CN101001951A - 分离转录终止序列的方法 - Google Patents

分离转录终止序列的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101001951A
CN101001951A CNA2005800260493A CN200580026049A CN101001951A CN 101001951 A CN101001951 A CN 101001951A CN A2005800260493 A CNA2005800260493 A CN A2005800260493A CN 200580026049 A CN200580026049 A CN 200580026049A CN 101001951 A CN101001951 A CN 101001951A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
dna
gene
screening
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2005800260493A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101001951B (zh
Inventor
H-S·宋
M·科克
J·A·布朗
L·P·洛亚尔
L·邢
H·贾
J·麦克米伦
L·伊雷兰德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF Plant Science GmbH
Original Assignee
BASF Plant Science GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF Plant Science GmbH filed Critical BASF Plant Science GmbH
Publication of CN101001951A publication Critical patent/CN101001951A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101001951B publication Critical patent/CN101001951B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1051—Gene trapping, e.g. exon-, intron-, IRES-, signal sequence-trap cloning, trap vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及用于鉴定和分离转录终止序列的有效的高通量方法、系统和DNA构建体。本发明还涉及通过所述方法从稻中鉴定和分离的特定终止序列。

Description

分离转录终止序列的方法
技术领域
本发明涉及用于鉴定和分离转录终止序列的有效的高通量方法、系统和DNA构建体。
背景技术
植物生物技术的目标是产生具有有利的新特性(如害虫和疾病抗性、对环境胁迫(如涝、干旱、热、冷、光强、日长、化学品等等)的抗性、改进的品质(如高果实产量、延长的贮藏寿命、统一的果实形状和颜色、较高的含糖量、较高的维生素C和A含量、较低的酸度等))的植物或产生某些化学品或药物(Dunwell 2000)。此外也可以提高对非生物胁迫(干旱、盐)和/或生物胁迫(昆虫、真菌、线虫感染)的抗性。可以通过开发具有所需表型的遗传改造植物实现作物产量的提高和产量的稳定性。
对生物技术的所有领域而言，除了启动子序列以外，转录终止序列也是重组表达特定基因的基本先决条件。在动物系统中已经良好的定义了转录终止结构(Zhao等，1999；Proudfoot，1986；Kim等，2003；Yonaha和Proudfoot，2000；Cramer等，2001；Kuerstem和Goodwin，2003)。防止与性状无关的(下游)序列的不需要的转录需要RNA转录的有效终止，所述无关序列可以干扰性状性能(更多细节见下文)。特别是与独立的插入相比，多个基因表达盒局部接近的排列(如在一个T-DNA内)经常导致抑制所述构建体中一个或多个基因的基因表达(Padidam和Cao，2001)。这尤其是在需要所有盒的强基因表达的情况下会引起问题。
以前需要通过单个转录终止序列的体外或体内转录分析来分析转录终止的效率，这是基于反复试验的艰巨而耗时的方法(Yonaha和Proudfoot，1999，2000；Yarnell和Roberts，1999)。为了简化此方法，已经将单核苷酸识别探针(如信标)用于体外转录(Liu等，2002)。
在植物中，对转录终止和再起始的了解还处于初期阶段。还不存在明确定义的多腺苷酸化信号序列。Hasegawa等(2003)不能鉴定美花烟草(Nicotiana sylvestris)中在体外和体内系统中都保守的多腺苷酸化信号序列并测定初级(非多腺苷酸化的)转录物的实际长度。存在这种模糊的想法：弱终止子能产生连读，其影响位于临近表达盒的基因的表达(Padidam和Cao，2001)。对转录终止的适当控制可阻止连读至位于下游的序列(如其他表达盒)并使RNA聚合酶II更有效的循环，这将提高基因表达。通过生物信息学预测功能性的有效转录终止序列不是可行的备选方法，因为事实上不存在可进行这种预测的保守序列。预测这些序列在转录终止中的效率甚至更为遥远。此外，通过实验测定初级转录物的实际长度和序列是很困难的，因为这些结构高度不稳定，迅速转化成多腺苷酸化的转录物(Hasegawa等，2003)。
产生遗传修饰的细胞和生物(如植物)需要适当的重组DNA以引入目的基因。重组DNA通常含有一个以上的表达盒。表达盒由启动子、目的基因和终止子组成。来自临近盒的不适当的转录终止可以不利地影响表达盒中目的基因的表达。转录连读和/或多次使用相同的转录终止序列可能具有一个或多个以下缺点：
1.下游序列的不需要的表达可以引起不希望的效应(如代谢谱的变化、基因沉默等)。
2.下游序列的不需要的表达引起对去调节程序的较高障碍。
3.多次使用相同的转录终止序列可通过后生沉默导致整个转基因表达方法的失败。由于目前一组评估的转录终止序列的非常有限，因此在一种转基因生物中多次使用同一转录终止序列经常是不可避免的，已经证明这会引起整个转基因表达构建体的非故意沉默(Matzke 1994；Matzke 1989)。
4.实现包含多个基因表达盒的构建体而没有不希望的不同盒的转录相互作用。这些相互作用可以(取决于盒的方向)包括非故意的表达(如表达盒具有相同方向的读框的情况)或非故意的基因沉默(如盒的倒置方向的情况)。
因此，仍然存在尚未解决的对于严紧和备选的转录终止序列的需求(特别是在植物生物技术领域)。没有可用于鉴定有效终止转录的“严紧”终止子的简单可靠的筛选系统。因此本发明的目的是提供容易地鉴定这些终止序列和提供用于植物的严紧和备选的转录终止序列的方法。通过本发明可实现此目标。
发明内容
因此，本发明的第一个实施方案涉及用于鉴定和分离转录终止序列的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其包含：
a)启动子序列，和
b)用于插入DNA序列的一个或多个插入位点，优选限制性或重组位点，和
c)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下的表达导致易于检测的特征，
其中与无插入相比，将有效的转录终止子插入所述插入位点改变了所述附加序列通过所述启动子序列的表达，和
ii)提供待评估其转录终止能力的一种或多种DNA序列，和
iii)将所述DNA序列的一个或多个拷贝插入所述筛选构建体或筛选载体的所述插入位点，和
iv)将带有所述插入DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适于诱导从所述启动子序列表达的体外或体内转录系统，和
v)鉴定和/或选择与无插入相比具有改变的易于检测特征的筛选构建体或筛选载体，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入的DNA序列用作转录终止序列，并任选地测定其序列。
所述插入位点相对于所述附加序列的定位有多种选择。例如，插入位点可以优选在选自以下位置的位置：
i)附加序列上游，在所述启动子和所述附加序列之间，和
ii)附加序列下游，和
iii)在所述附加序列之间。
取决于插入位点与所述附加序列的定位，产生了若干特别优选的实施方案。在一个优选的实施方案中，用于鉴定和分离转录终止序列的方法包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其在5’到3’方向上包含：
a)启动子序列，和
b)用于插入DNA序列的一个或多个插入位点，优选限制性或重组位点，和
c)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下的表达导致易于检测的特征，
其中与无插入相比，将有效的转录终止子插入所述插入位点抑制了所述附加序列通过所述启动子序列的表达，和
ii)提供待评估其转录终止能力的一种或多种DNA序列，和
iii)将所述DNA序列的一个或多个拷贝插入所述筛选构建体或筛选载体的所述插入位点，和
iv)将带有所述插入DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适于诱导从所述启动子序列表达的体外或体内转录系统，和
v)鉴定和/或选择与无插入相比具有改变的易于检测特征的筛选构建体或筛选载体，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入的DNA序列用作转录终止序列，并任选地测定它们的序列。
可以将一个或多个待评估其转录终止效率的序列插入筛选载体或筛选构建体。对于两个或更多拷贝的情况，在优选的实施方案中，将待评估其转录终止效率的所述DNA序列以反向重复的形式插入所述插入位点。因此，用于鉴定和分离转录终止序列的方法优选包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其在5’到3’方向上包含：
a)启动子序列，和
b)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下的表达导致易于检测的特征，和
c)用于插入DNA序列的一个或多个插入位点-优选限制性或重组位点，
ii)提供待评估其转录终止能力的一个或多个DNA序列，和
iii)以反向重复的形式将所述DNA序列至少两个拷贝的特定DNA序列插入所述筛选构建体或筛选载体的所述插入位点，其中与无插入相比，将有效的转录终止子的反向重复插入所述插入位点允许所述附加序列通过所述启动子序列的表达，和
iv)将带有所述插入DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适于诱导从所述启动子序列表达的体外或体内转录系统，和
v)鉴定和/或选择筛选与无插入相比具有所述易于检测特征的构建体或筛选载体，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入的DNA序列用作转录终止序列，并任选地测定其序列。
在本发明的另一优选实施方案中，用于鉴定和分离转录终止序列的方法包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其在5’到3’方向上包含：
a)启动子序列，和
b)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下的表达导致易于检测的特征，并在所述附加序列中嵌入用于插入DNA序列的一个或多个插入位点-优选限制性或重组位点，
其中与无插入相比，将有效的转录终止子插入所述插入位点可抑制所述附加序列通过所述启动子序列的全长转录，和
ii)提供待评估其转录终止能力的一个或多个DNA序列，和
iii)将所述DNA序列的一个或多个拷贝插入所述筛选构建体或筛选载体的所述插入位点，和
iv)将带有所述插入DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适诱导从所述启动子序列表达的体外或体内转录系统，和
v)鉴定和/或选择筛选与无插入相比具有所述易于检测特征的构建体或筛选载体，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入DNA序列用作转录终止序列，并任选测定其序列。
优选地，附加序列选自正选择标记、负选择标记、反选择标记、报道基因和毒性基因。对于毒性基因的情况，其中所述毒性基因可以是例如用于必需内源基因的基因沉默的构建体。
优选地，通过选自以下的方法提供待评估其转录终止效率的DNA序列：
i)通过从宿主基因组的扩增提供选择序列，和
ii)通过断裂宿主基因组提供序列文库。
更优选地，待评估其转录终止效率的DNA序列来自植物细胞。
有多种方法可用于将所述序列插入所述插入位点。优选地，通过选自以下的方法将待评估其转录终止效率的DNA序列插入所述插入位点：
i)重组克隆，和
ii)通过序列特异性限制和连接插入。
附图简述
图1-AA1：优选方法A的图解：用于待评估的转录终止子(TT)的插入位点(IS)位于启动子(P1)和附加序列(AS)之间，所述附加序列能引起易于检测的特征。对于有效转录终止子(+)的情况，从启动子P1的转录在所述转录终止子处停止(以构建体下方的箭头表示)。附加序列不发生表达，不引起特征的变化(以划线圆(crossed circle)表示)。对于无有效转录终止(-)的情况，从启动子P1的转录连读所述的所谓转录终止子，引起附加序列(以构建体下方的箭头表示)的表达，从而引起特征的变化(以闪电符号表示)。
A2：基于作为附加序列的终止子的优选方法A的图解。用于待评估的转录终止子(TT)的插入位点(IS)位于启动子(P1)和附加序列(AS)之间，所述附加序列在该情况下由已知转录终止子(T)的反向重复组成。启动子下游的所述终止子的第二个拷贝(以颠倒字母标出)在其功能性方向。对于有效转录终止子(+)的情况，从启动子P1的转录在所述转录终止子处停止(以构建体下方的箭头标出)，发生标记蛋白(M1)的正常表达(以黑色闪电符号标出)。对于无有效转录终止(-)的情况，从启动子P1的转录连读所述的所谓转录终止子，引起已知转录终止子反向重复的表达，导致标记M1表达的基因沉默(GS)(以划线圆标出)。优选地，该构建体包含引起标记M2表达的其他表达盒，标记M2发挥筛选构建体的一般性存在的阳性对照的功能，引起优选不同的第二种表型(以白色闪电符号标出)。
图1-B A3：基于作为附加序列的终止子的优选方法A的图解。用于待评估的转录终止子(TT)的插入位点(IS)位于不同标记基因的两个表达盒之间，所述标记基因的方向彼此头对头。通过已知转录终止子终止标记M2的盒。对于通过插入的测试终止子有效终止转录(+)的情况，从启动子P1的转录在所述转录终止子处停止(以构建体下方的箭头标出)，发生标记蛋白(M1)和(M2)的正常表达(以黑色和白色闪电符号标出)。对于无有效转录终止(-)的情况，从启动子P1的转录连读所述的所谓转录终止子，引起表达与从启动子P2所表达的RNA链互补的RNA链，从而导致第一种标记基因(M1)的转录物与来自第二种标记基因(M2)的组成型表达的转录物杂交。这导致标记基因M1和M2的基因都沉默(GS)(以划线圆标出)。
A4：基于作为附加序列的终止子的优选方法A的图解。用于待评估的转录终止子(TT)的插入位点(IS)位于启动子(P1)和附加序列之间，在这种情况下所述附加序列由非转录DNA序列(优选已知转录终止子的片段或全长序列)组成。第二个表达盒方向与第一个盒头对头，并且携带所述DNA序列、终止子或终止子片段的第二个拷贝。对于通过插入的测试终止子有效终止转录(+)的情况，从启动子P1的转录在所述转录终止子处停止(以构建体下方的箭头标出)，标记蛋白(M1)正常表达(以黑色闪电符号标出)。对于无有效转录终止(-)的情况，从启动子P1的转录连读所述的所谓转录终止子，引起已知转录终止子或转录终止子片段的表达，导致第一个标记基因(M1)的转录物与带有相同3’UTR序列的来自第二个标记基因(M2)的组成型表达转录物杂交，从而导致对标记基因M1和M2表达的剂量依赖性抑制(以划线圆标出)。优选地，构建体包含第二种标记基因(M2)。由于两种标记基因表达抑制的效果取决于两类转录物之间的杂交程度，因此可以筛选中间表型，这使得可以例如通过使用不同的筛选条件来选择“弱”候选终止子序列或“严紧”候选终止子序列。
图2：B1：优选方法B的图解：用于待评估的转录终止子(TT)的插入位点(IS)在附加序列(AS)下游，所述附加序列能引起易于检测的特征。以反向重复的形式插入待评估的转录终止子(TT)，其中启动子下游的第一个拷贝(以颠倒字母标出)在其功能性方向。对于有效转录终止子(+)的情况，从启动子P1的转录在转录终止子的第一个拷贝处停止(以构建体下方的箭头标出)，附加序列(AS)正常表达(以黑色闪电符号标出)。对于无有效转录终止(-)的情况，从启动子P1的转录连读所述的所谓转录终止子的两个拷贝，引起所述转录终止子反向重复的表达，导致附加序列(AS)表达的基因沉默(GS)(以划线圆标出)。
B2：优选地，构建体包含另一表达盒，其中AS2编码与AS1不同的特征。在无效转录终止子的情况下两种表达均沉默。对于有效终止子的情况，两个特征均表达(分别以黑色和白色闪电符号标出)。
图3优选方法C的图解：用于待评估的转录终止子(TT)的插入位点(IS)位于附加序列(AS)中的内含子(IN)中，所述附加序列能引起易于检测的特征。对于有效转录终止子(+)的情况，从启动子P1的转录在所述转录终止子处停止(以构建体下方的箭头标出)。不发生附加序列的全长表达，不引起特征的变化(以划线圆标出)。对于无有效转录终止(-)的情况，从启动子P1的转录连读所述的所谓转录终止子，引起附加序列的全长表达(以构建体下方的箭头标出)，从而导致特征的变化(以闪电符号标出)。
图4筛选构建体的示意图：
A：Lo523阴性对照构建体：与筛选构建体相应的未插入附加转录终止子序列的二元载体。使用此构建体转化植物细胞时将转录nptII基因。由于此基因下游不存在功能性终止子，转录向前通过nos终止子IR，引起带有发夹结构的转录物，其导致nptII基因表达的沉默。这些细胞不能在含有卡那霉素的选择培养基上生长。可以通过目测组成型表达的GFP标记基因可以区分这些非生长细胞与非转化细胞。
B：筛选构建体B：二元构建体，其含有用于从未转化细胞/植物中选择转化的细胞/植物的组成型表达报道基因的第一个表达盒，其后是含有强组成型启动子驱动的nptII选择标记的第二个表达盒。在nptII基因下游插入了农杆菌nos终止子序列的IR，它由反义方向的第一个重复和其后来自GUS报道基因的短间隔区序列以及以其功能性5’至3’方向插入的nos终止子的第二个重复组成。将待测试转录终止子活性的片段插入nptII基因和所述nos终止子IR之间。
D：Lo546阳性对照构建体C：来自构建体C的二元载体，其中在nptII和nos终止子IR之间插入了rbCs E9终止子序列的长片段。相信E9终止子发挥高效终止子的作用，因此会终止nptII基因的转录，引起表达正常表达水平的选择标记，所述选择标记使转化细胞能在卡那霉素存在下生长。
E：Lo239阴性对照构建体和用于插入候选终止子序列的基本构建体。使用此二元构建体进行转化导致具有组成型表达nptII基因的植物，产生带有确定的3’UTR的转录物。在种子发育时，通过种子特异性启动子启动β-葡糖醛酸糖苷酶标记的表达。得到的GUS转录物带有与nptII转录物相同的确定的3’序列，引起两类转录物之间的杂交，从而导致与两个标记基因相关的表型的损失。种子不能在含有卡那霉素的选择培养基上生长，并且不能在种子中检测到GUS标记。
F：Lo657阳性对照构建体。二元载体来自Lo239，在GUS标记基因和下游序列之间插入了rbCs E9终止子的长片段。通过有效终止在发育种子细胞内产生的GUS转录物，产生的转录物带有与组成型表达的nptII转录物相比不同的3’序列。两个标记盒都无干扰地转录并翻译，得到可在卡那霉素选择下生存并可检测累积的GUS蛋白的幼苗。
图5 pENTR构建体——位置1可见标记(报道基因)：含有组成型启动子控制下的GFP报道基因的Gateway Entry载体A。该载体与GatewayEntry载体B Lo376(SEQ ID NO：76)以及Gateway Entry载体C Lo522a(分别为Lo522b)组合用于基于重组的阳性对照构建体的构建，并与Lo503a(分别为Lo503b)组合用于基于重组的二元阴性对照构建体和筛选构建体的构建。
图6用于阳性对照的pENTR构建体：Gateway Entry载体C含有组成型STPT启动子控制下的nptII选择标记基因。在选择标记的3’在nos终止子IR之前插入了rbCs E9终止子序列的长片段。所述构建体与Gateway Entry载体A Lo484、B Lo376和C Lo522(分别为Lo 522b)组合用于基于重组的二元阳性对照构建体的构建。
图7用于阴性对照的pENTR构建体：Gateway Entry载体C含有组成型STPT启动子控制下的nptII选择标记基因。在选择标记的3’插入了nos终止子IR。这引起nptII基因和nos终止子反向序列片段的转录，所述反向序列片段之后是功能性5’-3’方向的nos终止子序列，它默认引起转录物3’末端的发夹结构。所述构建体与Gateway Entry载体A Lo484、B Lo376和C Lo522(分别为Lo522b)组合用于基于重组的二元阳性对照构建体的构建。
图8 pSUN1构建体——阴性对照：基于重组将来自各个pENTR载体的表达盒插入Gateway Destination载体Lo 442 pSUN1-R4R3 (SEQ IDNO：77)得到的二元载体。
图9 pSUN1构建体——阳性对照：基于重组将来自各个pENTR载体的表达盒插入Gateway Destination载体Lo 442 pSUN1-R4R3(SEQ IDNO：77)得到的二元载体。
图10二元构建体Lo239-pSUN3-GWs-B1-BnAK700∷GUS∷nosT-B2(阴性对照)和Lo657-pSUN3-GWs-B1-BnAK700∷GUS∷E9∷nosT∷B2(阳性对照)代表图4E和F。Lo239来自带有GUS标记盒的pENTR Lo235与带有ntpII盒的pSUN目标载体Lo125 pSUN3-Gws-NPTII的基于Gateway的重组。通过在GUS标记基因下游插入rbCs E9终止子的长片段修饰Lo235后，将得到的Lo654pENTR-BnAK700∷GUS∷E9∷nosT用于与Lo125 pSUN3-GWs-NPTII基于Gateway的重组，以产生阳性对照构建体Lo657-pSUN3-GWs-B1-BnAK700∷GUS∷E9∷nosT∷B2。
图11阴性和阳性对照构建体的筛选结果：将图10所述构建体用于拟南芥植物的花浸没转化。通过卡那霉素选择对收获的种子测试标记基因nptII的表达。来自用阳性对照构建体转化植物的种子在选择培养基上存活，显示表达nptII基因(GUS基因表达未显示，但已通过X-Gluc反应检测)，而阴性对照构建体仅产生不能在卡那霉素上存活的种子，并显示不表达Gus标记基因。
图12用于鉴定目的转录终止子(TOI)的构建体的简图。
(a)用于体外转录测定的构建体。基因1和2优选与植物基因组不同源的序列。
(b-d)用于体内测定的构建体。标为“dsRNA”的区域是产生双链RNA(dsRNA)的序列。这些dsRNA下调植物细胞的必需基因(b)、负选择标记基因(SMG)(c)或报道基因如荧光蛋白(FP)。
(d)在构建体(d)中，TOI下游的DNA可以是另一报道基因或任何序列。
(e)酵母中的筛选系统：该系统允许有效筛选随机序列。对照载体含有NOS终止子、截短的NOS、无终止子或带有未鉴定序列的DNA片段。
图13 A：对照构建体(A-D)和含有潜在终止子候选者的构建体(E)。GUS可被任何报道基因或非植物同源DNA片段(包括ATG和终止密码子)替代。在对照载体中产生了四种变异：(A)260bp胭脂碱合酶终止子(NOS)，包括多腺苷酸化位点、切割序列和切割序列下游的约80bp核苷酸，(B)反向NOS，(C)NOS DNA片段，包括多腺苷酸化信号和切割位点或缺乏多腺苷酸化信号和下游序列，和(D)无终止子。可以用多种基因组片段取代胭脂碱合酶终止子，可以选择所述基因组片段作为潜在终止子候选者。LuF代表作为连读区的萤光素酶基因片段(约200至300bp)。可以用非植物同源的DNA片段(如酵母基因间序列)取代LuF。章鱼碱合酶终止子位于盒的末端，以稳定包含连读产物的转录物。可以在基于pUC的载体或二元载体中构建这些构建体。TOI代表目的终止子。尽管已经在筛选系统中证明NOS仅具有中等效率，但是可以用它作为一种对照终止子用于本文所述的评估系统。
B：体外筛选系统。与连读区和多腺苷酸化RNA杂交的两个单链荧光探针，如信标探针。黑条形代表多腺苷酸化RNA。灰色条形代表连读产物。探针1(黑色星)与多腺苷酸化RNA的互补序列杂交。探针2(灰色星)与连读区的互补序列杂交。
C：对照构建体(A、C)和含有潜在终止子候选者的构建体(B、D)。RG代表任何报道基因。SMG代表任何选择标记基因。将约260bp的胭脂碱合酶终止子(NOS)用作对照终止子(A、C)。将植物基因组片段(＜1kb)克隆进GUS或bar与dsRNA片段之间，以鉴定目的终止子(TOI)。由于下调转基因植物中的必需基因，表达用于必需基因(EG)的dsRNA使植物致死(A、B)。由于下调转基因植物中的选择标记基因，表达用于SMG的dsRNA引起特定选择压下的致死(C、D)。然而，由于低水平连读或不连读，强严紧终止子可限制dsRNA的表达，结果产生转基因植物。可以在基于pUC的载体或二元载体中构建这些构建体。
D：对照构建体(A)是其中克隆了对照和测试序列的载体。阳性对照载体(B)包含在GUS报道基因下游的NOS终止子序列。阴性对照载体(C)包含得自可在植物中表达的可读框的内部部分的序列，因此不应具有转录终止活性。载体(D)代表包含待测试终止子活性的推定TOI候选者的载体。这些构建体构建入pUC载体中，并用于TOI优选序列的瞬时分析。
E：对照二元载体(A、C)不包含在原始报道基因GUS下游插入的推定终止子序列。测试载体(B、D)包含将在稳定转化植物中测试转录终止活性的推定TOI候选者。载体(A、B)包含第二个报道基因DsRed2下游的NOS终止子；这些构建体将用于确定推定TOI终止GUS的效率是否影响DsRed2的表达。载体(C、D)不含有用于第二个报道基因DsRed2的转录终止序列，并且将用于测试并列于DsRed2和GUS基因的3，末端之间的TOI序列的双向转录终止活性，
图14瞬时TOI测定之后的玉米叶组织。在GUS编码序列下游不包含功能性转录终止子的载体中未观察到GUS染色(A&C)。在(+)对照(B)载体以及全部四个TOI候选序列(D-G)中，功能性终止子的存在恢复了GUS表达。
图15对照构建体(A)和含有潜在终止子候选者的构建体(B)。构建体由强组成型启动子(如玉米泛蛋白启动子)、FP1(编码荧光蛋白1的基因)、已知终止子(A：如NOS)或新终止子(B)、IRES(如EMCV)、FP2(编码荧光蛋白2的基因)和章鱼碱合酶终止子组成。
图16目的终止子(TOI)构建体(A)和对照构建体(B和C)。将TOI嵌入致死基因或报道基因的内含子之内(A)。还将构建无嵌入内含子的TOI(B)，以及具有嵌入内含子的已知终止子NOS(C)的对照构建体。致死基因可以是白喉毒素片段A(DT-A)或本领域任一已知的植物致死基因。报道基因可以是绿色荧光蛋白或本领域已知在植物中具有功能的任一已知报道基因。
图17修饰的PIV2内含子。PIV内含子含有(1)共有5’识别序列，(2)5’剪接位点后的高AU含量，(3)3’剪接位点前的高AU含量，(4)共有3’识别序列，(5)共有分支点序列CURAY，(6)分支点序列和3’剪接位点之间的多聚U区域。
图18目的终止子(TOI)构建体(1)和对照构建体(2和3)。构建体4表达dsRNA分子，所述dsRNA分子将靶向含有构建体1(渗漏TOI)和构建体3RNAi的靶标区的mRNA以进行降解。ZmUbi(玉米泛蛋白启动子)、GFP(绿色荧光蛋白)、OCS(章鱼碱合酶终止子)、NOS(胭脂碱合酶终止子)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、RNAi(RNA干扰，沉默)。对于构建体1、2和3，所产生RNA的终点(翻译或降解)显示构建体4是否也在同一植物中表达。
图19载体pTOI3(SEQ ID NO：73)和pTOI4(SEQ ID NO：73)中插入片段的原理图。
图20用于瞬时分析的基于pUC的表达载体图。将对照和推定TOI序列克隆进此载体的Rsrl1-SacI位点。
图21在稳定转化植物中用于TOI活性分析的二元载体图。A-载体包含DsRed2报道基因下游的Nos终止子，将用于确定推定TOI终止GUS的效率是否影响DsRed2的表达。TOI序列在AvrII位点插入。B-载体不包含用于DsRed2的终止子，并且将用于评估TOI候选者的双向转录终止活性。TOI序列在SacI位点插入。
具体实施方式
一般定义
应该理解，本发明不受限于所述的具体方法、方案、细胞系、植物种或属、构建体和试剂。还应理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受附带的权利要求的限制。在以下描述中广泛使用了重组DNA技术中的大量术语。为了提供对说明书和权利要求书(包括给予这些术语的范围)明确而一致的理解，提供以下定义。
本文使用的术语“约”指大约、约略、在……左右或在……区域内。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展所述数值以上和以下的边界来修饰该范围。本文中一般使用术语“约”通过上下20％(更高或更低)的变化修饰所述值以上或以下的数值。
本文使用的“或”一词指具体列表中的任一成员，还包括该列表中成员的任何组合。
术语“核苷酸”指碱基-糖-磷酸组合。核苷酸是核酸序列(DNA和RNA)的单体单元。术语核苷酸包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTP、GTP和脱氧核糖核苷三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。这些衍生物包括如[αS]dATP、7-脱氮杂-dGTP和7-脱氮杂-dATP。本文中使用的术语核苷酸还指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的展示性实例包括但不仅限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。根据本发明，“核苷酸”可以是未标记的，或者是通过熟知的技术可检测标记的。可检测标记包括如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。
术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链、有义或反义形式的聚合物或杂交体。除非另有说明，具体的核酸序列还暗中包括其保守性修饰的变体(如简并密码子替换)和互补序列以及明确指出的序列。本文中术语“核酸”与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用。
本文使用的短语“核酸序列”指代表核苷酸的缩写、字母、字或词的连续列表。在一个实施方案中，核酸可以是“探针”，其为相对短的核酸，长度通常小于100个核苷酸。核酸探针经常从长度约50个核苷酸至长度约10个核苷酸。核酸的“靶标区”是核酸中鉴定为重要的部分。核酸的“编码区”是核酸的部分，其置于适当调节序列控制下时，以序列特异性方式转录并翻译以产生特定多肽或蛋白质。编码区编码这样的多肽或蛋白质。
本文使用的术语“探针”指能与目的核苷酸序列杂交的寡核苷酸，它以纯化的限制性消化产物天然产生或合成、重组或通过PCR扩增产生。探针可以是单链或双链的。考虑用任何“报道分子”标记本发明使用的任何探针，从而可以以任何检测系统进行检测，所述检测系统包括但不仅限于酶(如ELISA，以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性、量热、重量分析、磁性和发光系统。本发明旨在不受限于任何具体的检测系统或标记。
术语“寡核苷酸”指包含共价连接的核苷酸序列的合成或天然分子，所述核苷酸通过一个核苷酸的脱氧核糖或核糖3’位置与相邻核苷酸的脱氧核糖或核糖5’位置之间的磷酸二酯键连接。
术语“有义”应理解成指具有与靶序列同源或相同的序列的核酸，例如与蛋白转录因子结合的序列和与给定基因的表达相关的序列。根据优选的实施方案，核酸包含目的基因和允许所述目的基因表达的元件。有义RNA可在共抑制或有义抑制基因沉默方法中用于基因沉默。在转录时产生与内源基因转录物相同或至少非常相似的RNA转录物的基因的表达可以以目前尚未完全理解的基因表达抑制方式(称为共抑制)介导基因沉默(公开于Napoli 1990；Jorgensen 1996；Goring 1991；Smith 1990；Van der Krol1990)。所表达的RNA可以代表完整或部分的内源靶标。翻译不是必需的，转录已经足够。已经描述了植物中的应用(Napoli 1990；US 5,034,323)。
术语“反义”应理解成具有与靶序列(如信使RNA(mRNA)序列)互补的序列的核酸，认为通过与靶序列杂交启动对mRNA表达的阻断。为在植物宿主中的反义效应最大化，优选使用同源基因。同源是指可得自与植物宿主相同的植物物种。就本说明书而言，异源指得自不同植物或非植物物种。异源还包括基因的合成类似物，其修饰了其mRNA编码核酸序列以与宿主基因存在至少5％的差异。本领域大量描述了通过反义RNA的基因沉默(包括植物中的多种应用，如Sheehy 1988；US 4,801,340；MoI 1990)。反义方法的变化是使用α-端基异构核酸序列。这些α-端基异构序列与互补RNA形成特异性双链杂交体，其中与“正常”反义RNA(或β-核酸)相反，两条链彼此平行(Gautier 1987)。
术语“dsRNA”或“双链RNA干扰”旨在指通过表达对应于内源基因及其互补RNA链的RNA分子，从而提供可通过杂交形成双链RNA结构的两条RNA序列进行基因沉默的方法。两条RNA链可以在分开的分子上，或者可以是一个分子的部分，从而形成所称作的自身互补发夹结构。可以从例如含有双链DNA片段的“反向重复”的DNA表达形成自身互补发夹的RNA结构。在此上下文中，术语“反向重复”旨在指一个双链DNA分子中相反取向(即“头”对“头”或“尾”对“尾”的取向，以使第一个片段的有义链与第二个片段的反义链融合，反之亦然)的双链DNA片段(序列基本相同或优选相同)的取向。优选地，形成发夹的dsRNA可以包括连接两条互补链(如WO 99/53050所述)的接头(如内含子序列，例如来自马铃薯ST-LS1基因的内含子，Vancanneyt 1990)。本领域已经充分描述将dsRNAi用于多种生物，包括动物和植物生物的方法(如Matzke 2000；Fire1998；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364)。这些参考文献及其中公开的方法明确引入为参考。表达dsRNAi的细胞或生物的表型与敲除突变体相似，经常导致完全的基因沉默(Water-house 1998)。本文使用的术语“双链RNA”或“dsRNA”旨在指一个或多个核糖核酸序列，其由于互补序列而在理论上(即根据Watson和Crick的碱基配对原则)和/或实践上(如由于体外和/或体内杂交实验)能够形成双链RNA结构。本领域技术人员了解这一事实，即双链RNA结构的形成是单链和双链形式之间的平衡。优选地，双链(即杂交的)和单链(即非杂交或解离的)形式之间的关系至少为1∶10，优选至少为1∶1，更优选至少为10∶1。dsRNA的一条链与内源基因的序列基本相同。此上下文中基本相同指有效的基因沉默不需要100％的同一性，与靶序列相比，dsRNA序列可以包含插入、缺失和点突变。优选地，dsRNA序列和至少部分靶序列之间的同源性至少为60％，优选至少为80％，更优选至少为90％，最优选100％。或者，基本同一性是允许两个序列在高严格条件下杂交的同一性。靶序列中与dsRNA具有同源性的部分的长度至少为23个碱基，优选至少50个碱基，更优选至少100个碱基。靶基因的所述部分可以与基因的多个部分相似，但优选编码由所述基因转录的mRNA序列的部分。
术语“核酶”旨在指催化性RNA分子，其能够诱导靶RNA的序列特异性切割(Tanner 1999)。本领域已经公开了核酶的制备和用途(Haseloff1988；Haselhoff & Gerlach 1988；Steinecke 1992；de Feyter R 1996)。优选“锤头状”核酶(Haselhoff & Gerlach 1988)。已公开了基于定制核酶的基因沉默方法(EP 0 291 533，EP 0 321 201，EP 0 360 257)。还公开了在植物和植物细胞中的用途(Steinecke 1992；de Feyter 1996)。可以如所述(Steinecke1995)通过核酶和靶序列的二级结构及其相互作用的计算产生合适的靶序列和核酶(Bayley 1992；LIoyd 1994)。例如可以利用四膜虫L-19 IVS RNA的衍生物并几乎适用于任何靶序列(US 4,987,071；US 5,116,742)。或者，可以通过筛选多样化核酶文库选择核酶(Bartel 1993)。
术语“基因”指与适当的调节序列有效连接的编码区，所述调节序列能以某些方式调节多肽的表达。基因包括编码区(可读框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的DNA非翻译调节区(如启动子、增强子、抑制子等)以及适当时单个编码区(即外显子)之间的间插序列(即内含子)。
当涉及结构基因时，本文使用的术语“编码区”指编码氨基酸的核苷酸序列，所述氨基酸作为mRNA分子翻译的结果可见于新生多肽中。在真核生物中，编码区的边界为编码起始密码子甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”的5’侧和指定终止密码子的三个三联体(即TAA、TAG、TGA)之一的3’侧。除了含有内含子以外，基因组形式的基因还可以包括存在于RNA转录物中的位于序列5’和3’末端的序列。这些序列称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于mRNA转录物中存在的非翻译序列的5’或3’)。5’侧翼区可以含有调节序列如启动子和增强子，它们控制或影响基因的转录。3’侧翼区可以含有指导转录终止、转录后切割和多腺苷酸化的序列。
术语“扩增”指使用聚合酶提高核苷酸序列拷贝数的任何体外方法。核酸扩增引起核苷酸整合进DNA和/或RNA分子或引物中，从而形成与模板互补的新分子。形成的核酸分子及其模板可以作为模板来合成其他核酸分子。本文使用的扩增反应可以由许多轮复制组成。DNA扩增反应包括如聚合酶链式反应(PCR)。一次PCR反应可以由5至100个“循环”的变性及DNA分子合成组成。
术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指连续氨基酸残基的聚合物或寡聚物。
本文使用的术语“分离的”指物质已经从其最初环境中移出。例如，活的动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但从天然系统的一些或全部共存物质中分离的相同多核苷酸或多肽则是分离的。这些多核苷酸可以是载体的一部分和/或这些多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且将是分离的，因为这种载体或组合物不是其最初环境的一部分。
优选地，在涉及核酸(如“分离的核酸序列”)时，术语“分离的”指已鉴定并从一般与其天然来源相关的至少一种污染核酸中分离的核酸序列。分离的核酸是以与其在自然界中不同的形式或背景存在的核酸。相反，非分离的核酸是以其在自然界中存在的状态存在的核酸如DNA和RNA。例如，给定的DNA序列(如基因)存在于宿主细胞染色体中相邻基因附近；RNA序列(如编码特定蛋白质的特定mRNA序列)作为与编码多种蛋白质的多种其他mRNA形成的混合物存在于细胞中。例如，编码特定性状的分离的核酸序列包括例如，通常含有所述核酸序列的细胞中的这些核酸序列，其中所述核酸序列在与天然细胞不同的染色体或染色体外位置，或者侧翼为与天然存在的核酸序列不同的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。当使用分离的核酸序列表达蛋白质时，核酸序列将最少含有有义或编码链(即核酸序列可以是单链的)的至少一部分。或者，它可以含有有义和反义链(即核酸序列可以是双链的)。
本文使用的术语“纯化的”指从其天然环境中移出、分离或分开的分子，可以是核酸或氨基酸序列。因此“分离的核酸序列”是纯化的核酸序列。“基本纯化的”分子至少60％不含、优选至少75％不含、最优选至少90％不合与其天然共存的其他组分。
本文使用的术语“互补”或“互补性”指通过碱基配对原则相关的核苷酸序列。例如，序列5′-AGT-3′与序列5′-ACT-3′互补。互补性可以是“部分”或“全部”的。“部分”互补性是一个或多个核酸碱基不能根据碱基配对原则匹配。两核酸之间的“全部”或“完全”互补性是每一个核酸碱基都能根据碱基配对原则与另一碱基匹配。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著的影响。
本文使用的核酸序列的“互补序列”指核苷酸序列，其核酸显示与该核酸序列的核酸的全部互补性。
就生物、多肽或核酸序列而言，术语“野生型”、“天然”或“天然来源”指该生物是天然存在的或可得自至少一种天然存在的生物，而没有被人为改变、突变或操作。
涉及细胞使用时，术语“转基因”或“重组”指含有转基因的细胞，或者通过引入转基因改变了基因组的细胞。涉及组织或植物使用时，术语“转基因”分别指包含一个或多个含有转基因的细胞的组织或植物，或者通过引入转基因改变了基因组的组织或植物。可以通过若干方法产生转基因细胞、组织和植物，所述方法包括通过人为介入(如通过本文所述的方法)将包含核酸(通常为DNA)的“转基因”引入靶细胞或将转基因整合进靶细胞的染色体。
本文使用的术语“转基因”指通过实验操作引入细胞基因组的任何核酸序列。转基因可以是“内源DNA序列”或“异源DNA序列”(即“外源DNA”)。术语“内源DNA序列”指在其引入的细胞中天然可见的核苷酸序列，其前提为与它与天然存在序列相比不含有某种修饰(如点突变、存在选择标记基因等)。术语“异源DNA序列”指与核酸序列连接或经过操作而连接的核苷酸序列，所述核酸序列和核苷酸序列在自然界中不连接，或在自然界中在不同位置连接。异源DNA对其引入的细胞而言不是内源性的，而是得自另一细胞。异源DNA还包括含有某种修饰的内源DNA序列。异源DNA一般(尽管不必然)编码其在其中表达的细胞在正常情况下不产生的RNA和蛋白质。异源DNA的实例包括报道基因、转录和翻译调节序列、选择标记蛋白(如赋予药物抗性的蛋白质)等。优选地，就调节序列(如本发明的启动子)而言，术语“转基因”或“重组”指所述调节序列与天然环境中它不连接的核酸共价结合并毗邻。
术语“外源基因”指通过实验操作引入细胞基因组的任何核酸(如基因序列)，并可包括可见于该细胞的基因序列，只要引入的基因与天然存在基因相比含有某种修饰(如点突变、存在选择标记基因等)。
“重组多肽”或“重组蛋白”指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质，即用编码所需多肽或蛋白质的外源重组DNA构建体转化的细胞所产生的多肽或蛋白质。重组核酸和多肽还包括不存在于自然界，而是人为修饰、改变、突变或操作的分子。
术语“异源核酸序列”或“异源DNA”可互换使用，指与核酸序列连接的核苷酸序列，它们在自然界中不连接，或在自然界中在不同位置连接。异源DNA对其引入细胞而言不是内源性的，而是得自另一细胞。这些异源DNA一般(尽管不必然)编码其在其中表达的细胞在正常情况下不产生的RNA和蛋白质。
术语“生物”、“宿主”、“靶生物”或“宿主生物”指可以作为筛选构建体或筛选载体受体的任何原核或真核生物。本文使用的术语“宿主”包括可以遗传改造的原核或真核生物。这些宿主的实例可参阅Maniatis1989。包括完整生物以及由其产生的器官、部分、细胞、培养物和繁殖物质。优选的为微生物、非人动物和植物生物。优选的微生物为细菌、酵母、藻类或真菌。
优选的细菌是以下属的细菌：埃希氏菌属(Eschericha)、棒杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、欧文氏菌属(Erwina)、农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、梭菌属(Clostridium)、Proionibacterium、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、真杆菌属(Eubacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、Phaeodlactylum、豆形虫属(Colpidium)、被孢霉属(Mortierella)、虫霉属(Ehtomophthora)、毛霉属(Mucor)、Crypthecodinium或蓝细菌属(cyanobacteria)，例如Synechocystis属。特别优选的是能够感染植物并因而转移本发明构建体的微生物。优选的微生物是来自农杆菌属的微生物，特别是根癌农杆菌。
优选的酵母为假丝酵母属(Candida)、酵母菌属(Saccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia)。优选的真菌为曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、阿舒囊霉属(Ashbya)、链孢菌属(Neurospora)、镰刀菌属(Fusarium)、白僵菌属(Beauveria)或其他真菌。此外，就本发明目的而言，植物生物是有光合活性能力的其他生物，如藻类或蓝细菌和藓类。优选的藻类为绿藻如红球藻属(Haematococcus)、三角褐指藻(Phaedactylum tricornatum)、团藻属(Volvox)或杜氏藻属(Dunaliella)的藻类。
优选的真核细胞和生物包括植物细胞和生物、动物细胞和非人动物生物，包括真核微生物如酵母、藻类或真菌。
“非人动物生物”包括但不仅限于非人脊椎动物和无脊椎动物。优选鱼类物种、非人哺乳动物如奶牛、马、绵羊、山羊、小鼠、大鼠或猪、鸟类如鸡或鹅。优选的动物细胞包括如CHO、COS、HEK293细胞。无脊椎动物生物包括如线虫和昆虫。昆虫细胞包括如果蝇S2和灰赤夜蛾Sf9或Sf21细胞。
优选的线虫是能够侵袭植物、动物或人类生物的线虫。优选的线虫包括以下属的线虫：钩口线虫属(Ancylostoma)、鸡蛔虫属(Ascaridia)、蛔虫属(Ascaris))、仰口线虫属(Bunostomum)、新杆状线虫属(Caenorhabditis)、毛细线虫属(Capillaria)、夏氏线虫属(Chabertia)、古柏线虫属(Cooperia)、网尾线虫属(Dictyocaulus)、血矛线虫属(Haemonchus)、异刺线虫属(Heterakis)、细颈线虫属(Nematodirus)、结节线虫属(Oesophagostomum)、胃线虫属(Ostertagia)、尖尾线虫属(Oxyuris)、副蛔虫属(Parascaris)、圆线虫属(Strongylus)、弓蛔线虫属(Toxascaris)、鞭虫属(Trichuris)、毛圆线虫属(Trichostrongylus)、Tfhchonema、弓蛔虫属(Toxocara)或钩虫属(Uncinaria)。特别优选的为植物寄生线虫如伞滑刃线虫属(Bursaphalenchus)、小环线虫属(Criconemella)、Diiylenchus、茎线虫属(Ditylenchus)、球胞囊线虫属(Globodera)、螺旋线虫属(Helicotylenchus)、棘皮线虫属(Heterodera)、长针线虫属(Longidorus)、Melodoigyne、珍珠线虫属(Nacobbus)、针线虫属(Paratylenchus)、短体线虫属(Pratylenchu)、穿孔线虫属(Radopholus)、Rotelynchus、垫刃线虫属(Tylenchus)或剑线虫属(Xiphinema)。优选的昆虫包括以下属：鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(diptera)、鳞翅目(Lepidoptera)和同翅目(Homoptera)。
优选的真菌为曲霉属、木霉属、阿舒囊霉属、链孢菌属)、镰刀菌属、白僵菌属或Indian Chem Engr.Section B.第37卷，No 1，2(1995)15页，表6中所述的其他真菌。特别优选丝状半子囊菌纲棉阿舒囊霉(Ashyagossypii)。
优选的酵母为假丝酵母属、酵母菌属、汉逊酵母属或毕赤酵母属，特别优选酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(ATCC保藏号201178)。
本文使用的术语“植物”或“植物生物”指多个植物细胞，其高度分化成任何植物发育阶段中存在的结构。这些结构包括一种或多种植物器官，包括但不仅限于果实、嫩枝、茎、叶、花瓣等。优选作为转基因生物的宿主或靶生物尤其是植物。本发明范围内包括植物界的高等和低等植物的任何属和种。还包括成熟植物、种子、嫩枝和苗及部分、繁殖材料和来自于此的培养物，例如细胞培养物。术语“成熟植物”应理解为指处于苗之后的任何发育阶段的植物。术语“苗”应理解为指早期发育阶段的幼小的未成熟植物。
一年生、二年生、单子叶和双子叶植物是用于产生转基因植物的优选宿主生物。此外，基因表达在所有观赏植物、有用或观赏树木、花、切花、灌木或草坪中是有利的。可以提到的植物为例如但不仅限于被子植物、苔藓植物如苔纲(Hepaticae)(苔类)和Musci(藓类)；蕨类植物如羊齿类、木贼和石松；裸子植物如针叶树、苏铁、银杏和买麻藤纲(Gnetatae)；藻类如绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、Myxophyceae、黄藻纲(Xanthophyceae)、硅藻纲(Bacillariophyceae)(硅藻)和裸藻纲(Euglenophyceae)。
优选用于食品或饲料目的的植物，如豆科(Leguminosae)如豌豆、苜蓿和大豆；禾本科(Gramineae)如稻、玉米、小麦、大麦、高粱、粟、黑麦、黑小麦或燕麦、伞形科(Umbelliferae)特别是胡萝卜属，尤其是carota(胡萝卜)和芹菜(Apium)种，特别是芹菜(Graveolens dulce)等；茄科(Solanaceae)，特别是番茄属(Lycopersicon)，尤其是番茄(esculentum)种和茄属，特别是马铃薯(tuberosum)和茄子(melongena)，等(如烟草)；以及辣椒属(Capsicum)，特别是胡椒(annuum)等；豆科(Leguminosae)，特别是大豆属(Glycine)，尤其是max(大豆)、苜蓿、豌豆、紫花苜蓿、豆类或花生等种；十字花科(Brassicacae)，特别是芸苔属，尤其是napus(欧洲油菜)、芸苔(campestris)(甜菜)、卷心菜(oleracea cv Tastie)、花椰菜(oleracea cvSnowball Y)和花茎甘蓝(oleracea cv Emperor)；以及拟南芥属(Arabidopsis)，尤其是拟南芥(thaliana)种等等；菊科(Compositae)，特别是莴苣属(Lactuca)，尤其是莴苣种(sativa)等等；紫菀科(Asteraceae)如向日葵、万寿菊、莴苣或金盏花等等；葫芦科(Cucurbitaceae)如甜瓜、南瓜/西葫芦或胡瓜和亚麻子。其他优选的为棉花、甘蔗、大麻、亚麻、辣椒和多种树木、坚果和藤蔓物种。非常特别优选拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、万寿菊(Tagetes erecta)、金盏花(Calendula officinalis)、大豆(Gycine max)、玉米(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、小麦(Triticumaestivum)、豌豆(Pisum sativum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大麦(Hordeumvulgare)、欧洲油菜(Brassica napus)。
术语“细胞”指单个细胞或细胞群体。群体可以是含有一种细胞类型的纯群体。同样，群体可以包含超过一种细胞类型。在本发明中，对细胞群体可以包含的细胞类型数没有限制。细胞可以是同步化或不同步化的，优选细胞为同步化的。
术语“器官”就植物而言(或“植物器官”)指植物的部分，可包括(但不仅限于)例如根、果实、嫩枝、茎、叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。
术语组织就植物而言(或“植物组织”)指多个植物细胞的排列，包括分化的和未分化的植物组织。植物组织可以组成植物器官的部分(如植物叶的表皮)，但也组成肿瘤组织和培养物中的多种细胞类型(如单细胞、原生质体、胚、愈伤组织、原球茎样体等)。植物组织可以在植物中(in planta)，在器官培养物、组织培养物或细胞培养物中。
术语“染色体DNA”或“染色体DNA序列”应理解为独立于细胞周期状态的细胞核的基因组DNA。因此染色体DNA可以组织在染色体或染色单体中，它们可以是浓缩的或解旋的。可以通过本领域已知的多种方法证明并分析染色体DNA中的插入，所述方法为如聚合酶链式反应(PCR)分析、Southern印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR。
本文使用的术语“结构基因”旨在指转录成mRNA的DNA序列，所述mRNA接着翻译成特定多肽的特征性氨基酸序列。
术语“目的核苷酸序列”指任何核苷酸序列，本领域技术人员可出于任何原因(如赋予改善的品质)而认为需要对其进行操作。这些核苷酸序列包括但不仅限于结构基因(如报道基因、选择标记基因、癌基因、药物抗性基因、生长因子等)的编码区和不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调节序列(如启动子序列、多腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。
术语“表达”指基因产物的生物合成。例如，对于结构基因的情况，表达涉及结构基因转录成mRNA和任选的其后mRNA翻译成一种或多种多肽。
本文使用的术语“表达盒”或“表达构建体”旨在指待表达的任何核酸序列有效连接启动子序列和任选的促进所述核酸序列表达的其他元件(如终止子和/或多腺苷酸化序列)的组合。
本文使用的术语“启动子”、“启动子元件”或“启动子序列”指当与目的核苷酸序列连接时，能够控制目的核苷酸序列转录成mRNA的DNA序列。启动子一般(尽管不必然是)位于目的核苷酸序列的5’(即上游)(如靠近结构基因转录起始位点)，启动子控制目的核酸序列向mRNA的转录并提供RNA聚合酶和起始转录的其他转录因子特异性结合的位点。抑制型启动子的转录速率应答于抑制剂而降低。诱导型启动子的转录速率应答于诱导剂而提高。组成型启动子的转录速率不特别受到调节，尽管在普遍代谢条件影响下可能发生变化。
启动子可以是组织特异性或细胞特异性的。用于启动子时，术语“组织特异性”指这样的启动子，它能够指导目的核苷酸序列在特定组织类型(如花瓣)中选择性表达，而同一核苷酸序列在不同的组织类型(如根)中的表达相对缺失。可以通过例如以下来评估启动子的组织特异性：将报道基因与启动子序列有效连接以产生报道构建体，将报道构建体引入植物基因组从而使报道构建体整合进得到的转基因植物的每种组织中，检测转基因植物的不同组织中报道基因的表达(例如检测mRNA、蛋白质或报道基因编码的蛋白质的活性)。与报道基因在其他组织中的表达水平相比，检测到报道基因在一种或多种组织中较高的表达水平表明该启动子对于检测到较高表达水平的组织具有特异性。当用于启动子时，术语“细胞类型特异性”指这样的启动子，它能够指导目的核苷酸序列在特定细胞类型中的选择性表达，而在同一组织的不同类型细胞中同一核苷酸序列的表达相对缺失。当用于启动子时，术语“细胞类型特异性”还指能促进目的核苷酸序列在单个组织内的区域中选择性表达的启动子。可以使用本领域熟知的方法评估启动子的细胞类型特异性，如GUS活性染色或免疫组织化学染色。简言之，将组织切片包埋在石蜡中，用一级抗体与石蜡切片反应，所述抗体对表达受启动子控制的目的核苷酸序列所编码的多肽产物具有特异性。使对一级抗体具有特异性的标记(如缀合过氧化物酶)的二级抗体与切片的组织结合，通过显微术检测(如用抗生物素蛋白/生物素)特异性结合。
启动子可以是组成型或可调节的。涉及启动子时，术语“组成型”指启动子能在无刺激(如热激、化学品、光等)的情况下指导有效连接的核苷酸序列转录的启动子。组成型启动子一般能指导转基因在基本上任何细胞和任何组织中表达。相反，“可调节”启动子是在存在刺激(如热激、化学品、光等)情况下能指导有效连接的核酸序列转录水平的启动子，所述转录水平与不存在刺激时有效连接的核酸序列的转录水平不同。
本文使用的术语“转录终止子”或“转录终止序列”旨在指引起或启动核酸序列由启动子启动的转录停止的序列。优选地，转录终止序列还包含导致转录物多腺苷酸化的序列。例如，转录终止子可以包含一个或多个多腺苷酸化信号序列、一个或多个多腺苷酸化附着序列和导致转录终止的多种长度的下游序列。还应理解，编码表达的RNA转录物3’非翻译区的序列下游的序列也可以是转录终止子的一部分，尽管该序列本身不表达为RNA转录物的部分。此外，转录终止子可以包含可以影响其功能的附加序列，如3’非翻译区(即编码序列终止密码子之后的基因序列)。转录终止可能涉及多种机制，包括但不仅限于RNA聚合酶II受诱导而与其DNA模板解离。几乎所有的生物反应的转录终止的效率都不是100％。本文使用的术语“转录终止效率”或“转录终止的效率”表示所述转录终止子区中转录停止(或终止)的频率与连读转录超过所述转录终止子的频率之间的比值。涉及转录终止序列时，本文使用的术语“严紧”或“有效”应理解为转录终止效率至少为10(即停止/连读比值为10∶1)的转录终止序列，优选至少100(即停止/连读比值为100∶1)，更优选1000(即停止/连读比值为1000∶1)。转录可以在所述转录终止序列内的一个或多个特定碱基对处停止。因此，转录物的长度可能存在变异性。然而，转录终止优选具有低变异性，并且通过得到的转录物长度(除多腺苷酸尾以外)判断至少50％、优选至少80％、更优选至少90％终止于一个特定碱基对。
术语“有效的连接”或“有效连接”应理解为指例如调节元件(如启动子)与待表达的核酸序列以及适当时其他调节元件(如终止子)的顺序排列，其中每个调节元件都能实现其预期功能，以允许、修饰、促进或影响所述核酸序列的表达。表达可取决于核酸序列相对于有义或反义RNA的排列。为实现这一点，直接的化学连接不是必需的。遗传控制序列(如增强子序列)可以从很远的位置或从实际上其他DNA分子对靶序列发挥其功能。优选的排列是将待重组表达的核酸序列置于作为启动子的序列之后，以使两个序列彼此共价连接。启动子序列和待重组表达的核酸序列之间的距离优选小于200个碱基对，特别优选小于100个碱基对，非常特别优选小于50个碱基对。可以通过如所述(如Maniatis 1989；Silhavy 1984；Ausubel 1987；Gelvin 1990)惯用的重组和克隆技术产生有效连接和表达构建体。然而，也可以将其他序列(例如作为接头的带有限制性酶特异性切割位点的序列或作为信号肽的序列)置于两个序列之间。插入序列也可以引起表达融合蛋白。优选地，由启动子和待表达核酸序列连接组成的表达构建体可以以载体整合的形式存在，并可通过如转化插入植物基因组。
本文使用的术语“转化”指将遗传物质(如转基因)引入细胞中。细胞转化可以是稳定的或瞬时的。术语“瞬时转化”或“瞬时转化的”指在不将转基因整合进宿主细胞基因组的情况下将一个或多个转基因引入细胞。可以通过如酶联免疫吸附测定(ELISA)检测瞬时转化，其检测一个或多个转基因所编码多肽的存在。或者可以如本文所证明的，通过检测转基因(如uid A基因)所编码蛋白质(如β-葡糖醛酸糖苷酶)的活性来检测瞬时转化(如通过用在存在GUS酶时给出蓝色沉淀的X-Gluc进行染色的GUS酶组织化学测定；以及使用GUS-Light试剂盒(Tropix)的GUS酶活性化学发光测定)。术语“瞬时转化体”指瞬时整合了一种或多种转基因的细胞。
相反，术语“稳定转化”或“稳定转化的”指将一种或多种转基因引入并整合于细胞基因组，优选得到染色体整合和通过减数分裂的稳定遗传性。可以通过细胞基因组DNA与能结合一种或多种转基因的核酸序列的DNA印迹杂交检测细胞的稳定转化。或者，还可以通过细胞基因组DNA聚合酶链式反应扩增转基因序列来检测细胞的稳定转化。术语“稳定转化体”指将一种或多种转基因稳定整合进基因组DNA的细胞。因此，稳定转化体与瞬时转化体的区别在于，来自稳定转化体的基因组DNA含有一种或多种转基因，而来自瞬时转化体的基因组DNA不含有转基因。转化还包括以植物病毒载体的形式将遗传物质引入植物细胞，其涉及表染色体(epichromosomal)复制和基因表达，其就减数分裂稳定性而言可以显示可变特性。稳定转化还包括以病毒载体的形式将遗传物质引入细胞，其涉及表染色体复制和基因表达，其就减数分裂稳定性而言可以显示可变特性。
用于操作纤毛虫和藻类的克隆和转化技术为本领域所熟知(WO98/01572；Falciatore 1999；Dunahay 1995)。
原则上讲，适合植物细胞或生物的转化技术(如下文所述)也可用于动物或酵母生物和细胞。优选直接转化技术，如磷酸钙或脂质体介导的转化或者电穿孔。
术语用细菌“感染”指在条件下将靶生物样品(如细胞、组织等)与细菌共温育，以使细菌内含有的核酸序列引入靶生物样品的一个或多个细胞。
术语“农杆菌”指产生冠瘿的土壤产生的革兰氏阴性杆状植物致病细菌。术语“农杆菌”包括但不仅限于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(一般在感染植物中引起冠瘿)菌株和毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)(在感染宿主植物中引起毛根病)菌株。用农杆菌感染植物细胞一般引起感染细胞产生冠瘿碱(如胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)。因此，引起胭脂碱产生的农杆菌菌株(如LBA4301、C58、A208菌株)称为“胭脂碱型”农杆菌；引起章鱼碱产生的农杆菌菌株(如LBA4404、Ach5、B6菌株)称为“章鱼碱型”农杆菌；引起农杆碱产生的农杆菌菌株(如EHA105、EHA101、A281菌株)称为“农杆碱型”农杆菌。
术语“轰击”和“生物射弹轰击”指将微粒向靶生物样品(如细胞、组织等)加速以在靶生物样品中细胞的细胞膜上产生创伤和/或使微粒进入靶生物样品的方法。用于生物射弹轰击的方法为本领域所已知(如内容引入本文作为参考的US 5,584,807)，并以商品提供(如氦气驱动的微粒加速器(PDS-1000/He)(BioRad)。
涉及核酸使用时，术语“同源性”或“同一性”指互补性程度。两核酸间的同源性或同一性应理解为指每种情况下在序列完整长度上的核苷酸序列同一性，其借助程序算法GAP(Wisconsin Package Version 10.0，University of Wisconsin，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA)使用以下参数通过比较而计算：
缺口权重：12    长度权重：4
平均匹配：2,912  平均错配：-2,003
或者，部分互补序列应理解为至少部分抑制完全互补序列与靶核酸杂交的序列，使用功能术语“基本同源”指代。可以使用低严格条件下的杂交测定(DNA或RNA印迹、溶液杂交等)检查对完全互补序列与靶序列之间杂交的抑制。在低严格条件下，基本同源的序列或探针(即能与另一目的寡核苷酸杂交的寡核苷酸)会竞争并抑制完全同源序列与靶标的结合(即杂交)。这不是说低严格条件允许非特异性结合；低严格条件需要两序列的彼此结合是特异性(即选择性)相互作用。可以使用甚至缺乏部分互补性程度(如小于约30％同一性)的第二种靶标测试非特异性结合的缺乏；在不存在非特异性结合的情况下，探针不会与第二种非互补靶标杂交。
涉及双链核酸序列如cDNA或基因组克隆使用时，术语“基本同源”指在上述低严格条件下能与双链核酸序列的一条或两条链杂交的任何探针。涉及单链核酸序列使用时，术语“基本同源”指在上述低严格条件下能与单链核酸序列杂交的任何探针。
本文使用的术语“杂交”包括“使核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何方法”(Coombs 1994)。杂交和杂交强度(即核酸间结合的强度)受到如核酸间的互补性程度、相关条件的严格度、形成杂交体的Tm和核酸中的G∶C比等因素的影响。
本文使用的术语“Tm”指“解链温度”。解链温度是双链核酸分子群体半数解离成单链时的温度。计算核酸Tm的等式为本领域所熟知。标准参照物表明，当核酸在1M NaCl的水溶液中时，可以通过等式Tm＝81.5+0.41(％G+C)简单的估计Tm值(参阅如Anderson 1985)。其他参照包括更复杂的计算，其在Tm的计算中考虑结构和序列特征。
涉及核酸杂交使用时，低严格条件包括与以下等价的条件：使用长度从约100至约1000个核苷酸的DNA探针时，在由5×SSPE(43.8g/L NaCl、6.9g/L NaH2PO4.H2O和1.85g/L EDTA，用NaOH将pH调整至7.4)、1％SDS、5×Denhardt试剂[每500ml 50×Denhardt含有：5g菲可(400型，Pharmacia)、5g BSA(Fraction V；Sigma)]和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中在68℃结合或杂交，接着在室温下用包含0.2×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤。
涉及核酸杂交使用时，高严格条件包括与以下等价的条件：使用长度从约100至约1000个核苷酸的探针时，在由5×SSPE、1％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑精DNA组成的溶液中在68℃结合或杂交，接着在68℃下在包含0.1×SSPE和0.1％SDS的溶液中洗涤。
涉及杂交条件(如涉及目的杂交条件)使用时，术语“等价”指杂交条件和目的杂交条件引起具有相同范围的同源性百分比(％)的核酸序列杂交。例如，如果目的杂交条件引起第一个核酸序列与和第一个核酸序列具有80％至90％同源性的另一核酸序列杂交，如果该另一杂交条件也引起第一个核酸序列与和第一个核酸序列具有80％至90％同源性的另一核酸序列杂交，则称另一杂交条件与目的杂交条件等价。
涉及核酸杂交使用时，本领域熟知可以使用多种等价条件以包括低或高严格条件；例如考虑探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶标的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定等)以及盐浓度和其他组分(如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇存在与否)，并可以改变杂交溶液以产生与上文列出的条件不同但等价的低或高严格杂交条件。本领域技术人员了解，尽管可以优选高严格度以减少或消除目的核酸序列和其他核酸序列之间的非特异性结合，但也可以优选低严格度以检测与目的核酸序列具有不同同源性的多种核酸片列。
术语“识别序列”指蛋白质、化合物、DNA或RNA分子(如限制性内切核酸酶、修饰甲基化酶或重组酶)识别并结合的特定序列。就重组酶而言，识别序列通常指重组位点。例如，Cre重组酶的识别序列为loxP，它是34个碱基对的序列，由8碱基对的核心序列侧翼的两个13碱基对的反向重复(作为重组酶结合位点)组成(参阅Sauer 1994，图1)。识别序列的其他实例为重组酶λ整合酶识别的attB、attP、attL和attR序列。attB是约25个碱基对的序列，含有两个9碱基对的核心型lnt结合位点和7碱基对的重叠区。attP是约240个碱基对的序列，含有核心型lnt结合位点和臂型lnt结合位点以及辅助蛋白整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)的位点(参阅Landy 1993)。可以根据本发明改造这些位点，以增强本发明方法中产物的产生。当这些改造位点缺乏使重组反应不可逆的P1或H1结构域时，这些位点可以命名为attR’或attP’以显示以某种方式修饰了这些位点的结构域。
术语“重组酶”指催化特定重组位点处DNA区段交换的酶。
术语“重组克隆”指方法，其中通过位点特异性重组酶的作用在体外或体内交换、插入、取代、替换或修饰了核酸分子区段或这些分子的群体。
术语“重组蛋白”指多肽，包括涉及与一个或多个重组位点相关的重组反应的切除或整合蛋白质、酶、辅因子或相关蛋白(Landy 1993)。
抑制盒是含有亚克隆载体中存在的选择标记的阻抑物的核酸区段。
本文使用的术语“位点特异性重组酶”指一类重组酶，其一般具有至少以下四种活性之一(或其组合)：(1)识别一种或两种特定核酸序列；(2)切割所述序列；(3)与链交换相关的拓扑异构酶活性；和(4)使核酸被切割的链再连接的连接酶活性(参阅Sauer 1994)。保守性位点特异性重组与同源重组和转座的区别在于两个配偶体之间的高度特异性。链交换机制涉及在无DNA合成的情况下切割并再连接特定的DNA序列(Landy 1989)。
术语“载体”指为插入的核酸序列提供有用的生物或生物化学特性的核酸分子(优选DNA)，所述特性优选为允许复制和/或转化或转染进宿主细胞和生物。实例包括质粒、噬菌体、自主复制序列(ARS)、着丝粒和能在体外或在宿主细胞中复制或向宿主细胞内的目的位置传递目的核酸区段的其他序列。载体可具有一个或多个限制性内切核酸酶识别位点，可以在所述位点以确定性方式切开序列而不丧失载体的基本生物功能，并可在所述位点剪接核酸片段以引发其复制和克隆。载体还可以提供如用于PCR的引物位点、转录和/或翻译起始和/或调节位点、重组信号、复制子、选择标记等。显然，不需要使用同源重组、转座或限制性酶的插入所需的核酸片段的方法，例如(但不仅限于)PCR片段的UDG克隆(US 5,334,575，以其整体引入本文为参考)、TA CloningTM PCR克隆(Invitrogen Corp.，Carlsbad，Calif.)等也可用于将片段克隆进按照本发明使用的克隆载体。克隆载体还可以含有适用于鉴定用克隆载体转化的细胞的一个或多个选择标记。
术语“引物”指在核酸分子(如DNA分子)的扩增或聚合中通过核苷酸单体的共价连接延长的单链或双链寡核苷酸。在优选的方面中，引物包括一个或多个重组位点或这些重组位点的部分。重组位点的部分包括目的重组位点的至少2个碱基、至少5个碱基、至少10个碱基或至少20个碱基。使用重组位点的部分时，可以通过新合成的核酸分子提供重组位点缺少的部分。这些重组位点可以位于引物中和/或一个或两个末端。优选地，临近重组位点在引物中加入附加序列，以增强或改善重组和/或重组过程中重组位点的稳定化。这些稳定序列可以是任何长度的任何序列(优选富含G/C的序列)。优选地，这些序列大小范围从1至约1000个碱基、1至约500个碱基、1至约100个碱基、1至约60个碱基、1至约25个、1至约10个、2至约10个并优选约4个碱基。优选地，这些序列长度大于1个碱基并优选长度大于2个碱基。
术语“模板”指待扩增、合成或测序的双链或单链核酸分子。在双链分子的情况下，优选在扩增、合成或测序这些分子以前使其链变性，以形成第一条和第二条链，或者可以直接使用双链分子作为模板。在单链模板的情况下，与模板的部分互补的引物在适当的条件下杂交，接着具有聚合酶活性(如DNA聚合酶和/或逆转录酶)的一种或多种多肽可以合成与所述模板的全部或部分互补的核酸分子。或者，对于双链模板，可以将一个或多个启动子与一种或多种聚合酶组合使用，以产生与模板的全部或部分互补的核酸分子。根据本发明，新合成的分子的长度可能等于或小于原始模板。此外，可以在合成或扩增中使用核酸模板群，以产生一般代表原始模板群的核酸分子群。
术语“接头”指包含一个或多个识别位点(如重组位点或用于限制性内切核酸酶的识别位点)的寡核苷酸或核酸片段或区段(优选DNA)，它可以加入环形或线性DNA分子以及本文所述的其他核酸分子中。可以在环形或线性分子中的任何位置加入这些接头，尽管优选在(或接近)线性分子的一个或两个末端处加入接头。优选地，将接头置于特定的目的核酸分子的两侧(侧翼)。接头的合成(如通过寡核苷酸合成、退火方法和/或PCR)是本领域技术人员所熟知的标准技术。根据本发明，可以通过标准重组技术(如限制性消化和连接)在目的核酸分子中加入接头。例如，可以通过以下在环形分子中加入接头：首先用适当的限制性酶消化分子、在切割位点加入接头并重新形成在切割位点处含有接头的环形分子。或者，接头可以与线性分子的一个或多个(优选两个)末端直接连接，从而形成在一个或两个末端具有接头的线性分子。在本发明的一个方面中，可以将接头加入线性分子群(如cDNA文库或经切割或消化的基因组DNA)中，以形成在所述群的全部或大部分的一个并且优选两个末端含有接头的线性分子群。
本文使用的重组DNA技术以及分子和细胞生物学中使用的其他术语一般可被可应用的领域的普通技术人员理解。
发明详述
本发明的第一个主题涉及鉴定和分离转录终止序列的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其包含：
a)启动子序列，和
b)用于插入DNA序列的一个或多个插入位点，优选限制性或重组位点，和
c)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下的表达导致易于检测的特征，
其中与无插入相比，将有效的转录终止子插入所述插入位点可改变所述附加序列通过所述启动子序列的表达，和
ii)提供待评估其转录终止能力的一种或多种DNA序列，和
iii)将所述DNA序列的一个或多个拷贝插入所述筛选构建体或筛选载体的所述插入位点，和
iv)将带有所述插入DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适于诱导从所述启动子序列的表达的体外或体内转录系统，和
v)鉴定和/或选择与无插入相比具有改变的易于检测特征的筛选构建体或筛选载体，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入的DNA序列用作转录终止序列，并(任选的)测定其序列。
通过本发明的方法可以便利的鉴定新的转录终止序列。该方法可以基于体外或体内筛选系统。本发明的筛选方法允许选择含有有效的转录终止序列的DNA序列、筛选构建体或筛选载体和/或细胞或生物(优选植物细胞和植物生物)。以前必需一个序列接一个序列地评估终止子。测试终止效率(严紧性)非常艰巨。本发明的方法效率更高并且非常灵敏，从而仅会鉴定非常严紧的终止子。通过此筛选系统鉴定的严紧终止子可用于表达盒，其降低两个盒之间的连读并提高转基因表达的稳定性。多种目的终止子的发现将提供更好的理解植物中转录终止的机会。
本文使用的术语“易于检测的特征”应以广义理解，可以包括特征的任何变化，优选表型特征的变化。“变化”在此上下文中可以包括所述特征的提高或降低。因此，所述附加序列在所述启动子控制下的表达可能引起表型特征的提高或降低。例如表达可以引起除草剂抗性(提高的抗性)或者可以通过表达如毒性基因引起毒效应(降低的成活力)。取决于插入位点相对于所述附加序列的定位(如下文所详细描述的)，有效的转录终止子可能引起所述附加序列提高(优选启动)或降低(优选沉默)的表达，因此两种类型的变化都可以有利地利用。
1.插入位点的定位
插入位点相对于引起易于检测特征的附加序列可以有多种定位。
1.1变通方案A：
例如，插入位点可以位于附加序列上游(即5’方向)，从而插入位点在启动子序列和所述附加序列之间(以下称为“变通方案A”)。在将有效转录终止子序列插入所述插入位点的情况下，转录将在所述附加序列之前停止，不发生进入此附加序列的连读转录。在这种情况下，有效的转录终止子将引起附加序列表达的降低或优选完全抑制。取决于引起所述易于检测特征的所述附加序列的转录(即表达)与否(两者均有可能，取决于使用的附加序列的类型)，所述易于检测特征将消失或表达。在任一情况下有效的转录终止子都将导致变化的易于检测特征，它与不在插入位点中插入序列的方案相比可能是抑制或提高。
因此在本发明优选的实施方案中用于鉴定和分离转录终止序列的方法包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其在5’至3’方向上包含：
a)启动子序列，和
b)用于插入DNA序列的一个或多个插入位点，优选限制性或重组位点，和
c)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下的表达导致易于检测的特征，
其中与无插入相比，将有效的转录终止子插入所述插入位点抑制所述附加序列通过所述启动子序列的表达，和
ii)提供待评估其转录终止能力的一个或多个DNA序列，和
iii)将所述DNA序列的一个或多个拷贝插入所述筛选构建体或筛选载体的所述插入位点，和
iv)将带有所述插入的DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适于诱导从所述启动子序列表达的体外或体内转录系统，和
v)鉴定和/或选择与无插入相比具有改变的易于检测特征的筛选构建体或筛选载体，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入的DNA序列用作转录终止序列，并(任选的)测定其序列。
如下文所述，位于插入位点下游的附加序列可以仅通过RNA的表达(即转录)(如所述附加序列形成反义RNA或dsRNA分子的情况)或通过表达(即蛋白质的转录和翻译)引起所述易于检测的特征。在后一情况下，必须保证可以发生正确的翻译。这可以通过例如避免上游ATG密码子、将序列与上游编码序列符合读框的克隆或优选地使用IRES位点来保证，后者允许甚至在ATG密码子不靠近转录物5’末端的情况下进行有效的翻译(Vagner 2001；序列参阅如http://ifr31w3.toulouse.inserm.fr/IRESdatabase/)。
1.2变通方案B：
在本发明的另一优选的实施方案中，还可以将插入位点安排在附加序列的下游(即3’方向)(以下称为“变通方案B”)。对于这种变化，优选以反向重复的形式将待插入到插入位点以评估其转录终止能力的DNA序列插入。在插入的DNA序列是有效的转录终止子的情况下，仅反向重复的第一个拷贝(即第一部分)被转录，附加序列发生正常表达。取决于引起所述易于检测特征的所述附加序列的转录(即表达)与否(两者均有可能，取决于使用的附加序列的类型)，所述易于检测特征将消失或表达。在任一情况下，有效的转录终止子都将导致改变的易于检测特征，它与不在插入位点中插入序列的方案相比可能是抑制或提高。然而，如果插入弱转录终止子或完全不具有转录终止能力的序列，则完整的反向重复(即插入序列的两个拷贝)将被转录，导致包含双链发夹结构(由插入DNA序列的反向重复转录的RNA形成)的RNA的转录。这种RNA通过双链RNA干扰(dsRNAi)引起其自身表达的基因沉默(自身抑制或自身沉默)，导致包含所述附加序列的表达盒的基因沉默。在这种情况下，有效的转录终止子将引起附加序列提高表达，检测特征将向与有效转录终止子的情况中相反的方向变化。因此在本发明优选的实施方案中，用于鉴定和分离转录终止序列的方法包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其在5’至3’方向上包含：
a)启动子序列，和
b)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下的表达导致易于检测的特征，和
c)用于插入DNA序列的一个或多个插入位点，优选限制性或重组位点，
ii)提供待评估其转录终止能力的一个或多个DNA序列，和
iii)以反向重复的形式将所述DNA序列的特定DNA序列的至少两个拷贝插入所述筛选构建体或筛选载体的所述插入位点，其中与无插入相比，将有效的转录终止子的反向重复插入所述插入位点允许附加序列通过所述启动子序列的表达，和
iv)将带有所述插入DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适于诱导从所述启动子序列表达的体外或体内转录系统，和
v)鉴定和/或选择与无插入相比具有所述易于检测特征的筛选构建体或筛选载体，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入的DNA序列用作转录终止序列，并(任选的)测定其序列。
在这种变通方案的优选实施方案中使用两种不同的启动子和两种不同的附加序列。这两种表达盒以“尾对尾”的取向排列，从而使由所述启动子起始的转录彼此相反。用于反向重复的插入位点优选在两个表达盒的两个末端(尾)之间。插入弱转录终止子的反向重复将导致两个附加序列的基因沉默，而插入有效的转录终止子导致两个附加序列的表达。因此可实行对转录终止效率的双检验。优选地，序列之一选自负选择标记(从而有效的转录终止子将引起如除草剂或抗生素抗性)。另一附加序列可以选自报道基因(例如GFP或GUS，从而有效的转录终止子将引起易于检测的颜色)。
1.3变通方案C：
在本发明第三个优选的实施方案中，插入位点还可以安排在附加序列内部(例如并优选嵌入位于所述附加序列中的内含子中)(下文称为“变通方案C”)。只有在插入所述插入位点的序列不控制严紧转录终止时才产生所述附加序列的全长转录物，所述附加序列的表达将引起所述易于检测特征的改变。在将有效的转录终止子插入所述插入位点的情况下不产生全长转录物。因此在本发明优选的实施方案中，用于鉴定和分离转录终止序列的方法包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其在5’至3’方向上包含：
a)启动子序列，和
b)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下的表达导致易于检测的特征，并向所述附加序列嵌入用于插入DNA序列的一个或多个插入位点(优选限制性或重组位点)，
其中与无插入相比，将有效的转录终止子插入所述插入位点抑制所述附加序列通过所述启动子序列的全长转录，和
ii)提供待评估其转录终止能力的一个或多个DNA序列，和
iii)将所述DNA序列的一个或多个拷贝插入所述筛选构建体或者筛选载体的所述插入位点中，和
iv)将带有所述插入的DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适于诱导从所述启动子序列表达的体外或体内转录系统，和
v)鉴定和/或选择与无插入相比具有改变的易于检测特征的筛选构建体或筛选载体，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入的DNA序列用作转录终止序列，并(任选的)测定其序列。
可以通过多种方法实现在附加序列内的定位。在本发明改进的实施方案中，用于转录终止子序列的插入位点位于包含于所述附加序列内的内含子中。有效的转录终止将导致内含子和附加序列的不完全转录，从而阻止由所述附加序列引起的表型的发生。待表达的附加序列可以是例如毒性基因(如白喉毒素A)或报道基因(如GFP)。下文给出了其他实例。在有效转录终止的情况下，没有建立与所述序列相对应的表型。在毒性基因的情况下，只能建立包含有效转录终止子序列的稳定转化的细胞系。在另一优选的实施方案中，用于转录终止序列的插入位点位于附加序列的第一个5’部分(编码如报道基因(如GFP))和3’部分之间，后者优选为在植物中没有同源序列的非蛋白编码序列(如以下实施例所使用的萤光素酶基因的部分或λ噬菌体的序列)。除了这种筛选构建体以外还使用了另一种表达盒，其表达对应于所述3’部分序列的反义RNA，或优选双链RNA序列。在有效转录终止子的情况下，附加序列的转录将在终止子位点停止，5’末端序列将不被翻译。在无效(渗漏)转录终止子的情况下，转录将连读至所述3’部分序列，从而建立反义或双链RNA的靶标。这会引起完整构建体(包括编码标记序列的区域)的降解，从而“沉默”相关表型(如标记信号)。
2.本发明的筛选构建体或筛选载体
用于本发明方法的筛选构建体或筛选载体可以为多种形式。原则上，允许RNA分子表达或转录的任何形式都是合适的。因此，筛选构建体或筛选载体可以是例如RNA或DNA分子，还可以是单链或双链的，可以是线性或环状的。前述备选方案的任何组合也包括在内。
筛选构建体可以有利地用于不需要复制的方案，例如下文所述的体外筛选系统。然而，优选使用筛选载体。所述筛选载体可以是RNA载体(如RNA病毒载体)或优选地DNA载体。更优选筛选载体为环状双链DNA质粒载体。
本发明筛选构建体或筛选载体的基本特征包括
a)启动子序列，和
b)在所述启动子序列下表达后引起易于检测特征的附加序列。
2.1本发明的启动子
选择的启动子优选在用于评估所述转录终止序列的体外或体内系统中具有功能。优选地，此系统与转录终止序列在其后的表达构建体中发挥功能的系统相似或相同。例如，如果希望将转录终止序列用于植物生物，则使用基于植物细胞的转录系统(体外系统如小麦胚提取物或体内系统如植物细胞或植物)。在这种情况下，启动子序列优选为能在植物中启动转录的序列，优选内源植物启动子或来自植物病原体(如植物病毒或农杆菌)的启动子。本领域技术人员已知用于本发明方法的多种转录系统或宿主的多种启动子。
作为说明，适于哺乳动物宿主的启动子(和必要时，其他转录和翻译调节信号)可来自病毒来源如腺病毒、牛乳头状瘤病毒、猿猴病毒等，其中调节信号与具有高表达水平的特定基因相连。合适的转录和翻译调节序列还可以得自哺乳动物基因，如肌动蛋白、胶原、肌球蛋白和金属硫蛋白基因。示例性真核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer 1982)、疱疹病毒TK启动子(McKnight 1982)、SV40早期启动子(Benoist 1981)、劳氏肉瘤病毒启动子(Gorman 1982)、巨细胞病毒启动子(Foeking 1980)和小鼠乳腺瘤病毒启动子(一般参阅Etcheverry 1996)。或者，如果原核聚合酶由真核启动子表达，则可以使用原核启动子如噬菌体T3 RNA聚合酶启动子来控制目的基因在哺乳动物中的表达(Zhou 1990；Kaufman 1991)。
在植物中的表达优选植物特异性启动子。原则上，术语“植物特异性启动子”应理解为能控制基因(特别是外源基因)在植物或植物部分、植物细胞、植物组织或植物培养物中表达的任何启动子。在此上下文中，表达可以是例如组成型、诱导型或发育依赖性的。以下为优选的：
a)组成型启动子
“组成型”启动子指确保在植物发育的显著阶段(优选植物发育的全部时间)中在大量(优选全部)组织中表达的启动子。尤其优选使用植物启动子或来源于植物病毒的启动子。特别优选CaMV(花椰菜花叶病毒)35S转录物的启动子(Franck 1980；Odell 1985；Shewmaker 1985；Gardner 1986)或19S CaMV启动子(US 5,352,605；WO 84/02913)。其他合适的组成型启动子为稻肌动蛋白启动子(McElroy 1990)、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基(SSU)启动子(US 4,962,028)、豆球蛋白B启动子(GenBank检索号X03677)、来自农杆菌的胭脂碱合酶启动子、TR双启动子、来自农杆菌的OCS(章鱼碱合酶)启动子、泛蛋白启动子(Holtorf S 1995)、泛蛋白1启动子(Christensen 1989，1992；Bruce等1989)、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US 5,683,439)、液泡ATP酶亚单位启动子、pEMU启动子(Last1991)、MAS启动子(Velten 1984)和玉米H3组蛋白启动子(Lepetit 1992；Atanassova 1992)、拟南芥腈水解酶-1基因启动子(GeneBank检索号U38846，核苷酸3862至5325或5342)或来自小麦的富含脯氨酸蛋白启动子(WO 91/13991)以及在植物中组成型表达的基因的启动子。
b)组织特异性或组织优选的启动子
其他优选的是对种子具有特异性的启动子，例如菜豆蛋白启动子(US5,504,200；Bustos等1989；Murai 1983；Sengupta-Gopalan 1985)、2S白蛋白基因启动子(Joseffson 1987)、豆球蛋白启动子(Shirsat 1989)、USP(未知种子蛋白质)启动子(Bumlein 1991a)、油菜籽蛋白基因启动子(US5,608,152；Stalberg 1996)、蔗糖结合蛋白启动子(WO 00/26388)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Bumlein(1991b)、拟南芥油质蛋白启动子(WO 98/45461)和芸苔Bce4启动子(WO 91/13980)。其他优选的是叶特异性和光诱导启动子，如来自cab或核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶的启动子(Simpson 1985；Timko 1985)、花药特异性启动子，如来自LAT52的启动子(Twell 1989b)、花粉特异性启动子如来自ZmI3的启动子(Guerrero等(1993)MoI GenGenet 224：161-168)和小孢子优选的启动子，如来自apg的启动子(Twell等1983)。
c)化学诱导型启动子
表达盒还可以含有化学诱导型启动子(综述文章：Gatz 1997)，通过这种手段可以在特定的时间点控制外源基因在植物中的表达。类似的可以使用如PRP1启动子(Ward 1993)、水杨酸诱导型启动子(WO 95/19443)、苯磺酰胺诱导型启动子(EP 0 388 186)、四环素诱导型启动子(Gaz 1991，1992)、脱落酸诱导型启动子(EP-A1 0 335 528)或乙醇-环己酮诱导型启动子(WO 93/21334)等启动子。谷胱甘肽-S转移酶同工型II基因的启动子(GST-II-27)也是合适的，它被内源应用的安全剂如N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺(WO 93/01294)激活，并在单子叶植物和双子叶植物的多种组织中有效。本发明可使用的其他示例性诱导型启动子包括来自应答于铜的ACE1系统的启动子(Mett 1993)或来自玉米的应答于苯磺酰胺除草剂安全剂的In2启动子(Hershey 1991；Gatz 1994)。可以使用应答于植物通常不应答的诱导剂的启动子。示例性诱导型启动子为来自胆固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性被糖皮质激素诱导(Schena 1991)。
特别优选的是组成型启动子。另外，可以将其他启动子与待表达的核酸序列有效连接，所述启动子使在其他植物组织或其他生物(如大肠杆菌)中的表达成为可能。原则上，合适的植物启动子是所有上述启动子。
2.2本发明的附加序列
在所述启动子序列下表达后产生易于检测特征的“附加序列”可以选自多种序列。选择可取决于多种因素，例如，在所述插入位点插入有效的转录终止子是否预期导致降低的表达(变通方案A或C)或提高的表达(变通方案B)或附加序列为其功能性形式(即产生易于检测特征的形式)。
对于预期降低的表达(变通方案A和C)，优选使用编码选自报道基因、反选择标记或毒性基因的选择标记的序列。在本发明体内筛选系统的优选实施方案中，作为附加序列的毒性基因的表达将引起对所述细胞或生物(如植物细胞或植物)生长、繁殖和/或再生的抑制。因此，只有将有效(“严紧”)转录终止序列插入引起所述毒性表型的序列之间从而阻止表达抑制生长、繁殖和/或再生的序列时，细胞或生物才能存活。可以分离存活细胞并鉴定和分离转录终止序列，例如使用PCR扩增并其后测序。
对于预期提高的表达(变通方案B)，优选使用编码选自报道基因、负选择标记或正选择标记的选择标记的序列。
术语“选择标记”指任何核酸或氨基酸序列，其可用于从不包含所述选择标记的细胞或生物中选择和分离包含所述选择标记的细胞和生物。选择标记可以包括以下序列：
i)通过赋予对毒性化合物的抗性而允许分离包含所述标记的细胞或生物(本文称为“负选择标记”)，
ii)通过赋予包含所述选择标记的细胞或生物生长优势而允许分离所述细胞或生物(本文称为“正选择标记”)。
选择标记还可以包括通过赋予包含所述选择标记的细胞或生物生长劣势而允许分离不包含所述选择标记的细胞或生物的序列(本文称为“反选择标记”或“毒性基因”)。
选择标记可以编码活性，例如但不仅限于RNA、肽或蛋白质的产生，或者可以提供RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物等的结合位点。选择标记的实例包括但不仅限于：
(a)DNA区段，其编码在受体细胞或生物中提供对毒性化合物(如抗生素)的抗性的产物(“负选择标记”)。负选择标记赋予对杀生物化合物如代谢抑制剂(如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸，WO 98/45456)、抗生素(如卡那霉素、G 418、博来霉素或潮霉素)或除草剂(如膦丝菌素或草甘膦)的抗性。特别优选的负选择标记为赋予对除草剂的抗性的选择标记。可以提到的实例为：
-膦丝菌素乙酰转移酶(PAT；也称为Bialophos抗性；bar；de Block1987；EP 0 333 033；US 4,975,374)；
-赋予对Glyphosate(N-(膦酰甲基)甘氨酸)的抗性的5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Shah 1986)；
-Glyphosate降解酶(Glyphosate氧化还原酶；gox)；
-Dalapon失活脱卤素酶(deh)；
-失活磺酰脲和咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶(例如带有如S4和/或Hra突变的突变ALS变体)；
-降解Bromoxynil的腈水解酶(bxn)；
-编码如新霉素磷酸转移酶的卡那霉素或G418抗性基因(NPTII；NPTI)(Fraley等1983)；
-赋予对2-脱氧葡萄糖的抗性的2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶(DoGR1基因产物；WO 98/45456；EP 0 807 836)(Ran-dez-Gil等1995)；
-介导对潮霉素的抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)(Vanden Elzen等1985)；
-二氢叶酸还原酶(Eichholtz等1987)。
赋予对抗生素抗性的细菌来源的其他负选择标记包括赋予对抗生素大观霉素抗性的aadA基因、庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶(SPT)、氨基葡糖苷-3-腺嘌呤转移酶和博来霉素抗性决定子(Hayford 1988；Jones1987；Svab 1990；HiIIe 1986)。
特别优选的是赋予对D-氨基酸(如D-丙氨酸和D-丝氨酸)产生的毒效应的抗性的负选择标记(WO 03/060133；Erikson 2004)。在此上下文中特别优选的负选择标记为来自酵母Rhodotorula gracilis(Rhodosporidiumtoruloides)的daoI基因(EC：1.4.3.3：GenBank检索号：U60066)和大肠杆菌基因dsdA(D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)(EC：4.3.1.18；GenBank检索号：J01603))。
适于原核或非植物真核系统的选择标记也可以基于上述用于植物的选择标记(除了表达盒基于其他宿主特异性启动子)。就哺乳动物细胞而言，优选针对新霉素(G418)、潮霉素、博来霉素、Zeocin(Gatignol 1987；Drocourt 1990)、嘌呤霉素(参阅如Kaufman 1990a，1990b)的抗性。相应的选择标记基因为本领域已知(参阅如Srivastava 1991；Romanos 1995；Markie 1996；Pfeifer 1997；Tucker 1997；Hashida-Okado 1998)。就原核生物而言，优选针对氨苄青霉素、卡那霉素、大观霉素或四环素的抗性。可以使用已公开的核苷酸序列克隆或合成选择标记基因，或者可以商业购买标记基因。
(b)编码在受体细胞或生物中具有毒性的产物的DNA区段(“反选择标记”)。反选择标记特别适用于选择确定缺失本来含有所述标记的生物(Koprek 1999)。反选择标记的实例包括胸苷激酶(TK)、胞嘧啶脱氨酶(Gleave 1999；Perera 1993；Stougaard 1993)、细胞色素P450蛋白(Koprek1999)、卤代烷脱卤素酶(Naested 1999)、iaaH基因产物(Sundaresan 1995)、胞嘧啶脱氨酶codA(Schlaman & Hooykaas 1997)或tms2基因产物(Fedoroff & Smith 1993)。本发明范围内的术语“反选择标记”一般应以广义理解，包括所有以下蛋白质：
i)本身对细胞或生物(如植物细胞)产生毒效应，或
ii)将无毒化合物X转化成有毒化合物Y。
本文使用的术语“无毒化合物X”旨在指在否则相同条件下(即除了化合物X和Y不同外，条件相同)与其转化产物Y相比显示降低(优选没有)的生物活性(优选毒性)的化合物。优选化合物Y的毒性为相应化合物X毒性的至少2倍，优选至少5倍，更优选至少10倍，最优选至少100倍。可以通过多种机制实现从X到Y的转化，包括但不仅限于水解、脱氨、皂化、去磷酸化、磷酸化、氧化或其他方式的活化、代谢或转化。化合物X可以是例如植物生长添加剂或除草剂的无活性前体。本文使用的“毒性”或“毒效应”指对细胞或生物生理的可测量的不利效应，可包括但不仅限于降低或受损的生长、降低或受损的光合作用、降低或受损的细胞分裂、降低或受损的再生或增殖等症状。
反选择标记可以是内源基因或异源基因或来自另一生物的转基因。以下反选择标记用于示例：
1.胞嘧啶脱氨酶(CodA或CDase)，其中使用如5-氟胞嘧啶(5-FC)等化合物作为无毒化合物X。胞嘧啶脱氨酶催化从胞嘧啶脱氨成尿嘧啶(Kilstrup 1989；Anderson 1989)。5-FC转化成有毒代谢物(“Y”)5-氟尿嘧啶(5-FU)(Polak 1975)。5-FC具有低毒性Toxizitt(Bennett 1990)。相反，5-FU显示出抑制RNA和DNA合成的强细胞毒性效应(Calabrisi 1990；Damon 1989)。
植物和高等哺乳动物的细胞不表现显著的CDase活性，不能使5-FC脱氨(Polak 1976；Koechlin 1966)。在本发明的上下文中，将CDase作为转基因引入靶细胞。可以在筛选前完成引入(如产生稳定转化的细胞系或生物)。接着可以使用这些细胞或生物作为主细胞系或主生物。
包含所述序列的相应CDase序列、转基因生物(包括植物)以及基于如用5-FC(作为无毒底物X)处理这些细胞或生物的负选择方案为本领域已知(WO 93/01281；US 5,358,866；Gleave 1999；Perera 1993；Stougaard 1993；EP-A1 595 837；Mullen 1992；Kobayashi 1995；Schlaman 1997；XiaohuiWang 2001；Koprek 1999；Gallego 1999；Salomon 1998；Thykjaer 1997；Serino 1997；Risseeuw 1997；Blanc 1996；Corneille 2001)。胞嘧啶脱氨酶和编码它的基因可分离自多种生物，优选微生物例如新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、白假丝酵母(Candida albicans)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)、申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、曲霉、分支孢子菌属和瓶霉属(Bennett 1990)和细菌如大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(Andersen 1989)。所有这些本文所述的参考文献、序列和方法明确引入为参考。特别优选GenBank检索号：S56903所述序列和经修饰以允许在真核生物中表达的EP-A1 595 873所述修饰序列。
2.细胞色素P-450酶，特别是来自浅灰链霉菌(Streptomycesgriseolus)(菌株ATCC 11796)的细菌细胞色素P-450 SU1基因产物(CYP105A1)，其中使用如磺酰脲原除草剂R7402(2-甲基乙基-2-3-二氢-N-[(4，6-二甲氧基嘧啶-2-基)氨基羰基]-1，2-苯并异噻唑-7-磺酰胺-1，1-二氧化物)作为无毒物质X。本领域已描述了相应序列和使用如R7402的负选择方案(O′Keefe 1994；Tissier 1999；Koprek 1999；O′Keefe 1991)。所有这些本文所述的参考文献、序列和方法明确引入为参考。特别优选GenBank检索号：M32238所述的序列。
3.吲哚乙酸水解酶，如来自根癌农杆菌的tms2基因产物，其中使用auxinamide化合物或萘乙酰胺(NAM)等物质作为无毒化合物X(NAM转化成植物毒性化合物萘乙酸)。本领域已描述了相应的序列和负选择方案(使用NAM作为无毒化合物X)的实现(Fedoroff 1993；Upadhyaya 2000；Depicker 1988；Karlin-Neumannn 1991；Sundaresan 1995；Cecchini 1998；Zubko 2000)。所有这些本文所述的参考文献、序列和方法明确引入为参考。特别优选GenBank检索号：NC_003308(Protein_id＝″NP_536128.1)、AE009419、AB016260(Protein_id＝″BAA87807.1)和NC002147所述的序列。
4.来自如Xanthobacter autotropicus GJ10的卤代烷脱卤素酶(dhlA基因产物)。这种脱卤素酶将二卤代烷如1，2-二氯乙烷(DCE)水解成卤代醇和无机卤化物(Naested 1999；Janssen 1994；Janssen 1989)。所有这些本文所述的参考文献、序列和方法明确引入为参考。特别优选GenBank检索号：M26950所述的序列。
5.胸苷激酶(TK)，特别是来自病毒如单纯疱疹病毒、SV40、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒的病毒TK，特别优选来自I型单纯疱疹病毒的TK(TK HSV-1)，其中使用如阿昔洛韦、更昔洛韦或1，2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖-5-碘尿嘧啶(FIAU)等物质作为无毒化合物X。相应的化合物和负选择方案(例如使用阿昔洛韦、更昔洛韦或FIAU)的实现为本领域已知(Czako 1994；Wigler 1977；McKnight 1980；McKnight 1980；Preston 1981；Wagner 1981；St.Clair 1987)。所有这些本文所述的参考文献、序列和方法明确引入为参考。特别优选GenBank检索号：J02224、V00470和V00467所述序列。
6.鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶或叶黄素鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶，其中使用如6-硫代叶黄素或别嘌呤醇作为无毒物质X。优选来自如大肠杆菌的鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)(Besnard1987；Mzoz 1993；Ono 1997)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT；Jolly1983；Fenwick 1985)、叶黄素鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(如来自鼠弓形体(Toxoplasma gondii)，Knoll 1998；Donald 1996)。所有这些本文所述的参考文献、序列和方法明确引入为参考。特别优选GenBank检索号：U10247(鼠弓形体HXGPRT)、M13422(大肠杆菌gpt)和X00221(大肠杆菌gpt)所述的序列。
7.来自如大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，DeoD基因产物)，其中使用如6-甲基嘌呤脱氧核糖核苷等化合物作为无毒化合物X。合适的化合物和实施反选择方案(如使用6-甲基嘌呤脱氧核糖核苷等化合物作为无毒化合物X)的方法为本领域技术人员所熟知(Sorscher 1994)。所有这些本文所述的参考文献、序列和方法明确引入为参考。特别优选GenBank检索号：M60917所述的序列。
8.膦酸单酯水解酶，其适于将例如除草剂草甘膦的无生理活性酯衍生物(如草甘膦甘油酯)转化成除草剂的活性形式。合适的化合物和实施反选择方案(如使用草甘膦甘油酯作为无毒化合物X)的方法为本领域技术人员所熟知(US 5,254,801；Dotson 1996；Dotson 1996)。所有这些本文所述的参考文献、序列和方法明确引入为参考。特别优选GenBank检索号：U44852所述的序列。
9.Aux-1、优选Aux-2基因产物，如来自农杆菌菌株Ti质粒的aus(Beclin 1993；Gaudin 1995)。两种酶的活性导致在植物细胞中产生吲哚乙酰胺(IAA)。Aux-1编码将色氨酸转化成吲哚乙酰胺的吲哚乙酰胺合酶(IAMS)(VanOnckelen 1986)。Aux-2编码将吲哚乙酰胺(不具有植物激素活性的化合物)转化成活性生长素吲哚乙酸的吲哚乙酰胺水解酶(IAMH)(Inze1984；Tomashow 1984；Schroder 1984)。IAMH还能转化多种吲哚酰胺型底物，如萘乙酰胺，其转化成植物生长调节剂萘乙酸(NAA)。IAMH作为反选择标记的用途描述于例如US 5,180,873。还描述了发根农杆菌(A.rhizogenes)、葡萄农杆菌(A.vitis)(Canaday 1992)和萨氏假单胞菌(Pseudomonas savastanoi)(Yamada 1985)相应的酶。还描述了作为选择性杀死某些植物组织(如花粉；US 5,426,041)或转基因植物(US 5,180,873)的反选择标记的用途。用于反选择(如通过使用萘乙酰胺)的化合物和方法为本领域技术人员已知(见上文)。所有这些本文所述的参考文献、序列和方法明确引入为参考。特别优选GenBank检索号：M61151、AF039169和AB025110所述的序列。
10.腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)，其中使用如4-氨基吡唑并嘧啶作为无毒化合物X。用于实施反选择方案的适当化合物和方法为本领域技术人员所熟知(Wigler 1979；Taylor 1985)。所有这些本文所述的参考文献、序列和方法明确引入为参考。
11.Methoxinin脱氢酶，其中使用如2-氨基-4-甲氧基-丁酸(Methoxinin)作为无毒化合物X，其转化成毒性化合物甲氧基乙烯基甘氨酸(Margraff 1980)。
12.根瘤菌毒素(rhizobitoxine)合酶，其中使用2-氨基-4-甲氧基-丁酸(Methoxinin)作为无毒化合物X，其转化成2-氨基-4-[2-氨基-3-羟丙基]-反-3-丁酸(Rhizobitoxin)(Owens 1973)。
13.5-甲硫基核糖(MTR)激酶，其中使用如5-三氟甲硫基核糖(MTR-类似物，“破坏性底物”)作为无毒化合物X，其转化成毒性化合物Y二氟硫代羰酸(carbothionyldifluoride)。MTR激酶是甲硫氨酸补救途径的关键酶。在植物、细菌和原生生物中描述了相应的酶活性，但哺乳动物中则没有。可以根据确定的序列基序鉴定来自多个物种的MTR激酶(Sekowska2001；http://www.biomedcentral.com/1471-2180/1/15)。用于反选择的相应序列和方法(例如使用5-三氟甲硫基核糖)为本领域技术人员已知，并可便利地得自序列数据库(如Sekowska 2001；Cornell 1996)。所有这些本文所述的参考文献、序列和方法明确引入为参考。特别优选GenBank检索号：AF212863或AC079674所述序列以及本文引入为参考的WO 03/078629和DE 10212892中所述的其他MTK激酶。
14.醇脱氢酶(Adh)，特别是植物Adh-1基因产物，其中使用如转化成毒性化合物(Y)丙烯醛的优选化合物如烯丙醇作为无毒化合物X。用于实施反选择方案的合适的相应化合物和方法(如使用烯丙醇)为本领域技术人员所熟知(Wisman 1991；Jacobs 1988；Schwartz 1981)。序列可以便利地来自序列数据库。所有这些本文所述的参考文献、序列和方法明确引入为参考。特别优选GenBank检索号：X77943、M12196、AF172282、X04049或AF253472所述的序列。
15.其他优选作为反选择标记的是本身在表达所述基因或序列的细胞中表现毒性效应的“毒性基因”或“毒性序列”。实例可以包括但不仅限于编码例如以下毒性蛋白质的序列：白喉毒素A、核糖核酸酶(RNAse例如，Barnase)、核糖体抑制蛋白(RIP，如蓖麻蛋白)、爪蟾抗菌肽、DNAse、植物毒素、能引发超敏反应的蛋白质，和蛋白酶。当同时表达病原体来源的引发剂蛋白和相应的植物来源受体蛋白时可能引发超敏反应(HR)。这些相应引发剂/受体基因对及其在转基因植物中引发HR的可用性为本领域已知，例如黄枝孢(Cladosporium fulvum)的avr-基因和番茄Cf-基因(WO91/15585)或丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的avr-基因和拟南芥RPM1基因(Grant 1995)。
其他毒性序列是抑制必需内源基因(如持家基因)的序列。本领域技术人员了解可用于抑制(“沉默”)内源基因的基因表达的多种序列和方法。涉及基因、其基因产物或所述基因产物的活性时，术语“抑制”或“沉默”应以广义理解，包括在多种表达水平使功能性受损或降低的多种机制。包括如将转录和翻译定量降低至基本完全缺乏转录和/或翻译产物(即通过使用如RNA或蛋白质印迹分析、PCR等检测方法的不可检测到)。基因沉默的合适方法可包括但不仅限于通过以下实现基因沉默：
(i)反义抑制(细节见上文)，
(ii)正义抑制(共抑制)(细节见上文)，
(iii)双链RNA干扰(细节见上文)，
(iv)表达针对内源RNA转录物的核酶(细节见上文)，
(v)表达蛋白质或DNA结合因子：还可以通过表达某些DNA或蛋白质结合因子来“沉默”内源基因的表达，所述DNA或蛋白质结合因子干扰基因产物的基因的表达或活性。例如锌指型人工转录因子可适用于任何靶序列，并因而可用于基因沉默(例如通过导向靶基因的启动子区)。已描述了产生这些因子的方法(Dreier 2001；Dreier 2000；Beerli 2000a，2000b；Segal 2000；Kang 2000；Beerli 1998；Kim 1997；Klug 1999；Tsai1998；Mapp 2000；Sharrocks 1997；Zhang 2000)。另外还可以使用(通过与得到的蛋白质相互作用)直接抑制基因产物的因子。这些蛋白质结合因子可以是例如适体(Famulok 1999)、抗体、抗体片段或单链抗体。已经描述了它们的产生(Owen 1992；Franken 1997；Whitelam 1996)。
(vi)介导基因沉默的病毒表达系统：还可以使用特定的病毒表达系统介导内源基因的基因沉默(Amplikon；Angell 1999)。这些系统和方法(称为“VIGS”，病毒诱导的基因沉默)介导与来自病毒载体系统的内源基因相似的序列的表达。通过将表达划分为“病毒的”，整个表达(包括同源内源基因的表达)被植物病毒防御机制关闭。本领域已经描述了相应方法(Ratcliff 2001；Fagard 2000；Anandalakshmi 1998；Ruiz 1998)。适于作为本发明方法的靶标的必需内源基因可以为例如选自编码细胞成活力必需的酶的基因。这些所称作的“持家基因”可以例如选自编码如ATP合酶、细胞色素C、丙酮酸激酶、氨酰基转移酶或磷酸、2-、3-羧酸和2-氧代-戊二酸易位蛋白的基因。为举例之用，表1给出了靶标酶列表，但本发明不仅限于此表中提到的酶。更多详细列表可汇集自如《Biochemistry of Plants》(Stumpf & Conn编辑，1988-1991，第1-16卷Academic Press)或《Encyclopedia of Plant Physiology》(New Series，1976，Springer-Verlag，Berlin)等。
表1：靶标酶的实例
酶
ATP合酶(线粒体)
腺嘌呤核苷酸易位蛋白(线粒体)
磷酸易位蛋白(线粒体)
三羧酸易位蛋白(线粒体)
二羧酸易位蛋白(线粒体)
2-氧代-戊二酸易位蛋白(线粒体)
细胞色素C(线粒体)
丙酮酸激酶
甘油醛-3磷酸脱氢酶
NADPH-细胞色素P450还原酶
脂肪酸合酶复合体
甘油-3磷酸酰基转移酶
羟基甲基戊二酰辅酶A还原酶
氨酰基转移酶
转录因子
延伸因子
八氢番茄红素去饱和酶
硝酸还原酶
对羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)
转酮酶(优选EP-A1 723 017中描述并要求保护的酶)
铁氧还蛋白氧化还原酶(优选EP-A1 1 333 098中描述并要求保护的酶)
S-腺苷甲硫氨酸：Mg-原卟啉-IX-O-甲基转移酶(优选EP-A1 1 198 578中描述并要求保护的酶)
Dihydrorotase(EC 3.5.2.3)(优选EP-A1 1 210 437中描述并要求保护的酶)
磷酸核糖焦磷酸合酶(优选EP-A1 1 294 925中描述并要求保护的酶)
天冬氨酸氨甲酰转移酶(优选EP-A1 1 259 623中描述并要求保护的酶)
Dehydrochinate脱水酶/莽草酸脱氢酶(优选EP-A1 1 315 808中描述并要求保护的酶)
由于持家基因一般高度保守，可以使用来自其他(植物)物种的异源探针从待产生抗性的物种中分离相应基因。参考本发明的教导，本领域技术人员能够不需要过度实验就可以分离这些基因。
(c)编码通过提高或改善的再生、生长、繁殖、增殖而赋予受体细胞或生物优势的产物的DNA区段(“正选择标记”)。如来自根癌农杆菌(菌株：PO22；Genbank检索号：AB025109)的异戊烯基转移酶(细胞分裂素生物合成的关键酶)等基因可促进转化植物的再生(如通过在无细胞分裂素的培养基上选择)。已经描述了相应的选择方法(Ebinuma等2000a，2000b)。赋予转化植物与未转化植物相比的生长优势的其他正选择标记描述于例如EP-A 0 601 092。生长刺激选择标记可包括(但不仅限于)β-葡糖醛酸糖苷酶(与例如细胞分裂素葡糖苷酸组合)、甘露糖-6-磷酸异构酶(与甘露糖组合)、UDP-半乳糖-4-表异构酶(与例如半乳糖组合)，其中优选甘露糖-6-磷酸异构酶与甘露糖的组合。
(d)编码易于鉴定的产物的DNA区段(“报道基因”或“报道蛋白”或“报道分子”，如表型标记如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)和细胞表面蛋白)。术语“报道基因”、“报道蛋白”或“报道分子”旨在指任何易于定量的蛋白质(或其编码序列)，其通过如颜色或酶活性使得可以评估所述蛋白质的存在或所述报道基因的表达。报道基因编码易于定量的蛋白质，并通过其颜色或酶活性使得可以评估转化效率、表达位置或表达时间。在此上下文中非常特别优选编码如以下报道蛋白质(Schenborn 1999)的基因：绿色荧光蛋白(GFP)(Sheen 1995；Haseloff 1997；Reichel 1996；Tian1997；WO 97/41228；Chui 1996；Leffel 1997)、NAN报道基因(Kavanagh2002；WO 03/052104)、氯霉素转移酶、萤光素酶(Ow 1986；Millar 1992)、水母发光蛋白基因(Prasher 1985)、β-半乳糖苷酶、R基因座基因(编码在植物组织中调节花青苷色素的产生(红色)的蛋白质，从而使得可以不加入其他辅助物质或显色底物而直接分析启动子活性)(Dellaporta 1988；Ludwig 1990)，非常特别优选β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(Jefferson 1987b；1987a)。通过将组织与5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸温育后的蓝色来检测β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的表达；通过光发射检测细菌萤光素酶(LUX)的表达；通过与萤光素温育后的光发射检测萤火虫萤光素酶(LUC)的表达；通过用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳吡喃糖苷染色组织后的亮蓝色来检测半乳糖苷酶的表达。报道基因还可以用作可评分标记而作为抗生素抗性标记的替代。这些标记用于检测转移的基因的存在或测量其表达水平。只有在细胞的修饰效率高时，在植物中使用可评分标记鉴定或标记遗传修饰的细胞才能良好工作。
(e)编码在受体细胞中抑制细胞功能的产物的DNA区段；
(f)抑制上文(a)-(e)中任一DNA区段的活性的DNA区段；
(g)与修饰底物的产物(如限制性内切核酸酶)结合的DNA区段；
(h)编码可被蛋白质、RNA、DNA或化学品识别的特定核苷酸识别序列的DNA区段；
(i)在缺失或不存在时在受体细胞中直接或间接赋予对特定化合物的细胞杀伤的抗性或敏感性的DNA区段；
(j)编码在受体细胞中抑制基因产物活性的产物的DNA区段；
(k)编码在受体细胞中本来缺乏的产物的DNA区段(如tRNA基因、营养缺陷型标记)，和；
(l)可用于分离或鉴定目的分子的DNA区段(如特异性蛋白质结合位点)。
在本发明优选的实施方案中，在有效的转录终止子引起附加序列表达降低的情况下(特别是方法A，其中将转录终止子插入所述附加序列和启动子之间)，所述附加序列可以是已知转录终止子序列(如nos终止子)的反向重复，所述转录终止子序列以使其中第二个拷贝(位于启动子更下游的拷贝)为其“正常”取向(组成功能性转录终止子)的方式定位。必须注意，这种反向重复转录终止子的降低表达引起位于插入位点上游的序列的提高的表达(或较不沉默的表达)。在这些序列编码例如标记的情况下，可以观察到提高的抗性或信号。
优选地，这种转录终止子(下文的“第二个转录终止子”)与待评估其转录终止效率的序列不同。在这种情况下，优选使用其他序列，所述序列优选位于启动子和插入位点之间，并编码如选择标记或报道基因。在这种方案中，有效的转录终止序列会停止转录，并不引起所述第二个转录终止子的反向重复的转录。因此，启动子和插入位点之间的序列将发生正常表达(引起表达选择标记或报道基因)。在插入位点插入的序列不是有效转录终止子的情况下，转录将连读至所述第二个转录终止子的反向重复。这样的构建体将通过dsRNAi导致其自身基因的沉默。因此启动子和插入位点之间的序列不发生表达(使选择标记或报道基因的表达沉默)。已经描述了基于转录终止子(如NOS终止子)的反向重复序列的自身作用基因沉默(Brummell 2003)。
2.3筛选构建体或筛选载体的其他元件
除了启动子和附加序列以外，筛选构建体或筛选载体还可以包含其他元件(如遗传控制序列)。术语“遗传控制序列”应以广义理解，指对本发明的筛选构建体或筛选载体的实现或功能有影响的所有序列。例如，遗传控制序列在原核或真核生物中修饰转录和翻译。遗传控制序列还包括基因的5’非翻译区、内含子或非编码3’区，例如肌动蛋白-1内含子或Adh1-S内含子1、2和6(一般参考《The Maize Handbook》，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，New York(1994))。已经证明它们在基因表达的调节中可能发挥重要作用。因此，已经证明5’非翻译序列可增强异源基因的瞬时表达。可提到的翻译增强子的实例为烟草花叶病毒5’前导序列(Gallie，1987)等。此外，它们可促进组织特异性(Rouster，1998)。
筛选构建体或筛选载体还可以有利地包含一个或多个与启动子有效连接的增强子序列，它使核酸序列的重组表达提高。还可以在待重组表达的核酸序列的3’末端插入额外有利的序列，如其他调节元件或其他转录终止序列。
在本发明的一些实施方案(例如变通方案A或C)中，筛选构建体或筛选载体中还可以包含已知的转录终止序列(优选在附加序列之后)和任选地多腺苷酸化信号序列。适合作为控制序列的多腺苷酸化信号为植物多腺苷酸化信号，优选与来自根癌农杆菌T-DNA多腺苷酸化信号基本对应的多腺苷酸化信号，尤其是OCS(章鱼碱合酶)终止子和NOS(胭脂碱合酶)终止子。表达载体不必须含有转录终止和多腺苷酸化信号序列，因为这些元件可以由克隆的基因或基因片段提供。
本发明的筛选构建体或筛选载体还可以包含其他功能性元件。术语功能性元件应以广义理解，指对本发明筛选构建体或筛选载体的产生、扩增或功能有影响的所有元件。功能性元件可以包括例如(但不仅限于)选择标记基因(包括负、正和反选择标记，细节见上文)、报道基因以及
1)复制起点，其确保本发明的表达盒或载体在例如大肠杆菌中扩增。可以提到的实例为ORI(DNA复制起点)、pBR322 ori或P15A ori(Maniatis1989)。用于在大肠杆菌中具有功能性的复制系统的其他实例为ColE1、pSC101、pACYC184等。作为大肠杆菌复制系统的补充或替代，可以使用宽宿主范围复制系统，如P-1不相容质粒(如pRK290)的复制系统。这些质粒特别有效的与有甲或卸甲Ti质粒一起将T-DNA转移到植物物种宿主。表达载体还可以包含SV40起点。此元件可用于在表达SV40大T抗原的细胞系中进行附加型复制和挽救。
2)农杆菌介导的转化所必需的元件，例如T-DNA的右和/或(任选的)左边界或vir区。
3)克隆位点：克隆位点可以优选是多克隆位点。任何多克隆位点都可以使用，并可通过商业途径获得。
4)S/MAR(支架/基质附着区)。基质附着区(MAR)有效定义为在体外与核基质(核支架蛋白)特异性结合的DNA元件，已经提出其在体内介导染色质对核支架的附着。它们还可能在体内介导染色质与核支架的结合并改变间期核中基因组的拓扑学。当MAR位于转基因的任一侧时，其存在通常引起转基因生物(特别是植物)或细胞系中更高、更稳定的表达，最可能是通过使基因沉默最小化(综述：Allen 2003)。已经描述了多种S/MARS序列及其对基因表达的影响(Sidorenko 2003；Allen 1996；Villemure 2001；Mlynarova 2002)。可以优选使用S/MAR元件减少非故意的基因沉默(Mlynarova 2003)。S/MAR的实例为鸡溶菌酶A元件(Stief 1989)。
5)进一步修饰转录、翻译和/或表达的蛋白质的转运的序列。例如表达的蛋白质可以是包含分泌信号序列的嵌合蛋白。分泌信号序列与目的基因有效连接，以使两个序列在正确的读码框中连接并定位，以指导新合成的目的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列一般位于编码目的氨基酸序列的核苷酸序列的5’，尽管某些分泌信号序列可能位于目的核苷酸序列的其他位置(US 5,037,743，US 5,143,830)。表达载体还可以包含编码辅助纯化目的多肽的肽标签的核苷酸序列。可用于分离重组多肽的肽标签包括聚组氨酸标签(对镍螯合树脂具有亲和力)、c-myc标签、钙调素结合蛋白(用钙调素亲和层析分离)、物质P、RYIRS标签(与抗RYIRS抗体结合)、Glu-Glu标签和FLAG标签(与抗FLAG抗体结合，参阅如Luo 1996；Morganti 1996和Zheng 1997)。编码这些肽标签的核酸分子可来自例如Sigma-Aldrich Corporation(St.Louis，Mo.)。
本文公开和要求保护的所有组合物和方法都可以按照本发明的公开内容无需过度实验就可以产生和执行。尽管在优选实施方案中已经描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员而言显而易见的是，可以对本文所述的组合物、方法和方法的步骤或步骤的顺序应用多种改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体的，显然可以用在化学和生理上都相关的某些物质代替本文所述的物质而得到相同或相似的结果。对本领域技术人员而言显而易见的这些类似的替换和修饰都认为是在如附带的权利要求书所定义的本发明精神、范围和概念内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请都为其所有目的引入本文作为参考。
2.4本发明的合适载体
涉及从一个细胞转移DNA区段至另一细胞的核酸分子时，本文使用的术语“载体”和“运载体”可互换使用。本文使用的术语“筛选载体”指重组DNA分子，其至少包含所述启动子的上文定义的元件和发挥评估插入序列的转录终止效率的功能的附加序列。
本发明的方法不受限于本文公开的载体。能够表达核酸序列并优选地将目的核酸序列引入细胞(如植物细胞)的任何载体都考虑在本发明的范围内。载体一般包含与允许将载体克隆进细菌或噬菌体宿主的元件组合的上文定义的本发明必要元件。载体优选(但不必须)含有在宽范围的原核宿主中具有功能性的复制起点。一般(但不必须)包括选择标记以允许选择带有目的载体的细胞。载体的实例可以是质粒、粘粒、噬菌体、病毒或农杆菌。下文给出了用于个体转化技术的更具体的实例。
优选可以使表达构建体可能稳定整合进宿主基因组的载体。在将DNA注射或电穿孔进细胞(如植物细胞)的情况下，对质粒没有任何特别的要求。可以使用简单质粒，如pUC系列。如果需要从转化细胞再生完整植物，则在质粒中需要存在额外的选择标记基因。有多种可能的质粒载体可供将外源基因引入植物中，这些载体通常含有用于在大肠杆菌中增殖的复制起点和用于选择转化细菌的标记基因。实例为pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。
用于本发明的优选载体包括原核载体、真核载体或可以在多种原核和/或真核系统间穿梭的载体(如穿梭载体)。优选的真核载体包括可以在酵母细胞、植物细胞、鱼细胞、真核细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞中复制的载体。优选的原核载体包括在革兰氏阴性和/或革兰氏阳性菌中复制的载体，更优选在埃希氏菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、链霉菌、农杆菌、根瘤菌或假单胞菌属细菌中复制的载体。更优选在大肠杆菌和农杆菌中都能复制的载体。用于本发明的真核载体包括在酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞(特别是人细胞)、真菌细胞、昆虫细胞、鱼细胞等中增殖和/或复制的载体。重要的具体载体包括但不仅限于克隆载体、测序载体、表达载体、融合载体、双杂交载体、基因治疗载体和反向双杂交载体。取决于具体的载体，这些载体可用于原核和/或真核系统中。
按照本发明可以使用任何载体构建本发明的筛选载体。具体的，可以按照本发明改造本领域已知的载体和市售的载体(及其变体或衍生物)以包含用于本发明方法的一个或多个重组位点。这些载体可得自如Invitrogen、Vector Laboratories Inc.、Invitrogen、Promega、Novagen、NEB、Clontech、Boehringer Mannheim、Pharmacia、EpiCenter、OriGenes TechnologiesInc.、Stratagene、PerkinElmer、Pharmingen、Life Technologies，Inc.和Research Genetics。其后可以将这些载体用于克隆或亚克隆目的核酸分子。特别重要的载体一般类别包括原核和/或真核克隆载体、表达载体、融合载体、双杂交或反向双杂交载体、用于不同宿主的穿梭载体、诱变载体、转录载体、用于接受大插入片段的载体等。
其他重要的载体包括病毒来源的载体(M13载体、入噬菌体载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体)、高、低和可调拷贝数载体、具有在单一宿主中组合使用的兼容复制子的载体(pACYC184和pBR322)和真核附加型复制载体(pCDM8)。
特别重要的载体包括原核表达载体如pcDNA II、pSL301、pSE280、pSE380、pSE420、pTrcHisA、B和C、pRSET A、B和C(InVitrogen，Inc.)、pGEMEX-1和pGEMEX-2(Promega，Inc.)、pET载体(Novagen，Inc.)、pTrc99A、pKK223-3、pGEX载体、pEZZ18、pRIT2T和pMC1871(Pharmacia，Inc.)、pKK233-2和pKK388-1(Clontech，Inc.)和pProEx-HT(Life Technologies，Inc.)及其变体和衍生物。还可以从如以下真核表达载体产生载体供体：pFastBac、pFastBacHT、pFastBacDUAL、pSFV和pTet-Splice(Life Technologies，Inc.)、pEUK-C 1、pPUR、pMAM、pMAMneo、pBI101、pBI121、pDR2、pCMVEBNA和pYACneo(Clontech)、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110和pKK232-8(Pharmacia，Inc.)、p3′SS、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo和pOG44(Stratagene，Inc.)和pYES2、pAC360、pBlueBacHis A、B和C、pVL1392、pBsueBacIII、pCDM8、pcDNAI、pZeoSV、pcDNA3、pREP4、pCEP4和pEBVHis(Invitrogen，Inc.)及其变体或衍生物。
特别重要的其他载体包括pUC18、pUC19、pBlueScript、pSPORT、粘粒、噬菌粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、P1(大肠杆菌噬菌体)、pQE70、pQE60、pQE9(quagan)、pBS载体、PhageScript载体、BlueScript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pcDNA3(Invitrogen)、pGEX、pTrsfus、pTrc99A、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)、pSPORT1、pSPORT2、pCMVSPORT2.0和pSV-SPORT1(Life Technologies，Inc.)及其变体或衍生物。
其他重要的载体包括来自Invitrogen的pTrxFus、pThioHis、pLEX、pTrcHis、pTrcHis2、pRSET、pBlueBacHis2、pcDNA3.1/His、pcDNA3.1(-)/Myc-His、pSecTag、pEBVHis、pPIC9K、pPIC3.5K、pAO815、pPICZ、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pBlueBac4.5、pBlue-BacHis2、pMelBac、pSinRep5、pSinHis、pIND、pIND(SP1)、pVgRXR、pcDNA2.1.pYES2、pZErGO1.1、pZErO-2.1、pCR-Blunt、pSE280、pSE380、pSE420、pVL1392、pVL1393、pCDM8、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pcDNA3.1、pcDNA3.1/Zeo、pSe、SV2、pRc/CMV2、pRc/RSV、pREP4、pREP7、pREP8、pREP9、pREP10、pCEP4、pEBVHis、pCR3.1、pCR2.1、pCR3.1-Uni和pCRBac；来自Pharmacia的λExCell、λgt11、pTrc99A、pKK223-3、pGEX-1λT、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pEZZ18、pRIT2T、pMC1871、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110、pKK232-8、pSL1180、pNEO和pUC4K；来自NoVagen的pSCREEN-1 b(+)、pT7Blue(R)、pT7Blue-2、pCITE-4abc(+)、pOCUS-2、pTAg、pET-32LIC、pET-30LIC、pBAC-2cp LIC、pBACgus-2cp LIC、pT7Blue-2 LIC、pT7Blue-2、λSCREEN-1、λBlueSTAR、pET-3abcd、pET-7abc、pET9abcd、pET11abcd、pET12abc、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b-pET-17xb、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21abcd(+)、pET-22b(+)、pET-23abcd(+)、pET-24abcd(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28abc(+)、pET-29abc(+)、pET-30abc(+)、pET-31b(+)、pET-32abc(+)、pET-33b(+)、pBAC-1、pBACgus-1、pBAC4x-1、pBACgus4x-1、pBAC-3cp、pBACgus-2cp、pBACsurf-1、pIg、Signal pIg、pYX、Selecta Vecta-Neo、SelectaVecta-Hyg和Selecta Vecta-Gpt；来自Clontech的pLexA、pB42AD、pGBT9、pAS2-1、pGAD424、pACT2、pGAD GL、pGAD GH、pGAD10、pGilda、pEZM3、pEGFP、pEGFP-1、pEGFP-N、pEGFP-C、pEBFP、pGFPnV、pGFP、p6xHis-GFP、pSEAP2-Basic、pSEAP2-Contral、pSEAP2-Promoter、pSEAP2-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Control、pβgal-Promoter、pβgal-Enhancer、pCMVβ、pTet-Off、pTet-On、pTK-Hyg、pRetro-Off、pRetro-On、piRES1neo、pIRES1hyg、pLXSN、pLNCX、pLAPSN、pMAMneo、pMAMneo-CAT、pMAMneo-LUC、pPUR、pSV2neo、pYEX4T-1/2/3、pYEX-S1、pBacPAK-His、pBacPAK8/9、pAcUW31、BacPAK6、pTriplEx、λgt10、λgt11、pWE15、和λTriplEx；来自Stratagene的Lambda ZAP II、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescriptIIKS+/-、pBluescript IISK+/-、pAD-GAL4、pBD-GAL4 Cam、pSurfscript、Lambda FIX II、Lambda DASH、Lambda EMBL3、Lambda EMBL4、SuperCos、pCR-Scrigt Amp、pCR-Script Cam、pCR-Script Direct、pBS+/-、pBC KS+/-、pBC SK+/-、Phageseript、pCAL-n-EK、pCAL-n、pCAL-c、pCAL-kc、pET-3abcd、pET-11′abcd、pSPUTK、pESP-1、pCMVLacI、pOPRSVI/MCS、pOPI3 CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pMC1neo PoIy A、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415和pRS416。
特别重要的双杂交和反向双杂交载体包括pPC86、pDBLeu、pDBTrp、pPC97、p2.5、pGAD1-3、pGAD10、pACt、pACT2、pGADGL、pGADGH、pAS2-1、pGAD424、pGBT8、pGBT9、pGAD-GAL4、pLexA、pBD-GAL4、pHISi、pHISi-1、placZi、pB42AD、pDG202、pJK202、pJG4-5、pNLexA、pYESTrp及其变体或衍生物。
在大肠杆菌中表达的优选载体为pQE70、pQE60和pQE-9(QIAGEN，Inc.)；pBluescript载体、phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene Cloning Systems，Inc.)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia Biotech，Inc.)。
在真核动物系统表达的优选载体包括pWLNEO、pSv2CAT、pOG44、pXT1和pSG(Stratagene Inc.)；pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL(PharmaciaBiotech，Inc.)。诱导型载体的实例为pTet-tTak、pTet-Splice、pcDNA4/TO、pcDNA4/TO/LacZ、pcDNA6/TR、pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ、pcDNA4/TO/Myc-His A、pcDNA4/TO/Myc-His B、pcDNA4/TO/Myc-HisC、pVgRXR(In vitrogen，Inc.)或pMAM-系列(Clontech，Inc.；GenBank检索号：U02443)。
在酵母中表达的优选载体包括如pYES2、pYD1、pTEFI/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalph、pPIC9、pPIC3.5、PHIL-D2、PHIL-SI、pPIC3SK、pPIC9K和PA0815(Invitrogen，Inc.)。
本文以下描述了用于植物转化的优选载体，优选包括用于农杆菌介导的转化的载体。根癌农杆菌和发根农杆菌是能遗传转化植物细胞的植物致病性土壤细菌。根癌农杆菌和发根农杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责遗传转化植物的基因(Kado 1991)。本发明的载体可以基于农杆菌Ti或Ri质粒，从而可以利用进入植物基因组的天然DNA转移系统。
作为高度发展的寄生现象的一部分，农杆菌将其基因组信息的确定部分(T-DNA，两侧为约25bp的重复，称为左和右边界)转移进植物细胞的染色体DNA(Zupan 2000)。通过所谓vir基因(原始Ti质粒的部分)的组合作用介导所述DNA转移。为利用这个天然系统，开发了缺乏原始肿瘤诱导基因的Ti质粒(“卸甲载体”)。在进一步改进(所谓的“双元载体系统”)中，通过整合进便于操作的穿梭载体而将T-DNA与Ti质粒的其他功能性元件(如vir基因)物理分离(EP-A1 0 120 516；US 4,940,838)。这些双元载体包含(除了卸甲T-DNA及其边界序列以外)用于在农杆菌和大肠杆菌中复制的原核序列。农杆菌介导的转化的优点是通常仅边界侧翼的DNA被转移进基因组，并且优选仅插入1个拷贝。用于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述为本领域已知(Miki 1993；Gruber 1993；Moloney1989。)已经深入研究和描述了T-DNA用于转化植物细胞的用途(EP-A1120 516；Hoekema 1985；Fraley 1985和An 1985)。已知多种双元载体，其中一些是市售的，例如pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.USA)。
因此，对于农杆菌介导的转化，可以将筛选构建体整合入特定的质粒，或者筛选载体可以由特定质粒组成，例如穿梭载体或中间载体或双元载体。如果将Ti或Ri用于转化，以侧翼区的形式将Ti或Ri质粒T-DNA的至少右边界(多数情况下为右和左边界)与待引入的转基因表达构建体连接。优选使用双元载体。双元载体能在大肠杆菌和农杆菌中复制。它们可以包含选择标记基因和接头或多聚接头(用于插入例如待转移的表达构建体)，其两侧为右和左T-DNA边界序列。可以直接将它们转移进农杆菌(Holsters1978)。选择标记基因允许选择转化的农杆菌，例如赋予对卡那霉素抗性的nptII基因。在这种情况下作为宿主生物的农杆菌应该已经含有带有vir区的质粒。后者是将T-DNA转移进植物细胞所需要的。以这种方式转化的农杆菌可用于转化植物细胞。已经深入研究并描述了T-DNA用于转化植物细胞的用途(EP-A1 0 120 516；Hoekema 1985；An 1985，另见下文)。
通常的双元载体基于“宽宿主范围”质粒，如来自P型质粒RK2的pRK252(Bevan 1984)或pTJS75(Watson 1985)。这些质粒多数来自pBIN19(Bevan 1984)。已知多种双元载体，其中一些是市售的，例如pBI101.2或pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.USA)。其他载体在大小和操作上进行了改进(如pPZP，Hajdukiewicz 1994)。改进的载体系统还描述于WO 02/00900。
在优选的实施方案中，用于本发明实践的农杆菌菌株包括章鱼碱菌株如LBA4404或农杆碱菌株如EHA101或EHA105。用于DNA转移的合适的根癌农杆菌菌株为例如EHA101pEHA101(Hood 1986)、EHA105[pEHA105](Li 1992)、LBA4404[pAL4404](Hoekema 1983)、C58C1[pMP90](Koncz 1986)和C58C1[pGV2260](Deblaere 1985)。其他合适的菌株为胭脂碱菌株根癌农杆菌C58。其他合适的菌株为根癌农杆菌C58C1(Van Laerebeke 1974)、A136(Watson等1975)或LBA4011(Klapwijk 1980)。在优选的实施方案中，用于转化与植物酚化合物预培养的植物组织的农杆菌菌株含有L，L-琥珀碱(succinamopine)型Ti质粒，优选卸甲质粒如pEHA101。在另一优选的实施方案中，用于转化与植物酚化合物预培养的植物组织的农杆菌菌株含有章鱼碱型Ti质粒，优选卸甲质粒如pAL4404。通常在使用章鱼碱型Ti质粒或辅助质粒时，优选缺失或失活virF基因。在优选的实施方案中，农杆菌菌株用于转化与植物酚化合物如乙酰丁香酮预培养的植物组织。本发明的方法还可以与特定的农杆菌菌株组合使用以进一步提高转化效率，例如由于存在突变或嵌合virA或virG基因而改变了vir基因的表达和/或其诱导的农杆菌菌株(如Hansen 1994；Chen 1991；Scheeren-Groot 1994)。
可以通过普通DNA重组技术修饰双元载体或任何其他载体，将其在大肠杆菌中增殖，并通过电穿孔或其他转化技术引入农杆菌(Mozo 1990)。按本领域所述培养和使用农杆菌。例如，可以在补充了适当抗生素(如50mg/L大观霉素)的YP培养基(5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、5g/L Nail、15g/L琼脂，pH6.8)上将包含载体的农杆菌菌株培养3天。用接菌环从固体培养基上收集细菌并重悬。就本发明而言，通过如实施例中所述插入位点特异性重组位点来提供与农杆菌相容的载体。
构建载体之后，可以在宿主细胞中增殖载体以合成用于产生核酸聚合物的核酸分子。载体(常称为“穿梭载体”)能在至少两种无关表达系统中复制。为促进这种复制，载体应该包含至少两个复制起点，每个起点在一种复制系统中有效。穿梭载体一般能在真核系统和原核系统中复制。这使得可以在真核宿主(“表达细胞类型”)中检测蛋白质表达，并在原核宿主(“扩增细胞类型”)中扩增载体。作为示例，一个复制起点可以来自SV40，而另一个复制起点可以来自pBR322。本领域技术人员了解多种合适的复制起点。
构建载体之后，一般在宿主细胞中增殖载体。便利地在原核宿主细胞如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中进行载体增殖。合适的大肠杆菌菌株包括BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DB2、DB3.1、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451和ER1647(参阅如Brown编辑，Molecular BiologyLabfax(Academic Press 1991))。合适的枯草芽孢杆菌菌株包括BR151、YB886、MI119、MI120和B170(参阅如Hardy 1985)。在原核宿主中增殖载体的标准技术为本领域技术人员所熟知(参阅如Ausubel 1995；Wu1997)。
3.将作为转录终止子评估的序列
将使用本发明方法评估其作为转录终止子序列的效率的序列可以来自多种来源。在本发明的一个实施方案中，可以评估相信发挥转录终止子功能的序列的效率。这些序列可以来自如基因编码序列的下游区(如包含编码3’非翻译区的区域和其他下游基因组序列)，优选来自mRNA转录物末端周围的区域。多种这样的序列可以来自基因组和cDNA文库的比较。可以通过如从相应的宿主生物分离(通过本领域技术人员已知的多种克隆方法，如通过使用适当引物寡核苷酸的聚合酶链式反应)或直接通过DNA合成获得待插入筛选载体或筛选构建体的插入位点的相应核酸序列。
在优选的实施方案中，待插入以进行评估的DNA分子为双链线性DNA分子。所述分子的末端可以是平末端(即没有5’和/或3’突出端)或“粘”末端(即具有5’和/或3’突出端)。优选地，DNA分子末端可以带有突出端，所述突出端允许插入限制性内切核酸酶切割位点，以便于插入到插入位点。DNA分子的长度和分子量可以不同。在优选的实施方案中，分子大小从约50到约5000个碱基对，优选从约60到约2000个碱基对，更优选从约70到约1000个碱基对，最优选从约80到约500个碱基对。
除了教导的这种方法(基于可以推测具有一定转录终止效率的序列)以外，在本发明的另一个优选的实施方案中，筛选DNA序列的文库以获得有效的转录终止序列。此实施方案不需要任何先前的序列信息，优选仅基于有效转录终止的表型(在实践中难于与序列信息关联)。使用的DNA序列文库可以是合成文库或天然存在的DNA分子的文库或合成和天然存在的DNA分子的混合物。优选地，DNA分子文库是天然存在分子的文库，它可来自一种或多种生物的基因组DNA和/或cDNA。更优选地，文库来自生物(优选植物)的基因组DNA。
在优选的实施方案中，DNA文库的DNA分子是双链线性DNA分子。所述分子的末端可以是平末端(即没有5’和/或3’突出端)或“粘”末端(即具有5’和/或3’突出端)。文库的DNA分子的长度和分子量可以不同。在优选的实施方案中，分子大小从约50到约5000个碱基对，优选从约60到约2000个碱基对，更优选从约70到约1000个碱基对，最优选从约80到约500个碱基对。
可以通过本领域技术人员已知的多种方法从基因组和/或cDNA产生DNA分子的文库。例如，可以通过用内切核酸酶完全或部分消化来随机剪切DNA而产生文库。优选地，文库来自使用限制性内切核酸酶的完全消化，所述内切核酸酶优选具有4碱基识别位点(如Sau3A)。断裂(如通过限制性消化)后，可以通过如本领域已知的如分子量排阻层析(使用如SuperoseTM柱，Amersham Bioscience，Inc.的大小排阻层析)或凝胶电泳分离(如上文确定的)优选分子量的DNA分子(实例见Ellegren 1989)。
在本发明另一优选的实施方案中，可以对选择的序列评估其作为转录终止子序列的性能。这些序列可以是例如基因编码序列下游的区域(如包括编码3’非翻译区的区域和其他下游基因组序列的区域)，优选来自mRNA转录物末端周围的区域。可以通过在计算机芯片上(in silico)检索基因组数据库(如拟南芥或稻)来产生这些序列。
在一个优选的实施方案中，对部分(或优选全部)植物基因组(如稻或拟南芥基因组)筛选可能的来自植物的终止子候选者。使用以下标准鉴定并确定可以在本发明方法中进一步分析的转录终止子序列候选者：
1.鉴定和/或分离配对基因之间符合预定义基因间距离标准的基因间区。这些基因可以优选具有头对尾的取向(即转录以同一方向进行)，或优选地尾对尾取向(即彼此方向相反)。在头对尾的情况下，本文使用的术语“基因间区”指“尾”序列的终止密码子和“头”序列的起始密码子或(如果已知)“头”序列的启动子区起始之间的序列(但不排他)。在尾对尾取向中，本文使用的术语“基因间区”指两个编码序列的终止密码子之间的序列(但不排他)。优选地，来自尾对尾取向的配对基因的基因间区优选鉴定的长度为从约400到3000个碱基对、优选从约700到约2000个碱基对。可以通过多种方法进行鉴定，包括全基因组测序(如对于先前未知的序列)或在计算机芯片上筛选已知的序列(如拟南芥或稻基因组)。为此目的可以使用已有的数据库，如来自The Institute of Genome Research(TIGR；PUB_tigr_rice_genome_v4.nt                          (v03212003)，PUB_tigr_rice_cds_Oct022003.nt，pubOSest0603(ncbi))的最新的数据。
2.鉴定和/或分离两侧均为高表达水平基因的基因间序列。在此上下文中使用的术语“高表达”或“高表达水平”指为同一mRNA来源(即细胞或组织)中肌动蛋白表达水平的至少5％，优选至少10％，更优选至少30％，更优选至少50％的表达水平。可以通过多种方法判断表达，所述方法包括但不仅限于非标准化EST文库中的EST数、RNA印迹分析、RT-PCR等。一个或两个基因的低表达已被鉴定为通过连读转录实现的基因沉默的指示物。可以通过实验(如体外或体内的，如使用通过芯片或微阵列技术产生的表达概况分析)或优选在计算机芯片上通过简单的计数非标准化EST/cDNA文库中每个基因的EST数来描述表达水平，所述EST数可以代表表达水平。
3.鉴定和/或分离基因间序列，所述基因间序列两侧均为基因，其表达图式优选独立于另一配对基因的表达图式。在此上下文中，术语“独立表达图式”指例如在其组织和/或发育调节中第一个基因的表达与第二个基因的表达不同。配对基因的表达图式的独立性和相关性已被鉴定为连读转录的指示物。可以通过比较所述配对基因在多种器官或组织中的表达水平而实验地(如体外或体内的，如通过芯片技术的表达概况分析)或优选在计算机芯片上通过简单的计数非标准化EST/cDNA文库中每个基因的EST数来分析表达概况，所述EST数可以代表表达水平。
4.鉴定和/或分离基因间序列，所述基因间序列的一侧(或优选两侧)为来自所述配对基因的mRNA转录物的长度具有低变异性的基因。通过如EST、cDNA文库或数据库中多于一个转录物末端的存在来指示这种变异性。转录物长度的变异性已被鉴定为转录终止中低严格度的指示。可以通过实验(如通过RT PCR)或优选地在计算机芯片上通过简单分析数据库中EST或cDNA克隆的3’末端来分析转录物长度的变异性。
尽管基因间定位(步骤1)是前提，但在本发明优选的实施方案中，某基因间序列的标准2、3、4和基因间序列的长度(标准1的一部分)都得到标准评分。将所述分数相加(分数可以乘以某些反映标准的不同影响的权重指标)得到最终分数，其指示该序列作为转录终止子和隔离子(isolator)的潜力(见下文)。可以通过在一个或多个本发明的筛选系统中评估所述基因间区的序列来证实这种分数和潜力。最高的权重给予标准2(高表达概况)，其后是标准1(独立表达概况)和标准3(转录物长度的低变异性)。下文指出了优选的基因间区长度，但看起来对操作(即其后的克隆和转化步骤)的影响大于对所述区域功能性的影响。
由此鉴定的基因间区不仅适用于单基因表达盒，而且尤其适用于多基因表达盒，所述多基因表达盒不仅在一个序列中提供两个基因的转录终止，而且允许通过使其连读转录干扰最小化而有效“分离”所述两个表达盒(从而提供“隔离子”)，所述干扰已被证明是多基因表达盒构建体中特别严重的问题。涉及序列(优选位于两个表达盒之间)时，本文使用的术语“隔离子”旨在指所述序列使一个表达盒对从另一表达盒转录的影响最小化或防止该影响，从而使两个表达盒彼此隔离的能力。下文实施例1.2给出了实施此方法以提供基因间序列的优选实施方案和其他信息。
因此，本发明的另一实施方案涉及用于鉴定和/分离基因间区(优选具有高转录终止和/或隔离子潜力)的方法，所述方法包括以下选择标准的至少一种，优选至少两种，更优选至少三种，最优选全部：
1.鉴定和/或分离配对序列间符合预定义基因间距离标准的基因间区。
2.鉴定和/或分离两侧均为高表达水平基因的基因间序列。
3.鉴定和/或分离基因间序列，所述基因间序列两侧均为表达图式优选独立于另一配对基因表达图式的基因。
4.鉴定和/或分离基因间序列，所述基因间序列的一侧(或优选两侧)为来自所述配对基因的mRNA转录物的长度具有低变异性的基因。
基因间区侧翼的配对基因优选具有尾对尾取向。优选地，来自尾对尾取向的配对基因的基因间区鉴定为长度从约400到3000个碱基对、优选从约700到约2000个碱基对。
因此，本发明优选的实施方案涉及鉴定和/或分离具有转录终止潜力的基因间区的方法，所述方法至少包括以下步骤：
a)鉴定和/或分离配对基因间具有约400到3000个碱基对的基因间距离的基因间区，和
b)鉴定和/或分离两侧均为具有高表达水平基因的基因间序列。更优选地，所述方法包括以下步骤：
c)鉴定和/或分离基因间序列，所述基因间序列两侧均为表达图式优选独立于另一配对基因表达图式的基因，和
d)鉴定和/或分离基因间序列，所述基因间序列的一侧(或优选两侧)为来自所述配对基因的mRNA转录物的长度具有低变异性的基因。
基因间序列最优选地
a)位于尾对尾定位(即所述基因的表达方向彼此相反)的基因之间和/或
b)从侧翼基因各自的终止密码子起测量的长度为约700到约2000个碱基对。
基于所述方法鉴定了来自稻基因组的序列，并发现其有希望作为转录终止子序列。所述序列描述于SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107和108。
本发明的另一实施方案涉及所述序列在转基因表达构建体中用于终止转录的用途。更优选所述序列作为多基因表达构建体中隔离子的用途。
本发明的另一实施方案涉及转基因表达构建体，所述表达构建体在5’-3’方向上包含
a)在植物中具有功能的启动子序列，和
b)与所述启动子a)有效连接的待表达的目的核酸序列，和
c)选自以下的至少一个序列：
i)SEQ IDNO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、  28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107和108描述的序列，和
ii)与SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107或108描述的序列具有至少60％、优选80％、更优选90％、最优选95％同源性的序列，所述序列能够在植物细胞或生物中终止转录，和
iii)在低严格条件下、优选在高严格条件下与SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107或108描述的序列杂交的序列，所述序列能够在植物细胞或生物中终止转录，和
iv)i)、ii)和iii)中所述序列的至少50个连续碱基对、优选至少100个连续碱基对、更优选至少250个连续碱基对、最优选至少500个连续碱基对的片段，
其中所述序列c)与所述启动子a)和/或所述目的核酸b)异源，并介导从所述启动子a)的表达的终止。
本发明的另一实施方案涉及包含至少两个表达盒的转基因表达构建体，所述表达盒具有在5’-3’方向上包含如下的结构：
a1)在植物中具有功能的第一个启动子序列，和
b1)与所述启动子a1)有效连接的待表达的第一个目的核酸序列，和
c)选自以下组成的组的至少一个序列：
i)SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107和108描述的序列，和
ii)与SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107或108描述的序列具有至少60％、优选80％、更优选90％、最优选95％同源性的序列，所述序列能够在植物细胞或生物中终止转录，和
iii)在低严格条件下、优选在高严格条件下与SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107或108描述的序列杂交的序列，所述序列能够在植物细胞或生物中终止转录，和
iv)i)、ii)和iii)中所述序列的至少50个连续碱基对、优选至少100个连续碱基对、更优选至少250个连续碱基对、最优选至少500个连续碱基对的片段，
和
b2)待表达的第二个目的核酸序列，和
a2)在植物中具有功能的第二个启动子序列，其与所述目的核酸序列b2)有效连接，
其中所述序列c)与选自启动子a1)、启动子a2)、目的核酸b1)和目的核酸b2)的至少一种元件异源，并介导从所述启动子a1)和a2)的表达的终止。
由于上述转录终止子序列不引起蛋白质表达，因此可以接受较高程度的变异性而不改变功能性。
本发明的方法还可用于鉴定较大的序列中负责转录终止的区域。这使得可以缺失不必要的序列和提供用于转录终止的小序列，这是基因表达载体的构建中的重要目标。导致大载体的大序列与无效转化和构建体的不稳定性相关。优选地，此类鉴定可以通过向筛选载体或者筛选构建体插入较大序列的片段来实现。可以通过如核酸酶介导的较大序列5’和/或3’末端截短(通过限制酶或非特异性核酸酶如Ba/31)产生这些片段。相应的方法为本领域技术人员所熟知。
可以寻求鉴定转录终止必要区域的较大序列可以是例如基因编码序列的天然下游区，它是转基因构建体中使用的启动子的来源(如包含编码3’非翻译区的区域和其他下游基因组序列的区域)，优选来自mRNA转录物周围的区域。将启动子与其天然转录终止子(以及它们之间的目的异源序列)组合以获得最佳表达结果是有利的。从前必须使用非常长的3’非翻译区以保证有效的转录终止，或者必须对缩短的序列进行繁重的测试，然而本发明的方法允许快速有效地将潜在的转录终止子限制到其必需元件。
4.将DNA分子插入筛选载体
可以通过多种方法将待评估其转录终止效率的DNA分子插入筛选载体。优选通过一种或多种选自以下的方法实现插入：
a)插入到限制性位点：本领域技术人员了解可用于实施本发明方法的多种序列特异性内切核酸酶。合适的内切核酸酶可以是例如II型限制性内切核酸酶或人工(如嵌合)核酸酶。优选以所述内切核酸酶仅切割插入位点的方式选择的限制性内切核酸酶。这些限制性内切核酸酶可以优选包括具有至少8个碱基对的识别位点的稀有切割内切核酸酶(如NotI)或者甚至是具有非常长的识别序列的回归内切核酸酶(Belfort 1997；Jasin 1996；Internet：http://rebase.neb.com/rebase/re-base.homing.html；Roberts2001)。优选的回归内切核酸酶的实例包括但不仅限于F-SceI、I-CeuI、I-ChuI、I-DmoI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI、I-CsmI、F-TevI、F-TevII、I-TevI、I-TevII、I-AniI、I-CvuI、I-LlaI、I-NanI、I-MsoI、I-NitI、I-NjaI、I-PakI、I-PorI、I-PpoI、I-ScaI、I-Ssp6803I、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-PspI、PI-TfuI、PI-TliI。最优选I-CeuI、I-SceI、I-PpoI、PI-PspI和PI-SceI。
b)插入到重组位点：在本发明优选的实施方案中，通过使用重组蛋白实现将DNA区段插入筛选构建体或筛选载体的插入位点，所述重组蛋白包括重组酶和相关辅因子和蛋白质。基于本文提供的教导和指导，还可以使用来自多种生物的多种重组系统。参阅如Hoess 1986；Abremski 1986；Campbell，1992；Qian 1992；Araki 1992。它们中的许多都属于重组酶的整合酶家族(Argos 1986)。它们中研究最充分的可能是来自λ噬菌体的整合酶/att系统(Landy 1993)、来自噬菌体P1的Cre/loxP系统(Hoess 1990)和来自酿酒酵母2μ环状质粒的FLP/FRT系统(Braoch 1982)。用于重组酶介导的克隆的详细方法、(用作插入位点的)合适的重组位点和相应的重组酶描述于例如整体引入本文作为参考的US 5,888,732。优选的系统为GatewayTM克隆系统(Invitrogen，Inc.)。相应的即用型λ整合酶及其相应辅因子的混合物可得自Invitrogen Inc.(GatewayTM LR ClonaseTM Plus酶)。
还可以使用包括两种方法的组合的方法。然而，将待评估的序列直接插入(即在一步克隆程序中)几乎已完成的筛选构建体或筛选载体中并不是必须的。例如，可以先将它与附加序列连接，然后插入适当的构建体或载体中，从而构成评估方法中使用的最终筛选构建体或筛选载体。原则上，装配筛选构建体或筛选载体多个部分的方法和可能性不计其数，但它们是本领域技术人员所熟知和确定的。
就插入到插入位点而言，待插入的DNA序列可以与接头连接，所述接头提供分别用于限制性内切核酸酶或重组酶的适当识别序列。然而，对于限制性内切核酸酶的情况，在使用基因组消化物作为DNA序列文库的情况下不需要接头。这时用于消化的限制性酶应该产生与切割的插入位点相容的DNA末端。
5.体外筛选系统
以体外筛选系统进行时，可以例如使用识别单链核苷酸的灵敏荧光探针便利地在RNA水平检测附加序列(优选位于插入位点下游(即3’方向))的表达。这些特征也应理解为易于检测的特征。在将有效的转录终止子序列插入这些序列之前的情况下，将获得降低的、优选不显著或完全无法观察到的信号。
在体外筛选系统中，可以使用市售的体外转录系统(如小麦胚核提取物、HeLa核提取物、兔网织红细胞提取物或来自目的植物的核提取物)在RNA水平检测位于插入位点中插入的转录终止序列下游序列的转录，所述体外转录系统优选与单链识别荧光探针(如信标探针)组合。多种合适的体外转录/翻译系统是本领域已知并市售的(如ActiveProTM、PROTEINscriptTM II、Retic Lysate IVTTM(经处理)和Retic LysateIVTTM-96、Wheat Germ IVTTM，均可得自Ambion，Inc.，Austin，USA)。在这种情况下不涉及植物转化。因此，可以在简单基础上(如基于pUC)构建筛选构建体或筛选载体。优选地，将包含不同转录终止序列的筛选构建体或筛选载体置于96孔平板中用于体外转录。荧光探针在发生连读时杂交。发生的转录终止越严紧，在连读区中检测到的荧光产物越少。可以通过位于转录终止序列上游但仍受启动子控制的序列的表达使连读产物的量归一化。
6.体内筛选系统
在优选的实施方案中，本发明的方法在体内实现，优选在寻求有效转录终止子的靶生物中实现。体内筛选系统允许平行地对多个DNA序列评估其作为转录终止序列的性能。因此，可以使用DNA序列文库，并插入筛选构建体或筛选载体中以得到包含多种不同DNA序列的筛选构建体或筛选载体的文库。以使每个细胞或生物优选仅包含所述文库的一种筛选构建体或筛选载体(包含待评估转录终止能力的一种特定DNA序列)的方式将所述筛选构建体或筛选载体文库插入细胞或生物。因此，如下文更详细描述的，此优选实施方案不需要在评估转录终止能力之前分选多种筛选构建体或筛选载体，这使得该方法更为高效。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法涉及鉴定和分离转录终止序列的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其包含：
a)启动子序列，和
b)用于插入DNA序列的一个或多个插入位点，优选限制性或重组位点，和
c)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下的表达导致易于检测的特征，
其中与无插入相比，将有效的转录终止子插入所述插入位点可改变所述附加序列通过所述启动子序列的表达，和
ii)提供待评估其转录终止能力的一个或多个DNA序列，和iii)将所述DNA序列的一个或多个拷贝插入所述筛选构建体或筛选载体的所述插入位点，和
iv)将带有所述插入的DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适于诱导来自从启动子序列表达的细胞或生物，和
v)鉴定和/或选择与无插入相比具有改变的易于检测特征来细胞或生物，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入的DNA序列用作转录终止序列，并(任选的)测定其序列。
所有上文指出的优选变通方案(如变通方案A、B或C)还可以有利地与所述体内系统组合。在本发明的体内筛选系统中，位于插入位点下游(在3’末端)的序列的表达优选引起易于检测的表型。“引起”包括启动或抑制易于检测的表型。例如，位于插入位点下游(在3’末端)的序列可以编码引起表型的蛋白质，或者它可以编码引起所述引起表型的蛋白质表达的抑制的RNA(如反义或双链RNA)。上文给出了多个实例。
在本发明体内筛选系统的优选实施方案中，位于插入位点下游(在3’末端)的序列的表达将引起抑制所述细胞或生物(如植物细胞或植物)的生长、繁殖和/或再生的表型，因此在本发明上下文中应理解为对所述细胞和/或生物(如植物细胞或植物)具有“毒性”。因此，只有将严紧转录终止序列插入所述引起毒性表型的序列之前，从而阻止这种生长、繁殖和/或再生的抑制性序列的表达时，细胞(或生物)才能生存。可以分离存活的细胞，可以通过如使用PCR扩增并接着测序来鉴定和分离该转录终止子序列。
为进行体内系统中的筛选，优选将筛选构建体或筛选载体转化进细胞、组织或生物中。转化生物或转化细胞的产生需要将目的DNA引入目的宿主细胞。多种方法可用于称为转化的这一操作(还可参阅Keown 1990)。例如，可以通过显微注射或通过用DNA包被的微粒轰击直接引入DNA。还可以化学透化细胞(例如使用聚乙二醇)，以使DNA能够通过扩散进入细胞。还可以通过与其他含有DNA的单位如小细胞、细胞、溶酶体或脂质体进行原生质体融合而引入DNA。引入DNA的另一种合适方法为电穿孔，其中通过电脉冲使细胞可逆透化。
宿主细胞或生物可以是任何原核或真核生物。优选上文定义的哺乳动物细胞、非人哺乳动物生物、植物细胞和植物生物。优选将本发明的筛选构建体或筛选载体引入真核细胞。可以优选插入基因组(如质体或染色体DNA)，但也可以在染色体外或表染色体(epichromosomal)存在。优选的真核细胞为哺乳动物细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、鸟类细胞等。合适的哺乳动物宿主细胞实例包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL1587)、人胚肾细胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21，BHK-570，ATCC CRL 8544，ATCC CRL 10314)、犬肾细胞(MDCK；ATCC CCL 34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHODG44(Chasin 1986))、大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)、大鼠肝细胞瘤细胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)、SV40转化的猴肾细胞(COS-1；ATCC CRL 1650)和小鼠胚细胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)。
可以使用多种标准技术将筛选构建体或筛选载体引入宿主细胞，所述技术包括磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微粒介导的递送、电穿孔等。可以选择并繁殖转染细胞，以提供包含稳定整合进宿主细胞基因组的目的基因的重组宿主细胞。
筛选载体可以是用于杆状病毒系统的杆状病毒表达载体。杆状病毒系统提供了将目的克隆基因引入昆虫细胞的有效手段。合适的表达载体基于苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcMNPV)，含有熟知的启动子如果蝇热休克蛋白(hsp)70启动子、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒立即早期基因启动子(ie-1)和延迟早期39K启动子、杆状病毒p10启动子和果蝇金属硫蛋白启动子。产生重组杆状病毒的第二种方法利用基于转座子的系统(Luckow 1993)。以BAC-to-BAC试剂盒(Life Technologies，Rockville，Md.)销售利用转移载体的这种系统。这种系统利用含有Tn7转座子的转移载体PFASTBAC(Life Technologies)，Tn7转座子将编码目的多肽的DNA转移进杆状病毒基因组，其以称为“杆粒”(bacmid)的大质粒维持于大肠杆菌中(参阅Hill-Perkins 1990；Bonning 1994和Chazenbalk1995)。此外，转移载体可以包括与编码在所表达的多肽的C或N端的表位标签(例如Glu-Glu表位标签)的DNA的框内融合(Grussenmeyer 1985)。使用本领域已知的计数将含有目的基因的转移载体转化进大肠杆菌，并筛选含有指示重组杆状病毒的破坏的lacZ基因的杆粒。接着使用常规技术分离含有重组杆状病毒基因组的杆粒DNA。将重组病毒或杆粒用于转染宿主细胞。合适的昆虫宿主细胞包括来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)蛹卵巢细胞系IPLB-Sf-21的细胞系，如Sf9(ATCC CRL 1711)、Sf21AE和Sf21(Invitrogen Corporation；San Diego，Calif.)以及Drosophila Schneider-2细胞和来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的HIGH FIVE TM细胞系(Invitrogen)(US 5,300,435)。可以使用市售的无血清培养基生长和维持细胞。合适的培养基为用于Sf9细胞的Sf900 IITM (Life Technologies)或ESF921TM(Expression Systems)和用于粉纹夜蛾细胞的Ex-cellO405TM (JRHBiosciences，Lenexa，Kans.)或Express FiveTM(Life Technologies)。使用重组病毒时，通常将细胞由约2-5×105个细胞的接种密度培养至1-2×106个细胞，这时以0.1至10(更一般的接近3)的感染复数加入重组病毒原种。Bailey1991、Patel 1995、Ausubel 1995(16-37至16-57页)、Richardson 1995和Lucknow，1996提供了用于杆状病毒系统的已建立技术。
也可以使用真菌细胞包括酵母细胞作为用本发明筛选构建体或筛选载体转化的宿主细胞。就此而言，特别重要的酵母种包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。用于在酵母中表达的合适的启动子包括来自GAL1(半乳糖)、PGK(磷酸甘油激酶)、ADH(醇脱氢酶)、AOX1(醇氧化酶)、HIS4(组氨醇脱氢酶)的启动子等。已经设计了许多酵母克隆载体，并可以便利地使用。这些载体包括基于Ylp的载体如Ylp5、YRp载体如YRp17、YEp载体如YEp13和YCp载体如YCp19。用外源DNA转化酿酒酵母并由此产生重组多肽的方法公开于例如US 4,599,311、US 4,931,373、US 4,870,008、US 5,037,743和US 4,845,075。通过由选择标记确定的表型、通常的药物抗性或在缺乏特定营养物(如亮氨酸)的情况下生长的能力选择转化的细胞。用于酿酒酵母的示例性载体系统为POTI载体系统((US 4,931,373)，它允许通过在含有葡萄糖的培养基上生长来选择转化的细胞。用于酵母的其他合适的启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(参阅如US 4,599,311、US 4,615,974和US 4,977,092)和醇脱氢酶基因的那些。还可参阅US 4,990,446、5,063,154、5,139,936和4,661,454。
用于其他酵母的转化系统为本领域所已知，所述酵母包括多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)和麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)。参阅如Gleeson 1986和US 4,882,279。可以按照McKnight等(US4,935,349)的方法利用曲霉细胞。已经公开了用于转化产黄头孢(Acremonium chrysogenum)的方法(US 5,162,228)。已经公开了用于转化链孢霉的方法(US 4,486,533)。
例如，公开了甲醇毕赤酵母作为产生重组蛋白的宿主的用途(US5,716,808、US 5,736,383、Raymond 1998、WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536和WO 98/02565)。用于转化甲烷毕赤酵母的DNA分子一般制备为双链环状质粒，其优选在转化前线性化。对于甲烷毕赤酵母中的多肽产生，质粒中的启动子和终止子可以是甲烷毕赤酵母基因(如甲烷毕赤酵母醇利用基因(AUG1或AUG2))的启动子和终止子。其他有用的启动子包括二羟基丙酮合酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因。为了促进DNA整合进宿主染色体，优选质粒的完整表达区段两侧均为宿主DNA序列。对于需要使甲醇的使用最小化的大规模工业方法，可以使用缺失两种甲醇利用基因(AUG1和AUG2)的宿主细胞。为了产生分泌的蛋白，可以使用液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)缺陷型宿主细胞。使用电穿孔以便于含有编码目的多肽的DNA的质粒整合进甲烷毕赤酵母细胞。可以通过电穿孔转化甲烷毕赤酵母细胞，其中使用指数衰减，脉冲电场的场强从2.5至4.5kVcm，优选约3.75kV/cm，时间常数(t)从1至40毫秒，最优选约20毫秒。
用于将核酸分子引入细菌、酵母、昆虫、哺乳动物和植物细胞的标准方法由例如Ausubel(1995)提供。用于表达和回收通过哺乳动物细胞系统产生的外源蛋白质的一般方法由例如Etcheverry 1996提供。已经描述了从杆状病毒系统分离重组蛋白的确定方法(Richardson 1995)。
特别优选将筛选构建体或筛选载体转移进植物细胞、组织和/或生物。将转基因表达构建体或载体引入植物组织的方法可包括但不仅限于例如电注射(electroinjection)(Nan 1995；Griesbach 1992)、与脂质体、溶酶体、细胞、小细胞或其他可融合的脂质表面体融合(Fraley 1982)；聚乙二醇(Krens1982)、提高游离DNA摄入的化学品、使用病毒转化等。此外，使用基因枪的生物射弹法、电穿孔、在含DNA的溶液中温育干胚和显微注射也可以使用。
可以使用基于原生质体的方法(例如用于稻)，其中通过脂质体、PEG或电穿孔将DNA递送至原生质体(Shimamoto 1989；Datta 1990b)。通过电穿孔转化涉及应用短的高压电场在细胞膜中产生“孔”，DNA通过所述孔摄入。这些方法可用于例如产生稳定转化的单子叶植物(Paszkowski 1984；Shillito 1985；Fromm 1986)，特别是稻(Shimamoto 1989；Datta 1990b；Hayakawa 1992)。
粒子轰击或“生物射弹”是广泛使用的植物(特别是单子叶植物)转化方法。在“生物射弹”(微粒介导的DNA递送)方法中，用DNA包裹微粒粒子，并通过机械装置加速至高至足以穿透植物细胞壁和核的速度(WO91/02071)。外源DNA整合进宿主DNA，产生转化的细胞。“生物射弹”方法有许多变化(Sanford 1990；Fromm 1990；Christou 1988；Sautter 1991)。该方法已被用于产生稳定转化的单子叶植物，包括稻、玉米、小麦、大麦和燕麦(Christou 1991；Gordon-Kamm 1990；Vasil 1992；Wan 1994)。
除了这些“直接”转化技术以外，还可以通过根癌农杆菌或发根农杆菌通过细菌感染进行转化。这些菌株含有在农杆菌感染后转移至植物的质粒(Ti或Ri质粒)。称为T-DNA(转移DNA)的质粒部分整合进植物细胞的基因组(载体的描述见上文)。为将DNA转移进植物细胞，将植物外植体与转基因根癌农杆菌或发根农杆菌共培养。可以使用适当的培养基从感染的植物材料(如叶、根或茎节段，还包括原生质体或植物细胞悬液)开始，再生完整植物，所述培养基可以含有如用于选择转化的细胞的抗生素或杀生物剂。接着可以对获得的植物筛选引入的DNA的存在，在这种情况下所述DNA为本发明的表达构建体。一旦DNA整合进宿主基因组，所述基因型一般是稳定的，并且所述插入也可见于后代。整合的表达构建体一般含有选择标记，其将对杀生物剂(如除草剂)或抗生素(如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或膦丝菌素)的抗性传递给植物。选择标记使得可以从未转化细胞中选择转化细胞(McCormick 1986)。可以以惯常的方式培养和杂交得到的植物。应该培养两个或更多世代以确保基因组整合是稳定并且遗传的。相关领域中已经详细描述了上述方法(例如Jenes 1993和Potrykus 1991)。
本领域技术人员了解，可以通过本领域已知的多种方法增强农杆菌转化的效率。例如，在农杆菌培养物中包括天然损伤应答分子如乙酰丁香酮(AS)已经表明可提高根癌农杆菌的转化效率(Shahla 1987)。或者，可以通过损伤待转化的靶组织来提高转化效率。可以通过如冲击、浸软、用微粒轰击等实现对植物组织的损伤(参阅如Bidney 1992)。
已经报道了多种用于植物(特别是单子叶植物)转化的其他方法，包括如“花粉管法”(WO 93/18168；Luo 1988)、将DNA大量注射进花分蘖中(Du1989；de Ia Pena 1987)、将农杆菌注射进发育的颖果(WO 00/63398)和种子在DNA溶液中的组织温育(Topfer 1989)。在胚胎发生开始时将外源DNA直接注射进受精植物胚珠公开于WO 94/00583。WO 97/48814公开了产生稳定转化的能育小麦的方法和通过农杆菌转化小麦的系统，它基于新鲜分离或预培养的未成熟胚、胚胎发生愈伤组织和悬浮细胞。
可能需要将目的核酸序列靶向植物基因组的特定基因座。可以通过如使用农杆菌来源的序列的同源重组实现目的核酸序列在植物细胞基因组中的定点整合。一般的，将植物细胞与含有寻靶载体的农杆菌菌株温育，在所述载体中，与靶基因座内DNA序列同源的序列侧翼为农杆菌转移DNA(T-DNA)序列，如上文所述(US 5,501,967，其完整内容引入本文作为参考)。本领域技术人员了解，可以使用寻靶载体实现同源重组，所述寻靶载体含有与靶定的植物基因的任何部分同源的序列，所述部分属于基因的调节元件或基因的编码区。可以在植物基因的任何区域实现同源重组，只要待靶定的位点侧翼区的核酸序列是已知的。
需要同源重组时，使用的寻靶载体可以是取代型或插入型(US5,501,967)。取代型载体一般含有与靶基因组序列同源并位于异源核酸序列(如选择标记基因序列)侧翼的两个区域。取代型载体导致插入选择标记基因，从而破坏靶基因。插入型载体含有与靶基因同源的单个区域，导致将完整的寻靶载体插入靶基因。
如果选择标记是引入的DNA的一部分，则可以从未转化细胞中选择转化细胞，即含有整合进宿主细胞DNA的引入的DNA的细胞。
可以在用于随机整合和定点整合的构建体中使用正选择标记基因。正选择标记基因包括抗生素抗性基因和除草剂抗性基因等。表达这些标记基因的转化细胞能在杀死未转化野生型的所述抗生素或除草剂浓度存在下存活。实例为传递对除草剂膦丝菌素(双丙氨磷；Vasil 1992；Weeks 1993；Rathore 1993)的抗性的bar基因、传递对卡那霉素的抗性的nptII基因、传递对潮霉素的抗性的hpt基因或传递对除草剂草甘膦、遗传霉素(G-418)(氨基葡糖苷)(Nehra 1994)、草甘膦(Della-Cioppa等1987)的抗性的EPSP基因和ALS基因(chlorsulphuron抗性)。上文公开了其他优选的选择和筛选标记基因。
构建体中还可以包括负选择标记基因。在用于同源重组的构建体中优选使用与正选择标记基因组合的一个或多个负选择标记基因。负选择标记一般置于同源重组事件相关区域以外。负选择标记基因对以可表达方式将这些基因整合进其基因组的细胞提供劣势(优选致死性)。由于存在负选择标记基因，在基因组中随机整合了用于同源重组的寻靶载体的细胞将受到损坏或被杀死。在构建体中包括正选择标记的情况下，只有在基因组中整合了正选择标记的细胞可以存活。负选择标记基因的选择对本发明而言不是关键的，只要其在转化植物细胞中编码功能性多肽即可。负选择标记基因可以选自例如来自农杆菌Ti质粒的aux-2基因、来自SV40的tk基因、来自浅灰链霉菌的细胞色素P450、来自玉米或拟南芥的Adh基因等。可以使用编码能够将对植物细胞无害的物质转化成对植物细胞有害的物质的酶的任何基因。上文公开了其他优选的负选择标记。
然而，还可以通过本领域已知的多种(不基于选择标记的)其他方法证明和分析表达盒或载体在染色体DNA中的插入，所述方法包括但不仅限于基因组DNA的限制性作图、PCR分析、DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、DNA序列分析等。更具体地，这些方法可包括如PCR分析、DNA印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR。
一旦产生了转化的植物细胞，就可以使用本领域技术人员已知的方法获得完整植物。因此，本发明提供转基因植物。本发明的转基因植物不仅限于其中每个细胞都表达本文提供的启动子序列控制下的目的核酸序列的植物。本发明的范围内还包括含有至少一个表达目的核酸序列的细胞的任何植物(如嵌合植物)。转基因植物优选(但不必须)在多于一个细胞中、更优选在一种或多种组织中包含目的核酸序列。
得到含有表达载体的转基因植物组织之后，可以使用本领域已知的方法从此转基因植物组织再生转基因植物。本文使用的术语“再生”指从植物细胞、植物细胞组、植物部分或植物块(如从原生质体、愈伤组织、原球茎样体或组织部分)培养完整植物。
可以从转化的原生质体再生来自下列示例属的植物物种：草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、葫芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、茛菪属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solarium)、牵牛属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、十大功劳属(Majorana)、Ciohorium、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Hererocallis、龙面花属(Nemesia)、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、美人襟属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、Browaalia、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、黑麦草属(Lolium)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、高粱属(Sorghum)和曼陀罗属(Datura)。
为了从转基因原生质体再生转基因植物，首先提供转化的原生质体悬液或含有转化的外植体的培养皿。形成愈伤组织，可以从愈伤组织诱导嫩枝，接着生根。或者，可以在愈伤组织中诱导体细胞胚形成。这些体细胞胚像天然胚一样萌发形成植物。培养基一般含有多种氨基酸和植物激素，如生长素和细胞分裂素。在培养基中加入谷氨酸和脯氨酸也是有利的，特别是对于如玉米和苜蓿等物种。有效的再生取决于培养基、基因型和培养史。可以经验性地控制这三种变量，以得到可重现的再生。
还可以从培养的细胞或组织再生植物。已经显示能够从单个转化细胞再生而得到完整转基因植物的双子叶植物包括如苹果(Malus pumila)、黑莓(Rubus)、黑莓/覆盆子杂种(Rubus)、覆盆子(Rubus)、胡萝卜(Daucuscarota)、花椰菜(Brassica oleracea)、芹菜(Apium graveolens)、黄瓜(Cucumis sativus)、茄子(Solanum melongena)、莴苣(Lactuca sativa)、马铃薯(Solanum tuberosum)、油菜(Brassica napus)、野生大豆(Glycinecanescens)、草莓(Fragaria ananassa)、番茄(Lycopersicon esculentum)、胡桃(Juglans regia)、甜瓜(Cucumis melo)、葡萄(Vitis vinifera)和芒果(Mangifera indica)。已经显示能够从单个转化细胞再生而得到完整转基因植物的单子叶植物包括如稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)和玉米(Zeamays)。
此外，还在以下植物中观察到了从细胞(不一定是转化的)再生完整植物：杏(Prunus armeniaca)、芦笋(Asparagus officinalis)、香蕉(hybridMusa)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、樱桃(hybrid Prunus)、葡萄(Vitisvinifera)、芒果(Mangifera indica)、甜瓜(Cucumis melo)、咖啡黄葵(Abelmoschus esculentus)、洋葱(hybrid Allium)、橙(Citrus sinensis)、木瓜(Carrica papaya)、桃(Prunus persica)、欧洲李(Prunus domestica)、梨(Pyrus communis)、菠萝(Ananas comosus)、西瓜(Citrullus vulgaris)和小麦(Triticum aestivum)。
将再生植物转移至标准土壤环境并以常规方式栽培。在表达载体稳定整合进再生转基因植物之后，可以通过无性繁殖或通过有性杂交将其转移至其他植物。例如，在无性繁殖的作物中，可以通过插条或通过组织培养技术繁殖成熟的转基因植物，以产生多个相同的植物。在种子繁殖的作物中，将成熟转基因植物自交以产生能通过孟德尔遗传将转基因传递至后代的纯合近交植物。近交植物产生含有目的核酸序列的种子。可以培养这些种子以产生可产生所选表型的植物。近交植物还可用于通过使近交植物与其他近交植物杂交产生杂种来产生新的杂种。
可以通过PCR分析、抗生素或除草剂抗性、酶分析和/或DNA印迹验证转化来证实细胞、组织和植物的转基因性质。可以获得并分析再生植物的后代以确认转基因是否可遗传。转基因的遗传力也证实了植物中转基因的稳定转化。可以以惯常的方式繁殖得到的植物。应该培养两个或更多世代以确保基因组整合是稳定并可遗传的。已经描述了相应方法(Jenes 1993；Potrykus 1991)。
7.筛选、分离的进行和转录终止序列的用途
将待评估其转录终止效率的一种或多种DNA序列或甚至是序列文库插入筛选构建体或筛选载体之后，将这些载体交付适当的体外或体内筛选系统。
取决于使用的附加序列，可以通过本领域技术人员熟知的多种方法检测易于检测的特征或其变化。可以通过设置某些截断限制来控制筛选系统的“输出”(如不同转录终止子序列的数目)及其效率。例如颜色或荧光的某一强度(在特征为颜色的情况下)、针对毒性化合物的某一抗性(在特征为抗性的情况下)。
来自筛选过程的筛选构建体、筛选载体或含有它们的细胞或生物可用于分离和分析其中包含的转录终止序列。可以通过多种方法进行分离，包括但不仅限于插入位点中的序列的PCR介导的扩增，其中使用对所述插入位点侧翼已知区域具有特异性的引物。
分离的转录终止子序列可在生物技术中用于多种目的，优选用于需要严紧转录终止控制(即低连读频率)的基因表达构建体的构建。可以按照已描述(如Maniatis 1989；Silhavy 1984；和Ausubel 1987)的多种惯用重组和克隆技术产生这些表达盒(在5’-3’方向上由例如启动子、目的基因和分离的转录终止序列组成)。本领域技术人员了解，在此上下文中可以使用多种序列作为目的基因，例如用于提高食品和饲料的品质、产生化学品、精细化学品或药物(如维生素、油、碳水化合物，Dunwell 2000)、赋予对除草剂的抗性或赋予雄性不育。此外，可以增强生长、产量和对非生物和生物胁迫因素(如真菌、病毒、线虫或昆虫)的抗性。可以通过过表达蛋白质或降低内源蛋白质的表达(如表达相应的反义(Sheehy 1988；US 4,801,340；MoI1990)或双链RNA(Matzke 2000；Fire 1998；Waterhouse 1998；WO99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO00/49035；WO 00/63364))来赋予有利特性。
本领域普通技术人员会理解，对本文所述方法和应用的其他合适的修饰和改变是显而易见的，并可以不背离本发明或其任何实施方案而产生这些修饰和改变。详细描述本发明之后，同样可以通过下文实施例可以更清楚地理解，所述实施例仅以说明目的包括于此，并不旨在限定本发明。
序列
1.SEQ ID NO：1双元表达载体
          Lo546b-pSUN1-R4-Lo484∷Lo376∷Lo522b
2.SEQ ID NO：2双元表达载体
          Lo546a-pSUN1-R4-Lo484∷ Lo376∷Lo522a
3.SEQ ID NO：3核酸构建体
          Lo522b-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos
4.SEQ ID NO：4核酸构建体
          Lo522a-pENTR-C1-STPT-npfII-IRnos
5.SEQ ID NO：5双元表达载体
          Lo523b-pSUN1-R4-Lo484∷Lo376∷Lo503b
6.SEQ ID NO：6双元表达载体
          Lo523a-pSUN1-R4-Lo484∷Lo376∷Lo503a
7.SEQ ID NO：7核酸构建体
          Lo503b-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos
8.SEQ ID NO：8核酸构建体
          Lo503a-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos
9.SEQ ID NO：9核酸构建体
          Lo484-pENTR-A1-inv-35s-GFP-E9
10.SEQ ID NO：10-46：编码适于作为转录终止子和表达盒隔离子的序列的来自稻(Oryza sativa sbsp.japonica)的核酸序列
11.SEQ ID NO：47：引物1(SacI、AvrII、SpeI，OCS 5′)
5’-CG GAGCTC CCTAGG ACTAGT tcgaccggcatgccc-3’
12.SEQ ID NO：48引物2  (NotI，OCS 3′)
        5’-CC GCGGCCGC agcttggacaatcag-3’
13.SEQ ID NO：49引物3(AvrII、XmaI，RsrII，LuF5′)
5’-CG CCTAGG CCCGGG CGGACCG cattaagaagggccc-3′
14.SEQ ID NO：50引物4(SpeI，LuF3′)
          5’-CG ACTAGT agagagttctcagagc-3’
15.SEQ ID NO：51引物5(RsrII、BspEI、靶基因序列5′)
           5’CG CGGACCG TCCGGA-N-3’
         [N代表优选10至20个碱基的基因特异性序列]
16.SEQ ID NO：52引物6(SpeI、AgeI、靶基因序列3′)
           5’CG ACTAGT ACCGGT-N-3’
         [N代表优选10至20个碱基的基因特异性序列]
17.SEQ ID NO：53    pTOI3
18.SEQ ID NO：54    pTOI4
19.SEQ ID NO：55    寡核苷酸引物Loy482-NosT-upper-SalI
5’-AAATTTGTCGACCGATCGGTCAAACATT-3’
20.SEQ ID NO：56  寡核苷酸引物Loy483-NosT-Lower-HindIII
5’-AAATTTAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGATGACA-3’
21.SEQ ID NO：57 寡核苷酸引物Loy494-Gus_upper_SalI_间隔臂
5’-TTTTAGTCGACACGCTGGACTGGCATGAACT-3’
22.SEQ ID NO：58  寡核苷酸引物Loy492-NosT-lower-BglII SpeI
5’-TTTTAAGATCTACTAGTCCGATCTAGTAACATAGATGACA-3’
23.SEQ ID NO：59 寡核苷酸引物Loy493_Gus_upper_SalL_间隔臂
5’-TTTAAGTCGACAAGTCGGCGGCTTTTCTGCT-3’
24.SEQ ID NO：60 寡核苷酸引物Loy492-NosT-loWer-BglII SpeI
5’-TTTTAAGATCTACTAGTCCGATCTAGTAACATAGATGACA-3’
25.SEQ ID NO：61     寡核苷酸引物JMTOIprim1
   5′-GGTTCCAAGGTACCAAAACAATGGGCGCTGATGATGTTGTT-
   GAT-3’
26.SEQ ID NO：62        寡核苷酸引物JMTOIprim2
 5′-AAGGTAGAAGCAGAAACTTACCTGGATACGTCACTTTGACCA-3’
27.SEQ ID NO：63       寡核苷酸引物JMTOIprim3
5′-TGGTCAAAGTGACGTATCCAGGTAAGTTTCTGCTTCTACCTT-3’
28.SEQ ID NO：64      寡核苷酸引物JMTOIprim4
5’-GGTTCCAAGGATCCATTTATTTTGAAAAAAATATTTG-3’
29.SEQ ID NO：65   寡核苷酸引物JMTOIprim5
  5’-GGTTCCAAGGATCCAGTATATAGCAATTGCTTTTC-3’
30.SEQ ID NO：66    寡核苷酸引物JMTOIprim6
  5’-CGAGAACCTTCGTCAGTCCTGCACATCAACAAATTTTGGTCAT-
  AAAAAAAAAAATATTAGAAAAGTTATAAATTAAAATATAC-3’
31.SEQ ID NO：67      寡核苷酸引物JMTOIprim7
  5’-CTAATATTTTTTTTTTTATGACCAAAATTTGTTGATGTGCAGGAC-
  TGACGAAGGTTCTCGCAC-3’
32.SEQ ID NO：68      寡核苷酸引物JMTOIprim8
  5’-TTGGAACCACTAGTTTATCGCCTGACACGATTTCCTGC-3’
33.SEQ ID NO：69      寡核苷酸引物JMTOIprim9
  5’-GGTTCCAAGGATCCGATCGTTCAAACATTTGGCAA-3’
34.SEQ ID NO：70     寡核苷酸引物JMTOIprim10
  5’-GGTTCCAAGGATCCGATCTAGTAACATAGATGACA-3’
35.SEQ ID NO：71     筛选构建体pJMTOI1
36.SEQ ID NO：72     筛选构建体pJMTOI2
37.SEQ ID NO：73     筛选构建体pJMTOI3
38.SEQ ID NO：74     筛选构建体pJMTOI4
39.SEQ ID NO：75     筛选构建体pJMTOI5
40.SEQ ID NO：76  Lo376-pENTR-B2
41.SEQ ID NO：77    Lo442 pSUN1-R4R3-M20(OCS10)(目标载体)
42.SEQ ID NO：78 双元载体
   Lo239-pSUN3-GWs-B1-BnAK700∷GUS∷nosT-B2(10414bp)
43.SEQ ID NO：79        双元载体Lo657-pSUN3-GWs-B1-
                     BnAK700∷GUS∷E9∷nosT∷B2(11153bp)
44.SEQ ID NO：80       GFP-引物5：
  5’-CGGCCTAGGGGCGCCCGGACCGagctgttcaccggca-3’
45.SEQ ID NO：81GFP-引物6：
   5’-CGG ACT AGT gat gta gcc ctc agg-3’
46.SEQ ID NO：82     引物7：
    5’-CGA GCT CGT GCC TTT TGG ATC G-3’
47.SEQ ID NO：83  引物8：
    5’-CGG TCC GAA CGT GGT TGG-3’
48.SEQ ID NO：84    引物9：
   5’-CGA GCT CGG CCC TAT GAA TTG G-3’
49.SEQ ID NO：85     引物10：
   5’-CGG TCC GTC TCC TTC TGC ACA C-3’
50.SEQ ID NO：86    引物11：
   5’-CGA GCT CGA TGC ATT CCT TGG AT-3’
51.SEQ ID NO：87      引物12：
      5’-CCT AGG GTT TGG AGG TAT CAA G-3’
52.SEQ ID NO：88     引物13：
   5’-CGA GCT CCG TCC GAT GTG ATT CCG TC-3’
53.SEQ ID NO：89     引物14：
   5’-CCT AGG GGC AGT GTC GGC GGT T-3’
54.SEQ ID NO：90     引物15：
   5’-CGA GCT CCA GAG TGA CAG ACA GTG A-3’
55.SEQ ID NO：91     引物16：
   5’-CCT AGG TCT TCA ACT GTC CCC A-3’
56.SEQ ID NO：92         稻终止子BPST.3(1,137bp)。此序列是
   SEQ ID NO：45所述序列的功能等价物。
57.SEQ ID NO：93    稻终止子BPST.4(BPST.3的反向互补序列)(1,137bp)。此序列是SEQ ID NO：45所述序列的功能性等价物。
58.SEQ ID NO：94   人工序列，载体pRJB058(6,849 bp))
59.SEQ ID NO：95   来自pRJB062的插入片段：插入pRJB058的SacI-RsrII片段的Nos终止子(Nos-T)序列(257bp)
60.SEQ ID NO：96 来自pRJB064的插入片段：插入SacI消化并用T4 DNA聚合酶补平的pRJB058片段的ORF序列(1,089bp)
61.SEQ ID NO：97  来自pRJB066的插入片段：插  SacI消化并用T4 DNA聚合酶补平的PRJB058片段的稻BPST.1序列(1,420bp)
62.SEQ ID NO：98  来自pRJB065的插入片段：插入SacI消化并用T4 DNA聚合酶补平的pRJB058片段的稻BPST.2序列(1,414bp)
63.SEQ ID NO：99  来自pRJB067的插入片段：插入SacI消化并用T4 DNA聚合酶补平的pRJB058片段的稻BPST.3序列(1,165bp)
64.SEQ ID NO：100     来自pRJB068的插入片段：插入SacI消化并用T4 DNA聚合酶补平的pRJB058片段的稻BPST.4(BPST.3的反向互补序列)序列(1,165bp)
65.SEQ ID NO：101    BPST.5-MCS：带有EcoRI和AvrII位点的稻BPST.5序列(1,305bp)
66.SEQ ID NO：102    BPST.6-MCS：带有EcoRI和AvrII位点的稻BPST.6序列(1,350bp)
67.SEQ ID NO：103    BPST.7-MCS：带有EcoRI和SacI位点的稻BPST.7序列(1,532bp)
68.SEQ ID NO：104    BPST.8-MCS：带有EcoRI位点的稻BPST.8序列(BPST.7的反向互补序列)(1,532bp)
69.SEQ ID NO：105     来自pRJB058的双元载体pRLI024(16,914bp)
70.SEQ ID NO：106     来自pRLI024的双元载体pRLI031(15,919bp)
71.SEQ ID NO：107     稻终止子BPST.7(1,499bp)。此序列是
   SEQ ID NO：11所述序列的功能性等价物。
72.SEQ ID NO：108   稻终止子BPST.8(BPST.3的反向互补序列)(1,499bp)。此序列是SEQ ID NO：11所述序列的功能性等价物。
实施例
化学品
除非另有说明，实施例中的化学品和试剂得自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)，限制性内切核酸酶来自New England Biolabs(Beverly，MA)或Roche(Indianapolis，IN)，寡核苷酸由MWG Biotech Inc.(High Point，NC)合成，生物化学或分子生物学测定相关的其他修饰酶或试剂盒来自Clontech(Palo Alto，CA)、Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega Corporation(Madison，Wl)或Stratagene(La JoIIa，CA)。用于细胞培养基的材料得自Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)或DIFCO(Detroit，MI)。按Sambrook(1989)所述进行用于本发明目的的克隆步骤，如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、纯化DNA片段、将核酸转移至硝酸纤维素和尼龙膜、连接DNA片段、转化大肠杆菌细胞、培养细菌、繁殖噬菌体和重组DNA的序列分析。使用ABI激光荧光DNA测序仪按照Sanger (Sanger1977)的方法对重组DNA分子测序。
实施例1：开发用于鉴定转录终止子的基因组文库
按照Qiagen植物DNA制备试剂盒(目录号12143)制备来自靶植物的基因组DNA。将1μg基因组DNA用四碱基对切割酶(如Sau3A)在37℃消化过夜或者在Hamilton注射器中机械剪切或超声处理，接着电泳(0.8％琼脂糖凝胶)并使用QIAEX II Gel Extraction Kit(目录号20021)进行凝胶纯化。将断裂的基因组DNA(500至1000bp)克隆进本文所述的筛选构建体或筛选载体。将得到的构建体和载体文库批量转化进植物细胞(见下文)。
实施例2：在计算机芯片上鉴定作为转录终止子评估的序列
除了本文所述提供用于评估其作为转录终止子序列的适用性的序列(如通过实施例1提供的基因组序列)的其他方法以外，还可以通过在计算机芯片上检索基因组数据库(如拟南芥或稻的基因组数据库)来提供序列。因此，使用来自Institute of Genome Research(TIGR；PUB_tigr_rice_genome_v4.nt               (v03212003)、PUB_tigr_rice_cds_Oct022003.nt、pubO-Sest0603(ncbi))的最新数据对整个稻基因组序列筛选潜在的植物来源终止子候选者。此筛选系统包括三个主要组分：
1)鉴定符合预定义的(如700至2000bp)基因间距离标准的配对基因；
2)测定鉴定的配对基因的表达水平和表达图式；
3)通过基因组作图在基因间序列中选择终止子候选者。
基因组作图需要以下行为：
(1)手动验证基因组序列的基因模型、编码序列(CDS)的读框和基因间结构，和(2)基于EST序列比对和CDS选择潜在目的转录终止子候选者。
2.1鉴定目的配对基因
根据最近发表的日本稻(rice japonica)基因组序列和56056个已注释的稻CDS，检索来自基因组区的56056个已注释CDS的起点和终点的坐标并计算基因间距离。产生200bp/间隔的基因间距离频数分布表，以定义适当的基因间距离。为获得潜在终止子候选者的最大值，使用700至2000bp范围内的基因间距离，导致鉴定了16058对稻基因(由头对尾、尾对头和尾对尾取向的配对基因组成)。
首先，将每对鉴定的稻CDS与稻EST数据库进行blast比对以搜索EST同源物序列。使用拼接比对基因鉴定应用程序GeneSeqerTM(1.9版(2002年10月22日)，Department of Zoology & Genetics，Iowa StateUniversity，Ames，IA 50011-3260)将与EST同源的已鉴定序列作图到获得稻CDS的同一稻基因组区上。使用MyGV(1.0版(来自NewLink Genetics，2901 South Loop Drive，Suite 3900，Ames，Iowa 50010)应用程序通过图形显示GeneSeqerTM基因组作图结果来仔细验证内在基因模型，包括5’末端外显子、3’末端外显子、CDS读框和两个基因之间的基因间结构。潜在的基因终止子候选者为
1)配对CDS读框必须是头对尾、尾对尾或尾对头取向。尾对尾取向(即所述基因的表达的方向彼此相反)是最需要的，因为基因间序列不含有启动子序列，可以使基因间序列长度最小化；
2)根据序列比对的EST序列必须证实且支持已注释CDS及其基因模型。
在这些基因间区域中，鉴定优选区域用于进一步分析，所述优选区域位于具有尾对尾定位(即所述基因的表达的方向彼此相反)的基因之间。
2.2测定基因表达水平和表达图式
将每对已鉴定稻CDS(即对应于基因间区域的侧翼基因)用于鉴定与稻EST数据库具有高同一性的相应EST序列，其中使用blastn检索，期望值设为1.0e-20。已鉴定EST序列(推测与稻CDS相同的序列)用于检索基因表达概况分析数据，所述数据来自cDNA文库克隆分布或微阵列表达。总体而言，簇/变体大小超过100个来自cDNA文库的克隆的基因认为是高水平表达的，来自微阵列表达研究的信号强度超过前25％分位数的也是如此。需要将两个配对基因的高表达丰度作为基因选择的标准。此外，可以使用在cDNA文库上的克隆分布或使用在不同实验间的微阵列表达数据评估配对基因的共表达图式。计算线性相关系数以确定基因表达的图式。证明为独特表达图式的配对基因是所希望的。使用这些标准选择了5279对稻CDs序列。
2.3确定转录物长度变异性
优选地与基因间区域侧翼基因相应的EST序列比对的3’末端必须证明就转录物长度而言具有低变异性程度。已发现这是强终止子信号的预兆。
基于以上标准，选择了37个潜在的基因间基因组序列(SEQ ID NO：10至46)用于在本发明的筛选系统中进行测试，以鉴定目的终止子。所有这些序列都位于上文所述优选的尾对尾取向的基因之间。
实施例3：用于鉴定目的终止子的体外筛选系统
开发了高通量筛选方法以在mRNA水平鉴定转录终止子。该方法包括体外转录，其中使用与多腺苷酸化RNA区和连读区杂交的单链荧光探针，如信标探针。将连读产物的荧光量与多腺苷酸化RNA的量进行比较。较强和较严紧的终止子将显示较少的连读产物量。构建对照载体以建立筛选系统(见图13以及之前对此图的说明)。
这些构建体的启动子优选为强组成型启动子(如玉米泛蛋白启动子)。为测定未偶联的转录，可以将SP6或T7噬菌体启动子用于体外转录。表达盒中的编码序列可以是任何报道基因或基因组DNA，其在5’末端包含起始密码子并在3’末端包含终止密码子，与植物基因组不具有序列同源性(如来自酵母基因组的基因间序列)。可以用任何其他已知终止子替代胭脂碱合酶终止子，作为对照或未表征基因组DNA片段以鉴定潜在的终止子候选者。
3.1载体构建
载体pBPSMM268含有GUS∷马铃薯内含子基因及其后的NOS终止子区。通过以下步骤向此载体加入玉米泛蛋白启动子∷内含子：用StuI和SmaI消化pMM268，接着平末端连接从pBPSCER043的StuI消化得到的泛蛋白启动子∷内含子片段，产生载体pTOI01。
为确保未在推定的转录终止子处发生转录终止的mRNA的有效转录物加工，将OCS终止子区克隆进pTOI01。通过以下步骤产生pTOI02：用SacI和NotI消化pTOI01，并连接使用引物1和2(SEQ ID NO 47和48)通过PCR扩增载体p1bxSuperGusQC的OCS终止子产生的SacI/NotI片段。
引物1(SacI、AvrII、SpeI，OCS 5’；SEQ ID NO：47)：
5′-CG GAGCTC CCTAGG ACTAGT tcgaccggcatgccc-3′
引物2 (NotI，OCS3′；SEQ ID NO：48)：
5′-CC GCGGCCGC agcttggacaatcag-3′
将萤火虫萤光素酶基因的片段克隆进插入位点中待评估转录终止子序列的下游，以作为仅在功能很差的终止子存在时转录的唯一序列。通过用AvrII和SpeI消化pTOI02并连接进PCR扩增产生的AvrII/SpeI片段来产生pTOI03，所述PCR扩增使用引物3和4(SEQ ID NO：49和50)从载体pGL3(R2.2)基础载体(Promega目录号E6441)扩增萤火虫萤光素酶基因(LuF)的240 bp片段。
引物3(AvrII、XmaI、RsrII，LuF5′；SEQ ID NO：49)：
5′-CG CCTAGG CCCGGG CGGACCG cattaagaagggccc-3′
引物4(SpeI LuF3′；SEQ ID NO：50)：
5′-CG ACTAGT agagagttctcagagc-3′
载体pTOI03是用于产生测试推定的转录终止子序列的构建体的基础载体。载体pTOI04包含加入了正向NOS的pTOI03，并且通过将来自pBPSCR043的含有NOS的SacI片段插入pTOI03的唯一SacI位点而产生。(阳性对照-NOS)。载体pTOI05包含加入了反向NOS的pTOI03，通过将来自pBPSCR043的反向NOS SacI片段插入pTOI03的唯一SacI位点而产生。(阴性对照-反向NOS)。
通过PCR扩增来自稻基因组DNA的推定的终止子序列(选自SEQ IDNO：10至46描述的序列)来产生载体pTOI06-pTOI10，从而在序列的5’末端产生SacI位点，在3’末端产生RsrII位点。(注：如果单个基因组元件的序列排除了这两种限制性酶的使用，则可以将备选酶AvrII或XmaI用于克隆的目的)。转录终止子的来源可以来自在计算机芯片上的筛选系统和含有500至1000bp片段的基因组文库。
3.2 BMS悬浮培养细胞的制备
在含有2％(重量/体积)蔗糖和2mg/L 2，4-二氯代苯氧基乙酸的Murashige和Skoog(MS)液体培养基中繁殖Black Mexican Sweetcorn(BMS)悬浮培养的细胞。每周将5mL稳定期细胞转移至125mL新鲜培养基，并在黑暗中在27℃、130转/分钟(rpm)运行的旋转摇床上培养。
3.3核提取物的制备
HeLa核提取物购自Promega(HeLaScribeNuclear Extract；目录号E3092)。如所描述的从BMS制备核提取物(Moreno等人，1997)。在新鲜培养三天后，通过在4℃以2000rpm(对于800mL玻璃锥形瓶为1200rpm，170×g)将500mL管离心10分钟来收获对数生长期的BMS悬浮培养细胞。打散细胞沉淀并重悬于冷HBSS(Hank平衡盐溶液；Sigma目录号H9269)。将细胞转移至50mL Corning管并在4℃以1200rpm离心。目测收集细胞提及(PCV)。打散沉淀并重悬于5×PCV的低渗缓冲液，接着在冰上使细胞膨胀10分钟。以1200rpm将细胞离心10分钟。移去上清液。在沉淀中加入一倍体积的含有0.1％NP-40的PCV低渗缓冲液并重悬细胞。将重悬细胞转移至冷的dounce匀浆器并在加入1×PMSF(500×：8.71mg/mL)之前测量总体积。将细胞匀浆10至15次并检查细胞以得到80％至90％的细胞裂解。避免过度匀浆细胞是至关重要的。在一小部分细胞中加入锥虫蓝并在显微镜下检查细胞裂解。蓝色的细胞代表细胞裂解。将细胞裂解液迅速转移至Corex 30ml管中。加入0.1体积的蔗糖恢复缓冲液并温和混合。转子和离心机必须预冷。立即在有制动的Beckman JA-20转子中以10000rpm离心细胞2分钟。小心的移出含有胞质的上清液并通过加入甘油至20％(体积/体积)并储存于-70℃来保存。用移液管分离沉淀并转移至超速离心管中的核重悬缓冲液(3mL/109个细胞)，接着加入N-α-甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)蛋白酶抑制剂(250×：10mg/mL，1mM HCI中)、亮抑酶肽(2000×：1mg/mL，dH2O中)、抑酶肽(Sigma目录号A1153；1000×：1mg/mL，dH2O中)和胃蛋白酶抑制剂A(Sigma目录号P4265；2,000×：1mg/mL，MeOH中)至1倍。使管平衡，轻柔摇动30分钟并在2℃以35000rpm在Ti454(或42000rpm在Ti70.a中)离心90分钟。将上清液转移至另一超速离心管并目测体积。在30分钟中将0.33g(NH4)2SO4/mL洒到提取物上，或者在冰上每次加入后搅拌或摇动直至盐溶解。随着蛋白质的沉淀，溶液变成乳白色，在4℃再搅拌或摇动20分钟，接着在Ti45中以35000rpm(或在Ti70.1中以32000rpm)离心30分钟。将沉淀重悬于少于1mL的透析缓冲液中(109个细胞/mL)。在超过200体积的透析缓冲液(2L)中将重悬的细胞透析一小时。透析期间更换缓冲液后再透析4小时。将经透析的提取物以35000rpm离心1小时，接着以小等分试样保存于-80℃。
低渗缓冲液
10mM HEPES，pH7.9(KOH)
0.75mM亚精胺
0.15mM精胺
0.1mM EDTA
0.1mM EGTA，pH7.5(KOH)
1mM DTT
10mM KCl
(在使用前加入蛋白酶抑制剂和DTT)
10×蔗糖恢复缓冲液
500mM HEPES，pH7.9(KOH)
7.5mM亚精胺
1.5mM精胺
10mM KCl
2mM EDTA
10mM DTT
1×蔗糖 恢复缓冲液＝1体积10×盐+9体积75％(重量/体积)蔗糖
核重悬缓冲液
20mM HEPES，pH7.9(KOH)
0.75mM亚精胺
0.15mM精胺
0.2mM EDTA
2mM EGTA，pH7.5(KOH)
1mM DTT
25％甘油
10％饱和硫酸铵
(在使用前加入蛋白酶抑制剂和DTT)
透析缓冲液
20mM HEPES，pH7.9(KOH)
20％甘油
100mM KCl
0.2mM EDTA
0.2mM EGTA，pH7.5(KOH)
2mM DTT
(在使用前加入蛋白酶抑制剂和DTT)
3.4体外测定系统
用于分子信标探针的引物序列选自(1)GUS和NOS之间，用于检测多腺苷酸化产物和(2)截短的萤火虫萤光素酶基因内，用于检测连读产物。使用Beacon Designer 3.0设计探针。选择了两种不同报道染料用于此测定(如Texas Red、Rhodamine Red、Tamra、Joe、Tox、Oregon green等)。
通过在37℃用NotI酶进行限制性酶消化使构建体线性化，接着电泳(0.8％琼脂糖凝胶)并使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(目录号20021)进行凝胶纯化。在总体积25μL的反应溶液(15μL 1∶1比例(体积/体积)HeLa和BMS核提取物的混合物，400μM ATP、CTP、GTP、UTP，400nM终浓度的两种信标探针，5mM MgCl2，mg/mL BSA)中加入1μg线性化单模板。将反应溶液在室温下温育2小时。使用Cytofluor多孔平板读数器在485nm激发波长和530nm发射波长处监控反应进展(Razik和Quatrano，1997；Yammaguchi等，1998；Liu等，2002)。如果待评估的特定转录终止子序列提供有效的转录终止，则与探针1互补的序列的表达将远高于探针2特异性序列的表达。如果序列不能有效终止，则探针1：探针2表达的比值将较低。计算多腺苷酸化RNA和连读产物之间所获得产量的比值，以确定潜在的终止子候选者(见图13B和上文对该附图的说明)。除了使用单链荧光探针以外，还可以使用逆转录酶(RT)-PCR按照本领域的方案检测产量的比值。
实施例4：用于鉴定目的终止子的体内筛选系统
4.1载体构建
4.1.1 pUC表达载体
载体pBPSMM268含有GUS∷马铃薯内含子基因和其后的NOS终止子区。通过以下步骤在此载体中加入玉米泛蛋白启动子∷内含子：用StuI和SmaI消化pMM268，接着平末端连接得自pBPSCER043的StuI消化的泛蛋白启动子∷内含子片段，产生载体pRJB051。
将绿色荧光蛋白(GFP-f)基因的片段克隆进插入位点中待评估转录终止子序列的下游，以作为仅在功能很差的终止子存在时转录的唯一序列。通过用AvrII和SpeI消化pRJB051并连接进PCR扩增产生的AvrII/SpeI片段来产生pRJB058，所述PCR扩增使用GFP引物5和6(SEQ ID NO：80和81)从载体pALGFP1扩增GFP基因(GFP-F)的260bp片段。
GFP-引物5(AvrII、KasI、RsrII，AKR GFP19 5′；SEQ ID NO：80)：
5′-CGG CCT AGG GGC GCC CGG ACC Gag ctg ttc acc ggc a-3′
GFP-引物6(SpeI，S GFP 2813′；SEQ ID NO：81)：
5′-CGG ACT AGT gat gta gcc ctc agg-3′
载体pRJB058是用于产生测试推定的转录终止子序列的构建体的基础载体。载体pRJB062(SEQ ID NO：95)包含加入了正向NOS的pRJB058(SEQ ID NO：94)，通过将来自pBPSCR043的含有NOS的SacI片段插入pTOI03的唯一SacI位点而产生。(阳性对照-NOS)。
载体pRJB063(SEQ ID NO：95的反向互补序列)包含加入了反向NOS的pRJB058，通过将来自pBPSCR043的反向NOS SacI片段插入pTOI03的唯一SacI位点而产生。(阴性对照-反向NOS)。
载体pRJB064(SEQ ID NO：96)包含加入了来自pRJB018的1.1KbORF片段的pRJB048。该序列包含来自已知可读框的内部片段，并因而应具有最小的内在转录终止活性，因此将此载体作为推定的TOI的特定转录终止的阴性对照。通过将来自pRJB018的1.1Kb HpaI/StuI片段连接进用SacI消化并用3’-5-外切核酸酶处理的pRJB058，产生载体pRJB064。
载体pRJB065(SEQ ID NO：98)和pRJB066(SEQ ID NO：97)分别包含加入了稻基因组DNA BPST.2(SEQ ID NO：33的反向互补序列)和BPST.1(SEQ ID NO：33)的pRJB058。通过用引物7和8(SEQ ID NO：82和83)扩增稻基因组DNA产生1.4Kb PCR产物：
引物7：5′-CGA GCT CGT GCC TTT TGG ATC G-3′
引物8：5′-CGG TCC GAA CGT GGT TGG-3′
TOPO克隆PCR产物以产生pTOPO BPST.1(SEQ ID NO：33)和BPST.2(SEQ ID NO：33的反向互补序列)。将由pTOPO BPST.1和BPST.2的EcoRI消化和T4 DNA聚合酶补平反应得到的1.4Kb片段连接进用SacI消化并用3’-5-外切核酸酶处理的pRJB058。pRJB065(SEQ ID NO：98)代表得到的包含BPST.2推定终止子的载体，pRJB066(SEQ ID NO：97)代表包含BPST.1序列的连接产物。
载体pRJB067(SEQ ID NO：99)和pRJB068(SEQ ID NO：100)分别包含加入了稻基因组DNA BPST.3(SEQ ID NO：92)和BPST.4(SEQ IDNO：92的反向互补序列)的pRJB058。通过用引物9和10(SEQ ID NO：84和85)扩增稻基因组DNA产生1.1Kb PCR产物：
引物9：5′-CGA GCT CGG CCC TAT GAA TTG G-3′
引物10：5′-CGG TCC GTC TCC TTC TGC ACA C-3′
TOPO克隆PCR产物以产生pTOPO BPST.3和BPST.4。将由pTOPOBPST.3和BPST.4的EcoRI消化和T4 DNA聚合酶补平反应得到的1.1Kb片段连接进用SacI消化并用3’-5-外切核酸酶处理的pRJB058。pRJB067(SEQ ID NO：99)代表得到的包含BPST.3推定终止子的载体，pRJB068(SEQ ID NO：100)代表包含BPST.4序列的连接产物。
BPST.5(SEQ ID NO：18)产生来自使用引物11和12(SEQ ID NO：86和87)的稻基因组DNA扩增的1.2Kb PCR产物：
引物11：5′-CGA GCT CGA TGC ATT CCT TGG AT-3′
引物12：5′-CCT AGG GTT TGG AGG TAT CAA G-3′
BPST.6(SEQ ID NO：10)产生使用引物13和14(SEQ ID NO：88和89)从稻基因组DNA扩增的1.3Kb PCR产物：
引物13：5′-CGA GCT CCG TCC GAT GTG ATT CCG TC-3′
引物14：5′-CCT AGG GGC AGT GTC GGC GGT T-3′
BPST.7(SEQ ID NO：107)和BPST.8(SEQ ID NO：108的反向互补序列)产生使用引物15和16(SEQ ID NO：90和91)从稻基因组DNA扩增的1.5Kb PCR产物：
引物15：5′-CGA GCT CCA GAG TGA CAG ACA GTG A-3′
引物16：5′-CCT AGG TCT TCA ACT GTC CCC A-3′
如上文所述将其他TOI候选者分离并克隆进pUC表达载体。
4.1.2双元载体
为在稳定转化的玉米植物中评估推定的TOI序列的转录终止，制备了用于农杆菌介导的玉米转化的双元载体。在附带的序列表中提供了用于载体pRLI024和pRLI031的全长T-DNA序列(分别为SEQ ID NO：105和106)。通过交换终止子区由它们产生其他载体。
通过以下步骤产生载体pRLI024：将pRJB058的4.9Kb PvuII片段连接进用PmeI消化的pLM150，产生pJB077。通过FseI/PacI消化从载体pLM299释放3.1Kb DsRed2表达盒并连接进用FseI/PacI消化的pRJB077，以产生pRLI024(SEQ ID NO：105)。
通过以下步骤产生载体pRLI025：将pRJB062的4.9Kb PvuII片段(SEQ ID NO：95)连接进用PmeI消化的pLM150，产生pJB078。通过FseI/PacI消化从载体pLM299释放3.1 Kb DsRed2表达盒并连接进用FseI/PacI消化的pRJB078，以产生pRLI025。
通过以下步骤产生载体pRLI026：将pRJB064的4.9Kb PvuII片段(SEQ ID NO：96)连接进用PmeI消化的pLM150，产生pJB079。通过FseI/PacI消化从载体pLM299释放3.1Kb DsRed表达盒并连接进用FseI/PacI消化的pRJB079，以产生pRLI026。
通过以下步骤产生载体pRLI027：将pRJB066的4.9Kb PvuII片段(SEQ ID NO：97)连接进用PmeI消化的pLM150，产生pJB080。通过FseI/PacI消化从载体pLM299释放3.1Kb DsRed表达盒并连接进用FseI/PacI消化的pRJB080，以产生pRLI027。
通过以下步骤产生载体pRLI028：将pRJB065的4.9Kb PvuII片段(SEQ ID NO：98)连接进用PmeI消化的pLM150，产生pJB081。通过FseI/PacI消化从载体pLM299释放3.1Kb DsRed表达盒并连接进用FseI/PacI消化的pRJB081，以产生pRLI028。
通过以下步骤产生载体pRLI029：将pRJB067的4.9Kb PvuII片段(SEQ ID NO：99)连接进用PmeI消化的pLM150，产生pRLI022。通过FseI/PacI消化从载体pLM299释放3.1Kb DsRed表达盒并连接进用FseI/PacI消化的pRLI022，以产生pRLI029。
通过以下步骤产生载体pRLI030：将pRJB068的4.9Kb PvuII片段(SEQ ID NO：100)连接进用PmeI消化的pLM150，产生pRLI023。通过FseI/PacI消化从载体pLM299释放3.1Kb DsRed表达盒并连接进用FseI/PacI消化的pRLI023，以产生pRLI030。
产生了备选系列的双元载体，以评估推定的TOI指导双向转录终止的能力。对于这些载体，将TOI序列以尾对尾取向克隆进两个报道表达盒之间。
用SacI消化载体pLI024(SEQ ID NO：105)以去除950bp Nos-T和来自DsRed ORF和TOI MCS之间的间插序列。使载体重新环化以产生pLI031(SEQ ID NO：106)。
用SacI消化载体pLI025以去除950bp Nos-T和来自DsRed ORF和TOI MCS之间的间插序列。使载体重新环化以产生pLI032。
用SacI消化载体pLI026以去除950bp Nos-T和来自DsRed ORF和TOI MCS之间的间插序列。使载体重新环化以产生pLI033。
用SacI消化载体pLI027以去除950bp Nos-T和来自DsRed ORF和TOI MCS之间的间插序列。使载体重新环化以产生pLI034。
用SacI消化载体pLI028以去除950bp Nos-T和来自DsRed ORF和TOI MCS之间的间插序列。使载体重新环化以产生pLI035。
用SacI消化载体pLI029以去除950bp Nos-T和来自DsRed ORF和TOI MCS之间的间插序列。使载体重新环化以产生pLI036。
用SacI消化载体pLI030以去除950bp Nos-T和来自DsRed ORF和TOI MCS之间的间插序列。使载体重新环化以产生pLI037。
如上述将其他TOI候选者分离并克隆进双元载体。
4.2用于鉴定目的终止子的测定
测试构建体包含由玉米泛蛋白启动子驱动的GUS报道基因和用于插入推定的TOI和控制序列的酶位点。TOI功能性筛选基于以下原理：在不存在功能性终止子区时，GUS mRNA将不会被有效加工，从而不能支持GUS蛋白质的高翻译水平。这些瞬时分析的结果示于表2和图14。在TOI克隆位点缺乏插入的载体不能驱动可检测的GUS表达(pRJB058；SEQ IDNO：94)这一发现支持了实验理论。插入胭脂碱合酶(Nos)终止子能回复GUS表达(pRJB062；SEQ ID NO：95)。插入来自外源蛋白质编码基因(ORF序列)内部部分的序列不引起GUS表达(pRJB064；SEQ ID NO：96)，表明在pRJB062中可见的GUS表达是由于Nos的内在转录终止活性，而不是由于在该位点插入任一DNA序列引起的非特异性效应。BPST.1(SEQ IDNO：33)和BPST.2(SEQ ID NO：33的反向互补序列)显示与用Nos(+)对照载体所看到的相当的GUS表达水平。BPST.3(SEQ ID NO：92)和BPST.4(SEQ ID NO：92的反向互补序列)始终引起显著的GUS表达，其水平似乎稍低于用Nos观察到的水平。
表2.测试终止子候选者的瞬时GUS表达
终止子候选者 GUS表达*
BPST(空)-(pRJB058；SEQ ID NO：94) - 0％
BPST(+)-Nos(pRJB062；SEQ ID NO：95) ++++ 100％
BPST(-)-ORF(pRJB064；SEQ ID NO：96) - 0％
BPST.1(pRJB066；SEQ ID NO：97) ++++ 100％
BPST.2(pRJB065；SEQ ID NO：98) ++++ 100％
BPST.3(pRJB067；SEQ ID NO：99) +++ 80％
BPST.4(pRJB068；SEQ ID NO：100) +++ 80％
*GUS组织化学测定：一系列GUS活性(-无表达至++++高表达)。
在GUS编码序列下游不包含功能性转录终止子的载体(pRJB058和pRJB064；分别为SEQ ID NO：94和96)中未观察到GUS染色。在(+)对照(pRJB062；SEQ ID NO：95)载体以及所有四种TOI候选序列(pRJB065-pRJB068，SEQ ID示于表2)中功能性终止子的存在都回复了GUS表达。
4.3稳定转化的玉米中终止子候选者的分析
使用农杆菌介导的转化(实施例11.4)将双元载体pBPSLI027、pBPSLI028、pBPSLI029和pBPSLI030转化进玉米。将BPST.1(SEQ IDNO：33)、BPST.2(SEQ ID NO：33的反向互补序列)、BPST.3(SEQ ID NO：92)或BPST.4(SEQ ID NO：92的反向互补序列)终止子控制下的GUS表达水平和模式与NOS-t控制下的进行比较。BPST.1、BPST.2、BPST.3和BPST.4应显示与瞬时测定(表2)中的观察相似的水平。此结果将表明瞬时测定可作为模式系统使用，因此是用于鉴定功能性转录终止子的重要筛选系统之一。然而，应该通过产生稳定转化的转基因植物证实瞬时测定中获得的结果。
实施例5：用于鉴定潜在转录终止子的使用基因沉默的体内筛选系统
开发了高通量筛选系统以鉴定并分离严紧转录终止序列。此方法可以节约时间，并且不涉及RNA分析。由于dsRNA分子甚至在少量时也很有效，因此仅会鉴定非常严紧的终止子(图13C)。
如上文更详细描述的，RNA可优选选自
a)编码下调必需植物基因表达的反义RNA或优选双链RNA。原则上在纯合敲除中具有致死表型的任何基因都是适用的(如八氢番茄红素去饱和酶、硝酸盐还原酶、HPPD、乙酰羟酸合酶等)；
b)编码其表达对转基因植物产生致死效应的毒性蛋白质的RNA(负选择标记如TK、codA、tyrA、白喉毒素等)。此外，适于作为除草剂靶标的任何内源基因都可用于上述方法(表1)。
5.1用于RNAi的载体构建
对于使用RNAi下调机制评估转录终止的实验，修饰pTOI03以用适当的dsRNA盒取代LuF。适当的RNAi盒包含对靶基因特异的200至300bp，其后是约150-200bp的间隔区序列，其后是基因特异性序列的反向重复，这样在转录时由形成dsRNA茎区的基因特异性序列形成发夹结构。RNAi靶标可以是在下调后提供致死性或可筛选表型的任何基因(如AHAS、bar、除草剂靶基因(见表1)或其他必需内源基因如持家基因)。通过PCR使用引物5和6(SEQ ID NO：51和52)扩增产生基因特异性序列，其中使用适当的限制性位点用于正向和反向取向：
引物5(RsrII，BspEI，靶基因序列5′；SEQ ID NO：51)：
5′CG CGGACCG TCCGGA-N-3′
[N：优选10至20个碱基的基因特异性序列]
引物6(SpeI，AgeI，靶基因序列3′；SEQ ID NO：52)：
5′-CG ACTAGT ACCGGT-N-3’
[N：优选10至20个碱基的基因特异性序列]
通过：(1)用RsrII和SpeI消化的pTOI03，(2)用RsrII和AgeI消化的靶基因PCR产物，(3)具有AgeI和BspEI末端的间隔区序列，和(4)用BspEI和SpeI消化的靶基因PCR产物之间的四向连接(four-way ligation)产生RNAi载体(pTOI11)。
5.2用于鉴定目的终止子的测定
通过轰击植物组织或培养细胞(实施例9.1)、通过PEG介导的(或类似方法)将DNA引入植物原生质体(实施例9.2)或通过农杆菌介导的转化(实施例9.3)进行这些实验。用于这些实验的靶组织可以是植物组织(如叶或根)、培养细胞(如玉米BMS)或用于农杆菌方案的植物组织(如未成熟胚)。
可以从计算机芯片上的转录终止子序列筛选或通过随机基因组片段文库得到作为潜在转录终止子序列的序列。只有在稳定转化的情况下植物才能在其后的世代中存活，其中在编码毒性RNA的序列之前插入有效的终止子(从而阻断其表达)。分离存活的植物，使用PCR扩增终止子序列并测序。
实施例6：使用双顺反子RNA检测的体内筛选系统
开发了利用来自脑心肌炎病毒(EMCV)(一种小RNA病毒)的内部核糖体进入位点(IRES)或植物中任一功能性IRES的系统。已经显示EMCVIRES在植物中与规范的帽介导翻译平行地有效指导内部编码蛋白质的翻译(Urwin等，2000)。此方法允许在植物组织中筛选潜在终止子序列，并提供比较多个序列之间相对终止效率的筛选。为进行这些实验，产生了含有两种可区分的荧光蛋白(FP1和FP2)的潜在双顺反子元件，其中这两个可区分的荧光蛋白被待评估的转录终止子和IRES分开。如果特定的待评估转录终止子序列提供有效的转录终止，则FP1的表达将远高于FP2的表达。如果序列不能有效终止，则FP1∶FP2表达的比值将较低。
6.1载体构建
测试构建体包含以下元件(以从5’到3’的顺序描述)。靶组织的强组成型启动子用于驱动RNA的表达，如用于在玉米叶组织中表达的泛蛋白或ScBV。最近端的可读框编码FP1(如DsRed21)，其后是用于插入潜在转录终止子序列元件的限制性位点。紧靠用于待评估的转录终止子序列的插入位点下游的是脑心肌炎病毒(EMCV)IRES元件，其后是FP2(如GFP)的可读框，其后是已知的植物转录终止子。需要存在这种下游终止子以稳定未被转录终止子序列有效终止的转录物，从而允许检测编码FP2的mRNA。如果进行农杆菌介导的转化实验，则载体必须在表达盒和选择标记基因侧翼包含LB和RB T-DNA元件(图15)。
实施例7：基于nos终止子的反向重复的系统
7.1产生用于筛选终止子活性的阳性和阴性双元载体对照构建体
为测试序列的转录终止效率，产生了这样的构建体：其具有在ntpII标记基因上游的强组成型启动子(STPT启动子)，其后是克隆了推定的终止子序列的短MCS以及来自根癌农杆菌nos基因的3’-UTR的反向重复，其中第一个重复元件相对于STPT启动子是反义取向的。无推定终止子序列的这种排列作为阴性对照：由于反向nos元件不引起转录物截短和多腺苷酸化，因此在得到的转录物中掺入了两种取向的nosT，这产生了具有3’发夹结构的转录物，引起dsRNA介导的基因特异性RNA降解，从而沉默nptII基因。将核酮糖-二磷酸羧化酶E9终止子区克隆进nptII基因和nos反向重复(nos-IR)之间作为阳性对照，其导致nptII转录物的正确终止和nptII的表达。
7.2克隆pENTR-A1-inv-35s-GFP-E9
插入终止子E9：用BamHI和KpnI打开Lo394-pENTR-A1-inv。用BamHI和KpnI从Lo424-pENTR-A1-inv-P2-E9分离E9终止子并定向连接入打开的Lo394。得到的构建体命名为Lo483-pENTR-A1-inv-E9。位点的取向为attL_4-E9-attR1。
7.3与mGFP5er基因一起插入CaMV 35S启动子
用HindIII/SmaI从Lo409-pENTR-35s-GFP5er-GUS分离CaMV 35S启动子和维多利亚水母(Aquorea Victoria)绿色荧光蛋白基因mGFP5er基因，并以定向连接进用  HindIII/EcoRV打开的Lo483-pENTR-A1-Inv-E9。位点的取向为attL4-35s-mGFP5er-E9-attR1。得到的构建体命名为Lo484-pENTR-A1-inv-35s-GFP-E9(SEQ ID NO：9)。
7.4克隆pENTR-C1-STPT-nptII-nosIR
插入STPT启动子和nptII基因：用BamHI打开Lo393-pENTR-C1。用BamHI从Lo441-pENTR1A-STPT-nptII-CatpA切出STPT启动子和nptII基因，并不定向(undirected)连接进打开的Lo393。通过菌落PCR和其后的对照消化鉴定带有正确取向的克隆。位点的取向为attR2-STPT-nptII-attL3。得到的构建体命名为Lo485-pENTR-C1-STPT-nptII。
7.5以有义取向插入终止子nosT
使用突出端引物Loy482-NosT-upper-SalI和Loy483-NosT-Lower-HindIII(SEQ ID NO：55和56)通过PCR从Lo114-pSUN3-Gus-nos扩增来自根癌农杆菌的胭脂碱合酶(nos)基因的257bp 3’-UTR区。
Loy482-NosT-upper-SalI  (SEQ ID NO：55)：
5′-AAATTTGTCGACCGATCGGTCAAACATT-3′
Loy483-NosT-Lower-HindIII(SEQ ID NO：56)：
5′-AAATTTAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGATGACA-3′
用SalI/HindIII消化得到的282 bp PCR片段并定向克隆进用SacI/HindIII打开的Lo485-pENTR-C1-STPT-nptII。位点的取向为attR2-STPT-nptII-nosT-attL3。得到的构建体命名为Lo486-pENTR-C1-STPT-nptII-nos。
7.6在nptII基因和有义nosT之间插入反义取向的第二个nos终止子元件和来自gus基因3’区的填充序列
从Lo400-pENTR1A(B)-Ln-Prom2-TypDra-nosT中将nosT和gus基因3’区的部分一起扩增。因此设计在gus序列加入SalI位点并在nosT末端加入SpeI位点和BglII位点的引物。制备了两类构建体，其中一类在nosT反向重复之间包含129bp gus间隔区序列，另一类由IR之间的155bp间隔区组成。用引物Loy494-Gus-upper-SalI-间隔区和Loy492-NosT-Lower-BglII-SpeI(SEQ ID NO：57和58)扩增较短的形式。
Loy494-Gus-upper-SalI-间隔区(SEQ ID NO：57)：
5′-TTTTAGTCGACACGCTGGACTGGCATGAACT-3′
Loy492-NosT-Lower-BglII-SpeI(SEQ ID NO：58)：
5′-TTTTAAGATCTACTAGTCCGATCTAGTAACATAGATGACA-3′
使用Loy493-Gus-upper-SalI-间隔区和Loy492-NosT-lower-BglII-SpeI扩增较长的形式。
Loy493-Gus-upper-SalI-间隔区(SEQ ID NO：59)：
5′-TTTAAGTCGACAAGTCGGCGGCTTTTCTGCT-3′
Loy492-NosT-lower-BglII-SpeI(SEQ ID NO：60)：
5 ′-TTTTAAGATCTACTAGTCCGATCTAGTAACATAG
ATGACA-3′
用SalI/BglII消化得到PCR片段并连接进用SalI/BglII打开的Lo486-pENTR-C1-STPT-nptII-nos。这使得nptII可读框后为相对STPT启动子为反义取向的nos 3’-UTR、分别来自gus序列的反义取向的129 bp间隔区或155bp间隔区和有义取向的第二个nosT。位点取向为attR2-STPT-nptII-as nosT-间隔区-s nosT-attL3。得到的构建体命名为Lo503a-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos(SEQ ID NO：8)(IR之间具有较短的间隔区)和Lo503b-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos(SEQ ID NO：7)(IR之间具有较长的间隔区)。
7.7产生阴性对照构建体
7.7.1三重LR反应产生作为阴性对照的双元表达载体
使用LRplus重组酶混合物用质粒Lo484-pENTR-A1-inv-35s-GFP-E9、Lo376-pENTR-B2(无插入片段；SEQID NO：76)和Lo503a-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos或者用Lo503b-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos和Lo442-pSUN1-R4R3(SEQ IDNO：77)分别按照生产商的说明书进行三重LR反应。得到的双元植物转化载体分别命名为Lo523a-pSUN1-R4-Lo484∷Lo376∷Lo503a(SEQ ID NO：6)和Lo523b-pSUN1-R4-Lo484∷Lo376∷Lo503b(SEQ ID NO：5)。
7.8产生阳性对照构建体
7.8.1在IRnos上游插入E9终止子
用BamHI/EcoRV从Lo444-pGST-δ-KpnI-LUC+分离E9终止子。用SpeI打开Lo503，用Pfu torbo聚合酶将5’突出端完全补平，并用BglII再次切割。将E9终止子的BglII/EcoRv片段分别定向连接进打开的载体Lo503a和Lo503b(先用SpeI消化并补平，再用BamHI消化)。位点取向为attR2-STPT-nptII-E9-IRnos-attL3。得到的构建体命名为Lo522a-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos(SEQ ID NO：4)(IR之间带有较短的间隔区)和Lo522b-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos(SEQ ID NO：3)(IR之间带有较长的间隔区)。
7.8.2三重LR反应以产生作为阳性对照的双元表达载体
使用LR plus重组酶混合物用质粒Lo484-pENTR-A1-inv-35s-GFP-E9、Lo376-pENTR-B2(无插入片段；SEQ ID NO：76)和Lo522a-pENTR-C1-STPT-nptII-E9-IRnos或者用Lo522b-pENTR-C1-STPT-nptII-E9-IRnos和Lo442-pSUN1-R4R3(SEQID NO：77)分别按照生产商的说明书进行三重LR反应。得到的双元植物转化载体分别命名为Lo546a-pSUN1-R4-Lo484∷Lo376∷Lo522a(SEQ IDNO：2)和Lo546b-pSUN1-R4-Lo484∷Lo376∷Lo522b(SEQ ID NO：1)。
实施例8.使用头对头取向的两种表达盒的基于nos终止子反向重复的系统。
8.1产生用于筛选终止子活性的阳性和阴性双元载体对照构建体
为测试推定的终止子序列的转录终止效率而产生了这样的构建体：其带有β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)标记基因上游的强种子特异性启动子(BnAK启动子)，其后是克隆了推定的终止子序列的短MCS和来自根癌农杆菌nos基因的3'-UTR区。此构建体中的第二个表达盒含有来自根癌农杆菌nos基因的启动子，其后是nptII标记基因和3’nos UTR。两个表达盒的取向均为头对头方式。在转基因植物中，无推定终止子序列的这种排列作为阴性对照：由于右手和左手表达盒都使用nos终止子，因此在得到的转录物中掺入了两种取向的nosT，产生带有互补的3’序列的GUS和nptII转录物，引起两种mRNA的杂交，从而导致序列特异性RNA降解以及β-葡糖醛酸糖苷酶和nptII基因的完全或部分沉默。作为阳性对照，将核酮糖二磷酸羧化酶E9终止子区克隆到GUS基因和nosT之间，引起转录物的正确截短并使GUS高水平表达。由于不存在互补序列，因此带有3’Tnos UTR的来自nptII标记基因的转录物不与GUS转录物相互作用，并且nptII表达不受损(图1A3)。
8.2克隆Lo239-pSUN3-GWs-B1-BnAK700∷GUS∷nosT-B2
插入启动子：通过Lo229的HindIII/BamHI消化分离种子特异性启动子BnAK700，并插入载体Lo215 pENTR-MCS∷GUS∷nosT中以产生Lo235 pENTR-B-BnAK700∷GUS∷nosT。
通过Lo235与Gateway目的载体Lo125 pSUN3-GWs-NPTII的LR反应产生Lo 239(SEQ ID NO：78)(图10)。
8.3克隆Lo657-pSUN3-GWs-B1-BnAK700∷GUS∷E9∷nosT∷B2
插入E9终止子：用Ecl136II切割Gateway Entry载体Lo235产生平末端。通过用EcoRV和KpnI限制性切割Lo489产生E9插入片段并用Klenow片段补平。将平末端插入片段连接进线性化载体以产生Lo654pENTR-BnAK700∷GUS.E9∷nosT。通过L0654与Gateway目标载体Lo125 pSUN3-GWs-NPTII的LR反应产生Lo657(SEQ ID NO：79)(图10)。
实施例9：通过将目的序列嵌入致死基因或报道基因内含子中开发用于鉴定终止子的体内筛选系统
将目的终止子(TOI)嵌入致死基因(包括但不仅限于白喉毒素片段A(DT-A))或报道基因(包括但不仅限于绿色荧光蛋白(GFP))的内含子中(见图16A)。如果转录终止的效率低(“渗漏”TOI)，则全长致死或报道基因有一定的转录。带有嵌入TOI的内含子从转录的RNA中去除，允许翻译全长致死或报道蛋白。在使用致死基因的实例中，全长DT-A的表达杀死细胞。如果由于有效的转录终止(“严紧”TOI)，TOI不允许产生连读RNA产物，则仅有部分蛋白质被翻译，植物细胞可以存活。在使用GFP的实例中，渗漏TOI得到全长GFP和发出绿色荧光的细胞。严紧TOI仅产生部分GFP蛋白，细胞不发出荧光。构建对照构建体，其没有内含子中嵌入的TOI(图16B)和具有内含子中嵌入的已知终止子NOS(图16C)。
优选地，在这些构建体中使用强组成型启动子，如玉米泛蛋白启动子(Zmubi)。在盒的末端加入章鱼碱合酶终止子(OCS)以稳定连读产物。使用的内含子序列是经修饰以提高内含子剪接效率的马铃薯内含子(PIV2)。修饰的PIV2内含子含有以下元件以在植物中促进有效的内含子识别和剪接(图17)：
(1)在5’剪接位点由中等AU含量(外显子)向高AU含量(内含子)的过渡。
(2)在3’剪接位点由高AU含量(内含子)向中等AU含量(外显子)的过渡。
(3)共有5’剪接识别序列CAG/GUAAGU。“/”代表剪接位点。
(4)共有3’识别序列GCAG/G。
(5)3’剪接位点上游的共有分支点序列CURAY。
(6)紧靠分支点序列下游和3’剪接位点上游的多聚U段。
在接近内含子中心处加入BamHI限制性位点以用于插入目的转录终止子(TOI)。BamHI位点与Sau3AI相容，因此可理想地用于插入通过部分Sau3AI消化产生的基因组DNA片段。可以用其他限制性位点替换BamHI位点，以适应通过其他方法产生的TOI文库。可以将图15的盒置于双元载体中用于农杆菌介导的植物转化，或者置于基于pUC的载体中用于生物射弹转化。还参阅上面对图16的说明。
9.1载体构建
使用上文所述的亲本载体pTOI03构建图16中的构建体2(DT-A形式)。用KpnI和SpeI消化pTOI03以去除GUSint基因而留下ZmUbi启动子和OCS终止子。通过使用以下引物的重叠PCR将DT-A基因前一半的3’末端与PIV2内含子前一半的5’末端融合：
JMTOIprim1(SEQ ID NO：61)
5′-GGTTCCAAGGTACCAAAACAATGGGCGCTGATGATGTTGTTGAT-3’
JMTOIprim2(SEQ ID NO：62)
5′-AAGGTAGAAGCAGAAACTTACCTGGATACGTCACTTTGACCA-3’
JMTOIprim3(SEQ ID NO：63)
5′-TGGTCAAAGTGACGTATCCAGGTAAGTTTCTGCTTCTACCTT-3’
JMTOIprim4(SEQ ID NO：64)
5′-GGTTCCAAG GATCCATTTATTTTGAAAAAAATATTTG-3’
此重叠PCR将KpnI位点置于融合序列DT-A部分的5’末端，其后是ATG起始密码子，其之前是用于增强翻译的碱基AAAACA。它还产生DT-A和内含子序列之间的共有5’剪接位点和5’剪接位点下游133 bp的BamHI位点。通过使用下列引物的重叠PCR将PIV2内含子后一半的3’末端与DT-A基因后一半的5’末端融合：
JMTOIprim5(SEQ ID NO：65)
5’-GGTTCCAAGGATCCAGTATATAGCAATTGCTTTTC-3’
JMTOIprim6(SEQ ID NO：66)
5’-CGAGAACCTTCGTCAGTCCTGCACATCAACAAATTTTGGTCAT
AAAAAAAAAAATATTAGAAAAGTTATAAATTAAAATATAC-3’
JMTOIprim7(SEQ ID NO：67)
5’-CTAATATTTTTTTTTTTATGACCAAAATTTGTTGATGTGCAGGA
CTGACGAAGGTTCTCGCAC-3’
JMTOIprim8(SEQ ID NO：68)
5’-TTGGAACCACTAGTTTATCGCCTGACACGATTTCCTGC-3’
此重叠PCR将BamHI位点置于PCR产物的5’末端。加入了在相对于3’剪接位点+36至+26位置的11个连续U的序列片段和PIV2内含子中天然CTAAT共有分支点序列下游两个碱基以及PIv2和DT-A序列之间的共有3’剪接位点。此重叠PCR还在DT-A可读框末端产生TAA终止密码子，其后是SpeI限制酶位点。用KpnI和BamHI消化第一种重叠PCR产物，用BamHI和SpeI消化第二种PCR产物，以三向连接将两种PCR产物与用KpnI和SpeI消化的pTOI03连接，以产生pJMTO11(SEQ IDNO：71)。该构建体包含以下特征：
特征                      位置(碱基)
ZmUbi启动子               (1)..(1988)
编码序列的DT-A5′末端     (2007)..(2268)
内含子                    (2269)..(2488)
编码序列的DTA-A3’末端    (2489)..(2811)
OCS终止子                 (2818)..(3030)
通过使用以下PCR引物将BamHI位点置于NOS终止子末端来构建图16C中的构建体3(DT-A形式)：
JMTOIprim9(SEQ ID NO：69)
5’-GGTTCCAAGGATCCGATCGTTCAAACATTTGGCAA-3’
JMTOIprim10(SEQ ID NO：70)
5’-GGTTCCAAGGATCCGATCTAGTAACATAGATGACA-3’
用BamHI消化此PCR产物并连接进pJMTOl1的PIV2内含子中的唯一BamHI位点。筛选连接产生的质粒以鉴定具有正确的NOS取向的质粒，得到pJMTOI2(SEQ ID NO：72)。该构建体包含以下特征：
特征                      位置(碱基)
ZmUbi启动子               (1)..(1988)
编码序列的DT-A5′末端     (2007)..(2268)
内含子5’末端             (2269)..(2380)
Nos终止子                 (2387)..(2639)
内含子3′末端             (2646)..(2747)
编码序列的DTA-A3’末端    (2748)..(3070)
OCS终止子                 (3077)..(3289)
实施例10：有效终止子的体内筛选
在此实施例中，将目的终止子(TOI)置于报道基因(如绿色荧光蛋白(GFP))和与植物基因没有或几乎没有同源性并且是dsRNA介导的RNA沉默的靶标的序列之间(图18)。每个这些元件都在单个启动子的控制之下，在此实施例中为玉米泛蛋白启动子(ZmUbi)。在植物中表达时，如果TOI不终止质粒(渗漏TOI)，则完整转录物(包括编码GFP的区域)通过RNA沉默降解。如果TOI发挥终止子功能，则RNA将不是RNA沉默的靶标并将产生GFP，产生发出绿色荧光蛋白的植物(图18)。可以通过基因组DNA的断裂或通过更具选择性的方法获得TOI。
将BamHI位点置于图18中构建体3的GFP和间隔区之间的接点处，用于插入TOI(构建体1)或NOS终止子(构建体2，pJMTOI3，SEQ ID NO：73)。BamHI位点与Sau3AI相容，因而可以理想地用于插入通过部分Sau3AI消化产生的基因组DNA片段。可以用其他限制性位点替换BamHI位点，以适应通过其他方法产生的TOI文库。图18的盒可以置于双元载体中用于农杆菌介导的植物转化。构建体2(pJMTOI3)包含以下特征：
特征           位置(碱基)
ZmUbi启动子    (1)..(1988)
GFP            (2001)..(2696)
NOS终止子      (2703)..(2955)
间隔区         (2962)..(3161)
RNAi靶标       (3162)..(3461)
OCS终止子      (3468)..(3680)
为进行此实施例中描述的终止子筛选，必须建立能有效沉默含有RNAi靶区域的RNA的植物株系。在此实施例中使用拟南芥作为宿主生物，然而该筛选可用于可被转化的任何植物物种。可以使用已建立的转化和遗传筛选技术按以下步骤获得可有效沉默的植物。
1)用图18中的构建体3(pJMTOI4，SEQ ID NO：74)转化野生型拟南芥。选择具有构建体3单拷贝并发出强绿色荧光的T1植物。构建体3(pJMTOI4)包含以下特征：
特征           位置(碱基)
ZmUbi启动子    (1)..(1988)
GFP            (2001)..(2696)
间隔区         (2703)..(2902)
RNAi靶标       (2903)..(3202)
OCS终止子      (3209)..(3421)
2)用图18中的构建体4(pJMTOI5，SEQ ID NO：75)转化荧光T1植物。从此转化中选择这样的T1植物：构建体3为单拷贝为半合子，构建体4为单拷贝，并且不再发出绿色荧光(沉默植物)。构建体4(pJMTOI5)包含以下特征：
特征    位置(碱基)
ZmUbi启动子     (1)..(1988)
RNAi靶标有义    (2001)..(2300)
间隔区          (2309)..(2595)
RNAi靶标反义    (2602)..(2901)
NOS终止子       (2908)..(3160)
3)得到关于构建体4(pJMTOI5)的T2植物，其对于构建体4为纯合的、构建体3为无效的。为了产生额外的沉默植物，可以从步骤3中分离的植物得到T3植物。
建立含有构建体4的拟南芥沉默株系之后，可以用含有质粒TOI文库的构建体1和对照构建体2和3(分别为图18中pJMTOI3和pJMTOI4)转化此株系。T1植物发出程度相似的荧光，选择转化了构建体2的植物用于进一步分析。如果选择的植物具有单一整合体，则靶定GFP和RNAi靶区域的定量RT-PCR可以确定实验TOI是否作为有效的终止子。用构建体2(pJMTOI3)和构建体3(pJMTOI4)的转化的植物的RT-PCR作为对照。如果选择的植物具有构建体1的多个整合体，则可以从T2世代获得单一整合体。可以通过PCR扩增和克隆来自选择的植物的TOI。
实施例11：用于鉴定目的终止子的测定
通过轰击植物组织或培养细胞(实施例11.1)、通过PEG介导(或类似方法)的将DNA引入植物原生质体(实施例11.2)或通过农杆菌介导的转化(实施例11.3)进行这些实验。用于这些实验的靶组织可以是植物组织(如已描述叶组织可最好地支持IRES介导的翻译(Urwin等，2000))、培养的植物细胞(如玉米BMS)或用于农杆菌方案的植物胚。
可以通过计算机芯片上的转录终止子序列筛选或通过随机基因组片段文库得到作为潜在转录终止子序列的序列。通过定量报道基因的表达或使用本领域方案通过RT-PCR测定两种不同报道基因的表达比率，以确定潜在的强和严紧的终止子候选者。
11.1使用微粒轰击进行瞬时测定
使用Qiagen质粒试剂盒(目录号12143)分离质粒构建体。按照Sanford等(1993)所述方案将DNA沉淀到0.6μM金颗粒(Bio-Rad目录号165-2262)上并使用PDS-1000/He系统设备(Bio-Rad)加速到靶组织上(两周龄的玉米叶、BMS培养的细胞等)。室温下在无菌条件下进行所有的DNA沉淀和轰击步骤。
将2mg金颗粒(2mg/3次轰击)重悬于100％乙醇，接着在Eppendorf管中以2000转/分钟(rpm)在Beckman Microfuge 18离心机中离心。将沉淀在无菌蒸馏水中洗涤一次，离心并重悬于25μL 1μg/μL的总DNA中。在管中加入以下试剂：220μL H2O、250μL 2.5M CaCl2、50μL 0.1M亚精胺、游离碱。将DNA溶液短暂涡旋后置于冰上5分钟，接着在BeckmanMicrofuge 18离心机中以500rpm离心5分钟。除去上清液。将沉淀重悬于600μL乙醇，接着以14000rpm离心1分钟。将最终的沉淀重悬于36μL乙醇，立即使用或在轰击前在冰上存放长达4小时。就轰击而言，将二周龄玉米叶剪下约1cm长，置于2英寸直径的无菌Whatman滤纸上。对于BMS培养的细胞的情况，将5mL一周龄悬浮细胞缓慢真空过滤到置于滤器上的2英寸直径滤纸单元上以除去多余的液体。轰击之前，将盛有植物材料的滤纸置于渗透诱导培养基(N6 1-100-25，0.2M甘露醇、0.2M山梨糖醇)上在27℃置于黑暗中2-3小时。轰击前几分钟，将滤纸从培养基上取出并置于打开的无菌培养皿上以使愈伤组织表面部分干燥。为保持植物材料的位置，将灭菌的丝网筛放在样品上。用10μL金-DNA溶液轰击每个平板，对于叶材料以2200psi轰击一次，对于BMS培养的细胞以1100psi轰击两次。轰击之后，将盛有样品的滤纸转移至MS基础培养基上，并在黑暗中以27℃温育2天，接着进行瞬时测定。使用本领域的方案通过定量报道基因表达或RT-PCR测定报道基因的瞬时表达水平，以确定潜在的强且严紧的终止子候选者。
11.2使用原生质体的瞬时测定
按照Sheen(1990)开发的方案进行原生质体的分离。在25℃下将玉米苗在黑暗中保持10天并在制备原生质体以前光照20小时。将叶的中间部分剪成0.5mm的条(长度约6cm)，并在含有1％(重量/体积)纤维素RS、0.1％(重量/体积)离析酶R10(均来自Yakult Honsha，Nishinomiya，Japan)、0.6M甘露醇、10mM Mes(pH5.7)、1mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM β-巯基乙醇和0.1％BSA(重量/体积)的酶溶液中23℃下温育3小时，接着以80rpm轻柔摇动10分钟以释放原生质体。通过以100×g离心2分钟、在冷的0.6M甘露醇溶液中洗涤一次、离心并重悬于冷的0.6M甘露醇(2×106/mL)来收集原生质体。
将总体积100μL无菌水中的总计50μg质粒DNA加入0.5mL玉米原生质体悬液(2×106个细胞/mL)中并轻柔混合。加入0.5mL PEG溶液(40％PEG 4000、100mM CaNO3、0.5甘露醇)并轻柔摇动下在70℃预热，接着加入4.5mL MM溶液(0.6M甘露醇、15mM MgCl2和0.1％MES)。将此混合物在室温下温育15分钟。通过以600rpm沉淀5分钟并重悬于1.0mLMMB溶液[0.6M甘露醇，4mM Mes(pH5.7)和雀麦草花叶病毒(BMV)盐(任选)]将原生质体洗涤两次，接着在黑暗中以25℃温育48小时。最终洗涤步骤之后，将原生质体收集在3mL MMB培养基中，并在25℃黑暗中温育48小时。使用本领域的方案通过定量报道基因表达或RT-PCR来测定报道基因的瞬时表达水平，以确定潜在的强且严紧的终止子候选者。
11.3双子叶植物和单子叶植物中农杆菌介导的转化
11.3.1转基因拟南芥(哥伦比亚)植物的转化和再生
为产生转基因拟南芥植物，用上文所述的多种载体构建体转化根癌农杆菌(菌株C58C1 pGV2260)。接着将农杆菌菌株用于产生转基因植物。为此，将一个转化的农杆菌菌落在4mL培养基(培养基：含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL利福平的YEB培养基)中以28℃温育过夜。接着将此培养物用于接种相同培养基中的400mL培养物，将其温育过夜(28℃，220rpm)并离心(GSA转子，8000rpm，20分钟)。将沉淀重悬于渗入培养基(1/2MS培养基、0.5g/L MES、pH5.8、50g/L蔗糖)。将悬液装入植物箱(Duchefa)，并加入100ml SILWET L-77(用聚环氧烷修饰的七甲基三硅氧烷；Osi Specialties Inc.，目录号P030196)至终浓度为0.02％。在干燥器中将装有8至12株植物的植物箱暴露于真空10至15分钟，接着自然充气。重复2或3次。其后将所有植物种在装有湿润土壤的花盆中，并在长日照条件下(日间温度22至24℃，夜间温度19℃，相对大气湿度65％)培养。6周后收获种子。
或者可以通过根转化获得转基因拟南芥植物。使用最大为8周龄植物的白色根嫩枝。为此，使用保持在无菌条件下1MS培养基(1％蔗糖、100mg/L肌醇、1.0mg/L硫胺、0.5mg/L吡哆醇、0.5mg/L烟酸、0.5g MES，pH5.7、0.8％琼脂)中的植物。将根在愈伤组织诱导培养基上培养3天(1×Gamborg B5培养基、2％葡萄糖、0.5g/L巯基乙醇、0.8％琼脂、0.5mg/L2，4-D(2，4-二氯代苯氧基乙酸)、0.05mg/L细胞分裂素)。将长度0.5cm的根节段转移至10至20mL液体愈伤组织诱导培养基(组成如上述，但未补充琼脂)中，接种1mL上述过夜农杆菌培养物(28℃、200rpm在LB中培养)并摇动2分钟。使过剩的培养基流出后，将根外植体转移至具有琼脂的愈伤组织诱导培养基，其后转移至无琼脂的愈伤组织诱导液体培养基(含500mg/L羧噻吩青霉素，SmithKline Beecham Pharma GmbH，Munich)，摇动下温育并最终转移至根诱导培养基(5mg/L 2-异戊烯基腺嘌呤磷酸、0.15mg/L吲哚-3-乙酸、50mg/L卡那霉素、500mg/L羧噻吩青霉素)。5周后并且更换1或2次培养基之后，将小绿色嫩枝转移至萌发培养基(1MS培养基、1％蔗糖、100mg/L肌醇、1.0mg/L硫胺、0.5mg/L吡哆醇、0.5mg/L烟酸、0.5g MES，pH5.7、0.8％琼脂)并再生成植物。
11.3.2作物植物的转化和再生
就转化作物植物的目的而言，可以实施使用标准转化和再生技术的农杆菌介导的植物转化(Gelvin 1995；Glick 1993)。例如，可以通过子叶或下胚轴转化来转化油菜(Moloney 1989；De Block 1989)。农杆菌和植物的选择中使用的抗生素取决于用于转化的双元载体和农杆菌菌株。一般使用卡那霉素作为选择植物标记进行油菜的选择。可以使用例如Mlynarova(1994)所述技术进行亚麻(Linum usitatissimum)中的农杆菌介导的基因转移。可以使用如EP-A1 0 424 047或EP-A1 0 397 687、US 5,376,543、US 5,169,770中所述技术进行大豆的转化。可以使用如US 5,591,616中所述技术进行玉米或其他单子叶植物的转化。使用粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取或通过碳化硅纤维技术的植物转化描述于例如Freeling & Walbot(1993)″The maize handbook″ISBN 3-540-97826-7，Springer Verlag New York)。
参考文献
下文列出的参考文献及其引用的所有参考文献都引入本文作为参考，到它们补充、解释、提供背景或教导本文使用的方法、技术和/或组合物的程度。
1.Abremski et al.(1986)J.Biol.Chem.261(1)：391
2.Allen et al.(1996)Plant Cell 8(5)，899-913
3.Allen et al.(2000)Plant Mol Biol 43(2-3)：361-76
4.An et al.(1985)EMBO J，4：277-287
5.Anandalakshmi et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(22)：13079-84
6.Andersen et al.(1989)Arch Microbiol 152：115-118
7.Anderson & Young(1985) Quantitative Filter Hybridization，in Nucleic Acid Hybridization
8.Angell et al.(1999)Plant J 20(3)：357-362
9.Araki et al.(1992) J.Mol.Biol. 225(1)：25
10.Argos et al.(1986)EMBO J.5：433-440
11.Atanassova et al.(1992)Plant J 2(3)：291-300
12.Ausubel et al.(1995)Short Protocols in Molecular Biology，3.sup.rd Edition (John Wiley &Sons
13.Bailey et al.，″Manipulation of Baculovirus Vectors，″ in Methods in Molecular Biology， Vol-ume 7：Gene Transfer and Expression Protocols， Murray(ed.)，p.147-168(The HumanaPress，Inc.1991)
14.Bartel & Szostak(1993)Science 261：1411-1418
15.Bumlein et al.(1991a)Mol Gen Genet 225(3)：459-467
16.Bumlein et al.(1991b)Mol Gen Genet 225：121-128
17.Bayley et al.(1992)Plant Mol Biol.18(2)：353-361
18.Beclin et al.(1993)Transgenics Res 2：4855
19.Beerli et al.(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(4)：1495-500
20.Beerli et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(25)：14628-14633
21.Beerli et al.(2000)J Biol Chem 275(42)：32617-32627
22.Belfort & Roberts(1997)Nucleic Acids Res 25：3379-3388
23.Bennett(1990) in Goodman and Gilman：the Pharmacological Basis of Therapeutics. 8thed. eds. Gilman AG et al.(Pergamon Press，New York) pp.1165-1181
24.Benoist et al.(1981)Nature 290：304
25.Besnard et al.(1987)Mol Cell Biol 7：4139
26.Bevan et al.(1984)Nucl Acid Res 12，8711-8720
27.Bidney et al.(1992)Plant Mol. Biol. 18：301-313
28.Blanc et al.(1996)Biochimie 78(6)：511-517
29.Bonning et al.(1994)J. Gen. Virol. 75：1551 (1994)
30.Broach et al.(1982)Cell 29：227-234
31.Brown(1991)(ed.)，Molecular Biology Labfax Academic Press
32.Bruce et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：9692-9696
33.Brummell et al.(2003)Plant J.33：793-800
34.Bustos et al.(1989)Plant Cell 1(9)：839-53
35.Calabrisi & Chabner(1990)in Goodman and Gilman：the Pharmacological Basis of Thera-peutics. 8th ed.，eds. Gilman et al.(Pergamon Press，New York)pp.1209-1263
36.Campbell(1992)J. Bacteriol.174(23)：7495
37.Canaday et al.(1992)Mol Gen Genet 235：292-303
38.Cecchini et al.(1998)Mutat Res 401(1-2)：199-206
39.Chasin et al.(1986)Som. Cell. Mol. Genet.12：555
40.Chazenbalk & Rapoport(1995)J.Biol.Chem.270：1543
41.Chen & Winans(1991)J.Bacteriol.173：1139-1144
42.Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632
43.Christensen et al.(1992)Plant Mol Biol 18：675-689
44.Christou et al.(1988)Plant Physiol 87：671-674
45.Christou et al.(1991)Bio/Technology 9：957-982
46.Chui et al.(1996)Curr Biol 6：325-330
47.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology, Stockton Press，New York N.Y.]
48.Corneille et al.(2001)Plant J 27：171-178
49.Cornell et al.(1996)317：285-290).
50.Cramer et al.(1999)Current Topics in Microbiology and Immunology 240：95-118
51.Cramer et al.(2001)FEBS Letters 498：179-182
52.Czako & Matron(1994)Plant Physio1 104：1067-1071
53.Dale & Ow(1991)Proc Nat′l Acad Sci USA 88：10558-10562
54.Damon et al.(1989)Pharmac Ther 43：155-189)
55.Datta et al.(1990b)Bio/Technology 8：736-740
56.DE 10212892
57.de Block et al.(1987)EMBO J 6：2513-2518
58.De Block et al.(1989)Plant Physiol.91：694-701)
59.de Feyter et al.(1996)Mol Gen Genet.250(3)：329-338
60.De la Pena et al.(1987)Nature 325：274-276
61.Deblaere et al.(1985)Nucl Acids Res 13：4777-4788
62.Della-Cioppa et al.(1987)Bio/Technology 5：579-584
63.Dellaporta et al.(1988)In：Chromosome Structure and Function：Impact of New Concepts，18th Stadler Genetics Symposium， 11：263-282
64.Depicker et al.(1988)Plant Cell rep 104：1067-1071
65.Dietert et al.(1982)Plant Science Letters 26：233-240
66.Donald et al.(1996)J Biol Chem 271(24)：14010-14019
67.Dotson et al.(1996)J Biol Chem 271(42)：25754-25761
68.Dotson et al.(1996)Plant J 10(2)：383-392
69.Dreier et al.(2000)J Mol Biol 303(4)：489-502
70.Dreier et at.(2001)J Biol Chem 276(31)：29466-78
71.Drocourt et al.(1990)Nucl.Acids Res.18：4009
72.Du et al.(1989)Genet Manip Plants 5：8-12
73.Dunahay et al.(1995)J Phycol 31：10004-1012
74.Dunwell(2000)J Exp Bot 51 Spec No：487-96
75.Ebinuma et al.(2000a)Proc Natl Acad Sci USA 94：2117-2121
76.Ebinuma et al.(2000b)Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt，rol A，B，C)of Agrobacteriurn as selectable markers, In Molecular Biology of Woody Plants.Kluwer Academic Publishers
77.Eichholtz et al.(1987)Somatic Cell and Molecular Genetics 13，67-76
78.Ellegren & L
Figure A20058002604901321
s(1989)J.Chromatogr.467，217
79.EP-A1 0 120 516
80.EP-A1 0 270 615
81.EP-A1 0 321 201
82.EP-A1 0 333 033
83.EP-A1 0 335 528
84.EP-A1 0 388 186
85.EP-A1 0 397 687
86.EP-A1 0 424 047
87.EP-A1 0 595 837
88.EP-A1 0 595 873
89.EP-A1 0 601 092
90.EP-A1 0 807 836
91.EP-A1 0 291 533
92.EP-A1 0 360 257
93.Erikson et al.(2004) Nat Biotechnol.22(4)：455-8
94.Etcheverry(1996)″Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture，″in Pro-tein Engineering：Principles and Practice，Cleland et al.(eds.)，p.163-181(John Wiley &Sons，Inc.
95.Fagard & Vaucheret(2000)Plant Mol Biol 43(2-3)：285-93
96.Falciatore et al.(1999)Marine Biotechnology 1(3)：239-251
97.Famulok & Mayer(1999)Curr Top Microbiol Immunol 243：123-36
98.Fedoroff & Smith(1993)Plant J 3：273- 289
99.Fire et al.(1998)Nature 391：806-811
100.Foecking et al.(1980)Gene 45：101
101.Fenwick(1985)The HGPRT system，in Molecular Cell Genetics 1st Ed.(ed Gottesman，M.) Wiley，New York，pp.333-373
102.Fraley et al.(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79：1859-1863
103.Fraley et al.(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80：4803
104.Fraley et al.(1985)CRC Crit. Rev. Plant. Sci.， 4：1-45
105.Franck et al.(1980)Cell 21：285-294
106.Franken et al.(1997)Curr Opin Biotechnol 8(4)：411-416
107.Freeling & Walbot(1994)The Maize Handbook，Chapter 116，Eds.，Springer，New York
108.Fromm et al.(1986)Nature 319：791-793
109.Fromm et al.(1990)Bio/Technology 8：833-839
110.Gallego(1999)Plant Mol Biol 39(1)：83-93
111.Gallie et al.(1987)Nucl Acids Res 15：8693-8711
112.Gardner et al.(1986)Plant Mol Biol 6：221-228
113.Gatignol et al.(1987)Mol. Gen. Genet. 207：342
114.Gatz et al.(1991)Mol Gen Genetics 227：229-237
115.Gatz et al.(1992)Plant J 2：397-404
116.Gatz et al.(1994)Mol Gen Genetics 243：32-38).
117.Gatz et al.(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48：89-108
118.Gaudin & Jouanin(1995)Plant Mol Biol.28(1)：123-36
119.Gautier et al.(1987)Nucleic Acids Res 15：6625-6641)
120.Gavilondo & Larrick(2000)Biotechniques 29(1)：128-138
121.Gelvin et al.(Eds)(1990)Plant Molecular Biology Manual；Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，The Netherlands
122.Gelvin & Schilperoort(1995)Plant Molecular Biology Manual，2nd Edition，Dordrecht：Klu-wer Academic Publ.，ISBN 0-7923-2731-4
123.GenBank Acc.No.：AB025109
124.GenBank Acc.No.：U38846
125.GenBank Acc.No.：X03677
126.GenBank Acc.-No.：AB016260(Protein_id＝″BAA87807.1)
127.GenBank Acc.-No.：AE009419
128.GenBank Acc.-No.：AF212863
129.GenBank Acc.-No.：AC079674
130.GenBank Acc.-No.：J01603
131.GenBank Acc.-No.：M13422
132.GenBank Acc.-No.：M60917
133.GenBank Acc.-No.：M61151
134.GenBank Acc.-No.：AF039169
135.GenBank Acc.-No.：AB025110
136.GenBank Acc.-No.：NC002147
137.GenBank Acc.-No.：U02443
138.GenBank Acc.-No.：U10247
139.GenBank Acc.-No.：U44852
140.GenBank Acc.-No.：X00221
141.GenBank Acc.-No.：X77943
142.GenBank Acc.-No.：M12196
143.GenBank Acc.-No.：AF172282
144.GenBank Acc.-No.：X04049
145.GenBank Acc.-No.：AF253472
146.GenBank Acc.-No：J02224
147.GenBank Acc.-No.：V00470
148.GenBank Acc.-No.：V00467
149.GenBank Acc.-No：M26950.
150.GenBank Acc.-No：M32238.
151.GenBank Acc.-No：NC_003308(Protein_id＝″NP_536128.1)，
152.GenBank Acc.-No：S56903，
153.GeneBank Acc.-No.：U60066
154.Gleave et al.(1999)Plant Mol Biol 40(2)：223-235
155.Gleeson et al.(1986)J.Gen.Microbiol.132：3459
156.Glick & Thompson(1993)Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，BocaRaton：CRC Press，ISBN 0-8493-5164-2)
157.Glimelius(1984) Physiol Plant 61：38-44
158.Gordon-Kamm et al.(1990)Plant Cell 2：603-618
159.Goring et al.(1991)Proc. Nat′l Acad.Sci.USA 88：1770-1774
160.Gorman et al.(1982)Proc. Nat′l Acad. Sci.USA 79：6777
161.Gottesman(1985)Molecular Cell Genetics，John Wiley and Sons，New York
162.Grant et al.(1995)Science 269，843-846
163.Greener & Callahan(1994)Strategies 7：32-34
164.Griesbach(1992)HortScience 27：620
165.Gruber et al.(1993)″Vectors for Plant Transformation，″in METHODS IN PLANT MO-LECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY； pp.89-119
166.Grussenmeyer et al.(1985) Proc. Nat′l Acad. Sci. 82：7952
167.Guerrero et al.(1993)Mol Gen Genet 224：161-168
168.Hajdukiewicz et al.(1994) Plant Mol Biol 25：989-994
169.Hamer et al.(1982)J. Molec. Appl. Genet. 1：273
170.Hansen et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91：7603-7607
171.Hardy(1985)″Bacillus Cloning Methods，″in DNA Cloning：A Practical Approach，Glover(ed.)(IRL Press)
172.Hasegawa et al.(2003)The Plant journal 33：1063-1072
173.Haselhoff & Gerlach(1988)Nature 334：585-591
174.Haseloff et al.(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94(6)：2122-2127
175.Hashida-Okado et al.(1998)FEBS Letters 425：117
176.Hayakawa et al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：9865-9869
177.Hayford et al.(1988)Plant Physiol. 86：1216
178.Hershey et al.(1991)Mol Gen Genetics 227：229-237
179.Hille et al.(1986)Plant Mol.Biol.7：171
180.Hill-Perkins & Possee(1990)J. Gen.Virol.71：971
181.Hoekema(1985)In：The Binary Plant Vector System，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Al-blasserdam，Chapter V
182.Hoekema et al.(1983)Nature 303：179-181
183.Hoess & Abremski(1990)In Nucleic Acids and Molecular Biology，vol.4.Eds.：Ecksteinand Lilley，Berlin-Heidelberg：Springer-Verlag；pp. 90-109
184.Hoess et al.(1986)Nucleic Acids Research 14(6)：2287
185.Holliger & Bohlen(1999)Cancer & Metastasis Reviews 18(4)：411-419
186.Holsters et al.(1978)Mol Gen Genet 163：181-187
187.Holtorf et al.(1995)Plant Mol Biol 29：637-649
188.Hood & Jilka(1999)Curr Opin Biotechnol.10(4)：382-6
189.Hood et al.(1986)J Bacteriol 168：1291-1301
190.http://rebase.neb.com/rebase/rebase.homing.html；
191.http://www.biomed central.com/1471-2180/1/15
192.Inze et al.(1984)Mol Gen Genet 194：265-274
193.Jacobs et al.(1988)Biochem Genet 26(1-2)：105-22
194.Janssen(1989)J Bacteriol 171(12)：6791-9)
195.Janssen et al.(1994)Annu Rev Microbiol 48：163-191
196.Jasin(1996)Trends Genet 12：224-228
197.Bennett(1990)Chapter 50：Antifungal Agents，in Goodman and Gilman′s the Pharmacol-ogical Basis of Therapeutics 8th ed.，A.G.Gilman，ed.，Pergamon Press，New York
198.Jefferson(1987b)Plant Mol.Bio.Rep.5：387-405
199.Jefferson et al.(1987a)EMBO J.6：3901-3907
200.Jenes et al.(1983)Techniques for Gene Transfer，in：Transgenic Plants，Vol. 1，Engineer-ing and Utilization，edited by Kung & Wu，Academic Press 128-143
201.Jolly et al.(1983) Proc Natl Acad Sci USA 80：477
202.Jones et al.(1987) Mol Gen Genet 210：86
203.Jorgensen et al.(1996)Plant Mol Biol 31(5)：957-973
204.Joseffson et al.(1987)J Biol Chem 262：12196-12201
205.Kado(1991)Crit Rev Plant Sci 10：1
206.Kang & Kim(2000)J Biol Chem 275(12)：8742-8748
207.Karlin-Neumannn et al.(1991)Plant Cell 3：573-582
208.Kasuga et al.(1999)Nature Biotechnology 17：276-286
209.Kaufman(1990a)Meth. Enzymol. 185：487
210.Kaufman(1990b)Meth. Enzymol. 185：537
211.Kaufman et al.(1991)Nucl.Acids Res.19：4485
212.Kavanagh(2002)Plant J.32，391-400
213.Keown(199D)Methods in Enzymology 185：527-537
214.Kilstrup et al.(1989)J Bacteriol 171：2124-2127
215.Kim et al.(2003)Biotechnology Progress 19：1620-1622
216.Kim et al.(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94(8)：3616 -3620
217.Klapwijk et al.(1980)J. Bacteriol.，141，128-136
218.Klug(1999) J Mol Biol 293(2)：215-218
219.Knoll et al.(1998)Mol Cell Biol18(2)：807-814
220.Kobayashi et al.(1995)Jpn J Genet 70(3)：409-422
221.Koechlin et al.(1966)Biochemical Pharmacology 15：434-446
222.Koncz & Schell(1986)Mol Gen Genet 204：383-396
223.Koprek et al.(1999)Plant J 19(6)：719-726
224.Krens et al.(1982)Nature 296：72-74
225.Kuersten & Goodwin(2003)Nature Reviews Genetics 4：626-637
226.Landy(1989)Ann，Rev.Biochem.58：913-949
227.Landy(1993)Curr Opin Genet Dev.3(5)：699-707
228.Last et al.(1991)Theor. Appl.Genet.81：581-588
229.Lazzeri(1984)Annals of Botany 54：341-350
230.Leffel et al.(1997)Biotechniques.23(5)：912-8
231.Lepetit et al.(1992)Mol. Gen. Genet. 231：276-285
232.Li et al.(1992)Plant Mol Biol 20：1037-1048
233.Li(1982)Plant Cell Rep 1：209-211
234.Liu et al.，(2002) Analytical Biochemistry 300：40-45
235. Lloyd & Davis et al.(1994)Mol Gen Genet.242(6)：653-657
236.Lucknow(1996)″Insect Cell Expression Technology，″in Protein Engineering：Principlesand Practice，Cleland et al.(eds.)，pages 183-218(John Wiley & Sons，Inc.).
237.Luckow et al.(1993)J. Virol. 67：4566
238.Ludwig et al.(1990)Science 247：449
239.Luo & Wu(1988)Plant Mol.Biol.Rep.6：165-174
240.Luo et al.(1996)Arch.Biochem.Biophys.329：215
241.Ma & Vine(1999)Curr Top Microbiol.Immunol.236：275-92
242.Maniatis et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Har-bor Laboratory，Cold Spring Harbor (NY)
243.Mapp et al.(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(8)：3930-3935
244.Margraff et al.(1980)Experimentia 36：846)
245.Markie(1996)Methods Mol.Biol.54：359
246.Matzke et al.(1994)Mol Gen Genet 244：219-229
247.Matzke et al.(2000)Plant Mol Biol 43：401-415
248.Matzke et al.(1989)The EMBO Journal 8(3)：643-649
249.McElroy et al.(1990)Plant Cell 2：163171
250.McKnight(1982)Cell 31：355
251.McKnight et al.(1980)Nucl Acids Res 8(24)：5931-5948
252.McKnight et al.(1980)Nucl Acids Res 8(24)：5949-5964
253.Mett et al.(1993)PNAS 90：4567-4571
254.Miki et al.(1993)″Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants″in METHODS INPLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY；pp.67-88
255.Millar et al.(1992)Plant Mol Biol Rep 10：324-414
256.Mlynarova et al.(1994)Plant Cell Report 13：282-285
257.Mlynarova et al.(2003)Plant Cell.15(9)：2203-17
258.Mlynarova et al.(2002)Genetics 160，727-40
259.Mol et al.(1990)FEBS Lett 268(2)：427-430
260.Moloney et al.(1989)Plant Cell Reports 8：238-242
261.Moreno et al.(1997)J.Immunol.158：5841-5848
262.Morganti et al.(1996)Biotechnol.Appl.Biochem.23：67
263.Mozo & Hooykaas(1991)Plant Mol.Biol.16：917-918.
264.Mullen et al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89(1)：33-37
265.Mural et al.(1983) Science 23：476-482
266.Mzoz & Moolten(1993)Human Gene Therapy 4：589-595
267.Naested et al.(1999)Plant J 18(5)：571-576
268.Nan et al.(1995)In″Biotechnology in Agriculture and Forestry，″Ed.Y.P.S.Bajaj，Sprin-ger-Verlag Berlin Heidelberg，Vol 34：145-155
269.Napoli et al.(1990)The Plant Cell 2：279-289
270.Napoli et al.(1990)Plant Cell 2：279-289
271.Nehra et al.(1994)Plant J.5：285-297
272.O′Keefe(1991)Biochemistry 30(2)：447-55
273.O′Keefe et al.(1994)Plant Physiol 105：473-482
274.Odell et al.(1985)Nature 313：810-812
275.Olhoft et al.(2001)Plant Cell Rep 20：706-711
276.Ono et al.(1997)Hum Gene Ther 8(17)：2043-55
277.Ow et al.(1986)Science 234：856-859
278.Owen et al.(1992)Biotechnology (N Y) 10(7)：790-794
279.Owens et al.(1973)Weed Science 21：63-66)
280.Padidam & Cao(2001) BioTechniqus 31：328-334
281.Paszkowski et al.(1984)EMBO J 3：2717-2722
282.Patel et al.(1995)″The baculovirus expression system，″in DNA Cloning 2：ExpressionSystems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，pages 205-244 (Oxford University Press)
283.Perera et al.(1993)Ptant Mol. Biol 23(4)：793-799；
284.Perl et al.(1996)Nature Biotechnol14：624-628
285.Pfeifer et al.(1997)Gene 188：183
286.Polak & Scholer(1975)Chemotherapy (Basel) 21：113-130
287.Polak et al.(1976)Chemotherapy 22：137-153
288.Potrykus (1991) Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42：205-225
289.Prasher et al.(1985)Biochem Biophys Res Commun 126(3)：1259-1268
290.Preston et al.(1981)J Virol 38(2)：593-605
291.Proudfoot(1986)Nature 322：562-565
292.Qian et al.(1992)J.Biol.Chem.267(11)：7794
293.Randez-Gil et al.(1995)Yeast 11：1233-1240
294.Ratcliff F et al.(2001)Plant J 25(2)：237-45
295.Rathore et al.(1993)Plant Mol Biol 21(5)：871-884
296.Raymond et al.，Yeast 14：11-23(1998)
297.Razik & Quatrano(1997)Plant Cell 9：1791-1803
298.Richardson(ed.)(1995)Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press，Inc.)
299.Risseeuw(1997)Plant J 11(4)：717-728
300.Roberts & Macelis(2001)Nucl Acids Res 29：268-269
301.Romanos et al.(1995)″Expression of Cloned Genes in Yeast，″in DNA Cloning 2：Expres-sion Systems，2.sup.nd Edition，p.123-167(IRL Press)
302.Rouster et al.(1998)Plant J 15：435-440
303.Ruiz(1998)Plant Cell 10(6)：937-46)
304.Russel(1999)，Current Topics in Microbiology and Immunology 240：119-138
305.Salomon & Puchta(1998)EMBO J 17(20)：6086-6095
306.Sambrook et al.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press；ISBN 0-87969-309-6
307.Sanford(1990)Physiologia Plantarium 79：206-209
308.Sanger et al.(1977)Proc Natl Acad Sci USA 74：5463-5467
309.Sauer(1994)Current Opinion in Biotechnology 5：521-527
310.Sautter et al.(1991)Bio/Technology 9：1080-1085
311.Scheeren-Groot et al.(1994)J. Bacteriol 176：6418-6426
312.Schena et al.(1991)Proc Nat′l Acad Sci USA 88：10421
313.Schenborn & Groskreutz(1999)Mol Biotechnol 13(1)：29-44
314.Schlaman & Hooykaas(1997)Plant J11：1377-1385
315.Schroder et al.(1984)Eur J Biochem 138：387-391
316.Schwartz(1981) Environ Health Perspect 37：75-7
317.Segal & Barbas 3rd.(2000)Curr Opin Chem Biol 4(1)：34-39
318.Sekowska et al.(2001) BMC Microbiol 1：15
319.Sengupta-Gopalan et al.(1985) Proc. Nat′l Acad.Sci.USA 82：3320-3324
320.Serino(1997)Plant J 12(3)：697-701
321.Shah et al.(1986)Science 233：478
322.Shahla et al.(1987)Plant Mole.Biol.8：291-298
323.Sharrocks et al.(1997)Int J Biochem Cell Biol 29(12)：1371-1387
324.Sheehy et al.(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：8805-8809
325.Sheen(1990)Plant Cell 2：1027-1038
326.Sheen(1995)Plant J 8(5)：777-784
327.Shewmaker et al.(1985)Virology 140：281-288
328.Shillito et al.(1985)Bio/Technology，3：1099-1103
329.Shimamoto et al.(1989)Nature 338：274-276
330.Shirsat et al.(1989)Mol Gen Genet 215(2)：326-331
331.Sidorenko et al.(2003)Transgenic Research. 12(2)：137-54
332.Silhavy et al.(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY
333.Simpson et al.(1985)EMBO J 4：723-2729
334.Smith et al.(1990)Mol Gen Genet 224：447-481
335.Sorscher et al.(1994)Gene Therapy 1：233-238
336.Srivastava & Schlessinger(1991)Gene 103：53
337.St.Clair et al.(1987)Antimicrob Agents Chemother 31(6)：844-849
338.Stalberg et al.(1996)Planta 199：515-519
339.Steinecke et al.(1992)EMBO J 11(4)：1525-1530
340.Steinecke(1995)Ribozymes，Methods in Cell Biology 50，Galbraith et al.eds，AcademicPress，Inc. p.449-460
341.Stief et al.(1989)Nature 341：343
342.Stougaard(1993)Plant J 3：755-761
343.Stringham(1979)Z Pflanzenphysiol 92：459-462
344.Sundaresan et al.(1995)Gene Develop 9：1797-1810
345.Sundaresan et al.(1995)Gene Develop 9：1797-1810
346.Svab et al.(1990)Plant Mol. Biol. 14：197
347.Tanner(1999)FEMS Microbiol Rev 23(3)：257-275
348.Taylor et al.(1985)″The APRT Systern″，pp.，311-332，M.Gottesman (ed.)，Molecular CellGenetics，John Wiley and Sons，New York
349.The Maize Handbook，Chapter 116，Freeling and Walbot，Eds.，Springer，New York(1994)
350.Thykjaer et al.(1997)Plant Mol Biol 35(4)：523-530
351.Tian et al.(1997)Plant Cell Rep 16：267-271
352.Timko et al.(1985)Nature 318：579-582
353.Tissier et al.(1999)Plant Cell 11：1841-1852
354.Tomashow et al.(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：5071-5075
355.Topfer et al.(1989)Plant Cell，1：133-139
356.Tsai et al.(1998)Adv Drug Deliv Rev 30(1-3)：23-31
357.Tucker & Burke(1997)Gene 199：25
358.Twell et al.(1983)Sex.Plant Reprod.6：217-224
359.Twell et al.(1989b)Mol Gen Genet 217：240-245
360.Ulmasov & Folk (1995) The Plant Cell 7：1723-1734
361.Upadhyaya et al.(2000)Plant Mol Biol Rep 18：227-223
362.Urwin et al.(2000)Plant J 24：583-589
363.US 4,486,533
364.US 4,599,311
365.US 4,615,974
366.US 4,661,454
367.US 4,801,340
368.US 4,845,075
369.US 4,870,008
370.US 4,882,279
371.US 4,931,373
372.US 4,935,349
373.US 4,962,028
374.US 4,975,374
375.US 4,977,092
376.US 4,987,071
377.US 4,990,446,
378.US 4,940,838
379.US 5,037,743
380.US 5,037,743
381.US 5,063,154
382.US 5,139,936
383.US 5,143,830
384.US 5,162,228
385.US 5,169,770
386.US 5,180,873
387.US 5,300,435
388.US 5,334,575
389.US 5,352,605
390.US 5,358,866；
391.US 5,376,543
392.US 5,426,041
393.US 5,501,967
394.US 5,504,200
395.US 5,584,807
396.US 5,591,616
397.US 5,608,152
398.US 5,683,439
399.US 5,716,808
400.US 5,736,383，
401.US 5,888,732
402.US 5,034,323.
403.US 5,116,742
404.US 5,254,801
405.Vagner et al.(2001)EMBO Rep. 2(10)：893-8
406.Van der Krol et al.(1990)Plant Cell 2：291-99
407.Van Laerebeke et al.(1974)Nature 252：169-170
408.Vancanneyt et al.(1990)Mol Gen Genet 220(2)：245-250
409.Vanden Elzen et al.(1985)Plant Mol Biol. 5：299
410.VanOnckelen et al.(1986)FEBS Lett. 198：357-360
411.Vasil et al.(1992) io/Technology，10：667-674
412.Velten et al.(1984)EMBO J.3(12)：2723-2730
413.Villemure et al.(2001)J.Mol.Biol.312，963-974
414.Wagner et al.(1981)Proc Natl Acad Sci USA 78(3)：1441-1445
415.Wan & Lemaux(1994)Plant Physiol. 104：3748
416.Ward et al.(1993)Plant.Mol.Biol.22：361-366
417.Waterhouse et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95：13959-64
418.Watson et al.(1975)J.Bacteriol 123：255-264
419.Watson et al.(1985)EMBO J 4(2)：277-284
420.Weeks et al.(1993)Plant Physiol 102：1077-1084
421.Whitelam(1996)Trend Plant Sci 1：286-272)
422.Wigler et al.(1977)Cell 11(1)：223-232；
423.Wigler et al.(1979)Proc Natl Acad Sci USA 76(3)：1373-6
424.Wisman et al.(1991)Mol Gen Genet 226(1-2)：120-8
425 WO 00/26388
426.WO 00/44895
427.WO 00/44914
428.WO 00/49035
429.WO 00/63364
430.WO 00/68374
431.WO 02/00900
432.WO 03/060133
433.WO 03/078629
434.WO 03/052104
435.WO 84/02913
436.WO 91/02071
437.WO 91/13980
438.WO 91/13991
439.WO 91/15585
440.WO 93/01281
441.WO 93/01294
442.WO 93/18168
443.WO 93/21334
444.WO 94/00583
445.WO 95/19443
446.WO 97/17450
447.WO 97/17451
448.WO 97/41228
449.WO 97/48814
450.WO 98/01572
451.WO 98/02536
452.WO 98/02565
453.WO 98/45456
454.WO 98/45461
455.WO 99/32619
456.WO 99/53050
457.WO 00/44914
458.WO 00/49035
459.WO 00/63364
460.WO 00/68374
461.WO 99/53050
462.Wu et al.(1997)Methods in Gene Biotechnology(CRC Press，Inc.)
463.Xiaohui Wang et al.(2001)Gene 272(1-2)：249-255
464.Yamada et al.(1985)Proc Natl Acad Sci USA 82：6522-6526
465.Yarnell & Roberts(1999)Science 284：611-615
466.Yonaha & Proudfoot(1999)Molecular Cell 3：593-600
467.Yonaha & Proudfoot(2000)EMBO J.19：3770-3777
468.Zhang et al.(2000)J Biol Chem 275(43)：33850-33860
469.Zhao et al.(1999)Microbiol Mol Biol Rev 63：405-445
470.Zheng et al.(1997) Gene 186：55
471.Zhou et al.(1990) Mol.Cell.Biol.10：4529
472.Zubko et al.(2000)Nat Biotechnol 18：442-445
473.Zupan et al.(2000)Plant J 23(1)：11-28
序列表
<110>巴斯福植物科学有限公司
<120>分离转录终止序列的方法
<130>PF 55773 PCT(PF 55773 US/PF 56876 US)
<160>108
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>12287
<212>DNA
<213>双元表达载体Lo546b-pSUN1-R4-Lo484∷Lo376∷Lo522b
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<223>attB4重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(49)..(905)
<223>CaMV 35S
<220>
<221>misc_feature
<222>(912)..(1719)
<223>编码mGFP5er
<220>
<221>terminator
<222>(1762)..(2431)
<223>E9终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2432)..(2455)
<223>attB1重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(2542)..(2565)
<223>attb2重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(2581)..(3899)
<223>STPT启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(3930)..(4777)
<223>编码nptII
<220>
<221>终止子
<222>(4816)..(5494)
<223>E9终止子
<220>
<221>终止子
<222>(5500)..(5752)
<223>互补序列：nos终止子
<220>
<221>终止子
<222>(5907)..(6169)
<223>nos终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(6283)..(6303)
<223>互补序列：attB3重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(8245)..(9352)
<223>repA
<220>
<221>rep_origin
<222>(8245)..(9352)
<223>互补序列：ColE1
<220>
<221>misc_feature
<222>(11116)..(11907)
<223>aadA标记(Spectomycin)
<220>
<221>misc_feature
<222>(12081)..(12226)
<223>RB
<400>1
caactttgta tagaaaagtt ggccatgatt acgccaagct tgcatgcctg caggtcccca    60
gattagcctt ttcaatttca gaaagaatgc taacccacag atggttagag aggcttacgc    120
agcaggtctc atcaagacga tctacccgag caataatctc caggaaatca aataccttcc    180
caagaaggtt aaagatgcag tcaaaagatt caggactaac tgcatcaaga acacagagaa    240
agatatattt ctcaagatca gaagtactat tccagtatgg acgattcaag gcttgcttca    300
caaaccaagg caagtaatag agattggagt ctctaaaaag gtagttccca ctgaatcaaa    360
ggccatggag tcaaagattc aaatagagga cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga    420
acagttcata cagagtctct tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt    480
ggagcacgac acacttgtct actccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag    540
ggcaattgag acttttcaac aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc    600
agctatctgt cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca    660
tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga    720
tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa    780
gcaagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc    840
ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagaa cacgggggac    900
tctagaggat ccaaggagat ataacaatga agactaatct ttttctcttt ctcatctttt    960
cacttctcct atcattatcc tcggccgaat tcagtaaagg agaagaactt ttcactggag    1020
ttgtcccaat tcttgttgaa ttagatggtg atgttaatgg gcacaaattt tctgtcagtg    1080
gagagggtga aggtgatgca acatacggaa aacttaccct taaatttatt tgcactactg    1140
gaaaactacc tgttccatgg ccaacacttg tcactacttt ctcttatggt gttcaatgct    1200
tttcaagata cccagatcat atgaagcggc acgacttctt caagagcgcc atgcctgagg    1260
gatacgtgca ggagaggacc atcttcttca aggacgacgg gaactacaag acacgtgctg    1320
aagtcaagtt tgagggagac accctcgtca acaggatcga gcttaaggga atcgatttca    1380
aggaggacgg aaacatcctc ggccacaagt tggaatacaa ctacaactcc cacaacgtat    1440
acatcatggc cgacaagcaa aagaacggca tcaaagccaa cttcaagacc cgccacaaca    1500
tcgaagacgg cggcgtgcaa ctcgctgatc attatcaaca aaatactcca attggcgatg    1560
gccctgtcct tttaccagac aaccattacc tgtccacaca atctgccctt tcgaaagatc    1620
ccaacgaaaa gagagaccac atggtccttc ttgagtttgt aacagctgct gggattacac    1680
atggcatgga tgaactatac aaacatgatg agctttaaga gaacggatcc ccatctgcgg    1740
ccgcctcgag catatgctag aggatcctct agctagagct ttcgttcgta tcatcggttt    1800
cgacaacgtt cgtcaagttc aatgcatcag tttcattgcg cacacaccag aatcctactg    1860
agtttgagta ttatggcatt gggaaaactg tttttcttgt accatttgtt gtgcttgtaa    1920
tttactgtgt tttttattcg gttttcgcta tcgaactgtg aaatggaaat ggatggagaa    1980
gagttaatga atgatatggt ccttttgttc attctcaaat taatattatt tgttttttct    2040
cttatttgtt gtgtgttgaa tttgaaatta taagagatat gcaaacattt tgttttgagt    2100
aaaaatgtgt caaatcgtgg cctctaatga ccgaagttaa tatgaggagt aaaacacttg    2160
tagttgtacc attatgctta ttcactaggc aacaaatata ttttcagacc tagaaaagct    2220
gcaaatgtta ctgaatacaa gtatgtcctc ttgtgtttta gacatttatg aactttcctt    2280
tatgtaattt tccagaatcc ttgtcagatt ctaatcattg ctttataatt atagttatac    2340
tcatggattt gtagttgagt atgaaaatat tttttaatgc attttatgac ttgccaattg    2400
attgacaaca tgcatcaatc gaccgggtac ccaagtttgt acaaaaaagc aggctggtac    2460
ccggggatcc tctaggtcga ccagatctga tatctgcggc cgcctcgagc atatgggcat    2520
gcaagcttgg cgtaatcatg gacccagctt tcttgtacaa agtggggtac ccggggatcc    2580
tgatagctta tactcaaatt caacaagtta tatataaatg tatagatact acaatatcat    2640
taacaaaagt caccttaaat aaatacacat atcttttatg ttctctattg ttttgcgtac    2700
gctaacacaa tttctcatat gcaaaaggat gaatgagtaa caaattacct cataagaaca    2760
atcatctttg cttacatact aatacaataa tcactcaatc aaccaataac atcaatcaca    2820
taggtttaca tacaataatc actcaatcaa cttcataaga agaatcatgt ttacttaatt    2880
catcaattat ccccaaaaac accactatta agtataaact acaacatatt tgtagtgatg    2940
ggtcaacatt tttatcatat ttaaactcgg gttccctcaa atcgagaaat agtgaacatg    3000
taatattaat tttaaatcgc aattacagaa attaattgaa tttggtcaaa tggacagaat    3060
tttatagatt gggtggaact agaaaaaaaa aaaaaaagag tatagggtga attgagtaca    3120
tgaaagtaca tggtaatcct agttaaacgc ataatacatg tgggttcatt tgtatttttt    3180
tgtaacttac gagtaaactg gctacaacaa aaaaaaatta gaagattttt ttgttttgta    3240
gaaaacccta attttagtta tagttgtata actttgataa aattataaaa ttgtattacg    3300
aaaaaagtaa taagatattc aaaaaagcct agaataacgt atatgactat gagcatgaaa    3360
ctgcaagtca aatgctgaca gacaaccata aacaaaagaa attaaataga gataccttta    3420
aaataagtaa aatttcattt ataaaaaatc tactttcttg tgaatctgtc acgttcaata    3480
atttgaagac cactcaacat acaaggtaaa taatgaaaaa taaaatctac caaaatttca    3540
atcattatta tcttccaaaa aaacaaaatt atacagatga tgatggtgat atggaacttc    3600
gattggctaa tattcactgt gtctctaaaa accatccact tatcaagata agatggaccc    3660
tacactcatc caatctaaac cagtatctca agattcttat ctaattacat cattctctac    3720
cgttagatga aattgaccat taaccctacc ataactccat acaccgcgag atactggatt    3780
aaccaaatcg agatcatcgt agccgtccga tcaacaagta ccatctcttg aaatactcga    3840
aatcctcata agtccgtccc tctttgctct cactatcaaa actctgaatt tcgatttcat    3900
ctagagtcga gcccgggcga tatcggatct cgactctagt cgagggccca tgggagcttg    3960
gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg    4020
ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc    4080
gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca    4140
ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct    4200
cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga    4260
tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg    4320
gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat    4380
cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga    4440
gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg    4500
cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg    4560
ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat    4620
agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct    4680
cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga    4740
cgagttcttc tgagcgggac ccaagctagc ttcgacggat cctctagcat atgctcgagg    4800
cggccgcaga tatcagatcc tctagctaga gctttcgttc gtatcatcgg tttcgacaac    4860
gttcgtcaag ttcaatgcat cagtttcatt gcgcacacac cagaatccta ctgagtttga    4920
gtattatggc attgggaaaa ctgtttttct tgtaccattt gttgtgcttg taatttactg    4980
tgttttttat tcggttttcg ctatcgaact gtgaaatgga aatggatgga gaagagttaa    5040
tgaatgatat ggtccttttg ttcattctca aattaatatt atttgttttt tctcttattt    5100
gttgtgtgtt gaatttgaaa ttataagaga tatgcaaaca ttttgttttg agtaaaaatg    5160
tgtcaaatcg tggcctctaa tgaccgaagt taatatgagg agtaaaacac ttgtagttgt    5220
accattatgc ttattcacta ggcaacaaat atattttcag acctagaaaa gctgcaaatg    5280
ttactgaata caagtatgtc ctcttgtgtt ttagacattt atgaactttc ctttatgtaa    5340
ttttccagaa tccttgtcag attctaatca ttgctttata attatagtta tactcatgga    5400
tttgtagttg agtatgaaaa tattttttaa tgcattttat gacttgccaa ttgattgaca    5460
acatgcatca atcgacctgc agcccaagct tgatctagtc cgatctagta acatagatga    5520
caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta    5580
aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcatta    5640
catgttaatt attacatgct taacgtaatt caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag    5700
accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatcggggaa    5760
attcgagctc ggtagcaatt cccgaggctg tagccgacga tggtgcgcca ggagagttgt    5820
tgattcattg tttgcctccc tgctgcggtt tttcaccgaa gttcatgcca gtccagcgtt    5880
tttgcagcag aaaagccgcc gacttgtcga ccgatcggtc aaacatttgg caataaagtt    5940
tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt    6000
acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta    6060
tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa    6120
actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa gcttggcgta    6180
atcatggcaa ctttattata caaagttggc attataaaaa agcattgctt atcaatttgt    6240
tgcaacgaac aggtcactat cagtcaaaat aaaatcatta ttcaacttta ttatacatag    6300
ttgataattc actggccgga tctgcttggt aataattgtc attagattgt ttttatgcat    6360
agatgcactc gaaatcagcc aattttagac aagtatcaaa cggatgttaa ttcagtacat    6420
taaagacgtc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta caccacaata    6480
tatcctgcca ccagccagcc aacagctccc cgaccggcag ctcggcacaa aatcaccacg    6540
cgttaccacc acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt    6600
cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc gaggccgcca aggcccgagg    6660
cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag atcgcgcacg cccgcgagct    6720
gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc    6780
gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg    6840
cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga    6900
acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt    6960
accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac    7020
gtctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt ctgatgccaa gctggcggcc    7080
tggccggcca gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta    7140
tttgagtaaa acagcttgcg tcatgcggtc gctgcgtata tgatgcgatg agtaaataaa    7200
caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag    7260
gcaagacgac catcgcaacc catctagccc gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc    7320
tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc    7380
aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga ccgcgacgtg aaggccatcg    7440
gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg    7500
cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg    7560
ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac    7620
aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg    7680
aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct    7740
acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg    7800
cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg    7860
taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc ggccgtccga gcgcacgcag    7920
cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt    7980
tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac    8040
cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat    8100
aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag    8160
gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg    8220
gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca ctggaacccc caagcccgag gaatcggcgt    8280
gagcggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt    8340
ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc    8400
cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc    8460
agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac gagcaaccag attttttcgt    8520
tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt    8580
ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg    8640
gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg catggccagt gtgtgggatt acgacctggt    8700
actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga taccgggaag ggaagggaga    8760
caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc    8820
cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc attcggttaa acaccacgca    8880
cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg    8940
tgaagccttg attagccgct acaagatcgt aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat    9000
cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt    9060
gctgacggtt caccccgatt actttttgat cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg    9120
cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga    9180
acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg    9240
gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct    9300
agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga    9360
gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt    9420
ggatagcacg tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg    9480
gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa    9540
aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct    9600
ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct    9660
tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg    9720
ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc    9780
gccactcgac cgccggcgcc cacatcaagg caccctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg    9840
gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg    9900
ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag    9960
ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga    10020
gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag    10080
aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt    10140
tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc    10200
aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa    10260
aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa    10320
tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc    10380
ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc    10440
cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag    10500
ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga    10560
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc    10620
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac    10680
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg    10740
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca    10800
aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa    10860
aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa    10920
ctcacgttaa gggattttgg tcatgcatga tatatctccc aatttgtgta gggcttatta    10980
tgcacgctta aaaataataa aagcagactt gacctgatag tttggctgtg agcaattatg    11040
tgcttagtgc atctaacgct tgagttaagc cgcgccgcga agcggcgtcg gcttgaacga    11100
atttctagct agacattatt tgccgactac cttggtgatc tcgcctttca cgtagtggac    11160
aaattcttcc aactgatctg cgcgcgaggc caagcgatct tcttcttgtc caagataagc    11220
ctgtctagct tcaagtatga cgggctgata ctgggccggc aggcgctcca ttgcccagtc    11280
ggcagcgaca tccttcggcg cgattttgcc ggttactgcg ctgtaccaaa tgcgggacaa    11340
cgtaagcact acatttcgct catcgccagc ccagtcgggc ggcgagttcc atagcgttaa    11400
ggtttcattt agcgcctcaa atagatcctg ttcaggaacc ggatcaaaga gttcctccgc    11460
cgctggacct accaaggcaa cgctatgttc tcttgctttt gtcagcaaga tagccagatc    11520
aatgtcgatc gtggctggct cgaagatacc tgcaagaatg tcattgcgct gccattctcc  11580
aaattgcagt tcgcgcttag ctggataacg ccacggaatg atgtcgtcgt gcacaacaat  11640
ggtgacttct acagcgcgga gaatctcgct ctctccaggg gaagccgaag tttccaaaag  11700
gtcgttgatc aaagctcgcc gcgttgtttc atcaagcctt acggtcaccg taaccagcaa  11760
atcaatatca ctgtgtggct tcaggccgcc atccactgcg gagccgtaca aatgtacggc  11820
cagcaacgtc ggttcgagat ggcgctcgat gacgccaact acctctgata gttgagtcga  11880
tacttcggcg atcaccgctt cccccatgat gtttaacttt gttttagggc gactgccctg  11940
ctgcgtaaca tcgttgctgc tccataacat caaacatcga cccacggcgt aacgcgcttg  12000
ctgcttggat gcccgaggca tagactgtac cccaaaaaaa cagtcataac aagccatgaa  12060
aaccgccact gcgttccatg gacatacaaa tggacgaacg gataaacctt ttcacgccct  12120
tttaaatatc cgattattct aataaacgct cttttctctt aggtttaccc gccaatatat  12180
cctgtcaaac actgatagtt taaactgaag gcgggaaacg acaatcagat ctagtaggaa  12240
acagctatga ccatgattac gccaagctat cgattacgcc aagctat                12287
<210>2
<211>12261
<212>DNA
<213>双元表达载体Lo546a-pSUN1-R4-Lo484∷Lo376∷Lo522a
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<223>attB4重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(49)..(905)
<223>CaMV 35S启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(912)..(1719)
<223>编码mGFP5er
<220>
<221>终止子
<222>(1762)..(2431)
<223>E9终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2432)..(2455)
<223>attB1重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(2542)..(2565)
<223>attb2重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(2581)..(3899)
<223>STPT启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(3930)..(4777)
<223>编码nptII
<220>
<221>终止子
<222>(4816)..(5494)
<223>E9终止子
<220>
<221>终止子
<222>(5500)..(5752)
<223>互补序列：nos终止子
<220>
<221>终止子
<222>(5881)..(6143)
<223>nos终止子
<g20>
<221>misc_feature
<222>(6257)..(6277)
<223>互补序列：attB3重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(6296)..(6510)
<223>LB
<220>
<221>misc_feature
<222>(8219)..(9326)
<223>repA
<220>
<221>rep_origin
<222>(10075)..(10921)
<223>互补序列：ColE1
<220>
<221>misc_feature
<222>(11090)..(11881)
<223>互补序列：aadA标记(spectomycin)
<220>
<221>misc_feature
<222>(12055)..(12200)
<223>RB
<400>2
caactttgta tagaaaagtt ggccatgatt acgccaagct tgcatgcctg caggtcccca  60
gattagcctt ttcaatttca gaaagaatgc taacccacag atggttagag aggcttacgc  120
agcaggtctc atcaagacga tctacccgag caataatctc caggaaatca aataccttcc  180
caagaaggtt aaagatgcag tcaaaagatt caggactaac tgcatcaaga acacagagaa  240
agatatattt ctcaagatca gaagtactat tccagtatgg acgattcaag gcttgcttca  300
caaaccaagg caagtaatag agattggagt ctctaaaaag gtagttccca ctgaatcaaa  360
ggccatggag tcaaagattc aaatagagga cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga  420
acagttcata cagagtctct tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt    480
ggagcacgac acacttgtct actccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag    540
ggcaattgag acttttcaac aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc    600
agctatctgt cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca    660
tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga    720
tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa    780
gcaagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc    840
ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagaa cacgggggac    900
tctagaggat ccaaggagat ataacaatga agactaatct ttttctcttt ctcatctttt    960
cacttctcct atcattatcc tcggccgaat tcagtaaagg agaagaactt ttcactggag    1020
ttgtcccaat tcttgttgaa ttagatggtg atgttaatgg gcacaaattt tctgtcagtg    1080
gagagggtga aggtgatgca acatacggaa aacttaccct taaatttatt tgcactactg    1140
gaaaactacc tgttccatgg ccaacacttg tcactacttt ctcttatggt gttcaatgct    1200
tttcaagata cccagatcat atgaagcggc acgacttctt caagagcgcc atgcctgagg    1260
gatacgtgca ggagaggacc atcttcttca aggacgacgg gaactacaag acacgtgctg    1320
aagtcaagtt tgagggagac accctcgtca acaggatcga gcttaaggga atcgatttca    1380
aggaggacgg aaacatcctc ggccacaagt tggaatacaa ctacaactcc cacaacgtat    1440
acatcatggc cgacaagcaa aagaacggca tcaaagccaa cttcaagacc cgccacaaca    1500
tcgaagacgg cggcgtgcaa ctcgctgatc attatcaaca aaatactcca attggcgatg    1560
gccctgtcct tttaccagac aaccattacc tgtccacaca atctgccctt tcgaaagatc    1620
ccaacgaaaa gagagaccac atggtccttc ttgagtttgt aacagctgct gggattacac    1680
atggcatgga tgaactatac aaacatgatg agctttaaga gaacggatcc ccatctgcgg    1740
ccgcctcgag catatgctag aggatcctct agctagagct ttcgttcgta tcatcggttt    1800
cgacaacgtt cgtcaagttc aatgcatcag tttcattgcg cacacaccag aatcctactg    1860
agtttgagta ttatggcatt gggaaaactg tttttcttgt accatttgtt gtgcttgtaa    1920
tttactgtgt tttttattcg gttttcgcta tcgaactgtg aaatggaaat ggatggagaa    1980
gagttaatga atgatatggt ccttttgttc attctcaaat taatattatt tgttttttct    2040
cttatttgtt gtgtgttgaa tttgaaatta taagagatat gcaaacattt tgttttgagt    2100
aaaaatgtgt caaatcgtgg cctctaatga ccgaagttaa tatgaggagt aaaacacttg    2160
tagttgtacc attatgctta ttcactaggc aacaaatata ttttcagacc tagaaaagct    2220
gcaaatgtta ctgaatacaa gtatgtcctc ttgtgtttta gacatttatg aactttcctt    2280
tatgtaattt tccagaatcc ttgtcagatt ctaatcattg ctttataatt atagttatac    2340
tcatggattt gtagttgagt atgaaaatat tttttaatgc attttatgac ttgccaattg    2400
attgacaaca tgcatcaatc gaccgggtac ccaagtttgt acaaaaaagc aggctggtac    2460
ccggggatcc tctaggtcga ccagatctga tatctgcggc cgcctcgagc atatgggcat    2520
gcaagcttgg cgtaatcatg gacccagctt tcttgtacaa agtggggtac ccggggatcc    2580
tgatagctta tactcaaatt caacaagtta tatataaatg tatagatact acaatatcat    2640
taacaaaagt caccttaaat aaatacacat atcttttatg ttctctattg ttttgcgtac    2700
gctaacacaa tttctcatat gcaaaaggat gaatgagtaa caaattacct cataagaaca    2760
atcatctttg cttacatact aatacaataa tcactcaatc aaccaataac atcaatcaca    2820
taggtttaca tacaataatc actcaatcaa cttcataaga agaatcatgt ttacttaatt    2880
catcaattat ccccaaaaac accactatta agtataaact acaacatatt tgtagtgatg    2940
ggtcaacatt tttatcatat ttaaactcgg gttccctcaa atcgagaaat agtgaacatg    3000
taatattaat tttaaatcgc aattacagaa attaattgaa tttggtcaaa tggacagaat    3060
tttatagatt gggtggaact agaaaaaaaa aaaaaaagag tatagggtga attgagtaca    3120
tgaaagtaca tggtaatcct agttaaacgc ataatacatg tgggttcatt tgtatttttt    3180
tgtaacttac gagtaaactg gctacaacaa aaaaaaatta gaagattttt ttgttttgta    3240
gaaaacccta attttagtta tagttgtata actttgataa aattataaaa ttgtattacg    3300
aaaaaagtaa taagatattc aaaaaagcct agaataacgt atatgactat gagcatgaaa    3360
ctgcaagtca aatgctgaca gacaaccata aacaaaagaa attaaataga gataccttta    3420
aaataagtaa aatttcattt ataaaaaatc tactttcttg tgaatctgtc acgttcaata    3480
atttgaagac cactcaacat acaaggtaaa taatgaaaaa taaaatctac caaaatttca    3540
atcattatta tcttccaaaa aaacaaaatt atacagatga tgatggtgat atggaacttc    3600
gattggctaa tattcactgt gtctctaaaa accatccact tatcaagata agatggaccc    3660
tacactcatc caatctaaac cagtatctca agattcttat ctaattacat cattctctac    3720
cgttagatga aattgaccat taaccctacc ataactccat acaccgcgag atactggatt    3780
aaccaaatcg agatcatcgt agccgtccga tcaacaagta ccatctcttg aaatactcga    3840
aatcctcata agtccgtccc tctttgctct cactatcaaa actctgaatt tcgatttcat    3900
ctagagtcga gcccgggcga tatcggatct cgactctagt cgagggccca tgggagcttg    3960
gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg    4020
ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc    4080
gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca    4140
ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct    4200
cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga    4260
tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg    4320
gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat    4380
cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga    4440
gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg    4500
cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg    4560
ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat    4620
agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct    4680
cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga    4740
cgagttcttc tgagcgggac ccaagctagc ttcgacggat cctctagcat atgctcgagg    4800
cggccgcaga tatcagatcc tctagctaga gctttcgttc gtatcatcgg tttcgacaac    4860
gttcgtcaag ttcaatgcat cagtttcatt gcgcacacac cagaatccta ctgagtttga    4920
gtattatggc attgggaaaa ctgtttttct tgtaccattt gttgtgcttg taatttactg    4980
tgttttttat tcggttttcg ctatcgaact gtgaaatgga aatggatgga gaagagttaa    5040
tgaatgatat ggtccttttg ttcattctca aattaatatt atttgttttt tctcttattt    5100
gttgtgtgtt gaatttgaaa ttataagaga tatgcaaaca ttttgttttg agtaaaaatg    5160
tgtcaaatcg tggcctctaa tgaccgaagt taatatgagg agtaaaacac ttgtagttgt    5220
accattatgc ttattcacta ggcaacaaat atattttcag acctagaaaa gctgcaaatg    5280
ttactgaata caagtatgtc ctcttgtgtt ttagacattt atgaactttc ctttatgtaa    5340
ttttccagaa tccttgtcag attctaatca ttgctttata attatagtta tactcatgga    5400
tttgtagttg agtatgaaaa tattttttaa tgcattttat gacttgccaa ttgattgaca    5460
acatgcatca atcgacctgc agcccaagct tgatctagtc cgatctagta acatagatga    5520
caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta    5580
aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcatta    5640
catgttaatt attacatgct taacgtaatt caacagaaat  tatatgataa tcatcgcaag   5700
accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatcggggaa    5760
attcgagctc ggtagcaatt cccgaggctg tagccgacga tggtgcgcca ggagagttgt    5820
tgattcattg tttgcctccc tgctgcggtt tttcaccgaa gttcatgcca gtccagcgtg    5880
tcgaccgatc ggtcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt    5940
cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg    6000
taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt    6060
taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg    6120
tcatctatgt tactagatcg ggaagcttgg cgtaatcatg gcaactttat tatacaaagt    6180
tggcattata aaaaagcatt gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca ctatcagtca    6240
aaataaaatc attattcaac tttattatac atagttgata attcactggc cggatctgct    6300
tggtaataat tgtcattaga ttgtttttat gcatagatgc actcgaaatc agccaatttt    6360
agacaagtat caaacggatg ttaattcagt acattaaaga cgtccgcaat gtgttattaa    6420
gttgtctaag cgtcaatttg tttacaccac aatatatcct gccaccagcc agccaacagc    6480
tccccgaccg gcagctcggc acaaaatcac cacgcgttac caccacgccg gccggccgca    6540
tggtgttgac cgtgttcgcc ggcattgccg agttcgagcg ttccctaatc atcgaccgca    6600
cccggagcgg gcgcgaggcc gccaaggccc gaggcgtgaa gtttggcccc cgccctaccc    6660
tcaccccggc acagatcgcg cacgcccgcg agctgatcga ccaggaaggc cgcaccgtga    6720
aagaggcggc tgcactgctt ggcgtgcatc gctcgaccct gtaccgcgca cttgagcgca    6780
gcgaggaagt gacgcccacc gaggccaggc ggcgcggtgc cttccgtgag gacgcattga    6840
ccgaggccga cgccctggcg gccgccgaga atgaacgcca agaggaacaa gcatgaaacc    6900
gcaccaggac ggccaggacg aaccgttttt cattaccgaa gagatcgagg cggagatgat    6960
cgcggccggg tacgtgttcg agccgcccgc gcacgtctca accgtgcggc  tgcatgaaat    7020
cctggccggt ttgtctgatg ccaagctggc ggcctggccg gccagcttgg ccgctgaaga    7080
aaccgagcgc cgccgtctaa aaaggtgatg tgtatttgag taaaacagct tgcgtcatgc    7140
ggtcgctgcg tatatgatgc gatgagtaaa taaacaaata cgcaagggga acgcatgaag    7200
gttatcgctg tacttaacca gaaaggcggg tcaggcaaga cgaccatcgc aacccatcta    7260
gcccgcgccc tgcaactcgc cggggccgat gttctgttag tcgattccga tccccagggc    7320
agtgcccgcg attgggcggc cgtgcgggaa gatcaaccgc taaccgttgt cggcatcgac    7380
cgcccgacga ttgaccgcga cgtgaaggcc atcggccggc gcgacttcgt agtgatcgac    7440
ggagcgcccc aggcggcgga cttggctgtg tccgcgatca aggcagccga cttcgtgctg    7500
attccggtgc agccaagccc ttacgacata tgggccaccg ccgacctggt ggagctggtt    7560
aagcagcgca ttgaggtcac ggatggaagg ctacaagcgg cctttgtcgt gtcgcgggcg    7620
atcaaaggca cgcgcatcgg cggtgaggtt gccgaggcgc tggccgggta cgagctgccc    7680
attcttgagt cccgtatcac gcagcgcgtg agctacccag gcactgccgc cgccggcaca    7740
accgttcttg aatcagaacc cgagggcgac gctgcccgcg aggtccaggc gctggccgct    7800
gaaattaaat caaaactcat ttgagttaat gaggtaaaga gaaaatgagc aaaagcacaa    7860
acacgctaag tgccggccgt ccgagcgcac gcagcagcaa ggctgcaacg ttggccagcc    7920
tggcagacac gccagccatg aagcgggtca actttcagtt gccggcggag gatcacacca    7980
agctgaagat gtacgcggta cgccaaggca agaccattac cgagctgcta tctgaataca    8040
tcgcgcagct accagagtaa atgagcaaat gaataaatga gtagatgaat tttagcggct    8100
aaaggaggcg gcatggaaaa tcaagaacaa ccaggcaccg acgccgtgga atgccccatg    8160
tgtggaggaa cgggcggttg gccaggcgta agcggctggg ttgtctgccg gccctgcaat    8220
ggcactggaa cccccaagcc cgaggaatcg gcgtgagcgg tcgcaaacca tccggcccgg    8280
tacaaatcgg cgcggcgctg ggtgatgacc tggtggagaa gttgaaggcc gcgcaggccg    8340
cccagcggca acgcatcgag gcagaagcac gccccggtga atcgtggcaa gcggccgctg    8400
atcgaatccg caaagaatcc cggcaaccgc cggcagccgg tgcgccgtcg attaggaagc    8460
cgcccaaggg cgacgagcaa ccagattttt tcgttccgat gctctatgac gtgggcaccc    8520
gcgatagtcg cagcatcatg gacgtggccg ttttccgtct gtcgaagcgt gaccgacgag    8580
ctggcgaggt gatccgctac gagcttccag acgggcacgt agaggtttcc gcagggccgg    8640
ccggcatggc cagtgtgtgg gattacgacc tggtactgat ggcggtttcc catctaaccg    8700
aatccatgaa ccgataccgg gaagggaagg gagacaagcc cggccgcgtg ttccgtccac    8760
acgttgcgga cgtactcaag ttctgccggc gagccgatgg cggaaagcag aaagacgacc    8820
tggtagaaac ctgcattcgg ttaaacacca cgcacgttgc catgcagcgt acgaagaagg    8880
ccaagaacgg ccgcctggtg acggtatccg agggtgaagc cttgattagc cgctacaaga    8940
tcgtaaagag cgaaaccggg cggccggagt acatcgagat cgagctagct gattggatgt    9000
accgcgagat cacagaaggc aagaacccgg acgtgctgac ggttcacccc gattactttt    9060
tgatcgatcc cggcatcggc cgttttctct accgcctggc acgccgcgcc gcaggcaagg    9120
cagaagccag atggttgttc aagacgatct acgaacgcag tggcagcgcc ggagagttca    9180
agaagttctg tttcaccgtg cgcaagctga tcgggtcaaa tgacctgccg gagtacgatt    9240
tgaaggagga ggcggggcag gctggcccga tcctagtcat gcgctaccgc aacctgatcg    9300
agggcgaagc atccgccggt tcctaatgta cggagcagat gctagggcaa attgccctag    9360
caggggaaaa aggtcgaaaa ggtctctttc ctgtggatag cacgtacatt gggaacccaa    9420
agccgtacat tgggaaccgg aacccgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc    9480
ggtcacacat gtaagtgact gatataaaag agaaaaaagg cgatttttcc gcctaaaact    9540
ctttaaaact tattaaaact cttaaaaccc gcctggcctg tgcataactg tctggccagc    9600
gcacagccga agagctgcaa aaagcgccta cccttcggtc gctgcgctcc ctacgccccg    9660
ccgcttcgcg tcggcctatc gcggccgctg gccgctcaaa aatggctggc ctacggccag    9720
gcaatctacc agggcgcgga caagccgcgc cgtcgccact cgaccgccgg cgcccacatc    9780
aaggcaccct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc    9840
ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc    9900
gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc    9960
ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata    10020
tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg    10080
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc    10140
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt    10200
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc    10260
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa    10320
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc    10380
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg    10440
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc    10500
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc    10560
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca    10620
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact    10680
acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg    10740
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt    10800
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct    10860
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc    10920
atgatatatc tcccaatttg tgtagggctt attatgcacg cttaaaaata ataaaagcag    10980
acttgacctg atagtttggc tgtgagcaat tatgtgctta gtgcatctaa cgcttgagtt    11040
aagccgcgcc gcgaagcggc gtcggcttga acgaatttct agctagacat tatttgccga    11100
ctaccttggt gatctcgcct ttcacgtagt ggacaaattc ttccaactga tctgcgcgcg    11160
aggccaagcg atcttcttct tgtccaagat aagcctgtct agcttcaagt atgacgggct    11220
gatactgggc cggcaggcgc tccattgccc agtcggcagc gacatccttc ggcgcgattt    11280
tgccggttac tgcgctgtac caaatgcggg acaacgtaag cactacattt cgctcatcgc    11340
cagcccagtc gggcggcgag ttccatagcg ttaaggtttc atttagcgcc tcaaatagat    11400
cctgttcagg aaccggatca aagagttcct ccgccgctgg acctaccaag gcaacgctat    11460
gttctcttgc ttttgtcagc aagatagcca gatcaatgtc gatcgtggct ggctcgaaga    11520
tacctgcaag aatgtcattg cgctgccatt ctccaaattg cagttcgcgc ttagctggat    11580
aacgccacgg aatgatgtcg tcgtgcacaa caatggtgac ttctacagcg cggagaatct    11640
cgctctctcc aggggaagcc gaagtttcca aaaggtcgtt gatcaaagct cgccgcgttg    11700
tttcatcaag ccttacggtc accgtaacca gcaaatcaat atcactgtgt ggcttcaggc    11760
cgccatccac tgcggagccg tacaaatgta cggccagcaa cgtcggttcg agatggcgct    11820
cgatgacgcc aactacctct gatagttgag tcgatacttc ggcgatcacc gcttccccca    11880
tgatgtttaa ctttgtttta gggcgactgc cctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata    11940
acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact    12000
gtaccccaaa aaaacagtca taacaagcca tgaaaaccgc cactgcgttc catggacata    12060
caaatggacg aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta ttctaataaa    12120
cgctcttttc tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact    12180
gaaggcggga aacgacaatc agatctagta ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag    12240
ctatcgatta cgccaagcta t                                              12261
<210>3
<211>6256
<212>DNA
<213>核酸构建体L0522b-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos
<220>
<221>终止子
<222>(268)..(295)
<223>互补序列
<220>
<221>终止子
<222>(427)..(470)
<223>互补序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(591)..(747)
<223>attR2
<220>
<221>启动子
<222>(763)..(2081)
<223>STPT启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2112)..(2959)
<223>nptII
<220>
<221>终止子
<222>(2998)..(3676)
<223>E9终止子
<220>
<221>终止子
<222>(3682)..(3934)
<223>互补序列：nos终止子
<220>
<221>终止子
<222>(4089)..(4351)
<223>nos终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(4370)..(4465)
<223>互补序列：attL3
<220>
<221>misc_feature
<222>(4650)..(5459)
<223>卡那霉素抗性
<400>3
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga  60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga  120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca  180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc  240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta  300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc  360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa  420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg  480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa  540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggccctg cagctctaga gctcgaattc tacaggtcac  600
taataccatc taagtagttg gttcatagtg actgcatatg ttgtgtttta cagtattatg  660
tagtctgttt tttatgcaaa atctaattta atatattgat atttatatca ttttacgttt  720
ctcgttcaac tttcttgtac aaagtggggt acccggggat cctgatagct tatactcaaa  780
ttcaacaagt tatatataaa tgtatagata ctacaatatc attaacaaaa gtcaccttaa  840
ataaatacac atatctttta tgttctctat tgttttgcgt acgctaacac aatttctcat  900
atgcaaaagg atgaatgagt aacaaattac ctcataagaa caatcatctt tgcttacata    960
ctaatacaat aatcactcaa tcaaccaata acatcaatca cataggttta catacaataa    1020
tcactcaatc aacttcataa gaagaatcat gtttacttaa ttcatcaatt atccccaaaa    1080
acaccactat taagtataaa ctacaacata tttgtagtga tgggtcaaca tttttatcat    1140
atttaaactc gggttccctc aaatcgagaa atagtgaaca tgtaatatta attttaaatc    1200
gcaattacag aaattaattg aatttggtca aatggacaga attttataga ttgggtggaa    1260
ctagaaaaaa aaaaaaaaag agtatagggt gaattgagta catgaaagta catggtaatc    1320
ctagttaaac gcataataca tgtgggttca tttgtatttt tttgtaactt acgagtaaac    1380
tggctacaac aaaaaaaaat tagaagattt ttttgttttg tagaaaaccc taattttagt    1440
tatagttgta taactttgat aaaattataa aattgtatta cgaaaaaagt aataagatat    1500
tcaaaaaagc ctagaataac gtatatgact atgagcatga aactgcaagt caaatgctga    1560
cagacaacca taaacaaaag aaattaaata gagatacctt taaaataagt aaaatttcat    1620
ttataaaaaa tctactttct tgtgaatctg tcacgttcaa taatttgaag accactcaac    1680
atacaaggta aataatgaaa aataaaatct accaaaattt caatcattat tatcttccaa    1740
aaaaacaaaa ttatacagat gatgatggtg atatggaact tcgattggct aatattcact    1800
gtgtctctaa aaaccatcca cttatcaaga taagatggac cctacactca tccaatctaa    1860
accagtatct caagattctt atctaattac atcattctct accgttagat gaaattgacc    1920
attaacccta ccataactcc atacaccgcg agatactgga ttaaccaaat cgagatcatc    1980
gtagccgtcc gatcaacaag taccatctct tgaaatactc gaaatcctca taagtccgtc    2040
cctctttgct ctcactatca aaactctgaa tttcgatttc atctagagtc gagcccgggc    2100
gatatcggat ctcgactcta gtcgagggcc catgggagct tggattgaac aagatggatt    2160
gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca    2220
gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct    2280
ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct    2340
atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc    2400
gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct    2460
tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga    2520
tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg    2580
gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc    2640
agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac    2700
ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat    2760
cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga    2820
tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc    2880
cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg    2940
acccaagcta gcttcgacgg atcctctagc atatgctcga ggcggccgca gatatcagat    3000
cctctagcta gagctttcgt tcgtatcatc ggtttcgaca acgttcgtca agttcaatgc    3060
atcagtttca ttgcgcacac accagaatcc tactgagttt gagtattatg gcattgggaa    3120
aactgttttt cttgtaccat ttgttgtgct tgtaatttac tgtgtttttt attcggtttt    3180
cgctatcgaa ctgtgaaatg gaaatggatg gagaagagtt aatgaatgat atggtccttt    3240
tgttcattct caaattaata ttatttgttt tttctcttat ttgttgtgtg ttgaatttga    3300
aattataaga gatatgcaaa cattttgttt tgagtaaaaa tgtgtcaaat cgtggcctct    3360
aatgaccgaa gttaatatga ggagtaaaac acttgtagtt gtaccattat gcttattcac    3420
taggcaacaa atatattttc agacctagaa aagctgcaaa tgttactgaa tacaagtatg    3480
tcctcttgtg ttttagacat ttatgaactt tcctttatgt aattttccag aatccttgtc    3540
agattctaat cattgcttta taattatagt tatactcatg gatttgtagt tgagtatgaa    3600
aatatttttt aatgcatttt atgacttgcc aattgattga caacatgcat caatcgacct    3660
gcagcccaag cttgatctag tccgatctag taacatagat gacaccgcgc gcgataattt    3720
atcctagttt gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac    3780
tctaatcata aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa ttattacatg    3840
cttaacgtaa ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca agaccggcaa caggattcaa    3900
tcttaagaaa ctttattgcc aaatgtttga acgatcgggg aaattcgagc tcggtagcaa    3960
ttcccgaggc tgtagccgac gatggtgcgc caggagagtt gttgattcat tgtttgcctc    4020
cctgctgcgg tttttcaccg aagttcatgc cagtccagcg tttttgcagc agaaaagccg    4080
ccgacttgtc gaccgatcgg tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg    4140
ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa    4200
ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat    4260
tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc    4320
gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcggg aagcttggcg taatcatggc aactttatta    4380
tacaaagttg gcattataaa aaagcattgc ttatcaattt gttgcaacga acaggtcact    4440
atcagtcaaa ataaaatcat tatttggagc tccatggtag cgttaacgcg gccatcccct    4500
atagtgagtc gtattacatg gtcatagctg tttcctggca gctctggccc gtgtctcaaa    4560
atctctgatg ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg    4620
cttacataaa cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcgaggc    4680
cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg    4740
tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgct tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt    4800
ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa    4860
actggctgac ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg    4920
atgcatggtt actcaccact gcgatccccg gaaaaacagc attccaggta ttagaagaat    4980
atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt    5040
cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc    5100
aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct    5160
ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataaactttt gccattctca ccggattcag    5220
tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag    5280
gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat    5340
ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta    5400
ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaat    5460
cagaattggt taattggttg taacactggc agagcattac gctgacttga cgggacggcg    5520
caagctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttacgcgtc gttccactga gcgtcagacc    5580
ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct    5640
tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa    5700
ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag    5760
tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc    5820
tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg    5880
actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca    5940
cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcatt    6000
gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg    6060
tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc    6120
ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc    6180
ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc  6240
cttttgctca catgtt                                                  6256
<210>4
<211>6230
<212>DNA
<213>核酸构建体Lo522a-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos
<220>
<221>终止子
<222>(268)..(295)
<223>互补序列：终止子
<220>
<221>终止子
<222>(427)..(470)
<223>互补序列：终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(591)..(747)
<223>attR2重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(763)..(2081)
<223>STPT启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2112)..(2959)
<223>nptII
<220>
<221>终止子
<222>(2998)..(3676)
<223>E9终止子
<220>
<221>终止子
<222>(3682)..(3934)
<223>互补序列：nos终止子
<220>
<221>终止子
<222>(4063)..(4325)
<223>nos终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(4344)..(4439)
<223>互补序列：attL3重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(4624)..(5433)
<223>卡那霉素抗性
<400>4
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga  60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga  120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca  180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc  240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta  300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc  360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa  420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg  480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa  540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggccctg cagctctaga gctcgaattc tacaggtcac  600
taataccatc taagtagttg gttcatagtg actgcatatg ttgtgtttta cagtattatg  660
tagtctgttt tttatgcaaa atctaattta atatattgat atttatatca ttttacgttt  720
ctcgttcaac tttcttgtac aaagtggggt acccggggat cctgatagct tatactcaaa  780
ttcaacaagt tatatataaa tgtatagata ctacaatatc attaacaaaa gtcaccttaa    840
ataaatacac atatctttta tgttctctat tgttttgcgt acgctaacac aatttctcat    900
atgcaaaagg atgaatgagt aacaaattac ctcataagaa caatcatctt tgcttacata    960
ctaatacaat aatcactcaa tcaaccaata acatcaatca cataggttta catacaataa    1020
tcactcaatc aacttcataa gaagaatcat gtttacttaa ttcatcaatt atccccaaaa    1080
acaccactat taagtataaa ctacaacata tttgtagtga tgggtcaaca tttttatcat    1140
atttaaactc gggttccctc aaatcgagaa atagtgaaca tgtaatatta attttaaatc    1200
gcaattacag aaattaattg aatttggtca aatggacaga attttataga ttgggtggaa    1260
ctagaaaaaa aaaaaaaaag agtatagggt gaattgagta catgaaagta catggtaatc    1320
ctagttaaac gcataataca tgtgggttca tttgtatttt tttgtaactt acgagtaaac    1380
tggctacaac aaaaaaaaat tagaagattt ttttgttttg tagaaaaccc taattttagt    1440
tatagttgta taactttgat aaaattataa aattgtatta cgaaaaaagt aataagatat    1500
tcaaaaaagc ctagaataac gtatatgact atgagcatga aactgcaagt caaatgctga    1560
cagacaacca taaacaaaag aaattaaata gagatacctt taaaataagt aaaatttcat    1620
ttataaaaaa tctactttct tgtgaatctg tcacgttcaa taatttgaag accactcaac    1680
atacaaggta aataatgaaa aataaaatct accaaaattt caatcattat tatcttccaa    1740
aaaaacaaaa ttatacagat gatgatggtg atatggaact tcgattggct aatattcact    1800
gtgtctctaa aaaccatcca cttatcaaga taagatggac cctacactca tccaatctaa    1860
accagtatct caagattctt atctaattac atcattctct accgttagat gaaattgacc    1920
attaacccta ccataactcc atacaccgcg agatactgga ttaaccaaat cgagatcatc    1980
gtagccgtcc gatcaacaag taccatctct tgaaatactc gaaatcctca taagtccgtc    2040
cctctttgct ctcactatca aaactctgaa tttcgatttc atctagagtc gagcccgggc    2100
gatatcggat ctcgactcta gtcgagggcc catgggagct tggattgaac aagatggatt    2160
gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca    2220
gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct    2280
ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct    2340
atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc    2400
gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct    2460
tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga    2520
tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg    2580
gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc    2640
agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac    2700
ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat    2760
cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga    2820
tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc    2880
cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg    2940
acccaagcta gcttcgacgg atcctctagc atatgctcga ggcggccgca gatatcagat    3000
cctctagcta gagctttcgt tcgtatcatc ggtttcgaca acgttcgtca agttcaatgc    3060
atcagtttca ttgcgcacac accagaatcc tactgagttt gagtattatg gcattgggaa    3120
aactgttttt cttgtaccat ttgttgtgct tgtaatttac tgtgtttttt attcggtttt    3180
cgctatcgaa ctgtgaaatg gaaatggatg gagaagagtt aatgaatgat atggtccttt    3240
tgttcattct caaattaata ttatttgttt tttctcttat ttgttgtgtg ttgaatttga    3300
aattataaga gatatgcaaa cattttgttt tgagtaaaaa tgtgtcaaat cgtggcctct    3360
aatgaccgaa gttaatatga ggagtaaaac acttgtagtt gtaccattat gcttattcac    3420
taggcaacaa atatattttc agacctagaa aagctgcaaa tgttactgaa tacaagtatg    3480
tcctcttgtg ttttagacat ttatgaactt tcctttatgt aattttccag aatccttgtc    3540
agattctaat cattgcttta taattatagt tatactcatg gatttgtagt tgagtatgaa    3600
aatatttttt aatgcatttt atgacttgcc aattgattga caacatgcat caatcgacct    3660
gcagcccaag cttgatctag tccgatctag taacatagat gacaccgcgc gcgataattt    3720
atcctagttt gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac    3780
tctaatcata aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa ttattacatg    3840
cttaacgtaa ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca agaccggcaa caggattcaa    3900
tcttaagaaa ctttattgcc aaatgtttga acgatcgggg aaattcgagc tcggtagcaa    3960
ttcccgaggc tgtagccgac gatggtgcgc caggagagtt gttgattcat tgtttgcctc    4020
cctgctgcgg tttttcaccg aagttcatgc cagtccagcg tgtcgaccga tcggtcaaac    4080
atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata    4140
taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt    4200
atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac    4260
aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat    4320
cgggaagctt ggcgtaatca tggcaacttt attatacaaa gttggcatta taaaaaagca    4380
ttgcttatca atttgttgca acgaacaggt cactatcagt caaaataaaa tcattatttg    4440
gagctccatg gtagcgttaa cgcggccatc ccctatagtg agtcgtatta catggtcata    4500
gctgtttcct ggcagctctg gcccgtgtct caaaatctct gatgttacat tgcacaagat    4560
aaaaatatat catcatgaac aataaaactg tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt    4620
gttatgagcc atattcaacg ggaaacgtcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct    4680
gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat    4740
cgcttgtatg ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt    4800
gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt    4860
ccgaccatca agcattttat ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc    4920
cccggaaaaa cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt    4980
gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt    5040
aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt    5100
gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa    5160
atgcataaac ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt    5220
gataacctta tttttgacga ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga    5280
atcgcagacc gataccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga gttttctcct    5340
tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg    5400
cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc taatcagaat tggttaattg gttgtaacac    5460
tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac ggcgcaagct catgaccaaa atcccttaac    5520
gtgagttacg cgtcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct    5580
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca    5640
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc    5700
agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc    5760
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct    5820
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag    5880
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc    5940
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg    6000
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag    6060
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt  6120
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac  6180
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt             6230
<210>5
<211>11614
<212>DNA
<213>双元表达载体Lo523b-pSUN1-R4-Lo484∷Lo376∷Lo503b
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<223>attB3重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(49)..(905)
<223>CaMVC 35S启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(912)..(1719)
<223>编码mGFP5er
<220>
<221>终止子
<222>(1762)..(2431)
<223>E9终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2432)..(2455)
<223>attB1重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(2542)..(2565)
<223>attb2重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(2581)..(3899)
<223>STPT启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(3930)..(4777)
<223>编码nptII
<220>
<221>终止子
<222>(4827)..(5079)
<223>互补序列：nos终止子
<220>
<221>终止子
<222>(5234)..(5496)
<223>nos终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(5610)..(5630)
<223>互补序列：attB3重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(5649)..(5863)
<223>LB
<220>
<221>misc_feature
<222>(7572)..(8679)
<223>repA
<220>
<221>rep_origin
<222>(9428)..(10274)
<223>互补序列：ColE1
<220>
<221>misc_feature
<222>(10443)..(1 1234)
<223>互补序列：aadA标记(spectomycin)
<220>
<221>misc_feature
<222>(11408)..(11553)
<223>RB
<400>5
caactttgta tagaaaagtt ggccatgatt acgccaagct tgcatgcctg caggtcccca    60
gattagcctt ttcaatttca gaaagaatgc taacccacag atggttagag aggcttacgc    120
agcaggtctc atcaagacga tctacccgag caataatctc caggaaatca aataccttcc    180
caagaaggtt aaagatgcag tcaaaagatt caggactaac tgcatcaaga acacagagaa    240
agatatattt ctcaagatca gaagtactat tccagtatgg acgattcaag gcttgcttca    300
caaaccaagg caagtaatag agattggagt ctctaaaaag gtagttccca ctgaatcaaa    360
ggccatggag tcaaagattc aaatagagga cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga    420
acagttcata cagagtctct tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt    480
ggagcacgac acacttgtct actccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag    540
ggcaattgag acttttcaac aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc    600
agctatctgt cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca    660
tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga    720
tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa    780
gcaagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc    840
ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagaa cacgggggac    900
tctagaggat ccaaggagat ataacaatga agactaatct ttttctcttt ctcatctttt    960
cacttctcct atcattatcc tcggccgaat tcagtaaagg agaagaactt ttcactggag    1020
ttgtcccaat tcttgttgaa ttagatggtg atgttaatgg gcacaaattt tctgtcagtg    1080
gagagggtga aggtgatgca acatacggaa aacttaccct taaatttatt tgcactactg    1140
gaaaactacc tgttccatgg ccaacacttg tcactacttt ctcttatggt gttcaatgct    1200
tttcaagata cccagatcat atgaagcggc acgacttctt caagagcgcc atgcctgagg    1260
gatacgtgca ggagaggacc atcttcttca aggacgacgg gaactacaag acacgtgctg    1320
aagtcaagtt tgagggagac accctcgtca acaggatcga gcttaaggga atcgatttca    1380
aggaggacgg aaacatcctc ggccacaagt tggaatacaa ctacaactcc cacaacgtat    1440
acatcatggc cgacaagcaa aagaacggca tcaaagccaa cttcaagacc cgccacaaca    1500
tcgaagacgg cggcgtgcaa ctcgctgatc attatcaaca aaatactcca attggcgatg    1560
gccctgtcct tttaccagac aaccattacc tgtccacaca atctgccctt tcgaaagatc    1620
ccaacgaaaa gagagaccac atggtccttc ttgagtttgt aacagctgct gggattacac    1680
atggcatgga tgaactatac aaacatgatg agctttaaga gaacggatcc ccatctgcgg    1740
ccgcctcgag catatgctag aggatcctct agctagagct ttcgttcgta tcatcggttt    1800
cgacaacgtt cgtcaagttc aatgcatcag tttcattgcg cacacaccag aatcctactg    1860
agtttgagta ttatggcatt gggaaaactg tttttcttgt accatttgtt gtgcttgtaa    1920
tttactgtgt tttttattcg gttttcgcta tcgaactgtg aaatggaaat ggatggagaa    1980
gagttaatga atgatatggt ccttttgttc attctcaaat taatattatt tgttttttct    2040
cttatttgtt gtgtgttgaa tttgaaatta taagagatat gcaaacattt tgttttgagt    2100
aaaaatgtgt caaatcgtgg cctctaatga ccgaagttaa tatgaggagt aaaacacttg    2160
tagttgtacc attatgctta ttcactaggc aacaaatata ttttcagacc tagaaaagct    2220
gcaaatgtta ctgaatacaa gtatgtcctc ttgtgtttta gacatttatg aactttcctt    2280
tatgtaattt tccagaatcc ttgtcagatt ctaatcattg ctttataatt atagttatac    2340
tcatggattt gtagttgagt atgaaaatat tttttaatgc attttatgac ttgccaattg    2400
attgacaaca tgcatcaatc gaccgggtac ccaagtttgt acaaaaaagc aggctggtac    2460
ccggggatcc tctaggtcga ccagatctga tatctgcggc cgcctcgagc atatgggcat    2520
gcaagcttgg cgtaatcatg gacccagctt tcttgtacaa agtggggtac ccggggatcc    2580
tgatagctta tactcaaatt caacaagtta tatataaatg tatagatact acaatatcat    2640
taacaaaagt caccttaaat aaatacacat atcttttatg ttctctattg ttttgcgtac    2700
gctaacacaa tttctcatat gcaaaaggat gaatgagtaa caaattacct cataagaaca    2760
atcatctttg cttacatact aatacaataa tcactcaatc aaccaataac atcaatcaca    2820
taggtttaca tacaataatc actcaatcaa cttcataaga agaatcatgt ttacttaatt    2880
catcaattat ccccaaaaac accactatta agtataaact acaacatatt tgtagtgatg    2940
ggtcaacatt tttatcatat ttaaactcgg gttccctcaa atcgagaaat agtgaacatg    3000
taatattaat tttaaatcgc aattacagaa attaattgaa tttggtcaaa tggacagaat    3060
tttatagatt gggtggaact agaaaaaaaa aaaaaaagag tatagggtga attgagtaca    3120
tgaaagtaca tggtaatcct agttaaacgc ataatacatg tgggttcatt tgtatttttt    3180
tgtaacttac gagtaaactg gctacaacaa aaaaaaatta gaagattttt ttgttttgta    3240
gaaaacccta attttagtta tagttgtata actttgataa aattataaaa ttgtattacg    3300
aaaaaagtaa taagatattc aaaaaagcct agaataacgt atatgactat gagcatgaaa    3360
ctgcaagtca aatgctgaca gacaaccata aacaaaagaa attaaataga gataccttta    3420
aaataagtaa aatttcattt ataaaaaatc tactttcttg tgaatctgtc acgttcaata    3480
atttgaagac cactcaacat acaaggtaaa taatgaaaaa taaaatctac caaaatttca    3540
atcattatta tcttccaaaa aaacaaaatt atacagatga tgatggtgat atggaacttc    3600
gattggctaa tattcactgt gtctctaaaa accatccact tatcaagata agatggaccc    3660
tacactcatc caatctaaac cagtatctca agattcttat ctaattacat cattctctac    3720
cgttagatga aattgaccat taaccctacc ataactccat acaccgcgag atactggatt    3780
aaccaaatcg agatcatcgt agccgtccga tcaacaagta ccatctcttg aaatactcga    3840
aatcctcata agtccgtccc tctttgctct cactatcaaa actctgaatt tcgatttcat    3900
ctagagtcga gcccgggcga tatcggatct cgactctagt cgagggccca tgggagcttg    3960
gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg    4020
ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc    4080
gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca    4140
ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct    4200
cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga    4260
tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg    4320
gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat    4380
cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga    4440
gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg    4500
cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg    4560
ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat    4620
agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct    4680
cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga    4740
cgagttcttc tgagcgggac ccaagctagc ttcgacggat cctctagcat atgctcgagg    4800
cggccgcaga tatcagatct actagtccga tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat    4860
aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc    4920
gggactctaa tcataaaaac ccatctcata aataacgtca tgcattacat gttaattatt    4980
acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga    5040
ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg tttgaacgat cggggaaatt cgagctcggt    5100
agcaattccc gaggctgtag ccgacgatgg tgcgccagga gagttgttga ttcattgttt    5160
gcctccctgc tgcggttttt caccgaagtt catgccagtc cagcgttttt gcagcagaaa    5220
agccgccgac ttgtcgaccg atcggtcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa    5280
tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt    5340
aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc    5400
gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt    5460
atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcgggaagct tggcgtaatc atggcaactt    5520
tattatacaa agttggcatt ataaaaaagc attgcttatc aatttgttgc aacgaacagg    5580
tcactatcag tcaaaataaa atcattattc aactttatta tacatagttg ataattcact    5640
ggccggatct gcttggtaat aattgtcatt agattgtttt tatgcataga tgcactcgaa    5700
atcagccaat tttagacaag tatcaaacgg atgttaattc agtacattaa agacgtccgc    5760
aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac cacaatatat cctgccacca    5820
gccagccaac agctccccga ccggcagctc ggcacaaaat caccacgcgt taccaccacg    5880
ccggccggcc gcatggtgtt gaccgtgttc gccggcattg ccgagttcga gcgttcccta    5940
atcatcgacc gcacccggag cgggcgcgag gccgccaagg cccgaggcgt gaagtttggc    6000
ccccgcccta ccctcacccc ggcacagatc gcgcacgccc gcgagctgat cgaccaggaa    6060
ggccgcaccg tgaaagaggc ggctgcactg cttggcgtgc atcgctcgac cctgtaccgc    6120
gcacttgagc gcagcgagga agtgacgccc accgaggcca ggcggcgcgg tgccttccgt    6180
gaggacgcat tgaccgaggc cgacgccctg gcggccgccg agaatgaacg ccaagaggaa    6240
caagcatgaa accgcaccag gacggccagg acgaaccgtt tttcattacc gaagagatcg    6300
aggcggagat gatcgcggcc gggtacgtgt tcgagccgcc cgcgcacgtc tcaaccgtgc    6360
ggctgcatga aatcctggcc ggtttgtctg atgccaagct ggcggcctgg ccggccagct    6420
tggccgctga agaaaccgag cgccgccgtc taaaaaggtg atgtgtattt gagtaaaaca    6480
gcttgcgtca tgcggtcgct gcgtatatga tgcgatgagt aaataaacaa atacgcaagg    6540
ggaacgcatg aaggttatcg ctgtacttaa ccagaaaggc gggtcaggca agacgaccat    6600
cgcaacccat ctagcccgcg ccctgcaact cgccggggcc gatgttctgt tagtcgattc    6660
cgatccccag ggcagtgccc gcgattgggc ggccgtgcgg gaagatcaac cgctaaccgt    6720
tgtcggcatc gaccgcccga cgattgaccg cgacgtgaag gccatcggcc ggcgcgactt    6780
cgtagtgatc gacggagcgc cccaggcggc ggacttggct gtgtccgcga tcaaggcagc    6840
cgacttcgtg ctgattccgg tgcagccaag cccttacgac atatgggcca ccgccgacct    6900
ggtggagctg gttaagcagc gcattgaggt cacggatgga aggctacaag cggcctttgt    6960
cgtgtcgcgg gcgatcaaag gcacgcgcat cggcggtgag gttgccgagg cgctggccgg    7020
gtacgagctg cccattcttg agtcccgtat cacgcagcgc gtgagctacc caggcactgc    7080
cgccgccggc acaaccgttc ttgaatcaga acccgagggc gacgctgccc gcgaggtcca    7140
ggcgctggcc gctgaaatta aatcaaaact catttgagtt aatgaggtaa agagaaaatg    7200
agcaaaagca caaacacgct aagtgccggc cgtccgagcg cacgcagcag caaggctgca    7260
acgttggcca gcctggcaga cacgccagcc atgaagcggg tcaactttca gttgccggcg    7320
gaggatcaca ccaagctgaa gatgtacgcg gtacgccaag gcaagaccat taccgagctg    7380
ctatctgaat acatcgcgca gctaccagag taaatgagca aatgaataaa tgagtagatg    7440
aattttagcg gctaaaggag gcggcatgga aaatcaagaa caaccaggca ccgacgccgt    7500
ggaatgcccc atgtgtggag gaacgggcgg ttggccaggc gtaagcggct gggttgtctg    7560
ccggccctgc aatggcactg gaacccccaa gcccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa    7620
ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag    7680
gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg    7740
caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg    7800
tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat    7860
gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag    7920
cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt    7980
tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt    8040
tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc    8100
gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag    8160
cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag    8220
cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt    8280
agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta    8340
gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac    8400
cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc    8460
gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc    8520
gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg    8580
ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac    8640
cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg    8700
caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac    8760
attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg    8820
tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt    8880
tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa    8940
ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc    9000
tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct    9060
ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc    9120
cggcgcccac atcaaggcac cctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg    9180
acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca    9240
agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc    9300
acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg    9360
agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc    9420
aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga    9480
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca    9540
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg    9600
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt    9660
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc    9720
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct    9780
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc    9840
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta    9900
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca    9960
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag    10020
tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag    10080
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt    10140
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa    10200
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg    10260
attttggtca tgcatgatat atctcccaat ttgtgtaggg cttattatgc acgcttaaaa    10320
ataataaaag cagacttgac ctgatagttt ggctgtgagc aattatgtgc ttagtgcatc    10380
taacgcttga gttaagccgc gccgcgaagc ggcgtcggct tgaacgaatt tctagctaga    10440
cattatttgc cgactacctt ggtgatctcg cctttcacgt agtggacaaa ttcttccaac    10500
tgatctgcgc gcgaggccaa gcgatcttct tcttgtccaa gataagcctg tctagcttca    10560
agtatgacgg gctgatactg ggccggcagg cgctccattg cccagtcggc agcgacatcc    10620
ttcggcgcga ttttgccggt tactgcgctg taccaaatgc gggacaacgt aagcactaca    10680
tttcgctcat cgccagccca gtcgggcggc gagttccata gcgttaaggt ttcatttagc    10740
gcctcaaata gatcctgttc aggaaccgga tcaaagagtt cctccgccgc tggacctacc    10800
aaggcaacgc tatgttctct tgcttttgtc agcaagatag ccagatcaat gtcgatcgtg    10860
gctggctcga agatacctgc aagaatgtca ttgcgctgcc attctccaaa ttgcagttcg    10920
cgcttagctg gataacgcca cggaatgatg tcgtcgtgca caacaatggt gacttctaca    10980
gcgcggagaa tctcgctctc tccaggggaa gccgaagttt ccaaaaggtc gttgatcaaa    11040
gctcgccgcg ttgtttcatc aagccttacg gtcaccgtaa ccagcaaatc aatatcactg    11100
tgtggcttca ggccgccatc cactgcggag ccgtacaaat gtacggccag caacgtcggt    11160
tcgagatggc gctcgatgac gccaactacc tctgatagtt gagtcgatac ttcggcgatc    11220
accgcttccc ccatgatgtt taactttgtt ttagggcgac tgccctgctg cgtaacatcg    11280
ttgctgctcc ataacatcaa acatcgaccc acggcgtaac gcgcttgctg cttggatgcc    11340
cgaggcatag actgtacccc aaaaaaacag tcataacaag ccatgaaaac cgccactgcg    11400
ttccatggac atacaaatgg acgaacggat aaaccttttc acgccctttt aaatatccga    11460
ttattctaat aaacgctctt ttctcttagg tttacccgcc aatatatcct gtcaaacact    11520
gatagtttaa actgaaggcg ggaaacgaca atcagatcta gtaggaaaca gctatgacca    11580
tgattacgcc aagctatcga ttacgccaag ctat                                11614
<210>6
<211>11588
<212>DNA
<213>双元表达载体Lo523a-pSUN1-R4-Lo484∷Lo376∷Lo503a
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<223>attB4重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(49)..(905)
<223>CaMV 35S启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(912)..(1719)
<223>编码mGFP5er
<220>
<221>终止子
<222>(1762)..(2431)
<223>Ep终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2432)..(2455)
<223>attB1重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(2542)..(2565)
<223>attb2重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(2581)..(3899)
<223>STPT启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(3930)..(4777)
<223>编码nptII
<220>
<221>终止子
<222>(4827)..(5079)
<223>互补序列：nos终止子
<220>
<221>终止子
<222>(5208)..(5470)
<223>nos终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(5323)..(5837)
<223>LB
<220>
<221>misc_feature
<222>(5584)..(5604)
<223>互补序列：attB3重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(7546)..(8653)
<223>repA
<220>
<221>rep_origin
<222>(9402)..(10248)
<223>互补序列：ColE1
<220>
<221>misc_feature
<222>(10417)..(11208)
<223>互补序列：aadA标记(spectomycin)
<220>
<221>misc_feature
<222>(11382)..(11527)
<223>RB
<400>6
caactttgta tagaaaagtt ggccatgatt acgccaagct tgcatgcctg caggtcccca    60
gattagcctt ttcaatttca gaaagaatgc taacccacag atggttagag aggcttacgc    120
agcaggtctc atcaagacga tctacccgag caataatctc caggaaatca aataccttcc    180
caagaaggtt aaagatgcag tcaaaagatt caggactaac tgcatcaaga acacagagaa    240
agatatattt ctcaagatca gaagtactat tccagtatgg acgattcaag gcttgcttca    300
caaaccaagg caagtaatag agattggagt ctctaaaaag gtagttccca ctgaatcaaa    360
ggccatggag tcaaagattc aaatagagga cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga    420
acagttcata cagagtctct tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt    480
ggagcacgac acacttgtct actccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag    540
ggcaattgag acttttcaac aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc    600
agctatctgt cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca    660
tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga    720
tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa    780
gcaagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc    840
ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagaa cacgggggac    900
tctagaggat ccaaggagat ataacaatga agactaatct ttttctcttt ctcatctttt    960
cacttctcct atcattatcc tcggccgaat tcagtaaagg agaagaactt ttcactggag    1020
ttgtcccaat tcttgttgaa ttagatggtg atgttaatgg gcacaaattt tctgtcagtg    1080
gagagggtga aggtgatgca acatacggaa aacttaccct taaatttatt tgcactactg    1140
gaaaactacc tgttccatgg ccaacacttg tcactacttt ctcttatggt gttcaatgct    1200
tttcaagata cccagatcat atgaagcggc acgacttctt caagagcgcc atgcctgagg    1260
gatacgtgca ggagaggacc atcttcttca aggacgacgg gaactacaag acacgtgctg    1320
aagtcaagtt tgagggagac accctcgtca acaggatcga gcttaaggga atcgatttca    1380
aggaggacgg aaacatcctc ggccacaagt tggaatacaa ctacaactcc cacaacgtat    1440
acatcatggc cgacaagcaa aagaacggca tcaaagccaa cttcaagacc cgccacaaca    1500
tcgaagacgg cggcgtgcaa ctcgctgatc attatcaaca aaatactcca attggcgatg    1560
gccctgtcct tttaccagac aaccattacc tgtccacaca atctgccctt tcgaaagatc    1620
ccaacgaaaa gagagaccac atggtccttc ttgagtttgt aacagctgct gggattacac    1680
atggcatgga tgaactatac aaacatgatg agctttaaga gaacggatcc ccatctgcgg    1740
ccgcctcgag catatgctag aggatcctct agctagagct ttcgttcgta tcatcggttt    1800
cgacaacgtt cgtcaagttc aatgcatcag tttcattgcg cacacaccag aatcctactg    1860
agtttgagta ttatggcatt gggaaaactg tttttcttgt accatttgtt gtgcttgtaa    1920
tttactgtgt tttttattcg gttttcgcta tcgaactgtg aaatggaaat ggatggagaa    1980
gagttaatga atgatatggt ccttttgttc attctcaaat taatattatt tgttttttct    2040
cttatttgtt gtgtgttgaa tttgaaatta taagagatat gcaaacattt tgttttgagt    2100
aaaaatgtgt caaatcgtgg cctctaatga ccgaagttaa tatgaggagt aaaacacttg    2160
tagttgtacc attatgctta ttcactaggc aacaaatata ttttcagacc tagaaaagct    2220
gcaaatgtta ctgaatacaa gtatgtcctc ttgtgtttta gacatttatg aactttcctt    2280
tatgtaattt tccagaatcc ttgtcagatt ctaatcattg ctttataatt atagttatac    2340
tcatggattt gtagttgagt atgaaaatat tttttaatgc attttatgac ttgccaattg    2400
attgacaaca tgcatcaatc gaccgggtac ccaagtttgt acaaaaaagc aggctggtac    2460
ccggggatcc tctaggtcga ccagatctga tatctgcggc cgcctcgagc atatgggcat    2520
gcaagcttgg cgtaatcatg gacccagctt tcttgtacaa agtggggtac ccggggatcc    2580
tgatagctta tactcaaatt caacaagtta tatataaatg tatagatact acaatatcat    2640
taacaaaagt caccttaaat aaatacacat atcttttatg ttctctattg ttttgcgtac    2700
gctaacacaa tttctcatat gcaaaaggat gaatgagtaa caaattacct cataagaaca    2760
atcatctttg cttacatact aatacaataa tcactcaatc aaccaataac atcaatcaca    2820
taggtttaca tacaataatc actcaatcaa cttcataaga agaatcatgt ttacttaatt    2880
catcaattat ccccaaaaac accactatta agtataaact acaacatatt tgtagtgatg    2940
ggtcaacatt tttatcatat ttaaactcgg gttccctcaa atcgagaaat agtgaacatg    3000
taatattaat tttaaatcgc aattacagaa attaattgaa tttggtcaaa tggacagaat    3060
tttatagatt gggtggaact agaaaaaaaa aaaaaaagag tatagggtga attgagtaca    3120
tgaaagtaca tggtaatcct agttaaacgc ataatacatg tgggttcatt tgtatttttt    3180
tgtaacttac gagtaaactg gctacaacaa aaaaaaatta gaagattttt ttgttttgta    3240
gaaaacccta attttagtta tagttgtata actttgataa aattataaaa ttgtattacg    3300
aaaaaagtaa taagatattc aaaaaagcct agaataacgt atatgactat gagcatgaaa    3360
ctgcaagtca aatgctgaca gacaaccata aacaaaagaa attaaataga gataccttta    3420
aaataagtaa aatttcattt ataaaaaatc tactttcttg tgaatctgtc acgttcaata    3480
atttgaagac cactcaacat acaaggtaaa taatgaaaaa taaaatctac caaaatttca    3540
atcattatta tcttccaaaa aaacaaaatt atacagatga tgatggtgat atggaacttc    3600
gattggctaa tattcactgt gtctctaaaa accatccact tatcaagata agatggaccc    3660
tacactcatc caatctaaac cagtatctca agattcttat ctaattacat cattctctac    3720
cgttagatga aattgaccat taaccctacc ataactccat acaccgcgag atactggatt    3780
aaccaaatcg agatcatcgt agccgtccga tcaacaagta ccatctcttg aaatactcga    3840
aatcctcata agtccgtccc tctttgctct cactatcaaa actctgaatt tcgatttcat    3900
ctagagtcga gcccgggcga tatcggatct cgactctagt cgagggccca tgggagcttg    3960
gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg    4020
ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc    4080
gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca    4140
ggacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct    4200
cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga    4260
tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg    4320
gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat    4380
cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga    4440
gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg    4500
cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg    4560
ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat    4620
agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct    4680
cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga    4740
cgagttcttc tgagcgggac ccaagctagc ttcgacggat cctctagcat atgctcgagg    4800
cggccgcaga tatcagatct actagtccga tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat    4860
aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc    4920
gggactctaa tcataaaaac ccatctcata aataacgtca tgcattacat gttaattatt    4980
acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga    5040
ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg tttgaacgat cggggaaatt cgagctcggt    5100
agcaattccc gaggctgtag ccgacgatgg tgcgccagga gagttgttga ttcattgttt    5160
gcctccctgc tgcggttttt caccgaagtt catgccagtc cagcgtgtcg accgatcggt    5220
caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta    5280
tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt    5340
tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag    5400
aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac    5460
tagatcggga agcttggcgt aatcatggca actttattat acaaagttgg cattataaaa    5520
aagcattgct tatcaatttg ttgcaacgaa caggtcacta tcagtcaaaa taaaatcatt    5580
attcaacttt attatacata gttgataatt cactggccgg atctgcttgg taataattgt    5640
cattagattg tttttatgca tagatgcact cgaaatcagc caattttaga caagtatcaa    5700
acggatgtta attcagtaca ttaaagacgt ccgcaatgtg ttattaagtt gtctaagcgt    5760
caatttgttt acaccacaat atatcctgcc accagccagc caacagctcc ccgaccggca    5820
gctcggcaca aaatcaccac gcgttaccac cacgccggcc ggccgcatgg tgttgaccgt    5880
gttcgccggc attgccgagt tcgagcgttc cctaatcatc gaccgcaccc ggagcgggcg    5940
cgaggccgcc aaggcccgag gcgtgaagtt tggcccccgc cctaccctca ccccggcaca    6000
gatcgcgcac gcccgcgagc tgatcgacca ggaaggccgc accgtgaaag aggcggctgc    6060
actgcttggc gtgcatcgct cgaccctgta ccgcgcactt gagcgcagcg aggaagtgac    6120
gcccaccgag gccaggcggc gcggtgcctt ccgtgaggac gcattgaccg aggccgacgc    6180
cctggcggcc gccgagaatg aacgccaaga ggaacaagca tgaaaccgca ccaggacggc    6240
caggacgaac cgtttttcat taccgaagag atcgaggcgg agatgatcgc ggccgggtac    6300
gtgttcgagc cgcccgcgca cgtctcaacc gtgcggctgc atgaaatcct ggccggtttg    6360
tctgatgcca agctggcggc ctggccggcc agcttggccg ctgaagaaac cgagcgccgc    6420
cgtctaaaaa ggtgatgtgt atttgagtaa aacagcttgc gtcatgcggt cgctgcgtat    6480
atgatgcgat gagtaaataa acaaatacgc aaggggaacg catgaaggtt atcgctgtac    6540
ttaaccagaa aggcgggtca ggcaagacga ccatcgcaac ccatctagcc cgcgccctgc    6600
aactcgccgg ggccgatgtt ctgttagtcg attccgatcc ccagggcagt gcccgcgatt    6660
gggcggccgt gcgggaagat caaccgctaa ccgttgtcgg catcgaccgc ccgacgattg    6720
accgcgacgt gaaggccatc ggccggcgcg acttcgtagt gatcgacgga gcgccccagg    6780
cggcggactt ggctgtgtcc gcgatcaagg cagccgactt cgtgctgatt ccggtgcagc    6840
caagccctta cgacatatgg gccaccgccg acctggtgga gctggttaag cagcgcattg    6900
aggtcacgga tggaaggcta caagcggcct ttgtcgtgtc gcgggcgatc aaaggcacgc    6960
gcatcggcgg tgaggttgcc gaggcgctgg ccgggtacga gctgcccatt cttgagtccc    7020
gtatcacgca gcgcgtgagc tacccaggca ctgccgccgc cggcacaacc gttcttgaat    7080
cagaacccga gggcgacgct gcccgcgagg tccaggcgct ggccgctgaa attaaatcaa    7140
aactcatttg agttaatgag gtaaagagaa aatgagcaaa agcacaaaca cgctaagtgc    7200
cggccgtccg agcgcacgca gcagcaaggc tgcaacgttg gccagcctgg cagacacgcc    7260
agccatgaag cgggtcaact ttcagttgcc ggcggaggat cacaccaagc tgaagatgta    7320
cgcggtacgc caaggcaaga ccattaccga gctgctatct gaatacatcg cgcagctacc    7380
agagtaaatg agcaaatgaa taaatgagta gatgaatttt agcggctaaa ggaggcggca    7440
tggaaaatca agaacaacca ggcaccgacg ccgtggaatg ccccatgtgt ggaggaacgg    7500
gcggttggcc aggcgtaagc ggctgggttg tctgccggcc ctgcaatggc actggaaccc    7560
ccaagcccga ggaatcggcg tgagcggtcg caaaccatcc ggcccggtac aaatcggcgc    7620
ggcgctgggt gatgacctgg tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc agcggcaacg    7680
catcgaggca gaagcacgcc ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc gaatccgcaa    7740
agaatcccgg caaccgccgg cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga    7800
cgagcaacca gattttttcg ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag    7860
catcatggac gtggccgttt tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat    7920
ccgctacgag cttccagacg ggcacgtaga ggtttccgca gggccggccg gcatggccag    7980
tgtgtgggat tacgacctgg tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg    8040
ataccgggaa gggaagggag acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt    8100
actcaagttc tgccggcgag ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg    8160
cattcggtta aacaccacgc acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg    8220
cctggtgacg gtatccgagg gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga    8280
aaccgggcgg ccggagtaca tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac    8340
agaaggcaag aacccggacg tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg    8400
catcggccgt tttctctacc gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg    8460
gttgttcaag acgatctacg aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt    8520
caccgtgcgc aagctgatcg ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc    8580
ggggcaggct ggcccgatcc tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc    8640
cgccggttcc taatgtacgg agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg    8700
tcgaaaaggt ctctttcctg tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg    8760
gaaccggaac ccgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta    8820
agtgactgat ataaaagaga aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt taaaacttat    8880
taaaactctt aaaacccgcc tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga    8940
gctgcaaaaa gcgcctaccc ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg    9000
gcctatcgcg gccgctggcc gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca atctaccagg    9060
gcgcggacaa gccgcgccgt cgccactcga ccgccggcgc ccacatcaag gcaccctgcc    9120
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca    9180
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg    9240
ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg    9300
gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat    9360
accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac    9420
tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt    9480
aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca    9540
gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc    9600
ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact    9660
ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct    9720
gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag    9780
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca    9840
cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa    9900
cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc    9960
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag    10020
aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg    10080
tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca    10140
gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc    10200
tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgcatg atatatctcc    10260
caatttgtgt agggcttatt atgcacgctt aaaaataata aaagcagact tgacctgata    10320
gtttggctgt gagcaattat gtgcttagtg catctaacgc ttgagttaag ccgcgccgcg    10380
aagcggcgtc ggcttgaacg aatttctagc tagacattat ttgccgacta ccttggtgat    10440
ctcgcctttc acgtagtgga caaattcttc caactgatct gcgcgcgagg ccaagcgatc    10500
ttcttcttgt ccaagataag cctgtctagc ttcaagtatg acgggctgat actgggccgg    10560
caggcgctcc attgcccagt cggcagcgac atccttcggc gcgattttgc cggttactgc    10620
gctgtaccaa atgcgggaca acgtaagcac tacatttcgc tcatcgccag cccagtcggg 10680
cggcgagttc catagcgtta aggtttcatt tagcgcctca aatagatcct gttcaggaac 10740
cggatcaaag agttcctccg ccgctggacc taccaaggca acgctatgtt ctcttgcttt 10800
tgtcagcaag atagccagat caatgtcgat cgtggctggc tcgaagatac ctgcaagaat 10860
gtcattgcgc tgccattctc caaattgcag ttcgcgctta gctggataac gccacggaat 10920
gatgtcgtcg tgcacaacaa tggtgacttc tacagcgcgg agaatctcgc tctctccagg 10980
ggaagccgaa gtttccaaaa ggtcgttgat caaagctcgc cgcgttgttt catcaagcct 11040
tacggtcacc gtaaccagca aatcaatatc actgtgtggc ttcaggccgc catccactgc 11100
ggagccgtac aaatgtacgg ccagcaacgt cggttcgaga tggcgctcga tgacgccaac 11160
tacctctgat agttgagtcg atacttcggc gatcaccgct tcccccatga tgtttaactt 11220
tgttttaggg cgactgccct gctgcgtaac atcgttgctg ctccataaca tcaaacatcg 11280
acccacggcg taacgcgctt gctgcttgga tgcccgaggc atagactgta ccccaaaaaa 11340
acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgttccat ggacatacaa atggacgaac 11400
ggataaacct tttcacgccc ttttaaatat ccgattattc taataaacgc tcttttctct 11460
taggtttacc cgccaatata tcctgtcaaa cactgatagt ttaaactgaa ggcgggaaac 11520
gacaatcaga tctagtagga aacagctatg accatgatra cgccaagcta tcgattacgc 11580
caagctat                                                          11588
<210>7
<211>5583
<212>DNA
<213>核酸构建体Lo503b-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos
<220>
<221>终止子
<222>(268)..(295)
<223>互补序列
<220>
<221>终止子
<222>(427)..(470)
<223>互补序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(591)..(747)
<223>attR2重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(763)..(2081)
<223>STPT启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2112)..(2959)
<223>nptII
<220>
<221>终止子
<222>(3009)..(3261)
<223>互补序列：nos终止子
<220>
<221>终止子
<222>(3416)..(3678)
<223>nos终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(3697)..(3792)
<223>互补序列：attL3重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(3977)..(4786)
<223>卡那霉素抗性
<400>7
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga    60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga    120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca    180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc    240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta    300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc    360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa    420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg    480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa    540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggccctg cagctctaga gctcgaattc tacaggtcac    600
taataccatc taagtagttg gttcatagtg actgcatatg ttgtgtttta cagtattatg    660
tagtctgttt tttatgcaaa atctaattta atatattgat atttatatca ttttacgttt    720
ctcgttcaac tttcttgtac aaagtggggt acccggggat cctgatagct tatactcaaa    780
ttcaacaagt tatatataaa tgtatagata ctacaatatc attaacaaaa gtcaccttaa    840
ataaatacac atatctttta tgttctctat tgttttgcgt acgctaacac aatttctcat    900
atgcaaaagg atgaatgagt aacaaattac ctcataagaa caatcatctt tgcttacata    960
ctaatacaat aatcactcaa tcaaccaata acatcaatca cataggttta catacaataa    1020
tcactcaatc aacttcataa gaagaatcat gtttacttaa ttcatcaatt atccccaaaa    1080
acaccactat taagtataaa ctacaacata tttgtagtga tgggtcaaca tttttatcat    1140
atttaaactc gggttccctc aaatcgagaa atagtgaaca tgtaatatta attttaaatc    1200
gcaattacag aaattaattg aatttggtca aatggacaga attttataga ttgggtggaa    1260
ctagaaaaaa aaaaaaaaag agtatagggt gaattgagta catgaaagta catggtaatc    1320
ctagttaaac gcataataca tgtgggttca tttgtatttt tttgtaactt acgagtaaac    1380
tggctacaac aaaaaaaaat tagaagattt ttttgttttg tagaaaaccc taattttagt    1440
tatagttgta taactttgat aaaattataa aattgtatta cgaaaaaagt aataagatat    1500
tcaaaaaagc ctagaataac gtatatgact atgagcatga aactgcaagt caaatgctga    1560
cagacaacca taaacaaaag aaattaaata gagatacctt taaaataagt aaaatttcat    1620
ttataaaaaa tctactttct tgtgaatctg tcacgttcaa taatttgaag accactcaac    1680
atacaaggta aataatgaaa aataaaatct accaaaattt caatcattat tatcttccaa    1740
aaaaacaaaa ttatacagat gatgatggtg atatggaact tcgattggct aatattcact    1800
gtgtctctaa aaaccatcca cttatcaaga taagatggac cctacactca tccaatctaa    1860
accagtatct caagattctt atctaattac atcattctct accgttagat gaaattgacc    1920
attaacccta ccataactcc atacaccgcg agatactgga ttaaccaaat cgagatcatc    1980
gtagccgtcc gatcaacaag taccatctct tgaaatactc gaaatcctca taagtccgtc    2040
cctctttgct ctcactatca aaactctgaa tttcgatttc atctagagtc gagcccgggc    2100
gatatcggat ctcgactcta gtcgagggcc catgggagct tggattgaac aagatggatt    2160
gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca    2220
gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct    2280
ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct    2340
atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc    2400
gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct    2460
tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga    2520
tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg    2580
gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc    2640
agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac    2700
ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat    2760
cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga    2820
tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc    2880
cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg    2940
acccaagcta gcttcgacgg atcctctagc atatgctcga ggcggccgca gatatcagat    3000
ctactagtcc gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg    3060
cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa    3120
acccatctca taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc    3180
aacagaaatt atatgataat catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct taagaaactt    3240
tattgccaaa tgtttgaacg atcggggaaa ttcgagctcg gtagcaattc ccgaggctgt    3300
agccgacgat ggtgcgccag gagagttgtt gattcattgt ttgcctccct gctgcggttt    3360
ttcaccgaag ttcatgccag tccagcgttt ttgcagcaga aaagccgccg acttgtcgac    3420
cgatcggtca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc    3480
gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg    3540
catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata    3600
cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc    3660
tatgttacta gatcgggaag cttggcgtaa tcatggcaac tttattatac aaagttggca    3720
ttataaaaaa gcattgctta tcaatttgtt gcaacgaaca ggtcactatc agtcaaaata    3780
aaatcattat ttggagctcc atggtagcgt taacgcggcc atcccctata gtgagtcgta    3840
ttacatggtc atagctgttt cctggcagct ctggcccgtg tctcaaaatc tctgatgtta    3900
cattgcacaa gataaaaata tatcatcatg aacaataaaa ctgtctgctt acataaacag    3960
taatacaagg ggtgttatga gccatattca acgggaaacg tcgaggccgc gattaaattc    4020
caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg    4080
tgcgacaatc tatcgcttgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg    4140
caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga    4200
atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact    4260
caccactgcg atccccggaa aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg    4320
tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg    4380
taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa    4440
taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca    4500
agtctggaaa gaaatgcata aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg    4560
tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt    4620
tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg    4680
tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga    4740
tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaatcag aattggttaa    4800
ttggttgtaa cactggcaga gcattacgct gacttgacgg gacggcgcaa gctcatgacc    4860
aaaatccctt aacgtgagtt acgcgtcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat    4920
caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa    4980
accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa    5040
ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt    5100
aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt    5160
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata    5220
gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt    5280
ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagcattgag aaagcgccac  5340
gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga  5400
gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg  5460
ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa  5520
aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat  5580
gtt                                                                5583
<210>8
<211>5557
<212>DNA
<213>核酸构建体Lo503a-pENTR-C1-STPT-nptII-IRnos
<220>
<221>终止子
<222>(268)..(295)
<223>互补序列
<220>
<221>终止子
<222>(427)..(470)
<223>互补序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(591)..(747)
<223>attR2重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(763)..(2081)
<223>STPT启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2112)..(2959)
<223>nptII
<220>
<221>终止子
<222>(3009)..(3261)
<223>互补序列：nos终止子
<220>
<221>终止子
<222>(3390)..(3652)
<223>nos终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(3671)..(3766)
<223>互补序列：attL3重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(3951)..(4760)
<223>卡那霉素抗性
<400>8
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga    60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga   120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca   180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc   240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta   300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc   360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa   420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg   480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa   540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggccctg cagctctaga gctcgaattc tacaggtcac   600
taataccatc taagtagttg gttcatagtg actgcatatg ttgtgtttta cagtattatg   660
tagtctgttt tttatgcaaa atctaattta atatattgat atttatatca ttttacgttt   720
ctcgttcaac tttcttgtac aaagtggggt acccggggat cctgatagct tatactcaaa     780
ttcaacaagt tatatataaa tgtatagata ctacaatatc attaacaaaa gtcaccttaa     840
ataaatacac atatctttta tgttctctat tgttttgcgt acgctaacac aatttctcat     900
atgcaaaagg atgaatgagt aacaaattac ctcataagaa caatcatctt tgcttacata     960
ctaatacaat aatcactcaa tcaaccaata acatcaatca cataggttta catacaataa    1020
tcactcaatc aacttcataa gaagaatcat gtttacttaa ttcatcaatt atccccaaaa    1080
acaccactat taagtataaa ctacaacata tttgtagtga tgggtcaaca tttttatcat    1140
atttaaactc gggttccctc aaatcgagaa atagtgaaca tgtaatatta attttaaatc    1200
gcaattacag aaattaattg aatttggtca aatggacaga attttataga ttgggtggaa    1260
ctagaaaaaa aaaaaaaaag agtatagggt gaattgagta catgaaagta catggtaatc    1320
ctagttaaac gcataataca tgtgggttca tttgtatttt tttgtaactt acgagtaaac    1380
tggctacaac aaaaaaaaat tagaagattt ttttgttttg tagaaaaccc taattttagt    1440
tatagttgta taactttgat aaaattataa aattgtatta cgaaaaaagt aataagatat    1500
tcaaaaaagc ctagaataac gtatatgact atgagcatga aactgcaagt caaatgctga    1560
cagacaacca taaacaaaag aaattaaata gagatacctt taaaataagt aaaatttcat    1620
ttataaaaaa tctactttct tgtgaatctg tcacgttcaa taatttgaag accactcaac    1680
atacaaggta aataatgaaa aataaaatct accaaaattt caatcattat tatcttccaa    1740
aaaaacaaaa ttatacagat gatgatggtg atatggaact tcgattggct aatattcact    1800
gtgtctctaa aaaccatcca cttatcaaga taagatggac cctacactca tccaatctaa    1860
accagtatct caagattctt atctaattac atcattctct accgttagat gaaattgacc    1920
attaacccta ccataactcc atacaccgcg agatactgga ttaaccaaat cgagatcatc    1980
gtagccgtcc gatcaacaag taccatctct tgaaatactc gaaatcctca taagtccgtc    2040
cctctttgct ctcactatca aaactctgaa tttcgatttc atctagagtc gagcccgggc    2100
gatatcggat ctcgactcta gtcgagggcc catgggagct tggattgaac aagatggatt    2160
gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca    2220
gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct    2280
ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct    2340
atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc    2400
gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct    2460
tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga    2520
tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg    2580
gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc    2640
agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac    2700
ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat    2760
cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga    2820
tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc    2880
cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg    2940
acccaagcta gcttcgacgg atcctctagc atatgctcga ggcggccgca gatatcagat    3000
ctactagtcc gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg    3060
cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa    3120
acccatctca taaataacgt catgcattac atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc    3180
aacagaaatt atatgataat catcgcaaga ccggcaacag gattcaatct taagaaactt    3240
tattgccaaa tgtttgaacg atcggggaaa ttcgagctcg gtagcaattc ccgaggctgt    3300
agccgacgat ggtgcgccag gagagttgtt gattcattgt ttgcctccct gctgcggttt    3360
ttcaccgaag ttcatgccag tccagcgtgt cgaccgatcg gtcaaacatt tggcaataaa    3420
gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga    3480
attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt    3540
ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg    3600
caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaagcttggc    3660
gtaatcatgg caactttatt atacaaagtt ggcattataa aaaagcattg cttatcaatt    3720
tgttgcaacg aacaggtcac tatcagtcaa aataaaatca ttatttggag ctccatggta    3780
gcgttaacgc ggccatcccc tatagtgagt cgtattacat ggtcatagct gtttcctggc    3840
agctctggcc cgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat    3900
catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata    3960
ttcaacggga aacgtcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt    4020
ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcgc ttgtatggga    4080
agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta    4140
cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc    4200
attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc ggaaaaacag    4260
cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag    4320
tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg    4380
tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt    4440
ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt    4500
tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt    4560
ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat    4620
accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac    4680
ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga  4740
tgctcgatga gtttttctaa tcagaattgg ttaattggtt gtaacactgg cagagcatta  4800
cgctgacttg acgggacggc gcaagctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttacgcgt  4860
cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt  4920
ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt  4980
tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga  5040
taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag  5100
caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata  5160
agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg  5220
gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga  5280
gatacctaca gcgtgagcat tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca  5340
ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa  5400
acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt  5460
tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac  5520
ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgtt                           5557
<210>9
<211>5047
<212>DNA
<213>核酸构建体Lo484-pENTR-A1-inv-35s-GFP-E9
<220>
<221>终止子
<222>(268)..(295)
<223>互补序列
<220>
<221>终止子
<222>(427)..(470)
<223>互补序列
<220>
<221>nisc feature
<222>(593)..(687)
<223>attL4重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(715)..(1571)
<220>
<221>终止子
<222>(2428)..(3097)
<223>E9终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(3098)..(3254)
<223>互补序列：attR1重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(3441)..(4250)
<223>卡那霉素抗性
<400>9
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga   60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga  120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca  180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc  240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta  300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc  360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa  420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg  480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa     540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccga gttaacgcta ccatggagct ccaaataatg     600
attttatttt gactgatagt gacctgttcg ttgcaacaaa ttgataagca atgctttttt     660
ataatgccaa ctttgtatag aaaagttgcc atgattacgc caagcttgca tgcctgcagg     720
tccccagatt agccttttca atttcagaaa gaatgctaac ccacagatgg ttagagaggc     780
ttacgcagca ggtctcatca agacgatcta cccgagcaat aatctccagg aaatcaaata     840
ccttcccaag aaggttaaag atgcagtcaa aagattcagg actaactgca tcaagaacac     900
agagaaagat atatttctca agatcagaag tactattcca gtatggacga ttcaaggctt     960
gcttcacaaa ccaaggcaag taatagagat tggagtctct aaaaaggtag ttcccactga    1020
atcaaaggcc atggagtcaa agattcaaat agaggaccta acagaactcg ccgtaaagac    1080
tggcgaacag ttcatacaga gtctcttacg actcaatgac aagaagaaaa tcttcgtcaa    1140
catggtggag cacgacacac ttgtctactc caaaaatatc aaagatacag tctcagaaga    1200
ccaaagggca attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcc ggaaacctcc tcggattcca    1260
ttgcccagct atctgtcact ttattgtgaa gatagtggaa aaggaaggtg gctcctacaa    1320
atgccatcat tgcgataaag gaaaggccat cgttgaagat gcctctgccg acagtggtcc    1380
caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc    1440
ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg cacaatccca    1500
ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg agagaacacg    1560
ggggactcta gaggatccaa ggagatataa caatgaagac taatcttttt ctctttctca    1620
tcttttcact tctcctatca ttatcctcgg ccgaattcag taaaggagaa gaacttttca    1680
ctggagttgt cccaattctt gttgaattag atggtgatgt taatgggcac aaattttctg    1740
tcagtggaga gggtgaaggt gatgcaacat acggaaaact tacccttaaa tttatttgca    1800
ctactggaaa actacctgtt ccatggccaa cacttgtcac tactttctct tatggtgttc    1860
aatgcttttc aagataccca gatcatatga agcggcacga cttcttcaag agcgccatgc    1920
ctgagggata cgtgcaggag aggaccatct tcttcaagga cgacgggaac tacaagacac    1980
gtgctgaagt caagtttgag ggagacaccc tcgtcaacag gatcgagctt aagggaatcg    2040
atttcaagga ggacggaaac atcctcggcc acaagttgga atacaactac aactcccaca    2100
acgtatacat catggccgac aagcaaaaga acggcatcaa agccaacttc aagacccgcc    2160
acaacatcga agacggcggc gtgcaactcg ctgatcatta tcaacaaaat actccaattg    2220
gcgatggccc tgtcctttta ccagacaacc attacctgtc cacacaatct gccctttcga    2280
aagatcccaa cgaaaagaga gaccacatgg tccttcttga gtttgtaaca gctgctggga    2340
ttacacatgg catggatgaa ctatacaaac atgatgagct ttaagagaac ggatccccat    2400
ctgcggccgc ctcgagcata tgctagagga tcctctagct agagctttcg ttcgtatcat    2460
cggtttcgac aacgttcgtc aagttcaatg catcagtttc attgcgcaca caccagaatc    2520
ctactgagtt tgagtattat ggcattggga aaactgtttt tcttgtacca tttgttgtgc    2580
ttgtaattta ctgtgttttt tattcggttt tcgctatcga actgtgaaat ggaaatggat    2640
ggagaagagt taatgaatga tatggtcctt ttgttcattc tcaaattaat attatttgtt    2700
ttttctctta tttgttgtgt gttgaatttg aaattataag agatatgcaa acattttgtt    2760
ttgagtaaaa atgtgtcaaa tcgtggcctc taatgaccga agttaatatg aggagtaaaa    2820
cacttgtagt tgtaccatta tgcttattca ctaggcaaca aatatatttt cagacctaga    2880
aaagctgcaa atgttactga atacaagtat gtcctcttgt gttttagaca tttatgaact    2940
ttcctttatg taattttcca gaatccttgt cagattctaa tcattgcttt ataattatag    3000
ttatactcat ggatttgtag ttgagtatga aaatattttt taatgcattt tatgacttgc    3060
caattgattg acaacatgca tcaatcgacc gggtacccaa gtttgtacaa aaaagttgaa    3120
cgagaaacgt aaaatgatat aaatatcaat atattaaatt agattttgca taaaaaacag    3180
actacataat actgtaaaac acaacatatg cagtcactat gaaccaacta cttagatggt    3240
attagtgacc tgtagaattc gagctctaga gctgcagggc ggccatcccc tatagtgagt    3300
cgtattacat ggtcatagct gtttcctggc agctctggcc cgtgtctcaa aatctctgat    3360
gttacattgc acaagataaa aatatatcat catgaacaat aaaactgtct gcttacataa    3420
acagtaatac aaggggtgtt atgagccata ttcaacggga aacgtcgagg ccgcgattaa    3480
attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat    3540
caggtgcgac aatctatcgc ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac    3600
atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga    3660
cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt    3720
tactcaccac tgcgatcccc ggaaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt    3780
caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg    3840
tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa    3900
tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg    3960
aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc    4020
atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg    4080
atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct  tgccatccta tggaactgcc   4140
tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc    4200
ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa tcagaattgg    4260
ttaattggtt gtaacactgg cagagcatta cgctgacttg acgggacggc gcaagctcat    4320
gaccaaaatc ccttaacgtg agttacgcgt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa    4380
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa    4440
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc    4500
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt    4560
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc    4620
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac    4680
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca    4740
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcat tgagaaagcg    4800
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag    4860
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt    4920
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat    4980
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc    5040
acatgtt                                                              5047
<210>10
<211>1313
<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)
<400>10
cgtccgatgt gattccgtcc tcttgattgt tttccttccc cctaattttt gttgcatacg     60
cggagagaag ctttagcttt aagaggttaa ctggcggcac ctcaatttct ttgggcttca    120
gcatgggtta agaccaccta ataatcctgt cgcattcttg ctcttggaaa agtttcttcc    180
aacattgcag tccagtcaga gaatggcctg taataattag tgacaaaatt atagcagtag    240
atagaatctg ttcattcaag ttcttcaaat tactgggcca agcttcaatg tcattttttg    300
cttaactcgt gctcgtgctg ttatagttta caactatctt ctttacctgc ccataaccaa    360
tgtgaccatc gaatcaaacg tatgtggcgg tgaatcccgt tgcttgtgcg ttgctagatt    420
tttgaggtcg ccttctgttc caaattccaa tcatttgaat tcgaagggat tacctgtcga     480
ctgcgcatac gatcttttat tgagaatatt tgctaggtgt gggagttcct gcgtgtgttc     540
gtttagtgga cgtgcgtatg tgagcatgtg ctatatgttg tgcttcgtga aaactcagct     600
tcttttcatc aagatcggca cctctgctta tcacctaatc ccatcattcc aatagcaaca     660
taacatagat gtgacacatc ctatacatga tattgggatg gagagagtat tcctaagatg     720
catctctacc ctttctcttc gaatgcacat ttattgggag tcatttttaa tgtgcatttg     780
tgcaaactgg taccatggaa ccctagtgct accctaacag atatgctcca tcgtcactac     840
aaactcttgt ttacatccac aaactactgc ttggaagggc acgctgacat ttgatcagaa     900
gaaagaatga catgggtgcc aaagttatgg atcagtgtgg tgaaattcga gaataaccga     960
caagatactt ctcaatcttg tcacaataag agggttattt ttgtttagta cagtacaact    1020
aacgataccg cacaaaaaac ggtgaacgcg atatcgcaca aaaaaaagag caacacgttt    1080
gaattatatt caggtttgct actgcaatcc aacaccatct cataactaca ttatcctaat    1140
cgagcctttt taagtaatga ggccagtaca attaaaaaag gtgccgtaga caatagcaaa    1200
cccatgaaga actgaaaaca aatgaatgca aaactaaaat tgtcttagtt ctgtcgacaa    1260
atgccaactg ctataatcgt acatgcgtct ccgaagaaac cgccgacact gcc           1313
<210>11
<211>1498
<212>DNA
<213>稻
<400>11
cagagtgaca gacagtgata cttgctagcc ttttttatga gcaccctttt tggcctttta     60
gttcctcatt agctaagaga tgtgatgagt gaggttttat tttttggctt tgtttggagt    120
tttgctttgg aggaagatag agaagccttt agaatgagtt gtgatggagg atcacatagt    180
ttgtctcagg tttacaatgt gcggtaaaaa aaaggaagga aataaagtga tgttagaata    240
tacagttttt taatccattt ctacagcttc aaattctcga ttgagcggca cgttctttga     300
aatgttcata gcaaagcaaa tcaaacgaaa tggatgagat ttgaaactaa gaaactgcac     360
ttgacaaagc acgctgcgct ctctgaaatt catgttcagc agaacgcctt tcagaaattc     420
atgttctgct gctgcaggaa ggcagctaag aactccatgc aataaaaata taaaatgcag     480
tgcagttatt agttagtgta gtagtaatct aagaaacaac aggtttaaca gaatattacc     540
ttcaaaaaca tcccctcaaa tcaagactcg gaaatcaaca ccattctgaa actagatgca     600
atactgcgct cctaatggaa tcttcagtgg ttactcctac acgccactaa aaaaaacggg     660
ctttggaaaa acgtcaccct gaaacaaaag ctcagtaaaa ataccactct aaaatcttgc     720
agcatgcaat atcacaaaag cagatcaatc cgtaattgta tttatgctgc atataccgtg     780
atattttctg tgatcctctg cactatcttc agctcatcag ctgcatattt tgaagccgga     840
ctgatggctc atcgctttgt ttcggcttat tgtgatagcc atccatgcgt tgacgaaaga     900
tttagatata tcacaatttt aaccaagttc agagcaatgt tagctttagc tgatgatata     960
cacggcgcac tgattgccgc cgttattttc agagccttgt aaaacctgaa acaaattgtg    1020
tctccaaatt cttactagta ctgcagacat agcggatttg ttttcaggat gaattatcac    1080
aaaggtaagt caattcatag ccatattacg caagttcaaa actgcaggcc acaccatacg    1140
tttctgaaag tagaaacaag agatcttgca gcagatcacc actaaagaag cagtaaccgc    1200
aaaaaattat aacataatcc agaattaaca cttcgcagca ttactgaatt cactttaata    1260
gcacttctca tcatgaacta gtacaacaac ataactgtcc agtggaaatg tgaaatgcat    1320
acaccaagta atggtccata acatgaacta tatggataca acaacgttct tatttcgctc    1380
atatatacat gaaataagtc ttgcacgtct tggttactta ataggtgcga taatcgccgt    1440
aggcttttag aagaagaaaa aaaagtgagc ctgcaaagtt cctggggaca gttgaaga      1498
<210>12
<211>1246
<212>DNA
<213>稻
<400>12
cccttgacag ctccagtttt actcttgtgc agtgtactga aattctggta ctgtagtaca       60
gtcttccact ggtttggttt gtcgctgagg cagcagaagg cttatggtta cacgtacacg      120
gtgacggtag gtcggtagct ggcttttggg tagaggaatc tgtatgtctg agtgaaataa      180
tactggattc gccatttggt gcgtttcctt ttttgtttcc ttttggctgg cctgctttct      240
tgcttcgtaa cttgaccaaa aagttctggc cgtcgcaaag agctggaact gtgaatacat      300
tttctactgc ataaaacgtt acacgcatca tgcatcacct acacggttac acccgataga      360
attcggttac agttcaatta caaggcactc ccgagtccca gaagctagca cgtcgagcag      420
acaaacccta cagataaaat ttctcctcgc catgctttta agctttacgc taaccacatg      480
cttataataa taacgagcat tgccgcgtca tttccagatt gaagtggcag tgaagggcaa      540
caaaatgatc atcaccttgc tgaaattagt gggcagcagc aaccatagcc gtgcgagcac      600
ccgtgaaagt tgatatcagc gcccccagct gtaacttgtc attgcaagca aagcttagcc      660
ggtacctgca cacagacgcc atgaacaacg tgccatctta agggaaaagg ccataaatgg      720
ttatactacc tacctttcca agaagactaa aggctaaaaa tatttggaat atttcataat      780
attaatcagt tattatactt ccataagtat tccagatagc caaaggtcaa ctttaggtaa      840
ttgcatcatg aaagcaaccc aaagactcat tttcccccca aatgcaaaca ttccacaagg      900
cacaaataag caattccaac atgtgaggtt tgcttaacaa ctattgcttt gcagtatgca      960
accatttaac tgtaatggct aaattgtgaa acacatacaa taaagtatgt tagctggttt     1020
aaattattta ttattatttt tcttacgtaa gatactccat actagttatt tgatgtgatg     1080
acataaatga ctatcttgaa gcatataata tgaataaatc agcaaaatgt tccgtcaaag     1140
ttttgaaaaa aaagggtact gagtagaaaa tcagccaaaa atcacaaatg atttatgatc    1200
aaataaaata ttatatgcaa gttctaggtg aactaagcaa ggcaca                   1246
<210>13
<211>771
<212>DNA
<213>稻
<400>13
cgtggcaatg gctgtcatgc tttggcacat actaatagca aggtagaatg gtacagctat     60
ttcattattt ttgcccttgt atatttgtat cactacatga gtaaacgacg tttagttatc    120
gatagttttg ttatgagtga tgaatgatct gcatcgtact gccaatgcct tgcattctca    180
aatggttgca cacttgcact catacaaagt tagtacactc catcatatta taaattactt    240
ttttttcaag ttaaatttcc tgaaagtttg ataaaattta tagaaaaaat ataacgacgc    300
ttataacact aaattaattt cattacatct aacattaaac atattttgat ttttttttgt    360
tttgtgttaa atatattact atgtttttct ataaacttga ttaaacatat aaaagtttaa    420
cttcaaaaaa aagttaaaat gacttgtaat ataaaacgta ggcagtacaa tgcgaatgta   480
gggtactcca tccagctgag gtaaaccaac tccaatatat atacaaacac aaacaacgta    540
cccaattttt actgttaaaa tacaggcaca atgcctggta tcacacgtta ttaagtagac    600
agactcgata accatgacac ggacagggac ttcttgccac tggtttacgc acggttaata    660
ttacagacca cacatagaga gacggcttag ctatttgcaa ataagcttga caagatagat    720
gatgctccaa aaggatgcga tctcagcagt tgagtactta cgctggttca t             771
<210>14
<211>755
<212>DNA
<213>稻
<400>14
ttctgagcac ctgacaaaat attcagtcct ggattggacg tatatattgt tggtaaactc     60
ctgagttgct gatgagggaa aagtattgaa atgaaatctt gaggttttac ataggcgatt    120
gtgttcatca cataaacgcc ttccttttcc ttgcccggaa tgcaagaacg agagatacct    180
tgaaaatgtt ttatcctgtc atgaatgtac ctcaatcgca agatgtacag tgtggttgga    240
ccggctggtt ggttaattat attggtcctg acatgttcct atcctaatta atctcctgtt    300
tgtggggaaa acgaagaata agtatgtcat tttcatctag ctgggttgcc tgcatctgca    360
tgctagctag ctactgtaaa tgatgcgtac gtatgctcat gaatgaattc gcaagcgatc    420
gccgcaccat acatcctttg ttcttgccat taatcaagca agataagcta cctagtagtg    480
ctataacttg cgttgattaa ttgcatcggt cgattacaat acaagctcgc tatacatact    540
cgtccgctga ttgatcagtt tctgcacttc tgcagtgata aacacaaaca ctacctcgat    600
cgatcgatca gttgtgcagt gggtttgggc cctccggcac cacccgcttg gacgcagaca    660
caccatgatc ctcctcctcc tcctgcatca tgcgcctgct gctgtagtaa tggccgggcg    720
gcgccgccat ctcctccgtc aaaaggccgc agccc                               755
<210>15
<211>1373
<212>DNA
<213>稻
<400>15
tgctctgatg tatgccttca aattcatcct tctgtgcaga aaatagctgt agagaaatgg     60
aaactgggct gtttttatcc gtgcccccta atatgagaaa ctatgcctcc ctcagatttt    120
tttggctaga ctaacagaaa tatgagaata gcccatatca ttgacattag atgcagagca    180
tgggaaatgc caatgtggat tggcttgtgt gtaacaactg acaaacatgt gctgtgcaat    240
tgtgaatact ggagttgtac aagtggtata ctgtaatact gttatagcat agcatcagaa    300
tacaaagaca gaaatgaaca catagcatcg atgtctcttt tctttatttt tttctttgga    360
cagcatgcct tgaattattt gccataatgt ctccgtcccg ctggcttcat cacaccttct     420
ttgctgggtt tagtttcagt tcatcgtttg gattagctgt ttatgaatag agatgctgtt     480
tctgtctatg ttcactctca gggatgaaca tagggcctgc actgtctatg ttcaaactca     540
gagaggaaca ttgggcctgc actgcagcgg tgaaatggat ccgtgtgttc gcgccaccag     600
aatgagcttg gggcgcaatg gaacatgtga tgtcagttaa agttgcaggt aaggcagtca     660
ccggtcaaat cacggcactc gccaaccagg ccggagcata tcggctctgc cgtttgtttg     720
ctcctatctg tacgtagcac gagctgtttt ccattggcaa cgcctgatcg atcaaggcgt     780
tctactcccc tcagcacatg acgccaacgg gttgcatctg ctgacgacaa atcgctacgc     840
agactccaga ttttacagct gtgttctgca tcaaccatgg ggaattggcg acccaaagtg     900
ccaaaccatc acacgcaagt tgccatgatc gatgcgtgaa ccggaaattg atcctctaac     960
ttgtccccat aatttatgag cctacgtatg agtaacccat agcatagtat cagagaacag    1020
taagtcagat aagccttttc gatctgcgac catcaaaatc gaacaaacgg cagcacattt    1080
tagccgaaac gaatcagaga tctgccccag atttgcaacc tacacacttg acaatctcaa    1140
cttggctgcc tgcaatctgc cattcccctt ccactgcaac atggagatag ccccacccac    1200
caacgcagcc accctacgga aaagcacacc gtaacgccgc ccaccaaccc ccctccgaat    1260
ctcctccgat cccgacgcct atagatgaat aaatctcctc cctcttctca ctagacaaag    1320
cccaaaccaa ggccaaaacc ctcctcccct cctctcctct ccattccgcc gcc           1373
<210>16
<211>1208
<212>DNA
<213>稻
<400>16
tgtaccatat ctccagtgag gcttgagggc gaaaattcgg aagccctctg ttttacaacc    60
tgcttgtatg ccatgttcca gttctgagga taccgggacc tatcaatttc gtgtcctctg     120
ctgtgctaga ctcgatcaca ttggtgaacc atgaatatca tgtccctttc aaagaaatcg     180
ttgtgcaagt actgatatac cgtactctat tttgttgatt gctttttgag cgtgtgttta     240
tctgttcagt cgtcttgctc tctttttttt ttttttgggg gggggggggg tgggggtgga     300
tttttcataa aattggtatg cggcactaac gatcatgata gcgtcgaaag aacacgattc     360
ggtttattag ccccgaaaat tatctccatt tttcttttta acattttggc ggctgtcatg     420
caaaattgcg caggaaatta gactagttag tttaatatca aaattggcca catttgagta     480
ttactttttg ttccccgact gcatggtaaa aagaaagata taaatataca gaaatacttc     540
tgaaaatcta ctgacatgat tttcattttt tttccatacg ttaacacacg aagtttaaga     600
acctctctta actgctagcg ttccaaagca agaaaaggac aaaccgcatt ttaaaacaaa     660
ctccatgtta ttttcaagga ccaattaatt tgcatatgtg agtgcattcg atgatcatgt     720
ttacgctacc tccaattttg ttgaaatgtg tgatagtagc ttaaggaggt agcaggaccc     780
aaagtgggtg tgcgtatcca caagtgcgtg taattgtgtt caccttgtac taggggaaaa     840
aaaaagaaga gcaagacggt atggggtaaa ctgagaagaa aaaacggaga aaacctctat     900
ttcttaaaat ccctttctca actcatttta ctcacgtcca tgctcaccac aaagaaatga     960
attcgcagtc aaacatcact aaaataggta atgctccgca agttcatcca ctacacctac    1020
ggaaaaaaaa aatgtggtgc ccaaatgccc aataatacaa actgttcccc tcccgtttct    1080
ttggctgtcc tgttccatgc tctttgccga gccagaacaa aacacaattg agcaagccaa    1140
ccatggaaag ctcagcacat taaggcaggt caagatggaa cctgcacctc atgtacctac    1200
gctgtaag                                                             1208
<210>17
<211>1494
<212>DNA
<213>稻
<400>17
aggtttctag tctactactg ctagtacatt gcccgtggta ctcttgtttt gcatctaggc      60
tagggccagt gtgaaccagc agactaccac tgtgagtcgc ctctgtaata aaatttgttc     120
ggcctatggc catcctcagt acgttgtcaa tgtctcggtg ggctgttatg ctcaactgca     180
atgctgcatc cactgaaacc tctttctaga tgtgttggta tgaaatgcgg tattgcgttc     240
ccgatttccc ctgctactgt cttgaacctg ccgtggtaca atccttgttt gctgcacttc     300
atttttagtt cgttctaatt ccgcctggaa tgacttttga gtgcttcacg ggctgactgc     360
ctgaccgtgt tgctgtacat gcctacccca tcagttcaaa aaaaaacaat cctacctacg     420
aaattcgttt tttattggga caggacatcg gctgagttta atttcaaaat ttttcaacaa     480
actttcaact tttccatcac atcaaaactt tccctataca cgtaaacttt caacttttct     540
gtcatatcgt ttcaatttca accaaacttt taattttgat gtgaactaaa cccacccatc     600
attggatgga cttggcaaaa catggcttga ccattgagat cgttttgggg attttgttca     660
gtcagctctt ccatggtgtc tatcagaaga gttggggccg tacaacgcaa attatttccc     720
agatggtgtt gatatcatca atgatcatgg caatttggca aaccatttct tatttcccag     780
atggggttgg tataataatt aatcatggca accccatttg tttggtgcta acttgatgaa     840
acatgaatgc cctcaacctc aacagatggg ctccagtccg gccggcgccg gccagcactc     900
ggtcaacaca atatgggcac gagtggggct caaggaagtg tggggcgcag cacaaggagc     960
caagagacaa ggagtcatgt tggtcctttc agtttcaggc aaaaaaggaa ccgaaaggag    1020
ccaaggatcg gaccctttcg aagctttttt gaccatttcg tccgacttgc aaggcaggcc    1080
cagaaacaaa aataacccaa ctgtctagtg gtaatatcat ttgggatctg ttaggatttt    1140
cagttcgaag aaactgtcct gattcagagt tcagacaaaa tacgccttca gtagttggtc    1200
ctgccgcccc tcgtagtttc actatcgaaa gggatcgctg ctgtcgtaat acgtttggtt    1260
ttggcaatac agaaatcaat ctgctcgcaa agtataatat cataatccaa agttccaaac    1320
ccttttattc gaacatagta ccatatatca tacaaagcag ccacaacttg cagagaatgt    1380
gggtttcgaa catcaacaaa caaacaaatg caatgttcag tctacccggc tctcaatctt    1440
gatcatatgt acaaagcagg tatagacggg atctcatttc catggtgatt caat          1494
<210>18
<211>1274
<212>DNA
<213>稻
<400>18
gatgcattcc ttggattgtt cccaatgtat tccagaaatc atagttttga tgccaaagtt      60
ggtcttcggt atttgttact tggagatggc aaatcgactt gagcaatgtt aaagttttgg     120
gcatttaaat tatagacctt tgcttggcac ggttagcttg tttcaaatcc gttgtttgtt     180
gtggaatgtg tttcacatat gtggtaggtg aagaatctca ttatggttcg ctgtttcatt     240
ctcttgcgtt tatcacccgc tgtctgctaa cttagggtgt gtttagtcct cgtcaaaatt     300
ggaagtttgg ttgaaattgg aacaatgtga cgaaaaagtt gaaatttttt ttgtgggtag     360
gaaagttttg atgtgataga aaagttggaa gtttaaaaaa aaagtttaga actaaactcg     420
gccctagtca atttaccctt actattaggc attatccccg ctgtctgcta acctagtcaa     480
tttacccttg tattattact aggcattatc cttgcctccg ttagtggttt gttcttgaga     540
gcggccaggt aggaaaattc cacttgaaga ggagtgcgtt acgccggcct cttgccatta     600
tcatcgtttg tattgatatg cagaaataga aagaaaaacc taggattttg atgaaaataa     660
atcggatata gatatcataa aacacattgg aacttgagat ggagagaact ctagatattt     720
tccatgagat tgttacctaa ttcctacttt cctacaaaat cttatgaaac tgccattcga     780
aaggaatatc gtaggattct cgagtcccaa tccgttccag aaaggtaaat cggaacaatg     840
gtacgaaaaa tctgtcccca ttggatcata agacttggac ggtctatccc atggtactaa     900
gggttttgga aagaattttg cagaatttga atggatgtat cctatacaca agttttctgt     960
gtacacatcg tacacatcaa ctaacaattt ttaccaaaaa tctaagaaca aattcacatg    1020
ttctatcatg agttatcaca cattcacacg ttcatatctt ggttaaatct gaacagcagg    1080
ctgtaaataa accacaaaag tctccaaatt atgggcctca acagtaatca atatcgtttc    1140
ctcagacggc aattgccagt ttgccacaac agccatgttg gctaacattt gatacattcg    1200
gagtactgct tgaatttgca ggctctccct aaccttatta tccctatagt ctttgactct    1260
tgatacctcc aaac                                                      1274
<210>19
<211>806
<212>DNA
<213>稻
<400>19
aaaacgcaga gatgtgaatt tttaacacaa gaactatata ttagtcttgc aatcatctcc     60
ttagcgacct agagtctctt ttcgtaattg atctgtattt aatagtagca gtctctaaaa    120
tggacaccac tttgagccat cataggagtg tcttctccat tgaattgtga ggaaactggg    180
caaagcttct tcatggcagc tgtaacagag agtttaagca aaagggagca ggagtttgca    240
tttgccgaac tcgttgtcac tgcccctgag agcaatattc tgtcatcttt gtgaagatct    300
acatcttctt gtgaccttac aatttgttaa atcaatgcaa gaatatggtt atctgcttac    360
atgatcatca atagttttga gatttttgaa ttccctagaa aacaaattgt cagtgatctc    420
catgattagt tgtataacat gtagatcagg cagtaacaat atggattgag caagctggat    480
acttcagttt atttttacag tcacgaacaa ttatgcaagt tccaaagtac aaggcaaatg    540
gaacatgcca ccaaaccgct atgagtaaaa gtatgaaaca cagaatggct ggatagcttt    600
gcaatggttg atgcaaatat ggcgattcac ataacagaac agtgtgcaat gcacaaagtt    660
ttttaacaaa atggagctac taaaccataa ctactacttt actttagtgg cagtgatcca    720
ctctccagag tttacaccaa aaaaatctta agacctggca gcgtcacaaa caagtcaagc    780
atagcgttct aaaactctca ggtatt                                         806
<210>20
<211>1435
<212>DNA
<213>稻
<400>20
ctgaactaca gtctcagcga gttttattag caaggagaag ctgtaattag tggccactgt     60
tgttcaatgt aaaaagaaag aagcgacacg gtatgatgta caagaaagca cagatgtgtg    120
atagaatggt attagggaat gatgtgtgct gcatttggtg aaaagaatac acaactgtag    180
gcctcataca aatgtggttg ttaatttgtg acagaactac tctgaattta atagagatca    240
acctatacaa ataccatcaa agaaagtgtc ggcacgtgac caaaagttcc aaaaacacgg    300
gataactcct gattaaacaa ggagaaaaaa aaattatttt ctgatttatc tatatagcct    360
tcagttcaga gtttgatact tatactggaa aagtggaaat ggacccagaa cacgaatcaa    420
ccggaattta agttcagttc cagcacaatt ccaggcatcc gcccgtttgt ctgatgtcta    480
cgtactgcaa aaatgtcgct catgtctgct agacgactac caaattaggc caagaaaaaa    540
aaaaccaagc attaagcctt gaacattcac aggacaaagt ctgcaaatgg tccaagcaaa    600
ctgatgcaac catgcaaatt tcagtcacag ttacactgcg gaaagaaggc atacatgtca    660
aggcaacatg gcatgccatc atcacgccag ttcactgata cagcatccag tcataatgga    720
gttgcacaga ccatattact acaagggcaa agtcaacttg cagcacattg ctgttcgttt    780
tgagtagcct cagtcacagc ttagccgcct ccaacctggc gtttccagga gtcctccaca    840
ataagctcgt caacgcccca gtcctcatag ctatatttga acacacagta aactattata    900
atgaggttac aaaatcagga aacacataaa tgtcttttat tcaaatctca ccttccgtca     960
ggtaagtacc gcctaattgt gaatgggatc ttgcgtgctc tcagctcttt catggcaatc    1020
taatttgcac aaagacaata gtttagcata gcaagtaatt tgaaagatag aataaaatca    1080
actgacaatt tctgacagaa agagagaaga aatctaagta gtatttataa tgagttgttg    1140
ataagtgcag tcaacattca tctcatcttg gttttgtggg agtactctac caaaatattt    1200
cagttaccat gcctaaaaca taccaaaata attttttatc cgggaaaagc aatctaagac    1260
ccttgtggaa ttctaaaaac atgtgaaaat ttttcatgac atggaggaag agggacacgt    1320
gtaaacatac aaaattttaa gattgagaaa catatgggag tcaacaaaaa ttgtattcat    1380
attcccggaa gaaatgaatt cctccaatct ctccctttct ctggccatca tgata         1435
<210>21
<211>889
<212>DNA
<213>稻
<400>21
tcgtcctagg tggtccattg ccctcaacta gacaatctat gcgcatcagg tatgtcaaat     60
ggtttcaaca attttacctg ttctatttcg ttttaaaatt tgaaacaggg aagggcctgc    120
tgaatttgat catgaagtga atttgatatc cagatttctt atcagcgcca actccaaagc    180
acatgcagca attataagta ctgactgact gcaagaatag actgtacttc tatgaagttg    240
gatctcttca cctatctgtt caccctaaac cttttcatgg tttataagaa tgcgggttgt    300
ttcttgcaaa attttgggta gaatggtgca aaaaagaatt tgttcgataa tgaagatagc    360
tgtggttttg ttagcttgtg ttatattgat gtaatttaag atcatgcgag tgtttatttt    420
cccggcgaca ttcttttgtt tattcattat atgcagtatc catttatctt ggctctcacc    480
tgcctgatga aaaacatgta tgtttatcca taccatatgt aacaccgtcg aatgttaatc    540
acttctgcgt aacaatgcaa atgtgccaaa actagtatag aagtattccg gtcaaaaatg    600
aaagaacatt aataaacaaa agaaaaaaaa catctggcca gtaatgcctc gtccgaaact    660
agtaaactac gcgaaacaat caactgaaaa ggacaggtga atcagccaac caagactatt    720
gccagtaaac gagaaagcca gtgcagtaac aaccatccat aaattgaagg taaacgggcg    780
cattttccag caccatgcca accaggctga ttacaaatcc caacacatca gatgttttca    840
gggaaatcaa tagaatatga tcgttgctcg cgacagccgg gaatcagta                889
<210>22
<211>1721
<212>DNA
<213>稻
<400>22
cattgccatg cctttcatga tcttgcaata tggacttgtc tattatggat ttgtgtgtca     60
ctataaattt ggtagtgtga gactgcttga tggtttgtgg gtttgttcat ggaaccatgg    120
agatatggct ctatcctgta tttcgttgtt gcgctcagaa tgtatgggcc tgtgatgcac    180
tgttccaagt ttaattgaga tgtgtcaatg ttcaagttac agaataaatt gctgatatgt    240
tctcagttct catggacacc ttgggaggat tgtatggttc tgactactca tggaggttga    300
gtaatgcagc gtttccgttc gtttgctctt tatttgataa agtataaaat gcttcgggag    360
gattgtgtgg tttatgttag ctcatcgagg ttaagcaata cagcatttca gttcgtttgc    420
tctttatttt gataaatatc aaatgttttg gatgatttgt gtggttctat gttattcatc    480
aaggttgagt gatgtagcgt ttcggttcgt ttgcttcttt gttggataaa atatgaaagt    540
gcggtttggg caaatgcact tgtgggacaa aattaaaaga taaagatagt tcccctcttt    600
ttgttggata caacgtgact ttggctttgg ccaaatgcac ttgtgggact aaattaaaag    660
ataacctctt gggcaaattc acttgtggga aaatatgatg tgtgattttg ggaaaatgcg    720
cttgtgggac aaaataaaaa cataatcaaa atatgaagtg ctaattttct ttggcaaaat    780
gcagaaaata ataataatct aaatatgaag tgtaaatttt ctttgggcaa atgcataaaa     840
attgggaaaa gacaaaaaaa taaaacataa tcaaaatatg aactggaaaa ggtttaaaaa     900
aaatacaaaa cacataatca aaatatgcaa atatgaacta taaattttct ttgggcaaac     960
gcaatgtttt taggaagatg tgagcttttt ttccttaacc aaatcagcct aaaggcaaag    1020
accatcagag aactgtcata atctgattat cctgatctca ctcgtcaact tttcttccag    1080
gaagataata tgagaataca gaacaatgag gacaactcga cgcaacagtc agtggggagg    1140
agcaagcttg gaggagtcaa atagctcaaa cagtcatgca caatacttga tatggcctgg    1200
tctaccaaag cagtttttct ggatgtctct cttgggaaga tacatcattt tgttccccca    1260
cgaaaggcta caacaccctg attaacacaa gcaaaagttt cacccaaata catcctacag    1320
aatcattcct caactcccag agagcaaaag gtataaaaga accgtttcgg tatagtcaag    1380
caagctatct aagcagaatc aatggaacaa tgcgaaattc cgagcatcag aaccagcagt    1440
gcgtatggat ggctgtcatc agaacctgcg gagcccacga tcaaacatcc ttgcagatgg    1500
gcactcatat gacatatgac ccctcccacc gcaggtgcca cagatcatgg ttgtcatgca    1560
gttgcggctg atgtgccctg gcttgccaca caagcggcag gtaatgtcac ggaaagggcc    1620
gccctgtatc tctgaagaaa tggtcgtttt ttgacagttc cgagcaagat gcccagagac    1680
attgcacagg ttgcaaacag gctcgttcgt gcactcccga g                        1721
<210>23
<211>1599
<212>DNA
<213>稻
<400>23
acccatcaat taatctcttt tcttttctta atctattttt cttctctttg caatcactcc     60
tcctatttgt gcgatagcgt gcatgggcca tgtgacaatc tcttgtgatg aatggatgat    120
cacgcgtgct acctaaccta ccagatcgcc atatcaggct atcgctgatc gcgtgatctg    180
tagtatcaca tccgtttgtg tgggggtaaa atcagccatc ttcctgtaat aaaatagaat     240
gattttccat tagactcact gatcattggc tgtgaaattt gccggccgcc tgttcatcag     300
ttatctcgat caaggcttca acttttactg tggtatgccg gctcctagct ggaaaatgtt     360
gaggacaaaa actcttcttc aacccaaaga taacacaacc atcctgaatt tggttgtagg     420
ggacgcaaat tcaaaaccat aattttctgg tcacaataat tgatgtgttc aagataacct     480
gctctgctct gaattttctg tcatcttaat taattacagc tgccttgaat cgttcagaca     540
atacacgata tcttagttga ctcggaaata aaatgaacga atgaatctaa agacgagcct     600
tgcgtggatt gcaaattggc aaaggcagca cagatgctcc cgtcactcgc ttagaataac     660
aagccacaaa cacaacacaa gaacaaagag aatttgcttt gtgcaagatt cttctaatgc     720
gattacatca agaatctgtt actgtcagtg tcactgtcaa ccatttgcac aacgggcggg     780
ccttgacgtt ccagcatttt tgacgacgaa aaagtggaga aaagagagga gacaaaataa     840
cagtcttgcg tggcaccgcc tggagtccac gtcactttga acggctctgc tacaacgata     900
cacccggcaa gacagcaact tgcattgtgt ttatcattgg tggctcaaaa tcacagcaaa     960
acaagccatt gcaatatata atatgatgtc gacagacggc tgttcgcaaa gtaccatttt    1020
tcccacgata agctgaatct atcatactcg actgccagta tttggtcagt ttccatacac    1080
ggttagctga atcttgcctt cacaaattaa cagttttttt ccaccctgca agattgcatt    1140
ataataaacc tgtaacattt aagctatcga cagagacgtc agtaaaagga acaaccagcc    1200
agtttgcaat agcttatctg cttataatag gaagatgaac tctaactggc agtggcacag    1260
atcactgtga gaaataagaa ataacatgac tggttccatt tagcacaggc acatcaaagt    1320
ataccttttc ttcccagcta taccactaac tggaatgaat accatcgtat gtttcaatct    1380
tgtcaagaaa cgaataaaaa tatcttcatg cggacagggt tccaacaata gtaaaaaagg    1440
aaaaaagaat acagacgcat aattgccaat cctctacttt catctacata gctgtgcaac    1500
aaatgcttct ctgagctgca ccacatttta aactcaatac ggtattctgt gcaggtttgc    1560
caaaacaaaa aatgctaatg atctcgcccc atcaaccac                           1599
<210>24
<211>715
<212>DNA
<213>稻
<400>24
agtatcatgt tggcatgttc ggttgttctt gtttgttcgt gggtggaaac ttacattggt     60
tggaacataa caatacagaa tagggaatac tagtcagttt ggcatctgtt tagtttgatg    120
atatgacttg gtgatgatat atactcgaga tttgtttctc tcttctgcgt tttgaagaat    180
ttaggagctg taaatctgag ggcattatat atcgagatta cttctgcttc tgttgatcct    240
tttgcatgtt acttttcact gttaccaact agcagctgct cttatgcaca ggccctagcg    300
aacactaacc accattgcac tgacaaatca caaacaaaaa agaactccca tgcaaatttt    360
ggaatctata actcatcacc tctcattcgt aatagaatcg atcctgctag aaaagaggga    420
caaaaagagg gggaaaaaca aacatcaggt actccaaaaa gggccaagct taccaggact    480
acatctgaaa ttctgaatag acgtatatgc tacaattagt aaaccaatat caccactgct    540
ctcccttgcc acaaaacaag ggaagcttca atttatgacc cgatttttgc tgataatctc    600
tcacataaac ccaactcaac acataccctc ttcccgaatg ttgataattc caacccacga    660
aaatatcaaa ctttttcacc gacgcatagc aaccgaggca tagcaactaa ctcgc         715
<210>25
<211>1191
<212>DNA
<213>稻
<400>25
ggcagctggt cacgcttagc ggcggccggt ccggtgctag ccttctcctg agcttgtgtg    60
ttggcgatgt tggtgtgtgg gtggtggatt ttttttcttt ttcctggtta cgaccctcca     120
gggttataat attgtaattt tttcctgctc tatcaatata attttgcacc gtctcgtgcg     180
agtcgttcaa aaaaaaataa aggtagtttt taaaaaaaaa aatctaattt acagatgtat     240
tggatgagtt tgaccatgtg acatatgcat ggataaatat gttaaaatca ttacttaaat     300
cttttgtttt tttatctact tgttctatct tccatacaaa taagtatcaa tataatatta     360
gtataaaatt attatataaa ttgagaactt atgattgata tattaatata ttatatcagt     420
tatttaaaac taaccgttta agtttctcaa ttcataaaac cacaatccaa aattacttta     480
gacggtaata taaagggtct tataaagttt aggaggctag atatccgata atttaaaatc     540
cagagcataa gatagactca catacaatgt ttatgtggta tacgcctata tggacttttt     600
ccaagctgta acgggtggca aatttgccac ccaagccgca attctctaaa atatattccc     660
tataaaaaaa tatttttcat ttcatagtag ccaccaatat ctggaatgct ggatgatact     720
caaatgaact ctgctgttgt ctattgtatc agagcaaatt catcagctct aacaagaaag     780
aaacaataag ctattaagca taccggccgt cctcttgctg tttttaacgc atttgtagac     840
atatgtggtt tgagtaccaa ttcaatacaa agcaagagga gcagtacaaa ctaaatggta     900
ctcacacaat gaagcaaggt gaacttccaa atatctgcaa ccattattta cagaagataa     960
tagctattta gacagctatg agcctcacac atgtaccttt gaatcgccaa acaaatactt    1020
ctagcgcatt tatatatgaa catataatgg agccaacaca tcatttacaa ccaacatccc    1080
agtgagttat ttgtttggat caccactaac ttcgcaggca acctatgatt tgctctataa    1140
tcagttccgc ctcggtgaca atccaaacct tcacgagttg cctgcaacca a             1191
<210>26
<211>791
<212>DNA
<213>稻
<400>26
actttggtct accttttgta tgatagatat taagttaaga agtatgagac atcgatattg     60
ttcttgcgga tgtgtggctg gctggaagtg tgtacatttg tgattattcg tcccttgttg    120
taatcaccaa ggttctagca accgaaaata tttgattctt cgcatcgggt gagacataac    180
ttgtctgaag gtgacatgca tatctatcta ccttactcaa gagggaaaac aaaattctgc    240
atcttgaact gaactgaact gaactgaact tgccttctct tgttctgcat ttgattgatc    300
tttgtgcaga agaaatgccc ccaaatttgt ccatattttc ttcccattac ctcagcattg    360
cagatttggg ccttggcacg gttgttcaga acaagtgcgt cctgtttgca tactgaacct    420
ctgaaatttt cagagttcag aatcaggaac tagctcaatc aactgaaaat gctaaagatt    480
agaacaagcg aaccatgcca gcattaacat aaccgcaacg cggccagaca taaattaagg    540
tagatctgta actacaatat tgcttaatta tgagcttaca taagctagca gcaactgcac    600
tacagtacta caatactaca gactaatctt ggatgtcggc aaattcagtt ggggcatcat    660
ctgacgactg atcatgcagc aatgacctac ttgactacat ctctggcttc ctgaactata    720
gactatgagc aaggtgctca cctaacactg gaatatacta ctaagtagca ttctttacac    780
aggatgctgt t                                                         791
<210>27
<211>1478
<212>DNA
<213>稻
<400>27
cgaaggccca ggttttcgct tttatgctgc agctagttcg ttctcatttg aggtgggaag     60
gaaaactgcc tcaaaaaagg aaattttccc agcttacaag caccagcagc tgccttttct    120
gtgggtgtga ttttgcgttg gtaattgtta gcagttcagc agtttaattt ctcttttacc    180
ttattttgtt tctcatgtca ttaacaaccg ggtgtagcat ttaggaagtt ggatgatcat    240
gagctgtacc aaaatatttg tattgctgga agaatatatt gatggtagaa ttgtagctta     300
cacttcccaa aaatgtattt actggttgta caacagtcag cagtaaaatt aaatggaatt     360
taagtcaggg tcattcgttg tcctgctggt gaactatact cgagtacgtc tagggctcat     420
ctggtgaatg atcagaccaa tacgaaagaa ttccagctag taatttatca catcaaatta     480
atcataactc acttttcagg gcttatttac ttcgttgcct aattttggta aggtattgta     540
tagaccgatg gtttttactt tgagacctta ccaaatttta atagaagttt tgagagtaga     600
aagttatgga attaccaaag tgaacaaact ggctggctgg atgcaaaacc ataggcgcag     660
ccaaagacgc gagctgtttt tacactctag tacattacag taatcagcca gatctgtcaa     720
accatttgtc tgcaccaaca attagagctc tgcatgctat tctggcacaa aacccatcag     780
tatcagtaca tcacacgcat ccacacatac aaagcatccc agaagggatt gcaacccaaa     840
acggaacagc acaaactacg gccagttcga agtgggtcaa gatatacact catgtcgcac     900
aggctgtaac actaacacga gaagcaaact tgaagaatgc tgaggaaacg catctagcac     960
tagagtggga acgagtcgag cagctgccat cgaactgatg accatcaggc aattagagtt    1020
gcattcttgt aggacctgca tgtacaagtc atagctcatg acaagaggtt taaaagacaa    1080
tattataacc ccttcgtcct aaattccagg tttcaaaatt ctactcacaa gcatacatca    1140
tttaataagg gacattactg tcttttattc ttaaacttaa tctatgctaa acaacataaa    1200
aggacaacta tattgggacg ggggagtagc taacagagtg aaaatcaaag gagtaacgaa    1260
tttagtagtg tcactgtcga tacacctaat ttaacaccat aatatctcca actctccaca    1320
acacaaggac tgctgataaa ataaatgcac ttctttagga gaataatgtg ctcatcaagg    1380
ccatgtacaa aatatttctc caaaaagttc aacaaaggtt ccaggtaccc gtacagcaag    1440
ctatatcagg aatggagtcc aatgcgttac cttcatat                            1478
<210>28
<211>1678
<212>DNA
<213>稻
<400>28
gaaagcagca atcgccctgg actgtgattc tgtgacagcg aagttttggg tggaagatgc      60
agattgatgg ttctctgcaa ctgttggtgg agctaggttc agcagctatg ttcgcgagtg     120
tattagcgct cttttggcgg tgctgggtag tagaatgtag aatcgtttct tgttgattcc     180
ctgaactgat ccagatcaaa catcttctaa aggttctgcg atgcaatgct agctgcagac     240
gggagatggt acagggggtc gttttgctac tttgccgccg atgttgtagg gtgtgtagac     300
agactgtaga tgaataatgt cagtaacacc tgtggggggt tcagtgctag tgggctgcaa     360
aacttgagca ctgcttcgat caaattgtgt ctttgattat gaaattatgg aatccagcac     420
aggcaggtaa taatttcgta atagagcata aacaatttgt gaccttaggt gcgaagaaca     480
taaagctgac caaggtgaag taatattgat gcattgtgcg ctgcatttaa tttggttgtt     540
gaattcagag tacgtattta aataggtgtc cggaggggaa aatgtacaca aatgtttact     600
ccgtttgctg tgcatctcgc agtgatacaa aaaaatacaa atcaaaccac gctaaaaaat     660
ttagtcagtt gctcgtcttc agaattcagt cctcaaatat ttttaatgtt tcctccatgg     720
ctgctcgtcc gttcattttg cactcgtttt gctctctgtg aactggagag ccccagaggt     780
tctctttttg catgtaatct gagtttctga tcaaccattc agcctggcta agaaaaccat     840
atggtggtgg cgttcttcta acttgtgtct gcgcggctgt tggcttcatc caattcatcg     900
atcgccagtt actacttact tactaacagc gtccgggaac aggagttgag ccaaagaggc     960
aggtttatct tccattaagc ttaagagaac tcggagatat ctcgaagttc ttggcacggc    1020
acgtcctgtt ttcactttca aacttgagca ttcagtttag acgaggtact tgattttttt    1080
tttgtgtgca cgccccagca ggtgttttaa gaaaaaaatt aggcaactta aaattgttgt    1140
cccttctcct gtgttttgcg ctaataattc catcctgcac atggcatctc tgaggaatca    1200
aagatcaact agcaacagca acaattagcc gcgatagatc agacatagac actggcactt    1260
tcggatgaac aacagctagc tagattaact gaaagcaagc acggttacaa aggacacacc    1320
cagcagaggc atcagttgga aacaagaagc tagcagctgc tggccatgaa aagccaaagc    1380
atcacctagc tagcattcag cccctgcctg accgatcctg caataaacta aaacacatac    1440
cctagctact gaccatgatc gatcagcacc taaaccaaac taccaaagct agctaaagct    1500
aagcacgcat caccatatga aacataacat agcaaatcat acgggcgcct aaatgcgtgc    1560
atccgtcaag acctacatta ttattgataa gagagctagc tagctaagac tgactcgatg    1620
actacaactg agacgactac gacacactgg cattcacgga tgcaaaagtg tgtgtagt      1678
<210>29
<211>781
<212>DNA
<213>稻
<400>29
gcgtattcca attttttgat ttacgaattc ttcccgtgag ctcaagcaaa gagtggctct     60
gcagaacagt taagatctga tgcatagcca agttatatgg gttatgtatg tcaacaaatc    120
attgctcccc cccccccccc cagagatgta ttagtctgta tttcggcatt actcatttgg    180
aaatttgttt caaggcttgt gctttgatct atgtacttct atttgttatt ggaaaaggaa    240
ttaatatggc gattggtgtt acttcgctat ttgattgggt tattattgta gcctgaatat    300
tacattacaa accttcaatt ctgtagcaat agctttttat tagagaaatt ttacgggctc    360
ttaacgagat accgagaggt accacatttt tctgtaatgt accaagaaca aaaaaagtga    420
tactctcttt ataatccttg taaaaacaaa aggtaccaaa atgataactt ggaatactta    480
tcaagagctg taaaaatgac ccttggagca acggtgtaat tatactttaa gacaaaacga    540
tatagctata acccgaaaca aaagatcaaa tgtaagccta aaattagcta ttgcaaggag    600
ctgaaaaggc acttatgttc caatcaaatt atgtaagaat catattcctt tattctttca  660
tattggtgaa gccgtaccgt gtcagtatag gctgattttt ttacattaaa gcaaaaaaaa  720
atgtctatgt tcacaaggta gagggtgatt catgtgtcct tttactcttc agtaacaccg  780
g                                                                  781
<210>30
<211>1260
<212>DNA
<213>稻
<220>
<221>misc_feature
<222>(183)..(183)
<223>可以代表任何碱基(a，t，c，g)
<220>
<221>misc_feature
<222>(426)..(426)
<223>可以代表任何碱基(a，t，c，g)
<400>30
ttattttcca gttctggtgg tcacttccag ttgtgttttt actgtacaat tagggctctg     60
ttgggaggca acatatccta tgcacacagg ccctcacgta tacacacgtg cacatcaact    120
aaaaaatgtc accaaaaaat ctagaaaaaa tcatacatat actttcaatt gtattacacc    180
tanggttaaa atcttaatgt caaattcatt atattttagc cgtaacaaaa aaaaaacaaa    240
aaatctgaca gttttaaggt tacaattttg tcagcatttt atcttttttg ttattctcta    300
tgtacaataa atttgaagat gcgactttgc atgtagatgt aatactattg aaagtacatg    360
tatgaatttt actagaattt tttgtgataa tttttagttg gtatacacgg tgtgtatacg    420
tgaggncctg tgtgcatagg atacgctccc ctgttgggac gactatttta agggattttt    480
tcaataggaa ttagtccaat tcataccaaa atccttaaaa aaaaaatcct ctattctgaa    540
ggccttaagg acctattcgt tttggagaaa tttcagagga tttggatttt taagaattaa     600
ttcctatcat tgccatttgg tttataggaa tgtagacata ggaaaatcaa ggaattcttc     660
ctttcctaca agttgtagag agaaaacata agaaattttt cgtcttctta aatctcttgg     720
aaaattcctg tggattgaag tgtgcgtata tttctatttc tccactttaa attccttaaa     780
aacaaatagg gtgcctaact atttcatctg gtcttgtatg acactgacat ggtttttcag     840
atgcacattt agctaataca gtacaattca tattgttgaa gttttgcgca tatttttatg     900
taggagtaaa tgagttttaa gtatcaattt aaatttaaaa tgatgctggt acatcttttc     960
aaatttgatc aaaagctcca acgagtatta ctcctatttg cacataattg gcagcgttgt    1020
gaattccaaa caagcaaata aagaaagaaa aagacagctt aaaacgaccg cataactaga    1080
gtcacagcta agcgataatt cacaacatca cgatgcaaat cataaatcag tttcgttttt    1140
ataaaaaccc tcgtaggttc cagcagactg ctcataaaaa cggagtattc aacatcgcag    1200
agaccatttc tctgacccat agcaaaatca cagcgacaaa atccgctgtt tacatttaat    1260
<210>31
<211>1529
<212>DNA
<213>稻
<400>31
ttcaagttgc atcgccactt atgaacactc catgaacact taattctgga ggcatgattg     60
gtccgtggga ttaagacatc ttgatagact gcagtggagc ccagcccata atctgaagaa    120
ctcattaccg actcttggct gaagtgcttc ggagtgattg atgccattct gtcatgtgat    180
caagttcatg tccatactac atacgtcgtc tggtccttta gagcaacatg acttcaggac    240
gttgctatca acggctattg atgataaact agtaataaaa tttgtcgatg aaattacttg    300
ccgtgataaa tgattccgtt gtcgccaggt tacagttatt caacgtaaga acttcatatt    360
cattctagaa accaacacta ttcatcacca ttttcctcat ccccgaaaaa ctttgaccag     420
tacctctgtt tttgccaccc ccctccctcc ccggccacaa ggtgtagaat caagtgccat     480
cgctgaccaa tttgagctgc tcccaattaa aatacaaact aaaataaaaa agtatagaaa     540
aaatgaaatt acctatggat aatattatgt caatggcatt aaaatttgtg aattttggca     600
tttggataat agtacctccg ccttaaaata tatggatttt tcggattagg cacgagtaat     660
aagaaagttg gtggaattaa atagaaaaat attatgattg gttgagaaga ggaaaagttc     720
gtgaaattaa acagaaaaat gttatgattg attagaagaa aagaatgtaa gtagttcgaa     780
tggtgtaagg ttgtgattgg ttgagaagag aatgtaggta gagaaattgt tatatgttag     840
gataaaattt gaaggataca agttgttacg ttaaggagag agtattatgt ctatgtacta     900
tcaaaattca attatgattt tttttcaact taagctgttt tcgtcaattg gacgggatct     960
tgctacgacc acgatcggtt tggtaaacga cctgccccaa tccttcccac gcacctcctc    1020
tcccttcccg cgatcagtcg tcgcctacca accaactaca taatgctcta ccgacacctc    1080
ataaagctct ctcctccccc accctacgct accgtctctc gtgcacgcac ttcacgacga    1140
cttcgccagc aagggaattg tactccagag caacagctca accgacgacg agagctcaca    1200
acattgcctt tgcaaaaaaa acaactcgcg tatttcccat tctttataca attcctgtta    1260
tagtgtggta aaaaatttac acgtattgat ctctaggctg cctggattga tcggcgtcag    1320
ccctctccag ggagctctcg atcctgcccg ttgtgacaaa aataacatac acaaggcaca    1380
ataggatcga ctattctaac aaaaaaaaaa cgaaaaaaga aagttaagaa aaaaaaaacg    1440
aacggcatgt tcttctccca tcattccatt ttgcacttga accgtctgga tgcgtctgat    1500
gcttggatat catcaatggc atcgagaca                                      1529
<210>32
<211>1277
<212>DNA
<213>稻
<400>32
cagaaggaga tcaagaatgt ctttggcgag acattgcttc gacattgctt cagtgtcaaa      60
atacaccatc atcattgaga tcagtgttct taaggcgaca aggcgaggca aggcgaccca     120
cccctgctca attgcctagg cgacgcttta agcgtttaag gcgagggtaa ggcgacgcct     180
tccacacaag cacaagaggc atactagaaa tatatgaggc aaaaaagaga ggaagaacat     240
gaaggggcga ggaagatcca ttggagaagg gagcagcagg agggagacaa ccatcttctc     300
tttccatctt tcccatgttt ccaatctctg ctcgccctat tctctactct ctttccatct     360
ttcacccttc cctctcccta aattggtgca ctgctatatc tattctcttt ccatctttcg     420
cccttccctc tccctaaatt gtcgcacatg cgatttccgt cctatcttca cgcgatttcc     480
ttcccagcat gcataaatcc ctaagcggtg gggacgctct gctccctgat ggcgctcaga     540
cgcctaggga cgctttttaa accatgattg agattcctcc acgacgatca cctccatcca     600
gtttctcgct ccacattcta tccggcgatg agaatttgtt ttttatcaaa taactatcac     660
aaagctgcta gcccttcccc aaatccaccc ctacctctct cactgttgct actgttgatt     720
tttgcctaga catcagcatc actggataga acatgcaatg aggaactaga tggagtgagc     780
ttggtaaagg aattaattgg tgattgccat actttagcag cagcaaagca atgtctgaca     840
ctaagaacca cttgattttc ttgaggacag gagtctctgt tcctctagtt atttgtagga     900
attggactag gagcttcaag aacatggtgt tatgcggttg aatttgccat aggcagatca     960
atggagctcc catagtggca gcaatgaggg tgaataatgg acttcaagca taagttcaaa    1020
gaccagaagt ggactatttc tgaatttagt ccgaaaaatg aactttggga cgaaaagtat    1080
ggacttcatc catatcaaaa ccatgaccaa acataacttc tttcgaaatc catactgcac    1140
aaacatacat gtgccttttt ttaaaagata ttgggtaaag tgtatttgtg ccatgaatgg    1200
ctgctatcag gaatgcaatc tccacatgtt gtagcattgt taaaagctaa aactgcaaga    1260
ttttgcacca agtaata                                                    1277
<210>33
<211>1381
<212>DNA
<213>稻
<400>33
tgccttttgg atcgaaagat gcagttgttt tgctgctgaa ggcatcctca tgtctgttac      60
tttgatatgg tcttgaaata aatcttcgtt tacaagagaa caacactctg ttttatcttg     120
ttttgtgtgc cagaagcctg ctgaacaatt ttatgtcaat ttctttgcta ctaagaaagt     180
tatgcaccaa aatgaaggga aattctgtga agtttgtaat tttcaagtga ttggcattat     240
tctgtttagt tcgtgcagtg ccatgttcct tatataatca cagaacatgt aaaaggccga     300
aatattttcc ttgtcatttt ccatgcgaga acggcctttc gatgagactg gaaagtcctg     360
caataactat tgtccaaaat aacacacggc tctctaccga ttcacatcaa aaccaaccca     420
aacgctctct ctgttgcttg tgttctggac ttctctgagc gcagttcagg agtctcgagt     480
gtgcctcaac agtacatgtt aaacataaaa ctgccattga agattaccac caaccatatt     540
ggaagtttat catggcatat acttgccttt caaagaccct aattttcaaa gtgaacatgg     600
gactttcaga ctacagataa cctcaatcga taacatcacc gaaaattcga tattactaca     660
aagattttgg ttgaaaactt ctctgaaccc aatttaaata caagtcgccc tcggtgatgg     720
ctactcgcca ttccacgctc acagttgcag ttcacacttg caaaatgaaa aaaaaaatct     780
tctgaacagc aatcatcaac cggttcgacc tcaggatcat cacagaaatg aaaaggacga     840
ggaatctcaa tttaagaaag ttcctatcca aatatccaac aaaaatctga ctgtctggct     900
attattaatt caacaggaga tgctcgttaa agacaatata gttctgtaat ttgtaacaac     960
acaagagcct gaggatataa cgagttacaa acatgctgcc gttgcagcat ggtcatcaat    1020
atacaacatt acaacaacat atggggatcg cagaacactc ccattccacg attttacaac    1080
atatgcttca caacacgtta taaatacatg gttgtaccga gctgtagaga gacagccagc    1140
acgtcccaac tacaaatgca cactagccaa cagcaaacat aaaaactact ctctggtaag    1200
tcactatata tacgcactat agcttcacat gactaaaatt ataacatgac ataatttctt    1260
tcgtataaat tagccccagg aagcttctgt ccgaatcgcc atcttgggag caataaatat    1320
actggcattc ttcacaatgg atgcattatt tacatatata tacttcttct ccaaccacgt    1380
t                                                                    1381
<210>34
<211>1172
<212>DNA
<213>稻
<400>34
gtaactccag caatttactc ccaaccaata caattgcaca attgtgccct aaatttaata     60
ccagataagc taataagtga tctcttaaaa tgtctgtgat ctagggacct ggccatttga    120
tggagaattt ggttagctat ataccttgtg aagagattga tacaaagatg ggctatgagt    180
tcaagggaac tagttatggt gatcccagac catactcagc agatacttaa gtgtgcttcc    240
aatgatttta gcttcatttt tgtatagtaa aagaaatggt ttgtaccgag ccacagtgat    300
tgagcaatag agaagtagct aggtaggcat ttctgctctc atgtggaacg acatacaata    360
caatacacac agaattttta gaaaagaaaa atacaggtgg cggtgtatca tagtcataga    420
taaccatatt aagaaaaata tggatggcgg tgtatcaaaa accataaaat aaggtgtttc    480
tgtctatttg gagttgtttt ggcatgcttt cctgaaaaca ccaggctctt gttttcagaa    540
atccatgata agagagttga tcacttgctg gttttcttgt gggctatgat atcggccgac    600
ggccaagtat ctaataaaag attcttgatc agggccatgt ggagtgatca taaaaccttc    660
ttcttcagtg gcacttattg ggcaggacat tattaccaga ttaggttttg ttggaaacat    720
ttccattact tgctaactga aggagcactc cctgcagaga gctggccttg agcacaaaat     780
tccatctatt gctagactac cccaaatata aaaatgaggc aggaatcaga tcaaccccat     840
ggtcaattca aaatatgacc agtcgatata gcaccttaag aacttaaaat attaacaaaa     900
agggtagggg agttgcaatc agcgttgttt ggatggccca ggaattgaag ggctgagatc     960
atagcagatc tcatactaga gcacccaagt aaacatctcc caaaagaaat gtacatgttt    1020
atcagtgatt ttatttatct aattagcata ccaatacaaa ggaaaagaag tgcacagact    1080
aaagaaaacc tcacttttct caaaatagaa aaaataaacc acaaaatctt cctggggcta    1140
agtgagatct tacaacagtg tatgggagtt tt                                  1172
<210>35
<211>790
<212>DNA
<213>稻
<400>35
aggcaagaac gaacatgtga aggcaacgtg ctacactaag atcttcacat gttggttttt     60
tgtataaatc ttattcgcga ttgtcgcgcc tatcaagctt aagctatggc gatgtcgccc    120
aggtgacctc ttatgtaaat atgtgcgaat aagacagcat tctggagttg ttcttcctgt    180
ggacctctac ttgtagtata tggactaatg tgttgtatga gtacgtgaag cagaattcgg    240
tattatcaag gcttgtaatg ttagatgctc ttatattaca ctatgaagtg tcaactttca    300
agtggccacg tttacacata tatttgctat gctgacttgc tgagacatgc ttggttttag    360
ggcggtttgc agcttaacat gtgttccttt caaagagcag tagatctgca gtttgcatgg    420
tattcctgtc caaactgtct agtatactct atactgatac tctggtataa agctccctgc    480
agtttgcaac tgatgtattc tggaaactgc taagacacct cagctacctt tgtttgtttt    540
aaagactatc tcaactacct ggaactctgc attttgttta gtacggcaat taaggactga    600
gttttcagca aacagacttc gatgctattt ttgattgaaa taaagcaggc aaagttcggt    660
ctctcacata aacgaaacac attcatggat gatgtcgaaa gtgcaacgga atgatacaca    720
tgacatgtaa catttagcct tagaatttta ttgattcgac gcagcaatcc aacttttgac    780
ggacttggcc                                                           790
<210>36
<211>1283
<212>DNA
<213>稻
<400>36
atcgacgacg acgacggcca tggtgatcac tgctatagtt gtagcagaag gaggaggagg     60
ctgctctgct ttcttgctgt gtgctgcgat cgagttgtcc atcagtgttg ctgttcttag    120
agaagaagac tgacatctct ctctctctct atatatatag aaaaccctta atctatagag    180
cattttgttt ctgcttatat tgctacatgc tctatctttt tggttgaact atctacatat    240
atatctatat ttctatctac tcactccttt ctccttatgt aacatacctc tcaaaactct    300
gaactggctt gtgctgatca tctgatgtat aatatataat atataaatat atatcgcccc    360
ttggacacca tcgcatatca atctcctgga tatacttggt agactggctt aaatcatttc    420
tgctcttctg ggtcattaca gcttgattat aattggataa ttatcaaaga gctgagtagc    480
tgacacagtt tttgcattga gctgtcccag tccagagtct acttcgaagt ttagaacacc    540
agtatcactg catctgcata tgcctgatgc gaggaaagcc aataaatatg gatctgatga    600
gcatgccatg cagaaaggat aagatacaga cggcacgcat gcatgcccac atacacgtgc    660
tgtatcaatc aagagaacat catccaaata tccaaaccaa aatgcaaagg atcaacatca    720
tcatcaatga ccagtgccac actgcacaag ttaaagaggc acagcggatg agatctggtt    780
cagttcaggt acccttgttg agagttggca gagttcttgc tgtatccaaa gtgaatcttc    840
cccaagggga aagcaacaat ttacacggtg gtcaataaat aagagtgcat gtacaagtca    900
aaaatatagt agtagtatac ataaggtcca caacatcagc taattaagtt actccttttt     960
tggcttatta tttcatatgc actggtgtta aaattcctgc ggcggaacaa gacttttgct    1020
ttttcggctg gaaagattga gctttccatg gagcatcagc agcacaacac aattgaacag    1080
ctagctattc tttttaagtc gatcttgaaa catacattac tatgatgctg ggattaaaga    1140
gctggagaag agcttctgtg tctctccatt tttttttaca tcattgaggg aatgatcttg    1200
gccgaaatga ccggctttta ctttaccaca ggggaagaaa accttcttca gtcaggtgtg    1260
ttgcctccac catgcattca ggg                                            1283
<210>37
<211>1072
<212>DNA
<213>稻
<400>37
cagctcggta gcaaagcaca tattgaatca tgctgccgat acaaaaatcc tgctgtttag     60
aagatacaag ctaggaatag aaaagcaagc gaagactcaa catcaacatt gataacatgt    120
gggaaaaatg attgttgagg aaaccataga taaattggcc gaactcaact gcccattttt    180
cccaaaactg gtttagcagg aaagtttaag cagcatgtac aatgaaattg tatgtgcagc    240
tccatttata ctagtcctgc atgcaatgag ttctagacaa ccgaagttga taaaagtttc    300
atgacactgc catacaaaca acaaacaaat ctgtttcagg tctaatgaga ggaaaatgat    360
tgttggagaa aacagaataa gcttaaccca actgcccact ttcctctaat tgatatagca    420
ggaaacactt tcggcaaaaa atgcatagca taaggcatta ggccgataca cactatcctg    480
cagggtaaca tgacaacgga aaaaacaaat gtaaaatcca tgaaaaagta aaacatttct    540
ttggtactgc tatctagaga gaaaactaaa agctacagaa gcacaataag gaataaataa    600
agcaagaatg caatttacag atcaccaaaa cagacataat gtcataatat aaaaatatgt    660
agagataaat gagaggaaaa tgattgttga aaaaagcaca aaagcttaac ccaactgccc     720
actttcccca gatcaatata gcaggaaaca cttttggcac aagacgcaca aaaaagcgtt     780
aagccgatac acactatcct gcaggatgaa gcatatacag tgggcagaat gattacctac     840
tatactaatc tcatgtaaaa aaatgagaaa tatatcagga actagaaagt gagacacacc     900
ataaatgtta ctgagcacca ggaagaaatt aatagtgacg aatcttgtat tagttgctga     960
tgtttgcaac ttaaaaacta gaactcttta ctagtaataa tgttaataat gaacattaca    1020
taactgaaaa aaacatgaag cgcatgcatc agatcaccta aacttattct at            1072
<210>38
<211>1549
<212>DNA
<213>稻
<400>38
ttggtttaga gcttgagatg ttttaaaatc gttcattcct gagttataat agcccaagaa     60
cctcttgcac tatgttcgat caatccaccc cagctacttt cagatttctc gagtaattgg    120
tgcaattttg catgaacatg ctgccttgtt tggaattctt ttttgagtac cggagaatta    180
ccatgttagt gtgttggttt atgttttgaa ggtggccttg ttattctgtt gctgtgttga    240
tgtttggacg caattgctgg attggtactt ggtagcatgc tagaggtttt ttactctgct    300
tcatttgagt tgctgggttg cagttgcagg catcggtgta aactcaactc gaagtcgttt    360
gctgctgcct atagtccagg cggtgtaaat tcaaccttat tttttttgta aaatgaaatt    420
ttaatttcag gagagcaaca gacagaccaa actcttaact gttatgacct gacaagttta    480
atttctacca aaatttgtac cgtcgttgtc gaggaatttc ttcttgccgt tcgaattcga    540
tttcttcggt attgggttgg tccggtctca atccgttccg attgtgtcag tcttgggcca    600
taaagcccat gtgttacaag cctaacagcc caattcgact ggcccacgac ttttgcaggc    660
gggcaccaat tccgggtgca ctccgacgcg gggcgcgtga tcaaatttct tttcacactt    720
tatatcctat caaaatttaa taattttcaa attttgttat attttggtat tatataaatt     780
cagtagtgct aaactagttt ggttcacgca gaaaaaaaac atttgaattc gaaaggattt     840
gtttattatg ggaaataatc atataaggga acatatgtta tacatatata gaagcttttg     900
cgtgtacacg ccaactaaga aaatatggct ggttctaaaa cttctacacg ttttaaaatc     960
caataggaat gcaaagcata tgacatttca gctctacgtt tatctctatc tcgtattcac    1020
aatcatatgt ttcaaaggta accttatcaa atcctttttg gtggaaattt ccgaaattac    1080
aaaatacgaa caagcccttc agtactagcg ttggcgtact gcattttgcc catctcgctt    1140
ggccaagaaa gggggacaag ggggaaacgc atgtcgcagc ctggcacgtt ccaaacttcc    1200
aatcgcagag aaaaaaaaaa gagaagcaga tagagaggca tcgatcgtat ctacgagtac    1260
aaaagtaacc aagcaaacca tctagcttta ttttctcctg tccccaaggc caaacagcac    1320
agagctgagg cccccttaaa aattcatcag aacacatcca tcaaaaaact tattacaaca    1380
cggcgagtat atatgctacc atatcctcga caactgccta tagtgccaag aacactcaac    1440
aaccaccata caaacatttg acagaacaca tgcagatatc accgccggcg agttgaaact    1500
attctacccc ctcctcccag tttcttttcc cttcccccgt ttcagcagt                1549
<210>39
<211>766
<212>DNA
<213>稻
<400>39
gtaggaattc actaaaactg tatacttcgg actgggaagg gaaaacaaaa caaagtttat     60
tcagtatatt gttttgttct tctttgccat ccacttcagc tgtaagttca atttaacacc    120
ctttttgttg agcaagatat gctgtttttt cttggtgtca tttacatgtg gaatcagatg    180
ccagaaactt actttgtcaa gattggaatg ttcacaatta aattactaag gtgttctcat    240
ttttaacttg ctactgtagt cacattggcc acattagcac actatttcgt gttggctaaa    300
ttcctgtttt tgtacagttg tcgtacatat gtaaagtatg gagtgaagga tcgtaatact    360
ctagtgtagt tttcttaaaa tagttactga tattctgtgt tcacaaccac ctgctttata    420
ttcctagtag gtatcaaata ctagtctgca aatgaacaag tgattaagtg acaataagta    480
acatattcca aagaaagaac ttctacccat gctccatttt tcattcacag gcaccctctt    540
tgttaaacac tgtatcctcg tgtatgtcat gttacaactt tttataaatt acataaattg    600
tacaagtctc aactctcaat tcagtgagac agaaggattt ctcctccttt tttgaatgca    660
ggatctgatt gatcaaacaa atttaccggt caattccttc aatcttgtct tcaacctcag    720
agtagagctc cctgagcttt tccaagtttt cctctgatgt ttccca                   766
<210>40
<211>1691
<212>DNA
<213>稻
<400>40
gttatctgtt caaggagccc tgaaagtctg aaactgaaaa acaacatgaa taacagtgaa     60
tgattagaac ccagaaacct gctaaattgt ttatcagtga acatcttcat aaaccgtagt    120
ggaacccttc tgaaatcaat ctgaactgaa gctggcatct gcctgttaat acattataca    180
taataaaatt accggatcat cattttgtgc agatcaacac actgtaactg tagtatgcag    240
aaatcccgat ctgcagttgt tcctgtgatc ctgtctagca ttttgtaaag aagaaagcac    300
tggagcatga aaaaaccaat ctgaagctgt tcctgtcaag cattttagtt gtttgtttgc    360
gttgatacgt tctttgtttc tctgtggtat tgtcaaccag tcaaattgca atataatatc    420
attgagcgtt atatttgacc aagttacttc tgaattcatg cagaccacta tcacttttga    480
ccaattactt ctgaattcat gttcctttct ctattatcac tttgaccaat tacttcattt    540
atgttcttca ccctacaatc acttttgagt tttgaccaac tacttctgaa ttcatgttct    600
tctccctagc ttgttttaga gacttgactg ctgaatcaac atggccttcc ataatttgct     660
acctaactga acctaaacca agacattctc ttgcacgata cattttgctt tcatgcttat     720
agtttagaaa ccatgtctta tcttgcattg catactaagt tctcaaataa tttaatgaca     780
gtttgacatg gctgagctgt atgcctgttt atgcaaagct ggcatgttca tcatacgaac     840
tcttcagttc aaagttgaga gagccaacca gaaattgaaa gccaacgtca agaataaatc     900
agctacctat tgttagaatg tctatggata tctctgcaac cttaacagcc agctgcagaa     960
atcaatctga acttaatgct gtttccgtct agcatttatc tgtgacacct cacacgtaga    1020
tattgctcct tgaatggtac ttatgttgct ttcatttcta aagttactaa atcatgacca    1080
attcgatggc gatttcggtc ccagttcgtc acatttccac actgatgtct ttcagaggct    1140
ttaaacttcc accttctttt cagagctccc aattaaatca tctttcttga tcagtcactt    1200
ccatttttgc tactgatgat gccagtaata aaccaccatc atcggcatcg cacatgatga    1260
caattgacaa accaaccacc aactttcgag atccaacaaa ttcacagaca acaaaagagc    1320
aggtttctac cagattctga agagagcaaa ggaataatca gaagttgaaa gattctaaac    1380
attagactgc ttgccatctt aatatatcca acattaacaa gggcggtagt agaatcatta    1440
gtacacatga ttctacatca ctctctattt ttgctttttt ttttctaaca cattttagat    1500
gatgcacctg aaactgaaca gaagctgctt tactactaca agggatgcag caccagaaag    1560
ctgcaatttt tccccctttt tttttcagtt tttatacaca gtgaagaaaa gcagagagac    1620
taaactctga aaactccaag gttatacact agacagcagc agcagcagca tcaccactca    1680
cccatggcgc t                                                         1691
<210>41
<211>836
<212>DNA
<213>稻
<400>41
cctgctggta ttggagacgt taagaacatg acgttaggta atcctatctg tatttgaggc     60
aaactaggga cctcctgctg ctggcttaat gtattgcact gcatgacatt acatgacctc    120
catgtgttga acaagggctg aggctgttta actatagcac tagcagtacc gttttgcagc    180
tcgagagagc tagtagtgta tgtatgaatt cctcaggtgc tattcgtagt agtaagcgcg    240
aattgattat tatcagttca tgatggtgct actattcata ttcatgtttc tggttggcat    300
gggcggtgct agtgcaaact gcagagtgct gtaaatattc cccaaatctg caatgaattg    360
aacgagggtg catttgccct tatgactgtt gcggtgttgc aggtttttga atgagaagga    420
aagattacta tgtagaaaac gctgtgttgt atttgtcggt cgcaggcatc tggtggtaaa    480
ttctgttact gaagaaagtc cttgtcgcta tatatttgtg tgtttactta tgctcttgcc    540
tggaataaaa ctcgaggatc ttttcctttg caaaactggg aaaatccaga agtatatgct    600
atacgatcag ccgcattgca tttggttgat tgtattatag tgtacaaact cggcaacata    660
gttgaaattt ctgtggcatc cttattaaat aaatacttat tatacatacg tataaataac    720
tgctgcaagt aatctgcaag cagttgtttc tctcagctac tagtagtttg tgtgtgtgtg    780
tttccgtcga aaacccctgt gaaataacac aagccagggt taccgcaaca atgatt        836
<210>42
<211>1021
<212>DNA
<213>稻
<400>42
cggacttggg gagatctttt catgatgaaa agaaagttag gctcagtgtg taatatgtag     60
ggaattgttg gcatatccaa atgtatttcc tcttgaatac attattttgc tcgcatgcat    120
cctctccttt tccaattgta tgtttggttt atcgaatttt tgttgttccg acaaaaaaat    180
taggcccttg cagagtaatg gttcaggatt tcaagctgag cacagaatag aaagtttaac    240
aaaaaaaaga aagtgtagtc tgtagattgt aataccaata acatctgaaa accacaagct     300
atgtaattgt acctttatgc gtgtgatgtt tttaactaca atcaaacaat agtcagtgaa     360
accaagtcta agaggattga tcattgatgc cagttgatgt tgccttttca gattattcct     420
ggaatctaaa tgaaccatgg gatgcaacaa caagagtaac ccttttaaaa ccttttttta     480
tatatacaaa aagaaaatga tattagctca ggaagaaagg aggaacacaa acatcatctg     540
aagccatcaa gccaatacta ttaaatgaat gggtaatatc taacattcta tgaccaaaag     600
aattgtgtaa tagtgaaacc catactgttt gctgaatgta tttggaactg gaagcatcac     660
atctggaaaa aaggaaaaac agagaaccaa accagaaaac aatgtcactg agatgactgc     720
caagtataca ttccaatcca actgaacaaa tatgttacac aactaattaa acaaaaaaac     780
atgctggtac ggtggtaaat aatatatgct tcatatgaac accaataaaa tttcttcaca     840
tatgctgtta tcgtacaaaa tttgtttagt tgcaaagtga aattgcattg gaaggtcttt     900
ccactttgtt gcaaatatct agccttaaag tttccctcag tctacaggtg ttcacaaagt     960
tacttcagcc tcagaggtac ccactttgcc atcaaccagt ctggaaatat ctgctagatg    1020
c                                                                    1021
<210>43
<211>798
<212>DNA
<213>稻
<400>43
atgaccttag agcttttctt tcacctgtca tgacttgaat ggaaggcaaa taatctgttt     60
cacctctttc cagatgtaat ttctacagat gtcttctggg tcattttatg gatgtacctt    120
ctgaatgatt ttctgttgga ttccataatt ttgattatgt gaatatcaat aaaaacatgt    180
ttcaggtttt tagattccct taaaaggtaa agggttgtca tttactgaat ccatggctat    240
ctgaacttgt caagaatcca agatacacca gaagattgga attagttgat tctggcaaac    300
cagaaaaaaa aggttaaatg gagatgcggg gtatcgatcc ccgtacctct cgcatgctaa    360
gcgagcgctc taccatctga gctacatccc catgttgggg tcatttctta ttagttcatt    420
ctactattgg acaacacaaa gaccaaatgt aggcagaaag gcagtggatc gaatgaaagt    480
cacacgggcg caaatgccat ttacgaacaa atgagagcga actgaacttg tcatgttcaa    540
aacattgtgc cccaaggatt gaacggtaca gtatttcagg aaagaataca ttgccttcta    600
agcggtttga gtgataaaaa aattgttaaa aacataaaac acactgaatt aaatgtcaac    660
ggttccatgg tttcaactat cccagaaaag cagggttggc atttcgagat cttccgtctc    720
ttaaaactga atggatgccc atgcttcaaa atgaaaccct tgaggcagca actgaaagca    780
tgaaaagaaa tcaccaat                                                  798
<210>44
<211>865
<212>DNA
<213>稻
<400>44
ctgtcctata tatagccaaa atctggaatg cctccctggt cattttgttc gttacggctt     60
gtgtagtgtt ttgattttgt ttcgatttct gtagtagtgt cgtgctgctg tgccttttgt    120
ttttgtggct gtgacttgtg agcatccatg gaacttgtta cgctgaccaa taacattgtg    180
actcgggtag tctttatgtg gtttgcgctc aacttgaaag agtcagaacc aattgctgta    240
tatgtttttt ttttgggtga aatatgcgct gtagaagcaa atgatctgca tttctctggt    300
gttttgatgc caaatcgact actaatcgag actttatcgt aggcaaggat aacaagttat    360
gccttttgat actatcgagg catgttaacg tccattccag aaatattact tggctcagat    420
atgcaataaa caggagaaaa tcagcagcat actcttcccg aattacccga attacgttca    480
cacaccaaaa ttagggggta gaaaaaaagc ttgcaacgga gcaatgccga gcttgtgtgc    540
cagttcaaaa gggcgcttca gtaccggatt ggaagtacag actacagttt ggggtataaa    600
aacacacaga tgcaactgca aggcatataa gactaacttc aagtttgtag gaattaaaac    660
aagtatccca tctggaattc atcctcaccg atcaacgagt atcgcagtta aacagcagaa    720
ccgacaaata caagtaagct gacaaactat gaaaactgaa gtatctgaaa tacactaaca    780
ttcttaaggc ataaagcacg agatatgatt attcataatg ccggtcccaa cgaagagtca    840
tctgattgag cacttggaaa atcac                                          865
<210>45
<211>1162
<212>DNA
<213>稻
<400>45
gccctatgaa ttggaatgta tttgaccata caaaaaccat acaaagtgta gggttctaat     60
tagcaaatgt aagtttgtaa ttcttctgtc taaatgtagt gtgttgaggt ggtcagttgc    120
cgtgactggc tctttcagat ggtaattaca aagaaatgta acattaatgt tgtaacaagg    180
gtgccatttt gtttctgatt ccagatgaaa aggaaaaact attccatatt ctgcaggatt    240
aaacgtttct gctgttcaca acaggtaaag tcactccact tcagggaaag acagcaaaat    300
catttctttt acacagactt tagataaccc ttttttttgg ggttcttggt atatgccaac    360
ttttgtagcc tgcaccagaa acaaaaatga agacttttgc taaagatgta aaagtggcat    420
gatgtcctgg atgaccaaat aattcatgac aaatggatta aaagagccca atatctgaaa    480
gagactggcc agcagccact aatgtcacca accacatatg taacacttgg tgcataattc    540
aagagggagc atctcctcca gaatcaggat tgaaaggtac aacctcatag taaatcctcg    600
gaatatagca tgtgcagcat aagaatatat cagtgttgtg ctgggtaaga aaccacatga    660
accaattagg aataaataat catgctgaaa ttatagcaat gcttgcaatt tgcaaacgat    720
aaagctagac gcgggttgct ggaataacaa tccatctcca acaaaatagt acagaatata     780
actgaatggc cagctcagac cctaacagaa ttgaaaagct ggattcatca gcactccatt     840
gagcaatcta gatcaggaaa gagcatagat gcataatgaa ctgagatccc ttcaaaatga     900
ctaactaata tttttttttc ttataaaaga gtttacaaca gtacaaccac gaagatcagc     960
actaccatta ctgattttgt taacatagag tgatttatca tgtgtgccag acaaacaaca    1020
gatacattca tacatagcat aacttacagc acatgataca gactacggag aacggttaat    1080
cttaaaataa aaacaaaaaa acaaggaggc aaagcttatt ttgcctggga ttcatctaaa    1140
tgcagttgtg tgcagaagga ga                                             1162
<210>46
<211>1297
<212>DNA
<213>稻
<400>46
tgttttgtca agctcccgct tgggaaaagc ttggtttttt tgttacgtgt tttgacctgg     60
aacaacattt gacacatgtc ttttgatctc attgtctgtt tttcaagccc aataagaatt    120
tgggtcgagc attgttttag gatcgaccat atacagtacc tctctttgca ttacaatgaa    180
gagcagttaa tttgggtcac tttttacatc tttactgaag tagaaacgcg tcctctgtct    240
gtgacagttt ttttgttctc cagattgttt gccgcttttt acttgcctga tacctgtgat    300
agtagtacta gatgtagatg gttgtactgg gcgaaattca gcgaggctag gagttttgga    360
ggattttggt tgaactagtt tctgcgagaa ttcaataaaa tttctgaatt atgatggagc    420
cacggagaac aagcaatctg aaagaagata cgcaggtact gcgagtgtag tgcagccaga    480
agcaagttat ccgtagcttg tgaaagcaca gttggcttct tctacccaaa atataagaac    540
ctattaacca aaatataaga acctattaac gaatgagata ttttctagta ctaagtatat    600
tttctagtac taagtccata ttcgtagtac taggaaatgc cccatccgat ttaagttcaa    660
attcgtagta ttaggaaatg tcctatccgg ttctaggtta ttgtacttaa gaacagatgg   720
agtaggaaac taggttattg tacttaagaa cggatggagt aggaaacaac ggtgtactca   780
cacagagctg attgtctgaa caatcttcca gaggtcatca aactgctgat cagatcagaa   840
aaaaagattg aaattttgga tctcaatacc atttttacct gtcttgaacg gattgcaaca   900
atatgcattc agaactttag acatgcatac atactgcatt ggaaatgcgt ggaacaaaaa   960
cccatacctg ccttatggga actataagaa atatgttgta cattagcaac aaagtgaatt  1020
tccaatacaa acataagatc atcaatatta tccatgataa ataaaaatac agggctggta  1080
taagcaacat acaatctccg cttgttcaga acctaaaatt tgtttacagt tgtaccacat  1140
ggtatgctct ctacaactaa tgctactaag gaaatttcac agcatcgcga cagaacaaac  1200
aacagatgac atatcagtaa ctaaaatcat gtgttctgat atgtccagct gatgaggcat  1260
gcaaaacttc aggagatcag aaccctctac ttcaaag                           1297
<210>47
<211>35
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物引物1(SacI，AvrII，SpeI，OCS 5’)
<400>47
cggagctccc taggactagt tcgaccggca tgccc                              35
<210>48
<211>25
<212>DNA
<213>引物2(NotI，OCS 3’)
<400>48
ccgcggccgc agcttggaca atcag                                         25
<210>49
<211>36
<212>DNA
<213>引物3(AvrII，XmaI，RsrII，LuF 5’)
<400>49
cgcctaggcc cgggcggacc gcattaagaa gggccc    36
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>引物4(SpeI LuF 3’)
<400>50
cgactagtag agagttctca gagc                 24
<210>51
<211>16
<212>DNA
<213>引物5(RsrII，BspEI，靶标gene seq 5’)
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>n代表待扩增的靶序列的优选10到20个碱基
<400>51
cgcggaccgt ccggan                         16
<210>52
<211>15
<212>DNA
<213>引物6(SpeI，AgeI，靶标gene seq 3’)
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>n代表待扩增的靶序列的优选10到20个碱基
<400>52
cgactagtac cggtn                          15
<210>53
<211>4811
<212>DNA
<213>pTOI3
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(100)
<223>attL2重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(147)..(2134)
<223>泛蛋白启动子+内含子
<220>
<221>内含子
<222>(2551)..(2739)
<223>PIV2内含子
<220>
<221>misc_feature
<222>(4218)..(4242)
<223>目的转录终止子的插入位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(4243)..(4482)
<223>萤光素酶片段(Lu-F)
<220>
<221>终止子
<222>(4489)..(4701)
<223>ocs终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(4712)..(4811)
<223>attL1重组位点
<400>53
caaataatga ttttattttg actgatagtg acctgttcgt tgcaacaaat tgataagcaa      60
tgctttctta taatgccaac tttgtacaag aaagctgggt cggcgcgcca agcttgcatg     120
cctgcaggca tgcaagcttc cgcggctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct     180
agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac     240
acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat     300
aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt     360
tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt     420
ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc     480
cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt     540
tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta     600
gtttttttat ttaatagttt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa     660
caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata     720
atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc     780
gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct     840
ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg     900
cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc     960
agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata    1020
aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca    1080
cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg    1140
tcctcccccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc catggttagg    1200
gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg    1260
ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg    1320
ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga cgggatcgat    1380
ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat    1440
atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga    1500
tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag aattctgttt caaactacct    1560
ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata catattcata gttacgaatt    1620
gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc gggttttact    1680
gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg    1740
gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca aactacctgg tgtatttatt    1800
aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta agatggatgg    1860
aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga    1920
tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt acctatctat tataataaac    1980
aagtatgttt tataattatt tcgatcttga tatacttgga tgatggcata tgcagcagct    2040
atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta tttgcttggt actgtttctt    2100
ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag ggtacccccg ggtggtcagt    2160
cccttatgtt acgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat caaaaaactc gacggcctgt    2220
gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg gaattgatca gcgttggtgg gaaagcgcgt    2280
tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa cgatcagttc gccgatgcag    2340
atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agtctttata ccgaaaggtt    2400
gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg    2460
tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca    2520
cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtaagtttct gcttctacct ttgatatata    2580
tataataatt atcattaatt agtagtaata taatatttca aatatttttt tcaaaataaa    2640
agaatgtagt atatagcaat tgcttttctg tagtttataa gtgtgtatat tttaatttat    2700
aacttttcta atatatgacc aaaatttgtt gatgtgcagg tatcaccgtt tgtgtgaaca    2760
acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga    2820
aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc    2880
tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat gtcgcgcaag    2940
actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc agcgttgaac    3000
tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg actttgcaag    3060
tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg tgcgtcacag    3120
ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg tcagtggcag    3180
tgaagggcca acagttcctg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc tttggtcgtc    3240
atgaagatgc ggacttacgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg cacgaccacg    3300
cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct tacgctgaag    3360
agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact gctgctgtcg    3420
gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa gaactgtaca    3480
gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt aaagagctga    3540
tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac gaaccggata    3600
cccgtccgca agtgcacggg aatatttcgc cactggcgga agcaacgcgt aaactcgacc    3660
cgacgcgtcc gatcacctgc gtcaatgtaa tgttctgcga cgctcacacc gataccatca    3720
gcgatctctt tgatgtgctg tgcctgaacc gttattacgg atggtatgtc caaagcggcg    3780
atttggaaac ggcagagaag gtactggaaa aagaacttct ggcctggcag gagaaactgc    3840
atcagccgat tatcatcacc gaatacggcg tggatacgtt agccgggctg cactcaatgt    3900
acaccgacat gtggagtgaa gagtatcagt gtgcatggct ggatatgtat caccgcgtct    3960
ttgatcgcgt cagcgccgtc gtcggtgaac aggtatggaa tttcgccgat tttgcgacct 4020
cgcaaggcat attgcgcgtt ggcggtaaca agaaagggat cttcactcgc gaccgcaaac 4080
cgaagtcggc ggcttttctg ctgcaaaaac gctggactgg catgaacttc ggtgaaaaac 4140
cgcagcaggg aggcaaacaa tgaatcaaca actctcctgg cgcaccatcg tcggctacag 4200
cctcgggaat tgctaccgag ctccctaggc ccgggcggac cgcattaaga agggccctgc 4260
tcccttctac cctctggagg atggcaccgc tggcgagcag ctgcacaagg ccatgaagag 4320
gtatgccctg gtgcctggca ccattgcctt caccgatgcc cacattgagg tggacatcac 4380
ctatgccgag tacttcgaga tgtctgtgcg cctggccgag gccatgaaga ggtacggcct 4440
gaacaccaac caccgcatcg tggtgtgctc tgagaactct ctactagttc gaccggcatg 4500
ccctgcttta atgagatatg cgagacgcct atgatcgcat gatatttgct ttcaattctg 4560
ttgtgcacgt tgtaaaaaac ctgagcatgt gtagctcaga tccttaccgc cggtttcggt 4620
tcattctaat gaatatatca cccgttacta tcgtattttt atgaataata ttctccgttc 4680
aatttactga ttgtccaagc tgcggccgcg gagcctgctt ttttgtacaa agttggcatt 4740
ataaaaaagc attgctcatc aatttgttgc aacgaacagg tcactatcag tcaaaataaa 4800
atcattattt g                                                      4811
<210>54
<211>5053
<212>DNA
<213>pTOI4
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(100)
<223>attL2重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(147)..(2134)
<223>泛蛋白启动子+内含子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2158)..(4163)
<223>编码葡糖醛酸糖苷酶(GUS)+内含子
<220>
<221>内含子
<222>(2551)..(2739)
<223>PIV2内含子
<220>
<221>终止子
<222>(4225)..(4478)
<223>nos终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(4485)..(4724)
<223>萤光素酶片段(Lu-F)
<220>
<221>终止子
<222>(4731)..(4943)
<223>ocs终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(4954)..(5053)
<223>attL1重组位点
<400>54
caaataatga ttttattttg actgatagtg acctgttcgt tgcaacaaat tgataagcaa     60
tgctttctta taatgccaac tttgtacaag aaagctgggt cggcgcgcca agcttgcatg    120
cctgcaggca tgcaagcttc cgcggctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct    180
agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac    240
acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat    300
aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt     360
tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt     420
ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc     480
cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt     540
tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta     600
gtttttttat ttaatagttt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa     660
caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata     720
atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc     780
gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct     840
ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg     900
cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc     960
agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata    1020
aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca    1080
cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg    1140
tcctcccccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc catggttagg    1200
gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg    1260
ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg    1320
ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga cgggatcgat    1380
ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat    1440
atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga    1500
tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag aattctgttt caaactacct    1560
ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata catattcata gttacgaatt    1620
gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc gggttttact    1680
gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg    1740
gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca aactacctgg tgtatttatt    1800
aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta agatggatgg    1860
aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga    1920
tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt acctatctat tataataaac    1980
aagtatgttt tataattatt tcgatcttga tatacttgga tgatggcata tgcagcagct    2040
atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta tttgcttggt actgtttctt    2100
ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag ggtacccccg ggtggtcagt    2160
cccttatgtt acgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat caaaaaactc gacggcctgt    2220
gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg gaattgatca gcgttggtgg gaaagcgcgt    2280
tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa cgatcagttc gccgatgcag    2340
atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agtctttata ccgaaaggtt    2400
gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg    2460
tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca    2520
cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtaagtttct gcttctacct ttgatatata    2580
tataataatt atcattaatt agtagtaata taatatttca aatatttttt tcaaaataaa    2640
agaatgtagt atatagcaat tgcttttctg tagtttataa gtgtgtatat tttaatttat    2700
aacttttcta atatatgacc aaaatttgtt gatgtgcagg tatcaccgtt tgtgtgaaca    2760
acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga    2820
aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc    2880
tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat gtcgcgcaag    2940
actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc agcgttgaac    3000
tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg actttgcaag    3060
tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg tgcgtcacag    3120
ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg tcagtggcag    3180
tgaagggcca acagttcctg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc tttggtcgtc    3240
atgaagatgc ggacttacgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg cacgaccacg    3300
cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct tacgctgaag    3360
agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact gctgctgtcg    3420
gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa gaactgtaca    3480
gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt aaagagctga    3540
tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac gaaccggata    3600
cccgtccgca agtgcacggg aatatttcgc cactggcgga agcaacgcgt aaactcgacc    3660
cgacgcgtcc gatcacctgc gtcaatgtaa tgttctgcga cgctcacacc gataccatca    3720
gcgatctctt tgatgtgctg tgcctgaacc gttattacgg atggtatgtc caaagcggcg    3780
atttggaaac ggcagagaag gtactggaaa aagaacttct ggcctggcag gagaaactgc    3840
atcagccgat tatcatcacc gaatacggcg tggatacgtt agccgggctg cactcaatgt    3900
acaccgacat gtggagtgaa gagtatcagt gtgcatggct ggatatgtat caccgcgtct    3960
ttgatcgcgt cagcgccgtc gtcggtgaac aggtatggaa tttcgccgat tttgcgacct    4020
cgcaaggcat attgcgcgtt ggcggtaaca agaaagggat cttcactcgc gaccgcaaac    4080
cgaagtcggc ggcttttctg ctgcaaaaac gctggactgg catgaacttc ggtgaaaaac    4140
cgcagcaggg aggcaaacaa tgaatcaaca actctcctgg cgcaccatcg tcggctacag    4200
cctcgggaat tgctaccgag ctccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga    4260
ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag  4320
catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga  4380
gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat  4440
aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatccgg accgcattaa gaagggccct  4500
gctcccttct accctctgga ggatggcacc gctggcgagc agctgcacaa ggccatgaag  4560
aggtatgccc tggtgcctgg caccattgcc ttcaccgatg cccacattga ggtggacatc  4620
acctatgccg agtacttcga gatgtctgtg cgcctggccg aggccatgaa gaggtacggc  4680
ctgaacacca accaccgcat cgtggtgtgc tctgagaact ctctactagt tcgaccggca  4740
tgccctgctt taatgagata tgcgagacgc ctatgatcgc atgatatttg ctttcaattc  4800
tgttgtgcac gttgtaaaaa acctgagcat gtgtagctca gatccttacc gccggtttcg  4860
gttcattcta atgaatatat cacccgttac tatcgtattt ttatgaataa tattctccgt  4920
tcaatttact gattgtccaa gctgcggccg cggagcctgc ttttttgtac aaagttggca  4980
ttataaaaaa gcattgctca tcaatttgtt gcaacgaaca ggtcactatc agtcaaaata  5040
aaatcattat ttg                                                     5053
<210>55
<211>28
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物Loy482-NosT-upper-SalI
<400>55
aaatttgtcg accgatcggt caaacatt                                       28
<210>56
<211>36
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物Loy483-NosT-Lower-HindIII
<400>56
aaatttaagc ttcccgatct agtaacatag atgaca     36
<210>57
<211>31
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物Loy494-Gus_upper_SalI_间隔区
<400>57
ttttagtcga cacgctggac tggcatgaac t          31
<210>58
<211>40
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物Loy492-NosT-lower-BglII SpeI
<400>58
ttttaagatc tactagtccg atctagtaac atagatgaca 40
<210>59
<211>31
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物Loy493_Gus_upper_SalI_间隔区
<400>59
tttaagtcga caagtcggcg gcttttctgc t          31
<210>60
<211>40
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物Loy492-NosT-lower-BglII SpeI
<400>60
ttttaagatc tactagtccg atctagtaac atagatgaca 40
<210>  61
<211>44
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物JMTOIprim1
<400>61
ggttccaagg taccaaaaca atgggcgctg atgatgttgt tgat 44
<210>62
<211>42
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物JMTOIprim2
<400>62
aaggtagaag cagaaactta cctggatacg tcactttgac ca  42
<210>63
<211>42
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物JMTOIprim3
<400>63
tggtcaaagt gacgtatcca ggtaagtttc tgcttctacc tt  42
<210>64
<211>37
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物JMTOIprim4
<400>64
ggttccaagg atccatttat tttgaaaaaa atatttg        37
<210>65
<211>35
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物JMTOIprim5
<400>65
ggttccaagg atccagtata tagcaattgc ttttc          35
<210>66
<211>83
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物JMTOIprim6
<400>66
cgagaacctt cgtcagtcct gcacatcaac aaattttggt cataaaaaaa aaaatattag    60
aaaagttata aattaaaata tac                                            83
<210>67
<211>63
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物JMTOIprim7
<400>67
ctaatatttt tttttttatg accaaaattt gttgatgtgc aggactgacg aaggttctcg   60
cac                                                                 63
<210>68
<211>38
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物JMTOIprim8
<400>68
ttggaaccac tagtttatcg cctgacacga tttcctgc                           38
<210>69
<211>35
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物JMTOIprim9
<400>69
ggttccaagg atccgatcgt tcaaacattt ggcaa                              35
<210>70
<211>35
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物JMTOIprim10
<400>70
ggttccaagg atccgatcta gtaacataga tgaca                              35
<210>71
<211>3030
<212>DNA
<213>pJMTOI1
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(1988)
<223>玉米泛蛋白启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2007)..(2268)
<223>编码白喉毒素A的序列的5’-部分
<220>
<221>内含子
<222>(2269)..(2488)
<220>
<221>misc_feature
<222>(2489)..(2811)
<223>编码白喉毒素A的序列的3’-部分
<220>
<221>终止子
<222>(2818)..(3030)
<223>ocs终止子
<400>71
tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa      60
gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat     120
ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat     180
atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag     240
tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt     300
tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg     360
ttttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta     420
gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata gtttagatat     480
aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa     540
actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac     600
gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac     660
ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc caccgttgga     720
cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg     780
gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac gggggattcc tttcccaccg     840
ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt     900
tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac     960
ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ccctctctac    1020
cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg    1080
tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga    1140
cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg    1200
ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca    1260
tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt    1320
catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt    1380
ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt    1440
atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc    1500
taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt    1560
tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt    1620
agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca    1680
tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca    1740
tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg     1800
ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tatttcgatc     1860
ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct     1920
tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg     1980
tgttacttct gcagggtacc aaaacaatgg gcgctgatga tgttgttgat tcttctaaat     2040
cttttgtgat ggaaaacttt tcttcgtacc acgggactaa acctggttat gtagattcca     2100
ttcaaaaagg tatacaaaag ccaaaatctg gtacacaagg aaattatgac gatgattgga     2160
aagggtttta tagtaccgac aataaatacg acgctgcggg atactctgta gataatgaaa     2220
acccgctctc tggaaaagct ggaggcgtgg tcaaagtgac gtatccaggt aagtttctgc     2280
ttctaccttg taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta     2340
gtagtaatat aatatttcaa atattttttt caaaataaat ggatccagta tatagcaatt     2400
gcttttctgt agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatttttttt     2460
tttatgacca aaatttgttg atgtgcagga ctgacgaagg ttctcgcact aaaagtggat     2520
aatgccgaaa ctattaagaa agagttaggt ttaagtctca ctgaaccgtt gatggagcaa     2580
gtcggaacgg aagagtttat caaaaggttc ggtgatggtg cttcgcgtgt agtgctcagc     2640
cttcccttcg ctgaggggag ttctagcgtt gaatatatta ataactggga acaggcgaaa     2700
gcgttaagcg tagaacttga gattaatttt gaaacccgtg gaaaacgtgg ccaagatgcg     2760
atgtatgagt atatggctca agcctgtgca ggaaatcgtg tcaggcgata aactagttcg     2820
accggcatgc cctgctttaa tgagatatgc gagacgccta tgatcgcatg atatttgctt     2880
tcaattctgt tgtgcacgtt gtaaaaaacc tgagcatgtg tagctcagat ccttaccgcc     2940
ggtttcggtt cattctaatg aatatatcac ccgttactat cgtattttta tgaataatat     3000
tctccgttca atttactgat tgtccaagct                                      3030
<210>72
<211>3289
<212>DNA
<213>pJMTOI2
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(1988)
<223>玉米泛蛋白启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2007)..(2268)
<223>编码白喉毒素A的序列的5’-部分
<220>
<221>内含子
<222>(2269)..(2380)
<223>内含子的5’-部分
<220>
<221>终止子
<222>(2387)..(2639)
<223>nos终止子
<220>
<221>内含子
<222>(2646)..(2747)
<223>内含子的3’-部分
<220>
<221>misc_feature
<222>(2747)..(3070)
<223>编码白喉毒素A的序列的3’-部分
<220>
<221>终止子
<222>(3077)..(3289)
<223>ocs终止子
<400>72
tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa      60
gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat     120
ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat     180
atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag     240
tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt     300
tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg     360
tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta     420
gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata gtttagatat     480
aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa     540
actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac     600
gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac     660
ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc caccgttgga     720
cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg     780
gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac gggggattcc tttcccaccg     840
ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt     900
tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac     960
ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ccctctctac    1020
cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg    1080
tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga    1140
cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg    1200
ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca    1260
tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt    1320
catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt    1380
ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt    1440
atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc    1500
taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt    1560
tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt    1620
agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca    1680
tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca    1740
tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg    1800
ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tatttcgatc    1860
ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct    1920
tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg    1980
tgttacttct gcagggtacc aaaacaatgg gcgctgatga tgttgttgat tcttctaaat    2040
cttttgtgat ggaaaacttt tcttcgtacc acgggactaa acctggttat gtagattcca    2100
ttcaaaaagg tatacaaaag ccaaaatctg gtacacaagg aaattatgac gatgattgga    2160
aagggtttta tagtaccgac aataaatacg acgctgcggg atactctgta gataatgaaa    2220
acccgctctc tggaaaagct ggaggcgtgg tcaaagtgac gtatccaggt aagtttctgc    2280
ttctaccttg taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta    2340
gtagtaatat aatatttcaa atattttttt caaaataaat ggatccgatc gttcaaacat    2400
ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata    2460
atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat    2520
gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa    2580
aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg    2640
gatccagtat atagcaattg cttttctgta gtttataagt gtgtatattt taatttataa  2700
cttttctaat attttttttt ttatgaccaa aatttgttga tgtgcaggac tgacgaaggt  2760
tctcgcacta aaagtggata atgccgaaac tattaagaaa gagttaggtt taagtctcac  2820
tgaaccgttg atggagcaag tcggaacgga agagtttatc aaaaggttcg gtgatggtgc  2880
ttcgcgtgta gtgctcagcc ttcccttcgc tgaggggagt tctagcgttg aatatattaa  2940
taactgggaa caggcgaaag cgttaagcgt agaacttgag attaattttg aaacccgtgg  3000
aaaacgtggc caagatgcga tgtatgagta tatggctcaa gcctgtgcag gaaatcgtgt  3060
caggcgataa actagttcga ccggcatgcc ctgctttaat gagatatgcg agacgcctat  3120
gatcgcatga tatttgcttt caattctgtt gtgcacgttg taaaaaacct gagcatgtgt  3180
agctcagatc cttaccgccg gtttcggttc attctaatga atatatcacc cgttactatc  3240
gtatttttat gaataatatt ctccgttcaa tttactgatt gtccaagct              3289
<210>73
<211>3680
<212>DNA
<213>pJMTOI3
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(1988)
<223>玉米泛蛋白启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2001)..(2696)
<223>编码绿色荧光蛋白(GFP)
<220>
<221>终止子
<222>(2703)..(2955)
<223>nos终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2962)..(3161)
<223>间隔区
<220>
<221>misc_feature
<222>(3162)..(3461)
<223>dsRNAi靶标sequence
<220>
<221>终止子
<222>(3468)..(3680)
<223>ocs终止子
<400>73
tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa   60
gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat  120
ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat  180
atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag  240
tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt  300
tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg  360
tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta  420
gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata gtttagatat  480
aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa  540
actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac  600
gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac  660
ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc caccgttgga  720
cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg  780
gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac gggggattcc tttcccaccg  840
ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt     900
tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac     960
ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ccctctctac    1020
cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg    1080
tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga    1140
cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg    1200
ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca    1260
tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt    1320
catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt    1380
ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt    1440
atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc    1500
taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt    1560
tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt    1620
agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca    1680
tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca    1740
tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg    1800
ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tatttcgatc    1860
ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct    1920
tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg    1980
tgttacttct gcagggtacc atggctcagt caaagcacgg tctaacaaaa gaaatgacaa    2040
tgaaataccg tatggaaggg tgcgtcgatg gacataaatt tgtgatcacg ggagagggca    2100
ttggatatcc gttcaaaggg aaacaggcta ttaatctgtg tgtggtcgaa ggtggaccat    2160
tgccatttgc cgaagacata ttgtcagctg cctttatgta cggaaacagg gttttcactg     2220
aatatcctca agacatagct gactatttca agaactcgtg tcctgctggt tatacatggg     2280
acaggtcttt tctctttgag gatggagcag tttgcatatg taatgcagat ataacagtga     2340
gtgttgaaga aaactgcatg tatcatgagt ccaaatttta tggagtgaat tttcctgctg     2400
atggacctgt gatgaaaaag atgacagata actgggagcc atcctgcgag aagatcatac     2460
cagtacctaa gcaggggata ttgaaagggg atgtctccat gtacctcctt ctgaaggatg     2520
gtgggcgttt acggtgccaa ttcgacacag tttacaaagc aaagtctgtg ccaagaaaga     2580
tgccggactg gcacttcatc cagcataagc tcacccgtga agaccgcagc gatgctaaga     2640
atcagaaatg gcatctgaca gaacatgcta ttgcatccgg atctgcattg ccctgaggat     2700
ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg     2760
cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat     2820
gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat     2880
acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat     2940
ctatgttact agatcggatc catcaccgtt tgtgtgaaca acgaactgaa ctggcagact     3000
atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga aaaagcagtc ttacttccat     3060
gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc tctacaccac gccgaacacc     3120
tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat gtcgcgcaag actgtaacca cgcgtctgtt     3180
gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc agcgttgaac tgcgtgatgc ggatcaacag     3240
gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg actttgcaag tggtgaatcc gcacctctgg     3300
caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg tgcgtcacag ccaaaagcca gacagagtgt     3360
gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg tcagtggcag tgaagggcga acagttcctg     3420
attaaccaca aaccgttcta ctttactggc  tttggtcgtc aactagttcg accggcatgc    3480
cctgctttaa tgagatatgc gagacgccta tgatcgcatg atatttgctt tcaattctgt  3540
tgtgcacgtt gtaaaaaacc tgagcatgtg tagctcagat ccttaccgcc ggtttcggtt  3600
cattctaatg aatatatcac ccgttactat cgtattttta tgaataatat tctccgttca  3660
atttactgat tgtccaagct                                              3680
<210>74
<211>3421
<212>DNA
<213>pJMTOI4
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(1988)
<223>玉米泛蛋白启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2001)..(2696)
<223>编码绿色荧光蛋白(GFP)
<220>
<221>misc_feature
<222>(2703)..(2902)
<223>间隔区
<220>
<221>misc_feature
<222>(2903)..(3202)
<223>dsRNAi靶标
<220>
<221>终止子
<222>(3209)..(3421)
<223>ocs终止子
<400>74
tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa    60
gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat   120
ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat     180
atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag     240
tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt     300
tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg     360
tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta     420
gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata gtttagatat     480
aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa     540
actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac     600
gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac     660
ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc caccgttgga     720
cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg     780
gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac  gggggattcc tttcccaccg    840
ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt     900
tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac  cagatctccc ccaaatccac    960
ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ccctctctac    1020
cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg    1080
tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga    1140
cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg    1200
ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca    1260
tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt    1320
catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt    1380
ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt    1440
atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc    1500
taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt    1560
tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt    1620
agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca    1680
tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca    1740
tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg    1800
ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tatttcgatc    1860
ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct    1920
tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg    1980
tgttacttct gcagggtacc atggctcagt caaagcacgg tctaacaaaa gaaatgacaa    2040
tgaaataccg tatggaaggg tgcgtcgatg gacataaatt tgtgatcacg ggagagggca    2100
ttggatatcc gttcaaaggg aaacaggcta ttaatctgtg tgtggtcgaa ggtggaccat    2160
tgccatttgc cgaagacata ttgtcagctg cctttatgta cggaaacagg gttttcactg    2220
aatatcctca agacatagct gactatttca agaactcgtg tcctgctggt tatacatggg    2280
acaggtcttt tctctttgag gatggagcag tttgcatatg taatgcagat ataacagtga    2340
gtgttgaaga aaactgcatg tatcatgagt ccaaatttta tggagtgaat tttcctgctg    2400
atggacctgt gatgaaaaag atgacagata actgggagcc atcctgcgag aagatcatac    2460
cagtacctaa gcaggggata ttgaaagggg atgtctccat gtacctcctt ctgaaggatg    2520
gtgggcgttt acggtgccaa ttcgacacag tttacaaagc aaagtctgtg ccaagaaaga    2580
tgccggactg gcacttcatc cagcataagc tcacccgtga agaccgcagc gatgctaaga    2640
atcagaaatg gcatctgaca gaacatgcta ttgcatccgg atctgcattg ccctgaggat    2700
ccatcaccgt ttgtgtgaac aacgaactga actggcagac tatcccgccg ggaatggtga    2760
ttaccgacga aaacggcaag aaaaagcagt cttacttcca tgatttcttt aactatgccg  2820
gaatccatcg cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg  2880
tggtgacgca tgtcgcgcaa gactgtaacc acgcgtctgt tgactggcag gtggtggcca  2940
atggtgatgt cagcgttgaa ctgcgtgatg cggatcaaca ggtggttgca actggacaag  3000
gcactagcgg gactttgcaa gtggtgaatc cgcacctctg gcaaccgggt gaaggttatc  3060
tctatgaact gtgcgtcaca gccaaaagcc agacagagtg tgatatctac ccgcttcgcg  3120
tcggcatccg gtcagtggca gtgaagggcg aacagttcct gattaaccac aaaccgttct  3180
actttactgg ctttggtcgt caactagttc gaccggcatg ccctgcttta atgagatatg  3240
cgagacgcct atgatcgcat gatatttgct ttcaattctg ttgtgcacgt tgtaaaaaac  3300
ctgagcatgt gtagctcaga tccttaccgc cggtttcggt tcattctaat gaatatatca  3360
cccgttacta tcgtattttt atgaataata ttctccgttc aatttactga ttgtccaagc  3420
t                                                                  3421
<210>75
<211>3160
<212>DNA
<213>pJMTO15
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(1988)
<223>玉米泛蛋白启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2001)..(2300)
<223>用于dsRNAi靶标的dsRNA的正义链
<220>
<221>misc_feature
<222>(2309)..(2595)
<223>间隔区
<220>
<221>misc_feature
<222>(2602)..(2901)
<223>用于dsRNAi靶标的dsRNA的反义链
<220>
<221>终止子
<222>(2908)..(3160)
<223>nos终止子
<400>75
tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa   60
gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat  120
ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat  180
atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag  240
tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt  300
tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg  360
tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta  420
gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata gtttagatat  480
aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa  540
actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac  600
gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac  660
ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc caccgttgga  720
cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg  780
gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac gggggattcc tttcccaccg  840
ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt  900
tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac     960
ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ccctctctac    1020
cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg    1080
tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga    1140
cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg    1200
ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca    1260
tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt    1320
catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt    1380
ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt    1440
atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc    1500
taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt    1560
tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt    1620
agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca    1680
tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca    1740
tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg    1800
ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tatttcgatc    1860
ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct    1920
tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg    1980
tgttacttct gcagggtacc ctgtaaccac gcgtctgttg actggcaggt ggtggccaat    2040
ggtgatgtca gcgttgaact gcgtgatgcg gatcaacagg tggttgcaac tggacaaggc    2100
actagcggga ctttgcaagt ggtgaatccg cacctctggc aaccgggtga aggttatctc    2160
tatgaactgt gcgtcacagc caaaagccag acagagtgtg atatctaccc gcttcgcgtc    2220
ggcatccggt cagtggcagt gaagggcgaa cagttcctga ttaaccacaa accgttctac  2280
tttactggct ttggtcgtca ggcgcgccta ctccccgagt ctgaaccgct cgatcgaacc  2340
tcactcaaca ttgacgagag cgagtcgtct aactcttgca gcctctttgc gtcgtgaaag  2400
ctctctggaa gaagaagatt ctcatcagga tccccgagaa actcggataa gagactcaca  2460
gagtagccat gctcggtcac aacgctacaa tggtccaagc tcgtaagctc gaagccgaag  2520
tccagatctg tgctggcgaa gtcgatgtcg gacttaagaa cttcctccaa atggcggtcg  2580
cagtcttcaa attcgctcga gtgacgacca aagccagtaa agtagaacgg tttgtggtta  2640
atcaggaact gttcgccctt cactgccact gaccggatgc cgacgcgaag cgggtagata  2700
tcacactctg tctggctttt ggctgtgacg cacagttcat agagataacc ttcacccggt  2760
tgccagaggt gcggattcac cacttgcaaa gtcccgctag tgccttgtcc agttgcaacc  2820
acctgttgat ccgcatcacg cagttcaacg ctgacatcac cattggccac cacctgccag  2880
tcaacagacg cgtggttaca gactagtgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta  2940
agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt  3000
aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt  3060
agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag  3120
gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc                        3160
<210>76
<211>2665
<212>DNA
<213>Lo376-pENTR-B2
<220>
<221>终止子
<222>(269)..(295)
<223>互补序列：T2终止子
<220>
<221>终止子
<222>(427)..(470)
<223>互补序列：T1终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(569)..(668)
<223>attL1重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(755)..(853)
<223>互补序列：attL2重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(1059)..(1868)
<223>卡那霉素抗性
<400>76
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga   60
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga  120
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca  180
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc  240
tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta  300
gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc  360
acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa  420
caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg  480
gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa  540
aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac  600
ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa  660
agcaggctgg tacccgggga tcctctaggt cgaccagatc tgatatctgc ggccgcctcg  720
agcatatggg catgcaagct tggcgtaatc atggacccag ctttcttgta caaagttggc     780
attataagaa agcattgctt atcaatttgt tgcaacgaac aggtcactat cagtcaaaat     840
aaaatcatta tttgccatcc agctgatccg gtgcaggttg gcggcggcgt gcgtagcgaa     900
gaatccccta tagtgagtcg tattacatgg tcatagctgt ttcctggcag ctctggcccg     960
tgtctcaaaa tctctgatgt tacattgcac aagataaaaa tatatcatca tgaacaataa    1020
aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa    1080
cgtcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc    1140
gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgctt gtatgggaag cccgatgcgc    1200
cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg    1260
tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta    1320
ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg aaaaacagca ttccaggtat    1380
tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc    1440
ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg    1500
ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc    1560
gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taaacttttg ccattctcac    1620
cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga    1680
aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg    1740
ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa    1800
aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt    1860
ttttctaatc agaattggtt aattggttgt aacactggca gagcattacg ctgacttgac    1920
gggacggcgc aagctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttacgcgtcg ttccactgag    1980
cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa    2040
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag  2100
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg  2160
ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat  2220
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta  2280
ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg  2340
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc  2400
gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa  2460
gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc  2520
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt  2580
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct  2640
tttgctggcc ttttgctcac atgtt                                        2665
<210>77
<211>7686
<212>DNA
<213>Lo442 pSUN1-R4R3-M20(OCS10)(目的地载体)
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(153)
<223>RB(右边界)
<220>
<221>misc_feature
<222>(215)..(339)
<223>attR4重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(1004)..(1684)
<223>互补序列：氯霉素抗性
<220>
<221>misc_feature
<222>(1792)..(1916)
<223>互补序列：attR3重组位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(1935)..(2149)
<223>LB(左边界)
<220>
<221>misc_feature
<222>(3858)..(4965)
<223>编码repA
<220>
<221>rep_origin
<222>(5715)..(6560)
<223>互补序列：ColE1起点
<220>
<221>misc_feature
<222>(6729)..(7520)
<223>互补序列：aadA标记(spectomycin)
<400>77
ttccatggac atacaaatgg acgaacggat aaaccttttc acgccctttt aaatatccga   60
ttattctaat aaacgctctt ttctcttagg tttacccgcc aatatatcct gtcaaacact  120
gatagtttaa actgaaggcg ggaaacgaca atcagatcta gtaggaaaca gctatgacca  180
tgattacgcc aagctatcga ttacgccaag ctatcaactt tgtatagaaa agttgaacga  240
gaaacgtaaa atgatataaa tatcaatata ttaaattaga ttttgcataa aaaacagact  300
acataatact gtaaaacaca acatatccag tcactatggt cgacctgcag actggctgtg  360
tataagggag cctgacattt atattcccca gaacatcagg ttaatggcgt ttttgatgtc  420
attttcgcgg tggctgagat cagccacttc ttccccgata acggagaccg gcacactggc  480
catatcggtg gtcatcatgc gccagctttc atccccgata tgcaccaccg ggtaaagttc  540
acgggggact ttatctgaca gcagacgtgc actggccagg gggatcacca tccgtcgccc     600
gggcgtgtca ataatatcac tctgtacatc cacaaacaga cgataacggc tctctctttt     660
ataggtgtaa accttaaact gcatttcacc agcccctgtt ctcgtcggca aaagagccgt     720
tcatttcaat aaaccgggcg acctcagcca tcccttcctg attttccgct ttccagcgtt     780
cggcacgcag acgacgggct tcattctgca tggttgtgct taccgaaccg gagatattga     840
catcatatat gccttgagca actgatagct gtcgctgtca actgtcactg taatacgctg     900
cttcatagca tacctctttt tgacatactt cgggtataca tatcagtata tattcttata     960
ccgcaaaaat cagcgcgcaa atacgcatac tgttatctgg cttttagtaa gccggatcct    1020
ctagattacg ccccgcctgc cactcatcgc agtactgttg taattcatta agcattctgc    1080
cgacatggaa gccatcacaa acggcatgat gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct    1140
tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat    1200
tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca    1260
tattctcaat aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc accgtaacac gccacatctt    1320
gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa    1380
acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg aacactatcc catatcacca    1440
gctcaccgtc tttcattgcc atacggaatt ccggatgagc attcatcagg cgggcaagaa    1500
tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg    1560
taatatccag ctgaacggtc tggttatagg tacattgagc aactgactga aatgcctcaa    1620
aatgttcttt acgatgccat tgggatatat caacggtggt atatccagtg atttttttct    1680
ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc tcgacggatc ctaactcaaa atccacacat    1740
tatacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgcggcc gccatagtga    1800
ctggatatgt tgtgttttac agtattatgt agtctgttt t ttatgcaaaa tctaatttaa   1860
tatattgata tttatatcat tttacgtttc tcgttcaact ttattataca tagttgataa    1920
ttcactggcc ggatctgctt ggtaataatt gtcattagat tgtttttatg catagatgca    1980
ctcgaaatca gccaatttta gacaagtatc aaacggatgt taattcagta cattaaagac    2040
gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt ttacaccaca atatatcctg    2100
ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca caaaatcacc acgcgttacc    2160
accacgccgg ccggccgcat ggtgttgacc gtgttcgccg gcattgccga gttcgagcgt    2220
tccctaatca tcgaccgcac ccggagcggg cgcgaggccg ccaaggcccg aggcgtgaag    2280
tttggccccc gccctaccct caccccggca cagatcgcgc acgcccgcga gctgatcgac    2340
caggaaggcc gcaccgtgaa agaggcggct gcactgcttg gcgtgcatcg ctcgaccctg    2400
taccgcgcac ttgagcgcag cgaggaagtg acgcccaccg aggccaggcg gcgcggtgcc    2460
ttccgtgagg acgcattgac cgaggccgac gccctggcgg ccgccgagaa tgaacgccaa    2520
gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg gccaggacga accgtttttc attaccgaag    2580
agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga gccgcccgcg cacgtctcaa    2640
ccgtgcggct gcatgaaatc ctggccggtt tgtctgatgc caagctggcg gcctggccgg    2700
ccagcttggc cgctgaagaa accgagcgcc gccgtctaaa aaggtgatgt gtatttgagt    2760
aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg atgagtaaat aaacaaatac    2820
gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag aaaggcgggt caggcaagac    2880
gaccatcgca acccatctag cccgcgccct gcaactcgcc ggggccgatg ttctgttagt    2940
cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc gtgcgggaag atcaaccgct    3000
aaccgttgtc ggcatcgacc gcccgacgat tgaccgcgac gtgaaggcca tcggccggcg    3060
cgacttcgta gtgatcgacg gagcgcccca ggcggcggac ttggctgtgt ccgcgatcaa    3120
ggcagccgac ttcgtgctga ttccggtgca gccaagccct tacgacatat gggccaccgc    3180
cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat tgaggtcacg gatggaaggc tacaagcggc    3240
ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac gcgcatcggc ggtgaggttg ccgaggcgct    3300
ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc ccgtatcacg cagcgcgtga gctacccagg    3360
cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga atcagaaccc gagggcgacg ctgcccgcga    3420
ggtccaggcg ctggccgctg aaattaaatc aaaactcatt tgagttaatg aggtaaagag    3480
aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt gccggccgtc cgagcgcacg cagcagcaag    3540
gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg ccagccatga agcgggtcaa ctttcagttg    3600
ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg tacgcggtac gccaaggcaa gaccattacc    3660
gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta ccagagtaaa tgagcaaatg aataaatgag    3720
tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat caagaacaac caggcaccga    3780
cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg ccaggcgtaa gcggctgggt    3840
tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac ccccaagccc gaggaatcgg cgtgagcggt    3900
cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc gcggcgctgg gtgatgacct ggtggagaag    3960
ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa cgcatcgagg cagaagcacg ccccggtgaa    4020
tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc aaagaatccc ggcaaccgcc ggcagccggt    4080
gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc gacgagcaac cagatttttt cgttccgatg    4140
ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc agcatcatgg acgtggccgt tttccgtctg    4200
tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg atccgctacg agcttccaga cgggcacgta    4260
gaggtttccg cagggccggc cggcatggcc agtgtgtggg attacgacct ggtactgatg    4320
gcggtttccc atctaaccga atccatgaac cgataccggg aagggaaggg agacaagccc    4380
ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac gtactcaagt tctgccggcg agccgatggc    4440
ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc tgcattcggt taaacaccac gcacgttgcc    4500
atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc cgcctggtga cggtatccga gggtgaagcc    4560
ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc ggccggagta catcgagatc    4620
gagctagctg attggatgta ccgcgagatc acagaaggca agaacccgga cgtgctgacg    4680
gttcaccccg attacttttt gatcgatccc ggcatcggcc gttttctcta ccgcctggca    4740
cgccgcgccg caggcaaggc agaagccaga tggttgttca agacgatcta cgaacgcagt    4800
ggcagcgccg gagagttcaa gaagttctgt ttcaccgtgc gcaagctgat cgggtcaaat    4860
gacctgccgg agtacgattt gaaggaggag gcggggcagg ctggcccgat cctagtcatg    4920
cgctaccgca acctgatcga gggcgaagca tccgccggtt cctaatgtac ggagcagatg    4980
ctagggcaaa ttgccctagc aggggaaaaa ggtcgaaaag gtctctttcc tgtggatagc    5040
acgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccgga acccgtacat tgggaaccca    5100
aagccgtaca ttgggaaccg gtcacacatg taagtgactg atataaaaga gaaaaaaggc    5160
gatttttccg cctaaaactc tttaaaactt attaaaactc ttaaaacccg cctggcctgt    5220
gcataactgt ctggccagcg cacagccgaa gagctgcaaa aagcgcctac ccttcggtcg    5280
ctgcgctccc tacgccccgc cgcttcgcgt cggcctatcg cggccgctgg ccgctcaaaa    5340
atggctggcc tacggccagg caatctacca gggcgcggac aagccgcgcc gtcgccactc    5400
gaccgccggc gcccacatca aggcaccctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa    5460
cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag    5520
cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac    5580
ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt    5640
gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac    5700
cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg    5760
cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat    5820
aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc    5880
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc    5940
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga    6000
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt    6060
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg    6120
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc    6180
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg    6240
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc    6300
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg    6360
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc    6420
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct    6480
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt    6540
taagggattt tggtcatgca tgatatatct cccaatttgt gtagggctta ttatgcacgc    6600
ttaaaaataa taaaagcaga cttgacctga tagtttggct gtgagcaatt atgtgcttag    6660
tgcatctaac gcttgagtta agccgcgccg cgaagcggcg tcggcttgaa cgaatttcta    6720
gctagacatt atttgccgac taccttggtg atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct    6780
tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta    6840
gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg    6900
acatccttcg gcgcgatttt gccggttact gcgctgtacc aaatgcggga caacgtaagc    6960
actacatttc gctcatcgcc agcccagtcg ggcggcgagt tccatagcgt taaggtttca    7020
tttagcgcct caaatagatc ctgttcagga accggatcaa agagttcctc cgccgctgga    7080
cctaccaagg caacgctatg ttctcttgct tttgtcagca agatagccag atcaatgtcg    7140
atcgtggctg gctcgaagat acctgcaaga atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc  7200
agttcgcgct tagctggata acgccacgga atgatgtcgt cgtgcacaac aatggtgact  7260
tctacagcgc ggagaatctc gctctctcca ggggaagccg aagtttccaa aaggtcgttg  7320
atcaaagctc gccgcgttgt ttcatcaagc cttacggtca ccgtaaccag caaatcaata  7380
tcactgtgtg gcttcaggcc gccatccact gcggagccgt acaaatgtac ggccagcaac  7440
gtcggttcga gatggcgctc gatgacgcca actacctctg atagttgagt cgatacttcg  7500
gcgatcaccg cttcccccat gatgtttaac tttgttttag ggcgactgcc ctgctgcgta  7560
acatcgttgc tgctccataa catcaaacat cgacccacgg cgtaacgcgc ttgctgcttg  7620
gatgcccgag gcatagactg taccccaaaa aaacagtcat aacaagccat gaaaaccgcc  7680
actgcg                                                             7686
<210>78
<211>10414
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>双元载体Lo239-pSUN3-GWs-B1-BnAK700∷GUS::nosT-B2
<220>
<221>misc_recomb
<222>(4)..(28)
<223>attB1 Gateway重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(56)..(724)
<223>p-BnAK启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(749)..(2560)
<223>编码c-GUS(E.coli)的cds
<220>
<221>终止子
<222>(2631)..(2883)
<223>t-NOS胭脂氨酸合成酶终止子
<220>
<221>misc_recomb
<222>(2895)..(2919)
<223>attB2 Gateway重组位点
<220>
<221>终止子
<222>(2972)..(3224)
<223>互补序列：t-NOS胭脂氨酸合成酶终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(3300)..(4094)
<223>互补序列：编码c-NptII的cds赋予卡那霉素抗性
<220>
<221>启动子
<222>(4126)..(4413)
<223>互补序列：来自胭脂氨酸合成酶基因的p-NOS启动子
<220>
<221>misc_structure
<222>(4464)..(4678)
<223>互补序列：b-LB Left T-DNA边界
<220>
<221>misc_structure
<222>(10227)..(10372)
<223>互补序列：b-RB右T-DNA边界
<400>78
atcacaagtt tgtacaaaaa agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga cacgaagctt   60
tcgaggctaa cgttggtgga gatgttaagg cacggcatct tctcttcttc ttcttttttg  120
tttgtttgtt tgtttcgctc tctatcactc actcgatcga tccccagtct tcttttcggg  180
aaagctgtgt cagaccaatt atattccatc tttaatttgg ccctttttat tattcgctat  240
ggcccaacat ttcaggccca atttatacga ttataaatat aaccacttga ttgtgctgcc     300
gctcagctga atagtactcc ctccgttttt taatataaat cgttttacag ttatgcacgt     360
aaattaagaa aaccattaac tttttatatt ttctaaacaa aaacatcatt aattatttac     420
ttactcacaa ttcaaccaat agaaaaatag aagatatatt accattggtc atacaacatt     480
aattattaat aaattttaca tagaaaaccg aaaacgacat ataatttgga acaaaaaaat     540
ttctctaaaa ctacttatat taaaaaacgg agagagtata tttaactagt tcgtcttact     600
gacaaattga agaggcagac caagacacgc ggctcctcga tggctgtctt atgccaagtg     660
gcggtgcctg cttctgcatt aaataggtag aagaactcta attacagaag ctcgaggtag     720
ataggatccc cgggtaggtc agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga     780
aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattga     840
tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt     900
taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg     960
cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt    1020
cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta    1080
tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtatcac    1140
cgtttgtgtg aacaacgaac tgaactggca gactatcccg ccgggaatgg tgattaccga    1200
cgaaaacggc aagaaaaagc agtcttactt ccatgatttc tttaactatg ccggaatcca    1260
tcgcagcgta atgctctaca ccacgccgaa cacctgggtg gacgatatca ccgtggtgac    1320
gcatgtcgcg caagactgta accacgcgtc tgttgactgg caggtggtgg ccaatggtga    1380
tgtcagcgtt gaactgcgtg atgcggatca acaggtggtt gcaactggac aaggcactag    1440
cgggactttg caagtggtga atccgcacct ctggcaaccg ggtgaaggtt atctctatga    1500
actgtgcgtc acagccaaaa gccagacaga gtgtgatatc tacccgcttc gcgtcggcat    1560
ccggtcagtg gcagtgaagg gcgaacagtt cctgattaac cacaaaccgt tctactttac    1620
tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt gcgtggcaaa ggattcgata acgtgctgat    1680
ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac tcctaccgta cctcgcatta    1740
cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat ggcatcgtgg tgattgatga    1800
aactgctgct gtcggcttta acctctcttt aggcattggt ttcgaagcgg gcaacaagcc    1860
gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa cggggaaact cagcaagcgc acttacaggc    1920
gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa ccacccaagc gtggtgatgt ggagtattgc    1980
caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc acgggaatat ttcgcgccac tggcggaagc    2040
aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgcgtc aatgtaatgt tctgcgacgc    2100
tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc ctgaaccgtt attacggatg    2160
gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc agagaaggta ctggaaaaag aacttctggc    2220
ctggcaggag aaactgcatc agccgattat catcaccgaa tacggcgtgg atacgttagc    2280
cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg gagtgaagag tatcagtgtg catggctgga    2340
tatgtatcac cgcgtctttg atcgcgtcag cgccgtcgtc ggtgaacagg tatggaattt    2400
cgccgatttt gcgacctcgc aaggcatatt gcgcgttggc ggtaacaaga aagggatctt    2460
cactcgcgac cgcaaaccga agtcggcggc ttttctgctg caaaaacgct ggactggcat    2520
gaacttcggt gaaaaaccgc agcagggagg caaacaatga atcaacaact ctcctggcgc    2580
accatcgtcg gctacagcct cgggaattgc taccgagctc gaatttcccc gatcgttcaa    2640
acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca    2700
tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat    2760
ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa    2820
acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag    2880
atcgggaatt ctagacccag ctttcttgta caaagtggtg ataattcact ggccgtcgtt    2940
ttacaacgac tcagagcttg acaggaggcc cgatctagta acatagatga caccgcgcgc    3000
gataatttat cctagtttgc gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta aatgtataat    3060
tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcatta catgttaatt    3120
attacatgct taacgtaatt caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag accggcaaca    3180
ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatcggggat catccgggtc    3240
tgtggcggga actccacgaa aatatccgaa cgcagcaaga tctagagctt gggtcccgct    3300
cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata    3360
ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg    3420
gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat    3480
ccagaaaagc ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg    3540
acgagatcct cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg    3600
agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta    3660
cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc    3720
gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga    3780
gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca    3840
gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc    3900
gctgcctcgt cctgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc    3960
gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt    4020
gcccagtcat agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca    4080
tcttgttcaa tcatgcgaaa cgatccagat ccggtgcaga ttatttggat tgagagtgaa    4140
tatgagactc taattggata ccgaggggaa tttatggaac gtcagtggag catttttgac    4200
aagaaatatt tgctagctga tagtgacctt aggcgacttt tgaacgcgca ataatggttt    4260
ctgacgtatg tgcttagctc attaaactcc agaaacccgc ggctgagtgg ctccttcaac    4320
gttgcggttc tgtcagttcc aaacgtaaaa cggcttgtcc cgcgtcatcg gcgggggtca    4380
taacgtgact cccttaattc tccgctcatg atcagattgt cgtttcccgc cttcagttta    4440
aactatcagt gtttgacagg atcctgcttg gtaataattg tcattagatt gtttttatgc    4500
atagatgcac tcgaaatcag ccaattttag acaagtatca aacggatgtt aattcagtac    4560
attaaagacg tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt tacaccacaa    4620
tatatcctgc caccagccag ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca    4680
cgcgttacca ccacgccggc cggccgcatg gtgttgaccg tgttcgccgg cattgccgag    4740
ttcgagcgtt ccctaatcat cgaccgcacc cggagcgggc gcgaggccgc caaggcccga    4800
ggcgtgaagt ttggcccccg ccctaccctc accccggcac agatcgcgca cgcccgcgag    4860
ctgatcgacc aggaaggccg caccgtgaaa gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc    4920
tcgaccctgt accgcgcact tgagcgcagc gaggaagtga cgcccaccga ggccaggcgg    4980
cgcggtgcct tccgtgagga cgcattgacc gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat    5040
gaacgccaag aggaacaagc atgaaaccgc accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca    5100
ttaccgaaga gatcgaggcg gagatgatcg cggccgggta cgtgttcgag ccgcccgcgc    5160
acgtctcaac cgtgcggctg catgaaatcc tggccggttt gtctgatgcc aagctggcgg    5220
cctggccggc cagcttggcc gctgaagaaa ccgagcgccg ccgtctaaaa aggtgatgtg    5280
tatttgagta aaacagcttg cgtcatgcgg tcgctgcgta tatgatgcga tgagtaaata    5340
aacaaatacg caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc    5400
aggcaagacg accatcgcaa cccatctagc ccgcgccctg caactcgccg gggccgatgt    5460
tctgttagtc gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga    5520
tcaaccgcta accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat    5580
cggccggcgc gacttcgtag tgatcgacgg agcgccccag gcggcggact tggctgtgtc    5640
cgcgatcaag gcagccgact tcgtgctgat tccggtgcag ccaagccctt acgacatatg    5700
ggccaccgcc gacctggtgg agctggttaa gcagcgcatt gaggtcacgg atggaaggct    5760
acaagcggcc tttgtcgtgt cgcgggcgat caaaggcacg cgcatcggcg gtgaggttgc    5820
cgaggcgctg gccgggtacg agctgcccat tcttgagtcc cgtatcacgc agcgcgtgag    5880
ctacccaggc actgccgccg ccggcacaac cgttcttgaa tcagaacccg agggcgacgc    5940
tgcccgcgag gtccaggcgc tggccgctga aattaaatca aaactcattt gagttaatga    6000
ggtaaagaga aaatgagcaa aagcacaaac acgctaagtg ccggccgtcc gagcgcacgc    6060
agcagcaagg ctgcaacgtt ggccagcctg gcagacacgc cagccatgaa gcgggtcaac    6120
tttcagttgc cggcggagga tcacaccaag ctgaagatgt acgcggtacg ccaaggcaag    6180
accattaccg agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga    6240
ataaatgagt agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc    6300
aggcaccgac gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag    6360
cggctgggtt gtctgccggc cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc    6420
gtgagcggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg    6480
gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagcacgc    6540
cccggtgaat cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg gcaaccgccg    6600
gcagccggtg cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc    6660
gttccgatgc tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt    6720
ttccgtctgt cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga gcttccagac    6780
gggcacgtag aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga ttacgacctg    6840
gtactgatgg cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga    6900
gacaagcccg gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt ctgccggcga    6960
gccgatggcg gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt aaacaccacg    7020
cacgttgcca tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac ggtatccgag    7080
ggtgaagcct tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg gccggagtac    7140
atcgagatcg agctagctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa gaacccggac    7200
gtgctgacgg ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg ttttctctac    7260
cgcctggcac gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa gacgatctac    7320
gaacgcagtg gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg caagctgatc    7380
gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc tggcccgatc    7440
ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc ctaatgtacg    7500
gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg tctctttcct    7560
gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa cccgtacatt    7620
gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga tataaaagag    7680
aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct taaaacccgc    7740
ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa agcgcctacc    7800
cttcggtcgc tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc ggccgctggc    7860
cgctcaaaaa tggctggcct acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca agccgcgccg    7920
tcgccactcg accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga    7980
cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga    8040
tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc    8100
agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca    8160
gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg    8220
agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc    8280
gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa    8340
tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt    8400
aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa    8460
aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt    8520
ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg    8580
tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc    8640
agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc    8700
gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta    8760
tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct    8820
acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc    8880
tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa    8940
caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa    9000
aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa    9060
aactcacgtt aagggatttt ggtcatgcat gatatatctc ccaatttgtg tagggcttat    9120
tatgcacgct taaaaataat aaaagcagac ttgacctgat agtttggctg tgagcaatta    9180
tgtgcttagt gcatctaacg cttgagttaa gccgcgccgc gaagcggcgt cggcttgaac    9240
gaatttctag ctagacatta tttgccgact accttggtga tctcgccttt cacgtagtgg    9300
acaaattctt ccaactgatc tgcgcgcgag gccaagcgat cttcttcttg tccaagataa    9360
gcctgtctag cttcaagtat gacgggctga tactgggccg gcaggcgctc cattgcccag    9420
tcggcagcga catccttcgg cgcgattttg ccggttactg cgctgtacca aatgcgggac    9480
aacgtaagca ctacatttcg ctcatcgcca gcccagtcgg gcggcgagtt ccatagcgtt  9540
aaggtttcat ttagcgcctc aaatagatcc tgttcaggaa ccggatcaaa gagttcctcc  9600
gccgctggac ctaccaaggc aacgctatgt tctcttgctt ttgtcagcaa gatagccaga  9660
tcaatgtcga tcgtggctgg ctcgaagata cctgcaagaa tgtcattgcg ctgccattct  9720
ccaaattgca gttcgcgctt agctggataa cgccacggaa tgatgtcgtc gtgcacaaca  9780
atggtgactt ctacagcgcg gagaatctcg ctctctccag gggaagccga agtttccaaa  9840
aggtcgttga tcaaagctcg ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacggtcac cgtaaccagc  9900
aaatcaatat cactgtgtgg cttcaggccg ccatccactg cggagccgta caaatgtacg  9960
gccagcaacg tcggttcgag atggcgctcg atgacgccaa ctacctctga tagttgagtc 10020
gatacttcgg cgatcaccgc ttcccccatg atgtttaact ttgttttagg gcgactgccc 10080
tgctgcgtaa catcgttgct gctccataac atcaaacatc gacccacggc gtaacgcgct 10140
tgctgcttgg atgcccgagg catagactgt accccaaaaa aacagtcata acaagccatg 10200
aaaaccgcca ctgcgggggt tccatggaca tacaaatgga cgaacggata aaccttttca 10260
cgccctttta aatatccgat tattctaata aacgctcttt tctcttaggt ttacccgcca 10320
atatatcctg tcaaacactg atagtttaaa ctgaaggcgg gaaacgacaa tcagatctag 10380
taggaaacag ctatgaccat gattacgcca agct                             10414
<210>79
<211>11152
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>双元载体Lo657-pSUN3-GWs-B1-BnAK700::GUS::E9::nosT::g2
<220>
<221>misc_recomb
<222>(4)..(28)
<223>attB1 Gateway重组位点
<220>
<221>启动子
<222>(56)..(724)
<223>p-BnAK启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(749)..(2560)
<223>cds encoding c-GUS(E.coli)
<220>
<221>终止子
<222>(2691)..(3355)
<223>t-E9终止子
<220>
<221>终止子
<222>(3369)..(3621)
<223>t-NOS胭脂氨酸合成酶终止子
<220>
<221>misc_recomb
<222>(3633)..(3657)
<223>attB2 Gateway重组位点
<220>
<221>终止子
<222>(3710)..(3962)
<223>互补序列：t-NOS胭脂氨酸合成酶终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(4038)..(4832)
<223>互补序列：cds encoding c-NptII confers卡那霉素抗性
<220>
<221>启动子
<222>(4864)..(5151)
<223>互补序列：p-NOS启动子from the noplaine synthase gene
<220>
<221>misc_structure
<222>(5202)..(5416)
<223>互补序列：b-LB Left T-DNA border
<220>
<221>misc_structure
<222>(10965)..(11109)
<223>互补序列：b-RB Right T-DNA border
<400>79
atcacaagtt tgtacaaaaa agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga cacgaagctt    60
tcgaggctaa cgttggtgga gatgttaagg cacggcatct tctcttcttc ttcttttttg   120
tttgtttgtt tgtttcgctc tctatcactc actcgatcga tccccagtct tcttttcggg   180
aaagctgtgt cagaccaatt atattccatc tttaatttgg ccctttttat tattcgctat   240
ggcccaacat ttcaggccca atttatacga ttataaatat aaccacttga ttgtgctgcc   300
gctcagctga atagtactcc ctccgttttt taatataaat cgttttacag ttatgcacgt   360
aaattaagaa aaccattaac tttttatatt ttctaaacaa aaacatcatt aattatttac   420
ttactcacaa ttcaaccaat agaaaaatag aagatatatt accattggtc atacaacatt   480
aattattaat aaattttaca tagaaaaccg aaaacgacat ataatttgga acaaaaaaat   540
ttctctaaaa ctacttatat taaaaaacgg agagagtata tttaactagt tcgtcttact   600
gacaaattga agaggcagac caagacacgc ggctcctcga tggctgtctt atgccaagtg   660
gcggtgcctg cttctgcatt aaataggtag aagaactcta attacagaag ctcgaggtag   720
ataggatccc cgggtaggtc agtcccttat gttacgtcct gtagaaaccc caacccgtga   780
aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact gtggaattga   840
tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc caggcagttt   900
taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct ggtatcagcg   960
cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt tcgatgcggt  1020
cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc agggcggcta    1080
tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg tacgtatcac    1140
cgtttgtgtg aacaacgaac tgaactggca gactatcccg ccgggaatgg tgattaccga    1200
cgaaaacggc aagaaaaagc agtcttactt ccatgatttc tttaactatg ccggaatcca    1260
tcgcagcgta atgctctaca ccacgccgaa cacctgggtg gacgatatca ccgtggtgac    1320
gcatgtcgcg caagactgta accacgcgtc tgttgactgg caggtggtgg ccaatggtga    1380
tgtcagcgtt gaactgcgtg atgcggatca acaggtggtt gcaactggac aaggcactag    1440
cgggactttg caagtggtga atccgcacct ctggcaaccg ggtgaaggtt atctctatga    1500
actgtgcgtc acagccaaaa gccagacaga gtgtgatatc tacccgcttc gcgtcggcat    1560
ccggtcagtg gcagtgaagg gcgaacagtt cctgattaac cacaaaccgt tctactttac    1620
tggctttggt cgtcatgaag atgcggactt gcgtggcaaa ggattcgata acgtgctgat    1680
ggtgcacgac cacgcattaa tggactggat tggggccaac tcctaccgta cctcgcatta    1740
cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat ggcatcgtgg tgattgatga    1800
aactgctgct gtcggcttta acctctcttt aggcattggt ttcgaagcgg gcaacaagcc    1860
gaaagaactg tacagcgaag aggcagtcaa cggggaaact cagcaagcgc acttacaggc    1920
gattaaagag ctgatagcgc gtgacaaaaa ccacccaagc gtggtgatgt ggagtattgc    1980
caacgaaccg gatacccgtc cgcaaggtgc acgggaatat ttcgcgccac tggcggaagc    2040
aacgcgtaaa ctcgacccga cgcgtccgat cacctgcgtc aatgtaatgt tctgcgacgc    2100
tcacaccgat accatcagcg atctctttga tgtgctgtgc ctgaaccgtt attacggatg    2160
gtatgtccaa agcggcgatt tggaaacggc agagaaggta ctggaaaaag aacttctggc    2220
ctggcaggag aaactgcatc agccgattat catcaccgaa tacggcgtgg atacgttagc    2280
cgggctgcac tcaatgtaca ccgacatgtg gagtgaagag tatcagtgtg catggctgga    2340
tatgtatcac cgcgtctttg atcgcgtcag cgccgtcgtc ggtgaacagg tatggaattt    2400
cgccgatttt gcgacctcgc aaggcatatt gcgcgttggc ggtaacaaga aagggatctt    2460
cactcgcgac cgcaaaccga agtcggcggc ttttctgctg caaaaacgct ggactggcat    2520
gaacttcggt gaaaaaccgc agcagggagg caaacaatga atcaacaact ctcctggcgc    2580
accatcgtcg gctacagcct cgggaattgc taccgagatc tgcggccgcg gcgcgccaat    2640
tgactagtag gcctatcgat taattaaggc cgcctcgagc atatgctaga ggatcctcta    2700
gctagagctt tcgttcgtat catcggtttc gacaacgttc gtcaagttca atgcatcagt    2760
ttcattgcgc acacaccaga atcctactga gtttgagtat tatggcattg ggaaaactgt    2820
ttttcttgta ccatttgttg tgcttgtaat ttactgtgtt ttttattcgg ttttcgctat    2880
cgaactgtga aatggaaatg gatggagaag agttaatgaa tgatatggtc cttttgttca    2940
ttctcaaatt aatattattt gttttttctc ttatttgttg tgtgttgaat ttgaaattat    3000
aagagatatg caaacatttt gttttgagta aaaatgtgtc aaatcgtggc ctctaatgac    3060
cgaagttaat atgaggagta aaacacttgt agttgtacca ttatgcttat tcactaggca    3120
acaaatatat tttcagacct agaaaagctg caaatgttac tgaatacaag tatgtcctct    3180
tgtgttttag acatttatga actttccttt atgtaatttt ccagaatcct tgtcagattc    3240
taatcattgc tttataatta tagttatact catggatttg tagttgagta tgaaaatatt    3300
ttttaatgca ttttatgact tgccaattga ttgacaacat gcatcaatcg accggctcga    3360
atttccccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg    3420
gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca    3480
tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca    3540
tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg    3600
tgtcatctat gttactagat cgggaattct agacccagct ttcttgtaca aagtggtgat    3660
aattcactgg ccgtcgtttt acaacgactc agagcttgac aggaggcccg atctagtaac    3720
atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc    3780
gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc    3840
atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc    3900
atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga    3960
tcggggatca tccgggtctg tggcgggaac tccacgaaaa tatccgaacg cagcaagatc    4020
tagagcttgg gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc    4080
gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc    4140
tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc    4200
cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag    4260
gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg    4320
aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga    4380
ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg    4440
caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc    4500
tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc    4560
cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg    4620
gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg    4680
gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag    4740
cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga    4800
gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atccagatcc ggtgcagatt    4860
atttggattg agagtgaata tgagactcta attggatacc gaggggaatt tatggaacgt    4920
cagtggagca tttttgacaa gaaatatttg ctagctgata gtgaccttag  gcgacttttg   4980
aacgcgcaat aatggtttct gacgtatgtg cttagctcat taaactccag aaacccgcgg    5040
ctgagtggct ccttcaacgt tgcggttctg tcagttccaa acgtaaaacg gcttgtcccg    5100
cgtcatcggc gggggtcata acgtgactcc cttaattctc cgctcatgat cagattgtcg    5160
tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat cctgcttggt aataattgtc    5220
attagattgt ttttatgcat agatgcactc gaaatcagcc aattttagac aagtatcaaa    5280
cggatgttaa ttcagtacat taaagacgtc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc    5340
aatttgttta caccacaata tatcctgcca ccagccagcc aacagctccc cgaccggcag    5400
ctcggcacaa aatcaccacg cgttaccacc acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg    5460
ttcgccggca ttgccgagtt cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc    5520
gaggccgcca aggcccgagg cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag    5580
atcgcgcacg cccgcgagct gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca    5640
ctgcttggcg tgcatcgctc gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg    5700
cccaccgagg ccaggcggcg cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc    5760
ctggcggccg ccgagaatga acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc    5820
aggacgaacc gtttttcatt accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg    5880
tgttcgagcc gcccgcgcac gtctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt    5940
ctgatgccaa gctggcggcc tggccggcca gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc    6000
gtctaaaaag gtgatgtgta tttgagtaaa acagcttgcg tcatgcggtc gctgcgtata    6060
tgatgcgatg agtaaataaa caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact    6120
taaccagaaa ggcgggtcag gcaagacgac catcgcaacc catctagccc gcgccctgca    6180
actcgccggg gccgatgttc tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg cccgcgattg    6240
ggcggccgtg cgggaagatc aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga    6300
ccgcgacgtg aaggccatcg gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc    6360
ggcggacttg gctgtgtccg cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc    6420
aagcccttac gacatatggg ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc agcgcattga    6480
ggtcacggat ggaaggctac aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg    6540
catcggcggt gaggttgccg aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg    6600
tatcacgcag cgcgtgagct acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc    6660
agaacccgag ggcgacgctg cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa    6720
actcatttga gttaatgagg taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc    6780
ggccgtccga gcgcacgcag cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca    6840
gccatgaagc gggtcaactt tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac    6900
gcggtacgcc aaggcaagac cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca    6960
gagtaaatga gcaaatgaat aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat    7020
ggaaaatcaa gaacaaccag gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg    7080
cggttggcca ggcgtaagcg gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca ctggaacccc    7140
caagcccgag gaatcggcgt gagcggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg    7200
gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc    7260
atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa    7320
gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac    7380
gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc    7440
atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc    7500
cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg catggccagt    7560
gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga    7620
taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta    7680
ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc    7740
attcggttaa acaccacgca cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa gaacggccgc    7800
ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg attagccgct acaagatcgt aaagagcgaa    7860
accgggcggc cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca    7920
gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat cgatcccggc    7980
atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg    8040
ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc    8100
accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg    8160
gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc    8220
gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt    8280
cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc gtacattggg    8340
aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa    8400
gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt    8460
aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag    8520
ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg    8580
cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg    8640
cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcgcc cacatcaagg caccctgcct    8700
cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac    8760
agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt    8820
tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg    8880
cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata    8940
ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct cttccgcttc ctcgctcact   9000
gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta   9060
atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag   9120
caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc   9180
cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta   9240
taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg   9300
ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc   9360
tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac   9420
gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac   9480
ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg   9540
aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga   9600
aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt   9660
agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag   9720
cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct   9780
gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgcatga tatatctccc   9840
aatttgtgta gggcttatta tgcacgctta aaaataataa aagcagactt gacctgatag   9900
tttggctgtg agcaattatg tgcttagtgc atctaacgct tgagttaagc cgcgccgcga   9960
agcggcgtcg gcttgaacga atttctagct agacattatt tgccgactac cttggtgatc  10020
tcgcctttca cgtagtggac aaattcttcc aactgatctg cgcgcgaggc caagcgatct  10080
tcttcttgtc caagataagc ctgtctagct tcaagtatga cgggctgata ctgggccggc  10140
aggcgctcca ttgcccagtc ggcagcgaca tccttcggcg cgattttgcc ggttactgcg  10200
ctgtaccaaa tgcgggacaa cgtaagcact acatttcgct catcgccagc ccagtcgggc  10260
ggcgagttcc atagcgttaa ggtttcattt agcgcctcaa atagatcctg ttcaggaacc  10320
ggatcaaaga gttcctccgc cgctggacct accaaggcaa cgctatgttc tcttgctttt  10380
gtcagcaaga tagccagatc aatgtcgatc gtggctggct cgaagatacc tgcaagaatg  10440
tcattgcgct gccattctcc aaattgcagt tcgcgcttag ctggataacg ccacggaatg  10500
atgtcgtcgt gcacaacaat ggtgacttct acagcgcgga gaatctcgct ctctccaggg  10560
gaagccgaag tttccaaaag gtcgttgatc aaagctcgcc gcgttgtttc atcaagcctt  10620
acggtcaccg taaccagcaa atcaatatca ctgtgtggct tcaggccgcc atccactgcg  10680
gagccgtaca aatgtacggc cagcaacgtc ggttcgagat ggcgctcgat gacgccaact  10740
acctctgata gttgagtcga tacttcggcg atcaccgctt cccccatgat gtttaacttt  10800
gttttagggc gactgccctg ctgcgtaaca tcgttgctgc tccataacat caaacatcga  10860
cccacggcgt aacgcgcttg ctgcttggat gcccgaggca tagactgtac cccaaaaaaa  10920
cagtcataac aagccatgaa aaccgccact gcgggggttc catggacata caaatggacg  10980
aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta ttctaataaa cgctcttttc  11040
tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact gaaggcggga  11100
aacgacaatc agatctagta ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag ct          11152
<210>80
<211>37
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物5
<400>80
cggcctaggg gcgcccggac cgagctgttc accggca                            37
<210>81
<211>24
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物6
<400>81
cggactagtg atgtagccct cagg    24
<210>82
<211>22
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物7
<400>82
cgagctcgtg ccttttggat cg     22
<210>83
<211>18
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物8
<400>83
cggtccgaac gtggttgg         18
<210>84
<211>22
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物9
<400>84
cgagctcggc cctatgaatt gg   22
<210>85
<211>22
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物10
<400>85
cggtccgtct ccttctgcac ac   22
<210>86
<211>23
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物11
<400>86
cgagctcgat gcattccttg gat    23
<210>87
<211>22
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物12
<400>87
cctagggttt ggaggtatca ag     22
<210>88
<211>26
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物13
<400>88
cgagctccgt ccgatgtgat tccgtc 26
<210>89
<211>22
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物14
<400>89
cctaggggca gtgtcggcgg tt     22
<210>90
<211>25
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物15
<400>90
cgagctccag agtgacagac agtga  25
<210>91
<211>22
<212>DNA
<213>寡核苷酸引物16
<400>91
cctaggtctt caactgtccc ca    22
<210>92
<211>1137
<212>DNA
<213>稻
<220>
<221>终止子
<222>(1)..(1137)
<223>BPST.3
<400>92
ggaatgtatt tgaccataca aaaaccgtac aaagtgtagg gttctaatta gcaaatgtaa      60
gtttgtaatt cttctgtcta aatgtagtgt gttgaggtgg tcagttgccg tgactggctc     120
tttcagatgg taattacaaa gaaatgtaac attaatgttg taacaagggt gccattttgt     180
ttctgattcc agatgaaaag gaaaaactat tccatattct gcaggattaa acgtttctgc     240
tgttcacaac aggtaaagtc actccacttc agggaaagac agcaaaatca tttcttttac     300
acagacttta gataaccctt ttttttgggg ttcttggtat atgccaactt ttgtagcctg     360
caccagaaac aaaaatgaag acttttgcta aagatgtaaa agtggcatga tgtcctggat     420
gaccaaataa ttcatgacaa atggattaaa agagcccaat atctgaaaga gactggccag     480
cagccactaa tgtcaccaac cacatatgta acacttggtg cataattcaa gagggagcat     540
ctcctccaga atcaggattg aaaggtacaa cctcatagta aatcctcgga atatagcatg     600
tgcagcataa gaatatatca gtgttgtgct gggtaagaaa ccacatgaac caattaggaa     660
taaataatca tgctgaaatt atagcaatgc ttgcaatttg caaacgataa agctagacgc     720
gggttgctgg aataacaatc catctccaac aaaatagtac agaatataac tgaatggcca     780
gctcagaccc taacagaatt gaaaagctgg attcatcagc actccattga gcaatctaga   840
tcaggaaaga gcatagatgc ataatgaact gagatccctt caaaatgact aactaatatt   900
tttttttctt ataaaagagt ttacaacagt acaaccacga agatcagcac taccattact   960
gattttgtta acatagagtg atttatcatg tgtgccagac aaacaacaga tacattcata  1020
catagcataa cttacagcac atgatacaga ctacggagaa cggttaatct taaaataaaa  1080
acaaaaaaac aaggaggcaa agcttatttt gcctgggatt catctaaatg cagttgt     1137
<210>93
<211>1137
<212>DNA
<213>稻
<220>
<221>终止子
<222>(1)..(1137)
<223>BPST.4
<400>93
acaactgcat ttagatgaat cccaggcaaa ataagctttg cctccttgtt tttttgtttt   60
tattttaaga ttaaccgttc tccgtagtct gtatcatgtg ctgtaagtta tgctatgtat  120
gaatgtatct gttgtttgtc tggcacacat gataaatcac tctatgttaa caaaatcagt  180
aatggtagtg ctgatcttcg tggttgtact gttgtaaact cttttataag aaaaaaaaat  240
attagttagt cattttgaag ggatctcagt tcattatgca tctatgctct ttcctgatct  300
agattgctca atggagtgct gatgaatcca gcttttcaat tctgttaggg tctgagctgg  360
ccattcagtt atattctgta ctattttgtt ggagatggat tgttattcca gcaacccgcg  420
tctagcttta tcgtttgcaa attgcaagca ttgctataat ttcagcatga ttatttattc  480
ctaattggtt catgtggttt cttacccagc acaacactga tatattctta tgctgcacat  540
gctatattcc gaggatttac tatgaggttg tacctttcaa tcctgattct ggaggagatg   600
ctccctcttg aattatgcac caagtgttac atatgtggtt ggtgacatta gtggctgctg   660
gccagtctct ttcagatatt gggctctttt aatccatttg tcatgaatta tttggtcatc   720
caggacatca tgccactttt acatctttag caaaagtctt catttttgtt tctggtgcag   780
gctacaaaag ttggcatata ccaagaaccc caaaaaaaag ggttatctaa agtctgtgta   840
aaagaaatga ttttgctgtc tttccctgaa gtggagtgac tttacctgtt gtgaacagca   900
gaaacgttta atcctgcaga atatggaata gtttttcctt ttcatctgga atcagaaaca   960
aaatggcacc cttgttacaa cattaatgtt acatttcttt gtaattacca tctgaaagag  1020
ccagtcacgg caactgacca cctcaacaca ctacatttag acagaagaat tacaaactta  1080
catttgctaa ttagaaccct acactttgta cggtttttgt atggtcaaat acattcc     1137
<210>94
<211>6849
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>载体pRJB058
<220>
<221>启动子
<222>(204)..(2191)
<223>ZmUbi
<220>
<221>内含子
<222>(1186)..(2191)
<223>i-ZmUbi
<220>
<221>misc_feature
<222>(2224)..(4224)
<223>编码GUS的cds
<220>
<221>内含子
<222>(2609)..(2797)
<223>i-PIV2
<220>
<221>misc_feature
<222>(4284)..(4299)
<223>TOI克隆位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(4304)..(4567)
<223>GFP-片段
<400>94
caggaaacag ctatgaccat gtaatacgac tcactatagg ggatatcagc tggatggcaa   60
ataatgattt tattttgact gatagtgacc tgttcgttgc aacaaattga taagcaatgc  120
tttcttataa tgccaacttt gtacaagaaa gctgggtcgg cgcgccaagc ttgcatgcct  180
gcaggcatgc aagcttccgc ggctgcagtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga  240
gataatgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact  300
tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat  360
ataatctata gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag  420
acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta  480
gtgtgcatgt gttctccttt ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat  540
tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag  600
tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt  660
tttttattta atagtttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa  720
atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg  780
ccagcctgtt aaacgccgtc gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc  840
gcgtcgggcc aagcgaagca gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc     900
gagagttccg ctccaccgtt ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg     960
agcggcagac gtgagccggc acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg caccggcagc    1020
tacgggggat tcctttccca ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat    1080
agacaccccc tccacaccct ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac    1140
aaccagatct cccccaaatc cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc    1200
tccccccccc cccccctctc taccttctct agatcggcgt tccggtccat ggttagggcc    1260
cggtagttct acttctgttc atgtttgtgt tagatccgtg tttgtgttag atccgtgctg    1320
ctagcgttcg tacacggatg cgacctgtac gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca    1380
gtgtttctct ttggggaatc ctgggatggc tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc    1440
atgatttttt ttgtttcgtt gcatagggtt tggtttgccc ttttccttta tttcaatata    1500
tgccgtgcac ttgtttgtcg ggtcatcttt tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga    1560
tgtggtctgg ttgggcggtc gttctagatc ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt    1620
ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg tgccatacat attcatagtt acgaattgaa    1680
gatgatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat    1740
gcatatacag agatgctttt tgttcgcttg gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc    1800
gttcattcgt tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat    1860
tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa    1920
tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg    1980
catatgcagc atctattcat atgctctaac cttgagtacc tatctattat aataaacaag    2040
tatgttttat aattatttcg atcttgatat acttggatga tggcatatgc agcagctata    2100
tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg ctatttattt gcttggtact gtttcttttg    2160
tcgatgctca ccctgttgtt tggtgttact tctgcagggt acccccgggt aggtcagtcc    2220
cttatgttac gtcctgtaga aaccccaacc cgtgaaatca aaaaactcga cggcctgtgg    2280
gcattcagtc tggatcgcga aaactgtgga attggtcagc gttggtggga aagcgcgtta    2340
caagaaagcc gggcaattgc tgtgccaggc agttttaacg atcagttcgc cgatgcagat    2400
attcgtaatt atgcgggcaa cgtctggtat cagcgcgaag tctttatacc gaaaggttgg    2460
gcaggccagc gtatcgtgct gcgtttcgat gcggtcactc attacggcaa agtgtgggtc    2520
aataatcagg aagtgatgga gcatcagggc ggctatacgc catttgaagc cgatgtcacg    2580
ccgtatgtta ttgccgggaa aagtgtacgt aagtttctgc ttctaccttt gatatatata    2640
taataattat cattaattag tagtaatata atatttcaaa tatttttttc aaaataaaag    2700
aatgtagtat atagcaattg cttttctgta gtttataagt gtgtatattt taatttataa    2760
cttttctaat atatgaccaa aatttgttga tgtgcaggta tcaccgtttg tgtgaacaac    2820
gaactgaact ggcagactat cccgccggga atggtgatta ccgacgaaaa cggcaagaaa    2880
aagcagtctt acttccatga tttctttaac tatgccggaa tccatcgcag cgtaatgctc    2940
tacaccacgc cgaacacctg ggtggacgat atcaccgtgg tgacgcatgt cgcgcaagac    3000
tgtaaccacg cgtctgttga ctggcaggtg gtggccaatg gtgatgtcag cgttgaactg    3060
cgtgatgcgg atcaacaggt ggttgcaact ggacaaggca ctagcgggac tttgcaagtg    3120
gtgaatccgc acctctggca accgggtgaa ggttatctct atgaactgtg cgtcacagcc    3180
aaaagccaga cagagtgtga tatctacccg cttcgcgtcg gcatccggtc agtggcagtg    3240
aagggcgaac agttcctgat taaccacaaa ccgttctact ttactggctt tggtcgtcat    3300
gaagatgcgg acttgcgtgg caaaggattc gataacgtgc tgatggtgca cgaccacgca    3360
ttaatggact ggattggggc caactcctac cgtacctcgc attaccctta cgctgaagag    3420
atgctcgact gggcagatga acatggcatc gtggtgattg atgaaactgc tgctgtcggc    3480
tttaacctct ctttaggcat tggtttcgaa gcgggcaaca agccgaaaga actgtacagc    3540
gaagaggcag tcaacgggga aactcagcaa gcgcacttac aggcgattaa agagctgata    3600
gcgcgtgaca aaaaccaccc aagcgtggtg atgtggagta ttgccaacga accggatacc    3660
cgtccgcaag gtgcacggga atatttcgcg ccactggcgg aagcaacgcg taaactcgac    3720
ccgacgcgtc cgatcacctg cgtcaatgta atgttctgcg acgctcacac cgataccatc    3780
agcgatctct ttgatgtgct gtgcctgaac cgttattacg gatggtatgt ccaaagcggc    3840
gatttggaaa cggcagagaa ggtactggaa aaagaacttc tggcctggca ggagaaactg    3900
catcagccga ttatcatcac cgaatacggc gtggatacgt tagccgggct gcactcaatg    3960
tacaccgaca tgtggagtga agagtatcag tgtgcatggc tggatatgta tcaccgcgtc    4020
tttgatcgcg tcagcgccgt cgtcggtgaa caggtatgga atttcgccga ttttgcgacc    4080
tcgcaaggca tattgcgcgt tggcggtaac aagaaaggga tcttcactcg cgaccgcaaa    4140
ccgaagtcgg cggcttttct gctgcaaaaa cgctggactg gcatgaactt cggtgaaaaa    4200
ccgcagcagg gaggcaaaca atgaatcaac aactctcctg gcgcaccatc gtcggctaca    4260
gcctcgggaa ttgctaccga gctccctagg gggcgcccgg accgagctgt tcaccggcat    4320
cgtgcccatc ctgatcgagc tgaatggcga tgtgaatggc cacaagttca gcgtgagcgg    4380
cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg    4440
caagctgcct gtgccctggc ccaccctggt gaccaccctg agctacggcg tgcagtgctt    4500
ctcacgctac cccgatcaca tgaagcagca cgacttcttc aagagcgcca tgcctgaggg    4560
ctacatcact agttaagact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaacatccat    4620
gctagcgtta acgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc    4680
ggaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac    4740
aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgt gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg    4800
acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaac taagcagaag gccatcctga cggatggcct    4860
ttttgcgttt ctacaaactc ttcctggcta gcggtacgcg tattaattgc gttgcgctca    4920
ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc    4980
gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg    5040
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta    5100
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc    5160
aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag    5220
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac    5280
caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc    5340
ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt    5400
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc    5460
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga    5520
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta    5580
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta    5640
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga    5700
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg    5760
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag    5820
tggaacgacg cgtaactcac gttaagggat tttggtcatg agcttgcgcc gtcccgtcaa    5880
gtcagcgtaa tgctctgcca gtgttacaac caattaacca attctgatta gaaaaactca    5940
tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga    6000
aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga    6060
tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc    6120
tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag  6180
aatggcaaaa gtttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg  6240
tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga  6300
cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc  6360
aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc  6420
tggaatgctg tttttccggg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg  6480
ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag tctgaccatc  6540
tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca  6600
tcgggcttcc catacaagcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc  6660
catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct cgacgtttcc  6720
cgttgaatat ggctcataac accccttgta ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt  6780
gttcatgatg atatattttt atcttgtgca atgtaacatc agagattttg agacacgggc  6840
cagagctgc                                                          6849
<210>95
<211>257
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>插入pRJB058的SacI-RsrII片段的Nos-T序列
<220>
<221>终止子
<222>(3)..(254)
<223>插入pJB058的SacI-RsrII位点的Nos终止子
<400>95
cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc    60
gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg  120
catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata  180
cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc  240
tatgttacta gatccgg                                                 257
<210>96
<211>1089
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>插入SacI消化的并且T4 DNA聚合酶补平的pRJB058片段的ROF序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(1088)
<223>克隆到pRJB058的补平的SacI位点的内部ORF序列
<400>96
cgaacaacaa aaaaaccatc ccgaacaacc tggttgaaaa ctacctgacc ccgatgtctc   60
tggcatactg gttcatggat gatggtggta aatgggatta caacaaaaac tctaccaaca  120
aatcgatcgt actgaacacc cagtctttca ctttcgaaga agtagaatac ctggttaagg  180
gtctgcgtaa caaattccaa ctgaactgtt acgtaaaaat caacaaaaac aaaccgatca  240
tctacatcga ttctatgtct tacctgatct tctacaacct gatcaaaccg tacctgatcc  300
cgcagatgat gtacaaactg ccgaacacta tctcctccga aactttcctg aaaggtacca  360
aaggtgggat acgaaaagac cgaagaggag ggagaatgtt gaaacacaag cgccagagag  420
atgatgggga gggcaggggt gaagtggggt ctgctggaga catgagagct gccaaccttt  480
ggccaagccc gctcatgatc aaacgctcta agaagaacag cctggccttg tccctgacgg  540
ccgaccagat ggtcagtgcc ttgttggatg ctgagccccc catacctcta ttccgagtat  600
gatcctacca gacccttcag tgaagcttcg atgatgggct tactgaccaa cctggcagac   660
agggagctgg ttcacatgat caactgggcg aagagggtgc caggctttgt ggatttgacc   720
ctccatgatc aggtccacct tctagaatgt gcctggctag agatcctgat gattggtctc   780
gtctggcgct ccatggaaca cccggggaag ctcctgtttg ctcctaactt gctcctggac   840
aggaatcaag gtaaatgtgt ggaaggcatg gtggagatct tcgacatgct gctggctaca   900
tcatctcggt tccgcatgat gaatctgcag ggagaggagt ttgtgtgcct caaatctatt   960
attttgctta attctggagt gtacacattt ctgtccagca ccctgaagtc tctggaagag  1020
aaggaccata tccaccgagt cctggacaag atcacagaca ctttgatcca cctgatggcc  1080
aaggcaggc                                                          1089
<210>97
<211>1414
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>插入SacI消化的并且T4 DNA聚合酶补平的pRJB058的片段的稻BPST.1序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<223>EcoRI/SacI MCS
<220>
<221>终止子
<222>(19)..(1402)
<223>插入pRJB058的SacI位点的BPST.1序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1403)..(1414)
<223>RsrII/EcoRI MCS
<400>97
aattcgccct tcggaccgtg ccttttggat cgaaagatgc agttgttttg ctgctgaagg      60
catcctcatg tctgttactt tgatatggtc ttgaaataaa tcttcgttta caagagaaca     120
acactctgtt ttatcttgtt ttgtgtgcca gaagcctgct gaacaatttt atgtcaattt     180
ctttgctact aagaaagtta tgcaccaaaa tgaagggaaa ttctgtgaag tttgtaattt     240
tcaagtgatt ggcattattc tgtttagttc gtgcagtgcc atgttcctta tataatcaca     300
gaacatgtaa aaggccgaaa tattttcctt gtcattttcc atgcgagaac ggcctttcga     360
tgagactgga aagtcctgca ataactattg tccaaaataa cacacggctc tctaccgatt     420
cacatcaaaa ccaacccaaa cgctctctct gttgcttgtg ttctggactt ctctgagcgc     480
agttcaggag tctcgagtgt gcctcaacag tacatgttaa acataaaact gccattgaag     540
attaccacca accatattgg aagtttatca tggcatatac ttgcctttca aagaccctaa     600
ttttcaaagt gaacatggga ctttcagact acagataacc tcaatcgata acatcaccga     660
aaattcgata ttactacaaa gattttggtt gaaaacttct ctgaacccaa tttaaataca     720
agtcgccctc ggtgatggct actcgccatt ccacgctcac agttgcagtt cacacttgca     780
aaatgaaaaa aaaaatcttc tgaacagcaa tcatcaaccg gttcgacctc aggatcatca     840
cagaaatgaa aaggacgagg aatctcaatt taagaaagtt cctatccaaa tatccaacaa     900
aaatctgact gtctggctat tattaattca acaggagatg ctcgttaaag acaatatagt     960
tctgtaattt gtaacaacac aagagcctga ggatataacg agttacaaac atgctgccgt    1020
tgcagcatgg tcatcaatat acaacattac aacaacatat ggggatcgca gaacactccc    1080
attccacgat tttacaacat atgcttcaca acacgttata aatacatggt tgtaccgagc    1140
tgtagagaga cagccagcac gtcccaacta caaatgcaca ctagccaaca gcaaacataa    1200
aaactactct ctggtaagtc actatatata cgcactatag cttcacatga ctaaaattat    1260
aacatgacat aatttctttc gtataaatta gccccaggaa gcttctgtcc gaatcgccat    1320
cttgggagca ataaatatac tggcattctt cacaatggat gcattattta catatatata  1380
cttcttctcc aaccacgttc gagctcgaag ggcg                              1414
<210>98
<211>1414
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>插入SacI消化的并且T4 DNA聚合酶补平的pRJB058的片段的稻BPST.2序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(14)
<223>EcoRI/SacI MCS
<220>
<221>终止子
<222>(15)..(1398)
<223>插入pRJB058的补平的SacI位点的BPST.2序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1399)..(1414)
<223>RsrII/EcoRI MCS
<400>98
cgcccttcga gctcgaacgt ggttggagaa gaagtatata tatgtaaata atgcatccat     60
tgtgaagaat gccagtatat ttattgctcc caagatggcg attcggacag aagcttcctg    120
gggctaattt atacgaaaga aattatgtca tgttataatt ttagtcatgt gaagctatag    180
tgcgtatata tagtgactta ccagagagta gtttttatgt ttgctgttgg ctagtgtgca    240
tttgtagttg ggacgtgctg gctgtctctc tacagctcgg tacaaccatg tatttataac    300
gtgttgtgaa gcatatgttg taaaatcgtg gaatgggagt gttctgcgat ccccatatgt    360
tgttgtaatg ttgtatattg atgaccatgc tgcaacggca gcatgtttgt aactcgttat    420
atcctcaggc tcttgtgttg ttacaaatta cagaactata ttgtctttaa cgagcatctc   480
ctgttgaatt aataatagcc agacagtcag atttttgttg gatatttgga taggaacttt   540
cttaaattga gattcctcgt ccttttcatt tctgtgatga tcctgaggtc gaaccggttg   600
atgattgctg ttcagaagat tttttttttc attttgcaag tgtgaactgc aactgtgagc   660
gtggaatggc gagtagccat caccgagggc gacttgtatt taaattgggt tcagagaagt   720
tttcaaccaa aatctttgta gtaatatcga attttcggtg atgttatcga ttgaggttat   780
ctgtagtctg aaagtcccat gttcactttg aaaattaggg tctttgaaag gcaagtatat   840
gccatgataa acttccaata tggttggtgg taatcttcaa tggcagtttt atgtttaaca   900
tgtactgttg aggcacactc gagactcctg aactgcgctc agagaagtcc agaacacaag   960
caacagagag agcgtttggg ttggttttga tgtgaatcgg tagagagccg tgtgttattt  1020
tggacaatag ttattgcagg actttccagt ctcatcgaaa ggccgttctc gcatggaaaa  1080
tgacaaggaa aatatttcgg ccttttacat gttctgtgat tatataagga acatggcact  1140
gcacgaacta aacagaataa tgccaatcac ttgaaaatta caaacttcac agaatttccc  1200
ttcattttgg tgcataactt tcttagtagc aaagaaattg acataaaatt gttcagcagg  1260
cttctggcac acaaaacaag ataaaacaga gtgttgttct cttgtaaacg aagatttatt  1320
tcaagaccat atcaaagtaa cagacatgag gatgccttca gcagcaaaac aactgcatct  1380
ttcgatccaa aaggcacggt ccgaagggcg aatt                              1414
<210>99
<211>1165
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>插入SacI消化的并且T4 DNA聚合酶补平的pRJB058的片段的稻BPST.3序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(13)
<223>EcoRI/SacI MCS
<220>
<221>终止子
<222>(14)..(1150)
<223>插入pRJB058的补平的SacI位点的BPST.3序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1151)..(1165)
<223>RsrII/EcoRI MCS
<400>99
ggccctatga attggaatgt atttgaccat acaaaaaccg tacaaagtgt agggttctaa     60
ttagcaaatg taagtttgta attcttctgt ctaaatgtag tgtgttgagg tggtcagttg    120
ccgtgactgg ctctttcaga tggtaattac aaagaaatgt aacattaatg ttgtaacaag    180
ggtgccattt tgtttctgat tccagatgaa aaggaaaaac tattccatat tctgcaggat    240
taaacgtttc tgctgttcac aacaggtaaa gtcactccac ttcagggaaa gacagcaaaa    300
tcatttcttt tacacagact ttagataacc cttttttttg gggttcttgg tatatgccaa    360
cttttgtagc ctgcaccaga aacaaaaatg aagacttttg ctaaagatgt aaaagtggca    420
tgatgtcctg gatgaccaaa taattcatga caaatggatt aaaagagccc aatatctgaa    480
agagactggc cagcagccac taatgtcacc aaccacatat gtaacacttg gtgcataatt    540
caagagggag catctcctcc agaatcagga ttgaaaggta caacctcata gtaaatcctc    600
ggaatatagc atgtgcagca taagaatata tcagtgttgt gctgggtaag aaaccacatg    660
aaccaattag gaataaataa tcatgctgaa attatagcaa tgcttgcaat ttgcaaacga    720
taaagctaga cgcgggttgc tggaataaca atccatctcc aacaaaatag tacagaatat    780
aactgaatgg ccagctcaga ccctaacaga attgaaaagc tggattcatc agcactccat    840
tgagcaatct agatcaggaa agagcataga tgcataatga actgagatcc cttcaaaatg   900
actaactaat attttttttt cttataaaag agtttacaac agtacaacca cgaagatcag   960
cactaccatt actgattttg ttaacataga gtgatttatc atgtgtgcca gacaaacaac  1020
agatacattc atacatagca taacttacag cacatgatac agactacgga gaacggttaa  1080
tcttaaaata aaaacaaaaa aacaaggagg caaagcttat tttgcctggg attcatctaa  1140
atgcagttgt gtgcagaagg agacg                                        1165
<210>100
<211>1165
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>插入SacI消化的并且T4 DNA聚合酶补平的pRJB058的片段稻BPST.4序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(15)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(15)
<223>EcoRI/SacI
<220>
<221>终止子
<222>(16)..(1152)
<223>插入pRJB058的SacI位点的BPST.4序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1153)..(1165)
<223>AvrII/EcoRI
<400>100
cgtctccttc tgcacacaac tgcatttaga tgaatcccag gcaaaataag ctttgcctcc    60
ttgttttttt gtttttattt taagattaac cgttctccgt agtctgtatc atgtgctgta   120
agttatgcta tgtatgaatg tatctgttgt ttgtctggca cacatgataa atcactctat   180
gttaacaaaa tcagtaatgg tagtgctgat cttcgtggtt gtactgttgt aaactctttt   240
ataagaaaaa aaaatattag ttagtcattt tgaagggatc tcagttcatt atgcatctat   300
gctctttcct gatctagatt gctcaatgga gtgctgatga atccagcttt tcaattctgt   360
tagggtctga gctggccatt cagttatatt ctgtactatt ttgttggaga tggattgtta   420
ttccagcaac ccgcgtctag ctttatcgtt tgcaaattgc aagcattgct ataatttcag   480
catgattatt tattcctaat tggttcatgt ggtttcttac ccagcacaac actgatatat   540
tcttatgctg cacatgctat attccgagga tttactatga ggttgtacct ttcaatcctg   600
attctggagg agatgctccc tcttgaatta tgcaccaagt gttacatatg tggttggtga   660
cattagtggc tgctggccag tctctttcag atattgggct cttttaatcc atttgtcatg   720
aattatttgg tcatccagga catcatgcca cttttacatc tttagcaaaa gtcttcattt   780
ttgtttctgg tgcaggctac aaaagttggc atataccaag aaccccaaaa aaaagggtta   840
tctaaagtct gtgtaaaaga aatgattttg ctgtctttcc ctgaagtgga gtgactttac   900
ctgttgtgaa cagcagaaac gtttaatcct gcagaatatg gaatagtttt tccttttcat   960
ctggaatcag aaacaaaatg gcacccttgt tacaacatta atgttacatt tctttgtaat  1020
taccatctga aagagccagt cacggcaact gaccacctca acacactaca tttagacaga  1080
agaattacaa acttacattt gctaattaga accctacact ttgtacggtt tttgtatggt  1140
caaatacatt ccaattcata gggcc                                        1165
<210>101
<211>1305
<212>DNA
<213>人工的
<22g0>
<223>来自稻的具有5’和3’-多个克隆位点接头的终止子序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<223>EcoRI/SacI MCS
<220>
<221>终止子
<222>(19)..(1292)
<223>BPST.5
<220>
<221>misc_feature
<222>(1294)..(1305)
<223>AvrII/EcoRI MCS
<400>101
aattcgccct tcgagctcga tgcattcctt ggattgttcc caatgtattc cagaaatcat   60
agttttgatg ccaaagttgg tcttcggtat ttgttacttg gagatggcaa atcgacttga  120
gcaatgttaa agttttgggc atttaaatta tagacctttg cttggcacgg ttagcttgtt  180
tcaaatccgt tgtttgttgt ggaatgtgtt tcacatatgt ggtaggtgaa gaatctcatt  240
atggttcgct gtttcattct cttgcgttta tcacccgctg tctgctaact tagggtgtgt  300
ttagtcctcg tcaaaattgg aagtttggtt gaaattggaa caatgtgacg aaaaagttga  360
aatttttttt gtgggtagga aagttttgat gtgatagaaa agttggaagt ttaaaaaaaa  420
agtttagaac taaactcggc cctagtcaat ttacccttac tattaggcat tatccccgct  480
gtctgctaac ctagtcaatt tacccttgta ttattactag gcattatcct tgcctccgtt  540
agtggtttgt tcttgagagc ggccaggtag gaaaattcca cttgaagagg agtgcgttac  600
gccggcctct tgccattatc atcgtttgta ttgatatgca gaaatagaaa gaaaaaccta  660
ggattttgat gaaaataaat cggatataga tatcataaaa cacattggaa cttgagatgg  720
agagaactct agatattttc catgagattg ttacctaatt cctactttcc tacaaaatct   780
tatgaaactg ccattcgaaa ggaatatcgt aggattctcg agtcccaatc cgttccagaa   840
aggtaaatcg gaacaatggt acgaaaaatc tgtccccatt ggatcataag acttggacgg   900
tctatcccat ggtactaagg gttttggaaa gaattttgca gaatttgaat ggatgtatcc   960
tatacacaag ttttctgtgt acacatcgta cacatcaact aacaattttt accaaaaatc  1020
taggaacaaa ttcacatgtt ctatcatgag ttatcacaca ttcacacgtt catatcttgg  1080
ttaaatctga acagcaggct gtaaataaac cacaaaagtc tccaaattat gggcctcaac  1140
agtaatcaat atcgtttcct cagacggcaa ttgccagttt gccacaacag ccatgttggc  1200
taacatttga tacattcgga gtactgcttg aatttgcagg ctctccctaa ccttattatc  1260
cctatagtct ttgactcttg atacctccaa accctaggaa gggcg                  1305
<210>102
<211>1350
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自稻的具有5’和3’-多个克隆位点接头的终止子序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<223>EcoRI/SacI MCS
<220>
<221>终止子
<222>(19)..(1332)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1333)..(1350)
<223>AvrII/EcoRI MCS
<400>102
gaattcgccc ttcgagctcc gtccgatgtg attccgtcct cttgattgtt ttccttcccc      60
ctaatttttg ttgcatacgc ggagagaagc tttagcttta agaggttaac tggcggcacc     120
tcaatttctt tgggcttcag catgggttaa gaccacctaa taatcctgtc gcattcttgc     180
tcttggaaaa gtttcttcca acattgcagt ccagtcagag aatggcctgt aataattagt     240
gacaaaatta tagcagtaga tagaatctgt tcattcaagt tcttcaaatt actgggccaa     300
gcttcaatgt cattttttgc ttaactcgtg ctcgtgctgt tatagtttac aactatcttc     360
tttacctgcc cataaccaat gtgaccatcg aatcaaacgt atgtggcggt gaatcccgtt     420
gcttgtgcgt tgctagattt ttgaggtcgc cttctgttcc aaattccaat catttgaatt     480
cgaagggatt acctgtcgac tgcgcatacg atcttttatt gagaatattt gctaggtgtg     540
ggagttcctg cgtgtgttcg tttagtggac gtgcgtatgt gagcatgtgc tatatgttgt     600
gcttcgtgaa aactcagctt cttttcatca agatcggcac ctctgcttat cacctaatcc     660
catcattcca atagcaacat aacatagatg tgacacatcc tatacatgat attgggatgg     720
agagagtatt cctaagatgc atctctaccc tttctcttcg aatgcacatt tattgggagt     780
catttttaat gtgcatttgt gcaaactggt accatggaac cctagtgcta ccctaacaga     840
tatgctccat cgtcactaca aactcttgtt tacatccaca aactactgct tggaagggca     900
cgctgacatt tgatcagaag aaagaatgac atgggtgcca aagttatgga tcagtgtggt     960
gaaattcgag aataaccgac aagatacttc tcaatcttgt cacaataaga gggttatttt    1020
tgtttagtac agtacaacta acgataccgc acaaaaaacg gtgaacgcga tatcgcacaa    1080
aaaaaagagc aacacgtttg aattatattc aggtttgcta ctgcaatcca acaccatctc    1140
ataactacat tatcctaatc gagccttttt aagtaatgag gccagtacaa ttaaaaaagg    1200
tgccgtagac aatagcaaac ccatgaagaa ctgaaaacaa atgaatgcaa aactaaaatt    1260
gtcttagttc tgtcgacaaa tgccaactgc tataatcgta catgcgtctc cgaagaaacc    1320
gccgacactg cccctaggaa gggcgaattc    1350
<210>103
<211>1532
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自稻的具有5’和3’-多个克隆位点接头的终止子序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(19)
<223>EcoRI/SacI MCS
<220>
<221>终止子
<222>(20)..(1518)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1519)..(1532)
<223>EcoRI位点
<400>103
gaattcgccc ttcgagctcc agagtgatag acagtgctac ttgctagcct tttttatgag     60
cacccttttt ggccttttag ttcctcatta gctaagagat gtgatgagtg aggttttatt    120
ttttggcttt gtttggagtt ttgctttgga ggaagataga gaagccttta gaatgagttg    180
tgatggagga tcacatagtt tgtctcaggt ttacaatgtg cggtaaaaaa aaggaaggaa    240
ataaagtgat gttagaatat acagtttttt aatccatttc tacagcttca aattctcgat    300
tgagcggcac gttctttgaa atgttcatag caaagcaaat caaacgaaat ggatgagatt    360
tgaaactaag aaactgcact tgacaaagca cgctgcgctc tctgaaattc atgttcagca    420
gaacgccttt cagaaattca tgttctgctg ctgcaggaag gcagctaaga actccatgca    480
ataaaaatat aaaatgcagt gcagttatta gttagtgtag tagtaatcta agaaacaaca   540
ggtttaacag aatattacct tcaaaaacat cccctcaaat caagactcgg aaatcaacac   600
cattctgaaa ctagatgcaa tactgcgctc ctaatggaat cttcagtggt tactcctaca   660
cgccactaaa aaaaacgggc tttggaaaaa cgtcaccctg aaaacaagag ctcagtaaaa   720
ataccactct aaaatcttgc agcatgcatt atcacaaaag cagatcaatc cgtaattgta   780
tttatgctgc atataccgtg atattttctg tgatcctctg cactatcttc agctcatcag   840
ctgcatattt tgaagccgga ctgatggctc atcgctttgt ttcggcttat tgtgatagcc   900
atccatgcgt tgacgaaaga tttagatata tcacaatttt aaccaagttc agagcaatgt   960
tagctttagc tgatgatata cacggcgcac tgattgccgc cgttattttc agagccttgt  1020
aaaacctgaa acaaattgtg tctccaaatt cttactagta ctgcagacat agcggatttg  1080
ttttcaggat gaattatcac aaaggtaagt caattcatag ccatattacg caagttcaaa  1140
actgcaggcc acaccatacg tttctgaaag tagaaacaag agatcttgca gcagatcacc  1200
actaaagaag cagtaaccgc aaaaaattat aacataatcc agaattaaca cttcgcagca  1260
ttactgaatt cactttaata gcacttctca tcatgaacta gtacaacaac ataactgtcc  1320
agtggaaatg tgaaatgcat acaccaagta atggtccata acatgaacta tatggataca  1380
acaacgttct tatttcgctc atatatacat gaaataagtc ttgcacgtct tggttactta  1440
ataggtgcga taatcgccgt aggcttttag aagaagaaaa aaaagtgagc ctgcaaagtt  1500
cctggggaca gttgaagacc aagggcgaat tc                                1532
<210>104
<211>1532
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自稻的具有5’和3’-多个克隆位点接头的终止子序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(15)
<223>EcoRI位点
<220>
<221>终止子
<222>(16)..(1514)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1515)..(1532)
<223>EcoRI/SacI MCS
<400>104
cgaattcgcc cttggtcttc aactgtcccc aggaactttg caggctcact tttttttctt     60
cttctaaaag cctacggcga ttatcgcacc tattaagtaa ccaagacgtg caagacttat    120
ttcatgtata tatgagcgaa ataagaacgt tgttgtatcc atatagttca tgttatggac    180
cattacttgg tgtatgcatt tcacatttcc actggacagt tatgttgttg tactagttca    240
tgatgagaag tgctattaaa gtgaattcag taatgctgcg aagtgttaat tctggattat    300
gttataattt tttgcggtta ctgcttcttt agtggtgatc tgctgcaaga tctcttgttt    360
ctactttcag aaacgtatgg tgtggcctgc agttttgaac ttgcgtaata tggctatgaa    420
ttgacttacc tttgtgataa ttcatcctga aaacaaatcc gctatgtctg cagtactagt    480
aagaatttgg agacacaatt tgtttcaggt tttacaaggc tctgaaaata acggcggcaa    540
tcagtgcgcc gtgtatatca tcagctaaag ctaacattgc tctgaacttg gttaaaattg    600
tgatatatct aaatctttcg tcaacgcatg gatggctatc acaataagcc gaaacaaagc    660
gatgagccat cagtccggct tcaaaatatg cagctgatga gctgaagata gtgcagagga    720
tcacagaaaa tatcacggta tatgcagcat aaatacaatt acggattgat ctgcttttgt    780
gataatgcat gctgcaagat tttagagtgg tatttttact gagctcttgt tttcagggtg    840
acgtttttcc aaagcccgtt ttttttagtg gcgtgtagga gtaaccactg aagattccat   900
taggagcgca gtattgcatc tagtttcaga atggtgttga tttccgagtc ttgatttgag   960
gggatgtttt tgaaggtaat attctgttaa acctgttgtt tcttagatta ctactacact  1020
aactaataac tgcactgcat tttatatttt tattgcatgg agttcttagc tgccttcctg  1080
cagcagcaga acatgaattt ctgaaaggcg ttctgctgaa catgaatttc agagagcgca  1140
gcgtgctttg tcaagtgcag tttcttagtt tcaaatctca tccatttcgt ttgatttgct  1200
ttgctatgaa catttcaaag aacgtgccgc tcaatcgaga atttgaagct gtagaaatgg  1260
attaaaaaac tgtatattct aacatcactt tatttccttc ctttttttta ccgcacattg  1320
taaacctgag acaaactatg tgatcctcca tcacaactca ttctaaaggc ttctctatct  1380
tcctccaaag caaaactcca aacaaagcca aaaaataaaa cctcactcat cacatctctt  1440
agctaatgag gaactaaaag gccaaaaagg gtgctcataa aaaaggctag caagtagcac  1500
tgtctatcac tctggagctc gaagggcgaa tt                                1532
<210>105
<211>16914
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自pRJB058的双元载体
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>LB的互补序列
<220>
<221>启动子
<222>(187)..(986)
<223>ZmAHAS
<220>
<221>misc_feature
<222>(987)..(2903)
<223>编码ZmAHAS的cds
<220>
<221>终止子
<222>(2902)..(4112)
<223>ZmAHAS的互补序列
<220>
<221>启动子
<222>(4177)..(6164)
<223>ZmUbi
<220>
<221>内含子
<222>(5159)..(6164)
<223>ZmUbi
<220>
<221>misc_feature
<222>(6209)..(6886)
<223>编码DsRed2的cds
<220>
<221>终止子
<222>(6918)..(7170)
<223>NOS
<220>
<221>misc_feature
<222>(7614)..(7877)
<223>GFP片段的互补序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(7879)..(7901)
<223>TOI克隆位点的互补序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(7957)..(9957)
<223>互补序列：编码GUS的cds
<220>
<221>内含子
<222>(9384)..(9572)
<223>PIV2的互补序列
<220>
<221>内含子
<222>(9990)..(10995)
<223>ZmUbi的互补序列
<220>
<221>启动子
<222>(9990)..(11977)
<223>ZmUbi的互补序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(12147)..(12170)
<223>RB的互补序列
<400>105
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt     60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt    120
actgaattgg atccgcccgg gcggtacccg gggatcctct agaactagtg gatcccccgg    180
gctgcaggtc aacggatcac ctatcaacat cccagctaaa aacagtaaaa agggggaaaa    240
cgtgggtgag ttgagtctgt cttgtggaaa aaacgtttta gtttctcctg gaattaacaa    300
taaaaacagt tgaacaagat tgactgttcc tccgggaggg tttggaacat cgttacagat    360
gtgagcgaaa ggtgaggaaa cagagcggag ggcttggagg tgacctcggt agtcgacgcc    420
ggagttgagc ttgatgacga caccgtactg gcgtaccagg cctagtagtg aacaccgggc    480
ctgaagctgt cgccgccgct gctcatcttg tgggctgtgc ccggtgtccc tgttgcggat    540
tgcgggtggc agcctggcag gtgggtgcga cccgtttgga ctccctgatc tgggcccttt    600
gtgtcagtac cgtctgtact ccgatgacat gcacaccgtc gtccacagtc aagtccacaa    660
tctcccctct ttttttaacg gaatagttca aaatctcctt gacgcacgct atcgtgtacc     720
agcgctcact ggacaccacg tttgtaatcc acgccgacac gtcggtccca cgtcgacagg     780
ccccaccgtc cggtctgtag cgtgtacgta ttcgggcgac ggacgtgtcg tcgtcgtctt     840
gcgagtccca ttcccatcac catctgagcc acacatcctc tgaacaaaag cagggaggcc     900
tctacgcaca tccccctttc tcccactccg tgtccgtggc acccacccca aaccctcgcg     960
ccgcctccga gacagccgcc gcaaccatgg ccaccgccgc cgccgcgtct accgcgctca    1020
ctggcgccac taccgctgcg cccaaggcga ggcgccgggc gcacctcctg gccacccgcc    1080
gcgccctcgc cgcgcccatc aggtgctcag cggcgtcacc cgccatgccg atggctcccc    1140
cggccacccc gctccggccg tggggcccca ccgatccccg caagggcgcc gacatcctcg    1200
tcgagtccct cgagcgctgc ggcgtccgcg acgtcttcgc ctaccccggc ggcgcgtcca    1260
tggagatcca ccaggcactc acccgctccc ccgtcatcgc caaccacctc ttccgccacg    1320
agcaagggga ggcctttgcg gcctccggct acgcgcgctc ctcgggccgc gtcggcgtct    1380
gcatcgccac ctccggcccc ggcgccacca accttgtctc cgcgctcgcc gacgcgctgc    1440
tcgattccgt ccccatggtc gccatcacgg gacaggtgcc gcgacgcatg attggcaccg    1500
acgccttcca ggagacgccc atcgtcgagg tcacccgctc catcaccaag cacaactacc    1560
tggtcctcga cgtcgacgac atcccccgcg tcgtgcagga ggctttcttc ctcgcctcct    1620
ctggtcgacc ggggccggtg cttgtcgaca tccccaagga catccagcag cagatggcgg    1680
tgcctgtctg ggacaagccc atgagtctgc ctgggtacat tgcgcgcctt cccaagcccc    1740
ctgcgactga gttgcttgag caggtgctgc gtcttgttgg tgaatcccgg cgccctgttc    1800
tttatgttgg cggtggctgc gcagcatctg gtgaggagtt gcgacgcttt gtggagctga    1860
ctggaatccc ggtcacaact actcttatgg gcctcggcaa cttccccagc gacgacccac    1920
tgtctctgcg catgctaggt atgcatggca cggtgtatgc aaattatgca gtggataagg    1980
ccgatctgtt gcttgcactt ggtgtgcggt ttgatgatcg tgtgacaggg aagattgagg    2040
cttttgcaag cagggctaag attgtgcacg ttgatattga tccggctgag attggcaaga    2100
acaagcagcc acatgtgtcc atctgtgcag atgttaagct tgctttgcag ggcatgaatg    2160
ctcttcttga aggaagcaca tcaaagaaga gctttgactt tggctcatgg aacgatgagt    2220
tggatcagca gaagagggaa ttcccccttg ggtataaaac atctaatgag gagatccagc    2280
cacaatatgc tattcaggtt cttgatgagc tgacgaaagg cgaggccatc atcggcacag    2340
gtgttgggca gcaccagatg tgggcggcac agtactacac ttacaagcgg ccaaggcagt    2400
ggttgtcttc agctggtctt ggggctatgg gatttggttt gccggctgct gctggtgctt    2460
ctgtggccaa cccaggtgtt actgttgttg acatcgatgg agatggtagc tttctcatga    2520
acgttcagga gctagctatg atccgaattg agaacctccc ggtgaaggtc tttgtgctaa    2580
acaaccagca cctggggatg gtggtgcagt gggaggacag gttctataag gccaacagag    2640
cgcacacata cttgggaaac ccagagaatg aaagtgagat atatccagat ttcgtgacga    2700
tcgccaaagg gttcaacatt ccagcggtcc gtgtgacaaa gaagaacgaa gtccgcgcag    2760
cgataaagaa gatgctcgag actccagggc cgtacctctt ggatataatc gtcccacacc    2820
aggagcatgt gttgcctatg atccctaatg gtggggcttt caaggatatg atcctggatg    2880
gtgatggcag gactgtgtac tgatctaaaa tccagcaagc aactgatcta aaatccagca    2940
agcaccgcct ccctgctagt acaagggtga tatgttttta tctgtgtgat gttctcctgt    3000
attctatctt tttttgtagg ccgtcagcta tctgttatgg taatcctatg tagcttccga    3060
ccttgtaatt gtgtagtctg ttgttttcct tctggcatgt gtcataagag atcatttaag    3120
tgccttttgc tacatataaa taagataata agcactgcta tgcagtggtt ctgaattggc    3180
ttctgttgcc aaatttaagt gtccaactgg tccttgcttt tgttttcgct atttttttcc    3240
ttttttagtt attattatat tggtaatttc aactcaacat atgatgtatg gaataatgct    3300
agggctgcaa tttcaaacta ttttacaaac cagaatggca ttttcgtggt ttgaggggag    3360
tgaaaaaaaa tgaggcattt gactgaatta gttacctgat ccattttcgt ggtttggatc    3420
attggaatta aattccattc taataatagt aattttggca tatatcaatt aagttaattc    3480
ggttttatgc aaaatatatt tgtatactat tattatcaag atgtcggaga tatttatatg    3540
ctacattttt actatacagg agtgagatga agagtgtcat gtaagttaca cagtagaaac    3600
aaattctatt aatgcataaa atcatttcca tcatccaccc tatgaatttg agatagacct    3660
atatctaaac tttgaaaagt ggttgaatat caaattccaa attaaataag ttattttatt    3720
gagtgaattc taatttctct aaaacgaagg gatctaaacg ccctctaaag ctaatttgga    3780
aactcaaact ttcttagcat tggaggggat tgagaaaaaa tattaattca ttttcatctc    3840
aatcattcaa tctccaaaga gatttgagtt ccttattagt ctgttccatg catcaaatcg    3900
gctcaatgtg tcattatttg ccatgacgat tgacgagttg ttctggggcc tagcgctttc    3960
cacgccgatg tgctggggcc tggtcctgga gaagacagct tgatatttaa agctatcaat    4020
tgtttcaatt gattcccact tcatttttct aaatgtagaa aacggtgacg tataagaaaa    4080
agaatgaatt aggactttta ttccgtacac taatctagag cggccgcaag cttgtacaac    4140
gcgtaccggt taattaaggt accaagcttc cgcggctgca gtgcagcgtg acccggtcgt    4200
gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt    4260
tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta    4320
ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata    4380
aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag    4440
ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata    4500
atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga    4560
ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa    4620
ctctatttta gtttttttat ttaatagttt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact    4680
aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt    4740
cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg    4800
aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct    4860
ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga    4920
aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca    4980
cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc    5040
cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag    5100
cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt    5160
acgccgctcg tcctcccccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc    5220
catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt    5280
tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat    5340
tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga    5400
cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg cccttttcct    5460
ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc    5520
ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag aattctgttt    5580
caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata catattcata    5640
gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc    5700
gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg    5760
tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca aactacctgg    5820
tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta    5880
agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc    5940
atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt acctatctat    6000
tataataaac aagtatgttt tataattatt tcgatcttga tatacttgga tgatggcata    6060
tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta tttgcttggt    6120
actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag ggtacggatc    6180
cggcgcgcca ctagtcccgg tcgccaccat ggcctcctcc gagaacgtca tcaccgagtt    6240
catgcgcttc aaggtgcgca tggagggcac cgtgaacggc cacgagttcg agatcgaggg    6300
cgagggcgag ggccgcccct acgagggcca caacaccgtg aagctgaagg tgaccaaggg    6360
cggccccctg cccttcgcct gggacatcct gtccccccag ttccagtacg gctccaaggt    6420
gtacgtgaag caccccgccg acatccccga ctacaagaag ctgtccttcc ccgagggctt    6480
caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg gcgaccgtga cccaggactc    6540
ctccctgcag gacggctgct tcatctacaa ggtgaagttc atcggcgtga acttcccctc    6600
cgacggcccc gtgatgcaga agaagaccat gggctgggag gcctccaccg agcgcctgta    6660
cccccgcgac ggcgtgctga agggcgagac ccacaaggcc ctgaagctga aggacggcgg    6720
ccactacctg gtggagttca agtccatcta catggccaag aagcccgtgc agctgcccgg    6780
ctactactac gtggacgcca agctggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt    6840
ggagcagtac gagcgcaccg agggccgcca ccacctgttc ctgtagcggc cgccctgcag    6900
ggagctcgaa tttccccgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc    6960
ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa    7020
taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc    7080
aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat    7140
cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc gggaattcgg gcccggccgg ccagatcttg    7200
attgtcgttt cccgccttca gtttctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag    7260
tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa    7320
aggccatccg tcaggatggc cttctgctta gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt    7380
cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc acaacgttca aatccgctcc cggcggattt    7440
gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc    7500
gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg gcagttccct actctcgcgt taacgctagc    7560
atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtcttaact agtgatgtag    7620
ccctcaggca tggcgctctt gaagaagtcg tgctgcttca tgtgatcggg gtagcgtgag    7680
aagcactgca cgccgtagct cagggtggtc accagggtgg gccagggcac aggcagcttg    7740
ccggtggtgc agatgaactt cagggtcagc ttgccgtagg tggcatcgcc ctcgccctcg    7800
ccgctcacgc tgaacttgtg gccattcaca tcgccattca gctcgatcag gatgggcacg    7860
atgccggtga acagctcggt ccgggcgccc cctagggagc tcggtagcaa ttcccgaggc    7920
tgtagccgac gatggtgcgc caggagagtt gttgattcat tgtttgcctc cctgctgcgg    7980
tttttcaccg aagttcatgc cagtccagcg tttttgcagc agaaaagccg ccgacttcgg    8040
tttgcggtcg cgagtgaaga tccctttctt gttaccgcca acgcgcaata tgccttgcga    8100
ggtcgcaaaa tcggcgaaat tccatacctg ttcaccgacg acggcgctga cgcgatcaaa    8160
gacgcggtga tacatatcca gccatgcaca ctgatactct tcactccaca tgtcggtgta    8220
cattgagtgc agcccggcta acgtatccac gccgtattcg gtgatgataa tcggctgatg    8280
cagtttctcc tgccaggcca gaagttcttt ttccagtacc ttctctgccg tttccaaatc    8340
gccgctttgg acataccatc cgtaataacg gttcaggcac agcacatcaa agagatcgct    8400
gatggtatcg gtgtgagcgt cgcagaacat tacattgacg caggtgatcg gacgcgtcgg    8460
gtcgagttta cgcgttgctt ccgccagtgg cgcgaaatat tcccgtgcac cttgcggacg    8520
ggtatccggt tcgttggcaa tactccacat caccacgctt gggtggtttt tgtcacgcgc    8580
tatcagctct ttaatcgcct gtaagtgcgc ttgctgagtt tccccgttga ctgcctcttc    8640
gctgtacagt tctttcggct tgttgcccgc ttcgaaacca atgcctaaag agaggttaaa    8700
gccgacagca gcagtttcat caatcaccac gatgccatgt tcatctgccc agtcgagcat    8760
ctcttcagcg taagggtaat gcgaggtacg gtaggagttg gccccaatcc agtccattaa    8820
tgcgtggtcg tgcaccatca gcacgttatc gaatcctttg ccacgcaagt ccgcatcttc    8880
atgacgacca aagccagtaa agtagaacgg tttgtggtta atcaggaact gttcgccctt    8940
cactgccact gaccggatgc cgacgcgaag cgggtagata tcacactctg tctggctttt    9000
ggctgtgacg cacagttcat agagataacc ttcacccggt tgccagaggt gcggattcac    9060
cacttgcaaa gtcccgctag tgccttgtcc agttgcaacc acctgttgat ccgcatcacg    9120
cagttcaacg ctgacatcac cattggccac cacctgccag tcaacagacg cgtggttaca    9180
gtcttgcgcg acatgcgtca ccacggtgat atcgtccacc caggtgttcg gcgtggtgta    9240
gagcattacg ctgcgatgga ttccggcata gttaaagaaa tcatggaagt aagactgctt    9300
tttcttgccg ttttcgtcgg taatcaccat tcccggcggg atagtctgcc agttcagttc    9360
gttgttcaca caaacggtga tacctgcaca tcaacaaatt ttggtcatat attagaaaag    9420
ttataaatta aaatatacac acttataaac tacagaaaag caattgctat atactacatt    9480
cttttatttt gaaaaaaata tttgaaatat tatattacta ctaattaatg ataattatta    9540
tatatatatc aaaggtagaa gcagaaactt acgtacactt ttcccggcaa taacatacgg    9600
cgtgacatcg gcttcaaatg gcgtatagcc gccctgatgc tccatcactt cctgattatt    9660
gacccacact ttgccgtaat gagtgaccgc atcgaaacgc agcacgatac gctggcctgc    9720
ccaacctttc ggtataaaga cttcgcgctg ataccagacg ttgcccgcat aattacgaat    9780
atctgcatcg gcgaactgat cgttaaaact gcctggcaca gcaattgccc ggctttcttg    9840
taacgcgctt tcccaccaac gctgaccaat tccacagttt tcgcgatcca gactgaatgc    9900
ccacaggccg tcgagttttt tgatttcacg ggttggggtt tctacaggac gtaacataag     9960
ggactgacct acccgggggt accctgcaga agtaacacca aacaacaggg tgagcatcga    10020
caaaagaaac agtaccaagc aaataaatag cgtatgaagg cagggctaaa aaaatccaca    10080
tatagctgct gcatatgcca tcatccaagt atatcaagat cgaaataatt ataaaacata    10140
cttgtttatt ataatagata ggtactcaag gttagagcat atgaatagat gctgcatatg    10200
ccatcatgta tatgcatcag taaaacccac atcaacatgt atacctatcc tagatcgata    10260
tttccatcca tcttaaactc gtaactatga agatgtatga cacacacata cagttccaaa    10320
attaataaat acaccaggta gtttgaaaca gtattctact ccgatctaga acgaatgaac    10380
gaccgcccaa ccacaccaca tcatcacaac caagcgaaca aaaagcatct ctgtatatgc    10440
atcagtaaaa cccgcatcaa catgtatacc tatcctagat cgatatttcc atccatcatc    10500
ttcaattcgt aactatgaat atgtatggca cacacataca gatccaaaat taataaatcc    10560
accaggtagt ttgaaacaga attctactcc gatctagaac gaccgcccaa ccagaccaca    10620
tcatcacaac caagacaaaa aaaagcatga aaagatgacc cgacaaacaa gtgcacggca    10680
tatattgaaa taaaggaaaa gggcaaacca aaccctatgc aacgaaacaa aaaaaatcat    10740
gaaatcgatc ccgtctgcgg aacggctaga gccatcccag gattccccaa agagaaacac    10800
tggcaagtta gcaatcagaa cgtgtctgac gtacaggtcg catccgtgta cgaacgctag    10860
cagcacggat ctaacacaaa cacggatcta acacaaacat gaacagaagt agaactaccg    10920
ggccctaacc atggaccgga acgccgatct agagaaggta gagagggggg ggggggggga    10980
ggacgagcgg cgtaccttga agcggaggtg ccgacgggtg gatttggggg agatctggtt    11040
gtgtgtgtgt gcgctccgaa caacacgagg ttggggaaag agggtgtgga gggggtgtct    11100
atttattacg gcgggcgagg aagggaaagc gaaggagcgg tgggaaagga atcccccgta    11160
gctgccggtg ccgtgagagg aggaggaggc cgcctgccgt gccggctcac gtctgccgct    11220
ccgccacgca atttctggat gccgacagcg gagcaagtcc aacggtggag cggaactctc    11280
gagaggggtc cagaggcagc gacagagatg ccgtgccgtc tgcttcgctt ggcccgacgc    11340
gacgctgctg gttcgctggt tggtgtccgt tagactcgtc gacggcgttt aacaggctgg    11400
cattatctac tcgaaacaag aaaaatgttt ccttagtttt tttaatttct taaagggtat    11460
ttgtttaatt tttagtcact ttattttatt ctattttata tctaaactat taaataaaaa    11520
aactaaaata gagttttagt tttcttaatt tagaggctaa aatagaataa aatagatgta    11580
ctaaaaaaat tagtctataa aaaccattaa ccctaaaccc taaatggatg tactaataaa    11640
atggatgaag tattatatag gtgaagctat ttgcaaaaaa aaaggagaac acatgcacac    11700
taaaaagata aaactgtaga gtcctgttgt caaaatactc aattgtcctt tagaccatgt    11760
ctaactgttc atttatatga ttctctaaaa cactgatatt attgtagtac tatagattat    11820
attattcgta gagtaaagtt taaatatatg tataaagata gataaactgc acttcaaaca    11880
agtgtgacaa aaaaaatatg tggtaatttt ttataactta gacatgcaat gctcattatc    11940
tctagagagg ggcacgaccg ggtcacgctg cactgcagcc gcggaagctt gcatgcctgc    12000
aggcatgcaa gcttggcgcg ccgacccagc tttcttgtac aaagttggca ttataagaaa    12060
gcattgctta tcaatttgtt gcaacgaaca ggtcactatc agtcaaaata aaatcattat    12120
ttgccatcca gaaactatca gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa    12180
agagcgttta ttagaataat cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc    12240
catttgtatg tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga gtgcttggca ttccgtgcga    12300
taatgacttc tgttcaacca cccaaacgtc ggaaagcctg acgacggagc agcattccaa    12360
aaagatccct tggctcgtct gggtcggcta gaaggtcgag tgggctgctg tggcttgatc    12420
cctcaacgcg gtcgcggacg tagcgcagcg ccgaaaaatc ctcgatcgca aatccgacgc    12480
tgtcgaaaag cgtgatctgc ttgtcgctct ttcggccgac gtcctggcca gtcatcacgc    12540
gccaaagttc cgtcacagga tgatctggcg cgagttgctg gatctcgcct tcaatccggg    12600
tctgtggcgg gaactccacg aaaatatccg aacgcagcaa gatcgtcgac caattcttga    12660
agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt    12720
tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt    12780
ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa    12840
taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt    12900
tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat    12960
gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag    13020
atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg    13080
ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata    13140
cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat    13200
ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc    13260
aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg    13320
ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac    13380
gacgagcgtg acaccacgat gccggggggg gggggggggg acatgaggtt gccccgtatt    13440
cagtgtcgct gatttgtatt gtctgaagtt gtttttacgt taagttgatg cagatcaatt    13500
aatacgatac ctgcgtcata attgattatt tgacgtggtt tgatggcctc cacgcacgtt    13560
gtgatatgta gatgataatc attatcactt tacgggtcct ttccggtgat ccgacaggtt    13620
acggggcggc gacctcgcgg gttttcgcta tttatgaaaa ttttccggtt taaggcgttt    13680
ccgttcttct tcgtcataac ttaatgtttt tatttaaaat accctctgaa aagaaaggaa    13740
acgacaggtg ctgaaagcga gctttttggc ctctgtcgtt tcctttctct gtttttgtcc    13800
gtggaatgaa caatggaacc cccccccccc ccccctgcag caatggcaac aacgttgcgc    13860
aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg  13920
gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt  13980
gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca  14040
gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat  14100
gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca  14160
gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg  14220
atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg  14280
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt  14340
ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg  14400
ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata  14460
ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca  14520
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag  14580
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc  14640
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga  14700
tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg  14760
tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac  14820
gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg  14880
tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg  14940
ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct  15000
gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc  15060
gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt  15120
acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat  15180
gccgcatagt taagccagta tacactccgc tatcgctacg tgactgggtc atggctgcgc  15240
cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg  15300
cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat  15360
caccgaaacg cgcgaggcag cagatccccc gatcaagtag atacactaca tatatctaca  15420
atagacatcg agccggaagg tgatgtttac tttcctgaaa tccccagcaa ttttaggcca  15480
gtttttaccc aagacttcgc ctctaacata aattatagtt accaaatctg gcaaaagggt  15540
tgaccggggg gggggggaaa gccacgttgt gtctcaaaat ctctgatgtt acattgcaca  15600
agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca gtaatacaag  15660
gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg aggccgcgat taaattccaa  15720
catggatgct gatttatatg ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc  15780
gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa  15840
aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt  15900
tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac  15960
cactgcgatc cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga  16020
aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa  16080
ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa  16140
cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt  16200
ctggaaagaa atgcataagc ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga  16260
tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg  16320
acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga  16380
gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat  16440
gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc taatcagaat tggttaattg  16500
gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac ggcggctttg ttgaataaat  16560
cgaacttttg ctgagttgaa ggatcagatc acgcatcttc ccgacaacgc agaccgttcc  16620
gtggcaaagc aaaagttcaa aatcaccaac tggtccacct acaacaaagc tctcatcaac  16680
cgtggctccc tcactttctg gctggatgat ggggcgattc agggatcaca ggcagcaacg  16740
ctctgtcatc gttacaatca acatgctacc ctccgcgaga tcatccgtgt ttcaaacccg  16800
gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta  16860
caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg agtg        16914
<210>106
<211>15919
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>来自pRLI024的双元载体
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>LB的互补序列
<220>
<221>启动子
<222>(187)..(986)
<223>ZmAHAS
<220>
<221>misc_feature
<222>(987)..(2903)
<223>编码ZmAHAS的cds
<220>
<221>终止子
<222>(2902)..(4112)
<223>ZmAHAS
<220>
<221>启动子
<222>(4177)..(6164)
<223>ZmUbi
<220>
<221>内含子
<222>(5159)..(6164)
<223>ZmUbi
<220>
<221>misc_feature
<222>(6209)..(6886)
<223>编码DsRed2的cds
<220>
<221>misc_feature
<222>(6902)..(6907)
<223>TOI克隆位点的互补序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(6962)..(8962)
<223>互补序列：编码GUS的cds
<220>
<221>内含子
<222>(8389)..(8577)
<223>PIV2的互补序列
<220>
<221>内含子
<222>(8995)..(10000)
<223>ZmUbi的互补序列
<220>
<221>启动子
<222>(8995)..(10982)
<223>ZmUbi的互补序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(11152)..(11175)
<223>RB的互补序列
<400>106
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt      60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt     120
actgaattgg atccgcccgg gcggtacccg gggatcctct agaactagtg gatcccccgg     180
gctgcaggtc aacggatcac ctatcaacat cccagctaaa aacagtaaaa agggggaaaa     240
cgtgggtgag ttgagtctgt cttgtggaaa aaacgtttta gtttctcctg gaattaacaa     300
taaaaacagt tgaacaagat tgactgttcc tccgggaggg tttggaacat cgttacagat     360
gtgagcgaaa ggtgaggaaa cagagcggag ggcttggagg tgacctcggt agtcgacgcc     420
ggagttgagc ttgatgacga caccgtactg gcgtaccagg cctagtagtg aacaccgggc     480
ctgaagctgt cgccgccgct gctcatcttg tgggctgtgc ccggtgtccc tgttgcggat     540
tgcgggtggc agcctggcag gtgggtgcga cccgtttgga ctccctgatc tgggcccttt     600
gtgtcagtac cgtctgtact ccgatgacat gcacaccgtc gtccacagtc aagtccacaa     660
tctcccctct ttttttaacg gaatagttca aaatctcctt gacgcacgct atcgtgtacc     720
agcgctcact ggacaccacg tttgtaatcc acgccgacac gtcggtccca cgtcgacagg     780
ccccaccgtc cggtctgtag cgtgtacgta ttcgggcgac ggacgtgtcg tcgtcgtctt     840
gcgagtccca ttcccatcac catctgagcc acacatcctc tgaacaaaag cagggaggcc     900
tctacgcaca tccccctttc tcccactccg tgtccgtggc acccacccca aaccctcgcg     960
ccgcctccga gacagccgcc gcaaccatgg ccaccgccgc cgccgcgtct accgcgctca    1020
ctggcgccac taccgctgcg cccaaggcga ggcgccgggc gcacctcctg gccacccgcc    1080
gcgccctcgc cgcgcccatc aggtgctcag cggcgtcacc cgccatgccg atggctcccc    1140
cggccacccc gctccggccg tggggcccca ccgatccccg caagggcgcc gacatcctcg    1200
tcgagtccct cgagcgctgc ggcgtccgcg acgtcttcgc ctaccccggc ggcgcgtcca    1260
tggagatcca ccaggcactc acccgctccc ccgtcatcgc caaccacctc ttccgccacg    1320
agcaagggga ggcctttgcg gcctccggct acgcgcgctc ctcgggccgc gtcggcgtct    1380
gcatcgccac ctccggcccc ggcgccacca accttgtctc cgcgctcgcc gacgcgctgc    1440
tcgattccgt ccccatggtc gccatcacgg gacaggtgcc gcgacgcatg attggcaccg    1500
acgccttcca ggagacgccc atcgtcgagg tcacccgctc catcaccaag cacaactacc    1560
tggtcctcga cgtcgacgac atcccccgcg tcgtgcagga ggctttcttc ctcgcctcct    1620
ctggtcgacc ggggccggtg cttgtcgaca tccccaagga catccagcag cagatggcgg    1680
tgcctgtctg ggacaagccc atgagtctgc ctgggtacat tgcgcgcctt cccaagcccc    1740
ctgcgactga gttgcttgag caggtgctgc gtcttgttgg tgaatcccgg cgccctgttc    1800
tttatgttgg cggtggctgc gcagcatctg gtgaggagtt gcgacgcttt gtggagctga    1860
ctggaatccc ggtcacaact actcttatgg gcctcggcaa cttccccagc gacgacccac    1920
tgtctctgcg catgctaggt atgcatggca cggtgtatgc aaattatgca gtggataagg    1980
ccgatctgtt gcttgcactt ggtgtgcggt ttgatgatcg tgtgacaggg aagattgagg    2040
cttttgcaag cagggctaag attgtgcacg ttgatattga tccggctgag attggcaaga    2100
acaagcagcc acatgtgtcc atctgtgcag atgttaagct tgctttgcag ggcatgaatg    2160
ctcttcttga aggaagcaca tcaaagaaga gctttgactt tggctcatgg aacgatgagt    2220
tggatcagca gaagagggaa ttcccccttg ggtataaaac atctaatgag gagatccagc    2280
cacaatatgc tattcaggtt cttgatgagc tgacgaaagg cgaggccatc atcggcacag    2340
gtgttgggca gcaccagatg tgggcggcac agtactacac ttacaagcgg ccaaggcagt    2400
ggttgtcttc agctggtctt ggggctatgg gatttggttt gccggctgct gctggtgctt    2460
ctgtggccaa cccaggtgtt actgttgttg acatcgatgg agatggtagc tttctcatga    2520
acgttcagga gctagctatg atccgaattg agaacctccc ggtgaaggtc tttgtgctaa    2580
acaaccagca cctggggatg gtggtgcagt gggaggacag gttctataag gccaacagag    2640
cgcacacata cttgggaaac ccagagaatg aaagtgagat atatccagat ttcgtgacga    2700
tcgccaaagg gttcaacatt ccagcggtcc gtgtgacaaa gaagaacgaa gtccgcgcag    2760
cgataaagaa gatgctcgag actccagggc cgtacctctt ggatataatc gtcccacacc    2820
aggagcatgt gttgcctatg atccctaatg gtggggcttt caaggatatg atcctggatg    2880
gtgatggcag gactgtgtac tgatctaaaa tccagcaagc aactgatcta aaatccagca    2940
agcaccgcct ccctgctagt acaagggtga tatgttttta tctgtgtgat gttctcctgt    3000
attctatctt tttttgtagg ccgtcagcta tctgttatgg taatcctatg tagcttccga    3060
ccttgtaatt gtgtagtctg ttgttttcct tctggcatgt gtcataagag atcatttaag    3120
tgccttttgc tacatataaa taagataata agcactgcta tgcagtggtt ctgaattggc    3180
ttctgttgcc aaatttaagt gtccaactgg tccttgcttt tgttttcgct atttttttcc    3240
ttttttagtt attattatat tggtaatttc aactcaacat atgatgtatg gaataatgct    3300
agggctgcaa tttcaaacta ttttacaaac cagaatggca ttttcgtggt ttgaggggag    3360
tgaaaaaaaa tgaggcattt gactgaatta gttacctgat ccattttcgt ggtttggatc    3420
attggaatta aattccattc taataatagt aattttggca tatatcaatt aagttaattc    3480
ggttttatgc aaaatatatt tgtatactat tattatcaag atgtcggaga tatttatatg    3540
ctacattttt actatacagg agtgagatga agagtgtcat gtaagttaca cagtagaaac    3600
aaattctatt aatgcataaa atcatttcca tcatccaccc tatgaatttg agatagacct    3660
atatctaaac tttgaaaagt ggttgaatat caaattccaa attaaataag ttattttatt    3720
gagtgaattc taatttctct aaaacgaagg gatctaaacg ccctctaaag ctaatttgga    3780
aactcaaact ttcttagcat tggaggggat tgagaaaaaa tattaattca ttttcatctc    3840
aatcattcaa tctccaaaga gatttgagtt ccttattagt ctgttccatg catcaaatcg    3900
gctcaatgtg tcattatttg ccatgacgat tgacgagttg ttctggggcc tagcgctttc    3960
cacgccgatg tgctggggcc tggtcctgga gaagacagct tgatatttaa agctatcaat    4020
tgtttcaatt gattcccact tcatttttct aaatgtagaa aacggtgacg tataagaaaa    4080
agaatgaatt aggactttta ttccgtacac taatctagag cggccgcaag cttgtacaac    4140
gcgtaccggt taattaaggt accaagcttc cgcggctgca gtgcagcgtg acccggtcgt    4200
gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt    4260
tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta    4320
ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata    4380
aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag    4440
ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata    4500
atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga    4560
ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa    4620
ctctatttta gtttttttat ttaatagttt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact    4680
aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt    4740
cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg    4800
aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct    4860
ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga    4920
aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca    4980
cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc    5040
cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag    5100
cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt    5160
acgccgctcg tcctcccccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc    5220
catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt    5280
tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat    5340
tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga    5400
cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg cccttttcct    5460
ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc    5520
ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag aattctgttt    5580
caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata catattcata    5640
gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc    5700
gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg    5760
tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca aactacctgg    5820
tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta    5880
agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc    5940
atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt acctatctat    6000
tataataaac aagtatgttt tataattatt tcgatcttga tatacttgga tgatggcata    6060
tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta tttgcttggt    6120
actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag ggtacggatc    6180
cggcgcgcca ctagtcccgg tcgccaccat ggcctcctcc gagaacgtca tcaccgagtt    6240
catgcgcttc aaggtgcgca tggagggcac cgtgaacggc cacgagttcg agatcgaggg    6300
cgagggcgag ggccgcccct acgagggcca caacaccgtg aagctgaagg tgaccaaggg    6360
cggccccctg cccttcgcct gggacatcct gtccccccag ttccagtacg gctccaaggt    6420
gtacgtgaag caccccgccg acatccccga ctacaagaag ctgtccttcc ccgagggctt    6480
caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg gcgaccgtga cccaggactc    6540
ctccctgcag gacggctgct tcatctacaa ggtgaagttc atcggcgtga acttcccctc    6600
cgacggcccc gtgatgcaga agaagaccat gggctgggag gcctccaccg agcgcctgta    6660
cccccgcgac ggcgtgctga agggcgagac ccacaaggcc ctgaagctga aggacggcgg    6720
ccactacctg gtggagttca agtccatcta catggccaag aagcccgtgc agctgcccgg    6780
ctactactac gtggacgcca agctggacat cacctcccac aacgaggact acaccatcgt    6840
ggagcagtac gagcgcaccg agggccgcca ccacctgttc ctgtagcggc cgccctgcag    6900
ggagctcggt agcaattccc gaggctgtag ccgacgatgg tgcgccagga gagttgttga    6960
ttcattgttt gcctccctgc tgcggttttt caccgaagtt catgccagtc cagcgttttt    7020
gcagcagaaa agccgccgac ttcggtttgc ggtcgcgagt gaagatccct ttcttgttac    7080
cgccaacgcg caatatgcct tgcgaggtcg caaaatcggc gaaattccat acctgttcac    7140
cgacgacggc gctgacgcga tcaaagacgc ggtgatacat atccagccat gcacactgat    7200
actcttcact ccacatgtcg gtgtacattg agtgcagccc ggctaacgta tccacgccgt    7260
attcggtgat gataatcggc tgatgcagtt tctcctgcca ggccagaagt tctttttcca    7320
gtaccttctc tgccgtttcc aaatcgccgc tttggacata ccatccgtaa taacggttca    7380
ggcacagcac atcaaagaga tcgctgatgg tatcggtgtg agcgtcgcag aacattacat    7440
tgacgcaggt gatcggacgc gtcgggtcga gtttacgcgt tgcttccgcc agtggcgcga    7500
aatattcccg tgcaccttgc ggacgggtat ccggttcgtt ggcaatactc cacatcacca    7560
cgcttgggtg gtttttgtca cgcgctatca gctctttaat cgcctgtaag tgcgcttgct    7620
gagtttcccc gttgactgcc tcttcgctgt acagttcttt cggcttgttg cccgcttcga    7680
aaccaatgcc taaagagagg ttaaagccga cagcagcagt ttcatcaatc accacgatgc    7740
catgttcatc tgcccagtcg agcatctctt cagcgtaagg gtaatgcgag gtacggtagg    7800
agttggcccc aatccagtcc attaatgcgt ggtcgtgcac catcagcacg ttatcgaatc    7860
ctttgccacg caagtccgca tcttcatgac gaccaaagcc agtaaagtag aacggtttgt    7920
ggttaatcag gaactgttcg cccttcactg ccactgaccg gatgccgacg cgaagcgggt    7980
agatatcaca ctctgtctgg cttttggctg tgacgcacag ttcatagaga taaccttcac    8040
ccggttgcca gaggtgcgga ttcaccactt gcaaagtccc gctagtgcct tgtccagttg    8100
caaccacctg ttgatccgca tcacgcagtt caacgctgac atcaccattg gccaccacct    8160
gccagtcaac agacgcgtgg ttacagtctt gcgcgacatg cgtcaccacg gtgatatcgt    8220
ccacccaggt gttcggcgtg gtgtagagca ttacgctgcg atggattccg gcatagttaa    8280
agaaatcatg gaagtaagac tgctttttct tgccgttttc gtcggtaatc accattcccg    8340
gcgggatagt ctgccagttc agttcgttgt tcacacaaac ggtgatacct gcacatcaac    8400
aaattttggt catatattag aaaagttata aattaaaata tacacactta taaactacag    8460
aaaagcaatt gctatatact acattctttt attttgaaaa aaatatttga aatattatat    8520
tactactaat taatgataat tattatatat atatcaaagg tagaagcaga aacttacgta    8580
cacttttccc ggcaataaca tacggcgtga catcggcttc aaatggcgta tagccgccct    8640
gatgctccat cacttcctga ttattgaccc acactttgcc gtaatgagtg accgcatcga    8700
aacgcagcac gatacgctgg cctgcccaac ctttcggtat aaagacttcg cgctgatacc    8760
agacgttgcc cgcataatta cgaatatctg catcggcgaa ctgatcgtta aaactgcctg    8820
gcacagcaat tgcccggctt tcttgtaacg cgctttccca ccaacgctga ccaattccac    8880
agttttcgcg atccagactg aatgcccaca ggccgtcgag ttttttgatt tcacgggttg    8940
gggtttctac aggacgtaac ataagggact gacctacccg ggggtaccct gcagaagtaa    9000
caccaaacaa cagggtgagc atcgacaaaa gaaacagtac caagcaaata aatagcgtat    9060
gaaggcaggg ctaaaaaaat ccacatatag ctgctgcata tgccatcatc caagtatatc    9120
aagatcgaaa taattataaa acatacttgt ttattataat agataggtac tcaaggttag    9180
agcatatgaa tagatgctgc atatgccatc atgtatatgc atcagtaaaa cccacatcaa     9240
catgtatacc tatcctagat cgatatttcc atccatctta aactcgtaac tatgaagatg     9300
tatgacacac acatacagtt ccaaaattaa taaatacacc aggtagtttg aaacagtatt     9360
ctactccgat ctagaacgaa tgaacgaccg cccaaccaca ccacatcatc acaaccaagc     9420
gaacaaaaag catctctgta tatgcatcag taaaacccgc atcaacatgt atacctatcc     9480
tagatcgata tttccatcca tcatcttcaa ttcgtaacta tgaatatgta tggcacacac     9540
atacagatcc aaaattaata aatccaccag gtagtttgaa acagaattct actccgatct     9600
agaacgaccg cccaaccaga ccacatcatc acaaccaaga caaaaaaaag catgaaaaga     9660
tgacccgaca aacaagtgca cggcatatat tgaaataaag gaaaagggca aaccaaaccc     9720
tatgcaacga aacaaaaaaa atcatgaaat cgatcccgtc tgcggaacgg ctagagccat     9780
cccaggattc cccaaagaga aacactggca agttagcaat cagaacgtgt ctgacgtaca     9840
ggtcgcatcc gtgtacgaac gctagcagca cggatctaac acaaacacgg atctaacaca     9900
aacatgaaca gaagtagaac taccgggccc taaccatgga ccggaacgcc gatctagaga     9960
aggtagagag gggggggggg ggggaggacg agcggcgtac cttgaagcgg aggtgccgac    10020
gggtggattt gggggagatc tggttgtgtg tgtgtgcgct ccgaacaaca cgaggttggg    10080
gaaagagggt gtggaggggg tgtctattta ttacggcggg cgaggaaggg aaagcgaagg    10140
agcggtggga aaggaatccc ccgtagctgc cggtgccgtg agaggaggag gaggccgcct    10200
gccgtgccgg ctcacgtctg ccgctccgcc acgcaatttc tggatgccga cagcggagca    10260
agtccaacgg tggagcggaa ctctcgagag gggtccagag gcagcgacag agatgccgtg    10320
ccgtctgctt cgcttggccc gacgcgacgc tgctggttcg ctggttggtg tccgttagac    10380
tcgtcgacgg cgtttaacag gctggcatta tctactcgaa acaagaaaaa tgtttcctta    10440
gtttttttaa tttcttaaag ggtatttgtt taatttttag tcactttatt ttattctatt    10500
ttatatctaa actattaaat aaaaaaacta aaatagagtt ttagttttct taatttagag  10560
gctaaaatag aataaaatag atgtactaaa aaaattagtc tataaaaacc attaacccta  10620
aaccctaaat ggatgtacta ataaaatgga tgaagtatta tataggtgaa gctatttgca  10680
aaaaaaaagg agaacacatg cacactaaaa agataaaact gtagagtcct gttgtcaaaa  10740
tactcaattg tcctttagac catgtctaac tgttcattta tatgattctc taaaacactg  10800
atattattgt agtactatag attatattat tcgtagagta aagtttaaat atatgtataa  10860
agatagataa actgcacttc aaacaagtgt gacaaaaaaa atatgtggta attttttata  10920
acttagacat gcaatgctca ttatctctag agaggggcac gaccgggtca cgctgcactg  10980
cagccgcgga agcttgcatg cctgcaggca tgcaagcttg gcgcgccgac ccagctttct  11040
tgtacaaagt tggcattata agaaagcatt gcttatcaat ttgttgcaac gaacaggtca  11100
ctatcagtca aaataaaatc attatttgcc atccagaaac tatcagtgtt tgacaggata  11160
tattggcggg taaacctaag agaaaagagc gtttattaga ataatcggat atttaaaagg  11220
gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca gggttcccct  11280
cgggagtgct tggcattccg tgcgataatg acttctgttc aaccacccaa acgtcggaaa  11340
gcctgacgac ggagcagcat tccaaaaaga tcccttggct cgtctgggtc ggctagaagg  11400
tcgagtgggc tgctgtggct tgatccctca acgcggtcgc ggacgtagcg cagcgccgaa  11460
aaatcctcga tcgcaaatcc gacgctgtcg aaaagcgtga tctgcttgtc gctctttcgg  11520
ccgacgtcct ggccagtcat cacgcgccaa agttccgtca caggatgatc tggcgcgagt  11580
tgctggatct cgccttcaat ccgggtctgt ggcgggaact ccacgaaaat atccgaacgc  11640
agcaagatcg tcgaccaatt cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata  11700
ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt  11760
gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag  11820
acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca    11880
tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc    11940
agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat    12000
cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc    12060
aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg    12120
gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc    12180
agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat    12240
aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga    12300
gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc    12360
ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgccgg gggggggggg    12420
gggggacatg aggttgcccc gtattcagtg tcgctgattt gtattgtctg aagttgtttt    12480
tacgttaagt tgatgcagat caattaatac gatacctgcg tcataattga ttatttgacg    12540
tggtttgatg gcctccacgc acgttgtgat atgtagatga taatcattat cactttacgg    12600
gtcctttccg gtgatccgac aggttacggg gcggcgacct cgcgggtttt cgctatttat    12660
gaaaattttc cggtttaagg cgtttccgtt cttcttcgtc ataacttaat gtttttattt    12720
aaaataccct ctgaaaagaa aggaaacgac aggtgctgaa agcgagcttt ttggcctctg    12780
tcgtttcctt tctctgtttt tgtccgtgga atgaacaatg gaaccccccc cccccccccc    12840
tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc    12900
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc    12960
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg    13020
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac    13080
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc    13140
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt  13200
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac  13260
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa  13320
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc  13380
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt  13440
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg  13500
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc  13560
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt  13620
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga  13680
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct  13740
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg  13800
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca  13860
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa  13920
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt  13980
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga  14040
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga  14100
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg  14160
cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac tccgctatcg  14220
ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga  14280
cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc  14340
atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagcagat cccccgatca  14400
agtagataca ctacatatat ctacaataga catcgagccg gaaggtgatg tttactttcc  14460
tgaaatcccc agcaatttta ggccagtttt tacccaagac ttcgcctcta acataaatta  14520
tagttaccaa atctggcaaa agggttgacc gggggggggg ggaaagccac gttgtgtctc  14580
aaaatctctg atgttacatt gcacaagata aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt  14640
ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt  14700
gctcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc  14760
gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc  14820
cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg  14880
tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta  14940
ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat  15000
tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc  15060
ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg  15120
ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc  15180
gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taagcttttg ccattctcac  15240
cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga  15300
aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg  15360
ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa  15420
aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt  15480
ttttctaatc agaattggtt aattggttgt aacactggca gagcattacg ctgacttgac  15540
gggacggcgg ctttgttgaa taaatcgaac ttttgctgag ttgaaggatc agatcacgca  15600
tcttcccgac aacgcagacc gttccgtggc aaagcaaaag ttcaaaatca ccaactggtc  15660
cacctacaac aaagctctca tcaaccgtgg ctccctcact ttctggctgg atgatggggc  15720
gattcaggga tcacaggcag caacgctctg tcatcgttac aatcaacatg ctaccctccg  15780
cgagatcatc cgtgtttcaa acccggcagc ttagttgccg ttcttccgaa tagcatcggt  15840
aacatgagca aagtctgccg ccttacaacg gctctcccgc tgacgccgtc ccggactgat  15900
gggctgcctg tatcgagtg                                               15919
<210>107
<211>1499
<212>DNA
<213>稻
<220>
<221>终止子
<222>(1)..(1499)
<400>107
cagagtgata gacagtgcta cttgctagcc ttttttatga gcaccctttt tggcctttta     60
gttcctcatt agctaagaga tgtgatgagt gaggttttat tttttggctt tgtttggagt    120
tttgctttgg aggaagatag agaagccttt agaatgagtt gtgatggagg atcacatagt    180
ttgtctcagg tttacaatgt gcggtaaaaa aaaggaagga aataaagtga tgttagaata    240
tacagttttt taatccattt ctacagcttc aaattctcga ttgagcggca cgttctttga    300
aatgttcata gcaaagcaaa tcaaacgaaa tggatgagat ttgaaactaa gaaactgcac    360
ttgacaaagc acgctgcgct ctctgaaatt catgttcagc agaacgcctt tcagaaattc    420
atgttctgct gctgcaggaa ggcagctaag aactccatgc aataaaaata taaaatgcag    480
tgcagttatt agttagtgta gtagtaatct aagaaacaac aggtttaaca gaatattacc    540
ttcaaaaaca tcccctcaaa tcaagactcg gaaatcaaca ccattctgaa actagatgca    600
atactgcgct cctaatggaa tcttcagtgg ttactcctac acgccactaa aaaaaacggg    660
ctttggaaaa acgtcaccct gaaaacaaga gctcagtaaa aataccactc taaaatcttg    720
cagcatgcat tatcacaaaa gcagatcaat ccgtaattgt atttatgctg catataccgt    780
gatattttct gtgatcctct gcactatctt cagctcatca gctgcatatt ttgaagccgg   840
actgatggct catcgctttg tttcggctta ttgtgatagc catccatgcg ttgacgaaag   900
atttagatat atcacaattt taaccaagtt cagagcaatg ttagctttag ctgatgatat   960
acacggcgca ctgattgccg ccgttatttt cagagccttg taaaacctga aacaaattgt  1020
gtctccaaat tcttactagt actgcagaca tagcggattt gttttcagga tgaattatca  1080
caaaggtaag tcaattcata gccatattac gcaagttcaa aactgcaggc cacaccatac  1140
gtttctgaaa gtagaaacaa gagatcttgc agcagatcac cactaaagaa gcagtaaccg  1200
caaaaaatta taacataatc cagaattaac acttcgcagc attactgaat tcactttaat  1260
agcacttctc atcatgaact agtacaacaa cataactgtc cagtggaaat gtgaaatgca  1320
tacaccaagt aatggtccat aacatgaact atatggatac aacaacgttc ttatttcgct  1380
catatataca tgaaataagt cttgcacgtc ttggttactt aataggtgcg ataatcgccg  1440
taggctttta gaagaagaaa aaaaagtgag cctgcaaagt tcctggggac agttgaaga   1499
<210>108
<211>1499
<212>DNA
<213>稻
<220>
<221>终止子
<222>(1)..(1499)
<400>108
gagacaaact atgtgatcct ccatcacaac tcattctaaa ggcttctcta tcttcctcca     60
aagcaaaact ccaaacaaag ccaaaaaata aaacctcact catcacatct cttagctaat    120
gaggaactaa aaggccaaaa agggtgctca taaaaaaggc tagcaagtag cactgtctat    180
cactctgtct tcaactgtcc ccaggaactt tgcaggctca cttttttttc ttcttctaaa    240
agcctacggc gattatcgca cctattaagt aaccaagacg tgcaagactt atttcatgta     300
tatatgagcg aaataagaac gttgttgtat ccatatagtt catgttatgg accattactt     360
ggtgtatgca tttcacattt ccactggaca gttatgttgt tgtactagtt catgatgaga     420
agtgctatta aagtgaattc agtaatgctg cgaagtgtta attctggatt atgttataat     480
tttttgcggt tactgcttct ttagtggtga tctgctgcaa gatctcttgt ttctactttc     540
agaaacgtat ggtgtggcct gcagttttga acttgcgtaa tatggctatg aattgactta     600
cctttgtgat aattcatcct gaaaacaaat ccgctatgtc tgcagtacta gtaagaattt     660
ggagacacaa tttgtttcag gttttacaag gctctgaaaa taacggcggc aatcagtgcg     720
ccgtgtatat catcagctaa agctaacatt gctctgaact tggttaaaat tgtgatatat     780
ctaaatcttt cgtcaacgca tggatggcta tcacaataag ccgaaacaaa gcgatgagcc     840
atcagtccgg cttcaaaata tgcagctgat gagctgaaga tagtgcagag gatcacagaa     900
aatatcacgg tatatgcagc ataaatacaa ttacggattg atctgctttt gtgataatgc     960
atgctgcaag attttagagt ggtattttta ctgagctctt gttttcaggg tgacgttttt    1020
ccaaagcccg ttttttttag tggcgtgtag gagtaaccac tgaagattcc attaggagcg    1080
cagtattgca tctagtttca gaatggtgtt gatttccgag tcttgatttg aggggatgtt    1140
tttgaaggta atattctgtt aaacctgttg tttcttagat tactactaca ctaactaata    1200
actgcactgc attttatatt tttattgcat ggagttctta gctgccttcc tgcagcagca    1260
gaacatgaat ttctgaaagg cgttctgctg aacatgaatt tcagagagcg cagcgtgctt    1320
tgtcaagtgc agtttcttag tttcaaatct catccatttc gtttgatttg ctttgctatg    1380
aacatttcaa agaacgtgcc gctcaatcga gaatttgaag ctgtagaaat ggattaaaaa    1440
actgtatatt ctaacatcac tttatttcct tccttttttt taccgcacat tgtaaacct     1499

Claims (21)

1.用于鉴定和/或分离转录终止序列的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其包含：
a)启动子序列，和
b)用于插入DNA序列的一个或多个插入位点，优选限制性或重组位点，和
c)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下表达时产生易于检测的特征，
其中与无插入相比，将有效的转录终止子插入所述插入位点改变了所述附加序列通过所述启动子序列的表达，和
ii)提供待评估其转录终止能力的一个或多个DNA序列，和
iii)将所述DNA序列的一个或多个拷贝插入所述筛选构建体或筛选载体的所述插入位点，和
iv)将带有所述插入的DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适于诱导从所述启动子序列表达的体外或体内转录系统，和
v)鉴定和/或选择与无插入相比具有改变的易于检测特征的筛选构建体或筛选载体，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入的DNA序列用作转录终止序列，并任选地测定它们的序列。
2.权利要求1的方法，其中相对于所述附加序列而言，所述插入位点位于选自以下的位置：
i)附加序列的上游，在所述启动子和所述附加序列之间，和
ii)附加序列下游，和
iii)在所述附加序列之间。
3.权利要求1或2的方法，其中将所述待评估其转录终止效率的DNA序列以反向重复的形式插入所述插入位点中。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中用于鉴定和分离转录终止序列的方法包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其在5’至3’方向上包含：
a)启动子序列，和
b)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下的表达导致易于检测的特征，和
c)用于插入DNA序列的一个或多个插入位点，优选限制性或重组位点，
ii)提供待评估其转录终止能力的一个或多个DNA序列，和
iii)将所述DNA序列的特定DNA序列的至少两个拷贝以反向重复的形式插入所述筛选构建体或筛选载体的所述插入位点，其中与无插入相比，将有效转录终止子的反向重复插入所述插入位点允许所述附加序列通过所述启动子序列表达，和
iv)将带有所述插入的DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适于诱导从所述启动子序列表达的体外或体内转录系统，和
v)鉴定和/或选择与无插入相比具有所述易于检测特征的筛选构建体或筛选载体，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入的DNA序列用作转录终止序列，并任选地测定它们的序列。
5.权利要求1或2的方法，其中用于鉴定和分离转录终止序列的方法包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其在5’到3’方向上包含：
a)启动子序列，和
b)用于插入DNA序列的一个或多个插入位点，优选限制性或重组位点，和
c)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下的表达导致易于检测的特征，
其中与无插入相比，将有效的转录终止子插入所述插入位点抑制了所述附加序列通过所述启动子序列的表达，和
ii)提供待评估其转录终止能力的一个或多个DNA序列，和
iii)将所述DNA序列的一个或多个拷贝插入所述筛选构建体或筛选载体的所述插入位点中，和
iv)将带有所述插入的DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适于诱导从所述启动子序列表达的体外或体内转录系统，和
v)鉴定和/或选择与无插入相比具有改变的易于检测特征的筛选构建体或筛选载体，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入的DNA序列用作转录终止序列，并任选测定它们的序列。
6.权利要求5的方法，其中所述附加序列为已知转录终止子序列的反向重复，其以所述启动子序列下游的所述重复的第二个拷贝为组成功能性转录终止子的取向的方式定位，并且其中所述筛选构建体或筛选载体在所述插入位点和所述启动子之间含有产生易于检测表型的其他序列，并且其中由于所述已知的转录终止子的所述反向重复表达的缘故，所述插入位点中不存在有效转录终止子将引起所述其他序列表达的沉默。
7.权利要求1或2的方法，其中用于鉴定和分离转录终止序列的方法包括以下步骤：
i)提供筛选构建体或筛选载体，其在5’到3’方向上包含：
a)启动子序列，和
b)至少一个附加序列，所述序列在所述启动子序列下的表达导致易于检测的特征，和在所述附加序列中嵌入的用于插入DNA序列的一个或多个插入位点，优选限制性或重组位点，
其中与无插入相比，将有效的转录终止子插入所述插入位点抑制了所述附加序列通过所述启动子序列的全长转录，和
ii)提供待评估其转录终止能力的一个或多个DNA序列，和
iii)将所述DNA序列的一个或多个拷贝插入所述筛选构建体或筛选载体的所述插入位点，和
iv)将带有所述插入的DNA序列的所述筛选构建体或筛选载体引入适于诱导从所述启动子序列表达的体外或体内转录系统，和
v)鉴定和/或选择与无插入相比具有改变的易于检测特征的筛选构建体或筛选载体，和
vi)从所述鉴定和/或选择的筛选构建体或筛选载体中分离插入的DNA序列用作转录终止序列，并任选测定它们的序列。
8.权利要求7的方法，其中所述插入位点位于所述附加序列中包含的内含子中。
9.权利要求7的方法，其中所述附加序列包含编码标记蛋白的第一个5’部分和不编码蛋白质且与所述转录系统的内源序列无同源性的第二个3’部分，并且其中所述插入位点位于所述5’部分和3’部分之间，并且其中为了选择和/或鉴定的目的，将第二个表达盒引入所述转录系统，所述第二个表达盒包含在所述转录系统中具有功能的启动子和与其有效连接的序列，该序列编码与所述3’部分互补的反义或双链RNA分子。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述附加序列选自正选择标记、负选择标记、反选择标记、报道基因和毒性基因。
11.权利要求10的方法，其中所述毒性基因是用于使必需内源基因或选择标记基因沉默的构建体。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中通过选自以下的方法提供所述待评估其转录终止效率的DNA序列：
i)通过从宿主基因组扩增提供选择的序列，和
ii)通过断裂宿主基因组提供序列文库，和
iii)提供合成序列的文库，和
iv)通过权利要求13至15中任一项要求保护的方法提供选择的序列。
13.权利要求12的方法，其中所述待评估其转录终止效率的DNA序列来自真核生物。
14.权利要求12或13的方法，其中所述待评估其转录终止效率的DNA序列来自植物。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中通过选自以下的方法将所述待评估其转录终止效率的DNA序列插入所述插入位点：
i)重组克隆，和
ii)通过特异性限制和连接插入。
16.用于鉴定和/或分离具有转录终止潜力的基因间区域的方法，所述方法至少包括以下步骤：
a)鉴定和/或分离或分离配对基因之间基因间距离为约400至3000个碱基对的基因间区域，和
b)鉴定和/或分离两侧均为具有高表达水平的基因的基因间序列。
17.权利要求16的方法，其中还包括以下步骤：
c)鉴定和/或分离基因间序列，所述基因间序列两侧均为表达图式优选独立于另一配对基因表达图式的基因，和
d)鉴定和/或分离基因间序列，所述基因间序列的一侧或优选两侧为来自所述配对基因的mRNA转录物的长度具有低变异性的基因。
18.权利要求16或17的方法，其中所述基因间区域
a)位于具有尾对尾定位的基因之间和/或
b)从侧翼基因各自的终止密码子测量的长度为约700至约2000个碱基对。
19.转基因表达构建体，其在5’-3’方向上包含
a)在植物中具有功能的启动子，和
b)与所述启动子a)有效连接的待表达的目的核酸序列，和
c)选自以下的至少一个序列：
i)SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107和108描述的序列，和
ii)与SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107或108所述的序列具有至少60％、优选80％、更优选90％、最优选95％的同源性的序列，该序列能够在植物细胞或生物中终止转录，和
iii)在低严格条件下、优选在高严格条件下与SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107或108描述的序列杂交的序列，该序列能在植物细胞或生物中终止转录，和
iv) i)、ii)和iii)中所述序列的至少50个连续碱基对、优选至少100个连续碱基对、更优选至少250个连续碱基对、最优选至少500个连续碱基对的片段，
其中所述序列c)与所述启动子a)和/或所述目的核酸b)异源，并介导从所述启动子a)诱导的表达的终止。
20.转基因表达构建体，其包含至少两个表达盒，所述表达盒具有在5’-3’方向上包含如下的结构
a1)在植物中具有功能的第一个启动子序列，和
b1)与所述启动子a1)有效连接的待表达的第一个目的核酸序列，和
c)选自以下的至少一个序列：
i)SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107和108描述的序列，和
II)与SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107或108描述的序列具有至少60％、优选80％、更优选90％、最优选95％的同源性的序列，所述序列能在植物细胞或生物中终止转录，和
iii)在低严格条件下、优选在高严格条件下与SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107或108描述的序列杂交的序列，所述序列能够在植物细胞或生物中终止转录，和
iv) i)、ii)和iii)中所述序列的至少50个连续碱基对、优选至少100个连续碱基对、更优选至少250个连续碱基对、最优选至少500个连续碱基对的片段，
和
b2)待表达的第二个目的核酸序列，和
a2)在植物中具有功能的第二个启动子序列，其与所述目的核酸序列b2)有效连接，
其中所述序列c)与选自启动子a1)、启动子a2)、目的核酸b1)和目的核酸b2)的至少一种元件异源，并介导从所述启动子a1)和a2)诱导的表达的终止。
21.选自：
i)SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107和108描述的序列，和
ii)与SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107或108描述的序列具有至少60％、优选80％、更优选90％、最优选95％的同源性的序列，该序列能够在植物细胞或生物中终止转录，和
iii)在低严格条件下、优选在高严格条件下与SEQ ID NO：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、92、93、107或108描述的序列杂交的序列，该序列能够在植物细胞或生物中终止转录，和iv) i)、ii)和iii)中所述序列的至少50个连续碱基对、优选至少100个连续碱基对、更优选至少250个连续碱基对、最优选至少500个连续碱基对的片段，
组成的组的序列作为转录终止子和/或隔离子的用途。
CN2005800260493A 2004-08-02 2005-07-30 分离转录终止序列的方法 Expired - Fee Related CN101001951B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US59800104P 2004-08-02 2004-08-02
US60/598,001 2004-08-02
US69620905P 2005-07-01 2005-07-01
US60/696,209 2005-07-01
PCT/EP2005/008285 WO2006013072A2 (en) 2004-08-02 2005-07-30 Method for isolation of transcription termination sequences

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101001951A true CN101001951A (zh) 2007-07-18
CN101001951B CN101001951B (zh) 2011-06-15

Family

ID=35058842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800260493A Expired - Fee Related CN101001951B (zh) 2004-08-02 2005-07-30 分离转录终止序列的方法

Country Status (6)

Country Link
US (3) US8465915B2 (zh)
EP (4) EP1781784A2 (zh)
CN (1) CN101001951B (zh)
AU (3) AU2005268917B2 (zh)
CA (2) CA2573986C (zh)
WO (1) WO2006013072A2 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104135851A (zh) * 2011-12-30 2014-11-05 陶氏益农公司 合成的双向植物启动子ubi1的构建体和方法
CN106906214A (zh) * 2011-07-15 2017-06-30 纳幕尔杜邦公司 新型植物终止子序列
CN107604043A (zh) * 2017-08-04 2018-01-19 南方科技大学 基因组隔离子的高通量鉴定方法
CN108823228A (zh) * 2018-03-21 2018-11-16 安徽朵能生物科技有限公司 高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用
CN109385410A (zh) * 2018-09-13 2019-02-26 华中科技大学 海洋噬箘体Syn5的RNA聚合酶终止序列及其鉴定方法与应用

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060168677A1 (en) * 2005-01-24 2006-07-27 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Min. Of Agriculture & Agri-Food Transcriptional termination of transgene expression using host genomic terminators
WO2013017982A1 (en) * 2011-08-01 2013-02-07 Basf Plant Science Company Gmbh Method for identification and isolation of terminator sequences causing enhanced transcription
US9441238B2 (en) 2012-04-27 2016-09-13 Synthetic Genomics, Inc. Compositions and methods for modulating the sensitivity of cells to AHAS inhibitors
CA2886051A1 (en) * 2012-06-04 2013-12-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sb-actin terminator sequence for gene expression in plants
BR102014021335A2 (pt) 2013-08-30 2015-09-22 Dow Agrosciences Llc construtos para expressão de transgenes usando elementos reguladores de genes de ubiquitina de setaria
TW201527313A (zh) * 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（二）
US9951344B2 (en) * 2014-10-10 2018-04-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Exogenous terminators for controlling fungal gene expression
US20220195450A1 (en) * 2019-05-29 2022-06-23 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for generating dominant short stature alleles using genome editing
CN111139257B (zh) * 2020-01-15 2022-10-14 南京农业大学 一种梨pmei蛋白体外表达的方法及其应用

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US539936A (en) 1895-05-28 Twist lace machine
DK368882A (da) 1981-08-25 1983-02-26 Alan John Kingsman Expessions vektorer
US4486533A (en) 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US4977092A (en) 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
EP0131623B2 (en) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
US5139936A (en) 1983-02-28 1992-08-18 Collaborative Research, Inc. Use of the GAL1 yeast promoter
US4661454A (en) 1983-02-28 1987-04-28 Collaborative Research, Inc. GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
ATE54167T1 (de) 1984-12-06 1990-07-15 Fina Research Promotoren fuer die expression von fremden genen in hefe, plasmide, die diese promotoren enthalten, sowie deren verwendung zur herstellung von polypeptiden.
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
US5180873A (en) 1985-04-16 1993-01-19 Dna Plant Technology Corporation Transformation of plants to introduce closely linked markers
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
US4975374A (en) 1986-03-18 1990-12-04 The General Hospital Corporation Expression of wild type and mutant glutamine synthetase in foreign hosts
GB8611832D0 (en) 1986-05-15 1986-06-25 Holland I B Polypeptide
WO1987007299A1 (en) 1986-05-29 1987-12-03 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
JPS62291904A (ja) 1986-06-12 1987-12-18 Namiki Precision Jewel Co Ltd 永久磁石の製造方法
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
MC2115A1 (fr) 1987-12-15 1991-07-05 Gene Shears Pty Ltd Ribozynes
WO1989005859A1 (en) 1987-12-21 1989-06-29 The Upjohn Company Agrobacterium mediated transformation of germinating plant seeds
US5614395A (en) 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
EP0333033A1 (en) 1988-03-09 1989-09-20 Meiji Seika Kaisha Ltd. Glutamine synthesis gene and glutamine synthetase
NZ228320A (en) 1988-03-29 1991-06-25 Du Pont Nucleic acid promoter fragments of the promoter region homologous to the em gene of wheat, dna constructs therefrom and plants thereof
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
US5162228A (en) 1988-12-28 1992-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter
JP3046063B2 (ja) 1989-03-17 2000-05-29 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 遺伝子の発現の外部の調節
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
EP0485506B1 (en) 1989-08-09 1997-11-12 DeKalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile maize plants and cells thereof
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
GB9005772D0 (en) 1990-03-14 1990-05-09 Cambridge Advanced Tech Plant promoter
CA2058756A1 (en) 1990-03-16 1991-09-17 Vic. C. Knauf Sequences preferentially expressed in early seed development and methods related thereto
NL9000773A (nl) 1990-04-02 1991-11-01 Rijkslandbouwhogeschool Werkwijze voor het beschermen van planten tegen pathogenen.
US5168064A (en) * 1990-04-20 1992-12-01 The Regents Of The University Of California Endo-1,4-β-glucanase gene and its use in plants
JPH06501380A (ja) 1990-07-20 1994-02-17 パイオニア　ハイ―ブレッド　インターナショナル，インコーポレイテッド 二元性潜在性細胞毒性法によるハイブリッド種子の産生方法
US5254801A (en) 1990-12-03 1993-10-19 Monsanto Company Heterologous dominant conditional lethal gene which is a phosphonate monoester hydrolase and use thereof in plants
AU665178B2 (en) * 1990-12-21 1995-12-21 University Of Guelph Diagnosis for porcine malignant hyperthermia
HUT66106A (en) 1991-06-10 1994-09-28 Richardson Vicks Inc Denture stabilizing compositions having improved hold
GB9114259D0 (en) 1991-07-02 1991-08-21 Ici Plc Plant derived enzyme and dna sequences
US5358866A (en) 1991-07-03 1994-10-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cytosine deaminase negative selection system for gene transfer techniques and therapies
DK152291D0 (da) 1991-08-28 1991-08-28 Danisco Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
US5298418A (en) 1991-09-16 1994-03-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Cell line isolated from larval midgut tissue of Trichoplusia ni
IL101119A0 (en) 1992-03-03 1992-11-15 Univ Ramot Transgenic wheat
EP0637339B1 (en) 1992-04-13 2001-10-31 Syngenta Limited Dna constructs and plants incorporating them
WO1994000583A1 (en) 1992-06-23 1994-01-06 South Dakota State University Transformation of plants by direct injection of dna
US5591616A (en) 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons
US5334575A (en) 1992-12-17 1994-08-02 Eastman Kodak Company Dye-containing beads for laser-induced thermal dye transfer
US5470353A (en) 1993-10-20 1995-11-28 Hollister Incorporated Post-operative thermal blanket
AU674815B2 (en) 1994-01-21 1997-01-09 Powderject Vaccines, Inc. Gas driven gene delivery instrument
FR2724183B1 (fr) * 1994-09-02 1997-04-11 Pasteur Institut Vecteurs de criblage et/ou d'expression fonctionnels chez les mycobacteries - utilisation pour l'identification et l'expression de polypeptides exportes
AUPN328595A0 (en) * 1995-05-31 1995-06-22 Queensland University Of Technology Intergenic regions of banana bunchy top virus
CA2226463A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Life Technologies, Inc. Recombinational cloning using engineered recombination sites
WO1997017450A2 (en) 1995-11-09 1997-05-15 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in pichia methanolica
US5716808A (en) 1995-11-09 1998-02-10 Zymogenetics, Inc. Genetic engineering of pichia methanolica
AR006928A1 (es) 1996-05-01 1999-09-29 Pioneer Hi Bred Int Una molecula de adn aislada que codifica una proteina fluorescente verde como marcador rastreable para la transformacion de plantas, un metodo para laproduccion de plantas transgenicas, un vector de expresion, una planta transgenica y celulas de dichas plantas.
DE19619353A1 (de) 1996-05-14 1997-11-20 Bosch Gmbh Robert Verfahren zur Herstellung eines integriert optischen Wellenleiterbauteiles sowie Anordnung
EA199800212A1 (ru) 1996-06-21 1998-10-29 Монсанто Компани Способы получения устойчивотрансформируемой высокопродуктивной пшеницы посредством трансформации, опосредованной agrobacterium, и комбинации, получаемые ими
DE19626564A1 (de) 1996-07-03 1998-01-08 Hoechst Ag Genetische Transformation von Ciliatenzellen durch Microcarrier-Bombardement mit DNA beladenen Goldpartikeln
US5736383A (en) 1996-08-26 1998-04-07 Zymogenetics, Inc. Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants
AU708572B2 (en) 1996-07-17 1999-08-05 Zymogenetics Inc. Preparation of (pichia methanolica) auxotrophic mutants
AU718510B2 (en) 1996-07-17 2000-04-13 Zymogenetics Inc. Transformation of pichia methanolica
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
EP0870836A1 (de) 1997-04-09 1998-10-14 IPK Gatersleben 2-Desoxyglucose-6-Phosphat (2-DOG-6-P) Phosphatase DNA-Sequenzen als Selektionsmarker in Pflanzen
WO1999003261A1 (de) 1997-07-07 1999-01-21 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Vorrichtung und verfahren zum erfassen eines optischen signals
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
CN1202246C (zh) 1998-04-08 2005-05-18 联邦科学和工业研究组织 获得修饰表型的方法和措施
EP1117812B1 (en) * 1998-10-02 2006-11-15 Sumitomo Chemical Company, Limited Plant promoters and plant terminators
DE19852195C2 (de) 1998-11-04 2000-11-02 Inst Pflanzengenetik & Kultur Neue Expressionskassette zur Expression von beliebigen Genen in Pflanzensamen
EP1147204A1 (en) 1999-01-28 2001-10-24 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
WO2000049035A1 (en) 1999-02-19 2000-08-24 The General Hospital Corporation Gene silencing
US7285705B1 (en) 1999-04-19 2007-10-23 Biogemma S.A.S. Plant transformation method
WO2000063364A2 (en) 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
US7868149B2 (en) * 1999-07-20 2011-01-11 Monsanto Technology Llc Plant genome sequence and uses thereof
PL351385A1 (en) 1999-05-10 2003-04-07 Syngenta Participations Ag Regulation of viral gene expression
ES1045191Y (es) 2000-01-28 2001-06-01 Mundoforma Construcciones Modu Caseta modular perfeccionada.
AR044724A1 (es) * 2000-03-27 2005-10-05 Syngenta Participations Ag Promotores del virus de la rizadura amarilla del cestrum
US20070016976A1 (en) * 2000-06-23 2007-01-18 Fumiaki Katagiri Plant genes involved in defense against pathogens
AU7752001A (en) 2000-06-28 2002-01-08 Sungene Gmbh And Co Kgaa Binary vectors for improved transformation of plant systems
WO2003052104A1 (en) 2001-12-14 2003-06-26 Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin A reporter gene
GB0201043D0 (en) 2002-01-17 2002-03-06 Swetree Genomics Ab Plants methods and means
DE10212892A1 (de) 2002-03-20 2003-10-09 Basf Plant Science Gmbh Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression
DE102004044317A1 (de) 2004-05-11 2005-12-08 Koenig & Bauer Ag Falzaufbau sowie Verfahren zur Weiterverarbeitung einer Bahn

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106906214A (zh) * 2011-07-15 2017-06-30 纳幕尔杜邦公司 新型植物终止子序列
CN107881193A (zh) * 2011-07-15 2018-04-06 纳幕尔杜邦公司 新型植物终止子序列
CN106906214B (zh) * 2011-07-15 2021-04-02 纳幕尔杜邦公司 新型植物终止子序列
CN112961881A (zh) * 2011-07-15 2021-06-15 纳幕尔杜邦公司 新型植物终止子序列
CN104135851A (zh) * 2011-12-30 2014-11-05 陶氏益农公司 合成的双向植物启动子ubi1的构建体和方法
US9422569B2 (en) 2011-12-30 2016-08-23 Dow Agrosciences Llc Construct and method for synthetic bidirectional plant promoter UBI1
CN107604043A (zh) * 2017-08-04 2018-01-19 南方科技大学 基因组隔离子的高通量鉴定方法
CN107604043B (zh) * 2017-08-04 2019-04-16 南方科技大学 基因组隔离子的高通量鉴定方法
CN108823228A (zh) * 2018-03-21 2018-11-16 安徽朵能生物科技有限公司 高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用
CN108823228B (zh) * 2018-03-21 2021-08-13 安徽朵能生物科技有限公司 高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用
CN109385410A (zh) * 2018-09-13 2019-02-26 华中科技大学 海洋噬箘体Syn5的RNA聚合酶终止序列及其鉴定方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2005268917A1 (en) 2006-02-09
US20070243543A1 (en) 2007-10-18
EP2166104A1 (en) 2010-03-24
AU2010210009B2 (en) 2011-09-15
US9133466B2 (en) 2015-09-15
EP2166103A1 (en) 2010-03-24
AU2005268917B2 (en) 2010-05-20
CA2834275A1 (en) 2006-02-09
WO2006013072A3 (en) 2006-08-03
EP2163635B1 (en) 2013-05-22
CA2573986C (en) 2013-11-26
CA2573986A1 (en) 2006-02-09
WO2006013072A2 (en) 2006-02-09
US8465915B2 (en) 2013-06-18
US20150368663A1 (en) 2015-12-24
EP2163635A1 (en) 2010-03-17
AU2010210007B2 (en) 2012-04-19
CN101001951B (zh) 2011-06-15
AU2010210007A1 (en) 2010-09-02
EP1781784A2 (en) 2007-05-09
EP2166104B1 (en) 2013-06-12
US20130236954A1 (en) 2013-09-12
AU2010210009A1 (en) 2010-09-02
EP2166103B1 (en) 2013-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101001951B (zh) 分离转录终止序列的方法
KR20210149060A (ko) Tn7-유사 트랜스포존을 사용한 rna-유도된 dna 통합
CN101939434B (zh) 用于在大豆中提高种子贮藏油脂的生成和改变脂肪酸谱的来自解脂耶氏酵母的dgat基因
CA2763792C (en) Expression cassettes derived from maize
CN1981039A (zh) 组装多表达构建体的方法
DK2663645T3 (da) Gærstammer, der er modificeret til produktion af ethanol fra glycerol
CN109207387B (zh) 用于产生胶原的酵母菌株和方法
CN109563505A (zh) 用于真核细胞的组装系统
KR20210044795A (ko) 고 처리량 대사 공학에서 CRISPRi의 응용
KR20140092759A (ko) 숙주 세포 및 아이소부탄올의 제조 방법
CN110551713A (zh) 用于修饰梭状芽孢杆菌属细菌的优化的遗传工具
CN101815432A (zh) 涉及编码核苷二磷酸激酶(ndk)多肽及其同源物的基因的用于修改植物根构造的方法
BRPI0806354A2 (pt) plantas oleaginosas transgências, sementes, óleos, produtos alimentìcios ou análogos a alimento, produtos alimentìcios medicinais ou análogos alimentìcios medicinais, produtos farmacêuticos, bebidas fórmulas para bebês, suplementos nutricionais, rações para animais domésticos, alimentos para aquacultura, rações animais, produtos de sementes inteiras, produtos de óleos misturados, produtos, subprodutos e subprodutos parcialmente processados
EP3145949A1 (en) Lentiviral vectors
CN101827938A (zh) 涉及rt1基因、相关的构建体和方法的具有改变的根构造的植物
KR20140099224A (ko) 케토-아이소발레레이트 데카르복실라제 효소 및 이의 이용 방법
CN106906175A (zh) 用于生产尸胺的方法和重组微生物
KR20110076868A (ko) 분리 조건 및/또는 안전한 작업 범위 하에서의 ｃ5 탄화수소가 없는 이소프렌의 제조 방법 및 조성물
KR20130132405A (ko) 형질전환 빈도를 증가시키기 위해 변형된 아그로박테리움 균주
KR20190116282A (ko) 복수의 숙주를 위한 다중 dna 구조체의 조립 및 편집을 위한 모듈식 범용 플라스미드 디자인 전략
KR20120099509A (ko) 재조합 숙주 세포에서 육탄당 키나아제의 발현
CN109468339A (zh) 用于增强植物中组成型基因表达的调节性核酸分子
PT1984512T (pt) Sistema de expressão génica utilizando excisão-união em insetos
CN113621642A (zh) 一种用于农作物杂交育种制种的遗传智能化育制种系统及其应用
CN101918560B (zh) 在氮限制条件下具有改变的农学特性的植物以及涉及编码lnt2多肽及其同源物的基因的相关构建体和方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20110615

Termination date: 20160730

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee