BR112014014037A2

BR112014014037A2 - construto e método para o promotor vegetal ubi1 sintético bidirecional

Info

Publication number: BR112014014037A2
Application number: BR112014014037-5A
Authority: BR
Inventors: Sandeep Kumar; Diaa Alabed; Terry Wright; Manju Gupta
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2012-11-12
Publication date: 2020-11-03
Also published as: EP2797406A1; CA2855902A1; ZA201402992B; RU2639538C2; EP2797406B1; AU2012363062A1; EP2797406A4; IL233452A0; AR089510A1; CN104135851B; RU2014131448A; US9422569B2; BR112014014037B1; CA2855902C; US20130254943A1; SA112340162B1; JP2015503342A; JP6220794B2; HK1201121A1; AU2012363062B2

Abstract

POLINUCLEOTÍDEO COMPREENDENDO ELEMENTO PROMOTOR DE NÚCLEO MÍNIMO DE GENE DE UBIQUITINA-1 DE ZEA MAYS OU ZEA LUXURIANS , BEM COMO CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLÉICO E VETOR BINÁRIO, E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE CÉLULA E PLANTA TRANSGÊNICAS E PARA EXPRESSÃO DE MÚLTIPLOS GENES NAS MESMAS. A presente invenção refere-se a polinucleotídeo sintético compreendendo elemento promotor de núcleo mínimo de gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou Zea luxurians , a construto de ácido nucléico para expressão de múltiplos genes em células e/ou tecidos de plantas, e a vetor binário para transformação mediada por Agrobacterium. A presente invenção refere-se ainda ao método para a produção de célula transgênica utilizando o dito polinucleotídeo e para gerar planta ou célula transgênica, bem como a método para a expressão de sequência de nucleotídeos de interesse em célula de planta e para a expressão de múltiplos genes em células e/ou tecidos de plantas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLI-

NUCLEOTÍDEO COMPREENDENDO ELEMENTO PROMOTOR DE NÚCLEO MÍNIMO DE GENE DE UBIQUITINA-1 DE ZEA MAYS OU ZEA LUXURIANS, BEM COMO CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLÉICO E VETOR BINÁRIO, E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE CÉLULA E

PLANTA TRANSGÊNICAS E PARA EXPRESSÃO DE MÚLTIPLOS GENES NAS MESMAS". REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório No. de Série U.S. 61/582.138 depositado em 30 de dezembro de 2011. Este pedido de patente também reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório No. de Série U.S. 61/617.252 depositado em 29 de março de 2012.

CAMPO TÉCNICO

[002] A presente invenção refere-se ao campo da biologia mole- cular vegetal, e mais especificamente o campo da expressão estável de múltiplos genes em plantas transgênicas.

ANTECEDENTES

[003] Muitas espécies de plantas são capazes de ser transforma- das com transgenes de outras espécies para introduzir traços ou ca- racterísticas agronomicamente desejáveis, por exemplo, melhorar a qualidade de valor nutritivo, aumentar o rendimento, conferir resistên- cia a pragas ou doenças, aumentar a tolerância ao estresse da seca e, melhorar as qualidades de horticultura (como pigmentação e cresci- mento), transmitir resistência a herbicidas, permitir a produção de compostos e/ou materiais vegetais industrialmente úteis e/ou permitir a produção de produtos farmacêuticos. A introdução de transgenes em células vegetais e a recuperação subsequente de plantas transgênicas férteis que contêm uma cópia estavelmente integrada do transgene Segue-se folha 1a/104

1a/104 pode ser usada para produzir plantas transgênicas que possuam os traços desejáveis.

[004] O controle e a regulação da expressão genética podem ocorrer através de numerosos mecanismos. A iniciação da transcrição de um gene é Segue-se folha 2/104 um mecanismo de controle predominante da expressão gênica. O iní- cio da transcrição é geralmente controlado por sequências de polinu- cleotídeo localizadas na região flanqueadora 5’ ou a montante do gene transcrito. Estas sequências são referidas coletivamente como promo- tores. Os promotores geralmente contêm sinais de RNA polimerase para começar a transcrição para que o RNA mensageiro (mRNA) pos- sa ser produzido. O mRNA maduro é traduzido pelo ribossomo, por meio disso sintetizando as proteínas. As proteínas de ligação ao DNA interagem especificamente com sequências de DNA promotoras para promover a formação de um complexo transcricional e iniciar o pro- cesso de expressão gênica. Há uma variedade de promotores eucarió- ticos isolados e caracterizados de plantas que são funcionais para controlar a expressão de um transgene em plantas. Os promotores que afetam a expressão gênica em resposta a estímulos ambientais, disponibilidade nutritiva ou condições adversas incluindo choque tér- mico, anaerobiose ou presença de metais pesados foram isolados e caracterizados. Também há os promotores que controlam a expressão gênica durante o desenvolvimento ou em um tecido ou órgão de modo específico. Além disso, os promotores procarióticos isolados das bac- térias e vírus foram isolados e caracterizados sendo funcionais para controlar a expressão de um transgene em plantas.

[004] Um promotor eucariótico típico consiste de um promotor mínimo e outros elementos cis. O promotor mínimo é essencialmente uma região de caixa TATA onde RNA polimerase II (polII), Proteína de ligação TATA (TBP) e fatores associados à TBP (TAFs) podem ligar- se para iniciar a transcrição. Entretanto na maioria dos exemplos, ele- mentos de sequência além do motivo TATA são requeridos para trans- crição exata. Foi descoberto que tais elementos de sequência (por e- xemplo, potencializadores) elevam o nível total da expressão dos ge- nes próximos, muitas vezes em uma forma independente de posição e/ou orientação. Outras sequências próximas do sítio de início de transcrição (por exemplo, as sequências INR) de alguns genes de polII podem fornecer um sítio de ligação alternativo de fatores que também contribuem para a ativação transcricional, fornecendo alternativamente os sítios de ligação de promotor principais para transcrição em promo- tores sem os elementos TATA funcionais. Ver, por exemplo, Zenzie- Gregory e outros. (1992) J. Biol. Chem. 267: 2823-30.

[005] Outros elementos reguladores de genes incluem sequên- cias que interagem com fatores de ligação a DNA específicos. Estes motivos de sequência são referidos às vezes como elementos cis e são normalmente dependentes de posição e orientação, embora pos- sam ser encontrados 5’ ou 3’ à uma sequência codificante do gene, ou em um íntron. Tais elementos cis, aos quais os fatores de transcrição específicos para o tecido ou específicos para o desenvolvimento se ligam, individualmente ou em combinação, podem determinar o padrão de expressão espaço-temporal de um promotor no nível transcricional. O arranjo de elementos cis a montante, seguidos de um promotor mí- nimo, tipicamente estabelece a polaridade de um promotor particular. Os promotores em plantas que foram clonadas e largamente usadas tanto para pesquisa básica como para aplicação biotecnológica são geralmente unidirecionais, direcionando somente um gene que foi fun- dido na sua extremidade 3’ (isto é, a jusante). Ver, por exemplo, Xie e outros. (2001) Nat. Biotechnol. 19 (7):677-9; Patente U.S. No.

6.388.170.

[006] Muitos elementos cis (ou "sequências a montante regulado- ras") foram identificados em promotores vegetais. Estes elementos cis variam largamente no tipo do controle que exercem em genes opera- cionalmente ligados. Alguns elementos atuam para aumentar a trans- crição de genes operacionalmente ligados em resposta a respostas ambientais (por exemplo, temperatura, umidade, e ferimento). Outros elementos cis podem responder a sinais de desenvolvimento (por e- xemplo, germinação, maturação de semente e florescência) ou à in- formação espacial (por exemplo, especificidade de tecido). Ver, por exemplo, Langridge e outros. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23. O tipo de controle de elementos promotores específicos é tipicamente uma qualidade intrínseca do promotor; isto é, um gene he- terólogo sob controle de tal promotor será provavelmente expresso de acordo com o controle do gene nativo do qual o elemento promotor foi isolado. Estes elementos também tipicamente podem ser trocados por outros elementos e manter seu controle intrínseco característico sob expressão gênica.

[007] Muitas vezes é necessário introduzir múltiplos genes em plantas para engenharia metabólica e empilhamento de traços, genes os quais são frequentemente controlados por promotores idênticos ou homólogos. Entretanto, o silenciamento gênico baseado em homologia (HBGS) provavelmente surgirá quando múltiplos transgenes introduzi- dos têm promotores homólogos que os controlam. Ver por exemplo, Mol e outros. (1989) Plant Mol. Biol. 13:287-94. Foi relatado que HBGS ocorre extensivamente em plantas transgênicas. Ver, por exemplo, Vaucheret e Fagard (2001) Trends Genet. 17:29-35. Vários mecanis- mos foram sugeridos para explicar os fenômenos de HBGS, todos os quais incluem o atributo que a homologia de sequência no promotor dispara mecanismos de reconhecimento celular que resultam em si- lenciamento dos genes repetidos. Ver, por exemplo, Matzke e Matzke (1995) Plant Physiol. 107:679-85; Meyer e Saedler (1996) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47:23-48; Fire (1999) Trends Genet. 15:358-63; Hamilton e Baulcombe (1999) Science 286:950-2; e Steimer e outros. (2000) Plant Cell 12:1165-78.

[008] Estratégias de evitar HBGS em plantas transgênicas fre- quentemente envolvem o desenvolvimento de promotores sintéticos que são funcionalmente equivalentes mas têm homologia de sequên- cia mínima. Quando tais promotores sintéticos são usados para ex- pressar transgenes em plantas de cultura, podem ajudar em evitação ou redução de HBGS. Ver, por exemplo, Mourrain e outros. (2007) Planta 225 (2):365-79; Bhullar e outros. (2003) Plant Physiol. 132:988-

98. Tais promotores podem ser gerados introduzindo elementos cis conhecidos em um estiramento novo ou sintético de DNA, ou alternati- vamente pela "troca de domínio" em que os domínios de um promotor são substituídos por domínios funcionalmente equivalentes de outros promotores heterólogos. Dessa forma, permanece uma necessidade de construtos e métodos para expressão estável de múltiplos transgenes efetivamente com ris- co mínimo de recombinação ou perda de transgenes por meio de me- lhoramento ou múltiplas gerações em plantas transgênicas.

REVELAÇÃO

[009] São descritos neste pedido métodos para conversão de um promotor polar Ubi1 em promotores bidirecionais sintéticos, tal que um promotor sintético possa controlar a expressão de dois genes que flanqueiam o promotor. Em algumas modalidades, um método para conversão de um promotor polar Ubi1 em um promotor bidirecional sintético pode compreender, por exemplo, e sem limitação, identifica- ção da sequência nucleotídica de elemento promotor mínimo de um promotor de Ubi1; e/ou fornecimento de um ácido nucleico compreen- dendo duas sequências nucleotídicas do elemento promotor de Ubi1 mínimo orientadas em direções opostas. Em modalidades particulares, um ácido nucleico pode compreender duas sequências nucleotídicas do elemento promotor de Ubi1 mínimo orientadas em direções opos- tas, tal que a extremidade de cada elemento promotor mínimo que es- teja muito próxima ao gene de Ubi1 nativo correspondente seja ainda de outro elemento promotor mínimo do que uma extremidade do ácido nucleico que esteja próxima a uma sequência codificante operacio- nalmente ligada ao elemento promotor. Em alguns exemplos, o ele- mento promotor de Ubi1 mínimo é isolado do milho. Os elementos adi- cionais de um promotor de Ubi1 nativo que pode ser engendrado para estar incluído em um promotor bidirecional sintético incluem íntrons Ubi1, éxons de Ubi1 e/ou tudo ou parte de um Ubi1 a montante região de promotor. Em alguns exemplos, um promotor bidirecional sintético pode compreender mais de um de algum dos precedentes.

[0010] Também são descritos neste pedido promotores mínimos Ubi1 que podem ser úteis na construção de promotores sintéticos (por exemplo, promotores bidirecionais sintéticos) e promotores sintéticos particulares produzidos pelos métodos precedentes. Em algumas mo- dalidades, um promotor bidirecional sintético é o promotor que é capaz de controlar a transcrição de uma sequência nucleotídica operacio- nalmente ligada em uma célula vegetal. Por exemplo, um promotor bidirecional sintético pode ser capaz em modalidades particulares de controlar a transcrição em uma célula vegetal de duas sequências nu- cleotídicas operacionalmente ligadas que flanqueiam o promotor.

[0011] As modalidades particulares da invenção incluem células (por exemplo, células vegetais) compreendendo um promotor mínimo Ubi1 ou equivalente funcional deste. Por exemplo, as modalidades es- pecíficas incluem uma célula compreendendo um promotor sintético (por exemplo, um promotor bidirecional sintético) que inclui um promo- tor mínimo Ubi1 ou equivalente funcional deste. As células vegetais de acordo com as modalidades particulares podem estar presentes em uma cultura de células, um tecido, uma parte vegetal e/ou uma planta inteira. Dessa forma, uma planta (por exemplo, um monocotilédone ou dicotilédone) compreendendo uma célula compreendendo um promo- tor mínimo Ubi1 ou equivalente funcional deste está incluída em algu- mas modalidades.

[0012] Algumas modalidades da invenção incluem um meio para iniciar a transcrição de uma maneira independente de direção. Os meios para iniciar a transcrição de uma maneira independente de dire- ção incluem o promotor mínimo Ubi1 da SEQ ID NO: 1. Algumas mo- dalidades da invenção incluem um meio para iniciar a transcrição de duas sequências nucleotídicas operacionalmente ligadas de interesse. Os meios para iniciar a transcrição de duas sequências nucleotídicas operacionalmente ligadas de interesse incluem o promotor de Ubi1 bi- direcional sintético da SEQ ID NO: 5.

[0013] Os atributos precedentes e outros ficarão mais evidentes da descrição detalhada a seguir de várias modalidades, que continuam com referência às figuras acompanhantes.

[0014] Também são fornecidos construtos e métodos para expres- sar múltiplos genes em células vegetais e/ou tecidos vegetais. Os construtos fornecidos compreendem pelo menos uma ligação de pro- motor bidirecional a múltiplos cassetes de expressão gênica. Em al- gumas modalidades, os construtos e os métodos fornecidos empre- gam um promotor bidirecional baseado em um elemento promotor principal mínimo de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou equiva- lente funcional deste. Em algumas modalidades, os construtos e os métodos fornecidos permitem a expressão de genes entre três e vinte.

[0015] Em um aspecto, é fornecido um polinucleotídeo sintético compreendendo um elemento promotor principal mínimo de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou Zea luxurians. Em uma modalidade, o elemento promotor principal mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o elemento promotor principal mí- nimo compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo das SEQ ID NOS: 1 e 15-39. Em uma mo-

dalidade adicional, o elemento promotor principal mínimo compreen- dendo à SEQ ID NO: 1 ou seu complemento. Em uma modalidade adi- cional, o elemento promotor principal mínimo consiste essencialmente da SEQ ID NO: 1 ou seu complemento. Em outra modalidade, o poli- nucleotídeo sintético compreende ainda um éxon de um gene de Ubi- quitina-1 e um íntron de um gene de Ubiquitina-1. Em uma modalidade adicional, o éxon ou íntron é de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou Zea luxurians.

[0016] Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético compre- ende ainda uma sequência reguladora a montante de um gene de U- biquitina-1. Em uma modalidade adicional, em que a sequência regu- ladora a montante compreende uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 4 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional, em que a sequência reguladora a montante compreende a SEQ ID NO: 4 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional, em que a sequência reguladora a montante consiste essencialmente da SEQ ID NO: 4 ou seu complemento.

[0017] Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético compre- ende ainda pelo menos um elemento selecionado a partir de uma lista compreendendo uma sequência reguladora a montante (URS), um e- lemento potencializador, um éxon, um íntron, um sítio de início de transcrição, uma caixa TATA e um elemento consenso de choque tér- mico. Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético compreende ainda uma sequência nucleotídica de interesse operacionalmente liga- da ao elemento promotor principal mínimo. Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético compreende ainda um elemento selecionado a partir do grupo consistindo de uma sequência reguladora a montante (URS), um elemento potencializador, um éxon, um íntron, um sítio de início de transcrição, uma caixa TATA, um elemento consenso de cho-

que térmico e combinações destes. Em outra modalidade, o polinucle- otídeo sintético compreende ainda uma sequência nucleotídica de inte- resse operacionalmente ligada ao elemento promotor principal mínimo.

[0018] Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético compre- ende ainda um segundo elemento promotor principal mínimo de Zea mays ou Zea luxurians, em que dois elementos promotores principais mínimos estão em orientação complementar reversa entre si no poli- nucleotídeo. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o polinu- cleotídeo sintético compreende ainda um éxon de um gene de Ubiqui- tina-1 e um íntron de um gene de Ubiquitina-1. Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo sintético compreende uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 3 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo sintético compreende a SEQ ID NO: 3 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional, o poli- nucleotídeo sintético consiste essencialmente da SEQ ID NO: 3 ou seu complemento.

[0019] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o polinucleotí- deo sintético compreende ainda uma sequência reguladora a montante de um gene de Ubiquitina-1. Em uma modalidade adicional, em que a sequência reguladora a montante compreende uma sequência de poli- nucleotídeos que é pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 4 ou seu complemento. Em uma mo- dalidade adicional, a sequência reguladora a montante compreende a SEQ ID NO: 4 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional, a sequência reguladora a montante consiste essencialmente da SEQ ID NO: 4 ou seu complemento.

[0020] Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético que com- preende dois elementos promotores principais mínimos compreende ainda pelo menos um elemento selecionado a partir de uma lista com-

preendendo uma sequência reguladora a montante (URS), um éxon, um íntron, um sítio de início de transcrição, uma caixa TATA, um ele- mento consenso de choque térmico, e uma sequência nucleotídica de INÍCIO e/ou de PARADA de tradução. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o polinucleotídeo sintético compreendendo dois elemen- tos promotores principais mínimos compreende ainda um elemento selecionado a partir do grupo consistindo de uma sequência regulado- ra a montante (URS), um éxon, um íntron, um sítio de início de trans- crição, uma caixa TATA, um elemento consenso de choque térmico, uma sequência nucleotídica de INÍCIO e/ou de PARADA de tradução e combinações destes. Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo sintético compreende a SEQ ID NO: 5 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo sintético consiste essencial- mente da SEQ ID NO: 5 ou seu complemento.

[0021] Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético compre- endendo dois elementos promotores principais mínimos compreende uma primeira sequência nucleotídica de interesse operacionalmente ligada a um dos elementos promotores principais mínimos. Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo sintético compreende uma se- gunda sequência nucleotídica de interesse operacionalmente ligada ao elemento promotor principal mínimo que não é operacionalmente liga- do à primeira sequência nucleotídica de interesse.

[0022] Em uma modalidade do polinucleotídeo sintético fornecido, o éxon é de um gene de Ubiquitina-1 de Zea spp. Em uma modalidade do polinucleotídeo sintético fornecido, o éxon é de um gene de Ubiqui- tina-1 de Zea mays ou Zea luxurians. Em outra modalidade, o íntron é de um gene de Ubiquitina-1 de Zea spp. Em outra modalidade, o íntron é de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou Zea luxurians. Em uma modalidade adicional ou alternativa, Zea spp. é Zea mays. Em outra modalidade, Zea spp. é Zea luxurians.

[0023] Em outro aspecto, é fornecido um método para produção de uma célula com transgene. Os métodos compreendem a transfor- mação da célula com o polinucleotídeo sintético descrito neste pedido. Em uma modalidade, a célula é uma célula vegetal. Em outro aspecto, é fornecida uma célula vegetal compreendendo o polinucleotídeo sin- tético descrito neste pedido. Em outro aspecto, é fornecida uma planta compreendendo uma célula vegetal compreendendo o polinucleotídeo sintético descrito neste pedido.

[0024] Em outro aspecto, é fornecido um método para expressão de uma sequência nucleotídica de interesse em uma célula vegetal. O método compreende a introdução na célula vegetal da sequência nu- cleotídica de interesse operacionalmente ligada a um meio para iniciar a transcrição de uma maneira independente de direção. Em outro as- pecto, é fornecido um método para expressão de uma sequência nu- cleotídica de interesse em uma célula vegetal. O método compreende a introdução na célula vegetal da sequência nucleotídica de interesse operacionalmente ligada a um meio para iniciar a transcrição de duas sequências nucleotídicas operacionalmente ligadas de interesse. Em uma modalidade adicional, o método compreendendo introdução na célula vegetal de um ácido nucleico compreendendo: (a) a sequência nucleotídica de interesse operacionalmente ligada aos meios para ini- ciar a transcrição de duas sequências nucleotídicas operacionalmente ligadas de interesse; e (b) uma segunda sequência nucleotídica de in- teresse operacionalmente ligada aos meios para iniciar a transcrição de duas sequências nucleotídicas operacionalmente ligadas de inte- resse.

[0025] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o meio para iniciar a transcrição de duas sequências nucleotídicas operacional- mente ligadas de interesse compreende a SEQ ID NO: 5 ou seu com- plemento. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o meio para iniciar a transcrição de duas sequências nucleotídicas operacional- mente ligadas de interesse compreende a SEQ ID NO: 5. Em outra modalidade, o meio para iniciar a transcrição de duas sequências nu- cleotídicas operacionalmente ligadas de interesse compreende o com- plemento da SEQ ID NO: 5. Em outra modalidade, o ácido nucleico é introduzido na célula vegetal para visar a um sítio predeterminado no DNA da célula vegetal, a sequência nucleotídica de interesse opera- cionalmente ligada aos meios para iniciar a transcrição de duas se- quências nucleotídicas operacionalmente ligadas de interesse. Em uma modalidade adicional ou alternativa, a sequência nucleotídica de interesse operacionalmente ligada aos meios para iniciar a transcrição de duas sequências nucleotídicas operacionalmente ligadas de inte- resse é direcionada ao sítio predeterminado que utiliza recombinação mediada por nuclease dedo de zinco.

[0026] Em outro aspecto, é fornecido um construto de ácido nucle- ico para expressar múltiplos genes em células vegetais e/ou tecidos. O construto de ácido nucleico compreende (a) um promotor bidirecional; e (b) dois cassetes de expressão gênica em extremidades opostas do promotor bidirecional; em que pelo menos um dos cassetes de ex- pressão gênica compreende dois ou mais genes ligados através de um interruptor de tradução.

[0027] Em uma modalidade, o construto de ácido nucleico não compreende uma sequência viral. Em outra modalidade, o promotor bidirecional não compreende uma sequência viral. Em outra modalida- de, o promotor bidirecional compreende pelo menos um potencializa- dor. Em outra modalidade, o promotor bidirecional não compreende um potencializador. Em outra modalidade, o construto de ácido nuclei- co compreende um vetor binário de transformação mediada por Agro- bacterium.

[0028] Em uma modalidade, o promotor bidirecional compreende um elemento selecionado a partir do grupo consistindo de um elemen- to cis ou sequência reguladora a montante (URS), um elemento poten- cializador, um éxon, um íntron, um sítio de início de transcrição, uma caixa TATA, um elemento consenso de choque térmico e combinações destes. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o promotor bidi- recional compreende uma sequência reguladora a montante (URS) de um gene de Ubiquitina. Em uma modalidade adicional, o promotor bidi- recional compreende (i) um promotor diferente de um promotor de um gene de Ubiquitina e (ii) uma sequência reguladora a montante (URS) de um gene de Ubiquitina.

[0029] Em outra modalidade, o promotor bidirecional compreende um elemento promotor principal mínimo de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou Zea luxurians. Em outra modalidade, o promotor bidire- cional compreende ainda um segundo promotor principal mínimo de Zea mays ou Zea luxurians, em que dois elementos promotores princi- pais mínimos estão na orientação complementar reversa entre si. Em uma modalidade adicional, o elemento promotor principal mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntica à SEQ ID NO:1 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o e- lemento promotor principal mínimo compreende uma sequência de po- linucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo das SEQ ID NOS: 1 e 15-39. Em uma modalidade adicional, o elemento promotor principal mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos se- lecionada a partir do grupo consistindo das SEQ ID NOS: 1 e 15-34. Em uma modalidade adicional, o elemento promotor principal mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo das SEQ ID NOS: 1 e 15-29. Em uma modalida- de adicional, o elemento promotor principal mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo consistin-

do das SEQ ID NOS: 1 e 15-24. Em uma modalidade adicional, o ele- mento promotor principal mínimo compreende uma sequência de poli- nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo das SEQ ID NOS: 1 e 15-19. Em uma modalidade adicional, o elemento promotor principal mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO: 1.

[0030] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o promotor bidirecional compreende um éxon de um gene de Ubiquitina-1 e/ou um íntron de um gene de Ubiquitina. Em uma modalidade adicional, o promotor bidirecional compreende um polinucleotídeo de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 3 ou seu complemento. Em uma modalidade adicional, o promotor bidirecional compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 3 ou seu complemen- to. Em outra modalidade, o promotor bidirecional compreende um ín- tron de um gene de álcool desidrogenase. Em uma modalidade, o construto de ácido nucleico é estavelmente transformado em plantas transgênicas. Em uma modalidade, as plantas são plantas monocotilé- dones. Em outra modalidade, as plantas são plantas dicotilédones. Em outra modalidade, as plantas não são plantas monocotilédones. Em outra modalidade, as plantas não são plantas dicotilédones.

[0031] Em uma modalidade adicional ou alternativa, o promotor bidirecional compreende uma sequência reguladora a montante de um gene de Ubiquitina. Em uma modalidade adicional, a sequência regu- ladora a montante de um gene de Ubiquitina compreende um polinu- cleotídeo da sequência pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 4 ou seu complemento. Em uma modali- dade adicional, a sequência reguladora a montante de um gene de U- biquitina compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 4 ou seu complemento. Em outra modalidade, o promotor bidirecional compre- ende um polinucleotídeo de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%

ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 5 ou seu complemento. Em outra mo- dalidade, o promotor bidirecional compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 5 ou seu complemento.

[0032] Em uma modalidade, ambos os cassetes de expressão gê- nica compreendem dois ou mais genes ligados através de um interrup- tor de tradução. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o inter- ruptor de tradução é selecionado a partir do grupo consistindo de um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES), um sítio de splicing al- ternativo, um sítio de clivagem de ribozima, uma sequência de polinu- cleotídeos que codifica um peptídeo 2A, uma sequência de polinucleo- tídeos que codifica um peptídeo similar ao 2A, uma sequência de poli- nucleotídeos que codifica uma inteína, uma sequência de polinucleotí- deos que codifica um sítio de clivagem de protease e combinações destes. Em uma modalidade adicional ou alternativa, o interruptor de tradução compreende uma atuação do elemento hidrolase cis-atuante (CHYSEL). Em uma modalidade adicional, o CHYSEL é uma sequên- cia de peptídeo 2A ou similar a 2A. Em outra modalidade, um gene a montante do interruptor de tradução não compreende um códon de parada de tradução. Em outra modalidade, o construto de ácido nucle- ico capacita ou permite a expressão de pelo menos quatro genes. Em uma modalidade adicional, os quatro genes são transgenes. Em outra modalidade, o construto de ácido nucleico permite a expressão de ge- nes entre três e vinte. Em outra modalidade, o construto de ácido nu- cleico permite a expressão de genes entre quatro e oito. Em uma mo- dalidade adicional ou alternativa, os genes são transgenes. Em outra modalidade, pelo menos um cassete de expressão gênica compreen- de uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma proteína de fusão. Em uma modalidade adicional, a proteína de fusão compreende três a cinco genes.

[0033] Em algumas modalidades, a expressão de genes do pro-

motor bidirecional pelo menos é quatro vezes mais alta quando com- parada com um promotor unidirecional.

Em algumas modalidades, a expressão de genes do promotor bidirecional é de três a dez vezes mais alta quando comparada com um promotor unidirecional.

Em al- gumas modalidades, a expressão de genes do promotor bidirecional é de quatro a oito vezes mais alta quando comparada com um promotor unidirecional.

Em algumas modalidades, um gene de marcador de se- leção é colocado na extremidade distante do promotor (isto é, na ex- tremidade 3’ de um cassete de expressão gênica a jusante de outro gene). Em outro aspecto, é fornecido um método para gerar uma planta transgênica, compreendendo a transformação de uma célula vegetal com o construto de ácido nucleico fornecido neste pedido.

Em outro aspecto, é fornecido um método para gerar uma célula transgênica, compreendendo a transformação da célula com o construto de ácido nucleico fornecido neste pedido.

Em outro aspecto, fornecido é uma célula vegetal compreendendo o construto de ácido nucleico fornecido neste pedido.

Em uma modalidade adicional ou alternativa, o construto de ácido nucleico é estavelmente transformado na célula vegetal.

Em outro aspecto, é fornecido uma planta transgênica compreendendo o construto de ácido nucleico fornecido neste pedido.

Em uma modali- dade adicional ou alternativa, o construto de ácido nucleico é estavel- mente transformado em células da planta transgênica.

Em outro as- pecto, é fornecido um método de expressar múltiplos genes em células e/ou tecidos vegetais, compreendendo introdução nas células e/ou te- cidos vegetais do construto de ácido nucleico fornecido neste pedido.

Em uma modalidade adicional ou alternativa, células e/ou tecidos ve- getais são estavelmente transformados com o construto de ácido nu- cleico fornecido neste pedido.

Em outro aspecto, fornecido é um vetor binário de transformação mediada por Agrobacterium.

Em uma moda-

lidade, o vetor binário compreende o construto de ácido nucleico for- necido neste pedido. Em outra modalidade, o vetor binário compreen- de o polinucleotídeo sintético fornecido neste pedido. Em outro aspec- to, é fornecido o uso do promotor bidirecional fornecido neste pedido para a expressão de múltiplos transgenes em plantas.

[0034] BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E SEQUÊNCIAS

[0035] A FIG. 1 mostra um promotor de Ubi1 de milho exemplar (ZmUbi1) (não em escala), que compreende um Elemento a Montante de aproximadamente 900 bp localizado 5’ do sítio de início de transcri- ção (TSS). O elemento a montante contém uma caixa TATA (localiza- da aproximadamente a -30 bp do TSS), e dois elementos consenso de choque térmico de sobreposição (localizados aproximadamente a -200 bp do TSS). Este promotor também compreende aproximadamente 3’ de 1100 bp da região TSS. Esta região 3’ contém uma sequência líder adjacente (éxon de ZmUbi1), e um íntron.

[0036] A FIG. 2 mostra uma modalidade exemplar do promotor bi- direcional Ubi1 sintético fornecido, que inclui um elemento principal mínimo minUbi1P clonado a montante (em orientação complementar reversa) de um promotor de ZmUbi1.

[0037] A FIG. 3 mostra um desenho esquemático exemplar de cassetes de expressão do gene yfp e GUS, que são cada um opera- cionalmente ligados a um promotor bidirecional Ubi1 sintético.

[0038] A FIG. 4 mostra um mapa de plasmídeo representativo de pDAB105801. A FIG. 5 mostra um mapa de plasmídeo representativo de pDAB108706. A FIG. 6 mostra um mapa de plasmídeo representa- tivo de pDAB101556.

[0039] A FIG. 7A mostra a SEQ ID NO: 1, que compreende uma região de 215 bp de um promotor principal mínimo Ubi1 de Zea mays (minUbi1P). A FIG. 7B mostra a SEQ ID NO:2, que compreende um íntron de Ubi1 de Z. mays.

[0040] A FIG. 8A mostra a SEQ ID NO: 3, que compreende o complemento reverso de um polinucleotídeo compreendendo um pro- motor principal mínimo minUbi1P de Z. mays (sublinhado); um líder Ubi1 de Z. mays (éxon de ZmUbi1; fonte negritada); e um íntron de Z. mays Ubi1 (caixa baixa). A FIG. 8B mostra a SEQ ID NO: 4, que com- preende um segmento de um elemento Ubi1 a montante de Z. mays, onde o elemento (e/ou seu complemento reverso) pode estar localiza- do em um promotor de Ubi1 sintético com um elemento minUbi1P ad- jacente às suas extremidades 5’ ou 3’.

[0041] A FIG. 9 mostra a SEQ ID NO: 5, que compreende um promotor bidirecional de Ubi1 sintético exemplar, em que o comple- mento reverso de um primeiro minUbi1P e um segundo minUbi1P, é sublinhado. A FIG. 10 mostra a SEQ ID NO: 6, que compreende um ácido nucleico exemplar que compreende cassetes de expressão de gene yfp e GUS controlados por um promotor bidirecional Ubi1 sintéti- co.

[0042] A SEQ ID NO: 7 compreende um Iniciador de sentido direto YFP: 5’-GATGCCTCAGTGGGAAAGG-3’. A SEQ ID NO: 8 compreen- de um Iniciador de sentido reverso YFP: 5’-CCATAGGTGA GAGTGGTGAC AA-3’. A SEQ ID NO: 9 compreende um Iniciador de sentido direto de Invertase: 5’-TGGCGGACGA CGACTTGT-3’. A SEQ ID NO: 10 compreende um Iniciador de sentido reverso de Invertase: 5’-AAAGTTTGGA GGCTGCCGT-3’. A SEQ ID NO: 11 compreende uma Sonda de Invertase: 5’-CGAGCAGACC GCCGTGTACT TC- TACC-3’. A SEQ ID NO: 12 compreende um Iniciador de sentido direto de AAD1: 5’-TGTTCGGTTC CCTCTACCAA-3’. A SEQ ID NO: 13 compreende um Iniciador de sentido reverso de AAD1: 5’- CAACATCCAT CACCTTGACT GA-3’. A SEQ ID NO: 14 compreende uma Sonda de AAD1: 5’-CACAGAACCG TCGCTTCAGC AACA-3’ (também ver a Tabela 7).

[0043] A FIG. 11 mostra uma análise de Western blot representati- va que confirma expressão estável de YFP e GUS controlada por um construto de Promotor bidirecional de Ubiquitina-1 de Z. mays (pDAB108706) em plantas de milho T0. As plantas representativas mostraram a expressão de YFP estável em folhas controlada pelo e- lemento promotor principal mínimo Min-UbiP1. A quantidade da proteí- na que foi produzida é indicada como partes por milhão (ppm).

[0044] A FIG. 12 mostra uma análise de Western blot representati- va mostrando expressão estável de YFP e GUS do construto controle contendo um promotor de ZmUbi1 que somente controla a expressão de YFP (pDAB101556); uma sequência codificante GUS não está con- tida neste construto. A quantidade da proteína que foi produzida é in- dicada como partes por milhão (ppm).

[0045] A FIG. 13A mostra construtos exemplares de pilhas do cas- sete de quatro genes pDAB105843 [mostrando dois cassetes de A- AD1-2A-YFP (ou Phiyfp) mais Cry34-2A-Cry35] e pDAB105846 [mos- trando dois cassetes de YFP (ou Phiyfp)-2A-AAD1 mais Cry34-2A- Cry35]. As flechas sombreadas indicam a direção da transcrição do promotor bidirecional. Ubi1-minP compreende sequência de 200 nt a montante do sítio de início transcricional do promotor de Ubi1 do milho. Ubi1-URS compreende a região a montante reguladora do promotor de Ubi1 do milho consistindo da sequência a montante do sítio de iní- cio de transcrição excluindo o promotor mínimo de 200 nt (mostrado como flecha). O Ubi1-Int compreende um íntron do promotor de Ubi1 do milho. A FIG. 13B mostra construtos binários exemplares adicionais de pilhas do cassete de quatro genes de pDAB108717 e pDAB108718.

[0046] A FIG. 14 mostra apresentações esquemáticas exemplares de construtos multigênicos fornecidos neste pedido. Os interruptores de tradução são mostrados usando um símbolo especial.

[0047] A FIG. 15 mostra mapas representantes para os plasmí-

deos pDAB105818 e pDAB105748.

[0048] A FIG. 16 mostra mapas representativos dos plasmídeos pDAB105803 e pDAB105840.

[0049] A FIG. 17 mostra mapas representativos dos plasmídeos pDAB105841 e pDAB105842.

[0050] A FIG. 18 mostra mapas representativos dos plasmídeos pDAB105843 e pDAB101917.

[0051] A FIG. 19 mostra um mapa representativo de plasmídeo pDAB108717.

[0052] A FIG. 20 mostra mapas representativos para os plasmí- deos pDAB105844 e pDAB105845.

[0053] A FIG. 21 mostra mapas representativos dos plasmídeos pDAB105846 e pDAB108718.

[0054] A FIG. 22 mostra dados de expressão proteica exemplares para Cry35 de pDAB108717 (FIG. 22A) e pDAB108718 (FIG. 22B). A FIG. 23 mostra a sequência de ácidos nucleicos para cassetes de ex- pressão gênica de pDAB108717, onde cada gene e elemento são ilus- trados.

[0055] As FIGS. 24 A-E mostram os promotores principais míni- mos adicionais (min-Ubi1P ou Ubi1-minP) das SEQ ID NOS: 15-39.

[0056] A FIG. 25 mostra duas sequências exemplares de proteínas fluorescentes amarelas de Phialidium sp. SL-2003 (Phiyfp, SEQ ID NO: 50; e Phiyfpv3, SEQ ID NO: 51).

[0057] A FIG. 26 mostra modalidades exemplares do promotor bi- direcional de Ubi1 sintético e construtos fornecidos, incluindo pDAB108706 (ZMUbi bidirecional (-200)) e pDAB108707 (ZMUbi bidi- recional (-90)). pDAB101556 (controle de ZmUbi1-YFP) e pDAB108716 (ZMUbi1 sem promotor mínimo) servem como construtos de controle com promotores unidirecionais.

[0058] A FIG. 27A mostra os resultados de expressão exemplares

(V6) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para proteína YFP (LCMS) em ng/cm2. A FIG. 27B mostra os resultados de expressão relativa exemplares (V6) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para o RNA de YFP.

[0059] A FIG. 28A mostra os resultados de expressão exemplares (V6) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para proteína de GUS (LCMS) em ng/cm2. A FIG. 28B mostra os resultados de expres- são relativa exemplares (V6) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para o RNA de GUS.

[0060] A FIG. 29A mostra os resultados de expressão exemplares (V6) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para proteína AAD1 (LCMS) em ng/cm2. A FIG. 29B mostra os resultados de expressão relativa exemplares (V6) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para o RNA de AAD1.

[0061] A FIG. 30A mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para proteína YFP (LCMS) em ng/cm2. Os valores médios de pDAB108707, pDAB108706, pDAB101556 e pDAB108716 são 57,63, 52,66, 49,75, e 0 respectivamente. A FIG. 30B mostra uma análise estatística dos re- sultados de expressão relativa (V6) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para o RNA de YFP. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 são 9,96, 8,07, 6,95, e 1,01 respectivamente.

[0062] A FIG. 31A mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para proteína de GUS (LCMS) em ng/cm2. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 são 151,27, 143,22, 0, e 213,17 respectivamente. A FIG. 31B mostra uma análise estatística dos resultados de expressão relativa (V6) dos quatro cons- trutos mostrados na FIG. 26 para GUS RNA. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 são 0,65, 0,78, 0, e 3,03 respectivamente.

[0063] A FIG. 32A mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para proteína AAD1 (LCMS) em ng/cm2. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 são 710,88, 1417,01, 856,58, e 1795,43 respectivamente. A FIG. 32B mostra uma análise estatística dos resultados de expressão relativa (V6) dos qua- tro construtos mostrados na FIG. 26 para o RNA de AAD1. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 são 1,33, 1,37, 1,93, e 2,93 respectivamente.

[0064] FIGS. 33A, 33B, e 33C mostram resultados de expressão exemplares (V10) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para proteína YFP, AAD1 e GUS (LCMS) em ng/cm2 respectivamente.

[0065] As FIGS. 34A, 34B, e 34C mostram a análise estatística dos resultados de expressão (V10) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para proteína YFP, GUS e AAD1 (LCMS) em ng/cm2 res- pectivamente. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 de YFP (FIG. 34A) são 71,77, 81,81, 49,58, e 23,01 respectivamente. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 de GUS (FIG. 34B) são 109,63, 98,25, 0, e 138,02 respectivamente. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 de AAD1 (FIG. 34C) são 666,11, 597,80, 715,12, e 1002,84 respectivamente.

[0066] As FIGS. 35A, 35B, e 35C mostram os resultados de ex- pressão exemplares (R3) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para proteína YFP, GUS e AAD1 (LCMS) em ng/cm2 respectivamente.

[0067] As FIGS. 36A, 36B, e 36C mostram a análise estatística dos resultados de expressão (R3) dos quatro construtos mostrados na FIG. 26 para proteína YFP, GUS e AAD1 (LCMS) em ng/cm2 respecti-

vamente. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 de YFP (FIG. 36A) são 91,38, 49,49, 21,67, e 0,40 respectivamente. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 de GUS (FIG. 36B) são 5,52, 16,81, 1,07, e 46,60 respectivamente. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 de AAD1 (FIG. 36C) são 156,71, 153,44, 165,40, e 197,80 respectivamente.

[0068] A FIG. 37A mostra os resultados de expressão relativa e- xemplares (V6) do RNA de Cry34 dos quatro construtos pDAB105748 (ZMUbi1-YFP), pDAB105818 (ZMUbi1-Cry34/ZMUbi1-Cry35/ZMUbi1- AAD1), pDAB108717 (YFP/AAD-1-ZMUbi1 bidirecional-Cry34-Cry35) e pDAB108718 (AAD1/YFP-ZMUbi1-bidirecional-Cry34-Cry35). A FIG. 37B mostra os resultados de expressão relativa exemplares (V6) da proteína Cry34 (LCMS) dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[0069] A FIG. 38A mostra os resultados de expressão relativa e- xemplares (V6) de RNA de AAD1 dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718. A FIG. 38B mostra os re- sultados de expressão relativa exemplares (V6) da proteína AAD1 (LCMS) dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[0070] A FIG. 39A mostra os resultados de expressão relativa e- xemplares (V6) de RNA de YFP dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718. A FIG. 39B mostra os re- sultados de expressão relativa exemplares (V6) da proteína YFP (LCMS) dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[0071] A FIG. 40A mostra os resultados de expressão relativa e- xemplares (V6) de RNA de Cry35 dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718. A FIG. 40B mostra os re-

sultados de expressão relativa exemplares (V6) da proteína Cry35 (E- LISA) dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[0072] A FIG. 41 mostra os resultados de expressão relativa e- xemplares (V6) de RNA de PAT dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[0073] A FIG. 42A mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) de RNA de Cry34 dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os va- lores médios 0, 2,42, 2,67, e 2,25 respectivamente. A FIG. 42B mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) da proteína Cry34 dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os valores médios 0, 596,94, 2044,73, e 719,18 respectivamente.

[0074] A FIG. 43A mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) de RNA de AAD1 dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os va- lores médios 0, 1,98, 2,68, e 2,03 respectivamente. A FIG. 43B mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) da proteína AAD1 dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os valores médios 0, 2237,54, 5763,88, e 2379,15 respectivamente.

[0075] A FIG. 44A mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) de RNA de YFP dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os va- lores médios 3,59, 0, 2,78, e 1,95 respectivamente. A FIG. 44B mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) da proteína YFP dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os valores médios 1420,69, 251,68, 1154,04, e 706,04 respectivamente.

[0076] A FIG. 45A mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) de RNA de Cry35 dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os va- lores médios 0, 1,12, 3,74, e 3,20 respectivamente. A FIG. 45B mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) da proteína Cry35 dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os valores médios 0, 283,54, 635,83, e 90,97 respectivamente.

[0077] A FIG. 46 mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) de RNA de PAT dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com valores médios 1,56, 0,07, 1,46, e 1,01 respectivamente.

[0078] As FIGS. 47A, 47B, 47C e 47D mostram resultados de ex- pressão proteica exemplares (V10) de YFP, AAD1, Cry34 e Cry35 res- pectivamente dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[0079] As FIGS. 48A, 48B, 48C e 48D mostram a análise estatísti- ca dos resultados de expressão proteica (V10) de YFP, AAD1, Cry34 e Cry35 respectivamente dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718. Os valores médios de YFP (FIG. 48A) são 1033,47, 27,51, 136,18, e 119,06 respectivamen- te. Os valores médios de AAD1 (FIG. 48B) são 80,89, 1323,80, 1544,69, e 802,50 respectivamente. Os valores médios de Cry34 (FIG. 48C) são 0, 246,05, 1089,18, e 769,81 respectivamente. Os valores médios de Cry35 (FIG. 48D) são 0, 90,75, 106,09, e 88,80 respectiva- mente.

[0080] As FIGS. 49A, 49B, 49C, e 49D mostram resultados de ex- pressão proteica exemplares (R3) de YFP, AAD1, Cry34 e Cry35 res- pectivamente dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[0081] As FIGS. 50A, 50B, 50C, e 50D mostram a análise estatís- tica dos resultados de expressão proteica (R3) de YFP, AAD1, Cry34 e Cry35 respectivamente dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718. Os valores médios de YFP (FIG. 50A) são 2589,63, 43,62, 1305,27, e 1727,96 respectiva- mente. Os valores médios de AAD1 (FIG. 50B) são 244,41, 1803,99, 1642,44, e 1279,17 respectivamente. Os valores médios de Cry34 (FIG. 50C) são 422,45, 7258,15, 9285,74, e 7544,75 respectivamente. Os valores médios de Cry35 (FIG. 50D) são 0, 373,35, 441,11, e 348,45 respectivamente. A FIG. 51 mostra os resultados exemplares de Western blot de ex- pressão proteica de Cry34, Cry35 e AAD1 de pDAB108718 e pDAB108717.

[0082] MODO(S) PARA EXECUTAR A INVENÇÃO

[0083] O desenvolvimento de produtos transgênicos está ficando cada vez mais complexo, que requer piramidização de múltiplos trans- genes em um locus único. Tradicionalmente cada transgene normal- mente requer um promotor único para a expressão, portanto múltiplos promotores devem expressar transgenes diferentes dentro de uma pi- lha gênica. Além do aumento do tamanho da pilha gênica, isto fre- quentemente leva ao uso repetido do mesmo promotor para obter ní- veis similares de padrões de expressão de transgenes diferentes con- trolando o mesmo traço. Sabe-se que os construtos multigênicos con- trolados pelo mesmo promotor provocam silenciamento gênico, dessa forma produtos transgênicos tornam-se menos eficazes no campo. O excesso de sítios de ligação do fator de transcrição (TF) devido à repe- tição de promotor pode causar a depleção de TFs endógenos levando a inativação transcricional.

[0084] São fornecidos construtos e métodos que combinam o sis- tema de promotor bidirecional com a organização bicistrônica de ge-

nes em uma ou em ambas as extremidades do promotor, por exemplo, com o uso de uma sequência 2A do vírus Thosea asigna. O proteína 2A, que tem somente 16-20 aminoácidos de extensão, cliva a polipro- teína no seu próprio terminal carboxila. Esta "autoclivagem" ou a pro- priedade "ignorar o ribossomo" da 2A ou do peptídeo 2A símile podem ser usadas para processar poliproteínas artificiais produzidas em plan- tas transgênicas. Em uma modalidade, os genes Cry34 e Cry35 são fundidos em um cassete de expressão gênica, onde os genes YFP (ou Phiyfp) e AAD1 são fundidos em outro cassete de expressão gênica (com uma região de leitura aberta (ORF) única com uma cópia do ge- ne da proteína 2A colocada entre os dois genes em cada combina- ção). Por exemplo, cada um destes cassetes de expressão gênica (ou pares gênicos) pode ser colocado em qualquer extremidade do promo- tor bidirecional para dirigir 4 transgenes usando um promotor único. Dessa forma, os construtos e os métodos fornecidos neste pedido são úteis para evitar o uso repetido do mesmo promotor e reduzir significa- tivamente o tamanho dos construtos comerciais. Além disso, a condu- ção de quatro ou mais genes com um promotor também fornece a ca- pacidade de coexpressar genes controlando um único traço.

[0085] Os promotores vegetais usados para a pesquisa básica ou aplicação biotecnológica são geralmente unidirecionais, dirigindo so- mente um gene que foi fundido na sua extremidade 3’ (a jusante). Mui- tas vezes é necessário introduzir múltiplos genes em plantas para en- genharia metabólica e empilhamento de traço e por isso, se requer ti- picamente que em futuras plantações transgênicas múltiplos promoto- res dirijam a expressão de múltiplos genes. É desejável projetar estra- tégias que possam salvar o número de promotores implantados e permitir a expressão corregulada simultânea para piramidização gêni- ca. Em alguma modalidade, os promotores bidirecionais fornecidos podem dirigir a transcrição de múltiplas unidades de transcrição, inclu-

indo sequências de RNAi, de miRNA artificial ou de RNA em alça- grampo.

[0086] Uma abordagem para reduzir o número de promotores im- plantados é o uso de interruptores críticos ativadores da transcrição que podem dirigir a transcrição em ambas as direções. Estes promoto- res são chamados promotores bidirecionais. Os promotores sintéticos podem ser projetados para limitar o nível de homologia entre múltiplos promotores para ser usados na engenharia genética em plantas de cultura, que podem evitar o silenciamento gênico baseado em homo- logia. Os promotores bidirecionais artificialmente projetados podem ser instrumentos valiosos no desenvolvimento de plantas transgênicas. A função bidirecional de promotores em plantas foi relatada em alguns casos, incluindo promotores de CaMV 35S e o promotor de manopina sintase (mas). Entretanto, a conveniência de usar tais promotores não foi examinada para a expressão predizível, estável e simultânea de genes nas duas direções.

[0087] Outro método para expressão coordenada de múltiplos ge- nes deve codificar uma região de leitura aberta única em um precursor poliproteico contendo motivo interveniente curto com propriedades de auto processamento entre duas sequências codificantes. O processa- mento autocatalítico do precursor poliproteico leva à liberação de múl- tiplas proteínas independentes resultando na sua expressão coorde- nada sincronizada. Uma sequência peptídica 2A auto-hidrolizante foi usada tanto no sistema vegetal quanto animal para expressar dois transgenes. A sequência peptídica 2A é utilizada por vários vírus co- nhecidos e consiste de 16-20 aminoácidos. Esta sequência peptídica 2A autocliva-se (ou ignora o ribossomo) cotraducionalmente pela mo- dificação da atividade do ribossomo para permitir a hidrólise de 2A en- tre duas proteínas resultando na liberação de dois produtos proteicos.

[0088] São fornecidos construtos e métodos combinando a abor-

dagem de promotor bidirecional com a utilização do processamento de poliproteína usando que motivos intervenientes sintéticos, onde a ex- pressão de pelo menos 4 transgenes usando um promotor único pode ser prontamente alcançada. Os genes de Cry34 e Cry35, e os genes de YFP (ou Phiyfp) e AAD1 foram fundidos como cassetes de expres- são gênica ou pares gênicos em regiões de leitura aberta (ORF) úni- cas com uma cópia do gene da proteína 2A colocado entre os genes. Os pares gênicos podem ser colocados em qualquer extremidade do promotor bidirecional para dirigir quatro transgenes usando um promo- tor único. Os construtos e/ou os métodos fornecidos neste pedido são úteis para evitar o uso repetido do mesmo promotor evitando proble- mas potenciais de silenciamento transgênico. Além disso, esta abor- dagem de desenho de transgene pode reduzir significativamente o ta- manho das pilhas transgênicas contendo múltiplos transgenes. A con- dução de quatro ou mais genes com um promotor também fornece a capacidade de coexpressar genes controlando um traço único assegu- rando a eficácia a longo prazo de produtos transgênicos.

[0089] O desenvolvimento de plantas transgênicas está ficando cada vez mais complexo, e tipicamente requer o empilhamento de múltiplos transgenes em um locus único. Ver Xie e outros. (2001) Nat. Biotechnol. 19 (7):677-9. Uma vez que cada transgene normalmente requer um promotor único para expressão, múltiplos promotores de- vem expressar transgenes diferentes dentro de uma pilha gênica. A- lém disso, para aumentar o tamanho da pilha gênica, isto frequente- mente leva ao uso repetido do mesmo promotor para obter níveis simi- lares de padrões de expressão de transgenes diferentes. Esta aborda- gem muitas vezes é problemática, já que a expressão de múltiplos ge- nes dirigidos pelo mesmo promotor pode levar ao silenciamento gênico ou HBGS. Um excesso do sítios de ligação a fator de transcrição (TF) competindo em promotores repetidos pode causar a depleção de TFs endógenos e levar regulação transcricional negativa. O silenciamento de transgenes provavelmente afetará indesejavelmente o desempenho de uma planta transgênica produzida para expressar os transgenes. As sequências repetitivas dentro de um transgene podem levar à re- combinação gênica homóloga intra locus resultando em rearranjos po- linucleotídicos.

[0090] Os promotores vegetais usados para a pesquisa básica ou aplicação biotecnológica são geralmente unidirecionais, e regulam somente um gene que tenha sido fundido na sua extremidade 3’ (a ju- sante). Para produzir plantas transgênicas com vários traços ou carac- terísticas desejadas, seria útil reduzir o número de promotores que são implantados para dirigir a expressão dos transgenes que codificam os traços e características desejados. Muitas vezes é necessário introdu- zir múltiplos transgenes em plantas para engenharia metabólica e em- pilhamento de traço, por meio disso exigindo múltiplos promotores pa- ra dirigir a expressão de múltiplos transgenes. Pelo desenvolvimento de um promotor bidirecional sintético único que possa dirigir a expres- são de dois transgenes que flanqueiam o promotor, os números totais de promotores necessários para o desenvolvimento de plantações transgênicas podem ser reduzidos, por meio disso reduzindo o uso repetido do mesmo promotor, reduzindo o tamanho dos construtos transgênicos e/ou reduzindo a possibilidade de HBGS.

[0091] As modalidades neste pedido utilizam um processo em que um promotor unidirecional de um gene ubiquitina 1 de milho (por e- xemplo, ZmUbi1) é usado para projetar um promotor bidirecional sinté- tico, tal que um promotor possa dirigir a expressão de dois genes, um em cada extremidade do promotor. Os processos como utilizados nes- te pedido podem compreender a identificação do elemento promotor principal mínimo Ubi1 (minUbi1P) de um gene ZmUbi1 e a engenharia deste elemento em novos contextos para construir certos promotores bidirecionais sintéticos. Os promotores bidirecionais sintéticos, tais que possam ser criados por um processo de acordo com algumas modali- dades da invenção, podem permitir àqueles na técnica empilhar trans- genes em células vegetais e plantas reduzindo o uso repetido do mesmo promotor e reduzindo o tamanho de construtos transgênicos. Além disso, a regulação da expressão de dois genes com um promotor bidirecional sintético único também pode fornecer a capacidade de co- expressar os dois genes sob as mesmas condições, tal que possam ser úteis, por exemplo, quando cada um dos dois genes contribui para um traço único no hospedeiro. O uso de promotores bidirecionais em plantas foi relatado em alguns casos, incluindo os promotores CaMV (Barfield e Pua (1991) Plant Cell Rep. 10 (6-7):308-14; Xie e outros. (2001), e os promotores do promotor de manopina sintase (mas) (Vel- ten e outros. (1984) EMBO J. 3 (12):2723-30; Langridge e outros. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23).

[0092] O início de transcrição e a modulação da expressão gênica em genes vegetais são dirigidos por uma variedade de elementos de sequência de DNA que são coletivamente arranjados dentro do promo- tor. Os promotores eucarióticos consistem do elemento promotor prin- cipal mínimo (minP), e ainda sequências reguladoras a montante (URSs). O elemento promotor principal é um trecho mínimo da se- quência de DNA contígua que é suficiente para dirigir o início exato da transcrição. Os promotores principais em plantas também compreen- dem regiões canônicas associadas com o início da transcrição, como caixas CAAT e TATA. O elemento de caixa TATA é normalmente loca- lizado aproximadamente 20 a 35 nucleotídeos a montante do sítio de início de transcrição.

[0093] A ativação do minP é dependente do URS, ao qual várias proteínas se ligam e posteriormente interagem com o complexo de iní- cio de transcrição. URSs compreendem sequências de DNA que de-

terminam o padrão de expressão espaço-temporal de um promotor que compreende o URS. A polaridade de um promotor muitas vezes é determinada pela orientação do minP, enquanto o URS é bipolar (isto é, funciona independente da sua orientação). Por exemplo, os promo- tores CaMV 35S polares unidirecionais sintéticos podem ser converti- dos em um promotor bidirecional fundindo um minP na extremidade 5’do promotor na orientação oposta. Ver, por exemplo, Xie e outros. (2001) Nat. Biotechnol. 19 (7):677-9.

[0094] Determinadas abreviaturas descritas são listadas na Tabela

1. Tabela 1. As abreviaturas usadas na revelação Frase Abreviação ácido bicinconínico BCA vírus do mosaico da couve-flor CaMV peptídeo de trânsito para cloroplasto CTP silenciamento gênico baseado em homologia HBGS promotor principal mínimo ZmUbi1 minUbi1P Amplificação de ligação a oligo OLA salina tamponada com fosfato PBS salina tamponada com fosfato com Tween 20 PBST 0,05% Reação de polimerase em cadeia PCR amplificação por círculo rolante RCA PCR via transcriptase reversa RT-PCR extensão de iniciador de nucleotídeo único SNuPE sequência regulatória a montante URS gene Ubiquitina-1 de Zea mays ZmUbi1

[0095] Em exemplos específicos de algumas modalidades, ele- mentos modificados de um promotor de Ubi1 de milho (ZmUbi1) deri- vado da linhagem pura de Z. mays, B73, são usados para engendrar promotores bidirecionais sintéticos que podem funcionar em plantas para fornecer características de controle de expressão que são únicas em relação a promotores bidirecionais anteriormente disponíveis. Este promotor de ZmUbi1 originalmente derivado de B73 compreende se- quências localizadas no genoma de milho dentro de aproximadamente 899 bases 5’ do sítio de início de transcrição, e ainda dentro de apro- ximadamente 1093 bases 3’ do sítio de início de transcrição. Christen- sen e outros. (1992) Plant Mol. Biol. 18 (4):675-89 (descrição de um gene ZmUbi1 B73). Um promotor de ZmUbi1 modificado derivado de B73 que é usado em alguns exemplos é um promotor de aproximada- mente 2 kb que contém uma caixa TATA; dois elementos consenso de sobreposição de choque térmico; uma sequência líder de 82 ou 83 nu- cleotídeos (dependendo da fita de referência) imediatamente adjacen- te ao sítio de início de transcrição, que é referido neste pedido como éxon de ZmUbi1; e um íntron de 1015-1016 nucleotídeos (ver a FIG. 1 por exemplo). Outras variantes do promotor de ubiquitina de milho de- rivadas de espécies Zea e genótipos de Zea mays podem exibir alta conservação de sequência em torno do elemento minP consistindo do elemento TATA e dos elementos consenso de choque térmico a mon- tante. Dessa forma, as modalidades da invenção são exemplificadas pelo uso desta região curta altamente conservada (~200 nt) (por e- xemplo, SEQ ID NO: 1) de um promotor de ZmUbi1 como um elemen- to promotor principal mínimo para construção de promotores vegetais bidirecionais sintéticos.

[0096] Como usado neste pedido, os artigos, "a", "o", "um" e "uma" incluem referências plurais a menos que o contexto claramente e ine- quivocamente dite de outra maneira.

[0097] Como usada neste pedido, a frase "retrocruzamento" refe- re-se a um processo no qual um criador cruza a progênie híbrida de volta comum dos parentais, por exemplo, uma primeira geração híbri-

da F1 com um dos genótipos parentais do híbrido F1.

[0098] Como usada neste pedido, a frase "íntron" refere-se a qual- quer sequência de ácido nucleico compreendida em um gene (ou a sequência nucleotídica de interesse expressa) que é transcrita mas não traduzida. O íntron é diferente da sequência líder de extremidade 5’ não traduzida que não é considerada como parte de um gene. Os íntrons incluem a sequência de ácido nucleico não traduzida dentro de uma sequência expressa de DNA, bem como a sequência correspon- dente em suas moléculas de RNA transcritas.

[0099] Como usada neste pedido, a frase "isolado" refere-se ao componente biológico (incluindo um ácido nucleico ou proteína) que tenha sido substancialmente separado, produzido em separado ou pu- rificado a partir de outros componentes biológicos na célula do orga- nismo em que o componente naturalmente ocorre (isto é, outro DNA cromossômico e extracromossômico e RNA e proteínas), efetuando uma modificação química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado a partir de um cromossomo pela quebra de ligações químicas que conectam o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo). As moléculas de ácido nucleico e as proteí- nas que foram "isoladas" incluem moléculas de ácido nucleico e prote- ínas purificadas por métodos de purificação padrão. A frase "isolada" também abrange ácidos nucleicos e proteínas preparados por expres- são recombinante em uma célula hospedeira, bem como moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos quimicamente sintetizados.

[00100] Como usada neste pedido, a frase "expressão gênica" refe- re-se a um processo pelo qual a informação codificada de uma unida- de transcricional de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA ge- nômico) é convertida em uma parte operacional, não operacional, ou estrutural de uma célula, muitas vezes incluindo a síntese de uma pro- teína. A expressão gênica pode ser influenciada por sinais externos;

por exemplo, a exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou reduz a expressão gênica. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer lugar na via de DNA a RNA à proteína. A regulação da expressão gênica ocorre, por exem- plo, por controles que atuam sobre transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias co- mo mRNA, ou por meio de ativação, inativação, compartimentação ou degradação de moléculas proteicas específicas após terem sido feitas, ou por combinações destas. A expressão gênica pode ser medida ao nível de RNA ou ao nível proteico por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot, ou em ensaio(s) de atividade proteica in vivo, in vitro ou in situ.

[00101] Como usada neste pedido, a frase "silenciamento gênico baseado em homologia" (HBGS) refere-se a um termo genérico que inclui tanto o silenciamento gênico transcricional quanto o silenciamen- to gênico pós-transcricional. O silenciamento de um locus alvo por um locus de silenciamento não ligado pode resultar da inibição de trans- crição (silenciamento gênico transcricional; TGS) ou degradação de mRNA (silenciamento gênico pós-transcricional; PTGS), devido à pro- dução de RNA de fita dupla (dsRNA) correspondendo ao promotor ou sequências transcritas, respectivamente. O envolvimento de compo- nentes celulares distintos em cada processo sugere que TGS e PTGS induzidos por dsRNA provavelmente resultem da diversificação de um mecanismo comum antigo. Entretanto, uma comparação estrita de TGS e PTGS tem sido difícil de alcançar porque geralmente depende da análise do silenciamento de loci distintos. Um locus de transgene único pode ser descrito levar tanto a TGS como a PTGS, devido à produção de dsRNA correspondente ao promotor e sequências trans- critas de genes alvo diferentes. Ver, por exemplo, Mourrain e outros. (2007) Planta 225:365-79. É provável que os siRNAs sejam as verda-

deiras moléculas que provocam TGS e PTGS em sequências homólo- gas: os siRNAs seriam neste modelo os disparadores de silenciamento e metilação de sequências homólogas em cis e em trans através da extensão da metilação de sequências transgênicas no promotor endó- geno.

[00102] Como usada neste pedido, a frase "molécula de ácido nu- cleico" (ou "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo") refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos, que podem incluir tanto fitas antissenso como senso de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e po- límeros mistos do acima mencionado. Um nucleotídeo pode referir-se a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer tipo do nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico" como usado neste pedido é sinônima a "ácido nucleico" e "polinucleo- tídeo." Uma molécula de ácido nucleico tem normalmente pelo menos bases de extensão, a menos que de outra maneira especificado. O termo pode referir-se a uma molécula de RNA ou DNA do comprimen- to indeterminado. O termo inclui formas de DNA de fita simples e du- pla. Uma molécula de ácido nucleico pode incluir tanto nucleotídeos que ocorrem naturalmente como modificados ligados entre si por liga- ções nucleotídicas que ocorrem naturalmente e/ou que não ocorrem naturalmente.

[00103] As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente ou podem conter bases nucleotídi- cas não naturais ou derivatizadas, como será prontamente apreciado por aqueles especialistas na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nu- cleotídeos que ocorrem naturalmente por um análogo, modificações internucleotídeos (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriesteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; liga- ções carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.;

porções pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por e- xemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquilantes; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.) . O termo "molécula ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de fita simples, fita dupla, parcial- mente duplexada, triplexada, em grampo, circular e passível de circu- larização.

[00104] A transcrição prossegue de uma maneira 5’ a 3’ ao longo de uma fita de DNA. Isto significa que o RNA é feito pela adição se- quencial de ribonucleotídeo-5’-trifosfatos ao terminal 3’ terminal da ca- deia crescente (com uma eliminação requerida do pirofosfato). Em uma molécula de ácido nucleico linear ou circular, os elementos dis- cretos (por exemplo, sequências nucleotídicas particulares) podem ser mencionadas como estando "a montante" em relação a um elemento adicional se forem ligadas ou estivessem ligadas ao mesmo ácido nu- cleico na direção 5’ daquele elemento. Similarmente, os elementos discretos podem estar "a jusante" em relação a um elemento adicional se forem ou estivessem ligadas ao mesmo ácido nucleico na direção 3’ daquele elemento.

[00105] Como usada neste pedido, a frase "posição da base" refe- re-se à posição de uma dada base ou resíduo de nucleotídeo dentro de um ácido nucleico designado. O ácido nucleico designado pode ser definido pelo alinhamento (veja abaixo) com um ácido nucleico de refe- rência.

[00106] Como usada neste pedido, a frase "hibridização" refere-se a um processo onde os oligonucleotídeos e seus análogos hibridizam pela ligação de hidrogênio, que inclui a ligação de hidrogênio de Wat- son-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversa, entre bases complemen- tares. Geralmente, as moléculas de ácido nucleico consistem de bases nitrogenadas que são pirimidinas (citosina (C), uracila (U) e timina (T))

ou purinas (adenina (A) e guanina (G)). Estas bases nitrogenadas for- mam ligações de hidrogênio entre uma pirimidina e uma purina, e a ligação da pirimidina à purina é mencionada "como pareamento de ba- ses." Mais especificamente, A ligará hidrogênio a T ou U, e G vai se ligar ao C. "Complementar" refere-se à pareamento de bases que o- corre entre duas sequências de ácido nucleico distintas ou duas regi- ões distintas da mesma sequência de ácido nucleico.

[00107] Como usado neste pedido, as frases "especificamente hi- bridizáveis" e "especificamente complementar" referem-se a um grau suficiente de complementaridade tal que ligação estável e específica ocorre entre o oligonucleotídeo e RNA ou DNA alvo. O oligonucleotí- deo não precisa ser 100% complementar à sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável. Um oligonucleotídeo é especifica- mente hibridizável quando a ligação do oligonucleotídeo à molécula alvo de DNA ou RNA interfere na função normal do DNA ou RNA alvo, e há grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do oligonucleotídeo a sequências não alvo sob condições onde a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições fisi- ológicas no caso de em ensaios ou sistemas in vivo. Tal ligação é mencionada como hibridização específica.

[00108] As condições de hibridização que resultam nos graus parti- culares de estringência variarão dependendo da natureza do método de hibridização escolhido e da composição e do comprimento das se- quências de ácido nucleico de hibridização. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg2+) do tampão de hibridização contribuirão para a estringência da hibridização, embora o número de lavagens também influencie na estringência. Os cálculos quanto às condições de hibridização requeri- das para alcançar graus particulares de estringência são discutidos em Sambrook e outros. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, cap. 9 e 11.

[00109] Como usada neste pedido, a frase "condições estringentes" engloba condições sob as quais a hibridização somente ocorrerá se houver incompatibilidade de menos de 50% entre a molécula de hibri- dização e o DNA alvo. As "condições estringentes" incluem níveis par- ticulares adicionais de estringência. Dessa forma, como usado neste pedido, condições de "estringência moderada" são aquelas sob as quais as moléculas com incompatibilidade de sequência de mais de 50% não hibridizarão; condições de "alta estringência" são aquelas sob as quais as sequências com incompatibilidade de mais de 20% não hibridizarão; e condições de "estringência muito altas" são aquelas sob os quais as sequências com incompatibilidade de mais de 10% não hibridizarão.

[00110] Em modalidades particulares, as condições estringentes podem incluir a hibridização a 65 °C, seguida de la vagem a 65 °C com SSC 0,1x / SDS 0,1% por 40 minutos.

[00111] As seguintes são condições de hibridização representati- vas, não limitantes:

[00112] Estringência muito Alta: Hibridização em tampão SSC 5x a 65 °C por 16 horas; lavagem duas vezes em tampão SS C 2x à tempe- ratura ambiente por 15 minutos cada; e lavagem duas vezes em tam- pão SSC 0,5x a 65 °C por 20 minutos cada.

[00113] Alta Estringência: Hibridização em tampão SSC 5x-6x a 65- 70 °C por 16-20 horas; lavagem duas vezes em tampão SSC 2x à temperatura ambiente por 5-20 minutos cada; e lavagem duas vezes em tampão SSC 1x a 55-70 °C por 30 minutos cada.

[00114] Estringência moderada: Hibridização em tampão SSC 6x à temperatura ambiente a 55 °C por 16-20 horas; lavag em pelo menos duas vezes em tampão SSC 2x-3x à temperatura ambiente a 55 °C por 20-30 minutos cada.

[00115] Em modalidades particulares, as moléculas de ácido nucle- ico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob con- dições de estringência de hibridização muito altas. Nestas e em moda- lidades adicionais, as moléculas de ácido nucleico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de alta estrin- gência de hibridização. Nestas e em modalidades adicionais, as molé- culas de ácido nucleico especificamente hibridizáveis podem perma- necer ligadas sob condições de estringência de hibridização modera- das.

[00116] Como usada neste pedido, a frase "oligonucleotídeo" refe- re-se a um polímero de ácido nucleico curto. Os oligonucleotídeos po- dem ser formados pela clivagem de segmentos de ácido nucleico mais longos, ou por precursores da polimerização de nucleotídicos individu- ais. Os sintetizadores automatizados permitem a síntese de oligonu- cleotídeos até várias centenas de pares de base de extensão. Como os oligonucleotídeos podem ligar-se a uma sequência nucleotídica complementar, podem ser usados como sondas para detectar DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucle- otídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplificação de pequenas sequências de DNA. Em PCR, o oligonucleotídeo é tipi- camente referido como um "iniciador", que permite a uma DNA polime- rase estender o oligonucleotídeo e replicar a fita complementar.

[00117] Como usada neste pedido, a frase "identidade de sequên- cia" ou "identidade", refere-se a um contexto onde duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídicas, podem referir-se aos resíduos nas duas sequências que são as mesmas quando alinhadas para a cor- respondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.

[00118] Como usada neste pedido, a frase "porcentagem da identi- dade de sequência" refere-se ao valor determinado pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico e sequências de aminoácidos) sobre uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em compara- ção com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. A porcenta- gem é calculada pela determinação do número de posições nas quais o resíduo de aminoácido ou nucleotídeo idêntico ocorre em ambas às sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produ- zir a porcentagem de identidade de sequência.

[00119] Os métodos para alinhar sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinha- mento são descritos em, por exemplo: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Hig- gins e Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet e outros. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Hu- ang e outros. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson e outros. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana e outros. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia podem ser en- contrados, por exemplo, em Altschul e outros. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

[00120] O Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul e outros. (1990)) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (Bethesda, MD), e na inter- net, para uso em conexão a vários programas de análise de sequên-

cia. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência u- sando este programa está disponível na internet na seção de "ajuda" de BLAST™. Para comparações de sequências de ácido nucleico, a função "Blast 2 sequências" do programa BLAST ™ (Blastn) pode ser empregada usando os parâmetros pré-configurados. As sequências de ácido nucleico com a maior similaridade com as sequências de refe- rência mostrarão a identidade de porcentagem crescente quando ava- liadas por este método.

[00121] Como usada neste pedido, a frase "operacionalmente liga- da" refere-se a um contexto onde a primeira sequência de ácido nucle- ico é operacionalmente ligada a uma segunda sequência de ácido nu- cleico quando a primeira sequência de ácido nucleico está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por e- xemplo, um promotor é operacionalmente ligado com uma sequência codificante quando o promotor afeta a transcrição ou a expressão da sequência codificante. Quando recombinantemente produzidas, as se- quências de ácido nucleico operacionalmente ligadas são geralmente contíguas e, onde necessárias para juntar duas regiões que codificam proteína, na mesma fase de leitura. Entretanto, os elementos não têm de ser contíguos para estar operacionalmente ligados.

[00122] Como usada neste pedido, a frase "promotor" refere-se a uma região de DNA que geralmente está localizada a montante (em direção a região 5’ de um gene) que é necessário para a transcrição. Os promotores podem permitir a ativação ou a repressão própria do gene que controlam. Um promotor pode conter sequências específicas que são reconhecidas por fatores de transcrição. Estes fatores podem ligar-se às sequências de DNA do promotor e resultar no recrutamento da RNA polimerase, uma enzima que sintetiza RNA a partir da região codificante do gene.

[00123] Como usada neste pedido, a frase "transforma" ou "trans-

duz" refere-se a um processo onde um vírus ou vetor transferem molé- culas de ácido nucleico para uma célula. Uma célula é "transformada" por uma molécula de ácido nucleico "transduzida" na célula quando a molécula de ácido nucleico é estavelmente replicada pela célula, pela incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular ou pela replicação epissomal. Como usado neste pedido, o termo "transforma- ção" engloba todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula. Exemplos incluem, mas não são limitados a: transfecção com vetores virais; transformação com vetores plasmidiais; eletroporação (Fromm e outros. (1986) Natu- re 319:791-3); lipofecção (Felgner e outros. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); microinjeção (Mueller e outros. (1978) Célula 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley e outros. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); entrada de DNA direta; transformação mediada por fibras; e bombardeio com microprojétil (Klein e outros. (1987) Nature 327:70).

[00124] Como usada neste pedido, a frase "transgene" refere-se a uma sequência exógena de ácido nucleico. Em um exemplo, um transgene é uma sequência gênica (por exemplo, um gene de resis- tência a herbicida), um gene que codifica um composto industrialmente ou farmaceuticamente útil ou gene que codifica um traço agrícola de- sejável. Ainda em outro exemplo, o transgene é uma sequência de á- cido nucleico antissenso, em que a expressão da sequência de ácido nucleico antissenso inibe a expressão de uma sequência de ácido nu- cleico alvo. Um transgene pode conter sequências reguladoras opera- cionalmente ligadas ao transgene (por exemplo, um promotor). Em al- gumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico de interesse é um transgene. Entretanto, em outras modalidades, uma sequência de ácido nucleico de interesse é uma sequência de ácido nucleico endó- gena, em que as cópias genômicas adicionais da sequência de ácido nucleico endógena são desejadas, ou uma sequência de ácido nuclei- co que está na orientação antissenso em relação à sequência de uma molécula de ácido nucleico alvo no organismo hospedeiro.

[00125] Tão usada neste pedido, a frase "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico introduzida em uma célula, por meio disso produzindo uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucleico que lhe permitam replicar na célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Exemplos incluem, mas não são limi- tados a, um plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago ou vírus que transpor- te DNA exógeno em uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, moléculas antissenso, e/ou genes marcadores selecioná- veis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, por meio disso fa- zendo a célula expressar as moléculas de ácido nucleico e/ou proteí- nas codificadas pelo vetor. Um vetor pode incluir opcionalmente mate- riais para auxiliar na realização da entrada da molécula de ácido nucle- ico na célula (por exemplo, um lipossoma).

[00126] Como usada neste pedido, a frase "planta" inclui plantas e partes vegetais incluindo, mas não limitadas a células vegetais e teci- dos vegetais tais como folhas, troncos, raízes, flores, pólen e semen- tes. A classe de plantas que podem ser usadas na presente invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas superiores e inferi- ores acessíveis à mutagênese incluindo angiospermas (plantas mono- cotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias e algas multicelulares. Dessa forma, "planta" inclui plantas dicotiledôneas e plantas monocotiledôneas. Exemplos de plantas dicotiledôneas inclu- em tabaco, Arabidopsis, soja, tomate, mamão, canola, girassol, algo- dão, alfafa, batata, videira, guandu, ervilha, Brassica, grão de bico, be- terraba, colza, melancia, melão, pimentão, amendoim, abóbora, raba- nete, espinafre, abóbora, brócolis, repolho, cenoura, couve-flor, aipo,

repolho chinês, pepino, berinjela e alface. Exemplos de plantas mono- cotiledôneas incluem milho, arroz, trigo, cana-de-açúcar, cevada, cen- teio, sorgo, orquídeas, bambu, banana, taboas, lírios, aveia, cebola, painço e triticale.

[00127] Como usada neste pedido, a frase "material vegetal" refere- se a folhas, troncos, raízes, flores ou partes da flor, frutas, pólen, óvu- los, zigotos, sementes, estacas, culturas celulares ou de tecido, ou qualquer outra parte ou produto de uma planta. Em alguma modalida- de, o material vegetal inclui o cotilédone e a folha.

[00128] Como usada neste pedido, a frase "interruptor de tradução" refere-se a um mecanismo na extremidade de um gene permitindo a tradução de um gene a jusante imediato. O mecanismo do interruptor de tradução pode funcionar ao nível de ácido nucleico (por exemplo, sítio de entrada de ribossomo interno (IRES) viral ou eucariótico, um sítio de splicing alternativo ou um sítio de clivagem de ribozima) ou ao nível de peptídeo/proteína (por exemplo, um peptídeo 2A, um peptídeo 2A símile, um peptídeo inteína ou um sítio de clivagem de protease).

[00129] Estes mecanismos de interruptor de tradução ao nível de ácido nucleico ou ao nível de peptídeo/proteína são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, li, Z., H. M. Schumacher, e outros. (2010) J Biotechnol 145 (1): 9-16; Chen, Y., K. Perumal, e outros. (2000) Gene Expr 9 (3): 133-143; Dinkova, T. D., H. Zepeda, e outros. (2005) Plant J 41 (5): 722-731; Dorokhov, Y. L., M. V. Skulachev, e outros. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99 (8): 5301-5306; Fernandez-Miragall, O. e C. Hernandez (2011) PLoS One 6 (7): e22617; Groppelli, E., G. J. Belsham, e outros. (2007) J Gen Virol 88(Pt 5): 1583-1588; Ai, S. H., Y. S. Liang, e outros. (2010) Plant Biotechnol J 8(8): 928-938; Karetnikov, A. e K. Lehto (2007) J Gen Virol 88 (Pt 1): 286-297; Karetnikov, A. e K. Lehto (2008) Virology 371 (2): 292-308; Khan, M. A., H. Yumak, e outros. (2009) J Biol Chem 284

(51): 35461-35470; e Koh, D. C., S. M. Wong, e outros. (2003) J Biol Chem 278 (23): 20565-20573, o conteúdo dos quais são por meio deste incorporados por referência em suas totalidades. Os construtos de expressão multi-gênica contendo inteínas modificadas foram descri- tos nas Patente U.S. Nos. 7.026.526 e 7.741.530, bem como no Pedi- do de Patente U.S. 2008/0115243.

[00130] Como usada neste pedido, a frase "marcador selecionável" ou "gene marcador selecionável" refere-se a um gene que é opcional- mente usado na transformação vegetal, por exemplo, para proteger as células vegetais de um agente seletivo ou fornecer resistên- cia/tolerância a um agente seletivo. Somente aquelas células ou plan- tas que recebem um marcador selecionável funcional são capazes de se dividir ou crescer sob condições tendo um agente seletivo. Exem- plos de agentes seletivos podem incluir, por exemplo, antibióticos, in- cluindo espectinomicina, neomicina, canamicina, paromomicina, gen- tamicina e higromicina. Estes marcadores selecionáveis incluem o ge- ne da neomicina fosfotransferase (npt II), que expressa uma enzima conferindo resistência ao antibiótico canamicina e genes relacionados ao antibiótico neomicina, paromomicina, gentamicina e G418 ou o ge- ne da higromicina fosfotransferase (hpt), que expressa uma enzima que confere resistência à higromicina. Outros genes marcadores sele- cionáveis podem incluir genes que codificam resistência a herbicida incluindo a resistência ou a sensibilidade a Bar (resistência contra BASTA® (glifosinato de amônio), ou fosfinotricina (PPT)), acetolactato sintase (ALS, resistência contra inibidores como sulfonilureias (SUs), imidazolinonas (IMIs), triazolopirimidinas (TPs), pirimidinil oxibenzoa- tos (POBs), e sulfonilamino carbonil triazolinonas que impedem a pri- meira etapa na síntese dos aminoácidos de cadeia ramificada), glifosa- to, 2,4-D e metal. A frase "positiva para o marcador" refere-se a plan- tas que foram transformadas para incluir o gene marcador selecioná-

vel.

[00131] Vários marcadores selecionáveis ou detectáveis podem ser incorporados no vetor de expressão escolhido para permitir a identifi- cação e seleção de plantas transformadas ou transformantes. Muitos métodos estão disponíveis para confirmar a expressão de marcadores de seleção em plantas transformadas, incluindo, por exemplo, o se- quenciamento de DNA e PCR (reação de polimerase em cadeia), So- thern blotting, RNA blotting, métodos imunológicos para a detecção de uma proteína expressa a partir do vetor, por exemplo, a proteína pre- cipitada que medeia a resistência à fosfinotricina ou outras proteínas como genes repórter β-glucuronidase (GUS), luciferase, proteína fluo- rescente verde (GFP), DsRed, β-galactosidase, cloranfenicol acetil- transferase (CAT), fosfatase alcalina, e similares (Ver Sambrook, e ou- tros., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001).

[00132] Os genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores selecionáveis incluem genes que codificam a resistência a antibiótico, como os que codificam neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromi- cina fosfotransferase (HPT) bem como genes que conferem resistên- cia a compostos herbicidas. Os genes de resistência a herbicida ge- ralmente codificam uma proteína alvo modificada insensível ao herbi- cida ou a uma enzima que degrada ou detoxifica o herbicida na planta antes que possa atuar. Por exemplo, a resistência ao glifosato foi obti- da pelo uso de genes codificantes das enzimas alvo mutantes, 5 enol- piruvilshikimato-3-fosfato-sintase (EPSPS). Os genes e os mutantes de EPSPS foram descritos nas patente U.S. Nos. 4.940.835,

5.188.642, 5.310.667, 5.633.435, 5.633.448 e 6.566.587. A resistência ao glifosinato de amônio, bromoxinil, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) foi obtida usando genes bacterianos que codificam fosfinotricina acetil-

transferase, uma nitrilase ou uma monooxigenase 2,4- diclorofenoxiacetato, que detoxifica os respectivos herbicidas. As en- zimas/genes de resistência/tolerância a glifosinato foram descritas nas patentes U.S. Nos. 5.273.894, 5.276.268, 5.550.318 e 5.561.236. En- zimas/genes para resistência a 2,4-D foram anteriormente descritos nas patentes U.S. Nos. 6.100.446 e 6.153.401, bem como pedidos de patentes US 2009/0093366 e WO 2007/053482. Enzimas/genes de nitrilase foram anteriormente descritos na patente U.S. No. 4.810.648.

[00133] Outros herbicidas podem inibir o ponto de crescimento ou meristema, incluindo imidazolinona ou sulfonilureia, e os genes de re- sistência/tolerância de acetohidroxiacido sintase (AHAS) e sintase ace- tolactato (ALS) para estes herbicidas foram descritos. Os genes e os mutantes para AHAS e mutantes foram descritos nas patentes U.S. Nos. 4.761.373, 5.304.732, 5.331.107, 5.853.973, e 5.928.937. Os ge- nes e os mutantes de ALS foram descritos nas patentes U.S. Nos.

5.013.659 e 5.141.870.

[00134] Os genes de resistência a glifosato incluem os genes mu- tantes 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPs) (através da in- trodução de ácidos nucleicos recombinantes e/ou várias formas de mutagênese in vivo de genes EPSPs nativos), genes aroA e genes de glifosato acetil transferase (GAT), respectivamente). Os genes de re- sistência a outros compostos fosfono incluem o glifosinato (genes fos- finotricina acetil transferase (PAT) de espécies Streptomyces, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromogenes), e ácidos piridinóxi ou fenóxi propiônicos e ciclohexonas (genes que codi- ficam o inibidor de ACCase). Os genes de resistência/tolerância a her- bicida acetil coenzima A carboxilase (ACCas) foram descritos nas pa- tentes U.S. 5.162.602 e 5.498.544.

[00135] Uma molécula de DNA que codifica um gene mutante aroA pode ser obtida sob o número de acesso ATCC 39256, e a sequência nucleotídica do gene mutante é descrita na Pat. U.S. No. 4.769.061 por Comai, pedido de patente Europeia No. 0 333 033 por Kumada e outros., e Pat. U.S. No. 4.975.374 por Goodman e outros., revelando sequências nucleotídicas de genes de glutamina sintetase que confe- rem a resistência a herbicidas como L-fosfinotricina. A sequência nu- cleotídica de um gene PAT é fornecida no pedido de patente Europeia No. 0 242 246 por Leemans e outros. Também DeGreef e outros., Bi- o/Technology 7:61 (1989), descreve a produção de plantas transgêni- cas que expressam a genes quiméricos em barra que codificantes da atividade de PAT. Exemplos de genes que conferem resistência a áci- dos fenóxi propriônicos e ciclohexonas, incluindo setoxidim e haloxifop, são os genes Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3 descritos por Marshall e outros., Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992). Os genes GAT capazes de conferir resistência ao glifosato são descritos em WO 2005012515 por Castelo e outros. Os genes que conferem resistência a 2,4-D, fop e herbicidas de auxina piridilóxi são descritos em WO 2005107437 e no pedido de patente U.S. No. de Ser. 11/587.893.

[00136] Outros herbicidas podem inibir a fotossíntese, incluindo tri- azina (genes psbA e 1s+) ou benzonitrila (gene nitrilase). Przibila e outros., Plant Cell 3:169 (1991), descreve a transformação de Chlamy- domonas com plasmídeos que codificam genes psbA mutantes. As sequências nucleotídicas para genes nitrilase são reveladas na Pat. U.S. No. 4.810.648 por Stalker, e as moléculas de DNA contendo es- tes genes estão disponíveis sob os Nos. de Acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e a expressão do DNA que codifica uma glutationa S-transferase é descrito por Hayes e outros., Biochem. J. 285:173 (1992).

[00137] Para os fins da presente invenção, os genes marcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados a genes que que codifi- cam: neomicina fosfotransferase II (Fraley e outros. (1986) CRC Criti-

cal Reviews in Plant Science, 4:1-25); cianamida hidratase (Maier- Greiner e outros. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4250-4264); aspartato quinase; dihidrodipicolinato sintase (Perl e outros. (1993) Bi- o/Technology, 11:715-718); triptofano decarboxilase (Goddijn e outros. (1993) Plant Mol. Bio., 22:907-912); dihidrodipicolinato sintase e aspar- tato quinase dessensibilizada (Perl e outros. (1993) Bio/Technology, 11:715-718); gene bar (Toki e outros. (1992) Plant Physiol., 100:1503- 1507 e Meagher e outros. (1996) e Crop Sci., 36:1367); triptofano de- carboxilase (Goddijn e outros. (1993) Plant Mol. Biol., 22:907-912); neomicina fosfotransferase (NEO) (Southern e outros. (1982) J. Mol. Appl. General, 1:327; higromicina fosfotransferase (HPT ou HYG) (Shimizu e outros. (1986) Mol. Cell Biol., 6:1074); dihidrofolato reduta- se (DHFR) (Kwok e outros. (1986) PNAS USA 4552); fosfinotricina a- cetiltransferase (DeBlock e outros. (1987) EMBO J., 6:2513); ácido 2,2-dicloropropiônico dehalogenase (Buchanan-Wollatron e outros. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330); acetohidroxiáciodo sintase (Ander- son e outros., Pat. U.S. No. 4.761.373; Haughn e outros. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266); 5-enolpiruvil-shikimato-fosfato sintase (aroA) (Comai e outros. (1985) Nature 317:741); haloarilnitrilase (Stalker e outros., pedido de patente PCT publicado WO87/04181); acetil- coenzima A carboxilase (Parker e outros. (1990) Plant Physiol. 92:1220); dihidropteroato sintase (sul I) (Guerineau e outros. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127); e polipeptídeo fotosistema II de 32 kD (psbA) (Hirschberg e outros. (1983) Science, 222:1346).

[00138] Também incluídos são genes que codificam a resistência a: cloranfenicol (Herrera-Estrella e outros. (1983) EMBO J., 2:987-992); metotrexato (Herrera-Estrella e outros. (1983) Nature, 303:209-213; Meijer e outros. (1991) Plant Mol Bio., 16:807-820 (1991); higromicina (Waldron e outros. (1985) Plant Mol. Biol., 5:103-108; Zhijian e outros. (1995) Plant Science, 108:219-227 e Meijer e outros. (1991) Plant Mol

Bio. 16:807-820); estreptomicina (Jones e outros. (1987) Mol. Gen. Genet., 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard e outros. (1996) Transgenic Res., 5:131-137); bleomicina (Hille e outros. (1986) Plant Mol. Biol., 7:171-176); sulfonamida (Guerineau e outros. (1990) Plant Mol Bio., 15:127-136); bromoxinil (Stalker e outros. (1988) Scien- ce, 242:419-423); 2,4-D (Streber e outros. (1989) Bio/Technology, 7:811-816); glifosato (Shaw e outros. (1986) Science, 233:478-481); e fosfinotricina (DeBlock e outros. (1987) EMBO J., 6:2513-2518).

[00139] A lista de genes marcadores selecionáveis e repórter acima não se destina a ser limitante. Quaisquer genes repórter ou marcador selecionável são englobados pela presente invenção. Se necessário, tais genes podem ser sequenciados por métodos conhecidos na técni- ca.

[00140] Os genes repórter e os marcadores selecionáveis são sinte- tizados para expressão ótima na planta. Isto é, a sequência codificante do gene foi modificada para aumentar a expressão em plantas. O gene marcador sintético é projetado para ser expresso em plantas em um nível superior que resulta em eficiência de transformação mais alta. Os métodos para a otimização sintética de genes estão disponíveis na técnica. De fato, vários genes foram otimizados para aumentar a ex- pressão do produto gênico em plantas.

[00141] A sequência do gene marcador pode ser otimizada para a expressão em uma espécie particular de plantas ou alternativamente pode ser modificada para a expressão ótima em famílias vegetais. Os códons vegetais preferenciais podem ser determinados a partir dos códons de frequência mais alta nas proteínas expressas em maior quantidade nas espécies particulares de plantas de interesse. Ver, por exemplo, a EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak e ou- tros. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328; e Murray e out- ros. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498; Pat. U.S. No.

5.380.831; e Pat. U.S. No. 5.436.391. Desta forma, as sequências nu- cleotídicas podem ser otimizadas para a expressão em qualquer plan- ta. É reconhecido que toda ou qualquer parte da sequência gênica po- de ser otimizada ou sintética. Isto é, sequências totalmente otimizadas ou parcialmente otimizadas também podem ser usadas.

[00142] Genes que Conferem a Resistência a um Herbicida:

[00143] Resistência/tolerância de aceto-hidroxiácido sintase (AHAS) e acetolactato sintase (ALS) contra os herbicidas imidazolinona ou sul- fonilureia. Os genes e os mutantes para AHAS e mutantes foram des- critos nas patentes U.S. Nos. 4.761.373, 5.304.732, 5.331.107,

5.853.973 e 5.928.937. Os genes e os mutantes de ALS foram descri- tos nas patentes U.S. Nos. 5.013.659 e 5.141.870.

[00144] Os genes de resistência/tolerância de acetil coenzima A carboxilase (ACCas) contra os herbicidas ciclohexanedionas e/ou áci- do ariloxifenoxipropanóico (incluindo Haloxyfop, Diclofop, Fenoxyprop, Fluazifop, Quizalopfop) foram descritos nas patente U.S. 5.162.602 e

5.498.544.

[00145] Os genes de resistência/tolerância de glifosato. O gene 5- enolpiruvil-3-fosfoshikimato sintase (ES3P sintase) foi descrito na pa- tente U.S. No. 4.769.601. Os genes 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) e mutantes foram descritos nas patentes U.S. Nos.

4.940.835, 5.188.642, 5.310.667, 5.633.435, 5,633,448, e 6,566,587.

[00146] Os genes de resistência/tolerância a glifosinato (bialafos, fosfinotricina (PPT)). O gene da fosfinotricina acetiltransferase (Pat) foi descrito nas patentes U.S. Nos. 5.273.894, 5.276.268, e 5.550.318; e o gene do gene de resistência a bialafos (Bar) foi descrito nas patentes U.S. Nos. 5.561.236 e 5.646.024, 5.648.477 e 7.112.665. O gene da glutamina sintetase (GS) foi descrito na patente U.S. No. 4.975.372 e pedido de patente europeia EP 0333033 A1.

[00147] Os genes de resistência/tolerância de piruvato fenil hidróxi dioxigenase (HPPD) contra os herbicidas isoxazol, dicetonitrilas, e/ou tricetonas incluindo sulcotriona e mesotriona foram descritos nas pa- tente U.S. Nos. 6.268.549 e 6.069.115.

[00148] Genes de resistência/tolerância a 2,4-D. O gene de 2,4-D- monooxigenase foi descrito na patente U.S. No. 6.100.446 e

6.153.401. Genes adicionais de resistência/tolerância a 2,4-D são des- critos em US 2009/0093366 e WO 2007/053482.

[00149] O gene da fosfato imidazolglicerol dehidratase (IGPD) con- tra os herbicidas imidazol e/ou triazol foi descrito na patente U.S. No.

5.541.310. Os genes das enzimas de degradação de Dicamba (oxige- nase, ferredoxina e redutase) contra o herbicida Dicamba foram des- critos nas patente U.S. Nos. 7.022.896 e 7.105.724.

[00150] Os genes para herbicidas que inibem a fotossíntese, inclu- indo triazina (genes psbA e 1s+) ou um benzonitrila (gene nitrilase). Ver, por exemplo, Przibila e outros., Plant Cell 3:169 (1991) que revela a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos que codificam genes mutantes psbA. As sequências nucleotídicas para os genes ni- trilase são descritas na patente U.S. No. 4.810.648 e as moléculas de DNA contendo estes genes estão disponíveis sob o No. De Acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e a expressão do DNA que codifica uma glutationa S-transferase é descrita por Hayes e outros., Biochem. J. 285:173 (1992).

[00151] A menos que de outra maneira especificamente explicado, todos os termos técnicos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado que o comumente entendido por aqueles especia- listas na técnica à qual esta revelação pertence. As definições de ter- mos comuns na biologia molecular podem ser encontradas, por exem- plo, em: Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19- 854287-9); Kendrew e outros. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers

(ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 1995 (ISBN 1 56081 569 8).

[00152] São fornecidas moléculas de ácido nucleico compreenden- do uma sequência nucleotídica sintética que pode funcionar como um promotor bidirecional. Em algumas modalidades, um promotor bidire- cional sintético pode estar operacionalmente ligado a uma ou duas se- quência(s) nucleotídicas de interesse. Por exemplo, um promotor bidi- recional sintético pode estar operacionalmente ligado a uma ou duas sequência(s) nucleotídicas de interesse (por exemplo, dois genes, um em cada extremidade do promotor), para regular a transcrição de pelo menos uma (por exemplo, uma ou ambas) das sequência(s) nucleotí- dicas de interesse. Pela incorporação de um URS de um promotor no promotor bidirecional sintético, a expressão particular e os padrões reguladores (por exemplo, tal que sejam exibidos por genes sob o con- trole do promotor nativo) podem ser alcançados em relação a uma se- quência nucleotídica de interesse que está operacionalmente ligada ao promotor bidirecional sintético.

[00153] Algumas modalidades da invenção são exemplificadas nes- te pedido pela incorporação de um elemento promotor principal míni- mo de um promotor do gene de ubiquitina-1 de milho unidirecional (ZmUbi1) em um contexto molecular diferente daquele do promotor nativo para engendrar um promotor bidirecional sintético. Este elemen- to promotor principal mínimo é mencionado neste pedido como "minU- bi1P" e tem aproximadamente 200 nt de extensão. O sequenciamento e a análise de elementos minUbi1P de múltiplos genótipos de espécies Zea e Z. mays revelaram que os elementos minUbi1P funcionais são altamente conservados, tal que um elemento minUbi1P pode conser- var sua função como um iniciador da transcrição se compartilhar, por exemplo, pelo menos aproximadamente 75%; pelo menos aproxima- damente 80%; pelo menos aproximadamente 85%; pelo menos apro-

ximadamente 90%; pelo menos aproximadamente 91%; pelo menos aproximadamente 92%; pelo menos aproximadamente 93%; pelo me- nos aproximadamente 94%; pelo menos aproximadamente 95%; pelo menos aproximadamente 96%; pelo menos aproximadamente 97%; pelo menos aproximadamente 98%; pelo menos aproximadamente 99%; e/ou pelo menos aproximadamente 100% de identidade de se- quência ao elemento minUbi1P da SEQ ID NO:1. As características dos elementos minUbi1P que podem ser úteis em algumas modalida- des da invenção podem incluir, por exemplo, e sem limitação, a alta conservação acima mencionada da sequência nucleotídica; a presen- ça de pelo menos uma caixa TATA; e/ou a presença de pelo menos um (por exemplo, dois) elemento(s) consenso de choque térmico. Em elementos de minUbi1P particulares, mais de um elemento consenso de choque térmico pode estar sobreposto dentro da sequência de mi- nUbi1P.

[00154] O processo de incorporação um elemento minUbi1P em um contexto molecular diferente daquele de um promotor nativo para en- gendrar um promotor bidirecional sintético pode compreender a rever- são da orientação do elemento minUbi1P em um ácido nucleico em relação à sequência restante do promotor, incluindo seu promotor principal mínimo nativo. Dessa forma, um promotor bidirecional sintéti- co pode compreender um primeiro elemento minUbi1P incorporado 5’ de um segundo elemento promotor principal mínimo (por exemplo, um segundo elemento minUbi1P) no promotor na orientação reversa, tal que possa ser operacionalmente ligado a uma sequência nucleotídica de interesse localizada 5’ do primeiro elemento minUbi1P. Por exem- plo, o primeiro elemento minUbi1P pode ser incorporado na 5’ extre- midade de um promotor de ZmUbi1 na orientação reversa.

[00155] Um promotor de Ubi1 bidirecional sintético também pode compreender um ou mais elementos de sequência adicionais além de pelo menos um elemento minUbi1P. Em algumas modalidades, um promotor de Ubi1 bidirecional sintético pode compreender um promo- tor URS; um éxon (por exemplo, um líder ou peptídeo sinal); um íntron; uma sequência espaçadora; e ou combinações de um ou mais de um dos precedentes. Por exemplo, e sem limitação, um promotor de Ubi1 bidirecional sintético pode compreender uma sequência URS de um promotor de Ubi1 (por exemplo, o promotor de Ubi1 de milho); um é- xon que codifique um peptídeo líder de um gene Ubi1; um íntron de um gene Ubi1; e combinações destes.

[00156] Em alguns daqueles exemplos compreendendo um promo- tor de Ubi1 bidirecional sintético que compreende um promotor URS, o URS pode ser selecionado para conferir propriedades reguladoras par- ticulares ao promotor sintético. Os promotores conhecidos variam am- plamente no tipo de controle que exercem em genes operacionalmente ligados (por exemplo, respostas ambientais, sinais de desenvolvimento e informação espacial), e um URS incorporado em um promotor hete- rólogo tipicamente mantém o tipo de controle que URS exibe em rela- ção ao seu promotor nativo e gene(s) operacionalmente ligado. Lan- gridge e outros. (1989), supra. Exemplos de promotores eucarióticos que foram caracterizados e podem conter um URS compreendido den- tro de um promotor de Ubi1 bidirecional sintético de acordo com algu- mas modalidades incluem, por exemplo, e sem limitação: aqueles promotores descritos nas patente U.S. Nos. 6.437.217 (promotor de milho RS81); 5.641.876 (promotor de actina de arroz); 6.426.446 (promotor de milho RS324); 6.429.362 (promotor de milho PR-1);

6.232.526 (promotor de milho A3); 6.177.611 (promotores de milho constitutivos); 6.433.252 (promotor de oleosina L3 de milho);

6.429.357 (promotor de actina 2 de arroz e íntron actina 2 de arroz);

5.837.848 (promotor raiz-específico); 6.294.714 (promotores induzíveis pela luz); 6.140.078 (promotores induzíveis pelo sal); 6.252.138 (pro-

motores induzíveis por patógenos); 6.175.060 (promotores induzíveis pela deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais);

6.635.806 (promotor gama-coixina); e Pedido de Patente U.S. No. de Série 09/757.089 (promotor de aldolase de cloroplasto de milho).

[00157] Os promotores procarióticos exemplares adicionais incluem o promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert e outros. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (16):5745-9); o promotor de octopina sintase (OCS) (que é transportado em plasmídeos indutores de tumor de A- grobacterium tumefaciens); os promotores caulimovirus tais como o promotor 19S do vírus de mosaico de couve-flor (CaMV) (Lawton e outros. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); o promotor 35S de CaMV (O- dell e outros. (1985) Nature 313:810-2; o promotor 35S do vírus do mosaico de escrofulária (Walker e outros. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (19):6624-8); o promotor de sacarose sintase (Yang e Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); o promotor de complexo gênico R (Chandler e outros. (1989) Plant Cell 1:1175-83); CaMV35S (Patentes U.S. Nos. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196); FMV35S (Patentes U.S. Nos. 6.051.753, e 5.378.619); um promotor PC1SV (Patente U.S. No. 5.850.019); o promotor SCP1 (Patente U.S. No. 6.677.503); e os promotores de AGRtu.nos (No. de Acesso no GenBank V00087; Depicker e outros. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan e outros. (1983) Nature 304:184-7), e similares.

[00158] Em algumas modalidades, um promotor de Ubi1 bidirecio- nal sintético pode compreender ainda um éxon além do elemento(s) minUbi1P. Por exemplo, pode ser desejável em modalidades particula- res visar ou trafegar um polipeptídeo codificado por uma sequência nucleotídica de interesse operacionalmente ligada ao promotor a uma posição subcelular e/ou compartimento particular. Nestas e outras mo- dalidades, uma sequência codificante (éxon) pode ser incorporada em uma molécula de ácido nucleico entre o elemento minUbi1P e uma se-

quência nucleotídica que codifica um polipeptídeo. Estes elementos podem ser arranjados de acordo com a discrição do profissional espe- cialista tal que o promotor de Ubi1 bidirecional sintético promova a ex- pressão de um polipeptídeo (ou uma ou ambas de duas sequências codificantes do polipeptídeo que estão operacionalmente ligadas ao promotor) compreendendo o peptídeo codificado pela sequência codi- ficante incluída em uma relação funcional com o restante do polipeptí- deo. Em exemplos particulares, um éxon que codifica um peptídeo lí- der, trânsito, ou sinal (por exemplo, o peptídeo líder Ubi1) pode ser incorporado.

[00159] Os peptídeos que podem ser codificados por um éxon in- corporado em um promotor de Ubi1 bidirecional sintético incluem, por exemplo, e sem limitação: um éxon líder de Ubiquitina (por exemplo, Ubi1); e um peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP) (por exemplo, EPSPS CTP de A. thaliana (Klee e outros. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:437-42), e EPSPS CTP de Petunia hybrida (della-Cioppa e outros. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-7)), como exemplificado para o direcionamento de cloroplasto de dicamba mono-oxigenase (DMO) em Publicação Internacional PCT No. WO 2008/105890.

[00160] Os íntrons também podem ser incorporados em um promo- tor de Ubi1 bidirecional sintético em algumas modalidades da inven- ção, por exemplo, entre um elemento minUbi1P e uma sequência nu- cleotídica de interesse que é operacionalmente ligada ao promotor. Em alguns exemplos, um íntron incorporado em um promotor de Ubi1 bidirecional sintético pode ser, sem limitação, uma UTR 5’ que funcio- na como uma sequência líder de tradução que está presente em um mRNA totalmente processado a montante da sequência de início de tradução (tal sequência líder de tradução pode afetar o processamento de um transcrito primário a mRNA, estabilidade de mRNA e/ou eficiên- cia de tradução). Exemplos de sequências líder de tradução incluem líderes de proteína de choque térmico de milho e petúnia (Patente U.S. No. 5.362.865), líderes de proteína de revestimento de vírus vegetais, líderes de planta rubisco e outros. Ver, por exemplo, Turner e Foster (1995) Biotech Molecular. 3 (3):225-36. Exemplos não limitantes de UTRs 5’ incluem GmHsp (Patente U.S. No. 5.659.122); PhDnaK (Pa- tente U.S. No. 5.362.865); AtAnt1; TEV (Carrington e Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtu.nos (No. de Acesso no GenBank V00087; e Bevan e outros. (1983) Nature 304:184-7).

[00161] As sequências adicionais que podem ser opcionalmente incorporadas em um promotor de Ubi1 bidirecional sintético incluem, por exemplo, e sem limitação: sequências 3’ não traduzidas; regiões 3’ de terminação de transcrição; e regiões de poliadenilação. Estes são elementos genéticos localizados a jusante de uma sequência nucleotí- dica de interesse (por exemplo, uma sequência de interesse que é o- peracionalmente ligada a um promotor de Ubi1 bidirecional sintético), e incluem polinucleotídeos que fornecem o sinal de poliadenilação e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição, o proces- samento de mRNA ou a expressão gênica. Um sinal de poliadenilação pode funcionar em plantas para provocar a adição de nucleotídeos po- liadenilados na extremidade 3’ de um precursor de mRNA. A sequên- cia de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma vari- edade de genes vegetais, ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitante de uma região 3’ de terminação de transcrição é nopalina sin- tase da região 3’ (nos 3’; Fraley e outros. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de regiões 3’ não traduzidas di- ferentes é fornecido em Ingelbrecht e outros., (1989) Plant Cell 1:671-

80. Exemplos não limitantes de sinais de poliadenilação incluem um gene de RbcS2 de Pisum sativum (Ps. RbcS2-E9; Coruzzi e outros. (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (No. de Acesso no GenBank E01312).

[00162] Em algumas modalidades, um promotor de Ubi1 bidirecio- nal sintético compreende uma ou mais sequências nucleotídicas que facilitam visar de um ácido nucleico que compreende o promotor a um locus particular no genoma de um organismo alvo. Por exemplo, uma ou mais sequências podem estar incluídas que são homólogas a seg- mentos de sequência de DNA genômica no hospedeiro (por exemplo, sequências de DNA genômicas raras ou únicas). Em alguns exemplos, estas sequências homólogas podem guiar a recombinação e a inte- gração de um ácido nucleico que compreende um promotor de Ubi1 bidirecional sintético no sítio de DNA homólogo no genoma de hospe- deiro. Em exemplos particulares, um promotor de Ubi1 bidirecional sin- tético compreende uma ou mais sequências nucleotídicas que facilitam visar um ácido nucleico compreendendo o promotor a uma posição rara ou única em um genoma hospedeiro que utiliza enzimas de nu- clease engendradas que reconhecem a sequência na posição rara ou única e facilitam a integração naquela posição rara ou única. Tal sis- tema de integração visado empregando endonucleases de dedo do zinco como a enzima de nuclease é descrito no Pedido de Patente U.S. No. 13/011.735.

[00163] Os ácidos nucleicos compreendendo um promotor de Ubi1 bidirecional sintético podem ser produzidos usando qualquer técnica conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, e sem limitação: RCA; amplificação por PCR; amplificação por RT-PCR; OLA; e SNuPE. Es- tas e outras técnicas equivalentes são bem conhecidas por aqueles especialistas na técnica e são ainda descritas detalhadamente em, por exemplo, e sem limitação: Sambrook e outros. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001; e Ausubel e outros. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1998. Todas as referências citadas acima incluem ambos os manuais precedentes, incluindo qualquer desenho, figuras e/ou tabe-

las fornecidas nestes.

[00164] Entrega e/ou transformação: A presente revelação também fornece métodos para transformar uma célula com uma molécula de ácido nucleico que compreende um promotor de Ubi1 bidirecional sin- tético. Qualquer uma do grande número de técnicas conhecidas na técnica pela introdução de moléculas de ácido nucleico em plantas po- de ser usada para transformar uma planta com uma molécula de ácido nucleico que compreende um promotor de Ubi1 bidirecional sintético de acordo com algumas modalidades, por exemplo, para introduzir um ou mais promotores de Ubi1 bidirecionais sintéticos no genoma da planta hospedeira e/ou introduzir ainda uma ou mais moléculas de áci- do nucleico de interesse operacionalmente ligado ao promotor.

[00165] Métodos adequados para transformação de plantas incluem qualquer método pelo qual DNA pode ser introduzido em uma célula, por exemplo, e sem limitação: eletroporação (ver, por exemplo, a Pa- tente U.S. 5.384.253); o bombardeio de microprojétil (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208,

6.399.861, e 6.403.865); transformação mediada por Agrobacterium (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.635.055, 5.824.877, 5.591.616;

5.981.840, e 6.384.301); e a transformação de protoplasto (ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.508.184). Pela aplicação de técnicas tais como as precedentes, as células de virtualmente qualquer espécie de plantas podem ser estavelmente transformadas, e estas células po- dem ser desenvolvidas em plantas transgênicas por técnicas conheci- das por aqueles especialistas na técnica. Por exemplo, as técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto da transformação de algodão são descritas nas Patentes U.S. 5.846.797, 5.159.135,

5.004.863, e 6.624.344; técnicas para transformar plantas Brassica em particular são descritas, por exemplo, na Patente U.S. 5.750.871; téc- nicas para transformar a soja são descritas, por exemplo, na Patente

U.S. 6.384.301; e técnicas para transformar o milho são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. 7.060.876 e 5.591.616, e Publicação PCT Internacional WO 95/06722.

[00166] Após efetuar entrega de um ácido nucleico exógeno a uma célula do recipiente, a célula transformada é geralmente identificada para cultura adicional e regeneração vegetal. A fim de melhorar a ca- pacidade de identificar transformantes, cada um pode desejar empre- gar um gene marcador selecionável ou rastreável com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. Neste caso, a popu- lação celular potencialmente transformada pode ser analisada expon- do as células a um agente seletivo ou agentes, ou as células podem ser rastreadas para o traço gênico de marcador desejado.

[00167] As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo ou células que foram marcadas positivas em um ensaio de rastrea- mento, podem ser cultivadas em meios que suportam a regeneração de plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de te- cido vegetal adequado (por exemplo, meios MS e N6) pode ser modifi- cado pela inclusão de substâncias adicionais, como reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em meios básicos com regu- ladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para começar esforços de regeneração vegetal, ou após ciclos repetidos de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para a regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), em seguida trans- ferida para meios conducentes para formação de broto. As culturas são transferidas periodicamente até que formação de broto suficiente tenha ocorrido. Uma vez que os brotos são formados, são transferidos para meios conducentes para a formação de raízes. Uma vez que as raízes suficientes sejam formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento e maturidade adicionais.

[00168] Para confirmar a presença da molécula de ácido nucleico desejada que compreende um promotor de Ubi1 bidirecional sintético nas plantas de regeneração, uma variedade de ensaios pode ser reali- zada. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios biológicos molecula- res, como Southern e Northern blotting e PCR; ensaios bioquímicos, como detecção da presença de um produto proteico, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA e/ou Western blots) ou por função enzimá- tica; ensaios de partes vegetais, como ensaios de folha ou raiz; e aná- lise do fenótipo da planta regenerada inteira.

[00169] Os eventos de integração direcionados podem ser rastrea- dos, por exemplo, pela amplificação por PCR usando, por exemplo, iniciadores oligonucleotídicos específicos para moléculas de ácido nu- cleico de interesse. Entende-se que a genotipagem de PCR inclui, mas não é limitada à amplificação de reação de polimerase em cadeia (P- CR) de DNA genômico derivado do tecido de calo da planta hospedei- ra isolado predito conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrado no genoma, seguido de clonagem padrão e análise de se- quência de produtos de amplificação por PCR. Os métodos da genoti- pagem por PCR foram bem descritos (ver, por exemplo, Rios e outros. (2002) Plant J. 32:243-53), e pode ser aplicado a DNA genômico deri- vado de qualquer espécie de plantas ou tipo de tecido, incluindo cultu- ras de células. As combinações de iniciadores oligonucleotídicos que se ligam tanto à sequência alvo como à sequência introduzida podem ser usadas sequencialmente ou multiplexadas em reações de amplifi- cação por PCR. Os iniciadores oligonucleotídicos projetados para se anelarem ao sítio alvo, sequências de ácido nucleico introduzidas e/ou combinações dos dois podem ser produzidos. Dessa forma, as estra- tégias de genotipagem de PCR podem incluir, por exemplo, e sem limi- tação: amplificação de sequências específicas no genoma vegetal; amplificação de múltiplas sequências específicas no genoma vegetal; amplificação de sequências não específicas no genoma vegetal; e combinações de qualquer um dos precedentes. Um especialista na técnica pode inventar combinações adicionais de iniciadores e reações de amplificação para questionar o genoma. Por exemplo, um conjunto de iniciadores oligonucleotídicos diretos e reversos pode ser projetado para se anelarem à sequência(s) de ácidos nucleicos específicos para o alvo fora dos limites da sequência de ácido nucleico introduzida.

[00170] Iniciadores oligonucleotídicos diretos e reversos podem ser projetados para se anelarem especificamente a uma molécula de áci- do nucleico introduzida, por exemplo, em uma sequência que corres- ponde a uma região codificante dentro de uma sequência nucleotídica de interesse compreendido nesta, ou outras partes da molécula de á- cido nucleico. Estes iniciadores podem ser usados em conjunto com os iniciadores descritos acima. Os iniciadores oligonucleotídicos po- dem ser sintetizados de acordo com uma sequência desejada e estão comercialmente disponíveis (por exemplo, de Integrated DNA Techno- logies, Inc., Coralville, IA). A amplificação pode ser seguida por clona- gem e sequenciamento, ou pela análise de sequência direta dos pro- dutos de amplificação. Um especialista na técnica poderia idealizar métodos alternativos para análise de produtos de amplificação gera- dos durante a genotipagem por PCR. Em uma modalidade, os inicia- dores oligonucleotídicos específicos para o alvo gênico são emprega- dos em amplificações por PCR.

[00171] Algumas modalidades da presente invenção também forne- cem células compreendendo um promotor de Ubi1 bidirecional sintéti- co, por exemplo, como podem estar presentes em um construto de ácido nucleico. Em exemplos particulares, um promotor de Ubi1 bidire- cional sintético de acordo com algumas modalidades pode ser utilizado como uma sequência reguladora para regular a expressão de transge- nes em células vegetais e plantas. Em alguns tais exemplos, o uso de um promotor de Ubi1 bidirecional sintético operacionalmente ligado a uma sequência nucleotídica de interesse (por exemplo, um transgene) pode reduzir o número de promotores homólogos necessários para regular a expressão de um dado número de sequências nucleotídicas de interesse, e/ou reduzir o tamanho do construto(s) de ácido nucleico requerido para introduzir um dado número de sequências nucleotídicas de interesse. Além disso, o uso de um promotor de Ubi1 bidirecional sintético pode permitir a coexpressão de duas sequências nucleotídi- cas operacionalmente ligadas de interesse sob as mesmas condições (isto é, as condições sob as quais o promotor é ativo). Tais exemplos podem ser particularmente úteis, por exemplo, quando as duas se- quências nucleotídicas operacionalmente ligadas de interesse cada uma contribui para um traço único em um hospedeiro transgênico compreendendo as sequências nucleotídicas de interesse e coexpres- são das sequências nucleotídicas de interesse vantajosamente impac- tam a expressão do traço no hospedeiro transgênico.

[00172] Em algumas modalidades, uma planta transgênica compre- endendo um ou mais promotores de Ubi1 bidirecional sintético e/ou sequência(s) nucleotídicas de interesse podem ter um ou mais traços desejáveis conferidos (por exemplo, introduzidos, aumentados ou con- tribuídos) pela expressão da sequência(s) nucleotídica de interesse na planta. Tais traços podem incluir, por exemplo, e sem limitação: resis- tência a insetos, outras pragas e agentes causadores de doenças; to- lerâncias a herbicidas; estabilidade, rendimento ou prazo da validade aumentados; tolerâncias ambientais; produção farmacêutica; produção de produto industrial; e aumentos nutricionais. Em alguns exemplos, um traço desejável pode ser conferido pela transformação de uma planta com uma molécula de ácido nucleico compreendendo um pro- motor de Ubi1 bidirecional sintético operacionalmente ligado a uma sequência nucleotídica de interesse. Em alguns exemplos, um traço desejável pode ser conferido a uma planta produzida como uma planta de progênie via melhoramento, traço o qual pode ser conferido por uma ou mais sequências nucleotídicas de interesse operacionalmente ligadas a um promotor de Ubi1 bidirecional sintético que é passado à planta de uma planta parental compreendendo uma sequência nucleo- tídica de interesse operacionalmente ligada a um promotor de Ubi1 bidirecional sintético.

[00173] Uma planta transgênica de acordo com algumas modalida- des pode ser qualquer planta capaz de ser transformada com uma mo- lécula de ácido nucleico da invenção, ou de ser produzida com uma planta transformada com uma molécula de ácido nucleico da invenção. Consequentemente, a planta pode ser uma dicotiledônea ou monocoti- ledônea. Exemplos não limitantes de plantas dicotiledôneas para uso em alguns exemplos incluem: alfafa; feijões; brócolis; canola, repolho; cenoura; couve-flor; aipo; repolho chinês; algodão; pepino; berinjela; alface; melão; ervilha; pimentão; amendoim; batata; abóbora; rabane- te; colza; espinafre; soja; squash; beterraba; girassol; tabaco; tomate; e melancia. Exemplos não limitantes de plantas monocotiledôneas pa- ra uso em alguns exemplos incluem: milho; cebola; arroz; sorgo; trigo; centeio; painço; cana-de-açúcar; aveia; triticale; switchgrass; e grama.

[00174] Em algumas modalidades, uma planta transgênica pode ser usada ou cultivada de qualquer maneira, em que a presença um pro- motor de Ubi1 bidirecional sintético e/ou sequência nucleotídica opera- cionalmente ligada de interesse é desejável. Consequentemente, tais plantas transgênicas podem ser engendradas, inter alia, para ter um ou mais traços desejados, transformadas com moléculas de ácido nu- cleico de acordo com a invenção, e podem ser lavradas e/ou cultiva- das por qualquer método conhecido por aqueles especialistas na téc- nica.

[00175] Embora a invenção tenha sido descrita com referência a métodos e modalidades específicos, será apreciado que várias modifi-

cações e alterações podem ser feitas sem se afastar da invenção. Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar certos atributos e/ou modalidades particulares. Exemplos não devem ser interpretados a limitar a revelação para os atributos particulares ou modalidades e- xemplificadas.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Transformação e Expressão

[00176] Transformação de Agrobacterium tumefaciens: O vetor bi- nário pDAB108706 é transformado na cepa de Agrobacterium tumefa- ciens DAt13192 ternária (Pat. Prov. U.S. No. 61/368965). As colônias bacterianas são isoladas e DNA de plasmídeo binário é isolado e con- firmado via digestão com enzima de restrição.

[00177] Transformação do milho: Esterilização de Espiga e Isola- mento de Embrião. Para obter embriões imaturos de milho, plantas de Zea mays (c.v. B104) são cultivadas em estufa e autopolinizadas ou polinizados com parentesco para produzir espigas. As espigas são co- letadas pós-polinização de aproximadamente 9-12 dias. No dia do ex- perimento, as espigas são esterilizadas superficialmente pela imersão em uma solução 20% de alvejante doméstico, contendo hipoclorito de sódio 5%, e agitado durante 20-30 minutos, seguidos de três enxágues em água estéril. Após esterilização, os embriões zigóticos imaturos (1,5-2,2 mm) são assepticamente dissecados de cada espiga e ran- domicamente distribuídos em tubos de microcentrífuga contendo mei- os de infecção líquidos (Meio Basal LS, 4,43 gm/L; Solução de Vitami- na N6 [1000X], 1,00 mL/L; L-prolina, 700,0 mg/L; sacarose, 68,5 gm/L; glicose, 36,0 gm/L; 2,4-D, 1,50 mg/L. Para um dado conjunto de expe- rimentos, os embriões agrupados de 2-3 espigas são usados para ca- da tratamento.

[00178] Iniciação de Cultura de Agrobacterium: os estoques de gli- cerol de Agrobacterium que contém os vetores binários descritos aci-

ma são riscados em placas médias mínimas AB que contêm antibióti- cos apropriados e são cultivados a 20ºC durante 3-4 dias. Uma colônia única é escolhida e riscada em placas YEP contendo os mesmos anti- bióticos e foi incubada a 28ºC durante 1-2 dias.

[00179] Cultura e Cocultivo de Agrobacterium: No dia do experi- mento, as colônias de Agrobacterium são tomadas da placa YEP, sus- pensas em 10 mL do meio de infecção em um tubo disponível de 50 mL, e a densidade celular é ajustada à OD600 = 0,2-0,4 nm usando um espectrofotômetro. As culturas de Agrobacterium são colocadas em um agitador rotativo em 100 rpm, temperatura ambiente, enquanto a dissecação do embrião é realizada. Os embriões zigóticos imaturos entre 1,5-2,2 mm de tamanho são isolados dos núcleos de milho este- rilizados e colocados em 1 mL do meio de infecção e lavados uma vez no mesmo meio. A suspensão de Agrobacterium (2 mL) é adicionada a cada tubo e os tubos são invertidos por aproximadamente 20 vezes então sacudidos durante 10-15 minutos. Os embriões são transferidos para meios de cocultivo (Sais MS, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; mio-inositol, 100,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; dicamba – 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan™, 3,00 gm/L; vitamina MS [1000X] modificada 1,00 ml/L, AgNO3, 15,0 mg/L; Acetosiringona, 100 µM), orientado com o escutelo que fica em frente, e incubado durante 3-4 dias à luz a 25ºC.

[00180] A expressão transiente de GUS e YFP/Phiyfp: a expressão de YFP/Phiyfp transiente e GUS pode ser observada em embriões transformados e após 3 dias do cocultivo com Agrobacterium. Os em- briões são observados sob um estereomicroscópio (Leica Microsys- tems, Buffalo Grove, IL) usando filtro YFP e fonte de luz de 500 nm. Os embriões mostrando a expressão de YFP/Phiyfp são selecionados para o ensaio histoquímico GUS. Solução de marcação GUS é prepa- rada como descrito em Maniatis e outros. (1989) e embriões são incu-

bados em 1 mL de solução durante 24 horas a 37°C. O s embriões são observados para a expressão transiente de GUS sob microscópio.

[00181] Seleção de Calo e Regeneração de Eventos Putativos: A- pós o período de cocultivo, os embriões são transferidos para meios de repouso (sais MS, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; mioinositol, 100,0 mg/L; MES [ácido (2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 500,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba, 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan 2,30 gm/L; vitamina MS modi- ficada [1000X], 1,00 ml/L; AgNO3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) sem agente seletivo e incubado durante 24 horas de luz com intensidade luminosa de 50 µmol m-2s-1 durante 7 dias a 28ºC. Os em- briões são transferidos para a seleção de meios 1 (sais MS, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; mioinositol, 100,0 mg/L; MES [ácido (2-(n- morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 500,0 mg/L; hidrolisado enzi- mático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba, 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan™ 2,30 gm/L; vitamina MS modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNO3, 15,0 mg/L; carbenicilina, 250,0 mg/L) contendo haloxyfop 100 nM e incubados durante 24 horas de luz com intensidade luminosa de 50 µmol m-2s-1 durante 7 dias a 28ºC. Os embriões com calos embriogênicos proliferam são transferidos pa- ra meios de seleção 2 (sais MS, 4,33 gm/L; mioinositol, 100,0 mg/L; L- prolina, 700,0 mg/L; MES [ácido (2-(n-morfolino)-etanossulfônico), áci- do livre] 500,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba, 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan™ 2,30 gm/L; vita- mina MS modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNO3, 15,0 mg/L; Carbenici- lina, 250,0 mg/L) contendo haloxyfop 500 nM e são incubados durante 24 horas de luz com intensidade luminosa de 50 µmol m-2s-1 durante mais 14 dias a 28ºC. Esta etapa de seleção permite o calo transgênico se proliferar mais e diferenciar-se. O período de seleção de calo dura durante três semanas. Proliferando, os calos embriogênicos são trans-

feridos para meios de regeneração 1 (sais MS, 4,33 gm/L; mioinositol, 100,0 mg/L; L-prolina, 350,0 mg/L; MES [ácido (2-(n-morfolino)- etanossulfônico), ácido livre] 250,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína 50,0 mg/L; NAA 0,500 mg/L; ABA 2,50 mg/L; BA 1,00 mg/L; sacarose, 45,0 gm/L; Gelzan™ 2,50 gm/L; vitamina MS modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNO3, 1,00 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) con- tendo haloxyfop 500 nM e cultivados durante 24 horas de luz com in- tensidade luminosa de 50 µmol m-2s-1 durante 7 dias a 28ºC. Os calos embriogênicos com caules/brotos são transferidos para meios de re- generação 2 (sais MS, 4,33 gm/L; vitamina MS modificada [1000X], 1,00 ml/L; mioinositol, 100,0 mg/L; sacarose, 60,0 gm/L; Goma Gelana G434™ 3,00 gm/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) contendo haloxyfop 500 nM. As culturas são incubadas sob 24 horas de luz com intensidade luminosa de 50 µmol m-2s-1 durante 7-10 dias a 28ºC. Os caules pe- quenos com raízes primárias são transferidos para alongamento de caule e meios de enraizamento (sais MS, 4,33 gm/L; vitamina MS mo- dificada [1000X], 1,00 ml/L; mioinositol, 100,0 mg/L; sacarose, 60,0 gm/L; Goma Gelana G434™ 3,00 gm/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) em caixas MAGENTA™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), e são incubados sob 16/8 horas de luz/escuridão durante 7 dias a 28ºC. As mudas transgênicas putativas são analisadas para o número de cópias de transgene e transferidas para a estufa. EXEMPLO 2: Construção de Promotor de Ubi1 Bidirecional Sinté- tico e Vetor pDAB108706

[00182] Um desenho esquemático exemplar do promotor de Ubiqui- tina-1 de milho (Ubi1) é mostrado na FIG. 1. Um promotor de Ubi1 é clonado do milho. Um plasmídeo que contém o promotor de Ubi1 é amplificado por PCR usando um sistema de amplificação por PCR de alta fidelidade. Uma região de aproximadamente 200 nt do promotor de Ubi1 do milho é identificada como um promotor de Ubi1 principal mínimo de Zea mays (minUbi1P) (SEQ ID NO: 1). O minUbi1P da SEQ ID NO: 1 então é adicionado a um polinucleotídeo (SEQ ID NO: 2) compreendendo um éxon de Ubiquitina-1 de Zea mays (éxon de ZmU- bi1) e íntron de Ubiquitina-1 de Zea mays (íntron de ZmUbi1) usando métodos de clonagem comumente conhecidos na técnica para produ- zir o polinucleotídeo da SEQ ID NO: 3. O polinucleotídeo resultante então é clonado a montante em orientação reversa de um ácido nucle- ico que compreende o promotor de Ubi1 do milho (incluindo a sequên- cia reguladora a montante (URS) Ubi1); SEQ ID NO: 4) para produzir o promotor de Ubi1 bidirecional sintético da SEQ ID NO: 5 (ver a FIG. 5 por exemplo).

[00183] As sequências codificantes do gene repórter são clonadas a jusante de cada extremidade do promotor de Ubi1 bidirecional sinté- tico. Uma sequência codificante de proteína de fluorescência amarela (yfp) é inserida a jusante do fragmento de polinucleotídeo que contém os elementos promotores de minUbi1P, éxon de ZmUbi1 e íntron de ZmUbi1. Além disso, uma sequência líder a jusante que contém uma sequência de polinucleotídeos de parada de 3 estruturas e a sequên- cia do polinucleotídeo consenso de milho (Kozak) é adicionada aos fragmento de elementos promotores de minUbi1P, ZmUbi1, éxon e íntron de ZmUbi1. Uma sequência codificante de uidA (GUS) é inseri- da a jusante do promotor de Ubi1 bidirecional sintético em orientação reversa em relação à sequência de yfp (SEQ ID NO: 6; ver a FIG. 3 por exemplo). O polinucleotídeo resultante que compreende o promo- tor de Ubi1 bidirecional sintético operacionalmente ligado aos genes de yfp e GUS é clonado no plasmídeo pDAB105801. Um vetor binário que continha cassetes de expressão gênica GUS e yfp do plasmídeo pDAB105801 é completado via uma reação GATE- WAY™ L-R CLONASE™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). O vetor resultan- te, pDAB108706, contém os cassetes de expressão gênica GUS, yfp,

e aad-1 dentro da região de fita T (ver a FIG. 5 por exemplo). EXEMPLO 3: Expressão Transiente de Genes Operacionalmente Ligados ao Promotor de Ubiquitina-1 Bidirecional Sintético Exemplos representativos de expressão transiente de YFP e GUS em embriões de Zea mays transformados com pDAB108706 são imagea- dos.

Ambos os lados do promotor de ZmUbi1 bidirecional podem con- trolar a expressão robusta de sequências codificantes yfp e GUS ope- racionalmente ligadas.

Os níveis de expressão de YFP são compará- veis com os níveis de expressão de GUS.

Esta observação confirma que ambos os lados do promotor de ZmUbi1 bidirecional são biologi- camente funcionais.

Além disso, o elemento minUbi1P do promotor de Ubi1 bidirecional sintético pode expressar YFP em níveis de expressão similares comparando com o calo de Zea mays transformado com um plasmídeo binário (pDAB101556) que continha um promotor de ZmU- bi1 unidirecional que controla a sequência codificante de yfp.

A ex- pressão de YFP ou GUS não é detectada no embriões imaturos de controle negativo que não são transformados com um construto binário e não contêm sequências codificantes de yfp ou GUS.

EXEMPLO 4: Expressão Estável de Genes Operacionalmente Li- gados a um Promotor de Ubiquitina-1 Bidirecional Sintético Podem ser observadas as imagens de células de calo de Zea mays que são estavelmente transformadas com o vetor binário pDAB108706, que contém a sequência codificante de yfp.

Estas célu- las são obtidas de embriões de Z. mays que têm propagado no meio de seleção 2. O promotor de ZmUbi1 bidirecional pode controlar a ex- pressão robusta das sequências codificantes de yfp.

Estes resultados confirmam que o elemento promotor mínimo do promotor de ZmUbi1 bidirecional Min-UbiP1 é capaz de expressar um gene repórter em cé- lulas de calo de Z. mays estavelmente transformadas.

Os níveis da expressão da proteína YFP são similares comparando com a expres-

são YFP em calo de Z. mays transformado com um vetor binário de controle que continha o promotor de ZmUbi1 unidirecional que controla a sequência codificante de yfp (pDAB101556). A expressão de YFP ou GUS não é detectada no calo de controle negativo que não é trans- formado com um construto binário e não contém uma sequência codi- ficante yfp ou GUS. EXEMPLO 5: Estimativa de Número de Cópias de Transgene U- sando TaqMan® PCR em Tempo real

[00184] Os embriões de Zea mays são transformados com um vetor binário que contém um promotor de ZmUbi1 bidirecional, pDAB108706, e outras plantas são transformadas com um vetor biná- rio de controle, pDAB101556. A presença de transgenes yfp dentro do genoma de ambos os conjuntos de plantas Z. mays é confirmada via um ensaio de sonda de hidrólise. Mudas transgênicas estavelmente transformadas de Z. mays que se desenvolveram do calo são obtidas e analisadas para identificar eventos que continham um baixo número de cópias (1-2 cópias) de insertos de fita T inteiros do vetor binário pDAB108706 e vetor binário de controle pDAB101556. As mudas iden- tificadas são promovidas para a estufa e cultivadas.

[00185] O sistema Roche Light Cycler480™ é usado para determi- nar o número de cópias de transgenes de eventos que são transfor- mados com o vetor binário pDAB108706, e para eventos de controle que são transformados com o vetor binário pDAB101556. O método utiliza uma reação TaqMan® biplex que emprega oligonucleotídeos específicos para o gene yfp e para o gene endógeno de referência de Z. mays, invertase (número de Acesso no Genbank: U16123.1), em um ensaio único. O número de cópias e a zigosidade são determina- dos medindo a intensidade da fluorescência específica para yfp, quan- to à fluorescência específica para invertase, comparando com padrões de números de cópias conhecidos.

Em Z. mays transformado com o vetor binário pDAB108706, um frag- mento de DNA específico para o gene yfp é amplificado com um con- junto de iniciador/sonda TaqMan® que contém uma sonda marcada com o corante fluorescente FAM, e invertase é amplificada com um segundo conjunto de iniciador/sonda TaqMan® que contém uma son- da marcada com fluorescência HEX (Tabela 2). A mistura de reação de PCR é preparada como apresentado na Tabela 3, e os fragmentos de DNA específicos para o gene são amplificados de acordo com as condições apresentadas na Tabela 4. O número de cópias e a zigosi- dade das amostras são determinados medindo a intensidade relativa da fluorescência específica para o gene repórter, yfp, à fluorescência específica para o gene de referência, invertase, comparando com pa- drões de números de cópias conhecidos.

Tabela 2. Iniciador de nucleotídeo direto e reverso e sondas fluores- centes (sintetizados por Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Nome do Iniciador SEQ ID NO: Sequência do Iniciador Iniciador de Sentido SEQ ID NO:7 GATGCCTCAGTGGGAAAGG Direto de YFP Iniciador de Sentido SEQ ID NO:8 CCATAGGTGAGAGTGGTGACAA Reverso de YFP Sonda de Yfp --- ROCHE UPL Sonda #125 CTTGGAGC Cat # 04693604001 (Roche, Indianapolis, IN) Iniciador de Sentido SEQ ID NO:9 TGGCGGACGACGACTTGT Direto de Invertase Iniciador de Sentido SEQ ID AAAGTTTGGAGGCTGCCGT Reverso de Inver- NO:10 tase Sonda de Invertase SEQ ID 5′HEX/CGAGCAGACCGCCGTGTA NO:11 CTTCTACC /3BHQ_1/3′ Iniciador de Sentido SEQ ID TGTTCGGTTCCCTCTACCAA

Nome do Iniciador SEQ ID NO: Sequência do Iniciador Direto AAD1 NO:12 Iniciador de sentido SEQ ID CAACATCCATCACCTTGACTGA reverso de AAD1 NO:13 Sonda de AAD1 SEQ ID CACAGAACCGTCGCTTCAGCA- NO:14 ACA

[00186] Padrões são criados diluindo o vetor, pDAB108706, em DNA genômico de Z. mays B104 (gDNA) para obter padrões com uma relação conhecida de pDAB108706:gDNA. Por exemplo, amostras que têm uma; duas; e são preparadas quatro cópias de DNA de vetor por uma cópia do gDNA de Z. mays B104. Uma e duas diluições de cópias do pDAB108706 misturado com gDNA de Z. mays padrão de B104 são validadas contra um evento controle Z. mays que é conhecido por ser hemizigoto e um evento controle Z. mays que é conhecido por ser homozigoto (evento 278 de Z. mays; ver Publicação Patente Interna- cional No. PCT WO 2011/022469 A2). Ensaio TaqMan® biplex que utiliza oligonucleotídeos específicos para o gene AAD1 e oligonucleo- tídeos específicos para o gene endógeno de referência de Z. mays, invertase, é realizado amplificando e detectando um fragmento de DNA específico para o gene AAD1 com um conjunto de inicia- dor/sonda de TaqMan® que contém uma sonda marcada com o coran- te fluorescente FAM, e amplificando e detectando um fragmento de DNA específico para o gene de invertase com um segundo conjunto de iniciador/sonda de TaqMan® que contém uma sonda marcada com a fluorescência HEX (Tabela 2). A mistura de reação de AAD1 Taq- Man® é preparada como apresentado na Tabela 3 e os fragmentos específicos são amplificados de acordo com as condições apresenta- das na Tabela 4.

Tabela 3. Mistura de reação de Taqman® PCR Número de Reações µl cada Concentração Fi- nal H2O 0,5 µL - PVP (10%) 0,1 µL 0,1% ROCHE 2X Master Mix 5 µL 1X Iniciador de Sentido Direto do 0,4 µL 0,4 µM Gene (10 µM) Iniciador de Sentido Reverso 0,4 µL 0,4 µM do Gene (10 µM) Sonda Gênica UPL#125 (5 µM) 0,4 µL 0,2 µM Iniciador de Sentido Direto de 0,4 µL 0,4 µM Invertase (10 µM) Iniciador de Sentido Reverso 0,4 µL 0,4 µM de Invertase (10 µM) Sonda de Invertase (5µM) 0,4 µL 0,2 µM Molde de DNA 2,0 µL - Volume Total de Reação 10 µL -

[00187] O nível da fluorescência que foi gerada para cada reação foi analisado usando o Termociclador LightCycler Roche 480™ de a- cordo com instruções do fabricante. A porção fluorescente FAM foi ex- citada em uma densidade ótica de 465/510 nm e a porção fluorescente HEX foi excitada em uma densidade ótica de 533/580 nm. O número de cópias foi determinado pela comparação de valores Al- vo/Referência de amostras desconhecidas (saída por LightCycler 480™) a valores Alvo/Referência de quatro padrões de números de cópias conhecidos (Nulo, 1 cópia (hemi), 2 cópias (homo) e 4 cópias).

Tabela 4. Condições de termociclador para amplificação por PCR. Etapas de Temp (°C) Tempo No. de ciclos

PCR Etapa-1 95 10 minutos 1 95 10 segundos 40 Etapa-2 59 35 segundos 72 1 segundo Etapa-3 40 10 segundos 1

[00188] Os resultados a partir da análise do número de cópias de transgene de plantas transgênicas obtidas via transformação com um construto de promotor de ZmUbi1 bidirecional (pDAB108706), e de plantas transgênicas obtidas via transformação com um construto de YFP de promotor de ZmUbi1 unidirecional controle (pDAB101556) são mostrados na Tabela 5. Somente as plantas com 1-2 cópias do trans- gene yfp foram transferidas para a estufa para análises de expressão adicionais. Tabela 5. Estimativa de número de cópias de transgene das plantas transgênicas obtidas de construto de promotor bidirecional e construto de controle. Número de Número de E- 1-2 Cópias de Construto Embriões ventos Positi- yfp Transformados vos pDAB101566 100 31 13 pDAB108706 110 29 12 EXEMPLO 6: Expressão Estável de Planta Inteira de Genes Ope- racionalmente Ligados a um Promotor de Ubiquitina-1 Bidirecio- nal Sintético.

[00189] As plantas inteiras que continham um baixo número de có- pias de T-DNA do plasmídeo binário pDAB108706, e plantas que con- tinham baixo número de cópias do plasmídeo binário de controle pDAB101556, são cultivadas em uma estufa. São analisados os e- xemplos representativos da expressão estável de YFP em folha e teci- do de raiz de plantas T0 de milho transgênico obtidas de embriões de Z. mays transformados com pDAB108706. O promotor de ZmUbi1 bidi- recional pode controlar a expressão robusta de sequências codifican- tes de yfp tanto em tecidos de folhas como tecidos de raízes. A análise por microscopia também confirma que o elemento promotor mínimo no promotor de ZmUbi1 bidirecional Min-UbiP1 pode direcionar um plas- mídeo binário de controle (pDAB101556) que contém um promotor de ZmUbi1 unidirecional que controla a expressão de sequência codifi- cante de yfp. Estas plantas controle também mostram a expressão de YFP estável em tecidos de folhas e tecidos de raízes. EXEMPLO 7: Análise de Western Blot de Genes Operacionalmente Ligados a um Promotor de Ubiquitina-1 Bidirecional Sintético

[00190] Proteína Solúvel Total: Plantas T0 de milho transformadas foram escolhidas no estágio de desenvolvimento V6. Um total de qua- tro punções de folha da folha aberta mais jovem foram amostradas em um tubo matriz e colocadas em uma caixa matriz. Como um controle negativo, quatro punções de folha de duas plantas B104 de milho não transformadas no estágio de desenvolvimento V6 foram escolhidos em um tubo matriz. Uma conta de aço foi colocada nos tubos matrizes com as amostras, e em seguida 400 L de PBST foram adicionados a cada tubo. Os tubos foram fechados, e a proteína foi extraída via gol- pes de conta em 1500 rpm durante 5 minutos em um triturador de teci- do Kleco™. O fragmento foi peletizado via centrifugação. Uma amostra de 5 L de cada tubo foi diluída a 25 L com PBST em uma placa de microtítulo de 96 poços. Estas amostras foram analisa- das para a proteína solúvel total usando um kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL) de acordo com instruções do fabricante. Os padrões de albumina sérica bovina (BSA) fornecidos no kit foram analisados em duplicata, e a média dos valores foi usada para gerar uma curva padrão que foi posteriormente usada para calcu- lar a proteína solúvel total de cada amostra. A proteína solúvel total de cada amostra então foi normalizada a mg/µL. Tabela 6. Protocolo de Western blot. Etapa Condição Tempo Primeira Lavagem PBST 5 min. 2 g/mL de anti-PhiYFP de coelho Hibridização Pri- (Axxora, San Diego, CA) em Star- 60 min. mária tingBlock™ T20 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) Enxágue PBST 3 x 5 min. anti-IgG de coelho de cabra con- Hibridização Se- jugada à peroxidase de rábano 30 min. cundária silvestre (HRP) Segunda Lavagem PBST 3 x 5 min. Enxágue PBS 3 x 2 min.

[00191] Análise de Western Blot de YFP/Phiyfp: Na placa de micro- título de 96 poços, cada amostra de 5 L da proteína extraída é diluída com 5 L de Tampão 2x Laemmli + 2-β-mercaptoetanol. As amostras controle de YFP/Phiyfp purificado no tampão HEPES (HEPES 50 mM, KCl 200 mM, glicerol 10%) são adquiridas de Axxora (San Diego, CA). As amostras são preparadas na mesma placa diluindo-se 1:1 com o tampão Laemmli para produzir uma curva padrão das seguintes con- centrações: 0,5 ng/µL, 0,25 ng/µL e 0,125 ng/µL. As amostras são a- quecidas em um Termociclador a 95 °C por 30 minutos , e em seguida resfriadas a 4°C. Um gel Bio-Rad Criterion™ então é montado usando o tampão MES/SDS. Permite-se que as amostras se aqueçam à tem- peratura ambiente, e 10 L da amostra são carregados em cada poço de dois géis. Além disso, as amostras de YFP/Phiyfp purificado usado para uma curva padrão e marcador escada de proteína, são carrega- das em poços do gel. Os géis passam por eletroforese executada em 150 V e 150 mA por 90 min. Após a execução, as placas de gel são abertas e as proteínas são transferidas para uma membrana de nitro- celulose usando iBlot System™ (Invitrogen). A proteína é transferida do gel para a membrana pela execução de uma corrente de 20 V por minutos. A membrana de nitrocelulose é removida e colocada no tampão de bloqueio StartingBlock T20™ durante a noite a 4°C. O tam- pão de bloqueio então é descartado, e a membrana é processada u- sando o protocolo apresentado na Tabela 6.

[00192] A ligação de anticorpo é detectada usando Amersham E- CL™ mais o sistema de detecção quimioluminescente seguindo as instruções do fabricante. O filme é exposto em 10 minutos e 30 minu- tos. O filme exposto de 10 minutos é usado para quantificar a proteína, e o filme de exposição mais longa de 30 minutos é usado para confir- mar a ausência da proteína em B104 e outras amostras controle. A membrana é envolvida com uma banda nas costas do filme exposto, e a proteína é quantificada via análise de densidade de pixels. A densi- dade de pixels dos padrões de proteína purificada é primeiro usada para gerar uma curva padrão que é usada para quantificar a proteína nas amostras. Embora a membrana mostre bandas de um monômero e dímero de PhiYFP até no padrão purificado, somente o monômero de PhiYFP é usado para quantificar a expressão proteica. Os valores da proteína então são normalizados a ng/µL. A proporção da proteína solúvel total (TSP) normalizada a PhiYFP é calculada às unidades de ng de YFP/mg de TSP, ou alternativamente, partes por milhão (ppm).

[00193] Análise de Western Blot de GUS: Expressão da proteína GUS é quantificada de uma maneira similar a PhiYFP, com a seguinte exceção: uma amostra de 10 µL do extrato é diluída 1:1 com Laemmli 2x + 2-β-mercaptoetanol, desnaturada em 95°C por 30 minutos , e em seguida 15 µL são carregados no gel. As membranas processadas com o filme (exposição de 1 minuto) são sobrepostas com a membra- na da análise de densidade de pixels. Os resultados de uma análise de Western blot de 12 plantas T0 de mi- lho transgênico obtidas de embriões de Z. mays transformados com o vetor binário, pDAB108706, são mostrados na FIG. 11. O promotor de ZmUbi1 bidirecional mostra a expressão robusta de sequências codifi- cantes de yfp e GUS do tecido da folha. Esta observação confirma que o elemento promotor mínimo do promotor de ZmUbi1 bidirecional Min- UbiP1 expressou YFP em níveis de expressão similares comparando com calo de Z. mays transformado com um plasmídeo binário que con- tém um promotor de ZmUbi1 unidirecional que controla a sequência codificante de yfp (pDAB101556; ver a FIG. 12). EXEMPLO 8: Construto de uma Pilha de Cassete de Quatro genes

[00194] Um construto de plasmídeo pDAB105803 é usado como o plasmídeo inicial para gerar uma pilha de cassete de quatro genes (a- ad1-2a-Phiyfp e cry34-2a-cry35) controlado pelo promotor de Ubiquiti- na-1 bidirecional único de Zea mays. Um mapa representativo do plasmídeo pDAB105803 é mostrado na FIG. 16, que contém um pro- motor de Ubiquitina-1 bidirecional de Zea mays.

[00195] O fragmento aad1-2a-Phiyfp derivado do plasmídeo pDAB105841 é clonado no esqueleto de vetor de corte de SacI e Ba- mHI do plasmídeo pDAB105803 usando métodos de clonagem comu- mente conhecidos na técnica. Isto resultou no plasmídeo intermediário pDAB105842 (FIG. 17). Um fragmento cry34(8V6)-2a-cry35 digerido com NotI/XbaI obtido do plasmídeo pDAB105840 é clonado entre os sítios NotI/SpeI do plasmídeo pDAB105842 para construir o plasmídeo pDAB105843. O plasmídeo pDAB105843 contém cassetes gênicos cry34(8V6)-2a-cry35 e aad1-2a-Phiyfp em cada lado do promotor bidi- recional ZmUbi1 (FIG. 18).

Um vetor binário que contém o promotor bidirecional ZmUbi1 e casse- tes de expressão gênica cry34(8V6)-2a-cry35 e Phiyfp-2a-aad1 do plasmídeo pDAB105842 é gerado via uma reação GATEWAY L-R Clonase (Invitrogen, Carlsbad, CA) com um plasmídeo de destino pDAB101917. O vetor resultante, pDAB108717, contém os cassetes de expressão gênica cry34(8V6)-2a-cry35, aad1-2a-Phiyfp, e PAT den- tro das bordas de T-DNA (Fig. 19). EXEMPLO 9: Construto de uma Segunda Pilha de Cassete de Qua- tro genes

[00196] Um construto de plasmídeo pDAB105803 é usado para ge- rar uma segunda pilha de cassete de quatro genes (Phiyfp-2a-aad1 e cry34-2a-cry35) dirigido pelo promotor de Ubiquitina-1 bidirecional úni- co de Zea mays. Um fragmento Phiyfp-2a-aad1 derivado do plasmídeo pDAB105844 é clonado no esqueleto de vetor de corte de SacI e Ba- mHI do plasmídeo pDAB105803 usando métodos de clonagem comu- mente conhecidos na técnica. Isto resultou no plasmídeo intermediário pDAB105845 (FIG. 20). Um fragmento cry34(8V6)-2a-cry35 digerido com NotI/XbaI obtido do plasmídeo pDAB105840 é clonado entre os sítios NotI/SpeI do plasmídeo pDAB105845 para construir o plasmídeo pDAB105846 (FIG. 21). O plasmídeo pDAB105846 contém cry34(8V6)-2a-cry35 e cassetes gênicos Phiyfp-2a-aad1 em cada lado do promotor bidirecional ZmUbi1. Um vetor binário que contém o promotor bidirecional ZmUbi1 e casse- tes gênicos cry34(8V6)-2a-cry35 e Phiyfp-2a-aad1 do plasmídeo pDAB105846 é gerado via uma reação GATEWAY L-R Clonase (Invi- trogen, Carlsbad, CA) com um plasmídeo de destino pDAB101917. O vetor resultante, pDAB108718, contém os cassetes de expressão gê- nica cry34(8V6)-2a-cry35, Phiyfp-2a-aad1, e PAT dentro das bordas de T-DNA (FIG. 21). EXEMPLO 10: Transformação da Cepa de Agrobacterium tumefa-

ciens DAt13192 Os vetores binários pDAB108717 e pDAB108718 são transformados na cepa ternária DAt13192 de Agrobacterium tumefaciens (ver o Ped. de Pat. Prov. U.S. No. 61/368965). As colônias bacterianas são isola- das e DNA de plasmídeo binário é extraído e verificado via digestões com enzima de restrição. EXEMPLO 11: Transformação em Milho

[00197] Esterilização de Espiga e Isolamento de Embrião: Para ob- ter embriões imaturos de milho, plantas de Zea mays (c.v. B104) são cultivados em estufa e autopolinizadas ou polinizadas com parentesco para produzir espigas. As espigas são coletadas pós-polinização apro- ximadamente 9-12 dias. No dia do experimento, as espigas são esteri- lizadas superficialmente pela imersão em uma solução 20% de alve- jante doméstico, contendo hipoclorito de sódio 5%, e agitado durante 20-30 minutos, seguidos de três enxágues em água estéril. Após este- rilização, os embriões zigóticos imaturos (1,5-2,2 mm) são asseptica- mente dissecados de cada espiga e randomicamente distribuídos em tubos de microcentrífuga que contêm meios líquidos de infecção (Meio de Base LS, 4,43 g/L; Solução de Vitamina N6 [1000X], 1,00 mL/L; L- prolina, 700,0 mg/L; sacarose, 68,5 g/L; glicose, 36,0 g/L; 2,4-D, 1,50 mg/L. Para um dado conjunto de experimentos, os embriões agrupa- dos de 2-3 espigas são usados para cada tratamento.

[00198] Iniciação de Cultura de Agrobacterium: os estoques de gli- cerol de cepas de Agrobacterium que contêm os vetores binários des- critos acima são riscados em placas de meio mínimo AB contendo an- tibióticos apropriados e são cultivados a 20ºC durante 3-4 dias. Uma colônia única é escolhida e riscada em placas YEP que contêm os mesmos antibióticos e é incubada a 28ºC durante 1-2 dias.

[00199] Cultura e cocultivo de Agrobacterium: No dia do experimen- to, as colônias de Agrobacterium são escolhidas da placa YEP, sus-

pensa em 10 mL do meio de infecção em um tubo descartável de 50 mL, e a densidade celular é ajustada a OD600 = 0,2-0,4 nm usando um espectrofotômetro. As culturas de Agrobacterium são colocadas em um agitador rotativo em 115 rpm, temperatura ambiente, enquanto a dissecação de embrião é realizada. Os embriões zigóticos imaturos entre 1,5-2,2 mm no tamanho são isolados dos núcleos de milho este- rilizados e colocados em 1 mL do meio de infecção e lavados uma vez no mesmo meio. A suspensão de Agrobacterium (2 mL) é adicionada a cada tubo e os tubos foram invertidos para aproximadamente 20 vezes então agitados por 10-15 minutos. Os embriões são transferidos para meios de cocultura (Sais MS, 4,33 g/L; L-prolina, 700,0 mg/L; mioinosi- tol, 100,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicam- ba 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 g/L; Gelzan™, 3,00 g/L; vitamina MS modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNO3, 15,0 mg/L; Acetosiringona, 100,0 µM), orientados com revestimento de escutelo, e incubados du- rante 3-4 dias na luz em 25ºC.

[00200] Expressão transiente de YFP/Phiyfp: a expressão transien- te de YFP/Phiyfp pode ser observada em embriões transformados a- pós 3 dias de cocultura com Agrobacterium. Os embriões são obser- vados sob um estereomicroscópio (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL) usando filtro de YFP e fonte de luz de 500 nm.

[00201] Seleção de Calo e Regeneração de Eventos Putativos: A- pós o período de cocultivo, os embriões são transferidos para meios de repouso (sais MS, 4,33 g/L; L-prolina, 700,0 mg/L; mioinositol, 100,0 mg/L; MES [ácido (2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre], 500,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína, 100,0 mg/L; Dicamba, 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 g/L; Gelzan™, 2,30 g/L; vitamina MS modi- ficada [1000X], 1,00 ml/L; AgNO3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) sem agente seletivo e incubado durante 24 horas de luz com intensidade luminosa de 50 µmol m-2s-1 durante 7 dias a 28ºC. Os em-

briões são transferidos para meios de seleção 1 (sais MS, 4,33 g/L; L- prolina, 700,0 mg/L; mioinositol, 100,0 mg/L; MES [ácido (2-(n- morfolino)-etanossulfônico), ácido livre], 500,0 mg/L; hidrolisado enzi- mático de caseína, 100,0 mg/L; Dicamba, 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 g/L; Gelzan™, 2,30 g/L; vitamina MS modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNO3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L), conter Bialafos 3 mg/L e incubado durante 24 horas de luz com intensidade luminosa de 50 µmol m-2s-1 durante 7 dias a 28ºC.

[00202] Os embriões com calos embriogênicos proliferativos são transferidos para meios de seleção 2 (sais MS, 4,33 g/L; mioinositol, 100,0 mg/L; L-prolina, 700,0 mg/L; MES [ácido (2-(n-morfolino)- etanossulfônico), ácido livre], 500,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína, 100,0 mg/L; Dicamba, 3,30 mg/L; sacarose, 30,0 g/L; Gel- zan™ 2,30 g/L; vitamina MS modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNO3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L), contendo Bialafos 5 mg/L e é incubado durante 24 horas luz com intensidade luminosa de 50 µmol m-2s-1 durante mais 14 dias a 28ºC. Esta etapa de seleção permite o calo transgênico se proliferar mais e diferenciar-se. O período de sele- ção de calo pode durar durante três semanas. Proliferando, calos em- briogênicos são transferidos para meios de regeneração 1 (sais MS, 4,33 g/L; mioinositol, 100,0 mg/L; L-prolina, 350,0 mg/L; MES [ácido (2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre], 250,0 mg/L; hidrolisado enzimático de caseína, 50,0 mg/L; NAA, 0,500 mg/L; ABA, 2,50 mg/L; BA, 1,00 mg/L; sacarose, 45,0 g/L; Gelzan™ 2,50 g/L; vitamina MS modificada [1000X], 1,00 ml/L; AgNO3, 1,00 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L), contendo Bialafos 3 mg/L e cultivados durante 24 horas de luz com intensidade luminosa de 50 µmol m-2s-1 durante 7 dias a 28ºC. Os calos embriogênicos com caule/brotos são transferidos para meios de regeneração 2 (sais MS, 4,33 g/L; vitamina MS modificada [1000X], 1,00 ml/L; mioinositol, 100,0 mg/L; sacarose, 60,0 g/L; Goma Gelana

G434™, 3,00 g/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L), contendo Bialafos 3 mg/L. As culturas são incubadas 24 horas sob luz com intensidade lu- minosa de 50 µmol m-2s-1 durante 7-10 dias a 28ºC. Os caules peque- nos com raízes primárias são transferidos para alongamento de caule e meios de enraizamento (sais MS, 4,33 g/L; Solução de Vitamina N6 [1000X], 1,00 mL/L; mioinositol, 100,0 mg/L; sacarose, 30,0 g/L; ágar 5,50 g/L; em phytatray e são incubados sob 16/8 horas de luz/escuridão em 90 µmol m-2s-1 durante 7 dias a 28ºC. As mudas transgênicas putativas saudáveis são então selecionadas incubadas durante 16/8 horas luz/escuridão em 200 µmol m-2s-1 durante mais 2-5 dias a 25ºC e são analisadas para o número de cópias de transgene e transferidas para a estufa. EXEMPLO 12: Expressão Transiente de Phiyfp A expressão transiente de Phiyfp de embriões de Zea mays transfor- mados com pDAB108717 é realizada. O promotor de ZmUbi1 bidire- cional pode expressar Phiyfp do cassete de expressão gênica aad1- 2a-Phiyfp, onde o embrião não transformado não mostra nenhuma flu- orescência de Phiyfp. O nível similar da expressão de Phiyfp pode ser observado de embriões de Zea mays transformados com um plasmí- deo binário pDAB105748 (FIG. 15) contendo um promotor de Ubi1 u- nidirecional de Zea mays (Zm) que controla a sequência de codifica- ção de Phiyfp única exibiu o nível esperado da expressão de YFP/Phiyfp. A expressão transiente de Phiyfp pode ser observada de embriões de Zea mays transformados com pDAB108718, onde o pro- motor de Zm Ubi1 bidirecional pode expressar Phiyfp do cassete de expressão gênica de Phiyfp-2a-aad1. EXEMPLO 13: Expressão de Phiyfp em Milho Estavelmente Trans- formado

[00203] Expressão de Phiyfp em Calo de Zea mays Estavelmente Transformado Controlado por um Promotor Zm Ubi1 Bidirecional: os embriões de Zea mays transformados com o vetor binário pDAB108717 que contém o cassete de expressão gênica aad1-2a- Phiyfp mostram a boa expressão de Phiyfp. O promotor de Zm Ubi1 bidirecional pode controlar a expressão robusta de Phiyfp. Estes resul- tados confirmam que o elemento promotor mínimo do promotor de Zm Ubi1 bidirecional Min-UbiP1 é capaz de expressar um gene repórter, por exemplo, Phiyfp ou YFP. Os níveis da expressão da proteína de Phiyfp são similares comparando com o calo de Zea mays transforma- do com um vetor binário de controle que continha o promotor de Zm Ubi1 unidirecional que controla a sequência codificante de Phiyfp (pDAB105748). A expressão de Phiyfp não é detectada no calo de controle negativo que não é transformado com um construto binário e não continha sequências codificantes Phiyfp. Os embriões de Zea mays transformados com o vetor binário pDAB108718 que contém o cassete de expressão gênica de Phiyfp mostra boa expressão de Phiyfp-2a-aad1. O promotor de Zm Ubi1 bidi- recional pode controlar a expressão robusta de Phiyfp. Estes resulta- dos confirmam que o elemento promotor mínimo do promotor de Zm Ubi1 bidirecional Min-UbiP1 é capaz de expressar um gene repórter, por exemplo, Phiyfp ou YFP. EXEMPLO 14: Estimativa de Número de Cópia de Transgene

[00204] Estimativa de Número de Cópias de transgene Usando TaqMan™ PCR em Tempo real: as plantas de Zea mays foram trans- formadas com vetores binários que contêm um promotor de Zm Ubi1 bidirecional, pDAB108717and pDAB108718, e outras plantas são transformadas com um vetor binário de controle, pDAB105748. A pre- sença de sequência codificante (Phiyfp, aad1, cry34, cry35, Pat) den- tro do genoma de plantas Z. mays transgênicas para pDAB108717 e pDAB108718 foi confirmada via um ensaio de sonda de hidrólise Taq- Man. As plantas transgênicas para controlar o vetor pDAB105748 fo-

ram analisadas para a presença da sequência de Phiyfp.

As mudas transgênicas estavelmente transformadas de Z. mays que se desen- volveram do calo foram obtidas e analisadas para identificar eventos que continham baixo número de cópias (1-2 cópias) de insertos de fita T inteiros dos vetores binários pDAB108717 e pDAB108718 e vetor binário controle pDAB105748. As mudas confirmadas foram promovi- das para a estufa e cultivadas.

O sistema Roche Light Cycler480™ foi usado para determinar o núme- ro de cópias de transgene de eventos que foram transformados com vetor binário pDAB108717 e pDAB108718. O método utilizou uma rea- ção TaqMan® biplex que empregou oligonucleotídeos específicos para a sequência codificante e para o gene de referência endógeno de Z. mays, invertase (número de Acesso no Genbank: U16123.1), em um ensaio único.

O número de cópias e a zigosidade foram determinados medindo a intensidade da fluorescência específica para a sequência codificante, quanto à fluorescência específica para invertase, compa- rando com padrões de número de cópias conhecidos.

Tabela 7. Iniciador de sentido direto e reverso de nucleotídeo e sondas fluorescentes (sintetizado por Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Nome do Iniciador Sequência do Iniciador Iniciador de Sentido GATGCCTCAGTGGGAAAGG (SEQ ID NO: Direto de YFP 7) Iniciador de Sentido CCATAGGTGAGAGTGGTGACAA (SEQ ID Reverso de YFP NO: 8) Sonda de YFP ROCHE UPL Sonda #125 CTTGGAGC (SEQ ID NO: 40) Cat # 04693604001 (Roche, Indianapolis, IN) Iniciador de Sentido TGGCGGACGACGACTTGT (SEQ ID NO: 9) Direto de Invertase

Iniciador de Sentido AAAGTTTGGAGGCTGCCGT (SEQ ID NO: Reverso de Invertase 10) Sonda de Invertase 5′HEX/CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTA CC/3BHQ_1/3′ (SEQ ID NO: 11) Iniciador de Sentido TGTTCGGTTCCCTCTACCAA (SEQ ID NO: Direto de AAD1 12) Iniciador de Sentido CAACATCCATCACCTTGACTGA (SEQ ID Reverso de AAD1 NO: 13) Sonda de AAD1 CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA (SEQ ID NO: 14) Iniciador de Sentido GCCAACGACCAGATCAAGAC (SEQ ID NO: Direto de Cry34 41) Iniciador de Sentido GCCGTTGATGGAGTAGTAGATGG (SEQ ID Reverso de Cry34 NO: 42) Sonda de Cry34 CCGAATCCAACGGCTTCA (SEQ ID NO: 43) Iniciador de Sentido CCTCATCCGCCTCACCG (SEQ ID NO: 44) Direto de Cry35 Iniciador de Sentido GGTAGTCCTTGAGCTTGGTGTC (SEQ ID Reverso de Cry35 NO: 45) Sonda de Cry35 CAGCAATGGAACCTGACGT (SEQ ID NO: 46) Iniciador de Sentido ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT Direto de PAT (SEQ ID NO: 47) Iniciador de Sentido CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT Reverso de PAT (SEQ ID NO: 48) Sonda de PAT GGTGTTGTGGCTGGTATTGCTTACGCTGG (SEQ ID NO: 49)

[00205] Para amostras de Z. mays transformadas com os vetores binários pDAB108717 e pDAB108718, um fragmento de DNA específi- co para a sequência codificante é amplificado com um conjunto de ini-

ciador/sonda TaqMan® que contém uma sonda marcada com o coran- te fluorescente FAM, e invertase é amplificada com um segundo con- junto de iniciador/sonda TaqMan® que contém uma sonda marcada com fluorescência HEX (Tabela 7). A mistura de reação PCR é prepa- rada como apresentado na Tabela 8, e os fragmentos de DNA especí- ficos para o gene são amplificados de acordo com as condições apre- sentadas na Tabela 9. O número de cópias e a zigosidade das amos- tras são determinados medindo a intensidade relativa da fluorescência específica para a sequência codificante à fluorescência específica para o gene de referência, invertase, comparando com padrões de número de cópias conhecidos.

[00206] Os padrões são criados diluindo o vetor (pDAB108717 e pDAB108717) em DNA genômico B104 de Z. mays (gDNA) para obter padrões com uma relação conhecida de vetor:gDNA. Por exemplo, as amostras que têm uma, duas, e quatro cópias de DNA de vetor por uma cópia do gDNA B104 de Z. mays são preparadas. Uma e duas diluições de cópia do vetor misturado com gDNA B104 de Z. mays pa- drão são validadas contra um evento controle Z. mays que é conheci- do por ser hemizigoto e um evento controle Z. mays que é conhecido por ser homozigoto (Z. mays evento 278; Ver a Publicação Patente Internacional PCT WO No. 2011/022469 A2). Ensaio TaqMan® biplex que utiliza oligonucleotídeos específicos para o gene da sequência co- dificante e oligonucleotídeos específicos para o gene de referência en- dógeno de Z. mays, invertase, é realizado amplificando e detectando um fragmento de DNA específico para o gene para a sequência de co- dificação com um conjunto de iniciador/sonda TaqMan® que contém uma sonda marcada com o corante fluorescente FAM, e amplificando e detectando um fragmento de DNA específico para o gene de inverta- se com um segundo conjunto de iniciador/sonda TaqMan® que con- tém uma sonda marcada com a fluorescência HEX. De acordo com a

Tabela 7, a mistura de reação de TaqMan® da sequência codificante é preparada como apresentado na Tabela 8 e os fragmentos específicos são amplificados de acordo com as condições apresentadas na Tabela

9. Tabela 8. Mistura de reação Taqman® PCR.

Número de Reações µl cada Concentração Final H2O 0,5 µL - PVP (10%) 0,1 µL 0,1% ROCHE 2X Master Mix 5,0 µL 1X Iniciador de Sentido Direto de Sequên- 0,4 µL 0,4 µM cia de Codificação (10 µM) Iniciador de Sentido Reverso de Se- 0,4 µL 0,4 µM quência de Codificação (10 µM) Sonda de Sequência de Codificação 0,4 µL 0,2 µM UPL#125 (5 µM) Iniciador de Sentido Direto de Invertase 0,4 µL 0,4 µM (10 µM) Iniciador de Sentido Reverso de Inver- 0,4 µL 0,4 µM tase (10 µM) Sonda de Invertase (5µM) 0,4 µL 0,2 µM Molde de DNA 2,0 µL - Volume de reação total 10 µL -

[00207] O nível da fluorescência gerada para cada reação é anali- sado usando Termociclador LightCycler Roche 480™ de acordo com instruções do fabricante. A porção fluorescente FAM é excitada em uma densidade ótica de 465/510 nm e a porção fluorescente HEX é excitada em uma densidade ótica de 533/580 nm. O número de cópias pode ser determinado pela comparação de valores alvo/de referência de amostras desconhecidas (saída por LightCycler 480™) para valores alvo/de referência de quatro padrões de números de cópias conheci- dos (por exemplo, Nulo, de 1 cópia (hemi), de 2 cópias (homo), e de 4 cópias). Tabela 9. Condições de termociclador de amplificação por PCR. Etapas de Temp (°C) Tempo No. de ciclos

[00208] Os resultados da análise do números de cópias de transge- ne de plantas transgênicas obtidas via transformação com construtos de promotor de ZmUbi1 bidirecional (pDAB108717 e pDAB108718), e de plantas transgênicas obtidas via transformação com um construto do promotor de ZmUbi1 unidirecional controle Phiyfp (pDAB105748) é resumido na Tabela 10. Somente as plantas com 1-2 cópias de todos transgenes são transferidas para a estufa para análises de expressão adicionais. Tabela 10. Estimativa de número de cópias de transgene das plantas transgênicas obtidas de promotor bidirecional e construtos de controle. Número de Número de 1-2 Cópias de Construto Embriões Eventos todos os genes Transformados Positivos pDAB108717 314 66 14 pDAB108718 252 63 10 pDAB105748 32 8 2 EXEMPLO 15: Expressão Estável de Phiyfp em Plantas T0 de Mi- lho

[00209] Expressão de Phiyfp estável em Plantas T0 de Zea mays Direcionadas pelo Promotor Zm Ubi1 bidirecional: podem ser observa- dos os embriões de Zea mays transformados com o vetor binário pDAB108717 que contém o cassete de expressão gênica aad1-2a- Phiyfp. O promotor de Zm Ubi1 bidirecional pode controlar expressão robusta de Phiyfp tanto nos tecidos do caule quanto nos das raízes. Os resultados confirmam que o elemento promotor mínimo do promo- tor de Zm Ubi1 bidirecional Min-UbiP1 é capaz de expressar um gene repórter, por exemplo, Phiyfp ou YFP que é bicistronicamente fundido com aad1 usando uma sequência 2A. Os níveis da expressão da pro- teína de Phiyfp são similares a embriões transformados de Z. mays com um vetor binário de controle que contém o promotor de Zm Ubi1 unidirecional que controla a sequência codificante de Phiyfp (pDAB105748). A expressão de Phiyfp não é detectada nas plantas de controle negativo que não são transformadas com um construto binário e não contêm sequências codificantes de Phiyfp.

[00210] A expressão de Phiyfp em tecidos de folhas e de raízes de plantas T0 transgênicas de Zea mays para o vetor binário pDAB108718 que contém o cassete de expressão gênica Phiyfp-2a- aad1 pode ser observada. O promotor de Zm Ubi1 bidirecional pode controlar a expressão robusta de Phiyfp. Os resultados confirmam que o elemento promotor mínimo do promotor de Zm Ubi1 bidirecional Min- UbiP1 é capaz de expressar um gene repórter, por exemplo, Phiyfp ou YFP fundido a aad-1 com uma sequência 2A. EXEMPLO 16: Análise de Proteína Cry34, Cry35 e AAD1

[00211] As plantas são escolhidas nas colunas 1-10 de uma caixa matriz em tubos cônicos de 1,5 mL aos quais 1 conta de aço é adicio- nada seguida de PBST+ BSA 0,5% (0,6 mL). A caixa então é golpeada com a conta para moagem da amostra em um Triturador Geno durante minutos em 1500 rpm então centrifugada em 3700 rpm durante 7 minutos a 4ºC.

[00212] Ensaio ELISA de Cry34/35: Em uma placas separada de 96 poços profundos, uma amostra do extrato é diluída 1:200 em PBST + blotto 1%. Dois volumes de 25 µL da amostra diluída então são trans- feridos para separar as placas de 96 poços que foram ordenadas com anti-Cry34 e anti-Cry35 (Meso Scale Discovery). Nas colunas 11 e 12 de cada placa, concentrações de Cry34 e Cry35 padrão em PBST+ blotto 1% são adicionadas (25 µL). As placas então são incubadas agi- tando à temperatura ambiente durante uma hora. As placas então são lavadas com PBST (3x300 µL). Então 25 µL de uma solução de Sulfo- TAG conjugada anti-Cry34 e anti-Cry35 são adicionados a cada um dos poços e incubados com agitação à temperatura ambiente durante uma hora. As placas então são lavadas com PBST (3x300 µL). Um volume de 150 µL Tampão T de leitura (Meso Scale Discovery) então é adicionado e a placa é imediata lida em um leitor SECTOR® 6000. As concentrações de proteínas na amostra podem ser calculadas u- sando a curva padrão para a respectiva proteína gerada da mesma placa.

[00213] Ensaio ELISA de AAD-1: Em uma placas separada de 96 poços profundos, uma amostra do extrato é diluída 1:20 em PBST + BSA 0,5%. Dois volumes de 200 µL da amostra diluída então são transferidos para separar as placas de 96 poços que foram recobertas de anti-AAD1 (fornecido por Acadia Bioscience LLC). Nas colunas 11 e 12 de cada placa, concentrações de AAD1 padrão em PBST + BSA 0,5% são adicionadas (200 µL). Um volume de 50 µL de anti-AAD1 biotinilado então é adicionado a cada um dos poços e as placas são incubadas agitando à temperatura ambiente durante uma hora. As pla- cas então são lavadas com PBST (5x300 µL). Então 100 µL de uma solução de conjugado estreptavidina-fosfato alcalino são adicionados a cada um dos poços e incubados com a agitação à temperatura ambi-

ente durante 30 minutos. As placas então são lavadas com PBST (5x300 µL). Um volume de 100 µL de substrato (p-nitrofenilfosfato, PNPP) então é adicionado e incubado com agitação à temperatura ambiente durante 45 minutos. As placas então são lidas em A405 em leitor de placa SpectraMax M5 (Molecular Devices). As concentrações de proteínas na amostra podem ser calculadas usando a curva padrão gerada da mesma placa. EXEMPLO 17: Análise Proteica de Plantas T0 de Milho

[00214] Análise proteica de plantas T0 de milho direcionadas pelo construto de Promotor de Ubiquitina-1 bidirecional de Zea mays (pDAB108717): análise por ELISA representativa de 11 plantas T0 de milho transgênico obtidas de embriões de Zea mays transformados com pDAB108717 que contém cry34-2a-cry35 e aad1-2a-Phiyfp é re- sumido na Tabela 11. O promotor Zm Ubi1 bidirecional mostra a ex- pressão robusta tanto de sequências codificantes de Cry35 como de Cry34 na folha. Surpreendentemente, os dados proteicos demonstram até a expressão superior de 4 vezes de Cry34 do construto bidirecional pDAB108717 em comparação com construto controlado por Ubi1 de Zm unidirecional. Expressão superior 8-10 vezes similar de proteínas Cry35 e AAD1 também é inesperadamente observada do construto bidirecional pDAB108717 em comparação com construto controlado por Ubi1 de Zm unidirecional. Estas observações mostram que o pro- motor de Ubiquitina-1 bidirecional de Zm único no construto pDAB108717 pode expressar múltiplos genes (por exemplo, Cry34, Cry35 e AAD1) em níveis inesperadamente mais altos comparando com plantas de Zea mays transformadas com um plasmídeo binário que contém o promotor de Ubi1 unidirecional de Zm que dirige os mesmos genes, onde cada sequência codificante é dirigida por um promotor de Zm Ubi1 independente.

[00215] Correlação de expressão de Cry34 e Cry35 de plantas T0 de milho direcionadas pelo construto de Promotor de Ubiquitina-1 bidi- recional de Zea mays (pDAB108717): A análise de correlação entre proteínas Cry34 e Cry35 em 11 plantas T0 de milho transgênico obti- das de embriões de Zea mays transformados com pDAB108717 que contém cry34-2a-cry35 é mostrado na FIG. 23A. Uma correlação muito alta (R Quad =0,98) demonstra a corregulação de forte expressão en- tre Cry34 e Cry35 do cassete de expressão gênica cry34-2a-cry35 controlado pelo promotor de Ubi1 bidirecional de Zm. Tabela 11. Expressão de Cry34/Cry35/AAD1 em plantas transgênicas T0 de milho pDAB108717 ID da Planta Cry34 ng/cm2 Cry35 AAD1 ng/cm2 ng/cm2 108717[1]-032.001 277 294 137 108717[3]-067.001 85 93 130 108717[2]-137.001 427 467 6 108717[1]-027.001 484 563 185 108717[1]-036.001 0 0 -7 108717[2]-107.001 219 296 112 108717[2]-113.001 0 0 -12 108717[2]-115.001 160 175 68 108717[2]-118.001 196 179 -5 108717[2]-125.001 318 335 193 108717[2]-127.001 115 127 101 Zm Ubi-Cry34/Cry35 110 67 18

[00216] Análise proteica de plantas T0 de milho controladas pelo construto de Promotor de Ubiquitina-1 bidirecional de Zea mays (pDAB108718): a análise por ELISA representativa de 11 plantas T0 de milho transgênico obtidas de embriões de Zea mays transformados com pDAB108718 que contém cry34-2a-cry35 é resumido na Tabela

12. O promotor de ZmUbi1 bidirecional mostrou a expressão robusta tanto de sequências codificantes de Cry35 como de Cry34 na folha.

Os dados proteicos demonstram expressão vários vezes mais alta de pro- teínas Cry34, Cry35 e AAD1 do construto bidirecional pDAB108718 comparando com Zm construto unidirecional controlado por Ubi1. Esta observação confirma que o promotor de Ubiquitina-1 bidirecional de Zea mays no construto pDAB108718 expressou múltiplos genes (por exemplo, Cry34, Cry35 e AAD1) em níveis inesperadamente mais al- tos comparando com plantas de Zea mays transformadas com um plasmídeo binário que contém o promotor de Ubi1 de Zm unidirecional que controla os mesmos genes, onde cada sequência codificante con- trolada por um promotor de Ubi1 de Zm independente.

Correlação de expressão de Cry34 e Cry35 de plantas T0 de milho controlada pelo construto de Promotor de Ubiquitina-1 bidirecional de Zea mays (pDAB108718): A análise de correlação entre proteínas Cry34 e Cry35 em 11 plantas T0 de milho transgênico obtidas de em- briões de Zea mays transformados com pDAB108718 que contém cry34-2a-cry35 é mostrado na FIG. 23B.

Uma correlação muito alta (R Quad =0,98) demonstra a corregulação de forte expressão entre Cry34 e Cry35 do cassete de expressão gênica cry34-2a-cry35 controlado pelo promotor de Zm Ubi1 bidirecional.

Tabela 12. Expressão da Cry34/Cry35/AAD1 em plantas transgênicas T0 de milho pDAB108718 Tabela 12. Expressão da Cry34/Cry35/AAD1 em plantas transgênicas T0 de milho pDAB108718 ID da Planta Cry34 ng/cm2 Cry35 ng/cm2 AAD1 ng/cm2 108718[3]-060.001 0 0 -9 108718[3]-048.001 129 155 72 108718[2]-106.001 0 0 -8 108718[3]-061.001 78 109 0 108718[3]-049.001 28 11 -5

108718[3]-053.001 128 175 2 108718[1]-024.001 157 186 0 108718[2]-083.001 177 205 42 108718[2]-085.001 642 642 32 108718[2]-089.001 127 139 50 108718[2]-091.001 175 168 58 108718[2]-100.001 181 188 104 Zm Ubi-Cry34/Cry35 110 67 18 EXEMPLO 18: Empilhamento de Transgene: Promotores Bidire- cionais Sintéticos (dados de T1)

[00217] Expressão gênica de plantas T1 controlada pelos constru- tos de Promotor de Ubiquitina-1 bidirecional de Zea mays: dez a doze eventos de cópia única por construto são selecionados para a análise exceto que o construto de controle pDAB108716 tem somente um e- vento. Cinco plantas/eventos do estágio V6 são testadas e são testa- das três plantas/eventos dos estágios V10-12 e/R3. Os ensaios protei- cos são realizados usando LCMS ou ELISA.

[00218] Os construtos usados neste exemplo são mostrados na FIG. 26. pDAB108706 (ZMUbi bidirecional (-200)) e pDAB108707 (ZMUbi bidirecional (-90)) são construtos com o promotor bidirecional representativo da presente invenção; pDAB101556 (controle de ZmU- bi1-YFP) e pDAB108716 (ZMUbi1 sem promotor mínimo) servem co- mo construtos de controle com promotores unidirecionais.

[00219] Os resultados de expressão exemplares (V6) dos quatro construtos da proteína YFP (LCMS) em ng/cm2 são mostrados na FIG. 27A, e resultados de expressão relativa exemplares (V6) dos quatro construtos de RNA de YFP são mostrados na FIG. 27B.

[00220] Os resultados de expressão exemplares (V6) dos quatro construtos da proteína de GUS (LCMS) em ng/cm2 são mostrados na FIG. 28A, e resultados de expressão relativa exemplares (V6) dos qua-

tro construtos de GUS RNA são mostrados na FIG. 28B.

[00221] Os resultados de expressão exemplares (V6) dos quatro construtos da proteína AAD1 (LCMS) em ng/cm2 são mostrados na FIG. 29A, e resultados de expressão relativa exemplares (V6) dos qua- tro construtos de RNA de AAD1 são mostrados na FIG. 29B.

[00222] Uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) dos quatro construtos da proteína YFP (LCMS) em ng/cm2 é mostrada na FIG. 30A, e os valores médios de pDAB108707, os pDAB108706, pDAB101556 e pDAB108716 são 57,63, 52,66, 49,75, e 0 respectiva- mente. Uma análise estatística dos resultados de expressão relativa (V6) dos quatro construtos de RNA de YFP é mostrada na FIG. 30B, e os valores médios de pDAB108706, os pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 são 9,96, 8,07, 6,95, e 1,01 respectivamente.

[00223] Uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) dos quatro construtos da proteína de GUS (LCMS) em ng/cm2 é mos- trada na FIG. 31A, e os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 são 151,27, 143,22, 0, e 213,17 respectivamente. Uma análise estatística dos resultados de expressão relativa (V6) dos quatro construtos de RNA de GUS é mos- trada na FIG. 31B, e os valores médios de pDAB108706, os pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 são 0,65, 0,78, 0, e 3,03 respectivamente.

[00224] Uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) dos quatro construtos da proteína AAD1 (LCMS) em ng/cm2 é mostra- da na FIG. 32A, e os valores médios de pDAB108706, os pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 são 710,88, 1417,01, 856,58, e 1795,43 respectivamente. Uma análise estatística dos resul- tados de expressão relativa (V6) dos quatro construtos de RNA de AAD1 é mostrada na FIG. 32B, e os valores médios de pDAB108706, os pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 são 1,33, 1,37, 1,93, e

2,93 respectivamente.

[00225] As FIGS. 33A, 33B, e 33C mostram resultados de expres- são exemplares (V10) dos quatro construtos de proteína YFP, AAD1 e GUS (LCMS) em ng/cm2 respectivamente.

[00226] As FIGS. 34A, 34B, e 34C mostram a análise estatística dos resultados de expressão (V10) dos quatro construtos de proteína YFP, GUS e AAD1 (LCMS) em ng/cm2 respectivamente. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 de YFP (FIG. 34A) são 71,77, 81,81, 49,58, e 23,01 respectivamente. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 de GUS (FIG. 34B) são 109,63, 98,25, 0, e 138,02 res- pectivamente. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 de AAD1 (FIG. 34C) são 666,11, 597,80, 715,12, e 1002,84 respectivamente.

[00227] As FIGS. 35A, 35B, e 35C mostram resultados de expres- são exemplares (R3) dos quatro construtos de proteína YFP, GUS e AAD1 (LCMS) em ng/cm2 respectivamente.

[00228] As FIGS. 36A, 36B, e 36C mostram a análise estatística dos resultados de expressão (R3) dos quatro construtos de proteína YFP, GUS e AAD1 (LCMS) em ng/cm2 respectivamente. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 de YFP (FIG. 36A) são 91,38, 49,49, 21,67, e 0,40 respectivamente. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 de GUS (FIG. 36B) são 5,52, 16,81, 1,07, e 46.60 res- pectivamente. Os valores médios de pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556 e pDAB108716 de AAD1 (FIG. 36C) são 156,71, 153,44, 165,40, e 197,80 respectivamente. Os resultados mostram que os promotores de Ubi1 bidirecionais de milho da presente invenção podem controlar a expressão robusta de GUS e YFP, onde a expressão de YFP do promotor de Ubi1 bidirecio-

nal do Milho é similar à YFP controlado por Ubi1 unidirecional de mi- lho. Os resultados também sugerem que a transcrição bidirecional tem efeito não significativo sobre a expressão de GUS (expressão de GUS em comparação com os construtos sem o promotor mínimo sem ex- pressão de YFP). EXEMPLO 19: Uma Combinação do Promotor Bidirecional e Se- quência de Bicistrônica 2A para Controlar Quatro Transgenes de Um Promotor Único (dados de T1)

[00229] Expressão gênica de plantas T1 controlada pelos constru- tos de Promotor de Ubiquitina-1 bidirecional de Zea mays: dez a doze eventos de cópia únicos por construto são selecionados para a análise exceto que os construtos de controle têm quatro ou cinco eventos por construto. Cinco plantas/eventos do estágio V6 são testadas e são tes- tadas três plantas/eventos dos estágios V10-12 e/R3. Os ensaios pro- teicos são realizados usando LCMS ou ELISA.

[00230] A FIG. 37A mostra os resultados de expressão relativa e- xemplares (V6) de RNA de Cry34 dos quatro construtos pDAB105748 (ZMUbi1-YFP), pDAB105818 (ZMUbi1-Cry34/ZMUbi1-Cry35/ZMUbi1- AAD1), pDAB108717 (YFP/AAD-1-ZMUbi1 bidirecional-Cry34-Cry35) e pDAB108718 (AAD1/YFP-ZMUbi1 bidirecional-Cry34-Cry35). A FIG. 37B mostra os resultados de expressão relativa exemplares (V6) da proteína Cry34 (LCMS) dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[00231] A FIG. 38A mostra os resultados de expressão relativa e- xemplares (V6) de RNA de AAD1 dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718. A FIG. 38B mostra os re- sultados de expressão relativa exemplares (V6) da proteína de AAD1 (LCMS) dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[00232] A FIG. 39A mostra os resultados de expressão relativa e-

xemplares (V6) de RNA de YFP dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718. A FIG. 39B mostra os re- sultados de expressão relativa exemplares (V6) da proteína YFP (LCMS) dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[00233] A FIG. 40A mostra os resultados de expressão relativa e- xemplares (V6) de RNA de Cry35 dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718. A FIG. 40B mostra os re- sultados de expressão relativa exemplares (V6) da proteína Cry35 (E- LISA) dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[00234] A FIG. 41 mostra os resultados de expressão relativa e- xemplares (V6) de RNA de PAT dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[00235] A FIG. 42A mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) de RNA de Cry34 dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os va- lores médios 0, 2,42, 2,67, e 2,25 respectivamente. A FIG. 42B mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) da proteína Cry34 dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os valores médios 0, 596,94, 2044,73, e 719,18 respectivamente.

[00236] A FIG. 43A mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) de RNA de AAD1 dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os va- lores médios 0, 1,98, 2,68, e 2,03 respectivamente. A FIG. 43B mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) da proteína AAD1 dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os valores médios 0, 2237,54, 5763,88, e 2379,15 respectivamente.

[00237] A FIG. 44A mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) de RNA de YFP dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os va- lores médios 3,59, 0, 2,78, e 1,95 respectivamente. A FIG. 44B mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) da proteína YFP dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os valores médios 1420,69, 251,68, 1154,04, e 706,04 respectivamente.

[00238] A FIG. 45A mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) de RNA de Cry35 dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os va- lores médios 0, 1,12, 3,74, e 3,20 respectivamente. A FIG. 45B mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) da proteína Cry35 dos mesmos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com os valores médios 0, 283,54, 635,83, e 90,97 respectivamente.

[00239] A FIG. 46 mostra uma análise estatística dos resultados de expressão (V6) de RNA de PAT dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718 com valores médios 1,56, 0,07, 1,46, e 1,01 respectivamente.

[00240] As FIGS. 47A, 47B, 47C, e 47D mostram resultados de ex- pressão proteica exemplares (V10) de YFP, AAD1, Cry34 e Cry35 res- pectivamente dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[00241] As FIGS. 48A, 48B, 48C, e 48D mostram a análise estatís- tica dos resultados de expressão proteica (V10) de YFP, AAD1, Cry34 e Cry35 respectivamente dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[00242] As FIGS. 49A, 49B, 49C, e 49D mostram resultados de ex- pressão proteica exemplares (R3) de YFP, AAD1, Cry34 e Cry35 res-

pectivamente dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[00243] As FIGS. 50A, 50B, 50C, e 50D mostram a análise estatís- tica dos resultados de expressão proteica (R3) de YFP, AAD1, Cry34 e Cry35 respectivamente dos quatro construtos pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717 e pDAB108718.

[00244] A FIG. 51 mostra resultados exemplares de Western blot de expressão proteica de Cry34, Cry35 e AAD1 de pDAB108718 e pDAB108717.

[00245] Os resultados mostram que os quatro transgenes nos cons- trutos controlados pelos promotores únicos são funcionais com bons níveis de expressão. Três genes (Cry34/Cry35/AAD1) na pilha bidire- cional Ubi1 mostram níveis de expressão robustos como similar aos níveis de expressão fornecidos pela pilha gênica Ubi1-dirigida única (DExT). Embora diversos aspectos e modalidades exemplares tenham sido discutidos acima, aqueles especialistas na técnica reconhecerão cer- tas modificações, permutações, adições e subcombinações destas. Por isso, é destinado que as seguintes reivindicações acrescentadas e reivindicações introduzidas posteriormente são interpretadas para in- cluir todas tais modificações, permutações, adições e subcombinações como são no seu espírito verdadeiro e escopo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polinucleotídeo sintético, caracterizado pelo fato de que compreende um elemento promotor de núcleo mínimo de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou Zea luxurians, em que, preferencialmen- te, o polinucleotídeo sintético preenche pelo menos um dos seguintes: (i) o elemento promotor de núcleo mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 75% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou a seu complemento; (ii) o elemento promotor de núcleo mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1 e 15 a 39; (iii) o elemento promotor de núcleo mínimo compreende a SEQ ID NO: 1 ou seu complemento.

2. Polinucleotídeo sintético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um dos seguintes: (i) um éxon de um gene de Ubiquitina-1 de um íntron de gene de Ubiquitina-1, preferencialmente, o éxon é de um gene de Ubi- quitina-1 de Zea mays ou Zea luxurians; (ii) uma sequência reguladora a montante (URS) do gene de Ubiquitina-1, em que, preferencialmente, a sequência reguladora a montante compreende SEQ ID NO: 4 ou seu complemento; (iii) um elemento selecionado do grupo consistindo em uma sequência reguladora a montante (URS), um elemento reforçador, um éxon, um íntron, um sítio de iniciação de transcrição, um TATA box, um elemento de consenso de choque térmico e combinações destes; (iv) uma sequência de nucleotídeos de interesse ligada operavelmente ao elemento promotor de núcleo mínimo.

3. Polinucleotídeo sintético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um segundo ele mento promotor de núcleo mínimo de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou Zea luxurians, em que dois elementos promotores de núcleo mínimos estão em orientação complementar reversa um em relação ao outro no polinucleotídeo, e preferencialmente compreende ainda pelo menos um dos seguintes: (i) um éxon de um gene de Ubiquitina-1 de um íntron de gene de Ubiquitina-1, preferencialmente, compreendendo a SEQ ID NO: 3 ou seu complemento; (ii) uma sequência reguladora a montante (URS) de um ge- ne de Ubiquitina-1, em que, preferencialmente, a sequência reguladora a montante compreende SEQ ID NO: 4 ou seu complemento; (iii) um elemento selecionado do grupo consistindo em uma sequência reguladora a montante (URS), um éxon, um íntron, um sítio de iniciação de transcrição, um TATA box, um elemento de consenso de choque térmico, uma sequência de nucleotídeos de INÍCIO e/ou de PARADA de tradução e combinações destes, preferencialmente, com- preendendo SEQ ID NO: 5 ou seu complemento.

4. Polinucleotídeo sintético de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira sequência de nucleotídeos de interesse operavelmente ligada a um dos elemen- tos promotores de núcleo mínimos, preferencialmente, compreenden- do uma segunda sequência de nucleotídeos de interesse operavel- mente ligada ao elemento promotor de núcleo mínimo que não é ope- ravelmente ligado à primeira sequência de nucleotídeos de interesse.

5. Método para a produção de uma célula transgênica, ca- racterizado pelo fato de que compreende: transformar a célula com o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1 ou 3.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de planta.

7. Célula de planta, caracterizada pelo fato de que compre- ende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1 ou 3.

8. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende a cé- lula de planta, como definida na reivindicação 7.

9. Método para a expressão de uma sequência de nucleotí- deos de interesse em uma célula de planta, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir na célula de planta a sequência de nucleo- tídeos de interesse ligada operavelmente a um meio para iniciar a transcrição de uma maneira independente da direção ou de duas se- quências de nucleotídeos de interesse operavelmente ligadas, prefe- rencialmente, o método compreende introduzir na célula de planta um ácido nucléico compreendendo: (a) a sequência de nucleotídeos de interesse ligada operavel- mente ao meio para iniciar a transcrição de duas sequências de nucle- otídeos de interesse ligadas operavelmente; e (b) uma segunda sequência de nucleotídeos de interesse liga- da operavelmente ao meio para iniciar a transcrição de duas sequên- cias de nucleotídeos de interesse ligadas operavelmente.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o meio para iniciar a transcrição de duas sequências de nucleotídeos de interesse operavelmente ligadas compreende SEQ ID NO: 5 ou seu complemento, em que, preferencialmente, o ácido nu- cleico é introduzido na célula vegetal para direcionar, a um sítio prede- terminado no DNA da célula vegetal, a sequência de nucleotídeos de interesse operavelmente ligada aos meios para iniciar a transcrição de duas sequências de nucleotídeos operavelmente ligadas de interesse, em que, mais preferencialmente, a sequência de nucleotídeos de inte- resse operavelmente ligada aos meios para iniciar a transcrição de du- as sequências de nucleotídeos de interesse operavelmente ligadas é direcionada ao sítio predeterminado utilizando recombinação mediada por nuclease de dedo de Zinco, em que, preferencialmente, o dito construto nucleico permite a expressão de pelo menos quatro genes.

11. Construto de ácido nucléico para a expressão de múlti- plos genes em células e/ou tecidos de plantas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um promotor bidirecional; e (b) dois cassetes de expressão gênica sobre extremi- dades opostas do promotor bidirecional; em que pelo menos um dos cassetes de expressão gênica compreende dois ou mais genes ligados através de um interruptor de tradução, em que, preferencialmente, o construto de ácido nucléico pre- enche pelo menos um dos seguintes: (i) o promotor bidirecional não compreende uma sequência viral; (ii) o promotor bidirecional compreende pelo menos um po- tencializador; (iii) o construto de ácido nucleico compreende um vetor bi- nário de transformação mediada por Agrobacterium; (iv) o promotor bidirecional compreende um elemento sele- cionado do grupo consistindo de uma sequência reguladora a montan- te (URS), um elemento potencializador, um éxon, um íntron, um sítio de início de transcrição, um TATA box, um elemento consenso de choque térmico e combinações destes; (v) o promotor bidirecional compreende um elemento pro- motor de centro mínimo de um gene de Ubiquitina-1 de Zea mays ou Zea luxurians, em que, preferencialmente, o dito promotor bidirecional compreende ainda um segundo promotor de núcleo mínimo de Zea mays ou Zea luxurians, em que dois elementos promotores de núcleo mínimos estão em orientação complementar reversa um em relação ao outro, ou o dito elemento promotor de núcleo mínimo compreende uma sequência de polinucleotídeos pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou seu complemento, ou dito promotor bidirecional compreende um éxon de um gene de Ubiquitina-1 e/ou um íntron de um gene de Ubi- quitina, em que ainda mais preferencialmente, o dito promotor bidireci- onal compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 3 ou seu com- plemento, ou o dito promotor bidirecional compreende sequências a montante reguladoras de um gene de Ubiquitina, em que, preferenci- almente, as sequências a montante reguladoras de um gene de Ubi- quitina compreendem um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 4 ou seu complemento; (vi) o promotor bidirecional compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 5 ou seu complemento; (vii) o promotor bidirecional compreende uma sequência re- guladora a montante (URS) de um gene de Ubiquitina, em que, prefe- rencialmente, o dito promotor bidirecional compreende: (a) um promotor diferente de um promotor de um gene de Ubiquitina; e (b) uma sequência reguladora a montante (URS) de um ge- ne de Ubiquitina, (viii) ambos os cassetes de expressão gênica compreen- dem dois ou mais genes ligados através de um interruptor de tradução; (ix) o interruptor de tradução é selecionado do grupo con- sistindo de um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES), um sítio de splicing alternativo, um sítio de clivagem de ribozima, uma sequên- cia de polinucleotídeos que codifica um peptídeo 2A, uma sequência de polinucleotídeos que codifica um peptídeo 2A-like, uma sequência de polinucleotídeos que codifica uma inteína, uma sequência de poli- nucleotídeos que codifica um sítio de clivagem de protease e combina- ções destes;

(x) um gene a montante do interruptor de tradução não compreende um códon de parada de tradução; (xi) o construto de ácido nucleico permite a expressão de genes entre três e vinte, em que, preferencialmente, o dito construto de ácido nucleico permite a expressão de genes entre quatro e oito; (xii) a expressão de genes do promotor bidirecional é pelo menos quatro vezes mais alta comparando com um promotor unidire- cional; (xiii) a expressão de genes do promotor bidirecional é de três a dez vezes mais alta comparando com um promotor unidirecio- nal.

12. Método para gerar uma planta transgênica ou uma célu- la transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende transformar a célula ou a célula de planta com o construto de ácido nucléico, como definido na reivindicação 11.

13. Célula de planta ou planta transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende o construto de ácido nucléico, como de- finido na reivindicação 11, em que, preferencialmente, o construto de ácido nucléico é transformado de modo estável na célula de planta ou nas células da planta transgênica.

14. Método para a expressão de múltiplos genes em células e/ou tecidos de plantas, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir nas células e/ou nos tecidos de plantas o construto de ácido nucléico, como definido na reivindicação 11, em que, preferencialmen- te, as células e/ou tecidos de plantas são transformadas(os) de modo estável com o construto de ácido nucléico, como definido na reivindi- cação 11.

15. Vetor binário para transformação mediada por Agrobacte- rium, caracterizado pelo fato de que compreende o construto de ácido nucléico, como definido na reivindicação 11 ou o polinucleotídeo sinté-

tico, como definido na reivindicação 1.

16. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretiza- ções ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicial- mente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apre- sentados.