CN104135851A - 合成的双向植物启动子ubi1的构建体和方法 - Google Patents

合成的双向植物启动子ubi1的构建体和方法 Download PDF

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Abstract

提供用于在植物细胞和/或植物组织中表达多个基因的构建体和方法。提供的构建体包含连接于多个基因表达盒的至少一个双向启动子。在一些实施方案中，提供的构建体和方法采用基于来自玉蜀黍泛素-1基因的最小核心启动子元件的双向启动子或其功能等同物。在一些实施方案中，提供的构建体和方法允许3至20个基因的表达。

Description

合成的双向植物启动子UBI1的构建体和方法
优先权要求
本申请要求2011年12月30日提交的美国临时专利申请流水号61/582,138的申请日的权益。本申请还要求2012年3月29日提交的美国临时专利申请流水号61/617,252的申请日的权益。
技术领域
本申请一般涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及多个基因在转基因植物中稳定表达的领域。
发明背景
许多植物物种可以用来自其他物种的转基因转化以引入农学上期望的性状或特征，例如改善营养价值品质、提高产率、赋予害虫或疾病抗性、提高干旱和应激耐受性、改善园艺质量(如着色和生长)、给予除草剂抗性、使得能够从植物产生工业上有用的化合物和/或材料、和/或使得能产生药物。将转基因导入到植物细胞、随后复原含有稳定整合的转基因拷贝的可育转基因植物的做法，可以用来产生拥有期望性状的转基因植物。
基因表达的控制和调节的运行机制众多。基因的转录启动是基因表达的主要控制机制。转录的启动一般由位于所转录基因的5’侧翼或上游区中的多核苷酸序列控制。这些序列统称为启动子。启动子通常含有用于使RNA聚合酶开始转录的信号，使得能够产生信使RNA(mRNA)。成熟的mRNA被核糖体翻译，由此合成蛋白质。DNA结合蛋白与启动子DNA序列特异性相互作用以促进转录复合物的形成并启动基因表达过程。有多种从植物分离并得以表征的真核生物启动子，其对于驱动植物中的转基因表达是有功能的。已分离和表征了应答环境刺激、营养可用性、和包括热休克、厌氧生活或存在重金属在内的不利条件而影响基因表达的启动子。还有在发育期间或以组织或器官特异性方式控制基因表达的启动子。另外，已从细菌和病毒分离和表征了原核生物启动子，这些分离的原核生物启动子对于驱动植物中的转基因表达有功能。
典型的真核生物启动子由最小启动子和其他顺式元件组成。最小启动子实质上是一个TATA框区，RNA聚合酶II(polII)、TATA结合蛋白(TBP)和TBP相关因子(TAF)可在此结合而启动转录。然而，在大多数情况下，准确的转录需要TATA基序以外的序列元件。已发现这类序列元件(例如增强子)提高临近的基因的总体表达水平，且往往是以不依赖位置和/或取向的方式。在一些polII基因的转录起始位点附近的其他序列(例如INR序列)可以为其他促进转录活化的因子提供可变剪接位点，在缺少功能性TATA元件的启动子中，其甚至可替代地提供转录的核心启动子结合位点。参见例如，Zenzie-Gregory等(1992)J.Biol.Chem.267:2823-30。
其他基因调控元件包括与特定DNA结合因子相互作用的序列。这些序列基序有时称为顺式元件，且通常是位置和取向依赖性的，尽管它们可见于基因编码序列的5’或3’侧或内含子中。这类顺式元件，组织特异性或发育特异性转录因子结合的单独或组合地与它们结合，可以决定启动子在转录水平上的时空表达模式。上游顺式元件后随最小启动子的排列方式通常会产生具体启动子的极性。已克隆并广泛用于基础研究和生物技术应用的植物中的启动子一般是单向的，仅指导融合于其3’端(即下游)的一个基因。参见例如，Xie等(2001)Nat.Biotechnol.19(7):677-9；美国专利No.6,388,170。
在植物启动子中已鉴定出许多顺式元件(或“上游调节序列”)。这些顺式元件施加于与其可操作连接的基因的控制有很大不同。一些元件作用于提高可操作连接的基因应答环境响应(例如温度、湿度和创伤)的转录。其他顺式元件可能对发育线索(developmental cue)(例如萌发、种子成熟和开花)或空间信息(流例如组织特异性)应答。参见例如，Langridge等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3219-23。特定启动子元件的控制类型通常是启动子的内在性质；即，在这类启动子控制下的异源基因很可能依照该启动子元件所来源的天然基因的控制来表达。这些元件通常还可与其他元件交换并维持其对基因表达的特征性内在调控。
为了代谢工程和性状叠加的目的，经常需要将多个基因导入植物中，这些基因经常由相同的或同源的启动子调控。然而，当多个导入的转基因具有同源启动子来驱动它们时，很可能发生基于同源性的基因沉默(HBGS)。参见例如，Mol等(1989)Plant Mol.Biol.13:287-94。已报告HBGS在转基因植物中大量发生。参见例如，Vaucheret和Fagard(2001)Trends Genet.17:29-35。提出了几种机制来解释HBGS现象，其均包括以下特征，即启动子中的序列同源性触发导致重复基因沉默的细胞识别机制。参见例如，Matzke和Matzke(1995)Plant Physiol.107:679-85；Meyer和Saedler(1996)Ann.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.47:23-48；Fire(1999)Trends Genet.15:358-63；Hamilton和Baulcombe(1999)Science 286:950-2；和Steimer等(2000)Plant Cell12:1165-78。
避免转基因植物中HBGS的策略经常涉及开发功能等同但具有最小序列同源性的合成启动子。当将这类合成启动子用于在作物植物中表达转基因时，它们可以有助于避免或减少HBGS。参见例如，Mourrain等(2007)Planta225(2):365-79；Bhullar等(2003)Plant Physiol.132:988-98。这类启动子可通过在新的或合成的DNA区段中导入已知的顺式元件，或者通过“域交换”(其中一个启动子的域被来自其他异源启动子的功能等同域替换)来生成。
如此，仍然需要这样的构建体和方法，其可有效地用于多个转基因的稳定表达，且转基因植物中转基因通过育种或多个世代而发生重组或丧失的风险最小。
发明概述
本文中描述了用于将Ubi1极性启动子转化成合成的双向启动子，使得一个合成启动子能指导该启动子侧翼的两个基因表达的方法。在一些实施方案中，用于将Ubi1极性启动子转化成合成的双向启动子的方法可以包括，例如而不限于：鉴定Ubi1启动子的最小启动子元件核苷酸序列；和/或提供包含以相反方向取向的两个最小Ubi1启动子元件核苷酸序列的核酸。在具体的实施方案中，该核酸可以包含以相反方向取向的两个最小Ubi1启动子元件核苷酸序列，使得每个最小启动子元件的最接近相应的天然Ubi1基因的末端(the endof each minimal promoter element that is closest to the corresponding native Ubigene)相距另一个最小启动子元件比该核酸的最接近与该启动子元件可操作连接的编码序列的末端(an end of the nucleic acid that is proximate to a codingsequence operably linked to the promoter element)更远。在一些例子中，所述最小Ubi1启动子元件是从玉米分离的。其他可通过工程化引入合成的双向启动子中的天然Ubi1启动子元件包括Ubi1内含子、Ubi1外显子、和/或所有或部分的Ubi1上游启动子区。在一些例子中，合成的双向启动子可以包含多于一个前文中的任意者。
本文中还描述了在构建合成的启动子(例如合成的双向启动子)中可以有用的Ubi1最小启动子，和通过前述方法产生的具体的合成启动子。在一些实施方案中，合成的双向启动子是能控制可操作连接的核苷酸序列在植物细胞中转录的启动子。例如，合成的双向启动子在一些实施方案中可以能控制启动子侧翼的两个可操作连接的核苷酸序列在植物细胞中的转录。
本发明的具体实施方案包括包含Ubi1最小启动子或其功能等同物的细胞(例如植物细胞)。例如，特定的实施方案包括包含合成的启动子(例如合成的双向启动子)的细胞，所述合成的启动子包含Ubi1最小启动子或其功能等同物。依照具体实施方案的植物细胞可以存在于细胞培养物、组织、植物部分和/或全植物中。因此，一些实施方案包括这样的植物(例如单子叶或双子叶植物)，其包含具有Ubi1最小启动子或其功能等同物的细胞。
本发明的一些实施方案包括用于以方向独立性方式启动转录的手段。用于以方向独立性方式启动转录的手段包括SEQ ID NO:1的Ubi1最小启动子。本发明的一些实施方案包括用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的手段。用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的手段包括SEQID NO:5的合成的双向Ubi1启动子。
从参照所附附图进行的对几个实施方案的以下详细描述，前述内容和其他特征将变得更为明显的。
还提供用于在植物细胞和/或组织中表达多个基因的构建体和方法。提供的构建体包含连接于多个基因表达盒的至少一个双向启动子。在一些实施方案中，提供的构建体和方法采用基于来自玉蜀黍(Zea mays)泛素-1(Ubiquitin-1)基因的最小核心启动子元件的双向启动子或其功能等同物。在一些实施方案中，提供的构建体和方法允许3至20个基因的表达。
在一个方面，提供一种合成的多核苷酸，其包含来自玉蜀黍或大刍草(Zea luxurians)的泛素-1基因的最小核心启动子元件。在一个实施方案中，所述最小核心启动子元件包含与SEQ ID NO:1或其互补物至少65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或100％等同的多核苷酸序列。在一个另外的或备选的实施方案中，所述最小核心启动子元件包含选自下组的多核苷酸序列：SEQ IDNO:1和15-39。在一个别的实施方案中，所述最小核心启动子元件包含SEQID NO:1或其互补物。在一个进一步的实施方案中，所述最小核心启动子元件基本由SEQ ID NO:1或其互补物组成。在另一个实施方案中，所述合成的多核苷酸还包含来自泛素-1基因的外显子和来自泛素-1基因的内含子。在一个进一步的实施方案中，所述外显子或内含子来自玉蜀黍或大刍草的泛素-1基因。
在另一个实施方案中，所述合成的多核苷酸还包含来自泛素-1基因的上游调控序列。在一个别的实施方案中，其中所述上游调控序列包含与SEQ IDNO:4或其互补物至少65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或100％相同的多核苷酸序列。在一个进一步的实施方案中，其中所述上游调控序列包含SEQID NO:4或其互补物。在一个进一步的实施方案中，其中所述上游调控序列基本由SEQ ID NO:4或其互补物组成。
在另一个实施方案中，合成的多核苷酸还包含至少一种选自包含以下项的列表的元件：上游调控序列(URS)、增强子元件、外显子、内含子、转录起始位点、TATA框、和热休克共有元件。在另一个实施方案中，合成的多核苷酸还包含可操作连接于最小核心启动子元件的目的核苷酸序列。在另一个实施方案中，合成的多核苷酸还包含选自下组的元件：上游调控序列(URS)、增强子元件、外显子、内含子、转录起始位点、TATA框、热休克共有元件、及其组合。在另一个实施方案中，合成的多核苷酸还包含可操作连接于最小核心启动子元件的目的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，合成的多核苷酸还包含来自玉蜀黍或大刍草的第二最小核心启动子元件，其中所述两个最小核心启动子元件相对于彼此在所述多核苷酸中处于反向互补的取向。在一个进一步的或备选的实施方案中，合成的多核苷酸还包含来自泛素-1基因的外显子和来自泛素-1基因的内含子。在一个别的实施方案中，合成的多核苷酸包含与SEQ ID NO:3或其互补物至少65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或100％相同的多核苷酸序列。在一个进一步的实施方案中，合成的多核苷酸包含SEQ ID NO:3或其互补物。在一个进一步的实施方案中，合成的多核苷酸基本由SEQ ID NO:3或其互补物组成。
在一个进一步的或备选的实施方案中，合成的多核苷酸还包含来自泛素-1基因的上游调控序列。在一个别的实施方案中，其中所述上游调控序列包含与SEQ ID NO:4或其互补物至少65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或100％相同的多核苷酸序列。在一个进一步的实施方案中，上游调控序列包含SEQ ID NO:4或其互补物。在一个进一步的实施方案中，上游调控序列基本由SEQ ID NO:4或其互补物组成。
在另一个实施方案中，包含两个最小核心启动子元件的合成的多核苷酸还包含至少一种选自包含以下项的列表的元件：上游调控序列(URS)、外显子、内含子、转录起始位点、TATA框、热休克共有元件、和翻译起始和/或终止核苷酸序列。在一个进一步的或备选的实施方案中，包含两个最小核心启动子元件的合成的多核苷酸还包含选自下组的元件：上游调控序列(URS)、外显子、内含子、转录起始位点、TATA框、热休克共有元件、翻译起始和/或终止核苷酸序列、及其组合。在一个进一步的实施方案中，合成的多核苷酸包含SEQ ID NO:5或其互补物。在一个进一步的实施方案中，合成的多核苷酸基本由SEQ ID NO:5或其互补物组成。
在另一个实施方案中，包含两个最小核心启动子元件的合成的多核苷酸包含第一目的核苷酸序列，该第一目的核苷酸序列可操作地连接于最小核心启动子元件中的一个。在一个进一步的实施方案中，合成的多核苷酸包含第二目的核苷酸序列，该第二目的核苷酸序列可操作地连接于未与所述与第一目的核苷酸序列可操作连接的那个最小核心启动子元件。
在提供的合成多核苷酸的一个实施方案中，所述外显子来自玉蜀黍属的种的泛素-1基因。在提供的合成多核苷酸的一个实施方案中，所述外显子来自玉蜀黍或大刍草的泛素-1基因。在另一个实施方案中，所述内含子来自玉蜀黍属的种的泛素-1基因。在另一个实施方案中，所述内含子来自玉蜀黍或大刍草的泛素-1基因。在一个进一步的或备选的实施方案中，所述玉蜀黍属的种是玉蜀黍。在另一个实施方案中，所述玉蜀黍属的种是大刍草。
在另一个方面，提供一种用于产生转基因细胞的方法。所述方法包括用本文中描述的合成多核苷酸来转化细胞。在一个实施方案中，所述细胞是植物细胞。在另一个方面，提供包含本文中描述的合成多核苷酸的植物细胞。在另一个方面，提供包含包括本文中描述的合成多核苷酸的植物细胞的植物。
在另一个方面，提供一种用于在植物细胞中表达目的核苷酸序列的方法。所述方法包括将目的核苷酸序列导入植物细胞，所述目的核苷酸序列可操作地连接于用于启动以方向独立性方式转录的手段。在另一个方面，提供一种用于在植物细胞中表达目的核苷酸序列的方法。所述方法包括将目的核苷酸序列导入植物细胞，所述目的核苷酸序列可操作地连接于用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的手段。在一个进一步的实施方案中，所述方法包括将包含以下序列的核酸导入植物细胞：(a)目的核苷酸序列，其可操作地连接于用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的手段；和(b)第二目的核苷酸序列，其可操作地连接于用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的手段。
在一个进一步或备选的实施方案中，所述用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的手段包含SEQ ID NO:5或其互补物。在一个进一步或备选的实施方案中，所述用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的手段包含SEQ ID NO:5。在另一个实施方案中，所述用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的手段包含SEQ ID NO:5的互补物。在另一个实施方案中，将所述核酸导入植物细胞从而将目的核苷酸序列靶定到植物细胞DNA中的预确定位点，所述目的核苷酸序列可操作地连接于用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的手段。在一个进一步的或备选的实施方案中，利用锌指核酸酶介导的重组将所述目的核苷酸序列靶定到预确定的位点，所述目的核苷酸序列可操作地连接于用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的手段。
在另一个方面，提供用于在植物细胞和/或组织中表达多个基因的核酸构建体。所述核酸构建体包含(a)一种双向启动子；和(b)在双向启动子相反端的两个基因表达盒；其中至少一个基因表达盒包含经由翻译开关(switch)连接的两个或更多个基因。
在一个实施方案中，所述核酸构建体不包含病毒序列。在另一个实施方案中，所述双向启动子不包含病毒序列。在另一个实施方案中，所述双向启动子包含至少一个增强子。在另一个实施方案中，所述双向启动子不包含增强子。在另一个实施方案中，所述核酸构建体包含用于土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化的双元载体。
在一个实施方案中，所述双向启动子包含选自下组的元件：顺式元件或上游调控序列(URS)、增强子元件、外显子、内含子、转录起始位点、TATA框、热休克共有元件、及其组合。在一个进一步的或备选的实施方案中，所述双向启动子包含来自泛素基因的上游调控序列(URS)。在一个进一步的实施方案中，所述双向启动子包含(i)不同于泛素基因启动子的启动子，和(ii)来自泛素基因的上游调控序列(URS)。
在另一个实施方案中，所述双向启动子包含来自玉蜀黍或大刍草的泛素-1基因的最小核心启动子元件。在另一个实施方案中，所述双向启动子还包含来自玉蜀黍或大刍草的第二最小核心启动子元件，其中所述两个最小核心启动子元件相对于彼此处于反向互补的取向。在一个进一步的实施方案中，所述最小核心启动子元件包含与SEQ ID NO:1或其互补物至少65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％或100％相同的多核苷酸序列。在一个进一步的或备选的实施方案中，所述最小核心启动子元件包含选自下组的多核苷酸序列：SEQID NO:1和15-39。在一个进一步的实施方案中，所述最小核心启动子元件包含选自下组的多核苷酸序列：SEQ ID NO:1和15-34。在一个进一步的实施方案中，所述最小核心启动子元件包含选自下组的多核苷酸序列：SEQ ID NO:1和15-29。在一个进一步的实施方案中，所述最小核心启动子元件包含选自下组的多核苷酸序列：SEQ ID NO:1和15-24。在一个进一步的实施方案中，所述最小核心启动子元件包含选自下组的多核苷酸序列：SEQ ID NO:1和15-19。在一个进一步的实施方案中，所述最小核心启动子元件包含SEQ IDNO:1的多核苷酸序列。
在一个进一步的或备选的实施方案中，所述双向启动子包含来自泛素-1基因的外显子和/或来自泛素基因的内含子。在一个进一步的实施方案中，所述双向启动子包含与SEQ ID NO:3或其互补物至少75％,80％,85％,90％,95％或100％相同的多核苷酸序列。在一个进一步的实施方案中，所述双向启动子包含SEQ ID NO:3的多核苷酸或其互补物。在另一个实施方案中，所述双向启动子包含来自醇脱氢酶基因的内含子。在一个实施方案中，所述核酸构建体被稳定地转化入转基因植物中。在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物。在另一个实施方案中，所述植物是双子叶植物。在另一个实施方案中，所述植物不是单子叶植物。在另一个实施方案中，所述植物不是双子叶植物。
在一个进一步的或备选的实施方案中，所述双向启动子包含来自泛素基因的上游调控序列。在一个进一步的实施方案中，所述来自泛素基因的上游调控序列包含与SEQ ID NO:4或其互补物至少75％,80％,85％,90％,95％或100％相同的多核苷酸。在一个进一步的实施方案中，所述来自泛素基因的上游调控序列包含与SEQ ID NO:4的多核苷酸或其互补物。在另一个实施方案中，所述双向启动子包含与SEQ ID NO:5或其互补物至少75％,80％,85％,90％,95％或100％相同的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述双向启动子包含SEQ ID NO:5的多核苷酸或其互补物。
在一个实施方案中，所述两个基因表达盒均包含经由翻译开关连接的两个或更多个基因。在一个进一步的或备选的实施方案中，所述翻译开关选自下组：内部核糖体进入位点(IRES)、可变剪接位点、核酶切割位点、编码2A肽的多核苷酸序列、编码2A样肽的多核苷酸序列、编码蛋白质内含子(intein)的多核苷酸序列、编码蛋白酶切割位点的多核苷酸序列、及其组合。在一个进一步的或备选的实施方案中，所述翻译开关包含顺式作用的水解酶元件(CHYSEL)。在一个进一步的实施方案中，所述CHYSEL是2A或2A样肽序列。在另一个实施方案中，翻译开关上游的基因不包含翻译终止密码子。在另一个实施方案中，所述核酸构建体能使或允许至少4个基因表达。在一个进一步的实施方案中，所有4个基因均为转基因。在另一个实施方案中，所述核酸构建体能使3至20个基因表达。在另一个实施方案中，所述核酸构建体能使4至8个基因表达。在一个进一步的或备选的实施方案中，所述基因是转基因。在另一个实施方案中，至少一个基因表达盒包含编码融合蛋白的多核苷酸序列。在一个进一步的实施方案中，所述融合蛋白包含3至5个基因。
在一些实施方案中，从所述双向启动子的基因表达比单向启动子至少高4倍。在一些实施方案中，从所述双向启动子的基因表达比单向启动子高3至10倍。在一些实施方案中，从所述双向启动子的基因表达比单向启动子高4至8倍。在一些实施方案中，将选择标志置于启动子的远端(即在另一个基因下游的基因表达盒的3’端)。
在另一个方面，提供一种用于生成转基因植物的方法，包括用本文中提供的核酸构建体来转化植物细胞。在另一个方面，提供一种用于生成转基因细胞的方法，包括用本文中提供的核酸构建体来转化细胞。在另一个方面，提供一种植物细胞，其包含本文中提供的核酸构建体。在一个进一步的或备选的实施方案中，所述核酸构建体被稳定地转化入所述植物细胞中。在另一个方面，提供一种转基因植物，其包含本文中提供的核酸构建体。在一个进一步的或备选的实施方案中，所述核酸构建体被稳定地转化入所述转基因植物的细胞中。在另一个方面，提供一种用于在植物细胞和/或组织中表达多个基因的方法，包括将本文中提供的核酸构建体导入所述植物细胞和/或组织中。在一个进一步的或备选的实施方案中，将所述植物细胞和/或组织用本文中提供的核酸构建体稳定转化。在另一个方面，提供一种用于土壤杆菌介导的转化的双元载体。在一个实施方案中，所述双元载体包含本文中提供的核酸构建体。在另一个实施方案中，所述双元载体包含本文中提供的合成的多核苷酸。在另一个方面，提供本文中提供的双向启动子用于植物中多个转基因表达的用途。
附图简述
图1显示例示性(不按比例)玉米Ubi1(ZmUbi1)启动子，其包含位于转录起始位点(TSS)5’的约900bp上游元件。该上游元件含有TATA框(位于TSS的约-30bp)，和两个重叠的热休克共有元件(位于TSS的约-200bp)。该启动子还包含TSS区3’的约1100bp。该3’区含有相邻前导序列(ZmUbi1外显子)和内含子。
图2显示提供的合成Ubi1双向启动子的例示性实施方案，其包含在ZmUbi1启动子上游(以反向互补取向)克隆的minUbi1P最小核心元件。
图3显示yfp和GUS基因表达盒的例示性示意图，其各自可操作地连接于合成的Ubi1双向启动子。
图4显示pDAB105801的代表性质粒图谱。图5显示pDAB108706的代表性质粒图谱。图6显示pDAB101556的代表性质粒图谱。
图7A显示SEQ ID NO:1，其包含玉蜀黍Ubi1最小核心启动子(minUbi1P)的215bp区。图7B显示SEQ ID NO:2，其包含玉蜀黍Ubi1内含子。
图8A显示SEQ ID NO:3，其包含以下多核苷酸的反向互补物，该多核苷酸包含玉蜀黍minUbi1P最小核心启动子(下划线)；玉蜀黍Ubi1前导序列(ZmUbi1外显子；粗字体)；和玉蜀黍Ubi1内含子(小写)。图8B显示SEQ ID NO:4，其包含玉蜀黍Ubi1上游元件的区段，该元件(和/或其反向互补物)可位于有minUbi1P元件临近其5’或3’端的合成的Ubi1启动子中
图9显示SEQ ID NO:5，其包含例示性的合成Ubi1双向启动子，其中第一minUbi1P的反向互补物和第二minUbi1P加下划线。图10显示SEQ ID NO:6，其包含例示性的核酸，包含由合成的Ubi1双向启动子驱动的yfp和GUS基因表达盒。
SEQ ID NO:7包含YFP正向引物：5’-GATGCCTCAG TGGGAAAGG-3’。SEQ ID NO:8包含YFP反向引物：5’-CCATAGGTGA GAGTGGTGAC AA-3’。SEQ ID NO:9包含转化酶正向引物：5’-TGGCGGACGA CGACTTGT-3’。SEQID NO:10包含转化酶反向引物：5’-AAAGTTTGGA GGCTGCCGT-3’。SEQID NO:11包含转化酶探针：5’-CGAGCAGACC GCCGTGTACT TCTACC-3’。SEQ ID NO:12包含AAD1正向引物：5’-TGTTCGGTTC CCTCTACCAA-3’。SEQ ID NO:13包含AAD1反向引物：5’-CAACATCCAT CACCTTGACTGA-3’。SEQ ID NO:14包含AAD1探针：5’-CACAGAACCG TCGCTTCAGCAACA-3’(亦见表7)。
图11显示确认玉米T0植物中由双向玉蜀黍泛素1启动子构建体(pDAB108706)驱动的稳定YFP和GUS表达的代表性Western印迹分析。代表性植物显示由Min-Ubi1P最小核心启动子元件驱动的在叶中的稳定YFP表达。产生的蛋白质量指示为百万分率(ppm)。
图12显示代表性Western印迹分析，其显示来自含有仅驱动YFP表达的ZmUbi1启动子的对照构建体(pDAB101556)的稳定YFP和GUS表达；该构建体中不含GUS编码序列。产生的蛋白质量指示为百万分率(ppm)。
图13A显示4基因盒叠加(stack)的例示性构建体pDAB105843[显示AAD1-2A-YFP(或Phiyfp)加Cry34-2A-Cry35的两个盒]和pDAB105846[显示YFP(或Phiyfp)-2A-AAD1加Cry34-2A-Cry35的两个盒]。深色箭头指示从双向启动子的转录方向。Ubi1-minP包含玉米Ubi1启动子转录起始位点上游200nt序列。Ubi1-URS包含玉米Ubi1启动子上游调控区，其由除200nt最小启动子外的转录起始位点的上游序列组成(显示为箭头)。Ubi1-Int包含玉米Ubi1启动子的内含子。图13B显示来自pDAB108717和pDAB108718的4基因盒叠加的其他例示性双元构建体。
图14显示本文中提供的多基因构建体的例示性示意图。使用一种特殊的符号显示翻译开关。
图15显示质粒pDAB105818和pDAB105748的代表性图谱。
图16显示质粒pDAB105803和pDAB105840的代表性图谱。
图17显示质粒pDAB105841和pDAB105842的代表性图谱。
图18显示质粒pDAB105843和pDAB101917的代表性图谱。
图19显示质粒pDAB108717的代表性图谱。
图20显示质粒pDAB105844和pDAB105845的代表性图谱。
图21显示质粒pDAB105846和pDAB108718的代表性图谱。
图22显示pDAB108717(图22A)和pDAB108718(图22B)的Cry35的例示性蛋白质表达数据。图23显示pDAB108717的基因表达盒的核酸序列，其中示出了每个基因和元件。
图24A-E显示其他最小核心启动子(min-Ubi1P或Ubi1-minP)SEQ ID NO:15-39。
图25显示来自杯水母属(Phialidium)SL-2003种的黄色荧光蛋白的两条例示性序列(Phiyfp，SEQ ID NO:50；和Phiyfpv3，SEQ ID NO:51)。
图26显示提供的合成Ubi1双向启动子和构建体的例示性实施方案，包括pDAB108706(ZMUbi双向(-200))和pDAB108707(ZMUbi双向(-90))。pDAB101556(ZmUbi1-YFP对照)和pDAB108716(ZMUbi1无最小启动子)充当具有单向启动子的对照构建体。
图27A显示来自图26中显示的4种构建体的对于YFP蛋白(LCMS)的例示性表达结果(V6)，以ng/cm2计。图27B显示来自图26中显示的4种构建体的对于YFP RNA的例示性相对表达结果(V6)。
图28A显示来自图26中显示的4种构建体的对于GUS蛋白(LCMS)的例示性表达结果(V6)，以ng/cm2计。图28B显示来自图26中显示的4种构建体的对于GUS RNA的例示性相对表达结果(V6)。
图29A显示来自图26中显示的4种构建体的对于AAD1蛋白(LCMS)的例示性表达结果(V6)，以ng/cm2计。图29B显示来自图26中显示的4种构建体的对于AAD1RNA的例示性相对表达结果(V6)。
图30A显示来自图26中显示的4种构建体的对于YFP蛋白(LCMS)的以ng/cm2计表达结果(V6)的统计学分析。对于pDAB108707、pDAB108706、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为57.63、52.66、49.75和0。图30B显示来自图26中显示的4种构建体的对于YFP RNA的相对表达结果(V6)的统计学分析。对于pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为9.96、8.07、6.95和1.01。
图31A显示来自图26中显示的4种构建体的对于GUS蛋白(LCMS)的以ng/cm2计表达结果(V6)的统计学分析。对于pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为151.27、143.22、0和213.17。图31B显示来自图26中显示的4种构建体的对于GUS RNA的相对表达结果(V6)的统计学分析。对于pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为0.65、0.78、0和3.03。
图32A显示来自图26中显示的4种构建体的对于AAD1蛋白(LCMS)的以ng/cm2计表达结果(V6)的统计学分析。对于pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为710.88、1417.01、856.58和1795.43。图32B显示来自图26中显示的4种构建体的对于AAD1 RNA的相对表达结果(V6)的统计学分析。对于pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为1.33、1.37、1.93和2.93。
图33A、33B和33C分别显示来自图26中显示的4种构建体的对于YFP、AAD1和GUS蛋白(LCMS)以ng/cm2计的例示性表达结果(V10)。
图34A、34B和34C分别显示来自图26中显示的4种构建体的对于YFP、GUS和AAD1蛋白(LCMS)以ng/cm2计表达结果(V10)的统计学分析。对于YFP(图34A)，pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为71.77、81.81、49.58和23.01。对于GUS(图34B)，pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为109.63、98.25、0和138.02。对于AAD1(图34C)，pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为666.11、597.80、715.12和1002.84。
图35A、35B和35C分别显示来自图26中显示的4种构建体的对于YFP、GUS和AAD1蛋白(LCMS)以ng/cm2计的例示性表达结果(R3)。
图36A、36B和36C分别显示来自图26中显示的4种构建体的对于YFP、GUS和AAD1蛋白(LCMS)以ng/cm2计表达结果(R3)的统计学分析。对于YFP(图36A)，pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为91.38、49.49、21.67和0.40。对于GUS(图36B)，pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为5.52、16.81、1.07和46.60。对于AAD1(图36C)，pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为156.71、153.44、165.40和197.80。
图37A显示来自4种构建体pDAB105748(ZMUbi1-YFP)、pDAB105818(ZMUbi1-Cry34/ZMUbi1-Cry35/ZMUbi1-AAD1)、pDAB108717(YFP/AAD-1-ZMUbi1双向-Cry34-Cry35)和pDAB108718(AAD1/YFP-ZMUbi1双向-Cry34-Cry35)的Cry34 RNA的例示性相对表达结果(V6)。图37B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry34蛋白(LCMS)的例示性相对表达结果(V6)。
图38A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的AAD1RNA的例示性相对表达结果(V6)。图38B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的AAD1蛋白(LCMS)的例示性相对表达结果(V6)。
图39A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP RNA的例示性相对表达结果(V6)。图39B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP蛋白(LCMS)的例示性相对表达结果(V6)。
图40A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry35RNA的例示性相对表达结果(V6)。图40B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry35蛋白(ELISA)的例示性相对表达结果(V6)。
图41显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的PAT RNA的例示性相对表达结果(V6)。
图42A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry34RNA的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为0、2.42、2.67和2.25。图42B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry34蛋白的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为0、596.94、2044.73和719.18。
图43A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的AAD1RNA的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为0、1.98、2.68和2.03。图43B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的AAD1蛋白的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为0、2237.54、5763.88和2379.15。
图44A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP RNA的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为3.59、0、2.78和1.95。图44B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP蛋白的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为1420.69、251.68、1154.04和706.04。
图45A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry35RNA的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为0、1.12、3.74和3.20。图45B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry35蛋白的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为0、283.54、635.83和90.97。
图46显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的PAT RNA的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为1.56、0.07、1.46和1.01。
图47A、47B、47C和47D分别显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP、AAD1、Cry34和Cry35的例示性蛋白质表达结果(V10)。
图48A、48B、48C和48D分别显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP、AAD1、Cry34和Cry35的蛋白质表达结果(V10)的统计学分析。对于YFP(图48A)的均值分别为1033.47、27.51、136.18和119.06。对于AAD1(图48B)的均值分别为80.89、1323.80、1544.69和802.50。对于Cry34(图48C)的均值分别为0、246.05、1089.18和769.81。对于Cry35(图48D)的均值分别为0、90.75、106.09和88.80。
图49A、49B、49C和49D分别显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP、AAD1、Cry34和Cry35的例示性蛋白质表达结果(R3)。
图50A、50B、50C和50D分别显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP、AAD1、Cry34和Cry35的蛋白质表达结果(R3)的统计学分析。对于YFP(图50A)的均值分别为2589.63、43.62、1305.27和1727.96。对于AAD1(图50B)的均值分别为244.41、1803.99、1642.44和1279.17。对于Cry34(图50C)的均值分别为422.45、7258.15、9285.74和7544.75。对于Cry35(图50D)的均值分别为0、373.35、441.11和348.45。
图51显示来自pDAB108718和pDAB108717的Cry34、Cry35和AAD1蛋白质表达的Western印迹的例示性结果。
发明详述
转基因产品的开发正变得越来越复杂，需要将多个转基因堆叠(pyramiding)到单个基因座中。传统上，每个转基因的表达通常需要独特的启动子，因此需要多个启动子来表达一个基因叠加内的不同转基因。这不但会增加基因叠加的大小，还常常导致为了获得控制同一性状的不同转基因的相似的表达模式水平而重复使用同一启动子。已知由相同启动子驱动的多基因构建体会导致基因沉默，如此使得转基因产品在本领域中不那么有效。由于启动子重复所致的转录因子(TF)结合位点过量可导致内源TF的耗竭，从而引起转录失活。
提供了方法和构建体，它们将双向启动子系统与启动子一端或两端的双顺反子基因构造相组合，例如通过使用来自明脉扁刺蛾(Thosea asigna)病毒的2A序列。2A蛋白仅16-20个氨基酸长，在多聚蛋白自身的羧基末端切割多聚蛋白。2A或2A样肽的这种“自身切割”或“核糖体跳过(ribosome skip)”特性可用于加工转基因植物中产生的人工多聚蛋白。在一个实施方案中，Cry34和Cry35基因融合在一个基因表达盒中，而YFP(或PhiYFP)和AAD1基因融合在另一个基因表达盒(具有单个开放阅读框(ORF)，其中2A蛋白基因的拷贝被置于每种组合的两个基因之间)中。例如，可将这些基因表达盒(或基因对)中的每一个置于双向启动子的任一端，以使用单个启动子来驱动4个转基因。如此，本文中提供的构建体和方法可用于避免相同启动子的重复使用，并显著降低商品化构建体的大小。另外，用一个启动子驱动4个或更多个基因还提供了共表达控制单一性状的多个基因的能力。
用于基础研究或生物技术应用的植物启动子一般是单向的，仅指导已融合在其3’端(下游)的一个基因。为了代谢工程和性状叠加，经常需要将多个基因导入植物，因此，在将来的转基因作物中通常需要多个启动子来驱动多个基因的表达。期望设计出能节省所用的启动子的数目、且允许同时的受共调节的表达(simultaneous co-regulated expression)用于基因堆叠的策略。在一些实施方案中，提供的双向启动子能驱动多个转录单元，包括RNAi、人工miRNA或发夹-环RNA序列的转录。
减少配置的启动子数的一种办法是使用可以在两个方向驱动转录的关键的转录激活开关。这些启动子称为双向启动子。合成的启动子可设计为限制要用于作物植物中的遗传工程的多个启动子中的同源性水平，其可避免基于同源性的基因沉默。人工设计的双向启动子可以是用于开发转基因植物的有价值的手段。已在一些情况中报告了植物中的启动子双向功能，包括CaMV 35S和甘露碱合酶启动子(mas)启动子。然而，尚未检查使用这类启动子对于基因在两个方向的可预测、稳定和同时表达的适宜性。
用于协调多个基因表达的另一种方法是将单个开放阅读框编码到含有在两个编码序列之间具有自身加工特性的短干预基序的聚蛋白前体中。聚蛋白前体的自身催化加工导致多个独立蛋白质的释放，从而产生其同步化的协调表达。已在植物和动物两种系统中使用了合成的自身水解性的2A肽序列来表达两个转基因。该2A肽序列由几种已知病毒利用且由16-20个氨基酸组成。该2A肽序列共翻译地自身切割(或核糖体跳过)，其通过修改核糖体的活性以允许两蛋白质之间的2A的水解，从而导致两种蛋白质产物的释放。
提供将双向启动子办法与使用干预性合成基序的聚蛋白加工组合的构建体和方法，其中可以容易地实现使用单个启动子的至少4个转基因的表达。已将Cry34和Cry35的基因，以及YFP(或Phiyfp)和AAD1的基因作为基因表达盒或基因对融合到单一开放阅读框(ORF)中，在基因之间置有2A蛋白基因的拷贝。使用单个启动子，可将基因对置于双向启动子的任一端来驱动4个转基因。本文中提供的构建体和/或方法可用于避免同一启动子的重复施用，从而避免潜在的转基因沉默问题。另外，该转基因设计办法能显著地降低含有多个转基因的转基因叠加的大小。使用一个启动子驱动4个或更多个基因还提供共表达控制单一形状的基因的能力，从而确保转基因产物的长期功效。
转基因植物的开发正变得越来越复杂，且通常需要将多个转基因堆叠到单个基因座中。参见Xie等(2001)Nat.Biotechnol.19(7):677-9。由于每个转基因通常需要唯一的启动子用于表达，因此需要多个启动子来表达一个基因叠加内的不同转基因。除了增加基因叠加的大小外，这还通常导致同一启动子的重复使用从而获得不同转基因的相似水平的表达模式。该办法经常是有问题的，因为由同一启动子驱动的多基因表达可能导致基因沉默或HBGS。重复启动子中竞争性转录因子(TF)结合位点的过量可能导致内源性TF的消耗并引起转录下调。转基因的沉默将很可能不想要地影响产生的转基因植物表达转基因的性能。在转基因内的重复序列可能导致基因基因座内同源重组，从而导致多核苷酸重排。
用于基础研究或生物技术应用的植物启动子一般是单向的，且仅调节在其3’端融合(下游)的一个基因。为了产生具有多种期望性状或特征的转基因植物，减少驱动编码期望性状和特征的转基因表达的配置启动子的数目将是有用的。经常需要将多个转基因导入植物用于代谢工程和性状叠加，由此需要多个启动子来驱动多个转基因的表达。通过开发能驱动启动子侧翼的两个转基因表达的单一合成双向启动子，可以减少开发转基因作物所需的启动子的总数，由此减少同一启动子的重复施用，减小转基因构建体的大小，和/或降低HBGS的可能性。
本文中的实施方案利用以下方法，其中利用来自玉米泛素-1基因的单向启动子(例如ZmUbi1)设计合成的双向启动子，使得一个启动子能指导两个基因(在启动子每端各一个)的表达。如本文中利用的方法可以包括从ZmUbi1基因鉴定Ubi1最小核心启动子元件(minUbi1P)，并将该元件工程化到新背景中以构建特定的合成双向启动子。如可通过依照本发明的一些实施方案的方法创建的合成双向启动子可允许本领域技术人员将转基因叠加到植物细胞和植物中，同时减少相同启动子的重复使用，并减小转基因构建体的大小。此外，用单个合成的双向启动子来调节两个基因的表达还提供在相同条件下共表达这两个基因的能力，如例如当两个基因各自有助于宿主中的单一性状时可能有用。在一些情况中已报告了在植物中使用双向启动子，包括CaMV35启动子(Barfield和Pua(1991)Plant Cell Rep.10(6-7):308-14；Xie等(2001))和甘露碱合酶启动子(mas)启动子(Velten等(1984)EMBO J.3(12):2723-30；Langridge等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3219-23)。
植物基因中基因表达的转录启动和调控受共同排列在启动子内的多种DNA序列元件的指导。真核生物启动子的组成为最小核心启动子元件(minP)和其他上游调控序列(URS)。核心启动子元件是足以指导准确的转录启动的连续DNA序列的最小区段。植物中的核心启动子还包含与转录启动有关的规范区，如CAAT和TATA框。TATA框元件通常位于转录启动位点上游的约20至35个核苷酸。
minP的活化依赖于URS，多种蛋白质与之结合并随后与转录启动复合物相互作用。URS包含DNA序列，其确定包含URS的启动子的时空表达模式。启动子的极性经常由minP的取向决定，而URS是双极的(即其功能独立于其取向)。例如，可将CaMV 35S合成单向极性启动子转化为双向启动子，其通过将minP以相反取向融合在启动子的5’端。参见例如，Xie等(2001)Nat.Biotechnol.19(7):677-9。
在表1中列出了公开的某些缩写。
表1.本公开中使用的缩写
短语 缩写
双金鸡纳酸(bicinchoninic acid) BCA
花椰菜镶嵌病毒(cauliflower mosaic virus) CaMV
叶绿体转运肽 CTP
基于同源性的基因沉默 HBGS
ZmUbi1最小核心启动子 minUbi1P
寡聚连接扩增 OLA
磷酸盐缓冲盐水 PBS
含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水 PBST
聚合酶链式反应 PCR
滚环扩增(rolling circle amplification) RCA
逆转录酶PCR RT-PCR
单核苷酸引物延伸 SNuPE
上游调控序列 URS
玉蜀黍泛素-1基因 ZmUbi1
在一些实施方案的特定例子中，将源于玉蜀黍近交系B73的玉米Ubi1(ZmUbi1)启动子的经修饰元件用于工程化合成的双向启动子，其可以在植物中发挥功能以提供就先前可获的双向启动子而言独特的表达控制特征。最初起源于B73的这种ZmUbi1启动子包含位于玉米基因组中转录起始位点5’约899个碱基内还有转录起始位点3’约1093个碱基内的序列。Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18(4):675-89(描述B73ZmUbi1基因)。在一些例子中使用的源自B73的经修饰的ZmUbi1启动子是约2kb启动子，其含有TATA框；两个重叠的热休克共有元件；紧接于转录起始位点的82或83个核苷酸(依赖于参照链)的前导序列，本文中称为ZmUbi1外显子；和1015-1016个核苷酸的内含子(见例如图1)。源自玉蜀黍物种的其他玉米泛素启动子变体和玉蜀黍基因型可在由TATA元件和上游热休克共有元件构成的minP元件周围展现出高度序列保守性。如此，本发明的实施方案由使用ZmUbi1启动子的这一短的(～200nt)高度保守区(例如SEQ ID NO:1)作为最小核心启动子元件来构建合成双向植物启动子例示。
如本文中使用的，除非上下文清楚且明确地指示，冠词“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。
如本文中使用的，短语“回交”指其中培育者将杂交后代返回与亲本之一杂交的过程，例如第一世代杂种F1与F1杂种的亲本基因型之一。
如本文中使用的，短语“内含子”指转录但不翻译的基因(或表达的目的核苷酸序列)中所包含的任意核酸序列。内含子不同于5’端非翻译前导序列，后者不视为基因的一部分。内含子包括在表达的DNA序列内的不翻译的核酸序列，以及从其转录的RNA分子中的相应序列。
如本文中使用的，短语“分离的”指生物学组分(包括核酸或蛋白质)已经从该组分所天然存在的生物体细胞中的其它生物学组分(即其它染色体和染色体外的DNA和RNA、和蛋白质)实质性分开、分开产生、或纯化出来，同时引起该组分中的化学或功能变化(例如可通过断裂将核酸连接到染色体中的剩余DNA的化学键从染色体分离核酸)。已经“分离的”核酸分子和蛋白质包含通过标准的纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。短语“分离的”还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。
如本文中使用的，短语“基因表达”指核酸转录单元(包括例如基因组DNA)的编码信息被转化成细胞的运作性、非运作性或结构性部分的过程，往往包括蛋白质合成。基因表达可能受到外部信号，例如，细胞、组织或生物体暴露于增加或降低基因表达的作用剂，的影响。基因的表达还可在从DNA到RNA到蛋白质的途径中的任何一处受到调节。基因表达调节的发生方式有，例如，经由作用于转录、翻译、RNA运输和加工、中间分子如mRNA的降解的控制，或经由活化、失活、区室化、或生成特定蛋白质分子后的其降解、或其组合。基因表达可在RNA水平或蛋白质水平上通过本领域中已知的任意方法来测量，包括但不限于，Northern印迹、RT-PCR、Western印迹、或体外、原位或体内蛋白质活性测定法。
如本文中使用的，短语“基于同源性的基因沉默”(HBGS)指包括转录性基因沉默和转录后基因沉默两者在内的一般术语。非连锁的致沉默基因座对靶基因座的沉默作用可能缘于转录抑制(转录性基因沉默；TGS)或mRNA降解(转录后基因沉默；PTGS)，转录抑制或mRNA降解分别是由对应于启动子或转录序列的双链RNA(dsRNA)的产生所导致。在每个过程中牵涉的细胞组分不同，表明dsRNA诱导的TGS和PTGS很可能是一种古老的通用机制的多样化的结果。然而，难以实现TGS和PTGS的严格比较，因为这种比较一般依赖于对不同沉默基因座的分析。单个转基因基因座可能被描述为既触发TGS又触发PTGS，这是由于对应于不同靶基因的启动子和转录序列的dsRNA的产生。参见例如，Mourrain等(2007)Planta 225:365-79。siRNA很可能是触发同源序列上的TGS和PTGS的实际分子：在此模型中，通过转基因序列的甲基化扩散到内源性启动子中，siRNA可以顺式地或反式地触发同源序列的沉默和甲基化。
如本文中使用的，短语“核酸分子”(或“核酸”或“多核苷酸”)指核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA、cDNA、基因组DNA的正义和反义链以及上述项的合成形式和混合的聚合物。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或任一核苷酸类型的修饰形式。如本文中使用的“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。除非另外指明，核酸分子通常长度为至少10个碱基。该术语可以指具有不确定长度的RNA或DNA分子。该术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包含通过天然和/或非天然核苷酸联接而连接在一起的、天然和/或修饰的核苷酸。
核酸分子可以被化学或生化修饰，或者可以含有非天然或衍生化的核苷酸碱基，如本领域技术人员会容易领会的。这类修饰包括，例如标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如不带电荷的连接：例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电荷的连接：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂模块：例如肽；嵌入剂：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；和经修饰的连接：例如alpha异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑学构象，包括单链、双链、部分的双链体、三链体、发夹、环状和挂锁式(padlocked)构象。
转录以5’至3’方式沿DNA链前进。这意味着RNA通过将核糖核苷酸-5’-三磷酸连续添加到延伸的链的3’末端来制备(必要地消除焦磷酸)。在线性或环状核酸分子中，如果独立元件(例如特定的核苷酸序列)在同一核酸中或者会在同一核酸中键合于另一元件的5’方向，则可称它们相对于该另一元件为“上游”，类似地，如果独立元件在同一核酸中或者会在同一核酸中键合于另一元件的3’方向，则可称它们相对于该另一元件为“下游”。
如本文中使用的，短语“碱基位置”指给定的碱基或核苷酸残基在指定核酸内的位置。所述指定的核酸可通过与参照核酸比对(见下文)来限定。
如本文中使用的，短语“杂交”指其中寡核苷酸及其类似物通过互补碱基之间的氢键杂交的过程，所述氢键包括Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键。一般而言，核酸分子由含氮碱基组成，所述碱基为嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，并且嘧啶对嘌呤的键合称为“碱基互补”。更具体地，A会与T或U氢键键合，而G会与C键合。“互补”指在两条不同的核酸序列或同一核酸序列的两个不同区域之间发生的碱基互补。
如本文中使用的，短语“可特异性杂交”和“特异性互补”指程度足以从而使得寡核苷酸与DNA或RNA靶物之间发生稳定且特异性的结合的互补性。可特异性杂交不需要寡核苷酸与其靶序列为100％互补。如果寡核苷酸对靶DNA或RNA分子的结合可干扰靶DNA或RNA的正常功能，而且寡核苷酸有足够程度的互补性来避免寡核苷酸在期望特异性结合的条件下(例如在体内测定法或系统的情况中在生理学条件下)对非靶序列发生非特异性结合，则寡核苷酸是可特异性杂交的。这样的结合称为特异性杂交。
产生特定严格度的杂交条件会根据选择的杂交方法的性质和杂交的核酸序列的组成和长度而变化。一般地，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na+和/或Mg2+浓度)会对杂交的严格性起贡献，但洗涤次数也影响严格性。Sambrook等(编),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,第9章和第11章论述了得到特定严格度所需要的杂交条件的有关计算方法。
如本文中使用的，短语“严格条件”涵盖这样的条件，在该条件下仅当杂交分子与DNA靶物之间有低于50％的错配时才会发生杂交。“严格条件”包括其他具体的严格性水平。如此，如本文中使用的，“中等严格性”条件是这样的条件，在该条件下，具有超过50％序列错配的分子不会杂交；“高严格性”条件是这样的条件，在该条件下，具有超过20％错配的序列不会杂交；而“极高严格性”条件是这样的条件，在该条件下，具有超过10％错配的序列不会杂交。
在具体的实施方案中，严格条件可包括在65℃杂交，接着在65℃用0.1xSSC/0.1％SDS洗涤40分钟。
以下是代表性的非限制性杂交条件：
极高严格性：在5x SSC缓冲液中在65℃杂交16小时；在2x SSC缓冲液中各在室温洗涤15分钟两次；和在0.5x SSC缓冲液中各在65℃洗涤20分钟两次。
高严格性：在5x-6x SSC缓冲液中在65℃-70℃杂交16-20小时；在2x SSC缓冲液中各在室温洗涤5-20分钟两次；和在1x SSC缓冲液中各在55℃-70℃洗涤30分钟两次。
中等严格性：在6x SSC缓冲液中在室温至55℃杂交16-20小时；在2x-3xSSC缓冲液中各在室温至55℃洗涤20-30分钟至少两次。
在具体的实施方案中，特异性可杂交的核酸分子可在极高严格性的杂交条件下保持结合。在这些和别的实施方案中，特异性可杂交的核酸分子可在高严格性的杂交条件下保持结合。在这些和别的实施方案中，特异性可杂交的核酸分子可在中等严格性的杂交条件下保持结合。
如本文中使用的，短语“寡核苷酸”指短的核酸聚合物。寡核苷酸可通过切割更长的核酸区段，或通过聚合各个核苷酸前体而形成。自动化的合成仪允许合成长达数百个碱基对的寡核苷酸。由于寡核苷酸可结合互补核苷酸序列，因此可将它们用作探针来检测DNA或RNA。由DNA构成的寡核苷酸(寡聚脱氧核糖核苷酸)可用于PCR，一种用来扩增小DNA序列的技术。在PCR中，寡核苷酸一般称为“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。
如本文中使用的，短语“序列同一性”或“同一性”指两条核酸或多肽序列的情形，可以指当进行比对以在规定的比较窗口上实现最大对应性时，两条序列中相同的残基。
如本文中使用的，短语“序列同一性百分比”指通过在比较窗口内比较两条最佳比对的序列(例如核酸序列和氨基酸序列)所测定的值，其中为了实现两条序列的最佳比对，比较窗口中的序列部分相比于参照序列(不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即缺口)。百分比如下计算：确定两条序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目而得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数目，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。
用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。各种程序和比对算法记载于，例如：Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。对序列比对方法和同源性计算的详细考量可见于例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(NCBI)基础本地比对搜索手段(Basic Local Alignment SearchTool)(BLASTTM；Altschul等(1990))可从几个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)和在因特网上，与几个序列分析程序联合使用。关于如何使用该程序来测定序列同一性的描述可在因特网上BLASTTM的“帮助”部分获得。对于核酸序列的比较，可使用缺省参数来采用BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2sequences”函数。在通过此方法评估时，与参照序列具有越大的相似性的核酸序列将显示越高的序列同一性。。
酸序列与第二核酸序列存在功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列是可操作连接的。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子与该编码序列是可操作连接的。当可操作连接的多个核酸序列为重组产生时，它们一般是毗邻的，且在有必要连接两个蛋白质编码区时，它们位于同一阅读框中。然而，可操作连接的多个元件不一定需要是毗邻的。
如本文中使用的，短语“启动子”指一般位于上游(靠近基因的5’区)的为转录所必需的DNA区域。启动子可以允许其控制的基因的适宜的活化或抑制。启动子可以含有由转录因子识别的特定序列。这些因子可以结合启动子DNA序列并导致RNA聚合酶(一种从基因的编码区合成RNA的酶)的募集。
如本文中使用的，短语“转化”或“转导”指病毒或载体将核酸分子转移到细胞中的过程。细胞被“转导”到细胞中的核酸分子“转化”，当该核酸分子变得被该细胞稳定复制时(通过将核酸分子掺入细胞基因组或通过附加体复制)。如本文中使用的，术语“转化”涵盖可将核酸分子导入这类细胞的所有技术。例子包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm等(1986)Nature 319:791-3)；脂质转染(Felgner等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller等(1978)Cell 15:579-85)；土壤杆菌介导的转移(Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)；直接DNA摄取；whiskers介导的转化；和微抛射轰击(microprojectilebombardment)(Klein等(1987)Nature 327:70)。
如本文中使用的，短语“转基因”指外源核酸序列。在一个例子中，转基因是基因序列(例如除草剂抗性基因)，编码工业或药学可用化合物的基因，或编码期望的农学性状的基因。在又一个例子中，转基因是反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。转基因可以含有可操作连接于转基因的调控序列(例如启动子)。在一些实施方案中，目的核酸序列是转基因。然而，在其他实施方案中，目的核酸序列是内源核酸序列，其中期望该内源核酸序列的额外的基因组拷贝，或者目的核酸序列是相对于宿主生物体中的靶核酸分子序列而言处于反义取向的核酸序列。
如本文中使用的，短语“载体”指导入到细胞中，由此生成被转化的细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。例子包括，但不限于，携带外源DNA进入细胞的质粒、粘粒、噬菌体或病毒。载体还可以包含一种或多种基因、反义分子和/或选择标志物基因以及本领域中已知的其它遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此使得细胞表达载体所编码的核酸分子和/或蛋白质。任选地，载体可以包括帮助实现核酸分子进入细胞的材料(例如脂质体)。
如本文中使用的，短语“植物”包括植物和植物部分，包括但不限于，植物细胞和植物组织如叶、茎、根、花、花粉和种子。可在本发明中使用的植物的范畴一般而言与适用于诱变处理的高等和低等植物的范畴一样宽，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。因此，“植物”包括双子叶植物和单子叶植物。双子叶植物的例子包括烟草、拟南芥(Arabidopsis)、大豆、番茄、木瓜、加拿大油菜(canola)、向日葵、棉花、苜蓿(alfalfa)、马铃薯、葡萄、木豆(pigeon pea)、豌豆、芸苔(Brassica)、鹰嘴豆、甜菜、油菜籽、西瓜、甜瓜(melon)、胡椒、花生、南瓜、萝卜、菠菜、倭瓜(squash)、椰菜(broccoli)、甘蓝(cabbage)、胡萝卜、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、大白菜(Chinese cabbage)、黄瓜、茄子和莴苣。单子叶植物的例子包括玉米、稻、小麦、甘蔗、大麦、黑麦、高粱、兰花(orchids)、竹、香蕉、香蒲(cattail)、百合、燕麦、洋葱、粟/黍(millet)和黑小麦。如本文中使用的，短语“植物材料”指叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、插条(cutting)、细胞或组织培养物、或植物的任意其他部分或产物。在一些实施方案中，植物材料包括子叶和叶。
如本文中使用的，短语“翻译开关”指位于基因末端的一种机构，其允许紧接下游的基因翻译。翻译开关的机构可在核酸水平(例如病毒或真核细胞内部核糖体进入位点(IRES)、可变剪接位点或核酶切割位点)或在肽/蛋白质水平(例如2A肽、2A样肽、蛋白质内含子肽或蛋白酶切割位点)发挥作用。
这些在核酸水平或在肽/蛋白质水平的翻译开关机制是本领域公知的。参见例如，li,Z.,H.M.Schumacher等(2010)J Biotechnol 145(1):9-16；Chen,Y.,K.Perumal等(2000)Gene Expr 9(3):133-143；Dinkova,T.D.,H.Zepeda等(2005)Plant J 41(5):722-731；Dorokhov,Y.L.,M.V.Skulachev等(2002)ProcNatl Acad Sci U S A 99(8):5301-5306；Fernandez-Miragall,O.和C.Hernandez(2011)PLoS One 6(7):e22617；Groppelli,E.,G.J.Belsham等(2007)J Gen Virol88(Pt 5):1583-1588；Ha,S.H.,Y.S.Liang等(2010)Plant Biotechnol J 8(8):928-938；Karetnikov,A.和K.Lehto(2007)J Gen Virol 88(Pt 1):286-297；Karetnikov,A.和K.Lehto(2008)Virology 371(2):292-308；Khan,M.A.,H.Yumak等(2009)J Biol Chem 284(51):35461-35470；和Koh,D.C.,S.M.Wong等(2003)J Biol Chem 278(23):20565-20573，其内容通过提述完整并入本文。含有经修饰的蛋白质内含子的多基因表达构建体已披露在美国专利No.7,026,526和7,741,530以及美国专利申请2008/0115243中。
如本文中使用的，短语“选择标志物”或“选择标志物基因”指在植物转化中任选地使用的一种基因，用于例如保护植物细胞免于选择剂或提供对选择剂的抗性/耐受性。只有接受功能性选择标志物的细胞或植物才能在具有选择剂的条件下分裂或生长。选择剂的例子可包括例如，抗生素，包括壮观霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、艮他霉素和潮霉素。这些选择标志物包括针对新霉素磷酸转移酶(npt II)的基因(其表达赋予对抗生素卡那霉素抗性的酶)，和针对相关抗生素新霉素、巴龙霉素、艮他霉素和G418的基因，或针对潮霉素磷酸转移酶(hpt)的基因(其表达赋予对潮霉素抗性的酶)。其他可选择标志基因可包括编码以下的基因：除草剂抗性，包括Bar(针对(草胺膦铵盐(glufosinate ammonium))或草铵膦(phosphinothricin)(PPT)的抗性)、乙酰乳酸合酶(ALS，针对阻止支链氨基酸合成第一步的抑制剂如磺脲(SU)、咪唑啉酮类(IMI)、三唑并嘧啶类(TP)、嘧啶基氧苯酮(POB)和磺氨基羰基三唑啉酮(sulfonylamino carbonyl triazolinone)的抗性)、草甘膦(glyphosate)、2,4-D、和金属抗性或敏感性。短语“标志物阳性的”指植物已被转化从而包含选择标志物基因。
可将各种选择标志物或可检测标志物纳入选定的表达载体中以允许经转化植物或转化体的鉴定和选择。有许多方法来确认可选择标志物在经转化植物中的表达，包括例如DNA测序和PCR(聚合酶链式反应)、Southern印迹、RNA印迹、用于检测从载体表达的蛋白质(例如介导草铵膦抗性的沉淀蛋白质或其他蛋白质如报道基因β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶等)的免疫学方法(参见Sambrook,等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,2001)。
将选择标志物基因用于选择经转化的细胞或组织。选择标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，如那些编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因以及赋予对除草剂化合物抗性的基因。除草剂抗性基因一般编码经修饰的、对除草剂不敏感的靶蛋白，或者在除草剂能作用前将植物中的除草剂降解或解毒的酶。例如，已通过使用编码突变体靶酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因获得对草甘膦的抗性。针对EPSPS的基因和突变体已披露在美国专利No.4,940,835,5,188,642,5,310,667,5,633,435,5,633,448和6,566,587中。已获得对草胺膦铵盐、溴草腈(bromoxynil)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性，其通过使用编码将相应除草剂解毒的草铵膦乙酰转移酶、腈水解酶或2,4-二氯苯氧乙酸单加氧酶的细菌基因。用于草胺膦抗性/耐受性的酶/基因已披露在美国专利No.5,273,894,5,276,268,5,550,318和5,561,236中。用于2,4-D抗性的酶/基因先前已披露在美国专利No.6,100,446和6,153,401以及专利申请US 2009/0093366和WO 2007/053482中。针对腈水解酶的酶/基因先前已披露在美国专利No.4,810,648中。
其他除草剂可抑制生长点或分生组织，包括咪唑啉酮或磺脲，且已描述了针对这些除草剂的用于乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)抗性/耐受性的基因。针对AHAS和突变体的基因和突变体已披露在美国专利No.4,761,373,5,304,732,5,331,107,5,853,973和5,928,937中。针对ALS的基因和突变体已披露在美国专利No.5,013,659和5,141,870中。
草甘膦抗性基因分别包括突变体5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPs)基因(通过导入重组核酸和/或天然EPSP基因体内诱变的各种形式)、aroA基因和草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因)。针对其他膦酰基化合物的抗性基因包括草胺膦(来自链霉菌物种，包括吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)和绿色产色链霉菌(Streptomyces viridichromogenes)的草铵膦乙酰转移酶(PAT)基因)，和吡啶氧基(pyridinoxy)或苯氧基丙酸和环己酮(ACCase抑制剂编码基因)。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的除草剂抗性/耐受性基因已记载于美国专利5,162,602和5,498,544。
编码突变aroA基因的DNA分子可在ATCC登录号39256下获得，且突变基因的核苷酸序列已披露于Comai的美国专利No.4,769,061，Kumada等的欧洲专利申请No.0333033，和Goodman等的美国专利No.4,975,374中，其披露了赋予对除草剂如L-草铵膦的抗性的谷酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列在Leemans等的欧洲申请No.0242246中提供。还有DeGreef等的Bio/Technology 7:61(1989)描述了表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予对苯氧基丙酸和环己酮(包括稀禾定(sethoxydim)和氟吡氯禾灵(haloxyfop))的抗性的例示性基因是Marshall等,Theon.Appl.Genet.83:435(1992)描述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。能够赋予草甘膦抗性的GAT基因记载于Castle等的WO 2005012515。赋予对2,4-D、fop和pyridyloxy生长素除草剂抗性的基因记载于WO 2005107437和美国专利申请流水号11/587,893。
其他除草剂可抑制光合作用，包括三嗪(psbA和1s+基因)或氰苯(腈水解酶基因)。Przibila等,Plant Cell 3:169(1991)描述了用编码突变psbA基因的质粒来转化衣藻(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露在Stalker的美国专利No.4,810,648中，而含有这些基因的DNA分子可在ATCC登录号53435,67441和67442下获得。编码谷胱甘肽S转移酶的DNA的克隆和表达由Hayes等,Biochem.J.285:173(1992)描述。
就本发明目的而言，可选择的标志基因包括但不限于编码以下的基因：新霉素磷酸转移酶II(Fraley等(1986)CRC Critical Reviews in Plant Science4:1-25)；氨腈水合酶(Maier-Greiner等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4250-4264)；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合酶(Perl等(1993)Bio/Technology 11:715-718)；色氨酸脱羧酶(Goddijn等(1993)PlantMol.Bio.22:907-912)；二氢吡啶二羧酸合酶和脱敏化的aspartade激酶(Perl等(1993)Bio/Technology 11:715-718)；bar基因(Toki等(1992)Plant Physiol.100:1503-1507；和Meagher等(1996),Crop Sci.36:1367)；色氨酸脱羧酶(Goddijn等(1993)Plant Mol.Biol.22:907-912)；新霉素磷酸转移酶(NEO)(Southern等(1982)J.Mol.Appl.Gen.1:327)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)(Shimizu等(1986)Mol.Cell Biol.6:1074)；二氢叶酸还原酶(DHFR)(Kwok等(1986)PNAS USA 4552)；草铵膦乙酰转移酶(DeBlock等(1987)EMBO J.6:2513)；2,2-二氯丙酸脱卤素酶(Buchanan-Wollatron等(1989)J.Cell.Biochem.13D:330)；乙酰羟酸合酶(Anderson等,美国专利No.4,761,373；Haughn等(1988)Mol.Gen.Genet.221:266)；5-烯醇丙酮莽草酸-磷酸合酶(aroA)(Comai等(1985)Nature 317:741)；卤素芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(Stalker等，公开的PCT申请WO87/04181)；乙酰辅酶A羧化酶(Parker等(1990)Plant Physiol.92:1220)；二氢蝶酸(dihydropteroate)合酶(sul I)(Guerineau等(1990)Plant Mol.Biol.15:127)；和32kD光系统II多肽(psbA)(Hirschberg等(1983)Science222:1346)。
还包括编码对以下抗性的基因：氯霉素(Herrera-Estrella等(1983)EMBO J.2:987-992)；甲氨蝶呤(Herrera-Estrella等(1983)Nature 303:209-213；Meijer等(1991)Plant Mol Bio.16:807-820(1991)；潮霉素(Waldron等(1985)Plant Mol.Biol.5:103-108；Zhijian等(1995)Plant Science 108:219-227；和Meijer等(1991)Plant Mol.Bio.16:807-820)；链霉素(Jones等(1987)Mol.Gen.Genet.210:86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等(1996)Transgenic Res.5:131-137)；博来霉素(Hille等(1986)Plant Mol.Biol.7:171-176)；磺胺药物(Guerineau等(1990)Plant Mol.Bio.15:127-136)；溴草腈(Stalker等(1988)Science242:419-423)；2,4-D(Streber等(1989)Bio/Technology 7:811-816)；草甘膦(Shaw等(1986)Science 233:478-481)；和草铵膦(DeBlock等(1987)EMBO J.6:2513-2518)。
上述可选择标志和报道基因的列表无意构成限制。本发明涵盖任何报道或选择标志物基因。若需要，这类基因可通过本领域已知的方法测序。
报道基因和选择标志物基因以植物中表达最优的方式合成。亦即，基因的编码序列已被修饰来增强植物中的表达。合成的标志基因设计为在植物中以更高水平表达，产生更高的转化效率。本领域中存在用于基因的合成优化的方法。实际上，已将几个基因优化为提高基因产物在植物中的表达。
标志基因序列可以为了在特定植物物种中表达而优化，或者可修饰以用于植物家族中的最佳表达。可以根据特定的目的植物物种中表达量最大的蛋白质的频率最高的密码子来确定植物优选的密码子。参见例如，EPA 0359472；EPA 0385962；WO 91/16432；Perlak等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:3324-3328；和Murray等(1989)Nucleic Acids Research 17:477-498；美国专利No.5,380,831；和美国专利No.5,436,391。以此方式，可将核苷酸序列优化用于在任意植物中表达。公认基因序列的所有或任意部分均可以是优化或合成的。亦即，也可使用完全优化或部分优化的序列。
赋予对除草剂抗性的基因：
A.针对除草剂咪唑啉酮或磺脲的乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的抗性/耐受性。针对AHAS和突变体的基因和突变体已披露在美国专利No.4,761,373,5,304,732,5,331,107,5,853,973和5,928,937中。针对ALS的基因和突变体已披露在美国专利No.5,013,659和5,141,870中。
B.针对除草剂环己二酮和/或芳氧基苯氧基丙酸(包括吡氟氯禾灵(Haloxyfop)、禾草灵(Diclofop)、Fenoxyprop、吡氟禾草灵(Fluazifop)、Quizalopfop)的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抗性/耐受性基因已记载于美国专利5,162,602和5,498,544中。
C.用于草甘膦抗性/耐受性的基因。5-烯醇丙酮-3-磷酸莽草酸合酶(ES3P合酶)的基因已记载于美国专利No.4,769,601中。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和突变体的基因已记载于美国专利No.4,940,835,5,188,642,5,310,667,5,633,435,5,633,448和6,566,587。
D.用于草胺膦(双丙氨膦(bialaphos)、草铵膦(PPT))抗性/耐受性的基因。用于草铵膦乙酰转移酶(Pat)的基因已记载于美国专利No.5,273,894,5,276,268和5,550,318中；而用于双丙氨膦抗性基因(Bar)的基因已记载于美国专利No.5,561,236和5,646,024,5,648,477和7,112,665。用于谷氨酰胺合成酶(GS)的基因已记载于美国专利No.4,975,372和欧洲专利申请EP 0333033A1中。
E.对除草剂异唑(isoxazole)、二酮睛(diketonitrile)和/或三酮(包括磺草酮(sulcotrione)和甲基磺草酮(mesotrione))的羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的抗性/耐受性基因已记载于美国专利No.6,268,549和6,069,115中。
F.用于2,4-D抗性/耐受性的基因。2,4-D-单加氧酶的基因已记载于美国专利No.6,100,446和6,153,401。用于2,4-D抗性/耐受性的其它基因披露在US2009/0093366和WO 2007/053482中。
G.针对除草剂咪唑和/或三唑的咪唑甘油磷酸脱水酶(IGPD)基因已记载于美国专利No.5,541,310。针对除草剂Dicamba的Dicamba降解酶(加氧酶、铁氧还蛋白、和还原酶)的基因已披露在美国专利No.7,022,896和7,105,724中。
H.针对抑制光合作用的除草剂，包括三嗪(psbA和1s+基因)或氰苯(腈水解酶基因)的基因。参见例如，Przibila等,Plant Cell 3:169(1991)，其披露了用编码突变psbA基因的质粒来转化衣藻。腈水解酶基因的核苷酸序列披露在美国专利No.4,810,648中，而含有这些基因的DNA分子在ATCC登录号53435、67441和67442下可获。编码谷胱甘肽S转移酶的DNA的克隆和表达由Hayes等,Biochem.J.285:173(1992)描述。
除非另外特定地解释，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。对分子生物学常见术语的定义可见于例如：Lewin,Genes V,Oxford University Press,1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(编),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Meyers(编),MolecularBiology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
提供可充当双向启动子的合成核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，合成的双向启动子可以可操作地连接于一个或两个目的核苷酸序列。例如，合成的双向启动子可以可操作地连接于一个或两个目的核苷酸序列(例如两个基因，在启动子每端各一个)，从而调控至少一个(例如一个或两个)目的核苷酸序列的转录。通过将来自启动子的URS掺入合成的双向启动子中，可以就可操作地连接于合成双向启动子的目的核苷酸序列而言实现特定的表达和调控模式(例如如由在天然启动子控制下的基因所展示的)。
在本文中，将来自单向玉米泛素-1基因(ZmUbi1)启动子的最小核心启动子元件掺入不同于天然启动子的分子背景中以工程化构建合成的双向启动子，来例示本发明的一些实施方案。该最小核心启动子元件在本文中称为“minUbi1P”，且长度为约200nt。对来自多种玉蜀黍物种和玉蜀黍基因型的minUbi1P元件的测序和分析揭示功能性minUbi1P元件是高度保守的，从而minUbi1P元件如果，例如，与SEQ ID NO:1的minUbi1P元件有至少约75％；至少约80％；至少约85％；至少约90％；至少约91％；至少约92％；至少约93％；至少约94％；至少约95％；至少约96％；至少约97％；至少约98％；至少约99％；和/或至少约100％序列同一性，则其可能保留其作为转录启动者的功能。在本发明的一些实施方案中可用的minUbi1P元件的特征可包括，例如但不限于，前述的核苷酸序列的高度保守性；至少一个TATA框的存在；和/或至少一个(例如两个)热休克共有元件的存在。在具体的minUbi1P元件中，超过一个热休克共有元件可在minUbi1P序列中重叠。
将minUbi1P元件纳入不同于天然启动子的分子背景中以工程化构建合成的双向启动子的方法可以包括逆转核酸中minUbi1P元件相对于其余的启动子序列(包括其天然最小核心启动子)的取向。如此，合成的双向启动子可以包含以相反取向纳入启动子中第二最小核心启动子元件(例如第二minUbi1P元件)5’的第一minUbi1P元件，从而它可以可操作地连接于位于第一minUbi1P元件5’的目的核苷酸序列。例如，可将第一minUbi1P元件以相反取向纳入ZmUbi1启动子的5’端。
合成的双向Ubi1启动子除了至少一个minUbi1P元件外，还可以包含一个或多个另外的序列元件。在一些实施方案中，合成双向Ubi1启动子可以包含启动子URS；外显子(例如前导或信号肽)；内含子；间隔区序列；和/或前述任一种的一种或多种的组合。例如而不限于，合成双向Ubi1启动子可以包含来自Ubi1启动子(例如玉米Ubi1启动子)的URS序列；编码来自Ubi1基因的前导肽的外显子；来自Ubi1基因的内含子；以及这些的组合。
在包含包括启动子URS的合成双向Ubi1启动子的那些例子的一些中，URS可选择为对合成启动子赋予特定的调节特性。已知的启动子在其施加于可操作连接的基因上的控制类型中有广泛不同(例如环境应答、发育提示和空间信息)，且掺入异源启动子的URS典型地维持URS就其天然启动子和可操作连接的基因而言所展现的控制类型。Langridge等(1989)，见上。已表征且依照一些实施方案可以含有包含在合成双向Ubi1启动子内的URS的真核生物启动子的例子包括，例如而不限于：在美国专利No.6,437,217(玉米RS81启动子)；5,641,876(稻肌动蛋白启动子)；6,426,446(玉米RS324启动子)；6,429,362(玉米PR-1启动子)；6,232,526(玉米A3启动子)；6,177,611(组成型玉米启动子)；6,433,252(玉米L3油质蛋白(oleosin)启动子)；6,429,357(稻肌动蛋白2启动子和稻肌动蛋白2内含子)；5,837,848(根特异性启动子)；6,294,714(可被光诱导的启动子)；6,140,078(可被盐诱导的启动子)；6,252,138(可被病原体诱导的启动子)；6,175,060(可被磷缺乏诱导的启动子)；6,388,170(双向启动子)；6,635,806(gamma-coixin启动子)；和美国专利申请流水号09/757,089(玉米叶绿体醛缩酶启动子)中描述的那些启动子。
另外的例示性原核生物启动子包括胭脂碱(nopaline)合酶(NOS)启动子(Ebert等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16):5745-9)；章鱼碱(octopine)合酶(OCS)启动子(其携带在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导性质粒上)；花椰菜花叶病毒启动子如花椰菜镶嵌病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等(1987)Plant Mol.Biol.9:315-24)；CaMV 35S启动子(Odell等(1985)Nature 313:810-2；玄参镶嵌病毒35S启动子(Walker等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19):6624-8)；蔗糖合酶启动子(Yang和Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4144-8)；R基因复合物启动子(Chandler等(1989)Plant Cell1:1175-83)；CaMV35S(美国专利No.5,322,938,5,352,605,5,359,142和5,530,196)；FMV35S(美国专利No.6,051,753和5,378,619)；PC1SV启动子(美国专利No.5,850,019)；SCP1启动子(美国专利No.6,677,503)；和AGRtu.nos启动子(GenBank登录号V00087；Depicker等(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:561-73；Bevan等(1983)Nature 304:184-7)等。
在一些实施方案中，合成双向Ubi1启动子除了minUbi1P元件外还可以包含外显子。例如，在具体的实施方案中可能期望将可操作地连接于启动子的目的核苷酸序列所编码的多肽靶向或运输到特定的亚细胞位置和/或区室。在这些和其他实施方案中，编码序列(外显子)可以纳入minUbi1P元件和编码多肽的核苷酸序列之间的核酸分子中。可以依照熟练从业人员的判断来安排这些元件从而使得合成双向Ubi1启动子促进多肽(或可操作地连接于启动子的两个多肽编码序列之一或两个)的表达，所述多肽包含由纳入编码序列编码的多肽与其余多肽处于功能关系中。在具体的例子中，可以纳入编码前导、转运或信号肽(例如Ubi1前导肽)的外显子。
可以由掺入合成双向Ubi1启动子的外显子编码的肽包括，例如而不限于：泛素(例如Ubi1)前导序列；外显子；和叶绿体转运肽(CTP)(例如拟南芥EPSPS CTP(Klee等(1987)Mol.Gen.Genet.210:437-42)，和矮牵牛(Petuniahybrida)EPSPS CTP(della-Cioppa等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:6873-7))，如对于dicamba单加氧酶(DMO)的叶绿体靶向在国际PCT公开文本No.WO 2008/105890中所例示的。
在本发明的一些实施方案中还可以将内含子纳入合成双向Ubi1启动子，例如在minUbi1P元件与可操作地连接于启动子的目的核苷酸序列之间。在一些例子中，纳入合成双向Ubi1启动子的内含子可以无限制地为，充当翻译前导序列的5′UTR，其存在于翻译起始序列上游的完全加工过的mRNA中(此类翻译前导序列可以影响初始转录本到mRNA的加工、mRNA稳定性和/或翻译效率)。翻译前导序列的例子包括玉米和矮牵牛花热休克蛋白前导序列(美国专利No.5,362,865)、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物rubisco前导序列等。参见例如，Turner和Foster(1995)Molecular Biotech.3(3):225-36。5′UTR的非限制性例子包括GmHsp(美国专利No.5,659,122)；PhDnaK(美国专利No.5,362,865)；AtAnt1；TEV(Carrington和Freed(1990)J.Virol.64:1590-7)；和AGRtunos(GenBank登录号V00087；和Bevan等(1983)Nature 304:184-7)。
任选地，可纳入合成双向Ubi1启动子中的另外的序列包括，例如而不限于：3’非翻译序列；3’转录终止区；和多腺苷酸化区。这些是位于目的核苷酸序列(例如可操作地连接于合成双向Ubi1启动子的目的序列)下游的遗传元件，且包括提供多腺苷酸化信号的多核苷酸，和/或能影响转录、mRNA加工或基因表达的其他调节信号。多腺苷酸信号在植物中可作用于引起多腺苷酸核苷酸到mRNA前体3’端的添加。所述多腺苷酸化序列可源自天然基因、多种植物基因或T-DNA基因。3’转录终止区的非限制性例子是胭脂碱合酶3’区(nos 3’；Fraley等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)。使用不同的3’非翻译区的例子在Ingelbrecht等(1989),Plant Cell 1:671-80中提供。多腺苷酸化信号的非限制性例子包括来自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等(1984)EMBO J.3:1671-9)和AGRtu.nos(GenBank登录号E01312)的多腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，合成双向Ubi1启动子包含一个或多个促进包含该启动子的核酸靶定到靶生物体基因组中的特定基因座处的核苷酸序列。例如，可以纳入与宿主中的基因组DNA序列(例如稀有或唯一的基因组DNA序列)区段同源的一个或多个序列。在一些例子中，这些同源序列可以指导包含合成双向Ubi1启动子的核酸在宿主基因组中同源DNA位点处的重组和整合。在具体的例子中，合成的双向Ubi1启动子包含一个或多个促进包含该启动子的核酸靶定到宿主基因组中的稀有或唯一位置处的核苷酸序列，其利用了识别在该稀有或唯一位置处的序列并促进在该稀有或唯一位置处的整合的工程化的核酸酶。采用锌指内切核酸酶作为核酸酶的这类靶向性整合系统记载于美国专利申请No.13/011,735中。
可以使用任何本领域中已知的技术来产生包含合成双向Ubi1启动子的核酸，包括例如而不限于：RCA；PCR扩增；RT-PCR扩增；OLA；和SNuPE。这些和其他等同技术是本领域技术人员公知的，且进一步详细记载于，例如而不限于：Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.,ColdSpring Harbor Laboratory,2001；和Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,1998。上文引用的所有参考文献包括前述两者的手册，包括其中提供的任意附图、图、和/或表。
投递和/或转化：本公开还提供用于用包含合成双向Ubi1启动子的核酸分子来转化细胞的方法。依照一些实施方案，可以使用本领域已知用于将核酸分子导入植物中的大量技术中的任一种来将植物用包含合成双向Ubi1启动子的核酸分子转化，例如，以将一个或多个合成双向Ubi1启动子导入宿主植物基因组，和/或进一步导入可操作地连接于启动子的一个或多个目的核酸分子。
用于植物转化的合适方法包括可将DNA导入细胞的任意方法，例如而不限于：电穿孔(参见例如，美国专利5,384,253)；微抛射轰击(参见例如，美国专利5,015,580,5,550,318,5,538,880,6,160,208,6,399,861和6,403,865)；土壤杆菌介导的转化(参见例如，美国专利5,635,055,5,824,877,5,591,616；5,981,840和6,384,301)；和原生质体转化(参见例如，美国专利5,508,184)。通过应用如前所述的技术，可以稳定地转化基本上任意植物物种的细胞，并且通过本领域技术人员已知的技术使这些细胞发育成转基因植物。例如，在棉花转化的背景中可能特别有用的技术记载于美国专利5,846,797,5,159,135,5,004,863和6,624,344；具体用于转化芸苔属植物的技术记载于例如美国专利5,750,871；用于转化大豆的技术记载于例如美国专利6,384,301；而用于转化玉米的技术记载于例如美国专利7,060,876和5,591,616和国际PCT公开文本WO 95/06722。
在实现外源核酸到受体细胞的投递后，一般鉴定出经转化的细胞用于进一步培养和植物再生。为了改进鉴定转化体的能力，可能期望采用可选择或可筛选的标志基因和用于生成转化体的转化载体。在此情况中，可通过将细胞暴露于选择剂(一种或多种)来测定潜在转化的细胞群体，或可对细胞筛选期望的标志基因性状。
可在支持植物再生的培养基中培养从暴露于选择剂存活的细胞，或在筛选测定法中得分为阳性的细胞。在一些实施方案中，可通过纳入别的物质如生长调节剂来改良任何适宜的植物组织培养基(例如MS和N6培养基)。可在具有生长调节剂的基础培养基上维持组织直至可获得足够的组织来开始植物再生努力，或者在重复的手动选择轮数后，直至组织的形态学适用于再生(例如至少2周)，然后转移至有助于芽形成的培养基。周期性地转移培养物直至已发生充分的芽形成。一旦形成芽，就将其转移到有助于根形成的培养基。一旦形成充足的根，就将植物转移到土壤进行进一步生长和成熟。
为了确认包含合成双向Ubi1启动子的期望的核酸分子在再生植物中的存在，可以实施多种测定法。这类测定法包括例如：分子生物学测定法，如Southern和Northern印迹和PCR；生化测定法，如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫学手段(ELISA和/或Western印迹)或通过酶功能；植物部分测定法，如叶或根测定法；以及对全再生植物的表型的分析。
可例如通过PCR扩增来筛选靶向性整合事件，使用例如特异于目的核酸分子的寡核苷酸引物。理解PCR基因分型包括但不限于，对源自预测含有整合入基因组的目的核酸分子的分离宿主植物愈伤组织的基因组DNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增，继之以对PCR扩增产物的标准克隆和序列分析。PCR基因分型的方法已是大量描述的(参见例如，Rios等(2002),Plant J.32:243-53)，且可应用于源自任何植物物种或组织类型(包括细胞培养物)的基因组DNA。可在PCR扩增反应中连续或复合性使用结合靶序列和导入序列两者的寡核苷酸引物的组合。可以产生设计为与靶位点、导入的核酸序列和/或这两者的组合退火的寡核苷酸引物。如此，PCR基因分型策略可包括，例如而不限于：植物基因组中特定序列的扩增；植物基因组中多个特定序列的扩增；植物基因组中非特定序列的扩增；和前述任一项的组合。本领域技术人员可设计出引物和扩增反应的其他组合来查询基因组。例如，一组正向和反向寡核苷酸引物可设计为与特异于所导入核酸序列边界外的靶物的核酸序列退火。
正向和反向寡核苷酸引物可设计为与导入的核酸分子特异性退火，例如对应于其中包含的目的核苷酸序列内的编码区的序列，或核酸分子的其他部分。这些引物可连同上文所述引物使用。可依照期望的序列合成寡核苷酸引物，并且是商品化的(例如来自Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,IA)。扩增之后可以是克隆和测序，或扩增产物的直接序列分析。本领域技术人员可想到用于分析在PCR基因分型期间生成的扩增产物的备选方法。在一个实施方案中，在PCR扩增中采用特异于基因靶物的寡核苷酸引物。
本发明的一些实施方案还提供包含合成双向Ubi1启动子(例如如可以存在于核酸构建体中的)的细胞。在具体的例子中，依照一些实施方案的合成双向Ubi1启动子可用作调控序列来调控转基因在植物细胞和植物中的表达。在这些例子的一些中，使用可操作地连接于目的核苷酸序列(例如转基因)的合成双向Ubi1启动子可以减少调控给定数目的目的核苷酸序列的表达所需的异源启动子的数目，和/或减小导入给定数目的目的核苷酸序列所需的核酸构建体的大小。此外，使用合成双向Ubi1启动子可以允许两个可操作连接的目的核苷酸序列在相同条件下(即该启动子有活性的条件)的共表达。例如当两个可操作连接的目的核苷酸序列各自作用于包含该目的核苷酸序列的转基因宿主中的单个性状，且目的核苷酸序列的共表达有利地影响该性状在转基因宿主中的表达时，这类例子可以是特别有用的。
在一些实施方案中，包含一个或多个合成双向Ubi1启动子和/或目的核苷酸序列的转基因植物可以具有由目的核苷酸序列在该植物中的表达所赋予(例如引入、增强或贡献)的一种或多种期望的性状。这类性状可以包括，例如而不限于：对昆虫、其他害虫和致病剂的抗性；对除草剂的耐受性；提高的稳定性、产率或货架期；环境耐受性；药物产生；工业产物产生；和营养增强。在一些例子中，可赋予期望的性状，其通过用包含可操作地连接于目的核苷酸序列的合成双向Ubi1启动子的核酸分子来转化植物。在一些例子中，可对经由育种产生作为后代植物的植物赋予期望的性状，该性状可通过可操作地连接于合成双向Ubi1启动子的一个或多个目的核苷酸序列赋予，所述目的核苷酸序列是从包含可操作地连接于合成双向Ubi1启动子的目的核苷酸序列的亲本植物传递给该植物的。
依照一些实施方案中的转基因植物可以是能用本发明的核酸分子转化，或能用经本发明的核酸分子转化的植物育种产生的任何植物。相应地，所述植物可以是双子叶或单子叶植物。用于一些例子的双子叶植物的非限制性例子包括：苜蓿；豆类；椰菜；加拿大油菜，甘蓝；胡萝卜；花椰菜；芹菜；大白菜；棉花；黄瓜；茄子；莴苣；甜瓜(melon)；豌豆；胡椒；花生；马铃薯；南瓜；萝卜；油菜籽；菠菜；大豆；倭瓜；甜菜；向日葵；烟草；番茄；和西瓜。用于一些例子的单子叶植物的非限制性例子包括：玉米；洋葱；稻；高粱；小麦；黑麦；粟/黍；甘蔗；燕麦；黑小麦；柳枝稷；和草坪草。
在一些实施方案中，可以任意方式来使用或培养转基因植物，其中期望存在合成的双向Ubi1启动子和/或可操作连接的目的核苷酸序列。因此，这类转基因植物可通过用依照本发明的核酸分子转化而工程改造化，以便例如拥有一种或多种期望的性状，而且这类转基因植物可通过本领域技术人员已知的任意方法来收获(crop)和/或栽培。
尽管已参照特定方法和实施方案描述了本发明，但应领会可进行多种修改和变化而不背离本发明。
提供下列实施例来例示某些特定特征和/或实施方案。所述实施例不应理解为将公开内容限制为所例示的具体特征或实施方案。
实施例
实施例1：转化和表达
根癌土壤杆菌的转化：将pDAB108706双元载体转化到根癌土壤杆菌菌株DAt13192三重体(ternary)中(美国临时专利No.61/368965)。分离细菌菌落，并且分离和经由限制酶消化确认双元质粒DNA。
玉米转化：穗消毒和胚分离。为了获得玉米未成熟的胚，在温室中培育玉蜀黍植物(c.v.B104)并自花授粉或近缘授粉以产生穗。在授粉后约9-12天收获穗。在实验当天，通过将穗浸没到20％的家用漂白剂(其含有5％次氯酸钠)溶液中，摇动20-30分钟，接着在无菌水中漂洗3次对其进行表面消毒。在消毒后，从每个穗无菌切分未成熟的合子胚(1.5–2.2mm)，并随机分配到含有液体感染培养基(LS Basal Medium，4.43gm/L；N6维生素溶液[1000X]，1.00mL/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；蔗糖，68.5gm/L；葡萄糖，36.0gm/L；2,4-D，1.50mg/L)的微离心管中。对于给定的实验组，每个处理使用从2-3个穗归并的胚。
土壤杆菌培养启动：将含有上文所述双元载体的土壤杆菌的甘油储液划线接种于含有适宜抗生素的AB最小培养板上，并在20℃生长3-4天。挑取单个菌落并划线接种于含有相同抗生素的YEP板上，在28℃温育1-2天。
土壤杆菌培养和共培养：在实验当天，从YEP板取土壤杆菌菌落，悬浮于50mL一次性管中的10mL感染培养基中，并将细胞密度调整为OD600＝0.2-0.4nm(使用分光光度计)。将土壤杆菌培养物置于旋转的摇动器上以室温100rpm，同时实施胚切分。从消毒过的玉米粒分离大小为1.5-2.2mm的未成熟的合子胚，并置于1mL感染培养基中，在相同培养基中洗涤1次。将土壤杆菌悬液(2mL)添加到每个管中，并将管颠倒约20次，然后摇动10-15分钟。将胚转移到共培养培养基上(MS盐，4.33gm/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；肌醇，100.0mg/L；酪蛋白酶水解产物100.0mg/L；Dicamba-3.30mg/L；蔗糖，30.0gm/L；GelzanTM，3.00gm/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L；AgNo3，15.0mg/L；乙酰丁香酮，100μM)，以盾片朝上取向，并在光照中在25℃温育3-4天。
GUS和YFP/Phiyfp瞬时表达：可在经转化的胚中并在与土壤杆菌共培养3天后观察瞬时YFP/Phiyfp和GUS表达。使用YFP滤光片和500nm光源在立体显微镜(Leica Microsystems,Buffalo Grove,IL)下观察胚。选择显示YFP/Phiyfp表达的胚用于GUS组织化学测定。如Maniatis等(1989)中描述的制备GUS染色溶液，并将胚在1mL溶液中在37℃温育24小时。在显微镜下观察胚的GUS瞬时表达。
愈伤组织选择和假定事件的再生：在共培养时段后，将胚转移到无选择剂的静息培养基(MS盐，4.33gm/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；肌醇，100.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]500.0mg/L；酪蛋白酶水解产物100.0mg/L；Dicamba，3.30mg/L；蔗糖，30.0gm/L；Gelzan 2.30gm/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L；AgNo3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)并在50μmol m-2s-1光照强度的24小时光照中在28℃温育7天。将胚转移到含有100nM氟吡氯禾灵的选择1培养基(MS盐，4.33gm/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；肌醇，100.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]500.0mg/L；酪蛋白酶水解产物100.0mg/L；Dicamba，3.30mg/L；蔗糖，30.0gm/L；GelzanTM2.30gm/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L；AgNo3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)并在光强度为50μmol m-2s-1的24小时光照中于28℃温育7天。
将具有增殖的胚胎发生性愈伤组织的胚转移到含有500nM氟吡氯禾灵的选择2培养基上(MS盐，4.33gm/L；肌醇，100.0mg/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]500.0mg/L；酪蛋白酶水解产物100.0mg/L；Dicamba，3.30mg/L；蔗糖，30.0gm/L；GelzanTM2.30gm/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L；AgNo3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)并在光强度为50μmol m-2s-1的24小时光照中于28℃再温育14天。该选择步骤允许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。愈伤组织选择期持续3周。将增殖的胚胎发生性愈伤组织转移到含有500nM氟吡氯禾灵的再生1培养基上(MS盐，4.33gm/L；肌醇，100.0mg/L；L-脯氨酸，350.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]250.0mg/L；酪蛋白酶水解产物50.0mg/L；NAA 0.500mg/L；ABA 2.50mg/L；BA 1.00mg/L；蔗糖，45.0gm/L；GelzanTM2.50gm/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L；AgNo3，1.00mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)并在光强度为50μmol m-2s-1的24小时光照中于28℃培养7天。将具有抽芽/萌芽(shoot/bud)的胚胎发生性愈伤组织转移到含有500nM氟吡氯禾灵的再生2培养基上(MS盐，4.33gm/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L；肌醇，100.0mg/L；蔗糖，60.0gm/L；Gellan Gum G434TM3.00gm/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)。将培养物在光强度为50μmol m-2s-1的24小时光照中于28℃温育7-10天。将具有初生根的小抽芽转移到MAGENTATM盒(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中的芽延长和生根培养基中(MS盐，4.33gm/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L；肌醇，100.0mg/L；蔗糖，60.0gm/L；Gellan Gum G434TM3.00gm/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)，并在16/8小时光照/黑暗中于28℃温育7天。分析推定的转基因小植株的转基因拷贝数并转移到温室中。
实施例2：构建合成的双向Ubi1启动子和pDAB108706载体
玉米泛素-1启动子(Ubi1)的例示性示意图显示于图1。从玉米克隆了Ubi1启动子。使用高保真度PCR扩增系统来PCR扩增含有Ubi1启动子的质粒。玉米Ubi1启动子的约200nt区被鉴定为玉蜀黍Ubi1最小核心启动子(minUbi1P)(SEQ ID NO:1)。然后，使用本领域公知的克隆方法将SEQ ID NO:1的minUbi1P添加到包含玉蜀黍泛素-1外显子(ZmUbi1外显子)和玉蜀黍泛素-1内含子(ZmUbi1内含子)的多核苷酸(SEQ ID NO:2)以产生SEQ ID NO:3的多核苷酸。然后将所得多核苷酸克隆到包含玉米Ubi1启动子的核酸(包含Ubi1上游调控序列(URS)；SEQ ID NO:4)相反方向上游以产生SEQ ID NO:5的合成双向Ubi1启动子(见例如图5)。
将报道基因编码序列克隆到合成双向Ubi1启动子每端的下游。将黄色荧光蛋白(yfp)编码序列插入含有minUbi1P、ZmUbi1外显子和ZmUbi1内含子启动子元件的多核苷酸片段的下游。另外，将含有3-框终止多核苷酸序列和玉米通用多核苷酸(Kozak)序列的下游前导序列添加到minUbi1P、ZmUbi1外显子和ZmUbi1内含子启动子元件片段。将uidA(GUS)编码序列插入相对于yfp序列在相反方向的合成双向Ubi1启动子下游(SEQ ID NO:6；见例如图3)。将包含可操作地连接于yfp和GUS基因的合成双向Ubi1启动子的所得多核苷酸克隆到质粒pDAB105801中。
含有来自质粒pDAB105801的GUS和yfp基因表达盒的双元载体经由GATEWAYTML-R CLONASETM反应(Invitrogen,Carlsbad,CA)完成。所得载体pDAB108706含有在T链区内的GUS、yfp和aad-1基因表达盒(见例如图5)。
实施例3：可操作地连接于合成双向泛素1启动子的基因的瞬时表达
获得用pDAB108706转化的玉蜀黍胚中YFP和GUS瞬时表达的代表性例子的图像。双向ZmUbi1启动子的两侧均能驱动可操作连接的yfp和GUS编码序列的有力表达。YFP表达水平与GUS表达水平是可比的。这些观察确认了双向ZmUbi1启动子的两侧均是生物学有功能的。而且，合成双向Ubi1启动子的minUbi1P元件能以与用含有单向ZmUbi1启动子(驱动yfp编码序列)的双元质粒(pDAB101556)转化的玉蜀黍愈伤组织相比相似的表达水平来表达YFP。在未用双元构建体转化且不含yfp或GUS编码序列的阴性对照未成熟的胚中未检测到YFP或GUS的表达。
实施例4：可操作地连接于合成双向泛素1启动子的基因的稳定表达
可以观察到用含有yfp编码序列的pDAB108706双元载体稳定转化的玉蜀黍愈伤组织细胞的图像。这些细胞从在选择2培养基上增殖的玉蜀黍胚获得。双向ZmUbi1启动子能驱动yfp编码序列的有力表达。这些结果确认双向ZmUbi1启动子的Min-Ubi1P最小启动子元件能在稳定转化的玉蜀黍愈伤组织细胞中表达报道基因。YFP蛋白的表达水平与用含有单向ZmUbi1启动子(驱动yfp编码序列)的对照双元载体(pDAB101556)转化的玉蜀黍愈伤组织中的YFP表达相比是相似的。在未用双元构建体转化且不含yfp或GUS编码序列的阴性对照愈伤组织中未检测到YFP或GUS的表达。
实施例5：使用实时PCR的转基因拷贝数估测
将玉蜀黍胚用含有双向ZmUbi1启动子的双元载体pDAB108706转化，而将其他植物用对照双元载体pDAB101556转化。经由水解探针测定法确认两组玉蜀黍植物的基因组中yfp转基因的存在。获得并分析从愈伤组织发育的稳定转化的转基因玉蜀黍小植株以鉴定来自pDAB108706双元载体和pDAB101556对照双元载体的含有低拷贝数(1-2拷贝)的全长T链插入的事件。将经鉴定的小植株放到温室中并生长。
使用Roche Light Cycler480TM系统来测定用pDAB108706双元载体转化的事件和用pDAB101556双元载体转化的对照事件的转基因拷贝数。该方法采用双重反应，其在单个测定中采用特异于yfp基因和内源性玉蜀黍参照基因转化酶(Genbank登录号：U16123.1)的寡核苷酸。通过测量相对于转化酶特异性荧光的yfp特异性荧光的强度测定拷贝数和配型，与拷贝数已知的标准品相比较。
在用pDAB108706双元载体转化的玉蜀黍中，用含有经FAM荧光染料标记的探针的一个引物/探针集来扩增yfp基因特异性DNA片段，并使用含有经HEX荧光标记的探针的第二引物/探针集来扩增转化酶(表2)。如表3中所列的制备PCR反应混合物，并依照表4中列出的条件扩增基因特异性DNA片段。通过测量报道基因yfp特异性的荧光对参照基因转化酶特异性的荧光的相对强度来测定拷贝数和配型，与拷贝数已知的标准品相比较。
表2.正向和反向核苷酸引物和荧光探针(由Integrated DNA Technologies,Coralville,IA合成)
通过将载体pDAB108706稀释到玉蜀黍B104基因组DNA(gDNA)中以获得具有已知的pDAB108708:gDNA关系的标准品，来创建标准品。例如，制备具有1、2、和4个拷贝的载体DNA每1拷贝玉蜀黍B104gDNA的样品。将pDAB108706的1拷贝和2拷贝稀释物与玉蜀黍B104gDNA标准品混合，对比已知为半合的对照玉蜀黍事件和已知纯合的对照玉蜀黍事件进行验证(玉蜀黍事件278；参见PCT国际专利公开文本No.WO 2011/022469A2)。实施双重测定法，该测定法利用特异于AAD1基因的寡核苷酸和特异于内源玉蜀黍参照基因转化酶的寡核苷酸，用含有经FAM荧光染料标记的探针的一个引物/探针集来扩增和检测AAD1的基因特异性DNA片段，而用含有经HEX荧光标记的探针的第二个引物/探针集来扩增和检测转化酶的基因特异性DNA片段(表2)。如表3所列制备AAD1反应混合物，并依照表4中列出的条件扩增特异性片段。
表3.PCR反应混合物
使用Roche LightCycler 480TM热循环仪，依照制造商的指导，分析每个反应生成的荧光水平。FAM荧光模块在465/510nm的光密度激发，而HEX荧光模块在533/580nm的光密度激发。可以通过比较未知样品的靶物/参照值(LightCycler 480TM的输出)对4个拷贝数已知的标准品(空，1拷贝(半)，2拷贝(纯)和4拷贝)的靶物/参照值来确定拷贝数。
表4.PCR扩增的热循环仪条件.
对通过双向ZmUbi1启动子构建体(pDAB108706)转化获得的转基因植物，和通过对照单向ZmUbi1启动子YFP构建体(pDAB101556)转化获得的转基因植物的转基因拷贝数分析的结果显示于表5。仅将具有1-2个yfp转基因拷贝的植物转移到温室中用于进一步表达分析。
表5.从双向启动子构建体和对照构建体获得的转基因植物的转基因拷贝数估测
构建体 转化的胚数 阳性事件数 1-2个yfp拷贝
pDAB101566 100 31 13
pDAB108706 110 29 12
实施例6：可操作地连接于合成双向泛素1启动子的基因的全植物稳定表达
在温室中生长含有低拷贝T-DNA数的双元质粒pDAB108706的全植物，和含有低拷贝数的对照双元质粒pDAB101556的植物。分析从用pDAB108706转化的玉蜀黍胚获得的转基因T0玉米植物的叶和根组织中的YFP稳定表达的代表性例子。双向ZmUbi1启动子在叶组织和根组织中能驱动yfp编码序列的有力表达。显微术分析还确认，与用含有驱动yfp编码序列的单向ZmUbi1启动子的对照双元质粒(pDAB101556相比，)双向ZmUbi1启动子中的Min-UbiP1最小启动子元件能驱动相似表达水平的YFP表达。这些对照植物还显示在叶组织和根组织中的稳定YFP表达。
实施例7：可操作地连接于合成双向泛素1启动子的基因的Western印迹分析
总可溶蛋白：将经转化的T0玉米植物在V6发育阶段取样。将来自最幼展开叶的总共4个叶环切片(punch)采样到矩阵(matrix)管中并置于矩阵盒中。作为阴性对照，将在V6发育阶段的两个未经转化B104玉米植物的4个叶环切片采样到矩阵管中。将一个钢珠与样品一起置于矩阵管中，然后将400μL PBST添加到每个管。将管加盖，并通过在KlecoTM组织研磨器中1500rpm珠击(beadbeating)5分钟提取蛋白质。碎片通过离心沉淀。
将来自每个管的5μL样品用PBST在96孔微滴定板中稀释为25μL。使用BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific Pierce,Rockford,IL)依照制造商指导来分析这些样品的总可溶蛋白。一式两份地分析试剂盒中提供的牛血清清蛋白(BSA)标准，用平均值生成标准曲线，随后用该曲线计算每份样品的总可溶蛋白。然后将每份样品的总可溶蛋白标准化为mg/μL。
表6.Western印迹方案.
YFP/Phiyfp Western印迹分析：在96孔微滴定板中，将提取的蛋白质的每5μL样品用5μL 2x Laemmli缓冲液+2-β-巯基乙醇稀释。纯化的YFP/Phiyfp的对照样品，于HEPES缓冲液(50mM HEPES,200mM KCl,10％甘油)中，购自Axxora(San Diego,CA)。通过用Laemmli缓冲液1:1稀释以产生以下浓度的标准曲线来制备样品：0.5ng/μL、0.25ng/μL和0.125ng/μL。将样品在热循环仪中于95℃加热30分钟，然后降温至4℃。然后使用MES/SDS缓冲液来装配Bio-Rad Criterion gelTM。允许样品升温至室温，并将10μL样品加载到两块凝胶的每个孔中。另外，将用于标准曲线的纯化YFP/Phiyfp的样品和蛋白质分子量加载到凝胶的孔中。将凝胶在150V和150mA电泳运行90分钟。运行后，打开凝胶外套并使用iBlot SystemTM(Invitrogen)将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。通过运行20V的电流达10分钟将蛋白质从凝胶转移至膜。取出硝酸纤维素膜并置于StartingBlock T20TM封闭缓冲液中于4℃过夜。然后弃去封闭缓冲液，并使用表6中列出的方案处理膜。
使用Amersham ECLTM加化学发光检测系统按照制造商指导来检测抗体结合。将胶卷曝光10分钟和30分钟。10分钟曝光的胶卷用于定量蛋白质，而30分钟过度曝光的胶卷用于确认B104和其他对照样品中蛋白质的不存在。将膜贴在(tape to)曝光胶卷的背面，并通过像素密度(pixel density)分析来定量蛋白质。首先用纯化蛋白质的像素密度生成标准曲线，该曲线用于定量样品中的蛋白质。尽管膜甚至在纯化的标准品中也显示PhiYFP单体和二聚体的条带，但仅将PhiYFP单体用于定量蛋白质表达。然后将蛋白质的值标准化为ng/μL。标准化的总可溶蛋白(TSP)对PhiYFP的比率计算为以ng YFP/mg TSP为单位，或者百万分率(ppm)。
GUS Western印迹分析：以类似于PhiYFP的方式量化GUS蛋白的表达，但有以下例外：将10μL提取物样品用2x Laemmli+2-β-巯基乙醇1:1稀释，在95℃变性30分钟，然后将15μL加载到凝胶中。将处理过的膜和胶卷(1分钟暴露)用像素密度分析用的膜覆盖。
从用双元载体pDAB108706转化的玉蜀黍胚获得的12个转基因T0玉米植物的Western印迹分析的结果显示于图11。双向ZmUbi1启动子显示来自叶组织的yfp和GUS编码序列的有力表达。这些观察确认：与用含有驱动yfp编码序列的单向ZmUbi1启动子的双元质粒(pDAB101556；见图12)转化的玉蜀黍愈伤组织相比，双向ZmUbi1启动子的Min-UbiP1最小启动子元件以相似的表达水平表达YFP。
实施例8：4基因盒叠加的构建
将质粒pDAB105803构建体用作起始质粒来生成由单个玉蜀黍泛素1双向启动子驱动的4基因盒叠加(aad1-2a-Phiyfp和cry34-2a-cry35)。质粒pDAB105803的代表性图谱显示于图16，其含有玉蜀黍泛素1双向启动子。
使用本领域中公知的克隆方法将源自质粒pDAB105841的aad1-2a-Phiyfp片段克隆到质粒pDAB105803的BamHI和SacI切割的载体主链中。这产生中间质粒pDAB105842(图17)。将从质粒pDAB105840获得的经NotI/XbaI消化的cry34(8V6)-2a-cry35片段克隆到质粒pDAB105842的NotI/SpeI位点之间以构建质粒pDAB105843。质粒pDAB105843在ZmUbi1双向启动子的每侧含有cry34(8V6)-2a-cry3和aad1-2a-Phiyfp基因盒(图18)。
经由使用目标质粒pDAB101917的GATEWAY L-R CLONASE反应(Invitrogen,Carlsbad,CA)生成含有来自质粒pDAB105842的ZmUbi1双向启动子、和基因表达盒cry34(8V6)-2a-cry35和Phiyfp-2a-aad1的双元载体。所得载体pDAB108717含有T-DNA边界内的cry34(8V6)-2a-cry35、aad1-2a-Phiyfp和PAT基因表达盒(图19)。
实施例9：第二种4基因盒叠加的构建
将质粒pDAB105803构建体用于生成由单个玉蜀黍泛素-1双向启动子驱动的第二种4基因盒叠加(Phiyfp-2a-aad1和cry34-2a-cry35)。使用本领域中普遍已知的克隆方法将源自质粒pDAB105844的Phiyfp-2a-aad1片段克隆到质粒pDAB105803的BamHI和SacI切割的载体主链中。这产生中间质粒pDAB105845(图20)。将从质粒pDAB105840获得的经NotI/XbaI消化的cry34(8V6)-2a-cry35片段克隆到质粒pDAB105845的NotI/SpeI位点之间以构建质粒pDAB105846(图21)。质粒pDAB105846在ZmUbi1双向启动子的每侧含有cry34(8V6)-2a-cry35和Phiyfp-2a-aad1基因盒。
经由使用目标质粒pDAB101917的GATEWAY L-R CLONASE反应(Invitrogen,Carlsbad,CA)生成含有来自质粒pDAB105846的ZmUbi1双向启动子、和基因盒cry34(8V6)-2a-cry35和Phiyfp-2a-aad1的双元载体。所得载体pDAB108718含有T-DNA边界内的cry34(8V6)-2a-cry35、Phiyfp-2a-aad1和PAT基因表达盒(图21)。
实施例10：根癌土壤杆菌菌株DAt13192的转化
将pDAB108717和pDAB108718双元载体转化到根癌土壤杆菌三重体菌株DAt13192中(参见美国临时专利申请No.61/368965)。分离细菌菌落，提取双元质粒DNA并经由限制酶消化验证。。
实施例11：到玉米中的转化
穗消毒和胚分离：为了获得玉米未成熟的胚，在温室中生长玉蜀黍植物(c.v.B104)并自花授粉或近缘授粉以产生穗。在授粉后约9-12天收获穗。在实验当天，通过将穗浸没到20％的家用漂白剂(其含有5％次氯酸钠)溶液中，摇动20-30分钟，接着在无菌水中漂洗3次对其进行表面消毒。在消毒后，从每个穗无菌切分未成熟的合子胚(1.5–2.2mm)，并随机分配到含有液体感染培养基(LS基础培养基，4.43g/L；N6维生素溶液[1000X]，1.00mL/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；蔗糖，68.5g/L；葡萄糖，36.0g/L；2,4-D，1.50mg/L)的微离心管中。对于给定的实验组，将来自2-3个穗的胚合并用于每项处理。
土壤杆菌培养启动：将含有上文所述双元载体的土壤杆菌菌株的甘油储液划线接种于含有适宜抗生素的AB最小培养板上，并在20℃生长3-4天。挑取单个菌落并划线接种于含有相同抗生素的YEP板上，在28℃温育1-2天。
土壤杆菌培养和共培养：在实验当天，从YEP板挑取土壤杆菌菌落，悬浮于50mL一次性管中的10mL感染培养基中，并将细胞密度调整为OD600＝0.2-0.4nm(使用分光光度计)。将土壤杆菌培养物置于室温100rpm的旋转摇动器上，同时实施胚切分。从消毒过的玉米粒分离大小为1.5-2.2mm的未成熟的合子胚，并置于1mL感染培养基中，在相同培养基中洗涤1次。将土壤杆菌悬液(2mL)添加到每个管中，并将管颠倒约20次，然后摇动10-15分钟。将胚转移到共培养培养基上(MS盐，4.33g/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；肌醇，100.0mg/L；酪蛋白酶水解产物100.0mg/L；Dicamba 3.30mg/L；蔗糖，30.0g/L；GelzanTM，3.00g/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L，AgNo3，15.0mg/L；乙酰丁香酮，100μM)，以盾片朝上取向，并在光照中在25℃温育3-4天。
YFP/Phiyfp瞬时表达：在与土壤杆菌共培养3天后可在经转化的胚中观察到瞬时YFP/Phiyfp表达。使用YFP滤光片和500nm光源在立体显微镜(LeicaMicrosystems,Buffalo Grove,IL)下观察胚。
愈伤组织选择和推定事件的再生：在共培养时段后，将胚转移到无选择剂的静息培养基(MS盐，4.33g/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；肌醇，100.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]，500.0mg/L；酪蛋白酶水解产物，100.0mg/L；Dicamba，3.30mg/L；蔗糖，30.0g/L；GelzanTM，2.30g/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L；AgNO3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)中并在光强度为50μmol m-2s-1的24小时光照中在28℃温育7天。将胚转移到含有3mg/L双丙氨膦的选择1培养基(MS盐，4.33g/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；肌醇，100.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]，500.0mg/L；酪蛋白酶水解产物，100.0mg/L；Dicamba，3.30mg/L；蔗糖，30.0g/L；GelzanTM，2.30g/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L；AgNO3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)中并在光强度为50μmol m-2s-1的24小时光照中在28℃温育7天。
将具有增殖的胚胎发生性愈伤组织的胚转移到含有5mg/L双丙氨膦的选择2培养基上(MS盐，4.33g/L；肌醇，100.0mg/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]，500.0mg/L；酪蛋白酶水解产物，100.0mg/L；Dicamba，3.30mg/L；蔗糖，30.0g/L；GelzanTM2.30g/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L；AgNo3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)并在光强度为50μmol m-2s-1的24小时光照中于28℃再温育14天。该选择步骤允许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。愈伤组织选择期持续3周。将增殖的胚胎发生性愈伤组织转移到含有3mg/L双丙氨膦的再生1培养基上(MS盐，4.33g/L；肌醇，100.0mg/L；L-脯氨酸，350.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]，250.0mg/L；酪蛋白酶水解产物，50.0mg/L；NAA，0.500mg/L；ABA，2.50mg/L；BA，1.00mg/L；蔗糖，45.0g/L；GelzanTM2.50g/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L；AgNO3，1.00mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)并在光强度为50μmol m-2s-1的24小时光照中于28℃培养7天。
将具有芽/萌芽的胚胎发生性愈伤组织转移到含有3mg/L双丙氨膦的再生2培养基上(MS盐，4.33g/L；改良的MS维生素[1000X]，1.00ml/L；肌醇，100.0mg/L；蔗糖，60.0g/L；Gellan Gum G434TM，3.00g/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)。将培养物在光强度为50μmol m-2s-1的24小时光照中于28℃温育7-10天。将具有初生根的小芽转移到phytatray中的芽延长和生根培养基中(MS盐，4.33g/L；N6维生素溶液[1000X]，1.00mL/L；肌醇，100.0mg/L；蔗糖，30.0g/L；琼脂5.50g/L)，并在90μmol m-2s-1的16/8小时光照/黑暗下于28℃温育7天。选择健康的推定转基因小植株，然后在200μmol m-2s-1的16/8小时光照/黑暗下于25℃再温育2-5天，分析转基因拷贝数并转移到温室中。
实施例12：瞬时Phiyfp表达
实施来自用pDAB108717转化的玉蜀黍胚的Phiyfp瞬时表达。双向ZmUbi1启动子可从aad1-2a-Phiyfp基因表达盒表达Phiyfp，其中未转化的胚不显示任何Phiyfp荧光。可从用含有单向玉蜀黍(Zm)Ubi1启动子(驱动单个Phiyfp编码序列)的双元质粒pDAB105748(图15)转化的玉蜀黍胚观察到相似水平的Phiyfp表达，其展现预期水平的YFP/Phiyfp表达。可从用pDAB108718转化的玉蜀黍胚观察到Phiyfp的瞬时表达，其中双向Zm Ubi1启动子能从Phiyfp-2a-aad1基因表达盒表达Phiyfp。
实施例13：稳定转化的玉米中的Phiyfp表达
稳定转化的玉蜀黍愈伤组织中由双向Zm Ubi1启动子驱动的Phiyfp表达：用含有aad1-2a-Phiyfp基因表达盒的pDAB108717双元载体转化的玉蜀黍胚显示良好的Phiyfp表达。双向Zm Ubi1启动子能驱动Phiyfp的有力表达。这些结果确认了双向Zm Ubi1启动子的Min-UbiP1最小启动子元件能够表达报道基因，例如Phiyfp或YFP。Phiyfp蛋白的表达水平相比于用含有单向ZmUbi1启动子(驱动Phiyfp编码序列)的对照双元质粒(pDAB105748)转化的玉蜀黍愈伤组织是相似的。在未用双元构建体转化且不含Phiyfp编码序列的阴性对照愈伤组织中未检测到Phiyfp的表达。
用含有Phiyfp-2a-aad1基因表达盒的pDAB108718双元载体转化的玉蜀黍胚显示良好的Phiyfp表达。双向Zm Ubi1启动子能驱动Phiyfp的有力表达。这些结果确认了双向Zm Ubi1启动子的Min-UbiP1最小启动子元件能够表达报道基因，例如Phiyfp或YFP。
实施例14：转基因拷贝数的估测
使用实时TaqManTMPCR的转基因拷贝数估测：将玉蜀黍植物用含有双向Zm Ubi1启动子的双元载体pDAB108717和pDAB108718转化，而将其他植物用对照双元载体pDAB105748转化。经由TaqMan水解探针测定法确认对pDAB108717和pDAB108718转基因的玉蜀黍植物的基因组中编码序列(Phiyfp、aad1、cry34、cry35、Pat)的存在。分析对于对照载体pDAB105748转基因的植物中Phiyfp序列的存在。获得并分析从愈伤组织发育的稳定转化的转基因玉蜀黍小植株以鉴定含有来自pDAB108717双元载体和pDAB108718双元载体和pDAB105748对照双元载体的低拷贝数(1-2拷贝)的全长T链插入的事件。将确认的小植株放到温室中并生长。
使用Roche Light Cycler480TM系统来测定用pDAB108717和pDAB108718双元载体转化的事件的转基因拷贝数。该方法采用双重反应，其在单个测定中采用特异于编码序列和内源性玉蜀黍参照基因转化酶(Genbank登录号：U16123.1)的寡核苷酸。通过测量相对于转化酶特异性荧光的编码序列特异性荧光的强度来测定拷贝数和配型，与拷贝数已知的标准品相比较。
表7.正向和反向核苷酸引物和荧光探针(由Integrated DNA Technologies,Coralville,IA合成).
对于用pDAB108717和pDAB108718双元载体转化的玉蜀黍样品，用含有经FAM荧光染料标记的探针的一个引物/探针集来扩增编码序列特异性DNA片段，并使用含有经HEX荧光标记的探针的第二引物/探针集来扩增转化酶(表7)。如表8中所列的制备PCR反应混合物，并依照表9中列出的条件扩增基因特异性DNA片段。通过测量编码序列特异性的荧光对参照基因转化酶特异性的荧光的相对强度来测定样品的拷贝数和配型，与拷贝数已知的标准品相比较。
通过将载体(pDAB108717或pDAB108718)稀释到玉蜀黍B104基因组DNA(gDNA)中以获得具有已知的载体:gDNA关系的标准品，来创建标准品。例如，制备具有1、2和4个拷贝的载体DNA每1拷贝玉蜀黍B104gDNA的样品。将载体的1个和2个拷贝稀释物与玉蜀黍B104gDNA标准品混合，对比已知为半合的对照玉蜀黍事件和已知为纯合的对照玉蜀黍事件进行验证。(玉蜀黍事件278；参见PCT国际专利公开文本No.WO 2011/022469A2)。实施利用特异于编码序列基因的寡核苷酸和特异于内源玉蜀黍参照基因转化酶的寡核苷酸的biplex测定法，其通过用含有经FAM荧光染料标记的探针的一个引物/探针集来扩增和检测编码序列的基因特异性DNA片段，和用含有经HEX荧光标记的探针的第二引物/探针集来扩增和检测转化酶的基因特异性DNA片段。依照表7，如表8中列出的制备编码序列反应混合物，并依照表9中列出的条件扩增特异性片段。
表8.PCR反应混合物.
反应数 各μl 终浓度
H2O 0.5μL -
PVP(10％) 0.1μL 0.1％
ROCHE 2X主预混物(Master Mix) 5.0μL 1X
编码序列正向引物(10μM) 0.4μL 0.4μM
编码序列反向引物(10μM) 0.4μL 0.4μM
编码序列探针UPL#125(5μM) 0.4μL 0.2μM
转化酶正向引物(10μM) 0.4μL 0.4μM
转化酶反向引物(10μM) 0.4μL 0.4μM
转化酶探针(5μM) 0.4μL 0.2μM
模板DNA 2.0μL -
总反应体积 10μL -
使用Roche LightCycler 480TM热循环仪依照制造商指导分析每个反应生成的荧光水平。FAM荧光模块在465/510nm的光密度激发，而HEX荧光模块在533/580nm的光密度激发。可以通过比较未知样品的靶物/参照值(LightCycler 480TM输出)对4个拷贝数已知的标准品(例如空、1拷贝(半)、2拷贝(纯)、和4拷贝)的靶物/参照值来测定拷贝数。
表9.PCR扩增的热循环仪条件.
表10汇总了对用双向ZmUbi1启动子构建体(pDAB108717和pDAB108718)转化获得的转基因植物，和用对照单向ZmUbi1启动子Phiyfp构建体(pDAB105748)转化获得的转基因植物的转基因拷贝数分析的结果。仅将具有所有转基因的1-2个拷贝的植物转移到温室中用于进一步表达分析。
表10.从双向启动子和对照构建体获得的转基因植物的转基因拷贝数估测.
实施例15：玉米T0植物中的稳定Phiyfp表达
由双向Zm Ubi1启动子驱动的玉蜀黍T0植物中的稳定Phiyfp表达：可以观察到用含有aad1-2a-Phiyfp基因表达盒的pDAB108717双元载体转化的玉蜀黍胚。双向Zm Ubi1启动子能驱动Phiyfp在抽芽和根组织两者中的有力表达。结果确认了双向Zm Ubi1启动子的Min-UbiP1最小启动子元件能够表达报道基因，例如使用2A序列与aad1双顺反子式融合的Phiyfp或YFP。Phiyfp蛋白的表达水平与用含有驱动Phiyfp编码序列的单向Zm Ubi1启动子的对照双元载体(pDAB105748)转化的玉蜀黍胚是相似的。在未用双元构建体转化且不含Phiyfp编码序列的阴性对照植物中未检测到Phiyfp的表达。
用含有Phiyfp-2a-aad1基因表达盒的pDAB108718双元载体转基因的玉蜀黍T0植物的叶和根组织中可以观察到Phiyfp表达。双向Zm Ubi1启动子能驱动Phiyfp的有力表达。结果确认了双向Zm Ubi1启动子的Min-UbiP1最小启动子元件能够表达报道基因，例如使用2A序列与aad-1融合的Phiyfp或YFP。
实施例16：Cry34、Cry35和AAD1蛋白分析
将植物取样到矩阵盒的1-10列的1.5mL锥形管中，向管中添加1个钢珠，然后加入PBST+0.5％BSA(0.6mL)。然后，然后在Geno研磨器中将盒以1500rpm进行珠击打达5分钟磨碎样品，接着在4℃以3700rpm离心7分钟。
Cry34/35ELISA测定法：在另一个96深孔板中，将提取物样品在PBST+1％blotto中1:200稀释。然后，将两体积的25μL稀释样品转移到已排列有抗Cry34和抗Cry35(Meso Scale Discovery)的另外的96孔板中。在每个板的第11和12行，添加标准浓度的PBST+1％blotto中的Cry34和Cry35(25μL)。然后将板在震荡下室温温育1小时。然后将板用PBST(3x300μL)洗涤。然后，向每个孔添加25μL SulfoTAG缀合的抗Cry34和抗Cry35的溶液，并在室温摇动下温育1小时。然后将板用PBST(3x300μL)洗涤。接着添加一体积的150μLRead Buffer T(Meso Scale Discovery)并立即在6000阅读器上对板读数。可使用从同一板生成的相应蛋白质的标准曲线计算样品中的蛋白质浓度。
AAD-1ELISA测定法：在另外的96深孔板中，将提取物样品在PBST+0.5％BSA中1:20稀释。然后，将两体积的200μL的稀释样品转移到已用抗AAD1(由Acadia Bioscience LLC提供)包被的另外的96孔板中。在每个板的第11和12行，添加标准浓度的PBST+0.5％BSA中的AAD1(200μL)。然后向每个孔添加一体积50μL的生物素化抗AAD1，并将板在震荡下室温温育1小时。然后将板用PBST(5x300μL)洗涤。然后，向每个孔添加100μL的链霉亲合素-碱性磷酸酶缀合物溶液，并在室温温育30分钟。接着将板用PBST(5x300μL)洗涤。接着添加一体积的100μL底物(对硝基苯磷酸盐，PNPP)并在震荡下室温温育45分钟。然后在SpectraMax M5板阅读器(Molecular Devices)上在A405处对板读数。可使用从同一板生成的标准曲线来计算样品中的蛋白质浓度。
实施例17：玉米T0植物的蛋白质分析
对由双向玉蜀黍泛素1启动子构建体(pDAB108717)驱动的玉米T0植物的蛋白质分析：对从用含有cry34-2a-cry35和aad1-2a-Phiyfp的pDAB108717转化的玉蜀黍胚获得的11个转基因T0玉米植物的代表性ELISA分析汇总于表11。双向Zm Ubi1启动子在叶中显示Cry34和Cry35编码序列两者的有力表达。令人惊讶地，蛋白质数据显示来自双向构建体pDAB108717的Cry34表达比单向Zm Ubi1驱动的构建体高最多达4倍。同样未预料到的是，还观察到来自双向构建体pDAB108717的Cry35和AAD1蛋白表达比单向Zm Ubi1驱动的构建体高8-10倍。这些观察显示，与用含有驱动相同基因的单向Zm Ubi1启动子，其中每个编码序列由独立的Zm Ubi1启动子驱动的双元质粒转化的玉蜀黍植物相比，构建体pDAB108717中的单个Zm泛素1双向启动子表达能够以出人预料的更高水平表达多个基因(例如Cry34、Cry35和AAD1)。
由双向玉蜀黍泛素1启动子构建体(pDAB108717)驱动的玉米T0植物的Cry34和Cry35表达相关性：对从用含有cry34-2a-cry35的pDAB108717转化的玉蜀黍胚获得的11个转基因T0玉米植物中Cry34和Cry35蛋白之间的相关性分析显示于图23A。非常高的相关性(R平方＝0.98)显示来自由双向Zm Ubi1启动子驱动的cry34-2a-cry35基因表达盒的Cry34和Cry35之间的强表达共调节。
表11.T0玉米pDAB108717转基因植物中的Cry34/Cry35/AAD1表达
植物ID Cry34ng/cm2 Cry35ng/cm2 AAD1ng/cm2
108717[1]-032.001 277 294 137
108717[3]-067.001 85 93 130
108717[2]-137.001 427 467 6
108717[1]-027.001 484 563 185
108717[1]-036.001 0 0 -7
108717[2]-107.001 219 296 112
108717[2]-113.001 0 0 -12
108717[2]-115.001 160 175 68
108717[2]-118.001 196 179 -5
108717[2]-125.001 318 335 193
108717[2]-127.001 115 127 101
Zm Ubi-Cry34/Cry35 110 67 18
对由双向玉蜀黍泛素1启动子构建体(pDAB108718)驱动的玉米T0植物的蛋白质分析：对从用含有cry34-2a-cry35的pDAB108718转化的玉蜀黍胚获得的11个转基因T0玉米植物的代表性ELISA分析汇总于表12。双向Zm Ubi1启动子显示Cry34和Cry35编码序列两者在叶中的有力表达。蛋白质数据显示比单向Zm Ubi1驱动的构建体高多达几倍的来自双向构建体pDAB108718的Cry34、Cry35和AAD1蛋白表达。这些观察确认，构建体pDAB108718中的玉蜀黍泛素1双向启动子能以相比于用含有单向Zm Ubi1启动子(驱动相同基因，其中每个编码序列由独立的Zm Ubi1启动子驱动)的双元质粒转化的玉蜀黍植物未预料到的更高水平来表达多个基因(例如Cry34、Cry35和AAD1)。
由双向玉蜀黍泛素1启动子构建体(pDAB108718)驱动的玉米T0植物的Cry34和Cry35表达相关性：对从用含有cry34-2a-cry35的pDAB108718转化的玉蜀黍胚获得的11个转基因T0玉米植物中Cry34和Cry35蛋白之间的相关性分析显示于图23B。非常高的相关性(R平方＝0.98)显示来自由双向Zm Ubi1启动子驱动的cry34-2a-cry35基因表达盒的Cry34和Cry35之间的强表达共调节。
表12.T0玉米pDAB108718转基因植物中的Cry34/Cry35/AAD1表达
实施例18：转基因叠加：合成的双向启动子(T1数据)
由双向玉蜀黍泛素1启动子构建体驱动的T1植物的基因表达：选择每构建体10至12个单拷贝事件用于分析，例外的是对照构建体pDAB108716仅具有一个事件。对于V6阶段测试5个植物/事件，而对于V10-12和/R3阶段测试3个植物/事件。使用LCMS或ELISA进行蛋白质测定。
本实施例中使用的构建体显示于图26。pDAB108706(ZMUbi双向(-200))和pDAB108707(ZMUbi双向(-90))是具有本发明的代表性双向启动子的构建体；pDAB101556(ZmUbi1-YFP对照)和pDAB108716(ZMUbi1无最小启动子)充当具有单向启动子的对照构建体。
对于YFP蛋白(LCMS)来自4种构建体的按ng/cm2计的例示性表达结果(V6)显示于图27A，而对于YFP RNA来自4种构建体的例示性相对表达结果(V6)显示于图27B。
对于GUS蛋白(LCMS)来自4种构建体的按ng/cm2计的例示性表达结果(V6)显示于图28A，而对于GUS RNA来自4种构建体的例示性相对表达结果(V6)显示于图28B。
对于AAD1蛋白(LCMS)来自4种构建体的按ng/cm2计的例示性表达结果(V6)显示于图29A，而对于AAD1RNA来自4种构建体的例示性相对表达结果(V6)显示于图29B。
对于YFP蛋白(LCMS)来自4种构建体的按ng/cm2计的表达结果(V6)的统计学分析显示于图30A，且对于pDAB108707、pDAB108706、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为57.63、52.66、49.75和0。对于YFP RNA来自4种构建体的相对表达结果(V6)的统计学分析显示于图30B，且对于pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为9.96、8.07、6.95和1.01。
对于GUS蛋白(LCMS)来自4种构建体的按ng/cm2计的表达结果(V6)的统计学分析显示于图31A，且对于pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为151.27、143.22、0和213.17。对于GUS RNA来自4种构建体的相对表达结果(V6)的统计学分析显示于图31B，且对于pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为0.65、0.78、0和3.03。
对于AAD1蛋白(LCMS)来自4种构建体的按ng/cm2计的表达结果(V6)的统计学分析显示于图32A，且对于pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为710.88、1417.01、856,58和1795.43。对于AAD1RNA来自4种构建体的相对表达结果(V6)的统计学分析显示于图32B，且对于pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为1.33、1.37、1.93和2.93。
图33A、33B和33C分别显示对于YFP、AAD1和GUS蛋白(LCMS)来自4种构建体的以ng/cm2计的例示性表达结果(V10)。
图34A、34B和34C分别显示对于YFP、GUS和AAD1蛋白(LCMS)来自4种构建体的以ng/cm2计的表达结果(V10)的统计学分析。对于YFP(图34A)，pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为71.77、81.81、49.58和23.01。对于GUS(图34B)，pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为109.63、98.25、0和138.02。对于AAD1(图34C)，pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为666.11、597.80、715.12和1002.84。
图35A、35B和35C分别显示对于FP、GUS和AAD1蛋白(LCMS)来自4种构建体的以ng/cm2计的例示性表达结果(R3)。
图36A、36B和36C分别显示来自4种构建体的对于YFP、GUS和AAD1蛋白(LCMS)以ng/cm2计表达结果(R3)的统计学分析。对于YFP(图36A)，pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为91.38、49.49、21.67和0.40。对于GUS(图36B)，pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为5.52、16.81、1.07和46.60。对于AAD1(图36C)，pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556和pDAB108716的均值分别为156.71、153.44、165.40和197.80。
结果显示本发明的玉米Ubi1双向启动子能驱动GUS和YFP的有力表达，其中来自玉米Ubi1双向启动子的YFP表达类似于单向玉米Ubi1驱动的YFP。结果还表明，双向转录对于GUS表达具有不显著的影响(GUS表达相比于缺少最小启动子的构建体无YFP表达)。
实施例19：驱动4个转基因从单个启动子的双向启动子和2A双顺反子序列的组合(T1数据)
由双向玉蜀黍泛素1启动子构建体驱动的T1植物的基因表达：选择每构建体10至12个单拷贝事件用于分析，例外的是对照构建体具有4至5个事件每构建体。对于V6阶段测试5个植物/事件，而对于V10-12和/R3阶段测试3个植物/事件。使用LCMS或ELISA进行蛋白质测定。
图37A显示来自4种构建体pDAB105748(ZMUbi1-YFP)、pDAB105818(ZMUbi1-Cry34/ZMUbi1-Cry35/ZMUbi1-AAD1)、pDAB108717(YFP/AAD-1-ZMUbi1双向-Cry34-Cry35)和pDAB108718(AAD1/YFP-ZMUbi1双向-Cry34-Cry35)的Cry34RNA的例示性相对表达结果(V6)。图37B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry34蛋白(LCMS)的例示性相对表达结果(V6)。
图38A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的AAD1RNA的例示性相对表达结果(V6)。图38B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的AAD1蛋白(LCMS)的例示性相对表达结果(V6)。
图39A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP RNA的例示性相对表达结果(V6)。图39B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP蛋白(LCMS)的例示性相对表达结果(V6)。
图40A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry35RNA的例示性相对表达结果(V6)。图40B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry35蛋白(ELISA)的例示性相对表达结果(V6)。
图41显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的PAT RNA的例示性相对表达结果(V6)。
图42A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry34RNA的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为0、2.42、2.67和2.25。图42B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry34蛋白的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为0、596.94、2044.73和719.18。
图43A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的AAD1RNA的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为0、1.98、2.68和2.03。图48B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的AAD1蛋白的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为0、2237.54、5763.88和2379.15。
图44A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP RNA的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为3.59、0、2.78和1.95。图44B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP蛋白的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为1420.69、251.68、1154.04和706.04。
图45A显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry35RNA的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为0、1.12、3.74和3.20。图45B显示来自相同的4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的Cry35蛋白的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为0、283.54、635.83和90.97。
图46显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的PAT RNA的表达结果(V6)的统计学分析，均值分别为1.56、0.07、1.46和1.01。
图47A、47B、47C和47D分别显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP、AAD1、Cry34和Cry35的例示性蛋白质表达结果(V10)。
图48A、48B、48C和48D分别显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP、AAD1、Cry34和Cry35的蛋白质表达结果(V10)的统计学分析。
图49A、49B、49C和49D分别显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP、AAD1、Cry34和Cry35的例示性蛋白质表达结果(R3)。
图50A、50B、50C和50D分别显示来自4种构建体pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717和pDAB108718的YFP、AAD1、Cry34和Cry35的蛋白质表达结果(R3)的统计学分析。
图51显示来自pDAB108718和pDAB108717的Cry34、Cry35和AAD1蛋白质表达的Western印迹的例示性结果。
该结果显示单启动子驱动的构建体中的所有4个转基因是功能性的，具有良好的表达水平。Ubi1双向叠加中的3种基因(Cry34/Cry35/AAD1)显示与由单Ubi1驱动的基因叠加(DExT)所提供的表达水平相似的有力表达水平。
尽管在上文已论述了许多例示性的方面和实施方案，但本领域技术人员会认可其特定修改、置换、添加和子组合。因此，意图将所附权利要求和以后引入的权利要求解释为包括所有这类修改、置换、添加和子组合，如在其真实精神和范围内的。

Claims (66)

1.一种合成多核苷酸，其包含来自玉蜀黍(Zea mays)或大刍草(Zea luxurians)的泛素-1基因的最小核心启动子元件。
2.权利要求1的合成多核苷酸，其中所述最小核心启动子元件包含与SEQ IDNO:1或其互补物至少75％相同的多核苷酸序列。
3.权利要求1的合成多核苷酸，其中所述最小核心启动子元件包含选自下组的多核苷酸序列：SEQ ID NO:1和15-39。
4.权利要求1的合成多核苷酸，其中所述最小核心启动子元件包含SEQ IDNO:1或其互补物。
5.权利要求1的合成多核苷酸，其还包含来自泛素-1基因的外显子和来自泛素-1基因的内含子。
6.权利要求1的合成多核苷酸，其还包含来自泛素-1基因的上游调控序列。
7.权利要求6的合成多核苷酸，其中所述上游调控序列包含SEQ ID NO:4或其互补物。
8.权利要求1的合成多核苷酸，其还包含选自下组的元件：上游调控序列(URS)、增强子元件、外显子、内含子、转录起始位点、TATA框、热休克共有元件、及其组合。
9.权利要求1的合成多核苷酸，其还包含可操作地连接于所述最小核心启动子元件的目的核苷酸序列。
10.权利要求1的合成多核苷酸，其还包含来自玉蜀黍或大刍草的第二最小核心启动子元件，其中所述两个最小核心启动子元件相对于彼此在所述多核苷酸中处于反向互补的取向。
11.权利要求10的合成多核苷酸，其还包含来自泛素-1基因的外显子和来自泛素-1基因的内含子。
12.权利要求11的合成多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3或其互补物。
13.权利要求10的合成多核苷酸，其还包含来自泛素-1基因的上游调控序列。
14.权利要求13的合成多核苷酸，其中所述上游调控序列包含SEQ ID NO:4或其互补物。
15.权利要求10的合成多核苷酸，其还包含选自下组的元件：上游调控序列(URS)、外显子、内含子、转录起始位点、TATA框、热休克共有元件、翻译起始和/或终止核苷酸序列、及其组合。
16.权利要求15的合成多核苷酸，其包含SEQ ID NO:5或其互补物。
17.权利要求10的合成多核苷酸，其包含第一目的核苷酸序列，该第一目的核苷酸序列可操作地连接于所述最小核心启动子元件之一。
18.权利要求17的合成多核苷酸，其包含第二目的核苷酸序列，该第二目的核苷酸序列可操作地连接于未与所述第一目的核苷酸序列可操作地连接的最小核心启动子元件。
19.一种用于产生转基因细胞的方法，所述方法包括：
用权利要求1的多核苷酸转化所述细胞。
20.一种用于产生转基因细胞的方法，所述方法包括：
用权利要求10的多核苷酸转化所述细胞。
21.依照权利要求18的方法，其中所述细胞是植物细胞。
22.依照权利要求19的方法，其中所述细胞是植物细胞。
23.包含权利要求1的多核苷酸的植物细胞。
24.包含权利要求10的多核苷酸的植物细胞。
25.包含权利要求23的植物细胞的植物。
26.包含权利要求24的植物细胞的植物。
27.一种用于在植物细胞中表达目的核苷酸序列的方法，该方法包括将目的核苷酸序列导入植物细胞，所述目的核苷酸序列可操作地连接于用于以方向非依赖的方式启动转录的手段。
28.一种用于在植物细胞中表达目的核苷酸序列的方法，该方法包括将目的核苷酸序列导入植物细胞，所述目的核苷酸序列可操作地连接于用于启动两个可操作地连接的目的核苷酸序列的转录的手段。
29.依照权利要求28的方法，所述方法包括向植物细胞中导入核酸，所述核酸包含：
(a)目的核苷酸序列，其可操作地连接于所述用于启动两个可操作地连接的目的核苷酸序列的转录的手段；和
(b)第二目的核苷酸序列，其可操作地连接于所述用于启动两个可操作地连接的目的核苷酸序列的转录的手段。
30.权利要求5的合成多核苷酸，其中所述外显子来自玉蜀黍或大刍草的泛素-1基因。
31.依照权利要求29的方法，其中用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的所述手段包含SEQ ID NO:5或其互补物。
32.依照权利要求29的方法，其中将所述核酸导入所述植物细胞，从而将可操作地连接于所述用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的手段的所述目的核苷酸序列靶定到所述植物细胞DNA中的预定位点。
33.依照权利要求32的方法，其中利用锌指核酸酶介导的重组将可操作地连接于所述用于启动两个可操作连接的目的核苷酸序列转录的手段的所述目的核苷酸序列靶定到所述预确定的位点。
34.一种用于在植物细胞和/或组织中表达多个基因的核酸构建体，包含：
(a)双向启动子；和
(b)位于所述双向启动子的相反端的两个基因表达盒；
其中至少一个所述基因表达盒包含通过翻译开关(switch)连接的两个或更多个基因。
35.权利要求34的核酸构建体，其中所述双向启动子不包含病毒序列。
36.权利要求34的核酸构建体，其中所述双向启动子包含至少一个增强子。
37.权利要求34的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含用于土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化的双元载体。
38.权利要求34的核酸构建体，其中所述双向启动子包含选自下组的元件：上游调控序列(URS)、增强子元件、外显子、内含子、转录起始位点、TATA框、热休克共有元件、及其组合。
39.权利要求34的核酸构建体，其中所述双向启动子包含来自玉蜀黍或大刍草的泛素-1基因的最小核心启动子元件。
40.权利要求39的核酸构建体，其中所述双向启动子还包含来自玉蜀黍或大刍草的第二最小核心启动子元件，其中所述两个最小核心启动子元件相对于彼此处于反向互补的取向。
41.权利要求39的核酸构建体，其中所述最小核心启动子元件包含与SEQ IDNO:1或其互补物至少75％相同的多核苷酸序列。
42.权利要求39的核酸构建体，其中所述双向启动子包含来自泛素-1基因的外显子和/或来自泛素基因的内含子。
43.权利要求42的核酸构建体，其中所述双向启动子包含SEQ ID NO:3的多核苷酸或其互补物。
44.权利要求42的核酸构建体，其中所述双向启动子包含来自泛素基因的上游调控序列。
45.权利要求44的核酸构建体，其中所述来自泛素基因的上游调控序列包含SEQ ID NO:4的多核苷酸或其互补物。
46.权利要求34的核酸构建体，其中所述双向启动子包含SEQ ID NO:5的多核苷酸或其互补物。
47.权利要求34的核酸构建体，其中所述双向启动子包含来自泛素基因的上游调控序列(URS)。
48.权利要求47的核酸构建体，其中所述双向启动子包含：
(i)不同于泛素基因启动子的启动子，和
(ii)来自泛素基因的上游调控序列(URS)。
49.权利要求34的核酸构建体，其中所述两个基因表达盒均包含通过翻译开关连接的两个或更多个基因。
50.权利要求34的核酸构建体，其中所述翻译开关选自下组：内部核糖体进入位点(IRES)、可变剪接位点、核酶切割位点、编码2A肽的多核苷酸序列、编码2A样肽的多核苷酸序列、编码蛋白质内含子的多核苷酸序列、编码蛋白酶切割位点的多核苷酸序列、及其组合。
51.权利要求34的核酸构建体，其中在所述翻译开关上游的基因不包含翻译终止密码子。
52.权利要求33的核酸构建体，其中所述核酸构建体使至少4个基因能够表达。
53.权利要求34的核酸构建体，其中所述核酸构建体使3至20个基因能够表达。
54.权利要求53的核酸构建体，其中所述核酸构建体使4至8个基因能够表达。
55.权利要求34的核酸构建体，其中来自所述双向启动子的基因表达是单向启动子的至少4倍。
56.权利要求34的核酸构建体，其中来自所述双向启动子的基因表达是单向启动子的3至10倍。
57.一种用于生成转基因植物的方法，包括用权利要求34的核酸构建体来转化植物细胞。
58.一种用于生成转基因细胞的方法，包括用权利要求34的核酸构建体来转化细胞。
59.包含权利要求34的核酸构建体的植物细胞。
60.权利要求59的植物细胞，其中所述核酸构建体被稳定地转化入所述植物细胞中。
61.包含权利要求34的核酸构建体的转基因植物。
62.权利要求61的转基因植物，其中所述核酸构建体被稳定地转化入所述转基因植物的细胞中。
63.一种用于在植物细胞和/或组织中表达多个基因的方法，包括将权利要求34的核酸构建体导入所述植物细胞和/或组织中。
64.权利要求63的方法，其中用权利要求34的核酸构建体稳定转化所述植物细胞和/或组织。
65.一种用于土壤杆菌介导的转化的双元载体，其包含权利要求34的核酸构建体。
66.一种用于土壤杆菌介导的转化的双元载体，其包含权利要求1的合成多核苷酸。
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