DE112019005166T5 - Verfahren zur gezielten insertion von dna in gene - Google Patents

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Abstract

Verfahren und Zusammensetzungen zur Modifizierung der kodierenden Sequenz von endogenen Genen unter Verwendung von selten schneidenden Endonukleasen und Transposasen. Die hier beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen können verwendet werden, um die kodierende Sequenz endogener Gene zu modifizieren.

Description

  • VERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
  • Diese Anmeldung beansprucht den Vorteil der zuvor eingereichten und gleichzeitig anhängigen Anmeldungen USSN 62/746,497 , eingereicht am 16. Oktober 2018, USSN 62/830,654 , eingereicht am 8. April 2019, und USSN 62/864,432 , eingereicht am 20. Juni 2019, deren Inhalt durch Bezugnahme in vollem Umfang hierin einbezogen wird.
  • SEQUENZPROTOKOLL
  • Die vorliegende Anmeldung enthält ein Sequenzprotokoll, das im ASCII-Format über EFS-Web eingereicht wurde und hiermit durch Verweis in seiner Gesamtheit einbezogen wird. Diese ASCII-Kopie, die am 14. Oktober 2019 erstellt wurde, trägt den Namen SEQUENCE_LISTING_BA2018-4WO_P12987WO00.txt und ist 517.036 Byte groß.
  • TECHNISCHES GEBIET
  • Das vorliegende Dokument liegt auf dem Gebiet des Genome Editing. Genauer gesagt bezieht sich dieses Dokument auf die gezielte Modifikation von endogenen Genen unter Verwendung von selten schneidenden Endonukleasen oder Transposasen.
  • HINTERGRUND
  • Monogene Störungen werden durch eine oder mehrere Mutationen in einem einzigen Gen verursacht. Beispiele hierfür sind die Sichelzellkrankheit (Hämoglobin-Beta-Gen), die zystische Fibrose (Zystische-Fibrose-Transmembranleitfähigkeitsregulator-Gen) und die Tay-Sachs-Krankheit (Beta-Hexosaminidase-A-Gen). Monogene Erkrankungen sind für die Gentherapie interessant, da der Ersatz des defekten Gens durch eine funktionelle Kopie einen therapeutischen Nutzen bringen könnte. Ein Engpass für die Generierung effektiver Therapien ist jedoch die Größe der funktionalen Kopie des Gens. Viele Verabreichungsverfahren, einschließlich derer, die Viren verwenden, haben Größenbeschränkungen, die die Verabreichung von großen Transgenen behindern. Außerdem haben viele Gene alternative Spleißmuster, was dazu führt, dass ein einziges Gen für mehrere Proteine kodiert. Verfahren zur Korrektur von Teilregionen eines defekten Gens können eine alternative Möglichkeit zur Behandlung monogener Störungen darstellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Gene Editing ist eine vielversprechende Methode zur Korrektur von Mutationen, die bei genetischen Erkrankungen gefunden werden. Allerdings gibt es noch viele Herausforderungen bei der Entwicklung effektiver Therapien für einzelne Erkrankungen, einschließlich solcher, die durch gain-of-function-Mutationen verursacht werden, oder bei denen eine präzise Reparatur erforderlich ist. Diese Herausforderungen werden bei Erkrankungen wie der Spinozerebellären Ataxie 3 und der Spinozerebellären Ataxie 6 gesehen, bei denen die Störung durch gain-of-function-Mutationen (erweiterte Trinukleotidwiederholungen) am 3'-Ende der Gene verursacht wird.
  • Die hier beschriebenen Verfahren bieten neuartige Ansätze zur Korrektur von Mutationen, die am 3'-Ende von Genen gefunden werden. Die Offenlegung hierin basiert zumindest teilweise auf dem Design von bimodularen Transgenen, die mit der Integration durch mehrere Reparaturwege kompatibel sind. Die hier beschriebenen Transgene können über den homologen Rekombinationsweg, den nicht-homologen Endverbindungsweg oder sowohl über den homologen Rekombinations- als auch den nicht-homologen Endverbindungsweg oder durch Transposition in Gene integriert werden. Außerdem kann das Ergebnis der Integration in jedem Fall (HR, NHEJ vorwärts, NHEJ rückwärts; Transposition vorwärts oder Transposition rückwärts) zu einer präzisen Korrektur/Veränderung des Proteinprodukts des Zielgens führen. Die hier beschriebenen Transgene können verwendet werden, um Mutationen in der 3'-Region von Genen von Interesse zu fixieren oder einzuführen. Die Verfahren sind besonders nützlich in Fällen, in denen ein präzises Editieren von Genen erforderlich ist, oder in denen das mutierte endogene Gen, auf das abgezielt wird, nicht durch eine synthetische Kopie „ersetzt“ werden kann, weil es die Größenkapazität von Standardvektoren oder viralen Vektoren übersteigt. Die hier beschriebenen Verfahren können für die angewandte Forschung (z. B. Gentherapie) oder die Grundlagenforschung (z. B. Erstellung von Tiermodellen oder Verständnis der Genfunktion) eingesetzt werden.
  • Die hier beschriebenen Verfahren sind mit aktuellen Invivo-Transportvehikeln (z. B. Adeno-assoziierten Virusvektoren und Lipid-Nanopartikeln) kompatibel, und sie adressieren mehrere Herausforderungen beim Erreichen einer präzisen Veränderung von Genprodukten.
  • In einer Ausführungsform zeigt dieses Dokument ein Verfahren zum Integrieren eines Transgens in ein endogenes Gen. Das Verfahren kann die Bereitstellung eines Transgens umfassen, wobei das Transgen eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, eine erste und zweite partielle kodierende Sequenz bzw. Teilkodiersequenz und einen ersten und zweiten Terminator enthält bzw. beherbergt. In einigen Ausführungsformen können der erste und der zweite Terminator durch einen einzigen bidirektionalen Terminator ersetzt werden. Das Verfahren umfasst ferner die Verabreichung einer oder mehrerer selten schneidender Endonukleasen, die auf eine Stelle innerhalb des endogenen Gens abzielen, wo das Transgen dann in das endogene Gen integriert wird. Das Transgen kann auf eine Stelle innerhalb eines Introns oder an einer Intron-Exon-Verbindungsstelle ausgerichtet sein. Die erste und zweite partielle kodierende Sequenz bzw. Teilkodiersequenz können in einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung orientiert sein, so dass die Integration des Transgens in beide Richtungen (d. h. vorwärts oder rückwärts) durch NHEJ zu einer präzisen Veränderung des Proteinprodukts des Gens führen kann. In anderen Ausführungsformen kann das Transgen einen linken und rechten Homologiearm enthalten, um die Integration durch HR zu ermöglichen. Diese Transgene können in einem Adeno-assoziierten Virusvektor (AAV) beherbergt werden, wobei das Transgen über HR (durch die Homologiearme) oder durch NHEJ in Vorwärtsrichtung oder NHEJ in Rückwärtsrichtung (durch direkte Integration des AAV-Vektors in einen gezielten Doppelstrangbruch) integriert werden kann. In einer Ausführungsform können Vektoren mit einer ersten und zweiten kodierenden Sequenz und einem linken und rechten Homologiearm außerdem eine erste und zweite Stelle für die Spaltung durch eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen enthalten. Die Spaltung durch die eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen kann zur Freisetzung eines linearen Transgens mit Homologiearmen führen, das zur Integration durch HR oder NHEJ in das Genom in der Lage ist. In einer anderen Ausführungsform können Vektoren mit einer ersten und zweiten kodierenden Sequenz von einer ersten und zweiten Stelle für die Spaltung durch eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen flankiert werden. Die Spaltung durch die eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen kann zur Freisetzung eines linearen Transgens führen, das zur Integration durch NHEJ in das Genom in der Lage ist. In einer anderen Ausführungsform können Vektoren mit einer ersten und zweiten kodierenden Sequenz von einem linken und rechten Transposonende flankiert werden. Die Lieferung einer CRISPR-assoziierten Transposase (z. B. Cas6/7/8 zusammen mit TniQ, TnsA, TnsB und TnsC) kann zur Integration des Transgens durch Transposition führen.
  • Die Verfahren können verwendet werden, um den C-Terminus von Proteinen zu verändern, die von endogenen Genen produziert werden. In einigen Ausführungsformen kann das endogene Gen das ATXN3-Gen oder das CACNA1A-Gen umfassen. ATXN3 ist ein Gen, das für das Enzym Ataxin-3 kodiert. Ataxin-3 ist ein Mitglied des Ubiquitin-Proteasom-Systems, das die Zerstörung von überschüssigen oder beschädigten Proteinen ermöglicht. Die Spinozerebelläre Ataxie Typ 3 ist eine genetische Störung, die durch eine Trinukleotid-Wiederholungs-Expansion innerhalb des 3'-Endes des ATXN3-Gens verursacht wird. CACNA1A ist ein Gen, das für Proteine kodiert, die an der Bildung von Calciumkanälen beteiligt sind. Spinozerebelläre Ataxie Typ 6 ist eine genetische Störung, die durch Mutationen im CACNA1A-Gen verursacht wird. Die Mutationen, die SCA6 verursachen, beinhalten eine Trinukleotid- Wiederholungs-Expansion im 3'-Ende des CACNA1A-Gens. In einigen Ausführungsformen können die hier bereitgestellten Verfahren verwendet werden, um das 3'-Ende des endogenen ATXN3-Gens oder CACNA1A-Gens zu verändern. In bestimmten Ausführungsformen kann das Ziel für die Integration der hier beschriebenen Transgene Intron 9 des ATXN3-Gens oder Intron 46 des CACNA1A-Gens sein.
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie allgemein von einem Fachmann auf dem Gebiet, auf das sich diese Erfindung bezieht, verstanden wird. Obwohl Verfahren und Materialien ähnlich oder gleichwertig zu den hierin beschriebenen verwendet werden können, um die Erfindung auszuüben, sind geeignete Verfahren und Materialien unten beschrieben. Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und andere Referenzen, die hier erwähnt werden, sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke einbezogen. Im Falle von Konflikten ist die vorliegende Beschreibung, einschließlich der Definitionen, maßgebend. Darüber hinaus sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur illustrativ und nicht als einschränkend gedacht.
  • Die Einzelheiten einer oder mehrerer Ausführungsformen der Erfindung sind in der nachfolgenden Beschreibung dargelegt. Weitere Merkmale, Gegenstände und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und aus den Ansprüchen.
  • Figurenliste
    • 1 ist eine Darstellung der Transgene für die gezielte Insertion in endogene Gene. TS1, Zielstelle 1; SA1, Spleißakzeptorstelle 1, CDS1, kodierende Sequenz 1; T1, Terminator 1, TS2, Zielstelle 2; SA2, Spleißakzeptorstelle 2, CDS2, kodierende Sequenz 2; T2, Terminator 2; HAI, Homologiearm 1; HA2, Homologiearm 2; BT1, bidirektionaler Terminator 1; AS1, zusätzliche Sequenz 1; AS2, zusätzliche Sequenz 2.
    • 2 ist eine Darstellung, die die Integration eines Transgens in ein beispielhaftes Gen zeigt. Das Transgen umfasst zwei Zielstellen für eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen, zwei Spleißakzeptorsequenzen, zwei kodierende Sequenzen (3.1 und 3.2) und zwei Terminatoren (T). Die Integration erfolgt durch nicht-homologe Endverbindung („End Joining“) (NHEJ).
    • 3 ist eine Darstellung, die die Integration eines Transgens in ein beispielhaftes Gen zeigt. Das Transgen umfasst zwei Homologiearme, zwei Zielstellen für eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen, zwei Spleißakzeptorsequenzen, zwei kodierende Sequenzen (3.1 und 3.2) und zwei Terminatoren. Die Integration erfolgt entweder durch homologe Rekombination (HR) oder nicht-homologes End Joining (NHEJ).
    • 4 ist eine Darstellung von Exon 46, Intron 46 und Intron 47 des CACNA1A-Gens. Ebenfalls dargestellt ist das pB1011-D1-Transgen zur Integration in das CACNA1A-Gen.
    • 5 ist eine Darstellung der Integrationsergebnisse für das pB1011-D1-Transgen innerhalb des CACNA1A-Gens.
    • 6 ist eine Darstellung von Exon 9, Intron 9, Exon 10, Intron 10 und Exon 11 des ATXN3-Gens. Ebenfalls dargestellt ist das pB1012-D1-Transgen zur Integration in das ATXN3-Gen.
    • 7 ist eine Darstellung der Integrationsergebnisse für das pB1012-D1-Transgen innerhalb des ATXN3-Gens.
    • 8 sind Bilder von Gelen, die die Integration von Transgenen in das ATXN3-Gen nachweisen. 1, 100-bp-Leiter mit oberster Bande, die bei 1.517 bp verläuft; 2, pBA1135 5'-Verbindungsstelle; 3, pBA1136 5'-Verbindungsstelle; 4, pBA1137 5'-Verbindungsstelle; 5, pBA1135 3'-Verbindungsstelle; 6, pBA1136 3'-Verbindungsstelle; 7, pBA1137 3'-Verbindungsstelle; 8, 1kb-Leiter mit dunkleren Banden, die bei 500 bp, 1.000 bp und 3.000 bp verlaufen; 9, 1kb-Leiter mit dunkleren Banden, die bei 500 bp, 1.000 bp und 3.000 bp verlaufen; 10, pBA1135 invertierte 5'-Verbindungsstelle; 11, 1kb-Leiter mit dunkleren Banden, die bei 500 bp, 1.000 bp und 3.000 bp verlaufen; 12, pBA1136 invertierte 5'-Verbindungsstelle; 13, 1kb-Leiter mit dunkleren Banden, die bei 500 bp, 1.000 bp und 3.000 bp verlaufen; 14;, Primerpaar oNJB156+oNJB113; 15, Primerpaar 114+162; 16, Primerpaar oNJB116+oNJB113; 17, Primerpaar oNJB114+oNJB170; 18, Primerpaar oNJB167+oNJB170; 19, 100 bp-Leiter mit der dunklen Bande, die bei 500 bp verläuft; 20, genomische DNA aus Transfektion mit pBA1135 und Nuklease; 21, genomische DNA aus Transfektion mit pBA1136 und Nuklease; 22, genomische DNA aus Transfektion mit pBA1137 und Nuklease; 23, genomische DNA aus Transfektion mit Wasser; 24, keine DNA-Kontrolle.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Hierin werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Modifizierung der kodierenden Sequenz endogener Gene offenbart. In einigen Ausführungsformen umfassen die Verfahren das Einfügen eines Transgens in ein endogenes Gen, wobei das Transgen eine partielle kodierende Sequenz bereitstellt, die die kodierende Sequenz des endogenen Gens ersetzt.
  • In einer Ausführungsform weist dieses Dokument ein Verfahren zur Integration eines Transgens in ein endogenes Gen auf, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Transgens umfasst, wobei das Transgen eine erste und eine zweite Spleißakzeptorsequenz, eine erste und eine zweite Teilkodiersequenz und einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und einen zweiten Terminator umfasst, und die Verabreichung einer oder mehrerer selten schneidender Endonuklease(n), die auf eine Stelle innerhalb des endogenen Gens abzielen, wobei das Transgen in das endogene Gen integriert wird. Das Verfahren kann beinhalten, das Transgen so zu gestalten, dass der erste Spleißakzeptor operativ mit der ersten Teilkodiersequenz verbunden ist und der zweite Spleißakzeptor operativ mit der zweiten Teilkodiersequenz verbunden ist. Die Anordnung kann auch beinhalten, dass die erste Teilkodiersequenz operativ mit dem ersten Terminator verbunden ist und die zweite Teilkodiersequenz operativ mit dem zweiten Terminator verbunden ist. In einer Ausführungsform können die beiden Terminatoren durch einen einzigen bidirektionalen Terminator ersetzt werden. In einer Ausführungsform können Transgene mit erstem und zweitem Spleißakzeptor, erster und zweiter Teilkodiersequenz und erstem und zweitem Terminator in einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung orientiert sein. Die Transgene mit einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung der Sequenzen können ferner eine erste und zweite Zielstelle für eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen umfassen, wobei die Zielstellen die ersten und zweiten Spleißakzeptoren flankieren. In einer anderen Ausführungsform können die Transgene einen linken und rechten Homologiearm umfassen, die den ersten und zweiten Spleißakzeptor flankieren. In dieser Ausführungsform kann das Transgen innerhalb eines Adeno-assoziierten viralen Vektors beherbergt werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Transgen ferner eine erste und zweite Zielstelle für die eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen umfassen, wobei die Zielstellen den ersten und zweiten Spleißakzeptor flankieren. Die ersten und zweiten Zielstellen können den ersten und zweiten Homologiearm flankieren. In Ausführungsformen können die hier beschriebenen Transgene innerhalb eines Introns des endogenen Gens oder an einer Intron-Exon-Verbindungsstelle integriert werden. Die Transgene können innerhalb eines Introns oder an der Intron-Exon-Verbindungsstelle des ATXN3-Gens oder des CACNA1A-Gens integriert werden. Das Transgen kann eine erste und zweite Teilkodiersequenz umfassen, die für das Peptid kodiert, das von Exon 10 eines nicht-pathogenen ATXN3-Gens produziert wird, und kann auf Intron 9 oder die Intron-9-Exon-10-Verbindungsstelle eines pathogenen ATXN3-Gens ausgerichtet sein. Das Transgen kann eine erste und eine zweite Teilkodiersequenz umfassen, die für das Peptid kodieren, das von Exon 47 eines nicht-pathogenen CACNA1A-Gens produziert wird, und kann auf Intron 46 oder die Intron 46-Exon 47-Verbindungsstelle eines pathogenen CACNA1A-Gens ausgerichtet sein. In bestimmten Ausführungsformen kann die selten schneidende Endonuklease eine CRISPR/Cas12a-Nuklease oder eine CRISPR/Cas9-Nuklease sein. Die erste und zweite Teilkodiersequenz kodieren die gleichen Aminosäuren. In einer Ausführungsform können sich die erste und die zweite kodierende Sequenz in der Nukleinsäuresequenz unterscheiden, aber für die gleichen Aminosäuren kodieren. Das Transgen kann auf einem Vektor beherbergt werden, wobei das Vektorformat aus doppelsträngiger linearer DNA, doppelsträngiger zirkulärer DNA oder einem viralen Vektor ausgewählt ist. Der virale Vektor kann einen Adenovirus-Vektor, einen Adeno-assoziierten Virus-Vektor oder einen Lentivirus-Vektor umfassen. Die hier beschriebenen Verfahren können mit einem Transgen verwendet werden, das gleich oder kleiner als 4,7 kb ist. Das Transgen kann eine erste und zweite Teilkodiersequenz umfassen, die für ein partielles Peptid eines funktionellen Proteins kodieren, das von dem endogenen Zielgen produziert wird. Das endogene Zielgen kann aberrant sein.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt dieses Dokument DNA-Polynukleotide mit einer ersten und einer zweiten Spleißakzeptorsequenz, einer ersten und einer zweiten partiellen kodierenden Sequenz bzw. Teilkodiersequenz, einem bidirektionalen Terminator oder einem ersten und einem zweiten Terminator, optional einem ersten und einem zweiten Homologiearm und optional einer ersten und einer zweiten Zielstelle für eine selten schneidende Endonuklease bereit. Die DNA-Polynukleotide können eine Anordnung umfassen, bei der der erste Spleißakzeptor operativ mit der ersten partiellen kodierenden Sequenz verbunden ist und der zweite Spleißakzeptor operativ mit der zweiten kodierenden Sequenz verbunden ist. Die Anordnung kann auch umfassen, dass die erste Teilkodiersequenz operativ mit dem ersten Terminator und die zweite Teilkodiersequenz operativ mit dem zweiten Terminator verbunden ist. In einer Ausführungsform können die beiden Terminatoren durch einen einzigen bidirektionalen Terminator ersetzt werden. In einer Ausführungsform können die DNA-Polynukleotide mit den ersten und zweiten Spleißakzeptoren, den ersten und zweiten kodierenden Sequenzen und den ersten und zweiten Terminatoren in einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung orientiert sein. Die DNA-Polynukleotide mit einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung der Sequenzen können ferner eine erste und zweite Zielstelle für eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen umfassen, wobei die Zielstellen die ersten und zweiten Spleißakzeptoren flankieren. In einer anderen Ausführungsform können die DNA-Polynukleotide einen linken und rechten Homologiearm umfassen, die die ersten und zweiten Spleißakzeptoren flankieren. In dieser Ausführungsform kann das DNA-Polynukleotid innerhalb eines Adeno-assoziierten viralen Vektors beherbergt werden. In einer anderen Ausführungsform können die DNA-Polynukleotide weiterhin eine erste und zweite Zielstelle für eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen umfassen, wobei die Zielstellen die ersten und zweiten Spleißakzeptoren flankieren. Die ersten und zweiten Zielstellen können den ersten und zweiten Homologiearm flankieren. In Ausführungsformen können die hierin beschriebenen DNA-Polynukleotide innerhalb eines Introns des endogenen Gens oder an einer Intron-Exon-Verbindungsstelle integriert werden. Die DNA-Polynukleotide können innerhalb eines Introns oder an der Intron-Exon-Verbindungsstelle des ATXN3-Gens oder des CACNA1A-Gens integriert werden. Das DNA-Polynukleotid kann eine erste und zweite partielle kodierende Sequenz umfassen, die für das Peptid kodiert, das von Exon 10 eines nicht-pathogenen ATXN3-Gens produziert wird. Das DNA-Polynukleotid kann eine erste und zweite partielle kodierende Sequenz umfassen, die das Peptid kodiert, das von Exon 47 eines nicht-pathogenen CACNA1A-Gens produziert wird. Die erste und die zweite partielle kodierende Sequenz kodieren für die gleichen Aminosäuren. In einer Ausführungsform können sich die erste und die zweite kodierende Sequenz in der Nukleinsäuresequenz unterscheiden, aber für die gleichen Aminosäuren kodieren. Die DNA-Polynukleotide können auf einem Vektor beherbergt werden, wobei das Vektorformat ausgewählt ist aus doppelsträngiger linearer DNA, doppelsträngiger zirkulärer DNA oder einem viralen Vektor. Der virale Vektor kann aus einem Adenovirus-Vektor, einem Adeno-assoziierten Virus-Vektor oder einem Lentivirus-Vektor ausgewählt werden. Die hier beschriebenen DNA-Polynukleotide können gleich oder kleiner als 4,7 kb sein.
  • In einer Ausführungsform weist dieses Dokument ein Verfahren zur Integration eines Transgens in ein endogenes Gen auf, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Transgens umfasst, wobei das Transgen ein linkes und rechtes Transposonende, eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, eine erste und zweite partielle kodierende Sequenz und einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator umfasst, und die Verabreichung einer Transposase, die auf das endogene Gen abzielt, wobei das Transgen in das endogene Gen integriert wird. Das Verfahren kann umfassen, das Transgen so zu gestalten, dass der erste Spleißakzeptor operativ mit der ersten Teilkodiersequenz verbunden ist und der zweite Spleißakzeptor operativ mit der zweiten kodierenden Sequenz verbunden ist. Die Anordnung kann auch umfassen, dass die erste Teilkodiersequenz operativ mit dem ersten Terminator verbunden ist und die zweite Teilkodiersequenz operativ mit dem zweiten Terminator verbunden ist. In einer Ausführungsform können die beiden Terminatoren durch einen einzigen bidirektionalen Terminator ersetzt werden. In einer Ausführungsform können die Transgene mit den ersten und zweiten Spleißakzeptoren, den ersten und zweiten kodierenden Sequenzen und den ersten und zweiten Terminatoren in einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung orientiert sein. Die Transgene mit einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung der Sequenzen können ferner ein linkes und rechtes Transposonende umfassen, das die ersten und zweiten Spleißakzeptoren flankiert. In Ausführungsformen können die hier beschriebenen Transgene innerhalb eines Introns des endogenen Gens oder an einer Intron-Exon-Verbindungsstelle integriert werden. Die Transgene können innerhalb eines Introns oder an der Intron-Exon-Verbindungsstelle des ATXN3-Gens oder des CACNA1A-Gens integriert werden. Das Transgen kann eine erste und zweite partielle kodierende Sequenz umfassen, die für das Peptid kodiert, das von Exon 10 eines nicht-pathogenen ATXN3-Gens produziert wird, und kann auf Intron 9 oder die Intron-9-Exon-10-Verbindungsstelle eines pathogenen ATXN3-Gens ausgerichtet sein. Das Transgen kann eine erste und zweite partielle kodierende Sequenz umfassen, die für das Peptid kodiert, das von Exon 47 eines nicht-pathogenen CACNA1AGens produziert wird, und kann auf Intron 46 oder die Intron 46-Exon 47-Verbindungsstelle eines pathogenen CACNA1A-Gens ausgerichtet sein. Die Transposase kann eine CRISPR-Transposase sein, wobei die CRISPR-Transposase das Cas12k- oder Cas6-Protein umfasst. Die erste und die zweite Teilkodiersequenz kodieren die gleichen Aminosäuren. In einer Ausführungsform können sich die erste und die zweite kodierende Sequenz in der Nukleinsäuresequenz unterscheiden, aber für die gleichen Aminosäuren kodieren. Das Transgen kann auf einem Vektor beherbergt werden, wobei das Vektorformat aus doppelsträngiger linearer DNA, doppelsträngiger zirkulärer DNA oder einem viralen Vektor ausgewählt ist. Der virale Vektor kann einen Adenovirus-Vektor, einen Adeno-assoziierten Virus-Vektor oder einen Lentivirus-Vektor umfassen. Die hier beschriebenen Verfahren können mit einem Transgen verwendet werden, das gleich oder kleiner als 4,7 kb ist. Das linke Ende kann die in SEQ ID NO:41 gezeigte Sequenz umfassen und das rechte Ende kann die in SEQ ID NO:13 gezeigte Sequenz umfassen.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt dieses Dokument DNA-Polynukleotide mit einer ersten und zweiten Spleißakzeptorsequenz, einer ersten und zweiten partiellen kodierenden Sequenz, einem bidirektionalen Terminator oder einem ersten und zweiten Terminator und einem linken und rechten Transposonende bereit. Die DNA-Polynukleotide können eine Anordnung umfassen, bei der der erste Spleißakzeptor operativ mit der ersten partiellen kodierenden Sequenz verbunden ist und der zweite Spleißakzeptor operativ mit der zweiten kodierenden Sequenz verbunden ist. Die Anordnung kann auch einschließen, dass die erste Teilkodiersequenz operativ mit dem ersten Terminator und die zweite Teilkodiersequenz operativ mit dem zweiten Terminator verbunden ist. In einer Ausführungsform können die beiden Terminatoren durch einen einzigen bidirektionalen Terminator ersetzt werden. In einer Ausführungsform können die DNA-Polynukleotide mit den ersten und zweiten Spleißakzeptoren, den ersten und zweiten kodierenden Sequenzen und den ersten und zweiten Terminatoren in einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung orientiert sein. Die DNA-Polynukleotide mit einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung der Sequenzen können ferner ein linkes und rechtes Transposonende umfassen, die die ersten und zweiten Spleißakzeptoren flankieren. In Ausführungsformen können die hier beschriebenen DNA-Polynukleotide innerhalb eines Introns des endogenen Gens oder an einer Intron-Exon-Verbindungsstelle integriert werden. Die DNA-Polynukleotide können innerhalb eines Introns oder an der Intron-Exon-Verbindungsstelle des ATXN3-Gens oder des CACNA1A-Gens integriert werden. Das DNA-Polynukleotid kann eine erste und zweite partielle kodierende Sequenz umfassen, die für das Peptid kodiert, das von Exon 10 eines nicht-pathogenen ATXN3-Gens produziert wird. Das DNA-Polynukleotid kann eine erste und zweite partielle kodierende Sequenz umfassen, die das Peptid kodiert, das von Exon 47 eines nicht-pathogenen CACNA1A-Gens produziert wird. Die erste und die zweite partielle kodierende Sequenz kodieren für die gleichen Aminosäuren. In einer Ausführungsform können sich die erste und die zweite kodierende Sequenz in der Nukleinsäuresequenz unterscheiden, aber für die gleichen Aminosäuren kodieren. Die DNA-Polynukleotide können auf einem Vektor beherbergt werden, wobei das Vektorformat ausgewählt ist aus doppelsträngiger linearer DNA, doppelsträngiger zirkulärer DNA oder einem viralen Vektor. Der virale Vektor kann aus einem Adenovirus-Vektor, einem Adeno-assoziierten Virus-Vektor oder einem Lentivirus-Vektor ausgewählt werden. Die hier beschriebenen DNA-Polynukleotide können gleich oder kleiner als 4,7 kb sein. Das linke Ende kann die in SEQ ID NO:41 gezeigte Sequenz umfassen und das rechte Ende kann die in SEQ ID NO:13 gezeigte Sequenz umfassen.
  • In einer Ausführungsform weist dieses Dokument ein Verfahren zur Integration eines Transgens in ein endogenes Gen auf, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Transgens umfasst, wobei das Transgen eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, eine erste und zweite kodierende Sequenz, einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator und einen ersten und zweiten Homologiearm umfasst, wobei das Transgen in das endogene Gen integriert wird. Das Verfahren kann umfassen, das Transgen so zu gestalten, dass der erste Spleißakzeptor operativ mit der ersten kodierenden Teilsequenz verbunden ist und der zweite Spleißakzeptor operativ mit der zweiten kodierenden Sequenz verbunden ist. Die Anordnung kann auch umfassen, dass die erste Teilkodiersequenz operativ mit dem ersten Terminator verbunden ist und die zweite Teilkodiersequenz operativ mit dem zweiten Terminator verbunden ist. In einer Ausführungsform können die beiden Terminatoren durch einen einzigen bidirektionalen Terminator ersetzt werden. Die Homologiearme können die erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, die erste und zweite kodierende Sequenz, den einen bidirektionalen Terminator oder den ersten und zweiten Terminator flankieren. Die kodierende Sequenz kann eine vollständige kodierende Sequenz oder eine partielle kodierende Sequenz kodieren. In einer Ausführungsform können Transgene mit erstem und zweitem Spleißakzeptor, erster und zweiter kodierender Sequenz und erstem und zweitem Terminator in einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung orientiert sein. Die Transgene mit einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung der Sequenzen können ferner eine erste und zweite Zielstelle für eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen umfassen, wobei die Zielstellen die ersten und zweiten Spleißakzeptoren flankieren. In einer anderen Ausführungsform können die Transgene einen linken und rechten Homologiearm umfassen, die den ersten und zweiten Spleißakzeptor flankieren. In dieser Ausführungsform kann das Transgen innerhalb eines Adeno-assoziierten viralen Vektors beherbergt werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Transgen ferner eine erste und zweite Zielstelle für die eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen umfassen, wobei die Zielstellen den ersten und zweiten Spleißakzeptor flankieren. Die ersten und zweiten Zielstellen können den ersten und zweiten Homologiearm flankieren. In Ausführungsformen können die hier beschriebenen Transgene innerhalb eines Introns des endogenen Gens oder an einer Intron-Exon-Verbindungsstelle integriert werden.
  • Bei der Durchführung der Verfahren sowie bei der Herstellung und Verwendung der hierin offenbarten Zusammensetzungen werden, sofern nicht anders angegeben, konventionelle Techniken der Molekularbiologie, Biochemie, Chromatinstruktur und -analyse, computergestützten Chemie, Zellkultur, rekombinanten DNA und verwandten Gebieten eingesetzt, wie sie in der Fachwelt üblich sind. Diese Techniken sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Siehe z. B. Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 und 3. Auflage, 2001; Ausubel et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 und periodische Aktualisierungen; die Reihe METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 3. Auflage, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Band 304, „Chromatin" (P. M. Wassarman und A. P. Wolffe, Hrsg.), Academic Press, San Diego, 1999; und METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Band 119, „Chromatin Protocols" (P. B. Becker, Hrsg.) Humana Press, Totowa, 1999.
  • Die hier verwendeten Begriffe „Nukleinsäure“ und „Polynukleotid“ können austauschbar verwendet werden. Nukleinsäure und Polynukleotid können sich auf ein Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotid-Polymer in linearer oder zirkulärer Konformation und in Einzel- oder Doppelstrangform beziehen. Diese Begriffe sind nicht als einschränkend in Bezug auf die Länge eines Polymers zu verstehen. Die Begriffe können sowohl bekannte Analoga natürlicher Nukleotide als auch Nukleotide umfassen, die in den Basen-, Zucker- und/oder Phosphatanteilen modifiziert sind.
  • Die Begriffe „Polypeptid“, „Peptid“ und „Protein“ können austauschbar verwendet werden und beziehen sich auf kovalent miteinander verbundene Aminosäurereste. Der Begriff gilt auch für Proteine, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren chemische Analoga oder modifizierte Derivate von entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäuren sind.
  • Die Begriffe „operativ verbunden“ oder „operabel verbunden“ werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine Nebeneinanderstellung von zwei oder mehr Komponenten (z. B. Sequenzelemente), bei der die Komponenten so angeordnet sind, dass beide Komponenten normal funktionieren und die Möglichkeit zulassen, dass mindestens eine der Komponenten eine Funktion vermitteln kann, die auf mindestens eine der anderen Komponenten ausgeübt wird. Zur Veranschaulichung: Eine transkriptionelle regulatorische Sequenz, wie z. B. ein Promotor, ist operativ mit einer kodierenden Sequenz verbunden, wenn die transkriptionelle regulatorische Sequenz das Niveau der Transkription der kodierenden Sequenz als Reaktion auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines oder mehrerer transkriptioneller regulatorischer Faktoren steuert. Eine transkriptionelle regulatorische Sequenz ist im Allgemeinen operativ in cis mit einer kodierenden Sequenz verbunden, muss aber nicht direkt an diese angrenzen. Beispielsweise ist ein Enhancer eine transkriptionelle regulatorische Sequenz, die operativ mit einer kodierenden Sequenz verbunden ist, auch wenn sie nicht aneinandergrenzen. Weiterhin kann beispielsweise ein Spleißakzeptor operativ mit einer partiellen kodierenden Sequenz verbunden sein, wenn der Spleißakzeptor die Abgrenzung der 3'-Grenze eines Introns ermöglicht und wenn die Translation der resultierenden reifen mRNA zum Einbau der Peptidsequenz, die von der partiellen kodierenden Sequenz kodiert wird, in das endgültige Proteinprodukt führt.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Spaltung“ auf das Brechen des kovalenten Rückgrats eines Nukleinsäuremoleküls. Die Spaltung kann durch eine Vielzahl von Verfahren eingeleitet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die enzymatische oder chemische Hydrolyse einer Phosphodiesterbindung. Die Spaltung kann sich sowohl auf einen einzelsträngigen Nick als auch auf einen doppelsträngigen Bruch beziehen. Ein Doppelstrangbruch kann als Ergebnis von zwei verschiedenen einzelsträngigen Nicks auftreten. Die Nukleinsäurespaltung kann entweder zu stumpfen Enden oder zu versetzten Enden führen. In bestimmten Ausführungsformen werden selten schneidende Endonukleasen für die gezielte doppelsträngige oder einzelsträngige DNA-Spaltung verwendet.
  • Ein „exogenes“ Molekül kann sich auf ein kleines Molekül (z. B. Zucker, Lipide, Aminosäuren, Fettsäuren, phenolische Verbindungen, Alkaloide) oder ein Makromolekül (z. B. Protein, Nukleinsäure, Kohlenhydrat, Lipid, Glykoprotein, Lipoprotein, Polysaccharid) oder ein modifiziertes Derivat der oben genannten Moleküle oder einen Komplex beziehen, der eines oder mehrere der oben genannten Moleküle umfasst und außerhalb einer Zelle erzeugt wird oder vorhanden ist oder normalerweise nicht in einer Zelle vorhanden ist. Exogene Moleküle können in Zellen eingeführt werden. Verfahren zur Einführung oder „Verabreichung“ exogener Moleküle in Zellen können den Lipid-vermittelten Transfer, die Elektroporation, die direkte Injektion, die Zellfusion, den Partikelbeschuss, die Calciumphosphat-Copräzipitation, den DEAE-Dextran-vermittelten Transfer und den durch virale Vektoren vermittelten Transfer umfassen. Wie hier definiert, kann sich „Verabreichung“ auf die Abgabe, die Bereitstellung oder die Einführung von exogenen Molekülen in eine Zelle beziehen. Wenn ein Transgen oder eine selten schneidende Endonuklease an eine Zelle verabreicht wird, dann wird das Transgen oder die selten schneidende Endonuklease an die Zelle abgegeben, bereitgestellt oder in die Zelle eingeführt. Die selten schneidende Endonuklease kann als gereinigtes Protein, als Nukleinsäure oder als Mischung aus gereinigtem Protein und Nukleinsäure verabreicht werden. Die Nukleinsäure (d. h. RNA oder DNA) kann für die selten schneidende Endonuklease oder einen Teil einer selten schneidenden Endonuklease (z. B. eine gRNA) kodieren. Die Verabreichung kann durch Verfahren wie Lipid-vermittelten Transfer, Elektroporation, direkte Injektion, Zellfusion, Partikelbeschuss, Calciumphosphat-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelten Transfer, viralen Vektor-vermittelten Transfer oder jedes andere geeignete Mittel zur Abgabe von gereinigtem Protein oder Nukleinsäuren oder einer Mischung aus gereinigtem Protein und Nukleinsäuren an eine Zelle erreicht werden.
  • Ein „endogenes“ Molekül ist ein Molekül, das in einer bestimmten Zelle in einem bestimmten Entwicklungsstadium unter bestimmten Umgebungsbedingungen vorhanden ist. Ein endogenes Molekül kann eine Nukleinsäure, ein Chromosom, das Genom eines Mitochondriums, Chloroplasten oder einer anderen Organelle oder eine natürlich vorkommende episomale Nukleinsäure sein. Weitere endogene Moleküle können Proteine sein, z. B. Transkriptionsfaktoren und Enzyme.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich ein „Gen“ auf eine kodierende DNA-Region, die für ein Genprodukt kodiert, einschließlich aller DNA-Regionen, die die Produktion des Genprodukts regulieren. Dementsprechend schließt ein Gen Promotorsequenzen, Terminatoren, translationale regulatorische Sequenzen wie Ribosomenbindungsstellen und interne Ribosomeneintrittsstellen, Enhancer, Silencer, Isolatoren, Boundary-Elemente, Replikationsursprünge, Matrixanheftungsstellen und Locus-Kontrollregionen ein, ist aber nicht notwendigerweise darauf beschränkt. Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „Wildtyp-Gen“ auf eine Form des Gens, die mit der höchsten Frequenz in einer bestimmten Population vorhanden ist.
  • Ein „endogenes Gen“ bezieht sich auf eine DNA-Region, die normalerweise in einer bestimmten Zelle vorhanden ist und ein Genprodukt kodiert, sowie auf alle DNA-Regionen, die die Produktion des Genprodukts regulieren.
  • „Genexpression“ bezieht sich auf die Umsetzung der in einem Gen enthaltenen Information in ein Genprodukt. Ein Genprodukt kann das direkte Transkriptionsprodukt eines Gens sein. Das Genprodukt kann z. B. mRNA, tRNA, rRNA, Antisense-RNA, Ribozym, Struktur-RNA oder ein durch Translation einer mRNA erzeugtes Protein sein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Zu den Genprodukten gehören auch RNAs, die durch Prozesse wie Capping, Polyadenylierung, Methylierung und Editing modifiziert sind, sowie Proteine, die z. B. durch Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung, ADP-Ribosylierung, Myristylierung und Glykosylierung modifiziert sind.
  • „Kodierung“ bezieht sich auf die Umwandlung der in einer Nukleinsäure enthaltenen Information in ein Produkt, wobei das Produkt aus dem direkten Transkriptionsprodukt einer Nukleinsäuresequenz entstehen kann. Das Produkt kann z. B. mRNA, tRNA, rRNA, Antisense-RNA, Ribozym, Struktur-RNA oder ein durch Translation einer mRNA erzeugtes Protein sein, ist aber nicht darauf beschränkt. Zu den Genprodukten gehören auch RNAs, die durch Prozesse wie Capping, Polyadenylierung, Methylierung und Editing modifiziert sind, sowie Proteine, die z. B. durch Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung, ADP-Ribosylierung, Myristylierung und Glykosylierung modifiziert sind.
  • Eine „Zielstelle“ oder „Zielsequenz“ definiert einen Abschnitt einer Nukleinsäure, an den eine selten schneidende Endonuklease oder eine CRISPR-assoziierte Transposase binden wird, sofern ausreichende Bedingungen für die Bindung bestehen.
  • Der hier verwendete Begriff „Rekombination“ bezieht sich auf einen Prozess des Austauschs genetischer Information zwischen zwei Polynukleotiden. Der Begriff „homologe Rekombination (HR)“ bezieht sich auf eine spezielle Form der Rekombination, die z. B. bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen stattfinden kann. Die homologe Rekombination erfordert eine Nukleotidsequenzhomologie, die auf einem „Donor“-Molekül vorhanden ist. Das Donor-Molekül kann von der Zelle als Templat für die Reparatur eines Doppelstrangbruchs verwendet werden. Informationen innerhalb des Donor-Moleküls, die sich von der genomischen Sequenz am oder in der Nähe des Doppelstrangbruchs unterscheiden, können stabil in die genomische DNA der Zelle eingebaut werden.
  • Der hier verwendete Begriff „Integrieren“ bezieht sich auf den Prozess des Hinzufügens von DNA zu einer Zielregion der DNA. Wie hierin beschrieben, kann die Integration durch verschiedene Mittel erleichtert werden, einschließlich nicht-homologer Endverbindung, homologer Rekombination oder gezielter Transposition. Beispielsweise kann die Integration eines vom Anwender bereitgestellten DNA-Moleküls in ein Zielgen durch nicht-homologe Endverbindung erleichtert werden. Dabei wird ein gezielter Doppelstrangbruch innerhalb des Zielgens durchgeführt und ein vom Anwender bereitgestelltes DNA-Molekül verabreicht. Das vom Anwender bereitgestellte DNA-Molekül kann exponierte DNA-Enden umfassen, um das Einfangen während der Reparatur des Zielgens durch nicht-homologe Endverbindung zu erleichtern. Die exponierten Enden können bei der Verabreichung auf dem DNA-Molekül vorhanden sein (d. h. Verabreichung eines linearen DNA-Moleküls) oder bei der Verabreichung an die Zelle erzeugt werden (d. h. eine selten schneidende Endonuklease spaltet das vom Anwender bereitgestellte DNA-Molekül innerhalb der Zelle, um die Enden freizulegen). Zusätzlich kann das vom Anwender bereitgestellte DNA-Molekül auf einem viralen Vektor, einschließlich eines Adeno-assoziierten Virusvektors, beherbergt werden. In einem anderen Beispiel erfolgt die Integration durch homologe Rekombination. Hier kann die vom Anwender bereitgestellte DNA einen linken und rechten Homologiearm beherbergen. In einem anderen Beispiel erfolgt die Integration durch Transposition. Hier beherbergt die vom Anwender bereitgestellte DNA ein linkes und rechtes Transposonende.
  • Der hier verwendete Begriff „Transgen“ bezieht sich auf eine Sequenz von Nukleinsäuren, die auf einen Organismus oder eine Zelle übertragen werden kann. Das Transgen kann ein Gen oder eine Sequenz von Nukleinsäuren umfassen, die normalerweise im Zielorganismus oder in der Zielzelle nicht vorhanden sind. Zusätzlich kann das Transgen eine Kopie eines Gens oder einer Sequenz von Nukleinsäuren umfassen, die normalerweise im Zielorganismus oder in der Zielzelle vorhanden ist. Ein Transgen kann eine exogene DNA-Sequenz sein, die in das Zytoplasma oder den Zellkern einer Zielzelle eingeführt wird. In einer Ausführungsform enthalten die hier beschriebenen Transgene partielle kodierende Sequenzen, wobei die partiellen kodierenden Sequenzen für einen Teil eines Proteins kodieren, das von einem Gen in der Wirtszelle produziert wird.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „pathogen“ auf alles, was eine Krankheit verursachen kann. Eine pathogene Mutation kann sich auf eine Veränderung in einem Gen beziehen, die eine Krankheit verursacht. Ein pathogenes Gen bezieht sich auf ein Gen, das eine Modifikation enthält, die eine Krankheit verursacht. Als Beispiel bezieht sich ein pathogenes ATXN3-Gen bei Patienten mit Spinozerebellärer Ataxie 3 auf ein ATXN3-Gen mit einer expandierten CAG-Trinukleotidwiederholung, wobei die expandierte CAG-Trinukleotidwiederholung die Krankheit verursacht.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Schwanz-zu-Schwanz“ auf eine Orientierung zweier Einheiten in entgegengesetzter und reverser Richtung. Die beiden Einheiten können zwei Sequenzen auf einem einzigen Nukleinsäuremolekül sein, wobei das 3'-Ende jeder Sequenz nebeneinander angeordnet ist. Zum Beispiel kann eine erste Nukleinsäure mit den Elementen, in einer 5' zu 3'-Richtung, [Spleißakzeptor 1] - [partielle kodierende Sequenz 1] - [Terminator 1] und eine zweite Nukleinsäure mit den Elementen [Spleißakzeptor 2] - [partielle kodierende Sequenz 2] - [Terminator 2] in einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung platziert werden, was zu [Spleißakzeptor 1] - [partielle kodierende Sequenz 1] - [Terminator 1] - [Terminator 2 RC] - [partielle kodierende Sequenz 2 RC] - [Spleißakzeptor 2 RC] führt, wobei RC sich auf das reverse Komplement bezieht.
  • Der Begriff „Intron-Exon-Verbindungsstelle“ bezieht sich auf eine bestimmte Stelle innerhalb eines Gens. Die spezifische Stelle liegt zwischen dem letzten Nukleotid in einem Intron und dem ersten Nukleotid des folgenden Exons. Wenn ein hier beschriebenes Transgen integriert wird, kann das Transgen innerhalb der „Intron-Exon-Verbindungsstelle“ bzw. „Intron-Exon-Junction“ integriert werden. Wenn das Transgen Fracht enthält, wird die Fracht unmittelbar nach dem letzten Nukleotid im Intron integriert. In einigen Fällen kann die Integration eines Transgens innerhalb der Intron-Exon-Verbindungsstelle zu einer Entfernung der Sequenz innerhalb des Exons führen (z. B. Integration über HR und Ersetzen der Sequenz innerhalb des Exons durch die Fracht innerhalb des Transgens).
  • Der hier verwendete Begriff „homolog“ bezieht sich auf eine Sequenz von Nukleinsäuren oder Aminosäuren mit Ähnlichkeit zu einer zweiten Sequenz von Nukleinsäuren oder Aminosäuren. In einigen Ausführungsformen können die homologen Sequenzen mindestens 80% Sequenzidentität (z. B. 81%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität) zueinander aufweisen.
  • Der hier verwendete Begriff „partielle kodierende Sequenz“ bzw. „Teilkodiersequenz“ bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die für ein partielles Protein kodiert. Die partiell kodierende Sequenz kann ein Protein kodieren, das im Vergleich zum Wildtyp-Protein oder funktionellen Protein eine oder weniger Aminosäuren umfasst. Die partiell kodierende Sequenz kann für ein partielles Protein mit Homologie zum Wildtyp-Protein oder funktionellen Protein kodieren. Der Begriff „partielle kodierende Sequenz“ bezieht sich in Bezug auf ATXN3 auf eine Sequenz von Nukleinsäuren, die für ein partielles ATXN3-Protein kodiert. Das partielle ATXN3-Protein hat eine oder weniger Aminosäuren im Vergleich zu einem Wildtyp-ATXN3-Protein. Wenn das 3'-Ende des Gens modifiziert wird, können die eine oder weniger Aminosäuren vom N-terminalen Ende des Proteins stammen. Wenn das ATXN3-Gen 11 Exons hat, dann kann die partielle kodierende Sequenz eine Sequenz umfassen, die das Peptid kodiert, das von den Exons 2-11 oder 3-11 oder 4-11 oder 5-11 oder 6-11 oder 7-11 oder 8-11 oder 9-11 oder 10-11 oder 11 produziert wird.
  • Die in diesem Dokument beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen können Transgene mit einer Cargo-Sequenz bzw. Fracht-Sequenz verwenden. Der Begriff „Cargo“ bzw. „Fracht“ kann sich auf Elemente wie die vollständige oder partielle kodierende Sequenz eines Gens, eine partielle Sequenz eines Gens mit Einzelnukleotid-Polymorphismen relativ zum WT oder veränderten Ziel, einen Spleißakzeptor, einen Terminator, ein transkriptionelles regulatorisches Element, Reinigungs-Tags (z. B. Glutathion-S-Transferase, Poly(His), Maltose-bindendes Protein, Strep-Tag, Myc-Tag, AviTag, HA-Tag oder Chitin-bindendes Protein) oder Reportergene (z. B. GFP, RFP, lacZ, cat, Luciferase, puro, Neomycin) beziehen. Wie hier definiert, kann sich „Cargo“ auf die Sequenz innerhalb eines Transgens beziehen, die an einer Zielstelle integriert wird. Zum Beispiel kann sich „Cargo“ auf die Sequenz auf einem Transgen zwischen zwei Homologiearmen, zwei Zielstellen für eine selten schneidende Endonuklease oder einem linken und rechten Transposonende beziehen.
  • Der Begriff „Homologiesequenz“ bezieht sich auf eine Sequenz von Nukleinsäuren, die eine Homologie zu einer zweiten Nukleinsäure aufweist. Die Homologiesequenz kann z. B. auf einem Donormolekül als „Arm mit Homologie“ oder „Homologiearm“ vorhanden sein. Ein Homologiearm kann eine Sequenz von Nukleinsäuren innerhalb eines Donormoleküls sein, die eine homologe Rekombination mit der zweiten Nukleinsäure erleichtert. Wie hierin definiert, kann ein Homologiearm auch als „Arm“ bezeichnet werden. In einem Donor-Molekül mit zwei Homologie-Armen können die Homologie-Arme als „Arm 1“ und „Arm 2“ bezeichnet werden. In einem Aspekt kann eine Frachtsequenz mit einem ersten und zweiten Homologiearm flankiert sein.
  • Der Begriff „bidirektionaler Terminator“ bezieht sich auf einen Terminator, der die RNA-Polymerase-Transkription entweder in Sense- oder Antisense-Richtung terminieren kann. Im Gegensatz zu zwei unidirektionalen Terminatoren in Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung kann ein bidirektionaler Terminator eine nicht-chimäre DNA-Sequenz umfassen. Beispiele für bidirektionale Terminatoren sind der ARO4-, TRP1-, TRP4-, ADH1-, CYC1-, GAL1-, GAL7- und GAL10-Terminator.
  • Ein 5'- oder 3'-Ende eines Nukleinsäuremoleküls bezieht sich auf die Ausrichtung und chemische Orientierung der Nukleinsäure. Wie hier definiert, kann das „5'-Ende eines Gens“ das Exon mit dem Startcodon umfassen, aber nicht das Exon mit dem Stoppcodon. Wie hier definiert, kann das „3'-Ende eines Gens“ das Exon mit dem Stoppcodon umfassen, aber nicht das Exon mit dem Startcodon.
  • Der Begriff „ATXN3“-Gen bezieht sich auf ein Gen, das für das Enzym Ataxin-3 kodiert. Eine repräsentative Sequenz des ATXN3-Gens findet sich unter NCBI Reference Sequence: NG_008198.2 und der entsprechenden SEQ ID NO:42. Die Exon- und Introngrenzen können mit der in SEQ ID NO:42 angegebenen Sequenz definiert werden. Im Einzelnen umfasst Exon 1 die Sequenz von 1 bis 54. Exon 2 umfasst die Sequenz von 9745 bis 9909. Exon 3 umfasst die Sequenz von 10446 bis 10490. Exon 4 umfasst die Sequenz von 12752 bis 12837. Exon 5 umfasst die Sequenz von 13265 bis 13331. Exon 6 umfasst die Sequenz von 17766 bis 17853. Exon 7 umfasst die Sequenz von 23325 bis 23457. Exon 8 umfasst die Sequenz von 24117 bis 24283. Exon 9 umfasst die Sequenz von 25522 bis 25618. Exon 10 umfasst die Sequenz von 35530 bis 35648. Exon 11 umfasst die Sequenz von 42169 bis 48031. Intron 1 umfasst die Sequenz von 55 bis 9744. Intron 2 umfasst die Sequenz von 9910 bis 10445. Intron 3 umfasst die Sequenz von 10491 bis 12751. Intron 4 umfasst die Sequenz von 12838 bis 13264. Intron 5 umfasst die Sequenz von 13332 bis 17765. Intron 6 umfasst die Sequenz von 17854 bis 23324. Intron 7 umfasst die Sequenz von 23458 bis 24116. Intron 8 umfasst die Sequenz von 24284 bis 25521. Intron 9 umfasst die Sequenz von 25619 bis 35529. Intron 10 umfasst die Sequenz von 35649 bis 42168.
  • Der Begriff „CACNA1A“-Gen bezieht sich auf ein Gen, das für das Protein Calcium voltage-gated channel subunit alpha1A kodiert. Eine repräsentative Sequenz des CACNA1A-Gens findet sich unter NCBI Reference Sequence: NG_011569.1 und der entsprechenden SEQ ID NO:43. Die Exon- und Introngrenzen können mit der in SEQ ID NO:43 angegebenen Sequenz definiert werden. Im Einzelnen umfasst Exon 1 die Sequenz von 1 bis 529. Exon 2 umfasst die Sequenz von 51249 bis 51354. Exon 3 umfasst die Sequenz von 53446 bis 53585. Exon 4 umfasst die Sequenz von 134682 bis 134773. Exon 5 umfasst die Sequenz von 140992 bis 141144. Exon 6 umfasst die Sequenz von 146662 bis 146855. Exon 7 umfasst die Sequenz von 170552 bis 170655. Exon 8 umfasst die Sequenz von 171968 bis 172083. Exon 9 umfasst die Sequenz von 173536 bis 173592. Exon 10 umfasst die Sequenz von 176125 bis 176217. Exon 11 umfasst die Sequenz von 189140 bis 189349. Exon 12 umfasst die Sequenz von 193680 bis 193792. Exon 13 umfasst die Sequenz von 197933 bis 198045. Exon 14 umfasst die Sequenz von 198210 bis 198341. Exon 15 umfasst die Sequenz von 198607 bis 198679. Exon 16 umfasst die Sequenz von 202577 bis 202694. Exon 17 umfasst die Sequenz von 202848 bis 202915. Exon 18 umfasst die Sequenz von 205805 bis 205911. Exon 19 umfasst die Sequenz von 207108 bis 207917. Exon 20 umfasst die Sequenz von 219495 bis 219958. Exon 21 umfasst die Sequenz von 221255 bis 221393. Exon 22 umfasst die Sequenz von 223065 bis 223194. Exon 23 umfasst die Sequenz von 229333 bis 229392. Exon 24 umfasst die Sequenz von 230505 bis 230611. Exon 25 umfasst die Sequenz von 243628 bis 243727. Exon 26 umfasst die Sequenz von 244851 bis 245011. Exon 27 umfasst die Sequenz von 246760 bis 246897. Exon 28 umfasst die Sequenz von 248910 bis 249111. Exon 29 umfasst die Sequenz von 251202 bis 251366. Exon 30 umfasst die Sequenz von 253360 bis 253470. Exon 31 umfasst die Sequenz von 261196 bis 261279. Exon 32 umfasst die Sequenz von 270731 bis 270847. Exon 33 umfasst die Sequenz von 271187 bis 271252. Exon 34 umfasst die Sequenz von 271425 bis 271540. Exon 35 umfasst die Sequenz von 274601 bis 274751. Exon 36 umfasst die Sequenz von 276252 bis 276379. Exon 37 umfasst die Sequenz von 277666 bis 277762. Exon 38 umfasst die Sequenz von 281689 bis 281794. Exon 39 umfasst die Sequenz von 291853 bis 291960. Exon 40 umfasst die Sequenz von 292128 bis 292228. Exon 41 umfasst die Sequenz von 293721 bis 293830. Exon 42 umfasst die Sequenz von 293939 bis 294077. Exon 43 umfasst die Sequenz von 294245 bis 294358. Exon 44 umfasst die Sequenz von 295809 bis 295844. Exon 45 umfasst die Sequenz von 296963 bis 297149. Exon 46 umfasst die Sequenz von 297452 bis 297705. Exon 47 umfasst die Sequenz von 298413 bis 300019. Intron 1 umfasst die Sequenz von 530 bis 51248. Intron 2 umfasst die Sequenz von 51355 bis 53445. Intron 3 umfasst die Sequenz von 53586 bis 134681. Intron 4 umfasst die Sequenz von 134774 bis 140991. Intron 5 umfasst die Sequenz von 141145 bis 146661. Intron 6 umfasst die Sequenz von 146856 bis 170551. Intron 7 umfasst die Sequenz von 170656 bis 171967. Intron 8 umfasst die Sequenz von 172084 bis 173535. Intron 9 umfasst die Sequenz von 173593 bis 176124. Intron 10 umfasst die Sequenz von 176218 bis 189139. Intron 11 umfasst die Sequenz von 189350 bis 193679. Intron 12 umfasst die Sequenz von 193793 bis 197932. Intron 13 umfasst die Sequenz von 198046 bis 198209. Intron 14 umfasst die Sequenz von 198342 bis 198606. Intron 15 umfasst die Sequenz von 198680 bis 202576. Intron 16 umfasst die Sequenz von 202695 bis 202847. Intron 17 umfasst die Sequenz von 202916 bis 205804. Intron 18 umfasst die Sequenz von 205912 bis 207107. Intron 19 umfasst die Sequenz von 207918 bis 219494. Intron 20 umfasst die Sequenz von 219959 bis 221254. Intron 21 umfasst die Sequenz von 221394 bis 223064. Intron 22 umfasst die Sequenz von 223195 bis 229332. Intron 23 umfasst die Sequenz von 229393 bis 230504. Intron 24 umfasst die Sequenz von 230612 bis 243627. Intron 25 umfasst die Sequenz von 243728 bis 244850. Intron 26 umfasst die Sequenz von 245012 bis 246759. Intron 27 umfasst die Sequenz von 246898 bis 248909. Intron 28 umfasst die Sequenz von 249112 bis 251201. Intron 29 umfasst die Sequenz von 251367 bis 253359. Intron 30 umfasst die Sequenz von 253471 bis 261195. Intron 31 umfasst die Sequenz von 261280 bis 270730. Intron 32 umfasst die Sequenz von 270848 bis 271186. Intron 33 umfasst die Sequenz von 271253 bis 271424. Intron 34 umfasst die Sequenz von 271541 bis 274600. Intron 35 umfasst die Sequenz von 274752 bis 276251. Intron 36 umfasst die Sequenz von 276380 bis 277665. Intron 37 umfasst die Sequenz von 277763 bis 281688. Intron 38 umfasst die Sequenz von 281795 bis 291852. Intron 39 umfasst die Sequenz von 291961 bis 292127. Intron 40 umfasst die Sequenz von 292229 bis 293720. Intron 41 umfasst die Sequenz von 293831 bis 293938. Intron 42 umfasst die Sequenz von 294078 bis 294244. Intron 43 umfasst die Sequenz von 294359 bis 295808. Intron 44 umfasst die Sequenz von 295845 bis 296962. Intron 45 umfasst die Sequenz von 297150 bis 297451. Intron 46 umfasst die Sequenz von 297706 bis 298412.
  • Die prozentuale Sequenzidentität zwischen einer bestimmten Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz und einer Sequenz, auf die eine bestimmte Sequenzidentifikationsnummer verweist, wird wie folgt bestimmt. Zunächst wird eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz mit der in einer bestimmten SequenzIdentifikationsnummer angegebenen Sequenz unter Verwendung des Programms BLAST 2 Sequences (B12seq) aus der Standalone-Version von BLASTZ, die BLASTN Version 2.0.14 und BLASTP Version 2.0.14 enthält, verglichen. Diese Standalone-Version von BLASTZ kann online unter fr.com/blast oder unter ncbi.nlm.nih.gov bezogen werden. Eine Anleitung zur Verwendung des B12seq-Programms findet sich in der Readme-Datei zu BLASTZ. Bl2seq führt einen Vergleich zwischen zwei Sequenzen entweder mit dem BLASTN- oder dem BLASTP-Algorithmus durch. BLASTN wird für den Vergleich von Nukleinsäuresequenzen verwendet, während BLASTP für den Vergleich von Aminosäuresequenzen verwendet wird. Um zwei Nukleinsäuresequenzen zu vergleichen, werden die Optionen wie folgt gesetzt: -i wird auf eine Datei gesetzt, die die erste zu vergleichende Nukleinsäuresequenz enthält (z. B. C:\seq1.txt); -j wird auf eine Datei gesetzt, die die zweite zu vergleichende Nukleinsäuresequenz enthält (z. B. C:\seq2.txt); -p wird auf blastn gesetzt; -o wird auf einen beliebigen Dateinamen gesetzt (z. B. C:\output.txt); -q wird auf -1 gesetzt; -r wird auf 2 gesetzt; und alle anderen Optionen werden auf ihrer Standardeinstellung belassen. Der folgende Befehl kann z. B. verwendet werden, um eine Ausgabedatei zu erzeugen, die einen Vergleich zwischen zwei Sequenzen enthält: C:\B12seq -i c:\seq1.txt - j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Um zwei Aminosäuresequenzen zu vergleichen, werden die Optionen von Bl2seq wie folgt gesetzt: -i wird auf eine Datei gesetzt, die die erste zu vergleichende Aminosäuresequenz enthält (z. B. C:\seq1.txt); -j wird auf eine Datei gesetzt, die die zweite zu vergleichende Aminosäuresequenz enthält (z. B. C:\seq2.txt); -p wird auf blastp gesetzt; -o wird auf einen beliebigen Dateinamen gesetzt (z. B. C:\output.txt); und alle anderen Optionen werden auf ihrer Standardeinstellung belassen. Der folgende Befehl kann z. B. verwendet werden, um eine Ausgabedatei zu erzeugen, die einen Vergleich zwischen zwei Aminosäuresequenzen enthält: C:\B12seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Wenn die beiden verglichenen Sequenzen eine gemeinsame Homologie aufweisen, werden in der angegebenen Ausgabedatei diese Bereiche der Homologie als Sequenzalignments dargestellt. Wenn die beiden verglichenen Sequenzen keine gemeinsame Homologie aufweisen, werden in der angegebenen Ausgabedatei keine Sequenzalignments angezeigt.
  • Nach dem Alignment bzw. der vergleichenden Anordnung wird die Anzahl der Übereinstimmungen bestimmt, indem die Anzahl der Positionen gezählt wird, an denen ein identischer Nukleotid- oder Aminosäurerest in beiden Sequenzen vorhanden ist. Die prozentuale Sequenzidentität wird bestimmt, indem die Anzahl der Übereinstimmungen entweder durch die Länge der Sequenz in der identifizierten Sequenz oder durch eine artikulierte Länge (z. B. 100 aufeinanderfolgende Nukleotide oder Aminosäurereste von einer Sequenz in einer identifizierten Sequenz) geteilt wird, gefolgt von der Multiplikation des resultierenden Wertes mit 100. Der prozentuale Sequenzidentitätswert wird auf das nächste Zehntel gerundet.
  • In einer Ausführungsform zeigt dieses Dokument Verfahren zur Modifizierung des 3'-Endes von endogenen Genen, wobei endogene Gene mindestens ein Intron zwischen zwei kodierenden Exons aufweisen. Das Intron kann jedes Intron sein, das von der normalen messenger-RNA-Prozessierungsmaschinerie aus der Vorläufer-messenger-RNA entfernt wird. Das Intron kann zwischen 20 bp und >500 kb groß sein und Elemente wie eine Spleiß-Donorstelle, eine Verzweigungssequenz und eine Akzeptorstelle umfassen. Die hier offengelegten Transgene zur Modifikation des 3'-Endes endogener Gene können mehrere funktionelle Elemente umfassen, einschließlich Zielstellen für selten schneidende Endonukleasen, Homologiearme, Spleißakzeptorsequenzen, kodierende Sequenzen und Transkriptionsterminatoren ( 1) .
  • In einer Ausführungsform umfasst das Transgen zwei Zielstellen für eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen. Die Zielstellen können eine geeignete Sequenz und Länge für die Spaltung durch eine selten schneidende Endonuklease aufweisen. Die Zielstellen können für die Spaltung durch CRISPR-Systeme, TAL-Effektor-Nukleasen, Zink-Finger-Nukleasen oder Meganukleasen oder eine Kombination von CRISPR-Systemen, TALE-Nukleasen, Zink-Finger-Nukleasen oder Meganukleasen oder jede andere ortsspezifische Nuklease geeignet sein. Die Zielstellen können so positioniert werden, dass die Spaltung durch die selten schneidende Endonuklease zur Freisetzung eines Transgens aus einem Vektor führt. Der Vektor kann virale Vektoren (z. B. Adeno-assoziierte Vektoren) oder nichtvirale Vektoren (z. B. Plasmide, Minicircle-Vektoren) umfassen. Wenn das Transgen zwei Zielstellen umfasst, können die Zielstellen die gleiche Sequenz sein (d. h., sie werden von der gleichen selten schneidenden Endonuklease angegriffen) oder sie können unterschiedliche Sequenzen sein (d. h., sie werden von zwei oder mehr unterschiedlichen selten schneidenden Endonukleasen angegriffen).
  • In einer Ausführungsform umfasst das Transgen eine erste und zweite Zielstelle für eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen zusammen mit einem ersten und zweiten Homologiearm. Der erste und der zweite Homologiearm können eine Sequenz enthalten, die homolog zu einer genomischen Sequenz an oder in der Nähe der gewünschten Integrationsstelle ist. Die Homologiearme können eine geeignete Länge aufweisen, um an der homologen Rekombination mit der Sequenz an oder in der Nähe der gewünschten Integrationsstelle teilzunehmen. Die Länge jedes Homologiearms kann zwischen 20 nt und 10.000 nt liegen (z. B., 20 nt, 30 nt, 40 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt, 300 nt, 400 nt, 500 nt, 600 nt, 700 nt, 800 nt, 900 nt, 1.000 nt, 2.000 nt, 3.000 nt, 4.000 nt, 5.000 nt, 6.000 nt, 7.000 nt, 8.000 nt, 9.000 nt, 10.000 nt). In einer Ausführungsform kann ein Homologiearm funktionelle Elemente umfassen, einschließlich einer Zielstelle für eine selten schneidende Endonuklease und/oder eine Spleißakzeptorsequenz. In einer Ausführungsform kann ein erster Homologiearm (z. B. ein linker Homologiearm) eine Sequenz umfassen, die homolog zu dem Intron ist, auf das abgezielt wird, was die Spleißakzeptorstelle des Introns, auf das abgezielt wird, einschließt. In einer anderen Ausführungsform kann ein zweiter Homologiearm eine Sequenz umfassen, die zu einer genomischen Sequenz stromabwärts des Introns, auf das abgezielt wird, homolog ist (z. B. eine Exon-Sequenz, eine 3'-UTR-Sequenz). Der zweite Homologiearm darf jedoch keine Spleißakzeptorfunktionen in der reversen Komplementrichtung besitzen. Um festzustellen, ob eine Sequenz Spleißakzeptorfunktionen aufweist, können mehrere Schritte unternommen werden, einschließlich In-silico-Analysen und experimenteller Tests. Um festzustellen, ob Potenzial für Spleißakzeptorfunktionen vorhanden ist, kann die für den zweiten Homologiearm gewünschte Sequenz nach Konsensus-Verzweigungssequenzen (z. B. YTRAC) und Spleißakzeptorstellen (z. B. Y-reiches NCAGG) durchsucht werden. Wenn Verzweigungs- oder Spleißakzeptorsequenzen vorhanden sind, können Einzelnukleotid-Polymorphismen eingeführt werden, um die Funktion zu zerstören, oder es kann eine andere, aber benachbarte Sequenz ausgewählt werden, die keine solchen Sequenzen enthält. Vorzugsweise erstreckt sich das Fenster der Sequenz, die für einen zweiten Homologiearm verwendet werden kann, von 1 bp bis 10kb stromabwärts des Introns, auf das für die Integration abgezielt wird. Um experimentell zu bestimmen, ob die zweite Homologie eine Spleißakzeptorfunktion besitzt, kann ein synthetisches Konstrukt konstruiert werden, das den zweiten Homologiearm innerhalb eines Introns in einem Reportergen umfasst. Das Konstrukt kann dann einem geeigneten Zelltyp verabreicht und auf Spleißfunktion überwacht werden.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Transgen zwei Spleißakzeptorsequenzen, die hier als erste und zweite Spleißakzeptorsequenz bezeichnet werden. Die erste und die zweite Spleißakzeptorsequenz sind innerhalb des Transgens in entgegengesetzten Richtungen (d. h. in Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung) positioniert und flankieren interne Sequenzen (d. h. kodierende Sequenzen und Terminatoren). Wenn das Transgen in Vorwärts- oder Rückwärtsrichtung in ein Intron integriert ist, erleichtern die Spleißakzeptorsequenzen die Entfernung der benachbarten/stromaufwärts gerichteten Intronsequenz während der mRNA-Prozessierung. Die erste und die zweite Spleißakzeptorsequenz können die gleichen Sequenzen oder unterschiedliche Sequenzen sein. Eine oder beide Spleißakzeptorsequenzen können die Spleißakzeptorsequenz des Introns sein, in das das Transgen integriert werden soll. Eine oder beide Spleißakzeptorsequenzen können eine synthetische Spleißakzeptorsequenz oder eine Spleißakzeptorsequenz aus einem Intron eines anderen Gens sein.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Transgen eine erste und eine zweite kodierende Sequenz, die operativ mit der ersten und der zweiten Spleißakzeptorsequenz verbunden sind. Die erste und die zweite kodierende Sequenz sind innerhalb des Transgens in entgegengesetzten Richtungen positioniert (d. h. in Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung). Wenn das Transgen in ein endogenes Gen in Vorwärts- oder Rückwärtsrichtung integriert wird, wird die erste oder zweite kodierende Sequenz durch den Promotor des endogenen Gens in mRNA transkribiert. Die kodierenden Sequenzen können so gestaltet sein, dass sie defekte kodierende Sequenzen korrigieren, Mutationen einführen oder neue Peptidsequenzen einführen. Die erste und die zweite kodierende Sequenz können die gleiche Nukleinsäuresequenz sein und für das gleiche Protein kodieren. Alternativ können die erste und die zweite kodierende Sequenz unterschiedliche Nukleinsäuresequenzen sein und für dasselbe Protein kodieren (d. h. unter Ausnutzung der Degeneriertheit von Codons). Die kodierende Sequenz kann für Reinigungs-Tags (z. B. Glutathion-S-Transferase, Poly(His), Maltose-bindendes Protein, Strep-Tag, Myc-Tag, AviTag, HA-Tag oder Chitin-bindendes Protein) oder Reporterproteine (z. B. GFP, RFP, lacZ, cat, Luciferase, puro, Neomycin) kodieren. In einer Ausführungsform umfasst das Transgen eine erste und zweite partielle kodierende Sequenz, die operativ mit einer ersten und zweiten Spleißakzeptorsequenz verbunden sind, und das Transgen umfasst keinen Promotor.
  • In einer Ausführungsform kann das Transgen einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator umfassen, die operativ mit einer ersten und zweiten kodierenden Sequenz verbunden sind. Der bidirektionale Terminator oder der erste und der zweite Terminator sind innerhalb des Transgens in entgegengesetzten Richtungen positioniert (d. h. in Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung). Wenn das Transgen in ein endogenes Gen in Vorwärts- oder Rückwärtsrichtung integriert wird, beenden der bidirektionale Terminator oder der erste und zweite Terminator die Transkription vom Promotor des endogenen Gens. Der erste und der zweite Terminator können die gleichen Terminatoren oder unterschiedliche Terminatoren sein.
  • In einer Ausführungsform stellt dieses Dokument ein Transgen bereit, das eine erste und zweite Zielstelle für eine selten schneidende Endonuklease, eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, eine erste und zweite kodierende Sequenz und einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator umfasst. Das Transgen kann über nicht-homologieabhängige Verfahren, einschließlich nicht-homologes End Joining und alternatives nicht-homologes End Joining oder durch mikrohomologievermitteltes End Joining, in endogene Gene integriert werden. In einem Aspekt wird das Transgen in ein Intron innerhalb des endogenen Gens integriert (2).
  • In einer anderen Ausführungsform stellt dieses Dokument ein Transgen bereit, das einen ersten und zweiten Homologiearm, eine erste und zweite Zielstelle für eine selten schneidende Endonuklease, eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, eine erste und zweite kodierende Sequenz und einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator umfasst. Das Transgen kann sowohl über homologieabhängige Verfahren (z. B. syntheseabhängiges Strangannealing und mikrohomologievermitteltes End Joining) als auch über nicht-homologieabhängige Verfahren (z. B. nicht-homologes End Joining und alternatives nicht-homologes End Joining) in endogene Gene integriert werden. In einem Aspekt wird das Transgen in ein Intron innerhalb des endogenen Gens integriert (3). In einem anderen Aspekt wird das Transgen am Ende des Introns oder am Anfang des stromabwärts gelegenen Exons integriert (3).
  • In einer anderen Ausführungsform stellt dieses Dokument ein Transgen bereit, das einen ersten und zweiten Homologiearm, eine erste und zweite kodierende Sequenz, eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz und einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator umfasst (1). In einer anderen Ausführungsform stellt dieses Dokument ein Transgen bereit, das eine erste und zweite kodierende Sequenz, eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz und einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator umfasst.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt dieses Dokument ein Transgen bereit, das einen ersten und zweiten Homologiearm, eine erste und zweite kodierende Sequenz, eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator und eine erste und zweite zusätzliche Sequenz umfasst (1). In bestimmten Ausführungsformen kann die zusätzliche Sequenz eine beliebige zusätzliche Sequenz sein, die auf dem Transgen am 5'- und 3'-Ende vorhanden ist, jedoch sollte die zusätzliche Sequenz kein Element umfassen, das als Spleißakzeptor fungiert. Die zusätzliche Sequenz kann z. B. invertierte terminale Wiederholungen eines Virusgenoms sein. Die zusätzliche Sequenz kann auf einem Transgen vorhanden sein, das ein lineares Format hat. Das lineare Format ermöglicht die Integration durch NHEJ. Zum Beispiel kann ein Transgen, das in einem Adeno-assoziierten Virusvektor beherbergt ist, wobei die zusätzliche Sequenz die invertierten terminalen Wiederholungen sind, direkt durch NHEJ an einer Zielstelle nach Spaltung durch eine selten schneidende Endonuklease integriert werden (d. h., es ist keine Prozessierung des Transgens erforderlich). In einem anderen Beispiel ist die zusätzliche Sequenz ein linkes und rechtes Transposonende.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt dieses Dokument Transgene innerhalb viraler Vektoren, einschließlich Adenoassoziierter Viren und Adenoviren, bereit, wobei das Transgen eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, eine erste und zweite kodierende Sequenz und einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator umfasst. Aufgrund der invertierten terminalen Wiederholungen der viralen Vektoren umfassen die Transgene auch eine erste und zweite zusätzliche Sequenz.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt dieses Dokument Transgene innerhalb viraler Vektoren, einschließlich Adenoassoziierter Viren und Adenoviren, bereit, wobei das Transgen einen ersten und zweiten Homologiearm, eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, eine erste und zweite kodierende Sequenz und einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator umfasst. Aufgrund der invertierten terminalen Wiederholungen der viralen Vektoren umfassen die Transgene auch eine erste und zweite zusätzliche Sequenz.
  • In einigen Ausführungsformen können die hier bereitgestellten Transgene mit Transposasen integriert werden. Die Transposasen können CRISPR-Transposasen umfassen (Strecker et al., Science 10.1126/science.aax9181, 2019; Klompe et al., Nature, 10.1038/s41586-019-1323-z, 2019). Die Transposasen können in Kombination mit einem Transgen verwendet werden, das eine erste und eine zweite Spleißakzeptorsequenz, eine erste und eine zweite kodierende Sequenz, einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und einen zweiten Terminator (1) und ein linkes und rechtes Transposonende umfasst. Die CRISPR-Transposasen können das TypV-U5, C2C5 CRISPR-Protein, Cas12k, zusammen mit den Proteinen tnsB, tnsC und tniQ umfassen. In einigen Ausführungsformen kann das Cas12k von Scytonema hofmanni (SEQ ID NO:30) oder Anabaena cylindrica (SEQ ID NO:31) sein. In einer Ausführungsform können die hier beschriebenen Transgene, die ein linkes (SEQ ID NO:32) und ein rechtes Transposonende (SEQ ID NO:33) umfassen, zusammen mit ShCas12k, tnsB, tnsC, TniQ und einer gRNA (SEQ ID NO:14) an die Zellen abgegeben werden. Alternativ kann die CRISPR-Transposase das Cas6-Protein zusammen mit Hilfsproteinen wie Cas7, Cas8 und TniQ enthalten. In einer Ausführungsform können die hier beschriebenen Transgene, die ein linkes (SEQ ID NO:41) und rechtes Transposonende (SEQ ID NO:13) umfassen, zusammen mit Cas6 (SEQ ID NO:37), Cas7 (SEQ ID NO:37), Cas8 (SEQ ID NO:37), TniQ (SEQ ID NO:37), TnsA (SEQ ID NO:37), TnsB (SEQ ID NO:37), TnsC (SEQ ID NO:37) und einer gRNA (SEQ ID NO:12) an die eukaryotischen Zellen abgegeben werden. Die Proteine können den Zellen direkt als gereinigtes Protein verabreicht werden oder auf RNA oder DNA kodiert sein. Wenn sie auf RNA oder DNA kodiert sind, kann die Sequenz für die Expression in eukaryotischen Zellen codonoptimiert sein. Die gRNA (SEQ ID NO:12) kann stromabwärts eines RNA-polIII-Promotors platziert und mit einem Poly(T)-Terminator terminiert werden.
  • In einigen Ausführungsformen können die hier beschriebenen Transgene eine Kombination von Elementen aufweisen, die Spleißakzeptoren, partielle kodierende Sequenzen, Terminatoren, Homologiearme, linke und rechte Transposase-Enden und Stellen für die Spaltung durch selten schneidende Endonukleasen umfassen. In einer Ausführungsform kann die Kombination von 5' bis 3' lauten: [Spleißakzeptor 1] - [partielle kodierende Sequenz 1] - [Terminator 1] - [Terminator 2 RC] - [partielle kodierende Sequenz 2 RC] - [Spleißakzeptor 2 RC], wobei RC für das reverse Komplement steht. Diese Kombination kann auf einem linearen DNA-Molekül oder einem AAV-Molekül beherbergt werden und kann durch NHEJ durch einen gezielten Bruch in das Zielgen integriert werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Kombination von 5' bis 3' lauten: [Spaltstelle der selten schneidenden Endonuklease 1] - [Spleißakzeptor 1] - [partielle kodierende Sequenz 1] - [Terminator 1] - [Terminator 2 RC] - [partielle kodierende Sequenz 2 RC] - [Spleißakzeptor 2 RC] - [Spaltstelle der selten schneidenden Endonuklease 1]. In einer anderen Ausführungsform kann die Kombination von 5' bis 3' lauten: [Spaltstelle der selten schneidenden Endonuklease 1] - [Homologiearm 1] - [Spleißakzeptor 1] - [partielle kodierende Sequenz 1] - [Terminator 1] - [Terminator 2 RC] - [partielle kodierende Sequenz 2 RC] - [Spleißakzeptor 2 RC] - [Homologiearm 2] - [Spaltstelle der selten schneidenden Endonuklease 2]. In dieser Kombination können eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen verwendet werden, um HR und NHEJ zu ermöglichen. Zum Beispiel kann eine einzelne selten schneidende Nuklease das Zielgen (d. h. ein gewünschtes Intron) spalten und die Spaltstellen, die die Homologiearme flankieren, können so gestaltet werden, dass sie die gleiche Zielsequenz innerhalb des Introns darstellen. In einer anderen Ausführungsform kann die Kombination von 5' bis 3' wie folgt lauten: [Homologiearm 1 + Spaltstelle der selten schneidenden Endonuklease 1] - [Spleißakzeptor 1] - [partielle kodierende Sequenz 1] - [Terminator 1] - [Terminator 2 RC] - [partielle kodierende Sequenz 2 RC] - [Spleißakzeptor 2 RC] - [Homologiearm 2] - [Spaltstelle der selten schneidenden Endonuklease 1]. In dieser Kombination können eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen HR und NHEJ ermöglichen. Zum Beispiel kann eine einzelne selten schneidende Nuklease innerhalb des Homologiearms 1, stromabwärts des Homologiearms 2 und an der genomischen Zielstelle (d. h. an der Stelle mit Homologie zur Sequenz im Homologiearm 1) spalten. In einer anderen Ausführungsform kann die Kombination von 5' bis 3' wie folgt lauten: [linkes Ende für eine Transposase] - [Spleißakzeptor 1] - [partielle kodierende Sequenz 1] - [Terminator 1] - [Terminator 2 RC] - [partielle kodierende Sequenz 2 RC] - [Spleißakzeptor 2 RC] - [rechtes Ende für eine Transposase]. In allen Ausführungsformen können der Spleißakzeptor 1 und der Spleißakzeptor 2 die gleichen oder unterschiedliche Sequenzen sein; die partielle kodierende Sequenz 1 und die partielle kodierende Sequenz 2 können die gleichen oder unterschiedliche Sequenzen sein; der Terminator 1 und der Terminator 2 können die gleichen oder unterschiedliche Sequenzen sein.
  • In Ausführungsformen kann ein Transgen, das die Struktur [Spaltstelle der selten schneidenden Endonuklease 1] - [Homologiearm 1] - [Spleißakzeptor 1] - [partielle kodierende Sequenz 1] - [Terminator 1] - [Terminator 2 RC] - [partielle kodierende Sequenz 2 RC] - [Spleißakzeptor 2 RC] - [Homologiearm 2] - [Spaltstelle der selten schneidenden Endonuklease 2] umfasst, durch Zuführung einer oder mehrerer selten schneidender Endonukleasen in die DNA integriert werden. Wenn eine selten schneidende Endonuklease zugeführt wird, kann die selten schneidende Endonuklease das Transgen durch Spaltung an der Spaltstelle der selten schneidenden Endonuklease 1 und 2 freisetzen. Außerdem kann dieselbe selten schneidende Endonuklease einen Bruch innerhalb des Zielgens erzeugen, was eine Insertion durch HR oder NHEJ simuliert.
  • In anderen Ausführungsformen kann ein Transgen, das die Struktur [Homologiearm 1 + Spaltstelle der selten schneidenden Endonuklease 1] - [Spleißakzeptor 1] - [partielle kodierende Sequenz 1] - [Terminator 1] - [Terminator 2 RC] - [partielle kodierende Sequenz 2 RC] - [Spleißakzeptor 2 RC] - [Homologiearm 2] - [Spaltstelle der selten schneidenden Endonuklease 1] umfasst, durch Zuführung einer oder mehrerer selten schneidender Endonukleasen in die DNA integriert werden. Wenn eine selten schneidende Endonuklease zugeführt wird, kann die selten schneidende Endonuklease das Transgen durch Spaltung an der Spaltstelle der selten schneidenden Endonuklease 1 und 2 freisetzen. Darüber hinaus kann dieselbe selten schneidende Endonuklease einen Bruch innerhalb des Zielgens erzeugen, was eine Insertion durch HR oder NHEJ simuliert. Integration durch HR kann auftreten, wenn die Spaltung stromaufwärts der Integrationsstelle liegt (d. h. innerhalb eines Homologiearms).
  • In Ausführungsformen kann der Ort für die Integration von Transgenen ein Intron oder eine Intron-Exon-Verbindungsstelle sein. Beim Targeting auf ein Intron kann die partielle kodierende Sequenz eine Sequenz umfassen, die das Peptid kodiert, das von den folgenden Exons innerhalb des endogenen Gens produziert wird. Wenn das Transgen z. B. so konzipiert ist, dass es in Intron 9 eines endogenen Gens mit 11 Exons integriert wird, kann die partielle kodierende Sequenz eine Sequenz umfassen, die für das Peptid kodiert, das von den Exons 10 und 11 des endogenen Gens produziert wird. Wenn das Transgen auf eine Intron-Exon-Verbindungsstelle abzielt, kann es so gestaltet werden, dass es Homologiearme mit einer Sequenz umfasst, die homolog zum 3' des genannten Introns ist.
  • In einigen Ausführungsformen können die partiellen kodierenden Sequenzen vollständige kodierende Sequenzen sein. Die vollständige kodierende Sequenz kann für ein endogenes Gen (z. B. Faktor VIII, Faktor IX oder INS) oder für Reportergene (z. B. RFP, GFP, cat, lacZ, Luciferase) kodieren. Die vollständigen kodierenden Sequenzen können operativ mit Spleißakzeptoren und Terminatoren verbunden und in einem Transgen in einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung platziert werden.
  • Die hier bereitgestellten Verfahren und Zusammensetzungen können verwendet werden, um endogene Gene innerhalb von Zellen zu modifizieren. Zu den endogenen Genen können gehören: Fibrinogen, Prothrombin, Gewebefaktor, Faktor V, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XI, Faktor XII (Hageman-Faktor), Faktor XIII (fibrinstabilisierender Faktor), von-Willebrand-Faktor, Präkallikrein, hochmolekulares Kininogen (Fitzgerald-Faktor), Fibronectin, Antithrombin III, Heparin-Kofaktor II, Protein C, Protein S, Protein Z, Protein Z-verwandter Proteaseinhibitor, Plasminogen, Alpha-2-Antiplasmin, Gewebeplasminogenaktivator, Urokinase, Plasminogenaktivator-Inhibitor-1, Plasminogenaktivator-Inhibitor-2, Glukozerebrosidase (GBA), α-Galaktosidase A (GLA), Iduronat-Sulfatase (IDS), Iduronidase (IDUA), saure Sphingomyelinase (SMPD1), MMAA, MMAB, MMACHC, MMADHC (C2orf25), MTRR, LMBRD1, MTR, Propionyl-CoA-Carboxylase (PCC) (Untereinheiten PCCA und/oder PCCB), ein Glucose-6-Phosphat-Transporter (G6PT)-Protein oder Glucose-6-Phosphatase (G6Pase), ein LDL-Rezeptor (LDLR), ApoB, LDLRAP-1, ein PCSK9, ein mitochondriales Protein wie NAGS (N-Acetylglutamat-Synthetase), CPS1 (Carbamoylphosphat-Synthetase I) und OTC (Ornithin-Transcarbamylase), ASS (Arginin-Bernsteinsäure-Synthetase), ASL (Arginin-Bernsteinsäure-Lyase) und/oder ARG1 (Arginase), und/oder ein Solute Carrier Family 25 (SLC25A13, ein Aspartat/Glutamat-Carrier)-Protein, ein UGT1A1 oder UDP-Glucuronsyltransferase-Polypeptid A1, eine Fumarylacetoacetat-Hydrolyase (FAH), ein Alanin-Glyoxylat-Aminotransferase (AGXT)-Protein, ein Glyoxylat-Reduktase/Hydroxypyruvat-Reduktase (GRHPR)-Protein, ein Transthyretin-Gen (TTR)-Protein, ein ATP7B-Protein, ein Phenylalaninhydroxylase (PAH)-Protein, ein USH2A-Protein, ein ATXN-Protein und ein Lipoprotein-Lyase (LPL)-Protein.
  • Das Transgen kann eine Sequenz zum Modifizieren der Sequenz enthalten, die für ein Polypeptid kodiert, das fehlt oder nicht funktionsfähig ist oder eine gain-of-function-Mutation in dem Subjekt mit einer genetischen Krankheit aufweist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die folgenden genetischen Krankheiten: Achondroplasie, Achromatopsie, Säure-Maltase-Mangel, Adenosin-Deaminase-Mangel, Adrenoleukodystrophie, Aicardi-Syndrom, Alpha-1-Antitrypsin-Mangel, Alpha-Thalassämie, Androgen-Insensitivitäts-Syndrom, Pert-Syndrom, arrhythmogene rechtsventrikuläre Dysplasie, Ataxia-Telangictasia, Barth-Syndrom, Beta-Thalassämie, Blue-Rubber-Bleb-Nevus-Syndrom, Canavan-Krankheit, chronische granulomatöse Erkrankungen (CGD), Cri du Chat-Syndrom, zystische Fibrose, Morbus Dercum, ektodermale Dysplasie, Fanconi-Anämie, Fibrodysplasia ossificans progressiv, Fragiles X-Syndrom, Galaktosämie, Morbus Gaucher, generalisierte Gangliosidosen (z. B. GM1), Hämochromatose, die Hämoglobin-C-Mutation im 6. Codon von Beta-Globin (HbC), Hämophilie, Morbus Huntington, Hurler-Syndrom, Hypophosphatasie, Klinefleter-Syndrom, Morbus Krabbes, Langer-Giedion-Syndrom, Leukozytenadhäsionsmangel, Leukodystrophie, Long-QT-Syndrom, Marfan-Syndrom, Moebius-Syndrom, Mukopolysaccharidose (MPS), Nagel-Patella-Syndrom, nephrogener Diabetes insipdius, Neurofibromatose, Neimann-Pick-Krankheit, Osteogenesis imperfecta, Porphyrie, Prader-Willi-Syndrom, Progerie, Proteus-Syndrom, Retinoblastom, Rett-Syndrom, Rubinstein-Taybi-Syndrom, Sanfilippo-Syndrom, schwere kombinierte Immundefizienz (SCID), Shwachman-Syndrom, Sichelzellkrankheit (Sichelzellenanämie), Smith-Magenis-Syndrom, Stickler-Syndrom, Morbus Tay-Sachs, Thrombozytopenia Absent Radius (TAR)-Syndrom, Treacher-Collins-Syndrom, Trisomie, tuberöse Sklerose, Turner-Syndrom, Harnstoffzyklus-Störung, von-Hippel-Landau-Krankheit, Waardenburg-Syndrom, Williams-Syndrom, Morbus Wilson, Wiskott-Aldrich-Syndrom, X-chromosomales lymphoproliferatives Syndrom, lysosomale Speicherkrankheiten (z. B. Morbus Gaucher, GM1, Morbus Fabry und Morbus Tay-Sachs), Mukopolysaccahidose (z. B. Morbus Hunter, Morbus Hurler), Hämoglobinopathien (z. B. Sichelzellkrankheiten, HbC, α-Thalassämie, β-Thalassämie) und Hämophilien.
  • Weitere Krankheiten, die durch gezielte Integration behandelt werden können, sind die von-Willebrand-Krankheit, das Usher-Syndrom, die polyzystische Nierenerkrankung, die Spinozerebelläre Ataxie Typ 3 und die Spinozerebelläre Ataxie Typ 6.
  • In einer Ausführungsform ist die genomische Modifikation die Insertion eines Transgens in die endogene CACNA1A-Genomsequenz. Das Transgen kann eine synthetische und teilweise kodierende Sequenz für das CACNA1A-Protein enthalten. Die partielle kodierende Sequenz kann homolog zur kodierenden Sequenz innerhalb eines Wildtyp-CACNA1AGens sein, oder eine funktionelle Variante des Wildtyp-CACNA1A-Gens, oder eine Mutante des Wildtyp-CACNA1A-Gens. In einer Ausführungsform wird das Transgen, das für das partielle CACNA1A-Protein kodiert, in Intron 46 oder den Anfang von Exon 47 insertiert.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die genomische Modifikation die Insertion eines Transgens in die endogene ATXN3-Genomsequenz. Das Transgen kann eine synthetische und teilweise kodierende Sequenz für das ATXN3-Protein enthalten. Die partielle kodierende Sequenz kann homolog zur kodierenden Sequenz innerhalb eines Wildtyp-ATXN3-Gens sein, oder eine funktionelle Variante des Wildtyp-ATXN3-Gens, oder eine Mutante des Wildtyp-ATXN3-Gens. In einer Ausführungsform wird das Transgen, das für das partielle ATXN3-Protein kodiert, in Intron 9 oder den Anfang von Exon 10 insertiert.
  • In einer Ausführungsform können die hier beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden, um das 3'-Ende eines endogenen Gens zu modifizieren, was zu einer Modifikation des C-Terminus des vom endogenen Gen kodierten Proteins führt. Die Modifikation des 3'-Endes der kodierenden Sequenz des endogenen Gens kann den Ersatz des letzten kodierenden Exons (d. h. des Exons, das das Stoppcodon umfasst) bis hin zu einem Exon umfassen, das zwischen dem Exon mit der Startkodierung und dem letzten Exon liegt. Wie hier definiert, bezieht sich „Ersatz“ auf die Insertion von DNA in ein Gen, wobei die insertierte DNA die Information für die Produktion der mRNA und des Proteins von 1 oder mehreren Exons liefert. Der Ersatz kann durch die Integration eines Transgens in das endogene Gen erfolgen, wobei das Transgen eine oder mehrere kodierende Sequenzen umfasst, die operativ mit einem Spleißakzeptor verbunden sind. Die Insertion kann oder muss nicht zur Deletion von Sequenzen innerhalb des endogenen Gens führen (z. B. Deletion von Introns und Exons). Wenn ein Gen beispielsweise 72 Exons umfasst und das Startcodon innerhalb von Exon 1 liegt, kann die Modifikation den Ersatz der Exons 2-72, 3-72, 4-72, 5-72, 6-72, 7-72, 8-72, 9-72, 10-72, 11-72, 12-72, 13-72, 14-72, 15-72, 16-72, 17-72, 18-72, 19-72, 20-72, 21-72, 22-72, oder 23-72 oder 24-72 oder 25-72 oder 26-72 oder 27-72 oder 28-72 oder 29-72 oder 30-72 oder 31-72 oder 32-72 oder 33-72, oder 34-72, oder 35-72, oder 36-72, oder 37-72, oder 38-72, oder 39-72, oder 40-72, oder 41-72, oder 42-72, oder 43-72, oder 44-72, oder 45-72, oder 46-72, oder 47-72, oder 48-72, oder 49-72, oder 50-72, oder 51-72, oder 52-72, oder 53-72, oder 54-72, oder 55-72, oder 56-72, oder 57-72, oder 58-72, oder 59-72, oder 60-72, oder 61-72, oder 62-72, oder 63-72, oder 64-72, oder 65-72, oder 66-72, oder 67-72, oder 68-72, oder 69-72, oder 70-72, oder 71-72 oder 72 umfassen. In einer Ausführungsform können die Exons des endogenen Gens durch die Integration eines Transgens in das endogene Gen ersetzt werden, wobei das Transgen eine erste und zweite partielle kodierende Sequenz umfasst, wobei die erste und zweite partielle kodierende Sequenz für ein Peptid kodiert, das von den Exons des endogenen Gens produziert wird. Zum Beispiel kann die erste und zweite kodierende Sequenz des Transgens ein Peptid kodieren, das von den Exons des endogenen Gens 2-72, 3-72, 4-72, 5-72, 6-72, 7-72, 8-72, 9-72, 10-72, 11-72, 12-72, 13-72, 14-72, 15-72, 16-72, 17-72, 18-72, 19-72, 20-72, 21-72, 22-72 oder 23-72 oder 24-72 oder 25-72 oder 26-72 oder 27-72 oder 28-72 oder 29-72 oder 30-72 oder 31-72 oder 32-72 oder 33-72, oder 34-72, oder 35-72, oder 36-72, oder 37-72, oder 38-72, oder 39-72, oder 40-72, oder 41-72, oder 42-72, oder 43-72, oder 44-72, oder 45-72, oder 46-72, oder 47-72, oder 48-72, oder 49-72, oder 50-72, oder 51-72, oder 52-72, oder 53-72, oder 54-72, oder 55-72, oder 56-72, oder 57-72, oder 58-72, oder 59-72, oder 60-72, oder 61-72, oder 62-72, oder 63-72, oder 64-72, oder 65-72, oder 66-72, oder 67-72, oder 68-72, oder 69-72, oder 70-72, oder 71-72 oder 72 produziert wird. Das Transgen kann innerhalb des endogenen Gens im stromaufwärts gelegenen Intron oder am Anfang des Exons integriert werden, das dem ersten Exon innerhalb der partiellen kodierenden Sequenz des Transgens entspricht (2). Das Transgen kann so gestaltet werden, dass es 4,7 kb oder weniger groß ist, und in einen AAV-Vektor und Partikel eingebaut und in vivo an Zielzellen abgegeben wird.
  • In einer Ausführungsform ist das Transgen eine DNA-Sequenz, die eine erste und eine zweite partielle kodierende Sequenz beherbergt, wobei die partiellen kodierenden Sequenzen ein partielles Protein kodieren, wobei das partielle Protein homolog zu einer entsprechenden Region in einem funktionellen Protein ist, das von einem Wildtyp-Gen produziert wird. Das Wirtsgen oder endogene Gen ist eines, in dem die Expression des Proteins aberrant ist, mit anderen Worten, nicht exprimiert wird, in geringen Mengen exprimiert wird oder exprimiert wird, aber die mRNA oder das Proteinprodukt oder ein Teil davon nicht funktionell ist, eine reduzierte Funktion hat oder einen gain-offunction aufweist, was zu einer Störung im Wirt führt.
  • Wie hier beschrieben, kann das Donor-Molekül in einem viralen oder nicht-viralen Vektor vorliegen. Die Vektoren können in Form von zirkulärer oder linearer doppelsträngiger oder einzelsträngiger DNA vorliegen. Das Donor-Molekül kann mit einem Reagenz konjugiert oder assoziiert sein, das die Stabilität oder das zelluläre Update erleichtert. Bei dem Reagenz kann es sich um Lipide, Calciumphosphat, kationische Polymere, DEAE-Dextran, Dendrimere, Polyethylenglykol (PEG), zellpenetrierende Peptide, gasgekapselte Mikrobläschen oder magnetische Perlen handeln. Das Donor-Molekül kann in ein virales Partikel eingebaut werden. Das Virus kann retroviral, adenoviral, adeno-assoziierte Vektoren (AAV), Herpes simplex, Pockenvirus, hybrider adenoviraler Vektor, Epstein-Barr-Virus, Lentivirus oder Herpes simplex-Virus sein.
  • In bestimmten Ausführungsformen können die hier beschriebenen AAV-Vektoren von einem beliebigen AAV abgeleitet sein. In bestimmten Ausführungsformen ist der AAV-Vektor vom defekten und nicht-pathogenen Parvovirus Adeno-assoziierten Typ 2 Virus abgeleitet. Alle derartigen Vektoren sind von einem Plasmid abgeleitet, das nur die 145 bp invertierten terminalen AAV-Wiederholungen beibehält, die die Transgen-Expressionskassette flankieren. Effizienter Gentransfer und stabile Transgenabgabe durch Integration in das Genom der transduzierten Zelle sind die Schlüsseleigenschaften für dieses Vektorsystem. (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3, 1998; Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55, 1996). Andere AAV-Serotypen, einschließlich AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 und AAVrh.10 sowie jeder neuartige AAV-Serotyp können ebenfalls in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In einigen Ausführungsformen wird chimäres AAV verwendet, bei dem die viralen Ursprünge der langen terminalen Wiederholungssequenzen (LTR) der viralen Nukleinsäure heterolog zum viralen Ursprung der Kapsidsequenzen sind. Nicht einschränkende Beispiele sind chimäre Viren mit LTRs, die von AAV2 abgeleitet sind, und Kapside, die von AAV5, AAV6, AAV8 oder AAV9 abgeleitet sind (d. h. AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8 bzw. AAV2/9).
  • Die hier beschriebenen Konstrukte können auch in ein adenovirales Vektorsystem eingebaut werden. Auf Adenoviren basierende Vektoren sind zu einer sehr hohen Transduktionseffizienz in vielen Zelltypen fähig und erfordern keine Zellteilung. Mit solchen Vektoren können hohe Titer und hohe Expressionsniveaus erzielt werden.
  • Die hier beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen sind auf jeden eukaryotischen Organismus anwendbar, bei dem eine Veränderung des Organismus durch genomische Modifikation erwünscht ist. Zu den eukaryotischen Organismen gehören Pflanzen, Algen, Tiere, Pilze und Protisten. Die eukaryotischen Organismen können auch Pflanzenzellen, Algenzellen, Tierzellen, Pilzzellen und Protistenzellen einschließen.
  • Beispiele für Säugetierzellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Oozyten, K562-Zellen, CHO-Zellen (Ovarialzellen des chinesischen Hamsters), HEP-G2-Zellen, BaF-3-Zellen, Schneider-Zellen, COS-Zellen (Nierenzellen von Affen, die SV40-T-Antigen exprimieren), CV-1-Zellen, HuTu80-Zellen, NTERA2-Zellen, NB4-Zellen, HL-60-Zellen und HeLa-Zellen, 293-Zellen (siehe z. B. Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59), und Myelomzellen wie SP2 oder NS0 (siehe z. B. Galfre und Milstein (1981) Meth. Enzymol. 73(B):3 46). Auch periphere Blutmononukleozyten (PBMCs) oder T-Zellen können verwendet werden, ebenso wie embryonale und adulte Stammzellen. Zu den Stammzellen, die verwendet werden können, gehören beispielsweise embryonale Stammzellen (ES), induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC), mesenchymale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen, Leberstammzellen, Hautstammzellen und neuronale Stammzellen.
  • Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung können bei der Herstellung von modifizierten Organismen verwendet werden. Die modifizierten Organismen können kleine Säugetiere, Haustiere, Nutztiere und Primaten sein. Nicht einschränkende Beispiele für Nagetiere können Mäuse, Ratten, Hamster, Wüstenrennmäuse und Meerschweinchen umfassen. Nicht einschränkende Beispiele für Haustiere können Katzen, Hunde, Kaninchen, Igel und Frettchen sein. Nicht einschränkende Beispiele für Nutztiere können Pferde, Ziegen, Schafe, Schweine, Lamas, Alpakas und Rinder sein. Nicht einschränkende Beispiele für Primaten können Kapuzineraffen, Schimpansen, Lemuren, Makaken, Marmosetten, Tamarine, Klammeraffen, Totenkopfäffchen und Grüne Meerkatzen umfassen. Die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung können beim Menschen angewendet werden.
  • Beispielhafte Pflanzen und Pflanzenzellen, die mit den hier beschriebenen Verfahren modifiziert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf einkeimblättrige Pflanzen (z. B. Weizen, Mais, Reis, Hirse, Gerste, Zuckerrohr), zweikeimblättrige Pflanzen (z. B. Sojabohne, Kartoffel, Tomate, Luzerne), Obstpflanzen (z. B. Tomate, Apfel, Birne, Erdbeere, Orange), Futterpflanzen (z. B. Luzerne), Wurzelgemüsepflanzen (z. B. Karotte, Kartoffel, Zuckerrüben, Yamswurzel), Blattgemüsepflanzen (z. B, Salat, Spinat); vegetative Kulturen für den Verzehr (z. B. Sojabohnen und andere Hülsenfrüchte, Kürbis, Paprika, Auberginen, Sellerie usw.), blühende Pflanzen (z. B. Petunie, Rose, Chrysantheme), Koniferen und Kiefern (z. B. Kiefer, Fichte); Pappelbäume (z. B. P. tremula × P. alba); Faserpflanzen (Baumwolle, Jute, Flachs, Bambus); Pflanzen, die in der Phytoremediation verwendet werden (z. B. schwermetallanreichernde Pflanzen); Ölpflanzen (z. B. Sonnenblume, Raps) und Pflanzen, die für experimentelle Zwecke verwendet werden (z. B. Arabidopsis). Die hier offenbarten Verfahren können innerhalb der Gattungen Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Erigeron, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, Phaseolus, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna, und Zea verwendet werden. Der Begriff Pflanzenzellen umfasst sowohl isolierte Pflanzenzellen als auch ganze Pflanzen oder Teile von ganzen Pflanzen wie Samen, Kallus, Blätter und Wurzeln. Die vorliegende Offenbarung umfasst auch Samen der oben beschriebenen Pflanzen, wobei der Samen unter Verwendung der hierin beschriebenen Zusammensetzungen und/oder Verfahren modifiziert wurde. Die vorliegende Offenbarung umfasst ferner die Nachkommen, Klone, Zelllinien oder Zellen der oben beschriebenen transgenen Pflanzen, wobei die Nachkommen, Klone, Zelllinien oder Zellen das Transgen oder Genkonstrukt aufweisen. Exemplarische Algenarten umfassen Mikroalgen, Kieselalgen, Botryococcus braunii, Chlorella, Dunaliella tertiolecta, Gracileria, Pleurochrysis carterae, Sorgassum und Ulva.
  • Die in diesem Dokument beschriebenen Verfahren können die Verwendung von selten schneidenden Endonukleasen zur Stimulierung der homologen Rekombination oder nichthomologen Integration eines Transgenmoleküls in ein endogenes Gen umfassen. Die selten schneidende Endonuklease kann CRISPR, TALENs oder Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) einschließen. Das CRISPR-System kann CRISPR/Cas9 oder CRISPR/Cas12a (Cpf1) einschließen. Das CRISPR-System kann Varianten umfassen, die eine breite PAM-Fähigkeit (Hu et al., Nature 556, 57-63, 2018; Nishimasu et al., Science DOI: 10.1126, 2018) oder eine höhere On-Target-Bindung oder Spaltungsaktivität aufweisen (Kleinstiver et al., Nature 529:490-495, 2016). Das Gene-Editing-Reagenz kann in Form einer Nuklease (Mali et al., Science 339:823-826, 2013; Christian et al., Genetics 186:757-761, 2010), Nickase (Cong et al., Science 339:819-823, 2013; Wu et al, Biochemical and Biophysical Research Communications 1:261-266, 2014), CRISPR-FokI-Dimere (Tsai et al., Nature Biotechnology 32:569-576, 2014), oder gepaarte CRISPR-Nickasen (Ran et al., Cell 154:1380-1389, 2013) sein.
  • Die in diesem Dokument beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen können in einem Umstand verwendet werden, in dem es erwünscht ist, das 3'-Ende der kodierenden Sequenz eines endogenen Gens zu modifizieren. Zum Beispiel haben Patienten mit SCA3 oder SCA6 expandierte CAG-Wiederholungen in Exon 10 (zweitletztes Exon) bzw. Exon 47 (letztes Exon). Patienten mit SCA3 oder SCA6 können von einem Ersatz der Exons 10-11 bzw. 47 profitieren. In anderen Beispielen könnten Patienten mit genetischen Störungen aufgrund von Funktionsverlust-Mutationen innerhalb des 3'-Endes eines endogenen Gens vom Ersatz der letzten Exons des Gens profitieren.
  • Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben, die den Umfang der in den Ansprüchen beschriebenen Erfindung nicht einschränken.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Gezielte Integration von DNA in das ATXN3-Gen
  • Es wurden drei Plasmide mit Transgenen konstruiert, die für die Integration in das ATXN3-Gen in menschlichen Zellen ausgelegt sind. Alle Transgene wurden so konzipiert, dass sie innerhalb von Intron 9 oder der Verbindungsstelle von Intron 9 und Exon 10 des ATXN3-Gens eingefügt werden, und alle Transgene wurden so konzipiert, dass sie mindestens einen Spleißakzeptor und mindestens eine funktionelle kodierende Sequenz für die Exons 10 und 11 des ATXN3-Gens einfügen. Das erste Plasmid mit der Bezeichnung pBA1135 umfasste einen linken und einen rechten Homologiearm mit einer Sequenz, die zum 3'-Ende von Intron 9 und zum 5'-Ende von Intron 10 homolog war (d. h. ein erfolgreiches Gen-Targeting würde zur Entfernung von Exon 10 und zum Ersatz durch die Cargo-Sequenz innerhalb von pBA1135 führen). Zwischen den Homologiearmen befanden sich von 5' nach 3' ein Spleißakzeptor (Spleißakzeptor aus ATXN3-Intron 9), die kodierende Sequenz für die Exons 10 und 11 von ATXN3, der SV40-Terminator, der reverse BGH-Terminator, die reverse kodierende Sequenz für die Exons 10 und 11 (codonangepasst) und der reverse Spleißakzeptor. Die Sequenz für das pBA1135-Transgen ist in SEQ ID NO:17 dargestellt. Eine entsprechende Cas9-Nuklease wurde entworfen, um i) innerhalb des Introns 9 des ATXN3-Gens, ii) innerhalb des linken Homologiearms von pBA1135 und iii) am 3'-Ende des rechten Homologiearms von pBA1135 zu spalten. Es wurde erwartet, dass eine erfolgreiche Spaltung des Plasmids das Transgen freisetzt und somit die Sequenz als Templat für HR oder für die Integration über NHEJ verwendet werden kann. Die Cas9 gRNA-Zielstelle ist in SEQ ID NO:18 dargestellt. Die einzelnen Elemente innerhalb von pBA1135 sind in SEQ ID NO:44-51 dargestellt. SEQ ID NO:44 umfasst den linken Homologiearm, die Nuklease-Zielstelle und den Spleißakzeptor. SEQ ID NO:45 umfasst die partielle kodierende Sequenz (Exon 10 und 11) eines nicht-pathogenen ATXN3-Gens. SEQ ID NO:46 umfasst die SV40 p(A)-Terminatorsequenz. SEQ ID NO:47 umfasst den BGH-Terminator im reversen Komplement. SEQ ID NO:48 umfasst das reverse Komplement, codonangepasste partielle kodierende Sequenz (Exon 10 und 11) eines nicht-pathogenen ATXN3-Gens. SEQ ID NO:49 umfasst die Sequenz für den Spleißakzeptor. SEQ ID NO:50 umfasst die Sequenz für den rechten Homologiearm. SEQ ID NO:51 umfasst die Zielstellen-Sequenz für die Nuklease. Das zweite Plasmid mit der Bezeichnung pBA1136 enthielt die gleiche Fracht wie pBA1135, jedoch wurden die Homologiearme entfernt. Die Nuklease-Zielstellen wurden beibehalten, um die Freisetzung des Transgens aus dem Plasmid zu erleichtern. Es wurde erwartet, dass eine erfolgreiche Spaltung des Plasmids das Transgen freisetzt und somit die Sequenz für die Integration durch NHEJ in das ATXN3-Gen verwendet werden kann. Die Sequenz von pBA1136 ist in SEQ ID NO:19 dargestellt. Das dritte Plasmid mit der Bezeichnung pBA1137 enthielt die gleiche Sequenz wie pBA1135, mit Ausnahme der reversen Sequenzen und der Nuklease-Zielstelle (d. h. reverser Terminator, reverse kodierende Sequenz und reverser Spleißakzeptor). Das Plasmid pBA1137 wurde als Kontrolle für konventionelle HRbasierte Verfahren verwendet. Die Sequenz von pBA1137 ist in SEQ ID NO:20 dargestellt.
  • Die Transfektion wurde mit HEK293T-Zellen durchgeführt. HEK293T-Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2 in DMEM, hoch supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), gehalten. HEK293T-Zellen wurden mit 2 ug Donor, 2 ug Guide-RNA (RNA-Format) und 2 ug Cas9 (RNA-Format) transfiziert. Die Transfektionen wurden mittels Elektroporation durchgeführt. Genomische DNA wurde 72 Stunden nach der Transfektion isoliert und auf Integrationsereignisse untersucht. Eine Liste der Primer, die zum Nachweis von Integration oder genomischer DNA verwendet wurden, ist in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1: Primer zum Nachweis der Integration von Transgenen in ATXN3.
    Primername Sequenz (5' bis 3') SEQ ID NO:
    oNJB043 CAAAGGTGCCCTTGAGGTT 21
    oNJB044 AGGAGAAGTCTGCCGTTACT 22
    oNJB113 GGACAAACCACAACTAGAATGC 23
    oNJB114 TAGGAAAGGACAGTGGGAGT 24
    oNJB116 CCATTATGTCTCAGTTGTTCAGTG 25
    oNJB156 CCAGACCATCTCAGACACC 26
    oNJB162 GGCTGGGCTTCCACTTAC 27
    oNJB167 GTGGTTTGTCCAAACTCATCAA 28
    oNJB170 AGTAACTCTGCACTTCCCATTG 29
  • Um die Integration von pBA1135, pBA1136 und pBA1137 nachzuweisen, wurden PCRs an der genomischen DNA durchgeführt. Bei pBA1137 wurde das Transgen so konzipiert, dass es durch HR präzise integriert wird. Dementsprechend wurden in den 5'- und 3'-Verbindungsstellen-PCRs Banden detektiert, die auf eine präzise Insertion in Exon 10 hinweisen (8, Spur 4 und 7). Die erwarteten Bandengrößen waren 1.520 bp für die 5'-Verbindungsstelle und 786 bp für die 3'-Verbindungsstelle. Die Primer oNJB113 und oNJB116 wurden für die 5'-Verbindungsstellen-PCR verwendet. Die Primer oNJB167 und oNJB170 wurden für die 3'-Verbindungsstellen-PCR verwendet. Da bei pBA1136 keine Homologiearme vorhanden waren, wurde angenommen, dass das Transgen über NHEJ-Insertion insertiert wird. Für das Transgen, das sich in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung integriert, wurden Banden mit entsprechender Größe beobachtet. Die Integration in Vorwärtsrichtung ist in 8 in den Spuren 3 (erwartete Größe ca. 1.520 bp) und 6 (erwartete Größe ca. 1.519 bp) zu sehen. Die Integration in Rückwärtsrichtung ist in 8, Spur 12 (erwartete Größe ca. 1.520 bp) zu sehen. Die Primer oNJB113 und oNJB116 wurden für die 5'-Verbindungsstellen-PCR verwendet. Die Primer oNJB114 und oNJB170 wurden für die 3'-Verbindungsstellen-PCR verwendet. Die Primer oNJB116 und oNJB114 wurden für die inverse 5'-Verbindungsstellen-PCR verwendet. In Bezug auf ppBA1135 waren sowohl Homologiearme als auch Nuklease-Spaltstellen auf dem Transgen vorhanden. Die Integration durch HR wurde durch den Nachweis von Banden in den 5'- und 3'-Verbindungsstellen-PCRs beobachtet (8, Spur 2 und 5). Außerdem wurde die Integration durch NHEJ durch den Nachweis von Banden in einer inversen 5'-Verbindungsstellen-PCR beobachtet (8, Spur 10). Die erwartete Größe für die 5'-Verbindungsstellen-PCR betrug 1.520 bp. Die erwartete Größe für die 3'-Verbindungsstellen-PCR war 1.157 bp. Die erwartete Größe für die inverse 5'-Verbindungsstellen-PCR betrug ca. 1.520 bp. Die Primer oNJB113 und oNJB116 wurden für die 5'-Verbindungsstellen-PCR verwendet. Die Primer oNJB114 und oNJB170 wurden für die 3'-Verbindungsstellen-PCR verwendet. Die Primer oNJB116 und oNJB114 wurden für die inverse 5'-Verbindungsstellen-PCR verwendet.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die beschriebenen Transgene, die bidirektionale partielle kodierende Sequenzen umfassen, über mehrere verschiedene Reparaturwege in genomische DNA integriert werden können.
  • Beispiel 2: Gezielte Integration von DNA in das CACNA1A-Gen
  • Ein CACNA1A-Targeting-Transgen ist so konzipiert, dass es das 3'-Ende der CACNA1A-Kodierungssequenz ersetzt. Es wird ein Plasmid mit einem Transgen konstruiert, das so gestaltet ist, dass es die WT-Kodierungssequenz in Intron 46 oder in den Beginn von Exon 47 integriert (4). Das Transgen umfasst einen ersten Homologiearm, der homolog zur Sequenz unmittelbar nach der Spleißdonorstelle in Intron 46 ist. Der erste Homologiearm umfasst auch die Zielstelle für eine Nuklease (SEQ ID NO:9) und eine Spleißakzeptorsequenz. Auf den ersten Homologiearm folgt eine erste kodierende Sequenz, die das CACNA1A-Exon 47 und eine nicht-expandierte CAG-Wiederholungssequenz (SEQ ID NO:3) umfasst. Im Anschluss an die erste kodierende Sequenz folgt eine SV40-Poly(A)-Terminationssequenz (SEQ ID NO:4). In einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung ist ein zweiter Satz von funktionellen Elementen vorhanden. Der Anfang des zweiten Satzes von Elementen umfasst eine Zielstelle für die Nuklease (SEQ ID NO:9), gefolgt von einem zweiten Homologiearm. Der zweite Homologiearm beherbergt 446 bp, die homolog zur Sequenz unmittelbar nach der Stoppcodierung (SEQ ID NO:8) sind. Diese Sequenz wurde mittels in silico-Analyse als frei von Konsensusverzweigungs- oder Spleißakzeptorsequenzen bestimmt. Nach dem zweiten Homologiearm folgt ein zweiter Spleißakzeptor aus dem Karpfen-beta-Actin-Intron 1 (SEQ ID NO:7). Nach dem Spleißakzeptor folgt eine codonoptimierte Version des CACNA1A-Exons 47 (SEQ ID NO:6) und ein bGH-Poly(A)-Terminator (SEQ ID NO:5).
  • Eine entsprechende Cas12a-Nuklease ist so konzipiert, dass sie nach der Transfektion des Plasmids drei Doppelstrangbrüche erzeugt: i) innerhalb von Intron 46 des endogenen CACNA1A-Gens, 2) innerhalb des ersten Homologiearms im Transgen pBA1011-D1 und 3) nach dem zweiten Homologiearm im Transgen pBA1011-D1. Die Zielsequenz für die Cas12a-Nuklease ist in SEQ ID NO:9 dargestellt.
  • Die Bestätigung der Funktion des Transgens und der CRISPR-Vektoren wird durch Transfektion von HEK293-Zellen erreicht. HEK293-Zellen werden bei 37°C und 5% CO2 in DMEM-Medium mit hoher Glukose ohne L-Glutamin und ohne Natriumpyruvat, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (PS)-Lösung 100X, gehalten. HEK293-Zellen werden mit jedem der Plasmidkonstrukte und Kombinationen davon mit Lipofectamine 3000 transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wird die DNA extrahiert und auf Mutationen und gezielte Insertionen innerhalb des CACNA1A-Gens untersucht. Die Nukleaseaktivität wird mit dem Cel-I-Assay oder durch Deep Sequencing von Amplikons, die die CRISPR/Cas12a-Zielsequenz enthalten, analysiert. Die erfolgreiche Integration des Transgens wird mittels PCR analysiert (5).
  • Beispiel 3: Gezielte Integration von DNA in das ATXN3-Gen
  • Ein ATXN3-Targeting-Transgen ist so konzipiert, dass es das 3'-Ende der ATXN-Kodierungssequenz (Exons 10 und 11) ersetzt. Es wird ein Plasmid mit einem Transgen konstruiert, das so konzipiert ist, dass es die WT-Kodierungssequenz in Intron 9 oder in den Beginn von Exon 10 integriert (5). Das Transgen umfasst einen ersten Homologiearm, der zur Sequenz Intron 9 (SEQ ID NO:10) homolog ist. Der erste Homologiearm umfasst auch die Zielstelle für eine Cas12a-Nuklease und eine Spleißakzeptorsequenz. Auf den ersten Homologiearm folgt eine erste kodierende Sequenz, die das ATXN3-Exon 10 und 11 und eine nicht-expandierte CAG-Wiederholungssequenz umfasst. Im Anschluss an die erste kodierende Sequenz folgt eine SV40-Poly(A)-Terminationssequenz. In einer Schwanz-zu-Schwanz-Orientierung ist ein zweiter Satz von funktionellen Elementen vorhanden. Der Anfang des zweiten Satzes von Elementen umfasst eine Zielstelle für die Cas12a-Nuklease, gefolgt von einem zweiten Homologiearm. Der zweite Homologiearm beherbergt 379 bp, die homolog zur Sequenz unmittelbar nach dem Ende von Exon 10 (d. h. dem Beginn von Intron 10) sind. Für diese Sequenz wurde mittels In-silico-Analyse bestimmt, dass sie eine begrenzte Anzahl von potenziellen Verzweigungs- oder Spleißakzeptor-Sequenzen hat. Nach dem zweiten Homologiearm folgt ein zweiter Spleißakzeptor aus dem Karpfen-beta-Actin-Intron 1. Nach dem Spleißakzeptor folgt eine codonoptimierte Version der ATXN3-Exons 10 und 11 und ein bGH-Poly(A)-Terminator.
  • Eine entsprechende Cas12a-Nuklease ist so konzipiert, dass sie nach der Transfektion des Plasmids drei Doppelstrangbrüche erzeugt: i) innerhalb von Intron 9 des endogenen ATXN3-Gens, 2) innerhalb des ersten Homologiearms im pBA1012-D1-Transgen und 3) im Anschluss an den zweiten Homologiearm im pBA1012-D1-Transgen. Die Zielsequenz für die Cas12a-Nuklease ist in SEQ ID NO:11 dargestellt.
  • Die Bestätigung der Funktion des Transgens und der CRISPR-Vektoren wird durch Transfektion von HEK293-Zellen erreicht. HEK293-Zellen werden bei 37°C und 5% CO2 in DMEM-Medium mit hoher Glukose ohne L-Glutamin und ohne Natriumpyruvat, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (PS)-Lösung 100X, gehalten. HEK293-Zellen werden mit jedem der Plasmidkonstrukte und Kombinationen davon mit Lipofectamine 3000 transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wird die DNA extrahiert und auf Mutationen und gezielte Insertionen innerhalb des ATXN3-Gens untersucht. Die Nukleaseaktivität wird mit dem Cel-I-Assay oder durch Deep Sequencing von Amplikons, die die CRISPR/Cas12a-Zielsequenz enthalten, analysiert. Die erfolgreiche Integration des Transgens wird mittels PCR analysiert (7).
  • Beispiel 4: Gezielte Integration von DNA in das ATXN3-Gen mittels Cas12k-Transposasen
  • Ein ATXN3-Targeting-Transgen ist so konzipiert, dass es das 3'-Ende der ATXN-Kodierungssequenz (Exons 10 und 11) ersetzt. Es wird ein Plasmid mit einem Transgen konstruiert, das für die Integration der WT-Kodiersequenz in Intron 9 oder in den Beginn von Exon 10 ausgelegt ist. Das Transgen umfasst ein rechtes und ein linkes Ende des Transposons, einen ersten und einen zweiten Spleißakzeptor, eine erste und eine zweite kodierende Sequenz (die für Aminosäuren aus den Exons 10 und 11 kodieren) und einen ersten und einen zweiten Terminator. Die Sequenz zwischen dem rechten und linken Ende des Transposons ist in SEQ ID NO: 17 dargestellt.
  • Die Plasmide sind so konstruiert, dass sie die Scytonema hofmanni tnsB, tnsC, tniQ und Cas12k (SEQ ID NO:30) unter Verwendung eukaryotischer Promotoren exprimieren. Ein zweites Plasmid ist so konstruiert, dass es die entsprechende Cas12k-Guide-RNA (SEQ ID NO:14) exprimiert. Die Zielsequenz der Guide-RNA ist CCGCCCGACCTTTCACTTTC (SEQ ID NO:15). Das Cas12k-Transposon-Plasmid wird in HEK293-Zellen mit einem Plasmid kotransformiert, das das ATXN3-Targeting-Transgen enthält. HEK293-Zellen werden bei 37°C und 5% CO2 in DMEM-Medium mit hoher Glukose ohne L-Glutamin und ohne Natriumpyruvat, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (PS)-Lösung 100X, gehalten. HEK293-Zellen werden mit jedem der Plasmidkonstrukte und Kombinationen davon mit Lipofectamine 3000 transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wird die DNA extrahiert und auf gezielte Insertionen in das ATXN3-Gen untersucht. Die Integration des Transgens wird mittels PCR analysiert.
  • Beispiel 5: Gezielte Integration von DNA in das CACNA1A-Gen
  • Ein CACNA1A-Targeting-Transgen ist so konzipiert, dass es das 3'-Ende der CACNA1A-Kodierungssequenz ersetzt. Es wird ein Plasmid mit einem Transgen konstruiert, das für die Integration der WT-Kodiersequenz in Intron 46 oder den Beginn von Exon 47 ausgelegt ist. Das Transgen umfasst ein rechtes und linkes Transposonende, einen ersten und zweiten Spleißakzeptor, eine erste und zweite kodierende Sequenz (die Aminosäuren von Exon 47 kodiert) und einen ersten und zweiten Terminator.
  • Die Plasmide sind so konstruiert, dass sie die Scytonema hofmanni tnsB, tnsC, tniQ und Cas12k (SEQ ID NO:30) unter Verwendung eukaryotischer Promotoren exprimieren. Ein zweites Plasmid ist so konstruiert, dass es die entsprechende Cas12k-Guide-RNA (SEQ ID NO:14) exprimiert. Die Guide-RNA ist für die Zielsequenz CCCGGATCCCGGCTGTGACC (SEQ ID NO: 16) ausgelegt. Die Cas12k-Transposon-Plasmide werden in HEK293-Zellen mit einem Plasmid kotransformiert, das das ATXN3-Targeting-Transgen enthält. HEK293-Zellen werden bei 37°C und 5% CO2 in DMEM-Medium mit hoher Glukose ohne L-Glutamin und ohne Natriumpyruvat, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (PS)-Lösung 100X, gehalten. HEK293-Zellen werden mit jedem der Plasmidkonstrukte und Kombinationen davon mit Lipofectamine 3000 transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wird die DNA extrahiert und auf gezielte Insertionen in das ATXN3-Gen untersucht. Die Integration des Transgens wird mittels PCR analysiert.
  • ANDERE AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Es versteht sich, dass, während die Erfindung in Verbindung mit der detaillierten Beschreibung beschrieben wurde, die vorstehende Beschreibung dazu dient, den Umfang der Erfindung, der durch den Umfang der beigefügten Ansprüche definiert ist, zu veranschaulichen und nicht einzuschränken. Andere Aspekte, Vorteile und Modifikationen sind innerhalb des Umfangs der folgenden Ansprüche.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • US 62/746497 [0001]
    • US 62/830654 [0001]
    • US 62/864432 [0001]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Siehe z. B. Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 und 3. Auflage, 2001 [0018]
    • Ausubel et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 und periodische Aktualisierungen [0018]
    • Reihe METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 3. Auflage, Academic Press, San Diego, 1998 [0018]
    • METHODS IN ENZYMOLOGY, Band 304, „Chromatin“ (P. M. Wassarman und A. P. Wolffe, Hrsg.), Academic Press, San Diego, 1999 [0018]
    • METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Band 119, „Chromatin Protocols“ (P. B. Becker, Hrsg.) Humana Press, Totowa, 1999 [0018]
    • Strecker et al., Science 10.1126/science.aax9181, 2019; Klompe et al., Nature, 10.1038/s41586-019-1323-z, 2019 [0058]
    • Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3, 1998; Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55, 1996 [0072]
    • Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59), und Myelomzellen wie SP2 oder NS0 (siehe z. B. Galfre und Milstein (1981) Meth. Enzymol. 73(B):3 46 [0075]
    • u et al., Nature 556, 57-63, 2018 [0078]
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    • Kleinstiver et al., Nature 529:490-495, 2016 [0078]
    • Mali et al., Science 339:823-826, 2013; Christian et al., Genetics 186:757-761, 2010 [0078]
    • Cong et al., Science 339:819-823, 2013; Wu et al, Biochemical and Biophysical Research Communications 1:261-266, 2014 [0078]
    • Tsai et al., Nature Biotechnology 32:569-576, 2014 [0078]
    • Ran et al., Cell 154:1380-1389, 2013 [0078]

Claims (26)

  1. Verfahren zum Integrieren eines Transgens in ein endogenes Gen, wobei das Verfahren umfasst: a. Verabreichung eines Transgens, wobei das Transgen Folgendes umfasst: i. eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, ii. eine erste und eine zweite Teilkodiersequenz, und iii. einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator; b. Verabreichung von mindestens einer selten schneidenden Endonuklease, die auf eine Stelle innerhalb des endogenen Gens abzielt, wobei das Transgen innerhalb des endogenen Gens integriert ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste Spleißakzeptor operativ mit der ersten Teilkodiersequenz verbunden ist und der zweite Spleißakzeptor operativ mit der zweiten Teilkodiersequenz verbunden ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die erste Teilkodiersequenz operativ mit dem ersten Terminator verbunden ist und die zweite Teilkodiersequenz operativ mit dem zweiten Terminator verbunden ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die erste und die zweite Teilkodiersequenz operativ mit dem bidirektionalen Terminator verbunden sind.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der erste und der zweite Spleißakzeptor, die erste und die zweite Kodiersequenz und der erste und der zweite Terminator in einer Schwanz-zu-Schwanz-Ausrichtung orientiert sind.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Transgen weiterhin eine erste und zweite Zielstelle für eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen umfasst, wobei die Zielstellen den ersten und zweiten Spleißakzeptor flankieren.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Transgen weiterhin einen linken und rechten Homologiearm umfasst, die den ersten und zweiten Spleißakzeptor flankieren.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Transgen in einem Adeno-assoziierten viralen Vektor beherbergt ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Transgen weiterhin eine erste und zweite Zielstelle für die eine oder mehrere selten schneidende Endonukleasen umfasst, wobei die Zielstellen den ersten und zweiten Spleißakzeptor flankieren.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die erste und zweite Zielstelle den ersten und zweiten Homologiearm flankieren.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Transgen innerhalb eines Introns des endogenen Gens oder an einer Intron-Exon-Verbindungsstelle integriert ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Transgen innerhalb eines Introns oder an der Intron-Exon-Verbindungsstelle des ATXN3-Gens oder CACNA1A-Gens integriert ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Transgen eine erste und zweite Teilkodiersequenz umfasst, die für das Peptid kodiert, das von Exon 10 eines nicht-pathogenen ATXN3-Gens produziert wird, und auf Intron 9 oder die Intron 9-Exon 10-Verbindungsstelle eines pathogenen ATXN3-Gens ausgerichtet ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Transgen eine erste und zweite Teilkodiersequenz umfasst, die für das Peptid kodiert, das von Exon 47 eines nicht-pathogenen CACNA1A-Gens produziert wird, und auf Intron 46 oder die Intron 46-Exon 47-Verbindungsstelle eines pathogenen CACNA1A-Gens ausgerichtet ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nuklease eine CRISPR/Cas12a-Nuklease oder eine CRISPR/Cas9-Nuklease ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste und die zweite Teilkodiersequenz die gleichen Aminosäuren kodieren.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste und die zweite Kodiersequenz sich in der Nukleinsäuresequenz unterscheiden, aber für die gleichen Aminosäuren kodieren.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Transgen auf einem Vektor beherbergt ist, wobei das Vektorformat ausgewählt ist aus doppelsträngiger linearer DNA, doppelsträngiger zirkulärer DNA oder einem viralen Vektor.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der virale Vektor ausgewählt ist aus einem Adenovirus-Vektor, einem Adeno-assoziierten Virus-Vektor oder einem Lentivirus-Vektor.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Transgen gleich oder kleiner als 4,7 kb ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das endogene Gen das Wildtyp-Gen der Teilkodiersequenz ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das endogene Gen aberrant ist und die Teilkodiersequenzen ein partielles Protein aus einer funktionellen Version des endogenen Gens kodieren.
  23. DNA-Polynukleotid, umfassend: a. eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, b. eine erste und zweite Teilkodiersequenz, c. einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator, d. optional einen ersten und zweiten Homologiearm, und e. optional eine erste und zweite Zielstelle für eine selten schneidende Endonuklease.
  24. Verfahren zum Integrieren eines Transgens in ein endogenes Gen, wobei das Verfahren umfasst: a. Verabreichung eines Transgens, wobei das Transgen Folgendes umfasst: i. ein linkes und rechtes Transposonende, ii. eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, iii. eine erste und eine zweite Teilkodiersequenz, und iv. einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator; b. Verabreichung einer Transposase, wobei das Transgen innerhalb des endogenen Gens integriert ist.
  25. Verfahren zum Integrieren eines Transgens in ein endogenes Gen, wobei das Verfahren umfasst: a. Verabreichung eines Transgens, wobei das Transgen Folgendes umfasst: i. eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, ii. eine erste und zweite Kodiersequenz, und iii. einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator; b. Verabreichung von mindestens einer selten schneidenden Endonuklease, die auf eine Stelle innerhalb des endogenen Gens abzielt, wobei das Transgen innerhalb des endogenen Gens integriert ist.
  26. Verfahren zum Integrieren eines Transgens in ein endogenes Gen, wobei das Verfahren umfasst: a. Verabreichung eines Transgens, wobei das Transgen Folgendes umfasst: i. eine erste und zweite Spleißakzeptorsequenz, ii. eine erste und zweite Kodiersequenz, iii. einen bidirektionalen Terminator oder einen ersten und zweiten Terminator, und iv. einen ersten und zweiten Homologiearm, wobei das Transgen innerhalb des endogenen Gens integriert ist.
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