JP6803480B2 - Ｔ細胞受容体の合成及びｔｃｒ提示細胞への安定なゲノム組込みのための二部分装置 - Google Patents

Ｔ細胞受容体の合成及びｔｃｒ提示細胞への安定なゲノム組込みのための二部分装置 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、天然型の及び配列を多様化したＴ細胞受容体(TCR)オープンリーディングフレーム(ORF)の迅速な合成と、TCR提示細胞のゲノムへのこれらのTCR ORFの組込みとのための二部分装置(two-part device)の構築、組立て並びに使用に関する。体細胞組換えによる天然型TCR発生プロセスにおいて生じる多様性の程度が大きいので、TCR機能の試験及び操作のためにハイスループットでかつ費用効果が大きい遺伝子構築物内でTCRオープンリーディングフレーム(ORF)を提供することは難しい。本発明の第１の部分は、TCR遺伝子セグメントの部分を含む可変-定常エントリーベクター(Ｖ-Ｃエントリー)と連結ドナー(Ｊドナー)ベクターとからなる組立て済み二成分ベクターライブラリシステムを提供する。この二成分システムは、Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリから選択される或るＶ-Ｃエントリーベクターが、制限酵素消化/リガーゼサイクル反応においてTCR相補性決定領域３をコードする合成DNAオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)と共に、Ｊドナーベクターライブラリから選択される或るＪドナーベクターと組み合わされる場合に、全長TCR ORFを再構成する単一のベクターが創出されるように設計されている。このようなベクターライブラリシステムによると、選択されたベクターに関連付けられたTCR ORFの迅速で費用効果の大きい作製のためのPCRに依存しない方法が可能になる。更に、このシステムによると、親和性及び/又は機能成熟ワークフローのための合成TCR配列を作製するための新規なワークフローが可能になる。このTCR ORF再構成及び操作システム(TCR ORFを再構成し操作するシステム；TORES)は、よって、操作TCR提示細胞(eTPC)である本発明の第２の部分と組み合わせた場合に、TCR機能解析及び操作のための強力なツールである。これらのeTPC細胞は、TORESからのTCRをコードするベクターアウトプットと対をなす一対の合成ゲノム受容部位を含む。よって、TORES内で作製されるTCR ORFは、eTPCのゲノムへの組込みにそのまま供され、該eTPCは、様々な解析目的のためにTCR対を提示する安定な派生細胞(eTPC-t)の迅速でハイスループットな作製のために用いることができる。重要なことは、eTPCが、CD3複合体の全ての成分を構成的に発現するが、TCRアルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ鎖の内因性発現を欠くことである。まとめると、この二部分装置は、分析及び臨床用免疫診断システムのための中心的成分としてのeTPC-tを迅速に作製するために用いることができる。更に、本発明は、診断、医薬、研究及び開発のためにTCRを同定し、特徴決定しかつ操作するための二部分装置の使用に関する。
発明の序論
Ｔリンパ球(Ｔ細胞)による免疫監視機構は、全ての有顎脊椎動物の適応免疫における中心的な機能である。Ｔ細胞による免疫監視機構は、Ｔ細胞サブタイプにわたる豊富な機能的多様性を介して達成され、該Ｔ細胞サブタイプは、病原体感染及び腫瘍性細胞の排除に貢献し、侵入病原体、共生微生物、食物の分子成分のような共生非自己因子に対する適応免疫応答を組織化し、更には自己の免疫寛容を維持する。様々な外来及び自己因子に応答するために、Ｔ細胞は、これらの外来及び自己因子の分子構成成分を特異的に検出できなければならない。よって、Ｔ細胞は、個体が遭遇する自己及び非自己分子の大多数を、病原性生物及び病的な自己に対する有効な応答を開始するために十分な特異性を持って、健常な自己に対するそのような応答の開始を回避しながら検出できなければならない。この任務の非常に複雑な性質は、外来及び自己の分子の両方の実際的に無限の多様性を考慮した場合に明らかになり、病原性生物は、Ｔ細胞による検出を逃れるための進化圧力の下にある。
Ｔ細胞受容体(TCR)
Ｔ細胞は、主として、Ｔ細胞受容体(TCR)の発現により規定される。TCRは、Ｔ細胞適応免疫の標的と相互作用しそれを感知する役割を担うＴ細胞の成分である。一般的に言えば、TCRは、細胞表面で提示されるヘテロ二量体タンパク質複合体で構成される。２つのTCR鎖の各々は、共に免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインに属し、逆並行βシートを形成する可変(Ｖ)領域及び定常(Ｃ)領域である２つの細胞外ドメインで構成される。これらは、短い細胞質尾部に隣接するＩ型膜貫通ドメインにより細胞膜に係留されている。多様な分子構成成分に適応してそれを検出するＴ細胞の素質は、Ｔ細胞発生中に生じるTCR鎖におけるバリエーションから生じる。このバリエーションは、Ｂ細胞における抗体発生に類似の様式で体細胞組換えにより生じる。
TCR鎖多様性
Ｔ細胞プールは、幾つかの機能及び表現型が不均質な下位集団からなる。しかし、Ｔ細胞は、その表面で発現される体性再編成TCRアイソフォームに従ってαβ又はγδに大きく分類できる。２つのTCR鎖対アイソフォーム、すなわちTCRアルファ(TRA)とTCRベータ(TRB)との対、及びTCRガンマ(TRG)とTCRデルタ(TRD)との対が存在する。TRA:TRB対を発現するＴ細胞はαβＴ細胞と呼ばれ、TRG:TRD対を発現するＴ細胞は、しばしばγδＴ細胞と呼ばれる。
αβ及びγδ形のTCRは、共に多様なリガンド、すなわち「抗原」の認識を担い、各Ｔ細胞は、Ｔ細胞成熟中にαβ又はγδ受容体鎖を新たに生じる。これらの新たなTCR鎖対は、体細胞V(D)J組換えと呼ばれるプロセスにおいて受容体配列多様性を生じることにより認識の多様性を達成し、体細胞V(D)J組換えの後に各Ｔ細胞は、別個に再編成された単一TCRのコピーを発現する。TRA及びTRG遺伝子座では、幾つかの分離した可変(Ｖ)及び機能的(Ｊ)遺伝子セグメントが組換えのために利用可能であり、定常(Ｃ)遺伝子セグメントに並置されるので、VJ組換えと呼ばれる。TRB及びTRD遺伝子座での組換えは、更に、多様性(Ｄ)遺伝子セグメントを含むので、VDJ組換えと呼ばれる。
組換えられた各TCRは、αβＴ細胞の場合にα及びβ鎖、又はγδＴ細胞の場合にγ及びδ鎖により形成されるリガンド結合部位の構造により決定される、ユニークなリガンド特異性の能力を有する。TCRの構造多様性は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる、各鎖の３つの短いヘアピンループに主に限定される。３つのCDRは、受容体鎖対の各鎖からもたらされ、これらの６つのCDRループはまとめて、TCR細胞外ドメインの膜から遠い末端に存在して、抗原結合部位を形成する。
各TCR鎖における配列多様性は、２つの形態で達成される。第一に、組換えのための遺伝子セグメントの無作為選択は、基本的な配列多様性をもたらす。例えば、TRB組換えは、47のユニークＶ、２のユニークＤ及び13のユニークＪ生殖系列遺伝子セグメントの間で起こる。一般的に、Ｖ遺伝子セグメントは、CDR1及びCDR2ループの両方に貢献し、よって生殖系列にコードされている。配列多様性を生じるための第二の形態は、組み換えられるＶ、(Ｄ)及びＪ遺伝子セグメントの間の接合部にて鋳型ヌクレオチドの無作為欠失及び非鋳型ヌクレオチドの付加により生じる超可変CDR3ループ内で起こる。
TCR:CD3複合体
成熟αβ及びγδTCR鎖対は、ε、γ、δ及びζと呼ばれる幾つかのアクセサリーCD3サブユニットと一緒に複合体として細胞表面にて提示される。これらのサブユニットは、αβ又はγδTCRと一緒に３つの二量体(εγ、εδ、ζζ)として会合する。このTCR:CD3複合体は、αβ又はγδTCRと同族抗原との結合の際に細胞シグナル伝達応答を開始するためのユニットを形成する。TCR:CD3複合体として結合したCD3アクセサリーは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ(ITAM)と呼ばれるシグナル伝達モチーフに貢献する。
CD3ε、CD3γ及びCD3δは各々、単一のITAMに貢献するが、CD3ζホモ二量体は３つのITAMを含む。TCRと共に組み立てられる３つのCD3二量体(εγ、εδ、ζζ)は、よって、10のITAMに貢献する。同族抗原とのTCRライゲーションの際に、直列型チロシン残基のリン酸化は、重要な70kDaのζ鎖関連タンパク質(ζ-chain-associated protein of 70 kDa；ZAP-70)のようなSrcホモロジー２(Scr homology 2；SH2)ドメインを含むタンパク質のための対をなすドッキング部位を創出する。このようなタンパク質の動員は、Ｔ細胞活性化及び分化を最終的に担うTCR:CD3シグナル伝達複合体の形成を開始する。
αβＴ細胞
αβＴ細胞は、一般的に、ヒトにおいて、対応するγδＴ細胞よりも豊富に存在する。αβＴ細胞のほとんどは、細胞表面で複合体により提示されるペプチド抗原と相互作用する。これらの複合体は、ヒト白血球抗原(HLA)ファミリーの遺伝子によりコードされる主要組織適合複合体(MHC)と呼ばれるが、単純化のために、遺伝子及びMHCをともにまとめて本明細書においてHLAと称する。ペプチド-HLA(pHLA)認識Ｔ細胞は、最初に記述され、最もよく特徴決定されている。αβＴ細胞のより稀な形も記述されている。粘膜関連インバリアントＴ(MAIT)細胞は、比較的限定されたα及びβ鎖多様性を有するとみられ、タンパク質断片よりもむしろ細菌代謝産物を認識する。インバリアントナチュラルキラーＴ細胞(invariant natural killer T-cell；iNK Ｔ細胞)及び生殖系列によりコードされるミコリル反応性Ｔ細胞(germline-encoded mycolyl-reactive T-cell；GEM Ｔ細胞)は、非HLA分子により交差提示される糖脂質の認識に限定される。iNK Ｔ細胞は、大部分が、CD1dにより提示される糖脂質と相互作用すると考えられるが、GEM Ｔ細胞細胞は、CD1bにより提示される糖脂質と相互作用する。更に別の形のＴ細胞は、CD1a及びCD1cに関連付けられた糖脂質と相互作用すると考えられるが、このような細胞は、まだ詳細に特徴決定されていない。
通常型αβＴ細胞
ほとんどのαβＴ細胞の重要な特徴は、HLA分子に関連したペプチド抗原の認識である。これらは、しばしば、「通常型」αβＴ細胞と呼ばれる。個体内で自己HLA分子は、自己及び外来タンパク質からのペプチドをＴ細胞に提示し、悪性病変及び外来病原体に対する適応免疫、共生生物、食物及び自己に向けての適応寛容のための必須の基礎を提供する。HLAタンパク質をコードするHLA遺伝子座は、ヒトゲノムのうちで最も遺伝子密度が高く、多型性の領域であり、ヒトにおいて12,000を超えるアレルが記載されている。HLA遺伝子座における多型の程度が高いことにより、個体間のペプチド抗原提示の多様性が確実になり、このことは、集団レベルでの免疫のために重要である。
HLAクラスＩ及びII
２つの形の古典的HLA複合体、すなわちHLAクラスＩ(HLAI)及びHLAクラスII(HLAII)が存在する。３つの古典的HLAI遺伝子、すなわちHLA-A、HLA-B及びHLA-Cが存在する。これらの遺伝子は、インバリアントβ2ミクログロブリン(β2Ｍ)鎖と会合する膜貫通型α鎖をコードする。HLAIα鎖は、免疫グロブリンフォールド型の３つのドメイン、すなわちα1、α2及びα3で構成される。α3ドメインは、膜の近くにあり、大部分がインバリアントであるが、α1及びα2ドメインは一緒になって、多型の膜から遠くにある抗原結合窩を形成する。６つの古典的HLAII遺伝子、すなわちHLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA及びHLA-DRB1が存在する。これらの遺伝子は、α鎖及びβ鎖を含む、対をなすDP、DQ及びDRヘテロ二量体HLA複合体をコードする。各鎖は、免疫グロブリンフォールド型の２つの主要な構造ドメインを有し、ここで、α2及びβ2ドメインは、HLAIα3ドメインのものに類似の、膜に近い大部分がインバリアントのモジュールを含む。HLAIIα2及びβ2ドメインは一緒になって、膜から遠くにある抗原結合窩を形成し、多型性が高い領域である。
HLAI及びHLAIIの抗原結合窩は、８つの逆平行βシートのプラットフォーム上に２つの逆平行αヘリックスを含む。この窩において、ペプチド抗原が結合し、伸ばされた立体構造で提示される。HLAI及びHLAIIにおけるペプチド接触残基は、ほとんどの配列多型の場所であり、これは、異なるHLAアレルにより提示される多様なペプチドレパートリーの分子的基礎を構成する。ペプチドは、抗原結合窩と広範囲で接触し、その結果、各HLAアレルは、提示されたペプチドに対する別個の配列制約及び優先性を課す。所定のペプチドは、よって、限定された数のHLAとだけ結合し、相互的に、各アレルは、所定のタンパク質からのペプチドコレクションの特定の画分だけを受け入れる。各個体に存在するHLAI及びHLAIIアレルのセットは、HLAハプロタイプと呼ばれる。HLAI及びHLAII遺伝子の多型並びに遺伝性のアレルの相互優性発現は、ヒト集団全体にわたるHLAハプロタイプの非常に大きい多様性を駆動し、これは、αβTCRの莫大な配列多様性と組み合わせた場合に、これらのHLA-抗原-TCR相互作用の分析の標準化のために大きな障害となる。
HLAI及びHLAIIのαβTCR結合
αβTCRは、HLA及びペプチド抗原(変化した自己)の両方の残基により形成される混合pHLA結合界面の一部としてペプチドを認識する。HLAI複合体は、ほぼ全ての有核細胞の表面に提示され、内因性タンパク質に由来するペプチドを提示すると一般的に考えられている。Ｔ細胞は、よって、相互作用細胞のpHLAI複合体をサンプリングすることにより、HLAI提示細胞の内因性細胞性プロテオームを調べることができる。HLAIの結合は、相互作用Ｔ細胞によるTCR共受容体CD8の発現を必要とするので、HLAIサンプリングは、CD8+αβＴ細胞に制限される。これとは対照的に、HLAII複合体の表面発現は、プロフェッショナルAPCに主に制限され、提示細胞にとって外因性のタンパク質に由来するペプチドを提示すると一般的に考えられている。相互作用Ｔ細胞は、よって、提示細胞が存在する細胞外微小環境のプロテオームを調べることができる。HLAIIの結合は、相互作用Ｔ細胞によるTCR共受容体CD4の発現を必要とするので、HLAIIサンプリングは、CD4+αβＴ細胞に制限される。
αβTCRの胸腺選択
上記のαβTCRの役割は、pHLA複合体の検出であり、TCR提示Ｔ細胞は、確立された免疫におけるそのＴ細胞の役割と密接な関係がある応答を高めることができる。個体において生じたαβTCRレパートリーは、特定のハプロタイプと関連して、多様性が実際に起こる前に遭遇する可能性が高い全ての外来抗原の巨大で予測できない多様性の理由であるはずである。この結果は、自己pHLAとの強い相互作用を回避するように特異的に教授されただけで特定されていないpHLA複合体を認識する能力を有して非常に多様で多数のαβTCRがある程度無作為化された様式で生じる背景に対して達成される。これは、胸腺選択と呼ばれるプロセスにおいてＴ細胞成熟中に注意深く調整される。
胸腺におけるＴ細胞成熟の第１の工程中に、十分な親和性をもって自己pHLA複合体と相互作用できないαβTCRを有するＴ細胞は、生存シグナルを奪われ、排除される。ポジティブ選択と呼ばれるこの工程により、正しいHLAに関連付けられて提示される外来又は変化したペプチドを少なくとも認識できる可能性があるTCRレパートリーを生存Ｔ細胞が確実に有することになる。その後、自己pHLAと強く相互作用し、よって自己免疫を駆動する能力を有するαβTCRは、ネガティブ選択のプロセスにより能動的に除去される。ポジティブ及びネガティブ選択のこの組合せは、末梢にある自己pHLAに対する低い親和性を有するαβTCRを有するＴ細胞だけをもたらす。これは、自己に制限されるが自己反応性ではないαβＴ細胞レパートリーを確立する。HLAハプロタイプに対するＴ細胞発生のこの高度に個別化された性質は、αβTCR-抗原-HLA相互作用の標準化された分析における困難を強調する。更に、これは、移植片拒絶及び移植片対宿主病の両方の基礎、並びに一個体において同定されるαβTCRが第二の個体において完全に異なる影響を有し得るという一般的な原理の基礎を形成し、このことは、実際の臨床において現れるTCRベース及びＴ細胞ベースの治療及び診断方策について明確な意味を有する。
非通常型αβＴ細胞
αβＴ細胞の非HLA拘束又は「非通常型」の形は、非常に異なる分子抗原標的を有する。これらの非通常型αβＴ細胞は、古典的HLA複合体を結合させないが、CD1ファミリー又はMR1のような保存されたHLA様タンパク質を結合させる。CD1ファミリーは、抗原交差提示に関与する４つの形(CD1a、ｂ、ｃ及びｄ)を含む。これらの細胞表面複合体は、HLAIによく似たα鎖を有し、これがβ2Ｍとヘテロ二量体を形成する。α鎖の膜から遠い表面で提示される小さい疎水性ポケットは、病原体由来の脂質ベースの抗原のための結合部位を形成する。自然様NK Ｔ細胞(innate like NK T-cell；iNK Ｔ細胞)は、脂質/CD1ファミリー認識の最もよく理解された例であり、GEM Ｔ細胞は、別の顕著な例を表す。「Ｉ型」iNK Ｔ細胞は、CD1dに関連付けられた脂質α-GalCerと強く相互作用することが知られている。これらのiNK Ｔ細胞は、固定されたTCRα鎖(Vα10/Jα18)及び限定された数のβ鎖(制限されたvβ使用を有する)を有する非常に限定されたTCR多様性を示し、これらは、Toll様及びNod様受容体のような自然の病原体関連分子パターン(PAMPS)認識受容体になぞらえられている。これとは対照的に、「II型」NK Ｔ細胞は、より多様なTCRレパートリーを示し、より多様な形態のCD1d-脂質複合体結合を有するとみられる。GEM Ｔ細胞は、CD1bにより提示されるマイコバクテリア由来糖脂質を認識するが、CD1a、ｂ及びｃによる抗原提示並びにそれらのＴ細胞認識の分子的な詳細は、理解され始めたばかりである。
MAIT細胞は、インバリアントTCRα鎖(TRAJ33、TRAJ20又はTRAJ12とライゲーションされたTRAV1-2)を主に発現し、該鎖は、一連のTCRβ鎖と対形成できる。ペプチド又は脂質の代わりに、MAIT TCRは、HLAI様分子であるMR1により提示される病原体由来葉酸及びリボフラビンベースの代謝産物と結合できる。MAIT TCRについて観察されるTCRにおける限定されているが著しい多様性は、保存されたMR1に関連付けられた多様であるが相関する代謝産物の認識を可能にするとみられる。
非古典的HLA拘束αβＴ細胞TCRがどのようにして成熟中に胸腺において選択されるのか、よく理解されていない。しかし、上で概説したネガティブ及びポジティブ選択の基本的なプロセスが当てはまるようであり、胸腺内で特殊化した適所においてこのことが生じることを示唆するいくらかの証拠がある。
γδＴ細胞
αβTCR発生及びpHLA結合の詳細な機械論的理解とは対照的に、抗原標的及びそれらのγδＴ細胞対応物の関係性については比較的ほとんど知られていない。このことは、循環Ｔ細胞区画中のそれらの量が比較的低いことが理由の一つである。しかし、γδＴ細胞は、厳密にHLA拘束されないと広く考えられており、抗体と同様に、より自由に表面抗原を認識するとみられる。より最近では、γδＴ細胞は、外来抗原との免疫系の主な相互作用部位である上皮組織の常在型Ｔ細胞区画を支配できることが認識されるようになってきている。更に、γδＴ細胞腫瘍免疫監視及び調節不全になった自己のその他の形の監視機構についての様々な機序が文献において明らかにされ始めている。自然様及び適応γδＴ細胞の両方の特異的抗原標的は、まだほとんど定義されていないが、PAMPの組織分布及び迅速な認識は、外来抗原に対する応答の初期及び適応免疫系がまだ成熟中の生命の初期の両方におけるγδＴ細胞の基本的な役割を示唆する。
γδＴ細胞の多様な機能は、異なるVγVδ遺伝子セグメント使用に基づくとみられ、γδＴ細胞が主にインバリアントTCRと一緒に、感染中の非常に初期にPAMPの自然様認識を媒介する２つの主なカテゴリーにおいて広く理解できる。PAMP以外に、これらのタイプのγδＴ細胞は、更に、細胞ストレス、感染及びおそらく腫瘍発生の非常に初期のサインを与え得るリン酸抗原を含む自己分子を認識すると考えられている。PAMP及びこのようないわゆる損傷関連分子パターン(danger associated molecular pattern；DAMPS)並びに多数の組織拘束自然様γδＴ細胞の認識は、これらの細胞が、予め活性化、ホーミング及びクローン増殖を必要とせず抗原負荷に対して迅速に応答するのに適していることを強く示唆する。
γδＴ細胞の第二の形は、実際はより適応性があり、非常に多様性のγδTCRレパートリー及び末梢を循環してリンパ系組織に直接アクセスする能力を有すると考えられている。このような抗原特異的γδＴ細胞は、CMVのような一般的なヒト病原体について記載されており、メモリー応答を形成するとみられる。しかし、γδＴ細胞は、活性化の後に比較的限定されたクローン性増殖のみを示し、末梢循環又は組織におけるTCR多様性及びγδＴ細胞の特異的応答の程度についてはほとんど利用可能なデータはない。更に、γδTCRはpHLA複合体と相互作用せず、よって、この状況においてペプチド抗原と結合しないと一般的に考えらえているが、γδＴ細胞の幾つかの抗原標的だけが特徴決定されており、根底にある分子フレームワークはわずかに理解されているだけである。
末梢γδＴ細胞の頻度が低いこと及びヒトにおける組織常在性Ｔ細胞を研究することが困難であることのために、この重要で多様なタイプのＴ細胞がどのようにして適応免疫応答に参加するのかについての我々の知識が制限されてきた。この台頭してきた研究領域は、稀なγδＴ細胞を捕捉して特徴決定し、それらのTCR対を単離し、それらの同族抗原を同定する、より信頼できる技術を必要とする。
抗原及び抗原提示細胞
Ｔ細胞及びTCRとの関係において、抗原は、TCRと結合でき、Ｔ細胞内のシグナル伝達をもたらす任意の分子と定義できる。最もよく特徴決定されているＴ細胞抗原は、HLAI及びHLAII複合体において提示され、通常型αβＴ細胞と結合するペプチドである。しかし、近年、非通常型αβＴ細胞及びγδＴ細胞が抗原として広範囲の生体分子、例えば脂質、リポペプチド、糖ペプチド、糖脂質並びに一連の代謝産物及び異化産物を結合できることが明らかになってきた。更に、γδＴ細胞が、抗体様の様式で完全にフォールドされたタンパク質と直接結合できることが明らかになってきた。よって、Ｔ細胞抗原がHLAにより提示されるペプチドに主に拘束されるという視点は、過去20年間で、ほぼ全ての生体分子を含むように拡大されている。この概念を念頭に置いて、何を抗原提示細胞(APC)と考えることができるかを定義することが適切である。
前出のセクションで定義したように、HLAI及びHLAIIは、細胞型全体にわたって共通点のない発現プロファイルを有する。ほぼ全ての有核細胞が細胞表面でHLAI複合体を提示し、よって、Ｔ細胞サンプリングのためにペプチド抗原を提示する能力があることが広く受け入れられている。これとは対照的に、HLAIIは制限された発現プロファイルを有し、少なくとも定常状態条件において、樹状細胞(DC)、マクロファージ及びＢ細胞を含む抗原提示の専門的な役割を有する細胞の表面でだけ発現される。これらの専門細胞型は、しばしばプロフェッショナルAPCと呼ばれる。この文書の目的のために、用語「APC」は、αβ又はγδＴ細胞によるサンプリングのために抗原を提示できる任意の有核細胞を表すために用いる。このような抗原は、特異的抗原提示複合体、例えばHLA及びHLA様分子において「カーゴ」として提示されるものに限定されないが、αβ又はγδTCR保有細胞と結合できる任意の細胞表面提示部分を含むことができる。
TCRの治療への使用
初代Ｔ細胞の養子移入は、免疫不全患者にウイルス免疫を与えるために、ウイルス抗原に向かう、エクスビボで増殖させたＴ細胞をまず用いて、1990年代初期に臨床背景において初めて試験された。特定のがん抗原に対してエクスビボで増殖させた初代Ｔ細胞を用いる同様のアプローチが、そのすぐ後に悪性腫瘍の処置において試験された。現在でも課題であり続けるこれらの初期のアプローチにおけるある限界は、治療製品において組成を精細に最適化する必要性と対立する、Ｔ細胞の性質及び多様性についての理解の欠如である。現在、エクスビボで増殖させた初代Ｔ細胞の使用は、ウイルス抗原に対する特異性を有する初代Ｔ細胞を用いる一握りのイニシアティブ以外は、製薬業界においてほぼあきらめられている。
近年、遺伝物質を初代ヒト細胞に安定して導入する能力により、実験的遺伝子改変Ｔ細胞治療剤の種類が増えてきている。このような治療用細胞製品は、Ｔ細胞応答の力を利用し、Ｔ細胞特異性を疾患関連抗原標的、例えば悪性細胞によってのみ発現される抗原に向けなおすことを目的とする。これらは、実際のTCR鎖対ではなく、キメラ抗原受容体(CAR)をレシピエントＴ細胞に移入することに主に頼っている。CARは、CD3-TCR機能を模倣する合成キメラ受容体を生成するための、シグナル受容体エレメント、例えばCD3複合体のζ鎖にグラフトされた標的化部分(多くの場合、悪性細胞の表面発現タンパク質を標的にする一本鎖抗体エレメント)である。これらのいわゆるCAR Ｔ細胞(CAR-T)製品は、現在までに臨床試験においてまちまちの成功度を示しており、その可能性にもかかわらず、固有のユニークな分子標的を有する腫瘍、例えばＢ細胞悪性病変を超えて解釈することは容易ではない。代わりに、全長TCR鎖対ORFをＴ細胞に移入することについての興味が増えてきている。このようなTCRが操作されたＴ細胞治療剤は、困難な製造プロセスや、CAR-T製品と同様に、確認された抗原標的及び標的化構築物の欠如により現在制限されている。現在までに、悪性細胞上のHLAIにより提示されるペプチド抗原の認識のためのαβTCRの使用に焦点が当てられており、このアプローチの基本的な困難は、悪性細胞に特異的な抗原が必要であるということである。
TCR-pHLA相互作用が比較的低親和性のものであるので、天然型TCRは、TCRが操作されたＴ細胞療法のために最適ではないようであると考えられている。幾つかのアプローチが、一本鎖抗体親和性成熟と同じ方法で、インビトロで親和性成熟TCRのために考案されている。これらのTCR親和性成熟アプローチも、一般的に、一方の鎖のＶ領域を別の鎖のＶ領域に融合させて単一ポリペプチド構築物を作製する一本鎖フォーマットを用いる。このような単一ポリペプチドを、次いで、抗体操作ワークフローから適応させたファージ又は酵母ディスプレイシステムにおいて用いることができ、標的結合に基づく何回かの選択を経ることができる。このような一本鎖TCRアプローチにおいて、機能的TCR鎖対を得る点において２つの固有の限界が存在する。第一に、選択が標的との結合親和性に基づくことである。しかし、TCR親和性がTCRシグナル伝達アウトプットの強さ又は能力と常に相関するわけではないことが十分に文書化されている。第二に、親和性に基づく一本鎖構築物の選択が、それらが全長受容体として一旦再構成されると、等価な親和性であると常に解釈されない。
治療との関係において、親和性成熟化TCR対において更なる重要な限界が存在する。つまり、それらの配列が変更されたことを考慮すると、定義による得られた構築物はもはや胸腺選択に供されず、ここで、自己抗原と強く反応するTCRは、レパートリーから削除される。よって、これらの改変TCRは、自己反応性である固有の危険性を有し、この危険性を、現在の方法を用いてインビトロで除くことは非常に難しい。同じ理由により、治療用途のための選択されたか又は操作されたTCRはいずれも、個別化される必要がある。もしTCRが人工的に操作されるか又は天然型TCRが個体にわたって用いられるならば、破滅的な可能性がある自己免疫を回避するために、特定の各個体のHLAハプロタイプ及び提示されるペプチドレパートリーに基づいて交差反応性を除かなければならない。このことは、胸腺選択が、その所定の個体にのみ特異的な全ての利用可能なHLA分子の背景において行われるという事実のためである。このような交差反応性の可能性は不明である。しかし、我々のTCRレパートリーが、同じ種の他の個体のpHLA複合体を外来であると認識する能力は、適応免疫の基本的な特性であり、移植片拒絶及び移植片対宿主病を支持する。がん特異的黒色腫関連抗原(MAGE)に対する成熟TCR鎖対を用いる最近の臨床試験は、胸腺選択を迂回することの潜在的な問題に光を当てた。成熟TCRを有する自家Ｔ細胞を２名のがん患者に注入して戻したとき、これらの患者は、致命的な心臓疾患を迅速に発症した。その後の研究により、MAGE特異的成熟化TCRは、心臓タンパク質であるタイチンからのHLAIにより提示されるペプチドと交差反応性であったことがわかった。このことは、交差反応性は、TCRの治療への使用において別個の可能性であることを強く示唆する。
TCRを治療目的のために利用するための別の達成手段は、抗体治療用物質とほぼ同じ方法でそれらを親和性反応剤として用いることにある。一本鎖TCR分子は、コンジュゲート薬物物質を特定のHLA-抗原発現細胞集団に送達するために試験されている。このようなアプローチは、一般的に、CAR-T又はTCRが操作されたＴ細胞療法より安全であると考えられている。なぜなら、薬物物質の投与を単純に撤回することができるからである。しかし、交差反応性の可能性及び予測困難なオフターゲット効果により、この背景における可能性のある限界がまだ存在する。
臨床診断におけるTCRレパートリー検出
関連する観点において、臨床診断目的のために特定のTCR配列の量の検出を用いることに対する興味が増加している。特にディープシーケンシング法の台頭につれて、ある個体内の全体の、そして特定の関係におけるマッチしたαβ対についての完全なTCR多様性を把握することが可能である。このことは、患者における疾患関連抗原に対する免疫応答の確立のための代理の読み出しとして、増殖したＴ細胞クローンの量を単に検出することにより特定の状態及び疾患状態を診断するための手段になる可能性がある。しかし、このような包括的なアプローチは、確立された臨床タイムポイントを有する非常に強い免疫応答に現在のところ限定されており、シーケンシングにより同定された任意の特定のTCRの特異的抗原標的を同定することの根底にある困難に苦しんでいる。
Ｔ細胞抗原の治療及び診断のための使用
適応免疫応答を活用する基本的な強さは、TCR-抗原相互作用の精巧な特異性が、各病原体、がん細胞又は自己免疫疾患に特異的に関連する抗原についての詳細な知識を必要とするという中心的な技術的困難と言い換えられる。更に、各抗原は、特異的抗原提示複合体又はそのアレルにより提示され得るので、抗原の発見は、関連する各HLA遺伝子及びアレルについて行わなければならない。強い適応免疫応答と関連し、保存されたエピトープ応答階層を一般的に示すHIV、インフルエンザ及びCMVのような幾つかの感染性疾患について、最も重要なエピトープが、幾つかの一般的なHLAと関連付けられてマッピングされている。同様に、がん、アレルギー及び自己免疫の分野において、関連Ｔ細胞抗原をマッピングする系統的な試みが増えてきている。しかし、これらは、困難な手順であり、異なる臨床状況と関連するＴ細胞抗原を系統的に表す努力は、効率的で確固とした迅速で適応性のあるプロトコールが存在しないことにより妨げられている。
特に、がん細胞は、困難で重要な態様である。なぜなら、悪性細胞の表面で提示されるペプチドのほとんどは自己抗原であるか又は自己抗原に非常に類似しているからである。よって、胸腺選択は、これらのペプチドを強く認識しうるTCRを削除するであろう。それと同時に、腫瘍は免疫認識を逃れるように発展する。このことは、確立された腫瘍に対する有力な免疫応答が比較的稀であり、標的を予測又は発見することが難しいことを意味する。しかし、これらの応答は存在し、そして重要なことには、通常、よりよい結果と関連している。このような応答の標的、腫瘍関連抗原(TAA)は、ほとんどの場合、自己からの区別可能な特徴を有し、がん発展中に過剰発現されるか、発展のこの段階では細胞型に存在しないか、又は遺伝子変異若しくは翻訳後改変、例えばリン酸化により特異的に変更されたタンパク質に由来する。
利用可能な場合、このようなエピトープの知識により、基礎的な発見、診断目的のため及び例えばワクチン効力の試験として関連するＴ細胞応答を調べることが可能になる。重要なことに、これらは、アレルギー及び自己免疫におけるＴ細胞寛容化のための高度に特異的な標的と、重大なことに、特異的免疫療法のため及び悪性細胞に対抗する価値のある標的に向かう点とを提供する。悪性病変は、細胞免疫療法の有望性として特に価値のある標的であり、Ｔ細胞操作における進展は、がんのタイプについての特異的マーカーがたまたま利用可能である幾つかの場合を超える確認された標的TAAの欠如により遅くなる。細胞療法の可能性及び確認された標的の欠如に鑑みて、見込のあるTCR抗原の同定は、いまだに、特に癌を処置するための努力におけるTCRに基づく免疫療法の最も急を要する障害の一つである。
TCR及びＴ細胞抗原分析の技術的観点
全体として、TCRに基づく療法の発展はまだその初期段階であり、限定された成功しかしていない。とてつもない可能性があるが、診断的アプローチは、患者の疾患状態又は療法に対する応答を評価することを目的とする比較臨床研究においてほとんど実施されていない。天然型TCR鎖対の安定した捕捉と、ハイスループットにて細胞同士のコミュニケーションの機能的関係におけるTCR-抗原相互作用の標準化された系統的な分析とについて十分に発展していない技術は、TCRに基づく療法及び診断の発展のための主な障害である。
ディープシーケンシングアプローチにより、健常及び疾患におけるＴ細胞受容体多様性についての理解が改善されている。しかし、これらのアプローチは、主にTCRβ鎖のCDR3領域にわたる短い区間に一般的に焦点を当てている。ほとんどの研究は、TCRα鎖の寄与を無視しており、対合したαβ鎖及び興味の対象と決定されたTCRの抗原特異性を分析しようとしたものはほとんどない。単一細胞封入及び遺伝子バーコーディングを用いる最近のワークフローにより、天然型TCRαβ又はγδ鎖対の対形成及び全長配列の分析が可能になっているが、このようなワークフローは、まだ実験段階である。
単離TCR鎖対は、生物物理学的又は機能的形態のいずれかで抗原特異性の点で分析できる。生物物理学的分析は、TCR及び被分析物抗原の両方を可溶形で組換え生成することを必要とする。HLA拘束TCRの場合、このことは、よって、全ての個別のTCR及び同族pHLA複合体の生成を必要とするであろう。このことは、技術的に非常に困難であり、遅くてスループットが低い。更に、このような分析は、相互作用親和性のみを与え、これは予測可能な様式での機能的特徴との関連が低い。
最近まで、細胞との関係での単離TCR配列の詳細な機能解析は、初代Ｔ細胞又は不死Ｔ細胞株への被分析物TCR鎖対のトランスフェクションと、細胞活性化の伝統的なフローサイトメトリ分析による細胞応答の検出又は抗原負荷の際のトランスフェクションされた細胞から分泌される因子の検出という面倒なプロトコールにより制限されてきた。Guoらによる最近の発表において、単一細胞からの対をなすTCR鎖の迅速なクローニング、発現及び機能的特徴決定が報告された(Molecular Therapy - Methods and clinical development (2016) 3:15054)。この研究では、被分析物ヒトαβTCR対を、αβTCR発現が欠如したレポーター株化細胞で発現させているが、これは、TCR刺激の際に活性化されるNur77プロモータと連結した緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター系を含んでいた。この系は、レポーター株化細胞ゲノムへの標準化されたTCR組込みの欠如のために、まだ非効率であり、APCエレメントによる細胞に結合した抗原負荷のための系統的な方法を提供しない。
既知のＴ細胞抗原に対するTCRの同定についてのワークフローと同様に、健常及び疾患における新規なＴ細胞抗原のデノボ発見は、まだ非常に困難である。ほとんどのアプローチは、いまだに実際は生物物理学的であり、免疫化プロトコールにおいて試験しようとする候補抗原を、又は上記のように同族TCRの同定により生成することを狙いとする。Ｔ細胞抗原発見の分野における標準化はほとんど又は全く存在せず、この分野は、ほとんど学術研究に限定されている。
治療及び診断のための使用の両方においてTCR及びそれらの同族抗原に対する興味の蓄積、並びに著しい数の天然型TCRαβ及びγδ鎖対を捕捉する手段の出現につれて、TCR-抗原相互作用の系統的解析のための信頼できるハイスループットで標準化された技術がまだ欠如している。重要なことに、TCR及び抗原が共に生細胞により提示される細胞間コミュニケーションの天然の状況におけるTCR鎖対の機能解析のための標準化されたシステムが欠如している。更に、細胞間コミュニケーションの関連する状況におけるTCR候補選択及び/又はTCR鎖対の親和性/機能成熟を達成できるシステムが欠如している。
上記のように、TCR鎖のハイスループット作製及び発現並びに天然型細胞の状況でのそれらの発現のための標準化された技術が現在欠如している。全長TCRを迅速に作製でき、該TCRが分析のために天然型CD3細胞-表面複合体において提示されるようにTCR提示細胞のゲノムに単一コピーとして挿入されることができるシステムを得ることが非常に望ましい。CD3複合体により提示されるTCR対により、親和性解析が実際の天然型TCR組成を確実に反映するが、このことは、一本鎖TCR及びその他の非天然型TCRディスプレイ技術においては当てはまらない。更に、CD3複合体におけるTCR対の提示は、TCR対の機能解析のために絶対的に必要である。TCRシグナル伝達アウトプットの解析を意味する機能解析は、シグナルアウトプットが治療用のために通常最も重要であるパラメータであり、同族抗原/HLAとのTCRの親和性とうまく相関していないTCR操作ワークフローにおいて非常に重要である。
発明の詳細な説明
本発明は、上記の必要性に対処する。本発明は、TCR ORFの遺伝子再構成及び/又は配列多様化、及び、機能解析及び/又は選択のための操作TCR提示細胞(eTPC)へのこれらORFの挿入に適切な二部分装置を提供する。このような装置は、天然型細胞表面においてCD3複合体に関連付けて迅速に分析及び選択できる天然型鎖対及び/又は配列を多様化した鎖対を得るために適切である。
二部分装置の第１の部分は、TCR鎖の可変(Ｖ)、連結(Ｊ)及び定常(Ｃ)配列を有するベクターの予め組立てられたライブラリを含む二成分ベクターシステムを含む。該システムの第１の成分は、Ｖ及びＣ配列を含むＶ-Ｃエントリーベクターを含む(成分1A)。該システムの第２の成分は、Ｊ配列を含むＪドナーベクターを含む(成分1B)。二成分ベクターシステムは、全ての望ましいＶ-Ｃ配列組合せ及びＪ配列をそれぞれ有するＶ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターのライブラリに予め組立てられる。二成分ベクターシステムは、所望の配列を有する単一Ｖ-Ｃエントリーベクター及び単一Ｊドナーベクターが、第３の成分であるCDR3をコードする短いDNAオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)(成分1C)配列と組み合わされて、制限酵素及びリガーゼ依存性かつPCR非依存性の様式で単一試験管反応においてインビトロで全長TCR ORFを再構成できるような様式で設計されている。これらの三成分TCR ORF再構成及び操作システム(TORES)は、親和性又は機能成熟ワークフローのために天然型の、配列が多様化された又は合成のTCR ORFの大きいライブラリを迅速に作成するために理想的に適切である。
TORESと定義する本発明の第１の部分を、図１の「パート１」に要約する。標的全長TCR ORFに必要なＶ及びＣ TCR遺伝子セグメントを含む選択されたＶ-Ｃエントリーベクターを、必要なＪ TCR遺伝子セグメントを含むＪドナーベクターと組み合わせる。全長TCR ORFは、V(D)J組換え中に生じる非生殖系列配列の原因となるodeCDR3の付加により完成し、それぞれＶ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターによりコードされる固定化生殖系列によりコードされるＶ及びＪ配列が間に挿入されている。二成分ベクターシステム及び第３のodeCDR3成分は、制限酵素及びリガーゼ反応において組み合わされた場合に、所望の全長V-CDR3-J-C TCR ORFが再構成されるように設計されている。よって、二部分装置のこの第１の部分は、TCR ORFを特定のベクターに関連付けて組立てて、これらのTCRをコードするベクターが、二部分装置の第２の部分が動作するための組込みベクターとなるようにする。
二部分装置の第２の部分は、操作Ｔ細胞受容体提示細胞システム(eTPCS)と定義する、操作された多成分細胞システムを含む。第２の部分。図１の「パート２」に要約される少なくとも３つの成分で構成される多成分システム。第一に、操作TCR提示細胞(操作されたTCRを提示する細胞；eTPC)(成分2A)。第二に、操作されたゲノム受容部位の対(成分2B及び2D)を含む。第三に、二部分装置の第１の部分TORESに由来するTCRコーディング遺伝子組込みベクターであって、eTPCに含まれるゲノム受容部位とマッチする遺伝子組込みベクター(成分2C及び2E)。マッチしたゲノム受容部位及び組込みベクター(組込みカップルと呼ぶ)を、TCR対をコードする遺伝子材料の迅速で安定な組込みのために用いる。eTPCは、更に、第４の成分(任意成分)であるTCR刺激応答エレメント(成分2F)を、TCRシグナル伝達応答のインビトロ検出及び特徴決定のために更に含んでよい。
二部分装置は、よって、特異的組込みベクターと関連付けられた天然型の若しくは配列が多様化されたTCR ORF又はそのライブラリを得るため、そしてこれらの組込みベクターをマッチしたeTPCと組み合わせることにより、単一TCR対を発現する被分析物eTPC(eTPC-t)又はそのライブラリを得るために用いられる。
本発明は、全長TCR対を提示する安定な派生被分析物細胞(eTPC-t)の迅速でハイスループットな作製のために用いられる。この二部分装置は、研究の背景及び臨床免疫診断手順の両方で直接用いることができる分析システムへのTCR中心の細胞ベースのインプットを作製するためによく適している。よって、二部分装置は、一般的に、TCR ORFの派生物を得た後に１以上の被分析物eTPC-tを調製するために用いられる。これらの被分析物eTPC-tを、次いで、１以上の被分析物抗原と組み合わせて(まとめてeTPC:抗原システム、eTPC:A)、１以上のアウトプットを得る(図24)。被分析物抗原は、被分析物抗原提示細胞(APC)により、及び/又は可溶性若しくは固定化被分析物抗原として提供されるか、或いは/又は非細胞ベースの粒子(NCBP)上で提示される。
本発明は、TCR ORFを作製するため(TORES)及び細胞表面でTCR対を安定に発現する操作された株化細胞を作製するため(eTPCS)に、標準化された、柔軟性のあるそして組織化可能な二部分装置を提供する。単一TCR ORF対は、詳細な解析のために、二部分装置内の操作された細胞により提示されることができ、TCR ORFのライブラリもそうである。天然型又は配列が多様化されたTCRを提示する細胞のライブラリの作製は、新規なTCR特異性を同定若しくは操作するため、又は特定のTCR対についての同族抗原を同定するための分析又はスクリーニングの目的のために用いることができる。本発明の中心である標準化は、再現性を増し、生成サイクル時間を減らし、よってこのような被分析物材料を作製するための費用を減らす点において、現存する方法に対して著しい改善となる。この標準化は、制御されたコピー数で制御されたゲノム位置に信頼できるORF組込みを許容する確固とした組込みベクター/ゲノム受容部位サブシステムにより達成される。同様のTCR提示細胞を達成する以前の無作為組込み及びウイルスアプローチに対して著しい改善である。
TORES:二部分装置の第１の部分
二部分装置の第１の部分は、TORESと言い、これは、標的TCR ORFの再構成のための全ての必要なＶ、Ｃ及びＪ遺伝子セグメントを含むライブラリに組立てられる二成分ベクターシステムを含む(図１、パート１)。例えば、ライブラリは、実施例１に記載するように、ヒトTRA及びTRB遺伝子座の天然型タンパク質配列をコードする全ての遺伝子セグメントを含むように構築できる。
TORESを用いて、標的TCR、Ｖ、Ｊ及びＣ遺伝子セグメント使用を定義する配列情報を非生殖系列CDR3配列と一緒に用いて全長TCR ORFを再構成することで十分である。この情報から、標的TCR ORFのＶ/Ｃ及びＪ使用に対応するＶ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターがまず選択される。全長TCR ORFを完成するために必要な非生殖系列CDR3配列に相当する第１の部分の第３の成分であるodeCDR3も作製される。図２に示すように、３つの成分を、反応においてIIS型制限酵素及びDNAリガーゼ酵素と組み合わせて標的全長TCR ORF、並びに副生成物を作製する。得られる再構成された全長TCRは、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格に含まれ、よって、この親の構築物に含まれるベクターの特徴を全て含む。
制限酵素/リガーゼ反応剤中での３つの組合せ成分(図２、ｂ、ｃ)のIIS型制限酵素の作用により、２つの反応副生成物及び２つの反応中間体が得られる。Ｖ-Ｃエントリーベクター由来の反応副生成物は、切り取られた天然型選択マーカー及びIIS型結合部位である(図2d)。Ｊセグメント部が切り取られたＪドナーベクター骨格は、第２の反応副生成物である(図2e)。Ｊドナーベクターから切り取られたＪセグメント部は、反応中間体であり、Ｊセグメント部、Cセグメントからの小さいＣ部及びライゲーションに必要な一本鎖オーバーハングを両方含む(図2f)。第２の反応中間体は、Ｖ及びＣセグメント並びにライゲーションに必要な一本鎖オーバーハングを含む親のＶ-Ｃエントリー骨格である(図2g)。反応の最終生成物は、親のＶ-Ｃエントリーベクター骨格内で再構築され、odeCDR3ライゲーション部(図2c)、切り取られたＪセグメント部(図2f)並びにＶ及びＣ遺伝子セグメントを有するＶ-Ｃエントリー骨格(図2g)で構成される全長TCR ORFである。
第１の部分のＶ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクター成分
二部分装置の第１の部分は：
ａ．複製起点、
ｂ．第１のポジティブ選択マーカー、
ｃ．１以上の５'遺伝子エレメント、
ｄ．コザック配列、
ｅ．TCR可変遺伝子セグメント、
ｆ．IIS型制限酵素による部位特異的認識及び切断のための第１のIIS型配列、
ｇ．ネガティブ選択マーカー、
ｈ．第２のIIS型配列、
ｉ．TCR定常遺伝子セグメント、及び
ｊ．１以上の３'遺伝子エレメント
を含む１以上のＶ-Ｃエントリーベクター(成分1A)を含み、ここで、ａ)及びｂ)は、細菌宿主内での親のＶ-Ｃエントリーベクター及び再構成されたTCR ORF含有ベクターの増殖及び選択に用いられ、ｃ)及びｊ)は、二部分装置の第２の部分のマッチしたゲノム受容部位(成分2B又は2D)への組込みの態様並びに川下の応用に必要な追加の特徴を定義するために用いられ、ｄ)は、真核細胞での効率的な翻訳開始を確実にし、ｅ)は、開始コドンから、所与の二成分ベクターシステムにおいて全てのＶセグメントにわたって保存されるCDR3領域の５'末端のモチーフまでの可変(Ｖ)遺伝子セグメントであり、ｆ)は、標準化された一本鎖オーバーハングがＶ遺伝子セグメントの３'末端に創出されるように、IIS型制限酵素が５'方向で切断するよう指示するIIS型認識配列であり、ｇ)は、本システムが全長TCR ORFを再構成するように働いている間に、親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除するネガティブ選択マーカーであり、ｈ)は、標準化された一本鎖オーバーハングがＣ遺伝子セグメントの５'末端に創出されるように、IIS型制限酵素が３'方向で切断するよう指示するIIS型認識配列であり、ｉ)は、所与の二成分ベクターシステムにおいて全てのＣセグメントにわたって保存されるＣ遺伝子セグメントの５'末端のモチーフ、又はＣ遺伝子セグメントの５'末端の一部分を欠くＣ遺伝子セグメント部分からのＣ遺伝子セグメントであって、Ｊセグメントとの境界を定めるＣ遺伝子セグメントである(図2aを参照されたい)。
二部分装置の第１の部分は、1Bと呼ばれる成分を含み：
ａ．複製起点、
ｂ．第２のポジティブ選択マーカー、
ｃ．第３のIIS型配列、
ｄ．TCR連結遺伝子セグメント、
ｅ．定常遺伝子セグメントの小さい５'部分に相当するＣ部、及び
ｆ．第４のIIS型配列
を含む１以上のＪドナーベクターを含み、ここで、ａ)及びｂ)は、Ｊドナーベクターの増殖及び選択のために用いられ、ｃ)は、標準化された一本鎖オーバーハングがＪ遺伝子セグメントの５'末端に創出されるように、IIS型制限酵素が３'方向に切断するよう指示するIIS型認識配列であり、ｄ)は、所与の二成分ベクターシステムにおいて全てのＪセグメントにわたって保存されるCDR3領域の３'末端を定義する５'モチーフから始まって、二成分システムに含まれるＶ-ＣエントリーベクターによりコードされるＣセグメントの５'部分であるＣ部が組み込まれている３'配列までの連結(Ｊ)遺伝子セグメントであり、ｆ)は、標準化された一本鎖オーバーハングがＪ遺伝子セグメントの３'末端に創出されるように、IIS型制限酵素が５'方向に切断するよう指示する、当該配列のＣ部の部分に含まれるIIS型認識配列である(図2bを参照されたい)。
Ｊドナーベクターは、Ｃ遺伝子セグメントの小さい５'部分をコードするＣ部配列を厳密に有する必要はない。このＣ部は、TORESが動作している間の再構成反応のためのオーバーハングを最適化して標準化するために用いられる。これは、Ｊ遺伝子セグメントの３'末端で見いだされる配列のバリエーションがより高く、よって、Ｃ部を含むことにより、多様性がより低いＣ遺伝子セグメント内でオーバーハングを作製することにより標準化が可能になるからである。３'Ｊセグメント多様性を有さない他の生物からのTCR遺伝子座についてTORESを構築する場合、又は合成Ｊ遺伝子セグメントを用いる場合、Ｊセグメント内のオーバーハングをい標準化するためのＣ部は省略してもよい。このことにより、Ｊドナーライブラリ構築の複雑さが低くなる。
Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターにコードされる第１、第２、第３及び第４のIIS型配列の各々は、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、これらは同じである。このことにより、二成分ベクターシステム内の各制限部位が、同じIIS型酵素に適合し、TORESを用いる全長TCR ORFの再構成の間の制限酵素/リガーゼ反応に単一の酵素だけが必要となる。IIS型酵素はその認識配列内で切断せず、該認識配列の外に一本鎖オーバーハングが作製される。よって、IIS型制限酵素の作用により作製されるオーバーハングの性質は、認識配列の向きと、隣接配列との両方に依存する(実施例１を参照されたい)。
或いは、IIS型制限配列の各々は、互いに異なっていてよい。しかし、ユニークな認識配列を加えるたびに、制限酵素/リガーゼ反応に更なるIIS型酵素を組み込まなければならない。このことにより、全長TCR ORFを組み立てるための再構成反応の複雑さ及び費用が増加する。
Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターそれぞれに含まれる第１及び第２のポジティブ選択マーカーは、好ましくは異なる。このことにより、最終全長TCR ORF生成物の骨格を提供するＶ-ＣエントリーベクターがＪドナーベクターから独立して選択され、よって、(そうでなければ、再構成反応にバックグラウンドをもたらすことになる)未消化の又は再環化したＪドナーベクターを有する形質転換体を排除できる(図２を参照されたい)。
ポジティブ選択マーカーは：
ａ．抗生物質耐性遺伝子、
ｂ．栄養要求性補完遺伝子、
ｃ．レポーター遺伝子
から選択でき、ここで、このようなポジティブ選択マーカーの選択、フォーマッティング及び使用は、当業者に公知である。
Ｖ-Ｃエントリーベクターに組み込まれる５'遺伝子エレメントは：
ａ．遺伝子シスエレメント、
ｂ．リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
ｃ．興味対象のゲノム部位についての５'相同組換えアーム、
ｄ．mRNAスプライスアクセプター部位、
ｅ．配列内リボソーム進入部位、及び
ｆ．エピジェネティックインスレータ配列
から選択される１以上のエレメントを含み、ここで、ｂ)及びｃ)の少なくとも一方が含まれ、それらは二部分装置の成分2B及び2Dとして含まれるゲノム受容部位にマッチしており、ａ)は、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内で再構成された全長TCR ORF生成物によりコードされる転写産物の発現を駆動し、ｂ)は、リコンビナーゼ酵素の存在下で部位特異的組換えを駆動して、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内で再構成された全長TCR ORF生成物を、二部分装置の第２の部分のeTPCのゲノムに特異的に挿入する配列であり、ｃ)は、部位特異的相同組換えを駆動して、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内で再構成された全長TCR ORF生成物を、二部分装置の第２の部分のeTPCのゲノムに特異的に挿入する配列であり、ｄ)は、操作ドメイン-融合アプローチを可能にして、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内で再構成された全長TCR ORFから発現されるタンパク質の形を操り、ｅ)は、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内で再構成された全長TCR ORFから発現されるmRNAのキャップ非依存性の翻訳開始を許容し、ｆ)は、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内で再構成された全長TCR ORFを挿入し得るゲノムにおいて、(そうでなければ、エンハンサエレメントにより影響される)転写活性の遮蔽を許容する。
シスエレメントは、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格に再構成されたTCRの発現を、eTPCのゲノム受容部位に一旦挿入されるや否や駆動するために含めることができる。しかし、このことは、組込み中に、作製された組込みベクターをeTPCに送達する際のTCR鎖の一過性発現を可能にするであろう。よって、TCR鎖が正しいゲノムの状況に一旦組み込まれた場合にだけ発現され得るように、ゲノム受容部位自体の中にシスエレメントが含まれることが好ましい。
Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格は、再構成されたTCR ORFを含む前記ベクターが適当なリコンビナーゼ酵素の存在下で哺乳動物細胞にトランスフェクションされる場合に、再構成された全長TCR ORFのリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)を許容するリコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位をコードし得る(実施例１)。
Ｖ-Ｃエントリーベクターに含まれる第１のIIS型認識配列は、TCR可変遺伝子セグメント内(図2a)の前記認識配列の５'を切断して、合成されたodeCDR3(図2c)の５'末端のものに相補的な可変遺伝子セグメント(図2g)の３'末端にて一本鎖DNAオーバーハングを生成するような向きである。この第１のIIS型認識配列をどのように設計するかについての詳細は、実施例１及び２を参照されたい。
Ｖ-Ｃエントリーベクターは、第１のIIS型認識配列と第２のIIS型認識配列との間にネガティブ選択マーカーを含む(下記参照、図2a)。このネガティブ選択マーカーは：
ａ．第１の成分の他の場所にもTCR連結遺伝子セグメント内にも含まれない制限酵素認識部位、
ｂ．殺菌性因子をコードする遺伝子、
ｃ．レポーターエレメント
の１以上から選択され、ここで、ネガティブ選択マーカーは、親のＶ-Ｃエントリーベクターで形質転換された宿主細胞を排除して、よって、第１のポジティブ選択マーカーを用いてＶ-Ｃエントリーベクター骨格内に標的TCR ORFを含む形質転換体を選択する場合、再構成反応のバックグラウンドを低減するために用いられる(実施例３を参照されたい)。
ネガティブ選択マーカー自体を除いて、二部分システム内の全てのその他の配列は、システムの他の場所にこの配列を含むことに基づく不当なネガティブ選択を与えないために、前記配列を含んではならない。
この関係において、Ｖ-Ｃエントリーベクターに含まれる第２のIIS型認識配列は、TCR定常遺伝子セグメント(図2a)内で前記認識配列の３'側を切断して、定常遺伝子セグメント(図2g)の５'末端に、Ｊドナー断片反応中間体(図2f)の３'末端のものに相補的な一本鎖DNAオーバーハングを生成するような向きである。この第２のIIS型認識配列をどのように設計するかについての詳細は、実施例１及び２を参照されたい。
Ｖ-Ｃエントリーベクターに組み込まれる３'遺伝子エレメントは：
ａ．ターミネータエレメント、
ｂ．リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
ｃ．興味対象のゲノム部位についての３'相同組換えアーム、
ｄ．mRNAスプライスドナー部位、
ｅ．配列内リボソーム進入部位、及び
ｆ．エピジェネティックインスレータ配列
から選択される１以上のエレメントを含み、ここで、ｂ)及びｃ)の少なくとも一方が含まれ、それらは二部分装置の成分2B及び2Dとして含まれるゲノム受容部位にマッチしており、ａ)は、インサイチュでのTCR ORFの効率的なmRNA生成のための転写終結を駆動し、ポリＡシグナルをコードしていてもよい配列であり、ｂ)は、リコンビナーゼ酵素の存在下で部位特異的組換えを駆動して、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内で再構成された全長TCR ORF生成物を、二部分装置の第２の部分のeTPCのゲノムに特異的に挿入する配列であり、ｃ)は、部位特異的相同組換えを駆動して、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内で再構成された全長TCR ORF生成物を、二部分装置の第２の部分のeTPCのゲノムに特異的に挿入する配列であり、ｄ)は、下流のmRNAスプライスアクセプター部位をコードするゲノム遺伝子座への組込みの後に転写ユニットへのTCR ORFの融合を許容して、TCR発現レベルの強度又はＶ-Ｃエントリーベクター骨格内で再構成された全長TCR ORFから発現されるタンパク質の形を操り、ｅ)は、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内で再構成された全長TCR ORFから発現されるmRNAのキャップ非依存性の翻訳開始を許容し、ｆ)は、隣接クロマチンドメイン間の不適切な相互作用を妨げて、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内で再構成された全長TCR ORFを挿入し得るゲノムの状況において、隣接転写調節からの全長TCR ORF又はヘテロクロマチンの広がりを遮蔽する。
ターミネータエレメントは、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格に再構成され、eTPCのゲノム受容部位に組み込まれたTCRの発現中の転写終結を確実にするために含むことができる。ターミネータ配列を、実施例１に概説するように、ゲノム受容部位自体の中に含んでもよい。
Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格は、実施例３、４及び５に概説するように、再構成されたTCR ORFを含む前記ベクターが適当なリコンビナーゼ酵素の存在下でマッチしたゲノム受容部位と共にeTPCをトランスフェクションする場合に、再構成された全長TCR ORFのリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)を許容するリコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位をコードし得る、実施例１。
Ｊドナーベクターは、Ｊ遺伝子セグメントの３'に、Ｃ遺伝子セグメントの５'断片であるＣ部配列を有するＪ遺伝子セグメントを含む(図2b)。
Ｃ部配列は、Ｊドナーベクター由来Ｊ断片反応中間体(図2f)の３'末端にての中に、そしてIIS型消化オープンＶ-Ｃエントリーベクター反応中間体(図2g)の中のＣ遺伝子セグメントの５'末端にて、IIS型酵素の作用により作製される一本鎖オーバーハングを標準化するように設計される。
Ｊドナーベクターに含まれる第３のIIS型認識配列は、該認識配列の３'をTCR連結遺伝子セグメント内で切断して(図2b)、連結遺伝子セグメント(図2f)の５'末端にて、合成されたodeCDR3の５'末端のものに相補的な(図2c)一本鎖DNAオーバーハングを生成するような向きである。この第３のIIS型認識配列をどのように設計するかについての詳細は、実施例１及び２を参照されたい。
Ｊドナーベクターに含まれる第４のIIS型認識配列は、該認識配列の５'をTCR Ｃ部内で切断して(図2b)、３'C部(図2f)の３'端にて、５'IIS型消化オープンＶ-Ｃエントリーベクター反応中間体のものに相補的な(図2g)一本鎖DNAオーバーハングを生成するような向きである。この第３のIIS型認識配列をどのように設計するかについての詳細は、実施例１及び２を参照されたい。
二部分ベクターシステム内で、全てのベクター配列は、TORES組立て反応に用いられるIIS型制限酵素についての余剰のIIS型認識配列を含まない。このような配列を含むことは、コードされる遺伝子セグメント又はその部分内でのIIS型制限酵素の作用をもたらし、TCR再構成プロセスの混乱をもたらす。同様に、IIS型認識配列は、第３のシステム成分であるodeCDR3に含まれない(下記参照)。
TORESの二成分ベクターシステムは、TCR鎖の任意のコレクションについても構築できる。以下の実施例１では、二成分ベクターシステムは、ヒトTCRアルファ及びベータ鎖をそれぞれコードするヒトTRA及びTRB遺伝子座について構築される。このようなTORESの構築は、TCRデルタ及びガンマ鎖対をそれぞれコードするTRD及びTRG遺伝子座、又は実際に、有顎脊椎動物で見いだされる任意のTRA/TRB、TRD/TRG若しくはバリアントTCR鎖対システムの状況において等しく当てはめることができる。このようなTORESシステムは、細胞により発現されるTCR又は組換えTCRタンパク質の操作のための合成バリアントTCR ORFの組立てを許容する合成TCR遺伝子断片も組み込んでよい。
二部分システムの第１の部分の第３のodeCDR3成分
任意の与えられたTORESを用いて全長TCR ORFを再構成するために、二成分Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターシステムによりコードされない小さいORF断片が第３の成分として必要である。この第３の成分は、成分1Cと呼ばれる、CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)の形をとる。
このような第３の成分1C、odeCDR3は：
ａ．Ｖ-ＣエントリーベクターのTCR可変遺伝子セグメント内の第１のIIS型認識部位と結合するIIS型制限酵素により作製されるオーバーハングに相補的な第１の一本鎖オーバーハング配列、
ｂ．TCR CDR3領域をコードし、ネガティブ選択エレメントを含まず(ネガティブ選択エレメントは、請求項10で定義されるとおりである)、TORES反応ミックスに加えられるIIS型制限酵素についてのいずれのIIS型制限配列も含まない二本鎖セグメント、
ｃ．ＪドナーベクターのTCR連結遺伝子セグメント内の第３のIIS型認識部位と結合するIIS型制限酵素により作製されるオーバーハングに相補的な第２の一本鎖オーバーハング配列
を含む。
或いは、
ｄ．odeCDR3は、第１又は第２の成分と矛盾しない２つのIIS型酵素に挟まれ、消化された場合に、上記のａ、ｂ及びｃを含む生成物、短いdsDNA断片IIS型部位をコードする２つの副生成物が作製されるような向きであるCDR3をコードするdsDNA分子で構成され得る。この代替のdsDNA odeCDR3は、予めの消化を必要とすることなく、制限酵素/リガーゼ反応に適合する。
全長TCR ORFを再構成するためにTORESを用いる方法
二部分装置の第１の部分であるTORESは、実施例３においてヒトTRA/TRB鎖対について示すように、遺伝子ベクターに関連付けて、配列情報から全長TCR ORFを再構成するために用いることができる。
配列情報から全長TCR ORFを再構成するようにTORESを働かせるために、所与のTCR鎖についての二成分ベクターシステムのリソースに鑑みて、方法は：
ａ．Ｖ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｂ．Ｊドナーベクターを選択する工程と、
ｃ．odeCDR3を選択する工程と、
ｄ．ａ、ｂ及びｃを組み合わせて、ｉ)Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターに存在する全てのIIS型制限酵素認識及び切断部位を切断するIIS型制限酵素並びにii)DNAリガーゼ酵素と反応させて、iii)組合せミックスを温度制御反応に供する工程と、
ｅ．工程ｄから得られる反応生成物で、DNAベクター増殖能力を持つ選択可能な宿主生物を形質転換する工程と、
ｆ．宿主生物の選択を行って、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程
とを含み、ａ)及びｂ)は、標的全長TCR ORF内のＶ、Ｊ及びＣ遺伝子セグメントをコードする選択されたベクターに基づいて選択され、ｃ)は、ａ)及びｂにおいて選択されるＶ-Ｃエントリー又はＪドナーベクターによりコードされず、その中にコードされる可変及び連結セグメントと結合する全長TCR ORF配列を完成することに基づいて選択され、ｄ)３つの選択された成分を、反応混合物に、Ｖ-Ｃエントリー及びＪドナーベクター内の第１、第２、第３及び第４のIIS型制限酵素認識配列を切断する制限酵素と共に組み合わせること、ｅ)は、通常、形質転換能力を持つ細菌であり、ｆ)宿主の選択は、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格によりもたらされる第１のポジティブ選択マーカーに基づく。
一般的に、再構成のための全長TCR ORFの遺伝子エレメントを選択及び定義するためのワークフローは、標的生物組織からのTCR鎖のデノボシーケンシングを必然的に伴う。一般的なワークフローは、選別された単一細胞からのTCR鎖対の逆転写及びPCRベースの増幅と、そのあとのサンガーシーケンシングとを組み込む。代替のシーケンシング方法を用いることができる。一般的に重要なパラメータは、TCR ORF対を維持することである。更に、TCR ORFのＶ、CDR3、Ｊ及びＣセグメントにまたがる高品質の配列を情報が必要とされ、このことにより、特定のシーケンシングアプローチをとることが要求される。
よって、TCRオープンリーディングフレームを選択及び再構成する方法は：
ａ．TCRオープンリーディングフレーム配列を得る工程であって、前記配列情報が、ｉ)可変遺伝子セグメント使用、ii)定常遺伝子セグメント使用、iii)連結遺伝子セグメント使用、iv)可変遺伝子セグメント境界から連結遺伝子セグメント境界にまたがる全長CDR3配列を同定するために十分である工程と、
ｂ．工程ａ．ｉ)及びａ．ii)でそれぞれ同定される可変及び定常遺伝子セグメントに対応するＶ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｃ．工程ａ．iii)で同定される連結遺伝子セグメントに対応するＪドナーベクターを選択する工程と、
ｄ．工程ａ．iv)で同定されるCDR3配列に対応するodeCDR3を作製する工程と、
ｅ．ｂ、ｃ及びｄを組み合わせて、ｉ)Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターに存在する全てのIIS型制限酵素認識及び切断部位を切断するIIS型制限酵素並びにii)DNAリガーゼ酵素と反応させて、iii)組合せミックスを温度制御反応に供する工程と、
ｆ．工程ｅ．で得られる反応生成物で、プラスミド複製能力を持つ選択可能な宿主生物を形質転換する工程と、
ｇ．宿主生物の選択を行って、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内の全長の再構成されたTCR ORFを得る工程と
を含み、ａ)は、当業者に公知のシーケンシング方法により行われ、４つ全ての必要な遺伝子エレメントを同定するために十分な配列の長さ及び質を得ることができ、ｂ)及びｃ)は、必要なベクターを含むTORESライブラリから選択され、ｄ)は、デノボに合成されるか、又はodeCDR3ライブラリから選択され、ｅ)は、単一反応槽で行われる。
適切なＶ-Ｃエントリーベクター、Ｊドナーベクター及びodeCDR3を選択するために、標的TCR配列を、対応するTCR鎖についてのＶ、Ｃ及びＪ遺伝子セグメントのライブラリに対して整列させて、標的鎖のＶ、Ｃ及びＪセグメント使用を決定した。この配列アラインメント及び解析工程は、CDR3コーディング配列の定義、よって、odeCDR3配列の定義も許容する。よって、全体として、このような配列解析は、TCR鎖再構成のためのＶ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターの選択を許容する。この解析は、各鎖再構成反応のためのodeCDR3の合成も許容する。
IIS型消化及びDNAリガーゼ依存性ライゲーション(工程ｅ)を単独反応で行うことが望ましい。このことは、処理工程を最小限にし、幾つかのユニークオーバーハングが単一酵素により作製され、よってＪドナーベクター反応中間体及びodeCDR3の、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格への効率的な定方向クローニングを維持するように認識配列の外側を切断するIIS型制限酵素を用いる、システムの設計により可能になる。
或いは、IIS型制限消化及びDNAライゲーションは、逐次的な手順で行ってよい。
TORESの一般的な用途の一例は、TRA/TRB TCR鎖対の逆転写及びPCRベースの増幅と、そのあとのサンガーシーケンシングのための、ヒト組織からの抗原特異的=Ｔ細胞の単一細胞蛍光標示式細胞選別(FACS)の状況において例示される。これは、一般的に適用可能なワークフローであり、ここで、任意の組織を任意の有顎脊椎動物からのＴ細胞の供給源とすることができ、細胞を表現型の特徴に基づいて選別できる。選別された単一細胞は、pHLA多量体反応剤を用いて抗原特異性について染色される必要がない。
用いられるTCRシーケンシングアプローチは、TCR ORFの上記のように定義する遺伝子特徴が配列情報に基づいて定義できるように十分に高品質の配列情報が得られる限り、いずれの特定の方法又は技術にも限定されない。
天然型TCR鎖対をシーケンシング及び同定できるように単一細胞を分けるためのFACSの使用は、多重特異性抗体パネルを用いて収集できる正確で豊富な表現型情報のために、強力な方法である。しかし、エマルジョンPCR、微小流体細胞カプセル化を用いるデジタルPCRアプローチ、物理的分配基板を用いる液滴デジタルPCRを含む他の方法が、細胞を分配するために存在する。
供給源材料から天然型TCR対を得ることが一般的に望ましい。なぜなら、TCR対の両方の鎖が、HLA-抗原結合及び認識に寄与するからである。しかし、設定された特異性に対する単一鎖のハイスループットスクリーニングのように、単一の鎖だけの回収が望まれる場合がある。このような場合、TCRは、非分配細胞から増幅及び/又はシーケンシングしてよい。
多様化配列を有する全長TCR ORFを作製するためにTORESを使用する方法
TORESシステムは、幾つかの系統化された形態において多様化された全長TCR ORFを作製するために理想的に適する。このような系統的多様化は、TCR鎖についての親和性及び/又は機能成熟ワークフローに適用できる。標的TCR鎖配列のこのような多様化は、実施例５に詳しく記載する。
このようなTCR ORF配列多様化方法は、再構成反応と同じ全般的なスキームに従う。多様化は、単一のバリアントTCR ORFが反応当たり作製される多重並列再構成反応で行うことができる。しかし、ほとんどのシナリオでは、単一反応でバリアントTCR ORFのプールを作製することが望ましい。これらのアプローチの各々は、各遺伝子成分(Ｖ-Ｃエントリーベクター、Ｊドナーベクター、odeCDR3)の１以上の多重バリアントを再構成反応に提供することにより達成される。
実施例５に記載するように、TCR ORFは、規定された位置的配列多様性を有するodeCDR3のプールを加えることにより、CDR3領域にて系統的に多様化できる(図３)。
よって、CDR3領域におけるTCR ORF多様性を達成するためにTCRオープンリーディングフレームを選択及び再構成する方法は：
ａ．TCRオープンリーディングフレーム配列を得る工程であって、前記配列情報が、ｉ)可変遺伝子セグメント使用、ii)定常遺伝子セグメント使用、iii)連結遺伝子セグメント使用、iv)可変遺伝子セグメント境界から連結遺伝子セグメント境界にまたがる全長CDR3配列を同定するために十分である工程と、
ｂ．工程ａ．ｉ)及びａ．ii)でそれぞれ同定される可変及び定常遺伝子セグメントに対応するＶ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｃ．工程ａ．iii)で同定される連結遺伝子セグメントに対応するＪドナーベクターを選択する工程と、
ｄ．バリアント配列組成を有する工程ａ．iv)で同定されるCDR3配列に対応する２つ以上のodeCDR3を作製する工程と、
ｅ．ｂ、ｃ及びｄを組み合わせて、ｉ)Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターに存在する全てのIIS型制限酵素認識及び切断部位を切断するIIS型制限酵素並びにii)DNAリガーゼ酵素と反応させて、iii)組合せミックスを温度制御反応に供する工程と、
ｆ．工程ｅ．で得られる反応生成物で、プラスミド複製能力を持つ選択可能な宿主生物を形質転換する工程と、
ｇ．宿主生物の選択を行って、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程と
を含み、ａ)は、当業者に公知のシーケンシング方法により行われ、４つ全ての必要な遺伝子エレメントを同定するために十分な配列の長さ及び質を得ることができ、ｂ)及びｃ)は、必要なベクターを含むTORESライブラリから選択され、ｄ)は、デノボに合成されるか、又はodeCDR3ライブラリから選択され、ｅ)は、単一反応槽で行われる。
このような方法は、全てのodeCDR3バリアントを単一反応にプールして、配列多様化プールを作製することにより達成できるが、各odeCDR3バリアントを並行反応に供することによっても等しく達成され得る。
バリアントodeCDR3は、当業者に公知の様々な方法により作製できる。odeCDR3縮重/多様性の位置及び程度の選択は、単一の位置での単一残基の変化から、odeCDR3の長さでの完全縮重配列までの範囲であり得る。
TCR ORFは、単一odeCDR3の提供によりCDR3領域を維持するが、２つ以上のＶ-Ｃエントリーベクター及び/又はＪドナーベクターを再構成反応に提供することによりＶ、Ｃ及びＪセグメントを多様化することにより、系統的に多様化できる(図４、５及び６)。
よって、多様化Ｖ、Ｃ及び/又はＪセグメント使用を有するTCRオープンリーディングフレームを選択及び再構成する方法は：
ａ．TCRオープンリーディングフレーム配列を得る工程であって、前記配列情報が、ｉ)可変遺伝子セグメント使用、ii)定常遺伝子セグメント使用、iii)連結遺伝子セグメント使用、iv)可変遺伝子セグメント境界から連結遺伝子セグメント境界にまたがる全長CDR3配列を同定するために十分である工程と、
ｂ．工程ａ．ｉ)及びａ．ii)でそれぞれ同定される可変及び定常遺伝子セグメントに対応しない２つ以上のＶ-Ｃエントリーベクターを選択する工程と、
ｃ．工程ａ．iii)で同定される連結遺伝子セグメントに対応しない２つ以上のＪドナーベクターを選択する工程と、
ｄ．工程ａ．iv)で同定されるCDR3配列に対応するodeCDR3を作製する工程と、
ｅ．ｂ、ｃ及びｄを組み合わせて、ｉ)Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターに存在する全てのIIS型制限酵素認識及び切断部位を切断するIIS型制限酵素並びにii)DNAリガーゼ酵素と反応させて、iii)組合せミックスを温度制御反応に供する工程と、
ｆ．工程ｅ．で得られる反応生成物で、プラスミド複製能力を持つ選択可能な宿主生物を形質転換する工程と、
ｇ．宿主生物の選択を行って、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内の全長の再構成されたTCRオープンリーディングフレームを得る工程と
を含み、ａ)は、当業者に公知のシーケンシング方法により行われ、４つ全ての必要な遺伝子エレメントを同定するために十分な配列の長さ及び質を得ることができ、ｂ)及びｃ)は、必要なベクターを含むTORESライブラリから選択され、ｄ)は、デノボに合成されるか、又はodeCDR3ライブラリから選択され、ｅ)は、単一反応槽で行われる。
このような方法は、全てのＶ-Ｃエントリーベクター及び/又はＪドナーベクターバリアントを単一反応にプールして、配列多様化プールを作製することにより達成できるが、各ベクターバリアントを並行反応に供することによっても等しく達成され得る。
与えられたライブラリからの各Ｖ-Ｃエントリー及びＪドナーベクターを選択して、Ｖ、Ｃ及びＪ遺伝子セグメントを完全にカバーできる。
上記のCDR3並びにＶ、Ｃ及びＪ多様化のいずれの組合せを用いても、多様化TCR ORFのプール又はライブラリを作製できる。
このシステムを用いて、天然型Ｖ、Ｃ及びＪ遺伝子セグメント使用を完全にカバーし、規定されたCDR3特徴を有するTCR ORFの完全合成ライブラリを作製できる。
再構成及び多様化方法に関するTORESの特徴
上記のように、単一IIS型制限酵素を用いる組立て反応を行うことが望ましい。このことは、制限酵素の使用を節約し、IIS型作用の性質、並びに二成分ベクターシステムにおけるユニーク一本鎖オーバーハング及びodeCDR3の設計により可能になる。
或いは、４つまでのIIS型制限酵素認識配列が、Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターの４つのIIS型認識部位にわたる。
TCR ORF生成物の効率的なクローニングのために：
ａ．反応生成物の制限酵素消化を行って、親のＶ-Ｃエントリーベクターを消去すること、
ｂ．条件的殺菌性因子選択を行って、親のＶ-Ｃエントリーベクターで形質転換されたコンピテントな宿主を排除すること、及び/又は
ｃ．レポーター同定により、親のＶ-Ｃエントリーベクターで形質転換された宿主細胞の選択を行うこと
から選択される少なくとも一工程のネガティブ選択を、TORESを用いる全長TCR ORFの組立て中に行い、ここで、ネガティブ選択を用いて、IIS型酵素により未消化のまま残ったか又は消化の後に親の形に再びライゲーションされた親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除する。
Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格を考えると、親のＶ-Ｃエントリーベクターの排除は重要であり、よってこの骨格が有するポジティブ選択マーカーを、全長TCR ORF反応生成物を含むベクターのポジティブ選択に用いる。
この関係において、ネガティブ選択は、Ｖ-Ｃエントリーベクターから切り取られた反応副生成物内で設計された制限酵素部位を用いて行われる(図2d)。このネガティブ選択手順は、実施例３に記載する。
上記のネガティブ選択方法のいずれか１つ又は組合せを用いて、最終のクローニングされた生成物から親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除できる。クローニングされた反応生成物の効率的な回収のためにクローニング効率が十分に高いとみられるならば、このようなネガティブ選択手順は省略してよい。
形質転換宿主生物におけるクローニングされた全長TCR ORF含有ベクターの選択が、最終のクローニングされた生成物を得るために必要である。このような選択は、当業者に公知である。
宿主生物は、誘導されたか又は天然に形質転換能力を持つ細菌であり、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内に含まれる全長TCR ORFを含む形質転換体の選択は、抗生物質選択を含む。このことは、形質転換された細胞が存在する培養系に抗生物質を加えることを必然的に伴い、この抗生物質に対する耐性は、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内の第１のポジティブ選択マーカーである遺伝子によりコードされる。
或いは、形質転換体が存在する培養系の栄養要求性因子がポジティブ選択の形であってよく、ここで、栄養要求性補完は、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格内でコードされる遺伝子生成物により与えられる。上記のポジティブ選択の組合せを用いてよい。
Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターライブラリ
選択されたTCR ORFの再構成又は多様化を行うためのTORESの効率的な稼動のために、Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターライブラリの再構築が必要である。各TCR鎖の形について特異的なこのライブラリから、odeCDR3配列を補完した場合に、標的TCR ORF配列のＶ/Ｊ/Ｃ使用を満足するような選択が行われるのである。
Ｖ-Ｃエントリー及びＪドナーベクターライブラリは、TCRを有する生物の全ての生殖系列TCR Ｖ/Ｊ/Ｃ遺伝子セグメントを含むように構築してよい。このようなライブラリ
は、実施例１に示すTRB遺伝子座特異的TORESのように、Ｖ-Ｃエントリーベクター内に全てのＶ-Ｃ組合せを含んでもよく、このライブラリは、各可変セグメントに対する両方の定常遺伝子セグメントを有して複製される。
Ｖ-Ｃエントリー及びＪドナーベクターのライブラリは、コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に対して修飾されないように、Ｖ/Ｊ/Ｃ遺伝子セグメントを含んでよい。
このようなライブラリは、望ましくないIIS型認識配列、又はポジティブ及びネガティブ選択エレメントを有さないライブラリを作製するような、基礎の核酸配列における変化を許容する。基礎の核酸配列における変化は、再構成されたTCR鎖の最適な発現のためのコドン最適化のために用いることもできる。
或いは、Ｖ-Ｃエントリー及びＪドナーベクターのライブラリは、コードされるタンパク質の翻訳されたアミノ酸配列が、生殖系列遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質配列に対して修飾されるように、Ｖ/Ｊ/Ｃ遺伝子セグメントを含んでよい。
このようなライブラリは、異なる診断又は治療のための使用について最適化された特徴を有するTCRを構築するために用いることができる。Ｖ/Ｊ/Ｃ遺伝子セグメント内のフレームワーク残基又は領域における変化は、可溶性物質としてのTCRの発現のような様々なシナリオにおける発現又は安定性を増すために用いることができる。同様に、直接のHLA-抗原接触に関与しないフレームワークにおける変更は、TORESにより生成される再構成されたTCRのシグナル伝達能力を変更するために用いることができる。親和性タグ又は免疫原性配列も、下流の用途における再構成されたTCRの精製及び/又は検出を助けるように、フレームワーク内にコードされることができる。
Ｖ-Ｃエントリー及びＪドナーベクターライブラリは：
ａ．可変及び定常遺伝子セグメントの組合せをコードする１以上のＶ-Ｃエントリーベクターと、
ｂ．Ｊ遺伝子セグメントをコードする１以上のＪドナーベクターと、
所望により、
ｃ．制限消化/ライゲーション反応中の遊離のために一本鎖オーバーハングを有するか、予め露出されている(pre-exposed)か又はIIS型制限部位に挟まれており、Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターの一本鎖オーバーハングにマッチした１以上のodeCDR3又はodeCDR3の１以上のプールされたライブラリと、
所望により、
ｄ．陽性対照odeCDR3と同様に、制限消化/ライゲーション反応中の遊離のために一本鎖オーバーハングを有するか、予め露出されているか又はIIS型制限部位に挟まれており、Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターの一本鎖オーバーハングにマッチした１以上の標準化odeCDR3と、
所望により、
ｅ．参照としての予め組立てられた全長TCR ORFと
の組合せを含むキットに組立てることができ、ここで、ａ)及びｂ)は、意図する用途のために適切な未改変又は改変アミノ酸配列を有して、標的生物からの遺伝子セグメントの要求される遺伝的多様性をカバーし、ｃ)は、規定された又は多様化されたCDR3を有するTCR鎖の再構成のために用いられ、ｄ)は、再構成反応における陽性対照として用いられ、ｅ)は、該キットに含まれるＶ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターライブラリを用いて再構成された全長TCR ORFの下流の用途において陽性対照として用いられる。
第２の部分の装置インプットとしての第１の部分の装置アウトプットの定義
二部分装置全体の動作において、第１の部分(TORES)を用いて、規定される組込みベクターに関連付けて１以上のTCR鎖を作製する。TCRは、ヘテロ二量体複合体であるので、TORESが、TCR鎖対の各鎖についての２つの並行する組立てサブシステムを通常含む。よって、二部分装置の第１の部分としてのTORESは、各々がTCR鎖対の一方の鎖又はそのライブラリをコードする２つの組込みベクターを含む２つのアウトプットを作製する。TORESシステムの生成物成分2C及び2Eは、成分1AのＶ-Ｃエントリー骨格において提示される組込みベクターである。
二部分装置の第１の部分からのこれらのアウトプットは、二部分装置の第２の部分への直接のインプットとして用いられる(図1)。これらの第１の部分からのベクターアウトプット及び第２の部分へのインプットを、成分2C及び2Eと呼ぶ。これらのインプットの各々を、eTPC(成分2A)内でコードされるそれぞれゲノム受容部位成分2B及び2Dと対にして、２つの独立組込みカップルを形成する。
組込みカップルのこの対は、各組込み事象がTCR対の各鎖について単一TCR ORFだけを確実にもたらし、それにより、TCR表面タンパク質(TCRsp)の単一種を提示する標準化されたeTPC(eTPC-tと呼ぶ)が優先的に得られるように、互いに独立して単離される。
eTPCS:二部分装置の第２の部分
多成分eTPCシステム(eTPCS)を、図１の「パート２」に示す。多成分eTPCSは、装置の第１の部分から得られる２つのTCRコーディング組込みベクター、成分2C及び2Eと対にされる２つのゲノム受容部位、成分2B及び2Dを含む成分2Aと呼ばれる第１の成分eTPCを含む。全体として、TCR鎖の相補対を、組込みベクター(成分2C及び2E)を介してゲノム受容部位(成分2B及び2D)に導入することにより、eTPC(成分2A)を、TCR表面タンパク質(TCRsp)を発現するバリアントeTPC(eTPC-tと呼)に変換する(図８)。
eTPC、すなわち成分2Aは、システムの全ての他の成分が関係する多成分システムの基本成分である。よって、eTPCは、天然型である又は操作された或る特徴を含み、これらにより、eTPCは、被分析物eTPC-t集団及びその使用を創出するために用いるのに適切になる。
eTPC、成分2Aは、
ｉ．TCRアルファ、ベータ、デルタ及びガンマ鎖の内因性発現を欠き、
ii．細胞がTCR鎖の相補対を発現する場合にのみ細胞の表面で条件的に提示されるCD3 タンパク質を発現し、
iii．各部位にて１つの被分析物TCRアルファ、ベータ、デルタ又はガンマ鎖をコードする単一ORFの組込みのためのゲノム受容部位として、成分2B及び2Dと呼ばれる更なる改変を含み、
ここで、ｉ)は、前記発現を欠く天然に存在する細胞集団の選択により得ることができるか、又はそのような発現を欠くように操作されてよく、ii)は、前記発現を含む天然に存在する細胞集団の選択により得ることができるか、又はそのような発現を含むように操作されてよく、iii)は、eTPCのゲノムに固有の配列を用いることにより達成できるか、又は遺伝子工学の手段により導入してよい。
天然に存在する細胞集団からのTCRアルファ、ベータ、デルタ及びガンマ鎖を欠くeTPC細胞候補の選択は、当該技術において公知の方法により達成できる。TCRアルファ、ベータ、デルタ及びガンマ鎖に特異的な親和性反応剤を用いる標的細胞の染色、並びに細胞TCRアルファ、ベータ、デルタ及びガンマ鎖の選択がこれを直接達成できる。
TCRアルファ、ベータ、デルタ及びガンマ鎖発現を欠くようなeTPCの操作は、非標的化又は標的化手段により達成できる。細胞の非標的化変異誘発は、細胞に化学的、放射線又はその他の変異原を負荷し、次いで、標的TCRアルファ、ベータ、デルタ及びガンマ鎖の発現を欠く細胞を選択することにより達成できる。ゲノム遺伝子座の標的化変異は、限定されないが：
ｉ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ、
ii．CRISPR/Cas9媒介標的化、
iii．合成転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)
による部位特異的変異誘発を含む異なる手段により達成でき、ここで、前記部位特異的ヌクレアーゼは、部位特異的二本鎖DNA切断を誘発して、標的遺伝子座でのエラープローンDNA修復の機会を増やし、その後、変異細胞を、TCRアルファ、ベータ、デルタ及びガンマ鎖発現を欠く細胞の選択により得る。
CD3並びに成分2B及び/又は2Dの組込みのオプションは、当業者に公知であるが、相同性配向型組換え(HDR)及び/又は無作為組込み法を含んでよく、ここで、HDRは、HDRが生じるゲノム遺伝子座の標的化変異により促進でき、それらに限定されないが：
ｉ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ、
ii．CRISPR/Cas9媒介標的化、
iii．合成転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)
による部位特異的変異誘発を含む異なる手段により達成でき、ここで、前記部位特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子座にてHDRによる部位特異的DNA修復を誘発する。このような事象の後に、一部の細胞は、組み込まれたHDRベクターを有し、以下の任意の組合せにより選択及び/又は決定できる：
iv．非破壊的表現型発現解析
v．破壊的表現型発現解析
vi．遺伝子解析。
ここで、iv及びviは、成功したゲノム組込み事象の選択及び決定のための好ましい方法である。
或いは、ウイルスベクターを用いて、部位特異的又は非特異的様式で必要な成分を送達することができる。
eTPC成分2Aは、分析ワークフローにおいて被分析物抗原と共に用いるように設計されていことを考えると、好ましい態様では、eTPCは、このような分析に干渉するであろう因子を提示するeTPCを最小限にする特徴を含む。
eTPC成分2Aは、所望により、被分析物抗原提示複合体(aAPX)及び/又は被分析物抗原性分子(aAM)の少なくとも１ファミリーの内因性表面発現を欠き、表面発現の欠如は、標的被分析物抗原の適合させた分析(matched analysis)における干渉を最小限にするように選択される。
aAPXのファミリーは、以下のいずれであってもよい：
ｉ．HLAクラスＩ
ii．HLAクラスII
iii．非HLA抗原提示複合体。
aAMは：
ｉ．被分析物抗原性分子ORFから翻訳されたポリペプチド又はポリペプチドの複合体
ii．被分析物抗原性分子ORFから翻訳されたポリペプチドに由来するペプチド
iii．成分Ａプロテオームの変更に由来するペプチド
iv．成分Ａプロテオームの変更に由来するポリペプチド
ｖ．成分Ａメタボロームの変更に由来する代謝産物
から選択される。
成分2A eTPCは、所望により、Ｔ細胞共受容体を更に含んでよく、このような特徴により、被分析物eTPCの被分析物APCとの確固とした又は変動するコミュニケーションの形を許容し、調整可能なコミュニケーションは、特異的被分析物TCRsp及び/又は被分析物抗原の同定又は特徴決定のために適切である。
本発明の状況において、eTPC成分2Aは、所望により、CD4及び/又はCD8を発現してよく、ここで、CD4又はCD8の発現は、それぞれHLAII及びHLAI型の結合aAPXにeTPCを限定する。
eTPC成分2Aは、所望により、CD28及び/又はCD45を発現してよく、ここで、CD28及びCD45は、シグナル伝達に対するポジティブフィードフォワード効果によりシグナル感度に寄与するが、これらは、発現された被分析物TCRspによりシグナル伝達に関係するので、シグナル伝達に対するネガティブフィードバック効果によりシグナル特異性にも寄与する。
成分2A eTPCは、所望により、細胞表面接着分子成分の導入又は内因性細胞表面接着分子の除去を更に含んで、それぞれ、被分析物APCとのeTPCの結合及び免疫シナプスの形成を促進し、又はAPCが関与する分析ワークフロー内での堅固な結合及び有害な細胞クラスタリングの形成を回避することができる。
成分2Aに更なるORFとして導入できるか又は成分2Aから遺伝子的に除去され得るこのような接着分子は、接着タンパク質のインテグリンファミリーから選択できる。
eTPCは、eTPC:Aシステムを用いる分析ワークフロー(下記参照)内で、被分析物抗原反応剤の検出可能な結合により、又は同族抗原による刺激に対する天然型の若しくは操作されたeTPC中心の応答により、同族被分析物抗原の結合をアッセイするように設計されている。よって、発現されたTCRspの刺激からのシグナル伝達応答についての標準化されたレポーター読み出しがあることが望ましい。
eTPC成分2Aは：
ｉ．少なくとも１つの天然型プロモータ及び/又は少なくとも１つの合成プロモータと少なくとも１つのレポーターとを含む単一成分合成構築物
ii．少なくとも１つの天然型プロモータ及び/又は少なくとも１つの合成プロモータと少なくとも１つのレポーターとで設計された多成分合成構築物
から選択される2Fとよばれる成分である合成ゲノムTCR刺激応答エレメントを更に含むことができ、ここで、ｉ及び/又はiiの活性化は、合成経路、天然型経路又はその組合せから選択される少なくとも１つのシグナル伝達経路に依存する。
eTPCの一部としてゲノム受容部位と対をなすTCRをコードする組込みベクターは、成分2C及び2Eと呼ばれる。
これらの成分2C及び2Eの各々は、単一TCR鎖ORFをコードし、eTPCを、TCRspを発現するeTPC-tに変換するために要求される。
ベクターである成分2C又は2Eの各々は、ゲノム受容部位2B又は2Dのいずれかをそれぞれ標的にするように設計されている、コードされるTCR ORFを挟む５'及び３'遺伝子エレメントを有する。これらの組込みカップルは、2B-2C又は2D-2E組込みカップリング関係により決定されるように、１つのTCR ORFだけが各ゲノム受容部位に確実に挿入されるように互いにほどよく遮蔽されていなければならない。
上記のように、成分2C及び2Eは、装置の第１の部分であるTORESに由来する。よって、第１の部分ベクター骨格構造の特徴は、成分2A eTPCのゲノム受容部位である成分2B及び2Dにマッチしている。
上記のeTPCに含まれる組込みカップルの対は、一旦組み込まれたらゲノム受容部位から単一TCR鎖を除去するための部位の再利用を許容する特徴を有することが好ましい。
TCR ORFと非TCRsp発現構築物との間のこのようなサイクリングは、TCRの単一鎖を発現する中間体を作製するように、よってTCRsp発現がないように、eTPC-tにおいて発現される単一TCR ORFの交換を許容できる。この中間体は、eTPC-xと呼ばれる(図７を参照されたい)。このようなリサイクリングは、RCMEを行うようなリコンビナーゼ酵素を用いて達成できる。
ゲノム受容部位リサイクリングは、その他のリコンビナーゼ様酵素の使用、トランスポサーゼエレメントの使用、及び/又は部位特異的エンドヌクレアーゼを用いるか若しくは用いない相同組換えの使用によっても達成できる。
ゲノム受容部位である成分2B及び2Dは：
ｉ．リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)のために設計された合成構築物
ii．部位特異的相同組換えのために設計された合成構築物
から選択でき、ここで、ｉ)は、RMCEのためのゲノム受容部位の好ましい形である。RMCE法は、成分2B及び2Dが各々遮蔽された特異性を有するように、個別のリコンビナーゼ酵素に特異的な選択された異種特異的部位を採用してよい。
ゲノム受容部位である成分2B及び2Dは、以下の遺伝子エレメント：
ｉ．異種特異的リコンビナーゼ部位
ii．相同アーム
iii．真核生物プロモータ
iv．真核生物条件的調節エレメント
ｖ．真核生物ターミネータ
vi．選択マーカー
vii．スプライスアクセプター部位
viii．スプライスドナー部位
ix．タンパク質ノンコーディング遺伝子
ｘ．インスレータ
xi．可動遺伝子エレメント
xii．メガヌクレアーゼ認識部位
xiii．配列内リボソーム進入部位(IRES)
xiv．ウイルス自己切断型ペプチドエレメント
xv．コザックコンセンサス配列
の少なくとも１つから構成され、ここで、少なくともｉ)又はii)が含まれる。
好ましいゲノム受容部位は、以前に記載したエレメントのリストからの以下の選択されたエレメントを用いる２つの異なる配置から構成される。
第一の配置は、RMCE組込みにより、１つのTCR鎖と組込みの選択マーカーとをコードする単一ORFを受け入れるためであり、ここで、該配置は
５'-[Ａ] [Ｂ] [Ｃ] [Ｄ] [Ｅ] [Ｆ]-３'
であり、ここで、
Ａ)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモータであり、
Ｂ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位１であり、
Ｃ)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
Ｄ)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性コード化タンパク質マーカーであり、
Ｅ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位２であり、
Ｆ)は、エレメントｖ)真核生物ターミネータである。
第二の配置は、RMCE組込みにより、１以上のTCR鎖及び/又は組込みのための選択マーカーをコードする２つのORFを受け入れるためであり、ここで、該配置は：
５'-[Ａ] [Ｂ] [Ｃ] [Ｄ] [Ｅ] [Ｆ] [Ｇ] [Ｈ] [Ｉ]-３'
であり、ここで、
Ａ)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモータであり、
Ｂ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位１であり、
Ｃ)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
Ｄ)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性のコード化タンパク質マーカー１であり、
Ｅ)は、エレメントｖ)真核生物二方向転写ターミネータであり、
Ｆ)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性コード化タンパク質マーカー２であり、
Ｇ)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
Ｈ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位２であり、
Ｉ)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモータであり、
更に、この第二の配置において、エレメントＦ、Ｇ及びＩは、アンチセンス方向にコードされる。
成分2C及び2Eは、以下の遺伝子エレメント：
ｉ．異種特異的リコンビナーゼ部位
ii．相同アーム
iii．真核生物プロモータ
iv．真核生物条件的調節エレメント
ｖ．真核生物ターミネータ
vi．選択マーカー
vii．スプライスアクセプター部位
viii．スプライスドナー部位
ix．タンパク質ノンコーディング遺伝子
ｘ．インスレータ
xi．可動遺伝子エレメント
xii．メガヌクレアーゼ認識部位
xiii．配列内リボソーム進入部位(IRES)
xiv．ウイルス自己切断型ペプチドエレメント
xv．コザックコンセンサス配列
xvi．組込みの選択マーカー
xvii．抗生物質耐性カセット
xviii．細菌複製起点
xix．酵母複製起点
xx．クローニング部位
の少なくとも１つで構成される。
好ましい遺伝子組込みベクター成分2C及び成分2Eは、以前に記載したエレメントのリストからの以下の選択されたエレメントを用いる２つの異なる、可能性のある配置から構成される。
第一の配置は、RMCE組込みによる、１以上のTCR鎖及び/又は組込みの選択マーカーをコードする単一ORFの送達のためであり、ここで、該配置は
５'-[Ａ] [Ｂ] [Ｃ] [Ｄ] [Ｅ]-３'
であり、ここで、
Ａ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位１であり、
Ｂ)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
Ｃ)は、エレメントxx)TCR鎖及び/又はエレメントxvi)組込みの選択マーカーをコードする単一ORFのクローニング部位であり、
Ｄ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位２であり、
Ｅ)は、非特異的配向でのエレメントxvii)抗生物質耐性カセット及びエレメントxviii)細菌複製起点であり、
更に、エレメントviii及び/又はxivを、複数のTCR鎖及び/又はエレメントxviを一緒に連結するために用いてよい。
第二の配置は、RMCE組込みによる、１つのTCR鎖及び/又は組込みの選択マーカーをコードする１以上のORFの送達のためであり、ここで、該配置は：
５'-[Ａ] [Ｂ] [Ｃ] [Ｄ] [Ｅ] [Ｆ]-３'
であり、ここで、
Ａ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位１であり、
Ｂ)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
Ｃ)は、エレメントxx)少なくとも１つのTCR鎖及び/又はエレメントxvi)組込みの選択マーカーをコードする、真核生物ターミネータを有する、２つ以上のORFの導入のためのクローニング部位であり、
Ｄ)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列(アンチセンス方向)であり、
Ｅ)は、エレメントｉ)異種特異的リコンビナーゼ部位２であり、
Ｆ)は、特に方向が特定されないエレメントxvii)抗生物質耐性カセット及びエレメントxviii)及び/又は細菌複製起点であり、
更に、エレメントviii及び/又はxivを、多重TCR鎖及び/又はエレメントxviを各ORF内で一緒に連結するために用いてよい。
eTPC-tからeTPC-xへの変換(図７及び10を参照されたい)のための好ましい遺伝子組込みベクターである成分2Y及び成分2Zは、上記の2C及び2Eと同じ組込みベクターの要件を含み得るが、いずれのTCR鎖ORFもコードせず、好ましくは組込みのマーカーをコードする。
eTPC-x及びeTPC-tをコンパイルするための組込みカップルの使用
上記の多成分システムは、様々な様式で用いて、eTPC:Aシステムの分析又は準備のためのワークフロー内において被分析物TCRspを被分析物抗原に提示することに貢献する、別個の形の被分析物eTPC集団又はそのライブラリを調製できる。
予測可能なコピー数の１以上のORFのゲノム受容部位への効率的な組込みは、被分析物eTPC-t集団が迅速に調製及び特徴決定され得る標準化eTPCSの動作のために非常に有利である。よって、ゲノム受容部位及びカップリングさせた組込みベクターは、eTPCSの機能にとって重要である。成分2B及び成分2Dが、単一対のみの正しい組込み及び送達の高い可能性で、相補TCR鎖の単一対の導入が迅速で、繰り返し可能である上記のeTPC-tの調製方法に適することも望ましい。eTPC-x及び/又はeTPC-tを生成するための遺伝子組込みベクターとeTPCとの組合せは、幾つかの形態で達成できる(図７)。創出されるeTPC-t集団は、それを用いて候補抗原を分析する幾つかの起源から被分析物TCR鎖を誘導する必要がある。
TORES反応において用いる成分を規定するための被分析物TCR鎖配列情報の起源は：
ｉ．初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列のペア型クローニング(paired cloning)
ii．初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列の非ペア型クローニング
iii．合成TCR鎖ORF配列
から導くことができ、ここで、ｉ)は、胸腺選択を理由として、自己aAPX及び/又はaAPXカーゴに対して全般的に交差反応性である可能性が低い天然型TCRspの発見のために好ましく、ii)は、候補TCR親和性反応剤を同定するために用いることができ、iii)は、TCR親和性反応剤の親和性成熟又はTCR鎖のデノボ創出において用いることができる。
２つの組込みカップルを含む多成分システムを用いて、相補TCR鎖対の一方の鎖をコードする１つのORFと各々組み合わせた成分2C及び2Eを提供して、両方の被分析物TCR鎖がゲノム受容部位である成分2B又は2Dに組み込まれて2B'及び2D'を創出することにより、成分2AからeTPC-tを調製できる。得られる株化細胞は、提供されたTCR対を発現し、細胞表面にてTCRspとして提示される。eTPC-tは、２つの相補TCR鎖を同時に組み込んでTCRspを形成することにより調製できる(図８)。eTPC-tは、２つの相補TCR鎖を段階的に組み込んで、eTPC-x中間体を介してTCRspを形成することにより調製できる(図９)。
eTPC-xは、組込みのマーカーをコードするか又はORFをコードしない更なる組込みベクターの一方である成分2Y又は2Zを提供することにより、eTPC-tから調製できる(図10)。成分2Y又は2ZをeTPC-tと組み合わせることにより、いずれかの部位が交換されて、eTPC-xを発現する単一TCR鎖が得られる。
eTPCからの被分析物eTPC-x及び/又はeTPC-t集団の調製の上記の例において、多成分システム(eTPCS)は、規定された方法で既知の被分析物TCR鎖を提供して、規定されたTCRspを発現する被分析物eTPCの分離した集団を調製するために用いられる。このようなプロセスを多数回繰り返して、分析又は調製用ワークフローへのインプットとしてのeTPC-x及び/又はeTPC-tのライブラリを構築できる。代替のアプローチは、遺伝子組込みベクターと組み合わせた被分析物TCR鎖のプールしたライブラリを取り、これらをショットガン様式で組み込んで、被分析物eTPC-tのプールしたライブラリを得ることであり、該ライブラリにおいて、各eTPC-tは、単一種のTCRspを発現するが、まとめてプールとして複数種のTCRspを提示する(図11〜14を参照されたい)。このことは、被分析物抗原に対する候補TCRspの大きいライブラリを分析する場合に特に有用である。
２つの組込みカップルを含むeTPCSを用いて、単一被分析物TCR鎖のプールをコードする複数のORFのライブラリと組み合わせた成分2Cを提供することにより、成分2Aから一工程でeTPC-tプールを調製して、各細胞内で各対が部位2Bに組み込まれて2B'を創出できる。同時に、成分2Cにおいて提供された第１のライブラリに相補的な単一被分析物TCR鎖のプールをコードする複数のORFのライブラリと組み合わせた成分2Eを、各細胞内で各被分析物相補的TCR鎖が部位2Dに組み込まれて2D'を創出するように、提供する。eTPC-tプールにおいて得られる各細胞は、相補被分析物TCR鎖の無作為化された単一選択を有して、プール内の各細胞がユニーク無作為化TCRspを発現するようにする。このようなプールされたライブラリは、C'及びE'に進むセットからの提供される相補TCR鎖の全ての可能な組合せを含み得る(図11)。
２つの組込みカップルを含むeTPCSを用いて、以前に得られたe-TPC-xから一工程でeTPC-tプールを調製でき、ここで、部位2Bは2B'に変換され、単一被分析物TCR鎖を含む。eTPC-tは、提供される成分2Eライブラリの各TCR鎖が部位2Dに単一で組み込まれて2D'を創出するように、既に組み込まれた鎖に相補的な単一被分析物TCR鎖のプールをコードする複数ORFのライブラリと組み合わせた成分2Eを提供することにより調製する。eTPC-tプールにおいて得られる各細胞は、出発eTPC-xにより提供される被分析物TCR鎖と、相補被分析物TCR鎖の無作為化された単一選択とを有して、プール内の各細胞がユニークTCRspを発現するようにする。このようなアプローチは、相補TCR鎖対において固定した鎖に対して単一鎖を変動する影響について分析する場合に用いられる(図12)。
２つの組込みカップルを含むeTPCSを用いて、eTPC-xプールを調製してよい。eTPC-xは、相補鎖を割愛した単一被分析物TCR鎖のプールをコードする複数のORFのライブラリと組み合わせた成分2Cを提供することにより調製して、各細胞内で提供した成分2Cライブラリの各TCR鎖が、部位2Bに組み込まれて2B'を創出するようにする。eTPC-xにおいて得られる各細胞は、相補被分析物TCR鎖の無作為化された単一選択を有して、プール内の各細胞がユニーク単一TCR鎖を発現するようにする(図13)。このようなアプローチは、以前の例と同様に第２の組込みカップルを介して組み込まれる単一又は複数の相補TCR鎖に対してアッセイするeTPC-xを調製する場合に用いられる(図14)。
eTPC-x又はそのライブラリは、ターゲットアッセイにおいてTCRsp誘導体を迅速にスクリーニングするために、eTPC-xにおける、2B'に組み込まれたTCR ORFに相補的なTCR鎖ORFの一過性トランスフェクションのために用いることができる。
被分析物抗原との被分析物eTPC-tの接触
本発明は、まとめてeTPC:抗原(eTPC:A)システムと呼ばれる分析装置のコンパイルのために、分析eTPC-t集団を導くために用いられる二部分装置を形成する２つの多成分システムを提供することに関する(図24)。二部分装置内で、第１の部分は、組込みベクターの状況においてTCR ORFを導くために用いられ、これらを次いで第２の部分を含むマッチしたeTPCに挿入する。よって、二部分装置の作動は、成分1A、1B及び1Cの各々の１以上を用いて、１以上の成分2C及び2Eを導くことを必然的に伴い、これらを、少なくとも成分2B及び2Dを含む成分2Aと共に用いて、１以上のeTPC-tをコンパイルする。これらの被分析物eTPC-tを、次いで、１以上の被分析物抗原と分析eTPC:Aシステム内で組み合わせて、１以上のアウトプットを得る。被分析物抗原は、被分析物抗原提示細胞(APC)により、及び/又は可溶性若しくは固定化された親和性反応剤として提供されるか、及び/又は非細胞ベースの粒子(NCBP)上に提示される。
被分析物抗原は、TCRがeTPC:Aシステムにおいて推定上結合できる任意の物体であり：
ｉ．aAPX(被分析物抗原提示複合体)及び/又は
ii．aAM(被分析物抗原性分子)及び/又は
iii．aAPX:aAM(被分析物抗原性分子を提示する被分析物抗原提示複合体)及び/又は
iv．CM(非被分析物カーゴ分子)及び/又は
ｖ．aAPX:CM(カーゴ分子を提示する被分析物抗原提示複合体)
であることができ、ここで、aAPXは、aAMを提示できる複合体であり、aAMは、TCRにより直接認識されるか又はaAPXに積載された場合にTCRにより認識される任意の分子であり、aAPX:aAMは、aAMを積載したaAPXであり、CMは、aAPXに積載され得るが、被分析物でないので、被分析物抗原提示細胞(APC)又はアッセイシステム自体に由来し得るカーゴ分子であり、aAPX:CMは、CMが積載されたaAPXである。
これらの形の被分析物抗原は、eTPC:Aシステム内で異なる形態でeTPCに提示されることができ、
ｉ．被分析物抗原提示細胞(APC)及び/又は
ii．可溶性又は固定化された親和性反応剤及び/又は
iii．非細胞ベースの粒子(NCBP)
として表されることができ、ここで、被分析物抗原提示細胞(APC)は、抗原をeTPC-tに対して提示できる任意のAPCとみなされ、親和性反応剤は、eTPC:AシステムにおいてeTPC-tの細胞表面でのTCRsp結合及び/又は刺激をプローブするための被分析物として調製される任意の反応剤とみなされる。このような反応剤は、しばしば、被分析物抗原性分子(aAM)、被分析物抗原提示複合体(aAPX)又はaAMを積載したaAPX(aAPX:aAM)である。aAPX:aAMの典型的な例は、TCRを染色するために用いられるpHLA-多量体反応剤(例えば「四量体」)である。この状況における親和性反応剤も、抗体又は同様の物体であり得る。非細胞ベースの粒子(NCBP)は、親和性反応剤と同様の様式で機能するが、これは、粒子が、被分析物抗原又はeTPC:Aシステム内においてeTPC-tの表面でのTCRsp結合について評価されるその他の物体であるからである。しかし、NCBPは、提示される被分析物抗原又はその他の結合物体そのまま又はその代理として識別子として機能する、遺伝的又はその他の情報を更に有することができるより大きい物体とみなされる。NCBPの典型的な例は、ファージディスプレイのシナリオにおけるバクテリオファージであり、ここで、ファージは、抗体断片抗原結合(FAB)をディスプレイし得る。ポジティブに標識されたeTPC-tは、ファージと共に回収でき、シーケンシングして、eTPC-tの表面にてTCRspに特異的なFABを同定できる。
分析eTPC:Aシステムは、１以上の被分析物抗原と１以上のeTPC-t集団の選択で構成される(図24)。被分析物eTPC-t集団は、上記の多成分システムを用いて調製される(図１〜14)。eTPC:Aシステムは、被分析物抗原と被分析物eTPC-t集団との間の物理的接触を許容するフォーマットで提供され、ここで、このような接触は、１以上の被分析物抗原と１以上の被分析物eTPC-tのTCRspとの間の複合体形成を許容し、ここで、被分析物抗原は、以下：
vi．aAPX(被分析物抗原提示複合体)及び/又は
vii．aAM(被分析物抗原性分子)及び/又は
viii．aAPX:aAM(被分析物抗原性分子を提示する被分析物抗原提示複合体)及び/又は
ix．CM(非被分析物カーゴ分子)及び/又は
x．aAPX:CM(カーゴ分子を提示する被分析物抗原提示複合体)
のいずれかであり、ここで、被分析物抗原は、複合体形成がこのような複合体の安定化を導き得るように被分析物APCにより提示されるか、又は可溶性及び/若しくは固定化された親和性反応剤又はNCBPにより提示され、該複合体形成は、eTPC-tの観察可能な標識化及び/若しくは含まれる場合に成分2Fによる被分析物eTPC内のシグナル伝達の誘導、並びに/又は被分析物APCにおける観察可能なシグナルを導き、これは測定できる。
本発明の状況において、eTPC:Aシステムは：
ｉ．単一被分析物eTPC-tのインプット又は
ii．被分析物eTPC-tのプールされたライブラリのインプット
で構成され、以下：
iii．単一被分析物APCのインプット、又は
iv．単一被分析物親和性反応剤のインプット、又は
ｖ．単一被分析物NCBPのインプット、又は
vi．被分析物APCのプールされたライブラリのインプット、又は
vii．被分析物親和性反応剤のプールされたライブラリのインプット、又は
viii．被分析物NCBPのプールされたライブラリのインプット
の１つと組み合わされる。
緩衝液システムでの接触
被分析物APCと被分析物eTPC-tとの間の接触は、許容細胞培養又は緩衝液システムで行われ、ここで、前記システムは、被分析物APC及び被分析物eTPC-t細胞の両方の機能を許容する媒体を含む。
可溶性被分析物親和性、固定化された親和性反応剤及び/又は被分析物NCBPと被分析物eTPC-tとの間の接触は、許容緩衝システムで行われ、ここで、前記システムは、被分析物抗原及び被分析物eTPC-t細胞の両方の機能を許容する緩衝媒体を含む。
親和性反応剤又はNCBPでのeTPC-tの標識化
二部分装置から得られる被分析物eTPC-tは、eTPC-tにより提示されるTCRspの特徴決定のために用いることができる。このような特徴決定は、被分析物eTPC-tが固定化された若しくは可溶性親和性反応剤又は非細胞ベースの粒子(NCBP)と接触して、eTPC-tが標識されるような様式で行うことができる(図15)。
標識化は、フローサイトメトリ、顕微鏡観察、分光分析若しくは発光分析のような方法による標識の直接観察により、又は固定化された親和性反応剤若しくはNCBPでの捕捉により検出されることが考えられる。同様の様式で、親和性反応剤又はNCBPは、含まれるならばレポーターエレメントである成分2Fを刺激できる。成分2Fの刺激は、同定のためにeTPC-t及び/又は親和性反応剤若しくはNCBPの選択を可能にする(図16)。
シグナル応答定義
二部分装置から得られる被分析物eTPC-tは、被分析物TCRspを発現する被分析物eTPC-tの被分析物抗原に対するシグナル応答の特徴決定のために用いられ、ここで、このようなシグナル応答は、二値(binary)又は徐々に変化するもののいずれかであってよく、eTPC-tに固有(図15、16及び17)及び/又は含まれるならばAPCに固有(図18)として測定され得る。このようなシグナルは、フローサイトメトリ、顕微鏡観察、分光分析若しくは発光分析又は当業者に既知のその他の方法のような方法により検出できる。
シグナル応答を有するAPCとの接触
被分析物APCは、eTPC:Aシステム内においてeTPC-tと接触することもできる。一般的に、応答は、eTPC-t内でレポートされるシグナルにより測定される(図17)が、APC内でレポートされるシグナルにより測定することもできる(図18)。
一般的な方法-eTPC-tの選択
eTPC:A組合せシステムからのインプット被分析物eTPC-t又は被分析物eTPC-tのライブラリから１以上の被分析物eTPC-tを選択して、１以上の被分析物eTPC-tを得る方法であって、発現されるTCRspが１以上の被分析物抗原と結合する方法は：
ｉ．１以上の被分析物eTPC-tと１以上の被分析物抗原とを組み合わせて、被分析物TCRspと被分析物抗原との間の接触をもたらすことと、以下の少なくとも１つ：
ii．もしあるならば、１以上の被分析物TCRspと１以上の被分析物抗原との間の複合体の形成を測定すること、及び/又は
iii．標識被分析物抗原からのシグナルを測定すること、及び/又は
iv．もしあるならば、１以上の被分析物TCRspと１以上の被分析物抗原との間の複合体の形成により誘導される被分析物eTPC-tによるシグナル応答を測定すること、及び/又は
ｖ．もしあるならば、１以上の被分析物TCRspと１以上の被分析物抗原との間の複合体の形成により誘導される被分析物APCによるシグナル応答を測定することと、
vi．工程ii、iii、iv及び/又はｖに基づく１以上の被分析物eTPC-tを選択することであって、選択が、ポジティブ及び/又はネガティブ測定により行われることと
を含み、ここで、ｉ、iv及びvi又はｉ,ｖ及びviは、好ましい仕組みを含む。
一般的な方法-被分析物抗原の選択
インプット被分析物抗原又は被分析物抗原のライブラリから１以上の被分析物抗原を選択して１以上の被分析物抗原を得る方法であって、発現される被分析物抗原が、被分析物eTPC-tにより提示される１以上の被分析物TCRspと結合する方法は：
ｉ．１以上の被分析物抗原と１以上の被分析物eTPC-tとを組み合わせて、被分析物抗原により提示される被分析物抗原と１以上の被分析物eTPC-tの被分析物TCRspとの間の接触をもたらすことと、
ii．もしあるならば、１以上の被分析物抗原と１以上の被分析物TCRspとの間の複合体の形成を測定することと、及び/又は
iii．標識被分析物抗原からのシグナルを測定することと、及び/又は
iv．もしあるならば、被分析物TCRspと被分析物抗原との間の複合体の形成により誘導される１以上の被分析物eTPC-tにおけるシグナル応答を測定することと、及び/又は
ｖ．もしあるならば、１以上の被分析物TCRspと１以上の被分析物抗原との間の複合体の形成により誘導される被分析物APCによるシグナル応答を測定することと、
vi．工程ii、iii、iv及び/又はｖからの１以上の被分析物抗原を選択することであって、選択が、ポジティブ及び/又はネガティブ測定により行われることと
を含み、ここで、ｉ、iv及びvi又はｉ,ｖ及びviは、好ましい仕組みを含む。
シグナル応答についての一般的な方法
レポートされるシグナル応答に基づいてeTPC:A組合せシステムから被分析物eTPC-t及び/又は被分析物APC及び/又は親和性反応剤及び/又はNCBPを選択する方法は：
ｉ．天然型シグナル伝達応答を決定することと、及び/又は
ii．eTPC-tが成分2Fを含むならば、及び/又はAPCが等価な合成レポーターエレメントを含むならば、合成シグナル伝達応答を決定することと
を含む。
APC及び/又はeTPC-tに固有の、誘導される天然型又は合成シグナル応答は、以下：
ｉ．分泌された生体分子
ii．分泌された化学物質
iii．細胞内生体分子
iv．細胞内化学物質
ｖ．表面発現生体分子
vi．被分析物APCに対する被分析物eTPC-tの細胞傷害性作用
vii．シグナル応答が被分析物APCにより誘導され、ｉ〜ｖのいずれかの増加又は減少を検出することにより決定されるような被分析物APCに対する被分析物eTPC-tの傍分泌作用
viii．被分析物eTPC-tの増殖
ix．被分析物eTPC-tと被分析物APCとの間の免疫シナプス
の１以上の増加又は減少を検出することにより測定され、ここで、前記検出されるシグナル応答は、eTPC:A組合せシステム、及び/又は並行組立て組合せシステムの組立ての前の、被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tに固有の非誘導シグナル応答状態と比較され、ここで、被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tは、用いるeTPC:A組合せシステム内でシグナル応答を誘導しないことがわかっている対照被分析物抗原及び/若しくは被分析物TCR種並びに/又は可溶性被分析物抗原を提示し得る。
標識化及び/又はシグナル応答による選択の方法
eTPC:A組合せシステムから、親和性反応剤又はNCBPによるeTPC-tの測定可能な標識化に基づいて被分析物eTPC-t及び/又は被分析物親和性反応剤及び/又は被分析物NCBPを選択する方法は：
ｉ．親和性反応剤又はNCBPによるeTPC-tの標識化を決定する
ことを含み、
ii．天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
iii．eTPC-tが成分2Fを含むならば、合成シグナル伝達応答を決定すること
も含んでよく、ここで、eTPC-tの標識化を検出することによりeTPC-t及び/又は親和性反応剤及び/又はNCBPを選択することは、親和性反応剤及び/又はNCBPに検出可能な標識を含ませることによる、親和性反応剤及び/又はNCBPによるeTPC-tの表面標識化の検出を含んでよい。このような検出可能な標識は、蛍光、発光、分光、化学、放射化学、又は親和性部分であってよい。よって、eTPC-tのこのような選択は、FACS、MACS又は等価なハイスループットスクリーニング及び選択方法に基づいて行ってよい。
まとめ
eTPC:A組合せシステム内で、１以上の被分析物eTPC-t若しくは１以上の被分析物APCにおけるシグナル応答の測定、又は被分析物TCRspと被分析物抗原との間の複合体の形成により媒介され得るeTPC-tの標識化は、一次システムアウトプットの選択のために重要であり(図24工程ｖ)、ここで、一次システムアウトプットは、単一細胞若しくは細胞プール、及び/又は単一親和性反応剤若しくは親和性反応剤のプール、及び/又は単一NCBP若しくはNCBPのプールである。
細胞又は反応剤の選択は、接触させた被分析物APC若しくは被分析物eTPC-t細胞のいずれか及び/又は両方におけるレポートされるシグナル応答の存否に対して、或いは親和性反応剤若しくはNCBPでのeTPC-tの測定可能な標識化により行うことができる。
eTPC:Aシステムからの一次システムアウトプットの取得
本発明は、被分析物eTPC-tが導かれる二部分装置の提供に関する。これらの被分析物eTPC-tは、次いで、上記のように、eTPC:Aシステムにより１以上の被分析物抗原と組み合わされて、１以上のアウトプットを得る。被分析物抗原は、被分析物抗原提示細胞(APC)により、及び/又は可溶性若しくは固定化された被分析物抗原として提供されるか、並びに/或いは非細胞ベースの粒子(NCBP)上に提示される。システムは、１以上の被分析物抗原と１以上のeTPC-t集団の選択で構成される(図24)。eTPC:Aシステムは、被分析物抗原と被分析物eTPC-t集団との間の物理的接触を許容するフォーマットで提供され、ここで、このような接触は、１以上の被分析物抗原と１以上の被分析物eTPC-tのTCRspとの間の複合体の形成を許容し、ここで、被分析物抗原は、以下：
ｉ．aAPX及び/又は
ii．aAM及び/又は
iii．aAPX:aAM及び/又は
iv．CM及び/又は
ｖ．aAPX:CM
のいずれかであり、ここで、被分析物抗原は、被分析物APCにより提示されて提供されるか、或いは可溶性及び/若しくは固定化された被分析物親和性反応剤又は被分析物NCBPにより提示され、複合体の形成は、そのような複合体の安定化を導くことができ、eTPC-tの標識化及び/又はもし含まれるならば被分析物eTPC内のシグナル伝達の誘導を導くか、並びに/或いは被分析物APCがレポート及び測定され得る。
誘導されたシグナル応答のレポート、及び/又はeTPC-t標識化の形態は上述の通りであり、eTPC:Aシステムにコンパイルされる二部分装置の一次アウトプットの取得において測定されるために必要なのは、これらの報告される応答及び/又は標識化である。
eTPC:Aシステムからの一次アウトプットは、選択された細胞集団及び/又は選択された親和性反応剤若しくは選択されたNCBPであり、ここで、選択は：
ｉ．親和性反応剤若しくはNCBPによるeTPC-tの測定可能な標識化、及び/又は
ii．eTPC-tにおいて検出されるシグナル応答、及び/又は
iii．eTPC-tにおける検出されるシグナル応答の欠如、及び/又は
iv．被分析物APCにおいて検出されるシグナル応答、及び/又は
ｖ．被分析物APCにおいて検出されるシグナル応答の欠如
に基づいて行われ、ここで、一次アウトプットは、単一細胞、又は細胞のプール及び/又は１以上のeTPC-t関連親和性反応剤若しくはNCBPとして表すことができる。
eTPC:A組合せシステムから、被分析物親和性反応剤、NCBP若しくは被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tを、接触細胞における応答に基づいて選択できる。つまり、被分析物APCは、接触している被分析物eTPC-tにおける、レポートされる応答又はその欠如に基づいて選択できる。逆に、被分析物eTPC-tは、接触している被分析物抗原における、レポートされる応答又はその欠如に基づいて選択できるか、或いは被分析物抗原が被分析物親和性反応剤又はNCBPである場合は、被分析物親和性反応剤又はNCBPは、eTPC-t応答から選択できる。
システムからの一次APCアウトプットは、選択された細胞であり、ここで、選択は、被分析物APC又はeTPC-tのいずれかにおけるレポートされるシグナル応答の存否に基づいて行われ、これらの細胞は、APC及び/又はeTPC-tの１以上を含んでよく、ここで、選択された細胞は、単一細胞、同じアイデンティティの細胞のプール又は異なるアイデンティティの細胞のプールを含んでよい(図24工程ｖ)。
システムからの一次eTPC-tアウトプットは、選択された細胞であり、ここで、選択は、レポートされるシグナル応答の存否に基づいて行われ、これらの細胞は、eTPC-tを含み、ここで、選択された細胞は、単一細胞、同じアイデンティティの細胞のプール又は異なるアイデンティティの細胞のプールを含んでよい(図24工程ｖ)。
システムからの一次被分析物親和性反応剤又はNCBPアウトプットは、親和性反応剤又はNCBPが結合しているか又はしていない選択された細胞であり、ここで、選択は、被分析物eTPC-tによる標識化又はレポートされるシグナル応答の存否に基づいて行われ、ここで、選択された親和性反応剤又はNCBPは、単一親和性反応剤若しくはNCBP、同じアイデンティティの親和性反応剤若しくはNCBPのプール又は異なるアイデンティティの親和性反応剤若しくはNCBPのプールを含んでよい(図24工程ｖ)。
eTPC:A組合せシステムにおける被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tにおけるレポートされるシグナルは、被分析物細胞集団又は被分析物親和性反応剤又はNCBPを選択して、一次アウトプットを提供するために用いてよい。
APC及び/又はeTPC-t型の一次アウトプットは、二元システムから所望の被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-t集団を選択することにより、eTPC:A組合せシステムが二元培養の性質(例えば図15〜18)のものである場合に達成できる。
eTPC-tの一次アウトプットは、eTPC:A組合せシステムが、被分析物親和性反応剤若しくはNCBPで標識化されたか、或いはeTPC:Aシステム内で被分析物親和性反応剤若しくはNCBP又は被分析物APCにより活性化できる所望の被分析物eTPC-t集団を選択することにより、１以上の被分析物eTPC-tと被分析物抗原(例えば図19〜21)の二元組成のものである場合に達成できる。
被分析物親和性反応剤又はNCBPの一次アウトプットは、eTPC:Aシステムからの被分析物親和性反応剤又はNCBPにより誘導化されるシグナルで標識化されているか、及び/或いは該シグナルを有する所望の被分析物eTPC-t集団を選択することにより、eTPC:A組合せシステムが、１以上の被分析物eTPC-tと被分析物親和性反応剤又はNCBP(例えば図21)との二元組成のものである場合に達成できる。
APCの一次アウトプットは、被分析物APC内での応答の検出又はその欠如に基づいて被分析物APCを選択することにより、eTPC:A組合せシステムが、固定された被分析物eTPC-t及びプールされたライブラリ被分析物APC(例えば図22)のものである場合に達成できる。
eTPC:Aシステムからアウトプットを取得する形態
一次アウトプットを得ることができる幾つかの異なる形態があり、ここで、各形態は、選別の工程を伴う。選別は、蛍光標示式細胞選別(FACS)及び/又は磁気標示式細胞選別(MACS)及び/又は異なる親和性標示式細胞選別方法により達成してよい。
一次アウトプットAPC及び/又はeTPC-t細胞、並びに/或いはeTPC関連親和性反応剤又はNCBPは、単一細胞選別により得て、単一細胞を得てよいか、及び/又はプールへの細胞選別により得て、細胞のプールを得てよい。
一次アウトプットAPC及び/又はeTPC-t細胞は、単一細胞選別により得て、単一細胞を得てよく、所望により、単一細胞を次いで増殖させて、選択されたAPC又はeTPC-t細胞のモノクローナルプールを得てよい。
一次アウトプットAPC及び/又はeTPC-t細胞は、プールへの細胞選別により得て、細胞のプールを得てよく、所望により、細胞のプールを次いで成長させて、選択されたAPC及び/又はeTPC-t細胞のプールを得てよい。
eTPC:Aシステムからの終端システムアウトプットの取得
一次アウトプットが、測定されるシグナル応答又は安定な複合体形成に基づいて選択される選択された被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tである一次アウトプットを取得する上記の方法に続いて、eTPC:Aシステムからの終端アウトプットを、選択されたAPC及び/又はeTPC一次アウトプットの更なる処理により得ることができる。
この関係において、多成分システムからの終端アウトプットは、被分析物APC又は被分析物eTPC-t又は被分析物親和性反応剤若しくはNCBPにより提示され、eTPC:A組合せシステムからのそれらの選択により多成分システムからの一次アウトプットとして得られる：
ｉ．aAPX及び/又は
ii．aAM及び/又は
iii．aAPX:aAM及び/又は
iv．CM及び/又は
ｖ．aAPX:CM及び/又は
vi．TCRsp
のアイデンティティである。
eTPC:Aシステム内で、被分析物APC及び被分析物eTPCにより提示される被分析物分子が遺伝子にコードされている場合が頻繁にある。例えばバクテリオファージによりディスプレイされるNCBPの場合、被分析物NCBPが遺伝子にコードされるアイデンティティを有する場合もそうである。よって、被分析物APC又は被分析物eTPC-tにより提示される被分析物分子を同定するために、調製した被分析物APC、eTPC-t及び被分析物NCBPの遺伝子シーケンシングを行ってよい。
APCは、選別された及び/又は増殖させたAPC細胞のゲノム又はトランスクリプトームについての遺伝子配列を得て：
ｉ．aAPX及び/又は
ii．aAM及び/又は
iii．aAPX:aAM
iv．CM及び/又は
ｖ．aAPX:CM
のアイデンティティを決定するように処理してよく、ここで、得られるアイデンティティは、eTPC:Aシステムからの終端アウトプットを表す。この関係において、遺伝子成分を有する被分析物NCBPは、選別及び/又は増殖された被分析物NCBPのゲノム又はトランスクリプトームについての遺伝子配列が得られて、被分析物NCBPのアイデンティティを決定するように処理してよく、ここで、得られるアイデンティティは、eTPC:Aシステムからの終端アウトプットを表す。
eTPC-tは、選別及び/又は増殖されたeTPC-t細胞の成分2B'及び/又は成分2D'についての遺伝子配列を得て、TCRspのアイデンティティを決定するように処理してよく、ここで、TORESにより作製されるTCRspの得られるアイデンティティは、eTPC:Aシステムからの終端アウトプットを表す。
eTPCは、選別及び/又は増殖されたeTPC-t細胞のゲノム又はトランスクリプトームについての遺伝子配列を得て、TCRspのアイデンティティを決定するように処理してよく、ここで、TCRspの得られるアイデンティティは、eTPC:Aシステムからの終端アウトプットを表す。
遺伝子シーケンシングは、様々な形態で、様々な遺伝子材料起源から、特定の処理あり又はなしで達成できる。
この関係において、シーケンシング工程の前に
ｉ．ゲノムDNAを抽出すること、及び/又は
ii．成分2B'及び/又は2D'RNA転写産物を抽出すること、及び/又は
iii．成分2B'及び/又は2D'をコードするDNAをPCRにより増幅すること、
iv．成分2B'及び/又は2D'に由来するRNA転写産物をRT-PCRにより増幅すること
を行ってよい。
シーケンシング工程は、多成分システムからの一次アウトプットとして得られるAPC若しくはeTPC-t若しくは被分析物NCBP又はそれらのプールに対して破壊的であってよい。
シーケンシング工程が一次アウトプットeTPC-tに対して破壊的であるeTPC:Aシステムから一次アウトプットを得ることが望ましいならば、二部分装置の終端アウトプットとして得られる配列情報を用いて、被分析物eTPC-tと等価なアウトプットeTPC-tを調製してよい。
遺伝子によりコードされる被分析物分子の上記のシナリオにおいて、eTPC:Aシステムの終端アウトプットは、成分2B'及び/若しくは2D'並びに/又は細胞ゲノム及び/若しくはトランスクリプトームから配列情報を得ることにより得てよい。しかし幾つかの実施形態では、抗原情報は、遺伝子によりコードされない。翻訳後修飾された抗原、非遺伝子的手段によりeTPC:A組合せシステムに提供される抗原、被分析物APCプロテオーム又は代謝産物の誘導又は改変された状態から現れる抗原、eTPC:Aシステムに固有のCM、及び遺伝子エレメントのない親和性反応剤又はNCBPは、遺伝子シーケンシング手段により適度に同定されない場合がある。
非遺伝子手段によりeTPC:Aシステムに提供され得るaAMの重要な場合において、提供されたaAMをaAPX:aAM複合体としてAPCが提示し得る２つの異なる形態が存在する。第１のシナリオにおいて、aAMは、aAPXと直接結合でき、細胞表面にてaAPX:aAM複合体を形成する形で提供される。このようなaAMの例は、HLA複合体のためのペプチド抗原である。第二のシナリオにおいて、aAMは、被分析物APCにより取り込まれることができ、aAPX内のカーゴとして積載され、細胞表面にてaAPX:aAM複合体を形成するようにプロセシングされる形で提供される。
aAMカーゴ又はCMカーゴを選択して同定する方法であって、前記カーゴが、多成分システムの一次アウトプットとして選択されて得られるAPCのaAPXに積載される代謝産物及び/又はペプチドである方法は、
ｉ．aAPX:aAM又はaAPX:CM又はカーゴaM又はカーゴCMを単離することと、
ii．積載されたカーゴを同定することと
を含み、前記同定される積載されたカーゴ(CM又はaAM)は、二部分装置の終端アウトプットである。
選択されたAPCからカーゴ分子を同定できる２つの形態が一般的に存在する。第一に、aAPX:aAM又はaAPX:CMからのカーゴの強制的な遊離により、その後の同定のために利用可能なaAM又はCMが単離される。この例は、HLA複合体からペプチドaAMを自由にするAPCの酸洗浄である。第二に、複合体を自由にすること及び免疫親和性単離法による例えばaAPX:aAM又はaAPX:CMの捕捉により、aAM又はCMが同定できるようにaAPX:aAM又はaAPX:CM複合体が単離される。
単離aAM及び/若しくはCMを直接、又は単離aAPX:aAM若しくはaAPX:CM複合体から同定する方法は：
ｉ．質量分析
ii．ペプチドシーケンシング分析
を含むことができ、ここで、含まれるaAM及び/又はCMアイデンティティは、二部分装置からの終端アウトプットである。
eTPC:Aシステムとして二部分装置を用いる、被分析物抗原についてのTCRspの親和性の決定
一次アウトプットを得る上記の方法であって、一次アウトプットが、測定されるシグナル応答に基づいて選択される、選択された被分析物eTPC-t細胞である方法の後に、eTPC-t一次アウトプットを親和性分析に供して、同族被分析物抗原に対するTCRspの親和性を決定してよく、ここで、被分析物抗原は、以下：
ｉ．aAPX及び/又は
ii．aAM及び/又は
iii．aAPX:aAM及び/又は
iv．CM及び/又は
ｖ．aAPX:CM
のいずれかであり、ここで、被分析物抗原は、被分析物TCRspの親和性が以下の方法：
ｉ．選択された被分析物eTPC-tを、濃度の範囲の被分析物抗原で標識すること、
ii．工程ａの染色した被分析物eTPC-tに対してFACS分析を行うこと、
iii．濃度の範囲の被分析物抗原に対する被分析物eTPC-tの蛍光標識化の強度を決定すること、
iv．被分析物抗原に対するTCRspの親和性を算出すること
により決定されるように、可溶性親和性反応剤として提供されるか又は被分析物APC若しくは被分析物NCBPにより提示される。
被分析物TCRspの親和性は、親和性が参照蛍光強度に対する被分析物抗原蛍光強度の比率を用いて算出されるように、標識された参照が含まれ得る以前に記載された方法によって決定でき、ここで、標識された参照は：
ｉ．被分析物TCR鎖の一方又は両方の被分析物TCR鎖に対する親和性反応剤で標識された被分析物eTPC-t、
ii．１以上のCD3タンパク質に対する親和性反応剤で標識された被分析物eTPC-t
iii．標識された参照単一TCR鎖又は標識された参照TCR鎖対を提示する細胞又は粒子
から選択される。
TCR ORF再構成及び操作システム(TORES)と、操作されたTCR提示細胞システム(操作されたTCRを提示する細胞システム；eTPCS)とを含む二部分装置。 二部分装置の「パート１」は、TCR ORF再構成及び操作システム(TORES、上のパネル)である。このシステムは、固定配列のライブラリベースの二成分ベクターシステムであり、これは、非固定配列の第３の成分と組み合わせた場合に、TCR ORFを再構成及び多様化するために用いられる。TCR ORF再構成システムの全体的なライブラリ特徴の機能を、上のパネルに示す。単一Ｖ-Ｃエントリーベクターは、変動するＶ-Ｃ組合せを有するＶ-Ｃエントリーベクターのライブラリから選択される(成分1A)。この選択は、選択されたTCR鎖について必要なＶ-Ｃ組合せ配列に基づく。単一Ｊエントリーベクターは、コードされた変動するＪ遺伝子セグメントを有するＪドナーベクターのライブラリから選択される(成分1B)。この選択は、Ｖ-Ｃエントリーベクターのものと同じ選択されたTCR鎖について必要なＪ組合せ配列に基づく。最後に、CDR3をコードするオリゴマー二重鎖(odeCDR3)を、標的TCR鎖の全長ORFを完成するように選択する(成分1C)。これらの３成分(1A、1B及び1C)を、適当な制限及びリガーゼ酵素と共に単一反応に組み合わせる。反応サイクルは、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格の状況において単一工程で再構成されたTCR ORFを生成する(反応生成物)。このTCR ORFは、二部分装置の第２の部分の組込みベクター成分2C及び2Eである。 二部分装置の第２の部分は、５又は６つの成分を含む操作TCR提示細胞システム(操作されたTCRを提示する細胞システム；eTPCS)である。第１の成分2Aは、細胞の全ての必要な操作された特徴を有するeTPC系統自体である。eTPC 2Aは、３つの更なる成分を含み、このうち２つは、被分析物TCR鎖対の組込みのためのゲノム受容部位である2B及び2Dである。eTPCに含まれる第三の任意成分2Aは、TCRライゲーションの際に誘導される合成レポーター構築物である2Fである。２つの更なる独立成分である2C及び2Eは、矢印がカップリングさせた特異性を示す、それぞれ部位2B及び2DへのORFの部位特異的組込みのための遺伝子組込みベクターである。成分2C及び2Eは各々、二部分装置の第１の部分からの反応生成物を表す。 TORESを用いてTCR ORFを組み立てるための二成分ベクターシステムの遺伝子インプット、副生成物、中間体及び生成物の全般的な説明 ベクターシステムの２成分(ａ及びｂ)、オリゴヌクレオチド二重鎖(ｃ)を示し、これらの３成分がIIS型制限酵素及びリガーゼと共に単一反応に組み合わされる場合、２つの反応副生成物(ｄ及びｅ)、２つの反応中間体(ｆ及びｇ)及び１つの反応生成物(ｈ)が作製される。二成分システムのインプットベクター及び生成物は、環状プラスミド模式図として示し、遺伝子エレメントは、ラベルを付した箱として示す。副生成物又は中間体を表すオープンプラスミドベクターは、非環状プラスミド模式図であり、遺伝子エレメントは、ラベルを付した箱として示す。直鎖状DNAは、遺伝子エレメントを示すラベルを付した一連の箱として示す。 ａ)は、ラベルを付した箱として示す、最小限に必要な遺伝子エレメントを有するＶ-Ｃエントリーベクターの環状プラスミド模式図である。コザックは、翻訳の効率的な開始において役割を演じるコンセンサス配列のことをいう。Ｖセグメントは、TCR可変生殖系列ORF又は変異体/合成ORFの一部をコードする選択された配列のことを言う。IIS型←は、酵素が５'に切断するような向きのIIS型制限酵素結合部位のことをいう。IIS型→は、酵素が３'に切断するような向きのIIS型制限酵素結合部位のことをいう。-ve選択は、全長TCR再構成反応又はその後の選択工程中に、配列を有するプラスミドに対して有害なように設計されたネガティブ選択エレメントのことをいう。Ｃセグメントは、TCR定常生殖系列ORF又は変異体/合成ORFの一部をコードする選択された配列のことをいう。+ve選択#1は、ベクターを有する生物に選択の利点を運ぶために用いられるTORESの第１のポジティブ選択マーカーのことをいい、これは、第２のベクター成分(ｂ)のポジティブ選択マーカーとは異なる。Oriは、適合宿主内のプラスミドの増殖のために用いられる複製起点のことをいう。５'遺伝子エレメントは、再構築された全長TCRの下流の用途のために必要な属性を提供する任意の所望の遺伝子エレメントのことをいい、eTPCS内に含まれるゲノム受容部位への定方向組込みを手引きする配列を少なくとも含んで、再構築された全長TCRの５'に位置すべきである。３'遺伝子エレメントは、再構築された全長TCRの下流の用途のために必要な属性を提供する任意の所望の遺伝子エレメントのことをいい、eTPCS内に含まれるゲノム受容部位への定方向組込みを手引きする配列を少なくとも含んで、全長TCR ORFの３'に位置すべきである。 ｂ)は、ラベルを付した箱として示す最小限に必要な遺伝子特徴を有するＪドナーベクターの環状プラスミド模式図を示す。Ｊセグメント部は、TCR連結生殖系列ORF又は変異体/合成Ｊ遺伝子セグメントの一部をコードするDNA配列のことをいう。Ｃ部は、TCR定常遺伝子セグメントの小さい５'部分のことを言う。IIS型←は、酵素が５'方向に切断するような向きのIIS型制限酵素結合部位のことをいう。IIS型→は、酵素が３'方向に切断するような向きのIIS型制限酵素結合部位のことをいう。+ve選択#2は、ベクターを有する生物に選択の利点を運ぶために用いられるTORESの第２のポジティブ選択マーカーのことをいい、これは、第１のベクター成分(ａ)の第１のポジティブ選択マーカーとは異なる。Oriは、適合宿主内のプラスミドの増殖のために用いられる複製起点のことをいう。 ｃ)は、CDR3領域をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)としての標的TCR ORF配列を完成する第３の成分を示す。２つの一本鎖DNAオーバーハング、オーバーハング‡1-5'及びオーバーハング‡1-3'に挟まれたCDR3配列を含むこのDNA二重鎖。オーバーハング‡1-5'は、オープンＶ-Ｃエントリーベクター中間体(ｇ)におけるオーバーハング‡1-3'と適合する。オーバーハング‡2-3'は、ドナー断片中間体(ｆ)におけるオーバーハング‡2-5'と適合する。 ｄ)IIS型制限酵素によるＶ-Ｃエントリーベクター(ａ)の消化は、-ve選択エレメント並びにIIS型←及びIIS型→エレメントを含む直鎖状DNA Ｖ-Ｃエントリーベクター反応副生成物をもたらす。 ｅ)IIS型制限酵素によるＪドナーベクター(ｂ)の消化は、切り取られたＪドナー断片中間体(ｆ)に含まれるもの以外の親のプラスミドの全ての遺伝子エレメントを含む直鎖状プラスミド副生成物をもたらす。 ｆ)IIS型制限酵素によるＪドナーベクター(ｂ)の消化は、一本鎖DNAオーバーハング、オーバーハング‡2-5'及びオーバーハング‡3-3'に挟まれたＪセグメント部及びＣ部を含む直鎖状DNA断片をもたらす。オーバーハング‡2-5'は、CDR3 DNAオリゴヌクレオチド二重鎖(ｃ)におけるオーバーハング‡2-3'と適合する。オーバーハング‡ 3-3'は、オープンＶ-Ｃエントリーベクター中間体(ｇ)におけるオーバーハング‡3-5'と適合する。 ｇ)IIS型制限酵素によるＶ-Ｃエントリーベクター(ａ)の消化は、切り取られた直鎖状DNA Ｖ-Ｃエントリーベクター反応副生成物(ｄ)が有するもの以外の親のプラスミドの全ての遺伝子エレメントを含む非環状プラスミド中間体をもたらす。消化は、更に、２つの一本鎖DNAオーバーハングであるオーバーハング‡1-3'及びオーバーハング‡3-5'を創出する。CDR3 DNAオリゴヌクレオチド二重鎖(ｃ)におけるオーバーハング‡1-5'と適合するオーバーハング‡1-3'。オーバーハング‡3-5'は、Ｊドナー断片中間体(ｆ)におけるオーバーハング‡3-3'と適合する。 ｈ)３つ全ての適合する一本鎖DNAオーバーハングのライゲーションにより、環状プラスミド(ｈ)としての全長TCR ORFベクターが得られる。このプラスミドは、切り取られたＶ-Ｃエントリーベクター反応副生成物(ｄ)以外の親のＶ-Ｃエントリーベクター(ａ)の全ての遺伝子エレメントを含む。更に、全長TCR ORFベクターは、CDR3 DNAオリゴヌクレオチド二重鎖(ｃ)からのCDR3配列、並びにＪドナー断片反応中間体(ｆ)からのＪセグメント部及びＣ部を組み込んでいる。矢印は、適合する一本鎖DNAオーバーハング‡1、‡2及び‡3の間のおおよそのライゲーション点を示す。ライゲーション点‡1は、それぞれＶ-Ｃエントリーベクター反応中間体(ｇ)及びCDR3 DNAオリゴヌクレオチド二重鎖(ｃ)により提供された‡1-3'及び‡1-5'エレメントで構成される。ライゲーション点‡2は、それぞれCDR3 DNAオリゴヌクレオチド二重鎖(ｃ)及びＪドナー断片反応中間体(ｆ)により提供された‡2-3'及び‡2-5'エレメントで構成される。ライゲーション点‡3は、それぞれＪドナー断片反応中間体(ｆ)及びＶ-Ｃエントリーベクター反応中間体(ｇ)により提供される‡3-3'及び‡3-5'エレメントで構成される。 CDR3多様化TCR鎖を作製するためのTORESの動作 多様化されたCDR3インサートを有する全長TCR鎖を作製するために用いる場合のTORESの模式図を示す。親のTCRは、Ｖ-Ｊ-Ｃ使用及び規定されるCDR3領域配列を用いて規定される。対応する単一Ｖ-Ｃエントリーベクター(ボックスｉ)及び単一Ｊドナーベクター(ボックスii)を反応チューブに入れる。コードされるアミノ酸配列を変える規定される位置的ヌクレオチド縮重及び/又は点変異誘発を有するodeCDR3のプールを合成する(ボックスiii)。このようなCDR3プールは、生殖系列Ｖ-Ｊ-Ｃ使用を有する全長TCR ORFを含む「合成」CDR3を合成する、規定されたodeCDR3フレームワークの境界内の完全無作為化CDR3配列を含み得る。これらの３つの成分(ボックスｉ、ii及びiii)は、適当な制限及びリガーゼ酵素と共に単一反応に組み合わされる。反応サイクルは、含まれるバリアントodeCDR3の数に比例した幾つかのバリアントの再構成された全長TCR ORFを、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格の状況において単一工程で生成する(ボックスiv)。 Ｖセグメント多様化TCR鎖を作製するためのTORESの動作 多様化されたＶセグメント使用を有する全長TCR鎖を作製するために用いる場合のTORESの模式図を示す。親のTCRは、Ｖ-Ｊ-Ｃ使用及び規定されるCDR3領域配列を用いて規定される。対応する単一Ｊドナーベクター(ボックスii)を反応チューブに入れ、親のCDR3領域配列に相当するように合成された単一odeCDR3も同様である(ボックスiii)。生成物Ｖセグメント多様化全長TCR ORF生成物において所望のＶ及びＣセグメントに対応するＶ-Ｃエントリーベクターの選択も、反応チューブに加える(ボックスｉ)。これらの３つの成分(ボックスｉ、ii及びiii)は、適当な制限及びリガーゼ酵素と共に単一反応に組み合わせる。反応サイクルは、含まれるバリアントＶ-Ｃエントリーベクターの数に比例する幾つかのバリアントの再構成された全長TCR ORFを、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格の状況において単一工程で生成する(ボックスiv)。 Ｊセグメント多様化TCR鎖を作製するためのTORESの動作 多様化されたＪセグメント使用を有する全長TCR鎖を作製するために用いる場合のTORESの模式図を示す。親のTCRは、Ｖ-Ｊ-Ｃ使用及び規定されるCDR3領域配列を用いて規定される。対応する単一Ｖ-Ｃエントリーベクター(ボックスｉ)を反応チューブに入れ、親のCDR3領域配列に相当するように合成された単一odeCDR3も同様である(ボックスiii)。生成物Ｊセグメント多様化全長TCR ORF生成物において所望のＪセグメントに対応するＪドナーの選択も反応チューブに加える(ボックスii)。これらの３つの成分(ボックスｉ、ii及びiii)は、適当な制限及びリガーゼ酵素と共に単一反応に組み合わせる。反応サイクルは、含まれるＪドナーベクターの数に比例する幾つかのバリアントの再構成された全長TCR ORFを、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格の状況において単一工程で生成する(ボックスiv)。 Ｖ/Ｊセグメント多様化TCR鎖を作製するためのTORESの動作 多様化されたＶ及びＪセグメント使用を有する全長TCR鎖を作製するために用いる場合のTORESの模式図を示す。親のTCRは、Ｖ-Ｊ-Ｃ使用及び規定されるCDR3領域配列を用いて規定される。親のCDR3領域配列に相当するように合成された対応する単一odeCDR3(ボックスiii)。生成物Ｖ/Ｊセグメント多様化全長TCR ORF生成物において所望のＶ(Ｃ)及びＪセグメントの組合せに対応するＶ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターの選択を反応チューブに加える(ボックスii)。これらの３つの成分(ボックスｉ、ii及びiii)は、適当な制限及びリガーゼ酵素と共に単一反応に組み合わせる。反応サイクルは、含まれるものから可能なＶ-Ｃ及びＪドナーベクターの組合せの数に比例する幾つかのバリアントの再構成された全長TCR ORFを、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格の状況において単一工程で生成する(ボックスiv)。 eTPCからの中間体eTPC-x及び被分析物eTPC-t集団のコンピレーション。 二部分装置の動作は、TORES内で調製されるベクターをeTPCSへ挿入して、被分析物eTPC集団を調製し、被分析物TCRspを発現する細胞又は単一被分析物TCR鎖を発現する中間体を創出することを必然的に伴う。TCRspを提示するeTPCをeTPC-tと呼び、これは、２つの相補TCR鎖をコードするORFをeTPCに挿入することにより創出できる(工程ｉ)。単一被分析物TCR鎖のみを発現するeTPCをeTPC-xと呼び、これは、単一TCR鎖をコードするORFをeTPCに導入することにより創出できる(工程ii)。eTPC-tは、或いは、eTPC-xから創出でき、ここで、第２の相補TCR鎖をコードするORFを、現存するeTPC-xに導入する(工程iii)。幾つかの場合では、eTPC-xは、eTPC-tから、単一被分析物TCR鎖を除去することにより創出できる(工程iv)。 一工程でのeTPC-tのコンピレーション eTPC 2Aは、別個のゲノム受容部位2B及び2Dを含む。eTPC 2Aは、TCRシグナル応答エレメント2Fを更に含んでよい。TORES内で作製された別個の遺伝子組込みベクター2C及び2Eは、それぞれ独立して2B及び2Dとカップリングさせる。組込みベクター2Cは、単一TCR鎖をコードし、組込みベクター2Eは、第２の相補TCR鎖をコードする。eTPC 2Aは、組込みベクター2C及び2Eと組み合わせる。得られる細胞は、2Bゲノム受容部位に交換されるインサート2Cを有して、部位2B'が創出され、第１のTCR鎖のためのORFをもたらす。更に、得られる株化細胞は、2Dゲノム受容部位に交換されるインサート2Eを有して、部位2D'が創出され、第２のTCR鎖のためのORFをもたらす。この細胞は、表面にてTCRspを提示できるので、eTPC-tと呼ばれる。 eTPC-x中間体を介する二工程でのeTPC-tのコンピレーション eTPC 2Aは、別個のゲノム受容部位2B及び2Dを含む。eTPC 2Aは、TCRシグナル応答エレメント2Fを更に含んでよい。TORES内で作製された別個の遺伝子組込みベクター2C及び2Eは、それぞれ独立して2B及び2Dとカップリングさせる。組込み可能ベクター2Cは、単一TCR鎖をコードし、組込みベクター2Eは、第２の相反TCR鎖をコードする。工程１では、eTPC 2Aを、組込み可能ベクター2Cと組み合わせる。得られる細胞は、2Bゲノム受容部位に交換される2CのTCR ORFを有して、部位2B'が創出され、第１のTCR鎖のためのORFをもたらす。この細胞は、単一TCR鎖のみを発現するので、eTPC-xと呼ぶ。ゲノム受容部位2Dは、用いられないままである。工程２では、eTPC-xを組込みベクター2Eと組み合わせる。得られる細胞は、2Dゲノム受容部位に交換されるインサート2Eを有して、部位2D'が創出され、第２の相補TCRのためのORFをもたらす。この細胞は、表面にてTCRspを提示できるので、eTPC-tと呼ばれる。 eTPC-tのeTPC-xへの復帰 上のパネルに示す細胞は、表面にてTCRspを提示できるので、eTPC-tと呼ばれる。このeTPC-tは、TCR ORFにより占められたゲノム受容部位2B及び2Dを有して、それらを2B'及び2D'の形にする。部位2B'又は2D'とカップリングされ、2Y及び2Zと呼ばれるゲノム受容部位マーカーを有する遺伝子組込みベクター。eTPC-tへの2Y又は2Zの付加は、ゲノム受容部位マーカーを2B'又は2D'によりコードされるTCR鎖に交換する。得られる細胞は、単一TCR鎖のみを発現するので、eTPC-xと呼ばれる。 TCR鎖ライブラリからのTCRspの無作為組合せを発現するための、eTPCからのeTPC-tプールのショットガンコンピレーション eTPC 2Aは、別個のゲノム受容部位2B及び2Dを含む。別個の遺伝子組込みベクター2C及び2Eは、それぞれ独立して2B及び2Dとカップリングさせる。組込みベクター2C i及び2C iiは各々、単一TCR鎖をコードし、組込みベクター2E i及び2E iiは各々、相補単一TCR鎖をコードする。eTPC 2Aは、TCRシグナル応答エレメント2Fを更に含んでよい。eTPC 2Aは、組込みベクター2C i、2C ii、2E i及び2E iiと組み合わせる。得られる細胞プールは、複数の独立した場合において2Bゲノム受容部位に交換される2C i又は2C iiのTCR ORFを有し、部位2B' i及び2B' iiを創出し、これらは各々TCR鎖のための単一ORFをもたらす。得られる細胞プールは、複数の独立した場合において2Dゲノム受容部位に交換されるインサート2E i又は2E iiを更に有し、部位2D' i及び2D' iiを創出し、各々部位2C'i及び2C'iiでのものと相補的なTCR鎖のための単一ORFをもたらす。得られるeTPC-t細胞プールは、初期ベクターライブラリに含まれる各相補TCR鎖の１つで構成される分離した無作為化TCRspを表面にて各々発現する４つの別個の細胞コホートの混合集団を含む。このプロセスは、様々な尺度にて無作為化TCRsp提示を有する細胞ライブラリを達成するために、異なる数の2C及び2Eバリアントに尺度を合わせる(scaled to)ことができる。 TCR鎖ライブラリからの対合TCR鎖対の無作為組合せを発現するための、非対合被分析物TCR鎖を有するeTPC-xからのeTPC-tプールのショットガンコンピレーション 予めコンパイルしたeTPC-xは、単一TCR鎖を発現する交換されたゲノム受容部位2B'と、別個のゲノム受容部位2Dとを含む。別個の遺伝子組込みベクター2E i及び2E iiは、2Dとカップリングさせる。組込みベクター2E i及び2E iiは各々、単一TCR鎖をコードする。eTPC-xは、TCRシグナル応答エレメント2Fを更に含んでよい。eTPC-xは、組込みベクター2E i及び2E iiと組み合わせる。得られる細胞プールは、複数の独立した場合において2Dゲノム受容部位に交換されるインサート2E i又は2E iiを有し、部位2E i及び2E iiを創出し、これらは各々TCR鎖のための単一ORFをもたらす。得られるeTPC-t細胞プールは、初期ベクターライブラリに含まれる単一無作為化相補TCR鎖と対合した2B'から発現されるTCR鎖で構成される分離したTCRspを表面にて発現する別個の細胞コホートの混合集団を含む。 TCR鎖ライブラリの無作為メンバーを発現するeTPCからのeTPC-xプールのショットガンコンピレーション eTPC 2Aは、別個のゲノム受容部位2B及び2Dを含む。別個の遺伝子組込みベクター2C及び2Eは、それぞれ2B及び2Dと独立してカップリングさせる。組込みベクター2C i、2C ii及び2C iiiは各々、単一TCR鎖をコードする。eTPC 2Aは、TCRシグナル応答エレメント2Fを更に含んでよい。eTPC 2Aは、組込みベクター2C i、2C ii及び2C iiiと組み合わせる。得られる細胞プールは、複数の独立した場合において2Bゲノム受容部位に交換される2C i、2C ii又は2C iiiのTCR ORFを有し、部位2B' i、2B' ii又は2B' iiiを創出し、これらは各々TCR鎖のための単一ORFをもたらす。得られるeTPC-x細胞プールは、初期ベクターライブラリに含まれる分離した無作為化TCR鎖を各々発現する別個の細胞コホートの混合集団を含む。このプロセスは、様々な尺度にて無作為化TCR鎖提示を有する細胞ライブラリを達成するために、異なる数の2Cバリアントに尺度を合わせることができる。 TCR鎖ライブラリからの対合TCRspの無作為組合せを発現するための、非対合被分析物TCR鎖を有するeTPC-xのプールからのeTPC-tプールのショットガンコンピレーション eTPC-xのプールは、各々単一TCR鎖を発現する交換されたゲノム受容部位2B' i、2B' ii又は2B' iiiと、別個のゲノム受容部位2Dとを含む。別個の遺伝子組込みベクター2Eは、2Dとカップリングさせる。組込みベクター2Eは、単一TCR鎖をコードする。eTPC-xは、TCRシグナル応答エレメント2Fを更に含んでよい。eTPC-xプールは、組込みベクター2Eと組み合わせる。得られる細胞プールは、複数の独立した場合において2Dゲノム受容部位に交換される2EのTCR ORFを有し、TCR鎖についての単一ORFをもたらす部位2D'を創出する。得られるeTPC-t細胞プールは、2D'に含まれるTCR鎖と対合する、2B'によりコードされるTCR鎖の組合せから発現されるTCR鎖で構成される分離したTCRspを表面にて発現する別個の細胞コホートの混合集団を含む。このプロセスは、様々な尺度にて無作為化TCRsp提示を有する細胞ライブラリを達成するために、異なる数の2Eバリアントに尺度を合わせることができる。 可能性のある親和性反応剤と又はNCBPと結合したeTPC-tアウトプット状態を示す被分析物eTPC:A組合せシステムの動作。 被分析物eTPC-tは、表面にて相反TCRspをコードする１つのORFと共に各々組み込まれた部位2B'及び2D'を含む。被分析物eTPC-tと被分析物親和性反応剤又はNCBPとを接触させた場合に、この例では１つのネガティブと３つのポジティブである、異なるeTPC-t標識化状態を達成できる。ネガティブ状態は、被分析物親和性反応剤又はNCBPの検出可能な結合がない、インプットeTPC-tの休止状態であり、被分析物親和性反応剤又はNCBPがeTPC-tにより提示されるTCRspと安定な複合体を形成できないことを示す。３つのポジティブ状態は、細胞のより暗い影により示されるように、被分析物親和性反応剤又はNCBPの結合の程度の仮想の範囲を示す。これは、eTPC-t集団により発現されるTCRspとの被分析物親和性反応剤又はNCBP被分析物の傾斜する結合の度合いを示す。 被分析物親和性反応剤又はNCBPに応答してシグナルによりレポートされる(可能性のある)eTPC-t-アウトプット状態を示す被分析物eTPC:A組合せシステムの動作。 被分析物eTPC-tは、表面にて相反TCRspをコードする１つのORFと共に各々組み込まれた部位2B'及び2D'を含む。eTPC-tは、TCRシグナル応答エレメント2Fを更に含む。被分析物eTPC-tと被分析物親和性反応剤又はNCBPとを接触させた場合に、この例では１つのネガティブと３つのポジティブである、異なるeTPC-t応答状態を達成できる。ネガティブ状態は、2Fエレメントでのシグナル強度がないeTPC-tの休止状態であり、被分析物親和性反応剤又はNCBPが複合体を形成して、eTPC-tにより提示されるTCRspを刺激できないことを示す。３つのポジティブ状態は、2Fからの増加するシグナル強度を示す。状態2F'+、2F'++及び2F'+++は、それぞれ低、中及び高シグナル強度を示す。六角形で示される2Fの遺伝子産物は、蓄積されて、細胞のより暗い影により示されるように、各細胞状態のシグナル強度をレポートする。このことは、2Fエレメントへのシグナル伝達をもたらす、被分析物親和性反応剤又はNCBPに向かうeTPC-t集団により発現される被分析物TCRspの傾斜する応答を示す。 被分析物APCに応答してシグナルによりレポートされる(可能性のある)eTPC-t-アウトプット状態を示す被分析物eTPC:A組合せシステムの動作。 被分析物eTPC-tは、表面にて相反TCRspをコードする１つのORFと共に各々組み込まれた部位2B'及び2D'を含む。eTPC-tは、TCRシグナル応答エレメント2Fを更に含む。被分析物eTPC-tと被分析物APC集団とを接触させた場合に、この例では１つのネガティブと３つのポジティブである、異なるeTPC-t応答状態を達成できる。ネガティブ状態は、2Fエレメントでのシグナル強度がないeTPC-tの休止状態であり、被分析物APCにより提示されるaAPX:aAM/CM又はaAMがeTPC-tにより提示されるTCRspを刺激できないことを示す。３つのポジティブ状態は、2Fからの増加するシグナル強度を示す。状態2F'+、2F'++及び2F'+++は、それぞれ低、中及び高シグナル強度を示す。六角形で示される2Fの遺伝子産物は、蓄積されて、細胞のより暗い影により示されるように、各細胞状態のシグナル強度をレポートする。このことは、被分析物APCにより提示される被分析物aAPX:aAM/CM又はaAMに向かうeTPC-t集団により発現される被分析物TCRspの傾斜する応答を示す。 可能性のある被分析物APCアウトプット状態を示す被分析物eTPC:A組合せシステムの動作。 被分析物eTPC-tは、表面にて相反TCRspをコードする１つのORFと共に各々組み込まれた部位2B'及び2D'を含む。eTPC-tは、TCRシグナル応答エレメント2Fを更に含む。被分析物eTPC-tと被分析物APC集団とを接触させた場合に、この例では１つのネガティブと３つのポジティブである、異なるAPC応答状態を達成できる。ネガティブ状態は、被分析物APCの休止状態であり、TCRsp鎖対が被分析物APCにより提示されるaAPX:aAM/CM又はaAM複合体を刺激できないことを示す。３つのポジティブ状態は、接触させたaAPX:aAM/CM又はaAMからの増加するシグナル強度を示す。各細胞状態のレポートされるシグナル強度は、*、**、***により示し、細胞のより暗い影によっても示す。このことは、被分析物eTPC-tにより提示される被分析物TCRsp鎖対に向かう被分析物aAPX:aAM/CM又はaAMの傾斜する応答を示す。 eTPC-tのプールからの被分析物親和性反応剤又はNCBPと結合するTCRsp鎖対を同定するためのeTPC:A組合せの動作。 eTPC-tプールは、部位2B' i、ii又はiii及び2D' i、ii又はiiiを有する細胞を含み、ここで、各eTPC-tは、相補TCR鎖の対をコードするORFの対と共に組み込まれ、よって、集団内の各細胞コホートは、表面にて分離したTCRspを発現する。被分析物親和性反応剤又はNCBPは、被分析物eTPC-tプールと接触させる。この例では、2B' i/2D' iから発現されるTCR鎖の対(TCRsp i)だけが、被分析物親和性反応剤又はNCBPに特異的であるので、TCRsp iを有するeTPC-tの細胞コホート(etTPC-t*)だけが被分析物抗原又はNCBP(*)と検出可能に結合できる。被分析物親和性反応剤又はNCBPと結合するeTPC-t*は、親和性反応剤又はNCBP標識化に基づいて、プールから選択できる。その後、選択及び単離されたeTPC-t*の、被分析物TCRspをコードするORFは、2B'及び2D'の発現された転写産物の逆転写酵素PCRによる直接又は間接的な2B'及び2D' DNAのシーケンシングにより同定できる。 被分析物親和性反応剤又はNCBPを用いる刺激によるシグナルレポート応答の誘導によりeTPC-tのプールからTCRsp鎖対を同定するためのeTPC:A組合せシステムの動作。 eTPC-tプールは、部位2B' i、ii又はiii及び2D' i、ii又はiiiを有する細胞を含み、ここで、各eTPC-tは、TCR鎖の相補対をコードするORFの対と共に組み込まれ、よって、集団内の各細胞コホートは、表面にて分離したTCRspを発現する。eTPC-tは、TCRシグナル応答エレメント2Fを更に含む。被分析物抗原又はNCBPは、被分析物eTPC-tプールと接触させる。この例では、2B' i/2D' iから発現されるTCR鎖の対(TCRsp i)だけが、被分析物親和性反応剤又はNCBPに特異的であるので、TCRsp iを有するeTPC-tの細胞コホート(etTPC-t*)だけがエレメント2F(*)を介してシグナルレポート応答を誘導できる。被分析物親和性反応剤又はNCBPと結合するeTPC-t*は、親和性反応剤又はNCBP標識化に基づいて、eTPC-tのプールから選択できる。その後、選択及び単離されたeTPC-t*の被分析物TCRspをコードするORFは、2B'及び2D'の発現された転写産物の逆転写酵素PCRによる直接又は間接的な2B'及び2D' DNAのシーケンシングにより同定できる。 被分析物APCを用いる刺激によるシグナルレポート応答の誘導によりeTPC-tプールからTCRsp鎖対を同定するためのeTPC:A組合せシステムの動作。 eTPC-tプールは、部位2B' i、ii又はiii及び2D' i、ii又はiiiを有する細胞を含み、ここで、各eTPC-tは、相反TCR鎖の対をコードするORFの対と共に組み込まれ、よって、集団内の各細胞コホートは、表面にて分離したTCRspを発現する。eTPC-tは、TCRシグナル応答エレメント2Fを更に含む。被分析物APCは、表面でaAPX:aAM/CM又はaAMを発現する。この例では、2B' i/2D' iから発現されるTCR鎖対(TCRsp i)だけが、被分析物APCにより提示されるaAPX:aAM/CM又はaAMに特異的であるので、eTPC-tプールと被分析物APC集団とを接触させた場合に、TCRsp iを有するeTPC-tの細胞コホート(etTPC-t*)だけが、状態2F'によるTCRsp結合をレポートする。被分析物APCにより刺激されるeTPC-t*は、シグナルレポート応答に基づいて、プールから選択できる。その後、選択及び単離されたeTPC-t*の被分析物TCRspをコードするORFは、2B'及び2D'の発現された転写産物の逆転写酵素PCRによる直接又は間接的な2B'及び2D' DNAのシーケンシングにより同定できる。 APC中心シグナルレポート応答の誘導により、被分析物APCにより提示される被分析物抗原を同定するためのeTPC:A組合せシステムの動作。 被分析物APCプールは、それらの表面で様々なaAPX:aAM/CM又はaAMを発現する細胞を含む。被分析物eTPC-tは、表面にてTCRspの発現を駆動する交換されたゲノム受容部位2B'及び2D'を含む。この例では、複合体aAPX:aAM/CM又はaAM iだけが、被分析物eTPC-tにより提示されるTCRspに特異的であるので、被分析物APCプールと被分析物eTPC-t集団とを接触させた場合に、aAPX:aAM/CM iを発現する細胞コホートだけが応答する(*)。この応答は、表面表現型、転写産物の量又は細胞死における変化のようなeTPC-t結合に対する固有のシグナル応答であってよい。応答する被分析物APCは、被分析物eTPC-tにより提示される被分析物TCRspと接触したaAPX:aAM/CM又はaAMを決定するために選択できる。 eTPC-tによる親和性反応剤又はNCBP反応剤の捕捉により親和性反応剤又はNCBPのプールからそのような物体を同定するためのeTPC:A組合せシステムの動作。 被分析物eTPC-tは、表面にてTCRspの発現を駆動する交換されたゲノム受容部位2B'及び2D'を含む。親和性反応剤又はNCBPプールは、被分析物eTPC-tと接触させ、これは、被分析物eTPC-tにより提示されるTCRspに特異的な被分析物親和性反応剤又はNCBPの結合を許容する。この図において、TCRspは、親和性反応剤又はNCBP iとのみ特異的に結合し、よって、被分析物eTPC-tは、親和性反応剤又はNCBP iでのみ標識される。親和性反応剤又はNCBPは、よって、eTPC-tとの会合によりプールから選択でき、被分析物eTPC-tにより提示される被分析物TCRspに特異的なこれらの親和性反応剤又はNCBPを同定できる。 eTPC:A組合せシステムの組立てのためにeTPC-tを調製するための二部分TORES/eTPCS装置の動作。 二部分TORES/eTPCS装置を用いて様々な被分析物抗原を有する被分析物操作されたTCR提示細胞(eTPC-t)又は抗原提示細胞若しくは粒子をeTPC:A組合せシステムに調製する全体的な分析システム。一次アウトプットが導かれるのはeTPC:A組合せシステムからであり、これらの一次アウトプットから終端アウトプットが導かれる。全体的なシステムの動作は、２段階、すなわち調製段階及び分析段階を含む。 段階１の一態様では、被分析物親和性反応剤、APC及び/又はNCBPとして提供される被分析物抗原が調製される。このような被分析物抗原は、様々な形の抗原性部分；被分析物抗原提示複合体(aAPX)；被分析物抗原性分子(aAM)；aAMカーゴを積載したaAPX(aAPX:aAM)；カーゴ分子(CM)；CMを積載したaAPX(aAPX:CM)の中に抗原を発現し、ここで、被分析物抗原は、被分析物eTPC-tに対する親和性又はシグナル誘導について試験されるものを表す(工程ｉ)。段階１の別の態様では、二部分TORES/eTPCS装置を用いて、細胞表面に被分析物TCR鎖対(TCRsp)を発現する細胞を調製する(工程ii)。細胞表面にTCRspを発現するeTPCは、eTPC-tと呼ばれ、ここで、eTPC-tは、TCRspを被分析物抗原に提示して、被分析物抗原に対する親和性又はシグナル誘導を試験する。eTPC-tと被分析物抗原との接触は、eTPC:A組合せシステムの組立てに起因する(工程iii)。 全体的なシステムの段階２は、eTPC:A組合せシステムの組立てをもたらす段階１(工程iii)で調製したeTPC-tと被分析物抗原との接触である。接触させた被分析物親和性反応剤、APC及びNCBPは、被分析物抗原部分を被分析物eTPC-tに提示し、提示されたTCRspとの複合体形成に基づいてeTPC-tと結合する可能性がある。eTPC:A組合せシステム内で、被分析物抗原又は被分析物eTPC-tのアウトプットは、これらの応答種を同定できるようにそのシグナル状態(*及びより暗い影で示す)を変え得る(工程iv)。eTPC:Aシステム内で変更されたシグナル状態に基づいて、特異的被分析物親和性反応剤、APC及び/又はNCBPは、eTPC-tにおいて応答を誘導するそれらの能力、又はそれらにおいて応答を誘導するeTPC-tの能力に基づいて選択できる。応答は、細胞ベース被分析物からの活性シグナルベースのレポート応答、又はある被分析物の別の被分析物への結合を含む、任意の被分析物の状態の検出可能な変化であり得る。同様に、被分析物eTPC-tは、接触させた被分析物抗原における応答を誘導する能力、又はこれらの被分析物についてeTPC-tにおいてシグナル応答を誘導する能力について選択できる。この応答性に基づく選択は、eTPC:A組合せシステムの一次アウトプットを生み出す(工程ｖ)。被分析物細胞、親和性反応剤又はNCBPを工程ｖから得ることにより、提示される被分析物aAPX、aAM、aAPX:aAM、CM、aAPX:CM及び/又はTCRspは、装置の動作の終端アウトプットとして同定できる(工程vi)。 Ｖ-Ｃエントリーベクターの構築のためのＶクローニング断片の配置 実施例１に記載する、ヒトTRA及びTRB TCR鎖のためのTORESのＶ-Ｃエントリーベクターを組み立てるために用いるＶクローニング断片の図である。 Ｖクローニング断片は、５'及び３'末端にてユニークプライマー結合配列に挟まれて、クローニング断片のPCR媒介増幅を容易にする。BbsI部位は、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てに用いられる特異的IIS型制限酵素結合部位を表し、→は、認識部位が、この部位の３'方向に切断されるような向きであることを示し、←は、この部位が５'方向に切断されるような向きであることを示す。BbsI→部位は、コードされるコザック配列の５'を切断して、オーバーハング*1を創出する。BsaI←部位は、NotI ５'断片内に５'NotIオーバーハングを創出するように切断する。オーバーハング*1及び５' NotIオーバーハングは、最終的に、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てにおいて、消化されたＶ-Ｃエントリーベクター骨格のオーバーハング*1'、及び消化されたＣクローニング断片の３' NotIオーバーハングとそれぞれライゲーションされる。NotI ５'断片は、NotI認識配列の６ヌクレオチド５'断片を表し、ここで、NotIは、TORESの動作において親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除するためのネガティブ選択マーカーとして作用する。完全NotI認識部位は、Ｃクローニング断片により提供される３' NotI断片と再構成される。Ｖセグメントは、最終Ｖ-ＣエントリーベクターによりコードされるべきTCR V遺伝子セグメントを表し、所定のＶセグメントのATG開始コドンから、CDR3領域の境界を規定するＶセグメントの最後のCysコドンまでをコードする。BsaI←部位は、全長TCR ORFを再構成するためのTORESシステムの動作中に用いられるIIS型制限酵素認識配列である。BsaI酵素の作用(ここで、部位は、５'方向に切断するような向きである)は、各Ｖセグメントの最後のCysコドンの３ヌクレオチドと、そのCysコドンに先行するコドンの第３のヌクレオチドとを含む、Ｖセグメントの３'末端にてオーバーハング‡1の創出をもたらす。このオーバーハングは、所定のTORESセットにおいて全てのＶセグメント間で標準化される。最終的に、Ｖセグメントの３'にあるオーバーハング‡1は、全長TCR ORFを再構築するためのTORESシステムの動作において５' odeCDR3でのオーバーハング‡1とライゲーションされる。全てのspは、IIS型認識配列と標的オーバーハング配列との間の正しいスペーシングを創出するか、又は効率的な動作のためにNotI認識及び切断部位の間をあけるための１以上のヌクレオチドの付加を表す。 Ｖ-Ｃエントリーベクターの構築のためのＣクローニング断片の配置 実施例１に記載する、ヒトTRA及びTRB TCR鎖のためのTORESのＶ-Ｃエントリーベクターを組み立てるために用いるＣクローニング断片の図である。 Ｃクローニング断片は、５'及び３'末端にてユニークプライマー結合配列に挟まれて、クローニング断片のPCR媒介増幅を容易にする。BbsI部位は、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てに用いられる特異的IIS型制限酵素結合部位を表し、→は、認識部位が、この部位の３'方向に切断されるような向きであることを示し、←は、この部位が５'方向に切断されるような向きであることを示す。BbsI→部位は、NotI ３'断片内で３' NotIオーバーハングを創出するように切断する。BsaI←部位は、Ｃセグメントの停止コドンの３'を切断して、Ｃセグメントの３'末端にてオーバーハング*2を創出する。オーバーハング*2及び３' NotIオーバーハングは、最終的に、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立てにおいて、消化されたＶ-Ｃエントリーベクター骨格のオーバーハング*2'、及び消化されたVクローニング断片のの５' NotIオーバーハングとそれぞれライゲーションされる。NotI ３'断片は、NotI認識配列の６ヌクレオチド３'断片を表し、ここで、NotIは、TORESの動作において親のＶ-Ｃエントリーベクターを排除するためのネガティブ選択マーカーとして作用する。完全NotI認識部位は、Ｖクローニング断片により提供される５' NotI断片と再構成される。 Ｃセグメントは、最終Ｖ-ＣエントリーベクターによりコードされるべきTCR C遺伝子セグメントを表し、Ｃ遺伝子セグメントの最初のGluコドンの５'のシトシン残基から停止コドンまでをコードする。BsaI→部位は、全長TCR ORFを再構成するためのTORESシステムの動作中に用いられるIIS型制限酵素認識配列である。BsaI酵素の作用(ここで、部位は、３'方向に切断するような向きである)は、Ｃセグメントの５'末端にてオーバーハング‡3の創出をもたらす。 このオーバーハングは、所定のTORESセットにおいて全てのＣセグメント間で標準化される。最終的に、Ｃセグメントの５'にあるオーバーハング‡3は、全長TCR ORFを再構成するためのTORESシステムの動作においてＪドナーベクターの３'Ｃ部でのオーバーハング‡3とライゲーションされる。全てのspは、IIS型認識配列と標的オーバーハング配列との間の正しいスペーシングを創出するか、又は効率的な動作のためにNotI認識及び切断部位の間をあけるための１以上のヌクレオチドの付加を表す。 Ｖ-Ｃエントリーベクターの構築のためのＶ-Ｃエントリーベクター骨格の配置 実施例１に記載する、ヒトTRA及びTRB TCR鎖のためのTORESのＶ-Ｃエントリーベクターを組み立てるために用いるＶ-Ｃエントリーベクター骨格の図である。 環状プラスミドDNAは、複製起点(Ori)及びポジティブ選択マーカー#1を含む。この選択マーカーは、組立て中にＶ-Ｃエントリーベクター骨格のクローン及びＶ-Ｃエントリーベクターを単離する場合に形質転換宿主の選択のため、及びTORESの動作中に全長TCR ORFを含むベクターの選択のために用いられる。５'及び３'遺伝子エレメントは、TORES動作による作製の後の全長TCR ORFの作製後に最終TCR ORFを挟む標的エレメントをコードする。５'遺伝子エレメントは、TCR転写産物の発現を駆動する哺乳動物プロモータエレメントを表す場合があり、３'遺伝子エレメントは、転写ターミネータ配列を表す場合がある。ACC65I部位は、制限酵素認識配列を表し、ここで、Acc65I酵素の作用は、オーバーハング*1'の創出をもたらす。このオーバーハング*1'は、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立て中に消化されたＶクローニング断片中のオーバーハング*1とライゲーションされる。XbaI部位は、制限酵素認識配列を表し、ここで、XbaI酵素の作用は、オーバーハング*2'の創出をもたらす。このオーバーハング*2'は、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立て中に消化されたＣクローニング断片中のオーバーハング*2とライゲーションされる。Spは、両方の酵素の効率的な作用のためにAcc65I及びXbaI認識部位の間をあけるヌクレオチドの付加を表す。 Ｊ受入カセット断片の配置 実施例１に記載する、ヒトTRA及びTRB TCR鎖のためのTORESのＪドナーベクターの組立てに用いるＪ受入カセット断片の図である。Ｊ受入カセット断片は、Ｊドナー骨格に挿入されて、Ｊ受入カセットベクターを作製する。 Ｊ受入カセット断片は、２つの相補オリゴヌクレオチドをアニールして、５'及び３'末端にて４ヌクレオチド一本鎖オーバーハング(これらは、Ｊドナーベクター骨格への断片の挿入のために用いられる)を有する直鎖状二本鎖DNA構築物を創出することにより作製される。Ｊ受入カセット断片の５'末端のオーバーハング*3は、消化されたＪドナーベクター骨格のオーバーハング*3'とライゲーションされるが、３'末端のオーバーハング*4は、消化されたＪドナーベクター骨格のオーバーハング*4'とライゲーションされる。 BsaI部位は、TORESの動作において用いられて全長TCR ORFを組み立てるIIS型制限認識部位を表す。BsaI←部位は、５'方向に切断するような向きであり、Ｃ部配列に対して作用して、３'Ｃ部にてオーバーハング‡3を作製する。BsaI→部位は、最終的に、ＪドナーベクターのＪセグメント部に対して作用して、Ｊセグメント部の５'末端にてオーバーハング‡2を創出する。BsaI→エレメントも、オーバーハング*5を含み、これは、Ｊドナーベクターの組立て中にBbsI←部位に対するBbsIの作用により作製される。 BbsI部位は、Ｊドナーベクターを組み立てるために用いられるIIS型制限認識部位を表す。BbsI←部位は、BsaI→エレメントを切断してオーバーハング*5を作製するが、BbsI→部位は、Ｃ部の５'末端を切断して、オーバーハング*6を作製する。オーバーハング*5及びオーバーハング*6は、最終的に、Ｊセグメント部のオーバーハング*5'及びオーバーハング*6'とそれぞれライゲーションされる。Ｃ部は、TORESの動作中に非パリンドロームオーバーハングの標準化された作製を許容する標的Ｃ遺伝子セグメントの小さい部分を表す。このＣ部は、最終的に、Ｊセグメント部の３'末端に保持され、全長TCR ORを作製するためのTORESの動作中に消化されたＶ-Ｃエントリーベクターが有するＣセグメントとライゲーションされて配列の一部を形成する。NotI部位は、Ｊドナーベクターの作製中に親のＪ受入カセットベクターを排除するために用いられるネガティブ選択マーカーを表す。全てのspは、IIS型認識配列と標的オーバーハング配列との間の正しいスペーシングを創出するか、又は効率的な動作のためにNotI認識及び切断部位の間をあけるための１以上のヌクレオチドの付加を表す。 Ｊドナー骨格の配置 実施例１に記載する、ヒトTRA及びTRB TCR鎖のためのTORESのＪドナーベクターの組立てに用いるＪドナーベクター骨格の図である。Ｊ受入カセット断片をＪドナー骨格に挿入して、Ｊ受入カセットベクターを作製する。 環状プラスミドDNAは、複製起点(Ori)及びポジティブ選択マーカー#2を含む。この選択マーカーは、組立て中にＪドナーベクター骨格のクローン及びＪドナーベクターを単離する場合に形質転換宿主の選択のために用いる。重要なことに、このポジティブ選択マーカーは、Ｖ-Ｃエントリーベクター内でポジティブ選択マーカー#1とは異なるので、TORESの動作中に#1に対するポジティブ選択の下で親のＪドナーベクターが排除されて、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格の状況において全長TCR ORFが作製される。 EcoRI部位は、制限酵素認識配列を表し、ここで、EcoRI酵素の作用は、オーバーハング*3'の創出をもたらす。このオーバーハング*3'は、Ｊ受入カセットベクターの組立て中に、アニールされたＪ受入カセット断片中のオーバーハング*3とライゲーションされる。XbaI部位は、制限酵素認識配列を表し、ここで、XbaI酵素の作用は、オーバーハング*4'の創出をもたらす。このオーバーハング*4'は、Ｊ受入カセットベクターの組立て中に、アニールされたＪ受入カセット断片中のオーバーハング*4とライゲーションされる。Spは、両方の酵素の効率的な作用のためにAcc65I及びXbaI認識部位の間をあけるヌクレオチドの付加を表す。 Ｊ受入カセットベクターの配置 実施例１に記載する、ヒトTRA及びTRB TCR鎖のためのTORESのＪドナーベクターの組立てに用いるＪドナーベクター骨格の図である。Ｊ受入カセットベクターは、Ｊドナー骨格へのＪ受入カセット断片の挿入により創出される。 環状プラスミドDNAは、複製起点(Ori)及びポジティブ選択マーカー#2を含む。この選択マーカーは、組立て中にＪドナーベクター骨格のクローン及びＪドナーベクターを単離する場合に形質転換宿主の選択のために用いる。重要なことに、このポジティブ選択マーカーは、Ｖ-Ｃエントリーベクター内でポジティブ選択マーカー#1とは異なるので、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格の状況において全長TCR ORFを作製するためのTORESの動作中に#1に対するポジティブ選択の下で親のＪドナーベクターが排除される。 BsaI部位は、全長TCR ORFを組立てるためのTORESの動作において用いるIIS型制限認識部位を表す。BsaI←部位は、５'方向に切断するような向きであり、Ｃ部配列に作用して、３'Ｃ部にてオーバーハング‡3を作製する。BsaI→部位は、最終的にＪドナーベクターのＪセグメント部に作用して、Ｊセグメント部の５'末端にてオーバーハング‡2を創出する。BsaI→エレメントも、オーバーハング*5を含み、これは、Ｊドナーベクターの組立て中にBbsI←部位に対するBbsIの作用により作製される。 BbsI部位は、Ｊドナーベクターを組み立てるために用いられるIIS型制限認識部位を表す。BbsI←部位は、BsaI→エレメントを切断してオーバーハング*5を作製するが、BbsI→部位は、Ｃ部の５'末端を切断して、オーバーハング*6を作製する。オーバーハング*5及びオーバーハング*6は、最終的に、Ｊセグメント部のオーバーハング*5'及びオーバーハング*6'とそれぞれライゲーションされる。 Ｃ部は、TORESの動作中に非パリンドロームオーバーハングの標準化された作製を許容する標的Ｃ遺伝子セグメントの小さい部分を表す。このＣ部は、最終的に、Ｊセグメント部の３'末端に保持され、全長TCR ORFを作製するためのTORESの動作中に消化されたＶ-Ｃエントリーベクターが有するＣセグメントとライゲーションされる配列の一部を形成する。NotI部位は、Ｊドナーベクターの作製中に親のＪ受入カセットベクターを排除するために用いられるネガティブ選択マーカーを表す。 全てのspは、IIS型認識配列と標的オーバーハング配列との間の正しいスペーシングを創出するか、又は効率的な動作のためにNotI認識及び切断部位の間をあけるための１以上のヌクレオチドの付加を表す。 Ｊセグメント部の配置 実施例１に記載する、ヒトTRA及びTRB TCR鎖のためのTORESのＪドナーベクターの組立てに用いるＪセグメント部の図である。Ｊセグメント部をＪ受入カセットベクターに挿入して、Ｊドナーベクターを創出する。 両末端に一本鎖オーバーハングを有する直鎖状二本鎖DNA構築物を形成するための相補一本鎖オリゴヌクレオチドのアニーリングは、Ｊセグメント部を作製する。５'末端のオーバーハング*5'は、BbsIで消化されたＪ受入カセットベクター内に創出されるオーバーハング*5とアニールする。３'末端でのオーバーハング*6'は、BbsIで消化されたＪ受入カセットベクター内で作製されるオーバーハング*6とアニールする。 Ｊセグメント部は、標的Ｊ遺伝子セグメント配列を表す。Ｊドナーベクターが構築される様式(すなわち短いか又は長い)に応じて、Ｊセグメント部の５'境界が異なって規定される。短いＪドナーベクターについて、Ｊセグメント部の５'境界は、全長TCR ORFのＪ及びCDR3部分の間の規範的な境界を規定するために用いられるPhe-Ala/Gly又はTrp-Glyモチーフとして規定される。長いＪドナーベクターについて、Ｊセグメント部の５'境界は、Phe-Ala/Gly又はTrp-Glyモチーフの５'に10〜12ヌクレオチド伸びる。このことにより、Ｊドナーベクターによりコードされる全体的なTCR ORFの部分が伸び、逆に、TORESの動作において全長TCR ORFを構築するために必要なodeCDR3の長さが短くなる。Ｊセグメント部の３'末端にて、単一アデニン残基(Ａ)がコードされ、これは、Ｃ断片の最初のヌクレオチドを表す。このアデニンは、Ｊ受入カセットベクターから除外される。 eTPCへの組込みにより再構成されたTORES TRA及びTRBベクターの確認 TORESシステムを用いて、モデルTCRアルファ/ベータ対(JG9-TCR)を作製したが、これは、HLA-A*02:01において提示されるHCMV抗原に対する既知の特異性を有する。TORESは、成分2C又は2Eのいずれかの状況において各鎖を生成した(実施例３を参照されたい)。成分2C及び2Eプラスミド並びにflpリコンビナーゼをコードする構築物の、それぞれレポーターBFP及びRFPをコードする２つのゲノム組込み部位2B及び2Dを有するeTPC系統ACL-488へのトランスフェクションにより、RMCEによりeTPC-tを創出した。トランスフェクションの10日後に、成分2B及び2D選択マーカーによりコードされるBFP及びRFPシグナルが減少した個別の細胞を、単一細胞として選別した。得られたモノクローナルeTPC-t ACL-851を、親のeTPCと並行して分析し、単一の例を示した。a)及びb)親のeTPC株化細胞ACL-488及び一例としてのモノクローナルを、BFP及びRFPシグナルについてフローサイトメトリにより分析した。プロットは、BFP対RFPとしての単一生細胞を示し、eTPC株化細胞が、成分2B及び2Dに存在する選択マーカーについてポジティブであり(a)、2B/2Cと2D/2Eとの間の組込みカップル事象について予期されるように、得られるモノクローンがこれらのマーカーを喪失した(b)ことを示す。パーセンテージの値は、a)におけるダブルポジティブ細胞及びb)におけるダブルネガティブ細胞のパーセンテージを表す。c)〜f)eTPC ACL-488及びモノクローンeTPC-t ACL-851を、CD3及びTCRアルファ/ベータ(TCRab)についての抗体、並びにJG9-TCRに特異的なHLA多量体反応剤(Dex HLA-A*02:01-NLVP)で染色し、フローサイトメトリにより分析し、単一生細胞についてゲーティングした。親のeTPC系統は、細胞表面にてCD3又はTCRについてポジティブ染色を示さず(c)、HLA多量体反応剤での染色についてもネガティブであった(d)。対照的に、得られたモノクローンは、細胞表面にてCD3及びTCRについての両方の染色がポジティブであり(e)、発現されるJG9-TCRについて特異的な多量体反応剤でのポジティブ染色を示した。パーセンテージの値は、c)及びe)におけるCD3/TCRabダブルポジティブ細胞並びにd)及びf)におけるCD3/HLA-多量体ダブルポジティブ細胞のパーセンテージを表す。g)ゲノムDNAをモノクローナルeTPC-t ACL-851から調製し、成分2D'によりコードされるJG9-TCR-アルファ鎖又は成分2B'によりコードされるJG9-TCR-ベータ鎖に特異的なプライマーを用いるPCRに供した。PCR産物を、アガロースゲルにより分割し、予期されるバンドサイズを観察した。h)ゲノムDNAをモノクローナルeTPC-t ACL-851から調製し、成分2D'によりコードされるJG9-TCR-アルファ鎖又は成分2B'によりコードされるJG9-TCR-ベータ鎖に特異的なプライマー及びプローブを用いるデジタルドロップPCRに供した。TCRアルファ定常(TRAC)のイントロンについての参照アンプリコンプライマー/プローブを含めた。表は、TCRアルファ及びTCRベータに対する参照の比率を示す。0.33に近い比率は、各TCRアルファ及びベータ鎖の単一コピーが、三倍体系統であるeTPC-t系統ACL-851に存在することを示す。 eTPC-tからのeTPC-x復帰の実証 TCRアルファ及びベータ鎖をそれぞれ部位D'及びB'にて発現する親のeTPC-t株化細胞ACL-851を、GFPをコードするドナーベクター(成分Ｚ)で成分D'を交換することによりeTPC-x系統に復帰させた。成分Ｚは、GFP ORFを挟むリコンビナーゼ異種特異的F14/F15部位を含み、よって、成分D'と矛盾しなかった。eTPC-t系統ACL-851を、flpリコンビナーゼをコードする構築物と共に成分Ｚでトランスフェクションした。トランスフェクションの７日後に、GFPシグナルについてポジティブの個別の細胞を選別し、モノクローンとして成長させた。得られたeTPC-x系統を、親のeTPC-tと並行してフローサイトメトリにより分析し、単一の例を示した。a)及びb)親のeTPC-t ACL-851に由来するモノクローンeTPC-x ACL-987を、GFP発現について親の系統と共にフローサイトメトリにより分析した。プロットは、ゲーティングした単一生細胞のSSC対GFPパラメータを示す。親の株化細胞は、GFP発現がない(a)が、モノクローンACL-987は、予期されたようにGFPを得て(b)、このことは、TCRアルファORFがGFP ORFに交換されたことを示す。c)及びd)親のeTPC-t ACL-851と共に、親のACL-851に由来するモノクローンeTPC-x ACL-987を、CD3及びTCRabについての抗体で染色し、フローサイトメトリにより分析した。プロットは、単一生細胞に対してゲーティングしたCD3対TCRabパラメータを表す。親の細胞は、CD3及びTCRabの両方についてポジティブ染色を示した(c)が、派生したモノクローンは、両方についてネガティブ染色を示し(d)、このことは、派生したeTPC-x系統におけるTCRアルファORFの喪失を確認する。 eTPC-tのプールを創出するためのeTPC-xへのショットガン組込みの実証 eTPC-tプールを、成分B'において単一TCRベータ鎖を発現する親のeTPC-x系統から創出した。eTPC-x系統は、利用可能な部位2DにてレポーターとしてGFPを発現した。親の鎖を含む64のバリアントTCRアルファ鎖のプールを、TORESシステムを用いて構築して、成分2Eのプールを表した(実施例５を参照されたい)。親のTCR鎖対は、HLA-A*02:01において提示されるHCMV抗原についての既知の特異性を有するJG9-TCRを表す。親のeTPC-x ACL-987を、flpリコンビナーゼをコードする構築物と共に成分2Eプールでトランスフェクションした。ポリクローナル系統は、トランスフェクションの10日後に、GFPポジティブ細胞についての選別により選択した。得られたACL-988ポリクローナルeTPC-tは、その後、GFPについてのネガティブ染色及びHLA多量体反応剤(DEX HLA-A*02:01-NLVP)についてのポジティブ又はネガティブ染色に基づいて選別した。回収した単一細胞をシーケンシングして、コードされるTCR-アルファ鎖を同定し、親のTCR鎖対に特異的なHLA多量体反応剤を用いる染色の点で、天然型TCR-ベータ鎖と対にしたTCR-アルファ鎖バリアントの各々との並行分析と比較した。a)及びb)親のeTPC-x ACL-987系統及び得られたポリクローンeTPC-t ACL-988系統を、GFP発現についてフローサイトメトリにより分析した。プロットは、単一生細胞のSSC対GFPパラメータを表す。親の株化細胞は、GFPについてのポジティブシグナルを示し、このことは、インタクトな成分2Dを示す(a)。派生したポリクローナル系統は、GFPについて半分ポジティブ及び半分ネガティブを示し(b)、このことは、ポリクローナル集団における細胞の半分が、2DにてGFP ORFがTCRアルファORFに交換されて成分2D'を形成した可能性があることを示す。c)及びd)親のeTPC-x ACL-987系統及び得られたポリクローンeTPC-t ACL-988系統を、CD3抗体及び親のJG9-TCRに特異的なHLA多量体(DEX HLA-A*02:01-NLVP)で染色し、フローサイトメトリにより分析した。プロットは、単一生細胞のCD3対HLA多量体パラメータを表す。親の株化細胞は、CD3及びHLA多量体両方の染色についてネガティブである(c)。d)の左のパネルは、ゲーティングしたGFPネガティブ事象を表し、右のパネルはGFPポジティブ事象を表す。成分2Dが2D'に変換されたGFPネガティブ事象だけが、CD3ポジティブ染色を示し、このうちの部分集合が、HLA多量体についてのポジティブ染色を示す。ゲーティングしたHLA多量体ネガティブ及びポジティブゲートからの単一細胞を選別し、成分2D'にて組み込まれたORFをシーケンシングして、TCRアルファORFのアイデンティティを決定した。 e)64全てのJG9-TCR-アルファバリアントを、各々が独立して親のeTPC-x(ACL-987)をトランスフェクションできる発現構築物にクローニングした。HLA-A*02:01-NLVP四量体反応剤に対する相対染色単位(relative staining unit：RSU)を各々について決定した。RSUは、CD3ネガティブ集団に対するCD3ポジティブ集団についてのHLA-A*02:01-NLVP四量体シグナルの平均蛍光強度(MFI)の比として算出し、HLA多量体反応剤に対する各TCR鎖対バリアントの結合強度の指標である。図e)にプロットした各点は、64の各バリアントについて観察されたRSUを表す。塗りつぶしていない丸は、GFPネガティブ/HLA多量体ポジティブゲートから回収した、シーケンシングした細胞に相関する。塗りつぶしていない三角は、GFPネガティブ/HLA多量体ネガティブゲートから回収した、シーケンシングした細胞に相関する。 成分2Fの機能の実証 成分2Fを有するeTPC-t株化細胞(ACL-1277)であって、成分2B'及び2D'でのTCR鎖が、HLA-A*02:01において提示されるHMCV抗原性ペプチドNLVPMVATVに特異的なTCR対をコードする株化細胞。成分2Fレポーターは、RFPであった。このeTPC-tを、HLA特徴が異なる様々なAPC系統と、モデルペプチド抗原の存在下及び不在下で24時間接触させ、接触させた培養物をフローサイトメトリにより分析した。フローサイトメトリヒストグラムプロットは、APCにより提示されなかった特異的表面マーカーについての抗体染色により同定された生存単一Ｔ細胞のRFPシグナルに対する事象カウントを示す。a)及びb)HLA-A*02:01のみを発現するAPC細胞(ACL-209)を、NLVPMVATV(a)又はVYALPLKML(b)ペプチドでパルスし、その後、eTPC-tと共に24時間共培養した。c)及びd)HLA-A*24:02のみを発現するAPC細胞(ACL-963)を、NLVPMVATV(c)又はVYALPLKML(d)ペプチドでパルスし、その後、eTPC-tと共に24時間共培養した。e)HLA-A*02:01のみを発現するAPC細胞(ACL-209)を、ペプチドパルスなしで放置し、その後、eTPC-tと共に24時間共培養した。f)細胞表面でHLAを発現しないAPC細胞(ACL-128)を、NLVPMVATVでパルスし、その後、eTPC-tと共に24時間共培養した。RFPシグナルは、NLVPMVATV(発現TCRの既知の標的を表す)でパルスしたHLA-A*02:01発現細胞の存在下でのみeTPC-t ACL-1277において著しく増加した。ヒストグラムのゲート及び値は、RFPポジティブ及びRFPネガティブゲートにおける事象のパーセンテージを反映する。このことは、eTPC-tにより発現されるTCRspと同族HLA/抗原との結合(aAPX:aAM)に対する成分2Fの特異的応答を示す。
材料及び方法
DNAシーケンシング
ここで示す実施例の中で言及する全てのシーケンシングは、サンガー法により行い、GATC Biotec AB、スウェーデンが行った。
DNA合成
ここで示す実施例の中で言及する全てのDNA合成は、Integrated DNA technologies BVBA、ベルギーが行った。
125 bpより大きいDNA断片は、「gBlock遺伝子断片」生成物として、直鎖状二本鎖DNA分子として合成した。
15〜60 ntのDNA断片は、「カスタムオリゴヌクレオチド断片」生成物として、一本鎖DNA分子として合成した。
61〜124 ntのDNA断片は、「Ultramer DNAオリゴヌクレオチド断片」生成物として、一本鎖DNA分子として合成した。
ベクターライブラリ組立て及びクローニング
実施例に記載するベクターの構築は、当業者に公知の様々な方法を含み、具体的な反応組成物は、実施例１〜３に詳細に概説する。以下の鍵となる材料を、記載する手順において用いた：
CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)の組立て
odeCDR3は、部分相補一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールすることにより、慣例的に組立てた。詳細な反応組成及び条件は、実施例２に記載する。以下の鍵となる材料を、記載する手順において用いた：
TCR再構成
詳細な反応組成及び条件は、実施例３に記載する。以下の鍵となる材料を、記載する手順において用いた：
細胞のトランスフェクション
本出願で用いた全ての細胞は、HEK293細胞に由来する。トランスフェクションの前日に、細胞を、1.2〜1.4×106細胞/60mmディッシュの密度にて、90% DMEM+2mML-グルタミン+10% HI-FBS(Life Technologies)に播種した。
次の日に、65%集密の細胞を、合計5ug DNA及びjetPEI(登録商標)(Polyplusトランスフェクション試薬、Life Technologies)で、６のN/P比にてトランスフェクションした。DNA及びjetPEI(登録商標)のストック溶液を、それぞれ滅菌1M NaCl及び150mM NaClで希釈した。各溶液の最終容量は、全混合容量の50%に等しかった。次いで、PEI溶液を希釈DNAに加え、混合物を室温にて15分間インキュベートした。最後に、DNA/PEI混合物を、細胞フィルムを乱さないように注意しながら、60mmディッシュに加えた。細胞を48時間、(37℃、５% CO2、95%相対湿度)にてインキュベートした後に、DNA送達マーカー発現分析を行った。培地は、トランスフェクションの前に交換した。
組込みカップル対間のRMCE
RMCE組込みのために、細胞を、FLPをコードするDNAベクター(V4.I.8)0.6μg、2μgの成分2C/2Y、2μgの成分2E/2Z、0.4μgのDNA送達を追跡するためのマーカーをコードするDNAでトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後に、GFP又はRFPポジティブのいずれかの、DNA送達マーカーについてポジティブの細胞を、FACSにより選別した。トランスフェクションの４〜10日後に、成分2D及び2B選択マーカーによりコードされる蛍光タンパク質シグナルの減少を示す個別の細胞を、FACSにより選別した。ACL-987の作製については例外で、GFPポジティブを示す個別の細胞をFACSにより選別した。
RSUの特徴決定のためのTCR鎖対の一過性発現
一過性発現のために、細胞を、FLPをコードするDNAベクター(V4.I.8)、JG9-TCR-アルファバリアント(VP.7751.RC1.A1〜VP.7751.RC1.H8)、JG9-TCR-ベータWT鎖(V3.C.5)及びDNAベクタービヒクル(V1.C.2)でトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後に、全ての細胞をHLA-A*02:01-NLVP四量体及び抗CD3抗体で染色した。RSUは、CD3ネガティブ集団に対するCD3ポジティブ集団についてのHLA-A*02:01-NLVP四量体シグナルの平均蛍光強度(MFI)の比として算出し、各TCR鎖対バリアントの結合強度の指標であった。
蛍光標示式細胞選別(FACS)
単一細胞選別又はポリクローン選別は、標準的な細胞選別法により、BDInflux装置を用いて達成した。簡単に述べると、ACL細胞を、Try-pLE(商標)エクスプレストリプシン(ThermoFisher Scientific)を用いて採集し、適切な容量のDPBS 1×(Life Technologies)に再懸濁した後に、細胞選別を、20% HI-FBS及びAnti-Anti 100X(Life Technologies)を含むDMEM 1×培地中で行った。
細胞を、HLA-多量体反応剤で氷上で10分間、次いで、CD3及び/又はTCRab抗体で染色した。BDInflux装置による特異的細胞蛍光特性の検出は、表４に定義する。
モノクローナル作製のための単一細胞の選別、興味対象の表現型を示す細胞を、200 ulの成長培地を含む96ウェルプレートに入れた。試料あたり１〜２枚のプレートを選別した。ポリクローナル細胞選別は、細胞ソーターInflux(商標)(BD Bio-sciences)における２ウェイ選別設定を用いて、培地を含むFACSチューブに割り当てた。
JG9-TCR-アルファバリアントの分子的特徴決定のための単一細胞選別は、５μLのヌクレアーゼフリー水を予め充填したPCRプレートに選別した。検体は、その後の処理まで急速冷凍した。
遺伝子特徴決定のためのゲノムDNA抽出
DNAは、QIAamp DNAミニキット(Qiagen)を用いて５×106細胞から抽出した。DNAは、1×TE (10mM Tris pH8.0及び0.1 mM EDTA)中に貯蔵した。
成分2B又は2DへのTRA-ORF及びTRB-ORFのRMCE組込みを評価するためのPCR反応
TRA-ORFの組込みを評価するため、TRA-Cセグメント(フォワードプライマー1.F.7)及びゲノム受入部位に予め存在する部分であるsv40pAターミネータ(リバースプライマー15.H.2)にアニールするプライマーを用いた。予測サイズ566bp。
TRB-ORFの組込みを評価するため、TRB-Cセグメント(フォワードプライマー1.F.9)及びゲノム受入部位に予め存在する部分であるsv40pAターミネータ(リバースプライマー15.H.2)にアニールするプライマーを用いた。予測サイズ610bp。
PCR産物を、PowerPac Basic(Bio-Rad)を用いて1×TAE緩衝液中で１%アガロースゲルに泳動し、10,000倍希釈のsybersafeで染色し、Fusion SL(Vilber Lourmat)で分析した。
DNA送達後にゲノム中のTRA-ORF及びTRB-ORFのコピー数を評価するためのddPCR反応
選択したACL-851モノクローンのDNAを、興味対象のTCR_ORF Ｃセグメントを標的にする特異的プライマー及びプローブを用いることにより分析した。
TRA-ORFコピー数を評価するために、TRA-Cセグメントにアニールするプライマー及びプローブ(フォワードプライマー1.F.7、リバースプライマー1.F.8及びプローブ1.G.1)を用いた。
TRB-ORFコピー数を評価するために、TRB-Cセグメントにアニールするプライマー及びプローブ(フォワードプライマー1.F.9、リバースプライマー1.F.10及びプローブ1.G.2)を用いた。
全ての場合において、プライマー10.A.9及び10.A.10を、HEXとコンジュゲートした蛍光プローブ10.B.6と一緒に用いて、染色体のコピー数を決定するために参照遺伝子(TRAC)を同時にスクリーニングした。組込みコピー数は、HEK293細胞が参照遺伝子(TRAC)について三倍体であるとみなした。
ドロップレットデジタルPCRの前に、DNAをMfel(NEB)で消化して、直列の組込みを分離した。反応の構成及びサイクル条件は、プローブについてddPCR(商標)Supermix(dUTPなし)(Bio-Rad)のプロトコールに従い、QX200(商標)ドロップレットリーダー及びドロップレットジェネレーター並びにC1000 Touch(商標)ディープウェルサーマルサイクラー(Bio-Rad)を用いた。
データは、FAMの検出のためにCh1及びHEXの検出のためにCh2を用いて、QuantaSoft(商標)ソフトウェアを用いて取得した。
単一Ｔ細胞からのTCRアルファ及びベータ鎖のシーケンシング
FACSにより選別した個別のeTPC-t細胞を、TRA及びTRBの各々についてＶ領域特異的プライマーコレクションを必然的に伴う二工程増幅プロセス、続いて、配列分析のためのTRA及びTRBアンプリコンを創出するペア型ネステッドPCR反応に供した。この手順は、以前に記載されている(Hanら、Nat Biotechnol. 2014 32(7): 684〜692)。以下の材料を、記載する手順において用いた：
機能的成分2Fの実証
eTPC-t及びAPC細胞を、RPMI+10%熱不活化胎児ウシ血清(完全培地)中で、0.2×106〜1.5×106細胞/mlの間、37℃、90%相対湿度及び５%CO2にて慣例的に培養した。ペプチドNLVPMVATV及びVYALPLKMLは、Genescriptにより合成され、凍結乾燥された状態で受領した。ペプチドの一次ストックを10% DMSOに懸濁し、-80℃にて貯蔵した。作業ストックは、50μＭにて完全培地(50×濃縮)中で処理時に調製した。HLA-A*02:01(ACL-209)又はHLA-A*24:02(ACL-963)又はHLA-ヌル(ACL-128)を提示する以下のAPCを用いた。eTPC-t株化細胞(ACL-1277、成分2A)は、２つのユニークゲノム受容部位(成分2B、2D)を有するように操作して、HLAヌルとなるように操作し、天然型CD3発現を利用し、二成分 合成応答エレメント(成分2F)を有した。更に、ACL-1277は、成分B、DがB'/D'に変換されており、pHLA: HLA-A*02:01-NLVPMVATVに特異的なTCRspをコードするTCRアルファ/ベータORFが組み込まれている(実施例８を参照されたい)。
抗原パルス手順
APC細胞の活発に成長している培養物(0.5〜1.0×106細胞/ml)を懸濁し、細胞濃度を決定するために試料を採取して計数した。その後、１百万細胞を採集し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS、Gibco)で１回洗浄した後に、細胞濃度１〜２×106細胞/mlにて１μＭのペプチドと又はペプチドなしで完全培地に懸濁した。細胞を２時間、標準培養条件で、24ウェル培養プレートにてインキュベートした。２時間後に、細胞を採集し、遠心分離(400 rcf、３分)によりペレットにした後にDPBSで３×10 mlで洗浄した。細胞を、その後、完全培地中に0.2×106細胞/mlにて懸濁した。
eTPC-t採集
eTPC-t細胞の活発に成長している培養物(0.5〜1.0×106細胞/ml)を懸濁し、細胞濃度を決定するために試料を採取して計数した。細胞を採集し、PBSで１回洗浄し、次いで、完全培地中に0.6×106細胞/mlの濃度にて懸濁した。
eTPC:AシステムにおけるeTPC-t及びAPCの接触
96ウェル丸底プレートの各ウェルに、50μlの完全培地、50μlのAPC、続いて50μlのeTPC-tを加えた。これは、１：３の比率でのおよそ10,000のAPC及び30,000のeTPC-tで、およそ0.27×106細胞/mlの全細胞濃度に等しかった。細胞混合物を、次いで、標準培養条件にておよそ24時間インキュベートした。
染色及び分析
24時間のインキュベーションの後に、細胞を採集し、0.75 mlのＶ底Micronicチューブに移植し、500μl DPBSで1回洗浄し、その後、以下のようにして死細胞マーカー(DCM-APC-H7)で染色した。各ウェルに、25μlの染色溶液を加え、細胞を混合により懸濁し、次いで、15〜20分インキュベートした。染色溶液は、100μlの染色溶液当たり0.5μl DCM-APC-H7で構成されていた。インキュベーションの後に、細胞を、500μlのDPBS+2%FCS(洗浄緩衝液)で２回洗浄した。細胞を、次いで、eTPC-tに独特の表面マーカーで染色した。各ウェルに、30μlの染色溶液を加え、細胞を混合により懸濁し、次いで、30〜45分インキュベートした。染色溶液は、100μlの染色溶液当たり2.5μlの抗myc-AF647で構成された(クローン9E10、Santa Cruz Biotech)。インキュベーションの後に、細胞を、500μlの洗浄緩衝液で２回洗浄し、次いで、200μlの洗浄緩衝液に懸濁し、次いで、FACSによりLSR-Fortessa(BD Biosciences)で分析した。
実施例１ ヒトTRA及びTRBのためのTORESシステムの設計及び組立て
TORESは、所定のTCR鎖についてのＶ-Ｃエントリーベクターライブラリ及びＪドナーベクターライブラリからなる。選択されたＶ-Ｊ-Ｃの状況に挿入される標的deCDR3配列と組み合わされた場合に、全長TCR ORFを再構成できる。odeCDR3配列の特徴及び/又はＶ/Ｊ/Ｃ選択を変えることにより、この再構成工程は、TCR ORF操作ワークフローにおける配列多様化工程にもなり得る。本実施例では、ヒトTRA及びTRB鎖のための完全TORESシステムの設計及び組立てについて記載する。
天然型ヒトTRAレパートリーのためのTRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの設計及び組立て
本実施例では、天然型ヒトTRA V-C配列レパートリーを含むTRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの設計及び組立てについて記載する。モジュール組立て方法を用いるので、Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの構築が、ヒト、他の生物からの他のTCR鎖又は合成TCR鎖について迅速にサイクル可能になる。
TRA V-Cベクターライブラリのために必要なDNA成分は：
Ｉ．ヒトゲノムにおいてコードされる各機能的TRA Ｖ遺伝子セグメントについてのTRA Ｖクローニング断片
II．単一TRA Ｃクローニング断片
III．Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格
本実施例では、単一制限酵素及びリガーゼ反応において標的Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格に組立てられるように、TRA V及びTRA Cクローニング断片を合成して用いた。
本実施例では、異種特異的FRTＶ-Ｃエントリーベクター骨格の対を用いて、TRA及びTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを組立てた。各TRA及びTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリは、Ｖ-Ｃエントリーシステムに含まれる５'及び３'遺伝子エレメント、成分2C及び2Eである、別個のフリッパーゼ認識標的(FRT)配列を含むベクター骨格を用いて構築する。よって、このTORESの動作において作製される生成物TRA/TRB対は、５'及び３'遺伝子エレメント内に適合するFRTを含むゲノム受容部位(成分2B及び2D)を含むeTPC細胞への迅速ゲノム組込みに供することができる。
本実施例では、TRA Ｖ-Ｃエントリーベクターは、５'及び３'遺伝子エレメントとして、それぞれF14及びF15 FRT配列を含む。このF14/F15 Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格配列は、SEQ0688と表す。
本実施例では、TRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリは、IIS型制限酵素BbsIを用いて構築する。全長TRA ORFを再構成するための完全TORESの機能化において用いるIIS型制限酵素は、BsaIである。
合成TRA Ｖクローニング断片の設計
本実施例におけるTRA Ｖクローニング断片の遺伝子エレメントの配置を、図25に示す。
TRA Ｖクローニング断片の各末端は、PCRによる断片全体の増殖のための、20ヌクレオチドの標準化された５'及び３'プライマーバインドDNA配列をコードする。
５'プライマーバインドに隣接して、BbsI IIS型制限酵素結合部位がコードされ、BbsI結合部位の方向は、BbsI酵素がDNAをその認識配列に対して３'で切断するように手引きする。BbsI酵素活性により作製されるオーバーハングは、オーバーハング*1によりコードされる。このオーバーハングは、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格のアームを用いる定方向リガーゼ依存クローニングを許容するように設計されている。
コンセンサスコザック配列は、最終の再構成されかつ発現されたTRA mRNAの翻訳の効率的な開始のために、TRA Ｖ遺伝子セグメント内のATG開始コドンの５'にコードされる。本実施例では、各TRA Vセグメントは、TRA Vセグメントの最初のメチオニン残基からその最後のシステイン(Cys)まで全てのアミノ酸をコードする。このCys残基は、一般的に、TRA可変遺伝子セグメントの境界として認識され、この欠失は、天然に存在する組換え及び機能的TRA鎖において稀である。必要であれば、天然型ヒトTRA Ｖコンセンサス配列を編集して、TORESを用いる組立て又は再構成動作において用いられる任意の制限酵素、及び下流の用途において用いられる任意の酵素についての認識配列を除去する。
TRA Vセグメントの３'末端に、BsaI IIS型制限酵素結合部位BsaI←がコードされる。BsaI結合部位の方向は、BsaI酵素がDNAをその認識配列に対して５'で切断するように手引きする。得られるオーバーハング配列は、Ｖセグメントエレメントの最後のシステインコドンと、システインに先行するアミノ酸コドンの３番目のヌクレオチドとを含むように設計されている。よって、設計された配列に対するBsaIの作用は、TRA Vセグメントの３'末端にてTRA V Cys-オーバーハング‡1を創出する。本実施例では、このCys-オーバーハング‡1は、全ての含まれるTRA Vセグメントのうちで標準化されており、このことにより、クローニング方策が単純かつ一定になる。必要であれば、TRA V遺伝子エレメントをコードするヌクレオチドを変更して、翻訳されるアミノ酸配列を変化させずに、この標準化されたオーバーハングをコードするようにする。このBsaI←部位は、全長TRA再構成反応中利用する。
本実施例では、Ｖ-Ｃエントリーベクターネガティブ選択マーカーは、NotI制限酵素結合部位である。NotI結合部位を構築するために、TRA Ｖクローニング断片とTRA Ｃクローニング断片とが一緒にライゲーションされるときに、部位の２つの半分を組み合わせる。TRA Ｖクローニング断片は、６ヌクレオチドのNotI ５'セグメントをコードする。
３'プライマーバインド配列の５'末端に、第２のBbsI制限部位がコードされ、これは、BbsI酵素がDNAをその認識配列に対して５'で切断するようにする、BbsI←。設計された配列に対するBbsIの作用は、よって、４ヌクレオチドのオーバーハングであるNotI ５'オーバーハングを創出し、これは、TRA C DNA断片に作製されるオーバーハングと相補的であり、ライゲーションによりNotI結合部位を再構成するように設計されている。
Spは、IIS型制限酵素結合部位及び切断部位の正しいスペーシングを、そのような部位に隣接する場合に達成するための、TRA Ｖクローニング断片の特定の点へのヌクレオチド付加を表す。NotI制限酵素結合部位配列を挟むSpブロックは、効率的な作用のために、適切にNotI結合及び切断部位の間をあけるために用いられる。ヌクレオチドの選択は、BsaI結合部位のDAMメチル化の可能性のある影響を考慮した。
天然型ヒトTRA鎖の本実施例におけるTRA Ｖクローニング断片についての全長DNA配列を、SEQ0001〜SEQ0046として示す。これらの配列は、５'プライマーバインド及び３'プライマーバインド配列を含む。
合成TRA Ｃクローニング断片の設計
本実施例におけるTRA Ｃクローニング断片の遺伝子エレメントの配置を、図26に示す。
TRA Ｃクローニング断片の各末端は、PCRによる断片全体の増殖のための、20ヌクレオチドの標準化された５'及び３'プライマーバインドDNA配列をコードする。
５'プライマーバインド配列に隣接して、BbsI制限酵素認識部位がコードされるので、BbsI酵素がDNAをその認識配列BbsI→に対して３'で切断する。
TRA Ｃクローニング断片は、６ヌクレオチドのNotI ３'セグメントをコードし、これは、Ｖ-Ｃエントリーベクターネガティブ選択マーカーを作り上げるNotI認識部位を完成する。隣接BbsI→制限部位は、NotI ３'エレメントに作用して、４ヌクレオチドのNotI ３'オーバーハングを創出する。このオーバーハングは、TRA V DNA断片上に作製されるNotI ５'オーバーハングに相補的であり、Ｖ-Ｃエントリーベクターの組立ての際に完全NotI結合部位を再構成するように設計される。
NotI ３'エレメントの３'末端に、TRA Ｃクローニング断片は、BsaI制限酵素結合部位BsaI→をコードする。BsaI結合部位の方向は、BsaI酵素がDNAをその認識配列に対して５'で切断するように手引きする。得られるオーバーハング配列は、TRA C遺伝子断片の最初のシトシンから開始するように設計されている、TRA Cオーバーハング‡3。このBsaI→部位は、全長TRA再構成反応中利用される。BsaI→酵素は、Ｖ-ＣエントリーベクターにおいてコードされるTRA Cセグメントに対して作用して、再構成反応中に必要なTRA Cオーバーハング‡3を創出する。最初のグルタミンコドンの５'のシトシン残基から停止コドンまでのコンセンサスTRA Ｃ配列が、本実施例のTRA Ｃクローニング断片に含まれる。
３'プライマーバインドの５'に、BbsI制限酵素認識配列BbsI←がコードされる。BbsI結合部位の方向は、BbsI酵素がDNAをその認識配列に対して５'で切断するように手引きする。BbsI酵素活性により作製されるオーバーハングは、オーバーハング*2によりコードされる。このオーバーハングの設計は、組立て中にＶ-Ｃエントリーベクター骨格のアームを用いる定方向リガーゼ依存クローニングを許容する。
Spは、IIS型制限酵素結合部位及び切断部位の正しいスペーシングを、そのような部位に隣接する場合に達成するための、TRA Ｃクローニング断片の特定の点へのヌクレオチド付加を表す。NotI制限酵素結合部位配列を挟むSpブロックは、効率的な作用のために、適切にNotI結合及び切断部位の間をあけるために用いられる。ヌクレオチドの選択は、BsaI結合部位のDAMメチル化の可能性のある影響を考慮した。
天然型ヒトTRA鎖の本実施例におけるTRA Ｃクローニング断片についての全長DNA配列を、SEQ0047として示す。この配列は、５'プライマーバインド及び３'プライマーバインド配列を含む。
哺乳動物細胞における再構成されたTRA ORFの一過性発現のためのＶ-Ｃエントリーベクター骨格の設計
本実施例では、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格をpMAプラスミドから導く。これは、Col E1複製起点であるoriを、抗生物質耐性ベータ-ラクタマーゼ遺伝子、ポジティブ選択#1と共にコードする。ベータ-ラクタマーゼは、アンピシリン及びカルベニシリンのようなベータ-ラクタム抗生物質のペニシリン群に対する耐性を付与する。
図27に示すベクター骨格は、完全に再構成されたTRA ORFの下流の用途のための適切な機能性を付与する、必要な遺伝子エレメントをコードする。本実施例では、５'遺伝子エレメントは、CMV構成性哺乳動物プロモータをコードし、３'遺伝子エレメントは、SV40pAポリアデニル化シグナルをコードして、哺乳動物細胞における完全に再構成されたTRA ORFの一過性発現を許容する。
本実施例では、ベクター骨格は、オーバーハング*1'及びオーバーハング*2'をそれぞれ作製するAcc65I及びXbaI制限酵素結合部位をコードする。オーバーハング*1'は、TRA Ｖクローニング断片内のオーバーハング*1に相補的である(図25)。オーバーハング*2'は、TRA Ｃクローニング断片内のオーバーハング*2に相補的である(図26)。これらの相補オーバーハングは、Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格へのTRA V及びTRA Ｃクローニング断片の定方向クローニングを許容する。
Sp特徴は、効率的な作用のためにAcc65I及びXbaI制限酵素認識部位の距離をあけるために必要な、２つの部位の間に付加されたヌクレオチドを表す。
FRT F14部位をコードする５'遺伝子エレメントから、FRT F15をコードする３'遺伝子エレメントまでのベクター骨格の配列を、SEQ0688として表す。
TRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの組立ての方法
この方法は、選択されたTRA Ｖクローニング断片(図25)及びTRA Ｃクローニング断片(図26)を所定のＶ-Ｃエントリーベクター骨格(図2)に組立てて、TRA Ｖ-Ｃエントリーベクター(成分1A、図2a)を創出するための標準的な分子生物学技術を利用する。本実施例では、方法は、制限酵素消化及びライゲーション反応を単一反応で行う。
消化及びライゲーション反応について
100 ngの直鎖状ベクター骨格(ACC65I及びXbaI消化により直鎖化)
10 ngのTRA V遺伝子断片
20 ngのTRA C遺伝子断片
2μl 10×NEBリガーゼ緩衝液
0.5μlのBbsI
１μlのT4 DNAリガーゼ
20μlまでのH2O
反応条件
工程１：37℃にて２分
工程２：16℃にて３分
工程１及び２を20回反復
50℃にて５分
80℃にて５分
室温に戻す
得られた生成物で、コンピテント大腸菌(E.coli)細胞を形質転換し、該細胞を、カルベニシリン耐性コロニーについて選択する。選択されたコロニーから単離されるプラスミドをシーケンシングして、正しく組立てられた構築物を決定する。この手順を、独立したＶセグメントクローニング断片の各々について反復する。得られた構築物は、哺乳動物細胞における再構成されたTRAの一過性発現において後で用いるための全長TRA ORFの再構成において用いるためのTRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを作り上げる。TRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを作り上げるクローニングされたＶ-Ｃ断片の配列を、SEQ0049〜SEQ0094として示す。示した配列は、可変セグメントの開始コドンに先行するコザック配列から、Ｃセグメントの停止コドンまで全てを含む。
天然型ヒトTRAレパートリーのためのTRA Ｊドナーベクターライブラリの設計及び組立て
本実施例では、TRA Ｊ受入カセット断片を構築してＪドナーベクター骨格に挿入して、Ｊ受入カセットベクターを創出する。その後、合成TRA Ｊセグメント部をTRA Ｊ受入カセットベクターに組立てて、Ｊドナーベクターライブラリを創出できる。このフレキシブル多工程組立て法により、Ｊセグメント長のバリエーションのようなＪドナーセグメント特徴の迅速で対費用効果の良い操作が可能になる。
TRA Ｊドナーベクターライブラリに必要なDNA成分は：
Ｉ．TRA Ｊ受入カセット断片
II．Ｊドナーベクター骨格
III． TRAＪ受入カセットベクター
IV. TRA Ｊセグメント部
である。
合成TRA Ｊ受入カセット断片の設計
２つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのアニーリングを用いて、DNA断片の各末端に４ヌクレオチド一本鎖オーバーハングであるオーバーハング*3及びオーバーハング*4を設計により含む受入部位カセット断片を作製する。Ｊドナーベクター骨格への定方向リガーゼ依存クローニングを許容して、図28に示すTRAＪ受入カセットベクターを創出する４ヌクレオチドオーバーハング。
IIS型制限部位の対、BsaI←及びBsaI→は、受入部位カセットDNA断片の５'及び３'末端に位置する。BsaI認識部位の方向は、BsaI酵素がDNAを構築物の中央に向かって切断するように手引きするためである。これらの部位は、オーバーハング‡2-5'及びオーバーハング‡3-3'を作製することにより、TRA ORF再構成プロトコール中に用いられる。オーバーハング‡3は、受入カセット断片にコードされるTRA Ｃ部の成分であるが、オーバーハング‡2は、TRA Ｊセグメント部がクローニングされた後に規定される(下記参照)。
IIS型認識部位のBbsI対BbsI←及びBbsI→は、カセットの中央近くにコードされ、合成されたTRA Ｊセグメント部(下記参照)に含まれる相補オーバーハングの創出において、TRA Ｊドナーベクターの組立てのために用いられる。
５' BbsI部位であるBbsI←は、BsaIに切断して、この機能の３'末端にオーバーハング*5を創出する。3 BbsI部位であるBbsI→は、TRA Ｃ部エレメントに切断して、このエレメントの５'末端にオーバーハング*6を創出する。これらのオーバーハングは、この構築物のBsaI 及びTRA Ｃ部機能の内部にコードされて、最終の再構成されたTRA ORFに組み込まれる可能性のある非天然型ヌクレオチドの付加を回避する。
BbsI→酵素が作製したオーバーハングとBsaI←酵素が作製したオーバーハングとの間の領域は、TRA C遺伝子断片であるTRA Ｃ部の２番目のヌクレオチドから開始するTRA Ｃ領域の一部をコードする。TRA Ｃ遺伝子断片の２番目のヌクレオチドから開始する動機は、ヒトTRA遺伝子座TORESの本実施例においては、得られるオーバーハングがTATCであってパリンドロームオーバーハングではないからであり、これは、TRA Ｃ遺伝子断片の最初が含まれている場合にそうである(得られるオーバーハングATAT)。パリンドロームオーバーハングは、２つのベクター末端が必要なTRA Ｊセグメント部インサートなしで連結することを許容するので、回避すべきである。BbsI→部位の向きは、全てのTRA Ｊ断片３'末端の、受入部位カセットにおけるTRA Ｃ領域の５'開始へのインフレームリガーゼ依存クローニングを許容する。BsaI←部位の向きは、完全TORESを用いるTRA全長ORF再構成プロトコールの最終工程において、TRA Ｃ領域の開始と残りのTRA Ｃ断片とのインフレームリガーゼ依存クローニングを許容する。
２つのBbsI結合部位の間は、酵素NotIの８ヌクレオチド認識配列である。この制限部位は、親のプラスミドコロニーのバックグラウンドを低減するためのネガティブ選択マーカーとして利用される。これは、TRA Ｊ遺伝子断片挿入を行った後にNotI酵素が加えられたときに達成される。よって、TRA Ｊ遺伝子断片を正しくクローニングしているプラスミドは、NotI酵素の存在下で環状のままであるが、そのNotI部位がTRA Ｊ遺伝子断片に交換されていない親のプラスミドは直鎖状になり、次いで、細菌の形質転換が偏って、完全環状TRA Ｊ断片含有プラスミドを増殖させる。
Spは、IIS型制限酵素結合部位及び切断部位の正しいスペーシングを、そのような部位に隣接する場合に達成するための、TRA Ｊ受入カセット断片の特定の点へのヌクレオチド付加を表す。Spは、NotI制限酵素結合部位配列を挟むSpブロックは、効率的な作用のために、適切にNotI結合及び切断部位の間をあけるために用いられる。更なるヌクレオチドを含めて、最終の再構成された全長TRA内の正しいリーディングフレームを維持する。ヌクレオチドの選択は、BsaI結合部位のDAMメチル化の可能性のある影響を考慮した。
天然型ヒトTRA鎖の本実施例におけるTRA Ｊ受入カセット断片オリゴヌクレオチドのための全長DNA配列を、SEQ0095及びSEQ0096として示す。フォワード(F1)及びリバース(R1)オリゴヌクレオチド配列を共に列挙する。
Ｊドナーベクター骨格の設計
Ｊドナーベクター骨格を用いて、TRA Ｊ受入カセット断片を挿入して、TRA Ｊ受入カセットベクターを創出する。この骨格は、よって、Ｊドナーベクターライブラリ全体が有する。TRA全長ORFを創出するための最終反応において、この骨格は、反応副生成物であり(図2e)、よって、図29に示すように最小限の特徴を有する。
本実施例では、Ｊドナーベクター骨格は、Col E1複製起点であるoriをコードする。抗生物質耐性は、アミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ遺伝子であるポジティブ選択#2である。アミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼは、カナマイシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン及びゲンタマイシンのような抗生物質に対する耐性を付与する。この代わりのポジティブ選択は、ポジティブ選択#1で選択されるＪドナーベクターが全長TCR ORF再構成の後に選択されることが確実にないようにするために用いられる。
本実施例では、相補オーバーハングであるオーバーハング*3'及びオーバーハング*4'をそれぞれ作製するベクターEcoRI及びXhoI制限酵素結合部位。オーバーハング*3'は、TRA Ｊ受入カセット断片内に含まれるオーバーハング*3に相補的である。オーバーハング*4'は、TRA Ｊ受入カセット断片内に含まれるオーバーハング*4に相補的である。これらのオーバーハングは、TRA Ｊ受入カセット断片の定方向クローニングを許容する。
Spブロックは、効率的な作用を確実にするためにEcoRIとXhoI制限酵素結合部位の間の距離をあけるための、２つの部位の間に付加されたヌクレオチドを表す。
本実施例では、Ｊドナー骨格をSEQ0097として表す。
TRA Ｊ受入カセットベクターを組立てる方法
この方法は、所定のTRA Ｊ受入カセット断片(図28)を所定のＪドナーベクター骨格(図29)に組立てて、TRA Ｊ受入カセットベクター(図30)を創出するための標準的な分子生物学技術を利用する。得られるTRA Ｊ受入カセットベクターを用いて、TRA Ｊセグメント部(図31)を挿入して、TRA Ｊドナーベクター(成分1B、図2b)を構築する。
まず、TRA Ｊ受入カセットDNA断片を形成する２つのオリゴヌクレオチドをリン酸化してアニールする。
反応ミックス
オリゴヌクレオチド(センス鎖)(100μＭ) １μl
オリゴヌクレオチド(アンチセンス鎖)(100μＭ) １μl
T4リガーゼ緩衝液10× １μl
T4 PNK １μl
H2O ６μl
反応条件
37℃にて１時間インキュベート
95℃にて５分変性
センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを、反応剤をゆっくり１分当たり３℃にて25℃まで冷却することによりアニールする
TRA Ｊ受入カセット断片とＪドナーベクター骨格の組立てライゲーション
反応ミックス
直鎖状ベクター骨格 100 ng
受入部位カセットDNA断片(0.5μＭ) ２μｌ
T4リガーゼ緩衝液10× ２μl
T4リガーゼ 0.5μｌ
H2O 20μｌまで
反応条件
25℃にて１時間インキュベート
65℃にて10分間熱不活化
得られた生成物でコンピテント大腸菌細胞を形質転換し、カナマイシン耐性コロニーを選択する。耐性コロニーを選択して、正しく組立てられた構築物を決定する。得られるプラスミドは、TRA Ｊ受入カセットベクターである。本実施例では、TRA Ｊ受入カセットベクターをSEQ0098として表し、図30に示す。
合成TRA Ｊセグメント部の設計
TRA Ｊ受入カセットベクターを作製したら、合成TRA Ｊセグメント部を作製して、このベクターに挿入しなければならない。各TRA Ｊ配列は、独立したTRA Ｊ受入カセットベクターの状況に挿入して、ヒトTRA TORESの一部としてのTRA Ｊドナーベクターライブラリを作製する。
TRA Ｊドナーベクターライブラリは、長い又は短いＪセグメント部で構成される２つの異なる形で得られる。短いTRA Ｊセグメント部は、CDR3境界コドンの最初から全てのアミノ酸をコードする。しかし、TRA Ｊセグメントの大部分はTCR再編成中に10ヌクレオチド未満刈り込まれることを考慮して、より長いTRA Ｊ生殖系列セグメントを含むTRA Ｊドナーライブラリを設計する、長いTRA Ｊセグメント部。より長いTRA Ｊ遺伝子断片ライブラリに対する動機は、CDR3をコードするより短いオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)が、短いTRA Ｊ断片を用いる場合よりも全長TRA再構成のために必要とされるであろうことである。高可変配列が短いオリゴヌクレオチド二重鎖、odeCDR3として提供されるので、より短いCDR3オリゴヌクレオチド合成は、切断又は変異されたオリゴヌクレオチド混入物を含む可能性が低く、よって、全長TRA再構築中に配列の誤りを有するオリゴヌクレオチド二重鎖がクローニングされる可能性が低減する。更に、より短いodeCDR3合成は、費用節減になる。
TRA Ｊセグメント部は、４ヌクレオチド一本鎖オーバーハングをDNA断片の両末端に含むように設計された２つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドをアニールすることにより構築する。得られるTRA Ｊセグメント部を図31に示す。
オーバーハング*5'と呼ぶ５'オーバーハングは、BbsI作用によりＪドナー受入カセットベクター内に作製されるオーバーハング*5に相補的である。オーバーハング*6'と呼ぶ３'オーバーハングは、BbsI作用によりＪドナー受入カセットベクター内に作製されるオーバーハング*6に相補的である。相補オーバーハングのこの対は、TRA Ｊ受入カセットベクターへのTRA Ｊセグメント部の定方向クローニングを許容する。
短いTRA Ｊセグメント部は、CDR3-J境界Pheコドンの最初から全てのアミノ酸をコードする。CDR3は、Ｖ領域のＣ末端保存Cysと、Phe-Gly/Ala保存モチーフの一部であるＪ領域のPheとに挟まれた配列と規定される。この保存Phe-Gly/Alaモチーフを用いて、TRA J断片の５'オーバーハングを、下流のTRA再構成のためにTTTGに標準化する。本実施例におけるこの標準化の例外は、Trp及びGlyがCDR3領域の境界をなすヒトTRAJ33及びTRAJ38である。５'オーバーハングは、本実施例において、TRAJ33及びTRAJ38の両方についてTGGGである。
長いTRA Ｊセグメント部は、CDR3境界アミノ酸のＮ末端のより多くのアミノ酸をコードするように設計されている。各々の長い遺伝子断片の開始点は、生殖系列によりコードされるTCR連結エレメントの５'末端から10〜12 ntに位置するアミノ酸コドンの最初のヌクレオチドである。各々の長いTRA Ｊセグメント部の５'末端は、短いTRA Ｊセグメント部のものと同一のままである。
短い及び長いTRA Ｊセグメント部の両方に、図11においてＡブロックと表されるアデニンを、各TRA Ｊセグメント部の３'末端に付加する。このアデニンは、TRA Ｊ受入カセットから除外されるTRA Ｃ断片の最初のヌクレオチドである。
天然型ヒトＪセグメントの本実施例の短いTRA Ｊセグメント部の配列を、SEQ0099〜SEQ0210として表し、長いTRA Ｊセグメント部をSEQ0211〜SEQ0322として表す。両方の場合において、フォワード(F1)及びリバース(R1)オリゴヌクレオチド配列の両方を列挙する。
短い又は長いＪドナーベクターライブラリを組立てる方法
この方法は、短いTRA Ｊセグメント又は長いTRA Ｊセグメント部分(図31)をTRA Ｊ受入カセットベクター(図30)にクローニングして、短い又は長いTRA Ｊセグメントを含むTRA Ｊドナーベクター(成分1B、図2b)を創出するための標準的な分子生物学技術を利用する。本実施例では、この方法は、制限酵素消化及びライゲーション反応を単一反応で行う。
Ｊドナーベクターライブラリに必要なDNA成分は、以下のとおりである：
Ｉ．短いTRA Ｊセグメント部又は長いTRA Ｊセグメント部
II．Ｊドナー受入カセットベクター
TRA Ｊセグメント部を形成するための２つのオリゴヌクレオチドのリン酸化及びアニーリング
DNA断片
反応ミックス
オリゴヌクレオチド(センス鎖)(100μＭ) １μl
オリゴヌクレオチド(アンチセンス鎖)(100μＭ) １μl
T4リガーゼ緩衝液10× １μl
T4 PNK １μl
H2O ６μl
反応条件
37℃にて１時間インキュベート
95℃にて５分変性
センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを、反応剤をゆっくり１分当たり３℃にて25℃まで冷却することによりアニールする
消化及びライゲーション反応について
TRA Ｊ受入カセット骨格 100 ng
TRA J DNA断片(0.5μＭ) ２μl
10×NEB T4リガーゼ緩衝液 ２μl
BbsI 0.5μl
T4 DNAリガーゼ 0.5μｌ
H2O 20μｌまで
反応条件
工程１：37℃にて２分
工程２：16℃にて３分
工程１及び２を20回反復
50℃にて５分
80℃にて５分
室温に戻す
0.5μlのNotI酵素を加え、37℃にて30分インキュベートして、親のベクターを直鎖状にする。
反応生成物で、コンピテント大腸菌を形質転換し、カナマイシン耐性について選択する。選択された耐性コロニーをシーケンシングして、正しく組立てられた構築物を決定する。得られた構築物は、長い又は短いTRA Ｊ遺伝子断片のいずれかをコードするTRA Ｊドナーベクターライブラリを作り上げる。
BsaI認識部位の外側の骨格配列を除く、得られるライブラリの配列を、TRA短いＪドナーライブラリについてSEQ0323〜SEQ0378として、TRA長いＪドナーライブラリについてSEQ0379〜SEQ0434として示す。
天然型ヒトTRBレパートリーのためのTRB Ｖ-Ｃエントリーベクター及びTRB Ｊドナーベクターライブラリの設計及び組立て
上のセクションでは、天然型ヒトTRAレパートリーのためのＶ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターライブラリの設計及び組立てについて詳細に記載した。TRBレパートリーの配列をコードするこのようなベクターライブラリの全体的な設計及び組立ては、本質的に同じである。本実施例では、TORES又は天然型ヒトTRB TCR遺伝子座を構築するためのTRB Ｖ-Ｃエントリーベクター及びTRB Ｊドナーベクターライブラリの設計及び組立てを簡単に概説する。
TRA及びTRB鎖のためのＶ-Ｃエントリーベクター骨格が、システムの動作から得られるベクター生成物(成分2C及び2E)をeTPC-tのゲノム受容部位(成分2B及び2D)と対にするために、異なるFRT部位を含むことに注意することが重要である。このことは、単一TRA又はTRB鎖だけが、組込みカップル対により各eTPC細胞に組み込まれることを意味する。本実施例では、TRA鎖は、Ｖ-Ｃエントリーベクターにおいて、FRT F14及びF15部位が結合しているのに対して、TRB鎖はFRT FRT及びF3部位と結合している。
天然型ヒトTRBレパートリーのためのTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの設計及び組立て
本実施例では、天然型ヒトTRB Ｖ-Ｃ配列レパートリーを含むTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの設計及び組立て。
TRB Ｖ-Ｃベクターライブラリのために必要なDNA成分は：
Ｉ．ヒトゲノムにコードされる各機能的TRB Ｖ遺伝子セグメントについてのTRB Ｖクローニング断片
II．TRB C1又はTRB C2クローニング断片
III．Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格
である。
ヒトTRA遺伝子座と対照的に、ヒトTRB遺伝子座は、２つの別個の定常セグメントTRB C1及びC2をコードする。よって、両方の定常領域を捕捉するために、２つのＶ-Ｃエントリーベクターセットを構築して、Ｖセグメントの各々をC1及びC2セグメントの各々と対にする。
本実施例では、TRB Ｖ及びTRB Ｃクローニング断片を合成及び使用して、単一制限酵素及びリガーゼ反応において標的Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格に組立てる。本実施例では、標的Ｖ-Ｃエントリー骨格は、哺乳動物細胞内で再構成されたTRB ORFの一過性発現を許容するように設計されている。
本実施例では、IIS型制限酵素BbsIを用いてTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを構築する。全長TRB ORFを再構成するためにライブラリの機能化において用いるIIS型制限酵素は、BsaIである。
合成TRB Ｖクローニング断片の設計
TRB Ｖクローニング断片の遺伝子エレメントの配置は、図25に示すように、上の１で記載したTRA Ｖクローニング断片のものと同一である。
天然型ヒトTRB鎖の本実施例におけるTRB Ｖクローニング断片の全長DNA配列を、SEQ0435〜SEQ481として表す。
合成TRB Ｃクローニング断片の設計
TRB Ｃクローニング断片の遺伝子エレメントの配置は、図26に示すように、上で記載したTRA Ｃクローニング断片のものと同一である。
TRB遺伝子座は、２つの別個のＣセグメントをコードし、共にTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリの設計に含まれる。
天然型ヒトTRB鎖の本実施例におけるTRB Ｃクローニング断片の全長DNA配列を、SEQ0482及びSEQ0483として表す。
TRB Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを組立てる方法
所定のTRB Ｖ及びTRB Ｃクローニング断片を所定のＶ-Ｃエントリーベクター骨格に組立てて、TRB Ｖ-Ｃエントリーベクターを創出する方法は、TRAシステムについて上で記載したものと同じである。本実施例におけるTRB Ｖ-Ｃエントリーベクターについて用いるＶ-Ｃエントリーベクター骨格は、５'及び３'遺伝子エレメントとしてそれぞれFRT及びF3 FRT配列を含む。このFRT/F3 Ｖ-Ｃエントリーベクター骨格配列を、SEQ0689として表す。TRA及びTRB TORESシステムの間で異なるFRT部位の状況は、組込みベクターを互いに遮蔽し、それらを組込みカップル対としてeTPCのゲノム受容部位と対をなす。
TRA Ｖ-Ｃエントリーベクターライブラリを作り上げるクローニングされたＶ-Ｃ断片の配列を、SEQ0484〜SEQ0577として表す。
天然型ヒトTRBレパートリーについてのTRB Ｊドナーベクターライブラリの設計及び組立て
本実施例では、天然型ヒトTRB J配列レパートリーを含むTRB Ｊドナーベクターライブラリの設計及び組立て。
本実施例では、TRB Ｊ受入カセット断片を構築して、Ｊドナーベクター骨格に挿入して、TRB Ｊ受入カセットベクターを創出する。その後、合成TRB Ｊセグメント部をTRB Ｊ受入カセットベクターに組立てて、TRB Ｊドナーベクターライブラリを創出できる。このフレキシブル多工程組立て法により、Ｊセグメント長のバリエーションのようなＪドナーセグメント特徴の迅速で対費用効果の良い操作が可能になる。
この手順は、実施例２に記載するTRA Ｊドナーベクター組立てと同じパターンに従う。しかし、Ｊ受入カセット断片がＣセグメントの部分を含むので、TRA Ｊ及びTRB Ｊ受入カセット断片は、Ｃ部配列に関して異なり、それぞれのＣ遺伝子セグメントに対応しなければならないことに注意すべきである。更に、単一Ｊ受入カセット断片だけを必要とするTRA Ｊのシナリオとは対照的に、TRB Ｊは、代替のC1及びC2セグメントの使用を可能にするために、２つの別個のＪ受入カセット断片を必要とする。
TRB Ｊドナーベクターライブラリのために必要なDNA成分は：
Ｉ．TRB J C1又はTRB J C2受入カセット断片
II．Ｊドナーベクター骨格
III．TRB J C1又はTRB J C2受入カセットベクター
IV.TRB Ｊセグメント部
である。
合成TRA Ｊ受入カセット断片の設計
２つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのアニーリングを用いて、図28に示すように、４ヌクレオチド一本鎖オーバーハングをDNA断片の各末端に含む受入カセット断片を作製する。４ヌクレオチドオーバーハングにより、TRB Ｊ受入カセットベクターを創出するために、Ｊドナーベクター骨格への定方向リガーゼ依存クローニングが可能になる。
C1及びC2セグメントの代替の使用に必要な２つの受入カセット断片を、SEQ0578及びSEQ0581として表す。各断片について、フォワード(F1)及びリバース(R1)オリゴヌクレオチド配列を示す。
TRB Ｊ受入カセットベクターを組立てる方法
TRB Ｊ受入カセットベクターを組立てる方法は、実施例２に記載するTRA Ｊ受入カセットベクターを組立てる方法と同一である。同じＪドナーベクター骨格(SEQ0097)を用いて、TRB遺伝子座についての代替のＣセグメントに対応する１つのC1又はC2部を各々含む２つのTRB Ｊ受入カセットベクターを作製する。
得られる２つのTRB Ｊ受入カセットベクターを用いて、TRB Ｊセグメント部に挿入して、TRB Ｊドナーベクターを構築する。
得られるTRB Ｊ受入カセットベクターを、SEQ0582及びSEQ0583として表す。
合成TRB Ｊセグメント部の設計
TRB Ｊセグメント部は、４ヌクレオチド一本鎖オーバーハングをDNA断片の各末端に含むように設計された２つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドをアニールすることにより構築する。この部分の配置及び組立ての方法は、TRA Ｊセグメント部のものと同一であり、図31に示す。
短いTRB Ｊセグメント部の場合、CDR3-Ｊ境界Pheコドンの最初から全てのアミノ酸をコードする。CDR3は、Ｖ領域のＣ末端保存Cysと全てのヒトTRB Ｊセグメントにわたって保存されているPhe-Gly モチーフの一部であるＪ領域のPheとに挟まれた配列として規定される。この保存Phe-Glyモチーフを用いて、下流のTRB再構成のためにTRA Ｊ断片の５'オーバーハングをTTTGに標準化する。TRA Ｊセグメントと異なって、本実施例におけるTRA Ｊセグメント部におけるこの標準化されたオーバーハングに例外はない。
短い及び長いTRB Ｊセグメント部の両方に、図11においてＡブロックと表されるアデニンを、各TRB Ｊセグメント部の３'末端に付加する。このアデニンは、TRB Ｊ受入カセットから除外されるTRB Ｃ断片の最初のヌクレオチドである。
天然型ヒトＪセグメントの本実施例の短いTRB Ｊセグメント部の配列を、SEQ0584〜SEQ0609として、長いTRB Ｊセグメント部をSEQ0610〜SEQ0635として表す。両方の場合において、フォワード(F1)及びリバース(R1)オリゴヌクレオチド配列の両方を列挙する。
TRB短い又は長いＪドナーベクターライブラリを組立てる方法
TRB Ｊドナーライブラリを組立てる手順は、上記のTRAライブラリのものと同一である。しかし、TRA遺伝子座セグメントについての短い及び長いライブラリとは対照的に、TRBライブラリの場合、４つのライブラリを作製する。
TRBライブラリの場合、各短い及び長いライブラリは、代替のC1及びC2 Ｃセグメントの各々を有するように構築して、TRB Ｊドナーライブラリ内で４つの部分集合をもたらすことができる。
Ｊドナーベクターライブラリのために必要なDNA成分は、以下のとおりである：
Ｉ．短いTRB Ｊセグメント部又は長いTRB Ｊセグメント部
II．TRB J C1又はTRB J C2受入カセットベクター
上記と同じ手順に従って、TRB Ｊドナーライブラリ内の４つの得られる部分集合を作製する。BsaI認識部位の外側の骨格配列を除く得られるライブラリの配列を示す。
SEQ0636〜SEQ0648として表すTRB C1短いＪドナーライブラリ
SEQ0649〜SEQ0661として表すTRB C2短いＪドナーライブラリ
SEQ0662〜SEQ0674として表すTRB C1長いＪドナーライブラリ
SEQ0675〜SEQ0687として表すTRB C2長いＪドナーライブラリ
実施例２ CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)の設計及び作製
上の実施例では、全体的な二部分装置の成分2C及び2Eとしての全長ヒトTCR鎖をアウトプットするための、Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターライブラリヒトTRA及びTRB鎖としてのTORESの設計及び構築について記載する。
全長TCRオープンリーディングフレームの一工程再構成のためのこれらのＶ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターライブラリの使用は、標的全長TCR鎖配列を完成するために、CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)構築物が提供されることを必要とする(図2c)。Ｖ-Ｃエントリーベクター及びＪドナーベクターライブラリが一旦作製されると、これらのベクターは、標的全長TCR鎖配列の所望のＶ-Ｊ-Ｃ組合せを選択するために制限なく利用され得るストック要素を表す。対照的に、odeCDR3は、標的全長TCR ORFに特異的な短いユニーク配列を表す。
本実施例は、天然型ヒトTRA及びTRBベクタープラットフォームにおいて用いるためのodeCDR3の設計及び作製について記載する。
TRA odeCDR3の設計
２つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのアニーリングは、図2cに示すように、４ヌクレオチド一本鎖オーバーハングをDNA断片の各末端に含むodeCDR3を作製する。４ヌクレオチドオーバーハングは、エントリーベクターにコードされるTRA Vセグメントの３'末端(オーバーハング‡1-5')及びTRA再構成中のTRA Ｊ断片の５'末端(オーバーハング‡2-3')への定方向リガーゼ依存クローニングを許容するように設計されている。オーバーハング‡1-5'は、TRA Ｖ-ＣエントリーベクターのVセグメントにおいてコードされる標準化されたオーバーハング‡1-5に相補的なCTGCに標準化される。オーバーハング‡2-3'の場合、取りうる配列の形が２つあり、これは、ヒトTRA遺伝子座からのＪセグメントのうちの配列相違により決定される。天然型ヒトTRA ＪセグメントTRAJ33及びTRAJ38について、オーバーハング‡2-3'は、これらの２つのＪセグメントのＪドナーベクターにおいてコードされるオーバーハング‡2-3に相補的なTGGGに標準化される。全ての他のヒトTRA Ｊセグメントについて、オーバーハング‡2-3'は、これらのＪセグメントのＪドナーベクターにおいてコードされるオーバーハング‡2-3に相補的なTTTGに標準化される(実施例１を参照されたい)。
TRB odeCDR3の設計
TRB odeCDR3について、２つの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドのアニーリングは、図4cに示すように、４ヌクレオチド一本鎖オーバーハングをDNA断片の各末端に含むodeCDR3を作製する。４ヌクレオチドオーバーハングは、エントリーベクターにおいてコードされるTRB Ｖセグメントの３'末端、オーバーハング‡1-5'及びTRB再構成中のTRB Ｊ断片の５'末端、オーバーハング‡2-3'への定方向リガーゼ依存クローニングを許容するように設計されている。オーバーハング‡1-5'は、TRB Ｖ-ＣエントリーベクターのＶセグメントにおいてコードされる標準化されたオーバーハング‡1-5に相補的なTTGCに標準化される。２つの代替オーバーハング‡2-3の形が必要とされるTRA odeCDR3とは対照的に、TRB odeCDR3について、オーバーハング‡2-3は、全てのTRB ＪセグメントのＪドナーベクターにおいてコードされるオーバーハング‡2-3に相補的なTTTGに標準化される(実施例１を参照されたい)。
一般的なodeCDR3設計
一般的に、odeCDR3設計は、オーバーハングにマッチしていなければならず、４ヌクレオチドオーバーハングは、エントリーベクターにおいてコードされるＶセグメントの３'末端(オーバーハング‡1-5')及び再構成中のＪ断片の５'末端(オーバーハング‡2-3')への定方向リガーゼ依存クローニングを許容するように設計されている。
リン酸化CDR3 DNAオリゴヌクレオチド二重鎖を作製する方法
odeCDR3を形成するための２つのオリゴヌクレオチドのリン酸化及びアニーリング
反応ミックス
オリゴヌクレオチド(センス鎖)(100μＭ) １μl
オリゴヌクレオチド(アンチセンス鎖)(100μＭ) １μl
T4リガーゼ緩衝液10× １μl
T4 PNK １μl
H2O ６μl
反応条件
37℃にて１時間インキュベート
95℃にて５分変性
センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを、反応剤をゆっくり１分当たり３℃にて25℃まで冷却することによりアニールする
実施例３ eTPC-tを作製するためのTORES及びeTPCSを含む二部分装置の実証
本実施例は、標的TCRの配列情報に鑑みて、TRA及びTRB全長TCR ORFを再構成するために必要なベクターライブラリ成分及びodeCDR3を規定するために用いられる工程について記載する。本実施例は、全長モデルTRA及びTRB TCR鎖対を組立てるためのTORESプロセスについて実証する。本実施例は、eTPC-tを作製するための、eTPCへのRMCEによる前記ベクターの組込みによるeTPCSも実証し、その後、特異的HLA多量体反応剤での表面提示TCRの染色によりそのTCR対特異性を確認する。
Ｖ-Ｃエントリーベクター、Ｊドナーベクター及びodeCDR3の選択
クローニングライブラリにおいて表される全ての可能な生殖系列断片の配列を、興味対象のTRA又はTRB配列とアラインメントする。TRA又はTRB配列に対して最も高い同一性を有する遺伝子断片は、どのＶ、Ｊ及びＣ遺伝子エレメントが所望のTRA又はTRBクローン形質配列を構成するかを決定する。TRAについて、適当なＶ-Ｃエントリーベクターは、所望のTRAのＶ使用の決定に基づいて選択される。TRBについて、配列カバー範囲がＶ及びＣ使用を決定するために十分である場合、適当なＶ-Ｃエントリーベクターは、所望のクローン形質がTRBC1又はTRBC2のいずれを用いるかということに加えて、前記TRBクローン形質のＶ使用に対応して選択される。
特異的TRAJ又はTRB Ｊ遺伝子エレメントの短い及び長いバージョンが共にTRA及びTRB配列とそれぞれアラインメントされる場合、より長い遺伝子エレメントをコードする対応するプラスミドをTRA再構築のために用いる。
TRAが合成されるために必要なodeCDR3配列は、TRA Ｖアラインメントされた遺伝子断片の３'末端と、アラインメントされたTRAＪ遺伝子断片の５'末端との間の領域として決定される。オリゴヌクレオチドセンス鎖は、更なる５' ４ヌクレオチドオーバーハングであるオーバーハング‡1-5' CTGCを必要とし、これは、BsaIで消化された場合にTRA Ｖエントリーベクターに作製されるオーバーハングであるオーバーハング‡1-3'に普遍的である。相補オリゴヌクレオチドアンチセンス鎖は、更なる５' ４ヌクレオチドオーバーハングであるオーバーハング‡2-3'を必要とし、これは、TRA再構築反応に付加されるTRAJベクターに特異的なオーバーハングであるオーバーハング‡2-5'にユニークである。
TRBが合成されるために必要なCDR3配列は、TRB Ｖアラインメントされた遺伝子断片の３'末端と、アラインメントされたTRB Ｊ遺伝子断片の５'末端との間の領域として決定される。オリゴヌクレオチドセンス鎖は、更なる５' ４ヌクレオチドオーバーハングであるオーバーハング‡1-5'、TTGCを必要とし、これは、BsaIで消化された場合にTRB Ｖエントリーベクターに作製されるオーバーハングであるオーバーハング‡1-3'に普遍的である。相補オリゴヌクレオチドアンチセンス鎖は、更なる５' ４ヌクレオチドオーバーハングであるオーバーハング‡2-3'を必要とし、これは、TCR再構築反応に付加されるTRB Ｊベクターに特異的なオーバーハングであるオーバーハング‡2-5'にユニークである。
本実施例では、HLA-A*02:01において提示されるヒトサイトメガロウイルス(HCMV)抗原に対する既知の特異性を有するモデルTCR TRA/TRB対(JG9-TCR)を用いる。この抗原性ペプチドは、HCMV pp65タンパク質に由来し、HLA-A*02:01において提示されるペプチド抗原の全長アミノ酸配列は、NLVPMVATVである。TRA(JG9-TCR-アルファ)及びTRB(JG9-TCR-ベータ)鎖の配列を、それぞれSEQ701及びSEQ702として示す。
この全長配列に基づいて、TRA及びTRBライブラリから適当なＶ-Ｃエントリー及びＪドナーベクターを選択することは簡単であった。
本実施例では、SEQ0698骨格におけるTRA Ｖ-ＣエントリーベクターSEQ0088(リスト0049〜0094から)と、ＪドナーベクターSEQ0371(リスト0323〜0378)とを選択した。
本実施例では、SEQ0688骨格におけるTRB Ｖ-ＣエントリーベクターSEQ0563(リスト0484〜0577から)と、ＪドナーベクターSEQ0637(リスト0636〜0687)とを選択した。
TRA鎖について合成されたodeCDR3を、それぞれセンス及びアンチセンスとしてSEQ703及びSEQ704に示す。
TRB鎖について合成されたodeCDR3を、それぞれセンス及びアンチセンスとしてSEQ705及びSEQ706に示す。
全長再構成の方法
上記の選択されたTRA及びTRB成分の各々について、制限酵素/リガーゼサイクル反応を以下に記載するようにして行った：
消化及びライゲーション反応について
Ｖ-Ｃエントリーベクター 100 ng
Ｊドナーベクター 60 ng
odeCDR3オリゴヌクレオチド二重鎖(0.5μＭ) ２μl
10×T4リガーゼ緩衝液 ２μl
BsaI 0.5μl
T4 DNAリガーゼ 0.5μl
H2O 20μｌまで
反応条件
工程１：37℃にて２分
工程２：16℃にて３分
工程１及び２を20回反復
50℃にて５分
80℃にて５分
室温に戻す
0.5μlのNotI酵素を加え、37℃にて30分インキュベートする。
得られる反応生成物でコンピテント大腸菌細胞を形質転換し、カルベニシリン含有プレートに播種した。
カルベニシリン耐性コロニーのスクリーニング及びシーケンシングを行って、正しく組立てられた構築物を決定した。コロニーのスクリーニングは、単離プラスミドDNAの制限酵素特徴的(diagnostic)消化により行い、予期されるDNA断片サイズをDNA電気泳動により観察した。得られる構築物は、全長TCRアルファ及びベータクローン配列をコードする。
再構成されたTRA及びTRBベクターの確認
上記の再構成されたTCR TRA TRB対の特異性を確認するために、前記対を有するeTPC-tを作製したが、ここで、親のeTPCは、別個の合成ゲノム受容部位成分2B及び2Dを含む。部位成分2B及び2Dは各々、TCR対(JG9-TCR)の単一鎖をコードする、作製した組込みベクター成分2C及び2EにおけるRMCE部位とマッチするように設計した。
本実施例では、親のeTPC株化細胞ACL-488を用い、これは、TCRヌル、HLAヌル、CD4ヌル及びCD8ヌルであり、成分2B及び2Dを更に含む。成分2Bは、２つのユニーク異種特異的リコンビナーゼ部位FRT及びF3を含み、これらは、コザック配列及び選択マーカーである青色蛍光タンパク質(BFP)をコードするORFを挟む。FRT部位の５'には、EF1aプロモータがコードされ、F3部位の３'にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネータがコードされている。成分2Dは、２つのユニーク異種特異的リコンビナーゼ部位F14及びF15を含み、これらは成分2Bとは異なるものであった。これらの部位は、コザック配列及び選択マーカーである赤色蛍光タンパク質(RFP)をコードするORFを挟む。F14部位の５'にはEF1aプロモータがコードされ、F15部位の３'にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネータがコードされている。
TORESを用いて作製される上記の成分2C及び2Eは、２つの異種特異的リコンビナーゼ部位FRT/F3(2C)及びF14/F15(2E)を含み、よって、それぞれ成分2B及び2Dにマッチしている。成分2Cは、FRT/F3部位の間に、コザック配列、開始コドン及びJG9-TCR-ベータ鎖をコードするTCR ORFを更に含む。成分2Eは、F14/F15部位の間に、コザック配列、開始コドン及びJG9-TCR-アルファ鎖をコードするTCR ORFを更に含む。
eTPC-tを、ACL-488(eTPC)のエレクトロポレーションによりRMCEを通じて創出した。エレクトロポレーションの４〜10日後に、成分2D及び2B選択マーカーによりコードされる蛍光タンパク質シグナルBFP及びRFPの減少を示す個別の細胞を、FACSにより選別した。個別のモノクローンを成長させ、次いで表現型を評価した。得られたモノクローンACL-851は、BFP及びRFPネガティブであった(図32a及びb)。ACL-851は、TCR及びCD3表面発現も示したが、親の株化細胞は示さなかった(図32c及びe)。更に、導入したJG9-TCRは、HLA-A*02:01-NLVP四量体と特異的染色を示し、このことは、これがeTPC-tの表面で機能的TCRspであることを示した(図32d〜f)。ACL-851は、PCRにより、ゲノムに組み込まれた成分2B'及び成分2D'によりコードされるTCRspを含むことが確認された(図32g及びh)。
まとめると、成分2B及び2Dを成分2B'及び2D'に変換するようなTORESにおいて作製した成分2C及び2Eに送達されたTCR ORFを組み込むためのRMCEベースの組込み法を用いることによりeTPCをeTPC-tに変換し、ここで、このeTPC-tにより、細胞の表面で機能的TCRspが発現された。更に、本実施例は、eTPC-t及び被分析物抗原の二元組成物を組み合わせ、可溶性被分析物抗原(HLA多量体:HLA-A*02:01-NLVPMVATV)との間の複合体形成に基づいてeTPC-tが選択される単純なeTPC:Aシステムの動作を実証した。
実施例４:eTPC-tからのeTPC-x復帰の実証
本実施例では、eTPC-xへのeTPC-tの変換について記載し、ここで、eTPC-xは、TCR鎖ORFをコードする成分2B'を有し、成分2Dは、相補TCR鎖ORFの組込みのために利用可能である。eTPC-xの成分DへのeTPC-tの成分2D'のの変換は、成分2D'にマッチした遺伝子ドナーベクター(成分2Z)の使用により達成される。
本実施例では、実施例３で作製した親のeTPC-t株化細胞ACL-851を用いた。成分2Zは、成分2D'にマッチした２つの異種特異的リコンビナーゼ部位F14/F15、コザック配列、開始コドン及び組込みの選択マーカーとしての緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするORFで構成されるプラスミドベクターである。eTPC-tは、成分2Z及びRMCEリコンビナーゼ酵素をコードするベクターと、エレクトロポレーションにより組み合わされ、それにより、細胞は、CD3提示の喪失及び組込みのGFP選択マーカーの獲得について後で選択された。モノクローンACL-987は、FACSにより表現型が特徴決定され、ACL-987がGFPを獲得し、CD3及びTCRabを喪失したことが観察され(図33b、d)、このことは、JG9-TCR-アルファのGFP ORFへの交換、及び成分Dの成分D'への変換、よってeTPC-xの作製が成功したことを示した。これと比べて、親のeTPC-tであるACL-851は、GFP発現を欠き、CD3及びTCRab表面発現を有する(図33a〜c)。.
まとめると、本実施例は、eTPC-tのeTPC-xへの変換と、代替相補TCR鎖ORFの更なる組込みカップリング事象のための、GFP組込みの選択マーカーとの交換による成分2D'でのJG9-TCR-アルファTCR ORFの除去、それによる成分2Dの創出とを実証する。この変換は、ゲノム組込みのためのRMCE法を用いて行った。
実施例５:TORESによる一工程でのTCRバリアントの配列を多様化したプールの作製、及びeTPC-tのプールを創出するためのeTPC-xへのショットガン組込みの実証
本実施例は、64の単一JG9-TCR-アルファバリアントをコードするベクター(成分2E)のプールをどのようにして作成し、単一JG9-TCR-ベータを含む親のeTPC-x株化細胞(実施例４に記載する)に組み込んで、各細胞が表面で単一の分離したTCRspを発現するeTPC-tのライブラリを提示するために各個別の細胞が単一TRA鎖を組み込んでいるプールされたeTPC-tライブラリをどのようにして創出するのかについて記載する。このような方法は、「ショットガン」組込みと呼ぶ。64のJG9-TCRαバリアントは、図３に示す方法により、Ｖ及びＪ断片の接合部にあるCDR3配列を改変することにより創出した。この単一反応多様化は、天然型のTRB鎖対と共に哺乳動物細胞の表面で提示された場合に特異的HLA-多量体反応剤に対して広範囲の親和性を有するTCRセットを生成することが示されている。このアプローチは、哺乳動物生細胞の機能的な状況において提示及び選択され得る全長TCR ORFを用いる迅速TCR操作に理想的に適している。
odeCDR3縮重性による迅速TCR鎖多様化
TCR ORFの多様化及び選択は、特異性、親和性及び/又はシグナル伝達能力が変化したTCR鎖対を操作するために望ましい。TORESシステムは、元の標的配列から系統的に変化したTCR鎖コレクションの迅速な作製のために適している。本実施例では、選択されたコドン位置にて規定され限定されたヌクレオチド縮重性を有する再構成反応にodeCDR3を含めることによるモデルTCR鎖対の多様化のアプローチを示す。このアプローチを用いて、実施例３に示すモデルJG9-TCR対のJG9-TCR-アルファ鎖を多様化した。
多様TRA鎖コレクションの作製
図３は、odeCDR3プールの使用による単一反応でのTCR鎖の配列を多様化したコレクションの作製のための全体的な方策を表す。単一Ｃ-Ｖエントリーベクター及びＪドナーベクターを選択して、最終全長TCR生成物における標的Ｖ、Ｊ及びＣ遺伝子セグメントを表す(図３．ボックスｉ及びボックスii)。選択した多様性を有するodeCDR3プールが作製されて、このodeCDR3プールにおいて幾つかの異なるCDR3配列がある(図３、ボックスiii)。全ての成分を制限酵素/リガーゼサイクル反応に組み合わせた場合に、得られる生成物は、規定されたＶ、ＪＣ遺伝子セグメント使用で、CDR3領域における規定された多様性の全長TCR鎖を含む構築物のコレクションである(図３、ボックスiv)。最終生成物における多様化された全長TCR鎖の数は、反応に加えた初期odeCDR3プールにおけるodeCDR3バリアントの数に比例する。
本実施例では、JG9-TRA-アルファ鎖が配列多様化の標的であり、このことは、３つのコドンの各々において４つの異なるアミノ酸をもたらすことができるように各々が別々のコドンを変更する３つの別個の位置にてヌクレオチド縮重性を有するodeCDR3センス及びアンチセンスオリゴの合成により達成した。縮重性について選択したコドンは、CDR3ループにわたって間をあけた。odeCDR3オリゴをSEQ0743及びSEQ0744として示し、ここで、縮重コドンをＮで表す。
odeCDR3オリゴを、実施例２に概説する方法によりアニールし、３つの別々のコドン位置での４倍アミノ酸縮重は、元のコーディング配列(すなわちSEQ0701)を含む64のユニーク配列を有するodeCDR3生成物プールをもたらした。
odeCDR3を用いて、実施例３に概説する方法により全長TRA ORFを組立てて、３つの別個のコドン位置にて４倍アミノ酸縮重を有する64のユニークTRA ORFを創出した。本実施例では、記載する位置にて縮重ヌクレオチド使用を有するodeCDR3を合成し、すなわち再構成を単一チューブ内で行って、64全ての鎖バリアントを作製した。
並行して、各バリアントJG9-TCR-アルファ鎖及びJG9-TCR-ベータ鎖も別のＶ-Ｃエントリー骨格(SEQ0048)にクローニングしたが、これは、並行特徴決定のための一過性トランスフェクションを許容する。予期された全てのクローンを、単離ベクターとして調製し、配列を確認した。
TRB鎖対を有する多様化したJG9-TCR-アルファ鎖の特徴決定
本実施例では、JG9-TCR-ベータ(成分2B'において)及びCD3鎖を発現する親のeTPC-x株化細胞ACL-987(株化細胞の構築は、実施例４に記載する)を用いた。成分2Dは、選択マーカーGFPをコードし、実施例６に記載する。本実施例では、F14/F15部位に挟まれた成分2Eのプールを創出する64のJG9-TCR-アルファバリアントを作製した。
64の成分2EのACL-987へのエレクトロポレーションによりRMCEを通じて、eTPC-tプールを創出した。ポリクローンを、GFP発現に基づいて選択した。得られたポリクローンACL-988は、GFPポジティブ細胞のみで構成される親の系統とは異なって、GFPポジティブ及びGFPネガティブの両方の細胞集団で構成された(図34a及びb)。しかし、GFPネガティブ集団のみが、強いCD3発現を継続して示し、このことは、成分2Dの成分2D'への変換の成功、よってeTPC-xがeTPC-tに変換されたことを示す(図34c及びd)。更に、ACL-988 GFPネガティブ集団は、JG9-TCR特異的四量体反応剤(HLA-A*02:01-NLVP)を用いて染色した場合に２つの別個の強度を示し、このことは、この集団が、結合効率が異なるTCRバリアントを発現する細胞で構成されることを示唆した。
並行して、WT JG9-TCR-ベータと共に64全てのJG9-TCR-アルファバリアントの特徴決定を、親のeTPC(ACL-987)において一過的に発現させた。この一過性アッセイを用いて、バリアントJG9-TCRを発現する上記のプールしたeTPC-tにおいて提示される各TCR対についての参照に対するHLA-A*02:01-NLVP四量体反応剤に対する相対染色単位(RSU)を決定した。RSUは、CD3ポジティブ集団についてのCD3ネガティブ集団に対するHLA-A*02:01-NLVP四量体シグナルの平均蛍光強度(MFI)の比率として算出し、各TCR鎖対バリアントの結合強度の指標であった。親のACL-987系統を各JG9-TCR-アルファバリアントで独立してトランスフェクションした後に、細胞を、CD3に対する抗体及びHLA-A*02:01-NLVP四量体反応剤で染色し、フローサイトメトリにより分析した。図34eにプロットする各点は、各64のバリアントについて観察されたRSUを表す。
HLA-A*02:01 NLVPポジティブであったACL-988細胞が高いRSU TRAバリアントをコードし、HLA-A*02:01 NLVPネガティブのものが低RSU TRAバリアントをコードすることを確認するために、各集団についての個別の細胞及びそれらのTRAをシーケンシングし、図34eにプロットした。実際に、HLA-A*02:01 NLVPポジティブであった個別のACL-988細胞は、個別に試験したバリアントにおいて高RSUの結果を主に示したTRAバリアントをコードした(図34e、塗りつぶしていない丸)。更に、HLA-A*02:01 NLVPネガティブであった個別のACL-988細胞は、低RSU結果を主に示したTRAバリアントをコードした(図34e、塗りつぶしていないされている三角)。
まとめると、本実施例は、CDR3多様化TCR ORFをコードするベクターのプールしたライブラリを単一反応で作製する。このプールしたライブラリは、eTPCゲノム受容部位とマッチしているベクターにコードされる。複数のTCRを含むプールしたeTPC-tライブラリの作製は、天然型相反TCR ORFをコードするeTPC-xへのショットガン組込みを用いて単一工程で成功した。作製した遺伝子改変ポリクローナル株化細胞ACL-988は、天然型対に特異的なHLA四量体反応剤に対する様々な染色強度について機能的に染色できるTCRspのライブラリを提示した。このことは、ヒト細胞の表面で提示されるCD3複合体の天然の状況において選択されるTCR対の選択的操作についての協力で迅速なアプローチを表す。
実施例６:成分2Fの機能的実証
２つのユニークゲノム受容部位(成分2B及び2D)で操作され、天然型CD3発現を利用してHLA発現についてヌルになるように操作され、２成分合成応答エレメント(成分2F)を有するeTPC株化細胞(ACL-1063、成分2A)についてここで記載する。
応答エレメントは、ドライバ-アクチベータ成分及びアンプリファイヤ-レポート成分で構成され、これらの両方のユニットは、合成エンハンサを利用した。ドライバは、NFAT-AP1-NFkBについての３セットの直列転写因子結合部位(3xNF-AP-NB)をコードする天然型TCRシグナル伝達経路に応答性の合成エンハンサである。転写活性化の際に、ドライバは、アンプリファイヤエンハンサ領域内に同族DNA認識配列が直列で６回存在するヘルペスVP16活性化ドメイン、GAL4 DNA結合ドメイン並びにＮ及びＣ末端にて２つの核局在化シグナル(NV16G4N)の融合により導かれるアクチベータタンパク質である合成設計転写因子の発現を誘導する。ドライバ及びアンプリファイヤエンハンサは共に、コアプロモータ配列(CMV IE1プロモータからのＢ認識エレメント(BRE)、TATAボックス、イニシエータ(INR)及び転写開始部位(TSS)をそれぞれの転写因子結合部位のすぐ３'に利用した。転写活性化の際にアンプリファイヤは、レポーターRFPの発現を駆動する。
本実験では、実施例３に記載したように、eTPC株化細胞をeTPC-t株化細胞(ACL-1277)に変換したが、ここで、成分2B'及び2D'でのTCR鎖は、HCMV HLA-A*02:01-NLVPMVATVに特異的なTCR対をコードする。
eTPC-t株化細胞に、次いで、HLA-A*02:01(ACL-209)若しくはHLA-A*24:02(ACL-963)を提示するか、又はHLA-ヌル(ACL-128)であるAPCを負荷した。ここで、APCを、ペプチドNLVPMVATV若しくはVYALPLKMLでパルスしたか又はペプチドを用いなかった。その後、30,000のeTPC-tを10,000のAPCと24時間共培養した。24時間後に細胞を採集し、洗浄し、集団を区別するためにeTPC及びAPCについて特異的なマーカーで染色し、フローサイトメトリにより分析した。eTPC-tである成分2Fの強い活性化(RFP+発現＞80%)は、既知の同族標的抗原を負荷されたeTPC-t、すなわちA*02:01-NLVPMATVを有するAPCにおいてのみ観察された(図35)。
結論として、機能的成分2Fを含むeTPC株化細胞を操作し、その後、それを用いてeTPC-tを創出した。eTPC-tと同族標的Ｔ細胞抗原を提示するAPCとの相互作用の際に、RFP発現の増加として応答を測定可能であった。逆に、非同族Ｔ細胞抗原及びHLA又はHLAアレルなしを提示するAPCと接触させた場合、バックグラウンドを超えるRFP発現の測定可能な増加は、eTPC-tにより示されなかった。機能的成分2Fを有するeTPC-tを用いて、よって、Ｔ細胞受容体とAPCにより提示される同族Ｔ細胞抗原との間の機能的相互作用の同定及び特徴決定が可能である。
配列
以下、本明細書で言及する配列を示す表を提示する。
<210> 745 <223> pcDNA3.1_GFPベクターV1.A.4
<210> 746 <223> pcDNA3.1_RFPベクターV1.A.6
<210> 747 <223> pMA-SV40pAベクターV1.C.2
<210> 748 <223> pMA-CS-JG9-TCRベータベクターV3.C.5
<210> 749 <223> pMA-F14-GFP-F15ベクターV4.H9
<210> 750 <223> pMA-F14-TCR-JG9-アルファ-F15ベクターV7.A.3
<210> 751 <223> pMA-FRT-TCR-JG9-ベータ-F3ベクターV7.A.4
<210> 752 <223> F14-TCRaF15 CDR3degen.64mixベクターV8.F.8
<210> 753 <223> CMVpro-Flp-sv40pA-V2ベクターV4.I.8
<210> 754 <223> JG9-TRA CDR3 64バリアントベクター骨格VP.7751.RC1-A1〜H8
<210> 755 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_A1のCDR3配列
<210> 756 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_A2のCDR3配列
<210> 757 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_A3のCDR3配列
<210> 758 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_A4のCDR3配列
<210> 759 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_A5のCDR3配列
<210> 760 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_A6のCDR3配列
<210> 761 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_A7のCDR3配列
<210> 762 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_A8のCDR3配列
<210> 763 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_B1のCDR3配列
<210> 764 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_B2のCDR3配列
<210> 765 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_B3のCDR3配列
<210> 766 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_B4のCDR3配列
<210> 767 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_B5のCDR3配列
<210> 768 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_B6のCDR3配列
<210> 769 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_B7のCDR3配列
<210> 770 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_B8のCDR3配列
<210> 771 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_C1のCDR3配列
<210> 772 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_C2のCDR3配列
<210> 773 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_C3のCDR3配列
<210> 774 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_C4のCDR3配列
<210> 775 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_C5のCDR3配列
<210> 776 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_C6のCDR3配列
<210> 777 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_C7のCDR3配列
<210> 778 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_D1のCDR3配列
<210> 779 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_D2のCDR3配列
<210> 780 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_D3のCDR3配列
<210> 781 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_D4のCDR3配列
<210> 782 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_D5のCDR3配列
<210> 783 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_D6のCDR3配列
<210> 784 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_D7のCDR3配列
<210> 785 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_D8のCDR3配列
<210> 786 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_E1のCDR3配列
<210> 787 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_E2のCDR3配列
<210> 788 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_E3のCDR3配列
<210> 789 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_E4のCDR3配列
<210> 790 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_E5のCDR3配列
<210> 791 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_E6のCDR3配列
<210> 792 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_E7のCDR3配列
<210> 793 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_E8のCDR3配列
<210> 794 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_F1のCDR3配列
<210> 795 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_F2のCDR3配列
<210> 796 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_F3のCDR3配列
<210> 797 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_F4のCDR3配列
<210> 798 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_F5のCDR3配列
<210> 799 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_F6のCDR3配列
<210> 800 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_F7のCDR3配列
<210> 801 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_F8のCDR3配列
<210> 802 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_G1のCDR3配列
<210> 803 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_G2のCDR3配列
<210> 804 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_G3のCDR3配列
<210> 805 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_G4のCDR3配列
<210> 806 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_G5のCDR3配列
<210> 807 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_G6のCDR3配列
<210> 808 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_G7のCDR3配列
<210> 809 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_G8のCDR3配列
<210> 810 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_H1のCDR3配列
<210> 811 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_H2のCDR3配列
<210> 812 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_H3のCDR3配列
<210> 813 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_H4のCDR3配列
<210> 814 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_H5のCDR3配列
<210> 815 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_H6のCDR3配列
<210> 816 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_H7のCDR3配列
<210> 817 <223> JG9-TRA 64バリアントVP.7751.RC1_H8のCDR3配列
略語
aAM 被分析物抗原性分子
aAPX 被分析物抗原提示複合体
α-GalCer アルファ-ガラクトシルセラミド
aT 被分析物TCR
APC 抗原提示細胞
APX 抗原提示複合体
Ｂ細胞 Ｂリンパ球
β2Ｍ ベータ２ミクログロブリン
BFP 青色蛍光タンパク質
Ｃ(領域) 定常領域
CAR キメラ抗原受容体
CAR-T CAR Ｔ細胞
CD1b 表面抗原分類1b
CD1d 表面抗原分類1d
CD3 表面抗原分類３
CDR 相補性決定領域
CM カーゴ分子
CMV サイトメガロウイルス
Ｃ領域 定常領域
CRISPR クラスター化して規則的な配置の短いパリンドローム配列リピート
Ｄ(領域) 多様性領域
DAMPS 損傷関連分子パターン
DC 樹状細胞
DNA デオキシリボ核酸
dsDNA 二本鎖DNA
eAPC 操作された抗原提示細胞
eAPC-a 被分析物抗原性分子を発現する操作された抗原提示細胞
eAPC-p 被分析物抗原提示複合体を提示する操作された抗原提示細胞
eAPC-pa 被分析物抗原提示複合体及び被分析物抗原性分子を提示する操作された抗原提示細胞
eAPCS 操作された抗原提示細胞システム
eTPC 操作されたTCR提示細胞
eTPC-t 全長TCR対を提示する操作されたTCR提示細胞
eTPCS 操作されたTCR提示細胞システム
FAB 抗体断片抗原結合
FACS 蛍光標示式細胞選別
FRT フリッパーゼ認識標的
GEM Ｔ細胞 生殖系列によりコードされるミコリル反応性Ｔ細胞
GFP 緑色蛍光タンパク質
gRNA Cas9ガイドRNA
HCMV ヒトサイトメガロウイルス
HDR 相同性配向型組換え
HIV ヒト免疫不全ウイルス
HLA ヒト白血球抗原
HLAI HLAクラスI
HLAII HLAクラスII
IgSF 免疫グロブリンスーパーファミリー
iNK Ｔ細胞 インバリアントナチュラルキラーＴ細胞
IRES 配列内リボソーム進入部位
ITAM 免疫受容活性化チロシンモチーフ
Ｊドナー 連結ドナー
Ｊ領域 連結領域
MACS 磁気標示式細胞選別
MAGE 黒色腫関連抗原
MAIT 粘膜関連インバリアントＴ
MHC 主要組織適合複合体
MR1 主要組織適合複合体クラスＩ関連遺伝子タンパク質
mRNA メッセンジャーリボ核酸
NCBP 非細胞ベースの粒子
NK Ｔ細胞 ナチュラルキラーＴ細胞
odeCDR3 CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖
ORF オープンリーディングフレーム
PAMPS 病原体関連分子パターン
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
pHLA ペプチドHLA
RFP 赤色蛍光タンパク質
RMCE リコンビナーゼ媒介カセット交換
RNA リボ核酸
RT 逆転写
SH2 Src相同２
Ｔ細胞 Ｔリンパ球
TAA 腫瘍関連抗原
TALEN 転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ
TCR Ｔ細胞受容体
TCRsp CD3との複合体でのTCR表面タンパク質
TORES TCR ORF再構成及び操作システム
TRA TCRアルファ
TRB TCRベータ
TRD TCRデルタ
TRG TCRガンマ
Ｖ-Ｃエントリーベクター 可変-定常エントリーベクター
Ｖ(領域) 可変領域
ZAP-70 70 kDaのζ鎖関連タンパク質
定義
適応免疫：病原体を排除するか又はその成長を妨げる高度に専門化された全身性細胞及びプロセスで構成される全体的な免疫系の下位組織。
相補TCR鎖の対：翻訳されたタンパク質がTCR提示細胞の表面でTCRspを形成できる２つのTCR鎖
親和性：２つ以上の分子又はタンパク質の間の相互作用の動的又は平衡パラメータ
親和性反応剤：eTPC:AシステムにおいてeTPC-tの細胞表面でTCRsp結合及び/又は刺激をプローブするために被分析物として調製された任意の反応剤
アレル：所定の遺伝子のバリアント形
aAM：被分析物抗原性分子。一般的に、ゲノムDNA及び/又は特定の導入された遺伝子配列から細胞により発現されるタンパク質であるが、代謝産物でもあり得る。AMは、細胞で発現され、断片が次いでカーゴとしてAPXにより又はそれ自体で細胞表面で提示され得る。カーゴとして又はそうでなくても、AMは、次いで、Ｔ細胞受容体保有細胞又は関連する親和性反応剤の標的になり得る。
アンプリコン：PCRを含む様々な方法を用いる人工的増幅の供給源及び/又は生成物であるDNA又はRNA片
被分析物：組合せシステムにおいて同定及び/又は測定及び/又は照会される興味対象の物体
抗体：Ｂ細胞と呼ばれる免疫系の専門細胞により発現され、２つの鎖を含む親和性分子。
抗原：TCRと結合でき、Ｔ細胞内で伝達されるシグナルをもたらす任意の分子
被分析物抗原：分析的決定のために抗原を提示する任意の物体を集合的に表すeTPC:抗原システム(eTPC:A)
抗原結合窩：ペプチド抗原がMHC-I分子と結合する部位である長い窩又は溝。
APC：抗原提示細胞。通常、HLAの状況において細胞表面で抗原を提示できる細胞。
aAPX：被分析物抗原提示複合体。有核細胞により、ゲノムDNA及び/又は特定の導入された遺伝子配列をコードする遺伝子/ORFから細胞表面で発現及び提示されるタンパク質。APXは、ペプチド又はその他の代謝産物分子であるカーゴを提示する。
自己免疫：は、生物自体の健常細胞及び組織に対する生物の免疫応答の系である。
Ｃ(領域)：定常遺伝子セグメント。Ｔ細胞受容体を組立てるために用いられる遺伝子セグメントの一つ。ｃ領域は、TCRの多様性を駆動するのではなく、免疫系におけるその全般的な機能を規定する別個のセグメントである。
Ｃクローニング断片：定常クローニング断片。Ｃ遺伝子セグメントクローニング断片とも呼ぶ。Ｖ-Ｃエントリーベクターを構築するために用いられるＣ遺伝子セグメントの一部を有する構築物。
カーゴ積載装置：細胞で見いだされるタンパク質又はその他の提示される分子からカーゴ分子を作製してAPX上に積載するタンパク質の細胞性セット。
シスエレメント：近傍のORFの転写を制御するノンコーディングDNAの領域。
Ｃ部：定常部。Ｊ受入カセット断片、Ｊ受入カセット及びＪドナーベクターが有する定常遺伝子セグメント配列の小さい部分であって、TCR ORFを再構成するためのTORESの動作のためにオーバーハング配列を標準化する。
CDR：相補性決定領域。標的結合機能のほとんどを行う、TCR及び抗体の抗原に面する末端及び抗体の短い配列。各抗体及びTCRは、６つのCDRを含み、これらは、一般的に、多数の多様な標的分子の検出を可能にするために、分子の最も可変部分である。
CM：カーゴ分子。抗原提示複合体、例えばHLA I又はHLA IIにより提示されるペプチド又は代謝産物。CMは、ゲノムDNAから固有に細胞により発現され、培養培地に導入されるか又は特定の導入された遺伝子配列から発現されることができる。
同族抗原：特定のTCRにより認識される、しばしばHLAにより提示される抗原。TCR及び抗原は、同族物である。
コピー数：細胞のゲノム内でコードされる規定された配列が存在する全数。
細胞遺伝学的：染色体の構造及び機能に関する遺伝の学問、すなわち細胞の核型を決定する。
細胞傷害性の/細胞傷害：標的細胞を直接かつ特異的に損傷する因子をＴ細胞が放出するプロセス。
Ｄ(領域)：多様性遺伝子セグメント。Ｔ細胞受容体を組立てるために用いられる遺伝子セグメントの一つ。各個体は、これらの多数の異なるバリエーションのこれらの領域を有して、各個体が非常に多種類の異なるTCRを有するＴ細胞で武装できるようにする。
二量体：は、強いか又は弱い、共有又は分子間であり得る結合により連結された２つの構造的に似た単量体からなるオリゴマーである。
DNA：デソキシリボ核酸。遺伝子及びタンパク質をコードする遺伝物質を形成する分子の化学名称。
内因性：細胞内に起源を発する物質。
eTPC:Aシステム：eTPC:抗原システム。eTPC-tが被分析物抗原と接触するシステム。
真核生物条件的調節エレメント：所定の条件下で誘導又は抑制され得るプロモータの活性に影響し得るDNA配列
真核生物プロモータ：RNAポリメラーゼ結合部位及び応答エレメントをコードするDNA配列。プロモータ領域の配列は、RNAポリメラーゼ及び転写因子の結合を制御するので、プロモータは、興味対象の遺伝子がどこでいつ発現されるかを決定する大きな役割を演じる。
真核生物ターミネータ/シグナルターミネータ：RNAポリメラーゼIIと会合し、転写終結プロセスの引き金を引くタンパク質因子により認識されるDNA配列。これは、ポリＡシグナルもコードする。
操作された細胞：遺伝子改変によりゲノムが操作された改変細胞。
エピトープ：抗原決定因子としても知られるエピトープは、免疫系により、特に抗体、Ｂ細胞又はＴ細胞により認識される抗原の部分である。例えば、エピトープは、抗体が結合する特定の抗原片である。
エピジェネティックインスレータ配列：調節配列、例えばエンハンサ又はサイレンサとプロモータとの間のコミュニケーションを中断させるDNAエレメント。
eTPCシステム：eTPCS、eTPC-t細胞又はそのライブラリを、eAPC:eTPCシステムにおける組合せのために調製するシステム。
FACS/フローサイトメトリ：蛍光標示式細胞選別。フローサイトメトリは、特定の細胞表面及び細胞内マーカーの発現について個別の細胞をまとめて分析できる技術である。この技術の変法である細胞選別は、規定されたマーカーセットを有する細胞を、更なる分析のために回収することを可能にする。
APXのファミリー：抗原提示複合体を構成する機能的に関連するタンパク質をコードする幾つかの類似の遺伝子のセット
Flpリコンビナーゼ：パン酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の２μmプラスミドに由来するリコンビナーゼ(フリッパーゼ、Flp)。
蛍光(タンパク質)マーカー：特定の消光及び発光特徴を有し、顕微鏡観察、FACS及び関連する技術により検出できる分子。
生殖系列遺伝子セグメント：ヒトに自然に存在する(TCR)遺伝子セグメント。
遺伝子シスエレメント：は、それが調節する遺伝子と同じDNA分子上に存在するが、トランス調節エレメントは、それらが転写された遺伝子から離れた遺伝子を調節できる。シス調節エレメントは、しばしば、１以上のトランス因子のための結合部位である。
遺伝子バーコーディング：DNAバーコーディングは、それが特定の種に属することを同定するための、生物のDNA中の短い遺伝子マーカーを用いる分類学的方法である。
ゲノム受容部位：遺伝子ドナーベクター内にコードされるドナー遺伝子材料の標的化組込みのためのゲノム内の部位。
ゲノム受容部位リサイクリング：占められたゲノム受容部位の、新しい被分析物(TCR) ORFを組み込むことができる立体配置への復帰
ハプロタイプ：単一染色体上に位置する遺伝子決定因子のセット。
HLAハプロタイプ：各個体に存在するHLAI及びHLA IIアレルのセット。
異種特異的リコンビナーゼ部位：２つのDNA分子のクロスオーバーを促進するためのリコンビナーゼ酵素により認識されるDNA配列。
HLA I：ヒト白血球抗原クラスＩ。全ての有核細胞においてヒトにおいて発現される遺伝子。発現したHLA Iは、細胞表面に輸送されて、そこで、内部タンパク質の短い断片、ペプチドをカーゴとしてＴ細胞受容体に提示する。このように、これは、進行中の感染の可能性のある固有タンパク質の断片を提示する。HLA Iは、加えて、培養培地に加えられるか、導入された遺伝子エレメントから発現されたタンパク質から作製されるか又は細胞により取り込まれたタンパク質から作製されるペプチドをカーゴとして提示できる。HLAクラスＩ遺伝子は多型であり、これは、異なる個体が同じ遺伝子において、提示におけるバリエーションを導くバリエーションを有する可能性があることを意味する。HLAクラスIIと関連する。
HLA II：ヒト白血球抗原クラスII。適応免疫応答を調和し助ける特定の細胞(例えば樹状細胞)においてヒトにおいて発現される遺伝子。HLAクラスＩと関連する。HLAクラスIIタンパク質は、細胞表面に輸送されそこでこれらは外部タンパク質の短い断片、ペプチドをカーゴとしてＴ細胞受容体に提示する。このように、これは、進行中の感染の可能性のある固有タンパク質の断片を提示する。HLA IIは、培養培地に加えられるか、導入された遺伝子エレメントから発現されたタンパク質から作製されるか又は細胞により取り込まれたタンパク質から作製されるペプチドをカーゴとして更に提示できる。HLAクラスII遺伝子は多型であり、これは、異なる個体が同じ遺伝子において、提示におけるバリエーションを導くバリエーションを有する可能性があることを意味する。
相同アーム：相補相同アームとほぼ同一の配列同一性を有し、よって細胞性プロセスである相同性配向型修復による２つのDNA分子の交換を促進するDNAの区間。
免疫監視機構：免疫系が感染、悪性病変又はその他の病原性の可能性がある変化を検出し、それにより活性化されるプロセス。
免疫療法：疾患と戦う体の自然の防御を高める種類の処置。これは、免疫系機能を改善又は回復する、体により又は実験室で作られる物質を用いる。
インスレータ：近傍の遺伝子の活性化又は抑制により遺伝子が影響されることを妨げるDNA配列。インスレータは、発現停止された遺伝子から活性に転写された遺伝子へのヘテロクロマチンの広がりも妨げる。
組込み：細胞の染色体へのDNA配列の物理的ライゲーション
組込みベクター：TCR ORFを含み、組込みを可能にする遺伝子エレメントを５'及び３'末端に含む、ゲノム受容部位にマッチしたTORESの生成物。
組込みカップル：マッチした、組込みベクター及びゲノム受容部位
配列内リボソーム進入部位(IRES)：一旦転写されると、キャップ非依存様式で翻訳の開始を可能にするRNAエレメントをコードするDNA配列。
アイソフォーム：類似するが同一でないアミノ酸配列を有し、異なる遺伝子又は異なるエキソンが除かれた同じ遺伝子からのRNA転写産物のいずれかによりコードされる、2つ以上の機能的に類似のタンパク質のいずれか。
Ｊ(領域)：連結セグメント。Ｔ細胞受容体を組立てるために用いられる遺伝子セグメントの一つ。各個体は、これらの領域の多数の異なるバリエーションを有して、各個体が非常に多種類の異なるTCRを有するＴ細胞で武装できるようにする。
Ｊドナー骨格：連結ドナー骨格。Ｊ受入カセット断片が挿入されてＪ受入カセットベクターを創出するベクター骨格。
Ｊドナーベクター：Ｊ TCRセグメントを有し、このセグメントを、全長TCR ORFの再構成中にＶ-Ｃエントリーベクターに与える二成分ベクターシステムのベクター、
Ｊ受入カセット断片：連結受入カセット断片。Ｊ受入カセットベクターを構築するために用いられるＣ部を有するクローニング断片。
Ｊ受入カセットベクター：連結受入カセットベクター。Ｊセグメント部が挿入されてＪドナーベクターを創出する、Ｃ部を有するベクター。
Ｊセグメント部：連結セグメント部分。Ｊ受入カセットベクターに挿入されてＪドナーベクターを作製するＪ遺伝子セグメントの一部を有するDNA構築物。
コザック配列：翻訳の効率的な開始のために必要な短い配列
主要HLAクラスＩ：遺伝子HLA-A、HLA-B及びHLA-Cで構成されるAPXのファミリー。
マッチした：２つの成分が、相補成分の間の相互作用を駆動及び制限する遺伝子エレメントをコードする場合
メガヌクレアーゼ認識部位：メガヌクレアーゼと一般的に呼ばれるエンドデオキシリボヌクレアーゼにより認識されるDNA配列
代謝産物：細胞の代謝経路により創出又は変更された分子
可動遺伝子エレメント：トランスポサーゼ酵素の活性を有するDNAの組込みを許容するDNA配列。
モノクローン株化細胞：細胞複製の反復により単一祖先細胞から生成される規定された細胞群
mRNA スプライスアクセプター部位：５'末端にて、DNAヌクレオチドは、GT[プレメッセンジャーRNA(pre-mRNA)においてはGU]であり、３'末端にてAGである。これらのヌクレオチドは、スプライシング部位の一部である。ドナースプライス：イントロンの開始、イントロン５'左末端でのスプライシング部位。アクセプタースプライス：イントロンの終端、イントロン３'右末端でのスプライシング部位。
多量体：複数の同一単量体からなるタンパク質複合体。HLA多量体反応剤の文脈においてしばしば用いられる。
天然型：細胞に天然に存在する物体。
ネガティブ選択マーカー：ベクター及び/又はマーカーを有するベクターを有する宿主生物のネガティブ選択を与える選択可能なマーカー
非細胞ベースの粒子：(NCBP)は、該粒子が、被分析物抗原又はeTPC:Aシステム内のeTPC-tの表面でのTCRsp結合について評価されるその他の物体を提示するので、親和性反応剤と類似の様式で作用する。しかし、NCBPは、提示される被分析物抗原又はその他の結合物体の直接的又は近傍の識別子として作用する遺伝子又はその他の情報を更に有することができる、より大きい物体とみなされる。NCBPの典型的な例は、ファージディスプレイのシナリオにおけるバクテリオファージである。
ノンコーディング遺伝子：機能的ノンコーディングRNA分子に転写されるタンパク質ノンコーディングDNA配列。
odeCDR3：相補性決定領域をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖。全長TCR ORFを再構成するために二成分ベクターシステムに関連して用いられる、終端オーバーハングと共にCDR3遺伝子配列を有する合成構築物。
複製起点：そこで複製が開始する、ベクター、プラスミド又はゲノム内の特定の配列。
ORF：オープンリーディングフレーム。リボソームによるタンパク質(ポリペプチド)の合成のための翻訳フレームをコードする遺伝子材料の区間。
オーバーハング：二本鎖核酸分子の末端での一本鎖配列。しばしば粘着又は付着末端と呼ばれる。
PCR：特定の標的DNA分子が指数関数的に増幅されるポリメラーゼ連鎖反応
ペプチド：６〜30の間のアミノ酸長のアミノ酸の短い一続き。
表現型分析：細胞の観察可能な特徴の分析。
プラスミド：遺伝子構築物、典型的に、細菌又は原生動物の細胞質内の小さい環状DNA鎖は、染色体とは独立して複製できる。
多型：同じ遺伝子の異なるアレルの存在により、同じ種の個体において異なる形で存在する。
ポリペプチド：三次元構造を形成する、ペプチドの区間からなるタンパク質。
ポジティブ選択マーカー：ベクター及び/又はマーカーを有するベクターを有する宿主生物のポジティブ選択を与える選択可能なマーカー。
プライマー：例えばPCR中に標的DNA配列の特異的認識を可能にする短いDNA配列。
プロフェッショナルAPC：アルファベータ及びガンマデルタＴ細胞によりサンプリングのために抗原を提示できる任意の有核細胞。
プロモータ：遺伝子発現の制御された開始のための調節DNAエレメント。
リコンビナーゼ：遺伝子組換えを媒介する酵素。
レポーターエレメント：エレメントを有する生物又はベクターにおけるレポートされたシグナルを媒介する遺伝子エレメント。ポジティブ又はネガティブ選択マーカーとして用いることができる。
制限酵素切断配列：制限酵素の認識配列にとって外的又は固有であり得る、制限酵素により切断される遺伝子配列。
制限酵素認識配列：制限酵素により認識され、制限酵素が結合する遺伝子配列。
選択可能なマーカー：人工的選択法に適切な形質を与えるDNA配列。
スプライスアクセプター部位：表面でTCRspを有する細胞又はTCRspベースの反応剤との相互作用のための、イントロンAM、APX CM又は親和性反応剤の３'末端のDNA配列。
スプライスドナー部位：イントロンの５'末端でのDNA配列。
体細胞Ｖ(Ｄ)Ｊ組換え：このプロセスの後に、各Ｔ細胞が単一の別個に再編成されたTCRのコピーを発現する。TRB及びTRD遺伝子座での組換えのことをいい、多様性(Ｄ)遺伝子セグメントを更に含む。
自殺遺伝子：この遺伝子を有する宿主生物内で細胞死を媒介する遺伝子。ポジティブ又はネガティブ選択マーカーとして用いることができる。
合成：人工的に作製された物体。
Ｔ細胞：Ｔリンパ球。その表面でＴ細胞受容体を発現する白血球。自己と反応しないが、感染及び悪性疾患を認識し、同じ種のほとんどのメンバーからの移植片を拒絶する能力を有するように免疫系により選択される。
Ｔ細胞成熟：自己に属し、健常でないか又は自己に全く属さないものから健常である細胞をＴ細胞が区別できるようにするプロセス。胸腺で生じる。
Ｔ細胞レパートリー：Ｔ細胞受容体の別個のセット。
TCR：Ｔ細胞受容体。Ｔリンパ球と呼ばれるリンパ球の下位集団により発現される親和性分子。ヒトでは、TCRは、ウイルス若しくは細菌感染又はがん性細胞からの断片を含む、APX CM又はAPX AMにより提示されるカーゴを認識する。よって、TCR認識は、適応免疫系の肝要な部分である。TCRは、細胞表面で対形成する２つの鎖からなる。各細胞の表面で発現されるTCRは、様々な遺伝子(ｖ、ｄ、ｊ及びｃセグメント)の大きいプールから無作為に組立てられるので、各個体は、異なるTCRの非常に大きく多様なレパートリーを発現するＴ細胞のプールを有する。
ターミネータエレメント：は、転写中にゲノムDNAにおいて遺伝子又はオペロンの終端を印づける核酸配列の一区画である。この配列は、新しく合成されたmRNAにおいて、転写複合体からmRNAを放出するプロセスの引き金を引くシグナルを与えることにより、転写終結を媒介する。これらのプロセスは、複合体とのmRNA二次構造の直接相互作用及び/又は動員した終結因子の間接的な活性を含む。転写複合体の放出は、RNAポリメラーゼ及び関連する転写装置を自由にして、新しいmRNAの転写を開始する。終結エレメントは、DNAの鋳型鎖にあり、６塩基により分けられた２つの逆方向反復とそのあとの一連のアデニン(Ａ's)からなる。
胸腺選択：未熟胸腺細胞は、それらのＴ細胞受容体の特異性に基づく選択のプロセスを受ける。これは、機能的であるＴ細胞の選択(ポジティブ選択)及び自己反応性であるＴ細胞の排除(ネガティブ選択)を含む。胸腺の髄質が、Ｔ細胞成熟の部位である。
腫瘍関連抗原：腫瘍抗原は、腫瘍細胞で生成される抗原性物質であり、すなわちこれは宿主における免疫応答の引き金を引く。腫瘍抗原は、診断試験で腫瘍細胞を同定するために有用な腫瘍マーカーであり、がん療法で用いるための可能性のある候補である。
TRA：TCRアルファをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする４つの異なる遺伝子座のうちの一つ。翻訳されたTCRアルファ鎖タンパク質は、典型的に、翻訳されたTCRベータ鎖タンパク質と対形成して、アルファ/ベータTCRspを形成する。
TRB：TCRベータをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする４つの異なる遺伝子座のうちの一つ。翻訳されたTCRベータ鎖タンパク質は、典型的に、翻訳されたTCRアルファ鎖タンパク質と対形成して、アルファ/ベータTCRspを形成する。
TRD：TCRデルタをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする４つの異なる遺伝子座のうちの一つ。翻訳されたTCRデルタ鎖タンパク質は、典型的に、翻訳されたTCRガンマ鎖タンパク質と対形成して、ガンマ/デルタTCRspを形成する。
TRG：TCRガンマをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする４つの異なる遺伝子座のうちの一つ。翻訳されたTCRガンマ鎖タンパク質は、典型的に、翻訳されたTCRデルタ鎖タンパク質と対形成して、ガンマ/デルタTCRspを形成する。
二成分ベクターシステム：所望の配列を有する単一ＶＣエントリーベクターと単一Ｊドナーベクターとを、CDR3をコードする短いDNAオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)配列と組み合わせて、単一チューブ反応において、制限酵素及びリガーゼ依存的及びPCR依存的様式で、インビトロで全長TCR ORFを再構成できる。
Ｉ型膜貫通ドメイン：ストップ-トランスファーアンカー配列を用いて脂質膜に係留されている一回通過分子であり、そのＮ末端ドメインは、合成中に小胞体内腔(及び成熟形が原形質膜に位置するならば、細胞外空間)を標的にする。
IIS型制限酵素：非対称DNA配列を認識し、その認識配列の外側で切断する制限酵素。
Ｖ(領域)：可変領域。Ｔ細胞受容体を組立てるために用いられる遺伝子セグメントの一つ。各個体は、これらの領域の多数の異なるバリエーションを有して、各個体が非常に多種類の異なるTCRを有するＴ細胞で武装できるようにする。
Ｖ-Ｃエントリーベクター：Ｖ及びＣ TCRセグメントを有し、全長TCR ORFの再構成中にＪドナーベクター及びodeCDR3からの配列を受け入れる二成分ベクターシステムのベクター。
Ｖクローニング断片：可変クローニング断片。Ｖ遺伝子セグメントクローニング断片とも呼ばれる。Ｖ-Ｃエントリーベクターを構築するために用いられるＶ遺伝子セグメントの一部分を有する構築物。
ベクター：ベクターは、遺伝情報を有する遺伝子構築物である。この文脈において、ベクターは、通常、プラスミドDNAベクターを表す。ベクターは、宿主生物において増やして選択できる任意のこのような構築物のことであり得る。

Claims (32)

  1. 第１の部分が多成分のTCR ORF再構成及び操作システム(TORES)であり、第２の部分が多成分の操作TCR提示細胞システム(eTPCS)であり、
    TORESが、２つの別々の成分を含み、第１の成分1Aが、可変及び定常(Ｖ-Ｃ)Ｔ細胞受容体(TCR)遺伝子セグメントを有するベクターであり、第２の成分1Bが、連結(Ｊ)TCR遺伝子セグメントを有するベクターであり、
    TORESが、
    ａ．天然型TCR鎖
    ｂ．配列が多様化されたTCR鎖
    ｃ．合成TCR鎖
    から選択される被分析物TCR ORFを各々コードする１以上の遺伝子組込みベクターである成分2C及び/又は2Eをもたらすように働き、
    eTPCSが、成分2Aと呼ばれる第１の成分であるeTPCを含み、
    成分2Aが、
    ａ．TCRアルファ、ベータ、デルタ及びガンマ鎖の内因性発現を欠き、
    ｂ．細胞がTCR鎖の相補対を発現する場合にのみ該細胞の表面で条件的に提示されるCD3タンパク質を発現し、
    ｃ．各々が成分2C及び2Eによりそれぞれコードされる被分析物TCR ORFの組込みのためのゲノム受容部位である2B及び2Dと呼ばれる更なる成分を含み、
    ゲノム受容部位2B及び2Dが、各々
    ａ．リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)のために設計された合成構築物
    ｂ．部位特異的相同組換えのために設計された合成構築物
    から選択され、
    成分2C及び2Eが、１つの被分析物TCRアルファ、ベータ、デルタ及び/又はガンマ鎖をコードする単一ORFをそれぞれ成分2B及び2Dに送達するように設計され、2C及び/又は2Eが、所望により、組込みの選択マーカーをコードし、被分析物TCR鎖が、成分2Aに、CD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として発現され得る、二部分装置。
  2. １以上の遺伝子組込みベクターである成分2C及び/又は2Eが、第２の部分のインプットとして用いられる、請求項１に記載の二部分装置。
  3. eTPCSが、１以上のTORES由来被分析物TCR鎖を提示する１以上の被分析物eTPCをもたらし、１以上の被分析物eTPCが、
    ａ．TCR対を発現するeTPC(eTPC-t)及び/又は
    ｂ．TCR鎖を発現するeTPC(eTPC-x)及び/又は
    ｃ．その１以上のライブラリ
    から選択される、請求項１に記載の二部分装置。
  4. 被分析物TCR鎖対が、被分析物eTPCにより、CD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として発現される、請求項３に記載の二部分装置。
  5. 成分1Aが、
    ａ．複製起点、
    ｂ．第１のポジティブ選択マーカー、
    ｃ．１以上の５'遺伝子エレメント、
    ｄ．コザック配列、
    ｅ．TCR可変遺伝子セグメント、
    ｆ．IIS型制限酵素による部位特異的認識及び切断のための第１のIIS型配列、
    ｇ．ネガティブ選択マーカー、
    ｈ．第２のIIS型配列、
    ｉ．TCR定常遺伝子セグメント、及び
    ｊ．１以上の３'遺伝子エレメント
    を含むＶ-Ｃエントリーベクターである、請求項１に記載の二部分装置。
  6. 成分1Bが、
    ａ．複製起点、
    ｂ．第２のポジティブ選択マーカー、
    ｃ．第３のIIS型配列、
    ｄ．TCR連結遺伝子セグメント、
    ｅ．定常遺伝子セグメントの小さい５'部分に相当するＣ部、及び
    ｆ．第４のIIS型配列
    を含むＪドナーベクターである、請求項１又は５に記載の二部分装置。
  7. 成分1Aの５'遺伝子エレメントが、
    ａ．遺伝子シスエレメント、
    ｂ．リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
    ｃ．ゲノム受容部位2B又は2Dについての５'相同組換えアーム、
    ｄ．mRNAスプライスアクセプター部位、
    ｅ．配列内リボソーム進入部位、及び
    ｆ．エピジェネティックインスレータ配列
    から選択される１以上のエレメントを更に含み、
    ｇ．５'遺伝子エレメントが、少なくともｂ又はｃを必ず含む、請求項５又は６に記載の二部分装置。
  8. 成分1Aにおけるネガティブ選択マーカーが、以下：
    ａ．第１の成分の他の場所にもTCR連結遺伝子セグメント内にも含まれない制限酵素認識部位、
    ｂ．条件的殺菌性因子をコードする遺伝子、及び
    ｃ．レポーターエレメント
    の１以上から選択される、請求項５を引用する請求項６若しくは７又は請求項５を引用する請求項６を引用する請求項７に記載の二部分装置。
  9. 成分1Aの３'遺伝子エレメントが、
    ａ．ターミネータエレメント、
    ｂ．リコンビナーゼ酵素のための異種特異的認識部位、
    ｃ．ゲノム受容部位2B又は2Dについての３'相同組換えアーム、
    ｄ．mRNAスプライスドナー部位、
    ｅ．配列内リボソーム進入部位、及び
    ｆ．エピジェネティックインスレータ配列
    から選択される１以上のエレメントを更に含み、３'遺伝子エレメントが、少なくともｂ又はｃを必ず含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の二部分装置。
  10. 第１の部分の第１及び第２のポジティブ選択マーカーが、互いに異なり、抗生物質耐性遺伝子及び/又は栄養要求性補完遺伝子から選択される、請求項５を引用する請求項６、請求項５を引用する請求項６を引用する請求項７、請求項５を引用する請求項６を引用する請求項８、請求項５を引用する請求項６を引用する請求項７を引用する請求項８、請求項５を引用する請求項６を引用する請求項９、請求項５を引用する請求項６を引用する請求項７を引用する請求項９、請求項５を引用する請求項６を引用する請求項８を引用する請求項９又は請求項５を引用する請求項６を引用する請求項７を引用する請求項８を引用する請求項９に記載の二部分装置。
  11. 第１の部分が、CDR3をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖(odeCDR3)を含む第３の成分1Cを更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の二部分装置。
  12. 1Cが、
    ａ．1Aにおける第１のIIS型制限酵素認識及び切断部位に相補的な第１の一本鎖オーバーハング配列、
    ｂ．TCR CDR3領域をコードし、1Aにおけるネガティブ選択エレメントを含まず、成分1A及び1BのいずれのIIS型制限配列も含まない二本鎖セグメント、及び
    ｃ．1Bにおける第３のIIS型制限酵素認識及び切断部位に相補的な第２の一本鎖オーバーハング配列
    を含むか、或いは、1Cが、
    ｄ．IIS型制限酵素部位に挟まれたTCR CDR3をコードし、切断されたときに前記ａ〜ｃに規定される分子を生じる単一の二本鎖DNA分子
    を含む、請求項１１に記載の二部分装置。
  13. 成分2Aが、機能的形態の被分析物 抗原提示複合体(aAPX)の少なくとも１つのファミリー及び/又は被分析物 抗原性分子(aAM)の内因性表面発現を欠く細胞である、請求項１に記載の二部分装置。
  14. aAPXのファミリーが、以下：
    ｉ．HLAクラスＩ
    ii．HLAクラスII
    iii．非HLA抗原提示複合体
    のいずれかであってよい、請求項１３に記載の二部分装置。
  15. 第１の部分が多成分のTCR ORF再構成及び操作システム(TORES)であり、第２の部分が多成分の操作TCR提示細胞システム(eTPCS)であり、
    TORESが、２つの別々の成分を含み、第１の成分1Aが、可変及び定常(Ｖ-Ｃ)Ｔ細胞受容体(TCR)遺伝子セグメントを有するベクターであり、第２の成分1Bが、連結(Ｊ)TCR遺伝子セグメントを有するベクターであり、
    TORESが、
    ａ．天然型TCR鎖
    ｂ．配列が多様化されたTCR鎖
    ｃ．合成TCR鎖
    から選択される被分析物TCR ORFを各々コードする１以上の遺伝子組込みベクターである成分2C及び/又は2Eをもたらすように働き、
    eTPCSが、成分2Aと呼ばれる第１の成分であるeTPCを含み、
    成分2Aが、
    ａ．TCRアルファ、ベータ、デルタ及びガンマ鎖の内因性発現を欠き、
    ｂ．細胞がTCR鎖の相補対を発現する場合にのみ該細胞の表面で条件的に提示されるCD3タンパク質を発現し、
    ｃ．成分2C及び2Eによりそれぞれコードされる被分析物TCR ORFの組込みのためのゲノム受容部位である2B及び2Dと呼ばれる更なる成分を含み、
    ゲノム受容部位2B及び2Dが各々、リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)のために設計された合成構築物及び部位特異的相同組換えのために設計された合成構築物から選択され、
    成分2C及び2Eが各々、一対の被分析物TCR鎖をコードする２つのORFをそれぞれ成分2B及び2Dに送達するように設計され、該ORFは、所望により、組込みの選択マーカーをコードし、被分析物TCR鎖が、成分2Aに、CD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として発現され得る、二部分装置。
  16. 成分2Aが、
    ａ．少なくとも１つの天然型プロモータ及び/又は少なくとも１つの合成プロモータと少なくとも１つのレポーターとを含む単一成分合成構築物、
    ｂ．少なくとも１つの天然型プロモータ及び/又は少なくとも１つの合成プロモータと少なくとも１つのレポーターとを有するように設計された多成分合成構築物
    から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメントである2Fと呼ばれる成分を更に含み、
    ａ及び/又はｂの活性化が、合成経路、天然型経路又はその組合せから選択される少なくとも１つのシグナル伝達経路に依存する、請求項１又は１５に記載の二部分装置。
  17. ゲノム受容部位2B及び2Dが、リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)のために設計された合成構築物である、請求項１に記載の二部分装置。
  18. aAMが、
    ａ．被分析物 抗原性分子ORFから翻訳されたポリペプチド又はポリペプチドの複合体
    ｂ．被分析物 抗原性分子ORFから翻訳されたポリペプチドに由来するペプチド
    ｃ．遺伝子操作されたTCR-提示細胞(成分2A)のプロテオームの変更に由来するペプチド
    ｄ．遺伝子操作されたTCR-提示細胞(成分2A)のプロテオームの変更に由来するポリペプチド
    ｅ．遺伝子操作されたTCR-提示細胞(成分2A)のメタボロームの変更に由来する代謝産物
    から選択される、請求項１３又は１４に記載の二部分装置。
  19. 成分2Aが、CD4及び/又はCD8を発現する、請求項１３、１４及び１８のいずれか一項に記載の二部分装置。
  20. 成分2Aが、更なるTCR共受容体を発現する、請求項１３、１４、１８及び１９のいずれか一項に記載の二部分装置。
  21. 成分2Aが、CD28及び/又はCD45を発現する、請求項１３、１４及び１８〜２０のいずれか一項に記載の二部分装置。
  22. 成分2B及び2Dを含み、成分2B及び2Dが以下の遺伝子エレメント：
    ａ．異種特異的リコンビナーゼ部位
    ｂ．相同アーム
    ｃ．真核生物性プロモータ
    ｄ．真核生物性条件的調節エレメント
    ｅ．真核生物性ターミネータ
    ｆ．選択マーカー
    ｇ．スプライスアクセプター部位
    ｈ．スプライスドナー部位
    ｉ．タンパク質非コーディング遺伝子
    ｊ．インスレータ
    ｋ．可動遺伝子エレメント
    ｌ．メガヌクレアーゼ認識部位
    ｍ．配列内リボソーム進入部位(IRES)
    ｎ．ウイルス性自己切断型ペプチドエレメント
    ｏ．コザックコンセンサス配列
    の少なくとも１つで構成される、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の二部分装置。
  23. 成分2C及び2Eを含み、成分2C及び2Eが以下の遺伝子エレメント：
    ａ．異種特異的リコンビナーゼ部位
    ｂ．相同アーム
    ｃ．真核生物性プロモータ
    ｄ．真核生物性条件的調節エレメント
    ｅ．真核生物性ターミネータ
    ｆ．選択マーカー
    ｇ．組込みの選択マーカー
    ｈ．スプライスアクセプター部位
    ｉ．スプライスドナー部位
    ｊ．タンパク質ノンコーディング遺伝子
    ｋ．インスレータ
    ｌ．可動遺伝子エレメント
    ｍ．メガヌクレアーゼ認識部位
    ｎ．配列内リボソーム進入部位(IRES)
    ｏ．ウイルス性自己切断型ペプチドエレメント
    ｐ．抗生物質耐性カセット
    ｑ．細菌性複製起点
    ｒ．酵母性複製起点
    ｓ．クローニング部位
    ｔ．コザックコンセンサス配列
    の少なくとも１つで構成される、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の二部分装置。
  24. 成分2B及び2Dを含み、成分2B及び2Dが単一ORFのRMCE組込みのためであり、
    ａ．真核生物性プロモータ
    ｂ．2C及び2Eのものとマッチした一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
    ｃ．コザックコンセンサス配列
    ｄ．選択マーカー
    ｅ．真核生物性ターミネータ
    を含む、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の二部分装置。
  25. 成分2C及び2Eが存在し、各々が単一ORFのRMCE組込みのためであり、成分1Aが寄与する以下の遺伝子エレメント：
    ａ．2B及び2Dのものとマッチした一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
    ｂ．コザックコンセンサス配列
    ｃ．第１の部分であるTORESの働きにより再構成されるTCR ORF
    を含む、請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の二部分装置。
  26. 成分2C及び2Eを含み、成分2C及び2Eが、TORESの働きにより、単一の被分析物TCR鎖対をもたらす、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の二部分装置。
  27. 成分2C及び/又は2Eが含まれ、2C及び/又は2Eが、TORESの働きにより、2C及び/又は2Eによりコードされる被分析物TCR鎖対のライブラリをもたらす、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の二部分装置。
  28. 被分析物TCR鎖をコードする配列が、
    ａ．ドナー又は患者の初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列のペア型シーケンシング及び第１の部分であるTORESにおける再構成
    ｂ．ドナー又は患者の初代Ｔ細胞からのTCR鎖ORF配列の非ペア型シーケンシング及び第１の部分であるTORESにおける再構成
    ｃ．TORESの働きにより生じる合成TCR鎖ORF配列
    から導かれる、請求項２６又は２７に記載の二部分装置。
  29. １以上の成分2C及び/又は2Eが、成分2C及び/又は2Eにコードされる２つの相補被分析物TCR鎖を成分2B及び/又は2Dに組み込んでeTPC-tと呼ばれる細胞を得るために成分2Aと組み合わされ、成分2B及び/又は2Dが、成分2Aの表面で被分析物TCRspを発現する成分2B'及び/又は2D'になる、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の二部分装置。
  30. 成分2C又は2Eの一方が、成分2C又は2Eにコードされる１つの被分析物TCR鎖を成分2B又は2Dに組み込んでeTPC-xと呼ばれる細胞を得るために成分2Aと組み合わされ、成分2B又は2Dが、eTPC-xで単一TCR鎖を発現する成分2B'又は2D'になる、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の二部分装置。
  31. 成分2C又は2Eの一方が、成分2C又は2Eにコードされる１つの被分析物TCR鎖をeTPC-xの成分2B又は2Dに組み込んでeTPC-tを得るためにeTPC-xと組み合わされ、１つの被分析物TCR鎖が、eTPC-xに発現されるTCR鎖に相補的であり、成分2B又は2Dが、eTPC-tの表面でTCRspを発現する成分2B'又は2D'になる、請求項３０に記載の二部分装置。
  32. 少なくとも１つの被分析物eTPC-tの作製に使用するための請求項１〜３１のいずれか一項に記載の二部分装置。
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