CN112695041B - ZmSBP28基因在调控玉米株型中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了ZmSBP28基因在调控玉米株型中的用途。本发明发现将玉米中ZmSBP28基因进行敲除突变，与野生型相比，突变株的穗上叶上冲且挺立，叶夹角变小，株型明显变得紧凑。本发明提供了一种应用ZmSBP28基因培育株型紧凑或耐密植株型玉米新品种的方法，包括：将玉米中的ZmSBP28基因进行突变，筛选得到的株型紧凑或耐密植株型玉米新品种。本发明为培育耐密株型或具有耐密特性的优良高产玉米新品种提供了新的基因资源。
Description
技术领域
本发明涉及ZmSBP28基因的新用途，尤其涉及ZmSBP28基因在调控玉米株型中的用途，属于ZmSBP28基因的新用途领域。
背景技术
玉米是中国第二大粮食作物，常年种植面积2545万公顷左右，播种面积和总产占粮食作物的25％和28％左右。随着耕地面积的减少、人口的不断增加，玉米消费量则呈刚性增加。因此，提高单产、增加总产是玉米育种长期追求的重要目标。中国黄淮海玉米产区平均亩产不到400公斤，种植密度为3500-4500株/亩。因此，提高单产、增加总产的最大潜力在于提高种植密度。然而，增加玉米种植密度会使得群体中红光与远红光比值大幅度降低(R/FR<1.0)，从而激发了玉米的避荫反应，导致一系列不良后果，包括植株分枝减少、穗位增高、茎秆机械强度下降、易倒伏、早衰、空秆、光效利用率降低等，最终导致产量降低(Libenson et al.,2002；Robson et al.,2010；Weinig et al.,2006)。
叶夹角是玉米株型最重要农艺性状之一，尽管有关玉米叶夹角的QTL被定位，但到目前为止还没有通过图位克隆技术获得相应的候选基因。而一些与玉米叶夹角相关的基因通过比较基因组学和突变体技术被研究。Ku等(2011)利用比较基因组学方法，克隆了位于第二染色体上的qLA2的候选基因。研究表明，紧凑型亲本自交系豫82和松散型亲本自交系沈137其5’-UTR端”CTCC”变为”CCCC”，影响了ZmTAC1的表达水平，从而进一步影响叶夹角的大小，由此表明ZmTAC1基因表达水平的高低是通过5’-UTR位点序列‘CTCC'–‘CCCC'的变化调控的。Moreno等(1997)对lgl突变体的研究发现，该突变体为ligulelessl基因表达缺失突变体，该突变体表现为不能形成叶舌和叶耳，叶片和叶鞘的连接处不能够发育。利用活化剂(Ac)转座因子作为一个分子标签，将lgl的等位基因lgl-ml从中分离和克隆出来，研究证实LG1基因以一种细胞自主方式产生功能。Juarez等(2004)发现rld1和lbl1突变体表现出近轴/向上的叶部形态。通过克隆其相对应的基因发现，rld1编码一个HD-ZIPIII蛋白，通过远轴端的miR166-directed的转录裂解限定了空间近轴端表达。半显性Rldl-O突变体在miR166互补位点一个单核苷酸替换导致远轴端的突变体转录本的持续表达，这引起叶子偏向近轴端。遗传分析表明lbl1和Rldl-O彼此相互抑制，说明这2个基因在同一路径中起作用。对yabby基因的研究发现其直接引起侧生器官向外生长。
研究表明，历史上玉米品种更新的过程伴随着有利于密植的株型相关性状的改变，包括株高和穗位高降低，开花提早，雌雄开花间隔下降，叶片上冲，雄穗变小和雄穗分枝数减少等(Duvick and Cassman,1999；Hammer et al.,2009；Lauer et al.,2012；谢振江等，2007)，进一步证明了株型改良对玉米密植的重要性。因此，通过对株型性状基因的图位克隆和分子机理解析，探索耐密高产分子标记辅助育种技术，能够为选育耐密株型和耐密特性的优良高产玉米品种提供理论和技术支撑。
与已鉴定的QTL相比，已鉴定出的与叶夹角有关的基因数目远远不够，说明大量的与叶夹角相关的基因尚未得到鉴定。ZmSBP28基因是Squamosa启动子结合蛋白基因，其分子生物学功能目前在植物中尚未报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供ZmSBP28基因在调控玉米株型中的新用途；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明利用CRISPR/Cas9技术对ZmSBP28基因的两个靶位点进行基因编辑构建得到CRISPR/Cas9载体，将所构建的CRISPR/Cas9载体经过PCR测序验证无误后通过农杆菌介导的方法转化玉米自交系ZC01。通过表型观察和测量统计发现，WT叶片较软，穗上叶的叶尖向下耷拉，造成大田栽培中穗上叶相互遮挡；相比之下，SBP28突变株明显紧凑，穗上叶叶片上冲且挺立，相互遮挡较少，有利于更好的吸收阳光。
本发明进一步通过统计分析显示，SBP28突变株穗上叶的叶夹角均小于WT。根据SBP28突变株和WT穗位节和穗上位节叶片大小比较可见，SBP28突变株穗位叶和穗上叶的叶长和叶宽均比WT小；生物切片观察结果和木质素、纤维素含量测定结果显示：SBP28突变株的叶脉明显大于WT，SBP28突变株叶脉两侧有较大的维管组织，而WT叶脉中没有类似结构，这说明SBP28突变株叶脉木化程度要强；进一步通过红外光谱测定结果显示SBP28突变株叶脉中的纤维素和木质素含量均高于WT。
总之，通过表型观察和测量统计分析可见，相比WT，成熟SBP28突变株的株型穗上叶上冲且挺立，叶夹角变小，株型明显变得紧凑。上述试验结果证明ZmSBP28基因通过调控玉米叶夹角、雄穗分枝夹角、穗上叶挺立、茎秆木化强度等调控玉米株型。
因此，ZmSBP28基因在培育耐密株型或具有耐密特性的优良高产玉米新品种等方面具有重要的应用前景。相应的，可以将ZmSBP28基因应用于调控玉米株型或培育耐密株型或具有耐密特性的优良高产玉米新品种，包括：将玉米中的ZmSBP28基因进行敲除突变，使玉米穗上叶上冲且挺立、叶夹角变小，使玉米株型变得紧凑，能够耐密植，培育得到耐密株型或具有耐密特性的高产玉米新品种。
本领域人员可以采用常规的基因敲除或基因编辑技术等常规的方法将玉米中的ZmSBP28基因进行敲除突变，譬如构建ZmSBP28基因敲除载体或采用基因编辑技术构建ZmSBP28基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体等，将玉米中的ZmSBP28基因进行突变，这些方法均为本领域技术人员所熟练掌握。
其中，所述ZmSBP28基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
与之相反，还可以将ZmSBP28基因在玉米中进行过表达得到株型较为松散的转基因玉米品种，该转基因玉米的穗上叶的叶夹角变大，穗上叶相互遮挡较多。
譬如：将ZmSBP28基因可操作的与表达调控元件相连接，得到在玉米中表达该基因的重组植物表达载体；将所述重组植物表达载体转化玉米，使ZmSBP28基因在玉米中进行过表达。
本发明进一步公开了含有所述ZmSBP28基因的重组表达载体以及含有所述重组表达载体的重组宿主细胞；包括，将所述ZmSBP28基因可操作的与表达调控元件相连接得到重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，ZmSBP28基因和3′非编码区组成；其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。
所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因，用于选择经转化的细胞或组织。所述标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。
转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将ZmSBP28基因提供给植物。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick et al.Plant Cell Reports.1986.5:81-84)。所述的目标植物包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物。最优选的，所述的目标植物是玉米。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。
术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。
术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。
术语“重组植物表达载体”意指一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。
术语“转化”指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。术语“表达”指内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。
附图说明
图1显示ZmSBP28基因的靶位点大片段删除。
图2 SBP28转基因植株和野生型植株比较，WT穗上叶的叶尖向下耷拉，造成穗上叶相互遮挡，SBP28植株明显紧凑，穗上叶夹角明显减小，尤其穗上叶片上冲且挺立，相互遮挡较少，有利于更好的吸收阳光。
图3 SBP28转基因植株和野生型植株比较，SBP28植株穗上部位叶片的叶夹角明显比WT小。
图4 SBP28和WT穗位节和穗上位节叶片大小比较。
图5 A：WT穗上叶叶脉横切观察，B：SBP28穗上叶叶脉横切观察；C：WT和SBP28穗上叶叶脉木质素和纤维素的红外光谱检测；傅里叶红外光谱检测SBP28叶脉中木质素和纤维素含量均高于WT。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 ZmSBP28基因CRISPR/Cas9载体的构建、转化玉米及表型观察1.ZmSBP28基因的CRISPR/Cas9编辑载体的构建
利用SnapGene Viewer软件及同源序列比对设计和筛选各个ZmSPL基因特异的靶标序列(设计sgRNA)，为了保证基因编辑效率，每个基因选取两个最优的靶标序列：
ZmSBP28(GRMZM2G058588，Zm00001d026491)的CRISPR/Cas9靶标序为GAGCATCAGCAGC AGCAGCTGGG，GTAGAACTGG AGGATGTCGT GGG；
之后将这些靶标序列引入到sgRNA表达盒中。同时，将人类中的hSpCas9序列用商业化的In- PCR Cloning Kit试剂盒克隆到pCPB载体中，构建成为pCPB-ZmUbi:hSpCas9载体。接着，将两个sgRNA表达盒通过In-/>HD Cloning Kit试剂盒插入到pCPB-ZmUbi:hSpCas9的HindIII酶切位点间。
最终构建成的ZmSBP28基因CRISPR/Cas9基因编辑载体经过PCR测序验证无误后用于后续的遗传转化。
2.CRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的方法转化玉米
所构建的ZmSBP28基因CRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的方法转化玉米自交系ZC01。
3.玉米转化体的表型观察和测量统计分析
通过表型观察和测量统计发现，WT叶片较软，穗上叶的叶尖向下耷拉，造成大田栽培中穗上叶相互遮挡；SBP28突变株植株明显紧凑，穗上叶叶片上冲且挺立，相互遮挡较少，有利于更好的吸收阳光(图2)。进一步通过统计分析显示，sbp28突变株穗上叶的叶夹角均小于WT(图3，表1)。
表1 SBP28和WT穗上部分叶夹角大小比较分析
SBP28突变株和WT穗位节和穗上位节叶片大小比较可见，SBP28突变株穗位叶和穗上叶的叶长和叶宽均比WT小(图5)。生物切片观察结果和木质素、纤维素含量测定结果也显示，sbp28的叶脉明显大于WT，sbp28突变株叶脉两侧有较大的维管组织(黄色箭头)，而WT叶脉中没有类似结构，说明sbp28叶脉木化程度要强；通过红外光谱测定结果显示sbp28突变株叶脉中的纤维素和木质素含量均高于WT(图5)。
上述试验结果证明sbp28基因通过控制叶夹角、叶脉硬度调控玉米株型。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> ZmSBP28基因在调控玉米株型中的用途
<130> GD-2001-190703A
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1585
<212> DNA
<213> Zea mays L
<400> 1
gagatcccgc gcgcatatat ctgtgccatc gccatcaccc accatggccg gggcaacacc 60
accatagcac agcactagtg tgcctgtcct tgccgccgtc ctcccctccg tcccctacga 120
ctccatttcc gtgtgctcgt gtgtgtcctc ccctcccagc tagtgcacag atcgaccgac 180
ccaccgaccg accgatcgat ccatcgaaca taagccaggt agcagcaagc cggggcggag 240
aagatgatga acctatcggc tgccgctgcc gccgccgcca acgcctgcga tgagttcccc 300
tacgcgccgc ccaacgcggc cgctccccct tctctgttcc caatcatgga gcaggagagc 360
agcatccaca gggagcatca gcagcagcag ctgggcctgg gctacaaccc cgagcccaac 420
tccctggcac tgctgccccc gtccgacgcc gcccaccaca ccactatcgc cgccggcccc 480
cacgacatcc tccagttcta ccctgcttcc gcctcgcact acctcgccgc ctccaacccc 540
tacggccact tcgccgggag ctcctccttc caccagtcgt cgtcgtcgtc gtcgtcgtac 600
tactaccctc cgccaccgca ggccgcgccc gagtactact tccccaccct cgtcagctcc 660
gccgaggaga acatggccag cttcgccgcc acgcagctcg gcctcaacct cggctaccgc 720
acctacttcc cgccgagagg cgggtacacg tacggccacc acccgccgcg ctgccaggcc 780
gagggctgca aggccgacct ctccggcgcc aagcgctacc accgccgcca caaggtgtgc 840
gaccaccact ccaaggcgcc ggtcgtcgtc accgccggag gcatgcacca gaggttctgc 900
cagcagtgca gcagattcca tctgctggat gagttcgacg atgccaagaa gagctgtagg 960
aaacggctag cggaccacaa ccggcgccga cgcaagtcaa agccatcgga tgctgatgcc 1020
ggagacaaga aaagagcaca tgcgaacaaa gcagctcctg ctaaagacaa agcaggaagt 1080
agcagcaagc acatgcacat tgcagggttg ggtacacaga tcctggggag cacactcttg 1140
tccaaagaac aagatcaagc catggatctt ggagaagtgg tgaaagaagc agtggatccc 1200
aaggggaagg catcaatgct acagcatcac ggcattcatc agcaacaaca tcacggaatc 1260
catcagcaac atcacggctt ccccttccat tcatcgtcag caggctctag tgacaccaca 1320
tcaaatatag ctcaagtgca agagccaagc ttagggttcc accatcagca ccatcaacac 1380
agcaacgtct tgcagctcgg tcaggctatg tttgatctcg acttcgatca ctagtcaata 1440
tgtgatgcac tctctctctc tctctctctc acccacccct ccctccctct ttctttgttt 1500
gtgcgcataa tccgaatgtt tttccctttt taaattatct gtgtccattg ctgtaatgtg 1560
gacatagtaa tgatagtgta tgctt 1585
Claims (2)
1.ZmSBP28基因在增强玉米植株叶脉硬度中的用途，其特征在于：将玉米中的ZmSBP28基因进行敲除突变，获得具有叶脉硬度增强表型的sbp28突变体株系，所述ZmSBP28基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的增强叶脉硬度是叶脉增大、维管组织增大和/或提高叶脉中纤维素和木质素含量。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述敲除突变采用基因敲除或基因编辑技术将玉米中的ZmSBP28基因进行敲除突变。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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