CN103842507A

CN103842507A - 通过抑制酵母氨酸脱氢酶基因控制真菌和卵菌的RNAi

Info

Publication number: CN103842507A
Application number: CN201280048884.7A
Authority: CN
Inventors: T·德莱巴尔; C·多姆; B·伊西格曼; F·施米特; F·维拉尔巴; E·佩吉特
Original assignee: Bayer Pharma AG
Current assignee: Bayer Pharma AG; Bayer Intellectual Property GmbH
Priority date: 2011-10-04
Filing date: 2012-10-03
Publication date: 2014-06-04
Also published as: AU2012320554A1; BR112014008059A2; EP2764101A1; ES2628436T3; IN2014DN03473A; JP6255344B2; EA028662B1; CA2844868A1; EA201490715A1; EP2764101B1; US20150082495A1; AR088113A1; PL2764101T3; WO2013050410A1; AU2012320554B2; JP2015501139A; US20190382770A1; ZA201403196B; UA115132C2

Abstract

本发明涉及通过使用RNA干扰抑制一种或多种生物功能，尤其是抑制酵母氨酸脱氢酶基因来控制植物病原体，尤其是真菌或卵菌。本发明为此类控制提供利用植物病原体靶基因的RNA干扰的方法和组合物。本发明还涉及制备耐受所述植物病原体的转基因植物的方法，以及由此产生的转基因植物和种子。

Description

通过抑制酵母氨酸脱氢酶基因控制真菌和卵菌的RNAi

本发明涉及通过利用RNA干扰来抑制一种或多种生物学功能来控制植物病原和害虫特别是真菌和卵菌，特别是通过抑制参与α-氨基己二酸途径的真菌酵母氨酸脱氢酶基因或其卵菌同源物来控制。

本发明为此类控制提供利用真菌或卵菌靶基因的RNA干扰的方法和组合物。本发明还涉及制备耐受所述真菌或卵菌的转基因植物的方法，以及由此产生的转基因植物和种子。

本发明内容中采用的技术是RNA干扰或RNAi。

能诱导形成小双链RNA(dsRNA)的靶基因同源序列在生物中的表达使得能非常特异性地消除该基因并能观察由此得到的表型(Xiao等，2003)。

dsRNA仅在与该dsRNA相同的区域内引起同源RNA的降解(Zamore等，2000；Tang等，2003)。所述dsRNA是含有双链序列的RNA分子，通常至少为19个碱基对(bp)，包括正义链和反义链。dsRNA分子的特征还在于两条互补RNA链之间很大程度的互补性。dsRNA被降解成通常为18-25个核苷酸的RNA片段(siRNA)，而且靶RNA上的切割位点均匀间隔18-25个核苷酸。由此得到的小siRNA呈现相对靶RNA而言很高程度的相同性；但是siRNA和靶RNA的相应部分之间3-4个核苷酸的错配下系统仍可能运行(Tang等，2003)。因此提示这些18-25个核苷酸的片段构成识别靶标的RNA向导(Zamore等，2000)。在转染dsRNA后进行细胞裂解的果蝇(Drosophila melanogaster)施耐德2细胞所制得的提取物中也已测得这些小RNA(Hammond等，2000)。18-25个核苷酸的片段在mRNA切割中的导向作用得到下述观察的支持：分离自dsRNA的这些19-25个核苷酸的片段能参与mRNA的降解(Zamore等，2000)。在发生PTGS现象(转录后基因沉默，Post Transcriptional Gene Silencing)的植物组织中也累积显著同源性的RNA分子(Hamilton和Baulcome，1999)。这些小RNA能在三个不同层面上调节基因表达：

-转录(TGS指转录性基因沉默)，

-信使RNA降解(PTGS指转录后基因沉默)，

-miRNA途径

-翻译

涉及信使RNA降解的调节看来存在于所有真核生物中，而在转录层面的调节只在哺乳动物、植物、果蝇和秀丽新杆线虫(C.elegans)中有记载。对于翻译的调节，已在秀丽新杆线虫和果蝇中得以表征，且看来存在于哺乳动物(Hannon，2002)和植物(Ruiz Ferrer和Voinnet，2009)。根据所研究的生物，文献中提及这一现象时的表述有RNAi、PTGS、共抑制或平息(quelling，仅用于真菌)。

RNAi已被具体证实在将双链RNA(dsRNA)注射入秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)时是有效的(Fire等，1998；Montgomery等，1998；WO99/32619)。还在向昆虫饲喂对应于昆虫靶基因表达双链RNA的细菌时观察到该昆虫所述靶基因表达的抑制(WO01/37654)。

更近些时候，公开了用以治疗人乳头瘤病毒(HPV)感染的药物组合物，其包含至少与怀疑参与所述HPV感染的基因的部分基本互补的dsRNA和药学上可接受的载体(WO2009/0247607)。

在植物中进行dsRNA的引入来诱导内源靶基因的沉默(Hamilton等，1998，WO99/15682)，通过使用转基因表达与病毒基因基本相同的dsRNA的方式来诱导对RNA病毒的抗性(Waterhouse等，1998；Pandolfini等，2003，WO98/36083，WO99/15682，US5,175,102)，但也诱导对线虫的耐受(Chuang和Meyerowitz，2000，WO01/96584)或另外对于细菌土壤杆菌(Agrobacterium)的耐受(WO00/26346，Escobar等，2001)。更近些时候，已经显示表达与真菌的生长或其致病性必需的真菌基因基本相同的dsRNA的植物也可诱导针对该真菌的抗性(WO05/071091)。

然而，从那时开始，在RNAi-介导的针对植物病原真菌的抗性或耐受仅存在一些初步结果和非商业例子，其中双链(dsRNA)或小干扰分子(siRNA)在植物中表达，或作为外来组合物的部分施用于种子、植物或植物的果实或土壤或植物生长或需要其生长的惰性物质中。

困难之一是要发现合适的靶基因，其由dsRNA或siRNA的抑制诱导良好水平的真菌耐受性，高至适于商业应用的水平，而对于表达所述dsRNA或siRNA的植物或者包含所述dsRNA或siRNA的组合物所施用的植物没有有害作用。

C.在其博士论文[Host induced gene silencing-strategies for theimprovement of resistance against Cercospora beticola in sugar beet(B.vulgaris L.)and against Fusarium graminearum in wheat(T.aestivum L.)andmaize(Z.mays L.)(宿主诱导的基因沉默-改善甜菜(B.vulgaris L.)抵御甜菜生尾孢(Cercospora beticola)以及小麦(T.aestivum L.)和玉米(Z.mays L.)抵御禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的抗性的策略)”，2011年6月答辩]中，尝试通过用靶向高乌头酸酶基因的沉默构建体转化小麦来抑制禾谷镰刀菌的生长，该基因是在赖氨酸生物合成途径的必要基因。然而，没能产生转基因小麦植物。另外，尝试通过用含有针对诱导型沉默高乌头酸酶基因的构建体去转化真菌来删除或沉默禾谷镰刀菌中的高乌头酸酶基因也没有成功。

本发明人出乎意料地证明通过RNAi方法对真菌或卵菌酵母氨酸脱氢酶基因(其参与α-氨基己二酸(AAA)途径)的抑制会导致该生物感染、生长、发育、繁殖和/或致病的停止，并且最终造成其死亡。

这个RNAi技术的新靶标特别合适，考虑到AAA途径是特异性地发现于一些植物病原体包含高等真菌中，而未见于植物、人和动物中。

在20个常用的蛋白氨基酸中，L-赖氨酸是仅有的已知在植物和高等真菌中生物合成途径不同的氨基酸。在植物和细菌中，通过二氨基庚二酸(DAP)途径得到L-赖氨酸。在高等真菌和眼虫中，通过α-氨基己二酸(AAA)途径得到L-赖氨酸。酵母氨酸脱氢酶、高柠檬酸合成酶、高乌头酸酶、高异柠檬酸脱氢酶、α-氨基己二酸氨基转移酶、α-氨基己二酸还原酶和酵母氨酸还原酶是参与L-赖氨酸生物合成的α-氨基己二酸途径的酶。

在参与这两个不同途径(DAP和AAA途径)的酶中没有共同的(Xu等，2006，Bhattacharjee，J.K.，1985；Bhattacharjee，J.K.，1992；Vogel，H.J.，1965)。例如，真菌酵母氨酸脱氢酶参与赖氨酸生物合成，当赖氨酸-酮戊二酸来自植物时，有时也称为酵母氨酸脱氢酶，其负责赖氨酸代谢(Houmard等，2007)。对于人和动物，L-赖氨酸是必要的氨基酸，只能通过饮食中的蛋白质来得到。另外，参与真菌AAA途径的酶为赖氨酸合成所独有(Umbargar，H.E.，1978；Bhattachariee，J.K.，1992)。

在高等真菌中特异性的α-氨基己二酸(AAA)途径的存在(在植物或人或动物中均不存在)引导考虑将参与所述AAA途径的酶作为控制植物病原体，尤其是真菌病原体的特别有吸引力的靶标。

有趣的是，虽然已有报道卵菌中赖氨酸通过二氨基庚二酸途径合成(Born和Blanchard，1999)，但是在卵菌中已经发现与AAA途径的真菌基因同源的基因，其可能表示两个途径在卵菌中可能都存在。发明人已经显示针对卵菌酵母氨酸脱氢酶基因的dsRNA显著降低所述卵菌的生长，并且表达针对卵菌酵母氨酸脱氢酶基因的dsRNA的植物能够较少受到所述卵菌的感染。

已经证明并研究了赖氨酸生物合成的AAA途径的存在，例如在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Broquist，H.P.，1971，Bhattacharjee，J.K.，1992)、人致病性真菌白色念珠菌(Candida albicans)(Garrad，R.C.和Bhattacharjee，J.K.，1992)和植物病原体稻瘟菌(Magnaporthe grisea)(Umbargar，H.E.，1978)中。参与AAA途径的酵母氨酸脱氢酶已经被深入研究并且在不同生物体中比较，并且它们的技术特征，包含核苷酸和氨基酸序列、动力学、底物特异性、功能、3D-结构以及纯化和鉴定方式都是技术人员熟知的(参见Xu等，2001，其内容通过引用的方式纳入本文)。公开了来自不同真菌或卵菌的大量基因及其序列数据并且可在搜索型公共数据库如genBank中得到。

Randall，T.A等(2005)报道了来自卵菌致病疫霉(Phytophthorainfestans)的AAA途径的一列基因，其由它们的登录号及其序列数据识别，通过引用纳入本文，可在搜索型公共数据库中得到(Randall，T.A.，2005，MPMI，18，229-243；特别参见第239页表8)。

在一个实施方式中，本发明提供dsRNA分子，其包含：

i)第一条链，其包含与真菌或卵菌的至少18个连续核苷酸基本相同的序列，以及ii)第二条链，其包含与该第一条链基本互补的序列，其中所述真菌或卵菌基因是酵母氨酸脱氢酶基因。

本文使用的“RNAi”或“RNA干扰”是指由双链RNA(dsRNA)介导的序列特异性基因沉默的过程。本文使用的“dsRNA”或“dsRNA分子”是指部分或完全是双链的RNA。双链RNA也指小或短干扰RNA(siRNA)，短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA、微小RNA(miRNA)、环状干扰RNA(ciRNA)、短发夹RNA(shRNA)等。

如本文所用，当比较RNA和DNA序列时考虑到胸腺嘧啶取代尿嘧啶，用于dsRNA的术语“基本相同”或“大致同源”表示dsRNA一条链的核苷酸序列与靶基因中18个或更多个连续核苷酸至少约80％、至少85％相同，更优选与靶基因中18个或更多个连续核苷酸至少约90％相同，并且最优选与靶基因中18个或更多个连续核苷酸至少约95％、96％、97％、98％或99％相同或完全相同。18个或更多个核苷酸表示一个部分，其为靶基因的至少约18、20、21、22、23、24、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500或2000个连续碱基或达到其全长。

本文使用的“互补”多核苷酸是能够按照标准沃森克里克互补规则碱基配对的多核苷酸。具体地，嘌呤与嘧啶碱基配对形成鸟嘌呤与胞嘧啶的配对(G:C)和在DNA中腺嘌呤与胸腺嘧啶的配对(A:T)或在RNA中腺嘌呤与尿嘧啶的配对(A:U)的组合。应理解两条多核苷酸即使互相不是完全互补时，也可能互相杂交，前提是每条多核苷酸至少有一个区域与另一条基本互补。如本文所用，术语“基本互补”表示两条核酸序列在它们的核苷酸上超过至少80％是互补的。优选地，两条核酸序列的核苷酸至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或全部是互补的。或者，“基本互补”表示两条核酸序列可以在高度严谨条件下杂交。如本文所用，术语“基本相同”或“对应”表示两条核酸序列具有至少80％序列相同性。优选地，两条核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列相同性。

也如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”是指直链或支链、单链或双链、或其杂合体的RNA或DNA。术语也包括RNA/DNA杂合体。当合成产生dsRNA时，较不常见的碱基，如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等也能用作反义、dsRNA和核酶配对。例如，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已经显示以高亲和力结合RNA并且是基因表达的强力反义抑制剂。也可以作其它的修饰，如磷酸二酯主链、锁核酸或RNA的核糖基团中2′-羟基的修饰。

按照本发明，第一条链和第二条链可以有相同的大小。或者，第一条链的大小可以大于第二条链的大小。例如，第一条链的大小可以大于第二条链的大小约200个核苷酸。在本发明的另一方面，第二条链的大小大于第一条链的大小。

按照本发明，dsRNA分子包含第一条链，其包括与真菌或卵菌酵母氨酸脱氢酶基因的至少18个连续核苷酸基本相同的序列。

在一个特定的实施方式中，本发明提供dsRNA分子，其包含：

i)第一条链，其包含与真菌或卵菌的至少18个连续核苷酸基本相同的序列以及ii)第二条链，其包含与该第一条链基本互补的序列，其中所述真菌或卵菌基因选自：

a)包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43所示序列的多核苷酸；

b)编码具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44所示序列的多肽的多核苷酸；

c)与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43所示序列的多核苷酸有至少70％序列相同性，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％序列相同性的多核苷酸；

d)编码与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44所示序列的多肽有至少70％序列相同性，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％序列相同性的多肽的多核苷酸；

e)在严谨条件下与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43所示序列的多核苷酸杂交的多核苷酸；和

f)在严谨条件下与编码下述多肽的多核苷酸杂交的核苷酸，前述多肽与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44所示序列的多肽有至少70％序列相同性。

按照本发明，术语“相同性”被理解为表示与其它蛋白/核酸的氨基酸/核苷酸对应的氨基酸/核苷酸的数量，以百分比表示。优选在计算机程序帮助下通过比较本文公开的Seq.ID与其它蛋白/核酸来确定相同性。如果与另一个序列比较的序列有不同的长度，相同性是通过以下方式确定：较短序列具有的与较长序列共同的氨基酸的数量来确定相同性的百分比数值。优选地，通过计算机程序ClustalW的方式来确定相同性，该软件已被熟知并且公共可用(Thompson等，1994)。ClustalW在http://www.ebi.ac.uk/tools/clustalW2/index.html上公共可用。

优选地，使用ClustalW的计算机程序的2.1版来确定按照本发明的蛋白之间和其它蛋白的相同性。为此，必须设定以下参数：KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。

优选地，使用ClustalW计算机程序的2.1版来确定例如本发明所述核酸分子的核苷酸序列和其它核酸分子的核苷酸序列之间的相同性。为此，必须设定以下参数：

KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIX：IUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，转换(TRANSITIONS)：不加权(unweighted)。

按照本发明，术语“在严谨条件下杂交”是指多核苷酸或核酸序列与参比核酸序列的杂交水平显著高于背景噪音。背景噪音可能与杂交其它存在的DNA序列有关，尤其是在cDNA库中存在的其它cDNA。由能够选择性杂交的序列与按照本发明上述序列ID所定义序列之间的相互作用产生的信号水平通常超过其它DNA序列的相互作用产生的背景噪音的信号水平的10倍，优选100倍。例如，可以通过用放射性元素如³²P标记探针来测量相互作用的水平。通常通过使用介质的各种严格条件(例如约50℃-60℃下0.03M NaCl和0.03M柠檬酸钠)来得到选择性的杂交。当然能够按照现有技术的通常方法进行杂交(尤其是Sambrook等，2001，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第3版)。

是在本发明的特定实施方式中，dsRNA分子被施用于植物病原体，尤其是真菌或卵菌，和/或待保护的植物或作物上。本发明因此也涉及包含有效且非植物毒性量的本文定义的dsRNA分子的组合物。

本发明所述的dsRNA分子可以通过经典化学合成、通过体外转录或在生物体如动物细胞、细菌、酵母或植物中异源表达而产生的方式来制备(Aalto A.P.等，2007RNA.13(3)：422-9)。

本发明因此涉及产生本文定义的dsRNA分子的微生物。

本发明也涉及基因构建体，其包含至少一条DNA序列以及在5’和任选的在3’位置的异源调控元件，特征为该DNA序列能够形成本文定义的dsRNA分子。

本发明也涉及克隆和/或表达载体，特征为其含有至少一个本文定义的基因构建体。

术语“有效且非植物毒性量”是指本发明组合物的一定量，所述量足以控制或者破坏存在的或易于在作物上出现的病原体，且不会使所述作物产生任何明显的植物毒性症状。该量可在很宽的范围内变化，取决于以下因素：待控制的病原体、作物类型、气候条件和包含在本发明组合物中的化合物。这个量可通过系统性田间试验来确定，这是在本领域技术人员能力范围之内的。

因此，本发明提供一种组合物，该组合物包含：有效量的如本文定义的dsRNA分子(作为活性成分)以及农业上可接受的担体(support)、运载体、填料和/或表面活性剂。

根据本发明，术语“担体”表示天然或合成的有机或无机化合物，其与式(I)活性化合物组合或联合以使其更易于施用，尤其是使用到植物的各个部分。因此，该担体通常是惰性的，并且应是农业上可接受的。所述担体可以是固体或液体。合适的担体的示例包括粘土、天然或合成的硅酸盐、二氧化硅、树脂、蜡、固体肥料、水、醇类(特别是丁醇)、有机溶剂、矿物油和植物油及其衍生物。也可以使用此类担体的混合物。

本发明所述的组合物也可以包含另外的组分，诸如但不限于表面活性剂、保护性胶体、粘合剂、增稠剂、触变剂、渗透剂、稳定剂、螯合剂。更一般而言，所述活性化合物可与符合常用配制技术的任何固体或液体添加剂组合。

本发明的组合物通常可包含0.05-99重量％的活性化合物，优选为10-70重量％。

本发明的组合物可以以各种形式使用，例如气溶胶分散剂、胶囊悬浮剂、冷雾浓缩剂、可撒粉剂、可乳化的浓缩剂、水包油乳液、油包水乳液、包封的颗粒、精细颗粒、种子处理用可流动浓缩剂(flowable concentrate)、气体(加压条件下)、气体发生剂、颗粒、热雾浓缩剂、大颗粒、微颗粒、油可分散性粉剂、油混溶性可流动浓缩剂、油混溶性液体、糊料、植物小棒、干种子处理用粉剂、经农药涂覆的种子、可溶浓缩物、可溶粉剂、种子处理液剂、悬浮浓缩剂(可流动浓缩剂)、超低容量(ULV)液体、超低容量(ULV)悬浮液、水可分散性颗粒或片剂、浆液处理用水可分散粉剂、水溶性颗粒或片剂、种子处理用水溶性粉剂、以及可润湿性粉剂。这些组合物不仅包括用合适的设备(例如喷雾器或撒粉设备)即可施用至待处理的植物或种子上的组合物，还包括在施用于作物之前必须进行稀释的浓缩型的市售组合物。

本发明所述化合物也可以混以一种或多种植物药或植物生长促进化合物，如杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀螨剂、杀软体动物剂、抗性诱导剂、安全剂、信号化合物、生物品、信息素活性物质或其它具有生物活性的化合物。由此获得的混合物的活性谱更广。与其它杀真菌剂化合物的混合物尤其有益。

在本发明的特定实施方式中，在待保护的植物中导入或产生dsRNA。在植物中导入或产生之后，dsRNA还可能被加工成相对小的片段(siRNA)并且能够随后在植物中分配。或者，使用调控元件或启动子在植物中导入或产生dsRNA导致dsRNA以组织、暂时、空间或诱导型的方式表达并且还可以由含有RNAi加工机制的植物细胞加工成相对小的片段。

本发明因此涉及可以在植物细胞内产生本发明所述dsRNA的基因构建体或嵌合基因。所述的基因构建体或嵌合基因包含至少一条DNA序列以及在5’和任选的在3’位置的异源调控元件，其能够在植物中起作用，特征为该DNA序列一旦在植物中表达，就能够形成本文定义的dsRNA分子。

在一个特定的实施方式中，基因构建体或嵌合基因包含：

-在植物细胞中有功能的启动子调控序列，其可操作地连接到

-DNA序列，当其转录时产生的RNA分子包含至少部分互补的至少一条正义序列和一条反义序列，所述正义序列包含与靶基因(例如，在本发明含义中的酵母氨酸脱氢酶基因)的至少18个连续核苷酸基本相同的序列，并且所述反义序列包含与该正义序列基本互补的序列，和

-任选的终止子调控序列。

在所述实施方式中，本发明所述DNA序列可具有更具体的两个方面；在第一个方面，其包含由间隔子核苷酸序列或内含子隔开的正义和反义两个核苷酸序列，所述间隔子或内含子与靶基因没有任何同源性。在正义和反义取向中克隆的序列是想要抑制其在病原体中表达的序列。因此该DNA序列的转录提供对应于正义/间隔子-内含子/反义构建体的大单链RNA。能通过RT-PCR检测这个长RNA转录物。由于正义和反义序列是同源的，它们会配对并且分隔它们的间隔子或内含子起到环的作用用于折叠。然后在全部同源区域上得到dsRNA。随后由称为“DICER”的酶复合物特异性降解dsRNA。然后dsRNA的降解形成siRNA(在图中的“siRNA”)，具有19-25个碱基大小的小双链RNA。这些siRNA通过与衍生自靶基因的转录的RNA配对由RNA沉默机制酶促机制(RNA silencing machinery enzymaticmachinery)来导致转录RNA降解。

在第二个方面，DNA序列包含不同大小的正义和反义两个核苷酸系列，对应于核苷酸序列的部分的环状结构与其它核苷酸序列的没有任何同源性。在正义取向中克隆的核苷酸序列与需要抑制其表达的靶基因的序列大致同源。反义核苷酸序列与所述靶基因的序列的互补链大致同源。因此该DNA序列的转录提供对应于正义/反义构建体的大单链RNA。能通过RT-PCR检测这个长RNA转录物。同源正义/反义序列配对。然后在全部同源区域上得到dsRNA。随后由称为“DICER”的酶复合物特异性降解dsRNA。然后dsRNA的降解形成siRNA(图中的“siRNA”)，具有18-25个碱基大小的小双链RNA。这些siRNA通过与靶RNA配对由RNA沉默机制植物酶促机制导致靶RNA降解。

在另一个特定的实施方式中，所述基因构建体包含：

-在植物细胞中有功能的两个启动子调控序列，其中第一启动子调控序列可操作地连接到DNA序列，当该DNA序列被转录时产生的RNA分子至少包含正义序列，并且第二启动子调控序列可操作地连接到DNA序列，当此DNA序列被转录时产生的RNA分子至少包含部分与正义序列互补的反义序列，并且其中所述的正义序列包含与靶基因的至少18个连续核苷酸基本相同的序列，和

-任选的终止子调控序列。

在这个特定的实施方式中，基因构建体可以包含为两个嵌合基因，其一包含可操作地连接有第一DNA序列的第一启动子调控序列和任选的终止子调控序列，当所述第一DNA序列转录时产生的RNA分子至少包含与靶基因的至少18个连续核苷酸基本相同的正义序列，第二个嵌合基因包含可操作地连接有第二DNA序列的第二启动子调控序列和任选的终止子调控序列，当所述第二DNA序列其转录时产生的RNA分子至少包含与正义序列部分互补的反义序列。

这两个嵌合基因优选(但不是必须)连带导入植物细胞中，以有利于两条RNA单链杂交形成dsRNA。或者，基因构建体可包含为构建体，其包含：

-第一启动子，可操作地连接有

-双链DNA序列，其中一条链在第一启动子的控制下转录时，产生的RNA分子至少包含与靶基因的至少18个连续核苷酸基本相同的正义序列，和任选有终止子调控序列，并且其中第二条链在第二启动子的控制下转录时，产生的RNA分子至少包含与正义序列部分互补的反义序列，和任选有终止子调控序列，和

-第二启动子，在与第一启动子相反的方向上。

第一和第二启动子调控序列可以是不同的或相同的，优选是不同的。

本发明还涉及用于转化植物的克隆和/或表达载体，特征为其含有至少一个本文定义的嵌合基因和基因构建体。

本发明还涉及含有本发明的dsRNA分子的转基因植物细胞并且如本文所定义。

本发明因此涉及含有本发明的基因构建体或嵌合基因的转基因植物细胞。

在本发明的一个特定实施方式中，转基因植物细胞是大豆、油菜、水稻或马铃薯植物细胞。

本发明还涉及转基因植物、种子或其部分，其包含按照本发明的转基因植物细胞。

在本发明的一个特定实施方式中，转基因植物、种子或其部分是大豆、油菜、水稻或马铃薯的植物、种子或其部分。

本发明的表述“嵌合基因”或“表达盒”是指一种核苷酸序列，其包含在转录方向上彼此功能性相连的下述序列：在植物中具有功能的调节性启动子序列、编码蛋白质或RNA链的序列、和任选的在植物细胞中具有功能的终止子。

术语“嵌合基因”或“表达盒”一般指一种基因，其所含的某些元件不存在于天然基因中，而是取代了天然基因中存在的元件或是添加的元件。

本发明所用术语“嵌合基因”或“表达盒”也可对应于所有基因元件在天然基因中都存在的情况，或者，术语“基因”可对应于嵌合基因。

表述“嵌合基因”或“表达盒”也可对应于以下情形：编码蛋白质或RNA链的序列不直接连接启动子但(例如)属于在同一启动子控制下含有数个编码序列的多顺反子构建体的部分。在此情况下，所述启动子调控下的各编码序列设计为“嵌合基因”或“表达盒”。

本发明中术语“彼此功能性连接”指所述嵌合基因元件彼此相连的方式使它们的功能协调且能表达编码序列。例如，当能确保所述编码序列表达时，启动子就是与编码序列功能性连接。可用本领域技术人员熟知的技术，具体如Sambrook等(2001，《分子克隆：实验手册》第3版，Nolan C.编，纽约冷泉港实验室出版社)所述技术构建本发明的嵌合基因和装配其各种元件。组成此嵌合基因的调控元件的选择基本上取决于它们必须在其中起作用的植物和细胞的类型，本领域技术人员有能力选择在给定植物中具有功能的调控元件。

本发明的术语“启动子调控序列”是指在植物中天然表达的基因的任意启动子调控序列，尤其是在植物的叶中表达的启动子，例如称为细菌、病毒或植物来源的组成型的启动子，或称为光依赖型的启动子，如植物核酮糖-二羧化酶/氧合酶(RuBisCO)小亚基基因，或可以使用的任意已知的合适的启动子。在植物来源启动子中，注意申请EP0507698所述的组蛋白启动子，或水稻肌动蛋白启动子(US5,641,876)。在植物病毒基因启动子中，注意花椰菜花叶病毒(CaMV19S或35S)或木薯叶脉花叶病毒(CsVMV：WO97/48819)或圆环病毒启动子(AU689311)。也可以利用植物的特定区域或组织的特异性启动子调控序列，和更具体地种子特异性启动子(Datla，R.等，1997，Biotechnology Ann.Rev.，3，269-296)，特别是油菜籽蛋白(EP255378)、菜豆蛋白、麦谷蛋白、向日葵蛋白(WO92/17580)、白蛋白(WO98/45460)和油质蛋白(WO98/45461)启动子。也可以使用诱导型启动子，其可以优选选白苯丙氨酸解氨酶(PAL)启动子、HMG-CoA还原酶(HMG)启动子、壳多糖酶启动子、葡聚糖酶启动子、蛋白酶抑制剂(PI)启动子、PR1家族基因启动子、胭脂碱合成酶(nos)启动子或vspB基因启动子(US5670349)、HMG2启动子(US5670349)、苹果β半乳糖苷酶(ABG1)启动子或苹果氨基酸环丙烷羧酸合成酶(ACC合成酶)启动子(WO98/45445)。

术语“终止子调控序列”是指在植物细胞或植物中有功能的任意序列，也包含聚腺苷酸化序列，无论它们是细菌来源，例如根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的nos或ocs终止子，或是病毒来源，例如CaMV35S终止子，或是植物来源，例如在申请EP0633317中描述的组蛋白终止子。

可以根据本发明所述构建体或用于细胞或植物的转化并且包含所述构建体的质粒中选择基因的存在来进行选择步骤来鉴定已经整合本发明所述构建体的转化的细胞和/或植物。选择基因可以是在转录方向功能性连接有以下元件的嵌合基因的形式：在植物细胞中有功能的启动子调控序列，编码选择标记的序列，在植物细胞中有功能的终止子调控序列。

在可以使用的选择标记中，可包括含有抗生素抗性基因，例如潮霉素磷酸转移酶基因(Gritz等，1983，Gene25：179-188)、诱导对卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因(Wirtz等，1987，DNA，6(3)：245-253)或氨基糖苷3”-腺苷转移酶基因，但也包含含有除草剂耐受基因的标记物，如耐受双丙氨磷的bar基因(White等，NAR18：1062，1990)、耐受草甘膦的EPSPS基因(US5,188,642)或耐受异噁唑类的HPPD基因(WO96/38567)。也包含编码易于辨识的酶如GUS酶、GFP蛋白或在转化的细胞中编码调控颜料产生的颜料或酶的基因。这样的选择标记基因在专利申请WO91/02071、WO95/06128、WO96/38567和WO97/04103中具体描述。

本发明还涉及能够表达dsRNA来抑制真菌或卵菌酵母氨酸脱氢酶基因的转基因植物细胞或植物的制备方法，其中所述方法包含用本发明所述的嵌合基因或基因构建体转化植物细胞的步骤。

该方法还包含选择已经转化的植物细胞的步骤。

在本发明的特定实施方式中，本发明涉及能够表达dsRNA来抑制真菌或卵菌酵母氨酸脱氢酶基因的转基因植物细胞或植物的制备方法，其中所述方法包含用本发明所述的嵌合基因或基因构建体转化植物细胞的步骤，并且其中所述植物细胞是大豆、油菜、水稻或马铃薯植物细胞或者所述植物是大豆、油菜、水稻或马铃薯植物。

本发明也涉及转化的植物或其部分，和通过培养和/或交配上述再生的植物所衍生的植物或其部分，以及转化的植物的种子。

本发明还涉及从本发明的植物、其部分或种子获得的终端产品如食物、油、纤维。

为得到本发明所述的细胞或植物，本领域技术人员可使用大量已知转化方法中的一种。

这些方法中的一种包括使待转化的宿主生物体的细胞或组织与聚乙二醇(PEG)和本发明的载体接触(Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168(1)，111-115；Mercenier和Chassy，1988，Biochimie70(4)，503-517)。另一种方法是电穿孔，包括将待转化细胞或组织与本发明的载体置于电场中(Andreason和Evans，1988，Biotechniques6(7)，650-660；Shigekawa和Dower，1989，Aust，J.Biotechnol.3(1)，56-62)。另一方法包括将所述载体通过显微注射直接注入细胞或组织(Gordon和Ruddle，1985，Gene33(2)，121-136)。优选地，可以使用“生物射弹”方法。其包含在用吸附有本发明载体的颗粒轰击细胞或组织(Bruce等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(24)，9692-9696；Klein等，1992，Biotechnology10(3)，286-291；美国专利号4,945,050)。优选地，可以使用土壤杆菌属的细菌进行植物细胞或组织的转化，优选通过用根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)(Knopf，1979，Subcell.Biochem.6，143-173；Shaw等，1983，Gene23(3)：315-330)或毛根土壤杆菌(A.rhizogenes)(Bevan和Chilton，1982，Annu.Rev.Genet.16：357-384；Tepfer和Casse-Delbart，1987，Microbiol.Sci.4(1)，24-28)来感染所述植物的细胞或组织。优选地，按照由Hiei等(1994，Plant J.6(2)：271-282)所述的方案来用根癌土壤杆菌转化植物细胞或组织。本领域技术人员会根据待转化的宿主生物体的性质来选择合适的方法。

本发明所述的植物含有上述的转化的植物细胞。具体地，可以通过上述转化的植物细胞的再生得到转化的植物。通过合适的方法来获得再生，其取决于物种的性质。

本发明也包含这些植物的部分，以及这些植物的后代。术语“这些植物的部分”是指这些植物的任何器官，不论是地面上或地面下。地面上的器官有：茎干、叶和包括雄性和雌性生殖器的花。地面下的器官主要是根，但也可以是块茎。术语“后代”主要指含这些植物互相交配所产生胚胎的种子。术语“后代”可扩大到按照由本发明的转化植物之间交配产生的新一代所形成的所有种子。后代和种子也可通过所述转化植物的无性繁殖获得。本发明的种子可用农化组合物包衣，该农化组合物包含至少一种选自杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀菌剂或杀病毒剂的具有活性的有效产品。

本发明还涉及控制植物病原体，尤其是真菌或卵菌的方法，包含向所述病原体提供本发明所述并且如本文所定义的dsRNA分子。

在本发明的特定实施方式中，该方法涉及控制植物病原体，尤其是真菌或卵菌的方法，包含向所述病原体提供本发明所述且如本文所定义的dsRNA，或包含所述dsRNA的组合物，其中所述植物病原体是稻瘟菌(Magnaporthe grisea)、致病疫霉(Phytophthora infestans)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)或豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)。

在本发明的特定实施方式中，该方法涉及控制植物病原体，尤其是真菌或卵菌的方法，包含向所述病原体提供本发明所述并如本文所定义的dsRNA，或包含所述dsRNA的组合物，其中所述植物是大豆、油菜、水稻或马铃薯植物。

本发明还涉及控制植物、作物或种子的病原体，尤其是真菌或卵菌的方法，其特征在于，将农业上有效且基本上非植物毒性量的本发明所述dsRNA分子或本发明所述组合物以种子处理、叶部施用、茎部施用、浸透或滴灌施用(化学灌溉)的方式施用于种子、植物或植物果实，或已种植或其上需生长所述植物的土壤或惰性基质(例如无机基质，如砂、石棉、玻璃棉；膨胀矿物质，例如珍珠岩、蛭石、沸石或膨胀粘土)、浮石、火成碎屑物质或材料、合成的有机基质(例如聚氨酯)、有机基质(例如泥炭、堆肥、树木废产物(例如椰壳、木纤维或木屑、树皮))或液体基质(例如浮动水培系统、营养液膜技术、气栽体系)。

因此本发明涉及控制植物病原体，尤其是真菌或卵菌的方法，其特征在于将有效量的本发明所述dsRNA分子或本发明所述组合物施用于植物生长或能够生长的土壤中、植物的叶和/或果实或植物的种子上。

在本发明的特定实施方式中，本发明涉及控制植物病原体，尤其是真菌或卵菌的方法，其特征在于将有效量的本发明所述dsRNA分子或本发明所述组合物施用于植物生长或能够生长的土壤中、植物的叶和/或果实或植物的种子上，其中所述植物病原体是稻瘟菌(Magnaporthe grisea)、致病疫霉(Phytophthora infestans)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)或豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrh izi)。

在本发明的特定实施方式中，本发明涉及控制植物病原体，尤其是真菌或卵菌的方法，其特征在于将有效量的本发明所述dsRNA分子或本发明所述组合物施用于植物生长或能够生长的土壤中、植物的叶和/或果实或植物的种子上，其中所述植物是大豆、油菜、水稻或马铃薯植物。

术语“施用于待处理的植物”应理解为，出于本发明的目的，作为本发明主题的农药组合物可通过如下的各种处理方法施用：

●向所述植物的地上部分喷涂包含一种所述组合物的液体，

●在所述植物周围采用喷粉、向土壤中掺入颗粒或粉末、喷雾方式，而在所述植物是树木的情况下采用注射或涂抹方式，

●借助包含一种所述组合物的植物保护混合物，对所述植物的种子进行涂覆或膜涂覆。

本发明方法可以是治愈、预防或根除的方法。

在该方法中，所用组合物可预先通过混合两种或更多种本发明活性化合物来制备。

根据此方法的一种替代性方式，也可同时、连续或分开施用化合物(A)和(B)，以产生各包含两种或三种活性成分(A)或(B)中之一的不同组合物的结合(A)/(B、)效果。

本发明处理方法中常施用的活性dsRNA化合物的剂量通常且适宜为：

●对于叶部处理：0.0001-10,000g/公顷，优选为0.0001-1,000g/公顷，更优选为0.001-300g/公顷；在浸透或滴灌施用的情况下，所述剂量甚至可减少，尤其是当使用惰性基质(例如石棉或珍珠岩)时；

●对于种子处理：0.0001-200g/100kg种子，优选0.001-150g/100kg种子；

●对于土壤处理：0.0001-10,000g/公顷，优选0.001-5,000g/公顷。

本发明的dsRNA与另一种活性植物药或植物生长促进化合物混合时，所述植物药或植物生长促进化合物以常用的剂量使用。

所述植物药或植物生长促进化合物可以是杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀螨剂、杀软体动物剂、抗性诱导剂、安全剂或信号化合物。

在根据本发明的处理方法中，对于应用于叶处理时，植物药活性化合物通常施用剂量优选为10-800g/公顷，优选为50-300g/公顷。对于种子处理，活性物质的施用剂量通常优选为2-200克/100千克种子，更优选为3-150克/100千克种子。

本文所示的剂量是作为本发明方法的说明性示例给出。本领域技术人员知道如何根据待处理植物或作物的性质调节施用剂量。

在具体条件下，例如根据待处理或控制的病原体、植物致病真菌或卵菌的性质，较低剂量可提供足够的保护。某些气候条件、抗性或其它因素如致病原的性质或(例如)植物受到这些致病原感染的程度可能要求更高剂量的组合活性成分。最佳剂量通常取决于各种因素，例如待处理的致病原的类型，受感染植物或植物材料的类型或发育水平，植被密度或者施用方法。

用本发明的农药组合物或组合处理的作物是例如但不限于葡萄树、谷物、蔬菜、苜蓿、大豆、市售花园作物、草皮、树木或园艺植物。

本发明的处理方法还可用于处理繁殖材料(如块茎或根茎等)，以及种子、幼苗或移植幼苗以及植物或移植植物。该处理方法也可用于处理根。本发明的处理方法也可用于处理植物的地上部分，例如有关植物的树干、茎或梗、叶、花和果实，以及通常易受真菌感染的各材料(例如，由于储存，像干草)。

本发明还涉及控制植物病原体，尤其是真菌或卵菌的方法，包含在所述植物病原体的宿主植物中提供本发明的转化的植物细胞。

本发明还涉及控制植物病原体，尤其是真菌或卵菌的方法，包含在所述植物病原体的宿主植物中提供含有本文定义的dsRNA的转化的植物细胞。

本发明还涉及控制植物病原体，尤其是真菌或卵菌的方法，包含用本发明的基因构建体转化植物。

本发明还涉及控制植物病原体，尤其是真菌或卵菌的方法，包含以下步骤：

i)用本发明的嵌合基因转化植物细胞；

ii)将由此转化的细胞置于允许所述构建体转录的条件下，

iii)将所述细胞与病原体接触。

在本发明的特定实施方式中，本发明的方法是控制选自稻瘟菌(Magnaporthe grisea)、致病疫霉(Phytophthora infestans)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)或豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)的植物病原体。

在本发明的特定实施方式中，本发明的方法是控制植物病原体，其中所述植物是大豆、油菜、水稻或马铃薯植物。

本发明还涉及抑制植物病原体，尤其是真菌或卵菌酵母氨酸脱氢酶基因的方法，包含以下步骤：

i)用本发明的嵌合基因转化植物细胞；

ii)将由此转化的细胞置于允许所述构建体转录的条件下，

iii)将所述细胞与病原体接触。

在本发明的特定实施方式中，本发明的方法是抑制真菌或卵菌酵母氨酸脱氢酶基因，其中所述真菌或卵菌是稻瘟菌(Magnaporthe grisea)、致病疫霉(Phytophthora infestans)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)或豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)。

在本发明的特定实施方式中，本发明的方法抑制真菌或卵菌酵母氨酸脱氢酶基因，所述方法包含以下步骤：

i)用本发明的嵌合基因转化植物细胞；

ii)将由此转化的细胞置于允许所述构建体转录的条件下，

iii)将所述细胞与病原体接触；

其中所述植物是大豆、油菜、水稻或马铃薯植物。

依据本发明，可处理所有植物和植物部分。植物是指所有的植物和植物群体，例如优良(desirable)和不良(undesirable)野生植物、培育植物和植物品种(无论是否被植物品种或植物培育者权利保护)。培育植物和植物品种可为通过常规繁殖和育种方法获得的植物，所述方法可辅助或补充以一种或多种以下生物技术方法，例如：通过使用双单倍体、原生质体融合、随机和定向诱变、分子或遗传标记或利用生物工程和遗传工程方法。“植物部分”是指所有地上和地下部分以及植物的器官，例如芽、叶、花和根，其中列出例如叶、针状叶、茎干、树干、花、果实体、果实和种子以及根、球茎和根状茎。作物以及无性和有性繁殖材料(例如插枝、球茎、根状茎、长匐茎和种子)也属于植物部分。

在可通过本发明方法保护的植物中，可包括主要农作物，诸如玉米、大豆、棉花、芸苔属油菜(Brassica oilseeds)，例如甘蓝型油菜(Brassicanapus)(例如油菜(canola))，芜青(Brassicarapa)，褐芥菜(B.juncea)(例如芥末)和埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、稻、小麦、甜菜、甘蔗、燕麦、黑麦、大麦、小米、黑小麦、亚麻、藤本植物和以下各种植物类群的各种水果和蔬菜，例如蔷薇科(Rosaceae sp.)(例如，仁果类水果，如苹果和梨，还有核果，诸如杏、樱桃、扁桃和桃子，浆果类，诸如草莓)、茶蔗子科(Ribesioidae sp.)、胡桃科(Juglandaceae sp.)、桦木科(Betulaceaesp.)、漆树科(Anacardiaceae sp.)、山毛榉科(Fagaceae sp.)、桑科(Moraceaesp.)、木犀科(Oleaceae sp.)、猕猴桃科(Actinidaceae sp.)、樟科(Lauraceaesp.)、芭蕉科(Musaceae sp.)(例如香蕉树和种植物)、茜草科(Rubiaceaesp.)(例如咖啡豆)、山茶科(Theaceae sp.)、梧桐科(Sterculiceae sp.)、芸香科(Rutaceae sp.)(例如柠檬、橙子和葡萄柚)；茄科(Solanaceae sp.)(例如，西红柿、土豆、辣椒、茄子)、百合科(Liliaceae sp.)、菊科(Compositiaesp.)(例如莴苣、朝鲜蓟和菊苣，包括根菊苣、苦苣和常见菊苣)、伞形科(Umbelliferae sp.)(例如胡萝卜、香菜、芹菜和块根芹)、葫芦科(Cucurbitaceae sp.)(例如黄瓜，包括腌黄瓜、南瓜、西瓜、葫芦和蜜瓜)、葱科(Alliaceae sp.)(例如洋葱和韭菜)、十字花科(Cruciferae sp.)(例如白球甘蓝、红球甘蓝、西兰花、菜花、抱子甘蓝、小唐菜、甘蓝、萝卜、辣根、水芹、大白菜)、豆科(Leguminosae sp.)(例如花生、豌豆和豆类，例如攀爬豆类(climbing beans)和蚕豆)、藜科(Chenopodiaceae sp.)(例如饲用甜菜(mangold)、莙荙菜(spinach beet)、菠菜、甜菜根)；锦葵科(Malvaceae)(例如秋葵)、天门冬科(Asparagaceae)(例如芦笋)、园艺作物和森林作物；观赏植物；以及这些作物的遗传改进的同系物。

本发明的处理方法可用于处理经遗传改造的有机体(GMOs)，例如植物或种子。经遗传改造的植物(或转基因植物)是已有异源基因稳定整合入基因组中的植物。术语“异源基因”主要是指如下基因，其在植物外部提供或组装并且当被引入细胞核、叶绿体或线粒体基因组中时，通过表达相关的蛋白质或多肽或通过下调植物中存在的其它基因或者使得所述其它基因沉默(使用例如反义技术、共抑制技术或RNA干扰-RNAi-技术)来赋予经转化的植物新的或改进的农艺性质或其它性质。位于基因组中的异源基因也称作转基因。由植物基因组中的特定位置定义的转基因称作转化或转基因事件。

根据植物物种或植物品种、其位置和生长条件(土壤、气候、生长期、营养)，本发明的处理还可产生超叠加(“协同”)效果。因此，例如，本发明可使用的活性化合物和组合物的减少施用比率和/或拓宽活性谱和/或提高活性，植物生长更好、对高温或低温的耐受性增加、对干旱或对水或土壤含盐量的耐受性提高、开花性能提高、收获更容易、成熟加速、收获产量更高、果实更大、植物高度更高、叶子颜色更绿、开花更早、收获的产物的品质更高和/或营养价值更高、果实中的糖浓度更高、收获的产物的储存稳定性和/或加工性能更好，上述都是可能的，其超过实际预期的效果。

在某些施用率下，本发明的活性化合物复配物还可在植物中具有强化效果。因此，它们还可适用于调动植物防御系统抵抗不希望的微生物的攻击。这可能(合适时)是本发明组合的活性(例如抵抗真菌)增强的原因之一。在本申请上下文中，植物加强(抗性诱导)物质应理解为是指能刺激植物的防御系统的物质或物质的组合，其刺激方式使被处理的植物在随后被接种不利的微生物时对这些微生物表现出明显的抵抗性。在此情况中，不利的微生物应理解为是指植物病原真菌、细菌和病毒。因此，本发明的物质可用于保护植物，使其在经过所述处理后的一段时间内能抵抗上述病原体的攻击。在使用活性化合物处理植物后，实现保护的这段时间通常为1-10天，优选1-7天。

尽管上文列举了植物，本发明可以处理所有的植物及其部分。在优选的实施方式中，处理野生植物物种和植物品种，或者通过常规生物育种方法(例如交叉或原生质体融合)获得的植物品种，及其部分。在其它优选的实施方式中，处理通过基因工程方法(适当时结合常规方法)获得的转基因植物和植物品种(经遗传改造的生物体)及其部分。上文已解释了术语“部分”、“植物的部分”或“植物部分”的含义。更优选地，按照本发明处理市售或使用中的植物品种的植物。植物品种被理解为具有新性质(“性状”)并且通过常规育种、诱变或重组DNA技术得到的植物。它们可以是品种、变种、生物型或基因型。

本发明的处理方法可用于处理经遗传改造的有机体(GM0)，例如植物或种子。经遗传改造的植物(或转基因植物)是已有异源基因整合入基因组中的植物。术语“异源基因”主要是指如下基因，其在植物外部提供或组装并且当被引入细胞核、叶绿体或线粒体基因组中时，通过表达相关的蛋白质或多肽或通过下调植物中存在的其它基因或者使得所述其它基因沉默(使用例如反义技术、共抑制技术、RNA干扰-RNAi-技术或微RNA-miRNA技术)来赋予经转化的植物新的或改进的农艺性质或其它性质。位于基因组中的异源基因也称作转基因。由植物基因组中的特定位置定义的转基因称作转化或转基因事件。

根据植物物种或植物品种、其位置和生长条件(土壤、气候、生长期、营养)，本发明的处理还可产生超叠加(“协同”)效果。因此，例如，使根据本发明可用的活性化合物和组合物的施用率减小和/或活性范围拓宽和/或活性增加，使植物生长得更好，对于高温或低温的耐受性增加，对于干旱或水或土壤含盐量的耐受性提高，开花性能提高，收获更容易，成熟加速，收获产量更高，果实更大，植物高度更高，叶子颜色更绿，开花更早，收获的产物的品质更高和/或营养价值更高，果实中的糖浓度更高、收获的产物的贮存稳定性和/或加工性能更好，这些皆有可能，并超过实际预期的效果。

在某些施用率下，本发明的活性化合物复配物还可在植物中具有强化效果。因此，它们还可适用于调动植物防御系统抵抗不希望的微生物的攻击。这可能(合适时)是本发明组合的活性(例如抵抗真菌)增强的原因之一。在本申请上下文中，植物加强(抗性诱导)物质应理解为是指能刺激植物的防御系统的物质或物质的组合，其刺激方式使被处理的植物在随后被接种不利的微生物时对这些微生物表现出明显的抵抗性。在此情况中，不利的微生物应理解为是指植物病原真菌、细菌和病毒。因此，本发明的物质可用于保护植物，使其在经过所述处理后的一段时间内能抵抗上述病原体的攻击。在使用所述活性化合物处理植物之后，保护起作用的时间通常为1-10天，优选为1-7天。

本发明优选的待处理的植物和植物品种包括拥有使这些植物具有特别有利、有用性状的遗传材料(无论通过育种和/或生物技术方式获得)的所有植物。

本发明还优选的待处理的植物和植物品种对一种或多种生物胁迫具有抗性，即所述植物显示出较好的防御来抵御动物和微生物虫害，例如线虫、昆虫、螨虫、植物病原性真菌、细菌、病毒和/或类病毒。

抗线虫或昆虫的植物的例子在例如美国专利申请第11/765,491、11/765,494、10/926,819、10/782,020、12/032,479、10/783,417、10/782,096、11/657,964、12/192,904、11/396,808、12/166,253、12/166,239、12/166,124、12/166,209、11/762,886、12/364,335、11/763,947、12/252,453、12/209,354、12/491,396、12/497,221、12/644,632、12/646,004、12/701,058、12/718,059、12/721，595、12/638,591号中所述。

本发明的待处理的植物和植物品种还可以是对一种或多种非生物胁迫具有抗性的植物。非生物胁迫条件可包括，例如，干旱、低温暴露、热暴露、渗透胁迫、水淹、土壤盐度增加、矿物质暴露增加、臭氧暴露、强光暴露、限制性供应氮营养素、限制性供应磷营养素、避阴。

本发明的待处理的植物和植物品种还可以是特点为产量增加的植物。所述植物产量增加可由以下原因导致，例如，经改善的植物生理学、生长和发育(例如水利用效率、持水效率)、经改善的氮利用、增强的碳同化、经改善的光合作用、提高的发芽效率和加速成熟。产量还可受经改善的植物结构(在胁迫和非胁迫条件下)影响，其包括但不限于，早开花、对杂交种子生产的开花控制，幼苗活力、植物大小、节间数量及距离、根生长、种子大小、果实大小、豆荚大小、豆荚或穗数量、每穗或豆荚的种子数量、种子重量(seed mass)、提高种子填充、减少种子分散、减少豆荚开裂和耐倒伏性。其它产量特性包括种子成分，例如碳水化合物含量、蛋白质含量、油含量及成分、营养价值、抗营养化合物的减少、经改善的加工性和更好的贮备稳定性。

本发明可处理的植物是如下的杂交植物，其已经表达出杂种优势或杂交活力的特征，从而通常得到更高产量、活力、健康和对生物和非生物胁迫的抗性。此类植物通常通过近交雄性不育亲本(雌性亲本)与另一近交雄性可育亲本(雄性亲本)杂交获得。杂交种子通常从雄性不育植物收获并出售给种植者。雄性不育植物有时可(例如在玉米中)通过去除雄性产生，即机械去除雄性生殖器官(或雄花)，但更通常地，雄性不育是由植物基因组中的遗传决定簇产生。在这种情况下，以及特别是当种子是从杂交植物收获的所需产物时，确保杂交植物中的雄性能育性得以完全恢复通常是有益的。这可通过确保雄性亲本具有合适的能育性恢复基因来实现，所述能育性恢复基因能够恢复包含造成雄性不育的遗传决定簇的杂交植物中的雄性能育性。雄性不育的遗传决定簇可位于细胞质中。例如，细胞质雄性不育(CMS)的例子在芸苔属物种中有所描述(WO92/05251、WO95/09910、WO98/27806、WO05/002324、WO06/021972和US6,229,072)。然而，雄性不育的遗传决定簇也可位于细胞核基因组中。雄性不育植物也可由植物生物技术方法(例如基因工程)获得。WO89/10396中描述了获得雄性不育植物的特别有用的方法，其中，例如核糖核酸酶(例如芽孢杆菌RNA酶)在雄蕊的绒毡层细胞中选择性地表达。然后能育性可通过在绒毡层细胞中表达核糖核酸酶抑制剂(例如芽胞杆菌RNA酶抑制剂)来得到恢复(例如WO91/02069)。

本发明可处理的植物或植物品种(由植物生物技术方法如通过基因工程获得)是除草剂耐受植物，即对一种或多种给定的除草剂具有耐受性的植物。这些植物可通过遗传转化获得，或通过选择包含赋予这种除草剂耐受性的突变的植物获得。

抗除草剂植物是例如耐草甘膦植物，即对除草剂草甘膦或其盐具有耐受性的植物。可通过不同的方法使植物对草甘膦具有耐受性。例如，草甘膦耐受性植物可通过用5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的编码基因对植物进行转化来获得。这些EPSPS基因的例子是鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)的AroA基因(突变CT7)(Science1983，221，370-371)、农杆菌(Agrobacterium sp.)的CP4基因(Curr.Topics Plant Physiol.1992，7，139-145)、编码牵牛花EPSPS的基因(Science1986，233，478-481)、编码番茄EPSPS的基因(J.Biol.Chem.1988，263，4280-4289)或编码牛筋草(Eleusine)EPSPS的基因(WO01/66704)。还可为突变的EPSPS，在例如EP0837944、WO00/66746、WO00/66747或WO02/26995中所述。草甘膦耐受性植物还可通过表达编码草甘膦氧化还原酶的基因来获得，如US5,776,760和US5,463，175中所述。草甘膦耐受性植物还可通过表达编码草甘膦乙酰基转移酶的基因来获得，在例如WO02/036782、WO03/092360、WO2005/012515和WO2007/024782中所述。耐草甘膦植物还可通过选择包含上述基因天然产生的突变体的植物来获得，在例如WO01/024615或WO03/013226中所述。具有草甘膦耐受性的表达EPSPS基因的植物在例如美国专利申请第11/517,991、10/739,610、12/139,408、12/352,532、11/312,866、11/315,678、12/421,292、11/400,598、11/651,752、11/681,285、11/605,824、12/468,205、11/760,570、11/762,526、11/769,327、11/769,255、11/943801或12/362,774号中描述。具有能赋予草甘膦耐受性的其它基因(例如脱羧酶基因)的植物在例如美国专利申请11/588,811、11/185,342、12/364,724、11/185,560或12/423,926中所述。

其它除草剂耐受性植物是例如对抑制酶谷氨酰胺合成酶的除草剂(例如双丙氨磷、草胺膦或草丁膦)具有耐受性的植物。这些植物可通过表达解除所述除草剂的毒性或抵抗抑制的突变体谷氨酰胺合成酶来获得，在例如美国专利申请11/760,602所述。一种此类有效的解毒酶是一种编码草胺膦乙酰基转移酶的酶(例如链霉菌属(Streptomyces)物种的bar或pat蛋白)。表达外源草胺膦乙酰基转移酶的植物在例如美国专利5,561,236、5,648,477、5,646,024、5,273,894、5,637,489、5,276,268、5,739,082、5,908,810和7,112,665中描述。

其它除草剂耐受性植物还有对抑制羟基苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)的除草剂具有耐受性的植物。HPPD是催化将对-羟基苯丙酮酸(HPP)转化成尿黑酸盐的反应的酶。耐HPPD-抑制剂的植物可使用编码天然产生的抗HPPD酶的基因，或编码突变或嵌合HPPD酶的基因来转化，如WO96/38567、WO99/24585、WO99/24586、WO09/144079、WO02/046387或US6,768,044中所述。对HPPD-抑制剂的耐受性还可通过用编码某些能够形成尿黑酸盐的酶的基因转化植物来获得，尽管HPPD-抑制剂可抑制天然HPPD酶。WO99/34008和WO02/36787中描述了此类植物和基因。植物对HPPD抑制剂的耐受性还可通过将编码具有预苯酸脱氢酶(PDH)活性的酶的基因联同编码耐HPPD酶的基因去转化植物来改进，如WO04/024928中所述。另外，通过向其基因组添加编码能够代谢或降解HPPD抑制剂的酶(例如CYP450酶，如WO2007/103567和WO2008/150473中所述)的基因可使植物更耐受HPPD抑制剂除草剂。

对除草剂具有抗性的其它植物是对乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂具有耐受性的植物。已知ALS抑制剂包括，例如磺酰脲、咪唑并啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶氧基(硫基)苯甲酸酯/盐、和/或磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂。已知ALS酶(也称作乙酰羟基酸合酶，AHAS)中的不同突变会赋予对不同除草剂和除草剂组的耐受性，如例如Tranel和Wright(Weed Science2002，50，700-712)，以及美国专利第5,605,011、5,378,824、5,141,870和5,013,659号中所述。耐磺酰脲植物和耐咪唑并啉酮植物的生产在美国专利第5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937和5,378,824号、以及WO96/33270中所述。其它耐咪唑并啉酮的植物还描述于例如WO2004/040012、WO2004/106529、WO2005/020673、WO2005/093093、WO2006/007373、WO2006/015376、WO2006/024351和WO2006/060634中。其它耐磺酰脲和耐咪唑并啉酮的植物还在例如WO2007/024782和美国专利申请第61/288958号中所述。

其它咪唑并啉酮和/或磺酰脲耐受性植物可通过诱导突变、在存在除草剂的情况下选择细胞培养物或突变育种来获得，如(例如)US5,084,082(对于大豆)、WO97/41218(对于水稻)、US5,773,702和WO99/057965(对于甜菜)、US5,198,599(对于莴苣)、或WO01/065922(对于向日葵)中所述。

本发明还可处理的植物或植物品种(由植物生物技术方法如基因工程获得)是昆虫抗性转基因植物，即抵抗某些目标昆虫的攻击的植物。这些植物可通过遗传转化，或通过选择包含赋予该昆虫抗性的突变的植物来获得。

本文中所用的“昆虫抗性转基因植物”包括含有至少一种转基因的任何植物，所述转基因包含编码如下物质的编码序列：

1)来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫晶体蛋白或其杀虫部分，例如Crickmore等(1998，Microbiology and Molecular Biology Reviews，62，807-813)列出的杀虫晶体蛋白，由Crickmore等(2005)的苏云金芽孢杆菌毒素命名进行了更新，见http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/)，或其杀虫部分，例如Cry蛋白类的蛋白Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1F、Cry2Ab、Cry3Aa或Cry3Bb或其杀虫部分(例如，EP1,999,141和WO2007/107302)，或者由合成基因编码的这类蛋白，例如参见美国专利申请12/249,016；或

2)来自苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白或其部分，其在来自苏云金芽孢杆菌的第二其它晶体蛋白或其部分存在下具有杀虫性，例如由Cry34和Cry35晶体蛋白组成的二元毒素(Nat.Biotechno1.2001，19，668-72；Applied Environm.Microbio1.2006，71，1765-1774)或由Cry1A或Cry1F蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白组成的二元毒素(美国专利申请12/214,022和EP-A2300618)；或

3)包含来自苏云金芽孢杆菌的不同杀虫晶体蛋白部分的杂合杀虫蛋白，例如上述1)的蛋白的杂合子或上述2)的蛋白的杂合子，例如由玉米事件MON89034产生的Cry1A.105蛋白(WO2007/027777)；或

4)上述1)至3)中的任意一种蛋白，其中一些(特别是1-10个)氨基酸被另一种氨基酸代替以获得对目标昆虫物种的更高杀虫活性，和/或扩展受影响的目标昆虫物种的范围，和/或由于在克隆或转化过程中在编码DNA中引入的变化，例如玉米事件MON863或MON88017中的Cry3Bb1蛋白，或玉米事件MIR604中的Cry3A蛋白；或

5)来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)或蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)的杀虫分泌蛋白，或其杀虫部分，例如在http://www.1ifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html中所列的营养期杀虫(VIP)蛋白，例如来自VIP3Aa蛋白类的蛋白；或

6)来自苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的分泌蛋白，该蛋白在来自苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的第二分泌蛋白存在下具有杀虫性，例如由VIP1A和VIP2A蛋白组成的二元毒素(WO94/21795)；或

7)包含来自苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的不同分泌蛋白的多个部分的杂合杀虫蛋白，例如上述1)中蛋白的杂合子或上述2)中蛋白的杂合子；或

8)上述5)至7)中的任意一种蛋白，其中一些(特别是1-10个)氨基酸被另一种氨基酸代替以获得对目标昆虫物种的更高杀虫活性，和/或扩展受影响的目标昆虫物种的范围，和/或由于在克隆或转化过程中在编码DNA中引入的变化(同时仍编码杀虫蛋白)，例如玉米事件COT102中的VIP3Aa蛋白；或

9)来自苏云金芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的分泌蛋白，该蛋白在来自苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白存在下具有杀虫性，例如由VIP3和Cry1A或Cry1F组成的二元毒素(美国专利申请61/126083和61/195019)，或由VIP3蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白组成的二元毒素(美国专利申请12/214,022和EP-A2300618)。

10)上述9)的一种蛋白，其中一些(特别是1-10个)氨基酸被另一种氨基酸代替以获得对目标昆虫物种的更高杀虫活性，和/或扩展受影响的目标昆虫物种的范围，和/或由于在克隆或转化过程中在编码DNA中引入的变化(同时仍编码杀虫蛋白)。

当然，本文中所用的昆虫抗性转基因植物，还包括包含编码上述1-10类中任一种蛋白的基因的组合的任意植物。在一种实施方式中，昆虫抗性植物包含超过一种编码上述1-10类中的任一种蛋白的转基因，从而在使用针对不同目标昆虫物种的不同蛋白时扩展受影响的目标昆虫物种的范围，或通过使用对相同目标昆虫物种具有杀虫性但具有不同作用模式(例如在昆虫中结合不同的受体结合位点)的不同蛋白来延迟植物的昆虫抗性发展。

本文中所用的“昆虫抗性转基因植物”还包括含有至少一种转基因的任何植物，所述转基因包含表达后产生双链RNA的序列，该双链RNA在被植物虫害摄取后能抑制该植物虫害的生长，例如参见WO2007/080126、WO2006/129204、WO2007/074405、WO2007/080127和WO2007/035650。

本发明还可处理的植物或植物品种(由植物生物技术方法如基因工程获得)可耐受非生物胁迫。此类植物可通过遗传转化，或通过选择包含赋予该胁迫抗性的突变的植物来获得。特别有用的胁迫耐受性植物包括：

1)包含能够减少植物细胞或植物中多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)基因的表达和/或活性的转基因的植物，如WO00/04173、WO2006/045633、EP-A1807519或EP-A2018431中所述。

2)包含能够减少植物或植物细胞中的PARG编码基因的表达和/或活性的胁迫耐受增强性转基因的植物，如(例如)WO2004/090140中所述。

3)含有一种胁迫耐受增强性转基因的植物，该转基因编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成路径的植物功能酶，包括烟酰胺酶、烟酰酸磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺苷转移酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷合成酶或烟酰胺磷酸核糖基转移酶，如EP-A1794306、WO2006/133827、WO2007/107326、EP-A1999263或WO2007/107326。

本发明还可处理的植物或植物品种(由植物生物技术方法如基因工程获得)显示出改变了所收获的产品的数量、品质和/或储存稳定性，和/或改变了所收获的产品的具体成分的性质，例如：

1)合成改性淀粉的转基因植物，其改性淀粉的物理化学性质，尤其是直链淀粉含量或直链淀粉/支链淀粉比、支化程度、平均链长、侧链分布、粘度表现、胶凝强度、淀粉颗粒尺寸和/或淀粉颗粒形貌，与野生型植物细胞或植物中的合成淀粉相比有所改变，从而其更适合于具体的应用。所述合成改性淀粉的转基因植物在以下文献中公开：例如EP-A0571427、WO95/04826、EP-A0719338、WO96/15248、WO96/19581、WO96/27674、WO97/11188、WO97/26362、WO97/32985、WO97/42328、WO97/44472、WO97/45545、WO98/27212、WO98/40503、WO99/58688、WO99/58690、WO99/58654、WO00/08184、WO00/08185、WO00/08175、WO00/28052、WO00/77229、WO01/12782、WO01/12826、WO02/101059、WO03/071860、WO04/056999、WO05/030942、WO2005/030941、WO2005/095632、WO2005/095617、WO2005/095619、WO2005/095618、WO2005/123927、WO2006/018319、WO2006/103107、WO2006/108702、WO2007/009823、WO00/22140、WO2006/063862、WO2006/072603、WO02/034923、WO2008/017518、WO2008/080630、WO2008/080631、EP07090007.1、WO2008/090008、WO01/14569、WO02/79410、WO03/33540、WO2004/078983、WO01/19975、WO95/26407、WO96/34968、WO98/20145、WO99/12950、WO99/66050、WO99/53072、US6,734,341、WO00/11192、WO98/22604、WO98/32326、WO01/98509、WO01/98509、WO2005/002359、US5,824,790、US6,013,861、WO94/04693、WO94/09144、WO94/11520、WO95/35026、WO97/20936、WO2010/012796、WO2010/003701，

2)合成非淀粉碳水化合物聚合物的转基因植物，或与未经过遗传修饰的野生型植物相比具有改变的性质的合成非淀粉碳水化合物聚合物的转基因植物。例子是产生多聚果糖(尤其是菊糖和果聚糖类型)的植物如EP-A0663956、WO96/01904、WO96/21023、WO98/39460和WO99/24593中所揭示；产生α-1，4-葡聚糖的植物如WO95/31553、US2002031826、US6,284,479、US5,712,107、WO97/47806、WO97/47807、WO97/47808和WO00/14249中所揭示；产生α-1，6-支化α-1，4-葡聚糖的植物如WO00/73422中所揭示；产生交替糖(alternan)的植物如WO00/47727、WO00/73422、EP06077301.7、US5,908,975和EP-A0728213中所揭示；

3)产生透明质酸的转基因植物，在例如WO2006/032538、WO2007/039314、WO2007/039315、WO2007/039316、JP-A2006-304779和WO2005/012529中揭示。

4)转基因植物或杂交植物，例如具有以下特性的洋葱，所述特性诸如“高可溶性固体含量”、“低刺激性”(LP)和/或“储存时间长”(LS)，如美国专利申请12/020,360和61/054,026中所述。

本发明还可处理的植物或植物品种(由植物生物技术方法如基因工程获得)是具有改变的纤维特性的植物，例如棉花植物。这些植物可通过遗传转化，或通过选择包含赋予该改变的纤维特性的突变的植物来获得，包括：

a)包含改变形式的纤维素合酶基因的植物，例如棉花植物，如WO98/000549中所述。

b)包含改变形式的rsw2或rsw3同源核酸的植物，例如棉花植物，如WO2004/053219中所述。

c)具有增加蔗糖磷酸合酶的表达的植物，例如棉花植物，如WO01/17333中所述。

d)具有增加蔗糖合酶的表达的植物，例如棉花植物，如WO02/45485中所述。

e)植物，例如棉花植物，其中在纤维状细胞基础上的胞间连丝门控时间(timing of plasmodesmatal gating)的改变，例如通过下调纤维选择性β-1，3-葡聚糖酶来实现，如WO2005/017157中所述，或如WO2009/143995中所述。

f)具有改变的纤维反应性(例如通过表达包含nodC的N-乙酰基葡糖胺转化酶基因和几丁质合成酶基因)的植物，例如棉花植物，如WO2006/136351中所述。

本发明还可处理的植物或植物品种(由植物生物技术方法如基因工程获得)是具有改变的油分布(oil profile)性质的植物，例如油菜或相关芸苔属植物。这类植物可通过遗传转化或通过选择含有赋予这种改变的分布的突变的植物来获得，这类植物包括：

a)产生具有高油酸含量的油的植物，例如油菜植物，如例如US5,969,169、US5,840,946或US6,323,392或US6,063,947中所述

b)产生具有低亚麻酸含量的油的植物，例如油菜植物，如US6,270,828、US6,169,190或US5,965,755中所述

c)产生具有低水平饱和脂肪酸的油的植物，例如油菜植物，如例如美国5,434,283或美国专利申请12/668303中所述

还可根据本发明处理的植物或植物品种(由植物生物技术方法如基因工程获得)是具有改变的落粒性的植物，例如油菜或相关芸苔属植物。这类植物可通过遗传转化或通过选择含有赋予这种改变的落粒性的突变的植物来获得，并且这类植物包括诸如具有延迟的或降低的落粒性的油籽油菜的植物，如美国专利申请61/135,230、WO2009/068313和WO2010/006732中所述。

本发明还可处理的植物或植物品种(可通过植物生物技术方法，如基因工程获得)是具有改变的翻译后蛋白质修饰模式的植物，例如烟草植物，例如如WO2010/121818和WO2010/145846中所示。

可依据本发明处理的特别有用的转基因植物是含转化事件或转化事件组合的植物，它们是向美国农业部(USDA)动植物卫生检验局(APHIS)请求在美国非管制身份的对象，无论这些请求被准予或仍然处在待审中。该信息可随时很容易地从APHIS(美国马里兰州利弗代尔市利弗路4700号(邮编20737)(4700River Road Riverdale，MD20737，USA))获得，例如在其互联网站上(URL http://www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html)。截止到本申请的提交日，被APHIS审理中或被APHIS准予的要求非管制身份的请求是包括以下信息的请求：

-请求(Petition)：请求的识别号。转化事件的技术描述可在各请求文件中找到，而这些请求文件可根据该请求号从APHIS得到，例如从APHIS网站上获得。这些描述通过参考纳入本文。

-请求的延伸(Extension ofPetition)：对之前的请求要求延长。

-机构(Institution)：提交请求的实体的名称。

-管制项目(Regulated article)：涉及的植物物种。

-转基因表型(Transgenic phenotype)：通过转化事件赋予植物的特性。

-转化事件或系(Transformation event or line)：要求非管制身份的一个或多个事件(有时称为一个或多个系)的名称。

-APHIS文档：与请求相关的APHIS出版的各种文件，它们可以是APHIS要求的。

其它特别有用的含单个转化事件或转化事件组合的植物例如在各个国家或区域性管理机构的数据库中列出(参见，例如http://gmoinfo.jrc.it/gmp_browse.aspx和http://www.agbios.com/dbase.php)。

本发明可处理的特别有用的转基因植物是包含转化事件，或转化事件的组合的植物，其示于例如来自各个国家或区域管理机构的数据库中，包括事件1143-14A(棉花，昆虫控制，未保藏，参见WO2006/128569)；事件1143-51B(棉花，昆虫控制，未保藏，参见WO2006/128570)；事件1445(棉花，耐除草剂，未保藏，参见US-A2002-120964或WO02/034946)；事件17053(水稻，耐除草剂，保藏号为PTA-9843，参见WO2010/117737)；事件17314(水稻，耐除草剂，保藏号为PTA-9844，参见WO2010/117735)；事件281-24-236(棉花，昆虫控制-耐除草剂，保藏号为PTA-6233，参见WO2005/103266或US-A2005-216969)；事件3006-210-23(棉花，昆虫控制-耐除草剂，保藏号为PTA-6233，参见US-A2007-143876或WO2005/103266)；事件3272(玉米，品质特征，保藏号为PTA-9972，参见WO2006/098952或US-A2006-230473)；事件40416(玉米，昆虫控制-耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-11508，参见WO2011/075593)；事件43A47(玉米，昆虫控制-耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-11509，参见WO2011/075595)；事件5307(玉米，昆虫控制，保藏号为ATCC PTA-9561，参见WO2010/077816)；事件ASR-368(常绿草，耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-4816，参见US-A2006-162007或WO2004/053062)；事件B16(玉米，耐除草剂，未保藏，参见US-A2003-126634)；事件BPS-CV127-9(大豆，耐除草剂，保藏号为NCIMB No.41603，参见WO2010/080829)；事件CE43-67B(棉花，昆虫控制，保藏号为DSM ACC2724，参见US-A2009-217423或WO2006/128573)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，未保藏，参见US-A2010-0024077)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，未保藏，参见WO2006/128571)；事件CE46-02A(棉花，昆虫控制，未保藏，参见WO2006/128572)；事件COT102(棉花，昆虫控制，未保藏，参见US-A2006-130175或WO2004/039986)；事件COT202(棉花，昆虫控制，未保藏，参见US-A2007-067868或WO2005/054479)；事件COT203(棉花，昆虫控制，未保藏，参见WO2005/054480)；事件DAS40278(玉米，耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-10244，参见WO2011/022469)；事件DAS-59122-7(玉米，昆虫控制-耐除草剂，保藏号为ATCC PTA11384，参见US-A2006-070139)；事件DAS-59132(玉米，昆虫控制-耐除草剂，未保藏，参见WO2009/100188)；事件DAS68416(大豆，耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-10442，参见WO2011/066384或WO2011/066360)；事件DP-098140-6(玉米，耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-8296，参见US-A2009-137395或WO2008/112019)；事件DP-305423-1(大豆，品质特征，未保藏，参见US-A2008-312082或WO2008/054747)；事件DP-32138-1(玉米，杂交体系，保藏号为ATCC PTA-9158，参见US-A2009-0210970或WO2009/103049)；事件DP-356043-5(大豆，耐除草剂，保藏号为ATCCPTA-8287，参见US-A2010-0184079或WO2008/002872)；事件EE-1(茄子，昆虫控制，未保藏，参见WO2007/091277)；事件FI117(玉米，耐除草剂，保藏号为ATCC209031，参见US-A2006-059581或WO98/044140)；事件GA21(玉米，耐除草剂，保藏号为ATCC209033，参见US-A2005-086719或WO98/044140)；事件GG25(玉米，耐除草剂，保藏号为ATCC209032，参见US-A2005-188434或WO98/044140)；事件GHB119(棉花，昆虫控制-耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-8398，参见WO2008/151780)；事件GHB614(棉花，耐除草剂，保藏号为ATCCPTA-6878，参见US-A2010-050282或WO2007/017186)；事件GJ11(玉米，耐除草剂，保藏号为ATCC209030，参见US-A2005-188434或WO98/044140)；事件GM RZ13(甜菜，抗病毒性，保藏号为NCIMB-41601，参见WO2010/076212)；事件H7-1(甜菜，耐除草剂，保藏号为NCIMB41158或NCIMB41159，参见US-A2004-172669或WO2004/074492)；事件JOPLIN1(小麦，耐病性，未保藏，参见US-A2008-064032)；事件LL27(大豆，耐除草剂，保藏号为NCIMB41658，参见WO2006/108674或US-A2008-320616)；事件LL55(大豆，耐除草剂，保藏号为NCIMB41660，参见WO2006/108675或US-A2008-196127)；事件LL棉花25(棉花，耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-3343，参见WO03/013224或US-A2003-097687)；事件LLRICE06(水稻，耐除草剂，保藏号为ATCC-23352，参见US6,468,747或WO00/026345)；事件LLRICE601(水稻，耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-2600，参见US-A2008-2289060或WO00/026356)；事件LY038(玉米，品质特征，保藏号为ATCC PTA-5623，参见US-A2007-028322或WO2005/061720)；事件MIR162(玉米，昆虫控制，保藏号为PTA-8166，参见US-A2009-300784或WO2007/142840)；事件MIR604(玉米，昆虫控制，未保藏，参见US-A2008-167456或WO2005/103301)；事件MON15985(棉花，昆虫控制，保藏号为ATCC PTA-2516，参见US-A2004-250317或WO02/100163)；事件MON810(玉米，昆虫控制，未保藏，参见US-A2002-102582)；事件MON863(玉米，昆虫控制，保藏号为ATCC PTA-2605，参见WO2004/011601或US-A2006-095986)；事件MON87427(玉米，授粉控制，保藏号为ATCC PTA-7899，参见WO2011/062904)；事件MON87460(玉米，胁迫耐受性，保藏号为ATCCPTA-8910，参见WO2009/111263或US-A2011-0138504)；事件MON87701(大豆，昆虫控制，保藏号为ATCC PTA-8194，参见US-A2009-130071或WO2009/064652)；事件MON87705(大豆，品质特征-耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-9241，参见US-A2010-0080887或WO2010/037016)；事件MON87708(大豆，耐除草剂，保藏号为ATCC PTA9670，参见WO2011/034704)；事件MON87754(大豆，品质特征，保藏号为ATCCPTA-9385，参见WO2010/024976)；事件MON87769(大豆，品质特征，保藏号为ATCC PTA-8911，参见US-A2011-0067141或WO2009/102873)；事件MON88017(玉米，昆虫控制-耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-5582，参见US-A2008-028482或WO2005/059103)；事件MON88913(棉花，耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-4854，参见WO2004/072235或US-A2006-059590)；事件MON89034(玉米，昆虫控制，保藏号为ATCCPTA-7455，参见WO2007/140256或US-A2008-260932)；事件MON89788(大豆，耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-6708，参见US-A2006-282915或WO2006/130436)；事件MS11(油菜，授粉控制-耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-850或PTA-2485，参见WO01/031042)；事件MS8(油菜，授粉控制-耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-730，参见WO01/041558或US-A2003-188347)；事件NK603(玉米，耐除草剂，保藏号为ATCC PTA-2478，参见US-A2007-292854)；事件PE-7(水稻，昆虫控制，未保藏，参见WO2008/114282)；事件RF3(油菜，授粉控制-耐除草剂，保藏号为ATCCPTA-730，参见WO01/041558或US-A2003-188347)；事件RT73(油菜，耐除草剂，未保藏，参见WO02/036831或US-A2008-070260)；事件T227-1(甜菜，耐除草剂，未保藏，参见WO02/44407或US-A2009-265817)；事件T25(玉米，耐除草剂，未保藏，参见US-A2001-029014或WO01/051654)；事件T304-40(棉花，昆虫控制-耐除草剂，保藏号为ATCCPTA-8171，参见US-A2010-077501或WO2008/122406)；事件T342-142(棉花，昆虫控制，未保藏，参见WO2006/128568)；事件TC1507(玉米，昆虫控制-耐除草剂，未保藏，参见US-A2005-039226或WO2004/099447)；事件VIP1034(玉米，昆虫控制-耐除草剂，保藏号为ATCCPTA-3925.，参见WO03/052073)，事件32316(玉米，昆虫控制-耐除草剂，保藏号为PTA-11507，参见WO2011/084632)，事件4114(玉米，昆虫控制-耐除草剂，保藏号为PTA-11506，参见WO2011/084621)。

本发明的组合物还可用于针对易于在木材上或木材内部生长的真菌疾病。术语“木材”是指所有类型的木质物种、以及打算用于建筑的这种木材的所有类型的加工产品，例如实木、高密度木材、层压木材和胶合板。本发明处理木材的方法主要在于接触一种或多种本发明化合物或本发明组合物；这包括例如直接施用、喷涂、浸渍、注射或任意其它适合的方法。

在通过本发明方法可控制的植物或作物的疾病中，可提及：

粉状霉菌病，例如：

白粉病(Blumeriadiseases)，例如由小麦白粉菌(Blumeriagraminis)引起；

叉丝单囊壳属病(Podosphaera diseases)，例如由白叉丝单囊壳(Podosphaeraleucotricha)引起；

单丝壳属病(Sphaerotheca diseases)，例如由苍耳单丝壳(Sphaerothecafuliginea)引起；

钩丝壳属病(Uncinula diseases)，例如由葡萄钓丝壳(Uncinula necator)引起；

锈病，例如：

胶锈菌属病(Gymnosporangium diseases)，例如由赛宾锈菌(Gymnosporangium sabinae)引起；

驼孢锈病(Hemileia diseases)，例如由咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)引起；

层锈菌属病(Phakopsora diseases)，例如由豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)引起；

柄锈菌属病(Puccinia diseases)，例如由隐匿柄锈菌(Puccinia recondite)、禾柄锈菌(Puccinia graminis)或条形柄锈菌(Puccinia striiformis)引起；

单孢锈菌属病(Uromyces diseases)，由例如疣顶单孢锈菌(Uromycesappendiculatus)引起；

卵菌病(Oomycete diseases)，例如：

白锈病(Albugo diseases)，例如由白锈菌(Albugo candida)引起的；

盘梗霉属病(Bremia diseases)，例如由苣盘梗霉(Bremia lactucae)引起；

霜霉属病(Peronospora diseases)，例如由豌豆霜霉(Peronospora pisi)或芸苔霜霉(P.brassicae)引起；

疫霉属病(Phytophthora diseases)，例如由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起；

单轴霉属病(Plasmopara diseases)，例如由葡萄生单轴霉(Plasmoparaviticola)引起；

假霜霉属病(Pseudoperonospora diseases)，例如由葎草霜霉(Pseudoperonospora humuli)和黄瓜霜霉(Pseudoperonospora cubensis)引起的；

黄瓜霜霉病(Pseudoperonospora cubensis)；

腐霉属病(Pythium diseases)，例如由终极腐霉(Pythium ultimum)引起；

叶斑病、叶疱和叶枯病，例如：

支链孢属病(Altemaria diseases)，例如由茄链格孢(Alternaria solani)引起；

尾孢霉属病(Cercospora diseases)，例如由甜菜生尾孢(Cercospora beticola)引起；

金孢子菌属病(Cladiospomm diseases)，例如由瓜枝孢(Cladiosporiumcucumerinum)引起；

旋孢腔菌病(Cochliobolus diseases)，例如由禾旋孢腔菌(Cochliobolussativus)(Conidiaform：Drechslera，Syn：长蠕孢)或宫部旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus)引起；

刺盘孢属病(Colletotrichum diseases)，例如由豆刺盘孢(Colletotrichumlindemuthianum)引起；

油橄榄孔雀斑病(Cycloconium diseases)，例如由油橄榄孔雀斑菌(Cycloconium oleaginum)引起；

腐皮壳菌层病(Diaporthe diseases)，例如由柑桔间座壳(Diaporthe citri)引起；

痂囊腔菌属病(Elsinoe diseases)，例如由柑桔痂囊腔菌(Elsinoe fawcettii)引起；

长孢属病(Gloeosporium diseases)，例如由悦色盘长孢(Gloeosporiumlaeticolor)引起；

小丛壳属病(Glomerella diseases)，例如由围小丛壳(Glomerella cingulata)引起；

球座菌属病(Guignardia diseases)，例如由葡萄球座菌(Guignardia bidwellii)引起；

小球腔菌属病(Leptosphaeria diseases)，例如由十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、颖枯小球腔菌(Leptosphaeria nodorum)引起；

稻瘟病(Magnaporthe diseases)，例如由稻瘟菌(Magnaporthe grisea)引起；

球腔菌属病(Mycosphaerella diseases)，例如由禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)、落花生球腔菌(Mycosphaerella arachidicola)、香蕉黑条叶斑菌(Mycosphaerellafijiensis)引起；

壳针孢属病(Phaeosphaeria diseases)，例如由颖枯壳针孢(Phaeosphaerianodorum)引起；

核腔菌属病(Pyrenophora diseases)，例如由圆核腔菌(Pyrenophorateres)或偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici repentis)引起；

柱隔孢属病(Ramularia diseases)，例如由辛加柱隔孢(Ramulariacollo-cygni)或白斑柱隔孢(Ramularia areola)引起；

喙孢属病(Rhynchosporium diseases)，例如由黑麦喙孢(Rhynchosporiumsecalis)引起；

壳针孢属病(Septoria diseases)，例如由芹菜小壳针孢(Septoria apii)或番茄壳针孢(Septoria lycopersici)引起；

核瑚菌病(Typhula diseases)，例如由肉色核瑚菌(Typhula incarnata)引起；

黑星菌属病(Venturia diseases)，例如由苹果黑星菌(Venturia inaequalis)引起；

根病、鞘病和茎病，例如：

伏革菌病(Corticium diseases)，例如由禾伏革菌(Corticium graminearum)引起；

镰孢菌(霉)属病(Fusarium diseases)，例如由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)引起；

顶囊壳病(Gaeumannomyces diseases)，例如由禾顶囊壳(Gaeumannomycesgraminis)引起；

丝核菌属病(Rhizoctonia diseases)，例如由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起；

稻叶鞘腐败病(Sarocladium diseases)，例如由稻帚枝霉(Sarocladiumoryzae)引起；

小核菌病(Sclerotium diseases)，例如由稻腐小核菌(Sclerotium oryzae)引起；

塔普斯病(Tapesia diseases)，例如由塔普斯梭状芽孢杆菌(Tapesia acuformis)引起；

根串珠霉属病(Thielaviopsis diseases)，例如由根串珠霉(Thielaviopsisbasicola)引起；

耳穗和圆锥花序病，例如：

链格孢属病(Altemaria diseases)，例如由链格孢(Alternaria spp.)引起；；

曲霉病(Aspergillus diseases)，例如由黄曲霉(Aspergillusflavus)引起；

枝孢病(Cladosporium diseases)，例如由枝孢(Cladosporium spp.)引起；；

麦角菌属病(Claviceps diseases)，例如由麦角菌(Claviceps purpurea)引起；

镰孢菌(霉)属病(Fusarium diseases)，例如由大刀镰孢(Fusarium culmorum)引起；

赤霉病(Gibberella diseases)，例如由玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)引起；

水稻云形病(Monographella diseases)，例如由水稻云形菌(Monographellanivalis)引起；

黑穗病和腥黑穗病，例如：

轴黑粉菌属病(Sphacelotheca diseases)，例如由丝轴黑粉菌(Sphacelothecareilinana)引起；

腥黑粉菌属病(Tilletia diseases)，例如由小麦网腥黑粉菌(Tilletia caries)引起；

条黑粉菌属病(Urocystis diseases)，例如由隐条黑粉菌(Urocystis occulta)引起；

黑粉菌属病(Ustilago diseases)，例如由裸黑粉菌(Ustilago nuda)引起；

果实腐烂和霉菌病，例如：

葡萄孢菌属病(Botrytis diseases)，例如由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的；

青霉病(Penicillium diseases)，例如由甘薯青霉(Penicillium expansum)引起；

根霉病(Rhizopus)，例如由匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)引起；

核盘菌属病(Sclerotinia diseases)，例如由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起；

轮枝孢属病(Verticilium diseases)，例如由黑白轮枝孢(Verticilliumalboatrum)引起；

种子和土壤传播的腐烂、发霉、枯萎、腐败以及猝倒病：

链格孢病(Alternaria diseases)，例如由芥链格孢(Alternariabrassicicola)引起；

丝囊霉属病(Aphanomyces diseases)，例如由豌豆丝囊霉(Aphanomyceseuteiches)引起；

壳二孢属病(Ascochyta diseases)，例如由晶状体二胞菌(Ascochytalentis)引起；

曲霉病(Aspergillus diseases)，例如由黄曲霉(Aspergillus flavus)引起；

枝孢病(Cladosporium diseases)，例如由多主枝孢(Cladosporiumherbarum)引起；

旋孢腔菌病(Cochliobolus diseases)，例如由禾旋孢腔菌(Cochliobolussativus)引起；

(Conidiaform：Drechslera，Bipolaris Syn：长蠕孢)；刺盘孢病(Colletotrichum diseases)，例如由粒状体刺盘孢(Colletotrichum coccodes)引起；

镰孢菌(霉)属病(Fusarium diseases)，例如由大刀镰孢(Fusariumculmorum)引起；

壳球孢病(Macrophomina diseases)，例如由豆类壳球孢(Macrophominaphaseolina)引起；

水稻云形病(Monographella diseases)，例如由水稻云形菌(Monographella nivalis)引起；

茎点霉病(Phoma diseases)，例如由黑胫茎点霉(Phoma lingam)引起；

拟茎点霉病(Phomopsis diseases)，例如由大豆茎点霉(Phomopsis sojae)引起；

疫霉属病(Phytophthora diseases)，例如由恶疫霉(Phytophthoracactorum)引起；

核腔菌病(Pyrenophora diseases)，例如由麦类核腔菌(Pyrenophoragraminea)引起；

梨孢属病(Pyricularia diseases)，例如由稻梨孢(Pyricularia oryzae)引起的；

丝核菌属病(Rhizoctonia diseases)，例如由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起；

根霉病(Rhizopus diseases)，例如由米根霉(Rhizopus oryzae)引起；

小核菌病(Sclerotium diseases)，例如由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起的；

壳针孢病(Septoria diseases)，例如由颖枯壳针孢(Septoria nodorum)引起；

轮枝孢病(Verticillium diseases)，例如由大丽花轮枝孢(Verticilliumdahliae)引起；

溃疡、开裂及梢枯病，例如：

丛赤壳属病(Nectria diseases)，例如由干癌丛赤壳菌(Nectria galligena)引起；

枯萎病，例如：

链核盘菌属病(Monilinia diseases)，例如由核果链核盘菌(Monilinia laxa)引起；

叶泡或卷叶病，例如：

外担子菌病(Exobasidium diseases)，例如由坏损外担子菌(Exobasidiumvexans)引起；

外囊菌属病(Taphrina diseases)，例如由畸形外囊菌(Taphrina deformans)引起；

木质植物衰退病，例如：

依科病(Esca diseases)，例如由根霉格孢菌(Phaeomoniella clamydospora)引起；

葡萄顶枯病(Eutypa dyeback)，例如由葡萄藤猝倒病菌(Eutypa lata)引起；

灵芝病(Ganoderma diseases)，例如由岛灵芝(Ganoderma boninense)引起；

硬孔菌属病(Rigidoporus diseases)，例如由木硬孔菌(Rigidoporuslignosus)引起；

花和种子的疾病，例如：

葡萄孢属病(Botrytis diseases)，例如由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起；

块茎类疾病，例如：

长蠕孢菌属病(Helminthosporium diseases)，例如由立枯长蠕孢(Helminthosporium solani)引起；

根肿病，例如：

根肿菌病(Plasmodiophora diseases)，例如由芸苔根肿菌(Plamodiophora brassicae)引起；

由细菌生物体引起的病，例如：

黄单胞菌属物种，例如野油菜黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonascampestris pv.oryzae)；

假单胞菌属物种(Pseudomonas species)，例如丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)；

欧文氏菌属物种(Erwinia species)，例如解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)。

附图注释

图1：靶向酵母氨酸脱氢酶信使RMA的dsRNA存在下致病疫霉生长抑制的测量。

图2：酵母氨酸脱氢酶mRNA水平的qRT PCR分析。

序列表

SEQ ID NO：1：来自棒曲霉(Aspergillus clavatus)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：2：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：3：来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：4：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：5：来自灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：6：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：7：来自禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：8：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：9：来自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：10：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：11：来自拟轮生镰刀菌(Fusarium verticilloides)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：12：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：13：来自拟轮生镰刀菌(Fusarium verticilloides)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：14：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：15：来自香蕉黑条叶斑病菌(Mycosphaerella fijiensis)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：16：由上一核酸序列编码的多肽。

SEQ ID NO：17：来自稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：18：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：19：来自可可簇叶病菌(Monoliophthora perniciosa)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：20：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：21：来自禾柄锈菌(Puccinia graminis)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：22：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：23：来自致病疫霉(Phytophthora infestans)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：24：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：25：来自栎树疫霉(Phytophthora ramorum)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：26：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：27：来自大豆疫霉(Phytophthora sojae)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：28：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：29：来自偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：30：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：31：来自核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：32：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：33：来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：34：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：35：来自玉米黑粉菌(Ustilago maydis)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：36：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：37：来自黄萎轮枝孢菌(Verticillium albo-atrum)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：38：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：39：来自禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicol)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：40：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：41：来自串珠镰刀菌(Fusarium moniliform)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：42：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：43：来自麦角菌(Claviceps purpurea)的酵母氨酸脱氢酶(LYS1)。

SEQ ID NO：44：由上一核酸序列编码的蛋白。

SEQ ID NO：45：SACdh_Pi_T7F引物

SEQ ID NO：46：SACdh_Pi_T7_R引物

SEQ ID NO：47：肌动蛋白正向引物

SEQ ID NO：48：肌动蛋白反向引物

SEQ ID NO：49：p-Tub正向引物

SEQ ID NO：50：p-Tub反向引物

SEQ ID NO：51：SACdh正向引物

SEQ ID NO：52：SACdh反向引物

SEQ ID NO：53：pBINB33-1引物

SEQ ID NO：54：pBINB33-2引物

SEQ ID NO：55：SacdhPI R引物

SEQ ID NO：56：SacdhPI F引物

SEQ ID NO：57：LYS1Pot117-F引物

SEQ ID NO：58：LYS1Pot117-R引物

通过以下的实验性实施例的方式会更完整地理解本发明的各个方面。

以下所述的所有方法或操作以示例的方式给出并且对应于实现相同结果的各种可行方法中的选择。该选择对于结果的质量没有影响，并且相应地，本领域技术人员可以使用任意合适方法来实现相同的结果。具体地，除非在实施例中另外说明，按照Sambrook和Russel(2001，《分子克隆：实验手册》(Molecular cloning：A laboratory manual)，第3版，冷泉港实验室出版社，纽约)，Ausubel等(1994，《新编分子生物实验方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，新编方法(Current protocols)，美国第1卷和第2卷)，和Brown(1998，《分子生物学实验手册》(Molecular BiologyLabFax)，第2版，学术出版社，英国)中所述的标准实验方案进行所有采用的重组DNA技术。用于植物分子生物学的标准材料和方法在CroyR.D.D.(1993，《植物分子生物学手册》(Plant Molecular Biology LabFax)，BIOS科学出版有限公司(BIOS Scientific Publications Ltd)(英国)和Blackwell科学出版公司(Blackwell Scientific Publications)(英国))中描述。PCR(聚合酶链反应)的标准材料和方法也在Dieffenbach和Dveksler(1995，《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer：A laboratory manual)，冷泉港实验室出版社，纽约)和McPherson等(2000，《PCR基础：从背景到操作》(PCR-Basics：From background to bench)，第1版，SpringerVerlag，德国)中描述。

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实施例

实施例1：稻瘟菌的体外培养

使用稻瘟菌野生型菌株P1.2进行试验，该菌株源白蒙彼利埃(Montpellier)的CIRAD(法国农业研究发展国际合作中心(Centre de coopération internationaleen recherche agronomique pour le développement))的植物病原体实验室的菌库。Silué等(1998)描述了培养的条件，水稻-琼脂培养基的组成、维持和孢子形成以及原生质体制备。

实施例2：用靶向酵母氨酸脱氢酶的dsRNA转染稻瘟菌并且测量生长抑制

从布洛德研究所(Broad Institute)(http://www.broadinstitute.org/)得到稻瘟菌酵母氨酸脱氢酶(SACdh)基因序列Lys-1(MGG_01359.6：1426bp)。选择约325bp的区域用于dsRNA，由核苷酸301-626组成，由基因技术公司(Geneart company)合成并且克隆进质粒。

为了转染，按照生产商的说明书使用MEGAscript RNAi试剂盒(安碧公司(Ambion))产生来自稻瘟菌的酵母氨酸脱氢酶的dsRNA。按照生产商的说明书用转染试剂Lipofectamin RNAi混合物(英杰公司(Invitrogen))处理不同的量(200μg-2μg的dsRNA)。Lipofectamin-dsRNA复合物被加入到在含有TB3培养基(Villalba等，2008)的微量滴定板中的2.5x10⁶稻瘟菌原生质体中，并用Infinite M1000(Tecan)酶标仪以600nm OD监测生长5-7天。

在各个时间点上监测用酵母氨酸脱氢酶的dsRNA处理的稻瘟菌原生质体的生长与未处理的对照比较并且显示出生长的显著差异。

实施例3：致病疫霉的体外培养和游动孢子制备。

致病疫霉菌株菌株PT78在21℃下9cm的皮氏培养皿中体外避光培养于豌豆琼脂培养基上(125g/l煮沸并碾碎的豌豆，20g/l琼脂，羧苄青霉素100mg/l)。每15天，用4个5mm菌丝体立方孢塞(cubic plug)接种新的培养基。

为了释放游动孢子，12ml的冰水置于10天的培养物上并将该培养物在4℃下放置2小时。然后在不干扰(dwasturbing)菌丝体的情况下收集上清并且晶100μm筛过滤来去除菌丝片段。游动孢子被置于冰上并且用血球计数器计数。

实施例4：用靶向酵母氨酸脱氢酶的dsRNA转染致病疫霉并且测量生长抑制

从布洛德研究所的致病疫霉数据库中得到致病疫霉酵母氨酸脱氢酶基因序列Lys-1(PITG_03530：3020bp)。根据BLOCKit RNAi设计软件(英杰公司)，大约500bp的一个区域提供最佳siRNA，该区域由核苷酸2251-2750组成，由基因技术公司(Geneart company)合成并且克隆进入质粒0920357_SacDH_Pi_pMA。

按照生产商的说明书使用Megascript RNAi试剂盒(安碧公司)并且使用从质粒0920357_SacDH_Pi_pMA扩增的PCR产物为模板来进行dsRNA的合成。使用的正向引物是SACdh_Pi_T7_F：5’TAATACGACTCACTATAGGGTTGCAGGAGAGCGCAGAAAGC并且反向引物是SACdh_Pi_T7_R：TAATACGACTCACTATAGGGTCAGTTGGAGTCCGCGTGGTGT。

然后用100％乙醇和醋酸钠3M，pH5.2沉淀dsRNA，用70％乙醇洗涤2次并且团块重悬在无RNA酶的水中。

在48孔平板中制备转染混合物，依次加入V8培养基(5％的V8汁(比利时坎贝尔食品(Campbell Foods Belgium))，pH5)、合适量的dsRNA和10μl的脂质转染胺试剂RNAi混合物(英杰公司)至终体积200μl。在室温下孵育转染混合物15分钟。

游动孢子稀释入V8培养基中至5x104游动孢子/ml的浓度。然后，在平板的每个孔中加入800μL的游动孢子溶液。游动孢子的最终浓度是4x10⁵游动孢子/ml。

在每个平板上加入3个对照：V8培养基、V8培养基+游动孢子、V8培养基+游动孢子+Lipofectamine。在21℃下避光孵育板。

持续8天由酶标仪(Infinite1000，Tecan)测量620nm处的吸收来测定真菌的生长。采用下式计算生长抑制的百分比：100-(OD_dsRNA x100/OD_{对照Lipofectamine})。如图1所示，真菌的生长在针对酵母氨酸脱氢酶的dsRNA的存在下呈浓度依赖式(分别为100nM和200nM)的降低。

实施例5：致病疫霉酵母氨酸脱氢酶信使RNA的定量PCR分析：

为了产生足量RNA用于cDNA合成和实时RT-PCR，集中48孔板的多个孔来达到测试dsRNA的一定浓度：72小时时间点10孔、96小时时间点6孔、120小时时间点3孔。

在用dsRNA处理72小时、96小时和120小时之后，收集菌丝体。离心样品以去除培养基。样品在液氮中冷冻然后过夜冻干。

在RNA提取之前，研磨菌丝体。按照生产商的方案用RNeasy植物小试剂盒(凯杰公司(Qiagen))提取总RNA。通过DNA酶消化(无DNA，安碧公司)来去除RNA样品中的DNA污染物。按照由生产商提供的方案在2100生物分析仪(RNA6000Nano试剂盒，安捷伦)上测试RNA的完整性。按照生产商的方案通过使用试剂盒Thermoseript RT-PCR系统(英杰公司)的寡dT引发从2μg的总RNA中合成eDNA。然后用100％乙醇和醋酸钠3M，pH5.2沉淀eDNA，用70％乙醇洗涤2次并且团块重悬在10μL的无RNA酶的水中。eDNA稀释100倍用于qPCR测试。

通过使用Primer Express3软件(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))设计每条基因序列的引物对。按照生产商的方案在7900实时PCR系统(应用生物系统公司)上用Power SYBR PCR Master Mix(应用生物系统公司)来实施实时RT-PCR。如下进行Q-PCR：95℃10分钟，45个循环的95℃15秒和60℃1分钟，然后是解离阶段95℃15秒，60℃1分钟和95℃15秒。

使用肌动蛋白和β-微管蛋白基因作为内源性对照。用2ΔΔCt方法计算基因的相对表达。图2显示酵母氨酸脱氢酶信使RNA水平的显著降低并且这种降低关联有生长抑制。

表1：qPCR引物的序列：

实施例6：含有致病疫霉酵母氨酸脱氢酶基因的转化载体的构建。

a)植物表达载体IR47-71的制备

质粒pBinAR是二元载体质粒pBin19(Bevan，1984)的衍生物，其如下构建：包含花椰菜花叶病毒35S启动子的核苷酸6909-7437的529bp长度的片段，作为EcoR I\Kpn I片段分离自质粒pDH51(Pietrzak等，1986)并且连接在pUC18的多聚接头的EcoR I和Kpn I限制性位点之间。以这种方式形成质粒pUC18-35S。使用限制性内切酶Hind III和Pvu II，从质粒pAGV40(Herrera-Estrella等，1983)中分离包含Ti质粒pTiACHδ(Gielen等，1984)的T-DNA的章鱼碱合酶基因(基因3)的聚腺苷酸化信号(3′末端)的192bp长度的片段(核苷酸11749-11939)。在向Pvu I1限制性位点上加入Sph I接头之后，该片段被连接在pUC18-35S的Sph I和Hind III限制性位点之间。这样得到质粒pA7。在此，使用EcoR I和Hind III移出包含35S启动子和Ocs终止子的完整多聚接头并且连接进入适当切割的载体pBin19中。这样得到植物表达载体pBinAR(Hofgen和Willmitzer，1990)。

来自马铃薯的块茎特异蛋白(patatin)基因B33的启动子(Rocha-Sosa等，1989)作为Dra I片段(核苷酸-1512-+14)被连接进Ssf1-切割的载体pUC19中，其末端已经用T4-DNA聚合酶产生钝端。这样得到质粒pUC19-B33。由此质粒用EcoR I和Sma I移出B33启动子并且连接进入适当限制性切割的载体pBinAR中。这样得到植物表达载体pBinB33。为了促进进一步的克隆步骤，延伸了MCS(多克隆位点)。为此，合成了两个互补的寡核苷酸，在95℃下加热5分钟，缓慢冷却至室温使得固定良好(退火)并且被克隆进入pBinB33的Sal I和Kpn I限制性位点中。用于这个目的的寡核苷酸具有以下的序列：

pBINB33-1：5′-TCG ACA GGC CTG GAT CCT TAA TTA AAC TAGTCT CGA GGA GCT CGG TAC-3’

pBINB33-2：5′-CGA GCT CCT CGA GAC TAG TTT AAT TAA GGATCC AGG CCT G-3’

得到的质粒称为IR47-71。

b)包含致病疫霉酵母氨酸脱氢酶基因的核酸序列的植物表达载体pEPA248和pEPA262的制备。

从致病疫霉ORF Prot V1数据库中得到酵母氨酸脱氢酶序列(PITG_03530：3020bp)。按照BLOCKit RNAi设计软件(英杰公司)，一个约500bp的区域提供最佳siRNA，由基因技术公司合成该区域。

通过PCR从这个序列DNA中用引物SacdhPI R(5’-agaggtaccaagcttgcgtagctgg-3’)和SacdhPI F(5’-tatctcgagtctagacaacgccattggttac-3’)扩增300bp的片段。扩增的片段被克隆进pCRII-Topo(英杰公司)以得到质粒pEPA250。按照Wesley等(2001)，感兴趣的序列被克隆进pHannibal载体以得到质粒pEPA241。然后dsRNA表达盒被亚克隆进不同的二元(植物表达)载体pART27(GleaveAP，PMB20，(1992)，1203-1207)和IR47中来分别产生植物表达载体pEPA248和pEPA262。

载体pEPA248和pEPA262分别通过电穿孔被引入GV3101和C58C1RIF(pGV2260)土壤杆菌细胞中(Rocha-Sosa等(1989))，以进一步转化马铃薯植物。

实施例7：靶向核盘菌酵母氨酸脱氢酶基因lys1的转化载体的构建。

由基因技术公司合成核盘菌Lys1编码序列(酵母氨酸脱氢酶SS1G_06166.1)的351bp区域(pEPA293)，并且由设计用于实施2-步骤克隆的内部(XbaI，HindIII)和外部(XhoI，KpnI)限制性位点侧接入pHannibal载体(Wesley等，2001)。中间体质粒载有由pHannibal PdK内含子间隔的两个Lys1基因片段反转拷贝并且由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和OCS终止子调控。

然后用NotI切割完整的DNA盒并且插入pART27二元载体(Gleave，1992)得到具有基于卡那霉素抗性(由Nos启动子和终止子调控的nptII基因)的植物选择盒的最终质粒pEPA307。

相同的NotI盒也被插入到具有基于HPPD抑制剂抗性的植物选择标记物的二元载体(pFCO31)中，以用于大豆转化。然后最终质粒能够带T-DNA来转化植物，所示T-DNA在右边界和左边界之间包含我们感兴趣的盒、由CsVMV启动子调控的HPPD基因、叶绿体转运肽序列和3’Nos终止子。

实施例8：靶向豆薯层锈菌酵母氨酸脱氢酶基因lys1的转化载体的构建。

由基因技术公司合成豆薯层锈菌Lys1E.S.T.(酵母氨酸脱氢酶PHAPC_EH247326.1)的364bp区域(pCED42)，并且由设计用于实施2-步骤克隆的内部(XbaI，HindIII)和外部(XhoI，KpnI)限制性位点侧接入pHannibal载体(Wesley等，2001)。中间体质粒载有由pHannibal PdK内含子间隔的两个Lys1基因片段反转拷贝并且由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和OCS终止子调控。

然后用NotI切割完整的DNA盒并且插入pART27二元载体(Gleave，1992)得到具有基于卡那霉素抗性(由Nos启动子和终止子调控的nptII基因)的植物选择盒的最终质粒pCED45。

相同的NotI盒也被插入到具有基于HPPD抑制剂抗性的植物选择标记物的二元载体(pFCO31)中，以用于大豆转化中。然后最终质粒(pCED87)能够用T-DNA来转化植物，所述T-DNA在右边界和左边界之间包含我们感兴趣的盒、由CsVMV启动子调控的HPPD基因、叶绿体转运肽序列和3’Nos终止子。

实施例9：用包含编码发夹酵母氨酸脱氢酶构建体pEPA262的核酸分子的植物表达载体转化马铃薯植物

通过土壤杆菌使用植物表达载体pEPA262来转化马铃薯植物，该载体包含在如Rocha-Sosa等(1989)所述来自马铃薯的patatin基因B33启动子控制下的酵母氨酸脱氢酶的编码核酸序列。用质粒pEPA262转化的转基因马铃薯植物被称为“537ES”。

采用标准PCR方法(Sambrook等)来实施“537ES”事件的分子分析来监测酵母氨酸脱氢酶的核酸序列的存在，使用以下引物：SacDH PI F：5′-TATCTCGAGTCTAGACAACGCCATTGGTTAC-3′和SacDH PI R：5′-AGAGGTACCAAGCTTGCGTAGCTGG-3′。通过Northen印迹或通过RT-QPCR对酵母氨酸脱氢酶的核酸序列的表达分析导致不同事件选择来完成进一步的选择。用于这个目的的寡核苷酸具有以下的序列：LYS1_Pot117-F：5′-TCA ATA GAA GCG AAC GCG TAA A-3’和LYS1_Pot117-R：5′-GTTCGG GAT CTG CTC GAT GT-3’。

实施例10：土壤杆菌介导的拟南芥的转化。

pART27衍生的质粒通过电穿孔被引入根癌土壤杆菌菌株LBA4404(英杰Electromax)中。然后所得的细菌菌株用于拟南芥Col-0或瓦斯莱(Wassileskija)植物的花浸渍浸润，如Clough和Bent(PlantJ1998)所述。

实施例11：土壤杆菌介导的大豆的转化。

pFCO31衍生的质粒通过电穿孔被引入根癌土壤杆菌菌株LBA4404(英杰Electromax)中。然后所得的菌株用于如下所述的大豆转化。

大豆种子用氯气灭菌24小时。然后种子置于皮氏培养皿中，并避光室温浸入无菌去离子水20小时后接种。在28℃和200rpm搅拌下生长在含有合适抗生素的200ml的YEP(5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl2，pH至7.0)中的根癌土壤杆菌的过夜培养物在4000rpm，4℃下离心15分钟。团块重悬在40-50mL的感染培养基中至最终OD600nm为0.6-1并且在冰上储存。无菌条件下，使用15号手术刀片来切开浸种以分离子叶并且去除与它们连接的初生叶。每一片子叶作为接种外植体保存。制备约100个外植体，随后一起在土壤杆菌接种物中接种30分钟，并偶尔搅拌。

在经典皮氏培养皿中进行共培养，培养皿内含有4张滤纸(

1级)和4mL的共培养培养基(1/10X B5主要盐，1/10X B5次要盐，2.8mg/L亚铁(Ferrous)，3.8mg/L NaEDTA，30g/L蔗糖，3.9g/L MES(pH5.4)，过滤除菌的1X B5维生素，GA3(0.25mg/L)，BAP(1.67mg/L)，半胱氨酸(400mg/L)，二硫苏糖醇(154.2mg/L)和200μM乙酰丁香酮)。

外植体置于共培养板上(每板9个)，近轴面(平放)向下并且用带的单个垂直绳

密封并且进一步在18:6光周期下在24℃下孵育5天。在共培养结束时，外植体被置于(每板6个)芽诱导培养基(1X B5主要盐，1X B5次要盐，28mg/L亚铁，38mg/L NaEDTA，30g/L蔗糖，0.56g/LMES和8g/L琼脂(pH5.6)，过滤除菌的1X B5维生素，BAP(1.67mg/L)，特美汀(50mg/L)，头孢噻肟(50mg/L)，万古霉素(50mg/L)和环磺酮(Tembotrione)(0.1mg/L))中，倾斜45°，子叶节区域埋在培养基中并向上。芽诱导步骤持续1个月(24℃16/8光周期)。再一个月后，具有绿色萌芽的外植体被转移至芽伸长培养基(1X MS/B5培养基，加入用1mg/l玉米素核苷(ZR)，0.1mg/l IAA，0.5mg/l GA3，3％蔗糖，100mg/l焦谷氨酸，50mg/l天冬酰胺，0.56g/L MES，pH5.6，用0.8％琼脂固化，替卡西林(50mg/l)，头孢噻肟(50mg/l)万古霉素(50mg/L))上，每两周转移到新鲜培养基上。超过2cm高的小植株被转移至生根培养基上。切开小植株并且在180mL垂直塑料容器中置于生根培养基(1/2MS主要盐，次要盐和维生素B5，15g/L蔗糖，1mg/L IBA，8g/L纯化琼脂，pH5.7)上。一旦根充分形成并且顶体强壮，植物被置于温室中的土壤中并且用绿色塑料盒覆盖来在36℃加热床上顺应5天。在10天的顺应之后，植物被转移至于没有加热床的大盆中。

实施例12：亚洲大豆锈病(豆薯层锈菌)试验。

表达直接针对豆薯层锈菌Lysl的dsRNA的大豆植物在温室中在7.5cm盆中生长(28.5℃，50％湿度，14小时光照)。在培养箱中，使植物喷洒到分生孢子悬浮液(从用作接种来源的人工感染的大豆植物中得到的50ml的10-15X10⁴孢子/ml浓度，用于尺寸为55X34X5cm的一个盘，含有15盆)。悬浮液包含0.033％的吐温20。为了保持均匀的接种，需要多方向喷洒。然后植物在约25℃(白天)下和约20℃(夜晚)下用非常高的湿度(90％至饱和)孵育4天。在这段时间之后，植物被转回正常生长条件。以规律的间隔评估亚洲大豆锈病的发展来跟踪疾病发展的动态和症状的严重程度。所有亚洲大豆锈病的实验在L2安全水平的培养室和培养箱中按照HCB要求进行。

实施例13：核盘菌试验

在完整植物试验上研究野生型核盘菌分离株1980和pac1突变体(Rollins，2003)真菌的发展。核盘菌在4℃下储存于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA，马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂18g/l)上。真菌在含有PDA的皮氏培养皿中通过在中心放置菌丝体块来培养并且在静态条件下在21℃下维持4天。用从真菌菌落的活性生长边界切下的12-mm直径琼脂-菌丝体块接种4周龄的拟南芥野生型和转基因植物至植物中心。接种的植物保持在21℃，100％相对湿度的生长室内，12-小时光照周期，采用白色荧光灯，光强度为34mmol m-2s-1，并且每12小时监测以观察真菌发展。通过感染的叶的数量和病斑的长度和宽度来监测疾病症状。