CN107881193A - 新型植物终止子序列 - Google Patents

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CN107881193A CN201711133699.9A CN201711133699A CN107881193A CN 107881193 A CN107881193 A CN 107881193A CN 201711133699 A CN201711133699 A CN 201711133699A CN 107881193 A CN107881193 A CN 107881193A
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Abstract

本发明涉及新型植物终止子序列。本发明涉及基因表达调控序列，具体地，转录终止子序列。本文描述了植物转录终止子序列。本文描述了用于鉴定能够在一个取向或双向的方式终止转录的新型植物转录终止子序列的方法以及使用这些终止子序列生成转基因植物的方法。

Description

新型植物终止子序列
本申请是国际申请日为2012年7月13目的国际申请PCT/US2012/046686进入中国、申请号为201280032884.8的题为“新型植物终止子序列”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2011年7月15目的印度临时申请2001/DEL/2011和提交于2011年11月9日的美国临时申请61/557,433的权益，每一个的全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程的领域。更具体地，其涉及用于调节植物基因表达的新型植物终止子序列。
背景技术
植物基因工程近来的进步已打开了工程化植物以具有改善的特性或性状的新的大门。这些转基因植物在其基因组中典型地具有重组DNA构建体，其具有可操作地连接至多个调控区的蛋白编码区，所述调控区使转基因准确的表达。转基因植物中几个帮助调控基因表达的调控元件的例子为启动子、内含子、终止子、增强子和沉默子。
植物基因工程已发展至将多种性状引入商业上重要的植物中，也称为基因堆积。这可通过多基因转化来实现，其中转入多个基因以生成可表达复合表型或多个表型的转基因植物。然而调节或控制每种转基因的表达最优化是重要的。调控元件需要是各种不同的，以避免导入相同的转基因植物重复序列，相同的重复序列与对转基因的表达和稳定性的不可取的负面影响相关联(Peremarti等人(2010)Plant Mol Biol 73：363-378；Mette等人(1999)EMBO J 18：241-248；Mette等人(2000)EMBO J 19：5194-5201；Mourrain等人(2007)Planta 225：365-379、美国专利7632982、美国专利7491813、美国专利7674950、PCT申请PCT/US2009/046968)。因此，发现和表征能用于在重要作物物类中表达异源核酸的新型调控元件是重要的。各种不同的调控区能够被用于控制每种转基因的表达最优化。
调控序列位于包含转录终止和3′mRNA加工所需信号的蛋白编码区的下游，被称为终止子序列。所述终止子序列在mRNA加工、定位、稳定性和翻译中起关键作用(Proudfoot，N，(2004)Curr Opin Cell Biol 16：272-278；Gilmartin，G.M.(2005)Genes Dev.19：2517-2521)。包含在终止子序列中的所述3’调控序列可影响基因的表达水平。已经发现植物细胞中嵌合基因的优化表达依赖于适当的3′序列的存在(Ingelbrecht等人(1989)Plant Cell1：671-680)。对基因的渗漏终止子的通读转录可导致从另一个基因的启动子的一个转基因的无益转录。此外，在具有趋同基因的渗漏转录终止的转基因植物中，转基因的双向、趋同转录可导致趋同基因的重叠转录。趋同、重叠转录可降低转基因表达、或生成反义RNA(Bieri，S.等人(2002)Molecular Breeding 10：107-117)。这强调了发现新型和高效转录终止子的重要性。
发明内容
本发明描述了调节植物中基因表达的调控序列。具体地，描述的调控序列为转录终止子序列。本发明提供了包含终止子序列的重组DNA构建体。
一个实施例为包含分离的多核苷酸的重组构建体，所述分离的多核苷酸包含(a)如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的核苷酸序列；或(b)与如SEQ IDNO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的序列具有至少95％的序列同一性的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的功能性片段；其中所述分离的多核苷酸在植物细胞中作为转录终止子起作用。在另一个实施例中，所述分离的多核苷酸可操作地连接至异源多核苷酸的3’端，所述异源多核苷酸可操作地连接至启动子。
一个实施例为包含分离的多核苷酸的重组构建体，所述分离的多核苷酸包含(a)如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、l7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的核苷酸序列；或(b)与如SEQ IDNO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的序列具有至少95％的序列同一性的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的功能性片段；其中所述分离的多核苷酸在植物细胞中作为双向转录终止子起作用。另一个实施例为重组构建体，其中所述双向转录终止子可操作地连接至(a)第一异源多核苷酸的3′端，所述第一异源多核苷酸可操作地连接至第一启动子；以及(b)第二异源多核苷酸的3′端，所述第二异源多核苷酸可操作地连接至第二启动子；其中所述第一和第二异源多核苷酸以趋同方式转录。
一个实施例为在植物中表达异源多核苷酸的方法，其包括以下步骤：(a)将重组构建体导入到可再生的植物细胞中，其中所述重组构建体包含分离的多核苷酸，其包含(i)如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的核苷酸序列；或(ii)与如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的序列具有至少95％的序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的功能性片段；其中所述分离的多核苷酸在植物细胞中作为双向转录终止子起作用，并且进一步地，其中所述分离的多核苷酸可操作地连接至异源多核苷酸的3′端，所述异源多核苷酸可操作地连接至启动子；(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组构建体；以及(c)由步骤(b)的转基因植物获得子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且表现出所述异源多核苷酸的表达。
另一个实施例提供了调节两种异源多核苷酸在植物中的表达的方法，其包括以下步骤：(a)将重组构建体导入到可再生的植物细胞中，其中所述重组构建体包含分离的多核苷酸，其包含(i)如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的核苷酸序列；或(ii)与如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的序列具有至少95％的序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的功能性片段；其中所述分离的多核苷酸在植物细胞中作为双向转录终止子起作用，并且进一步地，其中所述双向转录因子可操作地连接至第一异源多核苷酸的3′端和第二异源多核苷酸的3′端，所述第一异源多核苷酸可操作地连接至第一启动子，并且第二异源多核苷酸可操作地连接至第二启动子；其中所述第一和第二异源多核苷酸以趋同方式转录；(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组构建体；以及(c)由步骤(b)的转基因植物获得子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且表现出所述第一异源多核苷酸和所述第二异源多核苷酸的表达。
另一个实施例为包含重组DNA构建体的载体、细胞、微生物、植物或种子，所述重组DNA构建体包含本文所述终止子序列。
另一个实施例为包含上文所述重组DNA构建体再生的、成熟的和能繁殖的转基因植物、从其产生的转基因种子、T1及后续世代。所述转基因的植物细胞、组织、植物和种子可以包含所关注的至少一种重组DNA构建体。
在一个实施例中，本文所述包含终止子序列的植物选自：拟南芥、玉米、大豆、向日葵、高梁、卡诺拉、芥菜、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
在一个实施例中，本文所述包含终止子序列的植物是单子叶植物。在另一个实施例中，本文所述包含终止子序列的植物是水稻植株。
附图说明和序列表
根据以下的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三个字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Research 13：3021-3030(1985)和BiochemicalJournal 219(No.2)：345-373(1984)所描述的IUPAC-IUBMB标准中所规定，它们以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§1.822所示的规定。
图1是二元植物转化载体的示意图，用于测试终止子的带有由玉米泛素启动子驱动的GUS报告基因的终止子测试载体(TTV；PHP49597)。GUSINT是β-葡糖苷酸酶基因，其在SnaBI位点插入内含子以防止细菌表达。也显示了用于克隆待测试的推定终止子序列的Acc65I位点。
图2显示了锚定所述构建体的单拷贝稳定水稻事件的叶片样品的GUS定量测定。
图3显示了锚定TTV构建体的单拷贝稳定水稻事件的qRT-PCR数据，所述TTV构建体包含候选终止子序列：无终止子对照物(TTV)、PINII终止子、T1(SEQ ID NO：2)、T4-T28(SEQID NO：5-29)、T30-T34(SEQ ID NO：31-35)。
SEQ ID NO：1是带有由玉米泛素启动子驱动的GUS(β-葡糖苷酸酶)报告基因的所述终止子测试载体(TTV；PHP49597)的序列。
如在表1中给出的，SEQ ID NO：2-35是来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)的候选终止子序列的序列。
表1
SEQ ID NO：36是PINII终止子的序列。
如在表2中给出的，SEQ ID NO：37-106是用于扩增候选终止子序列和PINII终止子序列的引物。
SEQ ID NO：107-113是用于RT-PCR，以测定对于候选终止子序列的通读转录的序列。
SEQ ID NO：114-125是用于qRT-PCR(定量反转录PCR)，以测试如在表4中给出的候选终止子序列探针和引物的序列。
SEQ ID NO：126-128是用于多聚A作图的引物的序列。
SEQ ID NO：129-162是较短的终止子序列的序列。
具体实施方式
本文中所列出每篇参考文献的公开内容均全文以引用方式并入本文。
如本文所用的并在所附的权利要求书中的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“植物”的涵义包括多株此类植物，“细胞”的涵义包括一个或多个细胞及本领域的技术人员已知的等同物等等。
如本文所用：
术语“单子叶植物”和“单子叶的植物”本文互换使用。单子叶植物包括禾本科植物。
术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”本文互换使用。双子叶植物包括下列科：十字花科植物、豆科植物、和茄科植物。
术语“全长互补序列”和“全长的互补序列”本文互换使用，指给定核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。
“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。
“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、植物繁殖体、种子和植物细胞以及相同植物的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“繁殖体”包括能够繁殖新的植株的减数分裂和有丝分裂的全部产物，包括但不限于种子、孢子以及作为营养生殖的途径的植物的部分，例如球茎、块茎、侧枝、或纤匐枝。繁殖体还包括移植物，在其中植物的一部分被枝接至不同的植株(甚至是不同的物种的植株)的另外的部分以产生活的生物体。繁殖体还包括通过克隆或集合减数分裂产物、或允许减数分裂产物(天然地或在人工干预下)集合在一起以形成胚芽或受精卵，而产生的全部植物和种子。
“子代”包括植物的任何后续世代。
基因改良种质的商业开发也已经进展至向作物植物导入多个性状的阶段，其通常称为基因堆叠法(gene stacking approach)。在该方法中，可将产生不同所关注特性的多种基因导入植物。基因堆叠可通过许多方法实现，包括但不限于共转化、再转化以及具有不同转基因的品系的杂交。
“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用，并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)可以用它们的单字母名称指代如下：“A”表示腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可由细胞翻译成蛋白质的RNA。
“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或者可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。
“编码区”是指编码蛋白质或多肽的信使RNA的部分(或另外的核酸分子如DNA分子的对应的部分)。“非编码区”是指信使RNA或其他核酸分子的不是编码区的全部部分，包括但不限于例如，启动子区域、5′非翻译区(“UTR”)、3′UTR、内含子和终止子。术语“编码区”和“编码序列”本文中可互换使用。术语“非编码区”和“非编码序列”本文中可互换使用。
“表达序列标签”(“EST”)是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列能得自FIS或重叠群。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。
“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。
“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“重组体”是指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。
“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。本文可互换使用术语“重组DNA构建体”和“重组构建体”。
术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。
“调控序列”或“调控元件”可互换使用，并且指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可以互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，但是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。
“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。
可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子的例子包括但不限于受光、热、胁迫、水涝或干旱、病原体、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。
“增强子序列”是指能够提高基因表达的序列。这些序列能够位于转录区的上游、内含子内、或下游。转录区由外显子和居间的内含子组成，从启动子直到转录终止区。基因表达的增强能够通过多种机制实现，包括但不限于提高转录效率、成熟mRNA的稳定化和翻译的强化。
“内含子”是基因的居间序列，其被转录至RNA，然后在产生成熟mRNA的过程中被切除。该术语也用于切除的RNA序列。“外显子”是被转录的基因序列的一部分，存在于得自该基因的成熟信使RNA中，并且不是编码最终基因产物的序列的必需部分。
术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“过表达”是指基因产物在转基因生物中超过在来自相同实验的沉默分离(或非转基因)生物中的水平的生产。
“表型”是指细胞或生物体的可检测的特征。
术语“杂交的”或“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植物时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。
“有利等位基因”为位于特定基因座、赋予或有助于所期望的表型的等位基因，所述表型例如提高的细胞壁消化性，或作为另外一种选择，为允许具有降低的细胞壁消化性的植物的鉴定的等位基因，其中所述植物可从育种计划或种植中被筛除(“反选择”)。标记的有利等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因，或者作为另外一种选择，与不利植物表型共分离，从而提供鉴定植物的有益效果。
术语“导入”指将核酸(例如表达构建体)或蛋白质提供至细胞中的手段。导入包括指将核酸整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸可整合进细胞的基因组内，并且包括指将核酸或蛋白质暂时提供给细胞。导入包括指稳定的或瞬时的转化方法以及有性杂交。因此，将核酸片段(例如重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞内的情况下的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内、转变成自主的复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。
“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白至功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括而且不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。
“转录终止子”、“终止序列”或“终止子”是指位于蛋白编码序列下游，包括能够影响mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化识别序列和其他序列编码调节信号的DNA序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸区域添加到mRNA前体的3′端。不同的3′非编码序列的使用示例于Ingelbrecht，I.L.等人，Plant Cell 1：671-680(1989)中。具有“终止子活性”的多核苷酸序列是指当被可操作地连接至待表达的第二多核苷酸序列的3′端时，能够终止从所述第二多核苷酸序列的转录并有利于信使RNA的有效的3′端加工以导致多聚A尾的添加的多核苷酸序列。转录的终止是通过RNA聚合物的RNA合成通过其被停止并且被加工的信使RNA和所述酶均从DNA模板上释放的过程。
RNA转录物的错误终止能够影响RNA的稳定性，并从而能够影响蛋白质的表达。转基因表达的可变性有时归因于终止效率的可变性(Bieri等人(2002)Molecular Breeding10：107-117)。如本文所用，术语“双向转录终止子”和“双向终止子”是指以5′至3′和3′至5′方向均具有终止转录的能力的转录终止子序列。作为双向转录终止子起作用的单个序列元件能够终止从两个趋同启动子起始的转录。
本发明包括本文所公开的终止子序列的功能性片段和变体。
“功能性片段”在本文中被定义为本文所公开的终止子序列的连续核苷酸子集，其能够实施与本文所公开的全长启动子序列相同或基本上相似的功能。与本文所公开的全长终止子具有基本上相似功能的“功能性片段”，是指在很大程度上保持了与全长终止子序列相同水平的终止转录能力的功能性片段。包含可操作地连接至本文所公开的终止子序列的“功能性片段”的异源性多核苷酸的重组构建体，表现出与包含可操作地连接至全长终止子序列的异源性多核苷酸的重组构建体基本上相似的异源性多核苷酸表达水平。
如本文所用，“变体”是包含改变的终止子的序列或终止子的功能性片段的序列，在其中原始序列的一个或多个核苷酸被删除、添加、和/或替换，同时基本上维持了终止子的功能。一个或多个碱基对能够在终止子内部被插入、删除、或替换，而不会影响其活性。片段和变体能够通过例如定点诱变和合成构建的方法获得。
这些终止子功能性片段可包含本文所公开的特定终止子序列的至少50个邻接的核苷酸、至少75个邻接的核苷酸、至少100个邻接的核苷酸、至少150个邻接的核苷酸、至少200个邻接的核苷酸、至少250个邻接的核苷酸、至少300个邻接的核苷酸、至少350个邻接的核苷酸、至少400个邻接的核苷酸、至少450个邻接的核苷酸、至少500个邻接的核苷酸、至少550个邻接的核苷酸、至少600个邻接的核苷酸、至少650个邻接的核苷酸、至少700个邻接的核苷酸、至少750个邻接的核苷酸或至少800个邻接的核苷酸。此类片段可以通过使用限制性酶来裂解天然存在的本文所公开的终止子核苷酸序列；通过合成来自天然存在的终止子DNA序列的核苷酸序列；或通过使用PCR技术而获得。具体参见Mullis等人，MethodsEnzymol.155：335-350(1987)和Higuchi，R.In PCR Technology：Principles andApplications for DNA Amplifications；Erlich，H.A.编辑；Stockton Press Inc.：NewYork，1989)。同样，这些终止子片段的变体，例如产生自定点诱变的那些，包括在本发明的组成之中。
如本文所用，术语“基本上类似于”和“基本上相当的”是指核酸片段，尤其是终止子序列，其中在一个或多个核苷酸碱基中的改变基本上不改变终止子终止转录的能力。这些术语还指本发明的核酸序列的修正形式，包括缺失和变异，所述修改形式是通过一个或多个核苷酸的删除或插入，其基本上不改变所产生的终止子相对于初始的未修改的终止子的功能特性。因此，正如本领域的技术人员应当理解的，本发明涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。
序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于生物信息计算包(Inc.，Madison，WI)的程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp(1989)，CABIOS.5：151-153)进行，默认参数(GAP PENALTY＝10，GAPLENGTH PENALTY＝10)。使用Clustal V方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2、GAP PENALTY＝5、WINDOW＝4、以及DIAGONALS SAVED＝4。用Clustal V程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算的。
作为另外一种选择，可以使用Clustal W比对方法。Clustal W比对方法(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992))可见于生物信息学计算软件包(Inc.，Madison，Wis.)的MegAlignTM v6.1程序。用于多重比对的默认参数对应于GAP PENALTY＝10、GAP LENGTH PENALTY＝0.2、Delay Divergent Sequences＝30％、DNA TransitionWeight＝0.5、Protein Weight Matrix＝Gonnet系列、DNA Weight Matrix＝IUB。用于成对比对的默认参数是Alignment＝缓慢-准确(Slow-Accurate)、GapPenalty＝10.0、GapLength＝0.10、Protein Weight Matrix＝Gonnet 250、以及DNA Weight Matrix＝IUB。用Clustal W程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异度”值。
如对于本领域的技术人员将是显而易见的，任何受关注的异源性多核苷酸均能够被可操作地连接至本发明所描述的终止子序列。能够被可操作地连接至本发明所描述的终止子序列的受关注的多核苷酸的例子包括但不限于：包含其他调控元件诸如内含子、增强子、启动子、翻译前导序列，来自基本上的蛋白质编码区、赋予营养价值的基因、赋予产量和杂种优势的提高的基因、赋予雄性和/或雌性不育性的基因、抗真菌、抗菌或抗病毒基因、选择性标记基因、选择性标记基因、抗除草剂性基因等的多核苷酸。同样地，本发明所描述的终止子序列能够被用于终止任何控制基因表达的核酸的转录。能够被用于控制基因表达的核酸的例子包括但不限于反义寡核苷酸、抑制性DNA构建体或编码转录因子的核酸。
本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)可包含至少一种调控序列。在本发明的一个实施例中，本文所公开的调控序列可操作地连接至任何其它调控序列。
实施例包括以下：
一个实施例为多核苷酸，其包含：(i)基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162进行比较时，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)基于Clustal V比对方法，在与SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162的功能性片段进行比较时，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的核酸序列；或(iii)(i)或(ii)的核酸序列的全长互补序列，其中所述多核苷酸在植物细胞中作为终止子起作用。
一个实施例为包含核苷酸序列的分离的多核苷酸，其中所述核苷酸序列对应于本文所述的终止子的等位基因。
本发明还提供了包含终止子序列的重组DNA构建体。
一个实施例为包含分离的多核苷酸的重组构建体，所述分离的多核苷酸包含(a)如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的核苷酸序列；或(b)与如SEQ IDNO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的序列具有至少95％的序列同一性的核苷酸序列；或(c)(a)或(b)的功能性片段；其中所述分离的多核苷酸在植物细胞中作为转录终止子起作用。在另一个实施例中，所述分离的多核苷酸可操作地连接至异源多核苷酸的3’端，所述异源多核苷酸可操作地连接至启动子。
一个实施例为包含分离的多核苷酸的重组构建体，所述分离的多核苷酸包含(a)如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的核苷酸序列；或(b)与如SEQ IDNO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的序列具有至少95％的序列同一性的核苷酸序列；(c)(a)或(b)的功能性片段；其中所述分离的多核苷酸在植物细胞中作为双向转录终止子起作用。本发明的另一个实施例为重组构建体，其中所述双向转录终止子可操作地连接至(a)第一异源多核苷酸的3′端，所述第一异源多核苷酸可操作地连接至第一启动子；以及(b)第二异源多核苷酸的3′端，所述第二异源多核苷酸可操作地连接至第二启动子；其中所述第一和第二异源多核苷酸以趋同方式转录。
一个实施例为在植物中表达异源多核苷酸的方法，其包括以下步骤：(a)将重组构建体导入到可再生的植物细胞中，其中所述重组构建体包含分离的多核苷酸，其包含(i)如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的核苷酸序列；或(ii)与如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的序列具有至少95％的序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的功能性片段；其中所述分离的多核苷酸在植物细胞中作为双向转录终止子起作用，并且进一步地，其中所述分离的多核苷酸可操作地连接至异源多核苷酸的3′端，所述异源多核苷酸可操作地连接至启动子；(b)由步骤(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且表现出所述异源多核苷酸的表达。
一个实施例为在植物中表达异源多核苷酸的方法，其包括以下步骤：(a)将重组构建体导入到可再生的植物细胞中，其中所述重组构建体包含分离的多核苷酸，其包含(i)如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的核苷酸序列；或(ii)与如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的序列具有至少95％的序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的功能性片段；其中所述分离的多核苷酸在植物细胞中作为双向转录终止子起作用，并且进一步地，其中所述分离的多核苷酸可操作地连接至异源多核苷酸的3′端，所述异源多核苷酸可操作地连接至启动子；(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组构建体；以及(c)由步骤(b)的转基因植物获得子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且表现出所述异源多核苷酸的表达。
另一个实施例提供了调节两种异源多核苷酸在植物中的表达的方法，其包括以下步骤：(a)将重组构建体导入到可再生的植物细胞中，其中所述重组构建体包含分离的多核苷酸，其包含(i)如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的核苷酸序列；或(ii)与如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的序列具有至少95％的序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的功能性片段；其中所述分离的多核苷酸作为植物细胞中的双向转录终止子起作用，并且进一步地，其中所述双向转录因子可操作地连接至第一异源多核苷酸的3′端和第二异源多核苷酸的3′端，所述第一异源多核苷酸可操作地连接至第一启动子，并且所述第二异源多核苷酸可操作地连接至第二启动子；其中所述第一和第二异源多核苷酸以趋同方式转录；(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组构建体并且表现出所述第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸的表达。
另一个实施例提供了调节两种异源多核苷酸在植物中的表达的方法，其包括以下步骤：(a)将重组构建体导入到可再生的植物细胞中，其中所述重组构建体包含分离的多核苷酸，其包含(i)如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的核苷酸序列；或(ii)与如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的序列具有至少95％的序列同一性的核苷酸序列；或(iii)(i)或(ii)的功能性片段；其中所述分离的多核苷酸作为植物细胞中的双向转录终止子起作用，并且进一步地，其中所述双向转录因子可操作地连接至第一异源多核苷酸的3′端和第二异源多核苷酸的3′端，所述第一异源多核苷酸可操作地连接至第一启动子，并且所述第二异源多核苷酸可操作地连接至第二启动子；其中所述第一和第二异源多核苷酸以趋同方式转录；(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组构建体；以及(c)由步骤(b)的转基因植物获得子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且表现出所述第一异源多核苷酸和所述第二异源多核苷酸的表达。
另一个实施例为包含重组DNA构建体的载体、细胞、微生物、植物或种子，所述重组DNA构建体包含本文所述终止子序列。
另一个实施例涵盖包含上文所描述的重组DNA构建体的再生的、成熟的和能繁殖的转基因植物、从其产生的转基因种子、T1和后续的世代。所述转基因的植物细胞、组织、植物和种子可以包含所关注的至少一种重组DNA构建体。
在一个实施例中，包含本发明中所述终止子序列的植物选自：拟南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、芥菜、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
在一个实施例中，包含本发明所描述的终止子序列的植物是单子叶植物。在另一个实施例中，包含本发明所描述的终止子序列的植物是水稻植株。
实例
本发明将在下面的实例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实例说明了本发明的实施例，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实例，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明做出各种变化和修改以使其适用于各种用法和条件。此外，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在涵盖于所附权利要求书的范围内。
实例1
新的终止子序列的鉴定
鉴定具有高共表达频率的趋同基因对的计算机策略涉及下列步骤：
·分析拟南芥和水稻基因组以鉴定趋同基因对。
·分析它们的转录组以鉴定具有高表达的趋同基因对
·鉴定样品，其中来自趋同对的两个基因都显示高表达。
候选拟南芥终止子的鉴定：
对于趋同基因对的鉴定，在趋同方向上基因间距离从20bp-1000bp的范围内分析拟南芥基因组GFF(通用文件格式，General File Format)文件以鉴定邻近基因模型。鉴定出总共3535个趋同基因对，然后检索了它们的核苷酸序列。对于转录组分析，从诺丁汉拟南芥库存中心(Nottingham Arabidopsis Stock Center)(NASC的国际机构)下载可公开获取的阵列数据，连同他们的元数据，包括样品的注释。样品被调整至100的平均信号值，质量差和没有元数据的那些都被弃去。最终，选择了～3000个样品用于这个分析。对于入选的趋同基因对中的每一个基因，鉴定了阵列上的探针，只选择那些唯一地映射到被选基因的探针用于进一步分析。采用中值集中法计算每一个样品的Z值；如果给定样品中的探针的Z值大于2，就认为该样品具有高表达。最终以基因对中的两个成员在至少一个样品中都显示高表达的规则选出入围的基因对。从这个分析，鉴定出89个此类(基因)对，它们被进一步选出24对入围基因对，其在至少10个样品中显示高表达。对于被选择的基因对还包括了基因注释和组织水平表达模式作为附加数据。拟南芥转录组瓦片阵列(Salk Institute Genomic Analysis Laboratory；Yamada等人，2003，Science，302(5646)：842-846)被用于独立评估所述24个基因对的共表达数据。以普通样品(其中基因对显示共表达)的数量和所述基因表达和瓦片阵列间的相关性计，最终选择了7个基因对用于实验分析。鉴定并克隆了在每个基因对终止密码子间的核苷酸序列用于测试，其包括两个基因的3’UTR(非翻译区)以及基因间区域。
候选水稻终止子的鉴定：
用相似的方法鉴定来自水稻的新型终止子。从MSU Rice Genome AnnotationProject Database获得完整水稻基因组，分析鉴定出2892个基因间距离范围20-1000bp的趋同基因对。从NCBI的表达信息库(Gene Expression Omnibus)下载公开的芯片数据，选择高质量的样品用于分析。为计算高表达，计算了每个样品中信号强度的第95百分率，即，在整个芯片上仅5％的基因显示信号强度值大于给定样品的阈值。对于每一个基因对，鉴定了两个基因都高于第95百分率的样品。从这个分析，鉴定出82个基因对在至少一个样品中显示高共表达；这些基因对的34个基因对在至少10个样品中显示高表达，入围用于进一步实验分析。在这些中，以基因对显示共表达的样品数和有效的基因模型的存在计，选择前10个候选对用于测试。鉴定了在每个基因对终止密码子间的核苷酸序列，其包括两个基因的3’UTR(非翻译区)以及基因间区域，并作为植物细胞中的转录终止子用于测试。
实例2
拟南芥和水稻终止子序列的扩增和克隆
使用标准的分子生物学技术(Sambrook等人)，我们构建了携带由玉米泛素启动子驱动的GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)报告基因的终止子测试载体(TTV)(PHP49597；图1；SEQ IDNO：1)。不含启动子的Ds-RED编码序列被列入GUS基因下游用于测量通读转录。Ds-Red序列接着的是PinII终止子，以使得全部的通读转录物能够终止和多聚腺苷酸化，如此我们能够通过使用寡聚脱氧胸苷(oligo dT)的反转录PCR(RT-PCR)检测它们。终止子测试载体还携带了针对单子叶植物优化的草胺膦乙酰转移酶(MOPAT)基因作为植物选择性标记。
使用Plant Maxi Kit(QIAGEN Inc.)根据制造商的说明从拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)叶片组织分离基因组DNA。使用DNA聚合酶(New England Biolabs Inc.)，采用表2列出的引物序列从基因组DNA扩增候选的终止子序列。T1至T14序列(SEQ ID NO：2-15)扩增自拟南芥(Arabidopsisthaliana)而T15至T34(SEQ ID NO：16-35)扩增自水稻(Oryza sativaL.var.Nipponbare)。T1至T7(SEQ ID NO：2-8)是T8至T14(SEQ ID NO：9-15)的互补序列，T15至T24(SEQ ID NO：16-25)是T25至T34(SEQ ID NO：26-35)的互补序列(表3)。采用In-FUSIONTM克隆(Clontech Inc.)，将所得DNA片段克隆至终止子测试载体Acc65I限制性位点，并完全测序。作为阳性对照，我们在与测试终止子相同的位点克隆了马铃薯PINII终止子(SEQ ID NO：36；Keil等人(1986)Nuc，eic Acids Res.14：5641-5650)以制备质粒PHP49598。
所有构建体被转化至农杆菌(Agrobacterium)(LBA4404/pSB1)然后在奇放线菌素和四环素上选择。通过从再转化大肠杆菌(E.coli)的限制性消化分析确认在农杆菌中所述质粒的完整性。
表2
表3
相反取向的终止子序列
取向1 取向2 菌种
T1(SEQ ID NO：2) T8(SEQ ID NO：9) 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
T2(SEQ ID NO：3) T9(SEQ 1D NO：10) 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
T3(SEQ ID NO：4) T1O(SEQ ID NO：11) 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
T4(SEQ ID NO：5) T11(SEQ ID NO：12) 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
T5(SEQ ID NO：6) T12(SEQ ID NO：13) 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
T6(SEQ ID NO：7) T13(SEQ ID NO：14) 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
T7(SEQ ID NO：8) T14(SEQ ID NO：15) 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
T15(SEQ ID NO：16) T25(SEQ ID NO：26) 水稻(Oryza Sativa)
T16(SEQ ID NO：17) T26(SEQ ID NO：27) 水稻(Oryza Sativa)
T17(SEQ ID NO：18) T27(SEQ ID NO：28) 水稻(Oryza Sativa)
T18(SEQ ID NO：19) T28(SEQ ID NO：29) 水稻(Oryza Sativa)
T19(SEQ ID NO：20) T29(SEQ ID NO：30) 水稻(Oryza Sativa)
T20(SEQ ID NO：21) T30(SEQ ID NO：31) 水稻(Oryza Sativa)
T21(SEQ ID NO：22) T31(SEQ ID NO：32) 水稻(Oryza Sativa)
T22(SEQ ID NO：23) T32(SEQ ID NO：33) 水稻(Oryza Sativa)
T23(SEQ ID NO：24) T33(SEQ ID NO：34) 水稻(Oryza Sativa)
T24(SEQ ID NO：25) T34(SEQ ID NO：35) 水稻(Oryza Sativa)
实例3
用候选的终止子序列转化水稻
通过采用包含在表2中所述构建体的农杆菌，通过农杆菌介导转化可将所述候选的终止子序列T1-T34(SEQ ID NO：2-35)转化到水稻植株中。
通过农杆菌感染转化和再生水稻愈伤组织：
日本晴水稻变种(O.sativa spp.japonica rice var.Nipponbare)种子在无水乙醇中灭菌10分钟，然后在水中洗涤3次，并在70％次氯酸钠[Fisher Scientific-27908]中孵育30分钟。然后用水洗涤种子5次并使其完全干燥。干燥的种子被接种至NB-CL培养基[CHU(N6)基础盐(PhytoTechnology-C416)4g/l；Eriksson′s维生素溶液(1000XPhytoTechnology-E330)1ml/l；硫胺素HCl(Sigma-T4625)0.5mg/l；2，4--二氯苯氧基乙酸(Sigma-D7299)2.5mg/l；BAP(Sigma-B3408)0.1mg/l；L-脯氨酸(PhytoTechnology-P698)2.5g/l；不含维生素的酸水解酪蛋白(Sigma-C7970)0.3g/l；肌醇(Sigma-13011)0.1g/l；蔗糖(Sigma-S5390)30g/l；(Sigma-G1101.5000)3g/l；pH 5.8]，并在黑暗中保存于28℃以使愈伤组织增殖。
来自新鲜的划线平板、包含有所述候选终止子序列(SEQ ID NO：2-35)或PINII终止子(SEQ ID NO：36)的期望插入序列的单个农杆菌菌落可接种至补充了四环素(Sigma-T3383)5mg/L、Rifamysin 10mg/L和奇放线菌素(Sigma-5650)50mg/L的YEB液体培养基[酵母提取物(BD Difco-212750)1g/L；蛋白胨(BD Difco-211677)5g/L；牛肉膏(Amresco-0114)5g/L；蔗糖(Sigma-S5390)5g/L；硫酸镁(Sigma-M8150)0.3g/L，pH-7.0]中。培养物在黑暗中于28℃以220rpm持续摇动生长过夜。第二天，培养物在补充了200μM乙酰丁香酮(Sigma-D134406)的PHI-A(CHU(N6)基础盐(PhytoTechnology-C416)4g/L；Eriksson′s维生素溶液(1000X PhytoTechnology-E330)1ml/l；硫胺素HCl(Sigma-T4625)0.5mg/L；2，4-二氯苯氧基乙酸(Sigma-D7299)2.5mg/L，L-脯氨酸(PhytoTechnology-P698)0.69mg/L；蔗糖(Sigma-S5390)68.5g/L；葡萄糖-36g/L(Sigma-G8270)；pH 5.8)培养基中被调节为550nm处0.5吸光度，并在28℃以220rpm的持续摇动孵育1小时。
将17-21天龄的增殖中的愈伤组织转移至无菌培养瓶中，将如上文所述制备的农杆菌溶液添加至所述瓶中。孵育悬浮液20分钟，每2分钟进行温和摇动。小心地滗出农杆菌悬浮液，并将愈伤组织置于No-4滤纸上。愈伤组织被立即转移至NB-CC培养基[补充了200μM乙酰丁香酮(Sigma-D134406)的NB-CL]并在21℃下孵育72小时。
培养终止和选择：
将共培养的愈伤组织置于干燥、无菌的培养瓶中，并用1升包含头孢噻肟(Duchefa-C0111.0025)0.250g/L和羧苄青霉素(Sigma-C0109.0025)0.4g/L的无菌蒸馏水洗涤。洗涤重复4次，或直到溶液显得澄清。小心地滗出水，并将愈伤组织置于No-4滤纸上，于室温干燥30分钟。干燥的愈伤组织被转移至NB-RS培养基[补充了0.25g/L头孢噻肟(Duchefa-C0111.0025)、0.4g/L(Sigma-C0109.0025)羧苄青霉素的NB-CL]并在28℃下孵育4天。
然后将愈伤组织转移至NB-SB培养基[补充了双丙氨磷(Meiji Seika K.K.，Tokyo，Japan)5mg/L的NB-RS]并于28℃孵育和每14天继代培养至新鲜培养基中。在40-45天的选择、增殖之后，双丙氨磷抗性的愈伤组织事件能够被容易地观察到。
从转化的水稻愈伤组织再生稳定转化的水稻植株：
转化的愈伤组织事件被转移至NB-RG培养基[CHU(N6)基础盐(PhytoTechnology-C416)4g/L；N6维生素1000x 1ml{甘氨酸(Sigma-47126)2g/L；盐酸硫胺素(Sigma-T4625)1g/L；酸；激动素(Sigma-K0753)0.5mg/L；不含维生素的酸水解酪蛋白(Sigma-C7970)0.5g/L；蔗糖(Sigma-S5390)20g/L；山梨醇(Sigma-S1876)30g/L，pH被调节至5.8并添加了4g/L(Sigma-G1101.5000)]。灭菌后加入0.1ml/l的CuSO4(100mM浓度，Sigma-C8027)和100ml/l 10X AA氨基酸pH游离的{甘氨酸(Sigma-G7126)75mg/L；L-天冬氨酸(Sigma-A9256)2.66g/L；L-精氨酸(Sigma-A5006)1.74g/L；L-谷氨酰胺(Sigma-G3126)8.76g/L}并于32℃在光照下孵育。15-20天后，再生的幼苗能够被转移至包含NB-RT培养基[MS基础盐(PhytoTechnology-M524)4.33g/L；来自1000X原液{烟酸(Sigma-G7126)1g/L，硫胺素HCl(Sigma-T4625)10g/L)}的B5维生素1ml/l；肌醇(Sigma-13011)0.1g/L；蔗糖(Sigma-S5390)30g/L；和IBA(Sigma-I5386)0.2mg/L；pH调节至5.8]的品红盒子中。在10-15天后获得的生根的植株，在转移至温室之前能够在液体Y培养基[原液A-F各1.25ml，用水补足至1000ml。各种原液的组成：原液(A)硝酸铵(HIMEDIA-RM5657)9.14g/L，(B)磷酸氢二钠(HIMEDIA-58282)4.03g，(C)硫酸钾(HIMEDIA-29658-4B)7.14g，(D)氯化钙(HIMEDIA-C5080)8.86g，(E)硫酸镁(HIMEDIA-RM683)3.24g，(F)(微量元素)四水氯化镁(HIMEDIA-10149)15mg，钼酸铵(HIMEDIA-271974B)6.74mg/L，硼酸(Sigma-136768)9.34g/L，七水硫酸锌(HiMedia-RM695)0.35mg/L，七水硫酸铜(HIMEDIA-C8027)0.31mg/L，六水氯化铁(Sigma-236489)0.77mg/L，一水柠檬酸(HIMEDIA-C4540)0.119g/L]，在转移至温室前在28℃下放置10-15天。收集了叶片样品，用于以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷(X-Gluc)进行组织化学GUS染色，染色采用标准规程(Janssen和Gardner，Plant Mol.Biol.(1989)14：61-72)。
使用标准程序，通过southem印迹对转基因植物进行了拷贝数分析。全部的单拷贝事件被转移至单独的盆中，仅对它们进行进一步的分析。对于全部的分析，从三个独立的一月龄单拷贝T0事件获取了叶片材料。
实例4
用候选的水稻终止子序列转化水稻
如实例3中所述，通过农杆菌介导转化测试所述候选水稻终止子序列(SEQ ID NO：16-35)起转录终止子作用的功效。在表2中描述了用于生成转基因植物的所述构建体。
实例5A
对在稳定转化的水稻组织中测试候选水稻终止子序列的测定
从稳定转化的水稻植株组织可进行反转录酶-PCR(RT-PCR)以及定量RT-PCR(qRT-PCR)，以测试候选终止子序列停止转录(即阻止通读转录)的能力。qRT-PCR是优选的测试所述候选终止子序列的方法。SEQ ID NO：100-113可被用于进行RT-PCR以确定从所述候选终止子序列通读转录。
组织化学和荧光GUS分析：
来自每个构建体的叶片样品可被用于以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷(X-Gluc)进行组织化学GUS染色，染色采用标准规程(Janssen和Gardner，Plant Mol.Biol.(1989)14：61-72)，来自每个构建体的三个独立单拷贝事件的三个叶片样品池可被用于采用标准规程(Jefferson，R.A.，Nature.342，837-8(1989)；Jefferson，R.A.，Kavanagh，T.A.&Bevan，M.W.EMBO J.6，3901-3907(1987)的定量MUG测定。
实例5B
测试稳定转化的水稻组织中的候选水稻终止子序列
稳定转化候选水稻终止子序列的水稻组织的GUS荧光分析：
当与TTV比较时，我们观察到具有PINII以及测试序列T15、T16、T17、T18、T19、T20、T22、T23、T24、T25、T26、T27、T28、T29、T30、T31、T32、T33和T34(分别为SEQ ID NO：16-21、23-35)时较高的GUS蛋白表达。然而，T21(SEQ ID NO：22)具有与TTV(图2)相同的GUS表达水平。
定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)以确定通读转录通过测试终止子：
用来自稳定转化的叶片组织来进行qRT-PCR。测试所述稳定转化的植株对于通过PINII和测试终止子的通读转录的存在。为了评估将指示这种转录正持续通过所述终止子的产物的存在，扩增靶向被测试的所述终止子的下游(序列)。在PINII和测试终止子的下游、所述填充序列(Ds Red)中设计引物组。可以用DsRed和GUS的比值测量通读。
对于每个构建体测试了来自三个独立单拷贝事件的至少三个叶片样品池。在表4中列出了所述引物和探针。
表4
从候选水稻序列通读转录：
可以预知，如在图3中描绘的在终止子测试载体(TTV(SEQ ID NO：1；PHP49597)中观察到通读转录。含PINII终止子(SEQ ID NO：36)的所述PHP49598构建体显著地降低了转录通读(图3)。由非常低的通读转录水平(图3)证实了来自水稻(Oryza sativa)的候选终止子序列T15、T16、T17、T18、T20、T23、T25、T26、T27、T28、T30和T32(分别为SEQ ID NO：16-19、21、24、26-29、31和33)能够有效终止转录，相当于所述PINII终止子。可以从表3看出，T14和T25(分别为SEQ ID NO：15和26)；T16和T26(分别为SEQ ID NO：17和27)；T17和T27(分别为SEQ ID NO：18和28)；T18和T28(分别为SEQ ID NO：19和29)；T20和T30(分别为SEQ ID NO：21和31)是相同的核苷酸序列但是克隆的方向相反。从而这些(序列)能以双向终止子序列起作用。与TTV终止子(图3)相比，候选的终止子序列T19、T21和T24(分别为SEQ ID NO：20、22和25)也显示更少通读。
实例6
用候选拟南芥终止子序列转化水稻
如实例3中所述，通过农杆菌介导转化可将所述候选拟南芥终止子序列(SEQ IDNO：2-15)转化至水稻植株中，以测试它们起转录终止子作用的功效。所述构建体描述于表2中。
实例7
在稳定转化的水稻组织中测试候选拟南芥终止子序列
如实例5中所述，从稳定转化的水稻植株组织进行QRT-PCR，通过将GUS表达与含PINII终止子的GUS表达相比较，以测试候选拟南芥终止子序列(SEQ ID NO：2-15)停止转录的能力(其阻止了转录通读转录)。
从候选拟南芥序列通读转录：
由非常低的通读转录水平(图3)证实了来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的终止子序列T7、T9、T10、T12、T13(分别为SEQ ID NO：8、10、11、13和14)能够有效终止转录，相当于PINII终止子。与TTV终止子(图3)相比，终止子序列T4、T5和T6也显示更少通读。
用候选拟南芥终止子序列稳定转化水稻组织的GUS荧光分析：
当与TTV比较时，我们观察到具有PINII以及测试序列T1、T3、T4、T6、T7、T8、T9、T10、T12、T13和T14(分别为SEQ ID NO：2、4、5、7、8、10、13、14和15)时更高的GUS蛋白表达。然而，T2、T5和T11(SEQ ID NO：3、6和12)具有和TTV(图2)相同的GUS表达水平。
实例8
较短的终止子序列的鉴定
每个候选双向转录终止子可由两个趋同组分转录终止子构成。为鉴定这些组份终止子序列，如下所述对聚腺苷酸化位点进行作图。
在终止子序列中对聚腺苷酸化位点进行作图
对于每个构建体从T0单拷贝事件的叶片组织提取RNA。采用来自INVITROGENTM的III第一链合成系统，使用连接了oligodT引物的接头(TETO-1527；SEQ IDNO：126)合成cDNA，并用GUS内部引物(TET0-1172；SEQ ID NO：127)和接头反向引物(TETO-1528；SEQ ID NO：128)进行PCR。用ZeroPCR克隆试剂盒(INVITROGENTM)克隆所述扩增产物。对于每个终止子，测序了40个克隆。序列分析显示了多个聚腺苷酸化(polyA)位点。在SEQ ID NO：129-162和表6中给出了对应于较长终止子序列的较短终止子序列的序列。
表5
引物名 SEQ ID NO 引物ID
TETO-1527 126 Adap-dT
TETO-1172 127 GUS iF
TETO-1528 128 Adap R
表6
实例9
测试在稳定转化的拟南芥组织中截短的终止子序列
以在实例8中所述获得的所述polyA数据计，所述终止子可被截短和克隆如实例2中所述。
通过花序浸渍法(Kim JY等人(2003)Development 130：4351-4362)可将所述截短的终止子(SEQ ID NO：129-162)转化至拟南芥(Arabidopsis thaliana)中。如在实例5中所述，可进行qRT-PCR和MUG分析以测试所述截短的终止子在T1拟南芥叶片组织中的效率。
序列表
<110> E.I. du Pont de Nemours and Company
Bhyri, Priyanka
Krishnamurthy, Nandini
Narayanan, Eswar
Nott, Ajit
Sarangi, Rinku R
<120> 新型植物终止子序列
<130> BB1788PCT
<150> US 61/557,433
<151> 2011-09-11
<150> 在2001/DEL/2011
<151> 2011-07-15
<160> 162
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 16437
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 载体序列
<400> 1
gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac 60
aatctgatca tgagcggaga attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg 120
acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga accgcaacgt tgaaggagcc actcagcaag 180
ctggtacgat tgtaatacga ctcactatag ggcgaattga gcgctgttta aacgctcttc 240
aactggaaga gcggttacca gagctggtca cctttgtcca ccaagatgga actgcggcct 300
cgaagctggc gcgccgtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat 360
tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc 420
agtttatcta tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt 480
actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa 540
ggacaattga gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt 600
tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca 660
tccatttagg gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt 720
attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat 780
aatttagata taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag 840
aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa 900
acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa 960
gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct 1020
ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt 1080
gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc 1140
ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc 1200
cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc 1260
cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc 1320
ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatgcatg gttagggccc ggtagttcta 1380
cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc tagcgttcgt 1440
acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct aacttgccag tgtttctctt 1500
tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg atcgatttca tgattttttt 1560
tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat gccgtgcact 1620
tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtctggt 1680
tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa ctacctggtg gatttattaa 1740
ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag atgatggatg 1800
gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg catatacaga 1860
gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt 1920
ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt 1980
atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag 2040
gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca 2100
tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata 2160
attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt 2220
ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac 2280
cctgttgttt ggtgttactt ctgcaggtcg actttaactt agcctaggat ccacacgaca 2340
ccatggtccg tcctgtagaa accccaaccc gtgaaatcaa aaaactcgac ggcctgtggg 2400
cattcagtct ggatcgcgaa aactgtggaa ttgatcagcg ttggtgggaa agcgcgttac 2460
aagaaagccg ggcaattgct gtgccaggca gttttaacga tcagttcgcc gatgcagata 2520
ttcgtaatta tgcgggcaac gtctggtatc agcgcgaagt ctttataccg aaaggttggg 2580
caggccagcg tatcgtgctg cgtttcgatg cggtcactca ttacggcaaa gtgtgggtca 2640
ataatcagga agtgatggag catcagggcg gctatacgcc atttgaagcc gatgtcacgc 2700
cgtatgttat tgccgggaaa agtgtacgta agtttctgct tctacctttg atatatatat 2760
aataattatc attaattagt agtaatataa tatttcaaat atttttttca aaataaaaga 2820
atgtagtata tagcaattgc ttttctgtag tttataagtg tgtatatttt aatttataac 2880
ttttctaata tatgaccaaa atttgttgat gtgcaggtat caccgtttgt gtgaacaacg 2940
aactgaactg gcagactatc ccgccgggaa tggtgattac cgacgaaaac ggcaagaaaa 3000
agcagtctta cttccatgat ttctttaact atgccggaat ccatcgcagc gtaatgctct 3060
acaccacgcc gaacacctgg gtggacgata tcaccgtggt gacgcatgtc gcgcaagact 3120
gtaaccacgc gtctgttgac tggcaggtgg tggccaatgg tgatgtcagc gttgaactgc 3180
gtgatgcgga tcaacaggtg gttgcaactg gacaaggcac tagcgggact ttgcaagtgg 3240
tgaatccgca cctctggcaa ccgggtgaag gttatctcta tgaactgtgc gtcacagcca 3300
aaagccagac agagtgtgat atctacccgc ttcgcgtcgg catccggtca gtggcagtga 3360
agggcgaaca gttcctgatt aaccacaaac cgttctactt tactggcttt ggtcgtcatg 3420
aagatgcgga cttgcgtggc aaaggattcg ataacgtgct gatggtgcac gaccacgcat 3480
taatggactg gattggggcc aactcctacc gtacctcgca ttacccttac gctgaagaga 3540
tgctcgactg ggcagatgaa catggcatcg tggtgattga tgaaactgct gctgtcggct 3600
ttaacctctc tttaggcatt ggtttcgaag cgggcaacaa gccgaaagaa ctgtacagcg 3660
aagaggcagt caacggggaa actcagcaag cgcacttaca ggcgattaaa gagctgatag 3720
cgcgtgacaa aaaccaccca agcgtggtga tgtggagtat tgccaacgaa ccggataccc 3780
gtccgcaagg tgcacgggaa tatttcgcgc cactggcgga agcaacgcgt aaactcgacc 3840
cgacgcgtcc gatcacctgc gtcaatgtaa tgttctgcga cgctcacacc gataccatca 3900
gcgatctctt tgatgtgctg tgcctgaacc gttattacgg atggtatgtc caaagcggcg 3960
atttggaaac ggcagagaag gtactggaaa aagaacttct ggcctggcag gagaaactgc 4020
atcagccgat tatcatcacc gaatacggcg tggatacgtt agccgggctg cactcaatgt 4080
acaccgacat gtggagtgaa gagtatcagt gtgcatggct ggatatgtat caccgcgtct 4140
ttgatcgcgt cagcgccgtc gtcggtgaac aggtatggaa tttcgccgat tttgcgacct 4200
cgcaaggcat attgcgcgtt ggcggtaaca agaaagggat cttcactcgc gaccgcaaac 4260
cgaagtcggc ggcttttctg ctgcaaaaac gctggactgg catgaacttc ggtgaaaaac 4320
cgcagcaggg aggcaaacaa ggtaccgatc catggcctcc tccgaggacg tcatcaagga 4380
gttcatgcgc ttcaaggtgc gcatggaggg ctccgtgaac ggccacgagt tcgagatcga 4440
gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg cacccagacc gccaagctga aggtgaccaa 4500
gggcggcccc ctgcccttcg cctgggacat cctgtccccc cagttccagt acggctccaa 4560
ggtgtacgtg aagcaccccg ccgacatccc cgactacaag aagctgtcct tccccgaggg 4620
cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga ggacggcggc gtggtgaccg tgacccagga 4680
ctcctccctg caggacggct ccttcatcta caaggtgaag ttcatcggcg tgaacttccc 4740
ctccgacggc cccgtaatgc agaagaagac tatgggctgg gaggcctcca ccgagcgcct 4800
gtacccccgc gacggcgtgc tgaagggcga gatccacaag gccctgaagc tgaaggacgg 4860
cggccactac ctggtggagt tcaagtccat ctacatggcc aagaagcccg tgcagctgcc 4920
cggctactac tacgtggact ccaagctgga catcacctcc cacaacgagg actacaccat 4980
cgtggagcag tacgagcgcg ccgagggccg ccaccacctg ttcctgtagg gccggccatc 5040
aacaactctc ctggcgcacc atcgtcggct acagcctcgg tgacgtgggg caacctagac 5100
ttgtccatct tctggattgg ccaacttaat taatgtatga aataaaagga tgcacacata 5160
gtgacatgct aatcactata atgtgggcat caaagttgtg tgttatgtgt aattactagt 5220
tatctgaata aaagagaaag agatcatcca tatttcttat cctaaatgaa tgtcacgtgt 5280
ctttataatt ctttgatgaa ccagatgcat ttcattaacc aaatccatat acatataaat 5340
attaatcata tataattaat atcaattggg ttagcaaaac aaatctagtc taggtgtgtt 5400
ttgcgaattg cggccgcgat ctgagcttct agaggatccc catcgatggg ccccggccga 5460
agcttgcatg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca 5520
ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg 5580
cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata taatctatag 5640
tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga catggtctaa 5700
aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg 5760
ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt ttattagtac 5820
atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt acatctattt 5880
tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ttttatttaa 5940
taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa 6000
gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta 6060
aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca 6120
agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc 6180
tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg 6240
tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct acgggggatt 6300
cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct 6360
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ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc 6480
cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatgcat ggttagggcc cggtagttct 6540
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tacacggatg cgacctgtac gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca gtgtttctct 6660
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ttgtttcgtt gcatagggtt tggtttgccc ttttccttta tttcaatata tgccgtgcac 6780
ttgtttgtcg ggtcatcttt tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga tgtggtctgg 6840
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tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat tttggaactg 7140
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aattattttg atcttgatat acttggatga tggcatatgc agcagctata tgtggatttt 7380
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ctcggcctcg gctccaccct ctacacccac ctcctcaaga gcatggaggc ccagggcttc 7860
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 2
taaacttgaa gtctgttaaa tttgatgaca cctctcggta ccaatcgaag aaatctagtg 60
aatttccggg atttttagat atctgattct gttgcgaagt ttttttatcc ttattagtgt 120
ctgttgagtg tagattgctt ggcgagtagc ccacaataaa gaaataaaaa tggcgaatct 180
ttagctttat ttactctgtt tttcatcgaa acagattcag taatatatac tctgtttttt 240
catcttacat ttgtttgcaa aaccgatatt atcaacttct cagtaacaca attcgttcct 300
gaaagagtgc aaaaaaaatg ttcctctaca acaccagaag tgttaagagc atcaatcata 360
cactgaaggc caaggattca tgatcacaag tgttaaaagt ttattgtctg acttaaagta 420
agaaacagaa cattaaaagc tttattattc acagttttat tcatggcaag cttaggaaca 480
gtccataact aagatgaaag cggagaagaa gcacaagtgc gaaaaagaaa ccaaattgaa 540
agtgttatta aaagtat 557
<210> 3
<211> 573
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 3
ttatggagat tttaagtatc ttttgatgat agtttacaca ctttgaataa gctgattcta 60
ctttatttct ctctgtttgt ttactgcttc agtgttttaa gtcttctctt tgtgtttgtt 120
gctgttgtgt ctttgatgga tttttgtgat ccgatttaat aaaagaagtg tgttcaaagt 180
aattctctag tctctttatt tgaaattccg gggatagcag attggtttcc gcaacattga 240
ctccaagttt ataatgatct tgatgatggt ctaaaagttt tgaataagct gactctaatt 300
tactaggttc tgtttgttta tataccttca gagagtttca agtcttctcg ttgtggtctt 360
gttctgtttt cttgatgtga tttcttattc attttaacaa aagaagtttg tgcaaagtca 420
caatgcagaa acccacttta tttagatttt agataagcaa agcacacaga tgcattatcc 480
ttaagaaaaa caaaatacaa cactagacca caacttcata aactcacaac ataaccttat 540
tcaaatttca gggatatcca gattggtttc aca 573
<210> 4
<211> 633
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 4
gagatgaaga aattgctctt atggttctga aaacttctaa tatgtcgagt tgttctgagt 60
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<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
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tcttaagatc ctcctcttct gcttctcttt ttatttgccg tgtcataatg aaaattgcat 240
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<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 6
tgcggtatac ttggcatttg gttttgctgt accctttcga aatctttatg tcgttgttta 60
gtttgttgta ttcgactatc ttcttagact ttgctgaaat tctcaagaga tttttttact 120
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acacagtact cgagatatgt tctgataaaa aaaatgttgg tactaacaat ttcagtttgg 420
atgggaagga ttatccgaat aaagatatac ctaattctga tcaaaagaga gcgaaaataa 480
gtctctggag tttagattga gaaactaaat gtcaacaaac cggaaacaaa aaaaaactgt 540
gtcaagtaac aaaaacaaaa gaaaagactc aaagagagta gcagcaacgt aagatttgat 600
tccaaagtgt ctcacaaggg aggaatgagt aatgctactc cctgttttat tcactcatca 660
caagtccatc aatcaatcta tctct 685
<210> 7
<211> 411
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 7
gttggtttca tcttattttc tgcgattttt gtacttgctg gatttggaat ccatttgttt 60
tagctctctc gtataagatt gtctcatctt tgcttgttaa ctctatattt tgaatcatca 120
agatatggtt ttgctgttaa tcattgacct tcgatatttt tttgccaatc cgttctctct 180
accaacctaa gaaaaaatca ctaatatctc acattagagg gtgcaaaatt tggaaggtct 240
atatcattgt ccaattttct gagtcataca aattctttca tatgattcat tgaacaagac 300
actcatttac ttataaagcg catttatatg ttcacatgat ttgtacaaaa ctcatgagac 360
tgcatcaagc agaaagtatt tatttatctt tacatgtcaa agctttgaga a 411
<210> 8
<211> 457
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 8
taacatcaaa gagcaggaag tttttaacaa ggaatctggt cgagacatcc atgttctgga 60
ccagacagtt ttttggttta gccttaaaat tccaaggttg tataagaaga acacactgtt 120
tgttattctt tgcggttggt aaccaatata gtaatatcag tatttcgtct caatctctct 180
tgttcttata ataatagaat gagaaatcga aatggaattt tcatgtgaag tggattagta 240
acattatcac aattgataaa acatttgtaa ataactagac aagctttctc ggctatcagt 300
taaaatagaa gttgaattaa cctcacaatt cgttttgtac ggaactaaga gatcacaaat 360
gaaaacggaa aacaacaaca aaaatgaaaa agcgatactt ttttaaacca ccctgtcatc 420
ctcatctcaa agagcttctt gacttccatg agtgcta 457
<210> 9
<211> 557
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 9
atacttttaa taacactttc aatttggttt ctttttcgca cttgtgcttc ttctccgctt 60
tcatcttagt tatggactgt tcctaagctt gccatgaata aaactgtgaa taataaagct 120
tttaatgttc tgtttcttac tttaagtcag acaataaact tttaacactt gtgatcatga 180
atccttggcc ttcagtgtat gattgatgct cttaacactt ctggtgttgt agaggaacat 240
tttttttgca ctctttcagg aacgaattgt gttactgaga agttgataat atcggttttg 300
caaacaaatg taagatgaaa aaacagagta tatattactg aatctgtttc gatgaaaaac 360
agagtaaata aagctaaaga ttcgccattt ttatttcttt attgtgggct actcgccaag 420
caatctacac tcaacagaca ctaataagga taaaaaaact tcgcaacaga atcagatatc 480
taaaaatccc ggaaattcac tagatttctt cgattggtac cgagaggtgt catcaaattt 540
aacagacttc aagttta 557
<210> 10
<211> 573
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 10
tgtgaaacca atctggatat ccctgaaatt tgaataaggt tatgttgtga gtttatgaag 60
ttgtggtcta gtgttgtatt ttgtttttct taaggataat gcatctgtgt gctttgctta 120
tctaaaatct aaataaagtg ggtttctgca ttgtgacttt gcacaaactt cttttgttaa 180
aatgaataag aaatcacatc aagaaaacag aacaagacca caacgagaag acttgaaact 240
ctctgaaggt atataaacaa acagaaccta gtaaattaga gtcagcttat tcaaaacttt 300
tagaccatca tcaagatcat tataaacttg gagtcaatgt tgcggaaacc aatctgctat 360
ccccggaatt tcaaataaag agactagaga attactttga acacacttct tttattaaat 420
cggatcacaa aaatccatca aagacacaac agcaacaaac acaaagagaa gacttaaaac 480
actgaagcag taaacaaaca gagagaaata aagtagaatc agcttattca aagtgtgtaa 540
actatcatca aaagatactt aaaatctcca taa 573
<210> 11
<211> 633
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 11
aaaagaaatg tctttaggtg acagtaagac catggaggag ttttcagctt taaattttgc 60
ttttgtaatt cagattccgg aatccttcat aatctctatc tgagtttagt tttgttgttg 120
aatcaaacat ccgatttaaa gttatgttca ttccatcttc tctccccttt tcgagcatgc 180
gagaatatga ttccccctat tgaacaaatc aatcaacctt taagcgataa caaattggtg 240
ttgtgaaaat tattaacttc ttgatctcgt tttgtcagat ctaaaattac tatagccaag 300
ctacctttca cgtcaagttg tcactcctat ctattccagt gatcttagga agtctatctt 360
ttggaagtca agttttactc tagggaacca aaagatttgt tcagaaacaa gaaaagttcc 420
ttagctgaat aacaaaaact tgaatcagta ttagacagac ccaccacacg atataacaga 480
cctgacacaa acccaaccct agaagtagtc acaatgttca agtaactcta aagatataaa 540
aaaaaagaca aagacatttt ggaaaatctt aaaactcaga acaactcgac atattagaag 600
ttttcagaac cataagagca atttcttcat ctc 633
<210> 12
<211> 639
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 12
tcactcaagt caaattgtct tggtcgtctc tttatatatt tttgtatctt cttattaaaa 60
aggtaaattt gacttttaat ataatggtgt gcttattgtg atttgtcatt atgtttgtac 120
ctatctcttt tgtgagttgt gtgatagata tactttgtat tttttcttaa aagtcaatat 180
aaatttctgt ttgcgagaga aaaatcgaat ctttgaatag tgaactttgt ggcgataaac 240
taatataatg attaatgaag agaatgttgc gatataggac actttcatat aatgaagaga 300
atgaacctga tcgataaaca tgtgggccta aaatgaagcc catctcaatc aactctctgg 360
acacaggtcc acttactcaa cacacaggcc catctgaata tgcaattttc attatgacac 420
ggcaaataaa aagagaagca gaagaggagg atcttaagag tttcatcacc atctcaagat 480
gatcattttc aaccttttta ttcttctaca aatccggcag gaaaatggga aagatcagta 540
gttgcccact caaaccatga accaagcaga gaaaaaacag agtacgtaga aagaaactag 600
tttaaaaaaa ctattgcaac ttcttcttcc atctcagtt 639
<210> 13
<211> 685
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 13
agagatagat tgattgatgg acttgtgatg agtgaataaa acagggagta gcattactca 60
ttcctccctt gtgagacact ttggaatcaa atcttacgtt gctgctactc tctttgagtc 120
ttttcttttg tttttgttac ttgacacagt ttttttttgt ttccggtttg ttgacattta 180
gtttctcaat ctaaactcca gagacttatt ttcgctctct tttgatcaga attaggtata 240
tctttattcg gataatcctt cccatccaaa ctgaaattgt tagtaccaac atttttttta 300
tcagaacata tctcgagtac tgtgttgatt ggattcacat atcttatgtt tccagaatct 360
gaacaataca aagagggaag agtctgtttt acactacacc aaatccttac tctagggaat 420
tcttctgtat tctctttagg tttaattctt agtaagcgag tgaataagag aatttactaa 480
agatcgttca taagtggact attgaagatg taactaaggc aatagtttga aatataaatg 540
ccaatcacaa gtggactgat gtttgagtaa aaaaatctct tgagaatttc agcaaagtct 600
aagaagatag tcgaatacaa caaactaaac aacgacataa agatttcgaa agggtacagc 660
aaaaccaaat gccaagtata ccgca 685
<210> 14
<211> 411
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 14
ttctcaaagc tttgacatgt aaagataaat aaatactttc tgcttgatgc agtctcatga 60
gttttgtaca aatcatgtga acatataaat gcgctttata agtaaatgag tgtcttgttc 120
aatgaatcat atgaaagaat ttgtatgact cagaaaattg gacaatgata tagaccttcc 180
aaattttgca ccctctaatg tgagatatta gtgatttttt cttaggttgg tagagagaac 240
ggattggcaa aaaaatatcg aaggtcaatg attaacagca aaaccatatc ttgatgattc 300
aaaatataga gttaacaagc aaagatgaga caatcttata cgagagagct aaaacaaatg 360
gattccaaat ccagcaagta caaaaatcgc agaaaataag atgaaaccaa c 411
<210> 15
<211> 457
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 15
tagcactcat ggaagtcaag aagctctttg agatgaggat gacagggtgg tttaaaaaag 60
tatcgctttt tcatttttgt tgttgttttc cgttttcatt tgtgatctct tagttccgta 120
caaaacgaat tgtgaggtta attcaacttc tattttaact gatagccgag aaagcttgtc 180
tagttattta caaatgtttt atcaattgtg ataatgttac taatccactt cacatgaaaa 240
ttccatttcg atttctcatt ctattattat aagaacaaga gagattgaga cgaaatactg 300
atattactat attggttacc aaccgcaaag aataacaaac agtgtgttct tcttatacaa 360
ccttggaatt ttaaggctaa accaaaaaac tgtctggtcc agaacatgga tgtctcgacc 420
agattccttg ttaaaaactt cctgctcttt gatgtta 457
<210> 16
<211> 782
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 16
gcattgtttt gatgctgcta cctataaaag tatgagcttc agatgagaat ttagagagct 60
cccctgaggc aatgggttat gactttgtta tcatcttagt actactccta tctaagggac 120
ggtgtaaggc tgtaatctat gtgcggtgca atgataaggc tatcctttct gcgtttgatc 180
atgacatctc atcgctgttc gattctttct cgctggcgtc tgttatgttg aatgatgcaa 240
ttcttctgta agattccgcc tttaccgaaa tatctctagt atcaaattta aattggagta 300
cggatcctct ttgaacatac ggatctattt gagataattt tgtctgatca tcaacgagaa 360
ctcggaagcg tgccaacctt gtgggtcaat tgtaacgata aagcagggag aatatagttc 420
cccctttttc ctctgatgat gaaatggcag gagaagtgta gttgagcctg ctgttttggt 480
gaagactgaa atggtatcag aaagtcagaa tccactataa ccaatacaac agcagctgat 540
atataatcat tgatcaagga aaacaactgc agctcataga ttaatgctta ctagctttgt 600
ccatcaatac atacaaaaac cagtccaaca gtcatggtaa ctgctccaaa tcaaagcacg 660
ccagaagttc tcttaacgcc tcacacagca ggaaacacaa caacaaactg gattttattt 720
atctacacat ccatcatatt tacataccaa gggagaatcc gcaggactca ttttcctttc 780
tt 782
<210> 17
<211> 825
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 17
aggcagcagc agtatccaac tagtcatgta tccagcctaa attgaaaagt cagatcatgt 60
gtaacatggc cctcaatatt tcgatgttgc cttgtggaaa aaatagctgg tattggtact 120
gtgtttttta ctccttccag ctaccgacgt tcagtgttag tgcacaaaat gttcatccat 180
ggtagtttgt ctacattgca gtcatgtaaa gttaaacatt cacgatttct gtacttttgc 240
atgtgtaact aaatgaaatg gtgtgttaca ttcattcctt caatcaaata atccatagaa 300
acaaactggt ttgtaactat tgtaactagt cgctagtgtc catggtattt tcgattgtgg 360
aacataatta gtttaatctg cttcagtata acttaagccg gctttatcct gtgtatgcat 420
cagcttcgct ccattgaaca tccaaacatc agtataagca ttttgtggcg actaatcatc 480
cggagatagg gcaatgcttt ctaccaactg aagagtagag acgtgatgct gtgagatgga 540
atgcaaattt cgcatattag taagaagttg gggaaggatt cgaccactca ctgagaagct 600
agagcatcat ggcacagtaa ttacaatgta acgtagcata ttcttgaaca agaacatctg 660
gtcaaatacc aaccgggaaa aaatccacat cgataaagag gtgccgagtg cttacatcaa 720
cgtctttgcc ataatcagaa cactactccg tacaagctaa cacgagagca gagattacat 780
ttgcacggat gcaaaagttt ccaagatagg gaactggagt gaagc 825
<210> 18
<211> 791
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 18
actgagcttt taaaagagtg aggtctaggt tctgttgtct gtctgtccat catccatgtg 60
ttgactgttg agggaactcg tttcttcttt tcttcacgag atgagttttt gtgtgcctgt 120
aatactagtt tgtagcaaag gctgcgttac ataaggtgat gagaattgag gtaaaatgag 180
atctgtacac taaattcatt cagactgttt tggcataaag aataatttgg ccttctgcga 240
tttcagaagc tataaattgc catctcacta aattctcctt ggtcctcatg gcaatgcaac 300
gacagtgtga agcactgaag cccgtaatgc tctatcacca ccatgtacaa cagaaccata 360
tatgtccata tgtacaactc gagtgttgtt tgagtggcca gcaaactggc tgaccaagcc 420
acacgagaga gaatactata aactcaatca tacataacaa gcccaagcaa cagaagacag 480
aacacaacaa cactcgagtc tgggaacagc aacgccgata cactacagca tactgcaacg 540
acacaaagga attggtaagg aaatggcacc aaaatcttgt agatctttag cgagtcattc 600
atttatagca tatgttggaa cagacatgag tcacaagatt tatgatagct tagataacag 660
atggtcggaa ttaaccgccg agagcctata gatgaacaaa aactctgttc caccagtgtt 720
ctcatgctaa aaactttctg aaatacccta ccctgttcac cgaatttctc cacctgttgg 780
atagcagcat t 791
<210> 19
<211> 881
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 19
ggtgacggcg acgcgatcga acaggtggtg atcgatgctg caacgtgtgt aaatatacag 60
cgccggctgg gtcaagagat ggctcgggtg acgcgcgcgc ggcgtgtcct ggcgttggcg 120
ccggggcatt ctttagtttt tcatcttttc atcatctcag atggtagata caaaacagtg 180
tatgtatgta gctctgtttc tctctataga accccaacaa attttgttgt tgatgttgtt 240
tatcttcata tgctttgatc ttgaaatcgt ctaccttact actgccgatc gttgctcaaa 300
agtgtggaag tttgaagcat cttccacggg cgttgctcta ctcccatctc gtttcaccac 360
gaaatcccct tcgcatagag gcatctcagc cgtacatctc caaacccacg ttctggattc 420
agcaaacgga cggcatatgc cagcggactg actaggattt gtggttcaga ataaaaatat 480
ggtttgcagt gtcaattttc caggagagtg actatgtcat actaacttca tactccaata 540
atgaagctaa gctatctcca tgtacatatc aaatacgaaa tcatatccaa gggaactaac 600
acagtcacaa acaacaggta cacagacaat tacagcacaa gcgcaggagg gaaataattt 660
taactgaact aggaagaaag gaaacacaac tcatttttta ttgatatatg ttggatgaat 720
ccaataaaac cgatacaagt cacgaaaaat cagactagat gaatccttcg agatcacatg 780
agcaaaagct ttcgacgaaa gctgtcctat agtcgtggaa gcaataacac ttgataaaga 840
taggaattca gacacgagag gttgcagact ataagatgtc a 881
<210> 20
<211> 772
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 20
ccgtggcaat ggctgtcatg ctttggcaca tactaatagc aaggtagaat ggtacagcta 60
tttcattatt tttgcccttg tatatttgta tcactacatg agtaaacgac gtttagttat 120
cgatagtttt gttatgagtg atgaatgatc tgcatcgtac tgccaatgcc ttgcattctc 180
aaatggttgc acacttgcac tcatacaaag ttagtacact ccatcatatt ataaattact 240
tttttttcaa gttaaatttc ctgaaagttt gataaaattt atagaaaaaa tataacgacg 300
cttataacac taaattaatt tcattacatc taacattaaa catattttga tttttttttg 360
ttttgtgtta aatatattac tatgtttttc tataaacttg attaaacata taaaagttta 420
acttcaaaaa aaagttaaaa tgacttgtaa tataaaacgt aggcagtaca atgcgaatgt 480
agggtactcc atccagctga ggtaaaccaa ctccaatata tatacaaaca caaacaacgt 540
acccaatttt tactgttaaa atacaggcac aatgcctggt atcacacgtt attaagtaga 600
cagactcgat aaccatgaca cggacaggga cttcttgcca ctggtttacg cacggttaat 660
attacagacc acacatagag agacggctta gctatttgca aataagcttg acaagataga 720
tgatgctcca aaaggatgcg atctcagcag ttgagtactt acgctggttc at 772
<210> 21
<211> 827
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 21
acaccacctg ctgtctgcgc ttgtttgttg ccacggctgc gctacaaaca caagccgtat 60
catctgccga acagctccat cgttagcttc ttttgatgcc ttacatctat cgctggacgt 120
ttatcgtgcg tacttgtccc atacagggat tgtgtttgga tgatttgtag agagggtact 180
gtatggcata agatccttca tattaatgtt ctgtgggtca catatcaact tgctattatt 240
gtattcagcg gttctctctc tattttgcct taagctgtgg taccatttta agtccagtgc 300
ttgcttttga ttgcttttct gagctttcca ggacatggaa tcgagcctgt gaatgtcgtc 360
ggccggttta tcctttcgac taataattta aattgtccag tgttggttag gaatggagta 420
tcagattctg gcggtttgca tgctgtttgg tcggcgacgt gccttatcct gaagatttat 480
atatagtact ttgattgatg tcaagaagga aatttcttta agaaactttt tacaaatagc 540
gattggtaga actgattaac aacatccacg gctcagaaaa ggaacgcaaa catatttgat 600
tcttccctaa attaatttgc cattgttatt tttacttgac catccgtcaa aatttacatg 660
aatacacaac gcacggacga acgatttatt catgtgaagg catgatttac atccttaaaa 720
ttctctcgca tctagatata gctagagagt ggccagctgc tgactatgca tggagctggc 780
acggcagtag tgtacaatgc tactgtaatt ttgtattgct acaagta 827
<210> 22
<211> 770
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 22
gctgaaattt ggttatctgt tatgagcata tctgatttcg atacccactg ttatgaaact 60
gaataaaccg cattcctgta tgctgggaat tttctcgtta gtgtacgctc caatactcgt 120
gccgttttca aagacaagca gtgatatgca aagcaatgct gtgtatcttg tgtgttacat 180
caggagtttt ttttaatggt gatttcgttc atagttttca gacatctgtt tccgtcacac 240
gttcgtggga atgacttttt tcatatgaaa tgcgcccatg gctgcgcctg aaataatttt 300
acttgtcccg tttgggatga atgaattctt ttcctgttcg ttgttcagta attcacacag 360
agtcataaac ataccggtgg aaacatgctc acaaagaaag aaacatcatg aagtcaggct 420
aaggataaga atagccagca cacctagagc aaaattttac taacatcaga tgcaagaaag 480
tctacatgag ttctaaaaag gaaactgggg aaaactaatt tacaccaatt atcactaata 540
gtacactaaa tataaacgac caagaagggc tctaggaacc cattttgtat ctagcacccg 600
aacgttgaac ctttctcccg ataaaagagg gatcaggcgt gcaacagact ggctctcacg 660
ccagggaaac cacaggtaca aaagaggcag cgaaagaaga aacaaaactt ttcctccggg 720
gcgaacatat acaacttgag aggaaaaata cacaatggcc gagagacaaa 770
<210> 23
<211> 814
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 23
agtgttactt attgttgcta ctatccatat tcgctaccat gcttatcatc gctagattaa 60
aggacatgta ttccagtatg gtcgtgcttt ttgcttggta ctctggtcac atttgtgatg 120
aatgttcgca gttttcgtgg tcatggtctg gattctacat tccacctaaa gaagttttta 180
cctggttatt taatccttga gttgttgaat tagctcatgg taattgtcag tagtcttcca 240
cttggttctc tctgtggatg atcgttcttg ttctctgttt gcgctgtggc tgattgttct 300
catgttttta aggtttttgg gttagtcact ggtcgcttcg tcactgtgag ccaaaccata 360
tgccggtagt tttcttcttc accatcatcc gtttgatcct gactcgcgga tctcctaatc 420
caacttctct cttttttttt tttaatccaa actcacccaa cgttggaaac atagcttgga 480
accccttgaa attgaacaga atttatagca ggcaaaaatg taagaaacca cgctagtgta 540
gcaggcttac agcggggcaa agcagctttt gttaagcaac cacttacgtt agagattcag 600
agataagcga tgttactttg tttttaccaa catttacata caagcggtac aacacatatt 660
gccagaaacc acttggtttt ccagccataa tttttgacaa ttcatgacgc gcgcgcgcac 720
acacaatgct ggattcacag ggtcacacag ccatgagcca tcagactgga agggctctgt 780
ttgttcatca catagtcaca gatcgccttg gcct 814
<210> 24
<211> 834
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 24
ttggcagcct acccactctg gtaggaaaaa tggaaggggc aagaagatac agtcgatgat 60
atttgatgtg ctacatacca attgtaatat ttcattcata tctagagcta gaaggatatt 120
cacttgtatt tcagactctg gttcacggtt taaattgata ttgtggtaga atgctttctt 180
ggatgggtat atagtgtgac tcgttaaaaa tatgacaaaa cggttcagct actctttaca 240
agtggtacgg caaattgtag acccaattgc acttggcggt gagctgcttt gttggagcaa 300
cagggcactg tctgcttgcg tggatgaaaa gctgagtcat ctgaagctag tgaacatttt 360
ttcgctggct cgctgcgtgt gttttttctc tgattgtggc ccggttgatt atgaaaatga 420
ccagtaagta aagtcatccg accctgctga tttgtttgtt ttgcctaacc tagctcatgc 480
tcggggtcgt gaatcgtgct acacttgttg cagctttcgt tttcttgaag agttggaagg 540
tgtcagctta gcttcctgtg cgtactagta ttgcagaaga aaacgtaaaa ctgtaccaga 600
gcaagaagac tttgacataa atttgtaaca aggcagatag gtggtacaaa tcaaggcact 660
cagctgaaca gctcaactga aatgcagaac tgaattgaag agtaaaaatg atccatgcat 720
gacagacaaa ccagtggaca ctgactgaag atggagcaat gaacaaaata aaatcaagac 780
ttgtttttat tggcgcatgc atatttaggg tgatatgatg catgacgaaa tgaa 834
<210> 25
<211> 740
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 25
ggtgttccat atagatgatc agatttctat aaccacatga gtacaatgta gagaattcaa 60
atgttttgta accacgtgag ctttgtacgc tatttgcacc acagttctcc ctgtatgttg 120
ttggctcttt tacaattaag aataatgcat gttgaagtat gagtcttcct gtttgcttct 180
ccttgatgat gaaacgctgc tgcatcaact gattattttt cagagaataa acgataaaca 240
aagcacggtg aagtatcgtg taacccacca taagtggtag agccgtagag gtaggactgt 300
gcatgctgaa ttgtaattac catggttagt tcagcagaat ttgcaaaaag aggacaacag 360
aattagacca tcgtcatgaa ttaatcaagg tacaaaccaa tggttgctgg tacatcagta 420
gcaaatggct gtagcactag cgtgcccata tttatattcc aagcctccaa ggtatacaat 480
acatatttga tgtaccgaac aactgaaaaa ggcgcttggt ttggaagcgc actattttta 540
aatttatagg ataacttctg acagcctttc ttctaaatga acttttggca accgctctga 600
agccgtgtaa cacaatccaa caaagcaatt tgcagtcaaa atttcgggca tgtgccgttc 660
tagttagaat ttaggatgtg actcactaag taattgtgat tgtttctcta tgcaaacacc 720
agccaacagt attgatttca 740
<210> 26
<211> 782
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 26
aagaaaggaa aatgagtcct gcggattctc ccttggtatg taaatatgat ggatgtgtag 60
ataaataaaa tccagtttgt tgttgtgttt cctgctgtgt gaggcgttaa gagaacttct 120
ggcgtgcttt gatttggagc agttaccatg actgttggac tggtttttgt atgtattgat 180
ggacaaagct agtaagcatt aatctatgag ctgcagttgt tttccttgat caatgattat 240
atatcagctg ctgttgtatt ggttatagtg gattctgact ttctgatacc atttcagtct 300
tcaccaaaac agcaggctca actacacttc tcctgccatt tcatcatcag aggaaaaagg 360
gggaactata ttctccctgc tttatcgtta caattgaccc acaaggttgg cacgcttccg 420
agttctcgtt gatgatcaga caaaattatc tcaaatagat ccgtatgttc aaagaggatc 480
cgtactccaa tttaaatttg atactagaga tatttcggta aaggcggaat cttacagaag 540
aattgcatca ttcaacataa cagacgccag cgagaaagaa tcgaacagcg atgagatgtc 600
atgatcaaac gcagaaagga tagccttatc attgcaccgc acatagatta cagccttaca 660
ccgtccctta gataggagta gtactaagat gataacaaag tcataaccca ttgcctcagg 720
ggagctctct aaattctcat ctgaagctca tacttttata ggtagcagca tcaaaacaat 780
gc 782
<210> 27
<211> 825
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 27
gcttcactcc agttccctat cttggaaact tttgcatccg tgcaaatgta atctctgctc 60
tcgtgttagc ttgtacggag tagtgttctg attatggcaa agacgttgat gtaagcactc 120
ggcacctctt tatcgatgtg gattttttcc cggttggtat ttgaccagat gttcttgttc 180
aagaatatgc tacgttacat tgtaattact gtgccatgat gctctagctt ctcagtgagt 240
ggtcgaatcc ttccccaact tcttactaat atgcgaaatt tgcattccat ctcacagcat 300
cacgtctcta ctcttcagtt ggtagaaagc attgccctat ctccggatga ttagtcgcca 360
caaaatgctt atactgatgt ttggatgttc aatggagcga agctgatgca tacacaggat 420
aaagccggct taagttatac tgaagcagat taaactaatt atgttccaca atcgaaaata 480
ccatggacac tagcgactag ttacaatagt tacaaaccag tttgtttcta tggattattt 540
gattgaagga atgaatgtaa cacaccattt catttagtta cacatgcaaa agtacagaaa 600
tcgtgaatgt ttaactttac atgactgcaa tgtagacaaa ctaccatgga tgaacatttt 660
gtgcactaac actgaacgtc ggtagctgga aggagtaaaa aacacagtac caataccagc 720
tattttttcc acaaggcaac atcgaaatat tgagggccat gttacacatg atctgacttt 780
tcaatttagg ctggatacat gactagttgg atactgctgc tgcct 825
<210> 28
<211> 776
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 28
aatgctgcta tccaacaggt ggagaaattc ggtgaacagg gtagggtatt tcagaaagtt 60
tttagcatga gaacactggt ggaacagagt ttttgttcat ctataggctc tcggcggtta 120
attccgacca tctgttatct aagctatcat aaatcttgtg actcatgtct gttccaacat 180
atgctataaa tgaatgactc gctaaagatc tacaagattt tggtgccatt tccttaccaa 240
ttcctttgtg tcgttgcagt atgctgtagt gtatcggcgt tgctgttccc agactcgagt 300
gttgttgtgt tctgtcttct gttgcttggg cttgttatgt atgattgagt ttatagtatt 360
ctctctcgtg tggcttggtc agccagtttg ctggccactc aaacaacact cgagttgtac 420
atatggacat atatggttct gttgtacatg gtggtgatag agcattacgg gcttcagtgc 480
ttcacactgt cgttgcattg ccatgaggac caaggagaat ttagtgagat ggcaatttat 540
agcttctgaa atcgcagaag gccaaattat tctttatgcc aaaacagtct gaatgaattt 600
agtgtacaga tctcatttta cctcaattct catcacctta tgtaacgcag cctttgctac 660
aaactagtat tacaggcaca caaaaactca tctcgtgaag aaaagaagaa acgagttccc 720
tcaacagtca acacatggat gatggacaga cagacaacag aacctagacc tcactc 776
<210> 29
<211> 881
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 29
tgacatctta tagtctgcaa cctctcgtgt ctgaattcct atctttatca agtgttattg 60
cttccacgac tataggacag ctttcgtcga aagcttttgc tcatgtgatc tcgaaggatt 120
catctagtct gatttttcgt gacttgtatc ggttttattg gattcatcca acatatatca 180
ataaaaaatg agttgtgttt cctttcttcc tagttcagtt aaaattattt ccctcctgcg 240
cttgtgctgt aattgtctgt gtacctgttg tttgtgactg tgttagttcc cttggatatg 300
atttcgtatt tgatatgtac atggagatag cttagcttca ttattggagt atgaagttag 360
tatgacatag tcactctcct ggaaaattga cactgcaaac catattttta ttctgaacca 420
caaatcctag tcagtccgct ggcatatgcc gtccgtttgc tgaatccaga acgtgggttt 480
ggagatgtac ggctgagatg cctctatgcg aaggggattt cgtggtgaaa cgagatggga 540
gtagagcaac gcccgtggaa gatgcttcaa acttccacac ttttgagcaa cgatcggcag 600
tagtaaggta gacgatttca agatcaaagc atatgaagat aaacaacatc aacaacaaaa 660
tttgttgggg ttctatagag agaaacagag ctacatacat acactgtttt gtatctacca 720
tctgagatga tgaaaagatg aaaaactaaa gaatgccccg gcgccaacgc caggacacgc 780
cgcgcgcgcg tcacccgagc catctcttga cccagccggc gctgtatatt tacacacgtt 840
gcagcatcga tcaccacctg ttcgatcgcg tcgccgtcac c 881
<210> 30
<211> 772
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 30
atgaaccagc gtaagtactc aactgctgag atcgcatcct tttggagcat catctatctt 60
gtcaagctta tttgcaaata gctaagccgt ctctctatgt gtggtctgta atattaaccg 120
tgcgtaaacc agtggcaaga agtccctgtc cgtgtcatgg ttatcgagtc tgtctactta 180
ataacgtgtg ataccaggca ttgtgcctgt attttaacag taaaaattgg gtacgttgtt 240
tgtgtttgta tatatattgg agttggttta cctcagctgg atggagtacc ctacattcgc 300
attgtactgc ctacgtttta tattacaagt cattttaact tttttttgaa gttaaacttt 360
tatatgttta atcaagttta tagaaaaaca tagtaatata tttaacacaa aacaaaaaaa 420
aatcaaaata tgtttaatgt tagatgtaat gaaattaatt tagtgttata agcgtcgtta 480
tattttttct ataaatttta tcaaactttc aggaaattta acttgaaaaa aaagtaattt 540
ataatatgat ggagtgtact aactttgtat gagtgcaagt gtgcaaccat ttgagaatgc 600
aaggcattgg cagtacgatg cagatcattc atcactcata acaaaactat cgataactaa 660
acgtcgttta ctcatgtagt gatacaaata tacaagggca aaaataatga aatagctgta 720
ccattctacc ttgctattag tatgtgccaa agcatgacag ccattgccac gg 772
<210> 31
<211> 827
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 31
tacttgtagc aatacaaaat tacagtagca ttgtacacta ctgccgtgcc agctccatgc 60
atagtcagca gctggccact ctctagctat atctagatgc gagagaattt taaggatgta 120
aatcatgcct tcacatgaat aaatcgttcg tccgtgcgtt gtgtattcat gtaaattttg 180
acggatggtc aagtaaaaat aacaatggca aattaattta gggaagaatc aaatatgttt 240
gcgttccttt tctgagccgt ggatgttgtt aatcagttct accaatcgct atttgtaaaa 300
agtttcttaa agaaatttcc ttcttgacat caatcaaagt actatatata aatcttcagg 360
ataaggcacg tcgccgacca aacagcatgc aaaccgccag aatctgatac tccattccta 420
accaacactg gacaatttaa attattagtc gaaaggataa accggccgac gacattcaca 480
ggctcgattc catgtcctgg aaagctcaga aaagcaatca aaagcaagca ctggacttaa 540
aatggtacca cagcttaagg caaaatagag agagaaccgc tgaatacaat aatagcaagt 600
tgatatgtga cccacagaac attaatatga aggatcttat gccatacagt accctctcta 660
caaatcatcc aaacacaatc cctgtatggg acaagtacgc acgataaacg tccagcgata 720
gatgtaaggc atcaaaagaa gctaacgatg gagctgttcg gcagatgata cggcttgtgt 780
ttgtagcgca gccgtggcaa caaacaagcg cagacagcag gtggtgt 827
<210> 32
<211> 770
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 32
tttgtctctc ggccattgtg tatttttcct ctcaagttgt atatgttcgc cccggaggaa 60
aagttttgtt tcttctttcg ctgcctcttt tgtacctgtg gtttccctgg cgtgagagcc 120
agtctgttgc acgcctgatc cctcttttat cgggagaaag gttcaacgtt cgggtgctag 180
atacaaaatg ggttcctaga gcccttcttg gtcgtttata tttagtgtac tattagtgat 240
aattggtgta aattagtttt ccccagtttc ctttttagaa ctcatgtaga ctttcttgca 300
tctgatgtta gtaaaatttt gctctaggtg tgctggctat tcttatcctt agcctgactt 360
catgatgttt ctttctttgt gagcatgttt ccaccggtat gtttatgact ctgtgtgaat 420
tactgaacaa cgaacaggaa aagaattcat tcatcccaaa cgggacaagt aaaattattt 480
caggcgcagc catgggcgca tttcatatga aaaaagtcat tcccacgaac gtgtgacgga 540
aacagatgtc tgaaaactat gaacgaaatc accattaaaa aaaactcctg atgtaacaca 600
caagatacac agcattgctt tgcatatcac tgcttgtctt tgaaaacggc acgagtattg 660
gagcgtacac taacgagaaa attcccagca tacaggaatg cggtttattc agtttcataa 720
cagtgggtat cgaaatcaga tatgctcata acagataacc aaatttcagc 770
<210> 33
<211> 814
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 33
aggccaaggc gatctgtgac tatgtgatga acaaacagag cccttccagt ctgatggctc 60
atggctgtgt gaccctgtga atccagcatt gtgtgtgcgc gcgcgcgtca tgaattgtca 120
aaaattatgg ctggaaaacc aagtggtttc tggcaatatg tgttgtaccg cttgtatgta 180
aatgttggta aaaacaaagt aacatcgctt atctctgaat ctctaacgta agtggttgct 240
taacaaaagc tgctttgccc cgctgtaagc ctgctacact agcgtggttt cttacatttt 300
tgcctgctat aaattctgtt caatttcaag gggttccaag ctatgtttcc aacgttgggt 360
gagtttggat taaaaaaaaa aaagagagaa gttggattag gagatccgcg agtcaggatc 420
aaacggatga tggtgaagaa gaaaactacc ggcatatggt ttggctcaca gtgacgaagc 480
gaccagtgac taacccaaaa accttaaaaa catgagaaca atcagccaca gcgcaaacag 540
agaacaagaa cgatcatcca cagagagaac caagtggaag actactgaca attaccatga 600
gctaattcaa caactcaagg attaaataac caggtaaaaa cttctttagg tggaatgtag 660
aatccagacc atgaccacga aaactgcgaa cattcatcac aaatgtgacc agagtaccaa 720
gcaaaaagca cgaccatact ggaatacatg tcctttaatc tagcgatgat aagcatggta 780
gcgaatatgg atagtagcaa caataagtaa cact 814
<210> 34
<211> 834
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 34
ttcatttcgt catgcatcat atcaccctaa atatgcatgc gccaataaaa acaagtcttg 60
attttatttt gttcattgct ccatcttcag tcagtgtcca ctggtttgtc tgtcatgcat 120
ggatcatttt tactcttcaa ttcagttctg catttcagtt gagctgttca gctgagtgcc 180
ttgatttgta ccacctatct gccttgttac aaatttatgt caaagtcttc ttgctctggt 240
acagttttac gttttcttct gcaatactag tacgcacagg aagctaagct gacaccttcc 300
aactcttcaa gaaaacgaaa gctgcaacaa gtgtagcacg attcacgacc ccgagcatga 360
gctaggttag gcaaaacaaa caaatcagca gggtcggatg actttactta ctggtcattt 420
tcataatcaa ccgggccaca atcagagaaa aaacacacgc agcgagccag cgaaaaaatg 480
ttcactagct tcagatgact cagcttttca tccacgcaag cagacagtgc cctgttgctc 540
caacaaagca gctcaccgcc aagtgcaatt gggtctacaa tttgccgtac cacttgtaaa 600
gagtagctga accgttttgt catattttta acgagtcaca ctatataccc atccaagaaa 660
gcattctacc acaatatcaa tttaaaccgt gaaccagagt ctgaaataca agtgaatatc 720
cttctagctc tagatatgaa tgaaatatta caattggtat gtagcacatc aaatatcatc 780
gactgtatct tcttgcccct tccatttttc ctaccagagt gggtaggctg ccaa 834
<210> 35
<211> 740
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 35
tgaaatcaat actgttggct ggtgtttgca tagagaaaca atcacaatta cttagtgagt 60
cacatcctaa attctaacta gaacggcaca tgcccgaaat tttgactgca aattgctttg 120
ttggattgtg ttacacggct tcagagcggt tgccaaaagt tcatttagaa gaaaggctgt 180
cagaagttat cctataaatt taaaaatagt gcgcttccaa accaagcgcc tttttcagtt 240
gttcggtaca tcaaatatgt attgtatacc ttggaggctt ggaatataaa tatgggcacg 300
ctagtgctac agccatttgc tactgatgta ccagcaacca ttggtttgta ccttgattaa 360
ttcatgacga tggtctaatt ctgttgtcct ctttttgcaa attctgctga actaaccatg 420
gtaattacaa ttcagcatgc acagtcctac ctctacggct ctaccactta tggtgggtta 480
cacgatactt caccgtgctt tgtttatcgt ttattctctg aaaaataatc agttgatgca 540
gcagcgtttc atcatcaagg agaagcaaac aggaagactc atacttcaac atgcattatt 600
cttaattgta aaagagccaa caacatacag ggagaactgt ggtgcaaata gcgtacaaag 660
ctcacgtggt tacaaaacat ttgaattctc tacattgtac tcatgtggtt atagaaatct 720
gatcatctat atggaacacc 740
<210> 36
<211> 330
<212> DNA
<213> 马铃薯（Solanum tuberosum）
<400> 36
cctcggtgac gtggggcaac ctagacttgt ccatcttctg gattggccaa cttaattaat 60
gtatgaaata aaaggatgca cacatagtga catgctaatc actataatgt gggcatcaaa 120
gttgtgtgtt atgtgtaatt actagttatc tgaataaaag agaaagagat catccatatt 180
tcttatccta aatgaatgtc acgtgtcttt ataattcttt gatgaaccag atgcatttca 240
ttaaccaaat ccatatacat ataaatatta atcatatata attaatatca attgggttag 300
caaaacaaat ctagtctagg tgtgttttgc 330
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T1正向引物
<400> 37
aggcaaacaa ggtacctaaa cttgaagtct gttaaatttg 40
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T1反向引物
<400> 38
gccatggatc ggtaccatac ttttaataac actttcaatt tg 42
<210> 39
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2正向引物
<400> 39
aggcaaacaa ggtaccttat ggagatttta agtatctttt g 41
<210> 40
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2反向引物
<400> 40
gccatggatc ggtacctgtg aaaccaatct ggatatc 37
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T3正向引物
<400> 41
aggcaaacaa ggtaccgaga tgaagaaatt gctcttatg 39
<210> 42
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T3反向引物
<400> 42
gccatggatc ggtaccaaaa gaaatgtctt taggtgac 38
<210> 43
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T4正向引物
<400> 43
aggcaaacaa ggtaccaact gagatggaag aagaagttg 39
<210> 44
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T4反向引物
<400> 44
gccatggatc ggtacctcac tcaagtcaaa ttgtcttg 38
<210> 45
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T5正向引物
<400> 45
aggcaaacaa ggtacctgcg gtatacttgg catttg 36
<210> 46
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T5反向引物
<400> 46
gccatggatc ggtaccagag atagattgat tgatggac 38
<210> 47
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T6正向引物
<400> 47
aggcaaacaa ggtaccgttg gtttcatctt attttctgc 39
<210> 48
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T6反向引物
<400> 48
gccatggatc ggtaccttct caaagctttg acatgtaaag 40
<210> 49
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7正向引物
<400> 49
aggcaaacaa ggtacctaac atcaaagagc aggaagt 37
<210> 50
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7反向引物
<400> 50
gccatggatc ggtacctagc actcatggaa gtcaag 36
<210> 51
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T8正向引物
<400> 51
aggcaaacaa ggtaccatac ttttaataac actttcaatt tg 42
<210> 52
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T8反向引物
<400> 52
gccatggatc ggtacctaaa cttgaagtct gttaaatttg 40
<210> 53
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T9正向引物
<400> 53
aggcaaacaa ggtacctgtg aaaccaatct ggatatccc 39
<210> 54
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T9反向引物
<400> 54
gccatggatc ggtaccttat ggagatttta agtatctt 38
<210> 55
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T10正向引物
<400> 55
aggcaaacaa ggtaccaaaa gaaatgtctt taggtgacag 40
<210> 56
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T10反向引物
<400> 56
gccatggatc ggtaccgaga tgaagaaatt gctcttatg 39
<210> 57
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T11正向引物
<400> 57
aggcaaacaa ggtacctcac tcaagtcaaa ttgtcttgg 39
<210> 58
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T11反向引物
<400> 58
gccatggatc ggtaccaact gagatggaag aagaagttgc 40
<210> 59
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T12正向引物
<400> 59
aggcaaacaa ggtaccagag atagattgat tgatggact 39
<210> 60
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T12反向引物
<400> 60
gccatggatc ggtacctgcg gtatacttgg catttggt 38
<210> 61
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T13正向引物
<400> 61
aggcaaacaa ggtaccttct caaagctttg acatgta 37
<210> 62
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T13反向引物
<400> 62
gccatggatc ggtaccgttg gtttcatctt attttctgc 39
<210> 63
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T14正向引物
<400> 63
aggcaaacaa ggtacctagc actcatggaa gtcaag 36
<210> 64
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T14反向引物
<400> 64
gccatggatc ggtacctaac atcaaagagc aggaag 36
<210> 65
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T15正向引物
<400> 65
aggcaaacaa ggtaccgcat tgttttgatg ctgctacc 38
<210> 66
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T15反向引物
<400> 66
gccatggatc ggtaccaaga aaggaaaatg agtcctgc 38
<210> 67
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T16正向引物
<400> 67
aggcaaacaa ggtaccaggc agcagcagta tccaacta 38
<210> 68
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T16反向引物
<400> 68
gccatggatc ggtaccgctt cactccagtt ccctatct 38
<210> 69
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T17正向引物
<400> 69
aggcaaacaa ggtaccgagt gaggtctagg ttctgttg 38
<210> 70
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T17反向引物
<400> 70
gccatggatc ggtaccaatg ctgctatcca acaggtgg 38
<210> 71
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T18正向引物
<400> 71
aggcaaacaa ggtaccggtg acggcgacgc gatcgaac 38
<210> 72
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T18反向引物
<400> 72
gccatggatc ggtacctgac atcttatagt ctgcaacctc 40
<210> 73
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T19正向引物
<400> 73
aggcaaacaa ggtaccccgt ggcaatggct gtcatg 36
<210> 74
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T19反向引物
<400> 74
gccatggatc ggtaccatga accagcgtaa gtactcaac 39
<210> 75
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T20正向引物
<400> 75
aggcaaacaa ggtaccacac cacctgctgt ctgcgctt 38
<210> 76
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T20反向引物
<400> 76
gccatggatc ggtacctact tgtagcaata caaaattaca g 41
<210> 77
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T21正向引物
<400> 77
aggcaaacaa ggtaccgctg aaatttggtt atctgtta 38
<210> 78
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T21反向引物
<400> 78
gccatggatc ggtacctttg tctctcggcc attgtgta 38
<210> 79
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T22正向引物
<400> 79
aggcaaacaa ggtaccagtg ttacttattg ttgctacta 39
<210> 80
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T22反向引物
<400> 80
gccatggatc ggtaccaggc caaggcgatc tgtgacta 38
<210> 81
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T23正向引物
<400> 81
aggcaaacaa ggtaccttgg cagcctaccc actctggt 38
<210> 82
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T23反向引物
<400> 82
gccatggatc ggtaccttca tttcgtcatg catcatat 38
<210> 83
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T24正向引物
<400> 83
aggcaaacaa ggtaccggtg ttccatatag atgatcag 38
<210> 84
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T24反向引物
<400> 84
gccatggatc ggtacctgaa atcaatactg ttggctgg 38
<210> 85
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T25正向引物
<400> 85
aggcaaacaa ggtaccaaga aaggaaaatg agtcctgc 38
<210> 86
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T25反向引物
<400> 86
gccatggatc ggtaccgcat tgttttgatg ctgctacc 38
<210> 87
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T26正向引物
<400> 87
aggcaaacaa ggtaccgctt cactccagtt ccctatct 38
<210> 88
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T26反向引物
<400> 88
gccatggatc ggtaccaggc agcagcagta tccaacta 38
<210> 89
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T27正向引物
<400> 89
aggcaaacaa ggtaccaatg ctgctatcca acaggtgg 38
<210> 90
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T27反向引物
<400> 90
gccatggatc ggtaccgagt gaggtctagg ttctgttg 38
<210> 91
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T28正向引物
<400> 91
aggcaaacaa ggtacctgac atcttatagt ctgcaacc 38
<210> 92
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T28反向引物
<400> 92
gccatggatc ggtaccggtg acggcgacgc gatcga 36
<210> 93
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T29正向引物
<400> 93
aggcaaacaa ggtaccatga accagcgtaa gtactcaa 38
<210> 94
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T29反向引物
<400> 94
gccatggatc ggtaccccgt ggcaatggct gtcatg 36
<210> 95
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T30正向引物
<400> 95
aggcaaacaa ggtacctact tgtagcaata caaaattaca 40
<210> 96
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T30反向引物
<400> 96
gccatggatc ggtaccacac cacctgctgt ctgcgctt 38
<210> 97
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T31正向引物
<400> 97
aggcaaacaa ggtacctttg tctctcggcc attgtgta 38
<210> 98
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T31反向引物
<400> 98
gccatggatc ggtaccgctg aaatttggtt atctgttatg 40
<210> 99
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T32正向引物
<400> 99
aggcaaacaa ggtaccaggc caaggcgatc tgtgacta 38
<210> 100
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T32反向引物
<400> 100
gccatggatc ggtaccagtg ttacttattg ttgctactat 40
<210> 101
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T33正向引物
<400> 101
aggcaaacaa ggtaccttca tttcgtcatg catcatat 38
<210> 102
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T33反向引物
<400> 102
gccatggatc ggtaccttgg cagcctaccc actctggt 38
<210> 103
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T34正向引物
<400> 103
aggcaaacaa ggtacctgaa atcaatactg ttggctgg 38
<210> 104
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T34反向引物
<400> 104
gccatggatc ggtaccggtg ttccatatag atgatcag 38
<210> 105
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PinII正向引物
<400> 105
aggcaaacaa ggtacccctc ggtgacgtgg ggcaac 36
<210> 106
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pin II反向引物
<400> 106
gccatggatc ggtaccgcaa aacacaccta gactag 36
<210> 107
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RTPCR的GUS正向引物
<400> 107
atggtccgtc ctgtagaaac ccca 24
<210> 108
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于RT-PCR的GUS反向引物
<400> 108
tcattgtttg cctccctgct gcgg 24
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GUS iF引物
<400> 109
caccgcgtct ttgatcgcgt 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增子B的DsRed iR引物
<400> 110
atgtcccagg cgaagggcag 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增子C的DsRed iR引物
<400> 111
ggaagttcac gccgatgaac 20
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增子D的DsRed iR引物
<400> 112
ggaacaggtg gtggcggccc t 21
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增子E的PinII引物
<400> 113
acacacaact ttgatgccca c 21
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GUS探针
<400> 114
aacgtgctga tggtgcacga cca 23
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于GUS qRTPCR的正向引物
<400> 115
cttacgtggc aaaggattcg a 21
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于GUS qRTPCR的反向引物
<400> 116
gccccaatcc agtccattaa 20
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DsRed探针
<400> 117
cggcgtgaac ttcccctccg a 21
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物DsRed qRTPCR
<400> 118
aggacggctc cttcatctac 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物DsRed qRTPCR
<400> 119
gtcttcttct gcattacggg 20
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MOPAT探针
<400> 120
accgtgaact tccgcaccga gc 22
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物MOPAT qRTPCR
<400> 121
cgtgaaccac tacatcgaga c 21
<210> 122
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物MOPAT qRTPCR
<400> 122
gtcgatccac tcctgcgg 18
<210> 123
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gr5探针序列
<400> 123
ttgaagtcac aaagcca 17
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物Gr5 qRTPCR
<400> 124
ggcagtttgg ttgatgctca t 21
<210> 125
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物Gr5 qRTPCR
<400> 125
tgctgtatat ctttgctttg aaccat 26
<210> 126
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于polyA作图的引物
<400> 126
gcgacacgac ggcacggttt tttttttttt ttttttttt 39
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于polyA作图的引物
<400> 127
caccgcgtct ttgatcgcgt 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于polyA作图的引物
<400> 128
gcgacacgac ggcacggttt 20
<210> 129
<211> 313
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 129
taaacttgaa gtctgttaaa tttgatgaca cctctcggta ccaatcgaag aaatctagtg 60
aatttccggg atttttagat atctgattct gttgcgaagt ttttttatcc ttattagtgt 120
ctgttgagtg tagattgctt ggcgagtagc ccacaataaa gaaataaaaa tggcgaatct 180
ttagctttat ttactctgtt tttcatcgaa acagattcag taatatatac tctgtttttt 240
catcttacat ttgtttgcaa aaccgatatt atcaacttct cagtaacaca attcgttcct 300
gaaagagtgc aaa 313
<210> 130
<211> 296
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 130
ttatggagat tttaagtatc ttttgatgat agtttacaca ctttgaataa gctgattcta 60
ctttatttct ctctgtttgt ttactgcttc agtgttttaa gtcttctctt tgtgtttgtt 120
gctgttgtgt ctttgatgga tttttgtgat ccgatttaat aaaagaagtg tgttcaaagt 180
aattctctag tctctttatt tgaaattccg gggatagcag attggtttcc gcaacattga 240
ctccaagttt ataatgatct tgatgatggt ctaaaagttt tgaataagct gactct 296
<210> 131
<211> 314
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 131
gagatgaaga aattgctctt atggttctga aaacttctaa tatgtcgagt tgttctgagt 60
tttaagattt tccaaaatgt ctttgtcttt ttttttatat ctttagagtt acttgaacat 120
tgtgactact tctagggttg ggtttgtgtc aggtctgtta tatcgtgtgg tgggtctgtc 180
taatactgat tcaagttttt gttattcagc taaggaactt ttcttgtttc tgaacaaatc 240
ttttggttcc ctagagtaaa acttgacttc caaaagatag acttcctaag atcactggaa 300
tagataggag tgac 314
<210> 132
<211> 346
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 132
aactgagatg gaagaagaag ttgcaatagt ttttttaaac tagtttcttt ctacgtactc 60
tgttttttct ctgcttggtt catggtttga gtgggcaact actgatcttt cccattttcc 120
tgccggattt gtagaagaat aaaaaggttg aaaatgatca tcttgagatg gtgatgaaac 180
tcttaagatc ctcctcttct gcttctcttt ttatttgccg tgtcataatg aaaattgcat 240
attcagatgg gcctgtgtgt tgagtaagtg gacctgtgtc cagagagttg attgagatgg 300
gcttcatttt aggcccacat gtttatcgat caggttcatt ctcttc 346
<210> 133
<211> 333
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 133
tgcggtatac ttggcatttg gttttgctgt accctttcga aatctttatg tcgttgttta 60
gtttgttgta ttcgactatc ttcttagact ttgctgaaat tctcaagaga tttttttact 120
caaacatcag tccacttgtg attggcattt atatttcaaa ctattgcctt agttacatct 180
tcaatagtcc acttatgaac gatctttagt aaattctctt attcactcgc ttactaagaa 240
ttaaacctaa agagaataca gaagaattcc ctagagtaag gatttggtgt agtgtaaaac 300
agactcttcc ctctttgtat tgttcagatt ctg 333
<210> 134
<211> 219
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 134
gttggtttca tcttattttc tgcgattttt gtacttgctg gatttggaat ccatttgttt 60
tagctctctc gtataagatt gtctcatctt tgcttgttaa ctctatattt tgaatcatca 120
agatatggtt ttgctgttaa tcattgacct tcgatatttt tttgccaatc cgttctctct 180
accaacctaa gaaaaaatca ctaatatctc acattagag 219
<210> 135
<211> 243
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 135
taacatcaaa gagcaggaag tttttaacaa ggaatctggt cgagacatcc atgttctgga 60
ccagacagtt ttttggttta gccttaaaat tccaaggttg tataagaaga acacactgtt 120
tgttattctt tgcggttggt aaccaatata gtaatatcag tatttcgtct caatctctct 180
tgttcttata ataatagaat gagaaatcga aatggaattt tcatgtgaag tggattagta 240
aca 243
<210> 136
<211> 244
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 136
atacttttaa taacactttc aatttggttt ctttttcgca cttgtgcttc ttctccgctt 60
tcatcttagt tatggactgt tcctaagctt gccatgaata aaactgtgaa taataaagct 120
tttaatgttc tgtttcttac tttaagtcag acaataaact tttaacactt gtgatcatga 180
atccttggcc ttcagtgtat gattgatgct cttaacactt ctggtgttgt agaggaacat 240
tttt 244
<210> 137
<211> 277
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 137
tgtgaaacca atctggatat ccctgaaatt tgaataaggt tatgttgtga gtttatgaag 60
ttgtggtcta gtgttgtatt ttgtttttct taaggataat gcatctgtgt gctttgctta 120
tctaaaatct aaataaagtg ggtttctgca ttgtgacttt gcacaaactt cttttgttaa 180
aatgaataag aaatcacatc aagaaaacag aacaagacca caacgagaag acttgaaact 240
ctctgaaggt atataaacaa acagaaccta gtaaatt 277
<210> 138
<211> 319
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 138
aaaagaaatg tctttaggtg acagtaagac catggaggag ttttcagctt taaattttgc 60
ttttgtaatt cagattccgg aatccttcat aatctctatc tgagtttagt tttgttgttg 120
aatcaaacat ccgatttaaa gttatgttca ttccatcttc tctccccttt tcgagcatgc 180
gagaatatga ttccccctat tgaacaaatc aatcaacctt taagcgataa caaattggtg 240
ttgtgaaaat tattaacttc ttgatctcgt tttgtcagat ctaaaattac tatagccaag 300
ctacctttca cgtcaagtt 319
<210> 139
<211> 293
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 139
tcactcaagt caaattgtct tggtcgtctc tttatatatt tttgtatctt cttattaaaa 60
aggtaaattt gacttttaat ataatggtgt gcttattgtg atttgtcatt atgtttgtac 120
ctatctcttt tgtgagttgt gtgatagata tactttgtat tttttcttaa aagtcaatat 180
aaatttctgt ttgcgagaga aaaatcgaat ctttgaatag tgaactttgt ggcgataaac 240
taatataatg attaatgaag agaatgttgc gatataggac actttcatat aat 293
<210> 140
<211> 352
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 140
agagatagat tgattgatgg acttgtgatg agtgaataaa acagggagta gcattactca 60
ttcctccctt gtgagacact ttggaatcaa atcttacgtt gctgctactc tctttgagtc 120
ttttcttttg tttttgttac ttgacacagt ttttttttgt ttccggtttg ttgacattta 180
gtttctcaat ctaaactcca gagacttatt ttcgctctct tttgatcaga attaggtata 240
tctttattcg gataatcctt cccatccaaa ctgaaattgt tagtaccaac atttttttta 300
tcagaacata tctcgagtac tgtgttgatt ggattcacat atcttatgtt tc 352
<210> 141
<211> 243
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 141
ttctcaaagc tttgacatgt aaagataaat aaatactttc tgcttgatgc agtctcatga 60
gttttgtaca aatcatgtga acatataaat gcgctttata agtaaatgag tgtcttgttc 120
aatgaatcat atgaaagaat ttgtatgact cagaaaattg gacaatgata tagaccttcc 180
aaattttgca ccctctaatg tgagatatta gtgatttttt cttaggttgg tagagagaac 240
gga 243
<210> 142
<211> 286
<212> DNA
<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）
<400> 142
tagcactcat ggaagtcaag aagctctttg agatgaggat gacagggtgg tttaaaaaag 60
tatcgctttt tcatttttgt tgttgttttc cgttttcatt tgtgatctct tagttccgta 120
caaaacgaat tgtgaggtta attcaacttc tattttaact gatagccgag aaagcttgtc 180
tagttattta caaatgtttt atcaattgtg ataatgttac taatccactt cacatgaaaa 240
ttccatttcg atttctcatt ctattattat aagaacaaga gagatt 286
<210> 143
<211> 402
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 143
gcattgtttt gatgctgcta cctataaaag tatgagcttc agatgagaat ttagagagct 60
cccctgaggc aatgggttat gactttgtta tcatcttagt actactccta tctaagggac 120
ggtgtaaggc tgtaatctat gtgcggtgca atgataaggc tatcctttct gcgtttgatc 180
atgacatctc atcgctgttc gattctttct cgctggcgtc tgttatgttg aatgatgcaa 240
ttcttctgta agattccgcc tttaccgaaa tatctctagt atcaaattta aattggagta 300
cggatcctct ttgaacatac ggatctattt gagataattt tgtctgatca tcaacgagaa 360
ctcggaagcg tgccaacctt gtgggtcaat tgtaacgata aa 402
<210> 144
<211> 482
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 144
aggcagcagc agtatccaac tagtcatgta tccagcctaa attgaaaagt cagatcatgt 60
gtaacatggc cctcaatatt tcgatgttgc cttgtggaaa aaatagctgg tattggtact 120
gtgtttttta ctccttccag ctaccgacgt tcagtgttag tgcacaaaat gttcatccat 180
ggtagtttgt ctacattgca gtcatgtaaa gttaaacatt cacgatttct gtacttttgc 240
atgtgtaact aaatgaaatg gtgtgttaca ttcattcctt caatcaaata atccatagaa 300
acaaactggt ttgtaactat tgtaactagt cgctagtgtc catggtattt tcgattgtgg 360
aacataatta gtttaatctg cttcagtata acttaagccg gctttatcct gtgtatgcat 420
cagcttcgct ccattgaaca tccaaacatc agtataagca ttttgtggcg actaatcatc 480
cg 482
<210> 145
<211> 396
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 145
gagtgaggtc taggttctgt tgtctgtctg tccatcatcc atgtgttgac tgttgaggga 60
actcgtttct tcttttcttc acgagatgag tttttgtgtg cctgtaatac tagtttgtag 120
caaaggctgc gttacataag gtgatgagaa ttgaggtaaa atgagatctg tacactaaat 180
tcattcagac tgttttggca taaagaataa tttggccttc tgcgatttca gaagctataa 240
attgccatct cactaaattc tccttggtcc tcatggcaat gcaacgacag tgtgaagcac 300
tgaagcccgt aatgctctat caccaccatg tacaacagaa ccatatatgt ccatatgtac 360
aactcgagtg ttgtttgagt ggccagcaaa ctggct 396
<210> 146
<211> 415
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 146
ggtgacggcg acgcgatcga acaggtggtg atcgatgctg caacgtgtgt aaatatacag 60
cgccggctgg gtcaagagat ggctcgggtg acgcgcgcgc ggcgtgtcct ggcgttggcg 120
ccggggcatt ctttagtttt tcatcttttc atcatctcag atggtagata caaaacagtg 180
tatgtatgta gctctgtttc tctctataga accccaacaa attttgttgt tgatgttgtt 240
tatcttcata tgctttgatc ttgaaatcgt ctaccttact actgccgatc gttgctcaaa 300
agtgtggaag tttgaagcat cttccacggg cgttgctcta ctcccatctc gtttcaccac 360
gaaatcccct tcgcatagag gcatctcagc cgtacatctc caaacccacg ttctg 415
<210> 147
<211> 290
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 147
ccgtggcaat ggctgtcatg ctttggcaca tactaatagc aaggtagaat ggtacagcta 60
tttcattatt tttgcccttg tatatttgta tcactacatg agtaaacgac gtttagttat 120
cgatagtttt gttatgagtg atgaatgatc tgcatcgtac tgccaatgcc ttgcattctc 180
aaatggttgc acacttgcac tcatacaaag ttagtacact ccatcatatt ataaattact 240
tttttttcaa gttaaatttc ctgaaagttt gataaaattt atagaaaaaa 290
<210> 148
<211> 443
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 148
acaccacctg ctgtctgcgc ttgtttgttg ccacggctgc gctacaaaca caagccgtat 60
catctgccga acagctccat cgttagcttc ttttgatgcc ttacatctat cgctggacgt 120
ttatcgtgcg tacttgtccc atacagggat tgtgtttgga tgatttgtag agagggtact 180
gtatggcata agatccttca tattaatgtt ctgtgggtca catatcaact tgctattatt 240
gtattcagcg gttctctctc tattttgcct taagctgtgg taccatttta agtccagtgc 300
ttgcttttga ttgcttttct gagctttcca ggacatggaa tcgagcctgt gaatgtcgtc 360
ggccggttta tcctttcgac taataattta aattgtccag tgttggttag gaatggagta 420
tcagattctg gcggtttgca tgc 443
<210> 149
<211> 405
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 149
gctgaaattt ggttatctgt tatgagcata tctgatttcg atacccactg ttatgaaact 60
gaataaaccg cattcctgta tgctgggaat tttctcgtta gtgtacgctc caatactcgt 120
gccgttttca aagacaagca gtgatatgca aagcaatgct gtgtatcttg tgtgttacat 180
caggagtttt ttttaatggt gatttcgttc atagttttca gacatctgtt tccgtcacac 240
gttcgtggga atgacttttt tcatatgaaa tgcgcccatg gctgcgcctg aaataatttt 300
acttgtcccg tttgggatga atgaattctt ttcctgttcg ttgttcagta attcacacag 360
agtcataaac ataccggtgg aaacatgctc acaaagaaag aaaca 405
<210> 150
<211> 431
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 150
agtgttactt attgttgcta ctatccatat tcgctaccat gcttatcatc gctagattaa 60
aggacatgta ttccagtatg gtcgtgcttt ttgcttggta ctctggtcac atttgtgatg 120
aatgttcgca gttttcgtgg tcatggtctg gattctacat tccacctaaa gaagttttta 180
cctggttatt taatccttga gttgttgaat tagctcatgg taattgtcag tagtcttcca 240
cttggttctc tctgtggatg atcgttcttg ttctctgttt gcgctgtggc tgattgttct 300
catgttttta aggtttttgg gttagtcact ggtcgcttcg tcactgtgag ccaaaccata 360
tgccggtagt tttcttcttc accatcatcc gtttgatcct gactcgcgga tctcctaatc 420
caacttctct c 431
<210> 151
<211> 423
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 151
ttggcagcct acccactctg gtaggaaaaa tggaaggggc aagaagatac agtcgatgat 60
atttgatgtg ctacatacca attgtaatat ttcattcata tctagagcta gaaggatatt 120
cacttgtatt tcagactctg gttcacggtt taaattgata ttgtggtaga atgctttctt 180
ggatgggtat atagtgtgac tcgttaaaaa tatgacaaaa cggttcagct actctttaca 240
agtggtacgg caaattgtag acccaattgc acttggcggt gagctgcttt gttggagcaa 300
cagggcactg tctgcttgcg tggatgaaaa gctgagtcat ctgaagctag tgaacatttt 360
ttcgctggct cgctgcgtgt gttttttctc tgattgtggc ccggttgatt atgaaaatga 420
cca 423
<210> 152
<211> 349
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 152
ggtgttccat atagatgatc agatttctat aaccacatga gtacaatgta gagaattcaa 60
atgttttgta accacgtgag ctttgtacgc tatttgcacc acagttctcc ctgtatgttg 120
ttggctcttt tacaattaag aataatgcat gttgaagtat gagtcttcct gtttgcttct 180
ccttgatgat gaaacgctgc tgcatcaact gattattttt cagagaataa acgataaaca 240
aagcacggtg aagtatcgtg taacccacca taagtggtag agccgtagag gtaggactgt 300
gcatgctgaa ttgtaattac catggttagt tcagcagaat ttgcaaaaa 349
<210> 153
<211> 380
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 153
aagaaaggaa aatgagtcct gcggattctc ccttggtatg taaatatgat ggatgtgtag 60
ataaataaaa tccagtttgt tgttgtgttt cctgctgtgt gaggcgttaa gagaacttct 120
ggcgtgcttt gatttggagc agttaccatg actgttggac tggtttttgt atgtattgat 180
ggacaaagct agtaagcatt aatctatgag ctgcagttgt tttccttgat caatgattat 240
atatcagctg ctgttgtatt ggttatagtg gattctgact ttctgatacc atttcagtct 300
tcaccaaaac agcaggctca actacacttc tcctgccatt tcatcatcag aggaaaaagg 360
gggaactata ttctccctgc 380
<210> 154
<211> 343
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 154
gcttcactcc agttccctat cttggaaact tttgcatccg tgcaaatgta atctctgctc 60
tcgtgttagc ttgtacggag tagtgttctg attatggcaa agacgttgat gtaagcactc 120
ggcacctctt tatcgatgtg gattttttcc cggttggtat ttgaccagat gttcttgttc 180
aagaatatgc tacgttacat tgtaattact gtgccatgat gctctagctt ctcagtgagt 240
ggtcgaatcc ttccccaact tcttactaat atgcgaaatt tgcattccat ctcacagcat 300
cacgtctcta ctcttcagtt ggtagaaagc attgccctat ctc 343
<210> 155
<211> 380
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 155
aatgctgcta tccaacaggt ggagaaattc ggtgaacagg gtagggtatt tcagaaagtt 60
tttagcatga gaacactggt ggaacagagt ttttgttcat ctataggctc tcggcggtta 120
attccgacca tctgttatct aagctatcat aaatcttgtg actcatgtct gttccaacat 180
atgctataaa tgaatgactc gctaaagatc tacaagattt tggtgccatt tccttaccaa 240
ttcctttgtg tcgttgcagt atgctgtagt gtatcggcgt tgctgttccc agactcgagt 300
gttgttgtgt tctgtcttct gttgcttggg cttgttatgt atgattgagt ttatagtatt 360
ctctctcgtg tggcttggtc 380
<210> 156
<211> 466
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 156
tgacatctta tagtctgcaa cctctcgtgt ctgaattcct atctttatca agtgttattg 60
cttccacgac tataggacag ctttcgtcga aagcttttgc tcatgtgatc tcgaaggatt 120
catctagtct gatttttcgt gacttgtatc ggttttattg gattcatcca acatatatca 180
ataaaaaatg agttgtgttt cctttcttcc tagttcagtt aaaattattt ccctcctgcg 240
cttgtgctgt aattgtctgt gtacctgttg tttgtgactg tgttagttcc cttggatatg 300
atttcgtatt tgatatgtac atggagatag cttagcttca ttattggagt atgaagttag 360
tatgacatag tcactctcct ggaaaattga cactgcaaac catattttta ttctgaacca 420
caaatcctag tcagtccgct ggcatatgcc gtccgtttgc tgaatc 466
<210> 157
<211> 482
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 157
atgaaccagc gtaagtactc aactgctgag atcgcatcct tttggagcat catctatctt 60
gtcaagctta tttgcaaata gctaagccgt ctctctatgt gtggtctgta atattaaccg 120
tgcgtaaacc agtggcaaga agtccctgtc cgtgtcatgg ttatcgagtc tgtctactta 180
ataacgtgtg ataccaggca ttgtgcctgt attttaacag taaaaattgg gtacgttgtt 240
tgtgtttgta tatatattgg agttggttta cctcagctgg atggagtacc ctacattcgc 300
attgtactgc ctacgtttta tattacaagt cattttaact tttttttgaa gttaaacttt 360
tatatgttta atcaagttta tagaaaaaca tagtaatata tttaacacaa aacaaaaaaa 420
aatcaaaata tgtttaatgt tagatgtaat gaaattaatt tagtgttata agcgtcgtta 480
ta 482
<210> 158
<211> 384
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 158
tacttgtagc aatacaaaat tacagtagca ttgtacacta ctgccgtgcc agctccatgc 60
atagtcagca gctggccact ctctagctat atctagatgc gagagaattt taaggatgta 120
aatcatgcct tcacatgaat aaatcgttcg tccgtgcgtt gtgtattcat gtaaattttg 180
acggatggtc aagtaaaaat aacaatggca aattaattta gggaagaatc aaatatgttt 240
gcgttccttt tctgagccgt ggatgttgtt aatcagttct accaatcgct atttgtaaaa 300
agtttcttaa agaaatttcc ttcttgacat caatcaaagt actatatata aatcttcagg 360
ataaggcacg tcgccgacca aaca 384
<210> 159
<211> 445
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 159
tttgtctctc ggccattgtg tatttttcct ctcaagttgt atatgttcgc cccggaggaa 60
aagttttgtt tcttctttcg ctgcctcttt tgtacctgtg gtttccctgg cgtgagagcc 120
agtctgttgc acgcctgatc cctcttttat cgggagaaag gttcaacgtt cgggtgctag 180
atacaaaatg ggttcctaga gcccttcttg gtcgtttata tttagtgtac tattagtgat 240
aattggtgta aattagtttt ccccagtttc ctttttagaa ctcatgtaga ctttcttgca 300
tctgatgtta gtaaaatttt gctctaggtg tgctggctat tcttatcctt agcctgactt 360
catgatgttt ctttctttgt gagcatgttt ccaccggtat gtttatgact ctgtgtgaat 420
tactgaacaa cgaacaggaa aagaa 445
<210> 160
<211> 371
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 160
aggccaaggc gatctgtgac tatgtgatga acaaacagag cccttccagt ctgatggctc 60
atggctgtgt gaccctgtga atccagcatt gtgtgtgcgc gcgcgcgtca tgaattgtca 120
aaaattatgg ctggaaaacc aagtggtttc tggcaatatg tgttgtaccg cttgtatgta 180
aatgttggta aaaacaaagt aacatcgctt atctctgaat ctctaacgta agtggttgct 240
taacaaaagc tgctttgccc cgctgtaagc ctgctacact agcgtggttt cttacatttt 300
tgcctgctat aaattctgtt caatttcaag gggttccaag ctatgtttcc aacgttgggt 360
gagtttggat t 371
<210> 161
<211> 411
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 161
ttcatttcgt catgcatcat atcaccctaa atatgcatgc gccaataaaa acaagtcttg 60
attttatttt gttcattgct ccatcttcag tcagtgtcca ctggtttgtc tgtcatgcat 120
ggatcatttt tactcttcaa ttcagttctg catttcagtt gagctgttca gctgagtgcc 180
ttgatttgta ccacctatct gccttgttac aaatttatgt caaagtcttc ttgctctggt 240
acagttttac gttttcttct gcaatactag tacgcacagg aagctaagct gacaccttcc 300
aactcttcaa gaaaacgaaa gctgcaacaa gtgtagcacg attcacgacc ccgagcatga 360
gctaggttag gcaaaacaaa caaatcagca gggtcggatg actttactta c 411
<210> 162
<211> 519
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza Sativa）
<400> 162
tgaaatcaat actgttggct ggtgtttgca tagagaaaca atcacaatta cttagtgagt 60
cacatcctaa attctaacta gaacggcaca tgcccgaaat tttgactgca aattgctttg 120
ttggattgtg ttacacggct tcagagcggt tgccaaaagt tcatttagaa gaaaggctgt 180
cagaagttat cctataaatt taaaaatagt gcgcttccaa accaagcgcc tttttcagtt 240
gttcggtaca tcaaatatgt attgtatacc ttggaggctt ggaatataaa tatgggcacg 300
ctagtgctac agccatttgc tactgatgta ccagcaacca ttggtttgta ccttgattaa 360
ttcatgacga tggtctaatt ctgttgtcct ctttttgcaa attctgctga actaaccatg 420
gtaattacaa ttcagcatgc acagtcctac ctctacggct ctaccactta tggtgggtta 480
cacgatactt caccgtgctt tgtttatcgt ttattctct 519

Claims (11)

1.包含分离的多核苷酸的重组构建体，所述分离的多核苷酸包含：
(a)如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的核苷酸序列；或
(b)与如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、129-161或162所示的序列具有至少95％的序列同一性的核苷酸序列；或
(c)(a)或(b)的功能性片段；
其中所述分离的多核苷酸在植物细胞中作为转录终止子起作用。
2.根据权利要求1所述的重组构建体，其中所述分离的多核苷酸作为双向转录终止子起作用。
3.根据权利要求1所述的重组构建体，其中所述分离的多核苷酸可操作地连接至异源多核苷酸的3′端，所述异源多核苷酸可操作地连接至启动子。
4.根据权利要求2所述的重组构建体，其中所述双向转录终止子可操作地连接至：
(a)第一异源多核苷酸的3′端，所述第一异源多核苷酸可操作地连接至第一启动子；以及
(b)第二异源多核苷酸的3′端，所述第二异源多核苷酸可操作地连接至第二启动子；
其中所述第一和第二异源多核苷酸以趋同方式转录。
5.植物，所述植物在其基因组中包含权利要求1、2、3或4的重组构建体。
6.来自权利要求5的植物的种子，其中所述种子包含所述重组构建体。
7.根据权利要求5所述的植物，其中所述植物选自：拟南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、芥菜、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
8.根据权利要求6所述的种子，其中所述种子选自：拟南芥、玉米、大豆、向日葵、高梁、卡诺拉、芥菜、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
9.在植物中表达异源多核苷酸的方法，包括以下步骤：
(a)将权利要求3的重组构建体导入到可再生的植物细胞中；
(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含权利要求3的重组构建体；以及
(c)由步骤(b)的转基因植物获得子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含权利要求3的重组构建体并且表现出所述异源多核苷酸的表达。
10.调节两种异源多核苷酸在植物中的表达的方法，包括以下步骤：
(a)将权利要求4的重组构建体导入到可再生的植物细胞中；
(b)由(a)的可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含权利要求4的重组构建体；以及
(c)由步骤(b)的转基因植物获得子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含权利要求4的重组构建体并且表现出所述第一异源多核苷酸和所述第二异源多核苷酸二者的表达。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述植物选自：拟南芥、玉米、大豆、向日葵、高梁、卡诺拉、芥菜、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
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