CN111315883B - 用于全长t细胞受体可读框的快速装配和多样化的两组分载体文库系统 - Google Patents

用于全长t细胞受体可读框的快速装配和多样化的两组分载体文库系统 Download PDF

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Abstract

包含两个独立组分的组合型系统，其中第一组分是携带可变和恒定(V‑C)T细胞受体(TCR)基因区段的载体，并且第二组分是携带TCR连接(J)基因区段的载体。可以如此修饰该合并型系统，从而所述第一组分是编码第一TCR链的修饰的V‑C入门载体，所述系统还包含第四和第五组分，其中第四组分包含双向终止子(BiT)供体载体，并且第五组分包含编码与所述第一TCR链互补的第二TCR链的修饰的V‑C入门载体。

Description

用于全长T细胞受体可读框的快速装配和多样化的两组分载 体文库系统
技术领域
异二聚T细胞受体(TCR)是适应性免疫的核心。在T细胞生成期间独特TCR持续产生，因而一系列基因区段重组成单个连续TCR可读框(ORF)。归因于这个重组过程中产生的庞大程度的多样性，难以从单个细胞中表达的TCR对中采集序列数据。另外，这种多样性还造成难以在遗传构建体内基于高通量提供这些TCR可读框(ORF)以检验和操作TCR功能。在第一方面，本发明提供预装配的两组分载体文库系统，其由可变-恒定入门载体(V-C入门)和连接供体(J供体)载体组成，包含TCR基因区段的一些部分。该双组分系统以如此方式设计，从而当选自V-C入门载体文库的V-C入门载体与选自J供体载体文库的J供体载体，连同编码TCR互补决定区3的合成DNA寡核苷酸双链体(odeCDR3)，在限制性酶消化/连接酶循环反应中组合时，可以产生单一载体，重构全长TCR ORF。这种载体文库系统使得PCR非依赖性方法可以用于在选定载体背景下快速和成本有效地产生TCR ORF。此外，这种系统允许以新颖过程产生合成的TCR序列用于亲和力和/或功能成熟过程。这种TCR ORF重构和工程化系统(TORES)因此是用于TCR功能性分析和工程化的强大工具。在第二方面，提供具有修饰的V-C入门载体的TORES，连同第三组分双向终止子供体载体(BiT供体)，从而能够实现将两个TCR ORF链对以反平行编码含义连接成单一产物载体的第二步骤。这种双向TORES2系统能够实现备选作业流程以递送配对的TCR ORF构建体用于TCR操作和表征。
发明背景
T淋巴细胞(T细胞)的免疫监视是全部有颌类脊椎动物的适应性免疫中的核心功能。T细胞免疫监视通过T细胞亚型的丰富功能多样性来实现，这些T细胞亚型的作用包括，消除病原体感染细胞和肿瘤细胞、以及协调适应性免疫应答以对抗正在入侵的病原体、共生性微生物、共生非自我因素(如食品原料的分子组分)、和甚至维持自我免疫耐受性。为了响应于各种外来因素和自我因素，T细胞必须能够特异性检测这些外来因素和自我因素的分子组分。因此T细胞必须能够以足够的特异性来检测个体遭遇到的庞大自我分子和非自我分子，从而针对致病生物和患病自我发动有效应答，同时避免对健康自我发动这类应答。考虑到外来分子和自我分子的多样性实际上不受限制且致病生物处于逃避T细胞检测的进化压力下，这项任务的高度复杂性质是明显的。
T细胞受体(TCR)
T细胞主要依据表达的T细胞受体(TCR)界定。TCR是T细胞的组分，其负责与T细胞适应性免疫的靶标相互作用并感知该靶标。概括而言，TCR由呈递在细胞表面上的异二聚体蛋白质复合体组成。两条TCR链各自由两个胞外结构域组成，即可变(V)区和恒定(C)区，两者均为免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，形成反平行β-片层。这些结构域由连接短胞质尾的I型跨膜结构域锚定在细胞膜中。T细胞能够适应并且检测分子组分多样性的性质，源自TCR链在T细胞发生期间产生的变异。这种变异与类似于B细胞中抗体生成的方式通过体细胞重组而产生。
TCR链多样性
T细胞集合由几个功能上和表型上异质的亚群组成。但是，T细胞可以根据它们在表面表达的经体细胞重排的TCR形式，广义地划分为αβ或γδ。存在两种TCR链对形式；TCR α(TRA)和TCR β(TRB)对；和TCR γ(TRG)和TCR δ(TRD)对。表达TRA:TRB对的T细胞称作αβ T细胞，而表达TRG:TRD对的T细胞经常称作γδ T细胞。
αβ形式和γδ形式的TCR负责识别多样的配体或‘抗原’，并且每个T细胞在T细胞成熟期间从头生成αβ或受体链。这些新生TCR链对通过在称作体细胞V(D)J重组的过程中产生受体序列多样性，实现多样性识别，此后，每个T细胞表达单一一种独特重排的TCR的拷贝。在TRA基因座和TRG基因座，多个离散的可变(V)和功能(J)基因区段可用于重组并与恒定(C)基因区段并置，因此称作VJ重组。在TRB基因座和TRD基因座处的重组额外地包括多样性(D)基因区段，并且称作VDJ重组。
每个重组的TCR具有用于独特配体特异性的潜力，这由α链和β链(在αβ T细胞情况下)或γ链和δ链(在T细胞情况下)形成的配体结合位点的结构决定。TCR的结构多样性主要限于每条链上的三个短发夹环，称作互补决定区(CDR)。受体链对的每条链各贡献三个CDR，合在一起这六个CDR环位于TCR胞外结构域的远膜端，形成抗原结合位点。
每条TCR链中的序列多样性以两种方式实现。首先，通过随机选择基因区段以重组，提供了基本的序列多样性。例如，TRB重组在47个独特V、2个独特D和13个独特J种系基因区段之间发生。通常而言，V基因区段贡献CDR1环和CDR2环，并且因此是种系编码的。产生序列多样性的第二方式出现在高变性CDR3环内部，其中通过在正在重组的V、(D)和J基因区段之间的交界处随机缺失模板核苷酸和加入非模板核苷酸，产生所述CDR3环。
TCR:CD3复合体
成熟的αβ和γδ TCR链对在细胞表面呈递，与多种称作ε、γ、δ和ζ的辅助CD3亚基形成复合体。这些亚基以三种二聚体(εγ、εδ、ζζ)形式与αβ或γδ TCR缔合。这种TCR:CD3复合体形成当αβ或γδ TCR与同族抗原(cognate antigen)接合时启动细胞信号传导响应的单位。缔合在TCR:CD3复合体中的CD3辅助亚基贡献了信号传导基序，其称作免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。CD3ε，CD3γ和CD3δ各自贡献单一ITAM，而CD3ζ同型二聚体含有3个ITAM。与TCR装配的三种CD3二聚体(εγ、εδ、ζζ)因此贡献10个ITAM。一旦TCR与同族抗原连接，则串联酪氨酸残基的磷酸化可以为含有Src同源性2(SH2)结构域的蛋白质(如关键的70kDaζ链缔合蛋白(ZAP-70))提供配对的对接位点。招募这类蛋白质将启动最终负责T细胞活化和分化的TCR:CD3信号传导复合体的形成。
αβ T细胞
人类中αβ T细胞通常比其γδ T细胞对应物更丰富。大部分的αβ T细胞与细胞表面上由HLA复合体呈递的肽抗原相互作用。首先描述了这些识别肽-HLA(pHLA)的T细胞并且迄今最充分表征了这些细胞。也已经描述了比较少见形式的αβ T细胞。粘膜相关的不变T(MAIT)细胞看起来具有相对有限的α链和β链多样性，并且识别细菌代谢物而非蛋白质片段。不变天然杀伤T细胞(iNK T细胞)和种系编码的分枝酰(mycolyl)反应性T细胞(GEM T细胞)限于识别由非HLA分子交叉呈递的糖脂。大部分认为iNK T细胞与CD1d呈递的糖脂相互作用，而GEM T细胞与CD1b呈递的糖脂相互作用。其他形式的T细胞据认为与CD1a和CD1c背景中的糖脂相互作用，然而，这些细胞仍待详细表征。
常规αβ T细胞
大部分αβ T细胞的关键特征是识别HLA分子背景下的肽抗原。这些细胞经常称作‘常规’αβ T细胞。在个体内部，自我-HLA分子向T细胞呈递源于自我和外来蛋白的肽，从而为针对恶性肿瘤和外来病原体的适应性免疫、针对共生生物、食品原料和自我的适应性耐受，提供必要基础。编码HLA蛋白的HLA基因座是人类基因组中基因最密集和最具多态性的区域，并且人类中描述了存在超过12,000个的等位基因。HLA基因座中的高度多态性确保了个体之间的肽抗原呈递多样性，这对群体水平的免疫力是重要的。
HLA I类和II类
存在两种形式的经典HLA复合体：HLA I类(HLAI)和HLA II类(HLAII)。存在三个经典的HLAI基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C。这些基因编码跨膜α链，其与不变的β2-微球蛋白(β2M)链缔合。HLAIα链由具有免疫球蛋白折叠的三个结构域：α1、α2和α3组成。α3结构域在近膜端并且基本上不变，而α1结构域和α2结构域共同形成远膜端的多态性抗原结合槽。存在六个经典的HLAII基因：HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1。这些基因编码包含α链和β-链的配对的DP、DQ和DR异二聚HLA复合体。每条链具有两个具有免疫球蛋白折叠的主要结构域，其中α2结构域和β2结构域包含类似于HLAIα3结构域的近膜端且基本上不变的模块。HLAIIα2和β2结构域共同形成远膜端的抗原结合槽并且是高多态性区域。
HLAI和HLAII的抗原结合槽包含在八个反平行-片层的平台上的两个反平行α-螺旋。在这个槽中，肽抗原结合并以延伸的构象呈递。在HLAI和HLAII中接触肽的残基是最具序列多态性的位置，构成了不同HLA等位基因呈递的肽库多样性的分子基础。肽与抗原结合槽广泛接触，并且因此，每个HLA等位基因对呈递的肽施与不同的序列约束和偏好性。因此，给定的肽将仅结合有限数目的HLA，并且对应地，每个等位基因仅容纳来自给定蛋白质的肽集合的一个特定部分。每位个体中存在的HLAI和HLAII等位基因集合称作HLA单倍型。HLAI基因和HLAII基因的多态性和遗传的等位基因的共显性表达在人类群体中驱动了极庞大的HLA单倍型多样性，这与αβ TCR的众多序列多样性组合，为这些HLA-抗原-TCR相互作用的分析标准化设置了高度障碍。
HLAI和HLAII的αβ TCR接合作用(engagement)
TCR识别作为混合的pHLA结合界面的一部分是肽，所述结合界面通过由HLA和肽抗原(改变的自我)的残基形成。HLAI复合体呈递在几乎全部有核细胞的表面上并且通常被认为呈递衍生自内源蛋白的肽。T细胞因此可以通过采样相互作用性细胞的pHLAI复合体，探查HLAI呈递细胞的内源性细胞蛋白质组。HLAI接合需要由相互作用性T细胞表达TCR共同受体CD8，因此HLAI采样限于CD8+ αβ T细胞。相反，HLAII复合体的表面呈递主要地限于专职APC，并且通常视为呈递从外源于呈递细胞的蛋白质衍生的肽。相互作用性T细胞可以因此探查呈递细胞所在的胞外微环境的蛋白质组。HLAII接合需要由相互作用性T细胞表达TCR共同受体CD4，因此HLAII采样限于CD4+αβ T细胞。
αβ TCR的胸腺选择
如上文所述的αβ TCR的作用是检测pHLA复合体，由此呈递TCR的T细胞可以产生与该T细胞在建立免疫中的作用密切相关的应答。应当考虑到，在个体内部生成的αβ TCR组库必须解决在抗原实际出现之前、在特定单倍型背景下可能遭遇到的全部外来抗原的浩瀚和不可预见的多样性。这种结果可以在如下背景下实现，其中按照准随机化的方式生成极端多样和众多的αβ TCR，其潜在地识别未明确的pHLA复合体，而仅被特别地指导以避免与自我pHLA的强烈相互作用。在称作胸腺选择的过程中，这在T细胞成熟期间被仔细地协调。
在胸腺中T细胞成熟的第一步，携带不能够与自我-pHLA复合体以足够亲和力相互作用的αβ TCR的T细胞，将被剥夺存活信号并被消除。这个称作正向选择的步骤可以确保存活的T细胞携带这样的TCR组库，所述的TCR组库(repertoire)至少潜在地能够识别在正确HLA背景下呈递的外来肽或变异肽。随后，通过负向选择过程，主动移除与自我-pHLA强烈相互作用并且因此具有驱动自身免疫性的可能性的αβ TCR。正向选择和负向选择的这种组合，导致只有携带对自我-pHLA具有低亲和力的αβ TCR的T细胞在外周增殖。由此建立自我限制的但非自我反应的αβ T细胞库。T细胞生成过程针对HLA单倍型的这种高度个体化性质，加大了对αβ TCR-抗原-HLA相互作用进行标准化分析的挑战性。另外，这也形成移植排异和移植物抗宿主病和如下一般原则的基础，所述的一般原则是：在一位个体中鉴定到的αβ TCR可能在第二位个体中具有完全不同作用，这对于临床实践中出现的基于TCR和基于T细胞的治疗和诊断策略具有明确意义。
非常规αβ T细胞
非HLA限制或‘非常规’形式的αβ T细胞具有非常不同的分子抗原靶。这些非常规的αβ T细胞不接合经典HLA复合体，反而接合保守的HLA样蛋白质如CD1家族或MR1。CD1家族包括参与抗原交叉呈递的四种形式(CD1a、b、c和d)。这些细胞表面复合体具有与HLAI相似的α链，其与β2-M形成异二聚体。在该α链的远膜端表面呈献的疏水性小口袋形成病原体衍生的基于脂质的抗原的结合位点。先天样NKT细胞(iNK T细胞)是最充分理解的识别脂质/CD1家族的一个例子，而GEM T细胞是另一明显例子。已知‘I型’iNK T细胞与在CD1d背景下的脂质α-GalCer强烈相互作用。这些iNK T细胞展示非常有限的TCR多样性，具有固定的TCRα链(Vα10/Jα18)和数目有限的β-链(受限的vβ利用)，已经被类比于先天病原体相关的分子模式(PAMPS)识别受体如toll样受体和Nod样受体。相反，‘II型’NK T细胞展示更多样的TCR组库，并且看起来具有更多样的CD1d-脂质复合体接合模式。GEM T细胞识别CD1b呈递的分枝杆菌(Mycobacteria)来源糖脂，然而，对通过CD1a、b和c的抗原呈递的分子细节以及它们的T细胞识别的理解，才刚开始。
MAIT细胞主要表达能够与一系列TCR β-链配对的不变TCR α链(TRAV1-2，连接于TRAJ33、TRAJ20或TRAJ12)。替代肽或脂质，MAITTCR可以结合HLAI样分子(MR1)呈递的、基于叶酸和基于核黄素的病原体衍生代谢物。在MAIT TCR上观察到的有限但明显的TCR多样性，看起来能够在保守的MR1背景下实现多样但相关代谢物的识别。
并不充分理解，非经典HLA限制肽αβ T细胞TCR在胸腺中在成熟期间如何被选择的。但是，看上去上文所略述的负向选择和正向选择的基本过程可能仍适用，并且一些证据表明，这在胸腺中在特化的微生境中发生。
γδ T细胞
与αβ TCR生成和pHLA接合的详细机理性理解相反，对抗原靶及其γδ T细胞对应物的情况，所知道的相对少。这部分地归因于它们在循环T细胞区室中相对低的丰度。但是，广泛地认为，γδ T细胞不是严格HLA限制性的，并且未不同于抗体，似乎更自由地识别表面抗原。另外，最近已经获悉，γδ T细胞可以在上皮组织的常驻性T细胞区室(免疫系统与外来抗原相互作用的主要部位)中占主导。此外，文献中开始出现γδ T细胞如何免疫监测肿瘤和监测其他自我失调形式的各种机制。先天样和适应性γδ T细胞两者的特定抗原靶仍界定模糊，但是PAMP的组织分布和快速识别提示，两种γδ T细胞在外来抗原的早期应答以及适应性免疫系统仍在成熟的生命早期具有重大作用。
γδ T细胞的多样功能似乎基于不同的VγVδ基因区段的利用，并且可以按照两个主要类别宽泛地理解，其中主要具有不变TCR的γδ T细胞介导感染期间极早期的PAMP先天样识别。除了PAMP之外，还认为这些类型的γδ T细胞识别自我分子，包括磷酰抗原，这些分子可能提供细胞应激、感染和潜在地肿瘤形成的极早期标签。对PAMP和这类所谓危险相关分子模式(DAMPS)以及大量组织限制性先天样γδ T细胞的认识，T细胞强烈地表明，这些细胞适合快速应答抗原攻击，而无需先前活化、归巢和克隆性扩增。
第二形式的γδ T细胞被认为在本质上是更为适应性的，具有高度多样的γδ TCR组库并能够外周循环和直接接近淋巴组织。已经描述了针对人常见病原体如CMV的这类抗原特异性γδ T细胞，并且它们似乎形成记忆应答。但是，也已经观察到，γδ T细胞在活化后仅显示相对有限的克隆性增殖，并且关于γδ T细胞在外周循环中或在组织中的TCR多样性和特异性应答的程度，可用数据甚少。另外，尽管通常认为γδ TCR不与pHLA复合体相互作用并且因此不与这种背景下的肽抗原接合，但仅已经表征γδ T细胞的少数抗原靶，并且潜藏的分子构架仅知之甚少。
人体中外周γδ T细胞的低频率和研究组织常驻性T细胞的困难性，已经限制我们对这种重要和多样的T细胞类型如何参与适应性免疫应答的了解。这个新兴的研究领域需要更可靠的技术来捕获和表征罕见γδ T细胞、分离其TCR对、以及鉴定其同族抗原。
抗原和抗原呈递细胞
在T细胞和TCR的情况下，抗原可以定义为可以由TCR接合并且在T细胞中导致信号转导的任何分子。最充分表征的T细胞抗原是在HLAI和HLAII复合体中呈递并且由常规αβ T细胞接合的肽。但是，近几年，已经显而易见，非常规的αβ T细胞和γδ T细胞能够接合广泛类型的作为抗原的生物分子，包括脂质、脂肽、糖肽、糖脂和一系列代谢物和分解代谢物。此外，已经提出，γδ T细胞或许能够以抗体样方式直接接合充分折叠的蛋白质。因此，T细胞抗原基本上限制于HLA呈递肽的观点已经在过去二十年期间扩展为包括几乎任何生物分子。由此概念，定义什么可以被视为抗原呈递细胞(APC)是有意义的。
如上文章节中所指出，HLAI和HLAII具有跨细胞类型的不同表达谱。广泛认可的是，几乎全部有核细胞均在细胞表面上呈递HLAI复合体，并且因此有能力呈递肽抗原供T细胞采样。相反，HLAII具有限的表达谱，并且至少在稳态条件中仅表达在具有抗原呈递专职作用的细胞的表面上，所述细胞包括树状细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞。这些专职细胞类型经常称作专职APC。出于本文的目的，术语APC用来描述能够呈递抗原供αβ或γδ T细胞采样的任何有核细胞。这类抗原不限于在特异性抗原呈递复合体如HLA和HLA样分子中作为‘载货’呈递的那些，还可以包括在细胞表面呈递的、能够接合携带αβ或TCR的细胞的任何结构部分。
TCR的治疗性用途
原代T细胞过继转移(adoptive transfer)在二十世纪九十年代早期首次在临床环境下试验，始于离体扩增的T细胞，这些T细胞被极化以针对病毒性抗原，旨在赋予免疫受损患者对病毒的免疫力。之后很快，在恶性肿瘤治疗中，使用离体扩增的针对特定癌抗原的原代T细胞，试验了相似方案。在这些早期方案中出现的且持续成为如今难题的一个限制是，对于T细胞的本质和多样性缺乏理解，这与精细优化治疗产品的组成的需求发生冲突。目前，离体扩增的原代T细胞的使用已经基本上为制药业摒弃，除了屈指可数的使用具有病毒抗原特异性的原代T细胞的举措。
近年来，将遗传物质可靠引入人原代细胞的能力已经见证了多种实验性基因修饰的T细胞治疗药的出现。这类治疗用细胞产品旨在利用T细胞应答的能力并使T细胞特异性针对疾病相关性抗原靶(例如，恶性细胞独特表达的抗原)重定向。这些产品主要取决于将嵌合抗原受体(CAR)转移入接受者T细胞，而非实际的TCR链对。CAR代表导引部分(最经常是靶向恶性细胞的表面表达蛋白质的单链抗体元件)，其中所述导引部分移植到信号受体元件(如CD3复合体的ζ链)上，以产生模拟CD3-TCR功能的合成嵌合受体。这些所谓的CAR T细胞(CAR-T)产品迄今在临床试验中达到综合成功，然而尽管如此，它们的潜力并不容易超出具有固有独特分子靶的肿瘤(如B细胞恶性肿瘤)的范围。备选地，将全长TCR链对的ORF转移入T细胞，正在越来越多地被关注。这类TCR工程化的T细胞治疗药目前受限于生产工艺的挑战性以及(类似于CAR-T产品)缺少已验证的抗原靶和导引构建体。迄今，一直致力于使用αβTCR识别HLAI呈递在恶性细胞上的肽抗原，而这种方法的一个基本问题是需要特异于恶性细胞的抗原。
由于TCR-pHLA相互作用具有相对低的亲和力，所以先天TCR被认为可能次优于TCR工程化的T细胞疗法。已经构思了几种方案以使TCR按照几乎与单链抗体亲和力成熟过程相同的方式在体外亲和力成熟。这些TCR亲和力成熟方案通常也利用单链样式，其中一条链的V区与另一条链的V区融合以产生单一多肽构建体。这类单一多肽随后可以用于改编自抗体工程化作业流程的噬菌体展示系统或酵母展示系统中，并且经过多轮次基于靶结合的选择。就产生功能性TCR链对而言，这种单链TCR方案中存在两个固有局限性。首先，选择过程基于的是靶结合亲和力。但是，文献已经充分记载，TCR亲和力并不总是与TCR信号传导输出的强度或能力相关。其次，一旦将单链构建体重构为全长受体后，基于亲和力对单链构建体的选择并不总是能够转换成等同的亲和力。
在治疗用背景中，对于亲和力成熟的TCR对，存在一个额外的限制。即，考虑到它们的序列已经改变，所产生的构建体依据定义已经不再接受胸腺选择，在胸腺选择中与自我抗原强烈反应的TCR将从组库中被去除。因此，这些修饰的TCR携带自反应性的内在风险，所述风险很难使用现有方法在体外排除。出于相同理由，用于治疗性应用时，任何选择的或工程化的TCR需要个体化。如果TCR是经人工工程化或跨个体应用的天然的TCR，则必须基于每个特定个体的HLA单倍型和呈递的肽组库来排除交叉反应，以避免潜在灾难性的自身免疫性。原因是：胸腺选择是在仅特异于给定个体的全部可用HLA分子的背景上进行的。不清楚这种交叉反应性的可能性。但是，我们的TCR组库将相同物种的其他个体的pHLA复合体识别为外来的能力，是适应性免疫的基本特性，并且是移植排异和移植物抗宿主病的基础。使用针对癌特异性黑素瘤相关抗原(MAGE)的成熟TCR链对，进行的最近临床试验，凸显了绕过胸腺选择的潜在问题。将携带成熟TCR的自体T细胞返输回两位癌症患者时，这些患者快速地出现致命的心脏病。后续研究确定，MAGE特异的成熟TCR与HLAI呈递的来自心脏蛋白质肌联蛋白的肽交叉反应。这强烈地表明，交叉反应性是治疗性使用TCR时的一种明显的可能性。
出于治疗目的利用TCR的一个不同途径是，按照几乎与抗体治疗用物质相同的方式使用它们作为亲和试剂。已经试验，单链TCR分子可以用于递送缀合的药物物质至特定的HLA抗原表达细胞群。总体上认为这种方案比CAR-T或TCR工程化的T细胞治疗药更安全，因为可以简单地停止该药物物质的施用。但是，难以预测的交叉反应性及脱靶效应可能性仍是这种设定下的潜在限制。
临床诊断中的TCR组库检测
在一个相关方面，日益浮现的兴趣是，出于临床诊断目的，检测特定TCR序列的丰度。尤其随着深度测序方法出现，可以全局地以及针对特定背景下的匹配αβ对，捕获某个体内部的完整TCR多样性。这潜在地构成了一种诊断特定状况和疾病状态的手段，其中仅检测扩增的T细胞克隆的丰度，作为患者中疾病相关性抗原的既定免疫应答的替代性读出结果。但是，这类全局方案目前受限于十分强烈的免疫反应和确立的临床时间点，并且遭遇以下基础性难题：鉴定依据测序鉴定的任何具体TCR的特异性抗原靶。
T细胞抗原的治疗性和诊断性用途
利用适应性免疫应答的该基本手段可以转换成一个核心技术难题，即，TCR-抗原相互作用的精致特异性需要详细知晓与每种病原体、癌细胞或自身免疫疾病特异性相关的抗原。另外，每种抗原可以由特定的抗原呈递复合体或其等位基因呈递，从而抗原开发不得不针对每个相关的HLA基因和等位基因来进行。对于与强烈适应性免疫应答相关并且通常显示保守性表位应答层级的几种传染性疾病如HIV、流感和CMV，已经在某些常见HLA的背景下作图定位最重要的表位。类似地，癌症、过敏和自身免疫性领域已经见证增长和系统性的相关T细胞抗原定位工作。但是，这些是有挑战性的过程，并且由于缺少有效、稳健、快速和可放大方案，也阻碍了系统性描述与不同临床背景相关的T细胞抗原的进行。
特别地，癌细胞代表一个有挑战性和重要的方面，这是因为呈递在恶性细胞表面上的大部分肽是自身抗原或与自身抗原十分相似。因此，胸腺选择将已经去除可能强烈识别这些肽的TCR，而与此同时，肿瘤会演进以逃避免疫识别。这意味着，针对已建立肿瘤，强力免疫应答是相对少见的，并且难以预测或发现靶标。但是，这些应答的确存在，并且重要地，通常与更好的结果相关。在大多数情况下，这类应答的靶，肿瘤相关抗原(TAA)，将具有区别于自我的特征，并且衍生自这样蛋白质，所述蛋白质在癌形成期间过量表达、或者在此形成阶段从细胞类型中缺失、或通过遗传突变或翻译后修饰(如磷酸化)被特异性改变。
这类表位的知识，如果可获得，则允许探查相关的T细胞应答，用于基础发现、诊断目的和例如检测疫苗效力。重要地，也可以为过敏和自身免疫中的T细胞耐受作用提供高度特异的靶，并且至关重要的是，可以指出用于特异性免疫疗法和对抗恶性细胞的有价值靶。恶性肿瘤是特别有价值的靶点，除了癌类型的特异标记物碰巧可获得的少数情况，细胞免疫疗法的前景和T细胞操作的进展因缺少已验证的靶TAA而被延缓。
鉴于细胞疗法的潜力和缺少已验证的靶，鉴定有前景的TCR抗原仍是基于TCR的免疫治疗的最急迫瓶颈之一，在治疗癌症的工作中尤其如此。
获得全长TCR ORF
主要归因于天然存在的TCR中V基因区段利用情况的多样性，难以从T细胞汇集物采集配对TCR链的序列数据。通常，为了以高可靠性可靠采集序列，有必要使用覆盖目标汇集物的完整V区多样性的引物汇集物，使用逆转录和/或PCR方法扩增TCR。这种过程产生从其可以获得序列数据的ORF片段，然而，产生不适用于轻易克隆全长TCR ORF的起始材料。因此，从T细胞汇集物挖掘配对序列数据的高效率策略通常与克隆全长TCR ORF供下游应用不相容。因此对于已测序TCR对的任何功能性测试或应用，需要费时且昂贵的TCR ORF合成。
全长TCR ORF的多样化
TCR的新兴治疗性用途已经见识以下兴趣的提升：在亲和力和/或功能成熟作业流程内部使TCR序列多样化，以衍生特异性和功能确定的合成性TCR对。通常，已经通过将TCR链对连接成用于噬菌体展示方法的单链构建体及向这些单链构建体引入序列多样性实现这点。目前缺少可以按系统方式快速多样化单一TCR ORF和其中这些全长TCR ORF适用于活哺乳动物细胞上表面表达的背景下立即接受测试和/或选择的技术。对于治疗性使用而言，这种技术将在TCR对成熟方面具有极大价值，特异性和信号传导能力高度确定。
TCR和T细胞抗原分析的技术方面
总体上，基于TCR的疗法的开发仍处于早期，并且成功有限。诊断方案，尽管潜力巨大，但一直很少用于旨在评估患者疾病状态或治疗响应的对照临床研究中。用于可靠捕获先天TCR链对和按照高通量且在细胞-细胞通讯的功能背景下系统分析TCR-抗原相互作用的技术仍开发不足，这已经成为基于TCR的疗法和诊断学发展的主要障碍。
深度测序方案已经导致对健康和疾病情况下T细胞受体多样性的理解改进。但是，这些方案总体上聚焦于跨越CDR3区域(主要地TCR β-链)的短段。大部分研究忽略了TCR α链的贡献，并且很少研究力图分析配对的αβ链以及确定为有意义的TCR的抗原特异性。使用单细胞包囊化和遗传条形码的最近作业流程，已经能够使先天TCR αβ链对或链对配对及分析全长序列，然而，这类作业流程仍是实验性的。
可以按生物物理模式或功能模式，从抗原特异性方面分析分离的TCR链对。生物物理分析需要重组产生TCR以及分析物抗原的可溶性形式。在HLA限制型TCR的情况下，这将因此需要产生全部独立TCR以及同族的pHLA复合体。这在技术上有高度挑战性、缓慢且通量十分低。另外，这种分析将仅提供相互作用亲和力，后者并不以可预测方式与功能特征充分相关。
直至最近，细胞背景下已分离TCR序列的详细功能性分析尚限于以下繁琐方案：将分析物TCR链对转染入原代T细胞或永生T细胞系，通过传统的细胞活化流式细胞分析来检测细胞应答、或检测已转染细胞在抗原攻击时产生的分泌因子。在Guo等人的最新发表物中，报道了来自单细胞的配对TCR链的快速克隆、表达和功能性表征(MolecularTherapy–Methods and clinical development(2016)3:15054)。在这项研究中，人αβ TCR对分析物在报道细胞系中表达，所述报道细胞系缺少TCR表达并含有Nur77启动子连接的绿色荧光蛋白(GFP)报道分子系统，该报道系统可以在TCR刺激时被激活。这个系统仍是低效的，原因在于缺少向报道细胞系基因组中的标准化TCR整合，并且未提供通过APC元件用于细胞结合型抗原攻击的系统方式。
类似于鉴定针对已知T细胞抗原的TCR的作业流程，在健康和疾病情况下从头发现新T细胞抗原仍高度有挑战性。大部分方案在本质上仍是生物物理的，并且旨在产生候选抗原，以便可以在免疫接种方案中测试、或通过鉴定如上所述的同族TCR而测试。在T细胞抗原开发领域，很少存在或不存在标准化，并且该领域主要限于学术研究。
尽管对TCR及其同族抗原在治疗性和诊断使用中的兴趣日益积累并且出现了捕获明显数目的先天TCR αβ和γδ链对的手段，但是仍缺少系统分析TCR-抗原相互作用的可靠高通量和标准化技术。重要地，缺少这样的标准化系统，它们用于全长TCR ORF的快速重构和/或系统性多样化，从而这些ORF可以直接适用于先天背景下活细胞表面上呈递的分析物TCR的先天背景时TCR链对的功能性分析。对治疗性和诊断性使用而言，这种能力对实现高通量分析先天TCR链对重要，对TCR链对的亲和力和/或功能成熟也重要。
在将会实现基于信息学和试剂使用TCR诊断学并且还将会实现基于TCR的个性化免疫疗法的高通量方法中，明确需要用于TCR链重构及其系统性多样化的快速和系统性方法。
发明详述
本发明解决了上文提到的需求。在第一方面，本发明提供一种两组分载体系统，其包含由携带TCR链的可变(V)序列、连接(J)序列和恒定(C)序列的载体组成的预装配文库。这种系统的第一组分包含了含有V和C序列的V-C入门载体。第二组分系统包含了含有J序列的J供体载体。两组分载体系统可以预装配成分别具有全部想要的V-C序列组合和J序列的V-C入门载体和J供体载体的文库。该两组分载体系统以如此方式设计，从而具有所需序列的单一V-C入门载体和单一J供体载体可以与编码CDR3的短DNA寡核苷酸双链体(odeCDR3)序列组合，以在单管反应中以限制性酶和连接酶依赖性和PCR非依赖性方式在体外重构全长TCR ORF。此外，模块化两组分系统理想地适合快速生成合成性或突变性全长TCR ORF的庞大文库，用于亲和力或功能成熟作业流程。在第二方面，将相应TCR链对(即TRA/TRB或TRD/TRG)的修饰的V-C入门载体编纂入一个5组分载体系统，以提供其中重构的TCR链对可以在单一载体内部毗连的系统。这种第二系统利用修饰的V-C入门载体、与第一系统相同的J供体载体并且还利用双向终止子供体载体(BiT供体)，从而在最终构建体中实现按反平行有义方向编码的毗连的TCR链对，其中每条TCR链间插一个‘双向终止子’元件。
TCR ORF重构和工程化系统(TORES)
本发明首先提供具有适于上文所提到用途的独特特征的两组分载体系统。这种TCR ORF重构和工程化系统(TORES)结合第三组分即编码CDR3的寡核苷酸双链体(odeCDR3)一起使用，旨在确定的载体背景内从头装配全长TCR ORF和/或在给定的TCR ORF内部产生程式化序列多样性。
本发明概括于图1A中。含有目标全长TCR ORF所需要的V和CTCR基因区段的选定V-C入门载体与含有所需J TCR基因区段的J供体载体组合。通过加入编码CDR3的寡核苷酸双链体(odeCDR3)完成全长TCR ORF，这解释了在V(D)J重组期间生成并由V-C入门载体和J供体载体分别编码的编码固定种系的V和J序列间插的未固定非种系序列。该两组分载体系统和第三odeCDR3组分如此设计，从而当合并在限制性酶和连接酶循环反应中时，可以重构完整V-CDR3-J-C TCR ORF。通过用来按照标准化方式执行遗传元件‘无痕’装配的IIS型限制性酶，实现这点。两组分载体系统装配成文库，所述文库含有用于重构目标全长TCRORF的全部所需V、C和J基因区段(图1B)。例如，可以构建文库以含有编码如实施例1和2中所述的人TRA组库和如实施例3中所述的人TRB组库的天然蛋白序列的全部基因区段。
为了从足以确定V、J和C基因区段利用情况的序列信息连同间插在固定的V和J区段之间的未固定CDR3序列中重构全长TCR ORF，首先选择与目标TCR ORF的V/C和J利用情况对应的V-C入门载体和J供体载体。还生成与完成全长TCR ORF所需的未固定CDR3序列对应的odeCDR3。这三种组分与IIS型限制性酶和DNA连接酶在循环反应中组合以产生目标全长TCR ORF，如图4和实施例7中所述。所得到的重构全长TCR含于V-C入门载体骨架内部，因此含有在这个亲本构建体内部所含的全部载体特征。
在限制性酶/连接酶循环反应中IIS型限制性酶对三种合并的组分(图4a、b、c)的作用，产生两种反应副产物和两种反应中间体。V-C入门载体衍生的反应副产物是切下的先天选择标记和IIS型结合位点(图4d)。已经从中切除J区段部分的J供体载体骨架代表第二反应副产物(图4e)。从J供体载体切下的J区段部分是反应中间体，并且含有J区段部分、来自C区段的一个小C部分、和连接所要求的单链突出端(图4f)。第二反应中间体是含有V和C区段和连接所要求的单链突出端的亲本V-C入门骨架(图4g)。反应的终产物是在亲本V-C入门载体骨架内部重构的全长TCR ORF，由odeCDR3(图4c)、切下的J区段部分(图4f)和携带V和C基因区段的V-C入门骨架(图4g)连接而成。
V-C入门载体和J供体载体组分
在本发明语境下，组合的两组分系统含一个或多个V-C入门载体，所述入门载体含有
a.复制起点
b.第一正向选择标记，
c.一个5'遗传元件或多个5'遗传元件，
d.Kozak序列
e.TCR可变基因区段，
f.第一IIS型序列，用于被IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，
g.负向选择标记，
h.第二IIS型序列，
i.TCR恒定基因区段，和
j.一个3'遗传元件或多个3'遗传元件
其中，a)和b)用于细菌宿主中增殖和选择亲本V-C入门载体和含有重构的TCR的载体；c)和j)用来定义重构的全长TCR ORF的下游应用；d)确保真核细胞中的高效翻译起始，所述高效翻译起始可能备选地代表原核生物和古细菌中用于翻译调节的Shine-Dalgarno序列；e)代表从起始密码子至CDR3区5'边缘处基序的可变(V)基因区段，所述基序在给定的两组分载体系统中跨所有V区段保守；f)代表IIS型识别序列，其指导IIS型限制性酶以5'方向切割，从而在V基因区段3'末端产生标准化单链突出端；g)代表在系统运行期间消除亲本V-C入门载体以便重构全长TCR ORF的负向选择标记；h)代表IIS型识别序列，其指导IIS型限制性酶以3'方向切割，从而在C基因区段5'末端产生标准化单链突出端；i)代表自C基因区段5'末端处基序开始的恒定(C)基因区段，所述基序在给定的两组分载体系统中跨所有C区段均保守并且定义与J区段的边界(参见图2和图4)。
对用于无需下游生物学应用情况下遗传重构全长TCR ORF(例如，待用作分子生物学作业流程的模板)的V-C入门载体，最小V-C入门载体将包含元件a)、b)、e)、f)、h)和i)，缺少调节元件。
V-C入门载体还可以含有一个或多个转录单位以表达适于下游应用的附加ORF，例如，哺乳动物抗生素耐药基因或报道构建体。
组合的两组分系统包含一个或多个J-供体载体，所述供体载体含有
a.复制起点
b.第二正向选择标记，
c.第三IIS型序列，
d.TCR连接基因区段，
e.C部分，对应于恒定基因区段的5'小部分，和
f.第四IIS型序列。
其中，a)和b)用于增殖和选择J供体载体；c)代表指导IIS型限制性酶以3'方向切割，从而在J基因区段的5'末端产生标准化单链突出端的IIS型识别序列；d)代表连接(J)基因区段，所述连接基因区段从界定CDR3区3'边缘的基序5'开始至并入C部分的3'序列，其中所述基序在给定的两组分载体系统跨全部J区段均保守，所述3'序列代表由包含于两组分系统内部的V-C入门载体编码的C区段的5'部分；f)代表IIS型识别序列，其指导IIS型限制性酶以5'方向切割，从而产生在J基因区段的3'末端的标准化单链突出端，并包含于该序列的C部分内部(参见图3和图4)。
J-供体载体不严格需要携带C部分序列，后者编码C基因区段的5'小部分。此C部分可以用来优化及标准化用于TORES运行期间的重构反应的突出端。原因是在J基因区段的3'末端发现有较高序列变异，由此C部分的纳入允许通过在多样性更小的C基因区段中产生突出端而标准化。针对无3'J区段多样性的其他生物的TCR基因座或使用合成J基因区段来构建TORES的情况下，可以省略此C部分，有利于在所述J区段中的突出端的标准化。这将降低J供体文库构建的复杂度。
第一、第二、第三和第四IIS型序列的每一者可以相同或不同。优选地，它们是相同的。这确保两组分载体系统内部的每个限制性位点相容于同一种IIS型酶，并且在使用该系统重构全长TCR ORF期间仅需要单一酶用于限制性酶/连接酶循环反应。IIS型酶不在它们的识别序列内部切割，并且因此在识别序列外生成单链突出端。因此，依赖IIS型限制性酶作用生成的突出端的性质取决于识别序列的方向以及事实上相邻序列两者(参见实施例1至4)。
备选地，每个IIS型限制性序列可以彼此不同。但是，随着添加每个独特识别序列，必须在限制性酶/连接酶循环反应中并入额外的IIS型酶。这将增加装配全长TCR ORF的重构反应的复杂度和成本。
分别在V-C入门载体和J供体载体内部的第一和第二正向选择标记正常情况下不同。这将确保V-C入门载体可以独立于J供体载体被选择(所述V-C入门载体提供最终全长TCR ORF产物之骨架)，并且由此可以消除否则将造成重构反应背景的、携带未消化或再环化J供体载体的转化体(参见图2和图3和实施例7)。
正向选择标记可以选自
a.抗生素耐药基因，
b.营养缺陷型互补基因，
c.报道基因
其中本领域技术人员熟知这类正向选择标记的选择、格式和应用。
并入V-C入门载体的5'遗传元件可以包含一个或多个选自以下的元件
a.基因顺式/作用元件，
b.用于重组酶的异特异性识别位点(heterospecific recognition site)，
c.针对目的基因组位点的5'同源重组臂
d.mRNA剪接受体位点，
e.内部核糖体进入位点，和
f.外遗传的绝缘子序列
其中，a)驱动由V-C入门载体骨架内部重构的全长TCR ORF产物编码的转录物表达；b)代表这样的序列，所述序列在重组酶存在下指导位点定向重组，以将V-C入门载体骨架内部重构的全长TCR ORF产物插入特定遗传背景中；c)代表这样的序列，所述序列指导位点定向同源重组，以将V-C入门载体骨架内部重构的全长TCR ORF产物插入特定遗传背景中；d)允许工程化结构域融合方案，以操纵从V-C入门载体骨架中重构的全长TCR ORF表达的蛋白质的形式；e)允许从V-C入门载体骨架中重构的全长TCR ORF表达的mRNA的非帽依赖性翻译起始；f)允许隔绝转录活性，否则该转录活性将受到在V-C入门载体骨架中重构的全长TCR ORF可能插入的基因组背景中的增强子元件的影响。
顺式/作用元件可以用来驱动TCR瞬时表达，其中所述TCR被重构入实施例1和3中提供的V-C入门载体骨架，此时将含有重构的TCRORF的所述载体转染入哺乳动物细胞。
重组酶的异特异性识别位点可以用来允许TCR发生重组酶介导的盒交换，其中所述TCR被重构入实施例4中提供的V-C入门载体骨架，此时将含有重构的TCR ORF的所述载体在适宜的重组酶存在下转染入哺乳动物细胞。
在V-C入门载体中包含的第一IIS型识别序列定向成在所述识别序列的5'及TCR可变基因区段中造成切割(图4a)，以在可变基因区段3'末端产生单链DNA突出端(图4g)，所述的突出端与合成的odeCDR3的5'末端处的单链DNA突出端互补(图4c)。关于如何设计这种第一IIS型识别序列的详情，参见实施例1、3、5和6。
V-C入门载体在第一IIS型识别序列和第二IIS型识别序列之间含有负向选择标记(参见下文，图2)。这个负向选择标记可以选自
a.不含于第一组分中或TCR连接基因区段内部其他地方的限制性酶识别位点，
b.细菌自杀基因，和
c.报道元件。
其中，当使用第一正向选择标记选择在V-C入门载体骨架内部含有目标TCR ORF的转化体时，负向选择标记可以用来消除亲本V-C入门载体转化的宿主细胞，并且因此减少重构反应的背景(参见实施例7)。
除负向选择标记本身例外，双组分系统中的全部其他序列必须不含所述序列，从而不会出现因在该系统的其它位置包括该序列而造成的过度负向选择。
在本发明语境下，V-C入门载体中包含的第二IIS型识别序列定向成在所述识别序列的3'及TCR恒定基因区段中造成切割(图4a)，以在恒定基因区段5'末端产生这样的单链DNA突出端(图4g)，所述突出端与J供体片段反应中间体的3'末端处的单链DNA突出端互补(图4f)。关于如何设计这种第二IIS型识别序列的详情，参见实施例1、2、3和5。
并入V-C入门载体的3'遗传元件可以包含一个或多个选自以下的元件
a.终止子元件，
b.用于重组酶的异特异性识别位点，
c.针对目的基因组位点的3'同源重组臂
d.mRNA剪接供体位点，
e.内部核糖体进入位点，和
f.外遗传的绝缘子序列。
其中a)代表这样的序列，其原位指导TCR ORF的转录终止以有效产生mRNA，并且可以编码聚腺苷酸信号；b)代表这样的序列，其指导位点定向同源重组，以将V-C入门载体骨架内部重构的全长TCR ORF产物插入特定遗传背景；c)允许TCR ORF在整合入编码下游mRNA剪接受体位点的基因组座位后与转录单位融合，以操纵TCR表达水平的强度或从V-C入门载体骨架中重构的全长TCR ORF表达的蛋白质的形式；e)允许从V-C入门载体骨架中重构的全长TCR ORF表达的mRNA的帽非依赖性翻译起始，f)防止毗邻的染色质区域之间的不适宜相互作用，由此在V-C入门载体骨架中重构的TCR ORF可能插入的基因组背景中使全长TCRORF隔绝于相邻的转录调节作用或异染色质扩散。
终止子元件用来确保TCR表达期间的转录终止，其中所述TCR被重构入实施例1和3中提供的V-C入门载体骨架，此时将含有重构的TCR ORF的所述载体转染入哺乳动物细胞。
重组酶的异特异性识别位点用来允许TCR发生重组酶介导的盒交换，其中所述TCR被重构入实施例4中提供的V-C入门载体骨架，此时将含有重构的TCR ORF的所述载体在适宜的重组酶存在下转染入哺乳动物细胞。
J供体载体含有带C部分序列的J基因区段，所述C部分序列代表相对于J基因区段的3'而言C基因区段的5'片段(图3)。
C-部分序列设计成单链突出端标准化，所述标准化是通过IIS型酶作用在J供体载体衍生的J片段反应中间体的3'末端生成的单链突出端(图4f)以及在IIS型消化的开放V-C入门载体反应中间体内部的C基因区段的5'末端生成的单链突出端(图4g)。
在J供体载体中包含的第三IIS型识别序列定向成在所述识别序列的3'及TCR连接基因区段中造成切割(图4b)，以在连接基因区段5'末端产生这样的单链DNA突出端(图4f)，所述突出端与合成的odeCDR3的5'末端单链DNA突出端(图4c)互补。关于如何设计这种第三IIS型识别序列的详情，参见实施例2、3、5和6。
J供体载体中包含的第四IIS型识别序列定向成在所述识别序列的5'及TCR C部分内部造成切割(图4b)，以在C部分的3'末端产生这样的单链DNA突出端(图4f)，所述突出端与IIS型消化的开放V-C入门载体反应中间体的5'单链DNA突出端(图4g)互补。关于如何设计这种第三IIS型识别序列的详情，参见实施例1、2、3、5和6。
两部分载体系统、全部编码的TCR基因区段和部分不应当含有用于操作或装配V-C入门载体或J供体载体的IIS型识别序列。纳入这类序列将在编码的基因区段或部分内部导致IIS型限制性酶作用，并且导致破坏TCR重构过程。类似地，载体骨架中或这些载体内部的任何5'和3'遗传元件中不应当包含IIS型识别序列，对于用来装配两部分载体系统的克隆性片段、代表第三系统组分的odeCDR3也是如此(参见下文)。
可以针对任何TCR链集合构建TORES的两组分载体系统。在下文实施例1至4中，针对分别编码人TCR α链和β链的人TRA基因座和TRB基因座构建两组分载体系统。这种TORES的构建同等地适用于分别编码TCR δ和γ链对的TRD和TRG基因座，或实际上适用于有颚脊椎动物中存在的任何TRA/TRB、TRD/TRG或变体TCR链对系统。
第三odeCDR3组分
为了使用任何给定的TORES重构全长TCR ORF，需要不由双组分V-C入门载体和J供体载体系统编码的小ORF片段作为第三组分。这种第三组分采取编码CDR3的寡核苷酸双链体形式(odeCDR3)。
这种第三组分odeCDR3包含
a.与第一IIS型限制性酶识别和切割位点互补的第一单链突出端序列，所述限制性酶定向以切割识别序列的5'并位于V-C入门载体的TCR可变基因区段内部，
b.双链区段，其编码TCR CDR3区并缺少负向选择元件，所述负向选择元件如项10中限定，并且还缺少第一或第二部分的任何IIS型限制性序列，和
c.与第三IIS型限制性酶识别和切割位点互补的第二单链突出端序列，所述第三IIS型限制性酶定向以切割所述识别序列的3'并位于J供体载体的TCR连接基因区段内部。
备选地，odeCDR3可以包含编码CDR3的dsDNA分子和/或质粒DNA，旁侧分布有与第一组分(V-C入门载体)或第二组分(J供体载体)相符的两个IIS型酶位点，所述IIS型酶位点如此定向，从而当消化时，产生包含前述a、b和c的产物及编码旁侧分布有IIS型位点的短dsDNA片段的两种副产物。这种备选性dsDNA odeCDR3相容于限制性酶/连接酶反应，不必然需要事先消化或处理。
作为TORES中使用V-C入门载体和J供体载体布局的备选，也可以通过采用相同的构思框架，使用J-C入门载体和V供体载体布局。
使用TORES重构全长TCR ORF的方法
TORES可以用来在遗传载体背景下从序列信息重构全长TCR ORF，如实施例7中针对人TRA/TRB链对所展示。
为了运行TORES以从序列信息重构全长TCR ORF，根据用于给定TCR链的两组分载体系统的来源，该方法可以包括
a.选择V-C入门载体，
b.选择J供体载体，
c.选择odeCDR3，
d.将a、b和c组合，以i)与(一种或多种)IIS型限制性酶反应，从而切割存在于V-C入门载体中和J供体载体中的全部IIS型限制性酶识别和切割位点，ii)与DNA连接酶反应并且iii)使合并的混合物经历热循环反应，
e.将获得自步骤d的反应产物转化入有能力进行DNA载体增殖的可选择宿主生物，以及
f.对宿主生物进行选择以获得在V-C入门载体骨架中重构的全长TCR可读框。
其中，基于选择的载体选择a)和b)，其中所述选择的载体编码目标全长TCR ORF中的V、J和C基因区段；基于完成全长TCR ORF序列选择c)，其不由a)和b)中选择的V-C入门载体或J供体载体编码，但被所述载体中编码的可变区段和连接区段界定；d)将三个选定的组分，连同将切割V-C入门载体和J供体载体内部第一、第二、第三和第四IIS型限制性酶识别序列的限制性酶一起，合并入反应混合物；e)通常代表转化感受态细菌；f)基于V-C入门载体骨架提供的第一正向选择标记选择宿主。
通常，选择和确定用于重构的全长TCR ORF的遗传元件的工作流程，需要来自目标生物组织的TCR链的从头测序。下文实施例8展示HLA-B*07:02限制性背景下从头鉴定对HCMV抗原特异的TRA/TRB链对集合。图13中描述的一个工作流程包括，对来自分选的单细胞的TCR链对的逆转录和基于PCR的扩增，以及后续进行Sanger测序。要求跨TCR ORF的V、CDR3、J和C区段的高质量序列信息，这取决于所采取的具体测序方案。
一种选择和重构TCR可读框的方法，因此包括
a.获得TCR可读框序列，其中所述序列信息足以鉴定i)可变基因区段利用情况、ii)恒定基因区段利用情况、iii)连接基因区段利用情况、iv)跨可变基因区段边界至连接基因区段边界的完整CDR3序列，和
b.选择与步骤a.i)和a.ii)中分别鉴定的可变基因区段和恒定基因区段相对应的V-C入门载体，和
c.选择与步骤a.iii)中鉴定的连接基因区段相对应的J供体载体，和
d.产生与步骤a.iv)中鉴定的CDR3序列相对应的odeCDR3，
e.将b、c和d组合，以i)与IIS型限制性酶反应从而切割存在于V-C入门载体中和J供体载体中的全部IIS型限制性酶识别和切割位点，ii)与DNA连接酶反应，iii)使得合并的混合物经历热循环反应，并且
f.将获得自步骤e.的反应产物转化到有能力进行质粒复制的可选择宿主生物中，
g.对宿主生物进行选择以获得在V-C入门载体骨架中重构的全长TCR可读框。
其中，a)通过本领域技术人员熟知的能够获得足够序列长度和质量以鉴定全部四个所要求遗传元件的测序方法实施；b)和c)选自含有所要求载体的TORES文库；d)是从头合成的或选自odeCDR3文库；e)在单一反应容器中实施。
为了选择适宜的V-C入门载体、J供体载体和odeCDR3，将目标TCR序列针对V、C和J基因区段文库，就其相应的TCR链进行比对，以确定目标链的V、C区段和J区段利用情况。此序列比对和分析步骤必须也允许定义CDR3编码序列，并且因此定义odeCDR3序列。因此，这种序列分析总体上允许选择V-C入门载体和J供体载体供TCR链重构。该分析还允许合成odeCDR3用于每个链重构反应。这个过程在实施例8中充分描述并且作为图13的部分概括。
期望在单一循环反应中实施IIS型消化和DNA连接酶依赖的连接(步骤e)。这最大限度减少处理步骤，并且这可以通过如下方式实现：采用在其识别序列外部进行切割的IIS型限制性酶设计系统，从而可以用单一酶产生多个独特突出端，由此保证J供体载体反应中间体和odeCDR3高效定向克隆入V-C入门载体骨架。
备选地，IIS型限制消化和DNA连接可以按依次方法进行。
在实施例8中，在以下背景下例举TORES的应用：单细胞荧光激活细胞分选(FACS)来自人外周血的抗原特异性CD8 T细胞，供基于逆转录和PCR扩增TRA/TRB TCR链对，随后进行Sanger测序。这是一个广泛适用的工作流程，其中来自任何有颚脊椎动物的任何组织均可以是T细胞源，并且细胞可以基于任何表型特征分选。重要地，单个分选的单细胞不必使用HLA-多聚体试剂就抗原特异性进行染色。
使用的TCR测序方案不限于任何具体方法或技术，前提是获得足够的高品质序列信息，从而可以基于所述序列信息确定上文限定的TCRORF的遗传特征。
通过使用FACS划分单细胞从而可以测序并鉴定先天TCR链对，是一种强有力的方法，原因是可以用多特异性抗体组合采集到准确和丰富的表型信息。但是，存在划分细胞的其他方法，包括；乳液PCR；使用微流体细胞囊化的数字PCR方案、使用物理划分底物的数字PCR。
通常期望从源材料获得先天TCR对，因为TCR对的两条链均有助于HLA-抗原接合和识别。但是，存在其中可能想要回收仅单条链的情况，如针对设定的特异性的单链高通量筛选。在这种情况下，可以从未划分的细胞扩增TCR和/或对其测序。
使用TORES产生序列多样化的全长TCR ORF的方法
TORES系统理想地适合在几种系统模式下产生多样化的全长TCRORF。这种系统多样化可以适用于TCR链的亲和力成熟和/或功能成熟作业流程。实施例9和10中充分描述目标TCR链序列的这种多样化。
这类TCR ORF序列多样化方法遵循与重构反应相同的总体方案。可以在多个平行的重构反应中实施多样化，其中每个反应生成TCR ORF的单一变体。但是，在大部分场景下，想要在单一反应中产生变体TCRORF的汇集物。通过向重构反应提供遗传组分(V-C入门载体、J供体载体、odeCDR3)之一者或多者的多个变体，可以实现这些方案的每一者。
如实施例9中所述，可以通过添加具有限定的位置序列多样性的odeCDR3汇集物，在CDR3区系统性多样化TCR ORF。
一种选择和重构TCR可读框以在CDR3区实现TCR ORF多样性的方法因此包括
a.获得TCR可读框序列，其中所述序列信息足以鉴定i)可变基因区段利用情况、ii)恒定基因区段利用情况、iii)连接基因区段利用情况、iv)跨可变基因区段边界至连接基因区段边界的完整CDR3序列，和
b.选择与步骤a.i)和a.ii)中分别鉴定的可变基因区段和恒定基因区段相对应的V-C入门载体，和
c.选择与步骤a.iii)中鉴定的连接基因区段相对应的J供体载体，和
d.产生两种或更多种与步骤a.iv)中鉴定的CDR3序列相对应的具有变异序列组成的odeCDR3，
e.将b、c和d组合，以i)与IIS型限制性酶反应从而切割存在于V-C入门载体中和J供体载体中的全部IIS型限制性酶识别和切割位点，ii)与DNA连接酶反应，iii)使得合并的混合物经历热循环反应，并且
f.将获得自步骤e.的反应产物转化到有能力进行质粒复制的可选择宿主生物中，和
g.对宿主生物进行选择以获得在V-C入门载体骨架中重构的全长TCR可读框，
其中，a)通过本领域技术人员熟知的能够获得足够序列长度和质量以鉴定全部四个所要求遗传元件的测序方法实施；b)和c)选自含有所要求载体的TORES文库；d)是从头合成的或选自odeCDR3文库；e)在单一反应容器中实施。
这种方法可以通过将全部odeCDR3变体汇集到单一反应中以产生序列多样化的汇集物来实现但也可以通过向平行反应提供每个odeCDR3变体来同等实现。
可以借助本领域技术人员熟知的多种方法生成变体odeCDR3。odeCDR3简并性/多样性的位置和程度的选择，可以从单一位置的单一残基变化至odeCDR3长度的完全序列简并。
如实施例10中所述，可以通过以下方式使TCR ORF系统性多样化：通过提供odeCDR3维持CDR3区，但通过向重构反应提供两种或更多种V-C入门载体和/或J供体载体，使V、C和J区段利用情况多样化。
一种选择并重构V、C和/或J区段利用情况多样化的TCR可读框的方法，因此包括
a.获得TCR可读框序列，其中所述序列信息足以鉴定i)可变基因区段利用情况、ii)恒定基因区段利用情况、iii)连接基因区段利用情况、iv)跨可变基因区段边界至连接基因区段边界的完整CDR3序列，和
b.选择两种或更多种不与步骤a.i)和a.ii)中分别鉴定的可变基因区段和恒定基因区段相对应的V-C入门载体，
c.选择两种或更多种不与步骤a.iii)中鉴定的连接基因区段相对应的J供体载体，
d.产生与步骤a.iv)中鉴定的CDR3序列相对应的odeCDR3，
e.将b、c和d组合，以i)与IIS型限制性酶反应从而切割存在于V-C入门载体中和J供体载体中的全部IIS型限制性酶识别和切割位点，ii)与DNA连接酶反应，iii)使得合并的混合物经历热循环反应，并且
f.将获得自步骤e.的反应产物转化到有能力进行质粒复制的可选择宿主生物中，
g.对宿主生物进行选择以获得在V-C入门载体骨架中重构的全长TCR可读框。
其中，a)通过本领域技术人员熟知的能够获得足够序列长度和质量以鉴定全部四个所要求遗传元件的测序方法实施；b)和c)选自含有所要求载体的TORES文库；d)是从头合成的或选自odeCDR3文库；e)在单一反应容器中实施。
这种方法可以通过将全部V-C入门载体和/或J供体载体变体汇集到单一反应中以产生序列多样化的汇集物来实现，但也可以通过向平行反应提供每个载体变体来同等实现。
可以从给定文库选择每个V-C入门载体和J供体载体以提供对V、C和J基因区段的全面覆盖。
上述CDR3和V、C和J多样化的任何组合可以用来产生多样化TCRORF的汇集物或文库。
这种系统可以用来产生全面覆盖天然V、C和J基因区段利用情况和确定的CDR3特征的全合成TCR ORF文库。
就重构/多样化方法而言的TORES特征
如上文提到，期望用单一IIS型限制性酶实施装配循环反应。这可以节省限制性酶使用的成本，并且这可以通过IIS型作用的性质以及在两组分载体系统和odeCDR3中设计独特单链突出端来实现。
备选地，使用多达四个IIS型限制性酶识别序列跨越V-C入门载体和J供体载体的四个IIS型识别位点。
为了高效克隆TCR ORF产物，在使用TORES装配全长TCR ORF期间进行至少一个步骤负向选择，其选自
a.进行反应产物的限制性酶消化以消除亲本V-C入门载体
b.进行自杀基因选择以消除亲本V-C入门载体转化的感受态宿主，和/或
c.借助报道分子鉴定，对亲本V-C入门载体转化的宿主细胞进行选择。
其中，负向选择用来消除保持未被IIS型酶消化或消化后已经再连接成亲本形式的亲本V-C入门载体。
考虑到V-C入门载体骨架并且因此此骨架中携带的正向选择标记被用于正向选择含有全长TCR ORF反应产物的载体，消除亲本V-C入门载体至关重要。
在本发明语境下，使用已经设计在自V-C入门载体切除的反应副产物内部的限制性酶位点，进行负向选择(图4d)。实施例7和8中描述这种负向选择法。
任一个上文提到的负向选择方法或其组合可以用来从最终克隆产物消除亲本V-C入门载体。如果认为克隆效率高到足以高效回收克隆的反应产物，则可以省略这种负向选择过程。
需要在转化的宿主生物中选择含有克隆的全长TCR ORF的载体以获得最终克隆的产物。本领域技术人员熟知这类选择。
宿主生物代表转化感受态细菌，并且选择含有在V-C入门载体骨架中所含的全长TCR ORF的转化体可以包括抗生素选择。这需要向其中存在已转化细胞的培养系统添加抗生素，并且这种抗生素的耐药性由作为V-C入门载体骨架中第一正向选择标记的基因编码。
备选地，自存在转化体的培养系统中移除营养缺陷因子，也可以是一种形式的正向选择，其中营养缺陷型互补作用由V-C入门载体骨架中编码的基因产物赋予。可以使用上述正向选择的组合。
包含TORES的V-C入门载体和J供体载体文库
为了高效运行TORES以进行选定TCR ORF的重构或多样化，需要预构建V-C入门载体和J供体载体文库。从对每种TCR链形式特异的文库进行选择，以在补充odeCDR3序列时满足目标TCR ORF序列的V/J/C利用情况。
可以构建V-C入门载体和J供体载体文库以含有具有这类TCR的生物的全部种系TCR可变、恒定和连接基因区段。就如实施例3中展示的TRB基因座特异性TORES，这种文库也可以在V-C入门载体中包括所有V-C组合，其中针对每个可变区段，两个恒定基因区段在该文库中重复。
V-C入门载体和J供体载体文库可以含有V/J/C基因区段，以便相对于种系基因区段编码的蛋白质序列，编码的蛋白质的已翻译氨基酸序列是未修饰的。
这种文库允许基础性核酸序列的变化，从而产生否则将缺少不想要的IIS型识别序列或正向选择和负向选择元件的文库。基础性核酸序列的变化也可以用于密码子优化，以在来自不同宿主生物的细胞中表达重构的TCR链。
备选地，V-C入门载体和J供体载体文库可以含有V/J/C基因区段，其中相对于种系基因区段编码的蛋白质序列，编码的蛋白质的已翻译氨基酸序列是修饰的。
这种文库可以用来构建具有针对不同诊断用途或治疗性用途进行优化的特征的TCR。V/J/C基因区段中构架残基或区域的变化可以用来多种场景下(如表达TCR作为可溶性试剂时)增加表达或稳定性。类似地，不涉及直接HLA-抗原接触的构架区中的变化可以用来改变通过TORES产生的重构TCR的信号传导能力。也可以在构架区内部编码亲和标签或免疫原性序列，从而在下游应用中辅助纯化和/或检测重构的TCR。
V-C入门载体和J供体载体文库可以装配成包含以下组合的试剂盒
a.一个或多个编码可变基因区段和恒定基因区段组合的V-C入门载体，和
b.一个或多个编码J基因区段的J供体载体，和任选地
c.一个或多个具有单链突出端的标准化odeCDR3作为阳性对照odeCDR3，所述单链突出端匹配于V-C入门载体和J供体载体的单链突出端，和任选地
d.作为参比的预装配的全长TCR ORF
其中，a)和b)覆盖来自目标生物的基因区段的所要求的遗传多样性，具有对预期应用有意义的未修饰或修饰的氨基酸序列；c)用作重构反应中的阳性对照，d)用作全长TCRORF的下游应用中的阳性对照，其中所述全长TCR ORF用所述试剂盒中提供的V-C入门载体文库和J供体载体文库重构。
构建V-C入门载体的方法
可以通过本领域技术人员熟知的多种分子生物学方法实现V-C入门载体文库和J供体载体文库装配，所述方法包括所需载体的直接DNA合成。但是，需要一种使用含有小基因区段的片段的快速和划算的组合方法。这种方法允许对TCR工程化作业流程重要的V-C入门载体和J供体载体形式快速循环。类似地，给定V-C入门载体和/或J供体载体文库的快速扩充可以用来解释给定群体的个体之间TCR基因区段的单核苷酸多态性和其他等位差异，这可能具有功能意义或影响伪异体移植治疗背景下TCR序列的免疫原性。实施例1、2和3中充分描述了用于装配V-C入门载体文库和J供体载体文库的系统性方法。
一种构建V-C入门载体的方法包括组合选自以下的三个DNA组分
a.可变基因区段克隆性片段
b.恒定基因区段克隆性片段
c.V-C入门载体骨架
其中，a)含有可变基因区段；b)含有恒定基因区段；c)代表向其中装配可变和恒定基因片段的V-C入门载体骨架。
在本发明语境下，可变基因区段克隆性片段包含
a.用于片段的聚合酶链反应依赖性扩充的5'引物结合序列
b.经定向以按照3'方向切割的第五IIS型序列
c.当IIs型酶作用于b中的第五IIs型序列时编码限定的单链突出端的第一突出端序列。
d.Kozak序列
e.TCR可变基因区段
f.第一IIS型序列
g.负向选择标记的5'序列区段
h.第六IIS型序列，经定向以按照5'方向切割，从而在g中负向选择标记的5'序列区段内部产生单链突出端。
i.用于片段的聚合酶链反应依赖性扩充的3'引物结合序列
其中，b)和h)编码在装配V-C入门载体中使用的IIS型序列；f)编码在操作重构反应中使用的IIS型序列；g)代表通过恒定基因区段克隆性片段中提供的互补片段完成的负向选择标记序列的片段。
图5中展示可变基因区段克隆性片段的示意图。实施例1和3分别描述这些克隆性片段装配用于人TRA基因座和TRB基因座的V-C入门载体的样式和用途。
这些实施例将人TRA可变基因区段克隆性片段定义为SEQ0001至SEQ0046，并且将人TRB可变基因区段克隆性片段定义为SEQ0435至SEQ0481。
为了装配V-C入门载体，可变基因区段克隆性片段必须与恒定基因区段克隆性片段组合。
一个恒定基因区段克隆性片段包含
a.用于片段的聚合酶链反应依赖性扩充的5'引物结合序列
b.第七IIS型序列，经定向以按照3'方向切割，从而在c中负向选择标记的3'序列区段内部产生单链突出端。
c.负向选择标记的3'序列区段
d.第二IIS型序列
e.TCR恒定基因区段
f.当IIs型酶作用于g中的第八IIs型序列时编码限定的单链突出端的第二突出端序列。
g.第八IIS型序列，经定向以按照5'方向切割，从而在f的突出端序列中产生单链突出端。
h.用于片段的聚合酶链反应依赖性扩充的3'引物结合序列
其中，b)和g)编码在装配V-C入门载体中使用的IIS型序列；g)编码在操作重构反应中使用的IIS型序列；c)代表通过可变基因区段克隆性片段中提供的互补片段完成的负向选择标记序列的片段。
图6中展示可变基因区段克隆性片段的示意图。实施例1和3分别描述这些克隆性片段装配用于人TRA基因座和TRB基因座的V-C入门载体的样式和用途。
这些实施例将人TRB恒定基因区段克隆性片段定义为SEQ0047，并且将人TRB恒定基因区段克隆性片段定义为SEQ0482和SEQ0483。
将可变基因区段克隆性片段和恒定基因区段克隆性片段组合入V-C入门载体骨架中，以装配V-C入门载体，
一个V-C入门载体骨架包含
a.复制起点
b.第一正向选择标记
c.5'遗传元件
d.第一限制性酶识别序列，其允许消化骨架以产生与装配反应期间通过IIS型作用在可变基因区段克隆性片段内部产生的突出端互补的单链突出端
e.第二限制性酶识别序列，其允许消化骨架以在装配反应期间通过IIS型作用产生恒定基因区段克隆性片段
f.3'遗传元件。
其中，c)和f)代表遗传元件，其用于如上文提到的不同生物系统中重构的TCR ORF应用。
图7中展示V-C入门载体骨架的示意图。实施例1、3和4分别描述不同V-C入门载体骨架形式装配用于TRA基因座和TRB基因座的V-C入门载体的样式和用途。
用于哺乳动物细胞中下游瞬时表达重构的TCR ORF的V-C入门载体骨架定义为SEQ0048，而用于重构的TCR ORF发生重组酶介导的盒交换的一对V-C入门载体骨架定义为SEQ0688和SEQ0689。
使可变基因克隆性片段和恒定基因克隆性片段进入不同V-C入门载体骨架快速循环是从给定V/J/C组合改变重构的TCR ORF的载体背景的特征的划算方法。这种方法允许向不同生物学应用重新分配先天或合成性TCR基因区段文库的快速重复。
在本文中援引的可变基因区段克隆性片段和恒定基因区段克隆性片段和V-C入门载体骨架实例之内，用于载体装配的IIS型酶是BbsI，而用于TCR ORF重构的IIS型酶是BsaI。V-C入门载体骨架含有Acc65I和XbaI的限制性酶识别位点，以产生分别与通过BbsI作用在可变基因克隆性片段和恒定基因克隆性片段中生成的5'突出端和3'突出端相容的突出端。
任何其他的组合限制性酶可以用于装配和重构反应，前提是它们满足上述标准。
优选地，上文命名为第五、第六、第七和第八IIS型序列的用于装配V-C入门载体的IIS型序列是相同的。
备选地，至多四个不同IIS型识别序列可以用于这个方法。
上文命名为第五、第六、第七和第八IIS型序列的用于装配V-C入门载体的IIS型序列必须不同于用于重构反应的上文命名为第一、第二、第三和第四IIS型序列的那些。
实施例1和3中充分描述了将可变基因区段克隆性片段和恒定基因区段克隆性片段与V-C入门载体骨架组合以装配V-C入门载体的方法。
一种装配V-C入门载体的方法包括
a.用两种对包含于V-C入门载体骨架内部的识别序列特异的限制性酶消化V-C入门载体骨架
b.将消化的V-C入门载体骨架与V克隆性片段和C克隆性片段连同DNA连接酶和识别第五、第六、第七和第八IIS型序列的一种或多种IIS型限制性酶一起合并，并且使合并的混合物经历热循环反应，并且
c.将所得的反应产物转化入感受态宿主生物并且使用所述第一正向选择标记进行正向选择，以获得完整的V-C入门载体
其中；a)产生与b)中通过IIS型酶作用在可变克隆性片段和恒定克隆性片段中产生的那些的单链突出端互补的单链突出端；b)代表消化可变和恒定片段以产生突出端，所述突出端将与a)中生成的突出端连接并且允许负向选择标记片段内部生成的互补突出端连接，以连接可变片段和恒定片段；c)代表V-C入门载体产物的选择和增殖。
V-C入门载体和构建元件的类属特征
以上描述使用人HLA TRA基因座和TRB基因座作为定义TORES系统的模板，还如实施例1至4中略述。但是，可以把来自任何TCR基因座的基因区段家族装配入TORES。在以上描述中，对人TRA/TRB基因座给出了何处存在TORES系统设计灵活性的准则，这些准则还适用于来自任何生物的任何其他基因座。在本章节中，使用在实施例1至4中提出的TRA/TRB设计作为模板，描述系统的一般特征。
为了实现用于任何给定TCR基因座的TORES，需要对所述TCR基因座编码的TCR链特异的四个序列元件：
X–可变(V)基因区段片段
Y–恒定(C)基因区段片段
Y’–恒定(C)基因区段部分
Z–连接(J)基因区段片段
根据上文描述和下文实施例，可以这四个形式的TCR序列元件装配入各种载体背景，以构建并为任何给定TCR链的任何给定V-J-C组合部署TORES。例如，用于先天TRG和TRD基因座的系统、变体和/或合成性人TCR链变体形式或除人类之外的生物的先天TCR链形式。
V基因区段片段和C基因区段片段是分别通过V克隆性片段和C克隆性片段装配入V-C入门载体的那些。实施例1和3中充分描述这个过程。
一个一般可变基因区段克隆性片段，其中第一IIS型序列编码酶BsaI的识别作用，并且第五和第六IIS型序列编码酶BbsI的识别作用，并且可变基因区段克隆性片段因此由序列SEQ0690代表。编码的可变基因区段片段命名为XNn，其中X是可变基因区段的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表所述序列中核苷酸的数目。
一个一般恒定基因区段克隆性片段，其中第一IIS型序列编码酶BsaI的识别作用，并且第七和第八IIS型序列编码酶BbsI的识别作用，并且恒定基因区段克隆性片段因此由序列SEQ0691代表。编码的恒定基因区段片段命名为YNn，其中Y是恒定基因区段的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表所述序列中核苷酸的数目。
由序列SEQ0048代表的V-C入门载体骨架用来构建适用于哺乳动物宿主细胞中瞬时表达或重构的全长TCR可读框的V-C入门载体，其中通过Acc65I和XbaI酶分别作用于骨架产生第一和第二突出端，并且5'和3'遗传元件分别由组成型启动子和多聚腺苷化信号代表。
由序列SEQ0688代表的V-C入门载体骨架用来构建V-C入门载体，所述V-C入门载体适于与具有合适的异特异性重组酶序列的匹配的遗传靶发生重组酶介导的盒交换，其中通过Acc65I和XbaI酶分别作用于骨架产生第一和第二突出端，并且5'和3'遗传元件分别由指导翻转酶活性的F14和F15异特异性重组酶序列代表。
由序列SEQ0689代表的V-C入门载体骨架用来构建V-C入门载体，所述V-C入门载体适于与具有匹配的异特异性重组酶序列的遗传靶发生重组酶介导的盒交换，其中通过Acc65I和XbaI酶分别作用于骨架产生第一和第二突出端，并且5'和3'遗传元件分别由指导翻转酶活性的FRT和F3异特异性重组酶序列代表。
通过将上述的一般V克隆性片段、C克隆性片段与选定的V-C入门载体骨架组合，可以为这些不同载体背景内部重构的TCR ORF的不同下游应用构建变体V-C入门载体。
一个采用具有序列SEQ0048的V-C入门载体骨架构建的一般V-C入门载体由序列SEQ0692代表。这种所得的V-C入门载体适用于哺乳动物宿主细胞中瞬时表达或重构的全长TCR可读框，其中第一和第二IIS型序列编码酶BsaI的识别作用，并且可变基因区段片段代表XNn，并且恒定基因区段片段代表YNn，其中X和Y是所述序列的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表每个序列中核苷酸的数目。
一个采用具有序列SEQ0688的V-C入门载体骨架构建的一般V-C入门载体由序列SEQ0693代表，其含有适于与具有匹配的异特异性重组酶序列的遗传靶发生重组酶介导的盒交换的F14和F15序列，其中第一和第二IIS型序列编码酶BsaI的识别作用，并且可变基因区段片段代表XNn，并且恒定基因区段片段代表YNn，其中X和Y是所述序列的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表每个序列中核苷酸的数目。
一个采用具有序列SEQ0689的V-C入门载体骨架构建的一般V-C入门载体由序列SEQ0694代表，其含有适于与具有匹配的异特异性重组酶序列的遗传靶发生重组酶介导的盒交换的FRT和F3序列，其中第一和第二IIS型序列编码酶BsaI的识别作用，并且可变基因区段片段代表XNn，并且恒定基因区段片段代表YNn，其中X和Y是所述序列的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表每个序列中核苷酸的数目。
具有不同异特异性重组酶位点的成对V-C入门载体可以用于TCR链对的每条链，如实施例4中对人TRA链和TRB链对所述。这意味着在下游应用这个配对的TORES系统中重构的TCR链时，可以将前者递送入具有双异特异性重组酶接受位点的遗传背景。例如，含有这类双异特异性重组酶接受位点用于基因组整合TCR链对的细胞系。
上文分别基于使用IIS型酶BbsI和BsaI进行构建和操作，描述V-C入门载体和从中装配它们的组分。基于上文给出的指导，一个或多个备选性IIS型酶可以用于这些任务的每一者。
构建J供体载体的方法
如构建V-C入门载体的上述组合方法，组合方法可以用来构建J供体载体。在本发明方法中，在一个两步骤过程中构建J供体载体，所述两步骤过程涉及在第一步骤中构建中间J接受盒载体，在第二步骤中向所述中间J接受盒载体插入J区段部分以形成J供体载体。在这种情况下，J接受盒载体，J供体载体衍生自其，含有恒定基因区段的小片段，称作C部分。因此，需要快速组合方法或构建以迭代需要差异性恒定基因区段利用情况的不同J供体载体形式。实施例2和3中实质上充分描述这种方法。
一种构建J供体载体的方法包括组合选自以下的四个DNA组分
a.J接受盒片段
b.J供体载体骨架
c.J接受盒载体
d.J区段部分
其中，a)含有上文提到的C-部分和四个迥异IIS型克隆位点用于载体装配和重构反应操作；b)是这样的载体骨架，向所述载体骨架插入一个以产生c)；d)是与c)组合以产生J供体载体的J基因区段部分。
一个J接受盒片段包含
a.在5'末端与J供体载体骨架中生成的突出端序列互补的第一单链突出端
b.第三IIS型序列，经定向以按照3'方向切割，与这样的序列连接，所述序列受到c中提到的第九IIS型序列指导的酶作用时形成单链突出端。
c.第九IIs型序列，经定向以按照5'方向切割并产生b中提到的单链突出端。
d.负向选择标记
e.第十IIS型序列，经定向以按照3'方向切割并在f中描述的序列的5'处产生单链突出端。
f.代表恒定基因片段的5'区域的C部分，在5'末端具有受第十IIS型序列指导的酶作用产生的突出端序列和在3'末端具有受g中所提到第四IIS型序列指导的酶作用产生的突出端序列。
g.第四IIS型序列，经定向以按照5'方向切割，从而在g中提到的含有C部分的5'序列内部产生单链突出端。
h.在3'末端与J供体载体骨架中生成的突出端序列互补的第二单链突出端
其中；a)和h)用于定向克隆入J供体载体骨架；b)和g)编码在操作重构反应中使用的IIS型序列；c)和e)编码在装配J供体载体中使用的IIS型序列；d)代表用于装配J供体载体期间消除亲本J接受盒载体的负向选择标记；f)代表J供体载体携带的恒定基因区段的片段。
图8中展示J接受盒片段的示意图。实施例2和3分别描述J接受盒片段装配用于人TRA基因座和TRB基因座的J接受盒载体的样式和用途。
在本发明语境下，通过以下方式形成J接受盒片段：使部分互补的单链寡核苷酸复性，产生在每个末端具有单链突出端的DNA双链体。将用于TRA基因座的J接受盒片段作为SEQ0098和SEQ0099描述。
将用于TRB基因座的J接受盒片段作为SEQ0578和SEQ0581描述，其中两种形式存在以解释人TRB基因座处使用的两个恒定基因区段。
在提供的实施例中，J接受盒片段，用于装配J供体载体的IIS型酶是BbsI，而用于重构TCR ORF的IIS型酶是BsaI。
一个J供体载体骨架包含
a.复制起点
b.第二正向选择标记
c.第一限制性酶识别序列，允许消化骨架以产生与J接受盒片段中的突出端互补的单链突出端
d.第二限制性酶识别序列，允许消化骨架以产生与J接受盒片段中的突出端互补的单链突出端
其中c)和d)允许通过使用独特的互补突出端序列定向克隆J接受盒片段。
J供体载体骨架示意性地在图9中代表并且在实施例2和3中详细描述。J供体载体骨架序列作为SEQ0097代表。
J供体载体骨架含有EcoRI和XhoI的限制性酶识别位点，以产生分别与J接受盒基因克隆性片段中提供的5'突出端和3'突出端相容的突出端。
任何其他的限制性酶组合可以用于装配和重构反应，前提是它们满足上述标准。
实施例2和3中充分描述了通过组合J接受盒片段和J供体载体骨架生成J接受盒载体的方法。
通过组合TRAJ接受盒片段和TRAJ J供体载体骨架构建J接受盒载体，其中该方法包括
a.用两种对包含于J供体载体内部的识别序列特异的限制性酶消化J供体载体骨架
b.用DNA连接酶，将消化的J供体载体骨架与J接受盒片段组合
c.将所得的反应产物转化入感受态宿主生物并且使用所述第二正向选择标记进行正向选择，以获得完整的J接受盒载体
其中；a)产生与J接受盒片段内部包含的那些单链突出端互补的单链突出端；b)代表连接互补突出端以形成J接受盒载体；c)代表选择和增殖J接受盒载体产物。
图10中展示J接受盒载体的示意图。实施例2和3分别描述构建用于人TRA基因座和TRB基因座的J接受盒载体。
将用于TRA基因座的J接受盒载体作为SEQ0098描述，而将用于TRB基因座的那些作为SEQ0582和SEQ0583描述。TRB基因座利用两个恒定基因区段，因此复制物TRB J接受盒载体含有对每个恒定基因区段特异的C部分序列。
J接受盒载体与J区段部分组合以产生J供体载体。J区段部分编码大量J基因区段。
所述J区段部分包含
a.在5'末端的第一单链突出端序列，其与第九IIS型序列指导的酶作用时，在J接受盒载体内产生的突出端互补
b.连接基因区段部分
c.在3'末端的第二单链突出端序列，其与第十IIS型序列指导的酶作用时，在J接受盒载体内产生的突出端互补
其中，a)和c)指导J区段部分定向克隆入装配反应中提供的IIS型酶所消化的J接受盒载体；b)编码由J供体载体产物待携带的连接基因区段。
图11中展示J区段部分的示意图。实施例2和3分别描述了J区段部分，其用来构建用于人TRA基因座和TRB基因座的J供体载体。
将涵盖人TRA基因座的J基因区段利用情况的短J区段部分作为SEQ0099至SEQ0210描述，其中通过以下方式形成J区段部分：使部分互补的单链寡核苷酸复性，产生在每个末端具有单链突出端的DNA双链体。
短J区段部分可以用来与具有最小长度的标准化J区段部分产生J供体载体，如实施例2和3中展示。
长J区段部分可以用来产生J基因区段覆盖情况扩展的J供体载体，以最大限度减少TCR重构反应中使用的odeCDR3的大小。缩短odeCDR3元件缩减所述元件的合成成本，并且还最大限度减少这些寡核苷酸双链体内部的突变负担。
将涵盖人TRA基因座的J基因区段利用情况的长J区段部分作为SEQ0211至SEQ0322描述，其中通过以下方式形成J区段部分：使部分互补的单链寡核苷酸复性，产生在每个末端具有单链突出端的DNA双链体。
将涵盖人TRB基因座的J基因区段利用情况的短J区段部分作为SEQ0584至SEQ0609描述，其中通过以下方式形成J区段部分：使部分互补的单链寡核苷酸复性，产生在每个末端具有单链突出端的DNA双链体。
将涵盖人TRB基因座的J基因区段利用情况的长J区段部分作为SEQ0610至SEQ0635描述，其中通过以下方式形成J区段部分：使部分互补的单链寡核苷酸复性，产生在每个末端具有单链突出端的DNA双链体。
在本发明语境下，上文命名为第九和第十IIS型序列的用于装配J供体载体的IIS型序列是相同的。
备选地，两个不同IIS型识别序列可以用于这个方法。
上文命名为第九和第十IIS型序列的用于装配J供体载体的IIS型序列必须不同于用于重构反应的上文命名为第一、第二、第三和第四IIS型序列的那些。
上文命名为第九和第十IIS型序列的用于装配J供体载体的IIS型序列与上文命名为第五、第六、第七和第八IIS型序列的用来装配V-C入门载体的那些相同。
这些用来装配V-C入门载体和J供体载体的IIS型序列不必要相同或不同，因为独立地处理它们。
J区段部分与含有匹配的C部分的J接受盒载体组合以产生J供体载体。
通过将J供体载体骨架与J区段部分组合，构建J供体载体，其中该方法包括
a.将J接受盒载体与J区段部分连同DNA连接酶和识别第九和第十IIS型序列的一种或多种IIS型限制性酶一起合并，并且使合并的混合物经历热循环反应，a
b.将所得的反应产物转化入感受态宿主生物并且使用所述第二正向选择标记进行正向选择，以获得完整的J供体载体
其中，通过切除负向选择标记序列，步骤(a)中IIS型酶对第九和第十IIS型序列的作用在J接受盒载体内部产生单链突出端。
图3中展示所得J供体载体的示意图。实施例2和3分别描述了使用J区段部分和J接受盒载体构建用于人TRA基因座和TRB基因座的J供体载体。
将含有用于人TRA基因座的短J区段的J供体载体作为SEQ0323至SEQ0378描述，而将含有用于人TRA基因座的长J区段的J供体载体作为SEQ0379至SEQ0434描述。
将含有与C1恒定基因区段配对的用于人TRB基因座的短J区段的J供体载体作为SEQ0636至SEQ0648描述，而将含有用于人TRA基因座的长J区段的J供体载体作为SEQ0662至SEQ0674描述。
将含有与C2恒定基因区段配对的用于人TRB基因座的短J区段的J供体载体作为SEQ0649至SEQ0661描述，而将含有用于人TRA基因座的长J区段的J供体载体作为SEQ0675至SEQ0687描述。
在提供的实施例中，用来装配J供体载体的IIS型酶是BbsI，而在重构TCR中使用的IIS型酶是BsaI。负向选择标记是NotI限制性酶序列。
构建J供体载体的方法还使得在转化和选择之前消除亲本J接受盒载体的负向选择步骤成为可能。
在提供的实施例中，这个负向选择使得NotI消化以在转化和选择之前消除亲本J接受盒载体成为可能。
J供体载体和构建元件的一般特征
如上文和以下实施例5中所述的，V-C入门载体文库和J供体载体文库的几个特征可以是一般的，因为将TCR基因区段元件构建入一般背景中，以实现TORES系统。
为了实现用于任何给定TCR基因座的TORES，需要对所述TCR基因座编码的TCR链特异的四个序列元件：
X–可变(V)基因区段片段
Y–恒定(C)基因区段片段
Y’–恒定(C)基因区段部分
Z–连接(J)基因区段片段
根据上文描述和下文实施例，可以将这四个形式的TCR序列元件装配入各种载体背景，以构建并为任何给定TCR链的任何给定V-J-C组合部署TORES。例如，用于先天TRG和TRD基因座的系统、变体和/或合成性人TCR链变体形式或除人类之外的生物的先天TCR链形式。
C基因区段部分和J基因区段片段是分别通过J接受盒片段和J克隆性片段向J供体载体中装配的那些。实施例2和3中充分描述这个过程。
一般性J接受盒片段由序列SEQ0695和SEQ0696代表，其中第三和第四IIS型序列编码酶BsaI的识别作用，并且第九和第十IIS型序列编码酶BbsI的识别作用，以及负向选择标记代表NotI限制性酶识别序列。在这个序列内部，编码的C-部分命名为Y’Nn，其中Y’是C-部分的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表所述序列中核苷酸的数目。
通过使序列对代表的单链寡核苷酸与部分互补的序列复性，产生J接受盒片段。
用以上一般性J接受盒片段构建J接受盒载体的J供体载体骨架由SEQ0097代表，其中限制性酶EcoRI和XhoI用来产生插入J接受盒片段序列所要求的单链DNA突出端。
通过组合从作为序列SEQ0695和SEQ0696代表的J接受盒片段中产生的J接受盒片段和由序列SEQ0097代表的J供体载体骨架构建的J接受盒载体因此由序列SEQ0697代表。在这个所得的J接受盒载体内部，第三和第四IIS型序列编码酶BsaI的识别作用，并且第九和第十IIS型序列编码酶BbsI的识别作用，以及负向选择标记代表NotI限制性酶识别序列。如衍生自J接受盒片段，编码的C-部分命名为Y’Nn，其中Y’是C-部分的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表所述序列中核苷酸的数目。
J接受盒载体具有插入的J区段部分以获得J供体载体。
用来插入SEQ0697代表的一般性J接受盒载体中的一般性J区段部分因此由互补序列SEQ0698和SEQ0699代表，其中J基因区段部分命名为ZNn，其中Z是J基因区段的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表所述序列中核苷酸的数目。
通过使SEQ0698和SEQ0699代表的两个单链寡核苷酸复性，产生J区段部分。
从SEQ0697代表的J接受盒载体和互补序列SEQ0698和SEQ0699代表的J区段部分组合装配的一般性J供体载体因此由序列SEQ0700代表。所得的这种J供体载体因此含有两个注释的序列插入物ZNn和Y’Nn，其中Z是J基因区段的名称，并且Y’是C区段部分的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表所述序列中核苷酸的数目。
上文分别基于使用IIS型酶BbsI和BsaI进行构建和操作，描述V-C入门载体和从中装配它们的组分。基于上文给出的指导，一个或多个备选性IIS型酶可以用于这些任务的每一者。
确定的载体背景下全长TCR ORF在诊断学和治疗药中的用途
利用T细胞免疫力治疗疾病的关键难题是HLA和TCR系统的个体间多样性，连同TCR组库的庞大个体内背景。这意味，取决于评估和/或提供TCR的药物和治疗策略需要真正的生物学背景下稳健评估TCR功能。
为了实现准确评估先天TCR链对，需要一种在确定的载体背景下递送已捕获TCRORF的可靠和划算的高通量方法。任何给定链对的TORES是递送这类TCR ORF的手段。
用于TCR ORF的确定的载体背景可以例如是瞬时表达载体，例如，其中如实施例8中所述，可以在人细胞的表面上快速表征TCR。在这个实施例中，可以将TCR测序并再表达以确认预期的特异性。这允许使用验证的TCR序列，在免疫治疗干预期间基于个性化基础，通过序列或用于诊断方法的基于扩增或基于探测的测定法追踪TCR克隆类型丰度。类似地，快速捕获和验证TCR链对意味着，可以在个性化用药中提供所述TCR对–如递送可溶性TCR构建体作为医疗化合物，或在效应细胞中提供TCR作为细胞治疗药。
在相似的方案中，TORES系统理想地适用于使TCR ORF工程化，以更改特异性和/或功能，如实施例9和10中略述。这个工程化过程可以用来增强或减少信号传导强度和/或变化或使TCR链对指向特定疾病抗原的特异性重定向。可以在个性化免疫治疗策略中提供这类工程化的TCR序列替代先天TCR链对。
双向TCR ORF重构和工程化系统(TORES2)
上述的TORES系统在独立的两部分载体文库系统内部处理每条TCR链。因此，TORES运行的产物是编码重构的TCR ORF的离散载体。在一个独立方面，本发明提供了使用两步骤方法向单一产物载体中毗连相应TCR链对的备选系统。在一个五组分载体文库系统中实现这点，其中修饰的V-C入门载体与TORES系统的J-供体载体和odeCDR3组合，以在独立反应中实现TCR链对重构。修饰的V-C入门载体随后允许重构的TCR ORF在第二步骤中通过添加第五载体组件(双向终止子供体载体(BiT供体))毗连，旨在实现以反平行编码含义编码两个TCR OFR对的载体。
这种双向TORES(TORES2)代表组合的五组分载体系统，因为修饰编码相应链对的元件的V-C入门载体是非对称的。意指V-C入门载体包含迥异的布局。即，从第一步骤的产物载体中切下一条链的重构的ORF并将其以反义方向连接入第一步骤的相应产物载体。因此，V-C入门载体的配对是关键，因为TORES2系统的原始V-C入门载体之一代表终产物骨架，并且因此为下游应用编码重构和毗连的TCR对的所需3'和5'遗传元件。为清晰起见，下文提出的说明书和实施例使TRA链固定为终产物骨架(例如，V-Cα入门载体)并且使TRB为整合至这种终产物骨架的链(例如V-Cβ入门载体)。相应的布局同等有效，相应TCR链对的任何其他组合也是如此。
TORES2的V-C入门载体组分
如上文提到，五组分载体文库系统包含在提供修饰的V-C入门载体背景方面不同于TORES系统的TORES2。这些修饰并入与第一步骤中用于TCR ORF重构的那些迥异的IIS型位点(标记为IIS型#2)和负向选择元件(标记为–ve选择#2)，以指导那些重构的ORF在第二步骤中毗连到单一载体中。实际上，TORES2系统在新的V-C入门载体背景中并入TORES系统。以下说明把TRA链作为骨架终产物对待，并且把TRB链作为以反义方向连接到重构的TRA链骨架中的那种对待。相同构架适用于任何TCR链对，并且不存在为何需要任一种TCR链处于所述载体布局之一中或另一种布局中的具体原因。
V-Cα入门载体含有，
a.复制起点
b.第一正向选择标记，
c.一个5'遗传元件或多个5'遗传元件，
d.Kozak序列
e.TCR α可变基因区段，
f.第一IIS型序列，用于被IIS型限制性酶位点特异性识别和切割(对于IIS型酶#1)，
g.第一负向选择标记，
h.第二IIS型序列(对于IIS型酶#1)，
i.TCR恒定基因区段，
j.第三IIS型序列(对于IIS型限制性酶#2)，
k.第二负向选择标记，
l.第四IIS型序列(对于IIS型限制性酶#2)，并且
m.一个3'遗传元件或多个3'遗传元件
其中，a)和b)用于细菌宿主中增殖和选择亲本V-C入门载体和含有重构的TCR的载体；c)和m)用来定义重构和毗连的全长TCR ORF的下游应用，并且可以包括如上文所述用于TORES的元件；d)确保真核细胞中的高效翻译起始，所述高效翻译起始可能备选地代表原核生物和古细菌中用于翻译调节的Shine-Dalgarno序列；e)代表从起始密码子至CDR3区5'边缘处基序的可变(V)α基因区段，所述基序在给定的两组分载体系统中跨所有V区段保守；f)代表IIS#1型识别序列，其指导IIS型限制性酶以5'方向切割，从而在V基因区段3'末端产生标准化单链突出端；g)代表在系统运行期间消除亲本V-C入门载体以便重构全长TCR ORF的负向选择标记#1；h)代表IIS型#1识别序列，其指导IIS型限制性酶以3'方向切割，从而在C基因区段5'末端产生标准化单链突出端；i)代表自C基因区段5'末端处基序开始的恒定(C)基因区段，所述基序在给定的两组分载体系统中跨所有C区段均保守并且定义与J区段的边界(参见图2和图4)；j)代表了指导IIS型限制性酶以5'方向切割，从而在3'末端在C基因区段后产生标准化单链突出端的IIS型#2识别序列，这种类型IIS酶不同于第一和第二IIS型#1酶；k)代表在产生双向载体构建体的操作期间消除亲本TRA ORF载体的负向选择标记#2，它区别于第一负向选择标记；l)代表了指导IIS型限制性酶以3'方向切割，从而在3'遗传元件之前产生标准化单链突出端的IIS型#2识别序列，这种类型IIS酶不同于第一和第二IIS型#1酶；m)代表一个3'遗传元件或多个3'遗传元件。
图20a中描述上述V-Cα入门载体的布局。
通常，第一和第二IIS型酶(指定为IIS型#1)相同，但也可以不同。类似地，第三和第四IIS型酶(指定为IIS型#2)相同，但也可以不同。关键地，用于第一和第二IIS型(IIS型#1)位点的IIS型酶必须与用于第三和第四IIS型(IIS型#2)位点的酶不同。
V-Cα入门载体骨架由SEQ0756代表，如实施例11中展示。
下文实施例11展示了用于人TRA基因座的TORES2的V-Cα入门载体(SEQ0756)，其中一些V/C序列已经相对于并入TORES系统中的那些序列被修饰，从而没有第三和第四位点(SEQ0757至SEQ0763)中使用的IIS型酶
V-Cβ入门载体含有，
a.复制起点
b.第一正向选择标记，
c.一个5'遗传元件或多个5'遗传元件，
d.第一IIS型序列，用于被IIS型#2限制性酶位点特异性识别和切割，
e.Kozak序列
f.TCR β可变基因区段，
g.第二IIS型序列，用于被IIS型限制性酶位点特异性识别和切割(IIS型#1)，
h.第一负向选择标记，
i.第三IIS型序列(IIS型#1)、
j.TCR恒定基因区段，
k.第四IIS型序列(IIS型#2)、
l.第二负向选择标记，和
m.一个3'遗传元件或多个3'遗传元件
其中，a)和b)用于细菌宿主中增殖和选择亲本V-C入门载体和含有重构的TCR的载体；c)和m)用来定义如上文对TORES系统所述的重构的全长TCR ORF的下游应用；d)代表了指导IIS型限制性酶以3'方向切割，从而在5'遗传元件后和Kozak序列之前产生标准化单链突出端的IIS型#2识别序列，这种类型IIS酶不同于第二和第三IIS型#1酶；e)确保真核细胞中的高效翻译起始，所述高效翻译起始可能备选地代表原核生物和古细菌中用于翻译调节的Shine-Dalgarno序列；f)代表从起始密码子至CDR3区5'边缘处基序的可变(V)基因区段，所述基序在给定的两组分载体系统中跨所有V区段保守；g)代表IIS#1型识别序列，其指导IIS型限制性酶以5'方向切割，从而在V基因区段3'末端产生标准化单链突出端；h)代表在系统运行期间消除亲本V-C入门载体以便重构全长TCRORF的负向选择标记；i)代表IIS型#1识别序列，其指导IIS型限制性酶以3'方向切割，从而在C基因区段5'末端产生标准化单链突出端；j)代表自C基因区段5'末端处基序开始的恒定(C)基因区段，所述基序在给定的两组分载体系统中跨所有C区段均保守并且定义与J区段的边界(参见图2和图4)；k)代表了指导IIS型限制性酶以5'方向切割，从而在C基因区段后但在3'遗传元件之前产生标准化单链突出端的IIS型#2识别序，这种类型IIS酶不同于第二和第三IIS型#1酶；m)代表第二负向选择标记，其不同于第一负向选择标记，l)代表一个3'遗传元件或多个3'遗传元件。
图20b中描述上述V-Cβ入门载体的布局。
在V-Cβ入门载体背景中3'和5'遗传元件是任选的，因为在这种载体内部重构的ORF稍后被切下并连接到V-Cα入门载体骨架背景中。即，V-Cα入门载体骨架。
通常，第二和第三IIS型酶(指定为IIS型#1)相同，但也可以不同。类似地，第一和第四IIS型酶(指定为IIS型#2)相同，但也可以不同。关键地，用于第二和第三IIS型位点(IIS型#1)的IIS型酶必须与用于第一和第四IIS型位点(IIS型#2)的酶不同。
通常，V-Cα入门载体的第一和第二IIS型位点(IIS型#1)与V-Cβ入门载体的第二和第三相同，但不必要如此，因为可以独立地操作这些反应。如果V-Cα入门载体的第一和第二IIS型位点区别于V-Cβ入门载体的第二和第三IIS型位点，则可以在单个反应中实施所述系统中TRA链和TRB链的重构。
通常，V-Cα入门载体的第三和第四IIS型位点(IIS型#2)与V-Cβ入门载体的第一和第四相同，从而仅需要向第二毗连反应添加单一IIS型酶(IIS型#2)。
通常，每个V-Cα和V-Cβ入门载体的第二负向选择标记(-ve选择#2)相同，从而在TORES2操作的毗连步骤中促进对亲本载体的高效负向选择，但也可以不同。
V-Cβ入门载体骨架由SEQ0764代表，如实施例11中展示。
下文实施例11展示了用于人TRB基因座的TORES2的V-Cβ入门载体(SEQ0764)，其中一些V/C序列已经相对于并入TORES系统中的那些序列被修饰，从而没有第一和第四位点(SEQ0765至SEQ0776)中使用的IIS型酶
J供体和TORES2的odeCDR3组分
J供体载体和编码CDR3的寡核苷酸双链体与如上文已经对常规TORES所述相同。二者均在第一步骤反应中用于指定的V-C入门载体骨架背景中，按照与上文对TORES所述的相同方法重构相应的TCR链对。
TORES2的双向终止子供体载体(BiT供体)
TORES2的前四个载体文库组分代表V-Cα和V-Cβ入门载体，连同聚焦于TRA/TRB的描述中用于每条TRA链和TRB链的J供体载体。再次，应当指出，任何TCR链可以遵循所述的设计原理，并入这种系统中，并且为清晰起见，固定具体的TRA和TRB布局。
第五组分代表双向终止子供体载体(BiT供体)，其提供一种双向终止子元件，所述双向终止子元件由第一步骤反应中重构并且在第二步骤反应中借助这个双向终止子元件毗连的反平行有义TRA链和TRB链间插。
双向终止子通常作为载体提供并且还被两个IIS型限制性酶位点(IIS型#2)包围。同等有意义的是，将双向终止子元件作为带这些IIS型位点或带目标单链DNA突出端无IIS型位点的线性dsDNA构建体提供。
含有双向终止子的载体含有，
a.复制起点
b.第二正向选择标记，
c.第一IIS型序列(IIS型#2)，
d.双向终止子，和
e.第二IIS型序列(IIS型#2)
其中，a)和b)用于细菌宿主中增殖和选择携带双向终止子的载体，c)代表了指导IIS型限制性酶(IIS型#2)以3'方向切割，从而产生标准化单链突出端的IIS型识别序列，d)代表了用来在表达重构入TRA骨架的TCR期间确保DNA有义链和反义链上转录终止的双向终止子，此时所述载体含有转染入哺乳动物细胞的重构的TCR ORF；e)代表了指导IIS型限制性酶以5'方向切割，从而产生标准化单链突出端的IIS型识别序列(IIS型#2)。
图21中描述上述BiT供体载体的布局。
通常，包含于BiT供体内部的正向选择标记区别于V-Cα和V-Cβ入门载体携带的正向选择标记，从而最大限度减少第二步骤毗连反应中对亲本BiT供体的携带。
通常，BiT供体中的第一和第二IIS型位点(IIS型#2)与V-Cα入门载体的第三和第四IIS型位点及V-Cβ入门载体的第一和第四均相同，从而仅需要向第二毗连反应添加单一IIS型酶(IIS型#2)。
双向终止子元件序列由SEQ0777代表。
运行TORES2以重构和毗连全长TCR ORF对
运行TORES2是一个两步骤过程，其包括TCR ORF重构第一步骤和TCR ORF毗连第二步骤。用于重构TCR ORF的方法与上文对TORES所述(参见图1和图4)相同。第一步骤的产物因此类似于TORES的产物，包含载体，所述载体编码含有V-CDR3-J-C元件布局的全长TCRORF。但是，TORES2系统以迥异于TORES系统的骨架背景提供这些TCRORF，其中TORES2骨架含有促进第二毗连步骤反应的额外克隆位点。这个第二步骤限制性酶和连接酶循环反应使得以反平行含义毗连来自第一步骤的重构的TCR ORF并间插BiT供体提供的双向终止子元件成为可能。描述上述TRA/TRB TORES2布局的图22中描述了整个过程。
编码重构的TRA的载体(图22a)、编码TRB的载体(图22b)和BiT供体(图22c)在具有IIS型酶(IIS型#2)和连接酶的单管中反应并经历限制性酶和连接酶循环反应。IIS型限制性酶将三种提供的载体消化成三种反应副产物和具有设计的突出端以定向连接成反应产物的三种反应中间体。
三个反应副产物由从TRA载体切下的–ve选择元件#2和IIS型#2位点(图22d)、已经从中切除重构的TRB ORF的开放型编码TRB的载体骨架(图22e)和已经从中切除双向终止子元件的开放型BiT供体骨架(图22f)代表。
第一反应中间体是在V-Cα入门载体骨架背景下编码重构的TRAORF的开放型TRA载体(图22g)。在如上文所述的原始V-Cα入门载体中的第三IIS型#2位点指导酶以5'方向切割，以在C基因区段之后在3'末端产生标准化单链突出端(图22g，突出端)，而第四IIS型#2位点指导酶以3'方向切割，以在3'遗传元件之前产生标准化单链突出端(图22e，突出端/>)。
第二反应中间体是从V-Cβ入门载体背景切下的TRB ORF编码片段。在上文描述的V-Cβ入门载体中的第一IIS型#2位点指导酶以3'方向切割，以在Kozak序列之前产生突出端(图22h，突出端)。第四IIS型#2位点指导酶以5'方向切割，在C-区段后产生突出端(图22h，突出端/>)。应当指出，图22h以其中这种中间体将连接入产物载体背景的反义方向描述该中间体。
第三反应中间体是从BiT供体切下的双向终止子元件，其中第一IIS型#2位点指导酶以5'方向切割，以产生标准化单链突出端(图22i，突出端)。第二IIS型#2位点指导酶以3'方向切割，以产生标准化单链突出端(图22i，突出端/>)。
在限制性酶和连接酶循环反应内部，单链突出端驱动连接酶介导的向产物载体中定向连接，在原始V-Cα入门载体骨架背景内部毗连TRA链和TRB链(图22j)。
可以针对任何TCR链集合构建TORES2。为清晰起见，使用TRA基因座和TRB基因座作为案例研究进行描述。这种TORES2的构建同等地适用于分别编码TCR δ和γ链对的TRD和TRG基因座，或实际上适用于有颚脊椎动物中存在的任何TRA/TRB、TRD/TRG或变体TCR链对系统。
在下文实施例中，提供用于人TRA/TRB基因座的TORES2系统，并且将该系统应用于重构模型人TCR ORF，并随后整合入匹配的工程化细胞系，所述工程化细胞系携带与原始V-Cα入门载体骨架背景的5'和3'遗传元件匹配的RMCE位点。这表明，TORES2轻易地与匹配的工程化细胞系组合使用，所述工程化细胞系优化用于整合和呈递重构的TCRORF，后者处于与申请WO 2018/083318A1中所述类似的两部分装置布局中。
下文给出显示本文所提到序列的表。
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缩略语列表
APC 抗原呈递细胞
BiT 双向终止子供体
CAR-T CAR T细胞
CAR 嵌合抗原受体
CDR 互补决定区
C区段 恒定区段(又称C区)
CMV 巨细胞病毒
DAMPS 危险相关分子样式
DC 树状细胞
DNA 脱氧核糖核酸
dsDNA 双链脱氧核糖核酸分子
D区段 多样性区段(又称D区)
eAPC 工程化抗原呈递细胞
FACS 荧光激活的细胞分选法
FRT 翻转酶识别靶
GEM T细胞 种系编码的分枝酰(mycolyl)反应性T细胞
GFP 绿色荧光蛋白
HLAI HLA I类
HLAII HLA II类
HDR 同源定向重组
HLA 人白细胞抗原
IgSF 免疫球蛋白超家族
IRES 内部核糖体进入位点
ITAM 免疫受体基于酪氨酸的激活基序
iNK T细胞 不变性天然杀伤T细胞
J区段 连接区段(又称J区)
MACS 磁激活的细胞分选
MAGE 黑素瘤相关抗原
MAIT 粘膜相关的不变性T
odeCDR3 编码CDR3的寡核苷酸双链体
ORF 可读框
PAMPS 病原体相关的分子模式
PCR 聚合酶链反应
RMCE 重组酶介导的盒交换
RFP 红色荧光蛋白
RT 逆转录
DNA 核糖核酸
SH2 Src同源性2
T细胞 T淋巴细胞
TCR T细胞受体
TRA TCR α
TRB TCR β
TRD TCR δ
TRG TCR γ
TAA 肿瘤相关抗原
TORES TCR ORF重构和工程化系统
TORES2 双向TCR ORF重构和工程化系统
V区段 可变区段(又称V区)
β2M β2-微球蛋白
ZAP-70 70kDaζ-链相关蛋白
定义列表
成对互补TCR链：二条TCR链，其中翻译的蛋白质能够在TCR呈递细胞的表面上形成TCRsp
亲和力：两个或更多个分子或蛋白质之间相互作用的动力学参数或平衡参数
等位基因：给定基因的变体形式
扩增子：使用多种方法(包括PCR)时作为人工扩增的来源和/或产物的一段DNA或RNA。
分析物：令人感兴趣待鉴定和/或测量和/或查询的实体
抗体：由免疫系统的特化细胞(称作B细胞)表达和含有两条链的亲和分子。B细胞表达非常庞大和非常多样的抗体组库，所述抗体通常不结合自身蛋白，而可以结合并中和将威胁宿主的病原体或毒素。经常使用天然的或人工工程化的抗体作为亲和试剂。
APC：抗原呈递细胞。能够在其细胞表面上、通常在HLA背景下呈递抗原的细胞。
C(-区段)：恒定区段。又称恒定区。用来装配T细胞受体的基因区段之一。c-区域是在免疫系统中定义其一般功能而非驱动TCR多样性的独特区段。
C克隆性片段：恒定克隆性片段。也称作C基因区段克隆性片段。携带用来构建V-C入门载体的C基因区段部分的构建体。
C-部分：恒定部分。恒定基因区段序列的小部分，由J接受盒片段、J接受盒和J供体载体携带以使突出端序列标准化，以运行TORES重构TCR ORF。
CDR：互补决定区。在TCR和抗体的面向抗原的末端上执行大部分靶结合功能的短序列。每种抗体和TCR含有六个CDR并且它们通常是分子的最可变部分，允许检测庞大数目的多样性靶分子。
顺式作用元件：调节附近ORF转录的非编码性DNA区域。
D(-区段)：多样性区段。又称D区。用来装配T细胞受体的基因区段之一。每名个体具有这些区域的众多不同变种，从而每名个体可能为T细胞武装种类非常庞大的不同TCR。
多样化：其中使序列多样化的过程。
DNA：脱氧核糖核酸。形成编码基因和蛋白质的遗传物质的分子的化学名称。
内源的：源自细胞中的物质
真核条件性调节元件：可以影响启动子的活性的DNA序列，所述启动子在限定条件下可能被诱导或阻遏。
真核启动子：编码RNA聚合酶结合位点和反应元件的DNA序列。启动子区的序列控制RNA聚合酶和转录因子结合，因此启动子在确定何处和何时您的目的基因将表达方面发挥巨大作用。
真核终止子/信号终止子：与RNA聚合酶II结合并触发转录过程终止的蛋白质因子识别的DNA序列。它还编码聚腺苷酸信号。
FACS/流式细胞术：荧光激活的细胞分选法。流式细胞术是籍此可以对独立细胞分析特定细胞表面标记和胞内标记表达的技术。该技术的变型，细胞分选，允许取回携带限定标记集合的细胞供进一步分析。
翻转酶：衍生自面包酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))2μm质粒的重组酶(翻转酶，Flp)。
异特异性重组酶位点：由重组酶识别以促进两个DNA分子交叉互换的DNA序列
HLA I：人白细胞抗原I类。在人体的全部有核细胞中表达的基因并输出蛋白质到细胞表面上，在所述细胞表面，它将内部蛋白质的短片段、肽作为载货呈递至T细胞受体。就这一点而论，它呈递潜在持续感染性片段连同固有蛋白质。HLA I可以额外地将添加至培养基、从表达自所引入遗传元件的蛋白质产生或从细胞摄取的蛋白质产生的肽作为载货呈递。HLA I类基因呈多态性，这意味着不同个体可能在相同基因中具有变异，其导致呈递过程变异。与HLA II类相关。
HLA II：人白细胞抗原II类。在人体中协调并帮助适应性免疫应答的特定细胞(例如树状细胞)中表达的基因。与HLA I类相关。HLA II类蛋白输出至细胞表面，在那里它们将外部蛋白的短片段、肽作为载货呈递给T细胞受体。就这一点而论，它呈递潜在持续感染性片段连同固有蛋白质。HLA II可以额外地将添加至培养基、从表达自所引入遗传元件的蛋白质产生或从细胞摄取的蛋白质产生的肽作为载货呈递。HLA II类基因呈多态性，这意味着不同个体可能在相同基因中具有变异，其导致呈递过程变异。
同源臂：一段DNA，其与互补性同源臂具有几乎相同序列同一性并因此通过细胞过程(同源性指导的修复)促进两个DNA分子发生交换。
免疫监视：其中免疫系统检测并因感染、恶性肿瘤或其他潜在致病性变异而变得活化的过程。
绝缘子：防止基因受附近基因激活或阻遏过程影响的DNA序列。绝缘子还防止异染色质从沉默的基因扩散至活跃转录的基因。
整合：DNA序列物理连接入细胞的染色体。
内部核糖体进入位点(IRES)：一旦转录则编码允许翻译以非帽依赖性方式起始的RNA元件的DNA序列
J(-区段)：连接区段。又称J区。用来装配T细胞受体的基因区段之一。每名个体具有这些区域的众多不同变种，从而每名个体可能为T细胞武装种类非常庞大的不同TCR。
J-C入门载体：两组分载体系统的载体，其携带J区段和C TCR区段并且在重构全长TCR ORF期间接受来自V供体载体的序列和odeCDR3。
J供体骨架：连接供体骨架。向其中插入J接受盒片段以产生J接受盒载体的载体骨架。
J供体载体：两组分载体系统的载体，其携带J TCR区段并在重构全长TCR ORF期间将这个区段供给V-C入门载体。
J接受盒片段：连接接受盒片段。携带用来构建J接受盒载体的C-部分的克隆性片段。
J接受盒载体：连接接受盒载体。其中插入J区段部分以产生J供体载体的载体，携带C-部分。
J区段部分：连接区段部分。携带J基因区段的部分的DNA构建体，其中将所述部分插入J接受盒载体以产生J供体载体。
K是表示酮的核苷酸代码(K＝G或T)
Kozak序列：高效翻译起始所要求的短序列
M是表示氨基的核苷酸代码(M＝A或C)
主要HLA I类：包含基因HLA-A、HLA-B和HLA-C的APX家族
匹配的：此时，两种组分编码了指导并限制互补的组分之间相互作用的遗传元件
大范围核酸酶识别位点：由通常称作大范围核酸酶的内切脱氧核糖核酸酶识别的DNA序列。
可移动遗传元件：可以允许具有转座酶活性的DNA整合的DNA序列
N是表示4种核苷酸的核苷酸代码(N＝A、T、C或G)
先天：对细胞而言天然存在的实体
负向选择标记：向载体和/或携带所述标记携带载体的宿主生物赋予负向选择作用的选择标记
odeCDR3：编码互补决定区的寡核苷酸双链体。携带带末端突出端的CDR3基因序列的人造构建体，与两组分载体系统联合使用以重构全长TCR ORF。
复制起点：载体、质粒或基因组中引发复制的特定序列。
ORF：可读框。一段编码翻译框架以借助核糖体合成蛋白质(多肽)的遗传物质
突出端：在双链核酸分子末端处的单链序列。经常称作粘性末端或粘末端。
PCR其中指数扩增特定靶DNA分子的聚合酶链反应
肽：6-30个氨基酸长度之间的短氨基酸串
表型分析：对细胞可观测特征的分析。
质粒：可以在细菌或原生动物的细胞质中独立于染色体发生复制的遗传构建体，一般为小型环状DNA链。
多态性的：在相同物种的个体中因存在相同基因的不同等位基因而以不同形式存在。
多肽：由一段肽组成，形成三维结构的蛋白质。
正选择标记：向载体和/或携带所述标记携带载体的宿主生物赋予正向选择作用的选择标记
引物：允许例如在PCR期间特异性识别靶DNA序列的短DNA序列。
启动子：用于基因表达受控起始的调节性DNA元件。
重组酶：介导遗传重组的酶。
重构：在本发明语境下，重构描述了运行TORES和TORES2以装配TCR ORF。‘重构反应’是这种操作需要的反应混合和热循环反应。
报道元件：遗传元件，其在携带所述元件的生物或载体中介导报告的信号。可以用作正向或负向选择标记。
限制性酶切割序列：由限制性酶切割的基因序列，可以相对于所述限制性酶的识别序列为固有的或固有的。
限制性酶识别序列：限制性酶识别和接合的基因序列。
选择标记：赋予适于人工选择方法的性状的DNA序列
剪接受体位点：在内含子AM、APX CM3'末端的DNA序列或与表面上具有TCRsp的细胞或基于TCRsp的试剂相互作用的亲和试剂。
剪接供体位点：在内含子5'末端的DNA序列
自杀基因：一种基因，其将会在携带所述基因的宿主生物内部介导细胞死亡。可以用作正向或负向选择标记。
人造的：人工产生的实体。
T细胞：T淋巴细胞。在其表面上表达T细胞受体的白细胞。受免疫系统选择不与自体反应，但是具有识别感染和恶性肿瘤以及排斥来自相同物种大部分成员的移植物的潜力。
TCR：T细胞受体。由称作T-淋巴细胞的淋巴细胞亚群表达的亲和分子。在人体中，TCR识别APX CM或APX AM呈递的载货，包括来自病毒或细菌性感染或癌细胞的片段。因此，TCR识别是适应性免疫系统的有机部分。TCR由两条在细胞表面上配对的链组成。在每个细胞的表面上表达的TCR从巨大的变异基因(v、d、j和c区段)汇集物中随机装配，并且因此每名个体具有表达非常庞大和多样的不同TCR组库的T细胞汇集物。
TRA：编码TCR α的基因座。编码可以形成VDJ重组的TCR链的四个不同基因座编码基因之一。翻译的TCR α链蛋白一般与翻译的TCRβ链蛋白配对，以形成α/β TCRsp。
TRB：编码TCR β的基因座。编码可以形成VDJ重组的TCR链的四个不同基因座编码基因之一。翻译的TCR β链蛋白一般与TCR α链蛋白配对，以形成α/β TCRsp。
TRD：编码TCR δ的基因座。编码可以形成VDJ重组的TCR链的四个不同基因座编码基因之一。翻译的TCR δ链蛋白一般与翻译的TCRγ链蛋白配对，以形成γ/δ TCRsp。
TRG：编码TCR γ的基因座。编码可以形成VDJ重组的TCR链的四个不同基因座编码基因之一。翻译的TCR γ链蛋白一般与翻译的TCRδ链蛋白配对，以形成γ/δ TCRsp。
IIS型限制性酶：识别非对称DNA序列并在其识别序列外部切割的限制性酶。
V(-区段)：可变区。又称V区。用来装配T细胞受体的基因区段之一。每名个体具有这些区域的众多不同变种，从而每名个体可能为T细胞武装种类非常庞大的不同TCR。
V-C入门载体：两组分载体系统的载体，其携带V和C TCR区段并且在重构全长TCRORF期间接受来自J供体载体的序列和odeCDR3。
V克隆性片段：可变克隆性片段。也称作V基因区段克隆性片段。携带用来构建V-C入门载体的V基因区段部分的构建体。
V供体载体：组分载体系统的载体，其携带V TCR区段并在重构全长TCR ORF期间将这个区段供给J-C入门载体。
载体：载体是携带遗传信息的遗传构建体。在本发明语境下，载体通常描述质粒DNA载体。载体可以代表在宿主生物中可以扩增并选择的任何这类构建体。
W是表示弱的核苷酸代码(W＝A或T)。
附图简述
图1.用于快速重构全长TCR ORF的两组分载体系统。
A)
描述了两组分载体系统(框i)、要求的寡聚物双链体输入(框ii)和所得的全长TCRORF载体(框iii)的核心特征。第一组分代表V-C入门载体，其并入选定的TCR V(可变)基因区段和TCR C(恒定)基因区段。这个入门载体代表其中将携带最终全长TCR ORF的骨架。因此，针对预期下游应用调整这种载体骨架的任何合乎需要的特征。通常，这将由至少5'和3'遗传元件代表。靶全长TCR ORF的所需V基因区段和C基因区段选自V-C入门载体文库，以构建具有任何所需V/C组合的TCRORF(框i)。第二组分代表含有已选定J(连接)基因区段的J供体载体。这种供体载体发挥供给J基因区段的作用，并且因此，这种载体的骨架是反应副产物。目标TCR ORF的所需J基因区段选自J供体载体文库。为了完成全长TCR ORF所需的序列，合成基本上与成熟TCR ORF(框ii)的CDR3区对应的短寡聚物双链体。合成这种带单链突出端的寡聚物双链体，所述单链突出端与通过限制性酶消化V-C入门载体和J供体载体所产生的独特突出端相容。随同适宜的限制性酶和连接酶一起并入单管反应时，全长TCR ORF从选自预存文库的V-C入门载体和J供体载体提供的序列和合成的寡聚物双链体(框iii)重构。
B)
说明TCR ORF重构系统的总体文库特征的功能。单一V-C入门载体选自V-C组合变动的V-C入门载体文库(框i)。这种选择基于已选定TCR链所要求的V-C组合序列。单一J入门载体选自具有变动的编码的J基因区段的J供体载体文库(框ii)。这种选择基于与V-C入门载体相同的已选定TCR链所要求的J组合序列。最后，选择编码CDR3的寡聚物双链体(odeCDR3)，从而完成目标TCR链的全长ORF(框iii)。将这三个组分(框i、ii和iii)连同适宜的限制酶和连接酶一起合并入单一反应。反应循环以单一步骤在V-C入门载体骨架背景下产生重构的全长TCRORF(框iv)。
图2.一般V-C入门载体的遗传特征的质粒示意图。
描述了具有作为已标记框描述的最低要求遗传元件的V-C入门载体的环化质粒示意图。Kozak，指在起始高效翻译中发挥作用的共有序列。V-区段，指编码某比例的TCR可变种系ORF、或突变/人造ORF的选定序列。IIS型←，指如此定向，从而这类酶以5'方向切割的IIS型限制性酶结合位点。IIS型→，指如此定向，从而这类酶以3'方向切割的IIS型限制性酶结合位点。-ve选择，指负向选择元件，其旨在全长TCR重建反应或后续选择步骤期间损坏携带该序列的质粒。C-区段，指编码某比例的TCR恒定种系ORF、或突变/合成性ORF的选定序列。+ve选择#1，指双组分系统的第一正向选择标记，其用来向携带载体的生物传输选择优势，并且与第二载体组分的正向选择标记不同(参见图3)。Ori，指用于相容性宿主内部增殖质粒的复制起点。5′遗传元件，指任何所需的基因元件，其提供为下游应用重构的全长TCR所需的属性，并且应当位于重构的全长TCR的5'，例如，顺式作用元件。3′遗传元件，指任何所需的基因元件，其提供为下游应用重构的全长TCR所需的属性，并且应当位于全长TCRORF的3'，例如，转录终止子元件。
图3.一般性J供体载体的遗传特征的质粒示意图。
描述了具有作为已标记框描述的最低要求遗传特征的J供体载体的环化质粒示意图。J区段部分，指编码某比例的TCR连接种系ORF、或突变/人造J基因区段的DNA序列。C部分，指TCR恒定基因区段的5′小部分。IIS型←，指如此定向，从而这类酶以5'方向切割的IIS型限制性酶结合位点。IIS型→，指如此定向，从而这类酶以3'方向切割的IIS型限制性酶结合位点。+ve选择#2，指双组分系统的第一正向选择标记，其用来向携带载体的生物传输选择优势，并且与第一载体组分的正向选择标记不同(参见图2)。Ori，指用于相容性宿主内部增殖质粒的复制起点。
图4.对重建全长TCR ORF的两组分载体系统的遗传输入、副产物、中间体和产物的一般性说明。
描述了载体系统的两种组分(a和b)、寡核苷酸双链体(c)，当这三种组分合并入具有IIS型限制性酶和连接酶的单一反应时，生成两种反应副产物(d和e)、两种反应中间体(f和g)和一种反应产物(h)。将输入载体和双组分系统的产物作为环化质粒示意图描述，所述环化质粒示意图具有作为已标记框描述的遗传元件；代表副产物或中间体的开放质粒载体是非环化质粒示意图，其具有作为已标记框描述的遗传元件；并且将线性DNA描述为一系列描述遗传元件的已标记框。
a)如图2中所示的一般V-C入门载体质粒。
b)如图3中所示的一般性J供体质粒。
c)含有CDR3序列的DNA寡聚物双链体旁侧分布有两个单链DNA突出端：突出端和突出端/>突出端/>与开放V-C入门载体中间体(g)中的突出端/>相容。突出端/>与供体片段中间体(f)中的突出端/>相容。
d)用IIS型限制性酶消化V-C入门载体(a)产生了含有–ve选择元件和IIS型←元件和IIS型→元件的线性DNA V-C入门载体反应副产物。
e)用IIS型限制性酶消化J供体载体(b)产生了非环化质粒副产物，其含有亲本质粒的全部遗传元件，不包括切除的J供体片段中间体(f)中携带的那些遗传元件。
f)用IIS型限制性酶消化J供体载体(b)产生了含有J区段部分和C部分的线性DNA片段，其旁侧分布有单链DNA突出端：突出端和突出端/>突出端/>是与CDR3DNA寡核苷酸双链体(c)中的突出端/>相容。突出端/>与开放V-C入门载体中间体(g)中的突出端/>相容。
g)用IIS型限制性酶消化V-C入门载体(a)产生了非环化质粒中间体，其含有亲本质粒的全部遗传元件，不包括切除的线性DNA V-C入门载体反应副产物(d)中携带的那些遗传元件。消化已经额外地产生两个单链DNA突出端：突出端和突出端/>突出端与CDR3 DNA寡核苷酸双链体(c)中的突出端/>相容。突出端/>与J供体片段中间体(f)中突出端/>相容。
h)连接全部三个相容性单链DNA突出端产生作为环化质粒的全长TCR ORF载体。这种质粒含有亲本V-C入门载体(a)的全部遗传元件，不包括切除的V-C入门载体反应副产物(d)。此外，全长TCR ORF载体整合来自CDR3 DNA寡核苷酸双链体(c)的CDR3序列和来自J供体片段反应中间体的J区段部分和C部分。箭头指示相容性单链DNA突出端和/>之间连接的近似点。连接点/>包含分别由V-C入门载体反应中间体(g)和CDR3 DNA寡核苷酸双链体(c)供应的/>和/>元件。连接点/>包含分别由CDR3DNA寡核苷酸双链体(c)和J供体片段反应中间体(f)供应的/>和/>元件。连接点/>包含分别由J供体片段反应中间体(f)和V-C入门载体反应中间体(g)供应的/>和/>元件。
图5.构建V-C入门载体的V克隆性片段的布局
描述了用来如实施例1至4中所述那样装配用于人TRA和TRB TCR链的TORES的V-C入门载体的V克隆性片段的示意图。
V克隆性片段在5'和3'末端旁侧分布有独特的引物结合序列以促进PCR介导的克隆性片段扩增。BbsI位点代表装配V-C入门载体时使用的特异性IIS型限制性酶结合位点，其中→代表该识别位点布置成按该位点的3'方向切割，并且←代表位点代表该识别位点布置成按该位点的5'方向切割。BbsI→位点切割所编码的Kozak序列的5'以产生突出端*1。BsaI←位点发生切割，以在NotI 5'片段内部产生5'NotI突出端。在装配V-C入门载体时，突出端*1和5'NotI突出端最终分别与消化的V-C入门载体骨架的突出端*1’和消化的C克隆性片段的3'NotI突出端连接。NotI 5'片段代表NotI识别序列的6核苷酸5'片段，其中NotI充当运行TORES时消除亲本V-C入门载体的负向选择标记。完整的NotI识别位点用C克隆性片段提供的3'NotI片段重构。V-区段代表由最终V-C入门载体待编码的TCR V基因区段，并且从给定V区段的ATG起始密码子至定义CDR3区域边界的V区段最末Cys密码子编码。BsaI←位点是运行TORES系统期间用以重构全长TCR ORF的IIS型限制性酶识别序列。BsaI酶的作用，其中该位点布置成以5'方向切割，导致在V区段的3'末端产生突出端其涵盖每个V区段的最末Cys密码子的三个核苷酸和这个Cys密码子之前的密码子的第三核苷酸。这种突出端在给定的TORES集合中在全部V区段之间均标准化。最终在运行TORES系统时，V区段3'处的突出端/>与odeCDR3的5'处的突出端/>连接，以重构全长TCR ORF。全部sp均指添加一个或多个核苷酸，以在IIS型识别序列和靶突出端序列之间产生正确间距，或以隔开NotI识别位点和切割位点以便有效发挥作用。
图6.构建V-C入门载体的C克隆性片段的布局
描述了用来如实施例1至4中所述那样装配用于人TRA和TRB TCR链的TORES的V-C入门载体的C克隆性片段的示意图。
C克隆性片段在5'和3'末端旁侧分布有独特的引物结合序列以促进PCR介导的克隆性片段扩增。BbsI位点代表装配V-C入门载体时使用的特异性IIS型限制性酶结合位点，其中→代表该识别位点布置成按该位点的3'方向切割，并且←代表位点代表该识别位点布置成按该位点的5'方向切割。BbsI→位点发生切割，以在NotI 3'片段内部产生3'NotI突出端。BsaI←位点切割C区段的终止密码子的3'，以在C区段的3'末端产生突出端*2。在装配V-C入门载体时，突出端*2和3'NotI突出端最终分别与消化的V-C入门载体骨架的突出端*2’和消化的V克隆性片段的5'NotI突出端连接。NotI 3'片段代表NotI识别序列的6核苷酸3'片段，其中NotI充当运行TORES时消除亲本V-C入门载体的负向选择标记。完整的NotI识别位点用V克隆性片段提供的5'NotI片段重构。
C-区段代表由最终V-C入门载体待编码的TCR C基因区段，并且从C基因区段的第一Glu密码子的5'胞嘧啶残基至终止密码子编码。BsaI→位点是运行TORES系统期间用以重构全长TCR ORF的IIS型限制性酶识别序列。BsaI酶的作用，其中该位点布置成以3'方向切割，导致在C区段的5'末端产生突出端这种突出端在给定的TORES集合中全部C区段之间均标准化。最终在运行TORES系统时，C区段5'处的突出端/>与J供体载体的3'C部分处的突出端/>连接，以重构全长TCR ORF。全部sp均指添加一个或多个核苷酸，以在IIS型识别序列和靶突出端序列之间产生正确间距，或以隔开NotI识别位点和切割位点以便有效发挥作用。
图7.构建V-C入门载体的V-C入门载体骨架的布局
描述了用来如实施例1至4中所述那样装配用于人TRA和TRB TCR链的TORES的V-C入门载体组装的V-C入门载体骨架的示意图。
环状质粒DNA含有复制起点(Ori)和正向选择标记#1。这种选择标记用于装配期间分离V-C入门载体骨架的克隆和V-C入门载体时选择转化的宿主，并且还用于TORES运行期间选择含有全长TCR ORF的载体。5'和3'遗传元件编码目标元件，其中所述目标元件置于通过TORES运行产生全长TCR ORF后的最终TCR ORF侧部。5'遗传元件可能代表驱动TCR转录物表达的哺乳动物启动子元件，并且3'遗传元件可能代表转录终止子序列。ACC65I位点代表一个限制性酶识别序列，其中Acc65I酶的作用导致突出端*1’产生。在装配V-C入门载体期间，这个突出端*1’与消化的V克隆性片段中的突出端*1连接。XbaI位点代表一个限制性酶识别序列，其中XbaI酶的作用导致突出端*2’产生。在装配V-C入门载体期间，这个突出端*2’与消化的C克隆性片段中的突出端*2连接。Sp指添加核苷酸以隔开Acc65I识别位点和XbaI识别位点，以便两种酶高效发挥作用。
图8.J接受盒片段的布局
描述了在如实施例2和3中所述那样装配用于人TRA和TRB TCR链的TORES的J供体载体时使用的J接受盒片段的示意图。J接受盒片段插入J供体骨架中，以产生J接受盒载体。
通过以下方式产生J接受盒片段：使两个互补性寡核苷酸复性以产生在5'和3'末端具有4核苷酸单链突出端的线性双链DNA构建体，所述突出端用于将片段插入J供体载体骨架。在J接受盒片段5'末端的突出端*3与消化的J供体载体骨架的突出端*3'连接，而在3'末端的突出端*4与消化的J供体载体骨架的突出端*4’连接。
BsaI位点代表在运行TORES期间用以装配全长TCR ORF的IIS型限制性识别位点。BsaI←位点定向成以5'方向切割，并且作用于C部分序列，以在3'C部分产生突出端BsaI→位点最终作用于J供体载体的J区段部分，以在J区段部分的5'末端产生突出端/>BsaI→元件还含有突出端*5，其中通过装配J供体载体期间BbsI作用于BbsI←位点，产生所述突出端。
BbsI位点代表用以装配J供体载体的IIS型限制性识别位点。BbsI←位点切割BsaI→元件以产生突出端*5，而BbsI→位点切割C部分的5'末端以产生突出端*6。突出端*5和突出端*6最终分别与J区段部分的突出端*5'和突出端*6’连接。
C部分代表目标C基因区段的小部分，所述的小部分允许运行TORES期间标准化产生无回文突出端。最终在J区段部分的3'末端携带这种C部分，并且形成序列的部分，其中在运行TORES时，所述的部分与消化的V-C入门载体携带的C区段连接以产生全长TCR ORF。
NotI位点代表在产生J供体载体期间用来消除亲本J接受盒载体的负向选择标记。
全部sp均指添加一个或多个核苷酸，以在IIS型识别序列和靶突出端序列之间产生正确间距，或以隔开NotI识别位点和切割位点以便有效发挥作用。
图9.J供体骨架的布局
描述了在如实施例2和3中所述那样装配用于人TRA和TRB TCR链的TORES的J供体载体时使用的J供体载体骨架的示意图。J接受盒片段插入J供体骨架中，以产生J接受盒载体。
环状质粒DNA含有复制起点(Ori)和正向选择标记#2。这种选择标记用于装配期间分离J供体载体骨架的克隆和J供体载体时选择转化的宿主。重要地，这种正向选择标记区别于V-C入门载体内部的正向选择标记#1，从而运行TORES期间亲本J供体载体，在依据#1的正向选择下消除，以产生V-C入门载体骨架背景下的全长TCR ORF。
EcoRI位点代表一个限制性酶识别序列，其中EcoRI酶的作用导致突出端*3'产生。在装配J接受盒载体期间，这个突出端*3'与复性的J接受盒片段中的突出端*3连接。XboI位点代表一个限制性酶识别序列，其中XboI酶的作用导致突出端*4’产生。在装配J接受盒载体期间，这个突出端*4’与复性的J接受盒片段中的突出端*4连接。Sp指添加核苷酸以隔开Acc65I识别位点和XbaI识别位点，以便两种酶高效发挥作用。
图10.J接受盒载体的布局
描述了在如实施例2和3中所述那样装配用于人TRA和TRB TCR链的TORES的J供体载体时使用的J供体载体骨架的示意图。通过将J接受盒片段插入J供体骨架中，产生J接受盒载体。
环状质粒DNA含有复制起点(Ori)和正向选择标记#2。这种选择标记用于装配期间分离J供体载体骨架的克隆和J供体载体时选择转化的宿主。重要地，这种正向选择标记区别于V-C入门载体内部的正向选择标记#1，从而亲本J供体载体运行TORES期间，在依据#1的正向选择下消除，以产生V-C入门载体骨架背景下的全长TCR ORF。
BsaI位点代表在运行TORES期间用以装配全长TCR ORF的IIS型限制性识别位点。BsaI←位点定向成以5'方向切割，并且作用于C部分序列，以在3'C部分产生突出端BsaI→位点最终作用于J供体载体的J区段部分，以在J区段部分的5'末端产生突出端/>BsaI→元件还含有突出端*5，其中通过装配J供体载体期间BbsI作用于BbsI←位点，产生所述突出端。
BbsI位点代表用以装配J供体载体的IIS型限制性识别位点。BbsI←位点切割BsaI→元件以产生突出端*5，而BbsI→位点切割C部分的5'末端以产生突出端*6。突出端*5和突出端*6最终分别与J区段部分的突出端*5'和突出端*6’连接。
C部分代表目标C基因区段的小部分，所述的小部分允许运行TORES期间标准化产生无回文突出端。最终在J区段部分的3'末端携带这种C部分，并且形成序列的部分，其中在运行TORES时，所述的部分与消化的V-C入门载体携带的C区段连接以产生全长TCR ORF。
NotI位点代表在产生J供体载体期间用来消除亲本J接受盒载体的负向选择标记。
全部sp均指添加一个或多个核苷酸，以在IIS型识别序列和靶突出端序列之间产生正确间距，或以隔开NotI识别位点和切割位点以便有效发挥作用。
图11.J区段部分的布局
描述了在如实施例2和3中所述那样装配用于人TRA和TRB TCR链的TORES的J供体载体时使用的J区段部分的示意图。将J区段部分插入J接受盒载体以产生J供体载体。
使互补性单链寡核苷酸复性以形成在任意末端带单链突出端的线性双链DNA构建体，这产生J区段部分。在5'末端的突出端*5'与BbsI消化的J接受盒载体内部生成的突出端*5复性。在3'末端的突出端*6’与BbsI消化的J接受盒载体内部生成的突出端*6复性。
J区段部分代表目标J基因区段序列。取决于构建的J供体载体的形式(即短或长)，差异地确定J区段部分的5'边界。对于短J供体载体，J区段部分的5'边界定义为用来限定全长TCR ORF的J部分和CDR3部分之间典型边界的Phe-Ala/Gly基序或Trp-Gly基序。对于长J供体载体，J区段部分的5'边界延长到Phe-Ala/Gly基序或Trp-Gly基序5'的十个至十二个核苷酸。这延长了由J供体载体编码的总体TCR ORF的部分，并且反过来缩短运行TORES时为构建全长TCR ORF所要求的odeCDR3的长度。在J区段部分的3'末端编码一个单一腺嘌呤残基(A)，其代表C片段的第一核苷酸。这个腺嘌呤从J接受盒载体排除。
图12.验证重构的模型TCR TRA/TRB对的特异性
用如实施例7中所述的TORES系统重构对HLA-A2*01限制性HCMV pp65衍生抗原特异的模型TRA/TRB TCR链对。将两种TRA和TRB质粒产物瞬时染入组成型表达CD3组分、但缺少TCR TRA链和TRB链内源性表达的人细胞系。转染后48小时，将细胞用针对CD3、TCRα/β和特异性HLA-A2*01-NLVPMVATV四聚体的抗体染色并且通过流式细胞术分析。模型TCR对呈递在细胞表面上，如通过CD3抗体和TCRα/β抗体阳性染色所示(左侧，顶部小图)。该模型TCR对还展示HLA-A2*01–NLVPMVATV四聚体试剂阳性染色(左侧，底部小图)，指示预期的结合特异性。还平行转染一个无关的TRA和TRB质粒构建对(居中组图)，同时平行转染空载体(最右侧组图)。不相关TCR呈递在细胞表面上，如CD3抗体和TCRα/β抗体阳性染色所示(居中，顶部小图)，但显示不与HLA-A2*01-NLVPMVATV四聚体试剂结合(居中，底部小图)。空载体转染的细胞不展示CD3抗体或TCRα/β抗体染色，或HLA-A2*01-NLVPMVATV四聚体试剂染色。
图13.从人外周血鉴定和重构TCR TRA/TRB链对集合的作业流程
为了展示TORES系统重构从人类标本捕获的先天TCR TRA/TRB链对的用途，通过从单细胞分选来自人PBMC级分的四聚体阳性细胞采集序列信息，生成对HLA-B*07:02限制性HCMV pp65抗原(TPRVTGGGAM)特异的TCR集合。实施例8中描述这种过程。
i)来自具有HLA-B*07:02等位基因的供体的PBMC级分用HLA-B*07:02-TPRV四聚体试剂染色。通过FACS，将显示四聚体阳性染色的单个CD8+ T细胞沉积入单一PCR管。
ii)含有单个细胞管经历具有在TRA链和TRB链的全部已表达可变基因区段和恒定基因区段中锚定的引物集合的逆转录反应。
iii)用内部引物集合，对逆转录产物进行巢式PCR反应，对于TRA链和TRB链而言，所述内部引物仍独立地锚定在全部已表达的V基因区段和C基因区段中。
iv)使巢式PCR产物经历Sanger测序
v)将PCR产物序列针对人种系TCR基因区段文库比对，以确定每条扩增的TCR链的V和J(和C)基因区段利用情况。测定从5'Cys密码子起至3'Phe-Ala/Gly或Trp-Gly基序的CDR3序列。
vi)从TORES文库中选择V-C入门载体，其对应于每条待重构的TRA链和TRB链的已确定V和C基因区段利用情况。
vii)从TORES文库中选择J供体载体，其对应于每条待重构的TRA链和TRB链的已确定J基因区段利用情况。
viii)合成odeCDR3，其对应于从每条待重构的TRA链和TRB链确定的CDR3区。
ix)为每个待重构的TRA和TRB TCR组装独立的限制性酶(RE)/连接酶循环反应，其含有选定的V-C入门载体、J供体载体和合成的odeCDR3。
x)将RE/连接酶循环反应产物转化入细菌并接受针对第一正向选择标记(即V-C入门载体骨架)的抗生素选择。
xi)增殖克隆并通过Sanger测序最终全长TCR ORF来确认。
图14.验证从人外周血捕获并用TORES重构的TCR TRA/TRB链对集合的特异性
从人外周血捕获一个含六个TCR TRA/TRB链对的集合并且通过图13中略述及实施例8中描述的工作流程重构。六个TCR对具有针对用来分离单个CD8+ T细胞的B*07:02-TPRV四聚体试剂的预期特异性。将六个已捕获对、无关TCR链对和空载体对照各自转染入表达CD3组分、但缺少TCR TRA链和TRB链内源性表达的人细胞系。转染后48小时，流式细胞分析用来以针对CD3、TCR α链和β链的抗体着染细胞，并且通过特异性HLA-B*07:02-TPRV四聚体试剂确认重构和表达的TCR的特异性。数据作为等值线图呈现。每幅小图在X-轴上显示CD3信号并且在Y-轴上显示HLA-B*07:02-TPRV四聚体。每幅小图右侧底部的插图是CD3阳性细胞的HLA-B*07:02-TPRV四聚体信号对CD3阴性细胞的比率，作为四聚体染色程度的任意单位。与无关对照TCR对相比，呈递的全部六条TCR链对均显示某种程度的特异性四聚体染色。
图15.运行TORES以产生CDR3多样化的TCR链
描述了用来产生CDR3插入物多样化的全长TCR链时TORES的示意图。以V-J-C利用情况和定义的CDR3区序列限定亲本TCR。将相应的单一V-C入门载体(框i)和单一J供体载体(框ii)置于反应管中。合成了具有改变已编码氨基酸序列的明确位置核苷酸简并性和/或点诱变的odeCDR3汇集物(框iii)。这种CDR3汇集物可以在确定的odeCDR3构架的边界内部包含完全随机化的CDR3序列，从而产生具有种系V-J-C利用情况的‘合成性’全长TCR ORFsCDR3。将这三个组分(框i、ii和iii)连同适宜的限制酶和连接酶一起合并入单一反应。反应循环以单一步骤在V-C入门载体骨架背景(框iv)下产生众多重构的变异全长TCR ORF，与包含的变异odeCDR3的数目成正比。
图16.使用有限CDR3简并性单轮次TCR链多样化生产生具有广谱靶亲和力的TCR集合
根据图15中呈现和如实施例9中所述的方案，如实施例7中所述的对HCMV pp65衍生抗原特异的模型TRA/TRB TCR链对的TRA链历经CDR3多样化循环。用4倍核苷酸简并性在3个独立位置合成TRA链odeCDR3，从而改变这三个位置的密码子选择。所得的反应产物含有64个全长TRA链变体，包括亲本序列。对64条TRA链的每一者克隆并序列确认。
A)将64个TRA链质粒的每一者连同亲本TRB质粒一起转染入组成型表达CD3组分、但缺少TCR TRA链和TRB链内源性表达的人细胞系。转染后48小时，将细胞用针对CD3的抗体并用HLA-A2*01-NLVPMVATV四聚体试剂染色并且通过流式细胞术分析。标出CD3+群体对CD3-群体的HLA-A2*01-NLVPMVATV四聚体信号的平均荧光强度(MFI)比率，作为每种TCR链对变体的结合强度的指示。箭头指示与亲本TRA相对应的数据点。椭圆指示在图谱任一端处的高结合变体和非结合变体。
B)表中用CD3+群体对CD3-群体的HLA-A2*01-NLVPMVATV四聚体信号的MFI比率展示每种TRA链变体，并且三个多样化位置(位置1、2和3)中每个位置处存在的氨基酸以单字母代码展示。箭头指示与亲本TRA相对应的数据点。括号指示在图谱任一端处的高结合变体和非结合变体。
图17.运行TORES以产生V-区段多样化的TCR链
描述了用来产生具有多样化V-区段利用情况的全长TCR链时TORES的示意图。以V-J-C利用情况和定义的CDR3区序列限定亲本TCR。将相应的单一J供体载体(框ii)置于反应管中，将所合成以对应于亲本CDR3区序列(框iii)的单一odeCDR3同样置于反应管中。还向反应管添加选择的V-C入门载体，其与产物V-区段多样化的全长TCR ORF产物中所需的V-区段和C-区段相对应(框i)。将这三个组分(框i、ii和iii)连同适宜的限制酶和连接酶一起合并入单一反应。反应循环以单一步骤在V-C入门载体骨架背景下产生众多重构的变异全长TCR ORF，与包含的变异V-C入门载体的数目成正比(框iv)。
图18.运行TORES以产生J-区段多样化的TCR链
描述了用来产生具有多样化J-区段利用情况的全长TCR链时TORES的示意图。以V-J-C利用情况和定义的CDR3区序列限定亲本TCR。将相应的单一V-C入门载体(框i)置于反应管中，将所合成以对应于亲本CDR3区序列的单一odeCDR3(框iii)同样置于反应管中。还向反应管添加选择的J供体，其与产物J区段多样化的全长TCR ORF产物中所需的J区段相对应(框ii)。将这三个组分(框i、ii和iii)连同适宜的限制酶和连接酶一起合并入单一反应。反应循环以单一步骤在V-C入门载体骨架背景下产生众多重构的变异全长TCR ORF，与包含的变异J供体载体的数目成正比(框iv)。
图19.运行TORES以产生V/J-区段多样化的TCR链
描述了用来产生具有多样化V-区段和J-区段利用情况的全长TCR链时TORES的示意图。以V-J-C利用情况和定义的CDR3区序列限定亲本TCR。合成相应的单一odeCDR3以对应于亲本CDR3区序列(框iii)。还向反应管添加V-C入门载体和J供体载体选项，其与产物V/J-区段多样化的全长TCR ORF产物中所需的V-(C-)区段和J-区段组合相对应(框ii)。将这三个组分(框i、ii和iii)连同适宜的限制酶和连接酶一起合并入单一反应。反应循环以单一步骤在V-C入门载体骨架背景下产生众多重构的变异全长TCR ORF，与从所包含的载体中可能的V-C和J供体载体组合数目成正比(框iv)。
图20.TORES2 V-C和V-C入门载体的遗传特征的示意图。
描述了具有作为已标记框描述的最低要求遗传元件的V-Cα(a)和V-Cβ(b)入门载体的环化质粒示意图。Kozak，指在起始高效翻译中发挥作用的共有序列。V-区段，指编码某比例的TCR可变种系ORF、或突变/人造ORF的选定序列。IIS型#1←，指如此定向，从而这类酶以5'方向切割的第一IIS型限制性酶结合位点。IIS型#1→，指如此定向，从而这类酶以3'方向切割的第一IIS型限制性酶结合位点。-ve选择#1，指负向选择元件，其旨在全长TCR重建反应或后续选择步骤期间损坏携带该序列的质粒。C-区段，指编码某比例的TCR恒定种系ORF、或突变/合成性ORF的选定序列。IIS型#2←，指如此定向，从而这类酶以5'方向切割的第二IIS型限制性酶结合位点。该酶与第一IIS型不同。IIS型#2→，指如此定向，从而这类酶以3'方向切割的第二IIS型限制性酶结合位点。该酶与第一IIS型不同。-ve选择#2，指负向选择元件，其旨在装配全长双向TCR ORF载体期间损坏携带该序列的质粒。-ve选择#2与第一-ve选择不同。+ve选择#1，指双组分系统的第一正向选择标记，其用来向携带载体的生物传输选择优势，并且与第二(J供体)载体组分的正向选择标记不同(参见图3)。Ori，指用于相容性宿主内部增殖质粒的复制起点。5′遗传元件，指任何所需的基因元件，其提供为下游应用重构的全长TCR所需的属性，并且应当位于重构的全长TCR的5'，例如，RMCE元件。3′遗传元件，指任何所需的基因元件，其提供为下游应用重构的全长TCR所需的属性，并且应当位于全长TCR ORF的3'，例如，第二RMCE元件。
图21.双向终止子供体(BiT供体)载体的遗传特征的质粒示意图。
描述了具有作为已标记框描述的最低要求遗传特征的双向终止子供体载体的环化质粒示意图。双向终止子元件(T-T)，指编码双向终止子的DNA序列。IIS型#2→，指如此定向，从而这类酶以3'方向切割的第二IIS型限制性酶结合位点。IIS型#2←，指如此定向，从而这类酶以5'方向切割的第二IIS型限制性酶结合位点。+ve选择#2，指双组分系统的第一正向选择标记，其用来向携带载体的生物传输选择优势，并且与第一载体组分的正向选择标记不同(参见图20)。Ori，指用于相容性宿主内部增殖质粒的复制起点。
图22.对重建配对TRA和TRB载体的双向两组分载体系统的遗传输入、副产物、中间体和产物的一般性说明。
描述了TRA(a)、TRB(b)和双向终止子供体载体(c)，当这三种组分合并入具有第二IIS型限制性酶和连接酶的单一反应时，生成三种反应副产物(d、e和f)、三种反应中间体(g、h和i)和一种反应产物(j)。将输入载体和双组分系统的产物作为环化质粒示意图描述，所述环化质粒示意图具有作为已标记框描述的遗传元件；代表副产物或中间体的开放质粒载体是非环化质粒示意图，其具有作为已标记框描述的遗传元件；并且将线性DNA描述为一系列描述遗传元件的已标记框。
a)如20a图中所示的V-Cα入门载体背景下重构的TRA ORF。
b)如20b图中所示的V-Cβ入门载体背景下重构的TRA ORF。
c)如图21中所示的BiT供体载体
d)用IIS型#2限制性酶消化TRA载体(a)产生了含有–ve选择元件#2和IIS型#2←和IIS型#2→结合位点的线性DNA TRA载体反应副产物。
e)用IIS型#2限制性酶消化TRB载体(b)产生了含有5'和3'遗传元件、IIS型#2→和IIS型#2←元件、–ve选择元件#2、+ve选择元件#1和复制起点元件的线性DNA TRB载体反应副产物。
f)用IIS型#2限制性酶消化双向终止子供体载体(c)产生了非环化质粒副产物，其含有亲本质粒的全部载体元件，不包括切除的双向终止子片段中间体(i)。
g)用IIS型#2限制性酶消化TRA载体(a)产生了非环化质粒中间体，其含有亲本质粒的全部遗传元件，不包括切除的线性DNA TRA载体反应副产物(d)中携带的那些遗传元件。消化已经额外地产生两个单链DNA突出端：突出端和突出端/>突出端/>与双向终止子中间体(i)中的突出端/>相容。突出端/>与TRB片段中间体(h)中的突出端/>相容。
h)用IIS型#2限制性酶消化TRB载体(b)产生了含有C区段、C部分、J区段、CDR3、V区段和Kozak序列的线性DNA片段，其旁侧分布有单链DNA突出端：突出端和突出端突出端/>与双向终止子中间体(i)中的突出端/>相容。突出端/>与开放TRA载体中间体(g)中的突出端/>相容。
i)用IIS型#2限制性酶消化双向终止子供体载体(c)产生了含有双向终止子的线性DNA片段中间体。消化已经额外地产生两个单链DNA突出端：突出端和突出端突出端/>与开放TRA载体中间体(g)中的突出端/>相容。突出端/>与TRB片段中间体(h)中的突出端/>相容。
j)连接全部三个相容性单链DNA突出端产生作为环化质粒的双向配对TRA和TRB载体。这种质粒含有亲本TRA载体(a)的全部遗传元件，不包括切除的TRA载体反应副产物(d)。此外，全长TCR ORF载体并入TRB片段中间体(h)和双向终止子中间体(i)。箭头指示相容性单链DNA突出端和/>之间连接的近似点。连接点/>包含分别由TRA载体反应中间体(a)和双向终止子中间体(i)供应的/>和/>元件。连接点/>包含分别由TRB片段中间体(h)和双向终止子片段(i)供应的/>和/>元件。连接点/>包含分别由TRA载体反应中间体(a)和TRB片段反应中间体(h)供应的/>和/>元件。
图23验证使用TORES2重构的模型TCR TRA/TRB对的特异性
用如实施例11中所述的TORES2系统重构对HLA-A*02:01限制性抗原特异的模型TRA/TRB TCR链对。双向TRA/TRB供体载体用来使TCR ORF稳定整合入人细胞系，所述人细胞系组成型表达CD3组分，但缺少TCR TRA链和TRB链内源性表达的人细胞系，并且还编码与包含于已经由原始V-Cα入门载体贡献的产物供体载体内部的RMCE位点相容的基因组接受位点。通过CD3复合体表面染色，确定由TORES2产生的重构的全长配对TRA和TRB供体载体的功能，并且通过特异性HLA-A*02:01-SLLMWITQV四聚体染色确认重构和表达的TCR的预期特异性。
a)模型TCR对整合入工程化TCR呈递细胞系的基因组中，所述的呈递细胞含有与供体载体匹配的基因组接受位点。这个基因组接受位点以反平行布局含有驱动两个独立荧光标记(红色荧光蛋白RFP和蓝色荧光蛋白BFP)的启动子元件，所述启动子元件由与实施例11中描述的TRA/TRB TORES2的最终TRA/TRB供体载体产物相似的双向终止子元件间插。一旦转染和接受细胞长出，实施流式细胞分析以观察这些荧光报道分子的持久性。基因组接受位点(RFP-BFP-)的不存在因此显示细胞已经成功地整合TRA/TRB供体载体。而不整合TRA/TRB供体载体的细胞展示基因组接受位点的存在(RFP+BFP+)。大部分细胞已经成功地将TRA/TRB供体载体序列整合入基因组接受位点。
b)对a)的RFP-BFP-群体和RFP+BFP+群体各自设门并且在第二叠加直方图中再显示。整合了双向构建体的细胞还显示CD3抗体染色阳性，显示TCR在细胞表面上表达(浅色直方图)。未整合双向构建体的细胞不能用CD3抗体染色(深色直方图)。
c)和d)对如a)和b)中那样分析的RFP-BFP-细胞设门并且再显示为等值线图。平行细胞样品已经用HLA-A*02:01-SLLMWITQV四聚体试剂染色c)，或不染色d)，其中，c)中的四聚体/CD3双阳性表示重构和整合的TCR ORF对的预期特异性。
材料和方法
DNA测序
实施例中所提到的全部测序均通过Sanger方法实施，并由瑞典GATC Biotec AB实施。
DNA合成
实施例中所提到的全部DNA合成均由比利时Integrated DNAtechnologies BVBA实施。
将>125bp的DNA片段合成为线性双链DNA分子，作为‘gBlock基因片段’产物。
将15-60nt的DNA片段合成为单链DNA分子，作为‘定制寡核苷酸片段’产物。
将61-124nt的DNA片段合成为单链DNA分子，如‘Ultramer DNA寡核苷酸片段’产物。
载体文库装配和克隆
实施例中描述的载体构建包括本领域技术人员熟知的多种方法，并且实施例1至3中详细描述具体的反应组成。以下关键材料用于所描述的方法中：
装配编码CDR3的寡核苷酸双链体(odeCDR3)
通过使部分互补的单链寡核苷酸复性，常规地装配odeCDR3。实施例6中提供反应组成和条件的详细描述。以下关键材料用于所描述的方法中：
产品 供应商 供应商编号
T4连接酶缓冲液10x New England BioLabs B0202S
T4 PNK New England BioLabs M0201L
TCR重构
实施例7至9中详述了运行TORES以重构全长TCR ORF。以下关键材料用于所描述的方法中：
荧光激活的细胞分选法(FACS)
通过FACS分选单个HLA-多聚体阳性CD8+ T细胞用于TCR链扩增和测序。使用BDInflux仪，通过标准细胞分选方法学实现这点。简而言之，将细胞用HLA-多聚体试剂在冰上染色10分钟，随后其用CD3抗体和CD8抗体染色，作为CD8+ T细胞的标志物。将具有CD3+CD8+多聚体+信号的细胞分选至事先加载有5μL无核酸酶的水的PCR平板中。将标本急冻直至后续加工。以下关键材料用于所描述的方法中：
产品 供应商 供应商编号
CMV-B.07:02-TPRVT-pp65(PE) Immudex WH2136
抗CD8(克隆RPA-T8)(BV510) BD 563256
抗CD3(克隆SK7)(APC-H7) BD 560176
来自单一T细胞的TCR α链和β链测序
使FACS单一分选的T细胞经历一个两步骤扩增过程，该过程需要针对每种TRA和TRB的V区特异性引物集合，随后进行配对巢式PCR反应，所述配对巢式PCR反应产生TRA扩增子和TRB扩增子供如实施例8中所述的序列分析。先前描述了这种方法(Han等人,NatBiotechnol.2014 32(7):684-692)。以下材料用于所述方法中：
实施例1
用于人先天TRA组库的TRA V-C入门载体文库的设计和装配
TORES由给定TCR链的V-C入门载体文库和J供体载体文库组成。与待插入选择的V-J-C背景中的目标odeCDR3序列组合时，可以重构全长TCR ORF。通过变动odeCDR3序列特征和/或V/J/C选择，这个重构步骤还可以代表TCR ORF工程化作业流程中的序列多样化步骤。在本实施例中，描述了含有人天然TRA V-C序列组库的TRA V-C入门载体文库的设计和装配。这是图2中描述的一般性V-C入门载体类型的实施例。
TRA V-C载体文库需要的DNA组分是：
I.用于人类基因组中编码的每种有功能TRA V基因区段的TRA V克隆性片段
II.单一TRA C克隆性片段
III.V-C入门载体骨架
在本实施例中，合成TRA V和TRA C克隆性片段并用来在单一限制性酶和连接酶反应中装配入目标V-C入门载体骨架。在本实施例中，目标V-C入门骨架设计成允许重构的TRAORF在哺乳动物细胞内部瞬时表达。
在本实施例中，使用IIS型限制性酶BbsI，构建TRA V-C入门载体文库。在完整TORES运行时用来重构全长TRA ORF的IIS型限制性酶是BsaI。
人造TRA V克隆性片段的设计
图5中描述本实施例中遗传元件TRA V克隆性片段的布局。
TRA V克隆性片段的每个末端编码20个核苷酸的标准化5'和3'引物结合DNA序列，以借助PCR扩增整个片段。
临近于5′引物结合，编码一个BbsI IIS型限制性酶结合位点，其中BbsI结合位点的方向引导BbsI酶切割其识别序列3′的DNA。BbsI酶活性产生的突出端由突出端*1编码。这个突出端设计成允许用V-C入门载体骨架的臂进行连接酶依赖性定向克隆。
在TRA V基因区段中ATG起始密码子的5′，编码一个共有性kozak序列用于最终重构和表达的TRA mRNA的高效翻译起始。在本实施例中，每个TRA V区段编码从TRA V区段的甲硫氨酸起始残基直至其最末半胱氨酸(Cys)的全部氨基酸。通常认为这个Cys残基是TRA可变基因区段的边界，在天然存在的重组和有功能的TRA链中罕见其缺失。根据需要，已经编辑天然的人TRA V共有序列以移除在TORES装配操作或重构操作范围内所用的任何限制性酶的识别序列，并且还移除下游应用中使用的任何酶的识别序列。
在TRA V区段的3'末端，编码了BsaI IIS型限制性酶结合位点BsaI←。BsaI结合位点的方向引导BsaI酶切割其识别序列5′的DNA。所产生的突出端序列旨在涵盖V区段元件的最末半胱氨酸密码子和该半胱氨酸之前的氨基酸密码子的第3核苷酸。因此，BsaI作用于设计的序列产生在TRA V区段的3'末端的TRA V Cys突出端在本实施例中，这个Cys-突出端/>在包含的全部TRA V区段之间标准化以简化和统一化克隆策略。必要时，改变编码TRAV遗传元件的核苷酸，以编码这种标准化突出端，但不改变翻译的氨基酸序列。在全长TRA重构反应期间利用这个BsaI←位点。
在本实施例中，V-C入门载体负向选择标记是NotI限制性酶结合位点。为了构建NotI结合位点，当TRA V克隆性片段和TRA C克隆性片段连接在一起时，两个对半位点合并。TRA V克隆性片段编码六个核苷酸的NotI 5′区段。
在3′引物结合序列的5'末端，编码第二BbsI限制性位点，其指导BbsI酶切割其识别序列BbsI←的5′的DNA。BbsI作用于设计的序列因此产生了4个核苷酸的突出端，NotI 5′突出端，其设计成与TRA C DNA片段上产生的突出端互补并在连接时重构NotI结合位点。
Sp指向TRA V克隆性片段的特定点添加的核苷酸，旨在IIS型限制性酶结合位点和切割位点毗连时，实现对这类位点的正确间隔。侧置于NotI限制性酶结合位点序列的Sp块已经用来适当地隔开NotI结合位点和切割位点，以便有效发挥作用。核苷酸选择考虑了潜在影响BsaI结合位点的DAM甲基化。
在人天然TRA链的这个实施施中，将TRA V克隆性片段的完整DNA序列作为SEQ0001至SEQ0046提供。这些序列包括5'引物结合序列和3'引物结合序列。
人造TRA C克隆性片段的设计
图6中描述本实施例中遗传元件TRA C克隆性片段的布局。
TRA C克隆性片段的每个末端编码20个核苷酸的标准化5'和3'引物结合DNA序列，以借助PCR扩增整个片段。
临近于5′引物结合序列，编码一个BbsI限制性酶识别位点，从而BbsI酶将切割其识别序列BbsI←的3′的DNA。
TRA C克隆性片段编码六个核苷酸的NotI 3′区段，其补全将构成V-C入门载体负向选择标记的NotI识别位点。相邻的BbsI→限制性位点作用于NotI 3′元件以产生四个核苷酸的NotI 3′突出端。这个突出端设计成与TRA V DNA片段上产生的NotI 5'突出端互补并且在装配V-C入门载体时重构完整的NotI结合位点。
在NotI 3′元件的3'末端，TRA C克隆性片段编码BsaI限制性酶结合位点，BsaI→。BsaI结合位点的方向引导BsaI酶切割其识别序列5′的DNA。所得到的突出端序列设计成始于TRA C基因片段的第一胞嘧啶，TRA C突出端在全长TRA重构反应期间利用这个BsaI→位点。BsaI→酶作用于V-C入门载体中编码的TRA C区段，以在重构反应期间产生必要的TRA C突出端/>在本实施例中，TRA C克隆性片段中包含从第一谷氨酰胺密码子5′的胞嘧啶残基直至终止密码子的共有TRA C序列。
在3′引物结合序列的5'，编码一个BbsI限制性酶识别序列，BbsI←。BbsI结合位点的方向引导BbsI酶切割其识别序列5′的DNA。BbsI酶活性产生的突出端由突出端*2编码。这个突出端的设计允许装配期间用V-C入门载体骨架的臂进行连接酶依赖性定向克隆。
Sp指向TRA C克隆性片段的特定点的核苷酸添加，旨在IIS型限制性酶结合位点和切割位点毗连时，实现对这类位点的正确间隔。侧置于NotI限制性酶结合位点序列的Sp块已经用来适当地隔开NotI结合位点和切割位点，以便有效发挥作用。选择被视为潜在影响BsaI结合位点的DAM甲基化的核苷酸。
在人天然TRA链的这个实施例中，将TRA C克隆性片段的完整DNA序列作为SEQ0047展示。这个序列包括5'引物结合序列和3'引物结合序列。
设计V-C入门载体骨架用于哺乳动物细胞瞬时表达重构的TRA ORF在本实施例中，V-C入门载体骨架衍生自pMA质粒。它编码Col E1复制起点，ori，连同抗生素耐药性β-内酰胺酶基因，正向选择#1。β-内酰胺酶赋予针对β-内酰胺类抗生素(如氨苄青霉素和羧苄青霉素)的青霉素基团的抗性。
如图7中所示，载体骨架编码要求的遗传元件，所述遗传元件向完整重构的TRAORF的下游应用赋予适宜的功能。在本实施例中，5′遗传元件编码CMV组成型哺乳动物启动子并且3′遗传元件编码SV40pA多聚腺苷化信号，以允许完整重构的TRA ORF在哺乳动物细胞中瞬时表达。
在本实施例中，载体骨架编码分别产生突出端*1’和突出端*2’的Acc65I和XbaI限制性酶结合位点。突出端*1’与TRA V克隆性片段内部的突出端*1互补(图5)。突出端*2’与TRA C克隆性片段内部的突出端*2互补(图6)。这些互补突出端允许TRA V和TRA C克隆性片段定向克隆到V-C入门载体骨架中。
Sp特征指在Acc65I和XbaI限制性酶识别位点之间添加的为了隔开这两个位点以高效发挥作用所需要的核苷酸。
从编码CMV组成型启动子的5′遗传元件至编码SV40pA多聚腺苷化信号的3′遗传元件的该载体骨架的DNA序列作为SEQ0048展示。
装配TRA V-C入门载体文库的方法
这种方法利用标准分子生物学技术将选择的TRA V克隆性片段(图5)和TRA C克隆性片段(图6)装配入给定的V-C入门载体骨架(图7)，以产生TRA V-C入门载体(图2)。在本实施例中，该方法在单一反应中执行限制性酶消化和连接反应。
RE消化和连接反应
100ng线性载体骨架(通过ACC65I和XbaI消化线性化)
10ng TRA V基因片段
20ng TRA C基因片段
2μl 10x NEB连接酶缓冲液
0.5μl BbsI
1μl T4 DNA连接酶
加H2O至20μl
反应条件
步骤1；在37℃，2分钟
步骤2；在16℃，3分钟
重复步骤1和步骤2，20次
50℃，5分钟
80℃，5分钟
返回室温
将所得的产物转化入针对羧苄青霉素抗性克隆接受选择的感受态大肠杆菌细胞。对分离自选定克隆的质粒测序以确定正确装配的构建体。对每个独立的V区段克隆性片段重复该方法。所产生的构建体构成TRAV-C入门载体文库，所述文库用于重构全长TRA ORF，后者稍后用于哺乳动物细胞中瞬时表达所述重构的TRA。构成TRA V-C入门载体文库的克隆的V-C片段的序列作为SEQ0049至SEQ0094展示。展示的序列包括位于可变区段的起始密码子之前的全部Kozac序列，直至C区段的终止密码子。
实施例2
用于人先天TRA组库的TRA J供体载体文库的设计和装配
TORES由给定TCR链的V-C入门载体文库和J供体载体文库组成。与待插入选择的V-J-C背景中的目标odeCDR3序列组合时，可以重构全长TCR ORF。通过变动odeCDR3序列特征和/或V/J/C选择，这个重构步骤还可以代表TCR ORF工程化作业流程中的序列多样化步骤。
在本实施例中，描述了含有人天然TRA J序列组库的TRA J供体载体文库的设计和装配。这是图3中描述的一般性J供体载体类型的实施例。
在本实施例中，构建TRA J接受盒片段并插入J供体载体骨架，以产生J接受盒载体。随后，可以将人造TRA J区段部分装配入TRA J接受盒载体，以产生J供体载体文库。这种灵活的多步骤装配方法允许快速和成本有效地工程化J供体区段特征，如J区段长度变动。
TRA J供体载体文库需要的DNA组分是：
I.TRA J接受盒片段
II.J供体载体骨架
III.TRA J接受盒载体
IV.TRA J区段部分
人造TRA J接受盒片段的设计
两个单链DNA寡核苷酸的复性用来产生接受位点盒片段，按照设计，所述接受位点盒片段在DNA片段的每个末端含有4核苷酸单链突出端：突出端*3和突出端*4。4核苷酸突出端允许连接酶依赖性定向克隆入J供体载体骨架，以产生TRA J接受盒载体，如图8中描述。
成对IIS型限制性位点，BsaI←和BsaI→位于接受位点盒DNA片段的5′和3′末端处。BsaI识别位点的方向引导BsaI酶向构建体的中心切割DNA。在TRA ORF重构方案期间通过产生突出端和突出端/>使用这些位点。突出端/>是接受盒片段中编码的TRAC部分的组分，而在克隆TRA J区段部分后限定突出端/>(参见下文)。/>
BbsI成对IIS型识别位点BbsI←和BbsI→在盒的中间附近编码并在产生合成的TRA J区段部分所包含的互补突出端时，用于装配TRAJ供体载体(参见下文)。5'BbsI位点，BbsI←，切割入BsaI位点，以在这个特征的3'末端产生突出端*5。3'BbsI位点，BbsI→，切割入TRA C部分元件，以在这个元件的5'末端产生突出端*6。这些突出端在这个构建体的BsaI和TRA C部分特征内部编码，从而避免添加会并入重构的最终TRA ORF中的非天然核苷酸。
在BbsI→酶生成的突出端和BsaI←酶生成的突出端之间的区域编码某个比例的TRA C区域，其始于TRA C基因片段(TRA C部分)的第二核苷酸。从TRA C基因片段的第二核苷酸开始的动机是因为在人TRA基因座TORES的这个实施例中，所得的突出端是TATC，并且不是回文突出端，若包括TRA C基因片段的始端(所得的突出端ATAT)，情况就是如此。应当避免回文突出端，因为它将引起两个载体末端在不插入所要求的TRA J区段部分的情况下连接。BbsI→位点的方向允许连接酶依赖的全部TRA J片段3'末端符合可读框地克隆至接受位点盒中TRA C区域的5′始端。BsaI←位点的方向允许TRA C区域的始端与剩余TRA C片段在使用完整TORES的TRA全长ORF重构方案的最终步骤中发生符合可读框的连接酶依赖性克隆。
在两个BbsI结合位点之间是酶NotI的8核苷酸识别序列。利用这个限制性位点作为减少亲本质粒克隆背景的负向选择标记。在已经进行TRA J基因片段插入后添加NotI酶时，实现这一点。因此，正确克隆TRA J基因片段的质粒将在NotI酶存在时保持环状，而并未将其NotI位点交换成TRA J基因片段的亲本质粒将线性化，这转而偏转细菌转化过程，以增殖含有完整环状TRA J片段的质粒。
Sp指向TRA J接受盒片段的特定点的核苷酸添加，旨在IIS型限制性酶结合位点和切割位点毗连时，实现对这类位点的正确间隔。侧置于NotI限制性酶结合位点序列的Sp块已经用来适当地隔开NotI结合位点和切割位点，以便有效发挥作用。已经包括额外的核苷酸以维持重构的最终全长TRA内部的正确可读框。选择被视为潜在影响BsaI结合位点的DAM甲基化的核苷酸。
在人天然TRA链的这个实施例中，将TRA J接受盒片段寡核苷酸的完整DNA序列作为SEQ0095和SEQ0096展示。列出正向(F1)和反向(R1)寡核苷酸序列。
J供体载体骨架的设计
J供体载体骨架用来插入TRA J接受盒片段，以产生TRA J接受盒载体。因此携带骨架至J供体载体文库。在产生TRA全长ORF的最终反应中，这个骨架是反应副产物(图4e)，并且因此携带如图9中所示的最少特征。
在本实施例中，J供体载体骨架编码Col E1复制起点，ori。抗生素耐药性是氨基糖苷类抗生素3'-磷酸转移酶基因，正向选择选择#2。氨基糖苷类抗生素3'-磷酸转移酶赋予针对抗生素底物(如卡那霉素、链霉素、新霉素和庆大霉素)的抗性。这种替代性正向选择用来确保在全长TCRORF重构后不选择J供体载体，其依据正向选择#1选择。
在本实施例中，载体EcoRI和XhoI限制性酶结合位点分别生成互补突出端，突出端*3'和突出端*4’。突出端*3'与TRA J接受盒片段内部所含的突出端*3互补。突出端*4’与TRA J接受盒片段内部所含的突出端*4互补。这些突出端允许定向克隆TRA J接受盒片段。
Sp块指在EcoRI和XhoI限制性酶结合位点之间添加的用于隔开这两个位点以确保高效作用的核苷酸。
在本实施例中，将J供体骨架作为SEQ0097展示。
装配TRA J接受盒载体的方法
这种方法利用标准分子生物学技术将给定的TRA J接受盒片段(图8)装配入给定的J供体载体骨架(图9)，以产生TRA J接受盒载体(图10)。所产生的TRA J接受盒载体用来插入TRA J区段部分(图11)，以构建TRA J供体载体(图3)。
首先，形成TRA J接受盒DNA片段的两种寡核苷酸必须磷酸化并复性。
反应混合物
反应条件
37℃温育1小时
95℃变性5分钟
通过将反应按照3℃/分钟缓慢冷却下来至25℃，使有义和反义寡核苷酸复性
TRA J接受盒片段和J供体载体骨架的装配连接。
反应混合物
反应条件
在25℃温育1小时
在65℃热失活10分钟
将所得的产物转化入感受态大肠杆菌细胞并针对卡那霉素抗性克隆选择。选择抗性克隆以确定正确装配的构建体。所产生的质粒是TRA J接受盒载体。在本实施例中，TRA J接受盒载体作为SEQ0098展示并在图10中描述。
人造TRA J区段部分的设计
产生TRA J接受盒载体后，必须产生插入至这种载体中的人造TRAJ区段部分。将每个TRA J序列插入独立的TRA J接受盒载体背景中，以产生TRA J供体载体文库作为人TRATORES的部分。
TRA J供体载体文库以两种不同形式存在，包含长或短的J区段部分。短TRA J区段部分编码从CDR3边界密码子起点开始的全部氨基酸。但是，考虑在TCR重排期间大部分TRAJ区段被削减到小于10个核苷酸，设计了含有较长TRA J种系区段(长TRA J区段部分)的TRAJ供体文库。较长TRA J基因片段文库的动机在于，与如果使用短TRA J片段相比，全长TRA重构将需要较短的编码CDR3寡核苷酸双链体(odeCDR3)。由于高度可变的序列作为短寡核苷酸双链体odeCDR3提供，较短CDR3寡核苷酸合成更不可能含有截短或突变的寡核苷酸污染物，并且因此减少全长TRA重建期间克隆具有序列差错的寡核苷酸双链体的可能性。另外，较短odeCDR3合成节省费用。
通过使设计成在DNA片段的每个末端含有4核苷酸单链突出端的两种单链DNA寡核苷酸复性，构建TRA J区段部分。图11中描述所产生的TRA J区段部分。
命名为突出端*5'的5'突出端与J供体接受盒载体内部通过BbsI作用所产生的突出端*5互补。命名为突出端*6’的3'突出端与J供体接受盒载体内部通过BbsI作用所产生的突出端*6互补。这对互补突出端允许TRA J区段部分定向克隆入TRA J接受盒载体。
短TRA J区段部分编码从CDR3-J边界Phe密码子起点开始的全部氨基酸。CDR3定义为旁侧分布有V区的C末端保守Cys和作为Phe-Gly/Ala保守基序之部分的J区Phe的序列。这个保守的Phe-Gly/Ala基序用来将TRA J片段的5′突出端标准化成TTTG用于下游TRA重构。本实施例中这种标准化的例外是借助Trp和Gly界定CDR3区的人TRAJ33和TRAJ38。在本实施例中，TRAJ33和TRAJ38的5′突出端是TGGG。
长TRA J区段部分设计成编码CDR3边界氨基酸N端的更多氨基酸。每个长基因片段的起始点均在氨基酸密码子的第一核苷酸处，位置距种系编码的TCR连接元件的5′末端10-12nt。每个长TRA J区段部分的5'末端保持与短TRA J区段部分的5'末端相同。
向短的和长的TRA J区段部分，添加在图11中作为A块表现的腺嘌呤至每个TRA J区段部分的3′末端。这个腺嘌呤代表TRA C片段的第一核苷酸，其从TRA J接受盒排除。
人先天J区段的这个实施例的短TRA J区段部分的序列作为SEQ0099至SEQ0210展示并且长TRA J区段部分的序列作为SEQ0211至SEQ0322展示。在两种情况下，列出正向(F1)和反向(R1)寡核苷酸序列。
装配短或长J-供体载体文库的方法
这种方法利用标准分子生物学技术将短TRA J区段部分或长TRA J区段部分(图11)克隆入TRA J接受盒载体(图10)，以产生含有短或长TRA J区段的TRA J供体载体(图3)。在本实施例中，该方法在单一反应中执行限制性酶消化和连接反应。
J供体载体文库需要的DNA组分如下：
I.短TRA J区段部分或长TRA J区段部分
II.J供体接受盒载体
磷酸化和复性两种寡核苷酸以形成TRAJ区段部分DNA片段
反应混合物
反应条件
37℃温育1小时
95℃变性5分钟
通过将反应按照3℃/分钟缓慢冷却下来至25℃，使有义和反义寡核苷酸复性
RE消化和连接反应
反应条件
步骤1；在37℃，2分钟
步骤2；在16℃，3分钟
重复步骤1和步骤2，20次
50℃，5分钟
80℃，5分钟
返回室温
添加0.5μl NotI酶并在37℃温育30分钟以线性化亲本载体。
将反应产物转化入感受态大肠杆菌细胞和并针对卡那霉素抗性选择。对选择的抗性克隆测序以确定正确装配的构建体。所得到的构建体构成TRA J供体载体文库，其编码长或短的TRA J基因片段。
对于TRA短J供体文库，所得文库的序列，不包括BsaI识别位点外部的骨架序列，作为SEQ0323至SEQ0378展示，并且对于TRA长J供体文库，作为SEQ0379至SEQ0434展示。
实施例3
用于人先天TRB组库的TRB V-C入门载体和TRB J供体载体文库的设计和装配
在以上实施例中，详述了用于人天然TRA组库的V-C入门载体和J供体载体文库的设计和装配。编码TRB组库的序列的这类载体文库的总体设计和装配实质上相同。在本实施例中，将略述旨在构建TORE或人天然TRB TCR基因座的TRB V-C入门载体和TRB J供体载体文库的设计和装配。
用于人天然TRB组库的TRB V-C入门载体文库的设计和装配
在本实施例中，描述了含有人天然TRB V-C序列组库的TRB V-C入门载体文库的设计和装配。这是图2中描述的一般性V-C入门载体类型的实施例。
TRB V-C载体文库需要的DNA组分是：
I.用于人类基因组中编码的每种有功能TRB V基因区段的TRB V克隆性片段
II.TRB C1或TRB C2克隆性片段
III.V-C入门载体骨架
与人TRA基因座相反，人TRB基因座编码两个不同的恒定区段，TRB C1和C2。因此，为了捕获两个恒定区，构建两个V-C入门载体集合，以使每个V区段与每个C1和C2区段配对。
在本实施例中，合成TRB V和TRB C克隆性片段并用来在单一限制性酶和连接酶反应中装配入目标V-C入门载体骨架。在本实施例中，目标V-C入门骨架设计成允许重构的TRBORF在哺乳动物细胞内部瞬时表达。
在本实施例中，使用IIS型限制性酶BbsI，构建TRB V-C入门载体文库。在文库运行时用来重构全长TRB ORF的IIS型限制性酶是BsaI。
人造TRB V克隆性片段的设计
如图5中所示，遗传元件TRB V克隆性片段的布局与实施例1中描述的TRA V克隆性片段的那些布局相同。
在人天然TRB链的这个实施施中，将TRB V克隆性片段的完整DNA序列作为SEQ0435至SEQ481展示。
人造TRB C克隆性片段的设计
如图6中所示，遗传元件TRB C克隆性片段的布局与实施例1中描述的TRA C克隆性片段的那些布局相同。
TRB基因座编码两个不同的C区段，并且二者均纳入TRB V-C入门载体文库的设计中。
在人天然TRB链的这个实施施中，将TRB C克隆性片段的完整DNA序列作为SEQ0482和SEQ0483展示。
装配TRB V-C入门载体文库的方法
将给定TRB V和TRB C克隆性片段装配入给定V-C入门载体骨架以产生TRB V-C入门载体的方法与实施例1中描述的方法相同。为哺乳动物细胞中瞬时表达全长TRA或TRBORF所设计的所使V-C入门载体骨架用于本实本施例中和实施例1中(SEQ0048)。
克隆的V-C片段的序列构成作为SEQ0484至SEQ0577展示的TRAV-C入门载体文库。
用于人先天TRB组库的TRB J供体载体文库的设计和装配
在本实施例中，描述了含有人天然TRB J序列组库的TRB J供体载体文库的设计和装配。这是图3中描述的一般性J供体载体类型的实施例。
在本实施例中，构建TRB J接受盒片段并插入J供体载体骨架，以产生TRB J接受盒载体。随后，可以将人造TRB J区段部分装配入TRBJ接受盒载体，以产生TRB J供体载体文库。这种灵活的多步骤装配方法允许快速和成本有效地工程化J供体区段特征，如J区段长度变动。
这种方法遵循与实施例2中描述的TRA J供体载体装配相同的方式。但是，应当指出，由于J接受盒片段含有C区段部分，TRA J和TRBJ接受盒片段在C部分序列方面不同，所述C部分序列必须对应于相应的C基因区段。另外，与仅需要单一J接受盒片段的TRA J场景相反，TRB J需要两个不同的J接受盒片段以导致使用替代性C1和C2区段。
TRB J供体载体文库需要的DNA组分是：
I.TRB J C1或TRB J C2接受盒片段
II.J供体载体骨架
III.TRB J C1或TRB J C2接受盒载体
IV.TRB J区段部分
人造TRA J接受盒片段的设计
两个单链DNA寡核苷酸的复性用来产生接受盒片段，所述接受盒片段在DNA片段的每个末端含有4核苷酸单链突出端，如图8中描述。4核苷酸突出端允许连接酶依赖性定向克隆入J供体载体骨架，以产生TRB J接受盒载体。
备选地使用C1和C2区段所需要的两个接受盒片段作为SEQ0578和SEQ0581展示。对于每种片段，提供正向(F1)和反向(R1)寡核苷酸序列。
装配TRB J接受盒载体的方法
装配TRB J接受盒载体的方法与实施例2中所述的装配TRA J接受盒载体的方法相同。相同的J供体载体骨架(SEQ0097)用来产生两个TRB J接受盒载体，其各自含有一个与TRB基因座的替代性C区段相对应的C1或C2部分。
所产生的两个TRB J接受盒载体用来插入TRB J区段部分TRB，以构建TRB J供体载体。
所产生的TRB J接受盒载体作为SEQ0582和SEQ0583展示。
人造TRB J区段部分的设计
通过使设计成在DNA片段的每个末端含有4核苷酸单链突出端的两种单链DNA寡核苷酸复性，构建TRB J区段部分。这个部分的布局和装配方法与TRA J区段部分的布局和装配方法相同并在图11中描述。
在这种情况下，短TRB J区段部分编码从CDR3-J边界Phe密码子起点开始的全部氨基酸。CDR3定义为旁侧分布有V区的C末端保守Cys和作为全部人TRB J区段间保守的Phe-Gly基序之部分的J区Phe的序列。这个保守的Phe-Gly基序用来将TRA J片段的5′突出端标准化成TTTG用于下游TRB重构。不同于TRA J区段，在本实施例中不存在TRA J区段部分中这种标准化突出端的例外。
向短的和长的TRB J区段部分，添加在图11中作为A块表现的腺嘌呤至每个TRB J区段部分的3′末端。这个腺嘌呤代表TRB C片段的从TRB J接受盒排除的第一核苷酸。
人先天J区段的这个实施例的短TRB J区段部分的序列作为SEQ0584至SEQ0609展示并且长TRB J区段部分的序列作为SEQ0610至SEQ0635展示。在两种情况下，列出正向(F1)和反向(R1)寡核苷酸序列。
装配TRB短或长J供体载体文库的方法
装配TRB J供体文库的方法与实施例2中描述的TRA文库的方法相同。但是，在TRB文库的情况下，与TRA基因座区段的短文库和长文库相反，应产生四种文库。
在TRB文库情况下，可以构建每个短文库和长文库以携带每个替代性C1和C2 C区段，在TRB J供体文库中产生四个子集。
J供体载体文库需要的DNA组分如下：
I.短TRB J区段部分或长TRB J区段部分
II.TRB J C1或TRB J C2接受盒载体
遵循如实施例2中所述的相同方法，在TRB J供体文库内部产生所得的四个子集。展示所得文库的序列，不包括BsaI识别位点外部的骨架序列。
作为SEQ0636至SEQ0648展示的TRB C1短J供体文库
作为SEQ0649至SEQ0661展示的TRB C2短J供体文库
作为SEQ0662至SEQ0674展示的TRB C1长J供体文库
作为SEQ0675至SEQ0687展示的TRB C2长J供体文库
实施例4
用于重组酶介导的盒交换应用的TRA和TRB V-C入门载体的设计
实施例1和3中分别设计TRA和TRB V-C入门载体，从而使用这些TORES对每条TCR链重构的全长TCR可以通过转染，直接适用于哺乳动物细胞中瞬时表达。TORES的总体设计允许V-C入门载体骨架与适于下游应用的任何骨架交换，并且允许需要的V-C入门载体文库从V和C克隆性片段快速装配。
在本实施例中，一对异特异性FRT V-C入门载体骨架用来装配TRA和TRB V-C入门载体文库。每个TRA和TRB V-C入门载体文库均用含有迥异翻转酶识别靶(FRT)序列的载体骨架构建。这类载体的一个下游应用是为快速基因组整合入携带相关FRT位点的哺乳动物细胞，提供重构的最终TRA和TRB对。
在本实施例中，具有图7中所述的设计的TRA V-C入门载体分别含有F14和F15 FRT序列作为5'和3'遗传元件。这种F14/F15 V-C入门载体骨架序列作为SEQ0688呈献。
使用实施例1中略述的方法，这种骨架用来利用TRA V克隆性片段(SEQ0001至SEQ0046)和TRA C克隆性片段(SEQ0047)，构建具有图2中所略述的设计的TRA V-C入门文库。这种构建产生具有以下序列的TRA V-C入门文库，所述序列与瞬时表达TRA V-C入门载体文库(SEQ0049至SEQ0094)的序列相同，但旁侧分布有F14/F15 V-C入门载体骨架背景中的FRT序列。
在本实施例中，具有图7中所述的设计的TRB V-C入门载体分别含有FRT和F3 FRT序列作为5'和3'遗传元件。这种FRT/F3 V-C入门载体骨架序列作为SEQ0689展示。
使用实施例3中略述的方法，这种骨架用来利用TRA V克隆性片段(SEQ0435至SEQ0481)和TRB C克隆性片段(SEQ0482和SEQ0483)，构建具有图2中所略述的设计的TRB V-C入门文库。这种构建产生具有以下序列的TRB V-C入门文库，所述序列与瞬时表达TRB V-C入门载体文库(SEQ0484至SEQ0577)的序列相同，但旁侧分布有FRT/F3 V-C入门载体骨架背景中的FRT序列。
总的来说，本实施例中的TRA与TRB V-C入门载体可以与以上实施例中的V-C入门载体互换使用。在每种情况下，J供体载体保持不变，odeCDR3的设计和提供也是如此(参见实施例6)。实际上，不同的V-C入门载体骨架为下游应用提供所需载体背景下作为TCR重构反应中直接产物的全长TCR ORF。
实施例5
适于提供任何V-J-C组合的V-C入门载体和J供体载体的设计
在V-C入门载体和J供体载体的以上实施例中，使用人先天TRA和TRC TCR链作为TORES的实际展示。但是，显而易见，向指定的载体样式插入需要的TCR链序列时，任何先天或非先天TCR链可以用于TORES样式中。
为了实现用于任何给定TCR链的TORES，需要对所述TCR链特异的四个序列元件：
X–可变(V)基因区段片段
Y–恒定(C)基因区段片段
Y’–恒定(C)基因区段部分
Z–连接(J)基因区段片段
根据上述实施例，可以将这四个形式的序列元件装配入各种载体背景，以构建并为任何给定TCR链的任何给定V-J-C组合部署TORES。例如，用于人先天TRG和TRD基因座的系统、合成性人TCR链变体形式或除人类之外的生物的先天TCR链形式。
V-C入门载体装配和最终构建体
为了实现V-C入门载体装配，可以构建两种含有有关V和C基因区段片段的中间体。
根据图5，V克隆性片段设计成在最终V-C入门载体装配的适宜克隆位点背景下含有需要的V基因区段片段。在本实施例中，还如实施例1、3和4中所展示，通过使用BbsI限制性酶位点实现V-C入门载体装配，所述限制性酶位点在5'和3'末端产生目标突出端，从而分别匹配V-C入门载体骨架和C克隆性片段中的互补突出端。例举的策略还并入NotI限制性酶位点作为负向选择标记。
将这种克隆方案的一般性序列作为SEQ-0690展示，其中V基因区段片段由5'和3'末端处的BbsI位点界定，并且V基因区段片段命名为XNn，其中X是V基因区段的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表所述序列中核苷酸的数目。V基因区段片段分别由5'和3'末端处的Kozac和间隔区核苷酸界定，并且包含翻译起始密码子。
可以被构建以针对特定TCR链序列装配V-C入门载体文库的第二中间体是如图6中所示的C克隆性片段。在本实施例中，还如实施例1、3和4中所展示，通过使用BbsI限制性酶位点实现V-C入门载体装配，所述限制性酶位点在5'和3'末端产生目标突出端，从而分别匹配V克隆性片段和V-C入门载体骨架中的互补突出端。例举的策略还并入NotI限制性酶位点作为负向选择标记。
将这种克隆方案的一般性序列作为SEQ-0691展示，其中C基因区段片段由5'和3'末端处的BbsI位点界定，并且C基因区段片段命名为YNn，其中Y是C基因区段的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表所述序列中核苷酸的数目。C基因区段片段分别由5'和3'末端处C基因区段的第一Glu密码子5'的胞嘧啶或等同保守位点和间隔区核苷酸界定，并且将会包含翻译终止密码子。
为了使用上文限定的V和C克隆性片段装配V-C入门载体，将这些片段与如图7中所示并且在实施例1和3中描述的V-C入门载体骨架组合。在本实施例和上文实施例中，这种载体骨架用分别产生突出端*1’和突出端*2’的Acc65I和XbaI限制性酶结合位点定义。突出端*1’与V克隆性片段内部的突出端*1互补(图5)。突出端*2’与C克隆性片段内部的突出端*2互补(图6)。这些互补突出端允许将V和C克隆性片段定向克隆到V-C入门载体骨架中。
Sp特征指在Acc65I和XbaI限制性酶识别位点之间添加的为了隔开这两个位点以高效发挥作用所需要的核苷酸。
如实施例4中所略述，V-C入门载体骨架(图7)，通过向V-C入门载体提供5'和3'遗传元件(图2)，最终提供了向其中重构全长TCR ORF的载体背景(图4h)。因此，可以对V-C入门载体骨架/V-C入门载体做出一系列选择，以满足重构的TCR ORF的一系列下游应用。
在本实施例中，如上文实施例1、3和4中那样，提供三个不同的V-C入门载体骨架。
具有编码CMV组成型启动子的5′遗传元件和编码SV40pA多聚腺苷化信号的3′遗传元件的V-C入门载体骨架的序列作为SEQ0048展示。这种载体背景允许在哺乳动物细胞中瞬时表达重构的TCR ORF。
当本实施例中这种瞬时表达V-C入门载体骨架SEQ0048与一般性V克隆性片段(SEQ0690)和C克隆性片段(SEQ0691)组合时，广义V-C入门载体可以由序列SEQ0692定义。
具有编码FTR位点(F14序列)的5′遗传元件和编码FRT位点(F15序列)的3′遗传元件的V-C入门载体骨架的序列作为SEQ0688展示。这种载体背景允许翻转酶介导的重构的TCR ORF盒交换入由F14和F15异特异性FRT位点界定的遗传背景。例如，这种方案可以用于使TCR ORF稳定整合入携带这类异特异性FRT接受位点的哺乳动物细胞系。
当本实施例中这种F14/F15 RCME V-C入门载体骨架SEQ0688与一般性V克隆性片段(SEQ0690)和C克隆性片段(SEQ0691)组合时，广义V-C入门载体可以由序列SEQ0693定义。
具有编码FRT位点(FRT序列)的5′遗传元件和编码FRT位点(F3序列)的3′遗传元件的第二V-C入门载体骨架的序列作为SEQ0689展示。这种载体背景允许翻转酶介导的重构的TCR ORF盒交换入由FRT和F3异特异性FRT位点界定的遗传背景。例如，这种方案可以用于使TCRORF稳定整合入携带这类异特异性FRT接受位点的哺乳动物细胞系。
当本实施例中这种FRT/F3 RCME V-C入门载体骨架SEQ0689与一般性V克隆性片段(SEQ0691)和C克隆性片段(SEQ0692)组合时，广义V-C入门载体可以由序列SEQ0694定义。
在本实施例中，可以在两种RCME背景之一下重构一条TCR链，并且可以在另一个RCME背景下重构第二链。例如，可以在F14/F15背景下重构TRA ORF，并且可以在FRT/F3背景下重构TRB ORF。因此，可以通过RCME，使配对的TRA/TRB构建体整合入携带F14/F15和FRT/F3位点的哺乳动物细胞系，用于所述细胞系中稳定表达TRA/TRB对。
J供体载体装配和最终构建体
上文描述了可以用来将多种V和C TCR基因区段组合装配入V-C入门载体作为TORES组分的一般性构建体。为了完成TORES，需要适宜的J供体载体。如上文实施例2中所述，可以在一个多步骤过程中装配J供体载体，以实现具有设计J区段特征的灵活性的J供体系统。要指出的一个重要方面是J供体载体贡献了与匹配的V-C入门载体文库的C区段对应的C部分。
为了装配J供体载体文库，需要四种不同的构建体；
I.J接受盒片段
II.J供体载体骨架
III.J接受盒载体
IV.J区段部分
在本实施例中，如实施例2中那样，使用BbsI限制性位点，装配J供体载体，并且使用所得的J供体载体和匹配的V-C入门载体中均携带的BsaI限制性位点，运行完整的TORES。
重要地，如图8中所示的J接受盒片段含有与匹配的V-C供体载体文库携带的C区段对应的C部分。将这种克隆方案的一般性序列作为SEQ0695至SEQ0696展示，其中编码C区段上5'部分的C部分由相对于5'的BbsI识别位点和相对于3'的BsaI位点界定。两个展示的序列代表为产生J接受盒片段而复性的有义和反义寡核苷酸，其中提供的Y’序列是互补的。展示的序列中C部分命名为Y’Nn，其中Y’是匹配上文所述Y C区段的C部分的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表所述序列中核苷酸的数目。将BbsI位点间隔并定向，旨在以3'方向切割，以产生匹配待插入J区段部分的克隆用突出端。将BsaI位点间隔并以5'方向切割，以在运行TORES时生成全长TCR ORF的最终装配反应中产生C突出端。在J接受盒片段5'末端的以3'方向切割的第二BsaI位点也用于TORES的最终运行。以5'方向切割的内部BbsI位点产生用于装配J-供体载体的第二克隆用突出端。在本实施例中，在BbsI识别位点之间编码间隔的NotI限制性位点，以充当从J供体载体装配过程消除亲本片段的负向选择标记。通过使设计成产生两个4核苷酸单链突出端(如实施例2中所述，在5'末端命名为突出端*3和在3'末端命名为突出端*4)的两个互补寡核苷酸复性，装配J接受片段。
为了用上述J接受盒片段装配中间J接受盒载体，必须产生J供体骨架，如图9中所示。在本实施例中，这种载体骨架的克隆特征是为允许有效限制性酶作用所间隔的EcoRI和XhoI限制性位点。用EcoRI和XhoI消化这种骨架，产生了与装配的J接受盒片段中的突出端*3和突出端*4互补的突出端*3'和突出端*4’。这允许将J接受盒片段定向克隆入J供体骨架，以产生如实施例2中所述的J接受盒载体。将具有与上述V-C入门载体的正向选择标记不同的正向选择标记的J供体载体骨架的实施例作为SEQ0097展示。
上文获得的J接受盒载体于图10中描述，并且基本上代表J供体载体骨架背景下的J接受盒片段，并且作为SEQ0697展示，其中Y’是C部分的名称，所述C部分匹配命名为Y且上文所述的C区段，N代表任何核苷酸，并且n代表所述序列中核苷酸的数目。
正是将一系列J区段插入J接受盒载体才构建了J供体载体文库。图11中描述J基因区段的设计，其中J基因区段由分别相对于5'末端和3'末端的突出端*5'和突出端*6’界定。在本实施例中，J区段部分由单个腺嘌呤核苷酸与3'突出端间隔，从而维持酶识别序列并在将J区段部分插入J接受盒载体以产生J供体载体时校正可读框，如实施例2中所述。在本实施例中，将J区段部分的一般性序列作为SEQ0698至SEQ0699展示，其中J基因区段部分命名为ZNn，其中Z是J基因区段的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表所述序列中核苷酸的数目。两个展示的序列代表为装配J区段部分所复性的有义和反义寡核苷酸，其中Z序列是互补的。
在本实施例中，将获得的一般性最终J供体载体作为SEQ0700(图3中展示的代表)展示。本实施例中的这种J供体载体代表插入的J区段部分和来自J接受盒载体的C部分。将该序列用两个注释的序列插入物ZNn和Y’Nn展示，其中Z是J基因区段的名称，并且Y’是C区段部分的名称，N代表任何核苷酸，并且n代表所述序列中核苷酸的数目。
在提供的全部序列中，选择被视为潜在影响BsaI结合位点的DAM甲基化的核苷酸。移除载体内部用于装配和选择酶的全部附加识别序列。还应当从插入所述片段和载体背景中的种系或合成性TCR V、J和C元件移除任何的这类识别序列。
实施例6
编码CDR3的寡核苷酸双链体(odeCDR3)的设计和产生
在以上实施例中，在针对多种应用设计并产生匹配的V-C入门载体和J供体载体中描述多种样式的TORES。这些V-C入门载体和J供体载体文库用于单步重构全长TCR可读框的用法需要提供编码CDR3的寡核苷酸双链体(odeCDR3)构建体，以便补全目标全长TCR链序列(图4c)。一旦产生V-C入门载体和J供体载体文库，这些载体代表可以无限用于选择目标全长TCR链序列的所需V-J-C组合的常备品。相反，odeCDR3代表对目标全长TCR ORF特异的独特短序列。
本实施例描述人天然TRA和TRB载体平台中所用odeCDR3的设计和产生。
TRA odeCDR3的设计
两个单链DNA寡核苷酸的复性产生在DNA片段的每个末端含有4核苷酸单链突出端的odeCDR3，如图4c中描述。4-核苷酸突出端设计成允许连接酶依赖性定向克隆至入门载体中编码的TRA V区段的3′末端(突出端)和TRA重构期间的TRA J片段的5′末端(突出端)。将突出端/>标准化成CTGC，互补于TRA V-C入门载体的V区段中编码的标准化突出端/>在突出端/>情况下，存在可以采取的两种序列形式，这决定于来自人TRA基因座的J区段之间的序列趋异性。对于人天然TRA J区段TRAJ33和TRAJ38，将突出端标准化成TGGG，互补于这两种J区段的J供体载体中编码的突出端/>对于全部其他的人TRA J区段，将突出端/>标准化成TTTG，互补于这些J区段的J供体载体中编码的突出端/>(参见实施例2)。
TRB odeCDR3的设计
就TRB odeCDR3而言，两个单链DNA寡核苷酸的复性产生在DNA片段的每个末端含有4核苷酸单链突出端的odeCDR3，如图4c中描述。4-核苷酸突出端设计成允许连接酶依赖性定向克隆至入门载体中编码的TRB V区段的3′末端(突出端)和TRB重构期间的TRBJ片段的5′末端(突出端/>)。将突出端/>标准化成TTGC，互补于TRB V-C入门载体的V区段中编码的标准化突出端/>与其中需要两个备选突出端/>形式的TRA odeCDR3相反，对于TRB odeCDR3，将突出端/>标准化成TTTG，互补于全部TRB J区段的J供体载体中编码的突出端/>(参见实施例3)。
odeCDR3一般设计
通常，odeCDR3设计必须匹配于这样的4-核苷酸突出端，其设计成允许连接酶依赖性定向克隆至入门载体中编码的V区段的3′末端(突出端)和重构期间的J片段的5′末端(突出端/>)。
产生磷酸化CDR3 DNA寡核苷酸双链体的方法
形成odeCDR3的两种寡核苷酸的磷酸化和复性
反应混合物
反应条件
37℃温育1小时
95℃变性5分钟
通过将反应按照3℃/分钟缓慢冷却下来至25℃，使有义和反义寡核苷酸复性。
实施例7
从相应的V-C入门载体文库和J供体载体文库重构TRA和TRB全长ORF
JG9a/b实施例。
这个实施例描述了用于定义为重构具有目标TCR的给定序列信息的TRA和TRB全长TCR ORF所要求的载体文库组分和odeCDR3的步骤。本实施例还展示了全长模型TRA和TRBTCR链对的装配过程，并且通过人细胞模型中瞬时表达和用特异性HLA-多聚体试剂对表面呈递的TCR染色，确认其特异性。
V-C入门载体、J供体载体和odeCDR3的选择
将克隆性文库中代表的全部可能种系片段的序列与目的TRA或TRB序列比对。与TRA或TRB序列具有最高同一性的基因片段确定哪种V、J和C遗传元件将构成所需的TRA或TRB克隆型序列。对于TRA，基于确定所需TRA的V利用情况，选择适宜的V-C入门载体。对于TRB，当序列覆盖度足以确定V和C利用情况时，除了所需TRB克隆类型是否使用TRBC1或TRBC2之外，还选择与所述克隆类型的V利用情况对应的适宜V-C入门载体。
在短形式和长形式的特定TRAJ或TRB J遗传元件分别与TRA和TRB序列比对的情况下，编码较长遗传元件的相应质粒将用于TRA重建。
确定合成TRA所需要的odeCDR3序列为TRA V比对的基因片段的3′末端和比对的TRAJ基因片段的5′末端之间的区域。寡核苷酸有义链需要额外的5′4-核苷酸突出端，突出端CTGC，所述突出端适应于TRA V入门载体上用BsaI消化时产生的突出端，突出端互补性寡核苷酸反义链需要额外的5′4-核苷酸突出端，突出端/>所述突出端对添加至TRA重建反应的TRAJ载体专用的突出端(突出端/>)为独特的。
确定合成TRB所需要的CDR3序列为TRB V比对的基因片段的3′末端和比对的TRB J基因片段的5′末端之间的区域。寡核苷酸有义链需要额外的5′4-核苷酸突出端，突出端TTGC，所述突出端适应于TRB V入门载体上用BsaI消化时产生的突出端，突出端互补性寡核苷酸反义链需要额外的5′4-核苷酸突出端，突出端/>所述突出端对添加至TCR重建反应的TRB J载体专用的突出端(突出端/>)为独特的。
在本实施例中，使用对HLA-A2*01-限制性抗原具有已知特异性的模型TCR TRA/TRB对。TRA链和TRB链的序列分别作为SEQ701和SEQ702展示。
基于这个全长序列，从TRA文库和TRB文库选择适宜V-C入门载体和J供体载体是简单明了的。在本实施例中，使用瞬时表达型(即，骨架作为SEQ0048展示的)V-C入门载体。
在本实施例中，选择TRA V-C入门载体SEQ0088(来自列表0049至0094)和J供体载体SEQ0371(来自列表0323至0378)。
在本实施例中，选择TRB V-C入门载体SEQ0563(来自列表0484至0577)和J供体载体SEQ0637(来自列表0636至0687)。
为TRA链合成的odeCDR3分别在SEQ703和SEQ704中作为有义链和反义链展示。
为TRB链合成的odeCDR3分别在SEQ705和SEQ706中作为有义链和反义链展示。
全长重构方法
对于上文选择的每种TRA组分和TRB组分，限制性酶/连接酶循环反应如下文描述那样进行。
RE消化和连接反应
反应条件
步骤1；在37℃，2分钟
步骤2；在16℃，3分钟
重复步骤1和步骤2，20次
50℃，5分钟
80℃，5分钟
返回室温
添加0.5μl NotI酶并在37℃温育30分钟。
将所得的反应产物转化入感受态大肠杆菌细胞和铺种在含有羧苄青霉素的平板上。
筛选羧苄青霉素抗性克隆并对其测序以确定正确装配的构建体。通过分离的质粒DNA的限制性酶鉴别性消化进行克隆筛选，并且通过DNA电泳观察预期的DNA片段大小。所产生的构建体编码全长TCR α和β克隆序列。
验证重构的TRA载体和TRB载体。
为了验证上文重构的TCR TRA/TRB对的特异性，将两种构建体瞬时染入表达全部CD3组分、但缺少TRA和TRB表达的细胞系中。这项分析展示于图12中，其中将重构的TCR连同无关TCR和空载体对照一起转染。空载体不显示针对TCRα/β或CD3的抗体表面染色，这些对照细胞也不显示被HLA-A2*01-NLVPMVATV四聚体试剂着染(图12，最右侧组图)。表面呈递CD3复合体需要TCR表达。无关TCR对TCRα/β和CD3阳性染色，但不显示HLA-A2*01-NLVPMVATV四聚体试剂染色(图12，居中组图)。这表明，TCR在细胞表面上表达，但对加载于HLA-A2*01四聚体试剂中的靶抗原无特异性。目标TCR呈TCRα/β和CD3阳性染色，并且还显示HLA-A2*01-NLVPMVATV四聚体试剂阳性染色(最左侧组图)。这表明，重构的TCR既呈递在细胞表面上，并如预期那样，也对加载于HLA-A2*01四聚体试剂中的靶抗原有特异性。
实施例8
重构从人外周血鉴定的抗原特异性TCR TRA/TRB链对集合
即将来到的基于TCR的个性化诊断学和治疗药中策略的关键要求之一是从个体快速捕获并表征抗原特异性TCR链对的能力。在本实施例中，实施一个工作流程，其中从分离自外周的人血的单个T细胞扩增TCRTRA/TRB链对并将其测序，随后通过在哺乳动物细胞中瞬时表达，重构并验证这些对。
TRA链和TRB链对测序及重构
图13展示总体工作流程。简而言之，从HLA-B*07:02阳性供体采集新鲜的PBMC标本，并用HLA-B*07:02-TPRV HLA-多聚体试剂染色。这种HLA-多聚体是加载来自HCMV pp65基因的已知免疫优势抗原的HLA-B*07:02等位基因，其完整肽序列是；TPRVTGGGAM。将单个HLA-B*07:02-TPRV多聚体阳性细胞FACS分选入含有5μL水的0.2mLPCR管。将样品急冻并储存在-80℃直至进一步加工(图13步骤i)。
使单个细胞分离物经历一个两步骤扩增过程，该过程需要针对每种TRA和TRB链的V区特异性引物集合(图13步骤ii)，随后进行产生TRA和TRB扩增子供序列分析(图13步骤iv)的配对巢式PCR反应(图13步骤iii)。先前描述了这种方法(Han等人,NatBiotechnol.2014 32(7):684-692)。
在本实施例中，展示6个配对的克隆作为下游加工的实施例。将获得的序列作为SEQ0707至SEQ0718展示。
随后将这些序列针对V、C和J基因区段文库，就其相应的TRA链和TRB链进行比对，以确定每条已扩增链的V、C区段和J区段利用情况。这个序列分析步骤还允许定义CDR3编码性序列，并且因此定义odeCDR3序列(图13步骤v)。这个序列分析允许选择V-C入门载体(图13步骤vi)和J供体载体(图13步骤vii)用于TCR链重构。该分析还允许合成odeCDR3用于每个链重构反应(图13步骤viii)。表1中总结选择和序列。
下表展示为从头测序和重构实施例中已鉴定的TCR TRA/TRB对的序列ID总结
对这些组分的选择允许为每条TRA链和TRB链装配独立的限制性酶/连接酶循环反应，以进行全长TCR ORF重构(图13步骤ix)。每个反应如上文实施例7中所述那样进行，包括转化和抗生素选择和(图13步骤x)、随后增殖并测序确认所得的重构的TCR ORF(图13步骤xi)。
验证TRA链和TRB链对
为了验证上文重构的TCR TRA/TRB对集合的特异性，将配对的构建体瞬时转染入表达全部CD3组分、但缺少TRA和TRB表达的细胞系中，如实施例7中所展示。这项分析展示于图14中。将细胞用6个TCRORF构建体对的每一者转染，用无关TRA/TRB克隆对和空载体对照平行转染。采用针对CD3的抗体和起初用来从PBMC标本分离单个T细胞的HLA-B*07:02-TPRV四聚体试剂染色后，通过流式细胞术分析细胞。在本实施例中，配对的构建体均显示与目标HLA-B*07:02-TPRV四聚体试剂结合，并且观察到定量性差异。向每个框插入的数字代表CD3阴性细胞事件对CD3阳性细胞事件的MFI比率。
实施例9
借助odeCDR3简并性的TCR链快速多样化
想要多样化和选择TCR ORF，以工程化具有改变的特异性、亲和力和/或信号传导能力的TCR链对。TORES系统适合快速产生从原始目标序列系统性改变的TCR链集合。在本实施例中，展示了通过将选定的密码子位置处具有定义的和有限的核苷酸简并性的odeCDR3纳入重构反应，使模型TCR链对多样化的方案。这种方法用来使实施例7中展示的模型TCRTRA/TRB对的TRA链多样化。显示当特定HLA-多聚体试剂随其天然TRB链对一起在哺乳动物细胞表面上呈递时，这个单一反应多样化产生对所述试剂具有广泛类型亲和力的TCR集合。这种方法理想地适用于利用可在活哺乳动物细胞的功能背景下呈递并受到选择的全长TCRORF快速进行TCR工程化。
多样性TRA链集合的产生
图15展示了通过使用odeCDR3汇集物，在单一反应中产生序列多样化的TCR链集合的总体策略。选择单一C-V入门载体和J供体载体以代表最终的全长TCR产物中的目标V、J和C基因区段(图15，框i和框ii)。产生具有选定多样性的odeCDR3汇集物，从而存在odeCDR3汇集物中代表的众多不同CDR3序列(图15，框iii)。当全部组分合并入限制性酶/连接酶循环反应时，所产生的产物是含有定义的V、J、C基因区段利用情况和CDR3区内多样性确定的全长TCR链的一组构建体(图15，框iv)。终产物中多样化全长TCR链的数目与添加至反应的初始odeCDR3汇集物中odeCDR3变体的数目完全成正比。
在本实施例中，使用一个对HLA-A2*01中呈递的人巨细胞病毒(HCMV)抗原具有已知特异性的模型TCR TRA/TRB对(与实施例7相同的对子)。这种抗原性肽衍生自HCMV pp65蛋白，并且在HLA-A2*01中呈递的肽抗原的完整氨基酸序列是NLVPMVATV。TRA链和TRB链的序列分别作为SEQ701和SEQ702展示。
在本实施例中，TRA链是序列多样化的目标，并且通过合成在3个不同位置具有核苷酸简并性的odeCDR3有义和反义寡聚物，实现这种多样化，所述核苷酸简并性各自改变独立的密码子，以产生三个密码子的每者处存在4种不同氨基酸的可能性。跨CDR3环间隔为简并性所选择的密码子。odeCDR3寡聚物作为SEQ0743和SEQ0744展示，其中N表示简并密码子。
通过实施例6中略述的方法，使odeCDR3寡聚物复性，3个独立的密码子位置处的4种氨基酸简并性产生了具有64个独特序列(包括原始编码性序列(即，SEQ0701))的odeCDR3产物汇集物。
通过实施例7中略述的方法，使用odeCDR3装配全长TRA ORF以产生在3个不同密码子位置具有4种氨基酸简并性的64个独特TRAORF。在本实施例中，合成在所示位置具有简并性核苷酸使用情况的odeCDR3，并且因此在单管中进行重构以产生全部64个链变体。在平行提供独特odeCDR3给独立反应时，该方案同等有效。全部预期的克隆均从单一反应制备并且确认序列。将每条TRA链作为独立质粒原液制备供后续表征。
TRA链配对TRB链多样化表征
为了表征特异性，将上文衍生的64条TCR TRA链的每一者连同TRB链(SEQ0702)一起共转染入表达全部CD3组分、但缺少TRA和TRB表达的细胞系中。随后，将这些细胞用针对CD3的抗体和HLA-A2*01-NLVPMVATV多聚体试剂染色并且通过流式细胞术分析。这项分析展示于图16中。
每个转染子群体表述为CD3阳性群体相对于CD3阴性群体的HLA-A2*01-NLVPMVATV多聚体信号的平均荧光强度(MFI)的比率，并作为依据递增比率排序的散射图标出(图16a)。显而易见，多样化的TRA链产生针对HLA-A2*01-NLVPMVATV多聚体的一系列亲和力。以箭头指示原始α链。大部分多样化的克隆显示比原始克隆更差的结合。还观察到显著数目的非结合物。令人震惊地，许多的克隆显示HLA-A2*01-NLVPMVATV多聚体染色(高结合物)明显增加，包括改善相对信号超过3倍的克隆。这些克隆也作为MFI比率递增排序的表格展示，其中列出呈递的氨基酸和多样化的位置1、2和3(图16b)。可以观察到，位置2处的Pro使HLA-A2*01-NLVPMVATV多聚体结合作用高度稳定，并且位置3处的Asp稳定程度较低。相反，位置3处的His彻底地消除结合作用，除非位置2处存在Pro时。这种朝向增加和减少HLA-A2*01-NLVPMVATV多聚体结合作用的氨基酸置换位置性偏好强烈地提示，使用TORES在TRA链中产生的定向氨基酸简并性，真正改变结合亲和力。
总之，这个实施例表明，CDR3环中通过TORES内部的odeCDR3简并性以单一步骤引入的最低多样性可以产生对分析物HLA-抗原复合体具有多样结合特征的TCR集合。这可以直接并入TCR成熟作业流程，以产生这样的合成性TCR，其具有各种TCR工程化场景下改变的特征，同时仍维持TCR链的全长先天背景，连同先天V、J和C基因区段利用情况。
实施例10
通过V和J区段改组的TCR链快速多样化
想要多样化和选择TCR ORF，以工程化具有改变的特异性、亲和力和/或信号传导能力的TCR链对。TORES系统适合快速产生从原始目标序列系统性改变的TCR链集合。在本实施例中，略述一种TCR链多样化方案，其中向全长TCR链反应提供单一odeCDR3连同多个V-C入门载体、J供体载体或多个V-C入门载体和J供体载体二者。这种方案可以用来使用先天种系V、J和C区段，使给定TCR链多样化，同时维持全新TCR链中通过核心CDR3携载的与同族HLA-抗原复合体接触的可能性。这种方法理想地适用于利用可在活哺乳动物细胞的功能背景下呈递并受到选择的全长TCR ORF快速进行TCR工程化。
改组V基因区段利用情况的实施例展示于图17中。这个示意性实施例略述以下的方案：用匹配亲本TCR链的序列维持单一odeCDR3和J供体载体利用情况，同时通过向重构反应提供众多V-C入门载体，提供V基因区段选择。在有机会利用多种C基因区段(例如人TRB)的TCR链情况下，也可以将此纳入多样化工作流程考虑。含有单一odeCRD3和J供体载体及V-C入门载体选择项的反应的产物将是众多含有亲本CDR3/J序列的全长TCR链，和每个提供的V(和/或C)基因区段。这种方案同等有效在具有众多选定V-C入门载体的独立反应中，而非图17中所述汇集反应中实现。
改组J基因区段利用情况的实施例展示于图18中。这个示意性实施例略述以下的方案：用匹配亲本TCR链的序列维持单一odeCDR3和V-C入门载体利用情况，同时通过向重构反应提供J供体载体选择，提供J基因区段选择。含有单一odeCRD3和V-C入门载体及J供体载体选择项的反应的产物将是众多含有亲本CDR3/V-C序列的全长TCR链和每个提供的J供体基因区段。这种方案同等有效在具有众多选定J供体载体的独立反应中，而非图18中所述汇集反应中实现。
改组V基因区段和J基因区段利用情况的最终实施例展示于图19中。这个示意性实施例略述以下的方案：用匹配亲本TCR链的序列维持单一odeCDR3，同时通过向重构反应提供V-C载体和J供体载体选择，提供V(-C)基因区段和J基因区段选择。含有单一odeCRD3和V-C入门载体与J供体载体二者选择项的反应的产物将是众多含有亲本CDR3序列的全长TCR链，和向该反应提供的V(-C)和J供体基因区段的每种组合。这种方案同等有效在具有众多选定V-C入门载体和J供体载体的独立反应中，而非图19中所述汇集反应中实现。
实施例11
使用TORES2从TRA和TRB重构全长TCR ORF
这个实施例描述了以RMCE位点作为5'和3'遗传元件的针对人TRA/TRB基因座的TORES2，并且展示模型人TCR对的重构和重构的ORF后续整合入工程化细胞系，所述工程化细胞系携带与原始用V-Cα入门载体骨架背景的5'和3'遗传元件匹配的RMCE位点。模型TCRTRA/TRB对具有针对HLA-A*02:01-限制性抗原的已知特异性。模型TRA序列和TRB序列分别由SEQ0778和SEQ0779代表。该抗原肽具有氨基酸序列SLLMWITQV。
用于TORES2的V-C入门载体、J供体载体、odeCDR3和双向终止子
使用如实施例7中所概述的相同选择标准，选择V-Cα、V-Cβ、J供体载体和编码odeCDR3的寡核苷酸双链体。如前所述，TORES2需要改编V-Cα和V-Cβ以并入迥异IIS型位点及负向选择元件。V-Cα入门载体骨架序列和V-Cβ入门载体骨架序列分别由SEQ7056和SEQ0764代表。归因于向这些骨架序列添加新限制性位点，与针对上述TORES系统展示的那些相比，某些V-区段序列需要修饰基础性核苷酸序列，从而从TCR编码性序列消除这些新限制性位点。修饰的TRA V-C序列由SEQ0757至SEQ0763代表，并且修饰的TRB V-C序列由SEQ0765至SEQ0776代表。使用的全部其他TRA和TRB序列如对上文TORES系统所述那样。
双向终止子供体组分
双向终止子供体载体(BiT供体)提供双向终止子元件，其中所述双向终止子元件在第二步骤反应中被引入并且最终毗连第一步骤反应中重构的反平行TRA链和TRB链。在本实施例中，双向终止子元件由SEQ0777代表并且在合适的载体骨架背景中提供。
重构反应
如实施例7中所述那样实施重构靶TRA和TRB ORF的第一限制性酶/连接酶循环反应。这产生重构的TRA和TRB，各自处于其相应的V-C入门载体骨架背景内。在第二反应中，这两种产物载体与BiT供体载体在新酶连接酶循环反应中组合，以产生终产物载体，其以反平行含义(sense)编码重构的TRA和TRB ORF，并且由引入的双向终止子元件毗连。
用于TORES2的RE消化和连接反应
反应条件
步骤1；在37℃，2分钟
步骤2；在16℃，3分钟
重复步骤1和步骤2，20次
50℃，5分钟
80℃，5分钟
返回室温
添加0.5μl SalI酶和MluI酶并在37℃温育30分钟。
将所得的反应产物转化入感受态大肠杆菌细胞和铺种在含有羧苄青霉素的平板上。
筛选羧苄青霉素抗性克隆并对其测序以确定正确装配的构建体。通过分离的质粒DNA的限制性酶鉴别性消化进行克隆筛选，并且通过DNA电泳观察预期的DNA片段大小。所产生的构建体编码全长TCR α和β克隆序列。
验证重构的全长TCR ORF
为了验证TORES2系统产生的重构的双向TRA/TRB供体载体的功能，将构建递送细胞系，所述细胞系表达全部CD3组分，但缺少TRA和TRB表达，并且还编码与包含于产物供体载体内部且由原始V-Cα入门载体贡献的RMCE位点相容的基因组接受位点，和在5'和3'末端的合适的反平行启动子元件。该分析展示于图23中，其中将重构的供体载体转染入细胞。已经丧失基因组接受位点标记的细胞(图23a，RFP-BFP-)是表达双向TCR ORF，导致CD3表面表达的细胞(图23b，浅灰色直方图)。而未丧失基因组接受位点标志物的细胞是整合双向TCR构建体失败(图23a)RFP+BFP+)和无CD3表面表达染色(图23b，深灰色直方图)的细胞。表面呈递CD3复合体需要TCR表达。已经丧失基因组接受标记的全部RFP-BFP-细胞均为CD3表面表达阳性(图23b，浅灰色直方图)。尚未丧失基因组接受标记的全部RFP+BFP+细胞均为CD3表面表达阴性(图23b，深灰色直方图)。与尚未用HLA-A*02:01–SLLMWITQV四聚体试剂染色的细胞(图23d)相比，表达已重构TCR的这些CD3+细胞也显示所述四聚体阳性染色(图23c)。综上，结果表明，重构的TCR既呈递在细胞表面上，又对加载于HLA-A*02:01–SLLMWITQV四聚体试剂中的靶抗原有特异性。
具体实施方案
下文中给出关于本发明及其多个方面的更多详情。
1.包含两个独立组分的组合型系统，其中第一组分是携带可变和恒定(V-C)T细胞受体(TCR)基因区段的载体，并且第二组分是携带TCR连接(J)基因区段的载体。
2.根据项1的组合型系统，其中第一组分是V-C入门载体，其含有
a.复制起点
b.第一正向选择标记
c.一个5'遗传元件或多个5'遗传元件，
d.Kozak序列
e.TCR可变基因区段，
f.第一IIS型序列，用于被IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，
g.负向选择标记，
h.第二IIS型序列
i.TCR恒定基因区段，和
j.一个3'遗传元件或多个3'遗传元件。
3.根据项1或2的组合型系统，其中第二组分是J供体载体，其含有
a.复制起点
b.第二正向选择标记，
c.第三IIS型序列，
d.TCR连接基因区段，
e.C部分，对应于恒定基因区段的一个5'小部分，和
f.第四IIS型序列。
4.根据项2或3的组合型系统，其中所述第一、第二、第三和第四IIS型序列相同或不同。
5.根据项2或3的组合型系统，其中所述第一、第二、第三和第四IIS型序列相同。
6.根据项2-5中任一者的组合型系统，其中第一和第二正向选择标记是不同的并且选自抗生素耐药基因或营养缺陷型互补基因。
7.根据项2-6中任一者的组合型系统，其中5'遗传元件包含一个或多个选自以下的元件
a.基因顺式/作用元件，
b.用于重组酶的异特异性识别位点，
c.针对目的基因组位点的5'同源重组臂
d.mRNA剪接受体位点，
e.内部核糖体进入位点，和
f.外遗传的绝缘子序列。
8.根据项2-7中任一者的组合型系统，其中TCR可变基因区段不含有在第一和第二组分中所含的IIS型序列。
9.根据项2-8中任一者的组合型系统，其中使第一IIS型序列定向以切割所述识别序列的5'并位于TCR可变基因区段内部。
10.根据项2-9中任一者的组合型系统，其中负向选择标记选自
a.不含于第一组分中或TCR连接基因区段内部其他地方的限制性酶识别位点，
b.细菌自杀基因，和
c.报道元件。
11.根据项2-10的组合型系统，其中使第二IIS型序列定向以切割所述识别序列的3'并位于TCR恒定基因区段内部。
12.根据项2-11中任一者的组合型系统，其中TCR恒定基因区段不含有在第一和第二组分中所含的任何IIS型序列。
13.根据项2-12中任一者的组合型系统，其中3'遗传元件包含一个或多个选自以下的元件
a.终止子元件，
b.用于重组酶的异特异性识别位点，
c.针对目的基因组位点的3'同源重组臂
d.mRNA剪接供体位点，
e.内部核糖体进入位点，和
f.外遗传的绝缘子序列。
14.根据项3-13中任一者的组合型系统，其中使第三IIS型序列定向以切割所述识别序列的3'并位于TCR连接基因区段内部。
15.根据项3-14中任一者的组合型系统，其中TCR连接基因区段不含有在第一和第二组分中所含的任何IIS型序列。
16.根据项3-15中任一者的组合型系统，其中使第四IIS型序列定向以切割所述识别序列的5'并位于TCR C部分区域或构建体内部。
17.根据项3-16中任一者的组合型系统，其中TCR C部分不含有在第一和第二组分中所含的任何IIS型序列。
18.根据前述任一项的组合型系统，其中除如项10中所限定的负向选择标记之外，全部所含的序列均缺少任何负向选择元件。
19.根据前述任一项的组合型系统，还包含第三组分，其包含编码CDR3的寡核苷酸双链体(odeCDR3)。
20.根据项19的组合型系统，其中odeCDR3具有
a.与第一IIS型限制性酶识别和切割位点互补的第一单链突出端序列，使所述第一IIS型限制性酶识别和切割位点定向以切割所述识别序列的5'，并位于TCR可变基因区段内部，
b.双链区段，其编码TCR CDR3区并缺少负向选择元件，所述负向选择元件如项10中限定，并且还缺少第一或第二部分的任何IIS型限制性序列，和
c.与第三IIS型限制性酶识别和切割位点互补的第二单链突出端序列，使所述第三IIS型限制性酶识别和切割位点定向以切割所述识别序列的3'并位于TCR连接基因区段内部。
21.如项1-18中任一者中所限定的V-C入门载体文库，其中文库是代表具有这类TCR的生物的全部种系TCR可变基因区段和恒定基因区段的一个或多个载体的集合。
22.如项1-18中任一者中所限定的J供体载体文库，其中文库是代表具有这类TCR的生物的种系TCR连接基因区段的一个或多个载体的集合。
23.如项1-18中任一者中所限定的V-C入门载体文库，其中文库是代表具有这类TCR的生物的一组变体种系TCR可变基因区段和恒定基因区段的一个或多个载体的集合，从而相对于种系基因区段编码的蛋白质序列，编码的蛋白质的已翻译氨基酸序列未修饰。
24.如项1-18中任一者中所限定的J供体载体文库，其中文库是代表具有这类TCR的生物的变体种系TCR连接基因区段的一个或多个载体的集合，从而相对于种系基因区段编码的蛋白质序列，编码的蛋白质的已翻译氨基酸序列未修饰。
25.如项1-18中任一者中所限定的V-C入门载体文库，其中文库是代表具有这类TCR的生物的一组变体种系TCR可变基因区段和恒定基因区段的一个或多个载体的集合，从而相对于种系基因区段编码的蛋白质序列，编码的蛋白质的已翻译氨基酸序列经修饰。
26.如项1、3-18中任一者中所限定的J供体载体文库，其中文库是代表具有这类TCR的生物的变体种系TCR连接基因区段的一个或多个载体的集合，从而相对于种系基因区段编码的蛋白质序列，编码的蛋白质的已翻译氨基酸序列经修饰。
27.文库，包含如1-26项中任一者中所限定的V-C入门载体和J供体载体的组合。
28.一种试剂盒，其包含以下组合
a.一个或多个编码可变基因区段和恒定基因区段组合的V-C入门载体，和
b.一个或多个编码J基因区段的J供体载体，和任选地
c.一个或多个具有单链突出端的标准化odeCDR3作为阳性对照odeCDR3，所述单链突出端匹配于V-C入门载体和J供体载体的单链突出端，和任选地
d.预装配的全长TCR ORF作为参比
29.一种用于体外重构全长TCR可读框(ORF)的方法，所述方法包括
a.选择V-C入门载体，
b.选择J供体载体，
c.选择odeCDR3，
d.将a、b和c组合，以i)与(一种或多种)IIS型限制性酶反应，从而切割存在于V-C入门载体中和J供体载体中的全部IIS型限制性酶识别和切割位点，ii)与DNA连接酶反应并且使合并的混合物经历热循环反应，
e.将获得自步骤d.的反应产物转化入有能力进行DNA载体增殖的可选择宿主生物，以及
f.对宿主生物进行选择以获得在V-C入门载体骨架中重构的全长TCR可读框。
30.根据项29的方法，其中V-C入门载体如项2中所限定，J供体载体如项3中所限定，并且通过使用如项6中所限定的第一正向选择标记对转化的宿主细胞进行项29的步骤f。
31.根据项29或30的方法，其中从选择的TCR序列重构选择的TCR可读框，所述方法包括
a.获得TCR可读框序列，其中所述序列信息足以鉴定i)可变基因区段利用情况、ii)恒定基因区段利用情况、iii)连接基因区段利用情况、iv)跨可变基因区段边界至连接基因区段边界的完整CDR3序列，和
b.选择与步骤a.i)和a.ii)中分别鉴定的可变基因区段和恒定基因区段相对应的V-C入门载体，和
c.选择与步骤a.iii)中鉴定的连接基因区段相对应的J供体载体，和
d.产生与步骤a.iv中鉴定的CDR3序列相对应的odeCDR3，
e.将b、c和d组合，以i)与(一种或多种)IIS型限制性酶反应从而切割存在于V-C入门载体中和J供体载体中的全部IIS型限制性酶识别和切割位点，ii)与DNA连接酶反应并使得合并的混合物经历热循环反应，并且
f.将获得自步骤d.的反应产物转化入有能力进行载体复制的可选择宿主生物，以及
g.对宿主生物进行选择以获得在V-C入门载体骨架中重构的全长TCR可读框。
32.根据项29-31中任一者的方法，其中使用单一IIS型限制性酶进行步骤d.i)。
33.根据项29-31中任一者的方法，其中使用至少两种IIS型限制性酶进行步骤d.i)。
34.根据项29-33中任一者的方法，还包括至少一个负向选择步骤，所述步骤包括
a.在项29的步骤e.或项31的步骤f.之前，进行反应产物的限制性酶消化以消除亲本V-C入门载体，之后转化宿主，和/或
b.进行自杀基因选择以消除亲本V-C入门载体转化的感受态宿主，和/或
c.借助报道分子鉴定，对亲本V-C入门载体转化的宿主细胞进行选择。
35.根据项29-34中任一者的方法，其中选择宿主生物包括选择抵抗在培养系统中存在的抗生素或竞争在培养系统中不存在的营养缺陷型因子的宿主生物，并且所述抗生素耐药性或营养缺陷型互补作用由V-C入门载体中编码的基因产物赋予。
36.根据项29-34中任一者的方法，其中在适于培养并选择宿主生物的培养系统中进行一个或多个步骤。
37.根据29至36项中任一者的方法，其用来产生两个或更多个具有多样化CDR3区的TCR ORF的汇集物，其中两个或更多个odeCDR3形式根据项29c被选择并合并以根据项29d进行单一限制性酶/连接酶循环反应。
38.根据29至36项中任一者的方法，其用来产生两个或更多个具有多样化V和/或C基因区段利用情况的TCR ORF的汇集物，其中两个或更多个V-C入门载体根据项29a被选择并合并以根据项29d进行单一限制性酶/连接酶循环反应。
39.根据29至36项中任一者的方法，其用来产生两个或更多个具有多样化J基因区段利用情况的TCR ORF的汇集物，其中两个或更多个J供体载体根据项29b被选择并合并以根据项29d进行单一限制性酶/连接酶循环反应。
40.根据29至36项中任一者的方法，其用来产生两个或更多个具有多样化V和/或C和J基因区段利用情况的TCR ORF的汇集物，其中两个或更多个V-C入门载体和J供体载体根据项29a和b被选择并合并以根据项29d进行单一限制性酶/连接酶循环反应。
41.根据29至36项中任一者的方法，其用来产生两个或更多个除多样化V和/或C和J基因区段利用情况以外，还具有多样化CDR3的TCR ORF的汇集物，其中两个或更多个odeCDR3根据项29c被选择，并且两个或更多个V-C入门载体和J供体载体根据项29a和b被选择并合并以根据项29d进行单一限制性酶/连接酶循环反应。
42.构建根据项1和项2的V-C入门载体的方法，其中该方法包括组合选自以下的三个DNA组分
a.可变基因区段克隆性片段
b.恒定基因区段克隆性片段
c.V-C入门载体骨架
43.根据项42的方法，其中所述可变基因区段克隆性片段包含
a.用于片段的聚合酶链反应依赖性扩充的5'引物结合序列
b.经定向以按照3'方向切割的第五IIS型序列
c.当IIs型酶作用于b中的第五IIs型序列时编码限定的单链突出端的第一突出端序列
d.Kozak序列
e.TCR可变基因区段
f.第一IIS型序列
g.负向选择标记的5'序列区段
h.第六IIS型序列，经定向以按照5'方向切割，从而在g中负向选择标记的5'序列区段内部产生单链突出端
i.用于片段的聚合酶链反应依赖性扩充的3'引物结合序列
44.根据项42或43的方法，其中所述恒定基因区段克隆性片段包含
a.用于片段的聚合酶链反应依赖性扩充的5'引物结合序列
b.第七IIS型序列，经定向以按照3'方向切割，从而在c中负向选择标记的3'序列区段内部产生单链突出端
c.负向选择标记的3'序列区段
d.第二IIS型序列
e.TCR恒定基因区段
f.当IIs型酶作用于g中的第八IIs型序列时编码限定的单链突出端的第二突出端序列
g.第八IIS型序列，经定向以按照5'方向切割，从而在f的突出端序列中产生单链突出端
h.用于片段的聚合酶链反应依赖性扩充的3'引物结合序列
45.根据项42-44中任一者的方法，其中所述V-C入门载体骨架包含
a.复制起点
b.第一正向选择标记
c.5'遗传元件
d.第一限制性酶识别序列，允许消化骨架以产生与项43c中提到的所述第一突出端互补的单链突出端
e.第二限制性酶识别序列，允许消化骨架以产生与项44f中提到的所述第二突出端互补的单链突出端
f.3'遗传元件。
46.根据项42至45中任一者的方法，其中第五、第六、第七和第八IIS型序列相同或不同。
47.根据项42至45中任一者的方法，其中第五、第六、第七和第八IIS型序列相同。
48.根据项42至45中任一者的方法，其中第五、第六、第七和第八IIS型序列不同于如项2至5中所限定的第一、第二、第三和第四IIS型序列。
49.根据42至48项中任一者的方法，包括
a.用所述第一限制性酶和所述第二限制性酶消化V-C入门载体骨架，以分别产生所述第一和第二突出端，
b.将消化的V-C入门载体骨架与V克隆性片段和C克隆性片段连同DNA连接酶和识别第五、第六、第七和第八IIS型序列的一种或多种IIS型限制性酶一起合并
c.将所得的反应产物转化入感受态宿主生物并且使用所述第一正向选择标记进行正向选择，以获得完整的V-C入门载体
50.可变基因区段克隆性片段，由序列SEQ0690代表。
51.恒定基因区段克隆性片段，由序列SEQ0691代表。
52.由序列SEQ0048代表的V-C入门载体，旨在构建适用于哺乳动物细胞中瞬时表达或重构的全长TCR可读框的V-C入门载体。
53.由序列SEQ0688代表的V-C入门载体，旨在构建适于与具有合适的异特异性重组酶序列的匹配遗传靶发生重组酶介导的盒交换的V-C入门载体。
54.由序列SEQ0689代表的V-C入门载体骨架，旨在构建适于与具有匹配的异特异性重组酶序列的遗传靶发生重组酶介导的盒交换的V-C入门载体。
V-C入门载体仿制物(qenerics)
55.由序列SEQ0692代表的V-C入门载体，适用于哺乳动物宿主细胞中瞬时表达或重构的全长TCR可读框。
56.由序列SEQ0693代表的V-C入门载体，适于与具有匹配的异特异性重组酶序列的遗传靶发生重组酶介导的盒交换。
57.由序列SEQ0694代表的V-C入门载体，适于与具有匹配的异特异性重组酶序列的遗传靶发生重组酶介导的盒交换。
58.构建根据项1或项3的J供体载体的方法，其中该方法包括组合选自以下的四个DNA组分
a.J接受盒片段
b.J供体载体骨架
c.J接受盒载体
d.J区段部分
59.根据项58的方法，其中所述J接受盒片段包含
a.在5'末端与60c中提到的突出端序列互补的第一单链突出端
b.第三IIS型序列，经定向以按照3'方向切割，与这样的序列连接，所述序列受到c中提到的第九IIS型序列指导的酶作用时形成单链突出端。
c.第九IIs型序列，经定向以按照5'方向切割并产生b中提到的单链突出端
d.负向选择标记
e.第十IIS型序列，经定向以按照3'方向切割并在f中描述的序列的5'处产生单链突出端
f.代表恒定基因片段的5'区域的C部分，在5'末端具有受第十IIS型序列指导的酶作用产生的突出端序列和在3'末端具有受g中所提到第四IIS型序列指导的酶作用产生的突出端序列
g.第四IIS型序列，经定向以按照5'方向切割，从而在含有f中提到的C部分的5'序列内部产生单链突出端。
h.在3'末端与60d中提到的突出端序列互补的第二单链突出端
60.根据项58或59的方法，其中所述J供体载体骨架包含
a.复制起点
b.第二正向选择标记
c.第一限制性酶识别序列，允许消化骨架以产生与项59a中提到的所述第一突出端互补的单链突出端
d.第二限制性酶识别序列，允许消化骨架以产生与项59h中提到的所述第二突出端互补的单链突出端
61.根据项58至60中任一者的方法，其中通过组合项53中描述的TRAJ接受盒片段和项54中描述的TRAJ J供体载体骨架，构建所述J接受盒载体，其中该方法包括
a.用所述第一限制性酶和所述第二限制性酶消化J供体载体骨架，以分别产生所述第一和第二突出端
b.将消化的J供体载体骨架与J接受盒片段组合
c.将所得的反应产物转化入感受态宿主生物并且使用所述第二正向选择标记进行正向选择，以获得完整的J接受盒载体
62.根据项58至61中任一者的方法，其中所述J区段部分包含
a.在5'末端的第一单链突出端序列，其与受项59b中提到的第九IIS型序列指导的酶作用时，在项59b中提到的J接受盒片段内产生的突出端互补，
b.连接基因区段部分
c.在3'末端的第二单链突出端序列，其与受项59e中提到的第九IIS型序列指导的酶作用时，在项59f中提到的J接受盒片段内产生的突出端互补
63.根据项58至62中任一者的方法，其中第九和第十IIS型序列相同或不同。
64.根据项58至62中任一者的方法，其中第九和第十IIS型序列相同。
65.根据项42至62中任一者的方法，其中第九和第十IIS型序列不同于如项2至5中所限定的第一、第二、第三和第四IIS型序列。
66.根据项42至62中任一者的方法，其中第九和第十IIS型序列与如项2至5中所限定的第五、第六、第七和第八IIS型序列相同或不同。
67.根据项42至62中任一者的方法，其中第九和第十IIS型序列与如项2至5中所限定的第五、第六、第七和第八IIS型序列相同。
68.根据项42至62中任一者的方法，其中通过将J供体载体骨架与J区段部分组合，构建所述J供体载体，其中该方法包括
a.将J接受盒载体与J区段部分连同DNA连接酶和识别第九和第十IIS型序列的一种或多种IIS型限制性酶一起合并，并且使合并的混合物经历热循环反应
b.将所得的反应产物转化入感受态宿主生物并且使用所述第二正向选择标记进行正向选择，以获得完整的J供体载体
69.由序列SEQ0695和SEQ0696代表的J接受盒片段。
70.由序列SEQ0097代表的J供体载体骨架。
71.由SEQ0697代表的J接受盒载体，通过组合项69中提到的J接受盒片段和项70中提到的J供体载体骨架来构建。
72.由序列SEQ0698和SEQ0699代表的J区段部分，旨在通过将J区段部分插入项71中提到的J接受盒载体，构建J供体载体。
73.由序列SEQ0700代表的J供体载体，装配自项71中提到的J接受盒载体和项72中提到的J区段部分。
74.如项2-19中任一者中所限定的V-C入门载体文库，其含有可变基因区段和恒定基因区段以概括人TRA基因座的基因区段利用情况，由序列SEQ0049至SEQ0094代表，其中载体适用于瞬时表达重构的全长TCR可读框。
75.如项3-19中任一者中所限定的J供体载体文库，其含有由序列SEQ0323至SEQ0378代表的连接基因区段以概括人TRA基因座的基因区段利用情况，其中载体与跨越完整CDR3区的odeCDR3一起使用。
76.如3-项中任一者中所限定的J供体载体文库，其含有由序列SEQ0379至SEQ0434代表的连接基因区段以概括人TRA基因座的基因区段利用情况，其中载体与长度上缩减三个至四个密码子的odeCDR3一起使用。
77.如项2-19中任一者中所限定的V-C入门载体文库，其含有可变基因区段和恒定基因区段以概括人TRB基因座的基因区段利用情况，由序列SEQ0484至SEQ0577代表，其中载体适用于瞬时表达重构的全长TCR可读框。
78.根据项3-19中任一项所限定的J供体载体文库，其含有由序列SEQ0636至SEQ0661代表的连接基因区段以概括人TRB基因座的基因区段利用情况，其中载体与跨越完整CDR3区的odeCDR3一起使用。
79.如项3-19中任一者中所限定的J供体载体文库，其含有由序列SEQ0662至SEQ0687代表的连接基因区段以概括人TRB基因座的基因区段利用情况，其中载体与长度上缩减三个至四个密码子的odeCDR3一起使用。
80.根据项1至20的组合型系统，用于在确定的载体背景下提供先天种系和/或多样化合成性TCR可读框。
81.在确定的载体背景下用于诊断或治疗方法的TCR可读框。

Claims (28)

1.包含三个独立组分的组合型系统，其中第一组分是携带可变和恒定T细胞受体TCR基因区段的V-C进入载体，并且第二组分是携带TCR连接J基因区段的J载体，
其中第一组分是V-C入门载体，其含有
a)复制起点
b)第一正向选择标记
c)一个5'遗传元件或多个5'遗传元件，
d)Kozak序列
e)TCR可变基因区段，
f)第一IIS型序列，用于被第一IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割所述识别序列的5'并在TCR可变基因区段的3'末端切割，
g)负向选择标记，
h)第二IIS型序列，用于被第二IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割到所述识别序列的3'直接切割和在TCR基因恒定区段的5'末端切割，
i)TCR恒定基因区段，和
j)一个3'遗传元件或多个3'遗传元件，
其中第二组分是J供体载体，其含有
a.复制起点
b.第二正向选择标记，
c.第三IIS型序列，用于被第三IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割所述识别序列的3'和在TCR连接基因区段的5'末端切割，
d.TCR连接基因区段，
e.C部分，对应于恒定基因区段的5'小部分，和
f.第四IIS型序列，用于第四IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割所述识别序列的5'和在构建体的TCR C-部分区的3'末端切割，从而生成的单链突出端序列与所述第二IIS型序列产生的那个单链突出端序列互补，
并且其中系统还包含第三组分，所述组分包含编码CDR3的寡核苷酸双链体odeCDR3，其中所述odeCDR3具有
a.第一单链突出端序列，其与通过在TCR可变基因区段的3'末端切割第一IIS型限制性位点产生的单链突出端序列互补，
b.双链区段，其编码TCR CDR3区并缺少负向选择标记，并且所述双链元件还缺少第一或第二组分的任何IIS型限制性序列，和
c.第二单链突出端序列，其与通过在TCR连接基因区段的5'末端切割第三IIS型限制性酶位点产生的单链突出端序列互补。
2.根据权利要求1所述的组合型系统，其中5'遗传元件包含一个或多个选自以下的元件
a.基因顺式作用元件，
b.用于重组酶的异特异性识别位点，
c.针对目的基因组位点的5'同源重组臂，
d.mRNA剪接受体位点，
e.内部核糖体进入位点，和
f.外遗传的绝缘子序列。
3.根据权利要求1或2所述的组合型系统，其中负向选择标记选自
a)不含于第一组分中或TCR连接基因区段内部其他地方的限制性酶识别位点，
b)细菌自杀基因，和
c)报道元件。
4.根据权利要求1或2所述的组合型系统，其中3'遗传元件包含一个或多个选自以下的元件
a.终止子元件，
b.用于重组酶的异特异性识别位点，
c.针对目的基因组位点的3'同源重组臂
d.mRNA剪接供体位点，
e.内部核糖体进入位点，和
f.外遗传的绝缘子序列。
5.根据权利要求1或2项所述的组合型系统，其中所述组合型系统不含有如权利要求1或2限定的那些以外的任何IIS型序列，并且不含有除权利要求1-4中任一项所述负向选择标记之外的其他负向选择标记。
6.根据权利要求1或2所述的组合型系统，其中odeCDR3是编码旁侧分布有两个IIS型识别和切割位点的CDR3的dsDNA分子或质粒DNA，从而被所述酶切割产生单链突出端，所述单链突出端与用第一IIS型切割在V-C入门载体中5'末端处和用第三IIS型切割J供体载体在3'末端所产生的那些单链突出端互补，以获得所述odeCDR3的消化产物，所述odeCDR3包含如权利要求1中所述odeCDR3的a、b和c。
7.根据权利要求1或2所述的组合型系统，其中第一至第四IIS型序列相同或不同。
8.一种使用根据权利要求1-7中任一项的组合型系统用于体外重构全长TCR可读框ORF的方法，所述方法包括
a)选择V-C入门载体，
b)选择J供体载体，
c)选择odeCDR3，
d)将a、b和c组合，以i)与一种或多种IIS型限制性酶反应，从而切割存在于V-C入门载体中和J供体载体中的全部IIS型限制性酶识别和切割位点，ii)与DNA连接酶反应并且使合并的混合物经历热循环反应，
e)将获得自步骤d.的反应产物转化入有能力进行DNA载体增殖的宿主生物，以及
f)增殖所述宿主生物以获得在所得的V-C入门载体骨架中重构的全长TCR可读框。
9.根据权利要求1所述的组合型系统，其中所述V-C入门载体选自序列SEQ ID NO:0692，
序列SEQ ID NO:0693，和
序列SEQ ID NO:0694。
10.根据权利要求1所述的组合型系统，其中所述J供体载体由序列SEQ ID NO:0700代表。
11.如权利要求1所述的组合型系统，其中所述V-C入门载体与J供体载体文库和odeCDR3组合用于重构全长TCR可读框，其中V-C入门载体含有由序列SEQ ID NO:0049至SEQID NO:0094代表的可变基因和恒定基因区段以概括人TRA基因座的基因区段利用情况；和/或V-C入门载体含有由序列SEQ ID NO:0484至SEQ ID NO:0577代表的可变基因和恒定基因区段以概括人TRB基因座的基因区段利用情况。
12.根据权利要求1所述的组合型系统，其中所述J供体载体含有由序列SEQ ID NO:0323至SEQ ID NO:0378代表的连接基因区段并且用于概括人TRA基因座的基因区段利用情况，其中载体与跨越完整CDR3区的odeCDR3一起使用；和/或
含有由序列SEQ ID NO:0379至SEQ ID NO:0434代表的连接基因区段以概括人TRA基因座的基因区段利用情况。
13.根据权利要求1所述的组合型系统，其中所述J供体载体含有由序列SEQ ID NO:0636至SEQ ID NO:0661代表的连接基因区段以概括人TRB基因座的基因区段利用情况，其中载体与跨越完整CDR3区的odeCDR3一起使用；和/或，
含有由序列SEQ ID NO:0662至SEQ ID NO:0687代表的连接基因区段以概括人TRB基因座的基因区段利用情况。
14.根据权利要求12所述的组合型系统，其中所述J供体载体与V-C入门载体和odeCDR3组合用于重构全长TCR可读框。
15.根据权利要求13所述的组合型系统，其中所述J供体载体与V-C入门载体和odeCDR3组合用于重构全长TCR可读框。
16.根据权利要求1所述的组合型系统，其中所述第一组分是编码第一TCR链的V-C入门载体，所述系统还包含了包含双向终止子BiT供体载体的组分和包含V-C入门载体的组分，所述V-C入门载体编码与所述第一TCR链互补的第二TCR链。
17.根据权利要求16所述的组合型系统，其中所述第一组分的所述V-C入门载体包含
a.第五IIS型序列，用于被第五IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割所述识别序列的5'并在恒定基因区段的3'末端切割，
b.位于第五IIS型序列3'的负向选择标记，
c.位于b.的负向选择标记的3'的第六IIS型序列，用于被第六IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割所述识别序列的3'并切割到3'遗传元件的5'。
18.根据权利要求16或17所述的组合型系统，其中所述V-C入门载体编码与所述第一链互补的第二TCR链并且还包含
a.第七IIS型序列，用于被第七IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割所述识别序列的3'并在Kozak序列的5'切割，
b.第八IIS型序列，用于被第八IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割所述识别序列的5'并在恒定基因区段的3'末端切割，
c.位于第八IIS型序列3'处的负向选择标记。
19.根据权利要求16所述的组合型系统，其中所述BiT供体载体含有
复制起点，
a.正向选择标记，
b.第九IIS型序列，用于被第九IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割所述识别序列的3'和在双向终止子元件的5'末端，
c.双向终止子元件，编码反义布局中的两种转录终止子，和
d.第十IIS型序列，用于被第十IIS型限制性酶位点特异性识别和切割，其中所述序列如此定向，从而酶切割所述识别序列的5'和双向终止子元件的3'。
20.根据权利要求16所述的组合型系统，其中第一至第四IIS型序列相同或不同。
21.根据权利要求16所述的组合型系统，其中第五至第十IIS型序列相同或不同，并且不同于第一至第四IIS型序列。
22.根据权利要求16所述的组合型系统，其中负向选择标记选自
a.不含于第一组分中或TCR连接基因区段内部其他地方的限制性酶识别位点，
b.细菌自杀基因，和
c.报道元件，
并且其中在权利要求17的b.和权利要求18的c.中定义的负向选择标记不同于权利要求1的g.中定义的负向选择标记，并且权利要求1的g.中定义的负向选择标记不同第一组分的V-C入门载体中和编码与所述第一TCR链互补的所述第二TCR链的V-C入门载体中的那些。
23.根据权利要求16所限定的组合型系统，其中所述V-C入门载体包含第一和第二V-C入门载体组，所述载体组各自含有
代表具有这类TCR的生物的全部种系TCR可变基因区段和恒定基因区段的一个或多个载体的集合，或
代表具有这类TCR的生物的一组变体种系TCR可变基因区段和恒定基因区段的一个或多个载体的集合，从而相对于种系基因区段编码的蛋白质序列，编码的蛋白质的已翻译氨基酸序列未修饰，或
代表具有这类TCR的生物的一组变体种系TCR可变基因区段和恒定基因区段的一个或多个载体的集合，从而相对于种系基因区段编码的蛋白质序列，编码的蛋白质的已翻译氨基酸序列经修饰，
其中第一和第二V-C入门载体组编码相应的TCR链。
24.根据权利要求23所述组合型系统，其中所述V-C入门载体用于提供在单产物构建体中以反平行布局编码的一对全长TCR可读框。
25.一种使用权利要求1-7和11-24中任一项所述的组合型系统用于体外重构在单产物构建体中以反平行布局编码的一对全长TCR可读框的方法，所述方法包括
a.为每条TCR链选择V-C入门载体，
b.为每条TCR链选择J供体载体，
c.为每条TCR链选择odeCDR3，
d.独立反应中针对每个TCR组合a、b和c，以i)与一种或多种IIS型限制性酶反应，从而切割存在于V-C入门载体中和J供体载体中的第一至第四IIS型限制性酶识别和切割位点，ii)与DNA连接酶反应并且使合并的混合物经历热循环反应，以获得第一和第二反应产物，
e.使来自步骤d.的两种反应产物与如权利要求16中限定的BiT供体载体合并，以i)与一种或多种IIS型限制性酶反应，从而切割第五至第十IIS型限制性酶识别和切割位点，ii)与DNA连接酶反应，并且对合并的反应产物进行热循环反应，以获得第三反应产物，
f.将获得自步骤e.的第三反应产物转化入有能力进行DNA载体增殖的宿主生物，以及
g.增殖所述宿主生物以获得在所得的V-C入门载体骨架中重构的全长TCR可读框。
26.根据权利要求1所述的组合型系统，其中所述的V-C入门载体由一对V-C入门载体组成，所述V-C入门载体对由SEQ ID NO:0756和0764代表。
27.根据权利要求26所述的组合型系统，其中所述一对V-C入门载体用于与具有匹配的异特异性重组酶序列的遗传靶发生重组酶介导的盒交换。
28.根据权利要求19所述的组合型系统，其中所述双向终止子元件由SEQ ID NO:0777序列代表。
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