construcción de ADN que lleva una parte de un segmento génico J que se inserta en un vector del casete de recepción J para generar un vector donante J.

Secuencia de Kozak: Secuencia corta requerida para la iniciación eficiente de la traducción

HLA de clase I principal: una familia de APX que comprende los genes HLA-A, HLA-B y HLA-C Coincidente: Cuando dos componentes codifican elementos genéticos que dirigen y restringen la interacción entre los componentes complementados

Sitio de reconocimiento de meganucleasa: Secuencia de ADN reconocida por una endodesoxirribonucleasa, denominada comúnmente meganucleasa

Metabolito: Una molécula creada o alterada en las rutas metabólicas de la célula

Elemento genético móvil: Una secuencia de ADN que puede permitir la integración de ADN con la actividad de enzimas transposasas

Línea celular monoclón: Grupo definido de células producidas a partir de una sola célula ancestral por replicación celular repetida

Sitio aceptor de corte y empalme de ARNm: En el extremo 5' los nucleótidos de ADN son GT [GU en el ARN premensajero (preARNm)]; en el extremo 3' son AG. Estos nucleótidos forman parte de los sitios de corte y empalme. DONANTE DE CORTE Y EMPALME: sitio de corte y empalme al principio de un intrón, extremo izquierdo 5' del intrón. ACEPTOR DE CORTE Y EMPALME: sitio de corte y empalme al final de un intrón, extremo derecho 3' del intrón.

Multímero: Un complejo proteínico que consiste en múltiples monómeros idénticos. Utilizado frecuentemente en el contexto del reactivo del multímero de HLA.

Nativo: una entidad de aparición natural en la célula

Marcador de selección negativa: Marcador seleccionable que confiere selección negativa a un vector y/u organismo hospedador que tiene dicho vector portador del marcador

Partícula no basada en células: (NCBP) actúa de modo similar a un reactivo de afinidad, en tanto que la partícula presenta un antígeno analito u otra entidad a evaluar para determinar el acoplamiento de la TCRsp a la superficie de una eTPC-t en un sistema eTPC:A. Sin embargo, se considera que una NCBP es una entidad más grande que puede también llevar información genética u otra información que actúe como identificador, bien directamente o mediante un intermediario, del antígeno analito presentado u otra entidad de unión. Un ejemplo típico de una NCBP sería un bacteriófago en un escenario de presentación en fago

Gen no codificante: Una secuencia de ADN que no codifica proteínas que se transcribe a moléculas de ARN funcionales no codificantes

odeCDR3: dúplex de oligonucleótidos que codifica regiones determinantes de la complementariedad. Construcción sintética que tiene la secuencia genética CDR3 con salientes terminales, que se utiliza junto con el sistema de vectores bicomponente para reconstituir un ORF del TCR de longitud completa.

Origen de replicación: una secuencia concreta de un vector, plásmido o genoma en la que se inicia la replicación.

ORF: Marco de lectura abierto. Extensión de material genético que codifica un marco de traducción para la síntesis de una proteína (polipéptido) por el ribosoma

Saliente: Una secuencia monocatenaria en el extremo de una molécula de ácido nucleico bicatenaria. A menudo denominados extremos cohesivos.

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa en la cual una molécula de ADN diana específica se amplifica exponencialmente

Péptido: Cadena corta de aminoácidos de 6-30 aminoácidos de longitud

Análisis fenotípico: Análisis de las características observables de una célula.

Plásmido: Una construcción genética que puede replicarse independientemente de los cromosomas, de forma típica, una pequeña cadena de ADN circular en el citoplasma de una bacteria o protozoo.

Polimórfico: Presente en formas diferentes en individuos de la misma especie por la presencia de alelos diferentes del mismo gen.

Polipéptido: Proteína que consiste en untira de péptidos que forman una estructura tridimensional.

Marcador de selección positiva: Un marcador seleccionable que transmite selección positiva a un vector y/u organismo hospedador que tiene dicho vector portador del marcador

Cebador: Secuencia de ADN corta que permite el reconocimiento específico de una secuencia de ADN diana, por ejemplo, durante una PCR.

APC profesional: cualquier célula nucleada capaz de presentar un antígeno para el muestreo por linfocitos T alfa beta y gamma delta.

Promotor: Elemento regulador de ADN para el inicio controlado de la expresión génica.

Recombinasa: Enzimas que median la recombinación genética.

Elemento indicador: Elemento genético que media una señal de notificación en el organismo o vector que lleva dicho elemento. Puede utilizarse como marcador de selección positiva o negativa.

Secuencia de escisión por enzimas de restricción: La secuencia genética escindida mediante una enzima de restricción, que puede ser extrínseca o intrínseca a la secuencia de reconocimiento de dicha enzima de restricción.

Secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción: La secuencia genética que es reconocida y a la que se une una enzima de restricción.

Marcador seleccionable: Una secuencia de ADN que transmite un rasgo adecuado para métodos de selección artificial Sitio aceptor de corte y empalme: Secuencia de ADN en el extremo 3' del intrón AM, APX CM o reactivo de afinidad para la interacción con células con TCRsp en la superficie o reactivos basados en TCRsp

Sitio donante de corte y empalme: Secuencia de ADN en el extremo 5' del intrón

Recombinación somática V(D)J: proceso después del cual cada linfocito T expresa copias de un único TCR reordenado de modo individual. Se refiere a la recombinación en los loci de TRB y TRD y también incluye un segmento génico de diversidad (D).

Gen suicida: Un gen que mediará la muerte celular dentro del organismo hospedador que lleva ese gen. Puede utilizarse como marcador de selección positiva o negativa.

Sintética: una entidad que se genera artificialmente.

Células T: Linfocito T. Leucocito que expresa un receptor de linfocitos T en su superficie. Seleccionado por el sistema inmunitario para no reaccionar con el propio organismo, pero que tiene el potencial de reconocer infecciones y neoplasias malignas, así como de rechazar injertos procedentes de la mayoría de los miembros de la misma especie.

Maduración de linfocitos T: proceso que permite que los linfocitos T distingan células que pertenecen al cuerpo y están sanas de aquellas que no están sanas o no pertenecen al organismo. Se produce en el timo Repertorio de linfocitos T: conjunto distintivo de receptores de linfocitos T

TCR: Receptor de linfocitos T. Molécula de afinidad expresada por un subgrupo de linfocitos denominados linfocitos T. En seres humanos, el TCR reconoce la carga presentada por APX CM o APX AM, que incluye fragmentos procedentes de infecciones víricas virales o bacterianas o células cancerosas.

Por lo tanto, el reconocimiento del TCR forma parte integrante del sistema de inmunidad adaptativa. El TCR consiste en dos cadenas que están emparejadas en la superficie celular. El TCR expresado en la superficie de cada linfocito se ensambla aleatoriamente a partir de un gran conjunto de genes variados (los segmentos v, d, j y c) y por tanto cada individuo tiene un conjunto de linfocitos T que expresan un repertorio muy grande y diverso de diferentes TCR.

Elemento terminador: es una sección de la secuencia de ácido nucleico que marca el extremo de un gen u operón en el ADN genómico durante la transcripción. Esta secuencia media la terminación transcripcional proporcionando señales en el ARNm recientemente sintetizado que desencadenan procesos que liberan el ARNm del complejo transcripcional. Estos procesos incluyen la interacción directa de la estructura secundaria del ARNm con el complejo y/o las actividades indirectas de factores de terminación reclutados. La liberación del complejo transcripcional libera ARN polimerasa y la maquinaria transcripcional relacionada para comenzar la transcripción de nuevos ARNm. El elemento de terminación está en la cadena molde de ADN y consiste en dos repeticiones invertidas separadas por la mitad de una docena bases y seguidas por un tramo de adeninas (A).

Selección tímica: Los timocitos inmaduros se someten a un proceso de selección basado en la especificidad de sus receptores de linfocitos T. Esto implica la selección de linfocitos T que son funcionales (selección positiva) y la eliminación de linfocitos T que son autorreactivos (selección negativa). La médula del timo es el sitio de maduración de los linfocitos T.

Antígenos asociados a tumores: El antígeno tumoral es una sustancia antigénica producida en células tumorales, es decir, desencadena una respuesta inmunitaria en el hospedador. Los antígenos tumorales son marcadores tumorales útiles para identificar células tumorales con pruebas diagnósticas y son candidatos potenciales para su uso en la terapia contra el cáncer.

TRA: Locus que codifica para TCR alfa. Uno de los cuatro loci distintos que codifican genes que pueden formar una cadena del TCR recombinada VDJ. Las proteínas de la cadena alfa del TCR traducidas se emparejan de forma típica con las proteínas de la cadena beta del TCR traducidas para formar TCRsp alfa/beta.

TRB: Locus que codifica TCR beta. Uno de los cuatro loci distintos que codifican genes que pueden formar una cadena del TCR recombinada VDJ. Las proteínas de la cadena beta del TCR traducidas se emparejan de forma tipica con las proteínas de la cadena alfa del TCR para formar TCRsp alfa/beta.

TRD: Locus que codifica para TCR delta. Uno de los cuatro loci distintos que codifican genes que pueden formar una cadena del TCR recombinada VDJ. Las proteínas de la cadena delta del TCR traducidas típicamente se emparejan con las proteínas de la cadena gamma del TCR traducidas para formar TCRsp gamma/delta.

TRG: Locus que codifica TCR gamma. Uno de los cuatro loci distintos que codifican genes que pueden formar una cadena del TCR recombinada VDJ. Las proteínas de la cadena gamma del TCR traducidas se emparejan de forma típica con las proteínas de la cadena delta del TCR traducidas para formar TCRsp gamma/delta.

Sistema de vectores bicomponente: un único vector de entrada V-C y un único vector donante J con las secuencias deseadas pueden combinarse con un dúplex de oligonucleótidos de ADN corto que codifica una secuencia CDR3 (odeCDR3) para reconstituir un ORF del TCR de longitud completa in vitro, en un solo tubo de ensayo en una reacción dependiente de enzima de restricción y ligasa e independiente de PCR.

Dominio transmembrana tipo I: moléculas de un solo paso ancladas a la membrana lipídica con una secuencia de anclaje de detención de la transferencia y su dominio del extremo N dirigido a la luz del retículo endoplasmático durante la síntesis (y al espacio extracelular, si las formas maduras se localizan en el plasmalema).

Enzima de restricción de Tipo IIS: enzimas de restricción que reconocen secuencias de ADN asimétricas y cortan fuera de su secuencia de reconocimiento.

(Región) V: Región variable. Uno de los segmentos génicos que se utiliza para ensamblar el receptor de linfocitos T. Cada individuo tiene un gran número de variaciones diferentes de estas regiones, lo que permite armar linfocitos T con una variedad muy grande de TCR diferentes.

Vector de entrada V-C: El vector del sistema de vectores bicomponente que lleva los segmentos V y C del TCR y que recibe secuencias de los vectores donantes J y odeCDR3 durante la reconstitución de un ORF del TCR de longitud completa.

Fragmento de clonación V: Fragmento de clonación variable. También denominado fragmento de clonación de segmento de gen V. Construcción que tiene una parte de un segmento génico V para construir un vector de entrada V-C.

Vector: Un vector es una construcción genética que contiene información genética. En el presente contexto, un vector describe habitualmente vectores de ADN plasmídico. Un vector puede representar cualquier construcción de este tipo que pueda propagarse y seleccionarse en un organismo hospedador.

Claims

REIVINDICACIONES

Un dispositivo de dos partes, en donde una primera parte es un sistema de diseño por ingeniería genética y reconstitución del ORF del TCR (TORES) multicomponente, y una segunda parte es un sistema de células presentadoras de TCR diseñado por ingeniería genética (eTPCS) multicomponente, en donde el TORES comprende dos componentes separados, en donde el primer componente 1A es un vector que lleva segmentos génicos variables y constantes (V-C) del receptor de linfocitos T (TCR), y el segundo componente 1B es un vector que lleva segmentos génicos de unión (J) del TCR, y en donde la operación de un TORES proporciona uno o más vectores de integración genética, componentes 2C y/o 2E, codificando cada uno un ORF del TCR analito seleccionado de

a. una cadena del TCR nativo

b. una cadena del TCR diversificada por secuencia

c. una cadena del TCR sintética

y en donde la eTPCS comprende un primer componente eTPC, designado como componente 2A, en donde el componente 2A

a. Carece de expresión endógena de las cadenas alfa, beta, delta y gamma del TCR, y b. Expresa proteínas CD3 que se presentan de forma condicionada en la superficie de la célula solo cuando la célula expresa un par complementario de cadenas del TCR y

c. Contiene componentes adicionales designados como 2B y 2D , sitios del receptor genómico, cada uno para la integración de un único ORF que codifica una cadena de TCR analito de alfa, beta, delta o gamma,

y en donde cada uno de los sitios del receptor genómico 2B y 2D se selecciona de

a. Una construcción sintética diseñada para el intercambio de casete mediado por recombinasa (RMCE)

b. Una construcción sintética diseñada para recombinación homóloga dirigida;

y en donde los componentes 2C y 2E , se hacen coincidir con los componentes 2B y 2D, respectivamente, y en donde los componentes 2C y 2E están diseñados para suministrar un único ORF que codifica una cadena alfa, beta, delta y/o gamma del TCR analito, y en donde 2C y/o 2E codifican opcionalmente un marcador de selección de integración, de modo que las cadenas del TCR analito pueden expresarse como proteína de superficie del TCR en complejo con el CD3 (TCRsp) en el componente 2A.

Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 1, en donde el uno o más vectores de integración genética, los componentes 2C y/o 2E, se utilizan como entrada en la segunda parte del dispositivo de dos partes.

Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 1, en donde el eTPCS proporciona una o más eTPC analito en la que se presentan una o más cadenas del TCR analito derivadas del TORES, y la una o más eTPC analito se seleccionan de

a. Una eTPC que expresa un par del TCR (eTPC-t) y/o

b. Una eTPC que expresa una cadena del TCR (eTPC-x) y/o

c. una o más genotecas de las mismas.

Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 3, en donde un par de cadenas de TCR analito se expresan como proteínas de superficie del TCR en complejo con CD3 (TCRsp) por una eTPC analito.

Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 1, en donde el componente 1A es un vector de entrada V-C que contiene

a. origen de replicación,

b. un primer marcador de selección positiva

c. elemento o elementos genéticos 5',

d. secuencia de Kozak,

e. segmento génico variable del TCR,

f. una primera secuencia de Tipo IIS, para el reconocimiento y escisión específicos de sitio mediante una enzima de restricción de Tipo IIS,

g. un marcador de selección negativa,

h. una segunda secuencia de Tipo IIS

i. segmento génico constante del TCR, y

j. elemento o elementos genéticos 3'.

6. Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 1 o 5, en donde el componente 1B es un vector donante J que contiene

a. origen de replicación,

b. un segundo marcador de selección positiva,

c. una segunda secuencia de Tipo IIS,

d. segmento génico de unión al TCR,

e. una parte C, que corresponde a una pequeña parte 5' de un segmento génico constante, y c. una cuarta secuencia de Tipo IIS.

7. Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 5-6, en donde el elemento genético 5' o componente 1A comprende además uno o más elementos seleccionados de

a. elemento génico cis actuante,

b sitio de reconocimiento heteroespecífico para las enzimas recombinasas,

c. un brazo de recombinación homóloga 5' para un sitio genómico de interés

d. un sitio aceptor de corte y empalme de ARNm,

e. un sitio interno de entrada al ribosoma, y

f. secuencia del aislante epigenético

g. en donde el elemento genético 5' debe contener al menos b o c.

8. Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en donde el marcador de selección negativo del componente 1A se selecciona de uno o más de los siguientes

a. un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción no contenido en otro sitio del primer componente o dentro del segmento génico de unión del TCR,

b. un gen que codifica un agente bactericida condicional, y

c. un elemento indicador.

9. Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde el elemento genético 3' del componente 1A comprende además uno o más elementos seleccionados de

a. un elemento terminador,

b. sitio de reconocimiento heteroespecífico para las enzimas recombinasas,

c. un brazo de recombinación homóloga 3' para un sitio genómico de interés,

d. un sitio donador de corte y empalme de ARNm,

e. un sitio interno de entrada al ribosoma, y

f. secuencia del aislante epigenético.

en donde el elemento genético 3' debe contener al menos b o c.

10. Un dispositivo de dos partes según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en donde el primer y segundo marcadores de selección positiva de la primera parte son diferentes y se seleccionan de un gen de resistencia a antibióticos y/o un gen complementario auxótrofo.

11. Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la primera parte además comprende un tercer componente 1C que comprende un dúplex de oligonucleótidos que codifica CDR3 más corto (odeCDR3)

12. Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 11, en donde 1C comprende

a. una primera secuencia de saliente monocatenario complementaria al primer sitio de reconocimiento y escisión con enzimas de restricción de Tipo IIS en 1A,

b. un segmento bicatenario que codifica una región CDR3 del TCR y desprovisto de un elemento de selección negativo en 1A, en donde un elemento de selección negativo está desprovisto de cualquier secuencia de restricción de Tipo IIS del componente 1A o 1B, y

c. una segunda secuencia de saliente monocatenario complementaria al tercer sitio de reconocimiento y escisión con enzimas de restricción de Tipo IIS en 1B;

o 1C comprende

d. una molécula de ADN monocatenario que codifica una CDR3 del TCR flanqueado por sitios de enzimas de restricción de Tipo IIS de modo que cuando se escinde genera la molécula definida en las reivindicaciones 12a hasta c.

13. Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 1, en donde el componente 2A es una célula que carece de expresión de superficie endógena de al menos una familia de complejos presentadores de antígeno analito (aAPX) y/o molécula antigénica analito (aAM).

14. Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 13, en donde la familia de aAPX puede ser cualquiera de los siguientes

a. HLA de clase I

b. HLA de clase II

c. complejo presentador de antígeno no HLA.

15. Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 1, en donde el componente 2A

a. Carece de expresión endógena de las cadenas alfa, beta, delta y gamma del TCR, y b. Expresa proteínas CD3 que se presentan de forma condicionada en la superficie de la célula solo cuando la célula expresa un par complementario de cadenas del TCR y

c. Contiene un componente adicional designado 2B , un sitio del receptor genómico para la integración de un único ORF que codifica al menos una cadena del TCR analito de alfa, beta, delta o gamma, y/o dos ORF que codifican el par de cadenas del TCR analito,

y el componente 2C comprende un vector de integración genética que se hace coincidir con el componente 2B, y en donde el componente 2C está diseñado para proporcionar

a. Un único ORF que codifica al menos una cadena de TCR analito de alfa, beta, delta y/o gamma y/o

b. Dos ORF que codifican un par de cadenas de TCR analito.

y en donde a y/o b codifica opcionalmente un marcador de selección de integración, de modo que las cadenas del TCR analito pueden expresarse como proteína superficial del TCR en complejo con la CD3 (TCRsp) en el componente 2A.

16. Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 15 en donde el componente 2A, contiene además un componente designado 2F, un elemento de respuesta a la estimulación del TCR genómico sintético seleccionado de

a. Una construcción sintética de un solo componente que contiene al menos un promotor nativo y/o al menos un promotor sintético y al menos un indicador

b. Una construcción sintética multicomponente diseñado con al menos un promotor nativo y/o al menos un promotor sintético y al menos un indicador,

y en donde la activación de a y/o b depende de al menos una ruta de transducción de la señal seleccionada de una ruta sintética, una ruta nativa o una combinación de las mismas.

17. Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 1, en donde el sitio del receptor genómico 2By 2D es una construcción sintética diseñada para el intercambio de casete mediado por recombinasa (RMCE).

18. Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 13-14, en donde aAM se selecciona de

a. un polipéptido o complejo de polipéptidos traducidos a partir del uno o más ORF de la molécula antigénica analito

b. un péptido derivado de un polipéptido traducido a partir del uno o más ORF de la molécula antigénica analito

c. un péptido derivado por alteración el proteoma del componente A

d. un péptido derivado por alteración el proteoma del componente A

e. un péptido derivado por alteración del metaboloma del componente A.

19. Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 y 18, en donde el componente 2A expresa CD4 y/o CD8.

20. Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 13-14 y 18-19, en donde el componente 2A expresa correceptores adicionales del TCR.

21. Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 13-14 y 18-20, en donde el componente 2A expresa CD28 y/o CD45.

Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 14-21, en donde se incluye el componente 2B y 2D y comprende al menos uno de los siguientes elementos genéticos

a. Sitios de recombinasa heteroespecíficos

b. Brazos homólogos

c. Promotor eucariótico

d. Elemento regulador condicional eucariota

e. Terminador eucariótico

f. Marcador de selección

g. Sitio aceptor de corte y empalme

h. Sitio donante de corte y empalme

i. Gen no codificante de proteínas

j. Aislante

k. Elemento genético móvil

l. Sitio de reconocimiento de meganucleasa

m. Sitio interno de entrada al ribosoma (IRES)

n. Elemento de péptido vírico autoescindible

o. Una secuencia de consenso de Kozak

Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 13-22, en donde el componente 2C y 2E están incluidos y comprende al menos uno de los siguientes elementos genéticos

a. Sitios de recombinasa heteroespecíficos

b. Brazos homólogos

c. Promotor eucariótico

d. Elemento regulador condicional eucariota

e. Terminador eucariótico

f. Marcador de selección

g. Marcador de selección de integración

h. Sitio aceptor de corte y empalme

I. Sitio donante de corte y empalme

j. Gen no codificante de proteínas

k. Aislante

l. Elemento genético móvil

m. Sitio de reconocimiento de meganucleasa

n. Sitio interno de entrada al ribosoma (IRES)

o. Elemento de péptido vírico autoescindible

p. Un casete de resistencia a antibióticos

q. Origen de replicación bacteriano

r. Origen de replicación de levadura

s. Un sitio de clonación

t. Una secuencia de consenso de Kozak

Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 14-23, en donde los componentes 2B y 2D están incluidos y son para la integración del RMCE de un solo ORF y comprenden:

a. Un promotor eucariótico

b. Un par de sitios de recombinasa heteroespecíficos coincidentes con los de 2C y 2E

c. Una secuencia de consenso de Kozak

d. Un marcador de selección

d. Un terminador eucariótico.

Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 14-24, en donde los componentes 2C y 2E están presentes y son cada uno para la integración de RMCE de un solo ORF y comprenden los siguientes elementos genéticos contribuidos por el componente 1A:

a. Un par de sitios de recombinasa heteroespecíficos coincidentes con los de 2B y 2D

b. Una secuencia de consenso de Kozak

c. Un ORF del TCR reconstituido por la operación de la Parte 1 TORES.

Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 14-25, en donde los componentes 2C y 2E están incluidos y son contribución del funcionamiento del TORES para proporcionar un único par de cadenas de TCR analito.

27. Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 14-26, en donde los componentes 2C y/o 2E están incluidos y son contribución del funcionamiento del TORES para proporcionar una genoteca de pares de cadenas de TCR analito codificados por 2C y/o 2E.

28. Un dispositivo de dos partes según la reivindicación 26 o 27 en donde las secuencias que codifican la cadena del TCR analito se derivan de

a. Secuenciación emparejada de secuencia(s) de ORF de la cadena del TCR a partir de linfocitos T primarios y reconstitución en la parte 1 TORES

b. Secuenciación no emparejada de secuencia(s) de ORF de la cadena del TCR a partir de linfocitos T primarios y reconstitución en la parte 1 TORES

c. Secuencia(s) de ORF de la cadena del TCR sintético generada(s) por el funcionamiento del TORES.

29. Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 26-28 en donde uno o más componentes 2C y/o 2E combinados con el componente 2A, para integrar dos cadenas del TCR analito complementarias codificadas en los componentes 2C y/o 2E, en los componentes 2B y/o 2D para obtener una célula, designada eTPC-t, en donde los componentes 2B y/o 2D se convierten en los componentes 2B' y/o 2D' de tal modo que expresa una TCRsp analito en la superficie del componente 2A .

30. Un cispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 26-28 , en donde uno del componente 2C o 2E combinado con el componente A, para integrar una cadena del TCR analito codificada en el componente 2C o 2E, en los componentes 2B o 2D, para obtener una célula, designada eTPC-x, en donde los componentes B o D se convierten en los componentes 2B' o 2D' de modo que la eTPC-x expresa una única cadena del TCR.

31. Un dispositivo de dos partes según cualquiera de la reivindicación 30, en donde uno del componente 2C o 2E combinado con una eTPC-x, para integrar una cadena del TCR analito codificada en el componente 2C o 2E que es complementaria de la cadena del TCR expresada en la eTPC-x, en los componentes 2B o 2D, de la eTPC-x, para obtener una eTPC-t, en donde los componentes 2B o 2D se convierten en los componentes 2B' o 2D' de tal modo que expresa una TCRsp en la superficie de la eTPC-t.

32. Un dispositivo de dos partes según cualquiera de las reivindicaciones 1-31 para su uso en la generación de al menos una eTPC-t analito.