BRPI0616844A2

BRPI0616844A2 - célula de planta geneticamente modificada, uso da mesma, planta, processo para produção da mesma, material de reprodução de plantas, partes de plantas colhìveis, processo para produção de hialuronano, composição, bem como seu processo de produção

Info

Publication number: BRPI0616844A2
Application number: BRPI0616844-2A
Authority: BR
Inventors: Claus Frohberg
Original assignee: Bayer Cropscience Ag
Priority date: 2005-10-05
Filing date: 2006-10-05
Publication date: 2011-07-05
Also published as: ZA200803693B; CA2624496A1; EP1941047A1; JP2009509556A; WO2007039315A1; CN101297041A; AU2006298962A1; US20080250533A1

Abstract

CéLULA DE PLANTA GENETICAMENTE MODIFICADA, USO DA MESMA, PLANTA, PROCESSO PARA PRODUçãO DA MESMA, MATERIAL DE REPRODUçãO DE PLANTAS, PARTES DE PLANTAS COLHìVEIS, PROCESSO PARA PRODUçãO DE HIALURONANO, COMPOSIçãO, BEM COMO SEU PROCESSO DE PRODUçãO. A presente invenção refere-se a células de plantas e plantas, que sintetizam uma quantidade aumentada de hialuronano, bem como processos para a produção dessas plantas, como também processos para a produção de hialuronano com auxílio dessas células de plantas ou plantas. Nesse caso, as células de plantas de acordo com a invenção ou plantas geneticamente modificadas apresentam a atividade de uma hialuronano sinta-se e, adicionalmente, uma atividade aumentada de uma UDP-glicose-desidrogenase (UDP-Glc-DH) em comparação com células de plantas de tipo silvestre ou plantas de tipo silvestre. Além disso, a presente invenção refere-se à utilização de plantas com síntese de hialuronano aumentada para a produção de hialuronano e alimentos ou forragens, que contêm hialuronano.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLULA DEPLANTA GENETICAMENTE MODIFICADA, USO DA MESMA, PLANTA,PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA MESMA, MATERIAL DE REPRODU-ÇÃO DE PLANTAS, PARTES DE PLANTAS COLHÍVEIS, PROCESSOPARA PRODUÇÃO DE HIALURONANO, COMPOSIÇÃO, BEM COMOSEU PROCESSO DE PRODUÇÃO".

A presente invenção refere-se a células de plantas e plantas,que sintetizam uma quantidade aumentada de hialuronano, bem como pro-cessos para a produção dessas plantas, como também processos para aprodução de hialuronano com auxílio dessas células de plantas ou plantas.Nesse caso, as células de plantas de acordo com a invenção ou plantas ge-neticamente modificadas apresentam a atividade de uma hialuronano sinta-se e, adicionalmente, um atividade aumentada de uma desidrogenase deUDP-glicose (UDP-GIc-DH) em comparação às células de plantas de tiposilvestre ou plantas de tipo silvestre. Além disso, a invenção refere-se à utili-zação de plantas com síntese aumentada de hialuronano para a produçãode hialuronano e alimentos ou forragens, que contêm hialuronano.

Hialuronano é um mucopolissacarídeo (glucosaminoglucano)linear, não ramificado, presente na natureza, o qual é composto de molécu-las alternativas de ácido glucurônico e N-acetil-glucosamina. O componentebásico de hialuronano consiste no dissacarídeo beta-1,3-N-acetil-glucosamina de ácido glucurônico. Essa unidade de repetição está ligadauma com a outra no hialuronano por ligações beta-1,4.

O termo ácido hialurônico é freqüentemente utilizado na áreafarmacêutica. Visto que o hialuronano se apresenta, na maioria das vezes,como poliânion e não como ácido livre, utiliza-se a seguir preferentemente otermo hialuronano, em que as duas formas de molécula valem como sendoabrangidas pela respectiva designação.

O hialuronano possui características físico-químicas extraordiná-rias, tais como por exemplo, características de polieletrólitos, característicasviscoelasticas, uma alta capacidade de ligar água, características de forma-ção de gel, que, além de outras características de hialuronano, são descritasem um artigo sinóptico por Lapcik et al. (1998, Chemical Reviews 98(8)2663-2684).

o hialuronano é componente de tecido de ligação extracelular elíquidos do corpo de vertebrados. No homem, o ácido hialurônico é sintetiza-do pela membrana celular de todas as células do corpo, principalmente pe-las células mesenquimais e está presente de maneira ubiquitária no corpo,com uma concentração particularmente alta nos tecidos de ligação, na ma-triz extracelular, no cordão umbilical, no líquido das articulações, no tecidocartilaginoso, na pele e no corpo vítreo do olho (Bernhard Gebauer, 1998,Inaugural-Dissertation, Virchow-Klinikum, Faculdade de Medicina Charité daUniversidade Humboldt em Berlin; Fraser et al., 1997, Journal of InternaiMedicine 242, 27-33). Recentemente, o hialuronano também pôde ser com-provado em organismos animais não vertebrados (moluscos) (Volpi e Mac-cari, 2003, Biochimie 85, 619-625).

Além disso, algumas bactérias gram-positivas patogênicas hu-manas (estreptococos do grupo A e C) e bactérias gram-negativas (pasteu-rela) sintetizam hialuronano como exopolissacarídeos, que preservam essasbactérias contra o acesso do sistema imunológico de seu hospedeiro, pois ohialuronano representa uma substância não imunógena. Vírus, os quais in-fectam algas verdes do gênero Chlorella monocelulares e parcialmente pre-sentes como endossimbiontes em espécies Paramecium, proporcionam àsalgas verdes monocelulares após a infecção do vírus, a capacidade, de sin-tetizar hialuronano (Graves et al., 1999, Virology 257, 15-23). No entanto, acapacidade para a síntese de hialuronano não é uma característica, que estáagregada às respectivas algas. A capacidade das algas, de sintetizar hialu-ronano é intermediada por uma infecção de um vírus, cujo genoma apresen-ta uma seqüência que codifica a hialuronano sintase (DeAngelis, 1997, Sci-ence 278, 1800-1803). Além disso, o vírus contém seqüências de genoma,que codificam um UDP-glicose-desidrogenase (UDP-GIc-DH). UDP-GIi-DHcatalisa a síntese de ácido UDP-glucurônico, que é utilizado como substratopela hialuronano sintase (DeAngelis et al., 1997, Science 278, 1800-1803,Graves et al., 1999, Virology 257, 15-23). Não se conhece a importância daexpressão de UDP-GIc-DH em vírus de células de Chlorella infectadas paraa síntese de hialuronano e nem se ela é necessária para a síntese de hialu-ronano.

As próprias plantas naturais não apresentam ácido nucleico emseu genoma, que codificam proteínas, que catalisam a síntese de hialurona-no e, embora tenham sido descritos e caracterizados um sem-número decarboidratos vegetais, até agora não foram comprovados nem hialuronanonem moléculas relacionadas ao hialuronano em plantas naturais, não infec-tadas (Graves et al., 1999, Virology 257, 15-23).

A catálise da síntese de hialuronano é realizada por uma únicaenzima integrada à membrana ou associada à membrana, a hialuronanosintase. As hialuronano sintases pesquisadas até agora podem ser divididasem dois grupos: hialuronano sintases da classe I e hialuronano sintases daclasse Il (DeAngelis, 1999, CMLS, Cellular and Molecular Life Sciences 56,670-682). Uma outra distinção das hialuronano sintases de vertebrados éefetuada com base nas isoenzimas identificadas. As diversas isoenzimassão designadas com números arábicos na ordem de sua identificação (porexemplo, hsHASI, hsHAS2, hsHAS3).

O mecanismo da transferência de moléculas de hialuronano sin-tetizadas através da membrana do citoplasma para longe do meio que en-volve as células, ainda não está completamente esclarecido. Hipóteses ante-riores partiam do fato de que o transporte através da membrana celular paralonge da hialuronano sintase seria realizado por ele mesmo. No entanto, re-sultados atuais apontam para o fato de que o transporte de moléculas dehialuronano se realiza através da membrana do citoplasma por um transpor-te dependente de energia por meio de proteínas de transporte competentespara esse fim. Dessa maneira, através de mutagênese, foram produzidascepas de Streptococcus, nas quais a síntese de uma proteína de transporteativa foi inibida. Essas cepas sintetizam menos hialuronano do que o tiposilvestre de cepas de bactérias correspondentes (Ouskova et al., 2004, Gly-cobiology 14(10), 931-938). Em células de fibroblastos humanas foi possíveldemonstrar, com auxílio de agentes de ação especificamente inibidora sobreproteínas de transporte, que tanto a quantidade de hialuronano produzido,como também a atividade de sintases de hialuronano pode ser reduzida(Prehm und Schumacher, 2004, Biochemical Pharmacology 68, 1401-1410).Não se sabe, se e se em tudo, em que quantidade de proteínas de transpor-te, que podem transportar hialuronano, está presente em plantas.

As extraordinárias características do hialuronano divulgam umavariedade de possibilidades para a aplicação nos mais diversos campos, taiscomo, por exemplo, na farmácia, na indústria cosmética, na produção dealimentos e forragens, em aplicações técnicas (por exemplo, como Iubrifican-tes) e outros. As aplicações mais importantes, nas quais o hialuronano é a-tualmente utilizado, estão na área medicinal e cosmética (vide, por exemplo,Lapcik et ai., 1998, Chemical Reviews 98(8), 2663-2684, Goa und Benfield,1994, Drugs 47(3), 536-566). Na área medicinal, os produtos contendo hialu-ronano são atualmente utilizados para o tratamento intra-articular da artrose,bem como na oftalmologia, que são utilizados em cirurgias no olho. O hialu-ronano também é utilizado para o tratamento de doenças articulares em ca-valos de corrida. Além disso, o ácido hialurônico é componente de algunsrinológicos, que servem,por exemplo, na forma de gotas oftálmicas e nasaispara umedecer a mucosa seca. Soluções injetáveis contendo hialuronanosão utilizadas como analgésicos e antirreumáticos. Hialuronano ou camadascontendo hialuronano derivatizado são aplicadas na cura de feridas. Implan-tes de gel contendo hialuronano são usados como preparações dermatológi-cas para a correção de deformações da pele na cirurgia plástica.

Para aplicações farmacológicas prefere-se o hialuronano comum alto peso molecular.

Na medicina estética as preparações de hialuronano são incluí-das nos materiais apropriados de preenchimento de pele. Injetando hialuro-nano, obtém-se por um tempo limitado o alisamento de rugas ou um volumeaumentado dos lábios. Em produtos cosméticos, especialmente em cremes para pele e loções, o hialuronano encontra freqüente aplicação como ume-decedor, devido a sua alta capacidade de ligação à água.

Além disso, as preparações contendo hialuronano são vendidascomo os chamados nutracêuticos(suplementos alimentares), que tambémsão aplicados em animais (por exemplo, cães, cavalos) para a prevenção ealívio de artrose.

Hialuronano utilizado para fins industriais é atualmente isoladode tecidos animais (cristas de gaios) ou produzido fermentativamente pormeio de culturas de bactérias.

Um processo para o isolamento de hialuronano de cristas degaios ou alternativamente de cordões umbilicais é descrito na US 4.141.973.Além de hialuronano em tecidos animais (por exemplo, cristas de gaios, cor-dões umbilicais) ainda há outros mucopolissacarídeos relacionados com hia-luronano, tais como sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato dequeratano, sulfato de heparano e heparina. Organismos animais apresen-tam, além disso, proteínas (hialaderinas), que se ligam especificamente emhialuronano e que são necessárias para as mais diversas funções no orga-nismo, tais como, por exemplo, para a degradação de hialuronano no fígado,a função de hialuronano como estrutura condutora para a migração celular, aregulação da endocitose, o ancoramento de hialuronano na superfície dacélula ou a formação de redes de hialuronano (Turley, 1991, Adv Drug Deli-very Rev 7, 257 e seguintes; Laurent e Fraser, 1992, FASEB J. 6, 183 e se-guintes; Stamenkoviv e Aruffo, 1993, Methods Enzymol. 245, 195 e seguin-tes; Knudson e Knudson, 1993, FASEB 7, 1233 e seguintes).

As cepas de Streptococcus usadas para a produção bacterianade hialuronano pertencem exclusivamente às bactérias patogênicas huma-nas. Ao serem cultivadas essas bactérias produzem também exotoxinas (pi-rogênicas) e hemolisinas (estreptolisina (especialmente alfa- e beta-hemolisina) (Kilian, M.: Streptococcus and Enterococcus. In: Medicai Micro-biology. Greenwood, D.; Slack, RCA; Peutherer, J.F. (Eds.). Capítulo 16.Churchill Livingstone, Edinburgh, Reino Unido: páginas 174-188, 2002, ISBN0443070776), que são colocadas em meio de cultura. Esse dificulta a purifi-cação e isolamento do hialuronano, o qual foi produzido com auxílio de ce-pas de Streptococcus. A presença de exotoxinas e hemolisinas nas prepara-ções representa um problema particularmente para aplicações farmacêuti-cas. A US 4.801.539 descreve a produção de hialuronano através da fer-mentação de uma cepa de bactérias que sofreu mutagênese (Streptococcuszooedemicus). A cepa de bactérias que sofreu mutagênese utilizada nãosintetiza mais a beta-hemolisina. Nesse caso, foi obtido um rendimento de3,6 g de hialuronano por litro de cultura.

A EP 0694616 descreve um processo para o cultivo de Strepto-coccus zooedemicus ou Streptococcus equi, no qual, com as condições decultura, não é sintetizada estreptolisina, mas grandes quantidades de hialu-ronano. Nesse caso, foi obtido um rendimento de 3,5 g de hialuronano porlitro de cultura.

Durante a cultura, cepas de Streptococcus transferem a enzimahialuronidase para o meio de cultura, o que leva a que também neste siste-ma de produção o peso molecular durante a purificação seja reduzido. O usode hialuronidase de cepas de Streptoeoceus negativas ou de processos deprodução, nos quais a produção de hialuronidase é inibida durante a cultura,para a produção de hialuronano, são descritos na US 4.782.046. Nesse ca-so, é obtido um rendimento de até 2,5 g de hialuronano por litro de cultura,sendo obtido um peso molecular médio máximo de 3,8x106 Da com umadistribuição de peso molecular de 2,4x106 até 4,0x106.

A US 20030175902 e a WO 03 054163 descrevem a produçãode hialuronano com auxílio da expressão heteróloga de uma hialuronanosintase a partir de Streptoeoceus equisimilis em Bacillus subtilis. Para obter aprodução de quantidades suficientes de hialuronano, necessita-se, além daexpressão heteróloga de uma hialuronano sintase, também a expressão si-multânea de uma UDP-glicose-desidrogenase nas células de Bacillus. Aquantidade absoluta de hialuronano, que é obtida na produção com auxíliode Bacillus subtilis, não é mencionada na US 20030175902 e na WO 030541*63. Foi obtido um peso molecular médio máximo de cerca de 4,2x10®Da. Esse peso molecular médio, no entanto, foi obtido apenas para a cepade Bacillus recombinante, na qual um gene que codifica o gene da hialuro-nano sintase de Streptococcus equisimilis e o gene que codifica a UDP-glicose-desidrogenase de Bacillus subtilis foi integrado no genoma do Bacil-Ius subtilis sob o controle do promotor amyQ e simultaneamente o genecxpY endógeno de Bacillus subtilis foi inativado (que codifica uma citocro-moxidase P450).

A WO 05 012529 descreve a produção de plantas de tabacotransgênicas que foram transformadas com moléculas de ácido nucleico,que codifica hialuronano sintases a partir de vírus infectados com Chlorella.Na WO 05 012529, por um lado, foram utilizadas seqüências de ácido nucle-ico, que codifica a hialuronano sintase da cepa CVHI1 do vírus Chlorella e,por outro lado, da cepa CVKA1 do vírus Chlorella, para a transformação deplantas de tabaco. A síntese de hialuronano pôde ser comprovada apenaspara uma planta, que após a transformação com uma seqüência de ácidonucleico, que codifica uma hialuronano sintase, que foi isolada da cepa CV-KA1 do vírus Chlorella. Para plantas de tabaco, que com uma seqüência deácido nucleico, que codificam uma hialuronano sintase, que foi isolada dacepa CVHI1 do vírus Chlorella, não foi possível comprovar nenhuma síntesede hialuronano nas plantas transgênicas correspondentes. A quantidade dehialuronano que foi sintetizada pela única planta de tabaco transgênica pro-dutora de hialuronano, obtida na WO 05 012529, é indicada com cerca de4,2 pg de hialuronano por ml de volume medido o que, considerando-se adescrição para a execução do respectivo experimento, corresponde aproxi-madamente a uma quantidade de no máximo 12 pg de hialuronano produzi-do por grama de peso fresco de material da planta.

Hialuronano sintase catalisa a síntese de hialuronano partindodos produtos de partida UDP-N-acetil glucosamina e ácido UDP-glucurônico.Os dois produtos de partida mencionados estão presentes em células vege-tais.

Ácido UDP-glucurônico serve em células vegetais como metabó-Iito para um dos vários possíveis processos de síntese do ácido ascórbico(Lorence et al., 2004, Plant Physiol 134, 1200-1205) e como metabólito cen-trai para a síntese do componente da parede celular pectina e hemicelulose,que são sintetizadas na retícula endoplasmática da célula vegetal (Reiter,1998, Plant Physiol Biochem 36(1), 167-176). O monômero mais importantee mais freqüente da pectina representa o ácido D-galacturônico (2004, H. W.Heldt em "Plant Biochemistry", 3a edição, Academic Press, ISBN0120883910), o qual é sintetizado com o emprego de ácido UDP-glucurônico. Além disso, entre outros, também podem ser sintetizados UDP-xilose, UDP-arabinose, ácido UDP-galacturônico e UDP-apiose, metabólitospara a síntese de hemicelulose e pectina, com o emprego de ácido UDP-glucurônico (Seitz et al„ 2000, Plant Journal, 21(6), 537-546). O ácido UDP-glucurônico pode ser sintetizado em células vegetais ou por meio do meta-bolismo de fosfato de hexose, que abrange, entre outros, a reação de UDP-glicose para ácido UDP-glucurônico através de UDP-GIc-DH ou por meio doprocesso de metabolismo oxidativo /r?yo-inositol, que abrange a reação deglicuronato-1-fosfato para ácido UDP-glucurônico por meio da uridililtransfe-rase de fosfato de glicuronato-1-fosfato. Os dois processos de metabolismopara a síntese de ácido glucurônico parecem existir, independentes uns dosoutros, alternativamente em diferentes tecidos/estágios de desenvolvimentode plantas Arabidopsis (Seitz et al., 2000, Plant Journal 21(6), 537-546). A-inda não está esclarecido, que contribuição os dois processos de metabo-lismo mencionados (metabolismo de fosfato de hexose ou metabolismo oxi-dativo de myo-inositol) prestam em cada caso em relação à síntese do ácidoUDP-glucurônico (Kárkõnen, 2005, Plant Biosystems 139(1), 46-49).

A enzima UDP-GIc-DH catalisa a reação de UDP-glicose paraácido UDP-glucurônico. Samac et al. (2004, Applied Biochemistry and Biote-chnology 113-116, Humana Press, EditorAshok Mulehandani, 1167-1182)descrevem a superexpressão específica de tecido de uma UDP-GIc-DH desoja em células Phloem de alfafa com o objetivo, de aumentar o teor de pec-tina nos caules dessas plantas. Embora a atividade da UDP-GIc-DH possaser aumentada em mais de 200% em comparação com o tipo silvestre deplantas correspondentes, a quantidade de pectina, que foi produzida porplantas correspondentes, era menor do que a quantidade de pectina, que foiproduzida pelas plantas de tipo silvestre correspondentes. A quantidade dosmonômeros xilose e ramnose na fração da parede celular das respectivasplantas transgênicas estava aumentada, ao contrário do que a quantidadede monômeros manose na fração da parede celular era reduzida.

A superexpressão constitutiva de uma UDP-GIc-DH em plantasArabidosis levou a que as respectivas plantas comparadas com plantas detipo silvestre correspondentes mostrassem um crescimento aberrante e a- presentassem um fenótipo anão (dwarf). A fração da parede celular dasplantas correspondentes apresentou uma quantidade aumentada de manosee galactose e uma quantidade reduzida de xilose, arabinose e ácidos urôni-cos em comparação às plantas de tipo silvestre correspondentes (Roman,2004, "Studies on The Role of UDP-GIc-DH in Polysaccharide Biosynthesis",Dissertation, Acta Universitatis Upsaliensis, ISBN 91-554-6088-7, ISSN0282-7476). Esses resultados estão, portanto, pelo menos parcialmente emdesacordo com os resultados de Samac et al. (2004, Applied Biochemistryand Biotechnology 113-116, Humana Press, Edittor Ashok Mulehandani,1167-1182), tinham comprovado uma quantidade reduzida de manose euma quantidade aumentada de xilose na fração da parede celular de plantastransgênicas correspondentes.

A produção de hialuronano com auxílio da fermentação de cepasde bactérias está ligada a altos custos, pois as bactérias precisam ser fer-mentadas em recipientes estéreis, fechados, com condições de cultura con-troladas, caras (vide, por exemplo, US 4.897.349). Além disso, a quantidadede hialuronano, que pode ser produzido por meio da fermentação de cepasde bactérias, é limitada pelas instalações de produção existentes em cadacaso. Nesse caso, deve-se considerar também que os fermentadores, devi-do às Iegalidades físicas, não podem ser construídos para volumes de cultu- ra excessivamente grandes. De modo especial, menciona-se aqui a misturauniforme para uma produção eficiente de substâncias introduzidas do exteri-or (por exemplo, fontes de substâncias nutritivas essenciais para bactérias,reagentes para a regulação do pH, oxigênio) com o meio de cultura, que po-de ser assegurada em grandes fermentadores, se de tudo, somente com grandes gastos técnicos.

A presença de outros mucopolissacarídeos e de proteínas quese ligam especificamente ao hialuronano em tecidos animais, encarece apurificação de hialuronano de organismos animais. O uso de preparaçõesmedicinais contendo hialuronano, que são contaminadas com proteínas a-nimais, pode levar a reações imunológicas indesejáveis do corpo de pacien-tes (US 4.141.973), especialmente quando o paciente apresenta uma alergiacontra proteínas animais (por exemplo, albumina de galinha). Além disso, asquantidades (rendimentos) de hialuronano, que podem ser obtidas a partirde tecidos animais com qualidade e pureza satisfatórias, são baixas (cristade galo: 0,079% w/w, EP 0144019, US 4.782.046), o que leva a que grandesquantidades de tecidos animais precisem ser processadas. Um outro pro-blema no isolamento de hialuronano a partir de tecidos animais, consiste emque o peso molecular do hialuronano durante a purificação é reduzido, por-que tecidos animais também apresentam uma enzima que degrada hialuro-nano (hialuronidase).

Cepas de Streptococcus produzem, além das hialuronidases eexotoxinas já mencionadas, também endotoxinas, que, quando presentesem produtos farmacológicos, representam riscos para a saúde do paciente.Em um estudo científico foi demonstrado, que mesmo preparações medici-nais contendo hialuronano encontradas no mercado, ainda apresentamquantidades comprováveis de endotoxinas bacterianas (Dick et al., 2003,Eur J Ophtalmol. 13(2), 176-184). Uma outra desvantagem do hialuronanoproduzido com auxílio de cepas de Streptococcus consiste em que o hialu-ronano isolado apresenta um peso molecular mais baixo, do que hialurona-no, que foi isolado de cristas de gaios (Lapcik et al. 1998, Chemical Reviews98(8), 2663-2684). A US 20030134393 descreve o emprego de uma cepa detreptoeoceus para a produção de hialuronano, a qual sintetiza uma cápsulade hialuronano particularmente pronunciada (supercapsuladas). O hialuro-nano isolado após a fermentação apresentou um peso molecular de9,1x106Da. No entanto, o rendimento importou meramente em 350 mg porlitro.

Na verdade, algumas das desvantagens da produção de hialu-ronano por meio de fermentação bacteriana ou do isolamento de tecidos a-nimais, poderiam ser excluídas através da produção de hialuronano por meiode plantas transgênicas, no entanto, as quantidades de hialuronano obtidasaté agora, que podem ser obtidas por meio de plantas transgênicas, necessi-tariam de uma área cultivável relativamente grande, para produzir maioresquantidades de hialuronano. Além disso, o isolamento ou purificação de hia-luronano de plantas, que apresentam um baixo teor de hialuronano é essen-cialmente mais caro e de custos mais intensos do que de plantas, que apre-sentam um maior teor de hialuronano.

Embora o hialuronano apresente características extraordinárias,até agora ele é utilizado, se de tudo, raramente, devido a sua pouca disponi-bilidade e ao alto preço.

Por conseguinte, o objetivo da presente invenção, é pôr agentese processos à disposição, que permitam pôr hialuronano à disposição emquantidade e qualidade suficiente, bem como abrir a possibilidade de dispo-nibilizar hialuronano também para aplicações técnicas e aplicações na áreade alimentos e forragens.

Esse objetivo é resolvido pelas formas de concretização desig-nadas nas reivindicações.

Dessa maneira, a presente invenção refere-se a células de plan-tas geneticamente modificadas ou plantas geneticamente modificadas, queapresentam uma molécula de ácido nucleico integrada de maneira estávelem seu genoma, que codifica uma hialuronano sintase, caracterizadas pelofato de que as células de plantas mencionadas ou as plantas mencionadasapresentam adicionalmente uma atividade aumentada de uma proteína coma atividade (enzimática) de uma UDP-glicose-desidrogenase (UDP-GIc-DH)em comparação às células de plantas de tipo silvestre correspondentes nãogeneticamente modificadas ou plantas de tipo silvestre não geneticamentemodificadas.

Nesse caso, a modificação genética de células de plantas gene-ticamente modificadas de acordo com a invenção, ou de plantas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção, pode ser qualquer modifica-ção genética, que causa uma integração estável de uma molécula de ácidonucleico, que codifica uma hialuronano sintase em uma célula de planta ouem uma planta e que leva ao aumento da atividade de uma proteína com aatividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH em células de plantas genetica-mente modificadas ou em plantas geneticamente modificadas, em compara-ção com células de plantas de tipo silvestre correspondentes não genetica-mente modificadas ou plantas de tipo silvestre não geneticamente modificadas.

O termo "célula de planta de tipo silvestre" no contexto da pre-sente invenção, significa que se trata de células de plantas, que serviramcomo material de partida para a produção das células de plantas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção, isto é, cuja informação gené-tica, apesar das modificações genéticas introduzidas, levam a uma integra-ção estável de uma molécula de ácido nucleico, que codifica uma hialurona-no sintase e ao aumento da atividade de uma proteína com a atividade deuma UDP-GIc-DH, que corresponde a uma célula de planta geneticamentemodificada de acordo com a invenção.

O termo "planta de tipo silvestre" no contexto da presente inven-ção, significa que se trata de plantas, que serviram como material de partidapara a produção das plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção, isto é, cuja informação genética, apesar das modificações genéti-cas introduzidas, leva a uma integração estável de uma molécula de ácidonucleico, que codifica uma hialuronano sintase e ao aumento da atividade deuma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH, que corresponde a umaplanta geneticamente modificada de acordo com a invenção.

O termo "correspondente" no contexto da presente invenção,significa que na comparação de vários objetivos, os respectivos objetivos,que são comparados uns com os outros, foram mantidos com as mesmascondições. No contexto da presente invenção, o termo "correspondente" nocontexto com células de plantas de tipo silvestre ou plantas de tipo silvestre,significa que as células de plantas ou plantas, que são comparadas umascom as outras foram cultivadas com as mesmas condições de cultura e queelas apresentam uma mesma idade (de cultura).

Pelo termo "hialuronano sintase (EC 2.4.1.212) no contexto dapresente invenção, deve ser entendida uma proteína, que partindo dos subs-tratos ácido UDP-glucurônico (UDP-GIcA) e N-acetil-glucosamina (UDP-GIcNAc), sintetiza hialuronano. A catálise da síntese de hialuronano segue,com isso, os seguintes esquemas de reação:ηUDP-GIcA + nUDP-GIcNAc -> beta-1,4-[GlcA-beta-1,3-GlcNAc]n + 2 nUDPMoléculas de ácido nucleico e seqüências de proteínas corres-pondentes, que codificam hialuronano sintase são descritas, entre outros,para os seguintes organismos: coelhos (Oryctolagus cuniculus) ocHas2(EMBL AB055978.1, US 20030235893), ocHas3 (EMBL AB055979.1, US 20030235893); Pavian (Papio anubis) paHasl (EMBL AY463695.1); sapo(.Xenopus laevis) xlHasl (EMBL M22249.1, US 20030235893), xlHas2(DG42) (EMBL AF168465.1), xlHas3 (EMBL AY302252.1); homem (Homosapiens) hsHASI (EMBL D84424.1, US 20030235893), hsHAS2 (EMBLU54804.1, US 20030235893), hsHAS3 (EMBL AF232772.1, US 20030235893); camundongo (Mus musculus), mmHasl (EMBL D82964.1,US 20030235893), mmHAS2 (EMBL U52524.2, US 20030235893), mmHas3(EMBL U86408.2, US 20030235893); bovino (Bos taurus) btHas2 (EMBLAJ004951.1, US 20030235893); galinha (Gallus gallus) ggHas2 (EMBLAF106940.1, US 20030235893); rato (Rattus norvegicus) rnHas 1 (EMBL AB097568.1, Itano et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(18) 18679-18678), r-nHas2 (EMBL AF008201.1); rnHas 3 (NCBI NM_172319.1, Itano et al., 2004,J. Biol. Chem. 279(18) 18679-18678), cavalo (Equus caballus) ecHAS2(EMBL AY056582.1, Gl:23428486), porco (Sus scrofa) sscHAS2 (NCBINM 214053.1, Gl:47522921), sscHas 3 (EMBLAB159675), peixe-zebra (Da-nio rerio) brHasl (EMBL AY437407), brHas2 (EMBL AF190742.1) brHas3(EMBL AF190743.1); Pasteurella multocida pmHas (EMBL AF036004.2);Streptococcus pyogenes spHas (EMBL, L20853.1, L21187.1, US 6,455,304,US 20030235893); Streptococcus equis seHas (EMBL AF347022.1,AY173078.1), Streptoeoceus uberis suHasA (EMBL AJ242946.2, US 20030235893), Streptoeoceus equisimilis seqHas (EMBL AF023876.1, US20030235893); Sulfolobus solfatarieus ssHAS (US 20030235893), Sulfolo-bus tokodaii stHas (AP000988.1), Parameeium bursaria Chlorella Virus 1,cvHAS (EMBL U42580.3, PB42580, US 20030235893).

Pelo termo "UDP-glicose desidrogenase (UDP-GIc-DH)" (E.C.1.1.1.22) no contexto da presente invenção, deve ser entendida uma proteí-na, que sintetiza [UDP glicose (UDP-GLc), NAD+ de ácido UDP glicurônico(UDP-GLcA) e NADH]. Essa catálise segue, com isso, o seguinte esquemade reação:

UDP-GIc + 2 NAD+ -» UDP-GIcA + 2 NADH

O termo "atividade aumentada de uma proteína com a atividade(enzimática) de uma UDP-GIc-DH" no âmbito da presente invenção, significaum aumento da expressão de genes endógenos, que codificam proteínascom a atividade de uma UDP-GIc-DH e/ou um aumento da quantidade detranscritos que codificam proteínas com a atividade de uma UDP-GIc-DHnas células e/ou um aumento da atividade enzimática de proteínas com aatividade de uma UDP-GIc-DH nas células.

Um aumento da expressão pode ser determinado, por exemplo,pela medição da quantidade de transcritos, que codificam uma proteína coma atividade de uma UDP-GIc-DH, por exemplo, através da análise de Nor-thern-Blot ou RT-PCR. Nesse caso, um aumento significa preferentementeum aumento da quantidade de transcritos em comparação com células deplantas de tipo silvestre correspondentes não geneticamente modificadas ouplantas de tipo silvestre não geneticamente modificadas em pelo menos50%, especialmente em pelo menos 70%, preferentemente em pelo menos85% e de modo particularmente preferido, em pelo menos 100%. Um au-mento da quantidade de transcritos, que codificam uma proteína com a ativi-dade de uma UDP-GIc-DH significa também, que plantas ou células de plan-tas, que não apresentam quantidades comprováveis de transcritos, que codi-ficam uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH, após modificaçãogenética de acordo com a invenção, apresentam quantidades comprováveisde transcritos, que codificam uma proteína com a atividade de uma UDP-Glc-DH.

O aumento da quantidade de proteína com a atividade de umaUDP-GIc-DH, que tem como conseqüência uma atividade aumentada des-sas proteínas nas respectivas células de plantas, pode ser determinado, porexemplo, através de métodos imunológicos, tais como análise de Western-Blot, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ou RIA (Radio ImmuneAssay). Métodos para a produção de anticorpos, que reagem especificamen-te com uma determinada proteína, isto é, que se ligam especificamente àdita proteína, são conhecidos pelo técnico (vide, por exemplo: Lottspeich undZorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin,ISBN 3-8274-0041-4). A produção desses anticorpos é oferecida por algu-mas firmas (por exemplo, Eurogentec, Bélgica) como serviço de encomenda.Nesse caso, um aumento da quantidade de proteína significa preferente-mente um aumento da quantidade de proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH em comparação com células de plantas de tipo silvestre correspon-dentes não geneticamente modificadas ou de plantas de tipo silvestre nãogeneticamente modificadas em pelo menos 50%, especialmente em pelomenos 70%, preferentemente em pelo menos 85% e de modo particularmen-te preferido, em pelo menos 100%. Um aumento da quantidade de proteínacom a atividade de uma UDP-GIc-DH significa também, que plantas ou célu-las de plantas, que não apresentam uma quantidade comprovável de umaproteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH, após modificação genéticade acordo com a invenção, apresentam uma quantidade comprovável deuma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH.

O aumento da atividade de uma proteína com a atividade deuma UDP-GIc-DH em extratos vegetais pode ser descrito por métodos co-nhecidos pelo técnico, tal como, por exemplo, descrito na WO 00 11192. Ummétodo preferido para a determinação da quantidade de uma proteína com aatividade de uma UDP-GIc-DH é citado em métodos gerais, ponto 5.

Um aumento da quantidade de atividade (enzimática) de proteí-nas com a atividade de uma UDP-GIc-DH, significa preferentemente um au-mento da atividade dessas proteínas em pelo menos 50%, preferentementeem pelo menos 70%, de modo especialmente preferido em pelo menos 85%e de modo particularmente preferido, em pelo menos 100%, em comparaçãocom células de plantas de tipo silvestre correspondentes não geneticamentemodificadas ou plantas não geneticamente modificadas. Um aumento daquantidade de atividade (enzimática) de proteínas com a atividade de umaUDP-GIc-DH, significa também, que plantas ou células de plantas, que nãoapresentam uma quantidade comprovável de uma proteína com a atividadede uma UDP-GIc-DH, após modificação genética de acordo com a invenção,apresentam uma quantidade comprovável de uma proteína com a atividadede uma UDP-GIc-DH.

Pelo termo "genoma" no contexto da presente invenção, deveser entendida a totalidade do material hereditário presente em uma célulavegetal. O técnico sabe, que além do núcleo da célula, também outros com-partimentos (por exemplo, plastídeos, mitocôndrias) contêm material hereditário.

Pelo termo "molécula de ácido nucleico integrada de maneiraestável" no contexto da presente invenção, deve ser entendida a integraçãode uma molécula de ácido nucleico no genoma da planta. Uma molécula deácido nucleico integrada de maneira estável destaca-se pelo fato de ser mul-tiplicada na replicação do ponto de integração correspondente junto com asseqüências de ácido nucleico próprias do hospedeiro, que ladeiam o pontode integração, de maneira que o ponto de integração no segmento de DNAfilho replicado é envolvido pelas mesmas seqüências de ácido nucleico, co-mo no segmento mãe onde foi feita uma leitura, que serve como matriz paraa replicação.

Para a integração estável de moléculas de ácido nucleico emuma célula hospedeira vegetal, há um sem-número de técnicas à disposição.

Essas técnicas abrangem a transformação de células vegetais com T-DNAcom a utilização de Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizoge-nes como meio de transformação, a fusão de protoplastos, a injeção, a ele-troporação de DNA, a introdução do DNA por meio da preparação biolística,bem como outras possibilidades (sinopse em "Transgenic Plants", Leandroed., Humana Press 2004, ISBN 1-59259-827-7). A utilização da transforma-ção de células vegetais intermediada por agrobactérias foi intensamentepesquisada e suficientemente descrita na EP 120516; Hoekema1 IN: TheBinary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V. Alblasserdam(1985), capítulo V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sei. 4, 1-46 e por An et al.EMBO J. 4, (1985), 277-287. Para a transformação de batata, vide, por e-xemplo, Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8, (1989), 29-33), para a transformaçãode plantas de tomate, por exemplo, a US 5.565.347.

Foi descrita também a transformação de plantas monocotiledô-neas por meio de vetores à base de Agrobacterium (Chan et al., Plant Mol.Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271-282; Deng et al.Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11,(1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Conner undDomisse, Int. J. Plant Sei. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al., TransgenicRes. 2, (1993), 252-265). Um sistema alternativo para a transformação deplantas monocotiledôneas é a transformação por meio da preparação biolís-tica (Wan e Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil et al., Bi-o/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24, (1994),317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631), a trans-formação de protoplastos, a eletroporação de células parcialmente permea-bilizadas, a introdução de DNA por meio de fibras de vidro. Especialmente, atransformação de milho é várias vezes descrita na literatura (compare, porexemplo, W095/06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm et al.,Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, (1990),603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor.Appl. Genet. 80, (1990), 721-726. A transformação de outras gramas, talcomo, por exemplo, o milho perene (switchgrass, Panicum virgatum) tam-bém é descrito (Richards et al., 2001, Plant Cell Reporters 20, 48-54).

Já foi descrita, também, a transformação eficiente de outras es-pécies de cereais, por exemplo, para cereais (Wan e Lemaux, vide acima;Ritala et al., vide acima; Krens et al., Nature 296, (1982), 72-74 e para trigo(Nehra et al., Plant J 5, (1994), 285-297; Becker et al., 1994, Plant Journal 5,299-307). Todos os métodos acima são apropriados no âmbito da presenteinvenção.

Células de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção,oferecem, em relação ao estado da técnica, a vantagem, de que elas produ-zem maiores quantidades de hialuronano do que plantas, que apresentamapenas a atividade de uma hialuronano sintase. Isso possibilita a produçãode hialuronano com baixos custos, pois o isolamento de hialuronano a partirde plantas com teor de hialuronano mais elevado é menos dispendioso e decustos mais favoráveis. Além disso, são necessárias menores áreas de culti-vo, para produzir hialuronano com plantas geneticamente modificadas deacordo com a invenção em comparação com plantas descritas no estado datécnica. Isso leva à possibilidade, de pôr hialuronano à disposição em quan-tidade suficiente também para aplicações técnicas, nas quais, devido a pou-ca disponibilidade e ao alto preço, não são utilizadas atualmente. Organis-mos vegetais do gênero Chlorella, que estão infectados com um vírus, nãosão apropriados para a produção de maiores quantidades de hialuronano.

Para a produção de hialuronano, as algas infectadas com vírus apresentama desvantagem de não terem integrado os genes, que são necessários paraa hialuronano sintase de maneira estável em seu genoma (Van Etten e Me-ints, 1999, Annu. Rev. Microbiol. 53, 447-494), de maneira que para a pro-dução de hialuronano é preciso efetuar sempre de novo uma nova infecçãopor vírus. Por isso, não é possível, isolar células de Chlorella individuais, quesintetizam continuamente a qualidade e quantidade desejada de hialurona-no. Além disso, a produção de hialuronano em algas de Chlorella infectadascom vírus realiza-se apenas por um tempo limitado e as algas são mortasatravés da Iise provocada pelo vírus já cerca de 8 horas após a infecção(Van Etten et al„ 2002, Arch Virol 147, 1479-1516). Por outro lado, a presen-te invenção oferece a vantagem de que células de plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção e plantas geneticamente modificadasde acordo com a invenção podem ser multiplicadas vegetativa ou sexual-mente de maneira ilimitada e que elas produzem continuamente hialuronano.

As plantas transgênicas descritas na WO 05 012529, que apre-sentam uma molécula de ácido nucleico que codifica uma hialuronano sinta-se, sintetizam uma quantidade relativamente pequena de hialuronano. Poroutro lado, a presente invenção oferece a vantagem, de que células de plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção e plantas geneti-camente modificadas de acordo com a invenção, sintetizam quantidadesnitidamente maiores de hialuronano.

Por conseguinte, o objetivo da presente invenção são tambémcélulas de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, que sinteti-zam hialuronano.

Visto que foi observado que o hialuronano se acumula durante otempo de desenvolvimento no tecido vegetal, a quantidade de hialuronanoem relação ao peso fresco ou em relação ao peso seco em células de plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou em plantasgeneticamente modificadas de acordo com a invenção, deve ser determina-da de modo particularmente preferido no momento da colheita ou em menosdias (um a dois) antes da colheita das respectivas células de plantas ou dasrespectivas plantas. De modo especial, nesse caso, utiliza-se aquele materi-al de plantas (por exemplo, tubérculos, sementes, folhas) em relação àquantidade de hialuronano, que deve ser cultivado para o processamentoulterior.

Células de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção,que sintetizam hialuronano, podem ser comprovadas pelo fato de se isolar ohialuronano sintetizado por elas e se comprovar sua estrutura.

Visto que o tecido vegetal apresenta a vantagem de não conter25 hialuronidases, pode ser utilizado um método de isolamento simples e rápidopara comprovar a presença de hialuronano em células de plantas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção ou de plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção. Para isso, acrescenta-se água aotecido da planta a ser examinado, antes do tecido da planta ser mecanica-30 mente triturado (por exemplo, com o auxílio de um moinho de bolas, moinhode percussão, um Warring Blendor, um extrator de suco e outros). Em se-guida, conforme a necessidade, pode acrescentar-se mais água à suspen-são, antes que pedaços de células e componentes insolúveis em água se-jam separados através de centrifugação ou peneiração. A detecção da pre-sença de hialuronano pode ser efetuada, em seguida, no sobrenadante obti-do após a centrifugação, por exemplo, por meio de uma proteína que se ligade maneira específica ao hialuronano. Um processo para a detecção de hia-luronano com auxílio de uma proteína que se liga de maneira específica aohialuronano é descrito, por exemplo, na US 5.019.498. Kits de testes, para aexecução do método descrito na US 5.019.498, podem ser adquiridos nocomércio (por exemplo, o kit de teste de ácido hialurônico (HA) da firma Cor-genix, Inc., Colorado, EUA, Prod. n° 029-001; vide também os métodos ge-rais ponto 4). Paralelamente a isso, uma alíquota do sobrenadante obtido dacentrifugação pode ser inicialmente digerido com uma hialuronidase, antesde efetuar a detecção da presença de hialuronano com auxílio da proteínaque se liga de maneira específica ao hialuronano, tal como descrito acima.

Pela ação da hialuronidase na preparação paralela, o hialuronano presentena mesma é degradado, de maneira que após a completa digestão, não sãomais comprováveis quantidades significativas de hialuronano.

Além disso, a detecção da presença de hialuronano no sobrena-dante da centrifugação também pode ser efetuada com outros métodos deanálise, tais como, por exemplo, da espectroscopia de IV, RMN ou massa.

Tal como já foi exposto, atualmente não está claro, qual proces-so de metabolismo (processo de metabolismo de fosfato de hexose ou dem/o-inositol oxidativo) é utilizado em células vegetais, principalmente para asíntese do ácido UDP-glucurônico e se os dois processos de metabolismoprestam uma contribuição quantitativa distinta de acordo com o tecido e/ouestágio de desenvolvimento da planta em relação à síntese do ácido UDP-glucurônico. Além disso, a superexpressão de uma UDP-GIc-DH em plantastransgênicas não levou a resultados consistentes e o objetivo de aumentar oteor de pectina na parede celular por meio de uma tal preparação não pôdeser atingido. Adicionalmente, a regulação da atividade de proteínas com aatividade de uma UDP-GIc-DH está sujeita a uma inibição através da UDP-xilose. Essa foi demonstrada tanto para as respectivas proteínas, que sãoprocedentes de procariontes (Campbell et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(6),3416-3422; Schiller et al., 1973, Biochim. Biophys Acta 293(1), 1-10), de or-ganismos animais (Balduini et al., 1970, Biochem. J. 120(4), 719-724) e deplantas (Hinterberg, 2002, Plant Physiol. Biochem. 40, 1011-1017).

A literatura não contém nenhuma referência a respeito de quemodo a quantidade de hialuronano sintetizado em células de plantas poderiaser limitada.

Por conseguinte, verificou-se surpreendentemente, que célulasde plantas geneticamente modificadas ou plantas geneticamente modifica-das, que apresentam uma molécula de ácido nucleico, que codifica uma hia-luronano sintase e que, adicionalmente, apresentam uma atividade aumen-tada de uma UDP-GIc-DH em comparação com células de plantas genetica-mente modificadas ou plantas geneticamente modificadas, que apresentam(apenas) a atividade de uma hialuronano sintase, produzem quantidadessignificativamente maiores de hialuronano.

Em uma forma de concretização preferida, a presente invençãorefere-se a células de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou a plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção, caracterizadas pelo fato de que elas produzem uma quantidade aumen-tada de hialuronano em comparação com células de plantas geneticamentemodificadas ou em comparação com plantas geneticamente modificadas,que apresentam (apenas) a atividade de uma hialuronano sintase ou emcomparação com plantas geneticamente modificadas, que apresentam aatividade de uma hialuronano sintase e nenhuma atividade aumentada deuma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH.

Pelo termo "célula de planta ou planta, que apresenta (apenas) aatividade de uma hialuronano sintase" no contexto da presente invenção,deve ser entendida uma célula de planta geneticamente modificada ou umaplanta geneticamente modificada, na qual a modificação genética consisteem que ela apresenta uma molécula de ácido nucleico, que codifica umahialuronano sintase em comparação com células de plantas de tipo silvestrecorrespondentes não geneticamente modificadas ou plantas de tipo silvestrenão geneticamente modificadas.

As "células de plantas ou plantas, que apresentam (apenas) aatividade de uma hialuronano sintase" destacam-se especialmente pelo fatode sintetizarem hialuronano e não apresentarem modificações genéticas a-dicionais, que ultrapassam a introdução de uma molécula de ácido nucleico,que codifica uma hialuronano sintase, em células de plantas de tipo silvestrenão geneticamente modificadas ou em plantas de tipo silvestre não geneti-camente modificadas. Preferivelmente, tais plantas não apresentam umaatividade aumentada de uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH.

A quantidade de hialuronano, que é produzido por células deplantas ou plantas, pode ser determinada com auxílio dos métodos já descri-tos acima, por exemplo, com o emprego de um kit de teste que pode ser ad-quirido no comércio (por exemplo, o kit de teste de ácido hialurônico (HA) dafirma Corgenix1 Inc., Colorado, EUA, Prod. n° 029-001). Um método preferi-do no contexto da presente invenção para a determinação do teor de hialu-ronano em células de plantas ou plantas é descrito sob métodos gerais, ponto 4.

Em uma outra forma de concretização da presente invenção,trata-se no caso das células de plantas geneticamente modificadas de acor-do com a invenção ou de plantas geneticamente modificadas de acordo coma invenção, de células de plantas de uma planta terrestre verde ou de plan-tas terrestres verdes, que sintetizam hialuronano.

O termo "planta terrestre verde (embriófita)" no contexto da pre-sente invenção deve ser entendido de maneira tal como é definido em S-trasburger, ,,Lehrbuch der Botanik", 34. Aufl., Spektrum Akad. Verl., 1999,(ISBN 3-8274-0779-6).

Uma forma de concretização preferida da presente invenção re-fere-se às células de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção de plantas multicelulares ou de plantas geneticamente modificadasde acordo com a invenção, que representam organismos multicelulares. Nocaso dessa forma de concretização trata-se, portanto, de células de plantasou de plantas, que não são procedentes de plantas monocelulares (protistas)ou não são protistas.

No caso das células de plantas geneticamente modificadas deacordo com a invenção ou de plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção, pode tratar-se, em princípio, de células de plantas ou deplantas de qualquer espécie de planta desejada, isto é, tanto de plantas mo-nocotiledôneas, como também de dicotiledôneas. De maneira preferida, tra-ta-se de plantas úteis, isto é, de plantas, que são cultivadas pelo homempara fins de alimentar seres humanos e animais ou para a produção de bio-massa ou para a produção de substâncias para fins técnicos, industriais (porexemplo, milho, arroz, trigo, centeio, aveia, cevada, mandioca, batata, toma-te, milho perene (Panicum virgatum), sagu, feijão da China, ervilha, sorgo,cenoura, berinjela, rábano, colza, alfafa, soja, amendoim, pepino, abóbora,melão, alho-porró, alho, couve, espinafre, batata doce, aspargo, abobrinha,salada, alcachofra, milho doce, pastinaca, scorzonera, tupinambo, banana, beterraba doce, cana-de-açucar, beterraba, brócoli, couve, cebola, cenouraamarela, dente-de-leite, morango, maçã, damasco, ameixa, pêssego, uvas,couve-flor, aipo, pimentão, nabo, ruibarbo). De modo particularmente prefe-rido, trata-se de plantas de tomate ou batata.

Em uma forma de concretização preferida, a presente invençãorefere-se a células de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou a plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção, em que a molécula de ácido nucleico que codifica à hialuronano sintaseé caracterizada pelo fato de codificar uma hialuronano sintase viral. Prefe-rentemente, a molécula de ácido nucleico que codifica a hialuronano sintasecodifica uma hialuronano sintase de um vírus, que infecta algas. Com rela-ção a um vírus, que infecta algas, a molécula de ácido nucleico que codificaa hialuronano sintase codifica preferencialmente uma hialuronano sintase deum vírus que infecta Chlorella, de modo particularmente preferido uma hialu-ronano sintase de um Paramecium bursaria Chlorella Virus 1 e de modo es-pecialmente preferido, uma hialuronano sintase de um Paramecium bursariaChlorella Virus de uma cepa H1.

Em uma outra forma de concretização preferida, a presente in-venção refere-se a células de plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção ou a plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção, em que a molécula de ácido nucleico que codifica a hialuronanosintase é caracterizada pelo fato de que os códons da molécula de ácidonucleico que codifica uma hialuronano sintase são modificados, em compa-ração com os códons da molécula de ácido nucleico, que codifica a hialuro-nano sintase do organismo original da hialuronano sintase. De modo particu-larmente preferido, os códons da hialuronano sintase são modificados demaneira tal, que eles são ajustados à freqüência da utilização dos códons dacélula de planta ou da planta, em cujo genoma eles são ou serão integrados.

Aminoácidos podem ser codificados, com base na degeneraçãodo código genético, por um ou mais códons. Diferentes organismos utilizamos códons que codificam um aminoácido com diferente freqüência. O ajustedos códons a uma seqüência de ácido nucleico codificadora à freqüência desua utilização na célula de planta ou na planta, em cujo genoma a seqüênciaa ser exprimida deve ser integrada, pode contribuir para uma quantidadeaumentada de proteína transladada e/ou para a estabilidade do respectivomRNA nas respectivas células de plantas ou plantas. O técnico pode deter-minar a freqüência da utilização de códons nas respectivas células de plan-tas ou nas plantas, em que ele pesquisa tantas seqüências de ácido nucleicocodificadoras quanto possível do respectivo organismo de maneira tal comocódons freqüentemente determinados são utilizados para a codificação deum determinado aminoácido. A freqüência da utilização de códons de de-terminados organismos é comum para o técnico pode ser efetuada de ma-neira simples e rápida com auxílio de programas de computador. Programasde computador correspondentes são publicamente acessíveis e entre outros,são livremente disponibilizados na internet (por exemplo,

http://gcua.schoedl.de/; http://www.kazusa.or.ip/codon/; http://www.entelechon.com/enq/cutanalvsis.html.

O ajuste dos códons a uma seqüência de ácido nucleico codificadora à fre-quência de sua utilização na célula de planta ou na planta, em cujo genomadeve ser integrada a seqüência a ser exprimida, pode ser efetuada por mu-tagênese in vitro ou preferentemente por nova síntese da seqüência genéti-ca. Métodos para a nova síntese de seqüências de ácido nucleico são co-nhecidos pelo técnico. Uma nova síntese pode ser efetuada, por exemplo,pelo fato de que inicialmente oligonucleotídeos de ácido nucleico individuaissão sintetizados, esses são hibridizados com oligonucleotídeos complemen-tares a esses, de maneira que eles formem um segmento duplo de DNA,antes que os oligonucleotídeos de segmentos duplos individuais sejam liga-dos uns com os outros de maneira tal que se obtém a seqüência de ácidonucleico desejada. A nova síntese de seqüências de ácido nucleico inclusiveo ajuste da freqüência de utilização dos códons a um determinado organis-mo alvo, também pode ser cedida como encomenda a empresas, que ofere-cem essa como prestação de serviço (por exemplo, Entelechon GmbH, Re-gensburg, Alemanha).

Preferentemente1 a molécula de ácido nucleico que codifica hia-Iuronano sintase é caracterizada pelo fato de codificar uma hialuronano sin-tase, cuja seqüência de aminoácidos com a seqüência de aminoácidos re-presentada sob SEQ ID n° 2 apresenta uma identidade de pelo menos 70%,preferentemente de pelo menos 80%, preferentemente de pelo menos 90%e de modo especialmente preferido, de pelo menos 95%. Em uma forma deconcretização particularmente preferida, a molécula de ácido nucleico quecodifica a hialuronano sintase é caracterizada pelo fato de codificar uma hia-luronano sintase, que apresenta a seqüência de aminoácidos representadasob SEQ ID n° 2.

Em uma outra forma de concretização, a molécula de ácido nu-cleico, que codifica uma hialuronano sintase com a seqüência de ácido nu-cleico representada sob SEQ ID n° 1 ou SEQ ID n° 3, apresenta uma identi-dade de pelo menos 70%, preferentemente de pelo menos 80%, preferen-temente de pelo menos 90% e de modo especialmente preferido de pelomenos 95%. Em uma forma de concretização particularmente preferida, aseqüência de ácido nucleico que codifica a hialuronano sintase é caracteri-zada pelo fato de apresentar a seqüência de ácido nucleico representadasob SEQ ID n° 3.

O plasmídeo IC 341-222, contendo uma molécula de ácido nu-cleico sintética, que codifica uma hialuronano sintase do vírus Parameciumbursaria Chlorella, foi apresentado no dia 25 de agosto de 2004 sob o núme-ro DSM 16664 de acordo com o Contrato de Budapest na Deutschen Sam-mlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, MascheroderWeg 1b,38124 Braunschweig, Alemanha. A seqüência de aminoácidos representadana SEQ ID n° 2 pode ser derivada na região codificadora da seqüência deácido nucleico integrada no plasmídeo IC 341-222 e codifica uma hialurona-no sintase do vírus Paramecium bursaria Chlorella.

Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a célu-las de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou aplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, em que amolécula de ácido nucleico que codifica a hialuronano sintase é caracteriza-da pelo fato de codificar uma proteína, cuja seqüência de aminoácidos podeser derivada da região codificadora da seqüência de ácido nucleico inseridano plasmídeo DSM 16664 ou que ela codifica uma proteína, cuja seqüênciade aminoácidos com a seqüência de aminoácidos, que pode ser derivada daregião codificadora da seqüência de ácido nucleico inserida no plasmídeoDSM 16664, apresenta uma identidade de pelo menos 70%, preferentemen-te de pelo menos 80%, preferentemente de pelo menos 90% e de modo es-pecialmente preferido de pelo menos 95%.

A presente invenção refere-se também a células de plantas ge-neticamente modificadas de acordo com a invenção ou a plantas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção, em que a molécula de ácidonucleico que codifica a hialuronano sintase é caracterizada pelo fato de re-presentar a seqüência de ácido nucleico que codifica a hialuronano sintase,integrada no plasmídeo DSM 16664 ou de apresentar com a seqüência deácido nucleico integrada no plasmídeo DSM 16664, uma identidade de pelomenos 70%, preferentemente de pelo menos 80%, preferentemente de pelomenos 90% e de modo especialmente preferido de pelo menos 95%.

Um outro objetivo da presente invenção refere-se a células deplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou a plantasgeneticamente modificadas de acordo com a invenção, caracterizadas pelofato de apresentarem uma molécula de ácido nucleico estranha integrada demaneira estável em seu genoma, em que a dita molécula de ácido nucleicoestranha leva ao aumento da atividade de uma proteína com a atividade deuma UDP-GIc-DH, em comparação com células de plantas de tipo silvestre correspondentes não geneticamente modificadas ou com plantas de tipo sil-vestre correspondentes não geneticamente modificadas.

Pelo termo "molécula de ácido nucleico estranha" no contexto dapresente invenção, entende-se uma tal molécula, que ou não ocorre natu-ralmente nas células de plantas de tipo silvestre correspondentes, ou que na disposição espacial concreta não ocorre naturalmente em células de plantasde tipo silvestre ou que está localizada em um ponto no genoma da célula deplanta de tipo silvestre, no qual ela não ocorre naturalmente. De modo prefe-rido, a molécula de ácido nucleico estranha é uma molécula recombinante,que se constitui de diversos elementos, cuja combinação ou disposição es-pacial específica não ocorre naturalmente em células vegetais.

Pelo temo "molécula de ácido nucleico recombinante" no contex-to da presente invenção, deve ser entendida uma molécula de ácido nuclei-co, que apresenta diferentes moléculas de ácido nucleico, que não estãonaturalmente presentes em uma combinação, tal como estão presentes em uma molécula de ácido nucleico recombinante. Dessa maneira, as moléculasde ácido nucleico recombinantes, por exemplo, além de moléculas de ácidonucleico, que codificam uma hialuronano sintase e/ou uma proteína com aatividade de uma UDP-GIc-DH, podem apresentar seqüências de ácido nu-cleico adicionais, que não estão naturalmente presentes em combinação com as moléculas de ácido nucleico mencionadas. As seqüências de ácidonucleico adicionais mencionadas, que estão presentes em uma molécula deácido nucleico recombinante em combinação com uma hialuronano sintaseou com uma proteína com a atividade de uma molécula de ácido nucleicoque codifica UDP-GIc-DH, nesse caso, seqüências desejadas. Elas podemrepresentar, por exemplo, seqüências de ácido nucleico genômicas e/ou ve-getais. No caso das seqüências de ácido nucleico adicionais, trata-se prefe-rentemente de seqüências reguladoras (promotores, sinais de terminação,aumentadores), de modo particularmente preferido, de seqüências regulado-ras, que são ativas no tecido vegetal, de modo especialmente preferido, deseqüências reguladoras específicas de tecidos que são ativas no tecido ve-getal. Métodos para a produção de moléculas de ácido nucleico recombinan-5 tes são conhecidos pelo técnico e abrangem métodos genéticos, tais como,por exemplo, a ligação de moléculas de ácido nucleico através de ligação,recombinação genética ou a nova síntese de moléculas de ácido nucleico(vide por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,3a edição (2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Har-10 bour, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons; 5th edition ( 2002),ISBN: 0471250929).

Células de plantas geneticamente modificadas e plantas geneti-camente modificadas, que apresentam uma molécula de ácido nucleico es-tranha integrada de maneira estável em seu genoma ou várias moléculas de15 ácido nucleico estranhas integradas de maneira estável em seu genoma,que codificam uma hialuronano sintase e que leva/levam ao aumento da ati-vidade de uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH, em compara-ção com células de plantas de tipo silvestre correspondentes não genetica-mente modificadas ou plantas de tipo silvestre não geneticamente modifica-20 das, podem ser diferenciadas das células de plantas de tipo silvestre men-cionadas ou das plantas de tipo silvestre mencionadas, entre outros, pelofato de conterem uma molécula de ácido nucleico estranha, que não ocorrenaturalmente nas células de plantas de tipo silvestre ou nas plantas de tiposilvestre ou pelo fato de que uma tal molécula se apresenta integrada em um25 ponto no genoma da célula da planta geneticamente modificada de acordocom a invenção ou no genoma da planta geneticamente modificada de acor-do com a invenção, no qual não ocorre nas células de plantas de tipo silves-tre ou nas plantas de tipo silvestre, isto é, em um outro meio genômico. Alémdisso, tais células de plantas geneticamente modificadas de acordo com a30 invenção e plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção,podem ser diferenciadas das células de plantas de tipo silvestre não geneti-camente modificadas ou das plantas de tipo silvestre não geneticamentemodificadas pelo fato de conterem pelo menos uma cópia da molécula deácido nucleico estranha integrada de maneira estável em seu genoma, even-tualmente, adicionalmente, às cópias de uma tal molécula que ocorrem natu-ralmente nas células de plantas de tipo silvestre ou plantas de tipo silvestre.

Se no caso da(s) molécula(s) de ácido nucleico estranha introduzida nascélulas de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção oua plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, tratar-se decópias adicionais para moléculas que já ocorrem naturalmente nas célulasde plantas de tipo silvestre ou de plantas de tipo silvestre, então as célulasde plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção e as plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, podem diferenci-ar-se de células de plantas de tipo silvestre ou de plantas de tipo silvestreespecialmente pelo fato de que a(s) cópia(s) adicional(adicionais) es-tá(estão) localizada(s) em pontos no genoma, nos quais não ocorre(m) nas15 células de plantas de tipo silvestre ou de plantas de tipo silvestre.

A integração estável de uma molécula de ácido nucleico no ge-noma de uma célula de planta ou de uma planta pode ser comprovada atra-vés de métodos genéticos e/ou de biologia molecular. Uma integração está-vel de uma molécula de ácido nucleico no genoma de uma célula de planta20 ou no genoma de uma planta destaca-se pelo fato de que a molécula de áci-do nucleico integrada de modo estável na descendência, que herdaria a mo-lécula de ácido nucleico mencionada, está presente no mesmo meio genô-mico como na geração dos pais.

A presença de uma integração estável de uma seqüência de25 ácido nucleico no genoma de uma célula de planta no genoma de uma plan-ta pode ser comprovada através de métodos conhecidos pelo técnico, entreoutros, com auxílio da análise de Southern-Blot da análise RFLP (RestrictionFragment Lenght Polymorphism) (Nam et al., 1989, The Plant Cell 1, 699-705; Leister and Dean, 1993, The Plant Journal 4 (4), 745-750), através de30 métodos à base de PCR, tais como, por exemplo, a análise do fragmentoamplificado de diferenças de comprimento (Amplified Fragment LengthPolymorphism, AFLP) (Castiglioni et al., 1998, Genetics 149, 2039-2056;Meksem et al., 2001, Molecular Genetics and Genomics 265, 207-214; Me-yer et al., 1998, Molecular and General Genetics 259, 150-160) ou atravésda utilização de fragmentos amplificados cortados com endonucleases derestrição (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences, CAPS) (Konieczny eAusubel, 1993, The Plant Journal 4, 403-410; Jarvis et al., 1994, Plant Mole-cular Biology 24, 685-687; Bachem et al., 1996, The Plant Journal 9 (5), 745-753).

Em princípio, uma molécula de ácido nucleico estranha pode serqualquer molécula de ácido nucleico desejada, que provoca um aumento daatividade de uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH na célula daplanta ou na planta.

No contexto da presente invenção, células de plantas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção e plantas geneticamente mo-dificads de acordo com a invenção, também podem ser produzidas atravésda utilização da chamada mutagênese de inserção (artigo sinóptico: Thor-neycroft et al., 2001, Journal of experimental Botany 52 (361), 1593-1601).Por mutagênese de inserção no contexo com a presente invenção, entende-se especialmente a inserção de transposons ou o chamado transfer DNA detransferência (T-DNA) para um gene ou para a proximidade de um gene, quecodifica uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH, sendo que comisso, a atividade de uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH narespectiva célula aumenta.

No caso dos transposons pode tratar-se tanto daqueles, que o-correm naturalmente na célula (transposons endógenos), como também da-queles que não ocorrem naturalmente na célula mencionada, mas sim, fo-ram introduzidos na célula por meio de métodos genéticos, tais como, porexemplo, transformação da célula (transposons heterólogos). A modificaçãoda expressão de genes por meio de transposon é conhecida pelo técnico.Uma sinopse sobre a utilização de transposons endógenos e heterólogoscomo ferramenta na biotecnologia de plantas é apresentada em Ramachan-dran e Sundaresan (2001, Plant Physiology and Biochemistry 39, 234-252).

A mutagênese de inserção de T-DNA baseia-se no fato de quedeterminados segmentos (T-DNA) de plasmídeos Ti de Agrobacterium po-dem ser integrados no genoma de células vegetais. Nesse caso, o local daintegração no cromossoma vegetal não é determinado, mas sim pode serefetuado em qualquer local desejado. Caso o T-DNA entegre-se em um seg-mento ou na proximidade de um segmento do cromossomo que representauma função de gene, então esse pode levar ao aumento da expressão dogene e com isso, também à modificação da atividade de uma proteína quecodifica o respectivo gene.

As seqüências inseridas no genoma (especialmente transposonsou T-DNA) destacam-se, nesse caso, pelo fato de conterem seqüências, quelevam a uma ativação das seqüências reguladoras de um gene, que codificauma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH ativação marcada. Prefe-rentemente, as seqüências inseridas no genoma (especialmente transpo-sons ou T-DNA) destacam-se pelo fato de serem integradas na proximidadede moléculas de ácido nucleico endógenas no genoma da célula de plantaou da planta, que codificam uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH.

Células de plantas geneticamente modificadas e plantas geneti-camente modificadas de acordo com a invenção podem ser produzidas, porexemplo, com auxílio do método do chamado "ativação marcada" (vide, porexemplo, Walden et al„ Plant J. (1991), 281-288; Walden et al„ Plant Mol.Biol. 26 (1994), 1521-1528). Este método baseia-se na ativação de promoto-res endógenos através de seqüências "aumentadoras", tais como, por e-xemplo, do aumentador do promotor RNA 35S do vírus mosaico da couve-25 flor ou do aumentador da octopina sintase.

Pelo termo ativação marcada por T-DNA no contexto da presen-te invenção, deve ser entendido um fragmento de T-DNA, que contém se-qüências acentuadoras e através de integração no genoma de uma célula deplanta leva ao aumento da atividade de uma proteína com a atividade de30 uma UDP-GIc-DH.

Pelo termo ativação marcada por transposons no contexto dapresente invenção, deve ser entendido um transposon, que contém sequên-cias acentuadoras e através de integração no genoma de uma célula deplanta leva ao aumento da atividade de uma proteína com a atividade deuma UDP-GIc-DH.

Uma forma de concretização particularmente preferida da pre- sente invenção refere-se a células de plantas geneticamente modificadas deacordo com a invenção ou a plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção, caracterizadas pelo fato de que uma molécula de ácido nu-cleico estranha codifica uma proteína com a atividade enzimática de umaUDP-GIc-DH.

De acordo com a invenção, a molécula de ácido nucleico estra-nha que codifica uma proteína com a atividade enzimática de uma UDP-GIc-DH pode ser proveniente de um organismo desejado, a molécula de ácidonucleico mencionada é preferentemente proveniente de bactérias, fungos,animais, plantas ou vírus, de modo particularmente preferido, de bactérias,plantas ou vírus, de modo especialmente preferido, de vírus.

Em relação aos vírus, a molécula de ácido nucleico estranha quecodifica uma proteína com a atividade enzimática de uma UDP-GIc-DH podeser preferentemente proveniente de um vírus, que infecta algas, preferente-mente de um vírus, que infecta algas do gênero Chlorella, de modo particu-larmente preferido de um vírus Paramecium bursaria Chlorella e de modoespecialmente preferido de um vírus Paramecium bursaria Chlorella de umacepa H1.

Ao invés de uma molécula de ácido nucleico de origem natural,que codifica uma proteína com a atividade enzimática de uma UDP-GIc-DH,uma molécula de ácido nucleico produzida por meio de mutagênese tambémpode ser introduzida em células de plantas geneticamente modificadas deacordo com a invenção ou a plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção, em que a molécula de ácido nucleico estranha que sofreuuma mutagênese mencionada destaca-se pelo fato de codificar uma proteí-na com a atividade enzimática de uma UDP-GIc-DH, que apresenta umainibição reduzida através dos metabólitos do metabolismo (por exemplo, ometabolismo do ácido glucurônico).Moléculas de ácido nucleico, que codificam uma proteína com aatividade de uma UDP-GIc-DH, são descritas na literatura e conhecidas pelotécnico. Dessa maneira, as moléculas de ácido nucleico, que codificam umaproteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH, são descritas de vírus, porexemplo, para o vírus Chlorella 1 (NCBI acc No NC_000852.3), de bacérias,por exemplo, para Escherichia coli (EMBL acc No: AF176356.1), de fungos,por exemplo, para Aspergillus niger (EMBL acc No AY594332.1), Cryptococ-cus neoformans (EMBL acc AF405548.1), de insetos, por exemplo, paraDrosophila melanogaster (EMBL acc No AF001310.1), de vertebrados, porexemplo, para Homo sapiens (EMBL acc No AF061016.1), Mus musculus(EMBL acc No AF061017.1), Bos taurus (EMBL acc No AF095792.1), Xeno-pus Iaevis (EMBL acc No AY762616.1) ou de plantas, por exemplo, paraPappel (EMBL acc No AF053973.1), Colocasia esculenta (EMBL acc NoAY222335.1), Dunaliella salina (EMBL acc No AY795899.1), Glyeine max(EMBL acc No U53418.1).

Em uma forma de concretização preferida, a presente invençãorefere-se a células de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou a plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção, em que a molécula de ácido nucleico estranha, que codifica uma prote-ína com a atividade de uma UDP-GIc-DH, é selecioanda do grupo constandoem:

a) moléculas de ácido nucleico, que codificam uma proteína coma seqüência de aminoácidos indicada sob SEQ ID n° 5.

b) moléculas de ácido nucleico, que codificam uma proteína, cu-ja seqüência apresenta uma identidade de pelo menos 60% em relação àseqüência de aminoácidos indicada sob SEQ ID n° 5;

c) moléculas de ácido nucleico, que abrangem a seqüência deácido nucleico representada sob SEQ ID n° 4 ou a seqüência de ácido nucle-ico representada sob SEQ ID n° 6 ou uma seqüência complementar,

d) moléculas de ácido nucleico, que em relação às seqüênciasde ácido nucleico descritas em a) ou c), apresentam uma identidade de pelomenos 70%;e) moléculas de ácido nucleico, que hibridizam com pelo menosum segmento das moléculas de ácido nucleico descritas em a) ou c), sobcondições estringentes;

f) moléculas de ácido nucleico, cuja seqüência de nucleotídeos,com base na degeneração do código genético, desvia da seqüência das mo-léculas de ácido nucleico mencionadas em a) ou c); e

g) moléculas de ácido nucleico, que representam fragmentos,variantes alélicas e/ou derivados das moléculas de ácido nucleico mencio-nadas em a), b), c), d), e) ou f).

O termo "hibridização" no âmbito da presente invenção, significauma hibridização com condições de hibridização convencionais, preferente-mente com condições estringentes, tais como são descritas, por exemplo,em Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). De modoparticularmente preferido, "hibridização" significa uma hibridização com asseguintes condições:Tampão de Hibridização:

2xSSC; solução IOxDenhardt (Fikoll 400+PEG+BSA; proporção1:1:1); 0,1% de SDS1 EDTA a 5 mM, Na2HP04 a 50 mM; 250 pg/ml de es-perma de arenque DNA; 50 pg/ml de tRNA; ou tampão de fosfato de sódio aM pH 7,2; EDTA a 1 mM; 7% de SDSTemperatura de Hibridização:

T=65 até 68°CTampão de Lavagem: 0,1xSSC; 0,1% de SDSTemperatura de Lavagem: T=65 até 68°C.

Moléculas de ácido nucleico, que hibridizam com moléculas deácido nucleico, que codificam uma proteína com a atividade de uma UDP-Glc-DH, podem ser provenientes de um organismo desejado, por conseguin-te, elas podem ser provenientes de bactérias, fungos, animais, plantas ouelas podem ser provenientes de vírus.

Moléculas de ácido nucleico, que hibridizam com moléculas deácido nucleico, que codificam uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH1 são preferentemente provenientes de um vírus, que infecta algas,preferentemente de um vírus, que infecta algas do gênero Chlorella, de mo-do particularmente preferido, de um vírus Paramecium bursaria Chlorella ede modo especialmente preferido, de um vírus Paramecium bursaria Chlorel-Ia de uma cepa H1.

Moléculas de ácido nucleico, que hibridizam com as moléculasde ácido nucleico mencionadas, podem ser isoladas, por exemplo, de biblio-tecas genômicas ou de cDNA. Nesse caso, a identificação e isolamento detais moléculas de ácido nucleico, pode ser efetuada com a utilização dasmoléculas de ácido nucleico mencionadas ou de partes dessas moléculas oude complementos reversos dessas moléculas, por exemplo, por meio de hi-bridização por processos padronizados (vide, por exemplo, Sambrook et al.,1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição. Cold Spring Har-bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou através de amplificaçãopor meio de PCR.

Como amostra de hibridização para o isolamento de uma se-qüência de ácido nucleico, que codifica uma proteína com a atividade deuma UDP-GIc-DH, podem ser utilizadas, por exemplo, moléculas de ácidonucleico, que apresentam exatamente a ou essencialmente a seqüência denucleotídios mencionada sob a SEQ ID n° 4 ou a SEQ ID n° 6 ou partes des-sas seqüências.

No caso dos fragmentos utilizados como amostra de hibridiza-ção, pode tratar-se também de fragmentos sintéticos ou de oligonucleotí-deos, que foram produzidos com auxílio das técnicas de síntese usuais ecuja seqüência está essencialmente de acordo com a de uma molécula deácido nucleico descrita no âmbito da presente invenção. Caso tenham sidoidentificados e isolados genes, que hibridizam com as seqüências de ácidonucleico descritas no âmbito da presente invenção, deveria ser efetuadauma determinação da seqüência e uma análise das características das pro-teínas codificadas por essa seqüência, para determinar, se se trata de prote-ínas, que apresentam a aatividade de uma UDP-GIc-DH. Métodos, tal comopode ser determinado se uma proteína apresenta a atividade de uma proteí-na com a atividade de uma UDP-GIc-DH, são conhecidos pelo técnico e su-ficientemente descritos na literatura (por exemplo, De Luca et al., 1976, Tis-sue Research 4, 247-254; Bar-Peled et al., 2004, Biochem. J. 381, 131-136;Turner und Botha, 2002, Archives Biochem. Biophys. 407, 209-216).

As moléculas que hibridizam as moléculas de ácido nucleicodescritas no âmbito da presente invenção, abrangem especialmente frag-mentos, derivados e variantes alélicas das moléculas de ácido nucleicomencionadas. O termo "derivado" no âmbito da presente invenção, significaque as seqüências dessas moléculas se diferenciam das seqüências dasmoléculas de ácido nucleico descritas acima em uma ou mais posições eapresentam um alto grau de identidade para essas seqüências. Nesse caso,os desvios para as moléculas de ácido nucleico descritas acima podem seroriginadas, por exemplo, por deleção, adição, substituição, inserção ou re-combinação.

O termo "identidade" no contexto da presente invenção, signifcauma identidade de seqüência sobre todo o comprimento da região codifica-dora de uma molécula de ácido nucleico ou todo o comprimento de uma se-qüência de aminoácidos, que codifica uma proteína, de pelo menos 60%,especialmente uma identidade de pelo menos 70%, preferentemente de pelomenos 80%, de modo particularmente preferido, de pelo menos 90% e demodo especialmente preferido, de pelo menos 95%. Pelo termo "identidade"no contexto da presente invenção, significa o número dos aminoáci-dos/nucleotídeos (identidade) que estão de acordo com outras proteí-nas/ácidos nucleicos, expresso em por cento. Preferentemente, a identidadeem relação a uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH é determi-nada através de comparações da seqüência de aminoácidos indicada sob aSEQ ID n° 5 ou a identidade em relação a uma molécula de ácido nucleicoque codifica uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH, através decomparações das seqüências de ácido nucleico indicadas sob a SEQ ID n° 4ou SEQ ID n° 6, para outras proteínas/ácidos nucleicos com auxílio de pro-gramas de computador. Caso as seqüências, que foram comparadas umascom as outras, apresentem diferentes comprimentos, a identidade deve serdeterminada de maneira tal que o número de aminoácidos, os quais têm emcomum a seqüência mais curta junto com a seqüência mais longa, determinea fração percentual da identidade. Preferivelmente, a identidade é determi-nada por meio do programa de computador conhecido e disponibilizado pu-blicamente CIustaIW (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994),4673-4680). CIustaIW é disponibilizado publicamente pela Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) e Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberq.DE), European Molecular Biology Laboratory1 Meyerhofstrasse 1,D 69117 Heidelberg1 Alemanha). CIustaW também pode ser baixado de di-versas páginas de internet, entre outras, no IGBMC (Institut de Génétique etde Biologie Moléculaire et Cellulaire1 B.P. 163, 67404 Illkirch Cedex, França;ftp://ftp-iqbmc.u-strasbq.fr/pub/) e no EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/),bem como em todas as páginas de internet refletidas do EBI (European Bio-informatics Institute1 Wellcome Trust Genome Campus1 Hinxton1 CambridgeCB10 1SD, Reino Unido). Preferivelmente, utiliza-se o programa de compu-tador CIustaIW da versão 1.8, para determinar a identidade entre as proteí-nas descritas no âmbito da presente invenção e outras proteínas. Nesse ca-so, devem ser ajustados os seguintes parâmetros: KTUPLE=I, T0PDIAG=5,WIND0W=5, PAIRGAP=3, GAP0PEN=10, GAPEXTEND=0.05, GAP-DIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP,NOHGAP. Preferivelmente, utiliza-se o programa de computador CIustaIWda versão 1.8, para determinar a identidade entre, por exemplo, a seqüênciade nucleotídeos das moléculas de ácido nucleico descritas no âmbito dapresente invenção e a seqüência de nucleotídeos de outras moléculas deácido nucleotídeos. Nesse caso, devem ser ajustados os seguintes parâme-tros:

KTUPLE=2, T0PDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAP0PEN=10,GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: unweighted.

Além disso, identidade significa que há equivalência funcionale/ou estrutural entre as respectivas moléculas de ácido nucleico ou entre asproteínas codificadas por elas. No caso das moléculas de ácido nucleico,que são homólogas às moléculas descritas acima e representam derivadosdessas moléculas, trata-se, via de regra, de variações dessas moléculas,que representam modificações, que exercem a mesma função biológica.Nesse caso, pode tratar-se tanto de variações que ocorrem naturalmente,por exemplo, de seqüências de outras espécies ou de mutações, sendo queessas mutações podem ter ocorrido de maneira natural ou introduzidas pormutagênese visada. Além disso, no caso das variações pode tratar-se deseqüências produzidas sinteticamente. No caso das variantes alélicas, podetratar-se tanto de variantes que ocorrem naturalmente, como também devariantes produzidas sinteticamente ou produzidas por técnicas de DNA re-combinantes. As moléculas de ácido nucleico representam, por exemplo,uma forma especial de derivados que, com base na degeneração do códigogenético, desviam de moléculas de ácido nucleico descritas no âmbito dapresente invenção.

As moléculas de ácido nucleico dos diversos derivados de molé-15 cuias de ácido nucleico, que codificam uma proteína com a atividade de umaUDP-GIc-DH, apresentam certas características comuns. Nestas podem serincluídas, por exemplo, atividade biológica, especificidade do substrato, pesomolecular, reatividade imunológica, conformação e outras, bem como carac-terísticas físicas, tais como, por exemplo, comportamento do curso em ele-20 troforeses de gel, comportamento cromatográfico, coeficientes de sedimen-tação, solubilidade, características espectroscópicas, estabilidade, ótimo pH,ótima temperatura e assim por diante. Características preferidas de proteí-nas com a atividade de uma UDP-GIc-DH são conhecidas pelo técnico, jáforam discutidas acima e devem ser aplicadas aqui correspondentemente.25 Em uma outra forma de concretização preferida, a presente in-

venção refere-se a células de plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção ou a plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção, em que as moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteí-na com a atividade enzimática de uma UDP-GIc-DH são caracterizadas pelo30 fato de que os códons das moléculas de ácido nucleico mencionadas sãomodificadas, em comparação com os códons da atividade enzimática deuma UDP-GIc-DH das moléculas de ácido nucleico, as quais codificam aproteína mencionada com a atividade enzimática de uma UDP-GIc-DH deum organismo original. Particularmente, preferem-se os códons das molécu-las de ácido nucleico que codificam uma proteína com a atividade enzimáticade uma UDP-GIc-DH de maneira tal que elas são ajustadas à freqüência dautilização dos códons da célula de plantas ou da planta, em cujo genomaeles são ou serão integrados.

Um outro objetivo da presente invenção refere-se a células deplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou a plantasgeneticamente modificadas de acordo com a invenção, caracterizadas pelofato de que as moléculas de ácido nucleico estranhas integradas de maneiraestável no genoma da célula de planta ou da planta, que codificam uma hia-Iuronano sintase e/ou que codificam uma proteína com a atividade enzimáti-ca de uma UDP-GIc-DH, são ligadas com elementos reguladores, que inici-am a transcrição em células de plantas (promotores). Pode tratar-se de pro-motores homólogos ou heterólogos. No caso dos promotores, pode tratar-sede promotores constitutivos, específicos de tecidos, específicos de desen-volvimento ou de promotores regulados por influências externas (por exem-plo, após a aplicação de substâncias químicas, pela ação de fatores abióti-cos, tais como calor e/ou frio, seca, aparecimento de doença e outros). Nes-se caso, as moléculas de ácido nucleico, que codificam uma hialuronanosintase ou uma proteína com a atividade enzimática de uma UDP-GIc-DH,que são integradas no genoma de uma célula de planta geneticamente mo-dificada de acordo com a invenção ou planta geneticamente modificada deacordo com a invenção, podem estar ligadas em cada caso com o mesmopromotor, ou diversos promotores podem estar ligados com uma seqüênciaindividual.

Uma forma de concretização preferida da presente invenção,refere-se a células de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou a plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção, em que pelo menos uma molécula de ácido nucleico estranha, de modoparticularmente preferido, pelo menos duas moléculas de ácido nucleico es-tranhas, selecionadas do grupo de moléculas de ácido nucleico, que codifi-cam uma hialuronano sintase ou uma proteína com a atividade enzimáticade uma UDP-GIc-DH, está(estão) ligada(s) com um promotor específico detecidos. Promotores específicos de tecidos preferidos representam promoto-res, que iniciam a iniciação da transcrição especificamente em células vege-tais de tubérculos, folhas, frutos ou sementes.

Para a expressão de moléculas de ácido nucleico, que codificamuma hialuronano sintase ou uma proteína com a atividade enzimática deuma UDP-GIc-DH, essas são preferentemente ligadas com seqüências deDNA reguladoras, que asseguram a transcrição nas células vegetais. Paraisso, incluem-se especialmente promotores. Em geral, toma-se em conside-ração para a expressão, todo o promotor ativo em células vegetais. Nessecaso, o promotor pode ser selecionado de maneira tal que a expressão sejaefetuada constitutivamente ou apenas em um determinado tecido, em umdeterminado momento do desenvolvimento da planta ou em um momentodeterminado pelas influências externas. Tanto em relação à planta, comotambém em relação à molécula de ácido nucleico a ser exprimida, o promo-tor pode ser homólogo ou heterólogo.

Promotores apropriados são, por exemplo, o promotor do vírusmosaico 35S RNA da couve-flor ou promotor ubiquitina do milho ou do Ces-trum YLCV (Yellow Leaf Curling Virus; WO 01 73087; Stavolone et al., 2003,Plant Mol. Biol. 53, 703-713) para uma expressão constitutiva, o promotorPatatingen B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) para uma ex-pressão específica do tubérculo em batatas ou um promotor específico defrutas para tomate, tal como por exemplo, o promotor Polygalacturonase dotomate (Montgomery et al., 1993, Plant Cell 5, 1049-1062) ou o promotor E8do tomate (Metha et al., 2002, Nature Biotechnol. 20(6), 613-618) ou o pro-motor ACC Oxidase do pêssego (Moon e Callahan1 2004, J. ExperimentalBotany 55 (402), 1519-1528) ou um promotor, que assegura uma expressãomeramente em tecidos fotossinteticamente ativos, por exemplo, o promotorST-LS1 (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 7943-7947;Stockhaus et al.., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) ou o promotor HMWG dotrigo para uma expressão específica do endosperma, o promotor USP1 opromotor faseolina, promotores de genes zein do milho (Pedersen et al., Cell29 (1982), 1015-1026, Quatroccio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93),promotor glutelina (Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng etal., Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383 (1996), 213-18), um promotor Shrunken-1 (Werr et al., EMBO J. 4 (1985), 1373-1380),um promotor globulina (Nakase et al., 1996, Gene 170(2), 223-226) ou umpromotor prolamina (Qu e Takaiwa, 2004, Plant Biotechnology Journal 2(2),113-125). No entanto, também podem ser utilizados promotores, que sãoativados apenas em um momento determinado por influências externas (vi-de, por exemplo a WO 9307279). Nesse caso, os promotores de proteínasde choque térmico (heat-shock), que permitem uma indução simples, podemter um interesse particular. Além disso, podem ser utilizados promotores es-pecíficos de semente, tais como, por exemplo, o promotor USP de Vicia fa-ba, que assegura uma expressão específica de semente em Vicia faba eoutras plantas (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679 Bàumlein etal., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467). A utilização de promotores, queocorrem no genoma de vírus infectados por algas, também é apropriada pa-ra a expressão de seqüências de ácido nucleico em plantas (Mitra et al.,1994, Biochem. Biophys. Res Commun 204(1), 187-194; Mitra e Higgins,1994, Plant Mol Biol 26(1), 85-93, Van Etten et al., 2002, Arch Virol 147,1479-1516).

Pelo termo "específico do tecido" no contexto da presente inven-ção, deve ser entendida a principal limitação de um desenvolvimento (porexemplo, a iniciação da transcrição) sobre um determinado tecido.

Pelos termos "célula de tubérculo, fruto ou semente" no contextoda presente invenção, devem ser entendidas todas as células, que estãocontidas em um tubérculo, fruto ou em uma semente.

Pelo termo "promotor homólogo" no contexto da presente inven-ção, deve ser entendido um promotor, que ocorre naturalmente em célulasde plantas ou plantas, que foram utilizadas para a produção de células deplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou de plantasgeneticamente modificadas de acordo com a invenção (homólogas em rela-ção à célula da planta ou da planta) ou um promotor, que regula a regulaçãoda expressão de um gene no organismo, a partir do qual foi isolada a se-qüência (homóloga em relação à molécula de ácido nucleico a ser exprimi-da).

Pelo termo "promotor heterólogo" no contexto da presente in-venção, deve ser entendido um promotor, que não ocorre naturalmente emcélulas de plantas ou plantas, que foram utilizadas para a produção de célu-las de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção (heterólogas em relação à célula da planta ou à planta) ou um promotor, que foi isoladonaturalmente no organismo, a partir do qual foi isolada uma seqüência deácido nucleico a ser exprimida, não para a regulação da expressão da se-qüência de ácido nucleico a ser exprimida (heteróloga em relação à molécu-la de ácido nucleico a ser exprimida).

Além disso, pode estar presente uma seqüência de terminação(sinal de poliadenilação), que serve para a adição de uma cauda Poly-A aotranscrito. À cauda Poly-A é acrescentada uma função na estabilização dostranscritos. Tais elementos são descritos na literatura (compare Gielen et al.,EMBO J. 8 (1989), 23-29) e são permutáveis quando desejado.

Entre o promotor e a região a ser codificada também podem es-tar presentes seqüências de íntrons. Essas seqüências íntron podem levar àestabilidade da expressão e a uma expressão aumentada nas plantas (Calliset al., 1987, Genes Devei. 1, 1183-1200; Luehrsen and Walbot, 1991, Mol.Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier et al., 1997, Plant Journal 12(4), 895-899; Rose e Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil et al.,1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579, XU et al., 2003, Science in China SeriesC Vol. 46 n° 6, 561-569). Seqüências íntron apropriadas são, por exemplo, oprimeiro íntron do gene sh1 do milho, o primeiro íntron do gene poliubiquitina1 do milho o primeiro íntron do gene EPSPS do arroz ou um dos dois primei-ros íntrons do gene PAT1 de Arabidopsis.

Um outro objetivo da presente invenção refere-se a plantas, con-tendo células de plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção. Tais plantas podem ser produzidas através da regeneração de célulasde plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção.

A presente invenção refere-se também a partes processáveis ouconsumíveis de plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção, contendo células de plantas geneticamente modificadas de acordo coma invenção.

Pelo termo "partes processáveis" no contexto da presente inven-ção devem ser entendidas partes de plantas, que encontram utilização naprodução de alimentos ou forragens, que são aplicadas como fonte de maté-ria-prima para processos industriais, como fonte de matéria-prima para aprodução de produtos farmacêuticos ou como fonte de matéria-prima para aprodução de produtos cosméticos.

Pelo termo "partes consumíveis" no contexto da presente inven-ção devem ser entendidas ramificações, que servem ao homem como ali-mento ou são utilizadas como forragem.

A presente invenção refere-se também ao material de cresci-mento de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção,contendo células de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção.

O termo "material de crescimento" abrange, nesse caso, aqueleselementos da planta, que são apropriados para a produção de descendentespor processo vegetativo ou sexual. Para a reprodução vegetativa prestam-sepor exemplo, estacas, culturas de calo, rizomas ou tubérculos. Outro materi-al de reprodução abrange, por exemplo, frutos, sementes, planta nascida desemente, protoplastos, culturas de células e outros. No caso do material decrescimento, trata-se preferentemente de tubérculos, frutos ou sementes.

Em uma outra forma de concretização, a presente invenção refe-re-se a partes de plantas colhíveis de plantas geneticamente modificadas deacordo com a invenção, tais como frutos, tubérculos de raízes, raízes, flores,brotos, rebentos, folhas ou caules, preferentemente sementes, frutos ou tu-bérculos, sendo que essas partes colhíveis contêm células de plantas gene-ticamente modificadas de acordo com a invenção.Preferentemente, a presente invenção refere-se ao material decrescimento de acordo com a invenção ou a partes colhíveis de plantas deacordo com a invenção, contendo hialuronano. De modo particularmentepreferido, trata-se nesse caso, de material de crescimento de acordo com ainvenção ou de partes colhíveis de plantas de acordo com a invenção, quesintetizam hialuronano.

O termo "planta de batata" ou "batata" no contexto da presenteinvenção significa espécies de plantas do gênero Solanum, particularmenteespécies produtoras de tubérculos do gênero Solanum e especialmente So-Ianum tuberosum.

O termo "planta de tomate" ou "tomate" no contexto da presenteinvenção significa espécies de plantas do gênero Lycopersicon, particular-mente Lycopersicon esculentum.

Uma outra vantagem da presente invenção está em que partescolhíveis, material de crescimento, partes processáveis ou partes consumí-veis de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção con-têm mais hialuronano do que plantas transgênicas descritas na literatura quesintetizam hialuronano. Por isso, plantas geneticamente modificadas de a-cordo com a invenção não apenas são particularmente apropriadas para autilização como matéria-prima, a partir da qual pode ser isolado o hialurona-no, mas sim, também como utilização direta como alimentos/forragens oupara a produção de alimentos/forragens, as quais apresentam um caráterpreventivo ou terapêutico (por exemplo, para a prevenção contra osteoartri-te, US 6.607.745). Visto que plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção apresentam um teor de hialuronano maior do que plantasdescritas na literatura, devem ser aplicadas menores quantidades de partescolhíveis, material de crescimento, partes processáveis ou partes consumí-veis de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção paraproduzir esses alimentos/forragens. Caso as partes consumíveis de plantasgeneticamente modificadas de acordo com a invenção sejam consumidaspor exemplo, diretamente como o chamado nutricêutico, então é possívelobter um efeito positivo já através do consumo de menores quantidades desubstância. Essa pode obter, entre outros, um significado particular na pro-dução de ração, pois a ração com um teor alto demais de componentes ve-getais, não é apropriada como forragem para as mais diferentes espéciesanimais.

Devido a alta capacidade de hialuronano de ligar água, as partescolhíveis apresentam material de crescimento, partes processáveis ou partesconsumíveis de plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção apresentam, além disso, a vantagem de que na produção de alimen-tos/forragens ligados precisam ser aplicados menos espessantes. Dessamaneira, por exemplo, na produção de géis é utilizado menos açúcar, o quetraz consigo um efeito de saúde positivo adicional. Na produção de alimen-tos/forragens, no qual é necessário retirar água da matéria-prima vegetal, avantagem na utilização de partes colhíveis, material de crescimento, partesprocessáveis ou partes consumíveis de plantas geneticamente modificadasde acordo com a invenção é que é preciso retirar menos água do respectivomaterial da planta, o que leva a custos de produção mais baixos e atravésde processos de produção mais cuidadosos (por exemplo, menor e/ou maiscurta adução de calor) é assegurado um valor nutritivo aumentado dos res-pectivos alimentos/forragens. Dessa maneira, por exemplo, na produção deketchup de tomates é preciso acrescentar menos energia, para obter a con-sistência desejada.

Um outro objetivo da presente invenção, refere-se a um proces-so para a produção de uma planta, que sintetiza hialuronano, em que:

a) uma célula de planta, é geneticamente modificada, em que amodificação genética abrange os seguintes estágios i até ii

i) introdução de uma molécula de ácido nucleico estranho, quecodifica uma hialuronano sintase na célula da planta

ii) introdução de uma modificação genética na célula da planta,sendo que a modificação genética leva ao aumento da ativi-dade de uma proteína com a atividade enzimática de uma

UDP-GIc-DH em comparação com células de plantas de tiposilvestre correspondentes não geneticamente modificadas,sendo que os estágios i até ii podem ser efetuados na ordem desejada, indi-vidualmente ou simultaneamente em combinações desejadas dos estágios iaté ii

b) uma planta é regenerada a partir de células de plantas do es-tágio a);

c) eventualmente outras plantas são produzidas com auxílio dasplantas de acordo com o estágio b), sendo que eventualmente a partir deplantas obtidas do estágio b) i ou b) ii podem ser isoladas células de plantase os estágios dos processos a) até c) são repetidos por tanto tempo, até quetenha sido produzida uma planta, que apresenta uma molécula de ácido nu-cleico estranha, que codifica uma hialuronano sintase e apresenta uma ativi-dade aumentada de uma proteína com a atividade enzimática de uma UDP-GIc-DH em comparação com células de plantas de tipo silvestre correspon-dentes, não geneticamente modificadas.

Um objetivo preferido da presente invenção, refere-se ao pro-cesso para a produção de uma planta que sintetiza hialuronano, no qual:

a) uma célula de planta, é geneticamente modificada, em que amodificação genética abrange os seguintes estágios i até ii na ordem dese-jada ou combinações desejadas dos seguintes estágios i até ii são efetuadasindividual ou simultaneamente

i) introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha, quecodifica uma hialuronano sintase na célula de planta

ii) introdução de uma modificação genética na célula da planta,em que a modificação genética leva ao aumento da atividadede uma proteína com a atividade enzimática de uma UDP-GIc-DH1 em comparação com células de plantas de tipo sil-vestre correspondentes não geneticamente modificadas

b) a partir de células de plantas contendo a modificação genéticade acordo com os estágios

i a) iii a) iiiii) a) i e a) ii,uma planta é regenerada

c) em células de plantas de plantas de acordo com o estágio éintroduzida

i) b) i uma modificação genética de acordo com o estágio a) ii,

ii) b) ii uma modificação genética de acordo com o estágio a) ie uma planta é regenerada

d) eventualmente outras plantas são produzidas com auxílio dasplantas, obtidas conforme um dos estágios b) iii ou c) i ou c) ii.

Para as modificações genéticas introduzidas na célula da plantaconforme o estágio a), vale que nesse caso pode tratar-se fundamentalmen-te de qualquer tipo de modificação, que leva ao aumento da atividade deuma proteína com a atividade enzimática de uma UDP-GIc-DH.

A regeneração das plantas de acordo com o estágio a) e even-tualmente estágio c) dos processos de acordo com a invenção pode ser efe-tuada por métodos conhecidos pelo técnico (por exemplo, descritos em"Plant Cell Culture Protocols", 1999, edt. by R. D. Hall, Humana Press, ISBN0-89603-549-2).

A produção de outras plantas (dependendo de processos de a-cordo com o estágio c) ou estágio d) dos processos de acordo com a inven-ção pode ser efetuada, por exemplo, através de reprodução vegetativa (porexemplo, por meio de estacas, tubérculos ou cultura de calos e regeneraçãoda planta inteira) ou através de reprodução sexual. Nesse caso, a reprodu-ção sexual realiza-se preferentemente de maneira controlada, isto é, plantasselecionadas com determinadas características são cruzadas umas com asoutras e reproduzidas. Nesse caso, a seleção é preferentemente efetuadade maneira tal que as outras plantas (produzidas dependendo de processosde acordo com o estágio c) ou estágio d)) apresentem as modificações intro-duzidas nos estágios precedentes.

Em processos para a produção de plantas de acordo com a in-venção, que sintetizam hialuronano, as modificações genéticas para a pro-dução das células de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção podem ser efetuadas simultaneamente ou em estágios subsequen-tes. Nesse caso, é insignificante se para modificações genéticas subsequen-tes, que levam a uma atividade aumentada de uma proteína com a atividadeenzimática de uma UDP-GIc-DH, for utilizado o mesmo método como para amodificação genética, que é utilizada para a introdução de uma molécula deácido nucleico estranha, que codifica uma hialuronano sintase na célula daplanta.

Em uma outra forma de concretização de processos para a pro-dução da planta, que sintetiza hialuronano, a modificação genética consistena introdução de uma molécula de ácido nucleico estranha no genoma dacélula da planta, em que a presença ou a expressão da molécula de ácidonucleico estranha leva a uma atividade aumentada de uma proteína com aatividade enzimática de uma UDP-GIc-DH da célula da planta.

Tal como já foi descrito acima para moléculas de ácido nucleicoestranhas introduzidas na célula da planta ou planta para a modificação ge-15 nética, no caso do estágio a) dos processos para a produção de uma plantade acordo com a invenção, que sintetiza hialuronano, pode tratar-se de umamolécula de ácido nucleico individual ou de várias moléculas de ácido nucle-ico. Dessa maneira, as moléculas de ácido nucleico estranhas, que codifi-cam uma hialuronano sintase ou codificam uma proteína com a atividade20 enzimática de uma UDP-GIc-DH podem estar presentes em uma única mo-lécula de ácido nucleico ou elas podem estar presentes nas moléculas deácido nucleico separadas. Caso estejam presentes moléculas de ácido nu-cleico, que codificam uma hialuronano sintase e codificam uma proteína coma atividade em várias moléculas de ácido nucleico, então essas moléculas25 de ácido nucleico podem ser simultaneamente introduzidas ou em estágiossubsequentes em uma célula de planta.

Além disso, para a introdução de uma molécula de ácido nuclei-co estranha na execução de processos para a produção de uma planta, quesintetiza hialuronano, de acordo com a invenção, utilizam-se, além de uma30 célula de planta de tipo silvestre ou de planta de tipo silvestre, células demutantes ou mutantes, que se destacam pelo fato de já apresentarem umaatividade aumentada de uma proteína com a atividade enzimática de umaUDP-GIc-DH. Caso a célula de mutante ou o mutante já apresente uma ati-vidade aumentada de uma proteína com a atividade enzimática de umaUDP-GIc-DH em comparação com células de plantas de tipo silvestre cor-respondentes ou de plantas de tipo silvestre, então para efetuar um proces-so para a produção de uma planta, que sintetiza hialuronano, de acordo coma invenção, basta introduzir na célula de mutante mencionada ou no mutan-te, uma molécula de ácido nucleico estranha, que codifica uma hialuronanosintase.

As informações dadas mais acima para a utilização de mutantes para a produção de células de plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção ou de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção devem ser aplicadas correspondentemente aqui.

Em formas de concretização preferidas, a presente invençãorefere-se a processos para a produção de uma planta, que sintetiza hialuro-nano, de acordo com a invenção, em que a molécula de ácido nucleico, quecodifica uma hialuronano sintase é selecionada no estágio a) do grupo cons-tando em:

a) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de codi-ficarem uma hialuronano sintase viral,

b) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de codi-ficarem uma hialuronano sintase de um vírus que infecta Chlorella,

c) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de codi-ficarem uma hialuronano sintase de um vírus de Paramecium bursaria Chlo-rella 1,

d) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de codi-ficarem uma hialuronano sintase de um vírus de Paramecium bursaria Chlo-rella 1 da cepa H1

e) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de queos códons da molécula de ácido nucleico, que codifica uma hialuronano sin-tase, são modificados, em comparação aos códons da molécula de ácidonucleico, que codifica a hialuronano sintase do organismo original da hialu-ronano sintase,f) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de queos códons da hialuronano sintase são modificados de maneira tal que elessão ajustados à freqüência da utilização dos códons das células de plantasou da planta, em cujo genoma eles estarão ou estão,

g) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de codi-ficarem uma hialuronano sintase com a seqüência de aminoácidos represen-tada sob a SEQ ID n° 2 ou de codificarem uma hialuronano sintase, cuja se-qüência de aminoácidos apresenta uma identidade de pelo menos 70%, pre-ferentemente de pelo menos 80%, de modo particularmente preferido, depelo menos 90% e de modo especialmente preferido de pelo menos 95%,

h) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de codi-ficarem uma proteína, cuja seqüência de aminoácidos pode ser derivada daregião codificadora da seqüência de ácido nucleico inserida no plasmídeoDSM 1664 ou de codificarem uma proteína, cuja seqüência de aminoácidoscom a seqüência de aminoácidos, que pode ser derivada da região codifica-dora da seqüência de ácido nucleico inserida no plasmídeo DSM 16664, a-presenta uma identidade de pelo menos 70%, preferentemente de pelo me-nos 80%, preferentemente de pelo menos 90% e de modo especialmentepreferido de pelo menos 95%,

i) moléculas de ácido nucleico, que abrangem uma seqüência deácido nucleico representada sob a SEQ ID n° 1 ou SEQ ID n° 3 ou a se-qüência de ácido nucleico representada sob a SEQ ID n° 1 o SEQ ID n° 3apresenta uma identidade de pelo menos 70%, preferentemente de pelomenos 80%, preferentemente de pelo menos 90% e de modo especialmentepreferido de pelo menos 95%,

j) moléculas de ácido nucleico, que abrangem a seqüência deácido nucleico inserida no plasmídeo DSM 16664 ou que com a seqüênciade ácido nucleico inserida no plasmídeo DSM 16664 apresentam uma iden-tidade de pelo menos 70%, preferentemente de pelo menos 80%, preferen-temente de pelo menos 90% e de modo especialmente preferido, de pelomenos 95%,

k) moléculas de ácido nucleico, que codificam uma hialuronanosintase, em que as seqüências de ácido nucleico que codificam a hialurona-no sintase estão ligadas com elementos reguladores (promotor), que iniciama transcrição em células de plantas ou

I) moléculas de ácido nucleico, de acordo com k), em que ospromotores representam promotores específicos de tecidos, de modo parti-cularmente preferido, promotores, que iniciam a iniciação da transcrição es-pecificamente em células de sementes vegetais de tubérculos, folha, fruto ousemente.

Em formas de concretização preferidas, a presente invençãorefere-se a processos para a produção de uma planta, que sintetiza hialuro-nano, de acordo com a invenção, em que a molécula de ácido nucleico es-tranha, que codifica uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH, éselecionada do grupo constando em:

a) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de codi-ficarem uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH, a qual é prove-niente de vírus, bactérias, animais ou plantas;

b) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de codi-ficarem uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH de um vírus queinfecta ChIoreIIa;

20 c) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de codi-

ficarem uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH de um vírus Pa-ramecium bursaria Chlorella;

d) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de queos códons da molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína com a

25 atividade de uma UDP-GIc-DH são modificados, em comparação com oscódons da molécula de ácido nucleico, a qual codifica a proteína correspon-dente com a atividade de uma UDP-GIc-DH do organismo original;

e) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de queos códons da molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína com a

30 atividade de uma UDP-GIc-DH são modificados de maneira tal que eles sãoajustados à freqüência da utilização dos códons da célula de planta ou daplanta, em cujo genoma eles serão ou estão integrados;f) moléculas de ácido nucleico, caracterizadas pelo fato de queos códons da proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH são modifica-dos de maneira tal que eles são ajustados à freqüência da utilização doscódons da célula de planta ou da planta, em cujo genoma eles serão ou es-tão integrados;

g) moléculas de ácido nucleico, que codificam uma proteína, cu-ja seqüência apresenta uma identidade de pelo menos 70%, preferentemen-te de pelo menos 80%, preferentemente de pelo menos 90% e de modo es-pecialmente preferido de pelo menos 95% em relação à seqüência de ami-noácidos mencionada sob a SEQ ID n° 5;

h) moléculas de ácido nucleico, que abrangem a seqüência denucleotídeos representada sob a SEQ ID n° 4 o sob a SEQ ID n° 6 ou umaseqüência complementar;

i) moléculas de ácido nucleico, que em relação às seqüências deácido nucleico descritas sob h), apresentam uma identidade de pelo menos70%, preferentemente de pelo menos 80%, preferentemente de pelo menos90% e de modo especialmente preferido de pelo menos 95%;

j) moléculas de ácido nucleico, que hibridizam com pelo menosum segmento das moléculas de ácido nucleico descritas sob f) ou h) comcondições estringentes;

k) moléculas de ácido nucleico, cuja seqüência de nucleotídeos,com base na degeneração do código genético, desvia da seqüência das mo-léculas de ácido nucleico mencionadas sob f) ou h); e

I) moléculas de ácido nucleico, que representam os fragmentos,variantes alélicas e/ou derivados das moléculas de ácido nucleico mencio-nadas sob a), b), c), d), e), f) ou h);

m) moléculas de ácido nucleico, que codificam uma proteínacom a atividade de uma UDP-GIc-DH, em que as seqüências de ácido nucle-ico que codificam uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH estão ligadas com elementos reguladores (promotor), que iniciam a transcrição emcélulas de plantas ou

n) moléculas de ácido nucleico, de acordo com m), em que ospromotores representam promotores específicos de tecidos, de modo parti-cularmente preferido, promotores, que iniciam a iniciação da transcrição es-pecificamente em células vegetais de tubérculos, folhas, frutos ou sementes.

Em uma outra forma de concretização preferida, os processospara a produção de uma planta, que sintetiza hialuronano, de acordo com ainvenção, são utilizados para a produção de plantas geneticamente modifi-cadas de acordo com a invenção.

Plantas obteníveis segundo processos para a produção de umaplanta, que sintetiza hialuronano, de acordo com a invenção, são tambémobjetivos da presente invenção.

Um outro objetivo da presente invenção refere-se a um processopara a produção de hialuronano, que abrange o estágio da extração de hia-luronano de células de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção, de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção,de material de reprodução de acordo com a invenção, de partes de plantascolhíveis de acordo com a invenção ou de plantas ou partes dessas, obtení-veis por um processo para a produção de plantas, que sintetizam hialurona-no, de acordo com a invenção. Preferivelmente, um tal processo abrangetambém o estágio da colheita das células de plantas cultivadas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção, das plantas cultivadas gene-ticamente modificadas de acordo com a invenção, do material de reproduçãode acordo com a invenção, das partes de plantas colhíveis de acordo com ainvenção, das partes de plantas processáveis de acordo com a invençãoantes da extração do hialuronano e de modo particularmente preferido, alémdisso, o estágio do cultivo de células de plantas geneticamente modificadasde acordo com a invenção ou de plantas geneticamente modificadas de a-cordo com a invenção antes da colheita.

Ao contrário de tecidos bacterianos ou animais, os tecidos vege-tais não apresentam hialuronidases e não contêm hialaderinas. Por isso, talcomo já foi descrito acima, a extração de hialuronano de tecidos vegetais épossível com auxílio de processos relativamente simples. Os extratos aquo-sos de células vegetais ou tecidos, contendo hialuronano, descritos acima,podem ser ulteriormente purificados conforme a necessidade, com métodosconhecidos pelo técnico, tais como, por exemplo, de várias precipitaçõessubsequentes com etanol. Um método preferido para a purificação de hialu-ronano e descrito sob os métodos gerais ponto 3.

Os processos já descritos para a extração de hialuronano decélulas de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção oude plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, são apli-cáveis também para o isolamento de hialuronano de material de reproduçãode acordo com a invenção, de partes de plantas colhíveis de acordo com ainvenção ou de plantas ou partes dessas plantas, obteníveis por um proces-so para a produção de plantas, que sintetizam hialuronano, de acordo com ainvenção.

O objeto da presente invenção é também a utilização de célulasde plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, de plantasgeneticamente modificadas de acordo com a invenção, de material de repro-dução de acordo com a invenção, partes de plantas colhíveis de acordo coma invenção, partes de plantas processáveis de acordo com a invenção ou deplantas, obteníveis por um processo de acordo com a invenção para a pro-dução de hialuronano.

Um outro objeto da presente invenção refere-se a composições,contendo células de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção. Nesse caso, é indiferente, se as células de plantas estão intactasou não mais intactas, pois elas foram destruídas, por exemplo, através deprocessos de processamento. De modo preferido, trata-se no caso das com-posições, de alimentos ou forragens, de produtos farmacêuticos ou de pro-dutos cosméticos.

Um objetivo preferido da presente invenção refere-se a compo-sições, contendo elementos de partes de plantas geneticamente modificadasde acordo com a invenção, de plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção, de material de reprodução de acordo com a invenção, departes de plantas colhíveis de acordo com a invenção ou de plantas, obtení-veis por um processo de acordo com a invenção e contendo moléculas deácido nucleico recombinantes, em que as moléculas de ácido nucleico re-combinantes são caracterizadas pelo fato de abrangerem moléculas de áci-do nucleico, que codificam uma hialuronano sintase e uma proteína com aatividade enzimática de uma UDP-GIc-DH.

Uma integração estável de moléculas de ácido nucleico estra-nhas no genoma de uma célula de planta ou planta faz com que as molécu-las de ácido nucleico estranhas, após a integração no genoma da célula deplanta ou planta, sejam ladeadas por seqüências vegetais genômicas deácido nucleico.

Por conseguinte, em uma forma de concretização preferida, ascomposições de acordo com a invenção, são caracterizadas pelo fato de queas moléculas de ácido nucleico recombinantes, contidas na composição deseqüências vegetais genômicas de ácido nucleico de acordo com a inven-ção, são ladeadas.

Nesse caso, as seqüências de ácido nucleico vegetais genômi-cas podem ser seqüências desejadas, que se apresentam naturalmente nogenoma da célula de planta ou planta, que foi utilizada para a produção dacomposição.

No caso das moléculas de ácido nucleico recombinantes conti-das nas composições de acordo com a invenção pode tratar-se de molécu-las de ácido nucleico recombinantes individuais ou diferentes, nas quais mo-léculas de ácido nucleico, que codificam uma hialuronano sintase e proteínacom a atividade enzimática de uma UDP-GIc-DH, estão presentes em umaúnica molécula de ácido nucleico, ou daquelas, nas quais as moléculas de ácido nucleico mencionadas estão presentes em moléculas de ácido nuclei-co recombinantes separadas. Dependendo de que maneira as moléculas deácido nucleico, que codificam uma hialuronano sintase ou que codificamuma proteína com a atividade enzimática de uma UDP-GIc-DH estão presen-tes em uma composição de acordo com a invenção, elas podem ser Iadea-das por seqüências de ácido nucleico vegetais genômicas idênticas ou dife-rentes.

O fato de que composições de acordo com a invenção contêmmoléculas de ácido nucleico recombinantes, pode ser comprovado com mé-todos conhecidos pelo técnico, tal como, por exemplo, de métodos à base dehibridização ou preferentemente de métodos à base de PCR (PolymeraseChain Reaction).

Preferivelmente, as composições de acordo com a invençãocontêm pelo menos 0,005%, preferentemente pelo menos 0,01%, de modoparticularmente preferido, pelo menos 0,05%, de modo especialmente prefe-rido, pelo menos 0,1% de hialuronano.

Tal como já foi mostrado acima, as células de plantas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção, plantas geneticamente modi-ficadas de acordo com a invenção, material de reprodução de acordo com ainvenção, partes de plantas colhíveis de acordo com a invenção, partes deplantas processáveis de acordo com a invenção, partes de plantas consumí-veis de acordo com a invenção ou plantas, obteníveis por um processo deacordo com a invenção podem ser utilizadas para produzir alimentos ou for-ragens. Mas também é possível a utilização como matéria-prima para apli-cações técnicas, sem precisar isolar o hialuronano. Dessa maneira, por e-xemplo, plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção oupartes de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção po-dem ser aplicadas em áreas de cultivo, para obter uma maior ligação de á-gua do solo. Além disso, a utilização de plantas geneticamente modificadasde acordo com a invenção ou de células de plantas geneticamente modifica-das de acordo com a invenção, é possível para a produção de agentes desecagem (por exemplo, para a utilização no transporte de objetos, que rea-gem de maneira sensível à umidade) ou com absorvedores de umidade (porexemplo, em fraldas para bebês ou para absorver líquidos aquosos escoa-dos). Para essas aplicações podem ser utilizadas, conforme a necessidade,plantas inteiras geneticamente modificadas de acordo com a invenção, par-tes de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção trituradas (porexemplo, moídas) ou partes de plantas de acordo com a invenção. Especi-almente em campos, nos quais são aplicadas plantas ou partes de plantasmoídas, são partes de plantas, que contêm hialuronano, no entanto, que a-presentam mesmo uma pequena fração de água. Nesse caso, trata-se prefe-rencialmente de grãos de plantas de cereais (milho, arroz, trigo, centeio, a-veia, cevada, sago ou sorgo). Visto que células de plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção e plantas geneticamente modificadasde acordo com a invenção apresentam um teor de hialuronano maior do queplantas transgênicas descritas na literatura, é preciso aplicar menos materialpara aplicações técnicas em comparação com aquelas, quando são utiliza-das células de plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção.

Além disso, são objetos da presente invenção os processos paraa produção de uma composição de acordo com a invenção, em que são uti-lizadas células de plantas geneticamente modificadas de acordo com a in-venção, plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, ma-terial de reprodução de acordo com a invenção, partes de plantas colhíveisde acordo com a invenção, partes de plantas processáveis de acordo com ainvenção, partes de plantas consumíveis de acordo com a invenção ou plan-tas, obteníveis por um processo para a produção de uma planta, que sinteti-za hialuronano, de acordo com a invenção. Preferentemente no caso dosprocessos para a produção de uma composição de acordo com a invenção,trata-se de processos para a produção de alimentos ou forragens, processospara a produção de um produto farmacêutico ou processos para a produçãode um produto cosmético.

Processos para a produção de alimentos ou forragens são co-nhecidos pelo técnico. Processos para a utilização de plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção ou de partes de plantas de acordocom a invenção, em campos técnicos, também são conhecidos pelo técnicoe abrangem, entre outros, mas não são exclusivamente restritos à trituraçãoou à moagem de plantas geneticamente modificadas de acordo com a in-venção ou de partes de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção. Algumas vantagens, que resultam da utilização de objetos para aprodução de alimentos/forragens de acordo com a invenção ou para a apli-cação em campos técnicos, já são ou foram descritas.

De modo particularmente preferido, trata-se no caso de um pro-cesso para a produção de uma composição, de um processo para a produ-ção de uma composição, que contém hialuronano.

Composições obteníveis por um processo para a produção deuma composição de acordo com a invenção, são igualmente objeto da pre-sente invenção.

A presente invenção refere-se também à utilização de células deplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, plantas ge-neticamente modificadas de acordo com a invenção, material de reproduçãode acordo com a invenção, partes de plantas colhíveis de acordo com a in-venção, partes de plantas processáveis de acordo com a invenção, partesde plantas consumíveis de acordo com a invenção ou plantas obteníveis porum processo para a produção de uma planta, que sintetiza hialuronano, deacordo com a invenção para a produção de uma composição de acordo coma invenção. Preferivelmente, trata-se da utilização de células de plantas ge-neticamente modificadas de acordo com a invenção, de plantas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção, material de reprodução deacordo com a invenção, partes de plantas colhíveis de acordo com a inven-ção, partes de plantas processáveis de acordo com a invenção, partes deplantas consumíveis de acordo com a invenção ou plantas obteníveis por umprocesso para a produção de uma planta, que sintetiza hialuronano, de a-cordo com a invenção para a produção de alimentos ou forragens, para aprodução de um produto farmacêutico ou para a produção de um produtocosmético.

Descrição das Seqüências

SEQ ID n° 1: seqüência de ácido nucleico, que codifica uma hialuronano sin-tase do vírus Paramecium bursaria Chlorella 1.

SEQ ID n° 2: seqüência de aminoácidos de uma hialuronano sintase do vírus

Paramecium bursaria Chlorella 1. A seqüência de aminoácidos representadapode derivar-se da SEQ ID n° 1.

SEQ ID n° 3: seqüência de ácido nucleico sintética, que codifica uma hialu-ronano sintase do vírus Paramecium bursaria Chlorella 1. A síntese dos có-dons da seqüência representada foi efetuada de maneira tal que ela é ajus-tada à utilização de códons em células de plantas. A seqüência de ácido nu-cleico representada codifica uma proteína com a seqüência de aminoácidosrepresentada sob SEQ ID n° 2.

SEQ ID n° 4: seqüência de ácido nucleico, que codifica uma proteína com aatividade de uma UDP-GIc-DH do vírus Paramecium bursaria Chlorella 1.SEQ ID n° 5: seqüência de aminoácidos de uma proteína com a atividade deuma UDP-GIc-DH do vírus Paramecium bursaria Chlorella 1. A seqüência de aminoácidos representada pode derivar-se da SEQ ID n° 4.

SEQ ID n° 6: seqüência de ácido nucleico sintética, que codifica uma proteí-na com a atividade de uma UDP-GIc-DH do vírus Paramecium bursaria C-hlorella 1. A síntese dos códons da seqüência representada foi efetuada demaneira tal que ela é ajustada à utilização de códons em células de plantas.A seqüência de ácido nucleico representada codifica uma proteína com aseqüência de aminoácidos representada sob SEQ ID n° 5.SEQ ID n° 7: oligonucleotídeo sintético, que foi utilizado no exemplo 1.SEQ ID n° 8: oligonucleotídeo sintético, que foi utilizado no exemplo 1.

Descrição das Figuras

Figura 1: representa uma curva de calibração e a respectiva e-quação da linha reta de regressão, a qual foi utilizada para o cálculo do teorde hialuronano no tecido vegetal. A curva de calibração foi criada com auxí-lio do kit de teste comercial kit de teste ácido hiawrônico (HA) da Firma Cor-genix, Inc., Colorado, USA. Prod. Nr. 029-001) e com as soluções padroni-zadas acompanhantes.

Métodos Gerais

A seguir, são descritos métodos, que podem ser utilizados nocontexto da presente invenção. Esses métodos representam formas de con-cretização concretas, no entanto, na restringem a presente invenção a essesmétodos. O técnico sabe, que através da modificação dos métodos descritose/ou através da substituição de métodos individuais ou partes de métodospor métodos alternativos ou por partes de métodos alternativos, ele podeexecutar a invenção da mesma maneira.

1. Transformação de Plantas de Batata

Plantas de batata foram transferidas com auxílio de Agrobacteri-um, tal como descrito por Rocha-Sosa et al., (EMBO J. 8, (1989), 23-29).

2. Isolamento de Hialuronano de Tecido Vegetal

Material de plantas para comprovar a presença de hialuronano epara determinar o teor de hialuronano em tecido vegetal foi processado daseguinte maneira: a cerca de 0,3 g de material de tubérculo foram acrescen-tados 200 μl de água (desmineralizada, condutibilidade >18 ΜΏ) e trituradocom um moinho de bolas oscilante de laboratório (MM200, Firma Retsch,Alemanha) (por 30 segundos a 30 HZ). Em seguida, foi efetuada uma outraadição de 800 μl de água (desmineralizada, condutibilidade >18 ΜΏ) e umaboa mistura (por exemplo, com auxílio de um Vortex). Os pedaços de célulase elementos insolúveis foram separados do sobrenadante através de centri-fugação por 5 minutos a 16000xg.

3. Purificação de Hialuronano

Cerca de 100 gramas de tubérculos foram descascados, corta-dos em pequenos pedaços de cerca de 1 cm3 e após adição de 100 ml deágua (desmineralizada, condutibilidade > 18 ΜΏ), triturados em um WarringBlendor por cerca de 30 segundos a velocidade máxima. Em seguida, ospedaços de células foram separados através de uma peneira de chá. Ospedaços de células separadas foram novamente suspensas com 300 ml deágua (desmineralizada, condutibilidade > 18 ΜΏ) e outra vez separadas a-través de uma peneira de chá. As duas suspensões obtidas (100 ml + 300ml) foram combinadas e centrifugadas por 15 minutos a 13000xg. Ao sobre-nadante de centrifugação obtido foi acrescentado NaCI até uma concentra-ção final de 1%. Depois que o NaCI foi dissolvido, realizou-se uma precipita-ção, através da adição do volume duplo de etanol, em seguida, boa misturae incubação durante a noite a -20°C. Em seguida, efetuou-se uma centrifu-gação por 15 minutos a 13000xg. O precipitado sedimentado, obtido apósessa centrifugação foi dissolvido em 100 ml de tampão (TrisHCI a 50 mM,pH 8, CaCb a 1 mM), antes de acrescentar proteinase K até uma concentra-ção final de 100 pg/ml e e incubar a solução por 2 horas a 42°C. Seguiu-seuma incubação por 10 minutos a 95°C. Novamente foi acrescentado NaCI aessa solução até uma concentração final de 1%. Após a dissolução do NaCI1realizou-se mais uma precipitação, através da adição do volume duplo deetanol, boa mistura e incubação por cerca de 96 horas a -20°C. Em seguida,realizou-se uma centrifugação por 15 minutos a 13000xg. O precipitado se-dimentado, obtido após essa centrifugação foi dissolvido em 30 ml de água(desmineralizada, condutibilidade >18 ΜΏ) e outra vez adicionado com Na-Cl até uma concentração final de 1%. Através da adição do volume duplo deetanol, boa mistura e incubação durante a noite a -20°C, realizou-se umanova precipitação. O precipitado obtido após uma centrifugação por 15 minu-tos a 13000xg, foi dissolvido em 20 ml de água (desmineralizada, condutibi-lidade > 18 ΜΏ).

Uma outra purificação foi efetuada por meio de filtração por cen-trifugação. Para isso, em cada caso 5 ml do precipitado dissolvido foram co-locados em um filtro de membrana (CentriconAmicon, largura dos poros10000 NMWL, Prod. n° UCF8 010 96) e centrifugados a 2200xg por tantotempo, até restarem ainda cerca de 3 ml da solução acima do filtro. Em se-guida, acrescentaram-se ainda 2 vezes em cada caso 3 ml de água (desmi-neralizada, condutibilidade >18 ΜΏ) à solução encontrada sobre a membra-na e em cada caso centrifugou-se outra vez com as mesmas condições, atéque ao final, ainda restassem cerca de 3 ml da solução acima do filtro. Assoluções presentes ainda sobre a membrana após a filtração por centrifuga-ção foram removidas e a membrana ainda foi lavada várias vezes (três acinco vezes) com cerca de 1,5 ml de água (desmineralizada, condutibilidade>18 ΜΏ). Todas as soluções e as soluções de lavagem ainda presentessobre a membrana são combinadas, adicionadas com NaCI até uma concen-tração final de 1%, após a dissolução do NaCI são providas com o volumeduplo de etanol, misturadas e precipitadas durante a noite mediante arma-zenamento a -20°C. O precipitado obtido após uma centrifugação por 15 mi-nutos a 13000xg foi dissolvido em 4 ml de água (desmineralizada, condutibi-lidade >18 ΜΏ) e em seguida, Iiofilizado (24 horas com uma pressão de0,037 KPa (0,37 mbar), instalação de liofilização Christ Alpha 1-4, Firma C-hrist, Osterode).

4. Comprovação de Hialuronano e Determinação do Teor de Hialuronano

A comprovação de hialuronano foi efetuada com auxílio de umteste que pode ser adquirido no comércio (kit de teste de ácido hialurônico(HA) da firma Corgenix1 Inc., Colorado, EUA, Prod. n° 029-001) conforme osdados do fabricante, que através de referência são admitidos, por este meio,como objetivo no relatório descritivo. O princípio do teste baseia-se na dis-ponibilidade de uma proteína que se liga especificamente ao hialuronano(HABP) e é efetuado de modo semelhante a um ELISA, em que uma reaçãocolorida indica o teor de hialuronano na amostra pesquisada. Portanto, asamostras a serem medidas devem ser aplicadas para a determinação quan-titativa de hialuronano em uma tal concentração (por exemplo: diluição darespectiva amostra ou utilização de menos água para a extração de hialuro-nano de tecido vegetal, dependendo se um valor limite foi ultra- ou infrapas-sado), que elas se encontram dentro dos limites indicados.

Em preparações paralelas, alíquotas das amostras a serem de-terminadas foram inicialmente submetidas a uma digestão de hialuronano,antes de terem sido medidas com o teste que pode ser adquirido no comér-cio (kit de teste de ácido hialurônico (HA) da firma Corgenix, Inc., Colorado,EUA, Prod. n° 029-001). A digestão de hialuronano foi efetuada com 400 μΙde extrato de tubérculos de batata em tampão de hialuronidase (tampão depotássio fósforo a 0,1 M, pH 5,3, NaCI a 150 mm) mediante adição de 5 pg3 unidades) de hialuronidase (Hialuronidase Tipo Ill de Sigma, Prd. Nr.H2251), com uma incubação de 30 minutos a 37°C. Em seguida, todas asamostras foram aplicadas em cada caso em uma diluição de 1:10 para adeterminação do teor de hialuronano.

5. Determinação da Atividade de uma UDP-GIc-DH

A determinação da atividade de uma proteína com a atividade deuma UDP-GIc-DH é efetuada tal como descrito por Spicerl et al. (1998, J.Bacteriol. 273 (39), 25117-25124.Exemplos1. Produção do Vetorde Expressão Vegetal IR 47-71

O plasmídeo pBinAr é um derivado do plasmídeo do vetor biná-rio pBin19 (Bevan, 1984, Nucl. Acid Res 12: 8711-8721), que foi construídoda seguinte maneira:

um fragmento longo com 529 p.b., que abrange os nucleotídeos6909-7437 do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor, foi isoladocomo fragmento EcoR I / Kpn I do plasmídeo pDH51 (Pietrzak et al., 1986Nucleic Acids Res. 14, 5858) e ligado entre os locais de corte de restriçãoEcoR I e Kpn I do poliligador de pUC18. Com isso, forma-se o plasmídeopUC18-35S. A partir do plasmídeo pAGV40 (Herrera-Estrella et al., 1983Nature, 303, 209-213), com auxílio das endonucleases de restrição Hind Ill ePvu II, foi isolado um fragmento comprido com 192 p.b., que abrange o sinalde poliadenilação (extremidade 3') do gene octopina sintase (gene 3) do T-DNA do plasmídeo Ti pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO Journal 3, 835-846) (Nucleotide 11749-11939). Após a adição de Iigantes Sph I ao ponto decorte Pvu II, o fragmento foi ligado entre os pontos de corte Sph I e Hind Illde pUC18-35S. Disto resulta o plasmídeo pA7. Aqui, todo o poliligador con-tendo o promotor 35S e terminador Ocs com EcoR I e Hind Ill foi recortado eligado no vetor pBin19 correspondentemente cortado. Com isso, formou-se ovetor de expressão vegetal pBinAr (Hõfgen e Willmitzer, 1990, Plant Science66, 221-230).

O promotor do gene patatina B33 de Solanum tuberosum (Ro-cha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29) foi ligado como fragmento Dra I(nucleotídeos -1512- +14) no vetor pUC19 cortado com Sst I, cujas extremi-dades foram alisadas com auxílio da T4-DNA polimerase. Disto formou-se oplasmídeo pUC19-B33. Deste plasmídeo foi recortado o promotor B33 comEcoR I e Sma I e ligado no vetor pBinAr correspondentemente cortado. Daíformou-se o vetor de expressão vegetal pBinB33.

Para facilitar outros estágios de clonagem, o MCS (Multiple Clo-ning Site) foi ampliado. Para isso, foram sintetizados dois oligonucleotídeoscomplementares, aquecidos por 5 minutos a 95°C, lentamente resfriados àtemperatura ambiente, para possibilitar uma boa fixação (enrijecimento) eclonar nos pontos de corte Sal I e Kpn I de pBinB33. Os oligonucleotídeos

utilizados para esse fim apresentaram a seguinte seqüência:

5'-TCg ACA ggC CTg gAT CCT TAA TTA AAC TAg TCT CgA ggA gCT CggTAC-3'

5'-CgA gCT CCT CgA gAC TAg TTT AAT TAA ggA TCC Agg CCT g-3'O plasmídeo obtido foi designado com IR 47-71.

2. Produção do Vetor de Expressão Vegetal pBinARHygO fragmento, contendo o promotor 35S, o terminador Ocs e todoo Sítio de Clonagem Múltipla foi recortado por meio das endonucleases derestrição EcoR I e Hind Ill do pA7 e clonado com no vetor pBIBHyg cortadocom as mesmas endonucleases de restrição (Becker, 1990, Nucleic AcidsRes. 18, 203). O plasmídeo obtido foi designado com pBinARHyg.

3. Síntese de Moléculas de Ácido Nucléicoa) Síntese de moléculas de ácido nucleico que codificam uma hialuronano sintase do vírus Paramecium bursaria Chlorella 1.

A seqüência de ácido nucleotídeo, que codifica uma hialuronanosintase do vírus Paramecium bursaria Chlorella 1, foi sintetizada pela firmaMedigenomix GmbH (Munique, Alemanha) e clonada no vetor pCR2.1 daFirma Invitrogen (Prod. n° K2000-01). O plasmídeo obtido foi designado comIC 323-215. A seqüência de ácido nucleico sintética, que codifica a proteínaHAS do vírus Paramecium bursaria Chlorella 1, é representada sob SEQ IDn° 3. A seqüência de ácido nucleico correspondente, originalmente isoladado vírus Paramecium bursaria Chlorella 1, é representado sob SEQ ID n° 1.

b) Síntese de moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína coma atividade de uma UDP-GIc-DH do vírus Parameeium bursaria Chlorella 1.

A seqüência de ácido nucleico, que codifica uma proteína com aatividade de uma UDP-GIc-DH do vírus Parameeium bursaria Chlorella 1, foisintetizada pela Firma Entelechon GmbH e clonada no vetor pCR4Topo daFirma Invitrogen (Prod. n° K4510-20). O plasmídeo obtido foi designado comIC 339-222. A seqüência de ácido nucleico sintética que codifica a proteínaUDP-GIc-DH do vírus Parameeium bursaria Chlorella 1, é representada sobSEQ ID n° 6. A seqüência de ácido nucleico correspondente, originalmenteisolada do vírus Paramecium bursaria Chlorella 1, é representada sob SEQID n° 4.

4. Produção do vetor de expressão vegetal IC 341-222, que abrange umaseguência de ácido nucleico codificadora para uma hialuronano sintase dovírus Paramecium bursaria Chlorella 1.

A partir do plasmídeo IC 323-215, por meio de digestão de res-trição com BamH I e Xho I, foram isoladas moléculas de ácido nucleico, gueabrangem a seqüência codificadora da hialuronano sintase e clonadas nospontos de corte BamH I e Xho I do plasmídeo IR 47-71. O vetor de expres-são vegetal obtido foi designado com IC 341-222.

5. Produção do vetor de expressão vegetal IC 349-222, que abrange se-qüências de ácido nucleico codificadoras para uma proteína com a atividadede uma UDP-GIc-DH do vírus Paramecium bursaria Chlorella 1.

A partir do plasmídeo IC 339-222, por meio de digestão de res-trição com BamH I e Kpn I, foram isoladas moléculas de ácido nucleico, gueabrangem a seguência codificadora para uma proteína com a atividade deuma UDP-GIc-DH do vírus Paramecium bursaria Chlorella 1 e clonadas noplasmídeo pA7 cortado pelas mesmas endonucleases de restrição. O plas-mídeo obtido foi designado com IC 342-222. Do plasmídeo IC 342-222, pormeio de digestão de restrição com Xba I e Kpn I foram isoladas moléculasde ácido nucleico, que abrangem a seqüência codificadora para uma proteí-na com a atividade de uma UDP-GIc-DH do vírus Parameeium bursaria C-hlorella 1 e clonadas no vetor de expressão pBinAr Hyg cortado com Xba I eKpn I. O plasmídeo obtido foi designado com IC 349-222.

6. Transformação de plantas, com vetores de expressão vegetal gue contêmmoléculas de ácido nucleico, gue codificam uma hialuronano sintase.

Plantas de batata (cv Désirée) foram transformadas com o vetorde expressão vegetal IC 341-222, gue contém uma seguência de ácido nu-cleico codificadora para uma hialuronano sintase do vírus Parameeium bur-saria Chlorella 1 com o controle do promotor do gene patatina B33 de Sola-num tuberosum (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29) de acordo como método mencionado sob métodos gerais ponto 1. As plantas de batatatransgênicas obtidas, que foram transformadas com o plasmídeo IC 341-222, foram designadas com 365 ES.

7. Análise das plantas transgênicas, que foram transformadas com vetoresde expressão vegetais, que abrangem moléculas de ácido nucleico, que co-dificam uma hialuronano sintase.

a) Criação de uma Série de Calibração

Uma série de calibração foi criada com a utilização das soluçõespadronizadas que acompanham o kit de teste comercial (Kit de Teste ÁcidoHialurônico (HA)da Firma Corgenix, Inc., Colorado, EUA, prod. n° 029-001),de acordo com os processos mencionados pelo fabricante. Para a determi-nação da extinção de 1600 ng/ml de hialuronano, foi empregada a quantida-de dupla, em relação à quantidade determinada pelo fabricante, do padrãoacompanhante, contendo 800 ng/ml de hialuronano. Foram efetuadas trêsséries de medição cada independentes e determinado o respectivo valormédio. Foi obtida a seguinte série de calibração:

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Tabela 3: Valores de medição para a determinação de uma curva de calibra-ção para a determinação quantitativa do teor de hialuronano no tecido vege-tal. Com auxílio do software (Microsoft Office Excel 2002, SP2), os valoresde medição obtidos foram registrados em um diagrama e determinada a e-quação em função da tendência linha de (vide figura 1). E4SOnm designa aextinção com um comprimento de onda de 450 nm, Des. Pad. designa odesvio padrão do valor médio calculado dos valores individuais.b) Análise de tubérculos de batata, das linhas 365 ES

Plantas individuais da linha 365 ES foram cultivadas em terra naestufa em vasos de 6 cm. Cerca de 0,3 g de material de tubérculos de batatadas plantas individuais foi processado em cada caso de acordo com o méto-do descrito sob métodos gerais ponto 2. A quantidade do hialuronano conti-do nos respectivos extratos de plantas, foi determinado com o método des-crito sob métodos gerais ponto 4 e com auxílio da curva de calibração repre-sentada no exemplo 7a) e figura 1. Nesse caso, o sobrenadante obtido apósa centrifugação foi utilizado em uma diluição de 1:10 para a determinação doteor de hialuronano. Para plantas selecionadas foram obtidos os seguintesresultados:

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Tabela 4: Quantidade de hialuronano (em gg de hialuronano por grama depeso fresco), que foi produzido por plantas transgênicas selecionadas, inde-pendentes, da linha 365 ES. A coluna 1 designa a planta, da qual foi colhidomaterial de tubérculo (,,tipo silvestre" designa, nesse caso, plantas, que nãosão transformadas, no entanto, apresentam o genótipo, que foi utilizado co-mo material de partida para a transformação). A coluna 2 indica a quantida-de do material de tubérculo, que foi aplicado para a determinação do teor dehialuronano. A coluna 3 contém a extinção medida de uma diluição 1:10 dorespectivo extrato de planta. A coluna 4 foi calculada com auxílio da equaçãolinear de regressão (vide figura 1) considerando-se o fator de diluição, talcomo segue: ((valor coluna 3 - 0,149)/0,00185) χ 10. Coluna 5 indica aquantidade do hialuronano em relação ao peso seco aplicado e foi calculadatal como segue: (valor coluna 4 / valor coluna 2) / 1000. „n.d." designa quan-tidades não comprováveis.

8. Transformação de plantas, que sintetizam hialuronano, com vetores deexpressão vegetais, que abrangem seqüências de ácido nucleico codificado-ras para uma proteína com a atividade de uma UDP-GIc-DH.

Plantas de batata das linhas 365 ES 13 e 365 ES 74 foramtransformadas, em cada caso, com o vetor de expressão vegetal 349-222,de acordo com o método indicado sob métodos gerais ponto 1.

Claims

1. Célula de planta geneticamente modificada, que apresentauma molécula de ácido nucleico integrada de maneira estável em seu ge-noma, que codifica uma hialuronano sintase, caracterizada pelo fato de quea célula de planta mencionada apresenta adicionalmente uma atividade au-mentada de uma proteína com a atividade de uma UDP-glicose-desidrogenase (UDP-GIc-DH), em comparação com células de plantas detipo silvestre correspondentes não geneticamente modificadas.

2. Célula de planta geneticamente modificada de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a atividade aumentada deuma proteína com a atividade de uma UDP-glicose-desidrogenase (UDP-GIc-DH) é causada pela introdução de uma molécula de ácido nucleico es-tranha na célula da planta.

3. Célula de planta geneticamente modificada de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleicoestranha codifica uma proteína com a atividade de uma UDP-glicose-desidrogenase (UDP-GIc-DH).

4. Célula de planta geneticamente modificada de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que sinte-tiza uma quantidade aumentada de hialuronano em comparação com célulasde plantas, que apresentam a atividade de uma hialuronano sintase e nãoapresentam uma atividade aumentada de uma UDP-glicose-desidrogenase(UDP-GIc-DH).

5. Planta, caracterizada pelo fato de que contem células de plan-tas geneticamente modificadas como definidas em qualquer uma das reivin-dicações 1 a 4.

6. Material de reprodução de plantas como definido na reivindi-cação 5, caracterizado pelo fato de que contem células de plantas genetica-mente modificadas como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a-4.

7. Partes de plantas colhíveis de plantas como definidas na rei-vindicação 5, caracterizadas pelo fato de que contem como definidas emqualquer células de plantas geneticamente modificadas como definidas emqualquer uma das reivindicações 1 a 4.

8. Processo para a produção de uma planta, que sintetiza hialu-ronano, caracterizado pelo fato de quea) uma célula de planta, é geneticamente modificada, sendo quea modificação genética abrange os seguintes estágios i atéii: i) introdução de uma molécula de ácido nucleico es-tranha, que codifica uma hialuronano sintase na célula deplantaii) introdução de uma modificação genética na célula da planta,sendo que a modificação genética leva ao aumento da ativi-dade de uma proteína com a atividade enzimática de umaUDP-glicose-desidrogenase (UDP-GIc-DH) em comparaçãocom células de plantas de tipo silvestre correspondentes nãogeneticamente modificadas,em que os estágios i até ii podem ser efetuados na ordem desejada, indivi-dualmente ou combinações desejadas dos estágios i até ii podem ser efetu-adas simultaneamenteb) uma planta é regenerada de células de plantas do estágio a);c) eventualmente outras plantas são produzidas com auxílio dasplantas de acordo com o estágio b), em que células de plantas eventualmen-te obtidas de plantas do estágio b) ou b) ii são isoladas e os estágios dosprocessos a) até c) são repetidos por tanto tempo, até ser produzida umaplanta, que apresenta uma molécula de ácido nucleico estranha, que codificauma hialuronano sintase e que apresenta uma atividade aumentada de umaproteína com a atividade enzimática de uma GFAT em comparação com cé-lulas de plantas de tipo silvestre correspondentes não geneticamente modifi-cadas.

9. Processo para a produção de hialuronano, caracterizado pelofato de que abrange o estágio da extração de hialuronano de células deplantas geneticamente modificadas como definidas em qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, de plantas como definidas na reivindicação 5, de mate-rial de reprodução como definida na reivindicação 6, de partes de plantascolhíveis como definidas na reivindicação 7 ou de plantas obteníveis confor-me um processo como definida na reivindicação 8.

10. Uso de uma célula de planta geneticamente modificada co-mo definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, de uma planta comodefinida na reivindicação 5, de material de reprodução como definida na rei-vindicação 6, de partes de plantas colhíveis como definidas na reivindicação-7 ou de plantas, obteníveis conforme um processo de acordo com a reivindi-cação 8 o referido uso caracterizado pelo fato de que é para a produção dehialuronano.

11. Composição caracterizada pelo fato de que contem célulasde plantas geneticamente modificadas como definidas em qualquer uma dasreivindicações 1 a 4.

12. Processo para a produção de uma composição contendohialuronano, caracterizado pelo fato de que são utilizadas células de plantasgeneticamente modificadas como definidas em qualquer uma das reivindica-ções 1 a 4, plantas como definidas na reivindicação 5, material de reprodu-ção como definido na reivindicação 6, partes de plantas colhíveis como defi-nidas na reivindicação 7 ou plantas obteníveis conforme um processo comodefinido na reivindicação 8.

13. Uso de células de plantas geneticamente modificadas comodefinidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, de uma planta comodefinida na reivindicação 5, de material de reprodução como definidas nareivindicação 6, de partes de plantas colhíveis de acordo com a reivindica-ção 7 ou de plantas, obteníveis conforme um processo com definido na rei-vindicação 8 o referido uso caracterizado pelo fato de que é para a produçãode uma composição como definida na reivindicação 11.