JP2013526832A - Aad−1イベントdas−40278−9、関連するトランスジェニックトウモロコシ系統およびそのイベント特異的同定 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、部分的に、植物育種および除草剤耐性植物に関する。本発明は、トウモロコシ細胞のゲノム内の特定の位置に挿入された、本明細書に記載される主題のaad−1ポリヌクレオチド配列を含むトウモロコシ植物(メイズ(maize))の新規な形質転換イベントを含む。いくつかの実施形態において、上記のポリヌクレオチド配列は、例えばその他の除草剤耐性遺伝子(複数可)および/または昆虫阻害タンパク質をコードする遺伝子(複数可)のようなその他の形質と「掛け合わせる」ことができる。いくつかの実施形態において、上記のポリヌクレオチド配列は、切り出して、その後、追加のポリヌクレオチド配列を用いて再び標的にすることができる。しかし、主題の発明は、本明細書に記載されるように単一イベントを有する植物を含む。
品種は、
(i)それが、最初の品種に支配的に由来するか、またはそれ自体が最初の品種に支配的に由来する品種に由来するが、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせに起因する本質的な特徴の発現を保持し、
(ii)それが、最初の品種から明確に区別でき、
(iii)導出の働きに起因する相違を除いて、それが、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせに起因する必須の特徴の発現における最初の品種と同様になる
場合、別の品種(「最初の品種」)に従属するとみなされる。
ポリヌクレオチドまたはそれより長い長さである。このようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な配列類似性を有するが、標的配列と異なり、標的配列とハイブリダイズする能力を保持するプローブを、従来の方法により設計できる。
もしくはそれより多くのヌクレオチド塩基対(+または−上で列挙する任意の増分)の組み合わさった長さの範囲であり得る。代わりに、プライマー対は、挿入ヌクレオチド配列全体を含むアンプリコンを生成するように、挿入されたDNAの両側のフランキング配列に由来できる。植物ゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入されたDNA配列からのある距離に位置し得る。この距離は、1ヌクレオチド塩基対から約2万ヌクレオチド塩基対までの範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、DNA熱増幅反応において形成されることがあるプライマーダイマーを特に除く。
AAD−1 アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−1
bp 塩基対
℃ セ氏度
DNA デオキシリボ核酸
DIG ジゴキシゲニン
EDTA エチレンジアミン四酢酸
kb キロベース
μg マイクログラム
μL マイクロリットル
mL ミリリットル
M モル質量
OLP オーバーラッププローブ
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PTU 植物転写単位
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SOP 標準操作手順
SSC 塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムの混合物を含有するバッファー溶液、pH7.0
TBE Trisベース、ホウ酸およびEDTAの混合物を含有するバッファー溶液、pH8.3
V ボルト
[実施例]
AAD1イベントであるpDAS1740−278を、メイズ系統Hi−IIのウィスカー(WHISKER)媒介形質転換により生成した。用いる形質転換法は、米国特許出願公開第20090093366号に記載されている。プラスミドpDAS1740(pDAB3812ともよばれる)のFspI断片(図1)を、メイズ系統に形質転換した。このプラスミド構築物は、RB7 MARv3::ゼア・メイズ(Zea mays)ユビキチン1プロモーターv2//AAD1 v3//ゼア・メイズPER5 3’UTR::RB7 MARv4植物転写ユニット(PTU)を含有する植物発現カセットを含有する。
サザンブロット解析を用いて、挿入されたDNA断片の組み込みパターンを確立し、イベントpDAS−1740−278−9(DAS−40278−9)におけるaad−1遺伝子の挿入断片/コピーの数を決定した。データを得て、トウモロコシゲノムに挿入されたaad−1導入遺伝子の組み込みおよび完全性を証明した。
トウモロコシの葉の試料の回収およびゲノムDNA(gDNA)の単離
gDNAを、aad−1トウモロコシイベントDAS−40278−9の個別の植物の葉から調製した。gDNAを、aad−1トウモロコシイベントDAS−40278−9を有する個別の植物から収穫した葉組織から抽出した。イベントDAS−40278−9の5つの異なる世代からのトランスジェニックトウモロコシ種子を用いた。世代あたり4つの植物に由来する、イベントDAS−40278−9についての20の個別のトウモロコシ植物を選択した。さらに、gDNAを、従来のトウモロコシ植物XHH13から単離したが、これは、本質の系統の代表である遺伝子背景を含有し、aad−1遺伝子は存在しない。
DNA消化および分離
DNAの分子特徴決定のために、トウモロコシイベントDAS−40278−9 DNA試料および従来の対照からの9マイクログラム(9μg)のゲノムDNAを、DNA1μgあたりに選択された制限酵素をおよそ5〜11単位と対応する反応バッファーとを各DNA試料に加えることにより消化した。各試料を、およそ37℃にて一晩インキュベートした。制限酵素EcoRI、NcoI、SacI、FseIおよびHindIIIを消化のために用いた(New England Biolabs、Ipswich、MA)。陽性のハイブリダイゼーション対照試料を、プラスミドDNAであるpDAS1740(pDAB3812)を、従来の対照からのゲノムDNAと、トウモロコシゲノムあたり1コピーの導入遺伝子にほぼ等しい比率で組み合わせることにより調製し、試験試料と同じ手順および制限酵素を用いて消化した。従来のトウモロコシ対照(XHH13)からのDNAを、試験試料と同じ手順および制限酵素を用いて消化して、陰性対照とした。
サザントランスファーおよびメンブレン処理
サザンブロット解析を、Memelinkら(1994) Southern, Northern, and Western Blot Analysis. Plant Mol. Biol. Manual F1:1〜23に記載されるようにして本質的に行った。簡単に述べると、DNA断片の電気泳動分離および視覚化の後に、ゲルを、0.25N HCl(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA)をおよそ15分間用いて脱プリン化し、次いで、変性溶液(AccuGENE、Sigma、St.Louis、MO)におよそ30分間、その後中和溶液(AccuGENE、Sigma、St.Louis、MO)に少なくとも30分間曝露した。サザントランスファーを、ナイロンメンブレン(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)上に、灯心(wicking)システムを10×SSC(Sigma、St.Louis、MO)とともに用いて一晩行った。トランスファーの後に、メンブレンを2×SSC溶液中で洗浄し、DNAをメンブレンにUV架橋により結合させた。このプロセスにより、ハイブリダイゼーションのための準備ができたサザンブロットメンブレンが得られた。
DNAプローブ標識およびハイブリダイゼーション
ナイロンメンブレンと結合したDNA断片を、標識プローブを用いて検出した。この研究のために用いたプローブは、ジゴキシゲニン(DIG)標識ヌクレオチドである[DIG−11]−dUTPのPCRに基づく組み込みにより、プラスミドpDAS1740からの遺伝子要素とその他の領域に特異的なプライマーにより作製された断片から作製した。PCR合成によるDNAプローブの作製は、PCR DIGプローブ合成キット(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)を、製造者が推奨する手順に従って用いて行った。この研究に用いたプローブのリストを、表1に記載する。
検出
プローブハイブリダイゼーションの最後に、プローブを含有するDIG Easy Hyb溶液をきれいなチューブにデカントし、−20℃にて貯蔵した。これらのプローブは、製造者が推奨する手順に従って2〜3回再使用できた。メンブレンブロットを短くすすぎ、きれいなプラスチック容器中で、低ストリンジェンシー洗浄バッファー(2×SSC、0.1%SDS)でおよそ5分間室温にて2回洗浄し、その後、高ストリンジェンシー洗浄バッファー(0.1×SSC、0.1%SDS)で15分間、それぞれおよそ65℃にて2回洗浄した。メンブレンブロットを、次いで、別のきれいなプラスチック容器に移し、DIG洗浄およびブロックバッファーセット(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)からの1×洗浄バッファーでおよそ2分間短く洗浄し、1×ブロッキングバッファー中で最短で30分間のブロッキングと、その後の1×ブロッキングバッファー中での抗DIG−AP(アルカリホスファターゼ)抗体(1:5,000希釈、Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)との最短で30分間のインキュベーションに進んだ。1×洗浄バッファーで2〜3回洗浄した後に、特異的DNAプローブは、メンブレンブロットに結合したままであり、DIG標識DNA標準物質を、CDP−Star化学発光核酸検出システム(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)を製造者の推奨に従って用いて視覚化した。ブロットを化学発光フィルム(Roche Diagnostics、Indianapolis、IN)に、1または複数の時点で露光して、ハイブリダイズしている断片を検出して、分子サイズ標準物質を視覚化した。フィルムを、次いで、All−Pro 100 Plusフィルム現像器(Konica SRX−101)で現像し、画像を報告のために走査した。検出されたバンドの数およびサイズを、各プローブについて文書化した。記載されるようなDIG検出後に視覚化されるDIG標識DNA分子量マーカーII(MWM DIG II)を用いて、サザンブロット上のハイブリダイズしている断片のサイズを決定した。
プローブ除去(stripping)
DNAプローブを、サザンハイブリダイゼーションデータが得られた後にメンブレンブロットから除去させ、メンブレンブロットは、製造者の推奨する手順に従って(DIG Application Manual for Filter Hybridization、(2003). Roche Diagnostics)、異なるDNAプローブとのハイブリダイゼーションのために再使用できた。簡単に述べると、シグナル検出およびフィルム曝露の後に、メンブレンブロットをMilli−Q水で十分にすすぎ、除去バッファー(0.2N NaOH、0.1%SDS)中でおよそ15分間、室温または37℃で2回洗浄した。メンブレンブロットを、次いで、2×SSC中で短く洗浄し、プレハイブリダイゼーションおよび別のDNAプローブとのハイブリダイゼーションの準備ができた。メンブレンブロットを、新しい化学発光フィルムに露光して、全てのDNAプローブを、次のハイブリダイゼーションに進む前に確実に除去させた。再露光したフィルムを、記録のための研究ファイルに以前のハイブリダイゼーションデータパッケージとともに保存した。
サザンブロットの結果
pDAS1740/FspI断片の既知の制限酵素部位に基づいて、特定の消化物およびプローブで予測される断片サイズおよび観察された断片サイズを、表2に示す。2つの型の断片をこれらの消化物およびハイブリダイゼーションから同定した:既知の酵素部位がプローブ領域と接し、pDAS1740/FspI断片内に完全に含まれる内部断片と、既知の酵素部位がプローブ領域の一端にあり、第2の部位がトウモロコシゲノム中に予測される境界断片。境界断片のサイズはイベントにより変動した。なぜなら、ほとんどの場合、DNA断片組み込み部位は各イベントについてユニークであるからである。境界断片は、組み込まれたDNAに対して制限酵素部位の場所を決定し、DNA挿入の数を評価するための手段を提供する。この研究で完了したサザンブロット解析に基づいて、プラスミドpDAS1740/FspIからのインタクトなaad−1 PTUの単一コピーが、挿入断片地図に詳細に示されるように、イベントDAS−40278−9のトウモロコシゲノムに挿入されたと結論付けた(図2〜3)。
主鎖配列の不在
プラスミドpDAS1740のほぼ全体のFspI主鎖領域(プラスミドpDAS1740の4867〜7143bp)をカバーする3つのDNA断片(表1)の等モル比率の組み合わせを主鎖プローブとして用いて、AAD−1トウモロコシイベントDAS−40278−9の特徴決定をした。プラスミドpDAS1740/FspI断片を用いて、イベントDAS−40278−9を作製したので、主鎖プローブの組み合わせを用いて、いずれの制限酵素消化の後にも特異的ハイブリダイゼーションシグナルは予測されなかった(表2)。全てのDAS−40278−9試料において、NcoIまたはSacI消化の後に主鎖プローブを用いて特異的ハイブリダイゼーションシグナルが検出されなかったことが確認された。陽性対照レーンは、予測されたハイブリダイズするバンドを含有し、このことは、プローブが、試料中に存在するならばいずれの相同DNA断片ともハイブリダイズできたことを証明した。このデータは、トウモロコシイベントDAS−40278−9の挿入が、プラスミドpDAS1740からのFspI領域の外側のいずれのベクター主鎖配列も含まなかったことを示唆した。
挿入されたDNAを特徴決定し、ゲノム挿入部位を示すために、イベントDAS−40278−9の挿入断片および境界領域のDNA配列を決定した。合計で、8557bpのイベントDAS−40278−9ゲノム配列が確認され、これは、1873bpの5’フランキング境界配列、1868bpの3’フランキング境界配列および4816bpのDNA挿入断片を含んだ。4816bpのDNA挿入断片は、インタクトなaad−1発現カセット、5’末端に259bpの部分MAR v3および3’末端に1096bpの部分MAR v4を含有する。配列解析により、5’組み込み接合部での21bpの挿入と、トウモロコシゲノムの挿入遺伝子座からの2塩基対の欠失とが明らかになった。1塩基対の挿入が、トウモロコシゲノムとDAS−40278−9挿入断片との間の3’組み込み接合部にて見出された。また、単一塩基変化(TからC)が、挿入断片中に、3’UTRの非コード領域内の5212位にて見出された。これらの変化はいずれも、aad−1発現カセットのオープンリーディングフレーム組成に影響しない。
ゲノムDNA抽出および定量
ゲノムDNAを、凍結乾燥したかまたは新しく粉砕した葉の組織から、CTAB変法を用いて抽出した。DNA試料を、1×TE(10mM Tris pH8.0、1mM EDTA)(Fluka、Sigma、St.Louis、MO)に溶解し、Pico Green法を製造者の使用説明(Molecular Probes、Eugene、OR)に従って用いて定量した。PCR解析のために、DNA試料を分子生物学グレードの水(5PRIME、Gaithersburg、MD)を用いて希釈して、10〜100ng/μLの濃度を得た。
PCRプライマー
表3に、イベントDAS−40278−9のDNA挿入断片およびフランキング境界領域をクローニングするために用いたプライマー配列を、図4に示す位置および記載とともに列挙する。表4に、挿入断片および境界配列を確認するために用いたプライマー配列を列挙する。プライマーの位置は、図4および5にそれぞれ示す。全てのプライマーは、Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville、IA)で合成した。プライマーを水(5PRIME、Gaithersburg、MD)に、貯蔵溶液のために100μMの濃度まで溶解し、作業溶液のために10μMの濃度まで水で希釈した。
ゲノムウォーキング
GenomeWalker(商標)ユニバーサルキット(Clontech Laboratories,Inc.、Mountain View、CA)を用いて、トウモロコシイベントDAS−40278−9の5’および3’フランキング境界配列をクローニングした。製造者の使用説明に従って、AAD−1トウモロコシイベントDAS−40278−9からの約2.5μgのゲノムDNAを、EcoRV、StuI(ともにキットにより提供される)またはScaI(New England Biolabs、Ipswich、MA)を用いて一晩消化した。消化したDNAを、DNA Clean&Concentrator(商標)−25(ZYMO Research、Orange、CA)を用いて精製した後に、GenomeWalker(商標)アダプタにライゲーションして、GenomeWalker(商標)ライブラリーを構築した。各GenomeWalker(商標)ライブラリーを、キットで提供されるアダプタプライマーAP1と、各構築物特異的プライマー5End3812_Aおよび3End3812_Cとを用いる1次PCR増幅のためのDNA鋳型として用いた。1マイクロリットルの1:25希釈の1次PCR反応物を、次いで、ネステッドアダプタプライマーAP2と、各ネステッド構築物特異的プライマー5End3812_Bと3End3812_Dとを用いる2次PCR増幅のための鋳型として用いた。TaKaRa LA Taq(商標)HS(Takara Bio Inc.、Shiga、Japan)をPCR増幅において用いた。50μLのPCR反応中に、1μLのDNA鋳型、8μLの2.5mM dNTPミックス、0.2μMの各プライマー、2.5単位のTaKaRa LA Taq(商標)HS DNAポリメラーゼ、5μlの10×LA PCRバッファーII(Mg2+プラス)、および1.5μLの25mM MgCl2を用いた。具体的なPCR条件を表5に列挙する。
従来のPCR
標準的なPCRを用いて、トウモロコシイベントDAS−40278−9におけるDNA挿入断片および境界配列をクローニングして確認した。TaKaRa LA Taq(商標)(Takara Bio Inc.、Shiga、Japan)、HotStarTaq DNAポリメラーゼ(Qiagen、Valencia、CA)、Expand High Fidelity PCRシステム(Roche Diagnostics,Inc.、Indianapolis、IN)またはEasy−A(登録商標)High−Fidelity PCRクローニング酵素&マスターミックス(Stratagene、LaJolla、CA)を、製造者が推奨する手順に従う従来のPCR増幅のために用いた。具体的なPCR条件およびアンプリコンの説明を、表6に列挙する。
PCR生成物の検出、精製、PCR生成物のサブクローニングおよび配列決定
PCR生成物を、製品の使用説明に従って、1.2%または2%E−ゲル(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いる電気泳動により調査した。断片サイズを、DNAマーカーとの比較により見積もった。必要であれば、PCR断片を、臭化エチジウムで染色した1×TBE中の1%アガロースゲルからQIAquickゲル抽出キット(Qiagen、Carlsbad、CA)を用いて断片を切り出すことにより精製した。
5’末端境界配列
DNA断片を、各トウモロコシイベントDAS−40278−9 GenomeWalker(商標)ライブラリーから、導入遺伝子の5’末端についての特異的ネステッドプライマーセットを用いて増幅した。およそ800bpのPCR生成物が、イベントDAS−40278−9 EcoRVおよびStuI GenomeWalker(商標)ライブラリーの両方から観察された。ScaI GenomeWalker(商標)ライブラリーは、約2kbの生成物を生じた。断片をpCR(登録商標)4−TOPO(登録商標)にクローニングし、各ライブラリーからの6つのコロニーを、末端の配列決定のために無作為に採取して、挿入断片が予測される配列を含有することを確認した。挿入断片のプライマーウォーキングによる完全な配列決定により、トウモロコシイベントDAS−40278−9 StuI、EcoRVおよびScaI GenomeWalker(商標)ライブラリーから増幅される断片が、それぞれ793、822および2132bpであったことが明らかになった。StuIおよびEcoRV GenomeWalker(商標)ライブラリーから作製したDNA断片は、ScaI GenomeWalker(商標)ライブラリーから作製したDNA断片と100%一致し、このことは、これらのDNA断片が、導入遺伝子挿入断片の5’領域から増幅されたことを示唆した。得られた1873bpのトウモロコシゲノム配列のBLAST検索は、トウモロコシBACクローンの配列と高い類似性を示した。さらに、挿入接合部の配列解析は、917bpのMAR v3が、その5’末端領域にて、プラスミドpDAS1740/FspI断片と比較して切断され、aad−1発現カセットの5’領域にて259bpの部分MAR v3が残っていることを示した。
3’末端境界配列
およそ3kbのサイズのDNA断片を、トウモロコシイベントDAS−40278−9 StuI GenomeWalker(商標)ライブラリーから、導入遺伝子の3’末端についての特異的ネステッドプライマーセットを用いて増幅した。DNA断片を、pCR(登録商標)4−TOPO(登録商標)にクローニングし、10のコロニーを、末端の配列決定のために無作為に採取して、予測される配列の挿入を確認した。予測される挿入断片を有する3つのクローンを完全に配列決定し、2997bpのDNA断片を産出した。このDNA断片の配列解析により、部分MAR v4要素(その5’領域の70bpを欠く)および1867bpのトウモロコシゲノム配列が明らかになった。BLAST検索は、1867bpのゲノムDNA配列が、5’境界配列で同定されたのと同じトウモロコシBACクローンにおける配列と100%一致したことを示した。
DNA挿入断片および接合部配列
DNA挿入断片および接合部領域を、トウモロコシイベントDAS−40278−9から、以前に記載したようなPCRに基づく方法を用いてクローニングした。5つのプライマー対を、5’および3’フランキング境界配列と予測される導入遺伝子配列とに基づいて設計した。合計で、5つのオーバーラップDNA断片(1767bpのアンプリコン1、1703bpのアンプリコン2、1700bpのアンプリコン3、1984bpのアンプリコン4および1484bpのアンプリコン5)をクローニングし、配列決定した(図4)。全体の挿入断片およびフランキング境界配列を、5つの断片のうちのオーバーラップ配列に基づいて組み立てた。最終的な配列では、pDAS1740/FspIに由来する4816bpのDNA挿入断片、1873bpの5’フランキング境界配列および1868bpの3’フランキング境界配列の存在が確認される。4816bpのDNA挿入断片は、インタクトなaad−1発現カセット、5’末端に259bpの部分MAR v3および3’末端に1096bpの部分MAR v4を含有する(配列番号29)。
トウモロコシゲノム配列の確認
トウモロコシゲノムにおけるイベントDAS−40278−9導入遺伝子の挿入部位を確認するために、PCR増幅を、異なるプライマー対を用いて行った(図4)。イベントDAS−40278−9およびその他のトランスジェニックまたは非トランスジェニックトウモロコシ系統からのゲノムDNAを鋳型として用いた。2つのaad−1特異的プライマーであるAI5End01およびAI5End02と、5’末端境界配列に基づいて設計した2つのプライマーである1F5End01および1F5End02とを用いて、aad−1遺伝子が5’末端境界領域に及ぶDNA断片を増幅した。同様に、aad−1が3’末端境界配列に及ぶDNA断片を増幅するために、3’末端境界配列に由来する1F3End05プライマーと、aad−1特異的AI3End01プライマーとを用いた。予測されるサイズのDNA断片は、AAD−1トウモロコシイベントDAS−40278−9のゲノムDNAからのみ、AAD−1トウモロコシイベントDAS−40278−9のフランキング境界にある一方のプライマーと、一方のaad−1特異的プライマーとからなる各プライマー対を用いて増幅された。対照DNA試料は、同じプライマー対を用いてPCR生成物を生じず、このことは、クローニングされた5’末端および3’末端の境界配列が、実際に、挿入されたaad−1遺伝子構築物のそれぞれ上流および下流の配列であることを示した。約8kbのサイズのかすかなバンドが、AAD−1トウモロコシイベントDAS−40278−9、AAD−1トウモロコシイベントDAS−40474および非トランスジェニックトウモロコシ系統XHH13を含む全てのトウモロコシ試料から、1F5End01およびAI5End01のプライマー対をPCR増幅に用いた場合に観察されたことに注意されたい。観察されたかすかなバンド(調製したゲル上で)は、このプライマー対を用いてのトウモロコシゲノムにおける非特異的増幅の結果であり得る。
ゲノム挿入部位を特徴決定して示すために、挿入断片の近傍にあるマーカー配列を決定した。多形SSRマーカーのパネルを用いて、導入遺伝子の場所を同定して地図にした。イベントpDAS1740−278は、第2染色体上で、2008DASトウモロコシ連鎖地図上のおよそ20cMにてSSRマーカーであるUMC1265とMMC0111との間のおよそ20cMにある。表6に、導入遺伝子pDAS1740−278の近傍にあると見出されるこれらの2つのマーカーについてのプライマー情報をまとめる。
gDNA単離
gDNAを、葉の押し抜きからDNEasy 96植物テストキット(Qiagen、Valencia、California)を用いて抽出した。プロトコールを改変して、自動化のために適応させた。単離されたgDNAを、Molecular Probes,Inc.(Eugene、OR)からのPicoGreen(登録商標)色素を用いて定量した。gDNAの濃度を、全ての試料について5ng/μlに、滅菌脱イオン水を用いて希釈した。
マーカーを用いるgDNAのスクリーニング
希釈したgDNAの遺伝子型を、単純配列反復(SSR)マーカーのサブセットを用いて決定した。SSRマーカーを、Applied Biosystems(Foster City、California)で、6−FAM、HEX/VICまたはNED(それぞれ青、緑および黄色)の蛍光タグで標識したフォワードプライマーを用いて合成した。マーカーをそれらの蛍光タグおよびアンプリコンサイズに基づいて群またはパネルに分けて、PCR後の多重化および分析を容易にした。
SSRマーカーの結果
導入遺伝子の近傍で同定されたフランキングマーカーについてのプライマーデータを、表6に列挙する。2つの緊密に関連するマーカーであるUMC1265およびMMC0111は、第2染色体上の導入遺伝子挿入断片からおよそ20cM離れて配置される。
トランスジェニックメイズイベントDAS−40278−9に由来する組換えaad−1タンパク質の生化学的特性を、特徴決定した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE、クーマシーブルーで染色、および糖タンパク質検出法)、ウェスタンブロット、免疫診断テストストリップアッセイ、マトリクス支援レーザ脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF MS)およびタンデムMSによるタンパク質配列決定解析を用いて、タンパク質の生化学的特性を特徴決定した。
免疫診断ストリップアッセイ
DAS−40278−9の葉の組織におけるaad−1タンパク質の存在を、American Bionosticaからの商業的に調製された免疫診断テストストリップを用いて確認した。ストリップは、葉の粗抽出物を試験することにより、トランスジェニック植物と非トランスジェニック植物とを区別できた(データは示さず)。非トランスジェニック抽出物(XHH13)は、検出可能な量の免疫反応性タンパク質を含有しなかった。この結果は、ウェスタンブロット解析によっても確認された。
トウモロコシからのaad−1タンパク質の精製
免疫精製されたメイズ由来のaad−1タンパク質(分子量:約33kDa)またはトウモロコシ茎組織からの水性粗抽出物を調製した。全ての葉および茎の組織を収穫し、実験室まで次のようにして輸送した。葉を、ハサミで植物から切断し、布の袋に入れ、将来の使用のためにおよそ−20℃で貯蔵した。別に、茎を土壌の線のすぐ上で切断し、布の袋に入れ、およそ−80℃にて約6時間、すぐに凍結させた。茎を、次いで、凍結乾燥器に5日間いれて水分を除去した。組織が一旦完全に乾燥したら、これらを微細な粉末にドライアイスを用いて粉砕し、必要になるまでおよそ−80℃にて貯蔵した。
SDS−PAGEおよびウェスタンブロット
イベントDAS−40278−9およびXHH13の茎からの凍結乾燥組織(約100mg)を2mLマイクロフュージチューブに秤量し、10%植物プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma、St.Louis、MO)を含有する約1mLのPBST(Sigma、St.Louis、MO)で抽出した。抽出は、4つの小さいボールベアリングを加え、試料を1分間Geno粉砕することにより容易にした。粉砕の後に、試料を20,000×gにて5分間遠心分離し、上清を4:1で5×Laemmliサンプルバッファー(2%SDS、50mM Tris pH6.8、0.2mg/mLブロモフェノールブルー、10%の新しく加えた2−メルカプトエタノールを含有する50%(w/w)グリセロール)と混合し、約100℃にて5分間加熱した。短い遠心分離の後に、45μLの上清を、Criterionセルゲルモジュールに装着されたBioRad Criterion SDS−PAGEゲル(Bio−Rad、Hercules、CA)に直接載せた。微生物由来aad−1の陽性の参照標準物質を、1mg/mLにてPBST pH7.4に再懸濁し、PBSTでさらに希釈した。試料を、次いで、Bio−Rad Laemmliバッファーと5%2−メルカプトエタノールとともに混合し、前に記載するようにして処理した。電気泳動は、Tris/グリシン/SDSバッファー(Bio−Rad、Hercules、CA)を用いて、150〜200Vの電圧で、前方の色素がゲルの端に到達するまで行った。分離の後に、ゲルを半分に切断し、一方の半分を、Pierce GelCode Blueタンパク質染色を用いて染色し、他方の半分を、ニトロセルロースメンブレン(Bio−Rad、Hercules、CA)に、Miniトランスブロット電気トランスファーセル(Bio−Rad、Hercules、CA)を60分間、100ボルトの一定電圧の下で用いてエレクトロブロットした。トランスファーバッファーは、20%メタノールおよびBio−RadからのTris/グリシンバッファーを含有していた。免疫検出のために、メンブレンを、aad−1特異的ポリクローナルウサギ抗体(Strategic Biosolution Inc.、Newark、DE、プロテインA精製ウサギポリクローナル抗体ロット#:DAS F1 197−15 1、1.6mg/mL)でプローブ付加した。ヤギ抗ウサギIgG(H+L)とアルカリホスファターゼ(Pierce Chemical、Rockford、IL)とのコンジュゲートを2次抗体として用いた。SigmaFast BCIP/NBT基質を、免疫反応性タンパク質バンドを現像して視覚化するために用いた。メンブレンを水で十分に洗浄して反応を停止させ、結果の記録を、デジタルスキャナ(Hewlett Packard、Palo Alto、CA)を用いて取得した。
翻訳後グリコシル化の検出
免疫親和性クロマトグラフィーにより精製されたメイズ由来aad−1タンパク質(画分#3)を、4:1で5×Laemmliバッファーと混合した。微生物由来aad−1、ダイズトリプシン阻害剤、ウシ血清アルブミンおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼを、Milli−Q水で、植物由来aad−1のおおよその濃度まで希釈し、Bio−Rad Laemmliバッファーと混合した。タンパク質を、次いで、約95℃にて5分間加熱し、20000×gにて2分間遠心分離して、清澄化された上清を得た。得られた上清を、Bio−RadCriterionゲルに直接アプライし、XT MES泳動バッファー(Bio−Rad、Hercules、CA)で、電気泳動を170Vにて約60分間運転した以外は本質的に上で記載したようにして電気泳動した。電気泳動の後に、ゲルを半分に切断し、一方の半分を、全タンパク質について、製造者のプロトコールに従ってGelCode Blue染料で染色した。染色が完了した後に、ゲルを、Molecular Dynamics濃度計で走査して、ゲルの永続的な視覚的記録を得た。ゲルの他方の半分は、GelCode糖タンパク質染色キット(Pierce Chemical、Rockford、IL)を、製造者のプロトコールに従って用いて染色して、糖タンパク質を視覚化した。糖タンパク質(検出限界はバンドあたり0.625ngほど低い)を、淡いピンクの背景の上にマゼンタのバンドとして視覚化した。糖タンパク質染色が完了した後に、ゲルをHewlett Packardデジタルスキャナで走査して、ゲルの永続的な視覚的記録を得た。グリコシル化染色の画像を取得した後に、ゲルをGelCode Blueで染色して、非グリコシル化タンパク質の存在について確認した。結果は、メイズ由来および微生物由来のaad−1タンパク質がともに、検出可能な共有結合された炭水化物を有さないことを示した。この結果は、ペプチド質量フィンガープリンティングによっても確認された。
メイズ由来およびシュードモナス(Pseudomonas)由来のaad−1の質量分析ペプチド質量フィンガープリンティングおよび配列決定
シュードモナス(Pseudomonas)由来およびメイズ由来のaad−1の質量分析解析を行った。トランスジェニックトウモロコシの茎に由来するaad−1タンパク質(イベントDAS−40278−9)を、トリプシンによる溶液消化に供し、その後、MALDI−TOF MSおよびESI−LC/MSに供した。検出されたペプチドの質量を、メイズ由来aad−1タンパク質の配列における可能性のあるプロテアーゼ切断部位に基づいて推定したものと比較した。理論的切断は、in silicoで、Proteometrics LLCからのProtein Analysis Worksheet(PAWS)フリーウェアを用いて作製した。一旦変性させたaad−1タンパク質は、プロテアーゼにより容易に消化され、多数のペプチドピークを生じる。
トリプシンペプチド断片配列決定
ペプチド質量フィンガープリンティングに加えて、メイズ由来aad−1タンパク質(メイズイベントDAS−40278−9から免疫親和性精製された)のNおよびC末端のアミノ酸残基を配列決定し、微生物由来タンパク質の配列と比較した。タンパク質配列を、タンデム質量分析により、微生物由来およびメイズ由来タンパク質の最初の11残基について得た(表8)。両方のタンパク質についてのアミノ酸配列は、A’HAALSPLSQR”(配列番号30)であり、N末端のメチオニンは、アミノペプチダーゼにより除去されていることが示された(表8)。N末端aad−1タンパク質配列は、M’AHAALSPLSQR’2(配列番号31)と予測された。これらの結果は、メイズおよびピー・フルオレセンス(P. fluorescens)における翻訳の間またはその後に、N末端メチオニンが、メチオニンアミノペプチダーゼ(MAP)により切断されることを示唆する。MAPは、タンパク質の2番目の残基がGly、Ala、Ser、Cys、Thr、ProおよびValのように小さい場合、メチオニル残基を迅速に切断する(Walsh、2006)。メチオニンが除去されていることに加えて、aad−1タンパク質のN末端ペプチドの小さい部分が、N末端メチオニンが切断された後にアセチル化されたことが示された(表8)。この結果は、真核生物(植物)発現タンパク質でしばしば遭遇する。なぜなら、およそ80〜90%のN末端残基が改変されるからである(PolevodaおよびSherman、2003)。また、セリンおよびアラニンをN末端に有するタンパク質は、最も頻繁にアセチル化されることが示されている(PolevodaおよびSherman、2002)。2つの同時翻訳プロセス、N末端メチオニン残基の切断およびN末端アセチル化は、はるかに最も一般的な改変であり、大多数の真核生物タンパク質(約85%)で生じる(PolevodaおよびSherman、2002)。しかし、N末端アセチル化に関連する生物学的重要性を証明する例は希である(PolevodaおよびSherman、2000)。
この研究の目的は、トウモロコシ組織において見出されるAAD−1タンパク質のレベルを決定することであった。さらに、トウモロコシのフォレージおよび穀粒に対して組成解析を行って、同質遺伝子非形質転換トウモロコシ系統とトランスジェニックトウモロコシ系統DAS−40278−9との間の等価性を調べた(噴霧なし、2,4−Dを噴霧、キザロホップを噴霧および2,4−Dとキザロホップとを噴霧)。同質遺伝子非形質転換トウモロコシ系統の農業経済学的特徴も、DAS−40278−9トウモロコシと比較した。野外発現、組成および農業経済学的試行は、米国およびカナダの主要なトウモロコシ生産地域内にある6つの試験現場で行った。これらの現場は、多様な農業経済学的実施と環境条件の地域を表す。試行は、Iowa、Illinois(2箇所)、Indiana、NebraskaおよびOntario、Canadaで行った。
試験したトウモロコシ系統
DAS−40278−9イベントを含有するハイブリッド種子および試験物質系統と同じ遺伝子背景の従来のハイブリッド種子であるがDAS−40278−9イベントを含有しない対照植物を、表10に列挙する。
除草剤散布
除草剤処理を、エーカーあたりおよそ20ガロン(187L/ha)の噴霧容量で行った。これらの散布は、商業的実施の最大限のラベル割合を反復するように設計した。表11に、用いた除草剤を列挙する。
農業経済学的データ収集および結果
農業経済学的特徴を、各場所でのブロック2、3および4内の全ての試験参加項目について記録した。表12に、測定された以下の特徴を列挙する。
試料回収
発現および組成解析のための試料を、表14に列挙するようにして回収した。
トウモロコシ試料中のaad−1タンパク質の決定
トウモロコシの試料を、aad−1タンパク質の量について解析した。可溶性で抽出可能なaad−1タンパク質を、Beacon Analytical System,Inc.(Portland、ME)から購入した酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キットを用いて定量する。
組成解析
トウモロコシのフォレージおよび穀粒の試料を、種々の試験を用いて栄養素含量について解析した。フォレージについて行った解析は、灰分、全脂質、水分、タンパク質、炭水化物、粗繊維、酸性デタージェント繊維、中性デタージェント繊維、カルシウムおよびリンを含んだ。穀粒について行った解析は、近成組成(灰分、全脂質、水分、タンパク質、炭水化物、粗繊維、酸性デタージェント繊維)、中性デタージェント繊維(NDF)、ミネラル、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、2次代謝産物および抗栄養素を含んだ。トウモロコシのフォレージおよび穀粒についての栄養素解析の結果を、文献で報告されている値と比較した(Watson、1982(4);Watson、1984(5);ILSI Crop Composition Database、2006(6);OECD Consensus Document on Compositional Considerations for maize、2002(7);およびCodex Alimentarius Commission 2001(8)を参照されたい)。
フォレージの近成組成、繊維およびミネラルの解析
対照、噴霧なしaad−1、aad−1+キザロホップ、aad−1+2,4−Dおよびaad−1+両方の参加項目からのトウモロコシフォレージ試料中のタンパク質、脂質、灰分、水分、炭水化物、ADF、NDF、カルシウムおよびリンの解析を行った。全ての場所にわたる結果のまとめを表16に示す。現場間および現場個別の解析について、全ての近成組成、繊維およびミネラルの平均値は、文献の範囲内であった。対照とトランスジェニック参加項目との間に、現場間解析において、水分、ADF、NDF、カルシウムおよびリンについて統計学的な相違は観察されなかった。タンパク質および灰分について、有意な対応のあるt検定が、噴霧なしAAD−1(タンパク質)、aad−1+キザロホップ(タンパク質)およびaad−1+両方(灰分)について観察されたが、有意な全体的な処理効果またはFDR調整p値を伴わなかった。脂質について、有意な対応のあるt検定および調整p値がともに、aad−1+キザロホップについて対照と比較して観察されたが、有意な全体的な処理効果は観察されなかった。炭水化物について、統計的に有意な全体的な処理効果、対応のあるt検定およびFDR調整p値が、aad−1+キザロホップと対照との間に観察された。炭水化物についても、有意な対応のあるt検定が噴霧なしaad−1参加項目について観察されたが、有意なFDR調整p値は観察されなかった。これらの相違は、生物学的に意味がない。なぜなら、これらの分析項目についての全ての現場間の結果は、トウモロコシについて報告された文献の範囲内であり、対照からの差は小さかったからである(<23%)。
穀粒の近成組成(proximate)および繊維の解析
全ての場所にわたるトウモロコシ穀粒における近成組成(タンパク質、脂質、灰分、水分、コレステロールおよび炭水化物)および繊維(ADF、NDFおよび全食物繊維)に関する結果のまとめを、表17に示す。近成組成および繊維についての全ての結果は、文献の範囲内であり、現場間解析において、対照とトランスジェニック参加項目との間に、脂質、灰分、NDFおよび全食物繊維について有意な相違は観察されなかった。水分について、有意な全体的な処理効果が観察されたが、有意な対応のあるt検定またはFDR調整p値を伴わなかった。ADFについて、有意な対応のあるt検定がaad−1+両方について観察されたが、有意な全体的な処理効果またはFDR調整p値はみられなかった。タンパク質および炭水化物の両方について、有意な対応のある検定、調整p値および全体的な処理効果が、噴霧なしaad−1、aad−1+キザロホップおよびaad−1+両方についてみられた。これらの相違は小さく(<12%)、全ての値は文献の範囲内であったので、相違は生物学的に意味があるとは考えられない。
穀粒のミネラル解析
ミネラルであるカルシウム、クロム、銅、ヨウ素、鉄分、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、セレン、ナトリウムおよび亜鉛についてのトウモロコシ穀粒試料の解析を行った。全ての場所にわたる結果のまとめを、表18に示す。全ての結果は、報告される文献の範囲内であった。現場間解析について、カルシウム、銅、鉄分およびカリウムについて有意な相違は観察されなかった。クロム、ヨウ素、セレンおよびナトリウムについての平均の結果は、方法の定量限界未満であった。マグネシウムおよびリンについて、有意な対応のあるt検定が、噴霧なしaad−1およびaad−1+キザロホップ参加項目について観察されたが、有意な全体的な処理効果またはFDR調整p値を伴わなかった。マンガンおよびモリブデンについて、有意な対応のあるt検定が噴霧なしaad−1について観察されたが、有意なFDR調整p値および全体的な処理効果は見られなかった。aad−1+両方の参加項目について、有意な対応のあるt検定が、亜鉛について観察されたが、有意なFDR調整p値または全体的な処理効果は存在しなかった。さらに、対照からのこれらの相違は小さく(<13%)、全ての値は、入手可能である場合は文献の範囲内であった。
穀粒のアミノ酸解析
トウモロコシ試料を、アミノ酸含量について、対照、噴霧なしaad−1、aad−1+キザロホップ、aad−1+2,4−Dおよびaad−1+両方のトウモロコシについて解析し、全ての場所にわたるおよび個別の野外の現場による結果のまとめを、表19に示す。全てのアミノ酸のレベルは報告された文献の範囲内であり、現場間解析における有意な相違は、アルギニン、リジンおよびチロシンについて観察されなかった。いくつかのアミノ酸について、現場間解析において有意な相違が観察された。これらの場合において、対照のアミノ酸含量は、aad−1トランスジェニック系統よりも低く、これは、aad−1系統と比較して、対照穀粒における全体的により低いタンパク質含量と関連すると考えられる。噴霧なしaad−1参加項目について、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるt検定およびFDR調整p値が、アルギニン、グリシン、リジン、トリプトファンおよびチロシン以外の全てのアミノ酸についてみられた。aad−1+キザロホップ参加項目について、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるt検定およびFDR調整p値が、アルギニン、システイン、グリシン、リジン、トリプトファンおよびチロシン以外の全てのアミノ酸についてみられた。aad−1+2,4−D参加項目について、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるt検定(有意なFDR調整p値とともに)が、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、リジン、チロシンおよびバリン以外の全てのアミノ酸についてみられた。aad−1+両方の参加項目について、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるt検定およびFDR調整p値が、アルギニン、グリシン、リジン、セリン、トリプトファンおよびチロシン以外の全てのアミノ酸についてみられた。アミノ酸について観察された多くの相違があったが、相違は小さく(<15%)、全ての現場にわたって観察されず、全ての平均値は、報告された文献の範囲内であった。
穀粒の脂肪酸解析
脂肪酸についてのトウモロコシ穀粒試料の解析を行った。全ての場所にわたる結果のまとめを、表20に示す。これらの脂肪酸について解析した対照、噴霧なしaad−1、aad−1+キザロホップ、aad−1+2,4−Dおよびaad−1+両方のトウモロコシ穀粒試料についての全ての結果は、発表された文献の範囲内であった。カプリル酸(8:0)、カプリン酸(10:0)、ラウリン酸(12:0)、ミリスチン酸(14:0)、ミリストレイン酸(14:1)、ペンタデカン酸(15:0)、ペンタデセン酸(15:1)、ヘプタデカン酸(17:0)、ヘプタデセン酸(17:1)、ガンマリノレン酸(18:3)、エイコサジエン酸(20:2)、エイコサトリエン酸(20:3)およびアラキドン酸(20:4)についての結果は、方法の定量限界(LOQ)未満であった。現場間解析において、16:0パルミチン酸、16:1パルミトレイン酸、18:0ステアリン酸、18:2リノール酸、18:3リノレン酸および20:0アラキジン酸について有意な相違は観察されなかった。18:1オレイン酸および20:1エイコセイン酸について、有意な対応のあるt検定が、噴霧なしaad−1(18:1)およびaad−1+2,4−D(18:1および20:1)参加項目について観察されたが、有意な全体的な処理効果またはFDR調整p値は伴わなかった。22:0ベヘン酸について、有意な全体的な処理効果および有意な対応のあるt検定が、aad−1+2,4−Dおよびaad−1+両方についてみられたが、有意なFDR調整p値は存在しなかった。
穀粒のビタミン解析
対照、噴霧なしaad−1、aad−1+キザロホップ、aad−1+2,4−Dおよびaad−1+両方のトウモロコシ参加項目からのトウモロコシ穀粒試料におけるビタミンA、B1、B2、B5、B6、B12、C、D、E、ナイアシンおよび葉酸のレベルを決定した。全ての場所にわたる結果のまとめを、表21に示す。ビタミンB12、DおよびEは、用いた解析方法によって定量可能でなかった。ビタミンについて報告される全ての平均の結果は、利用可能である場合は報告された文献の値と同様であった。報告された文献の範囲がないビタミン(ビタミンB5およびC)の結果は、得られた対照の値と同様であった(対照から<22%の相違)。現場間解析について、ビタミンB1、Cおよびナイアシンを除いて、統計学的相違は観察されなかった。ビタミンB1についての有意な対応のあるt検定が、対照と噴霧なしaad−1、aad−1+キザロホップおよびaad−1+両方との間に観察されたが、有意な全体的な処理効果またはFDR調整p値を伴わなかった。ビタミンCについて、有意な全体的な処理効果が、有意な対応のあるt検定およびFDR調整p値とともに、aad−1+キザロホップおよびaad−1+2,4−Dについて観察された。ナイアシンについても同様に、有意な全体的な処理効果が、有意な対応のあるt検定およびFDR調整p値とともに、aad−1+キザロホップおよびaad−1+両方について観察された。aad−1+2,4−Dについての有意な対応のあるt検定も、aad−1+2,4−D参加項目についてナイアシンについて見出されたが、有意な全体的な処理効果またはFDR調整p値を伴わなかった。相違は現場にわたって観察されず、値は文献の範囲内であった(入手可能である場合)ので、相違は、生物学的に意味があるとは考えられない。
穀粒の抗栄養素および2次代謝産物の解析
対照、噴霧なしaad−1、aad−1+キザロホップ、aad−1+2,4−Dおよびaad−1+両方のトウモロコシ参加項目からのトウモロコシ穀粒試料における2次代謝産物(クマル酸、フェルラ酸、フルフラールおよびイノシトール)および抗栄養素(フィチン酸、ラフィノースおよびトリプシン阻害剤)のレベルを決定した。全ての場所にわたる結果のまとめを、表22および23に示す。現場間解析について、全ての値は、文献の範囲内であった。aad−1参加項目と対照参加項目との間で、イノシトールおよびトリプシン阻害剤について現場間解析において、有意な相違は観察されなかった。フルフラールおよびラフィノースについての結果は、方法の定量限界未満であった。有意な対応のあるt検定が、クマル酸(噴霧なしaad−1、aad−1+2,4−Dおよびaad−1+両方)およびフェルラ酸(aad−1+キザロホップおよびaad−1+両方)について観察された。これらの相違は、有意な全体的な処理効果またはFDR調整p値を伴わず、対照と同様であった(<10%の相違)。有意な全体的な処理効果、対応のあるt検定およびFDR調整p値は、フィチン酸(噴霧なしaad−1)について見出された。全ての結果は、文献の範囲内であり、対照と同様であったので(<11%の相違)、これらの相違は、生物学的に意味があるとは考えられない。
近同質遺伝子系統(near-isoline)のトウモロコシ系統と比較したトウモロコシ系統40278の農業経済学的特徴を、多様な環境にわたって評価した。処理は、合計21の場所で試験された4つの遺伝子的に異なるハイブリッドとそれらの適当な近同質遺伝子系統対照ハイブリッドとを含んだ。
野外条件下で数世代にわたってトウモロコシイベントDAS−40278−9の導入遺伝子の農業経済学的性能が安定していることは、トウモロコシイベントDAS−40278−9挿入部位の周囲のこれらの同定された領域が、対象のその他のトランスジェニック遺伝子の標的にされた組み込みについての良好なゲノムの場所を提供することを示唆する。このような標的にされた組み込みは、いわゆる「位置効果」および導入遺伝子を宿主に組み込む際にゲノムに変異を創出する危険性の問題を克服する。このような標的にされた組み込みのさらなる利点は、それらに限定されないが、宿主ゲノムの重要な遺伝子座に導入遺伝子を偶発的に挿入することに起因する異常をも示すことなく所望のレベルの導入遺伝子の発現を示すトランスジェニック植物を得る前にスクリーニングして試験されなければならない多数の形質転換イベントを減らすことを含む。さらに、このような標的にされた組み込みは、両方の遺伝子を有するエリート植物系統の育種をより効率的にする、導入遺伝子の掛け合わせを可能にする。
選択マーカー遺伝子発現カセットの除去は、トウモロコシイベントDAS−40278−9のゲノム遺伝子座への標的にされた挿入にとって有利である。pat選択マーカーをトウモロコシイベントDAS−40278−9から除去することにより、ポリ核酸をトウモロコシのその後の世代において第4染色体を標的にして組み込むためにpat選択マーカーを再使用することが可能になる。
ブリトルスナップとは、通常、迅速成長期中の成長調節除草剤の散布後に強風によりトウモロコシの茎がくずれることをいう。強風による被害をシミュレートするためにトウモロコシを物理的に押す棒を用いる機械的「プッシュ」試験を、イベントDAS−40278−9を含有するハイブリッドトウモロコシおよびイベントDAS−40278−9を含有しない対照植物について行った。処理は、4つの地理的に異なる場所で完了し、4回反復した(例外として3回だけ反復した1つの試行があった)。プロットは、8列からなった:2列はイベントDAS−40278−9を含有し、2列はイベントを含有しない、2つのハイブリッドのそれぞれの4列。各列は20フィートの長さであった。トウモロコシ植物は、V4発達段階まで成長させ、2,4−Dを含有する市販の除草剤(Weedar 64、Nufarm Inc.、Burr Ridge、IL)を、1120g ae/ha、2240g ae/haおよび4480g ae/haの割合で用いた。除草剤を用いた7日後に、機械的プッシュ試験を行った。ブリトルスナップについての機械的プッシュ試験は、風被害をシミュレートするために、4フィートの棒で2列のトウモロコシを引き倒すことからなった。棒の高さおよび移動の速さは、未処理の植物を用いて低レベルの茎の破壊(10%以下)をもたらすように設定して、処理間で相違が証明されるのに十分に試験が厳しいことを確実にした。ブリトルスナップ処理の指向性は、もたれかかったトウモロコシに対して用いた。
イベントDAS−40278−9を含有するハイブリッドトウモロコシから、イベントを含有しない対照植物と比較して全タンパク質含量が増加した穀粒を作出した。2つの連続する多点野外試行を行ったが、これは、噴霧なしおよび除草剤処理を、3つの異なる除草剤の組み合わせで含んだ。8つの統計学的比較のうち7つにおいて、DAS−40278−9イベントは、有意により高い全タンパク質含量を有する穀粒を作出した(表27)。このデータは、個別のアミノ酸の解析により確証される。
近同質遺伝子系統(near-isoline)トウモロコシと比較した、イベントDAS−40278−9を含有するハイブリッドトウモロコシの農業経済学的特徴を、成長季節についての多様な地理的環境にわたって複数の野外試行から回収した。データを、実施例7に記載されるような農業経済学的特徴について収集して解析した。ヌル植物と比較した、イベントDAS−40278−9を含有するハイブリッドトウモロコシ系統についての結果を、表28に列挙する。さらに、発達のV3段階にて除草剤キザロホップ(280g ae/ha)および発達のV6段階にて噴霧された2,4−D(2,240g ae/ha)を噴霧したイベントDAS−40278−9を含有するハイブリッドトウモロコシ系統およびヌル植物についての農業経済学的特徴を、表29に記載する。
配列番号29は、主題のイベントDAS−40278−9についての挿入断片およびフランキング配列を示す。
配列番号30〜33は、実施例4に記載されるフランキングマーカーについてのプライマーである。
Claims (26)
- 配列番号29を含むゲノムを含むトランスジェニックトウモロコシ植物。
- アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に受託番号PTA−10244の下で寄託された種子に存在するAAD−1イベントDAS−40278−9を含むゲノムを含むトウモロコシ種子。
- 配列番号29を含むゲノムを含むトウモロコシ種子。
- 配列番号29を含む、請求項2に記載の種子を成長させることにより作出されるトウモロコシ植物。
- AAD−1イベントDAS−40278−9を含む、請求項4に記載のトウモロコシ植物の子孫植物。
- 配列番号29を含む、請求項1に記載のトウモロコシ植物の除草剤耐性子孫植物。
- 配列番号30および配列番号31により部分的に増幅可能なSSRマーカーUMC1265と、配列番号32および配列番号33により部分的に増幅可能なSSRマーカーMMC0111との間のおよそ20cMにて第2染色体上にあるトウモロコシ染色体標的部位に導入遺伝子挿入断片を含むトランスジェニックトウモロコシ植物であって、標的部位が異種核酸を含む植物。
- 配列番号30および配列番号31により部分的に増幅可能なSSRマーカーUMC1265と、配列番号32および配列番号33により部分的に増幅可能なSSRマーカーMMC0111との間のおよそ20cMにて第2染色体上の位置に異種核酸を挿入するステップを含む、トランスジェニックトウモロコシ植物を作製する方法。
- 花粉、胚珠、花、さや(boll)、長繊維(lint)、苗条、根および葉からなる群から選択され、配列番号29を含む、請求項4に記載の植物の一部分。
- 導入遺伝子挿入断片を、配列番号29の残基1〜1873および配列番号1の残基6690〜8557からなる群から選択されるゲノム配列内に、またはそれに接して含むトランスジェニックトウモロコシ植物。
- 少なくとも15ヌクレオチドを含み、配列番号29の残基1〜1873、配列番号29の残基6690〜8557およびその相補鎖からなる群から選択される核酸配列とのストリンジェントな洗浄条件下でのハイブリダイゼーションを維持する単離ポリヌクレオチド分子。
- 配列番号1〜28および30〜33からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
- 配列番号29の残基1863〜1875、配列番号29の残基6679〜6700およびその相補鎖からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェントな洗浄条件下でハイブリダイズする単離ポリヌクレオチド。
- ポリメラーゼ連鎖反応により生じるアンプリコンである、請求項13に記載のポリヌクレオチド。
- トウモロコシDNAを含む試料においてトウモロコシイベントを検出する方法であって、前記試料を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に受託番号PTA−10244の下で寄託された種子に存在するAAD−1トウモロコシイベントDAS−40278−9について特徴的である少なくとも1つのポリヌクレオチドと接触させるステップを含む方法。
- 前記試料を、
a.配列番号29の残基1〜1873、配列番号29の残基6690〜8557およびその相補鎖からなる群から選択されるフランキング配列と結合する第1プライマー、および
b.配列番号1の残基1874〜6689またはその相補鎖を含む挿入配列と結合する第2プライマー
と接触させるステップと、前記試料をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップと、前記プライマー間に生じるアンプリコンについてアッセイするステップとを含む、請求項15に記載の方法。 - 前記プライマーが、配列番号1〜28からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、少なくとも30ヌクレオチドを含み、配列番号29の残基1863〜1875、配列番号29の残基6679〜6700およびその相補鎖からなる群から選択される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記方法が、前記試料および前記ポリヌクレオチドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップと、前記DNAとの前記ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションについて前記試料をアッセイするステップとをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 請求項17に記載の第1プライマーおよび第2プライマーを含むDNA検出キット。
- 請求項18に記載の方法を行うためのDNA検出キット。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチドを含むDNA検出キット。
- 配列番号29を含むポリヌクレオチド。
- 請求項22に記載のポリヌクレオチドを生成する方法。
- トウモロコシゲノムのDNAセグメントに導入遺伝子を挿入する方法であって、前記DNAセグメントが、配列番号29のヌクレオチド残基1〜1873を含む5’末端と、配列番号1のヌクレオチド残基6690〜8557を含む3’末端とを含む方法。
- トウモロコシ植物を育種する方法であって、配列番号29を含む第1トウモロコシ植物を第2トウモロコシ植物と交雑させて、ゲノムを含む第3トウモロコシ植物を作出するステップと、前記第3トウモロコシ植物を前記ゲノムにおける配列番号29の存在についてアッセイするステップとを含む方法。
- トウモロコシ植物に除草剤耐性形質を遺伝子移入する方法であって、配列番号29を含む第1トウモロコシ植物を第2トウモロコシ植物と交雑させて、ゲノムを含む第3トウモロコシ植物を作出するステップと、前記第3トウモロコシ植物を前記ゲノムにおける配列番号29の存在についてアッセイするステップとを含む方法。
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