CN115851824A - 一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法以及sd1基因核心启动子和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及作物育种技术领域，具体涉及一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法以及SD1基因核心启动子和应用。育种方法包括对SD1基因的启动子区域进行基因编辑，经基因编辑获得大白果糯突变株；大白果糯突变株的SD1基因的转录水平为野生型大白果糯的0.5‑0.8倍。上述基因表达量的变化可对植株的生长产生正面影响，实现株高降低、产量增加、分蘖数增加以及生育期变短等效果。本方案可以解决现有技术中的贵州优质特色稻大白果糯由于分蘖较少、株高较高、生育期较长导致的单产较低且易倒伏的技术问题，可以应用于水稻株高、产量和生育期协同快速驯化以及贵州地方优质稻的分子育种实践。

Description

一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法以及 SD1基因核心启动子和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及作物育种技术领域，具体涉及一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法以及SD1基因核心启动子和应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界三大粮食作物之一，也是我国栽培面积最大、总产量最高的粮食作物。水稻生产状况直接关系到我国粮食安全问题。长期以来，虽然水稻生产水平有了很大提高，但是水稻的倒伏问题始终制约着水稻的高产和优质化发展。水稻一旦发生大面积倒伏，将会引起产量的严重损失及稻米品质的大幅下降，同时大幅增加收割成本。全球作物倒伏每年造成约数十亿美元的损失。因此，驯化品质优良的高杆野生稻和培育出抗倒伏的矮化新品种迫在眉睫。传统育种只能依靠品种或者种之间的杂交实现重组，选育出具有优良性状的品种。为了缩短育种周期，且能快速培育出高产、综合抗性强、结实率高的目标品系，逐渐产生了转基因育种和基于基因编辑技术的育种方式。转基因育种是指通过转基因的方法，导入外源的基因，达到性状改良的目标，从而培育出新品种。而转基因育种可以实现跨物种的基因交流，对目标性状改良的针对性强，提高育种效率。近年来，基因编辑技术的突飞猛进，特别是CRISPR/Cas9技术的应用，基因敲除技术已经成为常规技术，基因敲入技术也产生了突破。因此，定向敲除不良目标基因和定向整合优良目标基因，将大幅提高水稻定向遗传改良效率。

“大白果糯”是贵州的优质特色种质资源，本方案的实验材料收集于贵州省盘州市旧营乡旧营村，“大白果糯”在贵州兴仁、遵义和黔东南地区也种植较多。“大白果糯”种质资源保存于贵州大学水稻产业技术研究院和云贵高原特色作物省级种质资源圃。其米饭天然清香，口感绵软、粘性适中、适口性好，为米中精品。但是，“大白果糯”分蘖较少(4个左右)、株高较高(160cm以上)、生育期较长(150天以上)，导致其单产较低且易倒伏。如何实现品质优良的高杆稻的快速驯化和培育出抗倒伏的矮杆新品种，既是丰富现有种质资源库的现实需要，也是推动农业可持续发展的需要。水稻SD1基因，被誉为“绿色革命基因”，编码赤霉素合成途径中一个关键的酶——赤霉素20-氧化酶(GA20ox，389个氨基酸组成)，功能缺失突变的等位基因SD1会使得水稻植株获得半矮秆的表型，并显著提高产量(Sasaki A,Greenrevolution:A mutant gibberellin-synthesis gene in rice.Nature,2002,416(6882):701-702.)。虽然通过对SD1基因编码区进行编辑来达到矮化水稻株高的效果，但是由于基因完全突变会对水稻造成其他影响。如何精确的调控SD1的表达量，从而精确调控株高具有重要意义。

发明内容

本发明意在提供一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法，以解决现有技术中的贵州优质特色稻大白果糯由于分蘖较少、株高较高、生育期较长导致的单产较低且易倒伏的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法，对SD1基因的启动子区域进行基因编辑，经基因编辑获得大白果糯突变株；大白果糯突变株的SD1基因的转录水平为野生型大白果糯的0.5-0.8倍。

本方案还提供了一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法在大白果糯分子育种中的应用。

本方案的原理及优点是：

本方案的研究对象“大白果糯”在贵州遵义和黔东南地区种植较多，其米饭天然清香，口感绵软、粘性适中、适口性好，为米中精品，但株高较高、分蘖数较少和生育期较长导致其在田间极易倒伏且单产较低，亩产平均两百多公斤，品质好但易倒伏和产量不高限制了其推广和应用。发明人通过对SD1基因的多个启动子区段进行编辑，发现将大白果糯的SD1基因的表达量(转录水平)调控至野生型的0.5-0.8倍，可对植株的生长产生正面影响，具体表现在株高降低、产量增加、分蘖数增加以及生育期变短等。基于上述发现，发明人进而对“绿色革命”基因SD1的启动子序列多个区段进行了基因敲除，SD1基因表达受到抑制，获得了株高下降、单株产量提高、生育期缩短大白果糯突变株。因此，对SD1基因的启动子区域进行基因编辑，将大白果糯突变株的SD1基因的转录水平为野生型大白果糯的0.5-0.8倍，可以应用于水稻株高、产量和生育期协同快速驯化以及贵州地方优质稻的分子育种实践。其中，水稻生育期是指从水稻播种至水稻成熟收获的天数。

另外，基因编辑可以通过现有技术的常规手段实现，对SD1基因的启动子区域进行碱基替换、插入或者缺失的编辑处理。例如，可采用锌指核酸酶技术(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶技术(TALEN)、成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统技术(CRISPR/Cas9系统)，以及其它能实现基因组定点编辑的技术实现的。

由本方法获得的大白果糯突变株不仅包含第一代到第二代转基因水稻，也包括其子代。对于转基因水稻，可以在该物种中遗传该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因水稻(大白果糯突变株)包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

进一步，所述SD1基因编码的蛋白为：序列如SEQ ID No.3所示的SD1蛋白；或者如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.3具有80％以上的同一性且功能相同的相似蛋白；或者在SD1蛋白或者相似蛋白的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白。

序列表中的SEQ ID No.3由130个氨基酸残基组成。上述方法中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existencecost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

进一步，所述SD1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步，所述SD1基因为启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因。

通过编辑启动子序列，抑制大白果糯中SD1基因的表达是通过对大白果糯中SD1基因进行化学诱变、物理诱变、RNAi、基因组定点编辑或同源重组实现的。

进一步，所述基因编辑采用CRISPR/Cas9系统。

采用上述技术手段，CRISPR/Cas9是2013年开始发展起来的一种基因编辑技术，与锌指核酸内切酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9技术由于设计使用简单、灵活，费用较低等优点，成为最受关注、使用最为广泛的基因编辑技术。最近的研究发现使用CRISPR/Cas9技术在转基因水稻的T0代植株中，就可以获得纯合的靶基因突变植株，并且编辑后的基因可以稳定遗传到下一代(Zhang H,TheCRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing inrice in one generation.Plant Biotechnol J,2014,12(6):797-807.)。所述基因组编辑具体可借助CRISPR/Cas9系统实现。所述CRISPR/Cas9方法，其靶序列为位于SD1基因中任一包括XXXNGG的启动子序列或者编码序列上的XXX序列；其中，XXX为所述的DNA启动子序列或编码序列上任意19-20bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个核苷酸。

进一步，所述CRISPR/Cas9系统的sgRNA的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。发明人通过从大量实验中找到了比较一段特殊序列，即SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的序列，上述序列改变后，能够适度降低SD1基因的表达，还能够实现对水稻株高的快速降低、增加产量，并缩短了大白果糯的生育期，而其他启动子区段(SD1-1、SD1-2、SD1-3、SD1-5)或编码区敲除(SD1-6)均无此效果。

本方案还提供了赤霉素20-氧化酶SD1基因的核心启动子序列，包括序列如SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸片段。

本方案还提供了赤霉素20-氧化酶SD1基因的核心启动子序列在在大白果糯分子育种中的应用，包括使用CRISPR/Cas9系统对大白果糯进行基因编辑的步骤；CRISPR/Cas9系统的sgRNA的靶序列为所述核心启动子序列。

本方案的原理及优点是：

本发明利用基因编辑技术在大白果糯中对“绿色革命”基因SD1的启动子序列多个区段和编码序列一个区段进行了敲除，发现其ATG上游一个特殊区段敲除后，SD1基因表达受到抑制，“大白果糯”的株高下降、单株产量提高、生育期缩短。特殊区段即为序列如SEQID No.4和SEQ ID No.5所示的区段，对上述区段进行基因敲除，可以实现对基因SD1的表达调控。因此，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5可以作为赤霉素20-氧化酶SD1基因的核心启动子序列，应用在大白果糯分子育种中。

本方案还提供了一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的试剂，包括CRISPR/Cas9系统；CRISPR/Cas9系统包括用于表达sgRNA和Cas9蛋白的CRISPR/Cas9载体；所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2；sgRNA1的靶点为SEQ ID No.1中的与SD1基因起始密码子距离331-354bp的区段；sgRNA2的靶点为SEQ ID No.1中的与SD1基因起始密码子距离139-162bp的区段。

本方案的原理及优点是：本发明提供的大白果糯矮化增产和生育期缩短试剂，试剂的活性成分为抑制编码所述SD1蛋白的基因的表达以及降低所述SD1蛋白的丰度。在本技术方案中，所述CRISPR/Cas9系统包括CRISPR/Cas9载体，该载体用于表达sgRNA(sgRNA1和sgRNA2)。sgRNA1的靶点为SEQ ID No.1中与SD1基因起始密码子ATG距离331-354bp的区段；sgRNA2的靶点为SEQ ID No.1中与SD1基因起始密码子ATG距离139-162bp的区段。在本发明的具体的实施方式中，CRISPR/Cas9系统的重组载体包括重组载体CRISPR-OsSD1-2Target，该重组载体含有sgRNA1表达盒pOsU3-OsSD1gRNA、sgRNA2表达盒pOsU6a-OsSD1gRNA和Cas9蛋白编码基因，能表达sgRNA1和sgRNA2以及Cas9蛋白。

综上所述，本发明提供了通过抑制SD1基因的表达快速降低贵州地方优质特色稻“大白果糯”株高、提高产量和缩短生育期的方法。本发明的具体实施例证明通过编辑绿色革命基因SD1的特殊启动子区段，可实现株高的快速降低，能使“大白果糯”的株高快速降低、产量增加和生育期缩短，有利于合理密植，便于收获以及解决种质资源难以利用的问题。本技术方案的方法、试剂CRISPR/Cas9系统以及赤霉素20-氧化酶SD1基因的核心启动子序列可以应用于贵州地方优质稻分子育种中，以解决现有技术中的贵州优质特色稻大白果糯由于分蘖较少、株高较高、生育期较长导致的单产较低且易倒伏的技术问题。本发明利用基因编辑技术在“大白果糯”中对绿色革命基因SD1基因的启动子序列多个区段和编码区序列区段进行了敲除，发现其ATG上游一个特殊区段敲除后，SD1基因表达受到抑制，“大白果糯”的株高从150cm以上降到120cm左右，单株产量提高30％，且生育期缩短10天以上。本发明可以应用于水稻株高特别高和生育期特别长的水稻材料的快速驯化及贵州地方优质水稻的分子育种实践，从而实现对贵州地方优质水稻株高、产量和生育期的快速改良，解决贵州地方优质水稻株高较高、产量较低和生育期较长的问题，容易导致收获时发生因下雨和降温导致倒伏进而造成产量大量损失，从而难以推广种植的问题。

附图说明

图1为实施例1的不同水稻品种的表型、分蘖数、株高、直链淀粉、碱消值和胶稠度对比。

图2为实施例1的SD1基因的启动子区段和编码区段敲除靶标设计示意图。

图3为实施例2的SD1基因的启动子区段和编码区段敲除突变体测序情况示意图。

图4为实施例2的SD1基因的启动子区段和编码区段敲除突变体各个株系的平均株高统计(材料统计数量为20，不同小写字母表示差异性显著，p＜0.05)。

图5为实施例2的SD1基因的启动子区段和编码区段敲除突变体各个株系的平均分蘖数统计(材料统计数量为20，不同小写字母表示差异性显著，p＜0.05)。

图6为实施例2的SD1基因的启动子区段和编码区段敲除突变体各个株系的平均单株产量统计(材料统计数量为20，不同小写字母表示差异性显著，p＜0.05)。

图7为实施例2的SD1基因的启动子区段和编码区段敲除突变体各个株系的平均生育期统计(材料统计数量为20，不同小写字母表示差异性显著，p＜0.05)。

图8为实施例2的SD1基因的启动子区段和编码区段敲除突变体各个株系SD1基因的平均相对表达量(材料统计数量为4，不同小写字母表示差异性显著，p＜0.05)。

图9为实施例2的SD1基因的启动子区段敲除突变体(SD1-4)各个株系的表型。

图10为实施例2的SD1基因的启动子区段敲除突变体(SD1-4)各个株系的株高统计、单株分蘖数统计和单株产量统计(材料统计数量为20，不同小写字母表示差异性显著，p＜0.05)。

图11为实施例2的SD1基因的启动子区段敲除突变体(SD1-4)各个株系的单株产量表型。

图12为实施例2的SD1基因的启动子区段敲除突变体(SD1-4)各个株系的SD1基因的相对表达量(材料统计数量为4，不同小写字母表示差异性显著，p＜0.05)。

图13为实施例2的SD1基因的启动子区段敲除突变体(SD1-6)各个株系的表型。

图14为实施例2的SD1基因的启动子区段敲除突变体(SD1-6)各个株系的株高统计、单株分蘖数统计和单株产量统计(材料统计数量为20，不同小写字母表示差异性显著，p＜0.05)。

图15为实施例2的SD1基因的启动子区段敲除突变体(SD1-6)各个株系的单株产量表型。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；MaXetal，Arobust CRISPR/Cas9 system forconvenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicotplants.MolPlant.2015,8(8):1274-1284.)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

表达载体pYLsgRNA-OsU3、pYLsgRNA-OsU6a(详见文献附图Figure 1.C：Overallstructure of the sgRNA intermediate vectors.)、双元载体pYLCRISPR/Cas9P_ubi-H(详见文献附图Figure1.B：Structures of the pYLCRISPR/Cas9 binary vectors based onthe pCAMBIA1300 backbone)以及CRISPR敲除载体构建方法可参见文献“Ma,X.,et al.Arobust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genomeediting in monocot and dicot plants.Molecular Plant 8,1274-1284.(2015).”。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得上述载体。

以下实施例中所用转录本为SD1，仅作为一个例子，不限制应用中的编辑位点。如未特别指明，实例均按照常规实验条件或产品说明书条件进行。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3’末端核苷酸。

实施例1：贵州地方优质稻“大白果糯”靶位点的选择及CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

申请人前期已收集了贵州省优质稻“大白果糯”材料(材料种植于贵州贵阳)，与常见粳稻中花11、糯稻贵州小红糯、籼稻美香粘二号、糯稻苟黄岗等相比，发现“大白果糯”的分蘖数较低(图1A-B，C)，株高较高(图1A-B，D)，而直链淀粉较低(图1E)，碱消值较低(图1F)，胶稠度较高(图1G)，说明“大白果糯”品质较好，但分蘖过少和株高过高限制了其在农业上的应用。其中，在图1中，A和B分别为水稻“大白果糯”和中花11单株；C为分蘖数统计；D为株高统计；E为直链淀粉测定；F为碱消值测定，G为胶稠度测定；图中的标尺为15cm，C-D统计数据为：mean±SD，n＝20。E-G统计数据为：mean±SD，n＝4；结果使用Duncan检验进行差异显著性分析，数据上方标记有小写字母，同一图中不同小写字母表示之间有显著性差异，p＜0.05，下同。

一、靶序列的选择

“大白果糯”为贵州地方优质稻，其内部绿色革命基因SD1编码链的编码序列是序列表中的SEQ ID No.2所示序列(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)；SD1基因的启动子序列是序列表中的SEQ ID No.1所示的序列。

SEQ ID No.1：

SEQ ID No.2：

ATGGTGGCCGAGCACCCCACGCCACCACAGCCGCACCAACCACCGCCCATGGACTCCACCGCCGGCTCTGGCATTGCCGCCCCGGCGGCGGCGGCGGTGTGCGACCTGAGGATGGAGCCCAAGATCCCGGAGCCATTCGTGTGG CCGA(Target9)ACGGCGACGCGAGGCCGGCGTCGGCGGCGGAGCTGGACATGCCCGTGGTCGACGTGGGCGTGCTCCGCGACGGCGACGCCGAGGGGCTGCGCCGCGCCGCGGCGCAGGTGGCCGCCGCGTGCGCCACGCACGGGTTCTT CCAGGTG(Target10)TCCGAGCACGGCGTCGACGCCGCTCTGGCGCGCGCCGCGCTCGACGGCGCCAGCGACTTCTTCCGCCTCCCGCTCGCCGAGAAGCGCCGCGCGCGCCGCGTCCCGGGCACCGTGTCCGGCTACACCAGCGCCCACGCCGACCGCTTCGCCTCCAAGCTCCCATGGAAGGAGACCCTCTCCTTCGGCTTCCACGACCGCGCCGCCGCCCCCGTCGTCGCCGACTACTTCTCCAGCACCCTCGGCCCCGACTTCGCGCCAATGGGGAGGGTGTACCAGAAGTACTGCGAGGAGATGAAGGAGCTGTCGCTGACGATCATGGAACTCCTGGAGCTGAGCCTGGGCGTGGAGCGAGGCTACTACAGGGAGTTCTTCGCGGACAGCAGCTCAATCATGCGGTGCAACTACTACCCGCCATGCCCGGAGCCGGAGCGGACGCTCGGCACGGGCCCGCACTGCGACCCCACCGCCCTCACCATCCTCCTCCAGGACGACGTCGGCGGCCTCGAGGTCCTCGTCGACGGCGAATGGCGCCCCGTCAGCCCCGTCCCCGGCGCCATGGTCATCAACATCGGCGACACCTTCATGGCGCTGTCGAACGGGAGGTATAAGAGCTGCCTGCACAGGGCGGTGGTGAACCAGCGGCGGGAGCGGCGGTCGCTGGCGTTCTTCCTGTGCCCGCGGGAGGACAGGGTGGTGCGGCCGCCGCCGAGCGCCGCCACGCCGCAGCACTACCCGGACTTCACCTGGGCCGACCTCATGCGCTTCACGCAGCGCCACTACCGCGCCGACACCCGCACGCTCGACGCCTTCACGCGCTGGCTCGCGCCGCCGGCCGCCGACGCCGCCGCGACGGCGCAGGTCGAGGCGGCCAGCTGA；

SEQ ID No.3：

MVA EHP TPP QPH QPP PMD STA GSG IAA PAA AAV CDL RME PKI PEP FVW PNGDAR PAS AAE LDM PVV DVG VLR DGD AEG LRR AAA QVA AAC ATH GFF QVS EHG VDA ALARAA LDG ASD FFR LPL AEK RRA RRV PGT VSG YTS AHA DRF ASK LPW KET LSF GFH DRAAAP VVA DYF SST LGP DFA PMG RVY QKY CEE MKE LSL TIM ELL ELS LGV ERG YYR EFFADS SSI MRC NYY PPC PEP ERT LGT GPH CDP TAL TIL LQD DVG GLE VLV DGE WRP VSPVPG AMV INI GDT FMA LSN GRY KSC LHR AVV NQR RER RSL AFF LCP RED RVV RPP PSAATP QHY PDF TWA DLM RFT QRH YRA DTR TLD AFT RWL APP AAD AAA TAQ VEA AS*。

靶标设计：

SD1-1敲除株系靶标是Target1：TTACCGTTCATGTGCCTGTATGG；Target2：CGTCGCAAACAACAATTCCGCGG；SD1-2敲除株系靶标是Target2：CGTCGCAAACAACAATTCCGCGG；Target3：TTGGACAGACGACTAGCTTGTGG；SD1-3敲除株系靶标是Target2：CGTCGCAAACAACAATTCCGCGG；Target4：TTAAATCGATAAGCTACCAGAGG；SD1-5敲除株系靶标是Target7：CCTCCGAAACTACTGCGAGCCCA；Target8：CTAGTGTTAACTCTAATACATGG；SD1-6敲除株(编码区敲除)系靶标是Target9：TCGGCCACACGAATGGCTCCGGG；Target10：CACCTGGAAGAACCCGTGCGTGG。

SD1-4敲除株系靶标是：Target5：TATTAGAACGCGTCACGTAATGG(SEQ ID No.4；为SEQID No.1中的与SD1基因起始密码子距离331-354bp的区段)；Target6：CCCCTGTGGTGGGCCCCCCACGG(SEQ ID No.5；为SEQ ID No.1中的与SD1基因起始密码子距离139-162bp的区段)。

上述靶标具体位置见图2，以下的载体构建过程以SD1-4为例进行说明(Target5和Target6)。靶向Target5的sgRNA记为sgRNA1，靶向Target6的sgRNA记为sgRNA2。

二、sgRNA表达盒的构建

1、sgRNA1表达盒pOsU3-SD1gRNA的构建

以U-F、gRNA-R、U3-OsSD1-F、U3-OsSD1-R为引物，以pYLsgRNA-OsU3质粒为模板做融合PCR扩增出pOsU3-SD1gRNA表达盒。pOsU3-SD1gRNA表达盒能编码sgRNA1，即为sgRNA1表达盒，进行菌液PCR。选取含有标的条带的阳性单克隆进行测序，测序引物为SP1，所用引物序列具体如下：

U3-OsSD1-F:

(SEQ ID No.6，波浪线指示的序列为Target 5，下划线指示的序列为接头序列)；

U3-OsSD1-R:

(SEQ ID No.7，波浪线指示的序列与Target 5反向互补，下划线指示的序列为接头序列)；

U-F:CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG(SEQ ID No.8)；

gRNA-R:CGGAGGAAAATTCCATCCAC(SEQ ID No.9)。

将PCR产物进行稀释10倍，作为第二轮PCR扩增模板。以B-L、B2为引物进行第二轮PCR扩增，引入的BsaI酶识别位点。所用引物序列具体如下：

B-L:TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG(SEQ ID No.10，下划线指示的序列为BsaI酶识别位点)；

B2:AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC(SEQ ID No.11，下划线指示的序列为BsaI酶识别位点)。

扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收目的片段。

2、sgRNA2表达盒pOsU6a-SD1gRNA的构建

以U-F、gRNA-R、U6a-OsSD1-F、U6a-OsSD1-R为引物，以pYLsgRNA-OsU6a质粒为模板做融合PCR扩增出pOsU6a-SD1gRNA表达盒。pOsU6a-SD1gRNA表达盒能编码sgRNA2，即为sgRNA2表达盒。所用引物序列具体如下：

U6a-OsSD1-F:

(SEQ ID No.12，波浪线指示的序列为Target 6，下划线指示的序列为接头序列)；

U6a-OsSD1-R:

(SEQ ID No.13，波浪线指示的序列与Target 6反向互补，下划线指示的序列为接头序列)；

U-F:CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG(SEQ ID No.8)；

gRNA-R:CGGAGGAAAATTCCATCCAC(SEQ ID No.9)。

将PCR产物进行稀释10倍，作为第二轮PCR扩增模板，作为第二轮PCR扩增模板。以B2’、B-R为引物进行第二轮PCR扩增，引入的BsaI酶识别位点。所用引物序列具体如下：

B2’:TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG(SEQ ID No.14，下划线指示的序列为BsaI酶识别位点)；

B-R:AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC(SEQ ID No.15，下划线指示的序列为BsaI酶识别位点)。

扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收目的片段。

3、重组表达载体CRISPR-OsSD1-2Target的构建

以限制性内切酶BsaI和连接酶T4ligase，将步骤1得到的第二轮PCR纯化产物和步骤2得到的第二轮PCR纯化产物按照常规分子实验操作“边切边连”的方法构建到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H上。之后转化DH5α，挑取单克隆。

对重组质粒进行测序，已确定获得正确表达载体，其中，测序引物为：

SP1：CCGACATAGATGCAATAACTTC(SEQ ID No.16)。

将测序正确的重组质粒命名为CRISPR-OsSD1-2Target，为了便于识别以及与其他质粒区别，我们将其简称为SD1-4质粒。CRISPR-OsSD1-2Target含有sgRNA1表达盒pOsU3-SD1gRNA、sgRNA2表达盒pOsU6a-SD1gRNA和cas9编码基因，能表达sgRNA1和sgRNA2以及Cas9。以同样的方法获得SD1-1、SD1-2、SD1-3、SD1-5和SD1-6质粒，他们与SD1-4质粒的不同在于靶标序列的不同，详见前文的阐述。

实施例2：SD1基因启动子敲除的“大白果糯”植株的构建与表型测定

1、培育SD1基因启动子特殊区段敲除的“大白果糯”植株

将实施例1得到的SD1-1、SD1-2、SD1-3、SD1-4、SD1-5和SD1-6质粒分别通过本领域常规的电激方法转化农杆菌EHA105，利用农杆菌侵染“大白果糯”的愈伤组织，利用潮霉素50mg/L筛选愈伤，并对愈伤组织进行分化，4个月左右获得转化苗。炼苗1-2周后，移入土中，待苗生长约3个月后，提取转化苗的基因组DNA，以特异引物扩增OsSD1-1、OsSD1-2、OsSD1-3、OsSD1-4、OsSD1-5和OsSD1-6系列株系。

其中用于扩增OsSD1-4引物对由OsSD1-4-F和OsSD1-4-R构成：

OsSD1-4-F:5’-AGGAGAATCATTCGATTAACAGTGGA-3’，(SEQ ID No.17)；

OsSD1-4-R:5’-GTGTTGAGCGGGAGTGAGTTGA-3’，(SEQ ID No.18)。

单株收种，待T1代后，提取水稻苗的基因组DNA，进行测序确定突变类型。不同启动子区段突变体各株系(SD1-1至SD1-5)和编码区区段突变体各株系(SD1-6)测序结果见图3(下划线表示插入碱基，点虚线表示缺失碱基)。SD1-4的三个代表突变体中，Target5区段分别出现了17-20bp的碱基的缺失(分别为ATG上游334-354bp、335-354bp和337-354bp)，Target6区段均出现了碱基A的插入(在ATG上游144位的C和ATG上游145位C之间)。

基因编辑阳性苗种植在自然条件下，发现启动子区段敲除突变体SD1-4和编码区敲除突变体SD1-6两种敲除植株各个株系的平均株高明显下降，但启动子区段敲除突变体SD1-1、SD1-2、SD1-3、SD1-5四种敲除植株各个株系的平均株高与对照大白果糯株高无显著差异(图4)。启动子区段敲除突变体SD1-4和编码区敲除突变体SD1-6两种敲除植株各个株系的平均单株分蘖数明显提高(图5)。启动子区段敲除突变体SD1-4和编码区敲除突变体SD1-6两种敲除植株各个株系的平均单株产量明显提高(图6)。启动子区段敲除突变体SD1-4各个株系的平均生育期比对照提前10天以上，但其他材料各个株系的平均生育期与对照无变化(图7)。对各个材料不同株系的SD1基因的表达量检测发现(RT-qPCR)，启动子区段敲除突变体SD1-4中SD1的表达比对照明显下降，在0.6左右，而编码区敲除突变体SD1-6中SD1的表达几乎为0，但其他材料SD1的表达无明显下降(图8)。进一步发现，启动子区段SD1-4不同株系突变体株高明显下降，种子比对照早熟，生育期提前10天以上(图9)。对启动子区段SD1-4不同株系突变体株高进行了统计并确认了株高明显下降，但单株分蘖数、单株产量明显提高(图10和图11)，进一步对基因表达量进行了鉴定，发现启动子区段SD1-4不同株系突变体中SD1基因的相对表达量下降，以野生型为对照计为1，经大量样本统计，SD1-4突变株SD1基因的相对表达量为野生型的0.5-0.8倍(图12中以三种SD1-4突变株为例进行展示)，说明SD1基因表达量适度降低且在0.5-0.8范围内有利于株高、单产和生育期的控制。

而编码区区段SD1-6不同株系突变体株高比对照也明显下降，但是种子比对照没有早熟，生育期也没有提前(图13)。对启动子区段SD1-6不同株系突变体株高进行了统计并确认了株高明显下降，但单株分蘖数、单株产量明显提高(图14和图15)。以上说明对SD1基因启动子特殊区段进行敲除，适度降低SD1的表达量可以降低株高、提高分蘖并缩短生育期，而通过其他启动子区段或编码区不能达到此效果。其中，生育期缩短以及株高变低，对于水稻育种具有非常重要的意义。本方案中大白果糯SD1-4位点敲除后株高变低且生育期缩短，因此该品种可利用的空间率就更高了，因此可以在种植过程中实现立体化栽培，有利于提高单位面积的种植产量，同时也有利于提高农作物的种植速度。实现水稻生育期缩短，不仅突破了传统的水稻栽培和育种的方式，大大提高了粮食生产的效率和水平，同时也为未来的工厂化水稻栽培模式奠定了相关的基础。并且水稻生育周期缩短以后，将有利于未来对该品种的进一步育种研究。其次，本来大白果糯生育期太长，导致每年只能早播种，不然到十月以后贵阳天气变冷很容易导致种子在穗子上发霉不能成熟，生育期变短以后播种时就有更加灵活的播种时间，同时也能应对某一年提前变冷这种极端天气。

贵州地方优质特色稻“大白果糯”以品质著称，但是株高太高、单产偏低、生育期太长。因此，借助本发明可以通过编辑绿色革命基因SD1，实现株高的快速驯化、产量的增加和生育期的大大缩短，使“大白果糯”的株高变矮，产量变高，生育期缩短，便于收获的同时增强其抗倒伏能力，合适密植，有利于推广种植，利于种质资源的利用和推广。

Claims (10)

1.一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法，其特征在于：对SD1基因的启动子区域进行基因编辑，经基因编辑获得大白果糯突变株；大白果糯突变株的SD1基因的转录水平为野生型大白果糯的0.5-0.8倍。

2.根据权利要求1所述的一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法，其特征在于：所述SD1基因编码的蛋白为：序列如SEQ ID No.3所示的SD1蛋白；或者如SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与SEQ ID No.3具有80％以上的同一性且功能相同的相似蛋白；或者在SD1蛋白或者相似蛋白的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法，其特征在于：所述SD1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求2所述的一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法，其特征在于：所述SD1基因为启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因。

5.根据权利要求1所述的一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法，其特征在于：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9系统。

6.根据权利要求5所述的一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统的sgRNA的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5所示。

7.根据权利要1-6中任一项所述的一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的方法在大白果糯分子育种中的应用。

8.赤霉素20-氧化酶SD1基因的核心启动子序列，其特征在于：包括序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核苷酸片段。

9.根据权利要求8所述的赤霉素20-氧化酶SD1基因的核心启动子序列在大白果糯分子育种中的应用，其特征在于：包括使用CRISPR/Cas9系统对大白果糯进行基因编辑的步骤；CRISPR/Cas9系统的sgRNA的靶序列为所述核心启动子序列。

10.一种降低大白果糯株高、提高产量并缩短生育期的试剂，其特征在于：包括CRISPR/Cas9系统；CRISPR/Cas9系统包括用于表达sgRNA和Cas9蛋白的CRISPR/Cas9载体；所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2；sgRNA1的靶点为SEQ ID No.1中的与SD1基因起始密码子距离331-354bp的区段；sgRNA2的靶点为SEQ ID No.1中的与SD1基因起始密码子距离139-162bp的区段。

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