CN111304241A - 一种多基因编辑提高旱稻产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多基因编辑提高早稻产量的方法。所述方法利用CRISPR/cas9基因敲除系统构建多靶点表达载体，采用农杆菌介导的方法将多靶点表达载体转化早稻愈伤组织，对靶点基因DEP1，基因GS3，基因GW2和基因SD1中的至少两种进行定点敲除，获得提高早稻产量的多基因敲除突变体。本发明克服了早稻难以进行基因编辑的难点，通过CRISPR/Cas9多基因技术成功获得了多基因突变体，显著提高了早稻的产量，对早稻基因功能研究有重大意义而且在早稻育种中有很大的应用价值。

Description

一种多基因编辑提高旱稻产量的方法
技术领域
本发明涉及转基因旱稻领域，尤其涉及一种多基因编辑提高旱稻产量的方法。
背景技术
水稻是我国第一大粮食作物，约占粮食总产量的40％。然而水稻需水量大，约占农业用水的70％。我国地域广阔，水资源分布不均，西北地区长期缺水、华北地区旱灾频繁、云南西南部高寒贫困山区及半山区地形地势复杂，雨量分布在季节上不平衡，旱灾在长江流域和华南稻区也频繁发生，一旦干旱发生，水稻往往大幅减产。随着工业和城市用水及其它农业用水的迅猛增长也使水稻灌溉越来越难以保证，干旱缺水与水稻用水的供需矛盾日益严重，发展节水农业已经迫在眉睫。
旱稻(陆稻)品种较水稻品种具有较强的节水抗旱性能，其种植管理方式与小麦相似，耗水量仅是水稻的1/5～1/3。此外旱稻还具有耐瘠、适应性广等特点。但是相比于水稻，旱稻产量普遍较低且品质较差。因此培育优质高产旱稻新品种，发展旱稻旱作生产可以改变传统稻作生产栽培耕作方式、节约淡水资源，是实现稻谷可持续生产的新革命。
云南省农业科学院粮作所选育的旱稻新品种陆引46，2017年8月18日通过越南农业与农村发展部审定。陆引46系籼型旱稻，是云南省旱稻主栽品种。该品种表现为株型紧凑、分蘖力旺盛，同杂草竞争力强，兼顾了多穗型和大穗型的特点，抗稻瘟病，生育期适中，米质中上，但是产量优势不明显，故本发明旨在通过基因编辑手段提高旱稻的产量。
发明内容
本发明提供一种多基因编辑提高旱稻产量的方法，本发明选定多个产量关键基因，利用CRISPR/cas9多基因敲除的方法同时对抑制旱稻产量的关键基因进行敲除，筛选出能提高旱稻产量的优秀基因型组合，缩短育种周期，快速培育出高产旱稻。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种多基因编辑提高旱稻产量的方法，所述方法利用CRISPR/cas9基因敲除系统构建多靶点表达载体，采用农杆菌介导的方法将多靶点表达载体转化旱稻愈伤组织，对靶点基因DEP1，基因GS3，基因GW2和基因SD1中的至少两种进行定点敲除，获得提高旱稻产量的多基因敲除突变体。
优选地，利用CRISPR/cas9基因敲除系统构建多靶点表达载体对下列组合的靶点基因定点敲除：基因GS3、基因GW2和基因SD1；
或基因GW2、基因GS3和基因DEP1；
或基因GW2、基因SD1和基因DEP1；
或基因SD1、基因GS3和基因DEP1；
或基因DEP1、基因GS3、基因GW2和基因SD1；
或基因GW2和基因SD1。
优选地，所述基因DEP1的靶点位于第5外显子，位于基因组第3353-3372位碱基，靶点序列为GATCTTGAAGCAGCTGTACA；
所述基因GS3的靶点位于第1外显子，位于基因组第117-136位碱基，靶点序列为GACGCGCTCCACCGCGAGAT；
所述基因GW2的靶点位于第4外显子，位于基因组第2071-2090位碱基，靶点序列为AGTTATGCTGTGGAGTATCG；
所述基因SD1的靶点位于第1外显子，位于基因组第356-375位碱基，靶点序列CACCTGGAAGAACCCGTGCG。
优选地，所述旱稻为籼系旱稻，尤其适用于旱稻陆引46品种。
进一步地，所述多靶点表达载体中sgRNA序列来源于pYLCRISPR/sgRNA vectors菌种的质粒，靶点基因的启动子选用OsU6a、OsU6b、OsU6c和OsU3a中的至少两种；骨架载体来源于pYLCRISPR/Cas9菌种的质粒。
进一步地，所述多靶点表达载体中sgRNA表达盒连接方式选用下列任一种：
LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1；
LacZ-U6a-GW2---U6c-GS3---U3-DEP1；
LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1----U3-DEP1；
LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3；
U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1；
LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1；
其中，GW2、SD1、GS3和DEP1分别表示相应基因的靶点序列。
进一步地，所述靶点接头引物如下：
GW2-T-F：GCCGAGTTATGCTGTGGAGTATCG；
GW2-T-R：AAACCGATACTCCACAGCATAACT；
SD1-T-F：GTTGCACCTGGAAGAACCCGTGCG；
SD1-T-R：AAACCGCACGGGTTCTTCCAGGTG；
GS3-T-F：TCAGACGCGCTCCACCGCGAGAT；
GS3-T-R：AAACATCTCGCGGTGGAGCGCGT；
DEP1-T-F：GGCAGATCTTGAAGCAGCTGTACA；
DEP1-T-R：AAACTGTACAGCTGCTTCAAGATC。
本发明的特点如下：为了提高旱稻的产量，本发明选定抑制稻作物产量的5个靶基因DEP1，GS3，GW2，SD1和Gn1a进行多基因敲除，由于未在旱稻中检测到Gn1a基因，可能是由于该基因序列大片段缺失，故对另外4个基因进行敲除。本发明对DEP1，GS3，GW2和SD1中的2～4个的基因组合进行同时敲除，获得多个基因敲除的突变体，通过培育却发现能显著提高产量，而且有的突变体还具有抗倒伏的优势。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明克服了旱稻难以进行基因编辑的难点，通过CRISPR/Cas9多基因技术成功获得了多基因突变体，显著提高了旱稻的产量。CRISPR/Cas9多基因编辑技术避免了传统多突变体获得过程中的基因连锁和基因渗透现象，获得多个基因共敲除突变体不仅对旱稻基因功能研究有重大意义而且在旱稻育种中有很大的应用价值。
附图说明
图1为lacz-OSU6a-GW2-sgRNA表达盒；
图2为OSU6b-SD1-sgRNA表达盒；
图3为OSU6c-GS3-sgRNA表达盒；
图4为OSU3-DEP1-sgRNA表达盒；
图5为LY46-HY-1载体图谱；
图6为LY46-HY-2载体图谱；
图7为LY46-HY-3载体图谱；
图8为LY46-HY-4载体图谱；
图9为LY46-HY-5载体图谱；
图10为陆引46突变体拷种结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
以下实施例采用pYLCRISPR/Cas9菌种(TOP10F′)、CRISPR/sgRNA vectors菌种(DH10B)、启动子OsU6a、OsU6b、OsU6c和OsU3a均来自于华南农业大学生命科学学院刘耀光课题组。
实施例1
1载体构建
1.1受体材料LY46中靶基因检测
在转化受体籼系旱稻陆引46(LY46)中进行PCR和测序，检测靶基因DEP1，GS3，GW2，SD1、Gn1a的突变情况。实验结果表明，LY46中，共有4个基因，DEP1，GS3，GW2，SD1需要进行多基因敲除(陆引46中无法检测到Gn1a基因，认为该基因在陆引46中已经发生大片段deletion)。
1.2靶点设计
根据LY46中靶基因检测结果，设计和确定靶点设计结果如表1所示：
基因DEP1在exon5处设计靶点，位于3353-3372位碱基。基因DEP1碱基序列如SEQID NO：1；
基因GS3在exon1处设计靶点，位于117-136位碱基。基因GS3的碱基序列如SEQ IDNO：2；
基因GW2在exon4处设计靶点，位于2071-2090位碱基。基因GW2的碱基序列如SEQID NO：3；
基因SD1在exon1处设计靶点，位于356-375位碱基。基因SD1的碱基序列如SEQ IDNO：4。
表1
Figure BDA0002437717700000041
Figure BDA0002437717700000051
1.3载体构建
本实施例使用水稻来源的4个small nuclear RNA启动子的表达水平为OsU6a＞OsU6b＞OsU6c＞OsU3a。当连接靶点多于4个时，为了降低相同启动子序列在农杆菌发生同源重组的可能性，使相同启动子间的距离尽量近。因此U3、U6a～c启动子的使用和排列方式为：
1个靶点：LacZ-U6a；
2个靶点：LacZ-U6a-U6b；
3个靶点：LacZ-U6a-U6b-U6c；
4个靶点：LacZ-U6a-U6b-U6c-U3；
对于LY46，U3、U6a～c启动子和sgRNA表达盒的使用和排列方式为：
4个基因靶点排列方式如下：
LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1；
3个基因靶点的4组排列如下：
LacZ-U6a-GW2-------------------U6c-GS3---U3-DEP1；
LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1-------------------U3-DEP1；
LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3------------------；
-------------------------U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1；
1.3.1载体构建操作方法
本实施例构建了5个多基因靶点载体，分别为：
LY-HY-1 4个靶点：U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1；
LY-HY-2 3个靶点：U6a-GW2---U6c-GS3---U3-DEP1；
LY-HY-3 3个靶点：U6a-GW2---U6b-SD1---U3-DEP1；
LY-HY-4 3个靶点：U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3；
LY-HY-5 3个靶点：U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1；
由于5个多基因靶点载体的构建过程基本相同，下面以LY-HY-1：U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1为例，描述其具体构建过程。
菌种活化和质粒提取制备：将pYLCRISPR/Cas9菌种(TOP10F’)和CRISPR/sgRNAvectors菌种(DH10B)分别在合有卡那霉素(25μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)平板培养基划线培养过夜，挑取单菌落培养1ml种子液，再扩大培养用于提取质粒。
靶点接头制备将接头引物TE溶解成100μM母液各取1μl加入到98μl 0.5 x TE混合稀释到1μM。约90℃30s，移至室温冷却完成退火。
sgRNA载体酶切：分别取pYLgRNA-OsU3/LacZ、pYLsgRNA-OsU6a-LacZ、pYLsgRNA-OsU6b、pYLsgRNA-OsU6c、pYLsgRNA-OsU3质粒各1μg，在25μl反应用10U Bsa I酶切20min，冷冻保存。sgRNA表达盒连接反应：酶切过的pYLsgRNA-U#质粒(pYLgRNA-OsU3/LacZ、pYLsgRNA-OsU6a-LacZ、pYLsgRNA-OsU6b、pYLsgRNA-OsU6c、pYLsgRNA-OsU3)与各对应接头按照表2进行连接反应，室温(20-28℃)连接约10-15min，分别得到各连接产物。得到各连接产物后进行PCR扩增，具体反应过程如下：
表2
Figure BDA0002437717700000061
表3靶点接头(引物)
Figure BDA0002437717700000062
Figure BDA0002437717700000071
第一轮PCR扩增：每个sgRNA表达盒分为2个PCR反应，各15μl反应体系：取0.5μl各连接产物为模板，使用U-F/接头反向引物(反应1)，和接头正向引物/gR-R(反应2)，各0.2μM，25-28循环：94℃10s，60℃15s，68℃20s。(任意)取4μl电泳检查(反应2产物长度约140bp，用2％琼脂糖胶)。
第二轮PCR：预先将位置特异引物对(表4)混合成10×工作液，每种1.5μMsgRNA表达盒特定位置引物对的使用方法：
3 cassettes：Pps-GGL/Pgs-GG2，Pps-GG2/Pgs-GG3，Pps-GG3/Pgs-GGR；
扩增相应的gsRNA表达盒：
lacz-OSU6a-GW2-sgRNA，OSU6c-GS3-sgRNA，OSU3-DEP1-sgRNA；
lacz-OSU6a-GW2-sgRNA，OSU6b-SD1-sgRNA，OSU3-DEP1-sgRNA；
lacz-OSU6a-GW2-sgRNA，OSU6b-SD1-sgRNA，OSU6c-GS3-sgRNA；
OSU6b-SD1-sgRNA，OSU6c-GS3-sgRNA，OSU3-DEP1-sgRNA。
4 cassettes：Pps-GGL/Pgs-GG2，Pps-GG2/Pgs-GG3，Pps-GG3/Pgs-GG4，Pps-GG4/Pgs-GGR；
扩增相应的gsRNA表达盒：lacz-OSU6a-GW2-sgRNA，OSU6b-SD1-sgRNA，OSU6c-GS3-sgRNA和OSU3-DEP1-sgRNA。lacz-OSU6a-GW2-sgRNA，OSU6b-SD1-sgRNA，OSU6c-GS3-sgRNA和OSU3-DEP1-sgRNA表达盒分别如图1～图4所示，图1～图4中所有的表达盒均为未加位置特异引物的表达盒，其中，小写斜体字符为sgRNA seaffold，小写字符为相应的promoter，二者中间加粗字符19-20bp为相应靶点。
表4第二轮pcr引物设计(Golden gate cloning通用site specific primer)
Figure BDA0002437717700000072
Figure BDA0002437717700000081
注：加粗部分为Bsa I识别位点
取每个sgRNA表达盒第一轮PCR的两个反应产物各1μl，分别用H2O稀释10倍，然后各取1μl稀释产物混合为模板。各表达盒20-50μl PCR(1个靶点50μl；2-3个靶点各30μl；4个或以上靶点各20μl)。加入1/10量每种引物组合工作液(最终浓度0.15μM)。扩增17-20循环(实际情况调整)：95℃10s，58℃15s，68℃20s。
根据各样品产物估算的量，把所有PCR产物大致等量混合，用PCR产物纯化kit纯化。
双元载体与sgRNA表达盒的酶切-连接反应，反应各成分如表5所示。
表5
Figure BDA0002437717700000082
用变温循环进行酶切连接约10-15循环：37℃5min；10℃5min，20℃5min；最后37℃5min。
连接产物转化：取10ul连接产物热激转化70ul E.coli DH5a感受态细胞，转化后加入350ulSOC，37℃过夜培养。涂板培养基为LB+25μg/ml Kan，0.3～0.5mM IPTG，适量X-gal。IPTG诱导没有彻底切除ccdBs的空载质粒转化子的ccdBs表达致死。而含有目标插入序列(LacZ-gRNA表达盒)的阳性克隆由LacZs表达产生蓝色菌斑
挑选蓝色菌斑克隆，培养，提取质粒，测序检测。
导入农杆菌。获得的克隆电激转化农杆菌(EHA 105)。从农杆菌提取质粒(农杆菌提取质粒质量较差，只适合做PCR)，取约2-5ng质粒为模板再用所有靶点接头正向引物和反向引物配对进行PCR确认。
1.3.2载体构建结果
4个靶点载体LY-HY-1 U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1的载体图谱如图5所示，注图5中：IRAT-HY-1的multiple sgRNA expression cassettes处sgRNA表达盒连接情况为：U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1；
3个靶点载体LY-HY-2：U6a-GW2---U6c-GS3---U3-DEP1的载体图谱如图6所示；
LY-HY-3 U6a-GW2---U6b-SD1---U3-DEP1的载体图谱如图7所示；
LY-HY-4：U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3的载体图谱如图8所示；
LY-HY-5：U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1的载体图谱如图9所示。
1.3.3表达载体转化农杆菌
采用电击法将表达载体转化农杆菌菌株EHA105，-70℃保存。
2农杆菌介导的旱稻遗传转化
用农杆菌介导的遗传转化方法分别将载体LY-HY-1、LY-HY-2、LY-HY-3、LY-HY-4、LY-HY-5转化旱稻品种陆引46。
3编辑结果检测
3.1 DNA提取
用CTAB法小量抽提旱稻基因组DNA。
(1)取约2em长的水稻叶片置于2ml离心管中；
(2)采用磨样机进行打样(转速为2000rpm，1min)，磨样后在样品中加入800μL 1.5×CTAB，混匀；
(3)65℃水浴锅水浴20-30min，每5min中颠倒混匀一次；
(4)加入等体积的24∶1(氯仿∶异戊醇)，上下颠倒混匀，持续10min；
(5)10000rpm离心，10min；
(6)吸取400μL上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰镇的95％乙醇，-20℃冰镇20min；
(7)12000rpm离心，15min；
(8)弃上清，加入500μL 75％的乙醇，12000rpm离心5min；
(9)弃上清，置于超净台中吹干，加100μL ddH2O溶解，-20℃保存备用。
3.2靶基因PCR检测引物设计
表6
Figure BDA0002437717700000101
3.2 PCR检测
PCR反应体系如表7所示。
表7
Figure BDA0002437717700000102
注：GW2、DEP1、Gn1a用Takara的ExTaq酶扩增效果较好，SD1用KOD酶扩增效果较好，GS3只能用KOD酶扩增。
PCR扩增程序
Figure BDA0002437717700000103
PCR产物送测序公司测序
3.3基因型鉴定结果
经PCR和测序，发现各目标靶点的敲除率如表8所示。
表8
Figure BDA0002437717700000111
且发现有两个目标基因在同一单株发生编辑(表9)：家系1、2、3、5同时发生了两个基因的编辑。其中，家系1 DEP1和SD1同时发生编辑，DEP1的编辑类型为B10(607-608之间，Tinsertion)，SD1的编辑类型为D25(299，A-G)；家系2也是DEP1和SD1同时发生编辑，DEP1的编辑类型为B15(608-646，39bp deletion)，SD1的编辑类型为D25(299，A-G)；家系3 SD1和GS3同时发生编辑，SD1的编辑类型为D13(第1外显子的278-279位间A insertion，296-577位282bp替换为A)，GS3的编辑类型为E6(101-102之间，A insertion)。家系1、家系2和家系3都可以采用多靶点载体LY-HY-1、LY-HY-3和LY-HY-4进行定点敲除得到。家系5采用的多靶点载体为LY-HY-1，基因GW2和SD1同时发生编辑，GW2的编辑类型为A13(第4外显子的338位，A deletion)，碱基序列如SEQ ID NO：1；SD1的编辑类型为D13(第1外显子的278-279位间Ainsertion，296-577位282bp替换为A)，碱基序列如SEQ ID NO：2；具体如表9所示。
注：各家系中的突变位置是根据CDS的顺序来的，碱基编号以start code ATG中的A为1。其中，家系5中的CDS顺序突变位置与基因组中的对应位置如下：GW2中第2087位A缺失。SD1中第359-360位间A插入，第377-760位384bp替换为A，此处比CDS上缺失的多，是因为缺失部分包含一个内合子。
表9陆引46突变体基因型鉴定结果
Figure BDA0002437717700000112
4田间种植表型鉴定
4.1田间种植
每个家系材料种植18个单株(每行6株，种植3行)，株距15cm。用同样的方式种植野生型材料。
4.2表型鉴定
表10陆引46突变体拷种结果汇总
Figure BDA0002437717700000121
对田间种植的突变体材料进行千粒重、单株产量、株高、穗数、穗长的鉴定。分析结果显示，1、2、3、5、17的千粒重显著高于WT，其中5的千粒重比WT高34％(图10D，表10)。1、3、5、17的单株产量显著高于WT(图10E，表10)；株高分析发现，1、3、17的株高显著高于WT，5的株高显著低于WT；田间观测到株高高于WT的突变体抗倒伏能力变弱，在强降雨或刮风天气下极易倒伏，因此株高较低的家系5在育种上具有较高优势。
另外，本申请发明人也在构建基因SD1和GW2的双基因靶点载体，目标靶点的敲除率及在植株上的编辑效果尚未得出，但有较大的可能获得高产量的突变体。
序列表
<110> 保山华大智慧农业科技股份有限公司
<120> 一种多基因编辑提高旱稻产量的方法
<130> 20200311
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3946
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
gcgagatcac gttcctcaag gtgagcgccc cgcggcggcg gcggctgcgt ttttctctat 60
aggtttctct ttcacactcg ctcgctcgaa attctcgggg cccgagctct acttgcttcg 120
tcttcctttg actttaccga ttaattttaa aaaaaaggag atccgattcg ccgcgcattt 180
ttcaaaaccc aagcggccga gtacggagct acccgctact gcaagtagga tgctgtgaag 240
tgtacagtaa tggcgttgtt aattgcggta gctagtgcta ttctagtact tgtagtcctg 300
tttctaggcg gaggtgaatc acggcgccat caatccgagg ctggcgagac aagcttggcc 360
ctctttgggc gtggcgccat ggctgtacta cctttgtcgt cgtttggttg ggctcctcgt 420
tggagaaaag aagagcgtgg gcatggacaa ctgacctgag tggccttgtc agggagagcc 480
atagcagtgg acgtgtctgt ctccgccatt gcttcgtcga cactggacgt gcagacggca 540
tggccatgag ggctttgcac gatgggtggt gccgtgttgg tgttatgggc gccaccatgg 600
tttgaggctt ttgatgttgc tagattttgt gtttaacgag ggagggaaga atgtgttgtt 660
cttgacactg tgctgtgctt ttaaggagca gagatttcag aagctcttca gatatcagag 720
aacttctttg tagtagtaat caaatgcgct ttagacatct ttttatcgtt tcttgcaagg 780
tcagtccctg ctttggtacc cgatctcgct tttgtgcaac atcaaagtta cacttacaca 840
gtaaagcagg aatctttatg ggaccgttcg tactggtcaa ttactccagg ctttgattaa 900
tgggttttaa gttttaaccg cagatttggt acaagtaaca acctttattt actttttatt 960
tctgcaactg tgtcttttaa catgaaagaa tccagctcca ttcaaaagtt tagtttttat 1020
tttccattgt ggtgcatggt cactcagcct gcagtactga attatcaaaa ttttcttttg 1080
tcatttctct catgttaagt gcatagtcta ttttacttca acaggtagaa aaacttttgt 1140
gggtttgttt ctagctcaag gaggaaattc atgggtttgc atctagcaca tgagagaata 1200
atattggtct aacacaaagc tccttttgta ggatgagctt cacttccttg aaggagctca 1260
gcccgtttct cgttctggat gcattaaaga gtatgtacta ctgcccttca tgcattacag 1320
atattttgtt tttaagtttt tagaaatttg aagagcttat gtcaagtatg aaatgtcagc 1380
ttaattttat tgctgtcctt atctaatgtc ttatgctctg ttttataaaa tttggttgca 1440
ttttctcccc cagggaaaaa tcttgtataa gtgtgttatg tacttatgtg tataaaatct 1500
tgttgcactt gtatgtcaca cttaggccct gtttagatcc tccaaaatgg caaaagtttt 1560
gccattttga agcacctttt gccattttgg atctaaacac tagtaacaaa acttgacaat 1620
ttggcatttg gcatttgcta gtctatagta gcaaattgtg ccaaaaagtg ctttggaacc 1680
actccctctt tctttctctc tctcacttta gtgctagaat ggcaaaagtt taggatgcat 1740
ctaaacacca actagtactt ttacaatacc aaaacttttg ccaccaaaac ttttgccatt 1800
tgccatttgc tatttcaaat ggatataaac agggccttag caaatcacca tatgttaaaa 1860
ttaccttggg atgaaaaaga aaaaggaaac cagcattgaa gtcttgtttg aaatgcatat 1920
gtacttgtac cattacagaa attcttaaaa ctgctgtctt gacagctact tatcaaacag 1980
ccccacctgc atcataacgt tcctagtggt gcctataact ctgcctcagt tattattttg 2040
tggcccactg gtccaacaat ttgaaaaaaa ttatattgaa cagtagtatg acgtcctctt 2100
tgcttaagtt ccatattaca gctcatagtc ctgagatttg tttcaccgat tctttccatg 2160
cgatgtgcac atattcttat tcaatttaaa aaatgaaagc agattatttt taacaagtaa 2220
cctatcacgt tagcttaaca ttgtatattt gtggtggaat tatgtaatat tccgatatcg 2280
catttgaagt tttgaacatg tgtgctcaaa ttgagggaca catgactgta gtgaaagcaa 2340
atataaatgt ctgaacaatg gactatactt tgtattcatt actacaagtt atgtcctttt 2400
gcaggttgct aatgtcctct tacattactt gtcaggataa atgagtttgt tggtacaaaa 2460
catgacccac taataccaac gtatggcctc taaactttca gttcccccat tttaagcatg 2520
ttcgctgttt atttacgagt tttgacattg ttttttcctt ttccagaaag agaaggaggc 2580
acagatcttg ccgtcttttt cggtggatcg ggtatgtttt gatccaatat agtttgctcg 2640
caggttctga ggggcaagaa cattcaaata tctataatgt tttctgttgg attcaacatt 2700
catcactatt tccctcgaaa aaaaaacatt cgtcactatt ggaattgaaa gtctgaaagt 2760
gcctctagtc cctttgtatg ttaaaagtca ataaacaagc agtagttttc tatatgccac 2820
attaatatta ttgacgcatt ttaaaaagca aactagtcca gggatgtaat catctttgtt 2880
atctaaaact aaaaaaggaa aaactagtgc ttttttacat taacattgat ttttttgcgg 2940
ctgaaattac atgtagaaac tttggcataa taatctgtac tactgccaaa ctgagctttt 3000
acatggtgaa aatattttcc ctgcagatca aaattgtgta tctgcatttc atgtctttgc 3060
tgctgttgca agtgctcacc caagtgcaaa agaccaaggt gcctcaattg ttcttgcagc 3120
tcatgctgcg acgagccatg ctgtaagcca aactgcagtg cgtgctgcgc tgggtcatgc 3180
tgtagtccag actgctgctc atgctgtaaa cctaactgca gttgctgcaa gaccccttct 3240
tgctgcaaac cgaactgctc gtgctcctgt ccaagctgca gctcatgctg cgatacatcg 3300
tgctgcaaac cgagctgcac ctgcttcaac atcttttcat gcttcaaatc cctgtacagc 3360
tgcttcaaga tcccttcatg cttcaagtcc cagtgcaact gctctagccc caattgctgc 3420
acttgcaccc atccaagctg tagctgcaag ggctgtgcct gtccaagctg tggatgcaac 3480
ggctgtggct gtccaagctg cggatgcaac ggttgtggct gtccaagctg cggttgcaac 3540
ggctgtggcc ttccaagctg cggttgcaac ggctgcggct cctgctcttg cgcccaatgc 3600
aaacccgatt gtggctcgtg ctctaccaat tgctgtagct gcaagccaag ctgcaacggc 3660
tgctgcggcg agcagtgctg ccgctgcgcg gactgcttct cctgctcgtg ccctcgtagc 3720
tccagctgct tcaacatctt caaatgctcc tgcgctggct gctgctcgag cctgtgcaag 3780
tgcccctgca cgacgcagtg cttcagctgc cagtcgtcat gctgcaagcg gcagccttcg 3840
tgctgcaagt gccagtcgtc ttgctgcgag gggcagcctt cctgctgcga gggacactgc 3900
tgcagcctcc cgaaaccgtc gtgccctgaa tgttcctgtg ggtgtg 3946
<210> 2
<211> 5609
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
gatcatctcc attatcggaa cttcggagtg acatggcaat ggcggcggcg ccccggccca 60
agtcgccgcc ggcgccgccc gacccatgcg gccgccaccg cctccagctc gccgtcgacg 120
cgctccaccg cgagatcgga ttcctcgagg tacaatctat ctctatctgt ctatatcact 180
accattcata ctccttcgat cttgcttcaa aacaaaaaaa tatatatttc ctacttcata 240
ttcatataca cacgtacggc ttgctatctg tcgaattgtt tgcttctgca tgcatgcatc 300
actctcattg taagtttttc ccagcttaaa accactcctt ttatcttcgt tcttcttcct 360
tcttgttttt ttttaaaaaa acaacaactc atttaatctt catatagtgt atcatgcatc 420
atttgcttct ttgatcagtt ccccaaaaac tgctcctctc ttcccagcca aataattaaa 480
cttaagcaaa caagcaagtt gaactgatga tccaataaaa caaaacaaaa ccgatcgaat 540
aggaagtcaa tggcatatac cagctgctat agctgaagcc acgaatgctt agcttagctc 600
tagtcgatcc ctgttgactg ttcaacacac tgcactaaca caccagttaa tgagctgatt 660
aattaaacca ttaaatgagc ttaacgggcg gctagcttct tcctctgggc ccgtgccgat 720
cgtaccatcg gtttgcgcgt ccctccacct aaactctctg ccttgttatt ccctttgcct 780
agtactacat gcatttgcat catcatccca tcaccaatag tactacgttt caactggatt 840
ttggtggtgt ccaaccatat catatttggt tttgttctct agtttactcc tacattagtc 900
tctagcggtt ttgtggagta ctaaagaaaa caactaatca gccagggttt aacgtttaat 960
cggttggtgg ttttgttaat taatttcatc tactatttta gacttcacag gtcttcgagc 1020
tataagcatc gattgccatg catcaatcga tgctggtcca cgctagtttc tgagttctga 1080
ctagctctct taattgtgct ttgacctact ttaattaatt aaccagtggc tgcgtcactc 1140
attgaccaac attgtcatgt tacccggact gatttttttt ttctttaaaa aaacaccgga 1200
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tataattaaa ataattaaaa tggtgatgcc cagctttttt tttcctccaa taatttattt 1380
attggcttga tttcctgtgc tattaggagt aaaactactc cgttttaatt agcaccattt 1440
ttaaagcttc taaaattaac ctaagtaaag tacgacagta cttgctgtct agctttaaat 1500
gttttgggtg ttaaaatatc cctcagacat cacctgaaaa gttgacaggc taaacacatg 1560
cccatctccc tcgtttactt aaattaattc gaacaaacaa ctgtatatat atttcttgca 1620
gggtgaaata aattcaatcg aagggatcca cgctgcctcc agatgctgca gagagtaagc 1680
cagcctgctg tttctttttg tactacttcc atttcttctc gtctttactc ttaccatgca 1740
ttcacaaaat atacttactt accccagttt ttgatcatga actttgaccg ttatcttttt 1800
aagcaacttc aataaaatag gtttaaatgc aaatgttatg tacaccattg attataaaac 1860
cttggcaaat gaaagtaaaa aaccagcaca tttaatttct gaacgttggg agtattatta 1920
tttttatatc ttttactatc atttaatcat agtatcgtgc aagctttttg agtgtaatta 1980
ggttgcttaa ggtaaaaaaa tgtaactagg ttacatttag tactaaactg aacatttaat 2040
tagtaatgtt tcgttaagta actgtaattt caatgcatgc atgtcctccc gtaagagcaa 2100
gtttaatagt atagccaact actagctcca atttatttat agacaatcta atagctcatt 2160
catacaataa ttacatacta cactattaat atctgatccc acctgtcata cacatactgc 2220
attttggagt ccgtgctata gctgactaca aatctatagt ccgctgctct tctctctctt 2280
tatttatctc cttaaaatat gtttgcagct ggcttatagc ctgctattgt acctgctctg 2340
aaaatagtgc agagactgtt caaaaagtca ttgcacaata actattcaca tggaactgtg 2400
aaaagtatat attggaactt actagctaga tccttttggg aacatgggaa aagccaagtc 2460
acgtgtggaa tccctattcc ctgtgttctt cagctagaag agtgaaaata atgtactact 2520
actatacgga gatgaaatta cagcaggagc agaaagcggg aaaaaaactt taaatcaatt 2580
aaacaaacct ctctctgcaa aattcaacac cagcaacgaa caactcatca agttcttgtg 2640
ttatgtaccg gccggtaact aattgttgtt tgcataagcg aaacggtata tttgcaaaca 2700
aaaaataatt tatgaataaa acttttatat acatgttctt aattatctca aaacaaaggt 2760
tgaaaaataa acttcgatga aaaaatctca aaatcaattc caaatttatg gtgaaaattt 2820
taaattttgt ctgataaaca taagtataag caaaaaaaaa agtaaagcaa tgtcactatg 2880
ttaatggtat tggtatatat acctttgagt ttctgtctgt actttaggag tacatgctac 2940
gaacatgttt tcttggcttc tatttcgttg gaattacttg cgtattgtgg gccagacgcc 3000
tggtgaactt cgtcgattgt gtggactaat taagctcacc tgaaataagt ggttgaaaac 3060
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aattcatcgg aagaactcct gatccattca taacgatgta tggattttca ggtcgagaat 3180
ttgtctttaa cttcgcacga ctgttatttt ttttcttatt aattctctgt ttacaagcag 3240
ttcatcggag aagcgaagtc atgatcattc tcaccacttc ttgaagaagt ttcggtactc 3300
acttcattcc cggatcttaa tgtatatatg catatctgca ctgtgctaat tggtgtacac 3360
attatgtgat catcagtcca agttaattat tacttacaaa actgaactaa taaacactag 3420
aaaatatgta acttgcaaag tacatattga atcagggatt catatataga actccacctg 3480
cagatttctt ccaatatata tatgctgtca ccatgttttc acttgtcacc tagtacacct 3540
ttgactggga gactttcctt gatgatcgac gtggtcatat tcttcagatt gatttaattt 3600
cagatagaaa aaaatattgt ttacttagtt tctctccttc agtaagagag atgtgcaaga 3660
ccagcgatca aactatatga actgttcgtt tcatgataaa aaaaacatga tatggaataa 3720
ctaggtgatt caacatataa tggctgataa tccctcgttt caggagatac catcagtttt 3780
ctacttttct acttttctcc atgttctctt tttcatgttt gaggtggatc ggagcttgta 3840
ttagatgttt gctcagctca attattgctg cagatttccc tatatagcct ccactgtata 3900
tatactccct ccgattccat aatttaatga tattttgaac aatgacgctg tctccaaaat 3960
atatctttca ctttgttttc ctattataat atatacaata aaaaaaatac atatttactt 4020
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ttctagctat gtatctagat aattacaaga accaggtgaa atcacatttt atttttactg 4260
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ggcatcacct gcacaattaa tttggacaca aagtaaacat gaatgcaaca tacttcgttt 4380
catattgttt gttggtgtag gatttaaatt ttgtgtcaaa atacttgccg ttcttactac 4440
attcttaagc actttgagaa ctaaccttct cttcctaccc ttcatcaata cagtcatact 4500
aactaattgg ctcttatgcc ttgaaaaact aattaggatg tatttaatga gggtaaccat 4560
gtaatctgcc accagtgaat gcaattttgg ttcaaaattt cgggcccccg ccctaaaaag 4620
tcattatctc gatagaattt ttttgaattt agtcaaaatt tattcaaatt tagccaaatt 4680
gtgttaaatt tcaaataatt tcagtctaaa aagtgctgaa aatcccgaaa tttaggttct 4740
accgaaatgg ccggaaattt tcagcgaaaa tcaaacatga aaaccttgtc tgccacattt 4800
gttagtttgt gtaaagattt gctagaacga taagtaattt gaagcggatg tatattatat 4860
atcccacaaa accatcaact tgttaattac atgtatattt gtgcatgatg ctttcaccac 4920
tttgtggttg ttaacgatta aatcacacgt tttattttct cacagctgtt tgtgcagagc 4980
aagtgcgtgc tgcctcagct acctctcctg gatctgctgc tgcagcagcg ccgccggcgg 5040
ctgctcatcc tcctcctcct cctccttcaa cctcaagagg ccgagctgct gctgcaactg 5100
caactgcaac tgctgctcct cctcctcctc ctcatgtggg gcggcgttaa cgaagagtcc 5160
gtgtcgctgc cgccgccgca gctgctgctg ccgtcgctgc tgctgcggcg gcgtcggcgt 5220
ccgcgcgtgc gcgagctgca gctgctcccc gccgtgcgcg tgctgcgcgc cgccgtgcgc 5280
gggatgctcg tgccgctgca cctgcccgtg cccgtgcccc ggcggctgct cctgcgcgtg 5340
cccggcgtgc aggtgctgct gcggcgtccc tcgttgctgc cccccctgct tgtgatcgat 5400
cgatcgattg agcgaagctg cactgattgg ttaattaatt agttctcgat gatgatcgat 5460
cgagctgcgc gcgtacttaa ttagctagct aggttctggt gttaattagt tcctcatcga 5520
tgcatatgtt gattgccttg ctctgcttgc ggttatctgt aatttggctt tgctgccatg 5580
atgagtacgt gattgctgat ttattttac 5609
<210> 3
<211> 6429
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 3
gcagcagaga ggtctccact tccctttcct cccaccccga gaaagccaaa aaaagaaaaa 60
ttatttttca aaaaaaaagc tcgcctcgcc ctcgcgtcgt cgtccccatc accccccctc 120
ctccgctccg agtacgcgtg cgtataccac cacctccatc tccaccaccg tatgtatcta 180
cggtgaggcg gcggcggcgg aggaggagga ggagggggag tggtgagggt ttcatctgcg 240
gaggaggagg gaggaggagg gaggagggta gatctgggag ggggatgggg aacaggatag 300
gggggaggag gaaggcgggg gtggaggaga ggtacacgag gccgcagggg ctgtacgagc 360
acagggacat cgaccagaag aagctccgga agctgatcct cgaggccaag ctcgcgccgt 420
gctacatggg cgccgacgac gccgccgccg ccgccgacct cgaggagtgc cccatctgct 480
tcctggtata aaaccgcctc cggggagatg tggcgggtgg acgggaggaa gagatctctc 540
ccctcttcct cacttcctcc tcccgcttcc ttccacttca gctttttctc tctttttttt 600
tggtgggatt ttgtcgtaat gctactacta gtacttgttg ttgcgagagt agggcgtgga 660
ttgcgtgtgg ccgggtggtg gcgtggagcg tttcgattag ggggttgatt acttttgctc 720
ctgttcgatt gtggagagtg ccggtggtgt gtggccgtta tggagatgga tgaccacgcg 780
cagtgttttg gggcaagaat ttcagtcgac attggcacgg ttttggggtt gtttgtattg 840
ttcttggata attagtgcgg ttcgtggagc tgattttgcg aaatgtagta gtagtgtttg 900
aattatttct ggtagttagt agtggtatca tacttcgtat gtacattgtc cgcaatgttc 960
tcctaaattg ttttgttttc ttaatcatag tttacttact tttattatgt aattctgaga 1020
tacgtttttt tgggataatt atagtctagg aggttttggg tactcattta ttattgtcaa 1080
tattctatag gcctatctat tggctgcctg gctgtgatgc attgcatgaa atttaatgtt 1140
tactgccact cccggggttg ggacattaca gaccttatag gaaatttgac tagtttcata 1200
aatgaataat tggccaactg ttctgcaatg ttgggtgcct tcaatttcta atagtggatg 1260
ctctatagag tacggaggta ccatggtgat atttgtttgt tgtgtgtaat actttatttt 1320
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tagatttttt aaaaaaaaat tctgcagctt taatgctact agcttactgc aattaatgtt 1500
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ttgtattata ggagtatatt atatttggtg ttgaattata tgtttgcatt tgtgctaata 1680
gtggtattta acaattatca cttctggtat ttctgagttc aaactgtttg acaaccactc 1740
ctgtcctgaa atgcatgttt tctttctttg tagtactacc caagtcttaa ccgatcaaag 1800
tgttgctcaa aagggatatg caccggtaat acatctatcc tataactaac aattgtgttt 1860
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caataaagat gtccattctg caaaactccc agttatgctg tggagtatcg tggtgtaaag 2100
acaaaggagg aaaggagcat agaacaattt gtaagtaatt tatattctga tgtttttttt 2160
ttgttttgcc aaatgcattt catttatctc acataatatg tgttacagga agagcagaaa 2220
gtcatagaag cacaaatgag gatgcgccag caagcacttc aagatgaaga agataagatg 2280
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tatagagata tttgcagcac atccttttca ggtctgcaca ggctgcaact aacatagaaa 2400
tttagtaatg taccatttct tctgcttgat gtggtaattt actatgtgtt atgtctgttt 2460
cagtgccgtc ataccgatgt gctgagcaag aaactgaatg ctgttcatcg gaaccttcat 2520
gctctgccca gactagcatg cgccctttcc attctaggca taaccggtat gttattatct 2580
ttttctctga gttttagggt gtcattgtag cctggttatg ttgaactgca aaccttacta 2640
cacttctatg ttaaataccc tacctcaacc atgttgaagg gaagcaaatg agaagtattg 2700
ttaaaatagg ataaaggaaa gtaacagtat tatctataga atcaaatcga taacaaagat 2760
caaccgttgg attaaattgg atagtgggga ccagacacca taaaacactg gcatttcgga 2820
caagatcatt taattattcc actttaagct tgtgcagtct gtcctgatcc actgcactat 2880
ttaagtggat gagaagctgt gattggagtt actgttctag tgttaaggtt gacttgtatc 2940
agatacaatt gcctatccag tgacaaagtt tgaatgttta atttgtgaaa gtgtgaatgg 3000
agagaatttc tgcccacatc attgttgtac catgatagtt acagtaatct ttagtttatc 3060
tatactctag agggataaaa acaccaaaac agtttgatca aaattgttcg aggtaaatcc 3120
taagtataaa attgagaatg gatttgtttt tcaatatggt tatttgttat cgacattcag 3180
tgtttttatt tcacacaatg gccaattccg aaaaaacaat ctgggttctt tttatcccac 3240
tgtccatacc aagttgatgt agcaagtaac tactacacaa aatagtatat tgtagccctt 3300
tacatgcatc caatagatta agtggtcttc aatccaagga tgaaataagc aataacgtag 3360
gttccgatac caaattagca caaaacaatg ctaaatgctt ttagaggaag taaaccactc 3420
atttggttct tttacctata aacttgtgtt cgcttgatgt tctcaatatt gtcaggctat 3480
tttatagact tgaggagtaa acatttcttg atgacgttat cttctcctat tgtgctagac 3540
ataaaataca gtgtagcata acttgtgtac tgtgagtttt tttcaagttt ttcttgatgc 3600
tgcacaatag tatacaacaa tcgtctattc agtcacacat ggcacatcct cacatcaaac 3660
agaagttact ttttatgatg ttaatgtgta gtataacagc agaagctaaa cggtagaggg 3720
atacaggata ctcgagtcaa tatgaagttg gggttccatg gagtatttga atcgaataaa 3780
acatcttgat gatcaatatt ggttttcata ttgtttctat aagctagttt catatttttc 3840
tagagaacct attattattt tgcttcctgt cctcctcaga agattgacat tctgtactgg 3900
tagtgaattt gtgtttccct cataccctgt ttgggagggt ttcaacgtca gcttagtgca 3960
gtgctgcaaa gtttaaactc tatgaccaga gcataagtat ggcttaagga cttctgatga 4020
caaagccatt tttgaaacct gaagcctatt ttgatcaact tatgaactta tatggaaaac 4080
cagtttctga aagaggccaa atatcaataa atggtgcctt aatctccctt cagttttata 4140
gtttaccata tggatatttt tcctgtacta agtgtttctt gcttgctggt catgataatc 4200
ctttatgctg ttgagatgaa aatggtttct aaaattatga aactgtgtgt ttccccttac 4260
agtgatgata acattgacat gaatatagag gatatgatgg ttatggaagc gatttggcgt 4320
tccattcagg ttagtagttt tctcactggt ccttacatga gattattgat aatatgcata 4380
tggcatactg tggataatat tataaaagct gatttgttgg gtcaggtaat ggtttgtaaa 4440
tgagctgcac aaaaatagat tgttatttgc attgaacatg aaagtttgct aatctcctgg 4500
catgcttgtt gaattcagag cattttgcga gttctgataa atgcaagatc tagtctgcac 4560
aagcagaacc tgtattgtta agtgttcaat aataaaaaaa aatgtcaatt aaattgttga 4620
gaagtgtatt ggcgatagtg gataatgtag gatatgtttg gtttgaggga ccaacatcag 4680
ttagttcatc attgcctcat tcctcaggca catgctagtg gaaaaatgag taatgcagta 4740
ttcatgccaa aatcatccta gatggtgtga ttcctcaaac aaaacaggcc agtagatgat 4800
ggggttggta agataagtta tctttttgtc attttacttg agcagtactg cgcttggcac 4860
aaaaatattt ctggtcattt tgtgagaaca agaggacttt tcacattcct gcattcctga 4920
agggaactta ttatctaaca gcattgctaa actcagctct tcccatgccc ttagccatca 4980
aattgatttg ttatgatggt tgcattgtta gttttgcggt cccaattatt agccacttaa 5040
cgttcaggtc aggaactaat ggtgtttttt ttctccgtcc tttgtgttat attacctcca 5100
tcctaaaata agtgcagcca tgagtttccg cgcccaactt tgatcgtccg ttttatttga 5160
aattttttta taattagcat ttttgttgtt ataagatgat aaaacatgaa tagtacttta 5220
ctcgtgactt atgtttttga ttttttcaaa aaaatttcaa ataagacgaa tggtcaaagt 5280
tgggcgctga aaaccatggc tgcacttatt ttgggacgga ggtagtatca tttattcatt 5340
tgctgttcaa gctgtagctc atcgtgtact gttccccaat aagttgcttg ccatttggtc 5400
tatgtttcca gcttctttct tttgtgagca tttttccttc tgtatagctt gttactagaa 5460
agatgtaaac tttatgttaa atgctgcttc atctttgaat ttagattctt gggaataaac 5520
aataagcaaa gttcatgtat tgcgtataga aaagtctgca tatatttcta tcctaatacg 5580
gtcaatcttt tctctgagca ggagcaggga agtataggga atcctgtctg tggcaacttt 5640
atgcctgtaa ctgagccatc tccgcgtgaa cgccagccat tcgttccagc tgcttctcta 5700
gaaatacctc atggtggtgg attttcctgt gcggttgcgg caatggctga gcaccagcca 5760
cccagtatgg acttctctta catggctggc agcagcgcat tcccagtttt cgacatgttc 5820
cggcgaccat gcaacattgc tggtggaagc atgtgtaatc tggagagctc accggagagc 5880
tggagcggga tagcaccaag ctgcagcagg gaagtggtaa gagaagaagg agagtgctcg 5940
gctgaccact ggtcggaggg tgcagaggcc ggaacaagct acgcgggctc agacatcgtg 6000
gcagatgccg ggaccatgcc gcagctgcct ttcgccgaga acttcgccat ggcgccaagc 6060
cacttccgcc cggagagcat cgaagaacag atgatgtttt ccatggctct ttctttagca 6120
gatggtcatg gaagaacaca ctcgcaaggg ttggcatggt tgtaggtaga gcactctaat 6180
tttgacgcct tgctgccctc tcccttgcgc tgctgttgct gcccttctct cccctgcctc 6240
ctgcttctgc ctcctttttg ccaccagctc ttggcctttt tgttcacccc ttttttgcat 6300
gtgttttgtc gtcatggttt gatatagatc cagctatagc tctccattgt tattgcttat 6360
atgtatgtaa aatggaatat gaggaaatag aaaaaaggaa aatgggtcaa cagttctttt 6420
ggcagtagg 6429
<210> 4
<211> 3085
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 4
cacacacaca cacactcaca ctcacacacg ctctcaactc actcccgctc aacacagcgc 60
tcacttctca tctccaatct catggtggcc gagcacccca cgccaccaca gccgcaccaa 120
ccaccgccca tggactccac cgccggctct ggcattgccg ccccggcggc ggcggcggtg 180
tgcgacctga ggatggagcc caagatcccg gagccattcg tgtggccgaa cggcgacgcg 240
aggccggcgt cggcggcgga gctggacatg cccgtggtcg acgtgggcgt gctccgcgac 300
ggcgacgccg aggggctgcg ccgcgccgcg gcgcaggtgg ccgccgcgtg cgccacgcac 360
gggttcttcc aggtgtccga gcacggcgtc gacgccgctc tggcgcgcgc cgcgctcgac 420
ggcgccagcg acttcttccg cctcccgctc gccgagaagc gccgcgcgcg ccgcgtcccg 480
ggcaccgtgt ccggctacac cagcgcccac gccgaccgct tcgcctccaa gctcccatgg 540
aaggagaccc tctccttcgg cttccacgac cgcgccgccg cccccgtcgt cgccgactac 600
ttctccagca ccctcggccc cgacttcgcg ccaatggggt aattaaaacg atggtggacg 660
acattgcatt tcaaattcaa aacaaattca aaacacaccg accgagatta tgctgaattc 720
aaacgcgttt gtgcgcgcag gagggtgtac cagaagtact gcgaggagat gaaggagctg 780
tcgctgacga tcatggaact cctggagctg agcctgggcg tggagcgagg ctactacagg 840
gagttcttcg cggacagcag ctcaatcatg cggtgcaact actacccgcc atgcccggag 900
ccggagcgga cgctcggcac gggcccgcac tgcgacccca ccgccctcac catcctcctc 960
caggacgacg tcggcggcct cgaggtcctc gtcgacggcg aatggcgccc cgtcagcccc 1020
gtccccggcg ccatggtcat caacatcggc gacaccttca tggtaaacca tctcctattc 1080
tcctctcctc tgttctcctc tgcttcgaag caacagaaca agtaattcaa gctttttttt 1140
ctctctcgcg cgaaattgac gagaaaaata agatcgtggt aggggcgggg ctttcagctg 1200
aaagcgggaa gaaaccgacc tgacgtgatt tctctgttcc aatcacaaac aatggaatgc 1260
cccactcctc catgtgttat gatttatctc acatcttata gttaatagga gtaagtaaca 1320
agctactttt ttcatattat agttcgtttg attttttttt tttaaagttt ttttagtttt 1380
atccaaattt attgaaaaac ttagcaacgt ttataatacc aaattagtct catttagttt 1440
aatattgtat atattttgat aatatattta tgttatatta aaaatattac tatatttttc 1500
tataaacatt attaaaagcc atttataata taaaatggaa ggagtaatta atatggatct 1560
cccccgacat gagaatattt tccgatggtg tgacgacgcc atgtaagctt cggtgggcct 1620
ggacggccag aggtgccaac agccacgtcc aacaacccct gggtcccccc ctaacactcc 1680
aaacagtagt gagtagtgtc tcgtcgcgtt ttagtatttg atgacaaaca aagtgtgagt 1740
tgagttagcc accaccaact tgcacacgag cacatacatt tgtgtccatt ctcgccagtc 1800
acttccatct ctagtcctaa ctcctatcta gcgatgtaag cggataattt catcatccgt 1860
atataaacct gtttgttata gttaatttcc tatataatac tataacagta tacattttaa 1920
aagaaaacaa aattaggata aacaggccct gctcctatcc atccatggca cttggaagga 1980
ccagactcgg tcatgccatg ccaagccaag atatgggtta tggaagagta gagaagagga 2040
gagatgagag ataagcatgc gttctcctcc tcgttggatg tgtattttgg agggatttgt 2100
gtagtagtag cagcggcgcc gcggggacgg atgcggatgg tggcgctttc ggtggcgttt 2160
tcccgggggg gttttggttt ggcgcttggg ggggatggca tggcgcggcg tgcggctgca 2220
cgccacacac acgcgcgcgc acgcacgtac gtcgtcgtcg ccgcgggcgg acggtagctt 2280
agggtggtgt gttccgcgcg cgggcgcgga ttgttccatg ccgatcgatt tggcgccacc 2340
ctcgccgcgg ctcttgtcgc gtcgtgcgcc tctctcgcgc ggtttgtcct tgtcgcgttg 2400
ctcagccggc gacgggggca cggacattgg cgatgtagcc ctgcacgtgt cggcctctcc 2460
gttgatgaat gatgatgtat gtatgtattt ttttttgtct gaaggaattt gtggggaatt 2520
gttgtgtgtg caggcgctgt cgaacgggag gtataagagc tgcctgcaca gggcggtggt 2580
gaaccagcgg cgggagcggc ggtcgctggc gttcttcctg tgcccgcggg aggacagggt 2640
ggtgcggccg ccgccgagcg ccgccacgcc gcagcactac ccggacttca cctgggccga 2700
cctcatgcgc ttcacgcagc gccactaccg cgccgacacc cgcacgctcg acgccttcac 2760
gcgctggctc gcgccgccgg ccgccgacgc cgccgcgacg gcgcaggtcg aggcggccag 2820
ctgatcgccg aacggaacga aacggaacga acagaagccg atttttggcg gggcccacgc 2880
ccacgtgagg ccccacgtgg acagtgggcc cgggcggagg tggcacccac gtggaccgcg 2940
ggccccgcgc cgccttccaa ttttggaccc taccgctgta catattcata tattgcaaga 3000
agaagcaaaa cgtacgtgtg ggttgggttg ggcttctctc tattactaaa aaaaatataa 3060
tggaacgacg gatgaatgga tgctt 3085

Claims (7)

1.一种多基因编辑提高早稻产量的方法，其特征在于，所述方法利用CRISPR/cas9基因敲除系统构建多靶点表达载体，采用农杆菌介导的方法将多靶点表达载体转化早稻愈伤组织，对靶点基因DEP1，基因GS3、基因GW2和基因SD1中的至少两种进行定点敲除获得提高早稻产量的多基因敲除突变体。
2.根据权利要求1所述的多基因编辑提高早稻产量的方法，其特征在于，利用CRISPR/cas9基因敲除系统构建多靶点表达载体对下列组合的靶点基因进行定点敲除：
基因GS3、基因GW2和基因SD1；
或基因GW2、基因GS3和基因DEP1；
或基因GW2、基因SD1和基因DEP1；
或基因SD1、基因GS3和基因DEP1；
或基因DEP1、基因GS3、基因GW2和基因SD1；
或基因GW2和基因SD1。
3.根据权利要求1所述的多基因编辑提高早稻产量的方法，其特征在于，
所述基因DEP1的靶点位于第5外显子，位于基因组第3353-3372位碱基，靶点序列为GATCTTGAAGCAGCTGTACA；
所述基因GS3的靶点位于第1外显子，位于基因组第117-136位碱基，靶点序列为GACGCGCTCCACCGCGAGAT；
所述基因GW2的靶点位于第4外显子，位于基因组第2071-2090位碱基，靶点序列为AGTTATGCTGTGGAGTATCG；
所述基因SD1的靶点位于第1外显子，位于基因组第356-375位碱基，靶点序列CACCTGGAAGAACCCGTGCG。
4.根据权利要求1所述的多基因编辑提高早稻产量的方法，其特征在于，所述早稻为籼系早稻陆引46品种。
5.根据权利要求1所述的多基因编辑提高早稻产量的方法，其特征在于，所述多靶点表达载体中sgRNA序列来源于pYLCRISPR/sgRNA vectors菌种的质粒，靶点基因的启动子选用OsU6a、OsU6b、OsU6c和OsU3a中的至少两种；骨架载体来源于pYLCRISPR/Cas9菌种的质粒。
6.根据权利要求5所述的多基因编辑提高早稻产量的方法，其特征在于，所述多靶点表达载体中sgRNA表达盒连接方式选用下列任一种：
LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1；
LacZ-U6a-GW2---U6c-GS3---U3-DEP1；
LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1----U3-DEP1；
LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1---U6c-GS3；
U6b-SD1---U6c-GS3---U3-DEP1；
LacZ-U6a-GW2---U6b-SD1；
其中，GW2、SD1、GS3和DEP1分别表示相应基因的靶点序列。
7.根据权利要求1所述的多基因编辑提高早稻产量的方法，其特征在于，所述靶点接头引物如下：
GW2-T-F：GCCGAGTTATGCTGTGGAGTATCG；
GW2-T-R：AAACCGATACTCCACAGCATAACT；
SD1-T-F：GTTGCACCTGGAAGAACCCGTGCG；
SD1-T-R：AAACCGCACGGGTTCTTCCAGGTG；
GS3-T-F：TCAGACGCGCTCCACCGCGAGAT；
GS3-T-R：AAACATCTCGCGGTGGAGCGCGT；
DEP1-T-F：GGCAGATCTTGAAGCAGCTGTACA；
DEP1-T-R：AAACTGTACAGCTGCTTCAAGATC。
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