TWI601739B

TWI601739B - 合成性雙向植物啟動子ｕｂｉ１的建構物及方法

Info

Publication number: TWI601739B
Application number: TW101144314A
Authority: TW
Inventors: 庫瑪山迪普; 迪亞阿貝德; 泰瑞Ｒ萊特; 曼如古普塔
Original assignee: 陶氏農業科學公司
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2017-10-11
Also published as: EP2797406A1; CA2855902A1; ZA201402992B; RU2639538C2; EP2797406B1; AU2012363062A1; EP2797406A4; IL233452A0; AR089510A1; CN104135851B; RU2014131448A; US9422569B2; BR112014014037A2; BR112014014037B1; CA2855902C; US20130254943A1; SA112340162B1; JP2015503342A; JP6220794B2; HK1201121A1

Description

合成性雙向植物啟動子UBI1的建構物及方法

優先權主張

本申請案主張提申日為2011年12月30日之美國臨時專利申請案序號61/582,138的利益。本申請案亦主張提申日為2012年3月29日之美國臨時專利申請案序號61/617,252的利益。

發明領域

本發明一般而言係有關於植物分子生物學的領域，以及更特別地有關於基因轉殖植物內穩定表現多重基因的領域。

發明背景

許多的植物物種能夠用來自其他的物種的轉基因(transgenes)予以轉形以導入農藝上所欲的性狀或特徵，舉例而言，改善營養價值品質、增加產量、賦予害蟲或疾病之抗性、增加乾旱與壓力耐受性、改善園藝品質(例如色素沈著與生長)、授予除草劑抗性、賦予生產來自植物之工業上有用的化合物及/或材料的能力，及/或賦予藥物生產的能力。導入轉基因至植物細胞內以及含有轉基因之穩定整合複本的可孕性基因轉殖植物之隨後的回收可以使用來生產擁有所欲的性狀之基因轉殖植物。

基因表現的控制與調控能透過許多的機制而發生。一基因之轉錄起始為基因表現之主要的控制機制。轉錄的起始一般係藉由位於轉錄的基因之5’的側面或上游區域的多核苷酸序列來控制。此等序列全體提及為啟動子。啟動子一般含有RNA聚合酶開始轉錄的訊息以便能生產信使RNA(mRNA)。成熟的mRNA係藉由核糖體來轉譯，由此合成蛋白質。結合DNA的蛋白質與啟動子DNA序列專一地互相作用以促進轉錄複合物的形成以及起始基因表現進程。有由植物單離且予以特徵化之各種各樣的真核啟動子，其等對於驅動植物內的轉基因之表現為功能性的。已經單離且特徵化影響基因對環境的刺激的反應、營養的可利用性，或是不利的病況，包括熱休克、厭氧生活，或是存在重金屬，之表現的啟動子。亦有在整個發育期間或是以組織，或器官專一的方式來控制基因表現的啟動子。此外，由細菌與病毒單離的原核的啟動子已經經單離以及予以特徵化，其等對於驅動植物內的轉基因之表現為功能性的。

一種典型的真核啟動子係由最小啟動子與其他的順式單元所組成的。最小啟動子實質上為一種TATA盒(TATA box)區域，RNA聚合酶II(polII)、TATA結合蛋白質(TBP)，以及TBP附著因子(TAFs)可以結合至TATA盒區域以起始轉錄。然而於大部分的情況中，除了TATA部分(motif)，需要序列單元用於準確的轉錄。已經發現此等序列單元(舉例而言，增強子)通常以位置及/或方向無關性方式提高附近的基因之整體的表現位準。接近一些polII基因的轉錄起始位址(舉例而言，INR序列)之其他的序列可以提供亦貢獻轉錄活化之因子任擇的結合位址，甚至任擇地提供缺少功能性TATA單元的啟動子之轉錄的核心啟動子結合位址。見舉例而言，Zenzie-Gregory等人(1992)J.Biol.Chem.267：2823-30。

其他的基因調節單元包括與專一性的DNA的結合因子互相作用的序列。此等序列的部分有時提及為順式單元，以及通常為位置依賴性和方向依賴性，雖然可以發現其等對一基因的編碼序列為5’或是3’，或是於內含子內。會單獨地或是以組合方式結合組織專一性的或是發育專一性的轉錄因子之此等順式單元可以決定轉錄位準之啟動子的時空表現模式。上游的順式單元的配置，接著一個最小啟動子，典型地建立特定的啟動子之極性。已經選殖且廣泛地使用於基礎研究和生物科技應用兩者之植物內的啟動子一般為單向的，僅僅指示已經融合於其之3’端(亦即，下游)的一個基因。見，舉例而言，Xie等人(2001)Nat.Biotechnol.19(7)：677-9；美國專利第6,388,170號。

植物啟動子內已經鑑定出許多的順式單元(或“上游調節序列”)。此等順式單元於運用其等之可操作地連結的基因之控制的類型上廣泛地變化。一些單元作用來增加可操作地連結的基因因應環境的反應(舉例而言，溫度、濕氣，以及傷損)之轉錄。其他的順式單元能對發育的提示(舉例而言，發芽、種子成熟，以及開花)作出反應或是對空間資訊(舉例而言，組織專一性)作出反應。見，舉例而言，Langridge等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3219-23。專一性啟動子單元之控制的類型典型為啟動子之內在的品質；亦即，在此一啟動子控制之下的異源性基因很可能會依據單離出啟動子單元之天然的基因之控制來表現。此等單元亦典型可以與其他的單元交換以及維持其等對於基因表現之特有的內在控制。

代謝工程和性狀堆疊(trait stacking)通常必需導入多重基因至植物內，該等基因透過同一的啟動子或是同源啟動子來頻繁地控制。然而，當多重導入的轉基因具有同源啟動子驅動其等時，很可能出現同源為基礎的基因靜默(homology based gene silencing)(HBGS)。見，舉例而言，Mol等人(1989)Plant Mol.Biol.13：287-94。已經有報導HBGS廣泛地發生於基因轉殖植物內。見，舉例而言，Vaucheret and Fagard(2001)Trends Genet.17：29-35。已經有暗示數個機制來解釋HBGS現象，其等之全部均包括以下特徵，啟動子內的序列同源性會觸發導致重複基因的靜默之細胞的識別機制。見，舉例而言，Matzke and Matzke(1995)Plant Physiol.107：679-85；Meyer and Saedler(1996)Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.47：23-48；Fire(1999)Trends Genet.15：358-63；Hamilton and Baulcombe(1999)Science 286：950-2；以及Steimer等人(2000)Plant Cell 12：1165-78。

避免基因轉殖植物內之HBGS的策略常常涉及發展功能上等效但是具有最小的序列同源性之合成性啟動子。當使用此等合成性啟動子來表現作物植物內的轉基因時，其等可以輔助避免或是減少HBGS。見，舉例而言，Mourrain等人(2007)Planta 225(2)：365-79；Bhullar等人(2003)Plant Physiol.132：988-98。此等啟動子可以藉由以新穎的或是合成性延伸(stretch)的DNA導入已知的順式單元而產生，或是任擇地藉由“領域調換(domain swapping)”而產生，領域調換中一個啟動子的領域係以來自其他的異源性啟動子之功能上等效的領域來代替。

因而，對於有效地穩定表現多重轉基因伴隨於基因轉殖植物內在育種或是多代期間轉基因之重組或是損失之最小的風險之建構物和方法仍然有需求。

發明概要

本文中揭示將一個Ubi1極性啟動子轉變成合成性雙向啟動子的方法，以使得一種合成性啟動子的之可以指示位於該啟動子的側面之二個基因的表現。於一些具體例中，一種用於將一個Ubi1極性啟動子轉變成一個合成性雙向啟動子的方法可以包含，舉例而言且不限於，鑑定一個Ubi1啟動子之最小啟動子單元核苷酸序列；及/或提供一種核酸，其包含以相反方向來定向的2個最小Ubi1啟動子單元核苷酸序列。於特定的具體例中，一種核酸可以包含相反方向定向的2個最小Ubi1啟動子單元核苷酸序列，以使得各個最小啟動子單元最接近對應的天然的Ubi1基因的末端比起鄰近可操作地連結至該啟動子單元之編碼序列的該核酸的末端更遠離其他的最小啟動子單元。於一些具體例中，最小Ubi1啟動子單元係單離自玉米(maize)。可以建造成一種合成性雙向啟動子所包括之額外的天然的Ubi1啟動子單元包括包括Ubi1內含子、Ubi1外顯子，及/或Ubi1上游的啟動子區域之全部或部分。於一些具體例中，一種合成性雙向啟動子可以包含前述的任一者之一者以上。

再者，本文中揭示為Ubi1最小啟動子，其等可以用於建構合成性啟動子(舉例而言，合成性雙向啟動子)，以及由前述的方法所生產的特定的合成性啟動子。於一些具體例中，一種合成性雙向啟動子為一種能夠控制植物細胞內可操作地連結的核苷酸序列之轉錄的啟動子。舉例而言，於特定的具體例中之一種合成性雙向啟動子可能能夠控制位於該啟動子的側面之2個可操作地連結的核苷酸序列之轉錄。

本發明之特定的具體例包括細胞(舉例而言，植物細胞)，其包含一種Ubi1最小啟動子或其之功能性等效物。舉例而言，特定的具體例包括一種細胞，其包含一種包括一種Ubi1最小啟動子或其之功能性等效物的合成性啟動子(舉例而言，一種合成性雙向啟動子)。如特定的具體例之植物細胞可以出現於一種細胞培養物、組織、植物的部分，及/或全株植物內。因而，一些具體例中含括了包含一種含有Ubi1最小啟動子或其之功能性等效物的細胞的一種植物(舉例而言，單子葉植物或是雙子葉植物)。

本發明的一些具體例包括一構件，該構件係供用於以與方向無關性(direction-independent)方式來起始轉錄。供用於以與方向無關性方式來起始轉錄的構件包括序列辨識編號：1之Ubi1最小啟動子。本發明的一些具體例包括一種用於使有興趣的2個可操作地連結的核苷酸序列之起始轉錄的構件。用於使有興趣的2個可操作地連結的核苷酸序列之起始轉錄的構件包括序列辨識編號：5之合成性雙向Ubi1啟動子。

前述及其他的特徵從下列數個參照附圖進展的具體例之詳細說明會變得更顯而易見。

亦提供了用於表現多重基因於植物細胞及/或植物組織內的建構物和方法。所提供的建構物包含連結至多重基因表現匣的至少一個雙向啟動子。於一些具體例中，所提供的建構物和方法使用一種來自玉蜀黍(Zea mays)的泛素-1基因，或是其之功能性等效物的最小核心啟動子單元為基礎的雙向啟動子。於一些具體例中，所提供的建構物和方法允許3個和20個之間的基因表現。

於一態樣中，提供了一種合成性多核苷酸，其包含一種來自玉蜀黍或繁茂種玉蜀黍(Zea luxurians)的泛素-1基因之最小核心啟動子單元。於一具體例中，該最小核心啟動子單元包含一種多核苷酸序列，其與序列辨識編號：1或是其之互補物有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，或100%的同一性。於一另外的或任擇的具體例中，該最小核心啟動子單元包含選自於序列辨識編號：1和15-39所構成的群組之多核苷酸序列。於一另外的具體例中，該最小核心啟動子單元包含序列辨識編號：1或是其之互補物。於一另外的具體例中，該最小核心啟動子單元實質上由序列辨識編號：1或是其之互補物所組成。於另一個具體例中，該合成性多核苷酸進一步包含來自泛素-1基因之外顯子及來自泛素-1基因之內含子。於一另外的具體例中，該外顯子或內含子係來自玉蜀黍或繁茂種玉蜀黍的泛素-1基因。

於另一個具體例中，該合成性多核苷酸進一步包含來自泛素-1基因的上游調節序列。於一另外的具體例中，其中該上游調節序列包含一種多核苷酸序列，其與序列辨識編號：4或是其之互補物有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，或100%的同一性。於一另外的具體例中，其中該上游調節序列包含序列辨識編號：4或是其之互補物。於一另外的具體例中，其中該上游調節序列實質上由序列辨識編號：4或是其之互補物所組成。

於另一個具體例中，該合成性多核苷酸進一步包含選自於一列表的至少一單元，該列表包含上游調節序列(URS)、增強子單元、外顯子、內含子、轉錄起始位址、TATA盒，以及熱休克一致單元。於另一個具體例中，該合成性多核苷酸進一步包含一種有興趣的核苷酸序列，其可操作地連結至該最小核心啟動子單元。於另一個具體例中，該合成性多核苷酸進一步包含選自於以下所構成的群組之一單元：上游調節序列(URS)、增強子單元、外顯子、內含子、轉錄起始位址、TATA盒、熱休克一致單元，以及其等之組合。於另一個具體例中，該合成性多核苷酸進一步包含包含一種有興趣的核苷酸序列，其可操作地連結至該最小核心啟動子單元。

於另一個具體例中，該合成性多核苷酸進一步包含一種來自玉蜀黍或繁茂種玉蜀黍之第二最小核心啟動子，其中該2個最小核心啟動子單元於該多核苷酸內係處於相關於彼此為反向互補(complimentary)的排列。於一另外的或任擇的具體例中，該合成性多核苷酸進一步包含來自泛素-1基因之外顯子及來自泛素-1基因之內含子。於一另外的具體例中，該合成性多核苷酸包含一種多核苷酸序列，其與序列辨識編號：3或是其之互補物有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，或100%的同一性。於一另外的具體例中，該合成性多核苷酸包含序列辨識編號：3或是其之互補物。於一另外的具體例中，該合成性多核苷酸實質上由序列辨識編號：3或是其之互補物所組成。

於一另外的或任擇的具體例中，該合成性多核苷酸進一步包含來自泛素1基因的上游調節序列。於一另外的具體例中，其中該上游調節序列包含一種多核苷酸序列，其與序列辨識編號：4或是其之互補物有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，或100%的同一性。於一另外的具體例中，該上游調節序列包含序列辨識編號：4或是其之互補物。於一另外的具體例中，該上游調節序列實質上由序列辨識編號：4或是其之互補物所組成。

於另一個具體例中，該包含2個最小核心啟動子單元之合成性多核苷酸進一步包含選自於一列表的至少一單元，該列表包含上游調節序列(URS)、外顯子、內含子、轉錄起始位址、TATA盒、熱休克一致單元，以及轉譯開始(START)及/或停止(STOP)核苷酸序列。於一另外的或任擇的具體例中，該包含2個最小核心啟動子單元之合成性多核苷酸進一步包含選自於以下所構成的群組之一單元：上游調節序列(URS)、外顯子、內含子、轉錄起始位址、TATA盒、熱休克一致單元、轉譯開始(START)及/或停止(STOP)核苷酸序列，以及其等之組合。於一另外的具體例中，該合成性多核苷酸包含序列辨識編號：5或是其之互補物。於一另外的具體例中，該合成性多核苷酸實質上由序列辨識編號：5或是其之互補物所組成。

於另一個具體例中，該包含2個最小核心啟動子單元之合成性多核苷酸包含一種有興趣的第一核苷酸序列，其可操作地連結至該最小核心啟動子單元之一者。於一另外的具體例中，該合成性多核苷酸包含一種可操作地連結至該最小核心啟動子單元之有興趣的第二核苷酸序列，其沒有可操作地連結至該有興趣的第一核苷酸序列。

於提供的合成性多核苷酸之具體例中，該外顯子係來自玉蜀黍物種的泛素-1基因。於提供的合成性多核苷酸之具體例中，該外顯子係來自玉蜀黍或繁茂種玉蜀黍的泛素-1基因。於另一個具體例中，該內含子係來自玉蜀黍物種的泛素-1基因。於另一個具體例中，該內含子係來自玉蜀黍或繁茂種玉蜀黍的泛素-1基因。於一另外的或任擇的具體例中，玉蜀黍物種為玉蜀黍。於另一個具體例中，玉蜀黍物種為繁茂種玉蜀黍。

於另一個態樣中，提供了一種生產基因轉殖細胞的方法。該方法包含以本文中揭示的該合成性多核苷酸來轉形該細胞。於一具體例中，該細胞為植物細胞。於另一個態樣中，提供了一種植物細胞，其包含本文中揭示的該合成性多核苷酸。於另一個態樣中，提供了一種植物，其包含含有本文中揭示的合成性多核苷酸之植物細胞。

於另一個態樣中，提供了一種於植物細胞內表現有興趣的核苷酸序列的方法。該方法包含將該有興趣的核苷酸序列導入至該植物細胞內，該有興趣的核苷酸序列係可操作地連結至一構件，該構件係以與方向無關性(direction independent)方式來起始轉錄。於另一個態樣中，提供了一種於植物細胞內表現有興趣的核苷酸序列的方法。該方法包含將該有興趣的核苷酸序列導入至該植物細胞內，該有興趣的核苷酸序列係可操作地連結至一用於使有興趣的2個可操作地連結的核苷酸序列之起始轉錄的構件。於一另外的具體例中，該方法包含將含有以下的核酸導入至該植物細胞內：(a)該有興趣的核苷酸序列，該有興趣的核苷酸序列係可操作地連結至該用於使有興趣的2個可操作地連結的核苷酸序列之起始轉錄的構件；以及(b)有興趣的第二核苷酸序列，該有興趣的第二核苷酸序列係可操作地連結至該用於使有興趣的2個可操作地連結的核苷酸序列之起始轉錄的構件。

於一另外的或任擇的具體例中，該用於使有興趣的2個可操作地連結的核苷酸序列之起始轉錄的構件包含序列辨識編號：5或是其之互補物。於一另外的或任擇的具體例中，該用於使有興趣的2個可操作地連結的核苷酸序列之起始轉錄的構件包含序列辨識編號：5。於另一個具體例中，該用於使有興趣的2個可操作地連結的核苷酸序列之起始轉錄的構件包含序列辨識編號：5之互補物。於另一個具體例中，該核酸係導入至該植物細胞內以便將該有興趣的核苷酸序列標定(target)至該植物細胞的DNA內之預定的位址，該有興趣的核苷酸序列係可操作地連結至該用於使有興趣的2個可操作地連結的核苷酸序列之起始轉錄的構件。於一另外的或任擇的具體例中，該有興趣的核苷酸序列係使用鋅指核酸酶媒介的重組(Zinc finger nuclease-mediated recombination)來標定至該預定的位址，該有興趣的核苷酸序列係可操作地連結至該用於使有興趣的2個可操作地連結的核苷酸序列之起始轉錄的構件。

於另一個態樣中，提供了一種於植物細胞及/或組織內表達多重基因的核酸建構物。該核酸建構物包含(a)一個雙向啟動子；以及(b)位於該雙向啟動子的相反端之2個基因表現匣；其中該等基因表現匣之至少一者包含經由轉譯開關(translation switch)而連結的2個基因或是更多個基因。

於一具體例中，該核酸建構物不包含一病毒序列。於另一個具體例中，該雙向啟動子不包含一病毒序列。於另一個具體例中，該雙向啟動子包含至少一個增強子。於另一個具體例中，該雙向啟動子不包含一個增強子。於另一個具體例中，該核酸建構物包含一種供用於農桿菌屬媒介的轉形之二元載體。

於一具體例中，該雙向啟動子包含選自於以下所構成的群組之一順式單元或是上游調節序列(URS)、增強子單元、外顯子、內含子、轉錄起始位址、TATA盒、熱休克一致單元，以及其等之組合。於一另外的或任擇的具體例中，該雙向啟動子包含來自泛素基因的上游調節序列(URS)。於一另外的具體例中，該雙向啟動子包含(i)與泛素基因的啟動子不同的啟動子以及(ii)來自泛素基因的上游調節序列(URS)。

於另一個具體例中，該雙向啟動子包含一種來自玉蜀黍或繁茂種玉蜀黍的泛素-1基因之最小核心啟動子單元。於另一個具體例中，該雙向啟動子進一步包含來自玉蜀黍或繁茂種玉蜀黍之第二最小核心啟動子，其中該2個最小核心啟動子單元係處於相關於彼此為反向互補(complimentary)的排列。於一另外的具體例中，該最小核心啟動子單元包含一種多核苷酸序列，其與序列辨識編號：1或是其之互補物有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，或100%的同一性。於一另外的或任擇的具體例中，該最小核心啟動子單元包含選自於序列辨識編號：1和15-39所構成的群組之多核苷酸序列。於一另外的具體例中，該最小核心啟動子單元包含選自於序列辨識編號：1和15-34所構成的群組之多核苷酸序列。於一另外的具體例中，該最小核心啟動子單元包含選自於序列辨識編號：1和15-29所構成的群組之多核苷酸序列。於一另外的具體例中，該最小核心啟動子單元包含選自於序列辨識編號：1和15-24所構成的群組之多核苷酸序列。於一另外的具體例中，該最小核心啟動子單元包含選自於序列辨識編號：1和15-19所構成的群組之多核苷酸序列。於一另外的具體例中，該最小核心啟動子單元包含具序列辨識編號：1之多核苷酸序列。

於一另外的或任擇的具體例中，該雙向啟動子包含來自泛素-1基因之外顯子及/或來自泛素基因之內含子。於一另外的具體例中，該雙向啟動子包含一種與序列辨識編號：3或是其之互補物有至少75%、80%、85%、90%、95%或100%的同一性之多核苷酸。於一另外的具體例中，該雙向啟動子包含序列辨識編號：3或是其之互補物的多核苷酸。於另一個具體例中，該雙向啟動子包含來自醇去氫酶基因之內含子。於一具體例中，該核酸建構物係穩定地轉形至該基因轉殖植物之內。於一具體例中，該植物為單子葉植物。於另一個具體例中，該植物為雙子葉植物。於另一個具體例中，該植物不是單子葉植物。於另一個具體例中，該植物不是雙子葉植物。

於一另外的或任擇的具體例中，該雙向啟動子包含來自泛素基因的上游調節序列。於一另外的具體例中，來自泛素基因的該上游調節序列包含一種與序列辨識編號：4或是其之互補物有至少75%、80%、85%、90%、95%，或100%的同一性之多核苷酸序列。於一另外的具體例中，來自泛素基因的該上游調節序列包含序列辨識編號：4或是其之互補物的多核苷酸。於另一個具體例中，該雙向啟動子包含一種與序列辨識編號：5或是其之互補物有至少75%、80%、85%、90%、95%，或100%的同一性之多核苷酸。於另一個具體例中，該雙向啟動子包含序列辨識編號：5或是其之互補物的多核苷酸。

於一具體例中，該等基因表現匣二者均包含經由轉譯開關而連結的2個或更多個基因。於一另外的或任擇的具體例中，該轉譯開關係選自於以下所構成的群組：內部核糖體進入位址(IRES)、選擇式剪接位址、核糖酵素剪切位址、編碼2A胜肽的多核苷酸序列、編碼類2A胜肽的多核苷酸序列、編碼內含蛋白(intein)的多核苷酸序列、編碼蛋白酶剪切位址的多核苷酸序列，以及其等之組合。於一另外的或任擇的具體例中，該轉譯開關包含一個順式作用的水解酶單元(CHYSEL)。於一另外的具體例中，CHYSEL為2A或是類2A胜肽序列。於另一個具體例中，轉譯開關上游的一個基因不包含轉譯終止密碼子。於另一個具體例中，該核酸建構物可使得至少4個的基因表現或是允許至少4個的基因表現。於一另外的具體例中，所有的4個基因均為轉基因。於另一個具體例中，該核酸建構物可使得3和20個之間的基因表現。於另一個具體例中，該核酸建構物可使得4和8個之間的基因表現。於一另外的或任擇的具體例中，該等基因均為轉基因。於另一個具體例中，至少一個基因表現匣包含一個編碼融合蛋白的多核苷酸序列。於一另外的具體例中，該融合蛋白包含3至5個基因。

於一些具體例中，來自該雙向啟動子的基因之表現相較於一單向啟動子高至少4倍。於一些具體例中，來自該雙向啟動子的基因之表現相較於一單向啟動子高3到10倍。於一些具體例中，來自該雙向啟動子的基因之表現相較於一單向啟動子比較時高4到8倍。於一些具體例中，一選擇標記基因被放置於啟動子的遠端(亦即，於另一個基因的基因表現匣下游之3’端)。

於另一個態樣中，提供了一種產生基因轉殖植物的方法，其包含以本文提供的該核酸建構物來轉形植物細胞。於另一個態樣中，提供了一種產生基因轉殖細胞的方法，其包含以本文提供的該核酸建構物來轉形該細胞。於另一個態樣中，提供了一種植物細胞，其包含本文提供的該核酸建構物。於一另外的或任擇的具體例中，該核酸建構物係穩定地轉形至該植物細胞之內。於另一個態樣中，提供了一種基因轉殖植物，其包含本文提供的該核酸建構物。於一另外的或任擇的具體例中，該核酸建構物係穩定地轉形至該基因轉殖植物的細胞之內。於另一個態樣中，提供了一種於植物細胞及/或組織內表達多重基因的方法，其包含將本文提供的該核酸建構物導入至該植物細胞及/或組織內。於一另外的或任擇的具體例中，該植物細胞及/或組織係用本文提供的核酸建構物予以穩定地轉形。於另一個態樣中，提供了一種供用於農桿菌屬媒介的轉形之二元載體。於一具體例中，該二元載體包含本文提供的核酸建構物。於另一個具體例中，該二元載體包含本文提供的合成性多核苷酸。於另一個態樣中，提供了本文提供的雙向啟動子供用於植物內之多重轉基因的表現之用途。

圖1顯示出一種例示性(不按比例)玉米(maize)Ubi1(ZmUbi1)啟動子，其包含座落於轉錄起始位址(TSS)的5’之大概900 bp上游單元。上游單元包含TATA盒(座落於TSS之大概-30 bp)，以及2個重疊的熱休克一致單元(座落於TSS之大概-200 bp)。此啟動子亦包含TSS區域的3’大約1100 bp。此3’區域含有相鄰的前導子序列(ZmUbi1外顯子)，及內含子。

圖2顯示出提供的合成性Ubi1雙向啟動子之例示性具體例，其包括ZmUbi1啟動子之上游選殖的(處於反向互補的排列)minUbi1P最小核心單元。

圖3顯示出yfp及GUS基因表現匣之例示性示意圖，其等各自可操作地連結至合成性Ubi1雙向啟動子。

圖4顯示出pDAB105801的代表性質體圖。

圖5顯示出pDAB108706的代表性質體圖。

圖6顯示出pDAB101556的代表性質體圖。

圖7A顯示出序列辨識編號：1，其包含一種玉蜀黍Ubi1最小核心啟動子(minUbi1P)之215bp區域。圖7B顯示出序列辨識編號：2，其包含一個玉蜀黍Ubi1內含子。

圖8A顯示出序列辨識編號：3，其包含一種多核苷酸之反向互補物，該多核苷酸包含玉蜀黍minUbi1P最小核心啟動子(加底線)；玉蜀黍Ubi1前導子(ZmUbi1外顯子；粗體字型)；以及玉蜀黍Ubi1內含子(小寫)。圖8B顯示出序列辨識編號：4，其包含玉蜀黍Ubi1上游單元的一個區段，在那裡單元(及/或其之反向互補物)可以位於一種合成性Ubi1啟動子之處伴隨一種minUbi1P單元相鄰其之5’或3’端。

圖9顯示出序列辨識編號：5，其包含一種例示性合成性Ubi1雙向啟動子，其中第一minUbi1P的反向互補物，和第二minUbi1P為加底線的。

圖10顯示出序列辨識編號：6，其包含一種例示性核酸，該例示性核酸包含由合成性Ubi1雙向啟動子所驅動的yfp和GUS基因表現匣。

序列辨識編號：7包含一個YYFP順向引子：5’-GATGCCTCAG TGGGAAAGG-3’。序列辨識編號：8包含一個YFP反向引子：5’-CCATAGGTGA GAGTGGTGACAA-3’。序列辨識編號：9包含一個轉化酶順向引子：5’-TGGCGGACGA CGACTTGT-3’。序列辨識編號：10包含一個轉化酶反向引子：5’-AAAGTTTGGA GGCTGCCGT-3’。序列辨識編號：11包含一個轉化酶探針：5’-CGAGCAGACC GCCGTGTACT TCTACC-3’。序列辨識編號：12包含一個AAD1順向引子：5’-TGTTCGGTTC CCTCTACCAA-3’。序列辨識編號：13包含一個AAD1反向引子：5’-CAACATCCAT CACCTTGACT GA-3’。序列辨識編號：14包含一個AAD1探針：5’-CACAGAACCG TCGCTTCAGC AACA-3’(亦參見表7)。

圖11顯示出一種代表性的西方墨點(blotting)分析，其確認於玉米T0植物內由雙向玉蜀黍泛素1啟動子建構物(pDAB108706)所驅動之穩定的YFP和GUS表現。代表性的植物顯示出葉子內由Min-UbiP1最小核心啟動子單元所驅動之穩定的YFP表現。生產的蛋白質的量係指示為百萬分之一(ppm)。

圖12顯示出代表性的西方墨點分析，其顯示由來自含有只驅動YFP的表現之ZmUbi1啟動子的對照建構物(pDAB101556)之穩定的YFP和GUS表現；此建構物不包含GUS編碼序列。生產的蛋白質的量係指示為百萬分之一(ppm)。

圖13A顯示出4種基因匣的堆疊之例示性建構物pDAB105843[顯示AAD1-2A-YFP(或Phiyfp)加上Cry34-2A-Cry35的2個匣]和pDAB105846[顯示YFP(或Phiyfp)-2A-AAD1加上Cry34-2A-Cry35的2個匣]。陰影箭頭指示由該雙向啟動子之轉錄的方向。Ubi1-minP包含玉米Ubi1啟動子之轉錄起始位址上游的200nt的序列。Ubi1-URS包含玉米Ubi1啟動子上游調節區，其係由排除200nt最小啟動子之轉錄起始位址的上游序列所構成(顯示為箭頭)。Ubi1-Int包含玉米Ubi1啟動子之內含子。圖13B顯示出來自pDAB108717和pDAB108718之之4種基因匣的堆疊之二個額外的例示性建構物。

圖14顯示出本文提供的多重基因建構物之例示性示意圖像。轉譯開關係使用特殊的符號來表示。

圖15顯示質體pDAB105818以及pDAB105748的代表圖。

圖16顯示質體pDAB105803以及pDAB105840的代表圖。

圖17顯示質體pDAB105841以及pDAB105842的代表圖。

圖18顯示質體pDAB105843以及pDAB101917的代表圖。

圖19顯示質體pDAB108717的代表圖。

圖20顯示質體pDAB105844以及pDAB105845的代表圖。

圖21顯示質體pDAB105846以及pDAB108718的代表圖。

圖22顯示pDAB108717(第22A圖)以及pDAB108718(第22B圖)的Cry35之例示性蛋白質表現資料。

第23圖顯示pDAB108717的基因表現匣之核酸序列，圖中闡明各基因和單元。

圖24A-E顯示出序列辨識編號：15-39之額外的最小核心啟動子(min-Ubi1P或Ubi1 minP)。

圖25顯示來自水母(Phialidium)sp.SL 2003(Phiyfp，序列辨識編號：50；以及Phiyfpv3，序列辨識編號：51)的黃螢光蛋白之2個例示性序列。

圖26顯示所提供的合成性Ubi1雙向啟動子和建構物之例示性具體例，包括pDAB108706(ZMUbi雙向(-200))及pDAB108707(ZMUbi雙向(-90))。pDAB101556(ZmUbi1-YFP對照)及pDAB108716(沒有最小啟動子之ZMUbi1)作為帶有單向啟動子的對照建構物。

圖27A表明來自圖26內顯示的4個建構物關於YFP蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之例示性表現結果(V6)。圖27B表明來自圖26內顯示的4個建構物關於YFP RNA之例示性相對表現結果(V6)。

圖28A表明來自圖26內顯示的4個建構物關於GUS蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之例示性表現結果(V6)。圖28B表明來自圖26內顯示的4個建構物關於GUS RNA之例示性相對表現結果(V6)。

圖29A表明來自圖26內顯示的4個建構物關於AAD1蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之例示性表現結果(V6)。圖29B表明來自圖26內顯示的4個建構物關於AAD1 RNA之例示性相對表現結果(V6)。

圖30A表明來自圖26內顯示的4個建構物關於YFP蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之表現結果(V6)之統計分析。pDAB108707、pDAB108706、pDAB101556，和pDAB108716之平均值分別為57.63、52.66、49.75，和0。圖30B表明來自圖26內顯示的4個建構物關於YFP RNA之相對表現結果(V6)之統計分析。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716之平均值分別為9.96、8.07、6.95，和1.01。

圖31A表明來自圖26內顯示的4個建構物關於GUS蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之表現結果(V6)之統計分析。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716之平均值分別為151.27、143.22、0，和213.17。圖31B表明來自圖26內顯示的4個建構物關於GUS RNA之相對表現結果(V6)之統計分析。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716之平均值分別為0.65、0.78、0，和3.03。

圖32A表明來自圖26內顯示的4個建構物關於AAD1蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之表現結果(V6)之統計分析。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716之平均值分別為710.88、1417.01、856.58，和1795.43。圖32B表明來自圖26內顯示的4個建構物關於AAD1 RNA之相對表現結果(V6)之統計分析。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716之平均值分別為1.33、1.37、1.93，和2.93。

圖33A、33B，和33C各別表明來自圖26內顯示的4個建構物關於YFP、AAD1，和GUS蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之例示性表現結果(V10)。

圖34A、34B，和34C各別表明來自圖26內顯示的4個建構物關於YFP、GUS，和AAD1蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之表現結果(V10)之統計分析。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716關於YFP(圖34A)之平均值分別為71.77、81.81、49.58，和23.01。pDAB108706、 pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716關於GUS(圖34B)之平均值分別為109.63、98.25、0，和138.02。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716關於AAD1(圖34C)之平均值分別為666.11、597.80、715.12，和1002.84。

圖35A、35B，和35C各別表明來自圖26內顯示的4個建構物關於YFP、GUS，和AAD1蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之例示性表現結果(R3)。

圖36A、36B，和36C各別表明來自圖26內顯示的4個建構物關於YFP、GUS，和AAD1蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之表現結果(R3)之統計分析。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716關於YFP(圖36A)之平均值分別為91.38、49.49、21.67，和0.40。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716關於GUS(圖36B)之平均值分別為5.52、16.81、1.07，和46.60。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716關於AAD1(圖36C)之平均值分別為156.71、153.44、165.40，和197.80。

圖37A顯示來自4個建構物pDAB105748(ZMUbi1-YFP)、pDAB105818(ZMUbi1-Cry34/ZMUbi1-Cry35/ZMUbi1-AAD1)、pDAB108717(YFP/AAD-1-ZMUbi1雙向-Cry34-Cry35)，和pDAB108718(AAD1/YFP-ZMUbi1雙向-Cry34-Cry35)之Cry34 RNA的例示性相對表現結果(V6)。圖37B顯示來自相同的4個建構物pDAB105748、 pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之Cry34蛋白質(LCMS)的例示性相對表現結果(V6)。

圖38A顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之AAD1 RNA的例示性相對表現結果(V6)。圖38B顯示來自相同的4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之AAD1蛋白質(LCMS)的例示性相對表現結果(V6)。

圖39A顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之YFP RNA的例示性相對表現結果(V6)。圖39B顯示來自相同的4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之YFP蛋白質(LCMS)的例示性相對表現結果(V6)。

圖40A顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之Cry35 RNA的例示性相對表現結果(V6)。圖40B顯示來自相同的4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之Cry35蛋白質(ELISA)的例示性相對表現結果(V6)。

圖41顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之PAT RNA的例示性相對表現結果(V6)。

圖42A顯示來自4個建構物pDAB105748、 pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之Cry34 RNA的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值0、2.42、2.67，和2.25。圖42B顯示來自相同的4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之Cry34蛋白質的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值0、596.94、2044.73，和719.18。

圖43A顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之AAD1 RNA的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值0、1.98、2.68，和2.03。圖43B顯示來自相同的4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之AAD1蛋白質的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值0、2237.54、5763.88，和2379.15。

圖44A顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之YFP RNA的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值3.59、0、2.78，和1.95。圖44B顯示來自相同的4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之YFP蛋白質的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值1420.69、251.68、1154.04，和706.04。

圖45A顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之Cry35 RNA的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值0、1.12、3.74，和3.20。圖45B顯示來自相同的4個建構物 pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之Cry35蛋白質的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值0、283.54、635.83，和90.97。

圖46顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之PAT RNA的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值1.56、0.07、1.46，和1.01。

圖47A、47B、47C，和47D顯示分別來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之YFP、AAD1、Cry34，和Cry35的例示性蛋白質表現結果(V10)。

圖48A、48B、48C，和48D顯示分別來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之YFP、AAD1、Cry34，和Cry35的蛋白質表現結果(V10)之統計分析。YFP(圖48A)之平均值分別為1033.47、27.51、136.18，和119.06。AAD1(圖48B)之平均值分別為80.89、1323.80、1544.69，和802.50。Cry34(圖48C)之平均值分別為0、246.05、1089.18，和769.81。Cry35(圖48D)之平均值分別為0、90.75、106.09，和88.80。

圖49A、49B、49C，和49D顯示分別來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之YFP、AAD1、Cry34，和Cry35的例示性蛋白質表現結果(R3)。

圖50A、50B、50C，和50D顯示分別來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718 之YFP、AAD1、Cry34，和Cry35的蛋白質表現結果(R3)之統計分析。YFP(圖50A)之平均值分別為2589.63、43.62、1305.27，和1727.96。AAD1(圖50B)之平均值分別為244.41、1803.99、1642.44，和1279.17。Cry34(圖50C)之平均值分別為422.45、7258.15、9285.74，和7544.75。Cry35(圖50D)之平均值分別為0、373.35、441.11，和348.45。

圖51顯示來自pDAB108718以及pDAB108717之Cry34，Cry35、以及AAD1的蛋白質表現之西方墨點的例示性結果。

進行本發明之模式

轉基因產物的發展變得越來越複雜，其需要累加(pyramiding)多重轉基因至一單一的基因座之內。傳統上各個轉基因通常需要一種獨特的啟動子用於表現，所以需要多重啟動子來表現一個基因堆疊之內不同的轉基因。除增加基因堆疊的尺寸之外，此還頻繁地導致重複使用相同的啟動子來獲得控制相同的性狀之不同的轉基因之相似位準的表現模式。已知由相同的啟動子所驅動的多重基因建構物會造成基因靜默，因而使得轉基因產物於領域內較不有效。由於啟動子重複所致之過量的轉錄因子(TF)結合位址能造成耗盡內源性TFs而導致轉錄之不活性化。

提供了方法和建構物，其係組合雙向啟動子系統以及位於該啟動子的一端或二端上之雙順反子體制(bicistronic organization)的基因，舉例而言使用來自Thosea asigna病毒之2A序列。僅僅16-20個胺基酸長的2A蛋白質於其自身的羧端處裂斷多蛋白。可以使用2A或類2A胜肽的此“自我裂斷(self cleavage)”或是“核糖體跳越(ribosome skip)”特質來加工基因轉殖植物內生產的人工多蛋白。於一具體例中，Cry34和Cry35基因係融合於一個基因表現匣之內的，而YFP(或Phiyfp)和AAD1基因係融合至另一個基因表現匣(帶有一單一開放讀取架構(ORF)及一複本的2A蛋白質基因被放置於各組合的二個基因之間)之內的。舉例而言，此等基因表現匣(或基因對)的各者能放置於雙向啟動子的任一側之上來驅動使用一單一啟動子之4個轉基因。因而，本文提供的建構物和方法有用於防止重複使用相同的啟動子以及顯著地減少商業建構物的尺寸。此外，以一個啟動子來驅動4個或是更多個基因亦提供控制一單一性狀之共表現基因的能力。

使用於基礎研究或是生物科技應用之植物的啟動子一般為單向的，僅僅指示已經融合於其之3’端(下游的)的一個基因。通常必需以導入多重基因至植物內用於代謝工程和性狀堆疊以及因而，多重啟動子為將來的轉基因作物驅動多重基因的表現典型需要的。設計可以節省部署的啟動子數量以及允許基因累加的同時共同調節的表現之策略為值得嚮往的。於一些具體例中，所提供的雙向啟動子能驅動多重轉錄單位之轉錄，包括RNAi、人工miRNA，或是髮夾(haipin)環RNA序列。

一種用於減少部署的啟動子數量之方法為使用關鍵性的轉錄-活化交換(transcription-activating switches)，其可以驅動兩個方向的轉錄。此等啟動子稱為雙向啟動子。合成性啟動子可以設計成在使用於作物植物的遺傳工程之多重啟動子之中限制同源的位準，其可以避免同源為基礎的基因靜默。人工設計的雙向啟動子可以為發展基因轉殖植物方面有價值的工具。於一些事例中已經報導使用雙向功能的啟動子於植物內，包括CaMV 35S以及甘露鹼(mannopine)合成酶啟動子(mas)啟動子。然而，使用此等啟動子於可預料的、穩定的以及同時表現基因於兩個方向上的之適當性還未被檢查。

另一個用於協調多重基因的表現之方法為編碼一單一的開放讀取架構成為一個多蛋白的前驅物，其於兩個編碼序列之間含有具有自我加工(self processing)特質的短的中介部分。多蛋白的前驅物之自催化加工導致釋放多重獨立的蛋白質，其導致其等之同步協調的表現。一種合成性自水解的2A胜肽序列已經使用於植物和動物系統兩者內以表現兩個轉基因。2A胜肽序列係由數個已知的病毒使用以及由16-20個胺基酸所構成。此2A胜肽序列藉由修飾核糖體的活性而共轉譯地自我裂斷(或核糖體跳越)以允許兩個蛋白質之間的2A水解而導致兩個蛋白質產物的釋放。

所提供的為組合雙向啟動子的方法加上使用中介的合成性部分之多蛋白加工之建構物和方法，該建構物和方法可以容易達成使用一單一啟動子來表現至少4個轉基因的。Cry34和Cry35的基因，以及YFP(或Phiyfp)和AAD1 的基因已經如基因表現匣或是基因對一般地融合至單一的開放讀取架構(ORF)之內伴隨放置於該等基因之間的一個複本的2A蛋白質基因。該等基因對能放置於雙向啟動子的任一側之上以使用一單一啟動子來驅動4個轉基因。本文提供的建構物及/或方法有用於避免重複使用相同的啟動子來防止可能的轉基因靜默問題。此外，此轉基因設計方法可以顯著地降低含有多重轉基因的轉基因堆疊的尺寸。以一個啟動子來驅動驅動4個或是更多個基因亦提供控制一個單一性狀之共表現基因的能力以保證轉基因產物之長期功效。

轉基因產物的發展變得越來越複雜，以及典型需要堆疊多重轉基因至一個單一的基因座之內。參見Xie等人(2001)Nat.Biotechnol.19(7)：677-9。既然各個轉基因通常需要一種獨特的啟動子用於表現，所以需要多重啟動子來表現一個基因堆疊之內不同的轉基因。除了會增加基因堆疊的尺寸之外，此還頻繁地導致重複使用相同的啟動子來獲得不同的轉基因之相似位準的表現模式。此方法通常為有問題的，因為由相同的啟動子所驅動之多重基因的表現可能導致基因靜默或HBGS。重複啟動子過度競爭轉錄因子(TF)的結合位址可能會造成耗盡內源性TFs以及導致轉錄之向下調節。轉基因的靜默很可能會令人不快地影響一種生產來表現轉基因的基因轉殖植物之性能。於轉基因之內的重複序列可以導致基因之基因座內的同源重組而造成多核苷酸的重排。

使用於基礎研究或是生物科技應用之植物的啟動子一般為單向的，以及僅僅調節已經融合於其之3’端(下游的)的一個基因。為了生產帶有各種各樣所欲的性狀或特徵之基因轉殖植物，減少部署來驅動編碼所欲的性狀和特徵之轉基因的表現之啟動子的數量會是有用的。導入多重轉基因至植物內用於代謝工程及性狀堆疊通常為必需的，從而需要多重啟動子來驅動多重轉基因的表現。透過發展一種能驅動位於該啟動子的側面之兩個轉基因的表現之單一合成性雙向啟動子，轉基因作物的發展所需要之啟動子的總數量可以降低，從而減少重複使用相同的啟動子、降低轉基因建構物的尺寸，及/或減少HBGS的可能性。

本文的具體例使用一種方法，其中一種來自玉米泛素-1基因的單向啟動子(舉例而言，ZmUbi1)使用來設計一種合成性雙向啟動子，以使得一個啟動子可以指示二個基因的表現，一者於該啟動子的各端上。如本文中使用的方法可以包含鑑定來自ZmUbi1基因之Ubi1最小核心啟動子單元(minUbi1P)，以及建造此單元至新的環境內以建構某些合成性雙向啟動子。合成性雙向啟動子，例如可以藉由依據本發明的一些具體例之方法所創造，可以允許熟悉此藝者堆疊轉基因於植物細胞和植物之內同時減少相同的啟動子之重複使用且降低轉基因建構物的尺寸。再者，以一種單一合成性雙向啟動子來調節二個基因的表現也可以提供於相同的條件下共表現2個基因的能力，例如，舉例而言，當二個基因各自貢獻單一的性狀於宿主內時，可以為有用的。一些事例中已經報導使用雙向功能的啟動子於植物內，包括CaMV 35啟動子(Barfield and Pua(1991)Plant Cell Rep.10(6 7)：308-14；Xie等人(2001)，以及甘露鹼(mannopine)合成酶啟動子(mas)啟動子(Velten等人(1984)EMBO J.3(12)：2723-30；Langridge等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3219-23)。

植物基因內之基因表現的轉錄起始和調變係由全體配置於啟動子之內的各種各樣的DNA序列單元來指示。真核啟動子由所組成的最小核心啟動子單元(minP)，以及另外的上游調節序列(URSs)。該核心啟動子單元為足以指示準確的轉錄起始之最小延伸之連續的DNA序列。植物內的核心啟動子也包含與轉錄起始有關聯的典型區域，例如CAAT和TATA盒。TATA盒單元通常坐落於轉錄起始位址之上游的大概20至35個核苷酸之處。

minP之活化取決於URS，各種各樣的蛋白質結合至URS以及URS隨後與轉錄起始複合物互相作用。URSs包含DNA序列，此DNA序列決定包含URS之啟動子的時空表現模式。啟動子的極性通常由minP的方向來決定，而URS為雙極性的(亦即，其作用與其之方向無關)。舉例而言，CaMV 35S合成性單向極性啟動子可以藉由以相反的方向來融合minP於啟動子的5’端而轉變成雙向啟動子。見，舉例而言，Xie等人(2001)Nat.Biotechnol.19(7)：677-9。

揭示的某些縮寫係列舉於表1內。

於一些具體例之特定實例中，由玉蜀黍自交系，B73，衍生的玉米Ubi1(ZmUbi1)啟動子之經修飾的單元使用來建造合成性雙向啟動子，其可以作用於植物內以提供相對於先前可得到的雙向啟動子為獨特的表現控制之特徵。原始由B73衍生的ZmUbi1啟動子包含位於玉米基因體之內、轉錄起始位址的5’之大約899個鹼基，以及進一步於轉錄起始位址的3’之大約1093個鹼基之內的序列。Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18(4)：675-89(描述一種B73 ZmUbi1基因)。於一些實例中使用的一種由B73衍生之經修飾的ZmUbi1啟動子為大概2 kb啟動子，其含有一個TATA盒；二個重疊的熱休克一致單元；緊緊相鄰轉錄起始位址之82個或是83個核苷酸(取決於參考股)前導子序列，其於本文係提及為ZmUbi1外顯子；以及一個1015-1016個核苷酸內含子(舉例而言參見圖1)。由玉米物種和玉蜀黍基因型衍生之其他的玉米泛素啟動子變異體可以展示出約莫TATA單元和上游的熱休克一致單元所構成的minP單元之高的序列守恆性。因而，本發明之具體例係透過使用ZmUbi1啟動子之此短的(~200 nt)高度守恆區(舉例而言，序列辨識編號：1)作為一種用於建構合成性雙向植物啟動子之最小核心啟動子單元來舉例說明。

當使用於本文中，冠詞，“一個(a)”、“一個(an)”，以及“該(the)”包括複數的參考，除非上下文另有清楚且不含糊地指定。

當使用於本文中，片語“回交(backcrossing)”係提及一種方法，其中育種者使雜種後代往回雜交親代之一者，舉例而言，第一代雜種F1與F1雜種的親代基因型之一者。

當使用於本文中，片語“內含子”係提及一基因(或有興趣之表現的核苷酸序列)之內所包含的任何核酸序列，其經轉錄的但是未轉譯的。內含子不同於5’端未轉譯的前導子序列，前導子序列不被認為是一基因之部分。內含子包括表現的DNA序列之內的未轉譯的核酸序列，以及從那裡轉錄的RNA分子內之對應的序列。

當使用於本文中，片語“經單離的”係提及生物組份(包括一核酸或蛋白質)已經由有機體的細胞內之其他的生物組份實質分離的、生產離開的，或是純化離開的，該等組份天然存在於細胞內(亦即，其他的染色體與額外的染色體DNA和RNA，以及蛋白質)，而造成組份內之化學或功能變化(舉例而言，一核酸可藉由打斷連接核酸至染色體內剩餘的DNA之化學鍵而單離)。已“經單離的”核酸分子和蛋白質包括藉由標準的純化方法而純化的核酸分子和蛋白質。片語“經單離的”亦包括藉由重組表現於宿主細胞內來製備的核酸和蛋白質，以及化學合成的核酸分子、蛋白質，以及胜肽。

當使用於本文中，片語“基因表現”係提及一方法，一個核酸轉錄單位(包括，舉例而言，基因體DNA)之編碼資訊係透過基因表現而轉變成一細胞之操作的、非操作的，或是結構的部分，通常包括一蛋白質的合成。基因表現可以被外部的訊息影響；舉例而言，一細胞、組織，或是有機體暴露於會增加或是減少基因表現的製劑。一個基因的表現亦可以在由DNA至RNA至蛋白質的途徑之任何地方予以調節。基因表現的調控，舉例而言，會透過控制對於轉錄、轉譯、RNA運輸和加工、中間分子例如mRNA的降解之作用，或是在專一性蛋白質分子已經製造之後透過其等的活化、不活性化、分室作用，或是降解，或是透過其等之組合而發生。基因表現可以透過本技藝任何已知的方法而以RNA位準或是蛋白質位準來測量，包括，且不限於，北方墨點、RT PCR、西方墨點，或是活體外、原位，或是活體內的蛋白質活性分析。

當使用於本文中，片語“同源為基礎的基因靜默”(HBGS)係提及包括轉錄基因靜默和轉錄後基因靜默兩者的通稱。標的基因座經由無連接的的靜默基因座之靜默可以起因於轉錄的抑制(轉錄後基因靜默；TGS)或是mRNA降解(轉錄後基因靜默；PTGS)，由於分別對應於啟動子或轉錄的序列之雙股的RNA(dsRNA)的生產。各個方法內涉及相異的細胞組份暗示著dsRNA誘導的TGS和PTGS很可能起因於古老的共同機制之多樣化。然而，TGS和PTGS之嚴格的比較已經為不容易完成的，因為其一般依賴相異的靜默基因座之分析。一單一轉基因的基因座可以描述為觸發TGS和PTGS兩者，由於對應於不同的標的基因之啟動子及轉錄的序列之dsRNA的生產。見，舉例而言，Mourrain等人(2007)Planta 225：365-79。siRNAs很可能為觸發同源序列之TGS和PTGS之實際的分子：siRNAs於此模式中會透過擴展轉基因序列的甲基化成內源性啟動子而觸發順式以及反式的同源序列之靜默和甲基化。

當使用於本文中，片語“核酸分子”(或“核酸”或“多核苷酸”)係提及核苷酸的聚合型，其可以包括RNA、cDNA、基因體DNA，及合成型的意義股和反義股以及以上之混合聚合物。核苷酸可提及核醣核苷酸、去氧核醣核苷酸，或是任一型核苷酸之修飾形式。“核酸分子”當使用於本文中係與“核酸”和“多核苷酸”為同義的。核苷酸可提及核醣核苷酸、去氧核醣核苷酸，或是任一型核苷酸之修飾形式。“核酸分子”當使用於本文中係與“核酸”和“多核苷酸” 為同義的。一核酸分子之長度通常為至少10個鹼基，除非另有說明。該術語可提及一個不確定長度的RNA或DNA分子。該術語包括單股和雙股形式的DNA。一種核酸分子可以包括天然存在的核苷酸及/或藉由天然存在和非天然存在的核苷酸連結而連結在一起之經修飾的核苷酸之任何一個或兩者。

核酸分子可以為經化學或生化修飾的，或可以含有非天然的或衍生的核苷酸鹼基，如同熟悉此藝者會容易瞭解的。此等修飾包括，舉例而言，標記、甲基化、天然存在核苷酸的一個或多個者以類似物之取代、核苷酸內的修飾(舉例而言，未荷電的連結：舉例而言，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、胺甲酸酯，等等；荷電的連結：舉例而言，硫代磷酸酯(phosphorothioates)、二硫代磷酸酯，等等；懸垂部分(pendent moieties)：舉例而言，胜肽；嵌入劑：舉例而言，吖啶、補骨脂素(psoralen)，等等；螯合劑；烷化劑(alkylators)；以及經修飾的連結：舉例而言，脉變旋異構(alpha anomeric)核酸，等等)。該術語“核酸分子”亦包括任何拓撲構形，包括單股的、雙股的、部分雙螺旋的(duplexed)、三螺旋的、髮針形的、環狀的，以及扣鎖式(padlocked)構形。

轉錄以5’至3’的方式沿著DNA股進行。此意指RNA係藉由連續的添加核醣核苷酸-5’-三磷酸至生長鏈的3’端(連同必要的消去焦磷酸鹽)來實行。於線狀的或環狀的核酸分子內，設若離散的單元(舉例而言，特定的核苷酸序列)結合或將結合至離該單元的5’方向上之相同的核酸，其等相關於另外的單元可以係提及為“上游的”。同樣地，設若離散的單元結合或將結合至離該單元的3’方向上之相同的核酸，其等相關於另外的單元可以為“下游的”。

當使用於本文中，片語“鹼基位置”係提及指定的核酸內已知的鹼基或核苷酸殘基的位置。指定的核酸可以是用一種參考核酸經由對準(參見以下)來界定。

當使用於本文中，片語“雜交”係提及寡核苷酸和其等之類似物藉由介於互補的鹼基之間的氫鍵結而雜交的過程，氫鍵結包括華特生-克里克(Watson-Crick)、Hoogsteen或反Hoogsteen氫鍵結。大體而言，核酸分子由嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)，以及胸嘧啶(T))或是嘌呤(腺嘌呤(A)和鳥糞嘌呤(G))之含氮鹼基所組成。此等含氮鹼基形成嘧啶和嘌呤之間的氫鍵，以及嘧啶與嘌呤的鍵結係提及為“鹼基配對”。更特別地，A會氫鍵結至T或U，以及G會鍵結至C。“互補的”係提及介於二個相異的核酸序列之間的或相同的核酸序列之二個相異的區域之間發生的鹼基配對。

當使用於本文中，片語“可專一雜交的”和“專一互補的”係提及足夠程度的互補性以使得寡核苷酸和DNA或RNA標的之間發生穩定且專一性的結合。寡核苷酸對於其之可專一雜交的標的序列不須要為100%互補的。當一種寡核苷酸結合至標的DNA或RNA分子時會干擾標的DNA或RNA正常的功能，以及有足夠程度的互補性以於希望專一性的結合之條件下避免寡核苷酸對非標的序列非專一性的結合，舉例而言就活體內的分析或系統來說為生理的條件下，該寡核苷酸為可專一雜交的。此結合係提及為專一性的雜交。

導致特定的程度的嚴苛性之雜交條件會取決於所選擇的雜交方法的本質以及雜交的核酸序列之組成和長度而變化。大體而言，雜交的溫度和雜交緩衝液的離子強度(尤其Na+及/或Mg2+濃度)會對雜交的嚴苛性有貢獻，雖然清洗時間也會影響嚴苛性。關於達到特定程度的嚴苛性所需要的雜交條件之計算係於Sambrook等人(ed.),Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989,chs.9和11之內討論。.當使用於本文中，片語“嚴苛的條件”包含雜交僅僅會發生於雜交的分子和DNA標的之間設若有低於50%失配的雜交的條件下。“嚴苛的條件”包括進一步特定位準的嚴苛性。因而，當使用於本文中，“中度嚴苛性”的條件為帶有超過50%序列失配的分子不會雜交的該等條件；“高嚴苛性”的條件為帶有超過20%失配的序列不會雜交的該等條件；以及“非常高嚴苛性”的條件為帶有超過10%失配的序列不會雜交的該等條件。

於特定的具體例中，嚴苛條件可以包括在65℃，接著以0.1x SSC/0.1% SDS在65℃下清洗歷時40分鐘。

下列為代表性的、非限制性雜交條件：非常高嚴苛性：於5x SSC緩衝液內在65℃下雜交歷時 16小時；以2x SSC緩衝液於室溫清洗2次每次歷時15分鐘；以及以0.5x SSC緩衝液於65℃清洗2次每次歷時20分鐘。

高嚴苛性：於5x-6x SSC緩衝液內在65-70℃下雜交歷時16-20小時；以2x SSC緩衝液於室溫清洗2次每次歷時5-20分鐘；以及以1x SSC緩衝液於55-70℃清洗2次每次歷時30分鐘。

中度嚴苛性：於6x SSC緩衝液內在室溫至55℃下雜交歷時16-20小時；以2x-3x SSC緩衝液於室溫至55℃清洗至少2次每次歷時20-30分鐘。

於特定的具體例中，可專一雜交的核酸分子能於非常高嚴苛的雜交條件下保持為結合的。於此等與另外的具體例中，可專一雜交的核酸分子能於高嚴苛的雜交條件下保持為結合的。於此等與另外的具體例中，可專一雜交的核酸分子能於中度嚴苛的雜交條件下保持為結合的。

當使用於本文中，片語“寡核苷酸”係提及一種短的核酸聚合物。寡核苷酸可以藉由更長的核酸區段的裂斷來形成，或是藉由聚合個別的核苷酸的前驅物來形成。自動合成儀允許高達數百個鹼基對長度的寡核苷酸之合成。因為寡核苷酸可以結合至互補的核苷酸序列，其等可以使用作為偵測DNA或是RNA的探針。由DNA組成的寡核苷酸(寡去氧核醣核苷酸)可以使用於PCR，PCR為擴增小的DNA序列之技術。於PCR內，寡核苷酸典型地提及為一“引子”，其允許DNA聚合酶去延伸寡核苷酸以及複製互補股。

當使用於本文中，片語“序列同一性”或是“同一性”係提及2個核酸或是多肽序列的場合，可以提及當通過明確的比較視窗來對準最大的對應時，2個序列之間相同的殘基。

當使用於本文中，片語“序列同一性的百分比”係提及經由通過比較視窗來比較2個最佳對準的序列(舉例而言，核酸序列，和胺基酸序列)而決定的值，其中比較視窗內的序列部份當與參考序列(其不含有加入或刪失)相比時，為了2個序列之間的最佳對準可以含有有加入或刪失(亦即，空格)。百分比係藉由以下方式來計算：決定2個序列之間同一的核苷酸或胺基酸殘基發生的位置之數量以獲得匹配的位置之數量，將匹配的位置之數量除以比較視窗內總位置之數量，以及將結果乘上100來獲得序列同一性的百分比。

對準要比較的序列的方法為本技藝所熟知的。各種程式與對準演算法係說明於，舉例而言：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443；Pearson and Lipman (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444；Higgins and Sharp(1988)Gene 73：237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5：151-3；Corpet等人(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人(1992)Comp.Appl.Biosci.8：155-65；Pearson等人(1994)Methods Mol.Biol.24：307-31；Tatiana等人(1999)FEMS Microbiol.Lett.174：247-50，之內。序列對準的方法及同源性計算之詳細考慮因素可以於，舉例而言，Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10內找到。

國家生物資訊中心(NCBI)基本局部對準搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST^TM；Altschul等人(1990))可從數個來源得到，包括國家生物資訊中心(Bethesda,MD)，以及於網路上，供用於關於數個序列分析程式。如何使用此程式來決定序列同一性的說明可於網路在BLAST^TM的“輔助程式”節得到。關於核酸序列的比較，BLAST^TM(Blastn)程式之“Blast 2序列”功能可以利用系統內定參數來使用。當以此方法來評定時，具有關於參考序列還更大的相似性之核酸序列將顯示出增高的同一性百分比。

當使用於本文中，片語“可操作地連結”係提及當第一個的核酸序列與第二個的核酸序列處於功能性的關係的場合，第一個核酸序列可操作地連結第二個核酸序列。舉例說，當一個啟動子影響一編碼序列的轉錄或表現時，該啟動子可操作地連結該編碼序列。當重組生產時，可操作地連結的核酸序列一般為連續的以及，必需時要使二個蛋白質編碼區域結合，於相同的閱讀框架內。然而，要可操作地連結的單元不需要為連續的。

當使用於本文中，片語“啟動子”係提及一DNA區域，其通常座落於需要轉錄的區域之上游(朝一基因的5'區域)。啟動子可允許其等控制的基因之適當的活化或抑制。一啟動子可含有轉錄因子所辨認之特定的序列。此等因子可結合至啟動子DNA序列且導致RNA聚合酶的補充，RNA聚合酶為由基因之編碼區域來合成RNA之酵素。

當使用於本文中，片語“轉形”或“轉導”係提及一病毒或載體傳送核酸分子至一細胞的過程。當一核酸分子變成為由一細胞穩定地複製時，不論是藉由該核酸分子併入至細胞基因體之內或是藉由游離基因體(episomal)複製，則該細胞係由該“轉導”至細胞內的核酸分子所“轉形”。當使用於本文中，術語“轉形”包含可以導入一種核酸分子至此一細胞之內的所有技術。實例包括，但不限於：用病毒載體轉染；用質體載體轉形；電穿孔；(Fromm等人(1986)Nature 319：791-3)；脂轉染(lipofection)(Felgner等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7)；顯微注射(Mueller等人(1978)Cell 15：579-85)；農桿菌媒介之轉移(Fraley等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7)；直接DNA攝入；晶鬚媒介之轉形；以及微噴射轟擊法(microprojectile bombardment)(Klein等人(1987)Nature 327：70)。

當使用於本文中，片語“轉基因”係提及一個外源性的核酸序列。於一實例中，一個轉基因為一基因序列(舉例而言，一個除草劑抗性基因)、編碼工業上或是藥學上有用的化合物之基因，或是編碼所欲的農業性狀之基因。於再另一實例中，轉基因為一個反義核酸序列，其中反義核酸序列的表現抑制一標的核酸序列的表現。一個轉基因可以含有可操作地連結至該轉基因之調節序列(舉例而言，一個啟動子)。於一些具體例中，一個有興趣的核酸序列為一個轉基因。然而，於其他的具體例中，一個有興趣的核酸序列為一個內源的核酸序列，其中內源性核酸序列之額外的基因體複本為所欲的，或是一個核酸序列，其係處於相對於宿主生物內之標的核酸分子的序列為反義方向的。

當使用於本文中，片語“載體”係提及導入至一細胞之內的核酸分子，由此生產轉形的細胞。一載體可以包括准許其於宿主細胞內複製之核酸序列，例如複製起點。實例包括，但不限於，攜帶外源性DNA至一細胞之內的質體、黏接質體(cosmid)、噬菌體，或是病毒。實例包括，但是不限於，一載體也可以包括一個或多個基因、反義分子，及/或可選標記基因以及本技藝已知的其他遺傳單元。一載體可以轉導、轉形，或感染一細胞，藉此造成細胞表現該載體編碼的核酸分子及/或蛋白質。一載體可以選擇性地包括協助完成該核酸分子進入細胞的材料(舉例而言，脂質體)。

當使用於本文中，片語“植物”包括植物與植物的部分，其包括但不限於植物細胞及植物組織，例如葉子、莖、根、花、花粉，以及種子。本發明中使用的植物種類通常為經得起突變誘發之盡可能廣的高等和低等植物，其包括被子植物(單子葉與雙子葉植物)、裸子植物、蕨類植物與多細胞的藻類。因而，“植物”包括雙子葉植物與單子葉植物。雙子葉植物之實例包括煙草、阿拉伯芥(Arabidopsis)、大豆、番茄、木瓜、油菜、葵花、棉花、苜蓿、馬鈴薯、葡萄藤(grapevine)、樹豆、豌豆、蕓薹屬(Brassica)、雞豆、甜菜、油菜子(rapeseed)、西瓜、甜瓜、胡椒、花生、南瓜(pumpkin)、蘿蔔、菠菜、南瓜(squash)、青花菜(broccoli)、甘藍菜、胡蘿蔔、花椰菜、芹菜、山東白菜(Chinese cabbage)、胡瓜、茄子，以及萵苣(lettuce)。單子葉植物之實例包括玉米、米、小麥、甘蔗、大麥、黑麥(rye)、高梁、蘭花、竹子、香蕉、香蒲、百合、燕麥、洋蔥、粟，以及黑小麥(triticale)。

當使用於本文中，片語“植物材料”係提及葉子、莖、根、花或花的部分、果實、花粉、卵細胞、合子、種子、插條、細胞或組織培養物，或是植物之任何其他部分或產物。於一些具體例中，植物材料包括子葉及葉子。

當使用於本文中，片語“轉譯開關(translation switch)”係提及於一基因的末端允許最接近的下游基因之轉譯的機制。轉譯開關的機制可以以核酸位準(舉例而言，病毒或真核內部核糖體進入位址(IRES)、選擇式剪接位址，或核糖酵素剪切位址)或是以胜肽/蛋白位準(舉例而言，2A胜肽、類2A胜肽、內含蛋白胜肽或是蛋白酶剪切位址)來作用。

以核酸位準或是以胜肽/蛋白位準之此等轉譯開關機制為本技藝所熟知的。見舉例而言，li,Z.,H.M.Schumacher，等人(2010)J Biotechnol 145(1)：9-16；Chen,Y.,K.Perumal，等人(2000)Gene Expr 9(3)：133-143；Dinkova,T.D.,H.Zepeda，等人(2005)Plant J 41(5)：722-731；Dorokhov, Y.L.,M.V.Skulachev，等人(2002)Proc Natl Acad Sci U S A 99(8)：5301-5306；Fernandez Miragall,O.and C.Hernandez(2011)PLoS One 6(7)：e22617；Groppelli,E.,G.J.Belsham,等人(2007)J Gen Virol 88(Pt 5)：1583-1588；Ha,S.H.,Y.S.Liang，等人(2010)Plant Biotechnol J 8(8)：928-938；Karetnikov,A.and K.Lehto(2007)J Gen Virol 88(Pt 1)：286-297；Karetnikov,A.and K.Lehto(2008)Virology 371(2)：292-308；Khan,M.A.,H.Yumak，等人(2009)J Biol Chem 284(51)：35461-35470；以及Koh,D.C.,S.M.Wong，等人(2003)J Biol Chem 278(23)：20565-20573，其等之內容以其等之整體併入以作為參考資料。含有經修飾的內含蛋白之多重基因表現建構物已經揭示於美國專利號碼7,026,526和7,741,530，以及美國專利申請案2008/0115243之內。含有經修飾的內含蛋白之多重基因表現建構物已經揭示於美國專利號碼7,026,526和7,741,530，以及美國專利申請案2008/0115243之內。

當使用於本文中，片語“可選標記”或是“可選標記基因”係提及一基因，其選擇性地使用於植物轉形株內，舉例而言，以保護植物細胞免受一種選擇劑或是提供對一種選擇劑之抗性/耐受性。只有接收功能性可選標記的該等細胞或是植物能夠於具有一種選擇劑的條件下分裂或是生長。選擇劑之實例可以包括，舉例而言，抗生素，包括觀黴素(spectinomycin)、新黴素、康黴素(kanamycin)、巴龍黴素(paromomycin)、建它黴素(gentamicin)，以及濕黴素 (hygromycin)。此等可選標記包括新黴素磷酸轉移酶(npt II)之基因，其表現賦予抗生素康黴素抗性的酵素，以及相關的抗生素新黴素、巴龍黴素、建它黴素，和G418之基因，或是濕黴素磷酸轉移酶(hpt)之基因，其表現賦予濕黴素抗性的酵素。其他的可選標記基因可以包括編碼除草劑抗性之以下的基因，包括Bar(對抗BASTA®(草胺膦銨鹽(glufosinate ammonium))，或草胺膦(phosphinothricin)(PPT)之抗性)、乙醯乳酸合成酶(ALS，對抗抑制劑之抗性，例如磺醯脲(SUs)、咪唑啉酮(imidazolinone)(IMIs)、三唑嘧啶(TPs)、嘧啶氧苯甲酸酯(POBs)，以及磺醯胺基羰基三唑啉酮(sulfonylamino carbonyl triazolinones)，其防止支鏈胺基酸合成之第一個步驟)、草甘膦、2,4-D，以及金屬的抗性或是敏感性。片語“標記陽性”係提及已經轉形成包括可選標記基因的植物。

各種各樣的可選標記或是可偵測的標記可以併入至所選的表現載體之內以允許轉形的植物，或是轉形體之鑑定及選擇。可得到許多的方法來確認選擇標記於轉形的植物內之表現，包括舉例而言DNA定序和PCR(聚合酶連鎖反應)、南方墨點、RNA墨點、偵測來自載體的蛋白質表現之免疫學方法，舉例而言，媒介草胺膦(phosphinothricin)的抗性之沈澱的蛋白質，或是其他的蛋白質，例如報導基因β-葡萄醣醛酸酶(GUS)、螢光素酶、綠螢光蛋白(GFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、鹼性磷酸酶，以及類似物(見Sambrook，等人，Molecular Cloning： A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Press,N.Y.,2001)。

可選標記基因係使用來選擇轉形的細胞或組織。可選標記基因包括編碼以下的抗生素抗性的基因，例如編碼新黴素磷酸轉移酶II(NEO)和濕黴素磷酸轉移酶(HPT)的該等以及賦予除草劑化合物抗性的基因。除草劑抗性基因一般編碼對除草劑不敏感的經修飾的標的蛋白質或是編碼一酵素，該酵素於植物內、在除草劑可以作用之前降解除草劑或使除草劑去毒。舉例而言，對草甘膦的抗性或是已經藉由使用編碼突變標的酵素，5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因而獲得。EPSPS之基因和突變體已經揭示於美國專利號碼4,940,835、5,188,642、5,310,667、5,633,435、5,633,448，以及6,566,587之內。對草胺膦銨鹽(glufosinate ammonium)、溴苯腈(bromoxynil)，以及2,4二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性已經藉由使用編碼使各別的除草劑去毒之草胺膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶、腈酶，或2,4-二氯苯氧乙酸單氧化酶之細菌基因而獲得。對草胺膦(glufosinate)的抗性/耐受性之酵素/基因已經揭示於美國專利號碼5,273,894、5,276,268、5,550,318，以及5,561,236之內。2,4-D的抗性之酵素/基因先前已經揭示於美國專利號碼6,100,446和6,153,401之內，以及專利申請案US 2009/0093366和WO 2007/053482之內。腈酶之酵素/基因先前已經揭示於美國專利第4,810,648號之內。

其他的除草劑可以抑制生長點或是分生組織，包括咪唑啉酮或磺醯脲，以及已經描述的此等除草劑之乙醯羥酸(acetohydroxyacid)合成酶(AHAS)和乙醯乳酸合成酶(ALS)的抗性/耐受性之基因。AHAS和突變體之基因和突變體已經揭示於美國專利號碼4,761,373、5,304,732、5,331,107、5,853,973，以及5,928,937之內。ALS之基因和突變體已經揭示於美國專利號碼5,013,659以及5,141,870之內。

草甘膦抗性基因包括突變5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)基因(經由導入重組型核酸及/或天然EPSPs基因之活體內突變誘發的各種型式)、aroA基因和草甘膦乙醯轉移酶(GAT)基因，分別地)。其他的膦醯基化合物之抗性基因包括草胺膦(glufosinate)(來自鏈黴菌物種之草胺膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶(PAT)基因，鏈黴菌物種包括吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)和綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridichromogenes))，以及吡啶氧(pyridinoxy)或苯氧丙酸(phenoxy proprionic acids)及環4-甲戊-2-酮(cyclohexone)(ACCase抑制劑編碼基因)。乙醯輔酶A羧酶(ACCas)之除草劑抗性/耐受性基因已經描述於美國專利號碼5,162,602和5,498,544之內。

一種編碼突變aroA基因的DNA分子可以根據ATCC存取編號39256來獲得，以及突變基因的核苷酸序列係揭示於屬於Comai的美國專利第4,769,061號、屬於Kumada等人的歐洲專利申請案號碼0 333 033，以及屬於Goodman等人的U.S.Pat.號碼4,975,374之內，其揭示賦予，像是L-草胺膦(L-phosphinothricin)的除草劑抗性之麩醯胺合成酶基因的核苷酸序列。屬於Leemans等人之歐洲申請案號碼0 242 246提供PAT基因的核苷酸序列。再者DeGreef等人，Bio/Technology 7：61(1989)，描述表現編碼PAT活性之嵌合的bar基因之基因轉殖植物的生產。賦予苯氧丙酸(phenoxy proprionic acids)以及環4-甲戊-2-酮抗性的基因之示範，包括西殺草(sethoxydim)及甲基合氯氟(haloxyfop)，為由Marshall等人，Theon.Appl.Genet.83：435(1992)描述的Acc1 S1、Acc1 S2及Acc1 S3基因。能夠賦予草甘膦抗性的GAT基因係描述於屬於Castle等人的WO 2005012515之內。賦予2,4-D、芳氧苯氧基丙酸(fop)及吡啶氧基生長激素(pyridyloxy auxin)除草劑抗性的基因係描述於WO 2005107437以及美國專利申請案序號11/587,893之內。

其他的除草劑可以抑制光合成，包括三氮(psbA和1s+基因)或是苯甲腈(腈酶基因)。Przibila等人，Plant Cell 3：169(1991)，描述用編碼突變psbA基因的質體之單胞藻屬(Chlamydomonas)的轉形。腈酶基因之核苷酸序列係揭示於授予Stalker的美國專利號碼4,810,648之內，以及含有此等基因的DNA分子可以得自於ATCC存取編號53435、67441，以及67442。編碼麩胱甘肽S-轉移酶之DNA的選殖及表現係由Hayes等人描述，Biochem.J.285：173(1992)。

為了本發明的目的，可選標記基因包括，但不限於編碼以下的基因：新黴素磷酸轉移酶II(Fraley等人(1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4：1-25)；氰胺水合酶(cyanamide hydratase)(Maier Greiner等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4250-4264)；天門冬胺酸激酶；二氫吡啶二羧酸合成酶(dihydrodipicolinate synthase)(Perl等人(1993)Bio/Technology 11：715-718)；色胺酸去羧酶(Goddijn等人(1993)Plant Mol.Bio.22：907-912)；二氫吡啶二羧酸合成酶和減敏天門冬胺酸(desensitized aspartate)激酶(Perl等人(1993)Bio/Technology 11：715-718)；bar基因(Toki等人(1992)Plant Physiol.100：1503-1507；以及Meagher等人(1996)和Crop Sci.36：1367)；色胺酸去羧酶(Goddijn等人(1993)Plant Mol.Biol.22：907-912)；新黴素磷酸轉移酶(NEO)(Southern 等人(1982)J.Mol.Appl.Gen.1：327；濕黴素磷酸轉移酶(HPT或HYG)(Shimizu等人(1986)Mol.Cell Biol.6：1074)；二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase)(DHFR)(Kwok等人(1986)PNAS USA 4552)；草胺膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶(DeBlock等人(1987)EMBO J.,6：2513)；2,2-二氯丙酸去鹵酶(Buchanan Wollatron等人(1989)J.Cell.Biochem.13D：330)；乙醯羥酸合成酶(Anderson等人，U.S.Pat.號碼4,761,373；Haughn等人(1988)Mol.Gen.Genet.221：266)；5-烯醇式丙酮-莽草酸-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-phosphate synthase)(aroA)(Comai等人(1985)Nature 317：741)；鹵芳基腈酶(haloarylnitrilase)(Stalker等人，公開的PCT申請案WO87/04181)；乙醯輔酶A羧酶(Parker等人(1990)Plant Physiol.92：1220)；二氫喋酸 (dihydropteroate)合成酶(sul I)(Guerineau等人(1990)Plant Mol.Biol.15：127)；以及32 kD光系統II多肽(psbA)(Hirschberg等人(1983)Science,222：1346)。

再者包括的為編碼對以下的抗性之基因：氯黴素(Herrera Estrella等人(1983)EMBO J.,2：987-992)；甲氨蝶呤(Herrera Estrella等人(1983)Nature,303：209-213；Meijer等人(1991)Plant Mol Bio.,16：807-820(1991)；濕黴素(Waldron等人(1985)Plant Mol.Biol.,5：103-108；Zhijian等人(1995)Plant Science,108：219-227和Meijer等人(1991)Plant Mol.Bio.16：807-820)；鏈黴素(Jones等人(1987)Mol.Gen.Genet.,210：86-91)；觀黴素(Bretagne Sagnard等人(1996)Transgenic Res.,5：131-137)；博來黴素(bleomycin)(Hille等人(1986)Plant Mol.Biol.,7：171-176)；磺醯胺(Guerineau等人(1990)Plant Mol.Bio.,15：127-136)；溴苯腈(Stalker等人(1988)Science,242：419-423)；2,4-D(Streber等人(1989)Bio/Technology,7：811-816)；草甘膦(Shaw等人(1986)Science,233：478-481)；以及草胺膦(phosphinothricin)(DeBlock等人(1987)EMBO J.,6：2513-2518)。

以上的可選標記和報導基因之清單不打算為限制性的。本發明包含任何的報導子或是可選標記基因。設若必需，此等基因可以透過本技藝已知的方法來定序。

報導子以及可選標記基因係予以合成用於植物內最佳的表現。也就是說，該基因的編碼序列已經予以修飾以增強於植物內的表現。將合成性標記基因設計成要以較高的位準於植物內表現而導致較高的轉形效率。用於合成最佳化的基因之方法為本技藝可得的。事實上，已經最佳化數個基因來增加植物內基因產物的表現。

標記基因序列可以予以最佳化用於表現於特定的植物物種內或是任擇地可以予以修飾用於植物科內之最佳的表現。植物偏好密碼子可以由特定有興趣的植物物種內之最大量表現的蛋白質內之最高頻率的密碼子來決定。見，舉例而言，EPA 0359472；PA 0385962；WO 91/16432；Perlak等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88：3324-3328；和Murray等人(1989)Nucleic Acids Research,17：477-498；U.S.Pat.號碼5,380,831；以及U.S.Pat.號碼5,436,391。以此方式，可以最佳化核苷酸序列用於表現於任何的植物內。全部或任何部分的基因序列可以最佳化或是合成的是認可的。也就是說，也可以使用完全地最佳化或是部分最佳化的序列。

賦予除草劑抗性的基因：

A.對抗除草劑咪唑啉酮或磺醯脲之乙醯羥酸合成酶(AHAS)和乙醯乳酸合成酶(ALS)的抗性/耐受性。AHAS和突變體之基因和突變體已經揭示於美國專利號碼4,761,373、5,304,732、5,331,107、5,853,973，以及5,928,937之內。ALS之基因和突變體已經揭示於美國專利號碼5,013,659及5,141,870之內。

B.對抗除草劑環己二酮及/或芳氧苯氧基丙酸(包括甲基合氯氟、甲基禾草靈(Diclofop)、乙基芬殺草(Fenoxyprop)、伏寄普(Fluazifop)、快伏草(Quizalopfop))之乙醯輔酶A羧酶(ACCas)的抗性/耐受性基因已經描述於美國專利號碼5,162,602及5,498,544之內。

C.草甘膦抗性/耐受性之基因.5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(ES3P合成酶)的基因已經描述於美國專利第4,769,601號之內。5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)和突變體之基因已經描述於美國專利號碼4,940,835、5,188,642、5,310,667、5,633,435、5,633,448,以及6,566,587之內。

D.草胺膦(glufosinate)(双丙氨磷(bialaphos)、草胺膦(phosphinothricin)(PPT))抗性/耐受性之基因.草胺膦(phosphinothricin)乙醯轉移酶(Pat)之基因已經描述於美國專利號碼5,273,894、5,276,268，和5,550,318之內；以及双丙氨磷抗性基因(Bar)之基因已經描述於美國專利號碼5,561,236，和5,646,024、5,648,477，以及7,112,665之內。麩醯胺合成酶(GS)之基因已經描述於美國專利號碼4,975,372及歐洲專利申請案EP 0333033 A1之內。

E.對抗除草劑異唑、二酮腈(diketonitrile)，及/或三酮類包括磺草酮(sulcotrione)及硝磺草酮(mesotrione)的羥基苯基丙酮酸雙氧合酶(hydroxy phenyl pyruvate dioxygenase)(HPPD)之抗性/耐受性基因已經描述於美國專利號碼6,268,549及6,069,115之內。

F. 2,4-D抗性/耐受性之基因.2,4-D單氧化酶之基因已經描述於美國專利號碼6,100,446及6,153,401之內。額外的2,4-D抗性/耐受性之基因係揭示於US 2009/0093366及WO 2007/053482之內。

G.對抗除草劑咪唑及/或三唑的咪唑甘油磷酸酯脫水酶(imidazoleglycerol phosphate dehydratase)(IGPD)之基因已經描述於美國專利號碼5,541,310之內。對抗除草劑麥草畏(dicamba)的麥草畏降解酶(加氧酶、鐵氧化還原蛋白，以及還原酶)之基因已經揭示於美國專利號碼7,022,896及7,105,724之內。

H.抑制光合成的除草劑之基因，包括三氮(psbA及1s+基因)或苯甲腈(腈酶基因)。見，舉例而言，Przibila等人，Plant Cell 3：169(1991)揭示用編碼突變的psbA基因的質體之單胞藻屬的轉形。腈酶基因之核苷酸序列係揭示於美國專利號碼4,810,648之內以及含有此等基因的DNA分子可得自於ATCC存取編號53435、67441，以及67442。編碼麩胱甘肽S-轉移酶之DNA的選殖及表現係由Hayes等人描述，Biochem.J.285：173(1992)。

除非另有明確說明，本文中使用的所有技術和科學的術語具有如同此揭示所屬技藝之熟悉此藝者普遍瞭解的相同意義。分子生物學中共同術語的定義可以於以下找到，舉例而言：Lewin,Genes V,Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

提供包含合成性核苷酸序列的核酸分子，該合成性核苷酸序列可以作用為雙向啟動子。於一些具體例中，一種合成性雙向啟動子可以可操作地連結至有興趣的1個或2個核苷酸序列。舉例而言，一種合成性雙向啟動子可以可操作地連結至有興趣的1個或2個核苷酸序列(舉例而言，二個基因，一者於啟動子的各端上)，以便調節有興趣的核苷酸序列之至少一者(舉例而言，一者或兩者)的轉錄。藉由併入來自啟動子的URS於該合成性雙向啟動子內，可以完成有關於可操作地連結至該合成性雙向啟動子之有興趣的1個核苷酸序列之特定的表現和調節模式(舉例而言，例如透過在天然的啟動子的控制之下的基因來展現)。

本發明的一些具體例係於本文中舉例說明，其係透過併入一種來自雙向的玉米泛素-1基因(ZmUbi1)啟動子之最小核心啟動子單元至不同於天然的啟動子的環境之分子環境之內來建造一種合成性雙向啟動子。此最小核心啟動子單元於本文係提及為“minUbi1P”，以及大概為200 nt長度。來自多種玉米物種和玉蜀黍基因型之minUbi1P單元的定序和分析已經顯露出功能性的minUbi1P單元為高度守恆的，以使得一種minUbi1P單元可以保留其作為轉錄起始子的作用，設若其與序列辨識編號：1的minUbi1P單元共有，舉例而言，至少大約75%；至少大約80%；至少大約 85%；至少大約90%；至少大約91%；至少大約92%；至少大約93%；至少大約94%；至少大約95%；至少大約96%；至少大約97%；至少大約98%；至少大約99%；及/或至少大約100%的序列同一性。於本發明的一些具體例中可以為有用的minUbi1P單元的特徵可以包括，舉例而言且不限於，前述的核苷酸序列之高守恆性；存在至少一個TATA盒；及/或存在至少一個(舉例而言，二個)熱休克一致單元。於特定的minUbi1P單元內，超過一種熱休克一致單元可以重疊於minUbi1P序列之內。

併入一種minUbi1P單元至不同於天然的啟動子的環境之分子環境之內來建造一種合成性雙向啟動子的方法可以包含使該minUbi1P單元相關於啟動子之其餘的序列，包括其之天然的的最小核心啟動子，之排列反轉。因而，一種合成性雙向啟動子可以包含一種第一minUbi1P單元，其係以反向的排列併入至啟動子內之一種第二的最小核心啟動子單元(舉例而言，一種第二minUbi1P單元)的5’處，以使得其可以可操作地連結至坐落於該第一minUbi1P單元的5’處之有興趣的1個核苷酸序列。舉例而言，該第一minUbi1P單元可以以反向的排列併入至ZmUbi1啟動子之5’端。

一種合成性雙向SCBV啟動子除了至少一個minUbi1P單元之外，也還可以包含一個或多個額外的序列單元。於一些具體例中，一種合成性雙向Ubi1啟動子可以包含一個啟動子URS；一個外顯子(舉例而言，一個前導子或是訊息胜肽)；一個內含子；一個間隔子序列；以及或是前述的任一者之一個或多個之組合。舉例而言且不限於，一種合成性雙向Ubi1啟動子可以包含一個來自Ubi1啟動子(舉例而言，玉米Ubi1啟動子)的URS序列；一個編碼來自Ubi1基因的一種前導子胜肽之外顯子；來自Ubi1基因的內含子；以及此等之組合。

於該等實例的某些中，該等實例包含一種含有一個啟動子URS之合成性雙向Ubi1啟動子，該URS可以予以選擇以賦予該合成性啟動子特定的調節特質。已知的啟動子於運用其等之可操作地連結的基因之控制的類型上廣泛地變化(舉例而言，環境的反應、發育的提示，和空間資訊)，以及併入至異源性啟動子內的URS相關於其之天然的啟動子和可操作地連結的基因，典型地維持URS展現出控制的類型。Langridge等人(1989)，在前。真核啟動子之實例，該等真核啟動子已經特徵化且可以含有一個包含於依據一些具體例的合成性雙向Ubi1啟動子之內的URS，包括，舉例而言且不限於：於美國專利號碼6,437,217(玉米RS81啟動子)；5,641,876(米的肌動蛋白啟動子)；6,426,446(玉米RS324啟動子)；6,429,362(玉米PR-1啟動子)；6,232,526(玉米A3啟動子)；6,177,611(組成玉米啟動子)；6,433,252(玉米L3油體膜蛋白(oleosin)啟動子)；6,429,357(米的肌動蛋白2啟動子，及米的肌動蛋白內含子)；5,837,848(根專一性啟動子)；6,294,714(光可誘導的啟動子)；6,140,078(鹽可誘導的啟動子)；6,252,138(病原體可誘導的啟動子)；6,175,060(缺磷症可誘導的啟動子)；6,388,170(雙向啟動子)；6,635,806讪coixin啟動子；以及美國專利申請案序號09/757,089(玉米葉綠體醛醇酶啟動子)之內描述的該等啟動子。

額外的例示性原核啟動子包括胭脂鹼(nopaline)合成酶(NOS)啟動子(Ebert等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16)：5745-9)；章魚肉鹼合成酶(OCS)啟動子(其係攜帶於根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的腫瘤誘生型質體之上)；花椰菜嵌紋病毒(caulimovirus)啟動子，例如花椰菜斑紋病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)19S啟動子(Lawton等人(1987)Plant Mol.Biol.9：315-24)；CaMV 35S啟動子(Odell等人(1985)Nature 313：810-2；玄參斑紋病毒(figwort mosaic virus)35S啟動子(Walker等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19)：6624-8)；蔗糖合成酶啟動子(Yang and Russell(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：4144-8)；R基因複合體啟動子(Chandler等人(1989)Plant Cell 1：1175-83)；CaMV35S(美國專利號碼5,322,938、5,352,605、5,359,142，及5,530,196)；FMV35S(美國專利號碼6,051,753，及5,378,619)；PC1SV啟動子(美國專利號碼5,850,019)；SCP1啟動子(美國專利號碼6,677,503)；以及AGRtu.nos啟動子(GenBank存取號碼V00087；Depicker等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：561 73；Bevan等人(1983)Nature 304：184-7)，以及類似物。

於一些具體例中，一種合成性雙向Ubi1啟動子除了minUbi1P單元之外，還可以進一步包含一外顯子。舉例而言，於特定的具體例之中，標定或是運輸一種由可操作地連結至該啟動子之有興趣的核苷酸序列所編碼的多肽至特定的亞細胞位置及/或隔室可能為希望的。於此等與其他的具體例中，一編碼序列(外顯子)可以併入至一個核酸分子內、介於該minUbi1P單元和編碼一種多肽的核苷酸序列之間。此等單元可以依據熟練的從事者之判斷力來配置以使得合成性雙向Ubi1啟動子促進一種多肽(或是可操作地連結至該啟動子之二個多肽編碼序列之一者或兩者)的表現，該多肽包含由併入的編碼序列所編碼的胜肽，以一個功能性的關係與該多肽的剩餘部分。於特定實例中，可以併入編碼一個前導子、運輸子(transit)，或是訊息胜肽(舉例而言，Ubi1前導子胜肽)的一個外顯子。

可以由併入至合成性雙向Ubi1啟動子之內的一個外顯子所編碼之胜肽包括，舉例而言且不限於：泛素(舉例而言，Ubi1)前導子外顯子；以及葉綠體運送胜肽(CTP)(舉例而言，阿拉伯芥(A.thaliana)EPSPS CTP(Klee等人(1987)Mol.Gen.Genet.210：437-42)，以及矮牽牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(della-Cioppa等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：6873-7))，如同於國際PCT公開案號碼WO 2008/105890內舉例說明的葉綠體標定之麥草畏單氧化酶(DMO)。

於本發明的一些具體例中，內含子也可以併入至一種合成性雙向Ubi1啟動子之內，舉例而言，介於一種minUbi1P單元和可操作地連結至該啟動子之有興趣的核苷酸序列之間。於一些實例中，一個併入至一種合成性雙向Ubi1啟動子之內的內含子可以是，不限於，一個作用為一轉譯前導子序列之5’UTR，其出現於轉譯開始序列之完全加工的mRNA上游(此一轉譯前導子序列可以影響一個原始的轉錄本加工成mRNA、mRNA穩定性，及/或轉譯效率)。轉譯前導子序列之實例包括玉米和牽牛花熱休克蛋白前導子(美國專利第5,362,865號)、植物病毒外殼蛋白前導子、植物核酮糖雙磷酸羧化酶(rubisco)前導子，以及其他。見，舉例而言，Turner and Foster(1995)Molecular Biotech.3(3)：225-36。5’UTRs之非限制性實例包括GmHsp(美國專利第5,659,122號)；PhDnaK(美國專利第5,362,865號)；AtAnt1；TEV(Carrington and Freed(1990)J.Virol.64：1590-7)；以及AGRtu.nos(GenBank存取號碼V00087；以及Bevan等人(1983)Nature 304：184-7)。

可以選擇性併入至一種合成性雙向Ubi1啟動子之內的額外序列包括，舉例而言且不限於：3’非轉譯序列；3’轉錄終止區；以及聚腺苷酸化的區域。此等為坐落於一種有興趣的核苷酸序列的下游之遺傳單元(舉例而言，可操作地連結至一種合成性雙向Ubi1啟動子之有興趣的序列)，以及包括多核苷酸，其提供聚腺苷酸化訊息，及/或能夠影響轉錄、mRNA加工，或是基因表現之其他的調節訊息。一種聚腺苷酸化訊息可以作用於植物內而導致添加聚腺苷酸核苷酸至mRNA前驅物的3’端。聚腺苷酸化序列可以衍生自天然的基因、衍生自各種各樣的植物基因，或是衍生自T-DNA基因。一種3’轉錄終止區之非限制性實例為胭脂鹼合成酶3’區域(nos 3’；Fraley等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7)。Ingelbrecht等人(1989)，Plant Cell 1：671-80之內提供不同的3’非轉譯區之使用的實例。聚腺苷酸化訊息之非限制性實例包括來自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因之一者(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等人(1984)EMBO J.3：1671-9)以及AGRtu.nos(GenBank存取號碼E01312)。

於一些具體例中，一種合成性雙向Ubi1啟動子包含一個或多個核苷酸序列，其促進一種包含啟動子的核酸標定至一標的有機體的基因體內之特定的基因座。舉例而言，可以含括與宿主內的基因體DNA序列區段同源的一個或多個序列(舉例而言，稀有的或獨特的基因體DNA序列)。於一些具體例中，此等同源序列可以引導一種包含合成性雙向Ubi1啟動子的核酸在宿主基因體內之同源的DNA之處的重組和整合。於特定實例中，一種合成性雙向Ubi1啟動子包含促進一種含有啟動子的核酸標定至宿主基因體內之稀有的或獨特的位置之一個或多個核苷酸序列，其利用建造的核酸酶酵素，該核酸酶酵素識別位於稀有的或獨特的位置處之序列以及促進位於稀有的或獨特的位置處之整合。使用鋅指核酸內切酶作為核酸酶酵素之此一標定整合系統係描述於美國專利申請案13/011,735之內。

包含一種合成性雙向Ubi1啟動子的核酸可以使用本技藝已知的任何技術來生產，包括舉例而言且不限於：RCA；PCR擴增；RT-PCR擴增；OLA；以及SNuPE。此等和其他等效的技術為熟悉此藝者熟知的，以及於，舉例而言且不限於：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,2001；以及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,1998之內進一步詳細地描述。以上列舉的全部參考文獻包括前述的手冊兩者，包括其內所提供之任何的圖示、圖，及/或表格。

遞送及/或轉形：本揭示亦提供用一種包含合成性雙向Ubi1啟動子的核酸分子轉形細胞的方法。許多本技藝已知的導入核酸分子至植物內的技術之任一者可以使用來用包含如一些具體例的一種合成性雙向Ubi1啟動子的核酸分子來轉形植物，舉例而言，來導入一個或更多個合成性雙向Ubi1啟動子至宿主植物基因體之內，及/或進一步導入可操作地連結至該啟動子之有興趣的一個或更多個核酸分子的。

適合用於植物轉形的方法包括可以導入DNA至一細胞之內的任何方法，舉例而言且不限於：電穿孔法(見，舉例而言，美國專利5,384,253)；微噴射轟擊法(見，舉例而言，美國專利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861，以及6,403,865)；農桿菌屬媒介的轉形(見，舉例而言，美國專利5,635,055、5,824,877、5,591,616；5,981,840，及6,384,301)；以及原生質體(protoplast)轉形(見，舉例而言，美國專利5,508,184)。透過應用例如前述的技術，差不多任何的植物物種之細胞可以穩定地轉形，以及此等細胞藉由熟悉此藝者已知的技術可以發展成為基因轉殖植物。舉例而言，於棉花轉形的場合特別有用的技術係描述於美國專利5,846,797、5,159,135、5,004,863，以及6,624,344之內；用於轉形蕓薹屬植物的技術特別地說明於，舉例而言，美國專利5,750,871之內；用於轉形大豆的技術係說明於，舉例而言，美國專利6,384,301之內；以及用於轉形玉米的技術係說明於，舉例而言，美國專利7,060,876和5,591,616，以及國際PCT公開案WO 95/06722之內。

在達到遞送外源性的核酸至接受細胞(recipient cell)之後，轉形的細胞一般予以鑑定用於進一步培養和植物再生。為了改善鑑定轉形體的能力，可能希望使用一種可選或篩選標記基因加上用來產生轉形體之轉形載體。於此事例內，可能轉形的細胞族群可以藉由使細胞暴露於一種選擇劑或多種選擇劑來分析，或是細胞可以篩選所欲的標記基因性狀。

在暴露於選擇劑之後仍然生存的細胞，或是於篩選分析中已經評分為陽性的細胞，可以培養於支持植物的再生之培養基內。於一些具體例中，任何適合的植物組織培養基(舉例而言，MS和N6培養基)可以透過含括另外的物質，例如生長調節劑，而改良。組織可以維持於帶有生長調節劑的基礎培養基上直到可得到足夠的組織來開始植物再生努力為止，或是跟隨重複循環的手工選擇，直到組織的形態適合再生為止(舉例而言，至少2週)，接而轉移至有助於莖(shoot)形成的培養基。週期性地轉移培養物直到足夠的莖形成已出現為止。一旦莖形成，將其等轉移至有助於根形成的培養基。一旦形成足夠的根，植物可以轉移至土壤為了進一步的生長和成熟。

為了確認再生的植物內包含一種合成性雙向Ubi1啟動子之所欲的核酸分子之存在，可以執行各種各樣的分析。此等分析包括，舉例而言：分子生物分析，例如南方墨點和北方墨點以及PCR；生化分析，例如，舉例而言，透過免疫學的手段(ELISA及/或西方墨點)或是透過酵素功能來偵測蛋白質產物的存在；植物部分的分析，例如葉子或是根分析；以及全株再生植物之表現型的分析。

標定整合的事例可以，例如，透過使用，舉例而言，對於有興趣的核酸分子專一的寡核苷酸引子之PCR擴增來篩選。瞭解到PCR基因型分型包括，但不限於，由預料會含有一種整合至基因體之內的有興趣的核酸分子之經單離的宿主植物癒合組織衍生的基因體DNA之聚合酶連鎖反應(PCR)擴增，接著標準的PCR擴增產物之選殖和序列分析。PCR基因型分型的方法已經充分地描述(見，舉例而言，Rios等人(2002)，Plant J.32：243-53)，以及可以應用至衍生自任何的植物物種或是組織類型，包括細胞培養物，的基因體DNA。結合至標的序列和導入的序列兩者之寡核苷酸引子的組合可以連續地或是多工的使用於PCR擴增反應中。可以生產設計成要黏著(anneal)標的位址、導入的核酸序列，及/或二者之組合的寡核苷酸引子。因而，PCR基因型分型策略可以包括，舉例而言且不限於：於植物基因體內之專一的序列之擴增；於植物基因體內之多重特定的序列之擴增；於植物基因體內之非專一的序列之擴增；以及前述的任一者之組合。熟悉此藝者可以設計額外的引子組合和擴增反應來訊問基因體。舉例而言，可以設計一組順向和反向寡核苷酸引子來黏著對於導入的核酸序列的邊界之外的標的專一的核酸序列。

順向和反向寡核苷酸引子可以設計成要專一地黏著一個導入的核酸分子，舉例而言，在對應於其內所包含的有興趣的一個核苷酸序列之內的編碼區域之序列處，或是該核酸分子之其他部分。此等引子可以結合以上說明的引子來使用。寡核苷酸引子可以依據所欲的序列予以合成，以及為商業上可得到的(舉例而言，從Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,IA)。擴增可以接著選殖和定序，或是擴增產物之直接的序列分析。熟悉此藝者可以展望任擇的方法用於PCR基因型分型的整個期間所產生的擴增產物之分析。於一具體例中，對於基因標的專一的寡核苷酸引子係使用於PCR擴增。

本發明的一些具體例亦提供包含一種合成性雙向Ubi1啟動子的細胞，舉例而言，如同可以出現於一核酸建構物內。於特定實例中，依據一些具體例的一種合成性雙向Ubi1啟動子可以利用作為調節序列來調節植物細胞和植物之內的轉基因的表現。於一些此等實例中，一種可操作地連結至有興趣的1個核苷酸序列(舉例而言，1個轉基因)之合成性雙向Ubi1啟動子的使用可以減少調節已知數量的有興趣的核苷酸序列之表現所需要之同源啟動子的數量，及/或降低導入已知數量的有興趣的核苷酸序列所需要的該(等)核酸建構物之尺寸。再者，一種合成性雙向Ubi1啟動子之使用可以允許於相同的條件下共表現有興趣的2個可操作地連結的核苷酸序列(亦即，於啟動子為活性的條件下)。此等實例可以是特別地有用的，舉例而言，在有興趣的2個可操作地連結的核苷酸序列於一種包含有興趣的核苷酸序列之轉基因宿主內各自貢獻一單一的性狀時，以及有興趣的核苷酸序列之共表現有利地衝擊轉基因宿主內之性狀表現時。

於一些具體例中，一種包含一個或更多個合成性雙向Ubi1啟動子及/或有興趣的核苷酸序列之基因轉殖植物可以具有透過表現有興趣的核苷酸序列於植物內而賦予(舉例而言，導入、增強，或是貢獻)之一個或多個所欲的性狀。此等性狀可以包括，舉例而言且不限於：對昆蟲、其他的害蟲，和致病劑(disease causing agents)之抗性；除草劑耐受性；增強的穩定性、產量，或是儲放壽命；環境耐受性；藥學上的生產；工業的產物生產；以及營養增強。於一些實例中，一所欲的性狀可以透過用一種核酸分子來轉形植物而賦予，該核酸分子包含一種可操作地連結至有興趣的1個核苷酸序列之合成性雙向Ubi1啟動子。於一些實例中，一所欲的性狀可以賦予給經由育種而生產為後代植物之植物，該性狀可以透過可操作地連結至一種合成性雙向Ubi1啟動子之有興趣的一個或更多個核苷酸序列而賦予，該有興趣的一個或更多個核苷酸序列係由包含可操作地連結至一種合成性雙向Ubi1啟動子之有興趣的一個核苷酸序列的親代植物而傳遞給植物。

如一些具體例之一種基因轉殖植物可以為能夠用本發明的一種核酸分子予以轉形的任何植物，或是用本發明的一種核酸分子予以轉形的一種植物來培育的任何植物。於是，該植物可以為一種雙子葉植物或是單子葉植物。供使用於一些實例之中的雙子葉植物的非限制性實例包括：苜蓿；豆；青花菜；油菜、甘藍菜；胡蘿蔔；花椰菜；芹菜；山東白菜；棉花；胡瓜；茄子；萵苣；甜瓜；豌豆；胡椒；花生；馬鈴薯；南瓜(pumpkin)；蘿蔔；油菜子；菠菜；大豆；南瓜(squash)；甜菜；葵花；煙草；番茄；以及西瓜。供使用於一些實例之中的單子葉植物之非限制性實例包括有：玉米；洋蔥；米；高梁；小麥；黑麥；粟；甘蔗；燕麥；黑小麥；柳枝稷(switchgrass)；以及草坪草(turfgrass)。

於一些具體例中，一種基因轉殖植物可以以任何方式使用或是栽培，其中存在一種合成性雙向Ubi1啟動子及/或可操作地連結至有興趣的一個核苷酸序列為令人滿意的。於是，此等基因轉殖植物可以藉由用依據本發明的核酸分子來轉形而建造成，尤其，具有一個或多個所欲的性狀，以及可以透過熟悉此藝者已知的任何方法來種植及/ 或栽培。

儘管本發明已經參照特定的方法和具體例來描述，會瞭解到可以執行各種各樣的修飾和變化而不背離本發明。

提供下列實施例以闡明某些特定的特徵及/或具體例。實施例不應被理解為限制舉例說明的特定的特徵或是具體例之揭示。

實施例 實施例1：轉形和表現

根瘤農桿菌之轉形：使pDAB108706二元載體轉形至根瘤農桿菌菌株DAt13192三元(ternary)之內(U.S.Prov.Pat.號碼61/368965)。將細菌菌落單離且將二元質體DNA單離以及經由限制酶消化來確認。

玉米轉形：穗的滅菌(Ear Sterilization)和胚芽單離。為了獲得玉米未成熟的胚芽，玉蜀黍(c.v. B104)植物係於溫室內生長以及自我或是近親授粉(sib-pollinated)來生產穗。在授粉後大概9-12天收穫穗。於實驗那天，穗係藉由浸沒於含有5%次氯酸鈉之20%的家用漂白劑溶液之內來表面滅菌，以及搖動歷時20-30分鐘，接著以無菌水沖洗3次。在滅菌之後，從各個穗無菌切開未成熟的合子胚(1.5-2.2 mm)以及隨意地分配至含有液態感染培養基的微離心管之內(LS基本培養基，4.43 gm/L；N6維生素溶液[1000X]，1.00 mL/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；蔗糖，68.5 gm/L；葡萄糖，36.0 gm/L；2,4-D，1.50 mg/L。關於假定組的實驗，由2-3穗匯集的胚芽係使用於各個處理。

農桿菌培養的起始：含有以上說明的二元載體之農桿菌屬的甘油存料係於含有適當的抗生素之AB最少養分培養基(minimal medium)平盤之上劃線以及在20℃下生長歷時3-4天。挑選單一菌落且劃線至含有相同的抗生素之YEP平盤之上以及在28℃下孵育歷時1-2天。

農桿菌培養和共同培養：於實驗那天，從YEP平盤取得農桿菌菌落，懸浮於50 mL拋棄式管內之10 mL的感染培養基之內，以及使用分光光度計將細胞密度調整至OD600=0.2-0.4 nm。將農桿菌培養物放置於100 rpm的旋轉搖動器之上，室溫，而執行胚芽的剖分。由滅菌的玉米仁來單離尺寸介於1.5-2.2 mm之間的未成熟的合子胚以及放置於1 mL的感染培養基之內且以相同的培養基清洗一次。將農桿菌屬的懸浮液(2 mL)添加至各個管子以及使管子倒轉大約20次繼而搖動歷時10-15分鐘。將胚芽轉移至共同培養基之上(MS鹽，4.33 gm/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；酪蛋白酵素水解產物100.0 mg/L；麥草畏-3.30 mg/L；蔗糖，30.0 gm/L；Gelzan^TM，3.00 gm/L；改良的MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L，AgNo₃，15.0 mg/L；乙醯丁香酮(Acetosyringone)，100 μM)，以子葉盤(scutellum)面向上來定向，以及在25℃於光亮下孵育歷時3-4天。

GUS和YFP/Phiyfp的暫時表現：暫時的YFP/Phiyfp和GUS的表現可以於轉形的胚芽以及在與農桿菌屬共同培養3天之後觀察到。胚芽係於使用YFP濾光鏡和 500 nm光源的立體顯微鏡(Leica Microsystems，Buffalo Grove，IL)下觀察。選擇顯示YFP/Phiyfp的表現之胚芽用於GUS組織化學分析。GUS染色溶液係以如同於Maniatis等人(1989)之內描述方法來製備以及胚芽在37℃下於1 mL溶液內孵育歷時24小時。於顯微鏡下觀察胚芽GUS的暫時表現。

推定事例的癒合組織篩選和再生：在共同培養的期間之後，將胚芽轉移至無選擇劑的休眠培養基(MS鹽，4.33 gm/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；MES[(2-(n-嗎福啉基)-乙磺酸)，游離酸]500.0 mg/L；酪蛋白酵素水解產物100.0 mg/L；麥草畏，3.30 mg/L；蔗糖，30.0 gm/L；Gelzan 2.30 gm/L；改良的MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L，AgNo₃，15.0 mg/L；卡本西林(Carbenicillin)，250.0 mg/L)以及於28℃以50 μmol m^-2s^-1的光強度之光24小時孵育歷時7天。將胚芽轉移至含有100 nM甲基合氯氟之選擇1培養基之上(MS鹽，4.33 gm/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；MES[(2-(n-嗎福啉基)-乙磺酸)，游離酸]500.0 mg/L；酪蛋白酵素水解產物100.0 mg/L；麥草畏，3.30 mg/L；蔗糖，30.0 gm/L；Gelzan^TM 2.30 gm/L；改良的MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L，AgNo₃，15.0 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)以及於28℃以50 μmol m^-2s^-1的光強度之光24小時孵育歷時7天。

將帶有增殖的胚性(embryogenic)癒合組織之胚芽轉移至含有500 nM甲基合氯氟之選擇2培養基之上(MS鹽，4.33 gm/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；MES[(2-(n-嗎福啉基)-乙磺酸)，游離酸]500.0 mg/L；酪蛋白酵素水解產物100.0 mg/L；麥草畏，3.30 mg/L；蔗糖，30.0 gm/L；Gelzan^TM 2.30 gm/L；改良的MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L，AgNo₃，15.0 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)以及於28℃以50 μmol m^-2s^-1的光強度之光24小時孵育歷時另外的14天。此選擇步驟允許轉基因癒合組織進一步增殖和分化。癒合組織篩選期間持續3週。將增殖的胚性癒合組織轉移至含有500 nM甲基合氯氟之再生1培養基之上(MS鹽，4.33 gm/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；L-脯胺酸，350.0 mg/L；MES[(2-(n-嗎福啉基)-乙磺酸)，游離酸]250.0 mg/L；酪蛋白酵素水解產物50.0 mg/L；NAA 0.500 mg/L；ABA 2.50 mg/L；BA 1.00 mg/L；蔗糖，45.0 gm/L；Gelzan^TM 2.50 gm/L；改良的MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；AgNo₃，1.00 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)以及在28℃於50 μmol m^-2s^-1的光強度之24小時的光下培養歷時7天。將帶有莖/芽(shoot/buds)的胚性(Embryogenic)癒合組織轉移至含有500 nM甲基合氯氟之再生2培養基之上(MS鹽，4.33 gm/L；改良的MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；肌-肌醇(myo inositol)，100.0 mg/L；蔗糖，60.0 gm/L；結冷膠(Gellan Gum)G434^TM 3.00 gm/L；卡本西林，250.0 mg/L)。培養物在28℃於50 μmol m^-2s^-1的光強度之24小時的光下孵育歷時7-10天。將帶有初生根的小莖轉移至MAGENTA^TM盒子(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)內之莖伸長和發根培養基之上(MS鹽，4.33 gm/L；改良的MS-維生素 [1000X]，1.00 ml/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；蔗糖，60.0 gm/L；結冷膠G434^TM 3.00 gm/L；卡本西林，250.0 mg/L)，以及在28℃、於16/8小時光亮/黑暗下孵育歷時7天。分析推定的基因轉殖植物之轉基因的複本數目並且轉移至溫室。

實施例2：合成性雙向Ubi1啟動子和pDAB108706載體之建構

一種玉米泛素-1啟動子(Ubi1)之例示性的示意圖係顯示於圖1內。一種Ubi1啟動子係選殖自玉米。一種含有Ubi1啟動子的質體係使用一種高保真度PCR擴增系統來PCR擴增。玉米Ubi1啟動子之大概200nt的區域鑑定為一種玉蜀黍Ubi1最小核心啟動子(minUbi1P)(序列辨識編號：1)。序列辨識編號：1之minUbi1P接而使用本技藝普遍已知的選殖方法來添加至一種包含一玉蜀黍泛素-1外顯子(ZmUbi1外顯子)和玉蜀黍泛素-1內含子(ZmUbi1內含子)之多核苷酸以生產序列辨識編號：3之多核苷酸。生成的多核苷酸接而以反向的排列選殖一種包含玉米Ubi1啟動子(包括Ubi1上游調節序列(URS))；序列辨識編號：4)的核酸之上游以生產序列辨識編號：5之合成性雙向Ubi1啟動子。(舉例而言參見圖5)。

報導基因編碼序列係選殖該合成性雙向Ubi1啟動子的各端之下游。將一種黃螢光蛋白(yfp)編碼序列插入含有minUbi1P、ZmUbi1外顯子，以及ZmUbi1內含子啟動子單元之多核苷酸片段的下游。此外，將一種含有3-框架終止多核苷酸序列和玉米的一致多核苷酸(Kozak)序列的下游前導子序列添加至minUbi1P、ZmUbi1、外顯子以及 ZmUbi1內含子啟動子單元片段。一種uidA(GUS)編碼序列亦相關於yfp序列為反向的排列插入該合成性雙向Ubi1啟動子之下游(序列辨識編號：6；舉例而言參見圖3)。所生成的包含可操作地連結至yfp和GUS基因之合成性雙向Ubi1啟動子之多核苷酸係選殖至質體pDAB105801之內。

一種含有來自質體pDAB105801之GUS和yfp基因表現匣的二元載體係經由GATEWAY^TM L-R CLONASE^TM反應(Invitrogen,Carlsbad,CA)而完成。生成的載體，pDAB108706，含有GUS、yfp，以及aad-1基因表現匣於T股(T strand)區之內(舉例而言參見圖5)。

實施例3：可操作地連結至一種合成性雙向泛素1啟動子的基因之暫時表現

用pDAB108706轉形的玉蜀黍胚芽內之YFP和GUS的暫時表現之代表性實例可以被成像。該雙向ZmUbi1啟動子的兩側都能驅動可操作地連結的yfp和GUS編碼序列之穩健的表現。YFP的表現位準比得上GUS的表現位準。此等觀察確認該雙向ZmUbi1啟動子的兩側均為生物上功能性的。並且，該合成性雙向Ubi1啟動子之minUbi1P單元當與用一種僅含有一種單向ZmUbi1啟動子驅動yfp編碼序列之二元質體(pDAB101556)來轉形的玉蜀黍癒合組織相比時，可以表現相似表現位準的YFP。於未用一種二元建構物來轉形，以及不含有yfp或GUS編碼序列之負對照未成熟的胚芽內未偵測到yfp或GUS的表現。

實施例4：可操作地連結至一種合成性雙向泛素-1啟動子的基因之穩定表現

可以觀察到用pDAB108706二元載體予以穩定轉形的玉蜀黍癒合組織的細胞之影像，該二元載體含有yfp編碼序列。此等細胞係從已經於選擇2培養基上繁殖的玉蜀黍胚芽獲得。該雙向ZmUbi1啟動子能驅動yfp編碼序列之穩健的表現。此等結果確認雙向ZmUbi1啟動子之Min-UbiP1最小啟動子單元能夠於穩定轉形的玉蜀黍癒合組織的細胞內表現一種報導基因。YFP蛋白質的表現位準當與用一種對照二元載體來轉形的玉蜀黍癒合組織內之YFP的表現相比時為相似的，該對照二元載體含有驅動yfp編碼序列之單向ZmUbi1啟動子(pDAB101556)。於未用一種二元建構物來轉形以及不含有yfp或GUS編碼序列之負對照癒合組織內未偵測到YFP或GUS的表現。

實施例5：使用即時TaqMan® PCR估算轉基因的複本數目

玉蜀黍胚芽係用一種含有雙向ZmUbi1啟動子的二元載體，pDAB108706，予以轉形以及其他的植物係用一種對照二元載體，pDAB101556來轉形。於兩組的玉蜀黍植物之基因體內之yfp轉基因的存在係經由水解探針(hydrolysis probe)分析來確認。得到從癒合組織發展的穩定轉形的基因轉殖玉蜀黍小植株以及分析以鑑定含有來自pDAB108706二元載體和pDAB101556對照二元載體之低複本數目(1-2個複本)的全長T股插入子的事例。鑑定的小植株係前移至溫室並生長。

使用Roche Light Cycler480^TM系統來判定轉形以pDAB108706二元載體之事例，和轉形以pDAB101556二元載體之對照事例的轉基因的複本數目。該方法利用一種biplex TaqMan®反應，其使用對yfp基因以及對內源性玉蜀黍參考基因，轉化酶(Genbank存取編號：U16123.1)，為專一的寡核苷酸於單一的分析內。複本數目和接合性係藉由測量yfp-專一的螢光之強度相對於轉化酶-專一的螢光來決定，當與已知的複本數目之標準品相比時。

於用pDAB108706二元載體予以轉形的玉蜀黍內，一種yfp基因專一性DNA片段係用一種含有用FAM螢光染料予以標記的探針之TaqMan®引子/探針組來擴增，以及轉化酶係用一種含有用HEX螢光予以標記的探針之第二個TaqMan®引子/探針組來擴增(表2)。PCR反應混合物係以如同表3內提出的來製備，以及基因專一性DNA片段係依據表4提出的條件來擴增。樣本的複本數目和接合性係藉由測量對報導基因，yfp，專一的螢光相對強度對於參考基因，轉化酶，專一的螢光相對強度來決定，當與已知的複本數目之標準品相比時。

標準品係經由稀釋載體，pDAB108706，至玉蜀黍的B104基因體DNA(gDNA)之內來創造以獲得具已知的pDAB108706：gDNA關係之標準品。舉例而言，製備每一複本的玉蜀黍的B104 gDNA具有一個；二個；以及四個複本的載體DNA的樣本。一個和二個複本稀釋之pDAB108706混合以玉蜀黍的B104 gDNA標準品係對比已知為半合子的對照玉蜀黍事例，和已知為同型合子的對照玉蜀黍事例(玉蜀黍事例278；參見PCT國際專利公開案號碼WO 2011/022469 A2)來確認。執行一種利用對AAD1基因專一的寡核苷酸以及對內源性玉蜀黍的參考基因，轉化酶，專一的寡核苷酸之TaqMan® biplex分析，其係藉由用含有一種用FAM螢光染料予以標記的探針之TaqMan®引子/探針組來擴增且偵測AAD1的基因專一性DNA片段，以及藉由含有一種用探針HEX螢光予以標記的第二個TaqMan®引子/探針組擴增且偵測轉化酶的基因專一性DNA片段(表2)。AAD1 TaqMan®反應混合物係以如同表3內提出的來製備以及專一性片段係依據表4提出的條件來擴增。

各個反應所產生的螢光位準係使用Roche LightCycler 480^TM熱循環器、依據製造商之指示來分析。FAM螢光部分係以465/510 nm的光密度來激發，以及HEX螢光部分係以533/580 nm的光密度來激發。複本數目係藉由比較未知樣本的標的/參考值(由LightCycler 480^TM輸出的)與4個已知複本數目的標準品(零，1-複本(半)，2-複本(相同(homo))和4-複本)之標的/參考值來判定。

經由用一種雙向ZmUbi1啟動子建構物(pDAB108706)之轉形所獲得的基因轉殖植物以及用一種對照的單向ZmUbi1啟動子YFP建構物(pDAB101556)之轉形所獲得的基因轉殖植物之轉基因的複本數目分析之結果係顯示於表5內。僅僅將帶有1-2個複本之yfp轉基因的植物轉移至溫室用於進一步的表現分析。

實施例6：可操作地連結至一種合成性雙向泛素1啟動子的基因之全株植物穩定表現.

含有低複本的T-DNA數目之二元質體pDAB108706的全株植物，以及含有低的複本數目之對照二元質體pDAB101556的植物，係於溫室內生長。從用pDAB108706予以轉形的玉蜀黍胚芽所獲得的基因轉殖T0 玉米植物之葉和根組織內穩定表現YFP的代表性實例予以分析。該雙向ZmUbi1啟動子能驅動yfp編碼序列於樹葉組織和根部組織二者內之穩健的表現。顯微鏡術分析亦確認該雙向ZmUbi1啟動子內之Min-UbiP1最小啟動子單元能驅動對照二元質體(pDAB101556)，其含有一種驅動yfp編碼序列的表現之單向ZmUbi1啟動子。此等對照植物亦於葉組織和根組織內顯示出穩定的YFP表現。

實施例7：可操作地連結至一種合成性雙向泛素1啟動子的基因之西方墨點分析

總可溶性蛋白質：轉形的T₀玉米植物係於V6發育的階段取樣。從最幼小展開的葉子取樣總共4個葉子孔(punches)至基質管(matrix tube)中以及放置至基質盒之內。將V6發育的階段之二個未轉形的B104玉米植物之4個葉子孔取樣至基質管之內作為負對照。將一鋼珠放置至基質管之內和樣本一起，以及接而添加400 μL PBST至各個管子。將管子加蓋，以及於Kleco^TM組織磨碎器內以1500 rpm、經由珠攪打(bead beating)來萃取蛋白質歷時5分鐘。碎片係經由離心而製成丸狀。

將來自各個管子之5 μL樣本用PBST於96井微滴定平盤內稀釋至25 μL。使用一種BCA蛋白質分析套組(Thermo Scientific Pierce,Rockford,IL)、依據製造商之指示來分析此等樣本的總可溶性蛋白質。套組內所提供之牛血清白蛋白(BSA)的標準品以二重複來分析，以及使用數值的平均來產生一標準曲線，其隨後使用來計算各個樣本的總可溶性蛋白質。各個樣本的總可溶性蛋白質接而正規化至mg/μL。

YFP/Phiyfp的西方墨點分析：每5 μL萃取的蛋白質樣本用5 μL 2x Laemmli緩衝液+2-β-巰基乙醇來稀釋於96井微滴定平盤內。配於HEPES緩衝液(50 mM HEPES，200 mM KCl，10%甘油)內之純化的YFP/Phiyfp的對照樣本係由Axxora(San Diego,CA)購買。樣本係藉由於相同的平盤內、與Laemmli緩衝液之1：1稀釋來製備以生產下列濃度的標準曲線：0.5 ng/μL，0.25 ng/μL，以及0.125 ng/μL。於一熱循環器內以95℃加熱樣本歷時30分鐘，以及接而冷卻至4℃。接而使用MES/SDS緩衝液來組合一種Bio Rad Criterion gel^TM。允許樣本加熱至室溫，以及將10 μL的樣本裝載至二個凝膠的各井之內。此外，將標準曲線使用之純化的YFP/Phiyfp樣本，以及蛋白質階梯標記裝載至凝膠的井內。凝膠以150 V和150 mA電泳操作歷時90 min。在操作之後，打開凝膠外殼以及使用iBlot System^TM(Invitrogen)將蛋白質轉移至硝化纖維素膜。蛋白質透過運行20 V的電流歷時10分鐘而從凝膠轉移至膜。移去硝化纖維素膜以及放置於StartingBlock T20^TM封阻緩衝液內於4℃過夜。接而丟棄封阻緩衝液，以及使用於表6內提出的協定來加工膜。

抗體結合係使用Amersham ECL^TM加上化學發光偵測的系統、遵循製造商之指示來偵測。軟片曝光10分鐘和30分鐘。10分鐘曝光的軟片使用來定量蛋白質，以及30分鐘曝光過度的軟片使用來確認蛋白質不存在於B104和其他的對照樣本內。用膠布把膜黏貼至曝光的軟片背面，以及經由像素密度的分析來定量蛋白質。純化的蛋白質標準品之像素密度先使用來產生一標準曲線，該標準曲線用來定量樣本內的蛋白質。雖然膜即使於純化的標準品內還是顯示出PhiYFP單體和二聚體的帶，但是只有使用PhiYFP單體來定量蛋白質的表現。接而正規化蛋白質的數值至ng/μL。計算正規化的總可溶性蛋白質(TSP)對PhiYFP之比率為ng YFP/mg TSP的單位，或是任擇地，百萬分之一(ppm)。

GUS西方墨點分析：GUS蛋白質的表現以相似於PhiYFP的方式來定量，加上下列例外：10 μL萃取物的樣本用2x Laemmli+2-β-巰基乙醇以1：1稀釋，於95℃變性歷時30分鐘，以及接而將15 μL裝載至凝膠之內。加工的膜與軟片(1分鐘曝光)係用膜覆蓋用於像素密度的分析。

從用二元載體，pDAB108706，予以轉形的玉蜀黍胚芽所獲得的12個基因轉殖T₀玉米植物之西方墨點分析之結果顯示於圖11內。雙向ZmUbi1啟動子顯現來自樹葉組織之yfp和GUS編碼序列之穩健的表現。此等觀察確認雙向ZmUbi1啟動子之Min-UbiP1最小啟動子單元當與用一種含有驅動yfp編碼序列的單向ZmUbi1啟動子之二元質體(pDAB101556；參見圖12)來轉形的玉蜀黍癒合組織相比時，表現相似表現位準之YFP。

實施例8：4種基因匣的堆疊之建構物

一種質體pDAB105803建構物使用為起始質體以產生由一單一的玉蜀黍泛素-1雙向啟動子所驅動之4種基因匣的堆疊(aad1-2a-Phiyfp和cry34-2a-cry35)。質體pDAB105803的代表圖係顯示於圖16內，其含有一種玉蜀黍泛素-1雙向啟動子。

使用本技藝普遍已知的選殖方法將由質體pDAB105841衍生的aad1-2a-Phiyfp片段選殖至質體pDAB105803之BamHI和SacI切割載體主幹(cut vector backbone)內。此導致中間質體pDAB105842(圖17)。將由質體pDAB105840獲得之NotI/XbaI消化的cry34(8V6)-2a-cry35片段選殖至質體pDAB105842的NotI/SpeI位址之間以建構質體pDAB105843。質體pDAB105843含有cry34(8V6)-2a-cry35以及aad1-2a-Phiyfp基因匣於該ZmUbi1雙向啟動子的各側上(圖18)。

一種含有ZmUbi1雙向啟動子，以及來自質體pDAB105842之基因表現匣cry34(8V6)-2a-cry35和 Phiyfp-2a-aad1的二元載體係經由GATEWAY L-R CLONASE反應(Invitrogen，Carlsbad，CA)而產生於目的地(destination)質體pDAB101917。生成的載體，pDAB108717，含有cry34(8V6)-2a-cry35、aad1-2a-Phiyfp，以及PAT基因表現匣於T-DNA邊界之內(圖19)。

實施例9：第二種4種基因匣的堆疊之建構物

一質體pDAB105803建構物使用來產生由單一玉蜀黍泛素-1雙向啟動子所驅動的第二種4種基因匣的堆疊(Phiyfp-2a-aad1和cry34-2a-cry35)。使用本技藝普遍已知的選殖方法將由質體pDAB105844衍生的Phiyfp-2a-aad1片段選殖至質體pDAB105803之BamHI和SacI切割載體主幹內。此導致中間質體pDAB105845(圖20)。將由質體pDAB105840獲得之NotI/XbaI消化的cry34(8V6)-2a-cry35片段選殖至質體pDAB105845的NotI/SpeI位址之間以建構質體pDAB105846(圖21)。質體pDAB105846含有cry34(8V6)-2a-cry35和Phiyfp-2a-aad1基因匣於該ZmUbi1雙向啟動子的各側上。

一種含有ZmUbi1雙向啟動子，以及來自質體pDAB105846之基因匣cry34(8V6)-2a-cry35和Phiyfp-2a-aad1的二元載體由係經由GATEWAY L-R CLONASE反應(Invitrogen，Carlsbad，CA)而產生於目的地質體pDAB101917。生成的載體，pDAB108718，含有cry34(8V6)-2a-cry35、Phiyfp-2a-aad1，以及PAT基因表現匣於T-DNA邊界之內(圖21)。

實施例10：根瘤農桿菌菌株DAt13192之轉形

pDAB108717和pDAB108718二元載體係轉形至根瘤農桿菌三元菌株DAt13192之內(參見U.S.Prov.Pat.App.號碼61/368965)。將細菌菌落單離以及萃取二元質體DNA且經由限制酶消化來證實。

實施例11：轉形至玉米內

穗的滅菌和胚芽單離：為了獲得玉米未成熟的胚芽，玉蜀黍(c.v.B104)植物係於溫室內生長以及自我或是近親授粉來生產穗。在授粉後大概9-12天收穫穗。於實驗那天，穗係藉由浸沒於含有5%次氯酸鈉之20%的家用漂白劑溶液之內來表面滅菌，以及搖動歷時20-30分鐘，接著以無菌水沖洗3次。於實驗那天，穗係藉由浸沒於含有5%次氯酸鈉之20%的家用漂白劑溶液之內來表面滅菌，以及搖動歷時20-30分鐘，接著以無菌水沖洗3次。在滅菌之後，從各個穗無菌切開未成熟的合子胚(1.5-2.2 mm)以及隨意地分配至含有液態感染培養基的微離心管之內(LS基本培養基，4.43 g/L；N6維生素溶液[1000X]，1.00 mL/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；蔗糖，68.5 g/L；葡萄糖，36.0 g/L；2,4-D，1.50 mg/L。關於假定組的實驗，由2-3穗匯集的胚芽係使用於各個處理。

農桿菌培養的起始：含有以上說明的二元載體之農桿菌屬菌株的甘油存料係於含有適當的抗生素之AB最少養分培養基平盤之上劃線以及在20℃下生長歷時3-4天。挑選單一菌落且劃線至含有相同的抗生素之YEP平盤之上以及在28℃下孵育歷時1-2天。

農桿菌培養和共同培養：於實驗那天，從YEP平盤取得農桿菌菌落，懸浮於50 mL拋棄式管內之10 mL的感染培養基之內，以及使用分光光度計將細胞密度調整至OD₆₀₀=0.2-0.4 nm。將農桿菌培養物放置於115 rpm的旋轉搖動器之上，室溫，而執行胚芽的剖分。由滅菌的玉米仁來單離尺寸介於1.5-2.2 mm之間的未成熟的合子胚以及放置於1 mL的感染培養基之內且以相同的培養基清洗一次。將農桿菌屬的懸浮液(2 mL)添加至各個管子以及使管子倒轉大約20次繼而搖動歷時10-15分鐘。將胚芽轉移至共同培養基之上(MS鹽，4.33 g/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；酪蛋白酵素水解產物100.0 mg/L；麥草畏3.30 mg/L；蔗糖，30.0 g/L；Gelzan^TM，3.00 g/L；改良的MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L，AgNo₃，15.0 mg/L；乙醯丁香酮，100.0 μM)，以子葉盤(scutellum)面向上來定向，以及在25℃於光亮下孵育歷時3-4天。

YFP/Phiyfp的暫時表現：暫時的YFP/Phiyfp的表現可以於轉形的胚芽以及在與農桿菌屬共同培養3天之後觀察到。胚芽係於使用YFP濾光鏡和500 nm光源的立體顯微鏡(Leica Microsystems，Buffalo Grove，IL)下觀察。

推定事例的癒合組織篩選和再生：在共同培養的期間之後，將胚芽轉移至無選擇劑的休眠培養基(MS鹽，4.33 g/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；MES[(2-(n-嗎福啉基)-乙磺酸)，游離酸]，500.0 mg/L；酪蛋白酵素水解產物，100.0 mg/L；麥草畏，3.30 mg/L；蔗糖，30.0 g/L；Gelzan^TM，2.30 g/L；改良的MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L，AgNo₃，15.0 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)以及於28℃以50 μmol m^-2s^-1的光強度之光24小時孵育歷時7天。將胚芽轉移至含3 mg/L的双丙氨磷之選擇1培養基之上(MS鹽，4.33 g/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；MES[(2-(n-嗎福啉基)-乙磺酸)，游離酸]，500.0 mg/L；酪蛋白酵素水解產物，100.0 mg/L；麥草畏，3.30 mg/L；蔗糖，30.0 g/L；Gelzan^TM，2.30 g/L；改良的MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L，AgNo₃，15.0 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)，以及在28℃於50 μmol m^-2s^-1的光強度之24小時的光下孵育歷時7天。

將帶有增殖的胚性癒合組織之胚芽轉移至含5 mg/L的双丙氨磷之選擇2培養基之上(MS鹽，4.33 g/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；MES[(2-(n-嗎福啉基)-乙磺酸)，游離酸]，500.0 mg/L；酪蛋白酵素水解產物，100.0 mg/L；麥草畏，3.30 mg/L；蔗糖，30.0 g/L；Gelzan^TM 2.30 g/L；改良的MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L，AgNo₃，15.0 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)，以及於28℃以50 μmol m^-2s^-1的光強度之光24小時孵育歷時另外的14天。此選擇步驟允許轉基因癒合組織進一步增殖和分化。癒合組織篩選期間可以持續3週。將增殖的胚性(embryogenic)癒合組織轉移至含3 mg/L的双丙氨磷之再生1培養基之上(MS鹽，4.33 g/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；L- 脯胺酸，350.0 mg/L；MES[(2-(n-嗎福啉基)-乙磺酸)，游離酸]，250.0 mg/L；酪蛋白酵素水解產物，50.0 mg/L；NAA,0.500 mg/L；ABA，2.50 mg/L；BA，1.00 mg/L；蔗糖，45.0 g/L；Gelzan^TM 2.50 g/L；改良的MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；AgNo₃，1.00 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)以及在28℃於50 μmol m^-2s^-1的光強度之24小時的光之下培養歷時7天。

將帶有莖/芽的胚性癒合組織轉移至含3 mg/L的双丙氨磷之再生2培養基之上(MS鹽，4.33 g/L；改良的MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；蔗糖，60.0 g/L；結冷膠G434^TM，3.00 g/L；卡本西林，250.0 mg/L)。培養物在28℃於50 μmol m^-2s^-1的光強度之24小時的光下孵育歷時7-10天。將帶有初生根的小莖轉移至莖伸長和發根培養基之上(MS鹽，4.33 g/L；N6維生素溶液[1000X]，1.00 mL/L；肌-肌醇，100.0 mg/L；蔗糖，30.0 g/L；瓊脂5.50 g/L；於phytatray內以及在28℃下以90 μmol m^-2s^-1、於16/8小時光亮/黑暗下孵育歷時7天。選擇健康的推定基因轉殖小植株接而接而在25℃下以200 μmol m^-2s^-1、於16/8小時光亮/黑暗下孵育歷時另外的2-5天以及分析轉基因的複本數目並轉移至溫室。

實施例12：暫時的Phiyfp表現

來自用pDAB108717予以轉形的玉蜀黍胚芽之Phiyfp的暫時表現係被執行。雙向ZmUbi1啟動子可以表現來自aad1-2a-Phiyfp基因表現匣之Phiyfp，無轉形的胚芽不會顯示出任何的Phiyfp螢光。相似位準的Phiyfp表現可以由用一種二元質體pDAB105748(圖15)來轉形的玉蜀黍胚芽觀察到，pDAB105748含有一種驅動單一的Phiyfp編碼序列之單向玉蜀黍(Zm)Ubi1啟動子，該Phiyfp編碼序列顯示預期位準的YFP/Phiyfp表現。Phiyfp的暫時表現可以由用pDAB108718予以轉形的玉蜀黍胚芽觀察到，於pDAB108718內雙向Zm-Ubi1啟動子可以由Phiyfp-2a-aad1基因表現匣表現Phiyfp。

實施例13：於穩定轉形的玉米內之Phiyfp的表現

於雙向Zm Ubi1啟動子所驅動的穩定轉形的玉蜀黍癒合組織內之Phiyfp的表現：用含有aad1-2a-Phiyfp基因表現匣的pDAB108717二元載體來轉形之經轉形的玉蜀黍胚芽顯示出良好的Phiyfp表現。該雙向Zm Ubi1啟動子能驅動Phiyfp穩健的表現。此等結果確認雙向Zm Ubi1啟動子之Min UbiP1最小啟動子單元能夠表現報導基因，舉例而言Phiyfp或YFP。Phiyfp蛋白質的表現位準當與用一種對照二元載體來轉形的玉蜀黍癒合組織相比時為相似的，該對照二元載體含有驅動Phiyfp編碼序列之單向Zm Ubi1啟動子(pDAB105748)。於未用一種二元建構物來轉形以及不含有Phiyfp編碼序列之負對照癒合組織內並未偵測到Phiyfp的表現。

用含有Phiyfp-2a-aad1基因表現匣的pDAB108718二元載體來轉形之玉蜀黍胚芽顯示出良好的Phiyfp表現。該雙向Zm Ubi1啟動子能驅動Phiyfp穩健的表現。此等結果確認雙向Zm Ubi1啟動子之Min-UbiP1最小啟動子單元能夠表現報導基因，舉例而言Phiyfp或YFP。

實施例14：轉基因的複本數目之估算

使用即時TaqMan^TM PCR之轉基因的複本數目之估算：玉蜀黍植物係用含有雙向Zm Ubi1啟動子的二元載體，pDAB108717和pDAB108718來轉形，以及其他的植物係用一種對照二元載體，pDAB105748來轉形。編碼序列(Phiyfp、aad1、cry34、cry35、Pat)存在於pDAB108717和pDAB108718基因轉殖之玉蜀黍植物基因體之內係經由TaqMan水解探針分析來確認。基因轉殖對照載體pDAB105748之植物係分析Phiyfp序列的存在。得到從癒合組織發展的穩定轉形的基因轉殖玉蜀黍小植株以及分析以鑑定含有來自pDAB108717和pDAB108718二元載體，以及pDAB105748對照二元載體之低複本數目(1-2個複本)之全長T-股插入子的事例。確認的小植株係前移至溫室以及生長。

使用Roche Light Cycler480^TM系統來判定pDAB108717與pDAB108718二元載體轉形之事例的轉基因的複本數目。該方法利用一種biplex TaqMan®反應，其使用對該編碼序列以及對內源性玉蜀黍參考基因，轉化酶(Genbank存取編號：U16123.1)，為專一的寡核苷酸於單一的分析內。複本數目和接合性係藉由測量編碼序列-專一的螢光之強度相對於轉化酶-專一的螢光來決定，當與已知的複本數目之標準品相比時。

關於用pDAB108717和pDAB108718二元載體予以轉形的玉蜀黍樣本，一編碼序列專一性的DNA片段係用一種含有用FAM螢光染料標記的探針之TaqMan®引子/探針組來擴增，以及轉化酶係用一種含有用HEX螢光標記的探針之第二個TaqMam®引子/探針組來擴增(表7)。PCR反應混合物係以如同表8內提出的來製備，以及基因專一性DNA 片段係依據表9提出的條件來擴增。樣本的複本數目和接合性係藉由測量對編碼序列專一的螢光相對強度對於參考基因，轉化酶，專一的螢光相對強度來決定，當與已知的複本數目之標準品相比時。

標準品係經由稀釋載體(pDAB108717和pDAB108718)至玉蜀黍的B104基因體DNA(gDNA)之內來創造以獲得具已知的載體：gDNA關係之標準品。舉例而言，製備每一複本的玉蜀黍的B104 gDNA具有一個；二個；以及四個複本的載體DNA的樣本。一個和二個複本稀釋的載體混合以玉蜀黍B104 gDNA標準品係對比已知為半合子的對照玉蜀黍事例，和已知為同型合子的對照玉蜀黍事例(玉蜀黍事例278；參見PCT國際專利公開案號碼WO 2011/022469 A2)來確認。執行一種利用對該編碼序列基因專一的寡核苷酸以及對內源性玉蜀黍的參考基因，轉化酶，專一的寡核苷酸之T TaqMan® biplex分析，其係藉由用含有一種用FAM螢光染料予以標記的探針之TaqMan®引子/探針組來擴增且偵測編碼序列之基因專一性DNA片段，以及藉由含有一種用探針HEX螢光予以標記的第二個TaqMan®引子/探針組擴增且偵測轉化酶的基因專一性DNA片段。依據表7，該編碼序列TaqMan®反應混合物係以如同表8內提出的來製備以及專一性片段係依據表9提出的條件來擴增。

各個反應所產生的螢光位準係使用Roche LightCycler 480^TM熱循環器、依據製造商之指示來分析。FAM螢光部分係以465/510 nm的光密度來激發，以及HEX螢光部分係以533/580 nm的光密度來激發。複本數目可以藉由比較未知樣本的標的/參考值(由LightCycler 480^TM輸出的)與4個已知複本數目的標準品(舉例而言，零，1-複本(半)，2-複本(相同(homo))和4-複本)之標的/參考值來判定。

經由用雙向ZmUbi1啟動子建構物(pDAB108717和pDAB108718)之轉形所獲得的基因轉殖植物以及經由用一種對照的單向ZmUbi1啟動子Phiyfp建構物(pDAB105748)之轉形所獲得的基因轉殖植物之轉基因的複本數目分析之結果係顯示於表10內。僅僅將帶有1-2個複本之全部轉基因的植物轉移至溫室用於進一步的表現分析。

實施例15：玉米T0植物內穩定的Phiyfp表現

經由雙向Zm Ubi1啟動子所驅動的玉蜀黍T₀植物之穩定的Phiyfp表現：用含有aad1-2a-Phiyfp基因表現匣的pDAB108717二元載體予以轉形的玉蜀黍胚芽能觀察到。該雙向Zm Ubi1啟動子能於莖和根組織二者內驅動Phiyfp穩健的表現。該結果確認雙向Zm Ubi1啟動子之Min-UbiP1最小啟動子單元能夠表現報導基因，舉例而言Phiyfp或YFP，其係使用2A序列而雙順反地(bicistronically)與aad1融合。Phiyfp蛋白質的表現位準相似於用一種對照二元載體來轉形的玉蜀黍胚芽，對照二元載體含有驅動Phiyfp編碼序列的單向Zm Ubi1啟動子(pDAB105748)。於未用一種二元建構物來轉形以及不含有Phiyfp編碼序列之負對照植物內未偵測到Phiyfp的表現。

Phiyfp的表現於基因轉殖pDAB108718二元載體之玉蜀黍T0植物的葉和根組織內能觀察到，pDAB108718二元載體含有Phiyfp-2a-aad1基因表現匣。雙向Zm Ubi1啟動子能驅動Phiyfp穩健的表現。該結果確認雙向Zm Ubi1啟動子之Min-UbiP1最小啟動子單元能夠表現以2A序列而融合至aad1的報導基因，舉例而言Phiyfp或YFP。

實施例16：Cry34、Cry35，以及AAD1蛋白質分析

將植物取樣至1.5mL圓錐管內之基質盒子的管柱1-10之內，添加1個鋼珠接著PBST+0.5% BSA(0.6mL)至其內。盒子接而於Geno研磨機內以1500 rpm鋼珠攪打用於樣本的磨碎歷時5分鐘繼而於4℃以3700 rpm離心歷時7分鐘。

Cry34/35 ELISA分析：於一種分離的、96深井平盤內，萃取物的樣本稀釋1：200於PBST+1% blotto內。2次量的25 μL稀釋樣本接而轉移已經配置抗Cry34和抗Cry35(Meso Scale Discovery)之分離的96井平盤。在各個平盤的11和12管柱，添加配於PBST+1% blotto內之標準濃度的Cry34和Cry35(25 μL)。繼而孵育平盤同時於室溫搖動歷時1小時。接而以PBST(3x300 μL)清洗平盤。接著25 μL SulfoTAG接合抗Cry34和抗Cry35的溶液添加至各井以及伴隨於室溫搖動孵育歷時1小時。接而以PBST(3x300 μL)清洗平盤。接著添加150 μL體積的讀取緩衝液(Read Buffer)T(Meso Scale Discovery)以及立即於SECTOR® 6000讀數器上讀取平盤。樣本內蛋白質的濃度可以使用由同樣的平盤之各別的蛋白質產生的標準曲線來計算。

AAD-1 ELISA分析：於一種分離的、96深井平盤內，萃取物的樣本1：20稀釋於PBST+0.5% BSA內。接而將2次量的200 μL稀釋的樣本轉移至已經塗覆抗AAD1(由Acadia Bioscience LLC提供)之分離的96井平盤。在各個平盤的11和12管柱，添加配於PBST+0.5% BSA內之標準濃度的AAD1(200 μL)。接而添加50 μL體積的生物素化的抗AAD1至各井以及令平盤孵育同時於室溫搖動歷時1小時。接而以PBST(5x300 μL)清洗平盤。繼而將100 μL的鏈黴菌鹼性磷酸(steptavidin-alkaline phosphate)接合溶液添加至各井以及伴隨於室溫搖動孵育歷時30分鐘。接而以PBST(5x300 μL)清洗平盤。接而添加100 μL體積的受質(對硝苯磷酸，PNPP)以及伴隨於室溫搖動孵育歷時45分鐘。接而在SpectraMax M5平盤讀數器(Molecular Devices)上於A405讀取平盤。樣本內蛋白質的濃度可以使用由同樣的平盤產生的標準曲線來計算。

實施例17：玉米(Maize)T0植物之蛋白質分析

由雙向玉蜀黍泛素1啟動子建構物(pDAB108717)所驅動的玉米T0植物之蛋白質分析：從用pDAB108717予以轉形的玉蜀黍胚芽所獲得的11個基因轉殖T0玉米植物之ELISA典型分析係總結於表11內，pDAB108717含有cry34-2a-cry35和aad1-2a-Phiyfp。雙向Zm Ubi1啟動子顯現出Cry34和Cry35編碼序列二者於樹葉內之穩健的表現。出人意外地，蛋白質資料顯示來自雙向建構物pDAB108717 的Cry34與單向Zm Ubi1驅動的建構物相比為高達4倍更高的表現。亦意外地觀察到來自雙向建構物pDAB108717與單向Zm Ubi1驅動的建構物相比，Cry35和AAD1蛋白質為相似的8-10倍更高的表現。此等觀察顯示出建構物pDAB108717內單一的Zm泛素1雙向啟動子可以以出人意外地更高的位準來表現多重基因(舉例而言，Cry34、Cry35，以及AAD1)，當與轉形以二元質體的玉蜀黍植物相比時，該二元質體含有驅動同樣的基因之單向Zm Ubi1啟動子，各個編碼序列係由一個獨立的Zm Ubi1啟動子所驅動。

由雙向玉蜀黍泛素1啟動子建構物(pDAB108717)所驅動的玉米T0植物之Cry34和Cry35表現相關性：從轉形以含有cry34-2a-cry35之pDAB108717的玉蜀黍胚芽所獲得的11個基因轉殖T0玉米植物，介於Cry34和Cry35蛋白質之間的相關性分析係顯示於第23A圖內。非常高的相關性(R平方=0.98)展現出介於Cry34和Cry 35之間由來自雙向Zm Ubi1啟動子所驅動的cry34-2a-cry35基因表現匣之強的表現共同調節。

由雙向玉蜀黍泛素1啟動子建構物(pDAB108718)所驅動的玉米T0植物之蛋白質分析：從轉形以pDAB108718的玉蜀黍胚芽所獲得的11個基因轉殖T0玉米植物之典型ELISA分析係總結於表12內，pDAB108718含有cry34-2a-cry35。雙向ZmUbi1啟動子於樹葉內顯現出Cry34和Cry35編碼序列二者穩健的表現。蛋白質資料顯示當與單向Zm Ubi1驅動的建構物相比，來自雙向建構物pDAB108718之Cry34、Cry35和AAD1蛋白質數倍更高的表現。此等觀察確認建構物pDAB108718內玉蜀黍泛素1雙向啟動子以出人意外地更高的位準來表現多重基因(舉例而言，Cry34、Cry35，以及AAD1)，當與轉形以二元質體的玉蜀黍植物相比時，該二元質體含有驅動同樣的基因之單向Zm Ubi1啟動子，各個編碼序列係由一個獨立的Zm Ubi1啟動子所驅動。

由雙向玉蜀黍泛素1啟動子建構物(pDAB108718)所驅動的玉米T0植物之Cry34和Cry35表現相關性：從轉形以含有cry34-2a-cry35之pDAB108718的玉蜀黍胚芽所獲得的11個基因轉殖T0玉米植物，介於Cry34和Cry35蛋白質之間的相關性分析係顯示於第23B圖內。非常高的相關性(R平方=0.98)展現出介於Cry34和Cry 35之間由來自雙向Zm Ubi1啟動子所驅動的cry34-2a-cry35基因表現匣之強的表現共同調節。

實施例18：轉基因堆疊：合成性雙向啟動子(T1資料)

由該雙向玉蜀黍泛素1啟動子的建構物所驅動的T1植物之基因表現：每建構物選擇10至12個單一複本事例來分析，除了對照建構物pDAB108716只有1個事例之外。測試V6階段的5個植物/事例以及測試V10 12及/R3階段的3個植物/事例。使用LCMS或ELISA來執行蛋白質分析。

此實施例內使用的建構物係顯示於圖26。pDAB108706(ZMUbi雙向(-200))和pDAB108707(ZMUbi雙向(-90))為具有本發明代表性的雙向啟動子之建構物；pDAB101556(ZmUbi1-YFP對照)和pDAB108716(ZMUbi1沒有最小啟動子)作為帶有單向啟動子的對照建構物。

圖27A表明來自4個建構物關於YFP蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之例示性表現結果(V6)，以及圖27B表明來自4個建構物關於YFP RNA之例示性相對表現結果(V6)。

圖28A表明來自4個建構物關於GUS蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之例示性表現結果(V6)，以及圖28B表明來自4個建構物關於GUS RNA之例示性相對表現結果(V6)。

圖29A表明來自4個建構物關於AAD1蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之例示性表現結果(V6)，以及圖29B表明來自4個建構物關於AAD1 RNA之例示性相對表現結果(V6)。

圖30A表明來自4個建構物關於YFP蛋白質 (LCMS)以ng/cm2計之表現結果(V6)之統計分析，以及pDAB108707、pDAB108706、pDAB101556，和pDAB108716之平均值分別為57.63、52.66、49.75，和0。圖30B顯示來自4個建構物關於YFP RNA之相對表現結果(V6)之統計分析，以及pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716之平均值分別為9.96、8.07、6.95，和1.01。

圖31A顯示來自4個建構物關於GUS蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之表現結果(V6)之統計分析，以及pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716之平均值分別為151.27、143.22、0，和213.17。圖31B顯示來自4個建構物關於GUS RNA之相對表現結果(V6)之統計分析，以及pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716之平均值分別為0.65、0.78、0，和3.03。

圖32A顯示來自4個建構物關於AAD1蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之表現結果(V6)之統計分析，以及pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716之平均值分別為710.88、1417.01、856.58，和1795.43。圖32B顯示來自4個建構物關於AAD1 RNA之相對表現結果(V6)之統計分析，以及pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716之平均值分別為1.33、1.37、1.93，和2.93。

圖33A、33B，和33C各別顯示來自4個建構物關於YFP、AAD1，和GUS蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之例示性表現結果(V10)。

圖34A、34B，和34C各別顯示來自4個建構物關於YFP、GUS，和AAD1蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之表現結果(V10)之統計分析。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716關於YFP(圖34A)之平均值分別為71.77、81.81、49.58，和23.01。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716關於GUS(圖34B)之平均值分別為109.63、98.25、0，和138.02。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716關於AAD1(圖34C)之平均值分別為666.11、597.80、715.12，和1002.84。

圖35A、35B，和35C各別顯示來自4個建構物關於YFP、GUS，和AAD1蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之例示性表現結果(R3)。

圖36A、36B，和36C各別顯示來自4個建構物關於YFP、GUS，和AAD1蛋白質(LCMS)以ng/cm2計之表現結果(R3)之統計分析。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716關於YFP(圖36A)之平均值分別為91.38、49.49、21.67，和0.40。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716關於GUS(圖36B)之平均值分別為5.52、16.81、1.07，和46.60。pDAB108706、pDAB108707、pDAB101556，和pDAB108716關於AAD1(圖36C)之平均值分別為156.71、153.44、165.40，和197.80。

結果顯示出本發明的玉米Ubi1雙向啟動子能驅動GUS和YFP穩健的表現，來自玉米Ubi1雙向啟動子之YFP的表現相似於單向玉米Ubi1驅動的YFP。結果亦暗示雙向轉錄對於GUS的表現沒有顯著的作用(GUS的表現與缺少最小啟動子的建構物無YFP表現相比)。

實施例19：雙向啟動子和2A雙順反子序列之組合以驅動來自一單一啟動子之4個轉基因(T1資料)

由該雙向玉蜀黍泛素1啟動子建構物所驅動的T1植物之基因表現：每建構物選擇10至12個單一複本事例來分析，除了對照建構物每建構物有4或5個事例之外。測試V6階段的5個植物/事例以及測試V10 12及/R3階段的3個植物/事例。使用LCMS或ELISA來執行蛋白質分析。

圖37A顯示來自4個建構物pDAB105748(ZMUbi1-YFP)、pDAB105818(ZMUbi1-Cry34/ZMUbi1-Cry35/ZMUbi1-AAD1)、pDAB108717(YFP/AAD-1-ZMUbi1雙向-Cry34-Cry35)，和pDAB108718(AAD1/YFP-ZMUbi1雙向-Cry34-Cry35)之Cry34 RNA的例示性相對表現結果(V6)。圖37B顯示來自相同的4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之Cry34蛋白質(LCMS)的例示性相對表現結果(V6)。

圖42A顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之Cry34 RNA的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值0、2.42、2.67，和2.25。圖42B顯示來自相同的4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之Cry34蛋白質的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值0、596.94、2044.73，和719.18。

圖43A顯示來自4個建構物pDAB105748、 pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之AAD1 RNA的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值0、1.98、2.68，和2.03。圖43B顯示來自相同的4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之AAD1蛋白質的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值0、2237.54、5763.88，和2379.15。

圖45A顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之Cry35 RNA的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值0、1.12、3.74，和3.20。圖45B顯示來自相同的4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之Cry35蛋白質的表現結果(V6)之統計分析以及各別之平均值0、283.54、635.83，和90.97。

圖47A、47B、47C，和47D分別顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之YFP、AAD1、Cry34，和Cry35的例示性蛋白質表現結果(V10)。

圖48A、48B、48C，和48D分別顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之YFP、AAD1、Cry34，和Cry35的蛋白質表現結果(V10)之統計分析。

圖49A、49B、49C，和49D分別顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之YFP、AAD1、Cry34，和Cry35的例示性蛋白質表現結果(R3)。

圖50A、50B、50C，和50D分別顯示來自4個建構物pDAB105748、pDAB105818、pDAB108717，和pDAB108718之YFP、AAD1、Cry34，和Cry35的蛋白質表現結果(R3)之統計分析。

圖51顯示來自pDAB108718和pDAB108717之Cry34、Cry35、和AAD1的蛋白質表現之西方墨點的例示性結果。

結果顯示出單一啟動子-驅動的建構物內之全部4個轉基因係為功能性的伴隨良好的表現位準。Ubi1雙向的堆疊內之3個基因(Cry34/Cry35/AAD1)顯現如同相似於單一的Ubi1-驅動的基因堆疊(DExT)所提供的表現位準之穩健的表現位準。

儘管以上已經討論一些例示性的態樣和具體例，熟悉此藝者會承認其之某些修飾、對準、加入以及次組合。因而下列附隨的申請專利範圍和此後導入的申請專利範圍意欲解釋成包括全部的此等修飾、對準、加入以及次組合如同於其等真實的精神和範疇之內。

<110> 陶氏農業科學公司

<120> 合成性雙向植物啟動子UBI1的建構物及方法

<130> 2971-P10695.1US

<160> 51

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 215

<212> DNA

<213> 玉蜀黍

<400> 1

<210> 2

<211> 1102

<212> DNA

<213> 玉蜀黍

<400> 2

<210> 3

<211> 1319

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多核苷酸的反向互補物，其包含玉蜀黍minUbi1P最小核心啟動子；玉蜀黍Ubi1前導子；以及玉蜀黍Ubi1內含子

<220>

<221> UbiI-內含子

<222> (1)..(1015)

<220>

<221> Ubi1-前導子

<222> (1016)..(1097)

<220>

<221> minUbi1P-min核心_啟動子

<222> (1098)..(1319)

<400> 3

<210> 4

<211> 680

<212> DNA

<213> 玉蜀黍

<400> 4

<210> 5

<211> 3322

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 例示的合成性Ubi1雙向啟動子

<220>

<221> 第一_minUbi1P-反向_互補

<222> (1105)..(1319)

<220>

<221> 第二_minUbi1P-反向_互補

<222> (2009)..(2244)

<400> 5

<210> 6

<211> 6698

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 例示性核酸，其包含由合成性Ubi1雙向啟動子驅動的yfp和GUS表現匣

<400> 6

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YFP順向引子

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YFP反向引子

<400> 8

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉化酶順向引子

<400> 9

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉化酶反向引子

<400> 10

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉化酶探針

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAD1順向引子

<400> 12

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAD1反向引子

<400> 13

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAD1探針

<400> 14

<210> 15

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子

<400> 15

<210> 16

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子2

<400> 16

<210> 17

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子3

<400> 17

<210> 18

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子4

<400> 18

<210> 19

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子5

<400> 19

<210> 20

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子6

<400> 20

<210> 21

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子7

<400> 21

<210> 22

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子8

<400> 22

<210> 23

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子9

<400> 23

<210> 24

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子10

<400> 24

<210> 25

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子11

<400> 25

<210> 26

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子12

<400> 26

<210> 27

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子13

<400> 27

<210> 28

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子14

<400> 28

<210> 29

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子15

<400> 29

<210> 30

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子16

<400> 30

<210> 31

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子17

<400> 31

<210> 32

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子18

<400> 32

<210> 33

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子19

<400> 33

<210> 34

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子20

<400> 34

<210> 35

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子21

<400> 35

<210> 36

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子22

<400> 36

<210> 37

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子23

<400> 37

<210> 38

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子24

<400> 38

<210> 39

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> min-Ubi1P或Ubi1-min P最小核心啟動子25

<400> 39

<210> 40

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YFP探針

<400> 40

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cry34順向引子

<400> 41

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cry34反向引子

<400> 42

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cry34探針

<400> 43

<210> 44

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cry35順向引子

<400> 44

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cry35反向引子

<400> 45

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cry35探針

<400> 46

<210> 47

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PAT順向引子

<400> 47

<210> 48

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PAT反向引子

<400> 48

<210> 49

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PAT探針

<400> 49

<210> 50

<211> 234

<212> PRT

<213> 水母(Phialidium)sp.

<400> 50

<210> 51

<211> 234

<212> PRT

<213> 水母(Phialidium)sp.

<400> 51

Claims

一種核酸分子，其包含：序列辨識編號：5之合成性雙向啟動子；以及一異源性第一核苷酸序列，其編碼操作地連結至該合成性雙向啟動子之有興趣的序列。
如申請專利範圍第1項之核酸分子，其進一步包含一第二核苷酸序列，其編碼操作地連結至該合成性雙向啟動子之有興趣的序列；其中該合成性雙向啟動子在該分子中係位於該編碼有興趣的序列之第一及第二核苷酸序列之間。
一種生產基因轉殖細胞的方法，該方法包含：以如申請專利範圍第1或2項之核酸分子來轉形該細胞。
如申請專利範圍第3項之方法，其中該細胞為一植物細胞。
一種植物細胞，其包含如申請專利範圍第1或2項之核酸分子。
一種於植物細胞及/或組織內表達多重基因的核酸建構物，其包含：序列辨識編號：5之合成性雙向啟動子；以及位於該合成性雙向啟動子之相反端上的2個基因表現匣，其中該等基因表現匣之至少一者包含經由轉譯開關(translation switch)而連結的2個或更多個基因。
一種產生基因轉殖植物或基因轉殖細胞的方法，其包含以如申請專利範圍第6項之核酸建構物來轉形一植物細胞或一細胞。
一種植物細胞，其包含如申請專利範圍第6項之核酸建構物。
如申請專利範圍第8項之植物細胞，其中該核酸建構物係穩定地轉形至該植物細胞之內。
一種於植物細胞及/或組織內表達多重基因的方法，其包含將如申請專利範圍第6項之核酸建構物導入至該植物細胞及/或組織內。
一種供用於農桿菌屬媒介的轉形之二元載體，其包含如申請專利範圍第1或2項之核酸分子。
如申請專利範圍第6項之核酸建構物，其中該核酸建構物係一種供用於農桿菌屬媒介的轉形(Agrobacterium-mediated transformation)之二元載體。