ES2657825T3 - Métodos y medios para modificar el genoma de una planta en un sitio preseleccionado - Google Patents

Métodos y medios para modificar el genoma de una planta en un sitio preseleccionado Download PDF

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Abstract

Un método para modificar el genoma de una célula de planta de algodón en un sitio predefinido, que comprende las etapas de a. inducir una rotura de ADN de doble cadena en la vecindad de o en dicho sitio predefinido, induciéndose dicha rotura de la doble cadena mediante la introducción en dicha célula de una enzima endonucleasa de escisión rara que reconoce una secuencia de reconocimiento en la vecindad de o en dicho sitio predefinido; b. seleccionar una célula vegetal en la que dicha rotura de ADN de doble cadena se ha reparado dando como resultado una modificación en el genoma en dicho sitio preseleccionado, en el que dicha modificación se selecciona de i. un reemplazo de al menos un nucleótido; ii. una deleción de al menos un nucleótido; iii. una inserción de al menos un nucleótido; o iv. cualquier combinación de i.-iii.; caracterizado por que dicha célula está comprendida dentro del callo embriogénico quebradizo, en donde dicho callo embriogénico quebradizo se ha mantenido en condiciones de luz tenue y en un medio que comprende carbono activo, en donde dichas condiciones de luz tenue implican una intensidad de aproximadamente 1 a 7 μmol m2 s-1 con un fotoperiodo de aproximadamente 16 horas de luz/8 horas de oscuridad.

Description

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[51] La enzima endonucleasa puede, pero no necesita comprender una señal de localización nuclear (NLS) (Raikhel, Plant Physiol. 100: 1627-1632 (1992) y referencias en el mismo) tal como el NLS del antígeno T grande de SV40 (Kalderon et al. Cell 39: 499-509, 1984). La señal de localización nuclear puede estar ubicada en cualquier parte de la proteína, pero está ubicada convenientemente en el extremo N-terminal de la proteína. La señal de localización nuclear puede reemplazar a uno o más de los aminoácidos de la enzima inductora de la rotura de la doble cadena.
[52] La inducción de una rotura de la doble cadena en un sitio preseleccionado permite varias aplicaciones potenciales. Si no se introduce ADN reparador extraño, la región de ADN cerca del sitio de reconocimiento de endonucleasa puede alterarse por deleción, reemplazo o inserción de uno o varios a muchos nucleótidos. De ese modo, la formación de deleciones o inserciones pequeñas o más grandes en el sitio preseleccionado puede, por ejemplo, inactivar el gen que comprende la secuencia de nucleótidos del sitio preseleccionado/sitio de reconocimiento. Si las regiones de ADN genómico localizadas aguas arriba y aguas abajo del sitio preseleccionado o del sitio de reconocimiento tienen suficiente homología entre sí para permitir la recombinación entre la región de ADN aguas arriba y aguas abajo, la región de ADN intermedia, es decir, la región de ADN entre las dos regiones homólogas aguas arriba y aguas abajo de ADN puede ser eliminada (en bucle). Esto se puede utilizar, por ejemplo, para separar secuencias previamente introducidas tal como genes marcadores tal como se describe, p. ej., en el documento WO 06/105946.
[53] Si la inducción de la rotura de ADN de doble cadena va acompañada de la introducción de una molécula de ADN reparador extraño que se utiliza como molde, la reparación de la rotura de la doble cadena puede producirse básicamente de tres maneras. El ADN reparador puede integrarse en el ADN genómico en el sitio DSB por unión no homóloga en ambos extremos, o si una o dos regiones flanqueantes con homología con las regiones de aguas arriba y/o aguas abajo del sitio preseleccionado están presentes en el ADN reparador, la integración del ADN reparador también puede producirse (parcialmente) a través de la recombinación homóloga. Como tal, la rotura de la doble cadena en el sitio preseleccionado facilitará también el reemplazo de una región de ADN en la vecindad de ese sitio por una región de ADN de interés, p. ej., tal como se describe en los documentos WO 06/105946, WO08/037436 o WO08/148559.
[54] Para insertar un ADN extraño mediante recombinación homóloga en el sitio preseleccionado, el ADN extraño puede comprender al menos una región de ADN flanqueante que tiene una secuencia de nucleótidos que es similar a la secuencia de nucleótidos de la región de ADN de aguas arriba o aguas abajo del sitio preseleccionado. El ADN extraño también puede comprender dos regiones flanqueantes de ADN, ubicadas en extremos opuestos de la molécula y que tienen suficiente homología con la secuencia de nucleótidos de la región de ADN de aguas arriba y aguas abajo del sitio preseleccionado, respectivamente, para permitir la recombinación entre dichas regiones flanqueantes y dicha región de aguas arriba y aguas abajo.
Como se utiliza en esta memoria, “un sitio preseleccionado” o “un sitio predefinido” indica una secuencia de nucleótidos particular en el genoma nuclear de la planta, ubicada en o cerca de la secuencia de ADN diana, en la que se desea insertar el ADN extraño o intercambiar la secuencia de ADN diana. Una persona experta en la técnica podría elegir una enzima inductora de la rotura de ADN de doble cadena ("DSBI") que reconozca la secuencia de nucleótidos diana seleccionada o modificar una endonucleasa DSBI de ese tipo. Alternativamente, se puede introducir un sitio de reconocimiento de endonucleasa DSBI en el genoma de la planta utilizando cualquier método de transformación convencional o mediante reproducción convencional utilizando una línea de planta que tenga un sitio de reconocimiento de endonucleasa DSBI en su genoma, y cualquier ADN extraño deseado puede ser introducido después de ello en el sitio diana preseleccionado, previamente introducido.
[55] Tal como se utiliza en esta memoria, "ubicado en la vecindad" se refiere al sitio de inducción de la rotura de la doble cadena del ADN, es decir, el sitio de reconocimiento de la endonucleasa, que se encuentra a una distancia de entre 500 pb, 1 kpb, 2 kpb, 3 kpb, 4 kpb, 5 kpb a 10 kpb del sitio predefinido, es decir, el sitio en el ADN genómico que se va a modificar (el sitio diana).
[56] Tal como se utiliza en esta memoria, "una región de ADN flanqueante" es un ADN con una secuencia de nucleótidos que tiene homología con las regiones de ADN, respectivamente aguas arriba y/o aguas abajo de la secuencia de ADN diana o del sitio preseleccionado. Esto permite controlar mejor la precisión de la modificación prevista. De hecho, la integración mediante recombinación homóloga permitirá una unión precisa del fragmento de ADN extraño al genoma nuclear de la planta hasta el nivel de nucleótidos.
[57] Para tener suficiente homología para la recombinación, las regiones de ADN flanqueantes del ADN reparador pueden variar en longitud, y deberían ser de al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud. Sin embargo, la región flanqueante puede ser tan larga como sea prácticamente posible (p. ej., hasta aproximadamente 100-150 kb tal como cromosomas artificiales bacterianos completos (BACs). Preferiblemente, la región flanqueante será de aproximadamente 50 pb a aproximadamente 2000 pb. Además, las regiones que flanquean el ADN extraño de interés no necesitan ser idénticas a las regiones de ADN que flanquean el sitio preseleccionado y pueden tener entre aproximadamente 80% y aproximadamente 100% de identidad de la secuencia, de preferencia aproximadamente 95% a aproximadamente 100% de identidad de la secuencia con las regiones de ADN que flanquean al sitio preseleccionado. Cuanto más larga sea la región flanqueante, menos estricto será el requisito de homología. Además, se prefiere que la identidad de secuencia sea tan alta como sea posible en la práctica en la vecindad del DSB. Además, para lograr el intercambio de la secuencia de ADN diana sin cambiar la secuencia de ADN de las
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secuencias de ADN adyacentes, las secuencias de ADN flanqueantes deberían ser preferiblemente idénticas a las regiones de ADN aguas arriba y aguas abajo que flanquean el sitio preseleccionado o la secuencia de ADN diana destinada a ser intercambiada. Se aplican los mismos criterios para la recombinación entre la región aguas arriba y aguas abajo que tienen homología entre sí para separar las secuencias de ADN intermedias.
[58] Además, las regiones que flanquean el ADN extraño de interés no necesitan tener homología con las regiones que flanquean inmediatamente el sitio preseleccionado, sino que pueden tener homología con una región de ADN del genoma más alejada de ese sitio preseleccionado. La recombinación homóloga entre el ADN genómico y el ADN reparador dará como resultado una separación del ADN diana entre el sitio de inserción preseleccionado y la región de ADN de homología. En otras palabras, el ADN diana ubicado entre las regiones de homología será sustituido por el ADN extraño entre las regiones flanqueantes. Cuando el ADN reparador consiste sólo en las dos secuencias flanqueantes, es decir, carece de cualquier secuencia intermedia, este enfoque puede utilizarse para eliminar específicamente la región genómica ubicada entre las dos regiones de homología.
[59] Resultará claro que, en el caso en el que las regiones de homología estén presentes en el ADN reparador extraño, también se pueden utilizar recombinasas específicas para el sitio para llevar a cabo los métodos de la invención. Las recombinasas específicas para el sitio requieren dos sitios de reconocimiento, que pueden ubicarse en la misma molécula de ADN, pero también en dos moléculas de ADN diferentes, entre las cuales se produce la recombinación. De este modo, un ADN reparador que comprende al menos un sitio de reconocimiento de este tipo puede dirigirse a un locus genómico que también comprende al menos uno de dichos sitios. Ejemplos de recombinasas específicas para el sitio son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, el sistema Cre-Lox del bacteriófago P1 (Austin et al., 1981, Cell, 25:729-736), el sistema Flp-Frt de Saccharomyces, cerevisiae (Broach et al., 1982, Cell, 29:227-234), el sistema R-RS de Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al., 1985. J. MoL Biol., 182: 191-203) y la integrasa del fago PhiC31 de Streptomyces (Thorpe y Smith, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 55055510; Groth et al., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 5995-6000).
[60] El ADN extraño también puede comprender un marcador seleccionable o rastreable, que puede o no separarse después de la inserción tal como se describe, p. ej., en los documentos WO06/105946, WO08/037436 y WO08/148559.
[61] “Marcadores seleccionables o rastreables”, tal como se utilizan en esta memoria, tienen el significado habitual en la técnica e incluyen, pero no se limitan a fosfinotricina acetiltransferasa, neomicina fosfotransferasa, glifosato oxidasa, enzima EPSP tolerante al glifosato, gen nitrilasa, acetolactato sintasa mutante o gen acetohidroxiácido sintasa, β-glucoronidasa (GUS), genes de locus R, proteína fluorescente verde y similares. Marcadores seleccionables pueden proporcionar tolerancia o resistencia a compuestos de selección tales como fosfinotricina, neomicina, glifosato, higromicina, herbicidas inhibidores de ALS (p. ej., sulfonilurea y similares) o pueden proporcionar otros medios para seleccionar o enriquecer las células en las que ha tenido lugar la modificación deseada, p. ej., por medios visuales (tinción de GUS, fluorescencia).
[62] La selección de la célula vegetal o planta en la que el marcador seleccionable o rastreable y el resto de la molécula de ADN extraña se ha introducido por recombinación homóloga a través de las regiones de ADN flanqueantes puede lograrse, p. ej., seleccionando la ausencia de secuencias presentes en el ADN transformante, pero ubicadas fuera de las regiones de ADN flanqueantes. De hecho, la presencia de secuencias del ADN transformante fuera de las regiones de ADN flanqueantes indicaría que la formación de las células vegetales transformadas se realiza por inserción aleatoria de ADN. Con este fin, se pueden incluir marcadores seleccionables
o rastreables en la molécula de ADN transformante fuera de las regiones de ADN flanqueantes, que luego se pueden utilizar para identificar aquellas células vegetales que no tienen los marcadores seleccionables o rastreables localizados fuera del ADN transformante y que pueden haber surgido por recombinación homóloga a través de las regiones de ADN flanqueantes. Alternativamente, la molécula de ADN transformante puede contener marcadores seleccionables fuera de las regiones de ADN flanqueantes que permiten la selección para la ausencia de tales genes (genes marcadores de selección negativos).
[63]
Resultará claro que los métodos de acuerdo con la invención permiten la inserción de cualquier ADN de interés, incluyendo ADN que comprenda una secuencia de nucleótidos con una firma de secuencia de nucleótidos particular,
p.
ej., para la identificación posterior. El ADN de interés también puede ser uno o más genes expresables en plantas, incluyendo pero no limitados a un gen de tolerancia a herbicidas, un gen de resistencia a insectos, un gen de resistencia a enfermedades, un gen de resistencia al estrés abiótico, un gen que codifica una enzima implicada en la biosíntesis de aceite o la biosíntesis de hidratos de carbono, un gen que codifica una enzima implicada en la resistencia de las fibras y/o longitud de las fibras, un gen que codifica una enzima implicada en la biosíntesis de metabolitos secundarios.
[64] Genes de tolerancia a herbicidas incluyen un gen que codifica la enzima 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS). Ejemplos de genes EPSPS de este tipo son el gen AroA (CT7 mutante) de la bacteria Salmonella typhimurium (Comai et al., 1983, Science 221, 370-371), el gen CP4 de la bacteria Agrobacterium sp. (Barry et al., 1992, Curr. Topics Plant Physiol. 7, 139-145), los genes que codifican un EPSPS de Petunia (Shah et al., 1986, Science 233, 478-481), un EPSPS de Tomate (Gasser et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 4280-4289) o un EPSPS de Eleusina (documento WO 01/66704). También puede ser un EPSPS mutado tal como se describe, por ejemplo, en los documentos EP 0837944, WO 00/66746, WO 00/66747 o WO 02/26995. Plantas tolerantes al glifosato también
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documentos WO 2006/032538, WO 2007/039314, WO 2007/039315, WO 2007/039316, JP 2006304779 y WO 2005/012529.
[72] La persona experta en la técnica apreciará que, además del genoma nuclear, los métodos de la invención también se pueden aplicar para modificar, p. ej., el genoma del cloroplasto o el genoma mitocondrial, por lo que la inducción de DSB en el sitio predefinido puede ser adicionalmente potenciado al proporcionar la señal de fijación de objetivo correcta a la enzima endonucleasa.
[73] También se describen células de plantas de algodón y plantas generadas de acuerdo con los métodos de la invención. Plantas de este tipo pueden contener una secuencia de ADN heterólogo o extraño insertada en o en lugar de una secuencia diana o pueden contener una deleción, y sólo serán diferentes de sus plantas progenitoras por la presencia de la modificación particular.
[74] Tal como se describe, las células vegetales de la invención, es decir, una célula vegetal que comprende la combinación de ADN-T así como células vegetales generadas de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria que comprenden la modificación genómica deseada, pueden ser células no propagantes.
[75] Las plantas de algodón obtenidas mediante los métodos descritos en esta memoria pueden cruzarse adicionalmente mediante técnicas de reproducción tradicionales con otras plantas para obtener plantas de progenie que comprenden la modificación fijada como objetivo.
[76] Las plantas y semillas de algodón descritas en esta memoria pueden tratarse adicionalmente con un compuesto químico, tal como un compuesto químico seleccionado de las siguientes listas:
•
Herbicidas: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfen, Prometrin, Trifluralin, Carfentrazon, Cletodim, Fluazifopbutilo, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Piritiobac-sódico, Trifloxisulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazin, Tidiazuron
•
Insecticidas: acefato, aldicarb, clorpirifos, cipermetrina, deltametrina, abamectina, acetamiprid, emamectina benzoato, imidacloprid, indoxacarb, lambda-cihalotrina, spinosad, tiodicarb, gamma-cialotrina, espiromesifeno, piridalil, flonicamid, flubendiamida, triflumuron, Rynaxypyr, beta-ciflutrina, Espirotetramato, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid, Dinetofuran, Flubendiamida, Cyazypyr, Spinosad, Spinotoram, gamma Cihalotrina, 4 -[[(6-Clorpiridin-3il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, Tiodicarb, Avermectina, Flonicamid, Piridalil, Spiromesifen, Sulfoxaflor
•
Fungicidas: Azoxistrobina, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Clorotalonil, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobina, Epoxiconazol, Fenamidona, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobina, Fluxapiroxad, Iprodiona, Isopirazam, Isotianilo, Mancozeb, Maneb, Metominostrobina, Pentiopirad, Picoxistrobina, Propineb, Protioconazol, piraclostrobina, quintozeno, tebuconazol, tetraconazol, tiofanato-metilo, trifloxistrobina
[77] Algodón, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier variedad de algodón existente. Por ejemplo, la célula de la planta de algodón puede ser de una variedad útil para el cultivo de algodón. Las variedades de algodón más utilizadas son Gossypium barbadense, G. hirsutum, G. arboreum y G. herbaceum. Otras variedades incluyen G. africanum y G. raimondii.
[78] Ejemplos de plantas de algodón descritas en esta memoria incluyen aquellas de las que se puede derivar callo embriogénico, tales como Coker 312, Coker310, Coker 5Acala SJ-5, GSC25110, FIBERMAX 819, Siokra 1-3, T25, GSA75, Acala SJ2, Acala SJ4, Acala SJ5, Acala SJ-C1, Acala B1644, Acala B1654-26, Acala B1654-43, Acala B3991, Acala GC356, Acala GC510, Acala GAM1, Acala C1, Acala Royale, Acala Maxxa, Acala Prema, Acala B638, Acala B1810, Acala B2724, Acala B4894, Acala B5002, no Acala “picker” Siokra, variedad "stripper" FC2017, Coker 315, STONEVILLE 506, STONEVILLE 825, DP50, DP61, DP90, DP77, DES119, McN235, HBX87, HBX191, HBX107, FC 3027, CHEMBRED A1, CHEMBRED A2, CHEMBRED A3, CHEMBRED A4, CHEMBRED B1, CHEMBRED B2, CHEMBRED B3, CHEMBRED C1, CHEMBRED C2, CHEMBRED C3, CHEMBRED C4, PAYMASTER 145, HS26, HS46, SICALA, PIMA S6 ORO BLANCO PIMA, FIBERMAX FM5013, FIBERMAX FM5015, FIBERMAX FM5017, FIBERMAX FM989, FIBERMAX FM832, FIBERMAX FM966, FIBERMAX FM958, FIBERMAX FM989, FIBERMAX FM958, FIBERMAX FM832, FIBERMAX FM991, FIBERMAX FM819, FIBERMAX FM800, FIBERMAX FM960, FIBERMAX FM966, FIBERMAX FM981, FIBERMAX FM5035, FIBERMAX FM5044, FIBERMAX FM5045, FIBERMAX FM5013, FIBERMAX FM5015, FIBERMAX FM5017 o FIBERMAX FM5024 y plantas con genotipos derivados de las mismas. Estos son adecuados para aplicar los métodos arriba descritos.
[79] Tal como se utiliza en esta memoria, "que comprende(n)" debe interpretarse como que especifica la presencia de las características, los números enteros, las etapas o los componentes mencionados, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, números enteros, etapas o componentes o grupos de los mismos. Por lo tanto, p. ej., un ácido nucleico o una proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos que los realmente citados, es decir, puede estar embebida en un ácido nucleico o una proteína más grande. Un gen quimérico que comprende una región de ADN que se define funcional o estructuralmente puede comprender regiones de ADN adicionales, etc.
[80] El término "planta" también incluye la progenie de plantas que conservan las características distintivas de los parentales tales como la semilla obtenida por autofecundación o cruzamiento, p. ej., semilla híbrida, plantas híbridas y partes de plantas derivadas de la misma.
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[81] Tal como se utiliza en esta memoria, "parte de planta" incluye cualquier órgano de la planta o tejido de la planta, incluyendo, pero no limitado a frutos, semillas, embriones, fibras, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, flores, gametofitos, esporofitas, polen y microesporas.
[82] Los términos "proteína" o "polipéptido", tal como se utilizan en esta memoria, describen un grupo de moléculas que consiste en más de 30 aminoácidos, mientras que el término "péptido" describe moléculas que consisten en hasta 30 aminoácidos. Las proteínas y los péptidos pueden formar, además, dímeros, trímeros y oligómeros superiores, es decir, consisten en más de una molécula de (poli)péptido. Las moléculas de proteínas o péptidos que forman tales dímeros, trímeros, etc. pueden ser idénticas o no idénticas. Las estructuras de orden superior correspondientes se denominan, por consiguiente, homodímeros o heterodímeros, homotrímeros o heterotrímeros, etc. Los términos "proteína" y "péptido" también se refieren a proteínas o péptidos modificados de forma natural, en los que la modificación se realiza, p. ej., mediante glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Modificaciones de este tipo son bien conocidas en la técnica.
[83] Para el propósito de esta invención, la "identidad de secuencia" de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos relacionadas, expresada como un porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias óptimamente alineadas que tienen residuos idénticos (x100), dividido por el número de posiciones comparadas. Un hueco, es decir, una posición en un alineamiento en donde un residuo está presente en una secuencia pero no en la otra, se considera como una posición con residuos no idénticos. El alineamiento de las dos secuencias se realiza mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970). El alineamiento de secuencia asistido por ordenador anterior, puede realizarse convenientemente utilizando un programa de software estándar tal como GAP que es parte del Paquete Wisconsin Versión 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, EE.UU), utilizando la matriz de puntuación por defecto con una penalidad de creación del hueco de 50 y una penalidad por extensión del hueco de 3.
[84] La lista de secuencias contenida en el archivo denominado "BCS11-2008_WO_ST25", que es de 59 kilobytes (tamaño medido en Microsoft Windows®), contiene 4 secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4, se archiva mediante presentación electrónica y se incorpora en esta memoria como referencia.
[85] Los siguientes Ejemplos no limitantes describen métodos para modificar el genoma de una célula de planta de algodón utilizando una enzima DSBI y métodos de administración tanto mediada por Agrobacterium como administración directa en callo embriogénico.
[86] A menos que se indique lo contrario en los Ejemplos, todas las técnicas de ADN recombinante se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándares tal como se describe en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Los materiales y métodos estándares para el trabajo molecular de plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Cray, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Otras referencias para técnicas de biología molecular estándar incluyen Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, segunda edición, Academic Press (Reino Unido). Los materiales y métodos estándares para las reacciones en cadena de la polimerasa se pueden encontrar en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson et al. (2000) PCR – Basics: From Background to Bench, primera edición, Springer Verlag, Alemania.
[87]
EJEMPLOS
Ejemplo 1: construcción del vector
[88] Utilizando técnicas de ADN recombinante estándares se construyeron los siguientes vectores de ADN que comprenden los siguientes elementos enlazados operativamente (representados esquemáticamente en las figuras 1 y 2):
[89] Vector de ADN diana pTCV117 (SEC ID NO 1)
•
LB: límite izquierdo del ADN-T (nt 12540-12564)
•
Sitio l-Scel (nt 31-14)
•
3 'nos: secuencia que incluye la región 3' no traducida del gen de la nopalina sintasa del ADN-T de pTiT37 (Depicker et al., 1982) (nt 32-220, complemento inverso)
•
Barra: región codificadora del gen BAR de Streptomyces hygroscopicus (nt 240-791, complemento inverso)
•
5'cab22L: secuencia que incluye la secuencia conductora del gen de la proteína de unión a clorofila a/b de Petunia hybrida (Harpster et al., 1988) (nt 801-857, complemento inverso)
•
P35S2: promotor 35S (nt 858-1405, complemento inverso)
10
15
20
25
30
35
40
•
3 'g7: terminación del extremo 3’ y región de poliadenilación del gen 7 de Agrobacterium tumefaciens octopina tipo ADN-T (nt 1612-1409, complemento inverso)
•
Sitio de reconocimiento de l-Scel (nt 1643 -1617)
•
intron 1 h3At: secuencia que incluye el primer intrón del gen II de la variante de histona H3.III de Arabidopsis thaliana (Chaubet et al., 1992) (nt 1662-2127)
•
TPotpC: secuencia codificadora del péptido de tránsito optimizado, que contiene la secuencia de los genes de la subunidad pequeña RuBisCO de Zea mays (maíz) y Helianthus annuus (girasol), tal como se describe por Lebrun et al. (1996), (nt 2145 -2510)
•
2mepsps: región codificadora de EPSPS doble mutante del maíz (nt 2517-3852)
•
3 'histonAt: secuencia que incluye la región 3 ' no traducida del gen de histona H4 de Arabidopsis thaliana (Chaboute et al., 1987) (nt 3871-4537)
•
RB: límite derecho de ADN-T (nt 4594-4618)
[90] Vector de ADN reparador pTIB232 (SED ID NO 2):
•
LB: límite izquierdo del ADN-T (nt 25-1)
•
bar (del1-403): fragmento 5' del gen BAR de Streptomyces hygroscopicus (nt 46-448, complemento inverso)
•
5'cab22L: secuencia que incluye la secuencia conductora del gen de la proteína de unión a clorofila a/b de Petunia hybrida (Harpster et al., 1988) (nt 458-514, complemento inverso)
•
P35S2: promotor 35S (nt 515-1062, complemento inverso)
•
3’g7: Terminación del extremo 3' y región de poliadenilación del gen 7 de Agrobacterium tumefaciens octopina tipo ADN-T (nt1409-1612)
•
Pcsvmv XYZ: fragmento del promotor CsVMV (1285-1724)
•
5'csvmv: conductor del promotor CsVMV (nt 1725-1797)
•
hyg-1Pa: gen de resistencia a higromicina de E. coli (nt 1804-2829)
•
3’35S: terminación de la transcripción de 3’ 35S y región de poliadenilación (nt 2841-3065)
•
2mepsps (5 'del): fragmento 3' del gen EPSPS doble mutante del maíz (nt 3096-3501)
•
3'histonAt: región del extremo 3’ del gen de la histona 4 de Arabidopsis (nt 3520-4186)
•
RB: límite derecho de ADN-T (nt 4267-4243)
[91] ADN reparador y vector de expresión de endonucleasa pTIB236 (SEC ID NO 3):
•
LB: límite izquierdo del ADN-T (nt 1-25)
•
3’35S: terminación de la transcripción de 35S y región de poliadenilación (nt 104-328, complemento inverso)
•
hyg-1 Pa: gen de resistencia a higromicina de E. coli (nt 340-1365, complemento inverso)
•
5'csvmv: conductor del promotor CsVMV (nt 1372-1444, complemento inverso)
•
Pcsvmv XYZ: fragmento del promotor CsVMV (1445-1884, complemento inverso)
•
3'35S: región de poliadenilación de 35S (nt 1963-2097, complemento inverso)
•
l-Scel: región codificadora de Scel de código universal (nt 2185-2919, complemento inverso)
•
NLSsv40: señal de localización nuclear de SV40 (nt-2887-2910-, complemento inverso)
•
5'ats1 b: secuencia conductora del gen rbcS ATS1A de Arabidopsis thaliana (nt 2936-2976, complemento inverso)
•
P35S2: promotor 35S (nt 2976-3496, complemento inverso)
•
RB: límite derecho de ADN-T (nt 4592-5655)
[92] Vector de expresión de endonucleasa ptrr26 (SEQ ID NO 4) que comprende la región codificadora de I-Scel de código universal (documento WO 2006/074956):
•
RB: límite derecho de ADN-T
•
P35S2: promotor 35S
•
5'ats1b: secuencia conductora del gen rbcS ATS1A de Arabidopsis thaliana
imagen9
imagen10
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30
35
40
45
50
[98] Por lo tanto, se construyó un nuevo ADN reparador pTIB232 con regiones de homología con el ADN diana, que comprende un gen de resistencia a la higromicina impulsado por CSVMV flanqueado en un extremo por un fragmento 3’ del gen epsps (permitiendo la recombinación homóloga con el gen EPSPS en el locus diana, reemplazando así la parte 5' del gen EPSPS por el gen higromicina) y en el otro extremo flanqueado por un promotor 35S enlazado a un fragmento génico de 5' bar), tal como se indica esquemáticamente en la Figura 1. Las plantas diana pTCV117 se transformaron con el vector pTIB232 y el vector ptrr26 que comprende una región codificadora de l-Scel de código universal operativamente enlazada a un promotor 35S utilizando bombardeo de partículas tal como se describe en el Ejemplo 4.
[99] En primer lugar, se rastrearon transformantes en cuanto a la tolerancia a la higromicina, ya que esto indica la inserción del ADN reparador de pTIB232. Los eventos HygR se evaluaron posteriormente para la pérdida de resistencia a glifosato, que es indicativa de recombinación en el locus diana. Los 36 recombinantes hygR y GlyS así obtenidos se caracterizaron adicionalmente por análisis de PCR utilizando el par de cebadores P3 xP4 que reconoce la región genómica aguas arriba del gen EPSPS y el gen de higromicina (Figura 1). Esto dio como resultado la identificación de 8 eventos potenciales de selección de genes correctos (reemplazo de la parte 5' del gen epsps por el gen de higromicina por recombinación homóloga al menos unilateral: configuración I en la Figura 1), que posteriormente se confirmó que era de hecho corregir los eventos de fijación como objetivo génico por análisis de la secuencia del producto de PCR obtenido por el conjunto de cebadores P3, P4).
Ejemplo 8: Inserción fijado como objetivo a través de unión en los extremos no homóloga
[100] Plantas pTCV117 se transformaron con ADN reparador y vector de expresión de endonucleasa pTIB236, que comprende un gen higR funcional y un gen codificador de I-Scel de código universal funcional, sin homología con el sitio diana (véase la Figura 2), utilizando transferencia de ADN mediada por Agrobacteruim tal como se describe en el Ejemplo 5.
[101] Los 200 eventos hygR que se obtuvieron de este modo se analizaron mediante PCR utilizando 2 pares de cebadores P1xP2 y P3xP4; el par de cebadores P1xP2 que reconoce el gen hygR y la región genómica aguas abajo del gen bar y el otro par que reconoce la región genómica aguas arriba del gen EPSPS y el gen de higromicina (Figura 2). Esto resultó en la identificación de 17 eventos potenciales de inserción/reemplazo fijados como objetivo. El análisis de secuencia realizado en 4 de estos eventos demostró que en realidad eran eventos de inserción/reemplazo fijados como objetivo (configuración I, II en la Figura 2).
Ejemplo 9: Inserción o reemplazo fijado como objetivo a través de unión no homóloga de los extremosutilizando transformación mediada por Agrobacterium
[102] La línea diana G4GH198-01901 se transformó tal como se describe en el Ejemplo 5 con la cepa de Agrobacterium A5280=EHA101 (pTIB236) que comprende el ADN reparador y el vector de expresión de endonucleasa pTIB236.
[103] Se seleccionaron eventos resistentes a la higromicina (HygR), de los cuales 200 se analizaron por PCR para la inserción del gen hyg en el o los sitios de I-Scel diana utilizando los pares de cebadores P1xP2 y P3xP4. De estos 200 eventos, se encontró que aproximadamente el 10% eran eventos específicos. El análisis de la secuencia de algunos de estos eventos específicos reveló que el gen bar había sido reemplazado por el gen hyg o que el gen hyg había sido insertado junto al gen bar (evento apilado).
Ejemplo 10: Inducción de la rotura de la doble cadena fijada como objetivo utilizando una meganucleasa diseñada a medida
[104] Callos embriogénicos de plantas de algodón resistentes a PPT que contienen un gen quimérico que comprende el gen bar bajo el control del promotor CSVMV se transformaron mediante bombardeo de partículas con un vector que comprende un gen quimérico que codifica una meganucleasa modificada a medida que reconoce una secuencia diana en el gen bar, como una cadena sencilla (pCV170: SEQ ID NO 5) o como un heterodímero (pCV177: SEQ ID NO 6). Se realizó una co-administración del vector de meganucleasa con un vector que contiene el gen 2 mEPSPS bajo el control de un promotor expresable en plantas que confiere tolerancia a glifosato como un gen marcador seleccionable. Se obtuvieron aproximadamente 3000 callos resistentes al glifosato, de los cuales 85 eventos parecían sensibles a PPT, lo cual indica una alteración del gen bar. De estos, se caracterizaron 79 eventos para el genotipo mediante PCR utilizando cebadores que flanquean el sitio diana y la secuenciación posterior del producto de PCR (tabla 1).
Tabla 1: Caracterización de eventos de transformación resistentes a glifosato sensibles a PPT. La ausencia de un producto de PCR es indicativa de una deleción grande alrededor del sitio diana.
pCV170 (sc) Producto PCR obtenible
imagen11 nº eventos cambio en sitio diana nº eventos
no sí
11 8 deleción grande sin mutación reemplazo/inserción deleción 11 6 1 1
pCV177 (hd) Producto PCR obtenible
imagen12 nº eventos cambio en sitio diana nº eventos
no sí
33 27 deleción grande sin mutación Inserción deleción 33 19 4 4
[105] Por lo tanto, estos resultados demuestran que es posible inducir una rotura de ADN de doble cadena fijada como objetivo en la posición deseada con una meganucleasa de cadena sencilla así como una meganucleasa heterodímérica diseñada específicamente y que pueden obtenerse deleciones fijadas como objetivo, reemplazos e inserciones. usando estas meganucleasas en algodón.

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  1. imagen1
    imagen2
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