CN114438119B - 一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用 - Google Patents
一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114438119B CN114438119B CN202210151249.7A CN202210151249A CN114438119B CN 114438119 B CN114438119 B CN 114438119B CN 202210151249 A CN202210151249 A CN 202210151249A CN 114438119 B CN114438119 B CN 114438119B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- gene
- osmyb36a
- genes
- expression cassette
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
- C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
- C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法，将CRISPR/Cas9基因编辑技术和其它标签基因联合使用，分别构建OsMYB36a/b/c‑sgRNA表达盒，再通过酶切‑连接反应将它们与带标签的目的基因片段连接起来，得到OsMYB36a/b/c三基因敲除且携带待研究基因和表达标签的三敲载体，转化得到携带标记的多基因突变体水稻植株。本发明既能造成敲除靶点基因的突变又能启动带标签基因的表达，使多基因突变对其它基因影响的研究可视化。并且，该方法操作简单方便，通用性强。有助于节省研究时间、加快研究进度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用。
背景技术
突变体是研究基因功能的重要材料，其获得的方式也在迅速发展。在1927年，通过X射线诱发果蝇和玉米基因突变，以及后来用化学诱变剂和氮芥诱发果蝇的突变等。但是这些突变都是随机的，需要大量的筛选工作才能找到目的基因突变的材料，而且突变多以单碱基的替换为主，严重影响了对特定基因的研究。
直到1996年，ZFN(锌指核酸酶)的发现，人类对基因编辑开始有了新的认识。可以人为设计特异性识别目标DNA序列的锌指核酸酶，其与目标DNA结合后，FOKI核酸内切酶形成二聚体，将DNA双链切断，引发DNA的修复，造成基因敲除或插入，从而获得目标基因的突变。然而，这种突变的成功率较低，脱靶现象严重。在2011年，对改技术进行了改进，发展出了TALEN(转录激活效应因子核酸酶)技术。通过一对特异性识别DNA序列的蛋白分子TALE(Left TALE和Right TALE)与核酸内切酶FOKI结合，特异性靶向目标基因。然后通过Ⅲ型分泌系统将效应蛋白(TAL effector)输入细胞，并通过核酸内切酶FOKI切割DNA双链，引发DNA的修复，从而达到对基因的重编辑，获得目标基因的突变。但该技术对目标基因的序列特异性要求较高，并且脱靶效率仍然较高。
在2013年，CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短会问重复序列)技术的出现，给基因编辑技术带来了空前的进步，使人们对基因功能的研究达到了前所未有的热度。该技术主要是通过gRNA(guide RNA)特异性识别目标序列，引导Cas9蛋白酶对DNA双链进行切割，引发DNA修复，造成基因的敲除或插入，使基因发生移码突变。该技术操作方便，打靶效率高，已应用于众多领域的研究。
但是，在对敲除基因的研究过程中，科研人员常研究它们的上下游基因，以及该基因对其它基因的调控关系和影响。科研人员通常会筛选出不含筛选标记的敲除突变体，再将携带有特殊标记(如GFP、Flag、HA等标记)或其它片段(如：过表达片段等)转入，从而研究突变体对其它基因的影响。该过程不仅复杂、成本较高，而且耗时耗力，严重影响了科研的进度。对于研究多突变体对其它基因的影响时，利用常规的杂交获得不含筛选标记的突变体更加困难。另外，对繁殖周期较长的物种(如树木类)，用常规方法研究多基因之间的关系更加困难。
水稻OsMYB36a/b/c是与拟南芥AtMYB36最同源的三个基因。同时敲除三个基因可能会影响内皮层凯氏带的形成。然而凯氏带的缺陷会严重影响植株的生长发育，如OsCASP1基因的突变导致水稻长势极差而且结实很少。因此，研究OsMYB36a/b/c突变对凯氏带形成、内皮层极性蛋白的影响，通过传统的方法先筛选不含标记的OsMYB36a/b/c突变体，并得到足够的种子，再将其它带标签的目的基因转入，不但增加研究成本，而且周期很长，并且OsMYB36a/b/c突变体种子的获得十分困难。因此通过本发明可以轻松解决以上问题，并为多基因突变体对其它基因的研究提供有效的方案。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法，包括以下步骤：
步骤S1，将待研究基因转入带有表达标签的表达载体中，构建中间融合载体；
步骤S2，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计水稻的OsMYB36a基因、OsMYB36b基因和OsMYB36c基因的敲除靶点，设计靶点引物，先通过第一轮PCR将三个基因的靶点分别组装到三个不同的载体上，再以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二轮PCR引入接头，分别得到OsMYB36a-sgRNA表达盒A1、OsMYB36b-sgRNA表达盒A2和OsMYB36c-sgRNA表达盒A3；
其中，在第一轮PCR扩增中：将OsMYB36a基因靶点组装到pYLsgRNA-OsU6a/LacZ(GeneBank:KR029106)载体上，所用的PCR引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示；将OsMYB36b基因靶点组装到pYLsgRNA-OsU6b(GeneBank:KR029107)载体上，所用的PCR引物如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示；将OsMYB36c基因靶点组装到pYLsgRNA-OsU3m/LacZ(GeneBank:KR559260)载体上，所用的PCR引物如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示；
其中，在第二轮PCR扩增中：扩增出OsMYB36a-sgRNA表达盒A1的引物组如SEQ IDNO.13～SEQ ID NO.14所示，扩增出OsMYB36b-sgRNA表达盒A2的引物组如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16所示，扩增出OsMYB36c-sgRNA表达盒A3的引物组如SEQ ID NO.17～SEQ IDNO.18所示；
步骤S3，通过PCR从步骤S1得到的中间融合载体中扩增出带有待研究基因和表达标签的目的片段，将其作为第四个表达盒；
步骤S4，如果步骤S3所述的目的片段不含有BsaⅠ酶切位点，则将步骤S2得到的三个表达盒、步骤S4的第四个表达盒纯化后，与双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H进行酶切-连接反应，从而得到OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三基因敲除且携带待研究基因和表达标签的三敲载体；
步骤S5，如果步骤S3所述的目的片段含有BsaⅠ酶切位点，则按照以下步骤操作：
步骤S51，对步骤S2得到的第一轮产物，按照下面引物进行第二轮PCR，得到OsMYB36a-sgRNA表达盒B1、OsMYB36b-sgRNA表达盒B2和OsMYB36c-sgRNA表达盒B3；
在第二轮PCR中，扩增出OsMYB36a-sgRNA表达盒B1的引物组如SEQ ID NO.13～SEQID NO.14所示，扩增出OsMYB36b-sgRNA表达盒B2的引物组如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16所示，扩增出OsMYB36c-sgRNA表达盒B3的引物组如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.20所示；
步骤S52，将步骤S51得到的三个表达盒纯化后，与双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H进行酶切-连接反应，从而得到OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三个基因的三敲载体；
步骤S53，将步骤S52得到的三敲载体线性化，再将步骤S3得到的目的片段插入三敲载体中，从而得到OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三基因敲除且携带待研究基因和表达标签的三敲载体；
步骤S6，将步骤S4或步骤S5构建的三敲载体转化水稻，经筛选获得OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三基因突变的突变体水稻植株。
其中，步骤S1中的待研究基因为水稻OsCASP1基因(Os04g0684300)、水稻OsLsi1基因(Os02g0745100)或水稻OsIDD3基因(Os09g0555700)。
其中，步骤S1中的待研究基因包括了基因的启动子序列和CDS序列。
其中，步骤S1中的表达载体为pCAMBIA1301-GFP，它带有的表达标签是GFP。
其中，当待研究基因为水稻OsCASP1基因时，步骤S3的PCR引物序列如SEQ IDNO.21～SEQ ID NO.22所示。
其中，当待研究基因为水稻OsLsi1基因时，步骤S3的PCR引物序列如SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.24所示。
其中，当待研究基因为水稻OsIDD3基因时，步骤S3的PCR引物序列如SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.26所示。
其中，步骤S6中，将步骤S4或步骤S5构建的三敲载体转化水稻愈伤组织。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过一次转化直接将基因敲除表达盒和表达标签转入植株，省去了筛选无标记基因植株再次转化的时间，做到了一步到位，直接研究一个或多个基因对其他基因的影响，节省研究时间、加快研究进度；
(2)通过一次转化可以直接获得原本需要两次转化的效果，节省了研究费用；
(3)本发明的方法适用性强、操作方便，通过对常规的酶切连接方法进行改造便能实现该融合载体的构建。
说明书附图
图1为本发明的步骤S3得到得目的片段不含有BsaⅠ酶切位点时，构建带标记的多基因敲除载体的构建原理图；
图2为为本发明的步骤S3得到得目的片段含有BsaⅠ酶切位点时，构建带标记的多基因敲除载体的构建原理图；
图3为实施例1和实施例2得到的突变体水稻植株的表型；
图4为OsMYB36a/b/c敲除突变体对OsLsi1定位的影响；
图5为OsMYB36a/b/c敲除突变体对OsCASP1定位的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、实际若无特殊说明，皆为市售所得。
实施例1
步骤S1，将待研究基因转入带有表达标签的表达载体中，构建中间融合载体：
从NCBI中找出OsCASP1(Os04g0684300)基因的启动子序列，用引物对POsCASP1-GFP-F和POsCASP1-atg-R从水稻(Nipponbare)基因组DNA中扩增出2.082kb的OsCASP1启动子序列，同时用引物POsCASP1-atg-F和POsCASP1-GFP-R从日本晴水稻根部cDNA中扩增出OsCASP1的CDS。利用In-Fusion HD cloning kit(Takara公司)将扩增片段插入pCAMBIA1301-GFP载体中，得到ProOsCASP1-OsCASP1-GFP中间融合载体，测序正确后备用。
表1扩增OsCASP1(Os04g0684300)基因启动子和CDS的引物表
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 序列编号 |
| POsCASP1-GFP-F | GGCCAGTGCCAAGCTTAGTTGGTACGATGGTTTCTCCGAC | SEQ ID NO.27 |
| POsCASP1-atg-R | CGGCAGGCTCGCCGGAGCTCAT | SEQ ID NO.28 |
| POsCASP1-atg-F | ATGAGCTCCGGCGAGCCTGCCG | SEQ ID NO.29 |
| POsCASP1-GFP-R | TGCTCACCATGGATCCGCGCTTGCGGATAGAGCAGGCG | SEQ ID NO.30 |
步骤S2，通过CRISPR-P2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)网站设计水稻的OsMYB36a基因、OsMYB36b基因和OsMYB36c基因的敲除靶点，设计靶点引物，用重叠PCR的方法构建sgRNA表达盒。先通过第一轮PCR将三个基因的靶点分别组装到三个不同的载体上，再以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二轮PCR引入接头，分别得到OsMYB36a-sgRNA表达盒A1、OsMYB36b-sgRNA表达盒A2和OsMYB36c-sgRNA表达盒A3；
其中，在第一轮PCR扩增中：将OsMYB36a基因靶点组装到pYLsgRNA-OsU6a/LacZ(GeneBank:KR029106)载体上，所用的PCR引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示；将OsMYB36b基因靶点组装到pYLsgRNA-OsU6b(GeneBank:KR029107)载体上，所用的PCR引物如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示；将OsMYB36c基因靶点组装到pYLsgRNA-OsU3m/LacZ(GeneBank:KR559260)载体上，所用的PCR引物如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示；
表2第一轮PCR引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 序列编号 |
| U-F | CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG | SEQ ID NO.1 |
| OsMYB36a-gRTF | GCAGCCTCTACATTAGCATAGTTTTAGAGCTAGAAAT | SEQ ID NO.2 |
| OsMYB36a-Lac-Z-U6a | TATGCTAATGTAGAGGCTGCCGGCAGCCAAGCCAGCA | SEQ ID NO.3 |
| gR-R | CGGAGGAAAATTCCATCCAC | SEQ ID NO.4 |
| U-F | CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG | SEQ ID NO.5 |
| OsMYB36b-gRT | TGTAGCCTCTACATTAGCATGTTTTAGAGCTAGAAAT | SEQ ID NO.6 |
| OsMYB36b-Lac-Z-U3 | ATGCTAATGTAGAGGCTACATGCCACGGATCATCTGC | SEQ ID NO.7 |
| gR-R | CGGAGGAAAATTCCATCCAC | SEQ ID NO.8 |
| U-F | CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG | SEQ ID NO.9 |
| OsMYB36c-gRTF | CGGCCGAACATCAAGCACGGGTTTTAGAGCTAGAAAT | SEQ ID NO.10 |
| OsMYB36c-U6b | CCGTGCTTGATGTTCGGCCGCAACACAAGCGGCAGC | SEQ ID NO.11 |
| gR-R | CGGAGGAAAATTCCATCCAC | SEQ ID NO.12 |
表3第一轮PCR反应体系
将试剂混匀后，瞬时离心，进行PCR扩增，25-28个循环
其中，在第二轮PCR扩增中：扩增出OsMYB36a-sgRNA表达盒A1的引物组如SEQ IDNO.13～SEQ ID NO.14所示，扩增出OsMYB36b-sgRNA表达盒A2的引物组如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16所示，扩增出OsMYB36c-sgRNA表达盒A3的引物组如SEQ ID NO.17～SEQ IDNO.18所示；
表4第二轮PCR引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 序列编号 |
| Pps-GGL | TTCAGAggtctcTctcgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG | SEQ ID NO.13 |
| Pgs-GG2 | AGCGTGggtctcGtcagggTCCATCCACTCCAAGCTC | SEQ ID NO.14 |
| Pps-GG3 | TTCAGAggtctcTaagacttTGGAATCGGCAGCAAAGG | SEQ ID NO.15 |
| Pgs-GG4 | AGCGTGggtctcGagcgcttTCCATCCACTCCAAGCTC | SEQ ID NO.16 |
| Pps-GG2 | TTCAGAggtctcTctgacacTGGAATCGGCAGCAAAGG | SEQ ID NO.17 |
| Pgs-GG3 | AGCGTGggtctcGtcttcacTCCATCCACTCCAAGCTC | SEQ ID NO.18 |
步骤S3，用引物对Cas-POsCASP1-GFP-F和Cas-POsCASP1-GFP-R从步骤S1得到的中间融合载体中扩增出POsCASP1-OsCASP1-GFP-nos目的片段，将其作为第四个表达盒；
表5扩增POsCASP1-OsCASP1-GFP-nos目的片段的引物
步骤S4，在本实施例中，步骤S3的目的片段不含有BsaⅠ酶切位点，因此，步骤S2得到的三个表达盒、步骤S4的第四个表达盒纯化后，与双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H进行酶切-连接反应，酶切-连接反应体系见表6，酶切-连接反应条件：先3个循环(37℃for10min,10℃for 5min,20℃for 5min)；再10个循环(37℃for 3min,10℃for 5min,20℃for5min)。最后37℃for 5min。反应后立即转化或放入-20℃备用。取10μl酶切-连接反应产物，加入100μl的DH5α感受态中，菌落PCR鉴定阳性克隆后，提取质粒并测序。从而得到OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三基因敲除且携带OsCASP1基因启动子、CDS以及表达标签GFP的三敲载体，命名为OsMYB36a/b/c-POsCASP1-OsCASP1-GFP。
表6酶切-连接反应体系
步骤S5，将步骤S4构建的三敲载体经农杆菌菌株EHA101转化到水稻日本晴愈伤组织中。鉴定出携带POsCASP1-OsCASP1-GFP的OsMYB36a/b/c突变体水稻植株。
实施例2
步骤S1，将待研究基因转入带有表达标签的表达载体中，构建中间融合载体：
从NCBI中找出OsLsi1(Os02g0745100)基因的启动子序列，用引物对POsLsi1-GFP-F和POsLsi1-GFP-R从水稻(Nipponbare)基因组DNA中扩增出约2000bp的启动子序列和3094bp的基因序列(去除终止密码子)扩增片段插入pCAMBIA1301-GFP载体中，得到POsLsi1-OsLsi1-GFP中间融合载体，测序正确后备用。
表7扩增Lsi1(Os02g0745100)基因启动子和CDS的引物表
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 序列编号 |
| POsLsi1-GFP-F | CCCAAGCTTACCTGATTGAAACACCTCGTGAAC | SEQ ID NO.31 |
| POsLsi1-GFP-R | CCCAAGCTTCACTTGGATGTTCTCCATCTCGTC | SEQ ID NO.32 |
步骤S2，按照实施例1的步骤S2的方法制备OsMYB36a-sgRNA表达盒A1、OsMYB36b-sgRNA表达盒A2和OsMYB36c-sgRNA表达盒A3；
步骤S3，用引物对引物Cas-PLsi1-GFP-F和Cas-PGFPnos-R从步骤S1得到的中间融合载体中扩增出POsLsi1-OsLsi1-GFP-nos目的片段，将其作为第四个表达盒；
表8扩增POsLsi1-OsLsi1-GFP-nos目的片段的引物
步骤S4，在本实施例中，步骤S3的目的片段不含有BsaⅠ酶切位点，因此，按照实施例1步骤S4的方法构建得到OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三基因敲除且携带OsLsi1基因启动子、CDS以及表达标签GFP的三敲载体，命名为OsMYB36a/b/c-POsLsi1-OsLsi1-GFP。
步骤S5，将步骤S4构建的三敲载体经农杆菌菌株EHA101转化到水稻日本晴愈伤组织中。鉴定出携带POsLsi1-OsLsi1-GFP的OsMYB36a/b/c的突变体水稻植株。
实施例3
步骤S1，将待研究基因转入带有表达标签的表达载体中，构建中间融合载体：
从NCBI中找出OsIDD3基因(Os09g0555700)基因的启动子序列，用引物对POsIDD3-GFP-F和POsIDD3-atg-R从水稻(Nipponbare)基因组DNA中扩增出200bp的OsIDD3启动子序列，同时用引物POsIDD3-atg-F和POsIDD3-GFP-R从日本晴水稻根部cDNA中扩增出OsIDD3的CDS。利用In-Fusion HD cloning kit(Takara公司)将扩增片段插入pCAMBIA1301-GFP载体中，得到POsIDD3-OsIDD3-GFP中间融合载体，测序正确后备用。
表9扩增OsIDD3基因(Os09g0555700)基因启动子和CDS的引物表
步骤S2，按照实施例1的步骤S2的方法制备OsMYB36a-sgRNA表达盒A1、OsMYB36b-sgRNA表达盒A2和OsMYB36c-sgRNA表达盒A3；
步骤S3，用引物对引物Cas-PLsi1-GFP-F和Cas-PGFPnos-RCas-POsIDD3-GFP-F和Cas-PGFPnos-R从步骤S1得到的中间融合载体中扩增出POsIDD3-OsIDD3-GFP-nos目的片段，将其作为第四个表达盒；
表10扩增POsIDD3-OsIDD3-GFP-nos目的片段的引物
步骤S4，在本实施例中，步骤S3的目的片段含有BsaⅠ酶切位点，因此按照以下步骤操作：
步骤S41，对步骤S2得到第一轮产物，使用表11的引物进行第二轮PCR，得到OsMYB36a-sgRNA表达盒B1、OsMYB36b-sgRNA表达盒B2和OsMYB36c-sgRNA表达盒B3；
在第二轮PCR中，扩增出OsMYB36a-sgRNA表达盒B1的引物组如SEQ ID NO.13～SEQID NO.14所示，扩增出OsMYB36b-sgRNA表达盒B2的引物组如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示，扩增出OsMYB36c-sgRNA表达盒B3的引物组如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.20所示；
通过第二轮PCR，去除了Lac-Z-OsU3前面的MluⅠ酶切位点以及Pgs-GGR引物引入的MluⅠ酶切位点；
表11目的片段含有BsaⅠ酶切位点的第二轮PCR的引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 序列编号 |
| Pps-GGL | TTCAGAggtctcTctcgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG | SEQ ID NO.13 |
| Pgs-GG2 | AGCGTGggtctcGtcagggTCCATCCACTCCAAGCTC | SEQ ID NO.14 |
| Pps-GG3-2 | TTCAGAggtctcTaagacttTTGACATTGTAGGACTATATTGC | SEQ ID NO.19 |
| Pgs-GGR-2 | AGCGTGggtctcGaccgATCCATCCACTCCAAGCTC | SEQ ID NO.20 |
| Pps-GG2 | TTCAGAggtctcTctgacacTGGAATCGGCAGCAAAGG | SEQ ID NO.17 |
| Pgs-GG3 | AGCGTGggtctcGtcttcacTCCATCCACTCCAAGCTC | SEQ ID NO.18 |
步骤S42，将步骤S41得到的三个表达盒纯化后，与双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H进行酶切-连接反应，酶切-连接反应体系见表12，酶切-连接反应条件：先3个循环(37℃for 10min,10℃for 5min,20℃for 5min)；再10个循环(37℃for 3min,10℃for 5min,20℃for 5min)。最后37℃for 5min。反应后立即转化或放入-20℃备用。取10μl酶切-连接反应产物，加入100μl的DH5α感受态中，菌落PCR鉴定阳性克隆后，提取质粒并测序。从而得到OsU6a-sgRNA:OsU6b-sgRNA:OsU3-sgRNA的三敲载体；
表12酶切-连接反应体系
步骤S53，将步骤S52得到的三敲载体线性化，用In-Fusion HD cloning kit(Takara)将步骤S3得到的目的片段插入三敲载体中，从而得到OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三基因敲除且携带待研究基因和表达标签的三敲载体，命名为OsMYB36a/b/c-POsIDD3-OsIDD3-GFP；
步骤S6，将步骤S4构建的三敲载体经农杆菌菌株EHA101转化到水稻日本晴愈伤组织中。鉴定出携带OsMYB36a/b/c-POsIDD3-OsIDD3-GFP的突变体水稻植株。
实施例4实施例1-2得到的突变体水稻植株的表型
将实施例1-2得到的突变体水稻植株与野生型水稻一起培养在6L的盆中，生产至成熟期，植株的照片如图3所示，从图3可以看出和野生型相比，这实施例1-2的突变体水稻植株的长势都明显很弱。表现为株高降低，分蘖数减少等特征。结果表明的方法能够实现OsMYB36a/b/c三基因同时突变。
实施例5OsMYB36a/b/c敲除突变体对OsCASP1定位的影响
为了研究携带POsCASP1-OsCASP1-GFP的OsMYB36a/b/c突变体植株对OsCASP1的影响。按照Yamaji和Ma(amaji N,Ma J F.Spatial Distribution andTemporal Variationofthe Rice Silicon Transporter Lsi1[J].Plant Physiol,2007,143(3):1306-1313)所述的方法进行抗体染色。结果如图4所示，野生型植株(A和B，B是A的放大图)中的OsOsCASP1-GFP能够在内皮层极性定位，而在实施例1的OsMYB36a/b/c突变体植株(C和D，C是D的放大图)的内皮层中没有观察到GFP信号。结果表明，OsMYB36a/b/c的敲除导致OsCASP1在根中不表达。
实施例6OsMYB36a/b/c敲除突变体对OsLsi1定位的影响
为了研究携带POsLsi1-OsLsi1-GFP的osmyb36a/b/c突变体植株对OsLsi1的影响。按照Yamaji和Ma(amaji N,Ma J F.Spatial Distribution and Temporal Variationofthe Rice Silicon Transporter Lsi1[J].Plant Physiol,2007,143(3):1306-1313)所述的方法进行抗体染色。结果如图5所示，野生型植株(A和B，B是A的放大图)中的OsLsi1-GFP能够在内皮层和外皮层极性定位，而在实施例2的OsMYB36a/b/c突变体植株(C和D，C是D的放大图)中OsLsi1-GFP在外皮层的正常极性定位，而在内皮层没有观察到GFP信号。结果表明OsMYB36a/b/c敲除后，OsLsi1在内皮层中不表达，但不影响其在外皮层中的定位。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西大学
<120> 一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用
<130> JC
<160> 36
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ctccgtttta cctgtggaat cg 22
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gcagcctcta cattagcata gttttagagc tagaaat 37
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
tatgctaatg tagaggctgc cggcagccaa gccagca 37
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
cggaggaaaa ttccatccac 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ctccgtttta cctgtggaat cg 22
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
tgtagcctct acattagcat gttttagagc tagaaat 37
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
atgctaatgt agaggctaca tgccacggat catctgc 37
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
cggaggaaaa ttccatccac 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
ctccgtttta cctgtggaat cg 22
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
cggccgaaca tcaagcacgg gttttagagc tagaaat 37
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
ccgtgcttga tgttcggccg caacacaagc ggcagc 36
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
cggaggaaaa ttccatccac 20
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa gg 42
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
ttcagaggtc tctaagactt tggaatcggc agcaaagg 38
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
agcgtgggtc tcgagcgctt tccatccact ccaagctc 38
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
agcgtgggtc tcgtcttcac tccatccact ccaagctc 38
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
ttcagaggtc tctaagactt ttgacattgt aggactatat tgc 43
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 20
agcgtgggtc tcgaccgatc catccactcc aagctc 36
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 21
ttcagaggtc tctcgctaca agttggtacg atggtttctc cgac 44
<210> 22
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 22
agcgtgggtc tcgaccgacg cgtgatctag taacatagat gacaccg 47
<210> 23
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 23
ttcagaggtc tctcgctaca acctgattga aacacctcgt gaac 44
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 24
agcgtgggtc tcgaccgacg cgtgatctag taacatagat gacaccg 47
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 25
aatcggcagc aaaggacgcg tctaacatgc acgtttggag gtccg 45
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 26
agtcctacaa tgtcaacgcg tgatctagta acatagatga caccg 45
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 27
ggccagtgcc aagcttagtt ggtacgatgg tttctccgac 40
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 28
cggcaggctc gccggagctc at 22
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 29
atgagctccg gcgagcctgc cg 22
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 30
tgctcaccat ggatccgcgc ttgcggatag agcaggcg 38
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 31
cccaagctta cctgattgaa acacctcgtg aac 33
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 32
cccaagcttc acttggatgt tctccatctc gtc 33
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 33
acgacggcca gtgccaagct tctaacatgc acgtttggag gtccg 45
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 34
acagggagag atcgatcact acagc 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 35
gctgtagtga tcgatctctc cctgt 25
<210> 36
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 36
gcccttgctc accatggatc cgttcatgtt tgccgggtcc agtgag 46
Claims (7)
1.一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，将待研究基因转入带有表达标签的表达载体中，构建中间融合载体；
步骤S2，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计水稻的OsMYB36a基因、OsMYB36b基因和OsMYB36c基因的敲除靶点，设计靶点引物，先通过第一轮PCR将三个基因的靶点分别与含有不同启动子的sgRNA组装，再以第一轮PCR扩增的产物为模板，通过第二轮PCR引入接头，分别得到OsMYB36a-sgRNA表达盒A1、OsMYB36b-sgRNA表达盒A2和OsMYB36c-sgRNA表达盒A3；
其中，在第一轮PCR扩增中：将OsMYB36a基因靶点与pYLsgRNA-OsU6a/LacZ(GeneBank:KR029106)载体上的启动子和sgRNA组装，所用的PCR引物如SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.4所示；将OsMYB36b基因靶点与pYLsgRNA-OsU6b(GeneBank:KR029107)载体上的启动子和sgRNA组装，所用的PCR引物如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示；将OsMYB36c基因靶点与pYLsgRNA-OsU3m/LacZ(GeneBank:KR559260)载体上的启动子和sgRNA组装，所用的PCR引物如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示；
其中，在第二轮PCR扩增中：扩增出OsMYB36a-sgRNA表达盒A1的引物组如SEQ IDNO.13～SEQ ID NO.14所示，扩增出OsMYB36b-sgRNA表达盒A2的引物组如SEQ IDNO.15～SEQ IDNO.16所示，扩增出OsMYB36c-sgRNA表达盒A3的引物组如SEQ IDNO.17～SEQ ID NO.18所示；
步骤S3，通过PCR从步骤S1得到的中间融合载体中扩增出带有待研究基因和表达标签的目的片段，将其作为第四个表达盒；
步骤S4，如果步骤S3所述的目的片段不含有BsaⅠ酶切位点，则将步骤S2得到的三个表达盒、步骤S4的第四个表达盒纯化后，与双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H进行酶切-连接反应，从而得到OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三基因敲除且携带待研究基因和表达标签的三敲载体；
步骤S5，如果步骤S3所述的目的片段含有BsaⅠ酶切位点，则按照以下步骤操作：
步骤S51，对步骤S2得到的第一轮产物，按照下面引物进行第二轮PCR，得到OsMYB36a-sgRNA表达盒B1、OsMYB36b-sgRNA表达盒B2和OsMYB36c-sgRNA表达盒B3；
在第二轮PCR中，扩增出OsMYB36a-sgRNA表达盒B1的引物组如SEQ IDNO.13～SEQ IDNO.14所示，扩增出OsMYB36b-sgRNA表达盒B2的引物组如SEQ IDNO.15～SEQ ID NO.16所示，扩增出OsMYB36c-sgRNA表达盒B3的引物组如SEQ IDNO.19～SEQ ID NO.20所示；
步骤S52，将步骤S51得到的三个表达盒纯化后，与双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H进行酶切-连接反应，从而得到OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三个基因的三敲载体；
步骤S53，将步骤S52得到的三敲载体线性化，再将步骤S3得到的目的片段插入三敲载体中，从而得到OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三基因敲除且携带待研究基因和表达标签的三敲载体；
步骤S6，将步骤S4或步骤S5构建的三敲载体转化水稻，经筛选获得OsMYB36a、OsMYB36b、OsMYB36c三基因突变的突变体水稻植株。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中的待研究基因为水稻OsCASP1基因(Os04g0684300)、水稻OsLsi1基因(Os02g0745100)或水稻OsIDD3基因(Os09g0555700)；所述待研究基因包括了基因的启动子序列和CDS序列。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中的表达载体为pCAMBIA1301-GFP，它带有的表达标签是GFP。
4.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：当待研究基因为水稻OsCASP1基因时，步骤S3的PCR引物序列如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.22所示。
5.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：当待研究基因为水稻OsLsi1基因时，步骤S3的PCR引物序列如SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.24所示。
6.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：当待研究基因为水稻OsIDD3基因时，步骤S3的PCR引物序列如SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.26所示。
7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S6中，将步骤S4或步骤S5构建的三敲载体转化水稻愈伤组织。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210151249.7A CN114438119B (zh) | 2022-02-16 | 2022-02-16 | 一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210151249.7A CN114438119B (zh) | 2022-02-16 | 2022-02-16 | 一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114438119A CN114438119A (zh) | 2022-05-06 |
| CN114438119B true CN114438119B (zh) | 2023-10-13 |
Family
ID=81373689
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210151249.7A Active CN114438119B (zh) | 2022-02-16 | 2022-02-16 | 一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114438119B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102676544A (zh) * | 2012-05-25 | 2012-09-19 | 复旦大学 | 水稻MYB家族转录因子OsMYB84基因编码序列及其应用 |
| CN107557382A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-01-09 | 福建农林大学 | 一种植物根中多层凯氏带的诱导方法 |
| WO2018175900A2 (en) * | 2017-03-23 | 2018-09-27 | Colorado State University Research Foundation | Synthetic desalination genetic circuit in plants |
| CN110183523A (zh) * | 2019-05-30 | 2019-08-30 | 中国农业科学院生物技术研究所 | OsMYB36蛋白及其编码基因和应用 |
| CN111304241A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-06-19 | 保山华大智慧农业科技股份有限公司 | 一种多基因编辑提高旱稻产量的方法 |
| CN112011548A (zh) * | 2020-07-30 | 2020-12-01 | 广西大学 | 一种水稻OsCASP1基因及其应用 |
| CN113278646A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-08-20 | 湖北伯远合成生物科技有限公司 | 一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2612655A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-06-21 | University Of Victoria Innovation And Development Corporation | Poplar transcription factor myb134 |
| WO2019028355A1 (en) * | 2017-08-04 | 2019-02-07 | Rutgers, The State University Of New Jersey | COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING ENDOPHYTIC BACTERIUM FOR APPLICATION TO TARGET PLANTS TO PROMOTE PLANT GROWTH AND STRENGTHEN RESISTANCE TO ABIOTIC AND BIOTIC STRESS FACTORS |
-
2022
- 2022-02-16 CN CN202210151249.7A patent/CN114438119B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102676544A (zh) * | 2012-05-25 | 2012-09-19 | 复旦大学 | 水稻MYB家族转录因子OsMYB84基因编码序列及其应用 |
| WO2018175900A2 (en) * | 2017-03-23 | 2018-09-27 | Colorado State University Research Foundation | Synthetic desalination genetic circuit in plants |
| CN107557382A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-01-09 | 福建农林大学 | 一种植物根中多层凯氏带的诱导方法 |
| CN110183523A (zh) * | 2019-05-30 | 2019-08-30 | 中国农业科学院生物技术研究所 | OsMYB36蛋白及其编码基因和应用 |
| CN111304241A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-06-19 | 保山华大智慧农业科技股份有限公司 | 一种多基因编辑提高旱稻产量的方法 |
| CN112011548A (zh) * | 2020-07-30 | 2020-12-01 | 广西大学 | 一种水稻OsCASP1基因及其应用 |
| CN113278646A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-08-20 | 湖北伯远合成生物科技有限公司 | 一种构建水稻多基因编辑突变体库的方法及应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CRISPR/Cas9介导的家蚕抗核型多角体病毒素材创新研究;董战旗;万方学位论文;全文 * |
| Genome-wide characterization and identification of root development and stress-related CsMYB36 genes;Chunhua Wang等;Vegetable Research;全文 * |
| Three OsMYB36 members redundantly regulate Casparian strip formation at the root endodermis;Zhigang Wang等;Plant Cell;全文 * |
| transcription factor MYB36 [Oryza brachyantha];NCBI;Genbank Database;全文 * |
| 番茄根系内皮凯氏带调控机制的研究;李朋雪;中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑;全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114438119A (zh) | 2022-05-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | High efficient multisites genome editing in allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system | |
| CN105821075B (zh) | 一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法 | |
| CN105177038B (zh) | 一种高效定点编辑植物基因组的CRISPR/Cas9系统 | |
| Cove | The moss Physcomitrella patens | |
| Tadege et al. | Mutagenesis and beyond! Tools for understanding legume biology | |
| CN106701818A (zh) | 一种培育水稻普通核不育系的方法 | |
| US20210403901A1 (en) | Targeted mutagenesis using base editors | |
| Ramadan et al. | Efficient CRISPR/Cas9 mediated pooled-sgRNAs assembly accelerates targeting multiple genes related to male sterility in cotton | |
| Moon et al. | Construction of a CRISPR/Cas9-mediated genome editing system in Lentinula edodes | |
| CN106086036B (zh) | 水稻苗期叶片白化性状基因Oscaac1及其应用 | |
| CN114540406B (zh) | 基因组编辑表达框、载体及其应用 | |
| CN107227303B (zh) | 一种OsGA3ox1基因在水稻雄性不育株系创制中的应用 | |
| Henderson et al. | Efficient crispr/cas9-mediated knockout of an endogenous phytoene desaturase gene in t1 progeny of apomictic hieracium enables new strategies for apomixis gene identification | |
| CN114438119B (zh) | 一种携带标记的多基因突变体水稻植株的制备方法及其应用 | |
| CN106883291B (zh) | 植物株型相关蛋白prog2及其编码基因与应用 | |
| CN117285610A (zh) | 孤雌生殖单倍体诱导基因NtDMP及其应用 | |
| CN107794264A (zh) | 用于构建多倍体植物突变体库的接头序列及鉴定方法 | |
| CN106893780A (zh) | 一种筛选棉花抗旱相关基因的方法 | |
| CN109234438B (zh) | 与黄瓜无限生长型基因共分离的分子标记Indel-De3 | |
| González et al. | Optimization of vectors and targeting strategies including GoldenBraid and genome editing tools: GoldenBraid assembly of multiplex CRISPR/Cas12a guide RNAs for gene editing in Nicotiana benthamiana | |
| Li et al. | Highly efficient multiplex genome editing in dicots using improved CRISPR/Cas systems | |
| CN105294845B (zh) | 大麦抗叶锈病蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN114182038B (zh) | 一种菠菜y染色体特异的核苷酸探针及其应用 | |
| Wang et al. | Precise fine-turning of GhTFL1 by base editing tools defines ideal cotton plant architecture | |
| CN112852996B (zh) | 鉴定万寿菊舌状花花瓣裂片性状的scar分子标记、检测引物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |