CN105294845B - 大麦抗叶锈病蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

大麦抗叶锈病蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与大麦抗叶锈病相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，为蛋白质A和/或蛋白质B；所述蛋白质A为序列1所示的蛋白质或其氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与抗叶锈病相关的蛋白质；所述蛋白质B为序列2所示的蛋白质或其氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与抗叶锈病相关的蛋白质。实验证明，同时表达Rlr1基因和Rlr2基因的转基因大麦植株，其对叶锈病的抗性明显加强。本发明在经济作物，特别大麦的遗传改良等行业领域具有广阔的市场和应用前景。

Description

大麦抗叶锈病蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及两种与大麦抗叶锈病相关的蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
叶锈病是一种分布非常广泛的麦类作物病害，世界上大多数小麦和大麦生产区均有发现。在大麦生产中通常的年份大麦叶锈病可造成30％的减产，流行年份减产可达60％。研究与实践证明，利用抗病基因和培育抗病品种是防治作物叶锈病最经济、安全、有效和环保的措施。
要应用抗病基因，首先先克隆抗病基因。近年来植物抗病基因的克隆方法随着分子生物学技术以及高通量测序技术的进步也不断地在发展。目前植物抗病基因的克隆的主要方法有图位克隆技术，转座子标签技术，基因同源克隆技术，RNA水平的差异显示技术以及转录组测序技术等等。图位克隆技术是一种非常有效的克隆抗病基因的方法，但是由于需要大量的基因型及表型鉴定工作，因此它是一种非常耗时耗力的技术，尤其是对麦类作物这种基因组庞大且复杂的植物。由于基因组庞大而复杂，且遗传转化效率较低等因素的限制，转座子标签技术也同样不适合麦类作物。而基因的同源克隆技术不能用来发现新的抗病基因。基于RNA水平的基因差异表达技术在抗病基因的克隆和研究中发挥极大的作用，例如可以运用cDNA-AFLP技术或者基因芯片技术分析接种病原微生物前后的基因表达情况就可以找到接种前后有差异表达的抗病基因。随着第二代测序技术的快速发展，RNA水平的表达分析可以通过更为简单的转录组和表达谱测序技术来实现。
第二代测序技术相对于传统的第一代测序技术具有测序速度快，数据量大，操作流程自动化，成本成本低廉等优势。目前代表技术有Illumina公司的Solexa技术，ABI公司的SOLiD技术，Roche公司的454技术；能够同时对几十万到几百万条DNA分子进行测序。
Solexa测序技术最早使用Solexa公司研发，后被Illumina公司收购，其测序仪命名为Illumina Genome Analyzer。2010年，Genome Analyzer IIx升级到HiSeqTM2000，目前已经升级到HiSeqTM2500。Solexa测序技术的核心原理是边合成边测序的方法(sequence bysynthesis,SBS)。Solexa测序技术最大的优势是速度快，数据量大，成本相对低廉；但是序列读长较短。
Roche公司的Roche(454)GS FLX测序仪是在焦磷酸测序法(Hyman,1988)基础上发展起来的。其原理是通过DNA合成时释放的焦磷酸分子与反应体系中的ATP硫酸化酶反应形成ATP；ATP再和荧光素酶共同氧化反应体系中的荧光素分子并发出荧光，进而判断碱基类型。基本流程包括：首先生成连有接头的测序文库；然后将DNA片段与水油包被的直径大约28μm的磁珠在一起孵育、退火，emulsion PCR生成测序所需的模板；最后将磁珠颗粒放置在PicoTiterPlate(PTP)的小孔中，每个小孔仅能容下一个磁珠颗粒，再加入DNA聚合酶和dNTP进行合成反应；采用焦磷酸测序法获得序列信息。Roche(454)测序技术的优势是序列读长长，可达400bp以上；缺点是无法准确测量同聚物长度。
ABI公司的SOLiD(Sequencing by Oligo Ligation and Detection)测序仪采用的是连接酶测序法(Pfeifer et al.1989)。基本原理是首先通用引物和待测片段的接头退火，然后加入4种带有不同荧光标记的8碱基半简并寡聚核苷酸探针和连接酶；通过荧光检测连接上的探针种类；最后根据简并引物中已知位置碱基的种类和循环数确定待测片段中对应位置的碱基类型。其准确率最高可达99.99％，但是测序长度较短。
目前二代测序技术的发展极大的降低了转录组测序的成本，更开发出数字基因表达谱(Digital Gene Expressing Profiling,DGE)测序技术来直接检测基因表达的情况。理论上DGE测序可以得到某一状态下的所有转录本的表达情况，比基因芯片技术覆盖的范围要大，成本也低于基因芯片技术。
发明内容
本发明的目的是提供与大麦抗叶锈病相关的蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的蛋白质，为蛋白质A(命名为Rlr1蛋白)和/或蛋白质B(命名为Rlr2蛋白)；
所述蛋白质A(Rlr1蛋白)为下述a1)或a2)：
a1)氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质；
a2)将a1)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与抗叶锈病相关的蛋白质；
所述蛋白质B(Rlr2蛋白)为下述b1)或b2)：
b1)氨基酸序列为序列表中序列2所示的蛋白质；
b2)将b1)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与抗叶锈病相关的蛋白质。
为了便于蛋白的纯化，可在由序列表中序列1或序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述a2)和b2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a2)和b2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列3或序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
当所述蛋白质为所述蛋白质A和所述蛋白质B时，其中所述蛋白质A和所述蛋白质B可为任意比例，如摩尔比1:1。
编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因。
其中，编码所述蛋白质A(Rlr1蛋白)的基因(命名为Rlr1基因)是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列3所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质A的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且所述蛋白质A的DNA分子；
编码权利要求1中的所述蛋白质B(Rlr2蛋白)的基因(命名为Rlr2基因)是如下4)至6)中任一所述的DNA分子：
4)序列表中序列4所示的DNA分子；
5)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质B的DNA分子；
6)与4)或5)限定的DNA分子具有90％以上同源性且所述蛋白质B的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
其中，序列3由1263个核苷酸组成，第1-1263位为ORF，编码序列表中序列1所示的Rlr1蛋白。序列4由1458个核苷酸组成，第1-1458位为ORF，编码序列表中序列2所示的Rlr2蛋白。
当所述基因为所述Rlr1基因和所述Rlr2基因时，其中所述Rlr1基因和所述Rlr2基因可为任意比例，如摩尔比1:1。
含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述Rlr1基因转录的启动子具体为序列表中序列5；启动所述Rlr2基因的转录的启动子具体为序列表中序列6。
更为具体的，所述重组表达载体为如下(a)或(b)：
(a)在pH7GW2D(-p35S)载体的attR1和attR2之间插入序列表中序列7所示DNA片段的重组质粒。
(b)在pH7GW2D(-p35S)载体的attR1和attR2之间插入序列表中序列8所示DNA片段的重组质粒。
所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。
所述蛋白质，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
a1)调控植物对叶锈病的抗性；
a2)选育抗叶锈病能力提高的植物品种。
在本发明中，所述调控植物对叶锈病的抗性体现在：在所述植物体内，若所述Rlr1蛋白和所述Rlr2蛋白的表达量越高，则所述植物对叶锈病的抗性越强。
在本发明中，所述选育抗叶锈病能力提高的植物品种的方法，具体可包括将所述Rlr1蛋白和所述Rlr2蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法可为如下(A)或(B)：
(A)培育抗叶锈病能力提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：
a)向目的植物中导入所述Rlr1蛋白和所述Rlr2蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗叶锈病能力提高的转基因植物。
(B)培育抗叶锈病能力降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：
c)在目的植物中对所述Rlr1蛋白和/或所述Rlr2蛋白的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；
d)从步骤c)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗叶锈病能力降低的转基因植物。
在步骤a)中，所述向目的植物中导入所述Rlr1蛋白和所述Rlr2蛋白的编码基因，可为如下(a1)或(a2)：
(a1)向所述目的植物中导入所述Rlr1蛋白的编码基因，得到表达所述Rlr1基因的转基因植物A；向所述目的植物中导入所述Rlr2蛋白的编码基因，得到表达所述Rlr2基因的转基因植物B；将所述转基因植物A和所述转基因植物B进行杂交，从杂交后代中获得同时表达所述Rlr1基因和所述Rlr2基因的转基因植物。
(a2)向所述目的植物中同时导入所述Rlr1蛋白和所述Rlr2蛋白的编码基因，得到同时表达所述Rlr1基因和所述Rlr2基因的转基因植物。
在步骤c)中，所述在目的植物中对所述Rlr1蛋白的编码基因进行抑制表达，具体是通过将序列3的第734-1099位所示的DNA片段转入所述目的植物中实现的；所述在目的植物中对所述Rlr2蛋白的编码基因进行抑制表达，具体是通过将序列4的第202-639位所示的DNA片段转入所述目的植物中实现的。
所述序列3的第734-1099位所示的DNA片段和/或所述序列4的第202-639位所示的DNA片段具体可通过重组载体的形式转入所述目的植物。具体的，含有所述序列3的第734-1099位所示的DNA片段的重组载体具体为在pCa-γbLIC质粒的酶切位点ApaⅠ处正向插入了“AAGGAAGTTTAA+序列3的第734-1099位+ACGGTGGTGGTGGTT”所示DNA片段的重组质粒(命名为pCa-γbRlr1)。含有所述序列4的第202-639位所示的DNA片段的重组载体具体为在pCa-γbLIC质粒的酶切位点Apa Ⅰ处正向插入了“AAGGAAGTTTAA+序列4的第202-639位+ACGGTGGTGGTGGTT”
编码所述Rlr1蛋白的基因(Rlr1基因)是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列3所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质A的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且所述蛋白质A的DNA分子；
编码所述Rlr2蛋白的基因(Rlr2基因)是如下4)至6)中任一所述的DNA分子：
4)序列表中序列4所示的DNA分子；
5)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质B的DNA分子；
6)与4)或5)限定的DNA分子具有90％以上同源性且所述蛋白质B的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
所述基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。农杆菌介导等生物学方法转化到植物细胞或组织中。
在上述应用或方法中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。
在本发明中，所述植物为单子叶植物——大麦，具体为大麦品种为Vada和GoldenPromise。
实验证明，同时转化了Rlr1基因和Rlr2基因的转基因大麦植株，其对叶锈病的抗性明显加强。本发明在经济作物，特别大麦的遗传改良等行业领域具有广阔的市场和应用前景。
附图说明
图1为实施例1中PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳结果。其中，A为采用引物Rlr1-F和Rlr1-R进行PCR扩增所得产物，M为DNA分子量标准，1为PCR产物；B为采用引物Rlr2-F和Rlr2-R进行PCR扩增所得产物，M为DNA分子量标准，1为PCR产物。
图2为实施例2中荧光定量PCR的结果。
图3为实施例3中各大麦株系的叶片接种大麦叶锈菌后的表型图。其中，Vada表示未经接种处理的大麦品种Vada；Vada(BSMV:00)表示接种了重组农杆菌EHA105/pCa-γbLIC的大麦；Vada(BSMV:Rlr1)表示接种了重组农杆菌EHA105/pCa-γbRlr1的大麦；Vada(BSMV:Rlr2)表示接种了重组农杆菌EHA105/pCa-γbRlr2的大麦。
图4为实施例3中各大麦株系的RLP50值统计结果。其中，Vada表示未经接种处理的大麦品种Vada；Vada(BSMV:00)表示接种了重组农杆菌EHA105/pCa-γbLIC的大麦；Vada(BSMV:Rlr1)表示接种了重组农杆菌EHA105/pCa-γbRlr1的大麦；Vada(BSMV:Rlr2)表示接种了重组农杆菌EHA105/pCa-γbRlr2的大麦；L94表示感病对照大麦品种L94。
图5为实施例4中Rlr1转基因植株和Rlr2转基因植株的PCR鉴定结果。利用康润生物的DNA提取试剂盒StarSpin Plant DNA Kit提取转基因植株的基因组DNA，以Rlr1-QPCR-F和Rlr1-QPCR-R为引物，进行转基因阳性植株的鉴定，如图有扩增条带的植株为阳性植株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大麦品种Vada：为大麦叶锈病抗病品种，记载于“Qi X,Niks RE,Stam P,LindhoutP(1998)Identification of QTLs for partial resistance to leaf rust(Pucciniahordei)in barley.Theoretical and Applied Genetics 96,1205-1215.”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明。
大麦品种L94：为大麦叶锈病感病品种，记载于“Qi X,Niks RE,Stam P,LindhoutP(1998)Identification of QTLs for partial resistance to leaf rust(Pucciniahordei)in barley.Theoretical and Applied Genetics 96,1205-1215.”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明。
大麦品种Golden Promise：记载于“王锋.农杆菌介导的耐盐基因EhHOG对大麦幼胚及其愈伤组织的遗传转化.华中农业大学,作物遗传育种,2014,硕士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明。
大麦叶锈菌1.2.1：记载于“Qi X,Niks RE,Stam P,Lindhout P(1998)Identification of QTLs for partial resistance to leaf rust(Puccinia hordei)inbarley.Theoretical and Applied Genetics 96,1205-1215”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明。
VIGS载体体系(pCa-γbLIC质粒、pCa-α质粒、pCa-β质粒和pCa-γbHvPDS)：由中国农业大学的李大伟老师实验室构建，记载于“Yuan C,Li C,Yan L,Jackson AO,Liu Z,HanC,Yu J,Li D(2011)A high throughput barley stripe mosaic virus vector forvirus induced gene silencing in monocots and dicots.PLoS One 6,e26468一文”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明。其中，pCa-γbLIC质粒中含有大麦条纹花叶病毒(BMSV)的3条基因组RNA所对应的DNA序列，同时在质粒中γb基因的下游导入LIC连接位点，用于克隆外源基因片段。
pH7GW2D(-p35S)载体：将载体pH7GW2D用限制性内切酶SpeⅠ酶切后自连获得。
实施例1、大麦抗叶锈病基因Rlr1和Rlr2的克隆及测序
用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(天根)提取大麦品种Vada成株期叶片总RNA，用反转录试剂盒SuperScriptTMⅢRT(Invitrogen)将大麦叶片总RNA反转录成cDNA。
用反转录试剂盒SuperScriptTMⅢRT(Invitrogen)进行反转录的方法如下：
(a)在RNA-free的PCR管中依次加入以下试剂：Oligo(dT)18(500μg/ml)1μl；总RNA1-5μg；dNTP mix(10mM)1μl；DEPC H2O补足至13μl。于65℃孵育5min，快速冰浴2min，稍离心。
(b)在上述PCR管中依次加入以下试剂：5×First-Strand buffer 4μl；0.1M DTT1μl；RNaseOUTTM(40U/μl)1μl；SuperScriptTMⅢ(200U/μl)1μl。50℃反转录50min。
(c)75℃15min，终止反应，加30μl ddH2O稀释，-20℃保存备用。
以大麦品种Vada的叶片cDNA为模板，采用引物Rlr1-F和Rlr1-R进行PCR扩增。采用引物Rlr2-F和Rlr2-R进行PCR扩增。
Rlr1-F：5’-ATGGTGTGCCCGGTGCTGCTG-3’(序列3的第1-21位)；
Rlr1-R：5’-TCACTGCCGACGTGGTGCACA-3’(序列3的第1243-1263位的反向互补序列)。
Rlr2-F：5’-ATGCAGCGACGTGGCAC-3’(序列4的第1-17位)；
Rlr2-R：5’-TCATTTCCAAAGTAAAG-3’(序列4的第1442-1458位的反向互补序列)。
反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图1所示，采用引物Rlr1-F和Rlr1-R进行PCR扩增所得产物(产物1)大小约为1263bp；采用引物Rlr2-F和Rlr2-R进行PCR扩增所得产物(产物2)大小约为1458bp。
将PCR产物经胶回收纯化后，通过T-A连接克隆到pGEM-T Easy载体中，菌液PCR鉴定的阳性克隆送到上海美吉生物医药科技有限公司测序。将经测序表明在pGEM-T Easy载体中连入序列3所示DNA片段的重组质粒命名为pGEM-T Rlr1；将经测序表明在pGEM-T Easy载体中连入序列4所示DNA片段的重组质粒命名为pGEM-T Rlr2。
实施例2、Rlr1和Rlr2的表达模式分析
根据荧光定量PCR分析对引物的要求和Rlr1基因和Rlr2基因的CDS序列设计荧光定量PCR的引物，以大麦泛素结合酶18(Hv-UBC18)基因的表达作为内参。引物序列如表1所示。
表1 Rlr1和Rlr2的表达模式分析所用引物序列
引物名称 引物序列(5’→3’) 位置
Rlr1-QPCR-F GTACGCTTGCAATACTGACCATC 序列3的第734-756位
Rlr1-QPCR-R TCCAAAAGAGACCAGAAGCAATAC 序列3的第1076-1099位
Rlr2-QPCR-F ATGCAGCGACGTGGCAC 序列4的第1-17位
Rlr2-QPCR-R GCTCGGAAATTGTCTAGACTG 序列4的第150-170位
Hv-UBC18-F CGATGCACCCGCACATTTACAG
Hv-UBC18-R CGTTGCGGCAGTTCCTAAC
培养室种植大麦品种Vada，等到第4片叶完全展开时，接种新鲜的大麦叶锈菌1.2.1的夏孢子(滑石粉稀释30倍)，接种后在时间点0h，3h，6h，12h，24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h和192h分别取接种后的叶片100mg提取RNA，反转录成cDNA，将cDNA稀释到合适的浓度用做荧光定量PCR的模板。
实验所用的荧光定量PCR仪器为corbett的RG-3000。所有的PCR Mix为天根SuperReal PreMix(SYBR Green)。
反应体系如下：2×SuperReal PreMixr 10μl；Sense primer(10μM)0.6μl；Anti-sense primer(10μM)0.6μl；cDNA 1μl；ddH2O补足至20μl。
PCR程序如下：95℃15min；95℃10s，60℃20s，72℃20s(荧光检测)，35个循环。
荧光定量PCR的结果如图2所示，Rlr1和Rlr2表达都受到接种大麦叶锈菌1.2.1的诱导，但是表达模式有所不同。Rlr1的表达在接种后6h开始被诱导，12h时达到最高，其后其表达量开始降低，但是仍然在一个相对较高的水平，一直到144h之后，其表达量开始下调，一直到192h对达到最低；Rlr2的表达在接种后6h开始上调，一直到120h达到最高，之后其表达水平开始下降，到192h达到最低。
实施例3、Rlr1和Rlr2的病毒诱导基因沉默(VIGS)实验
一、重组载体的构建
根据Rlr1基因和Rlr2基因的CDS序列设计带有LIC接头的引物(见表2)，从大麦品种Vada的叶片cDNA中扩增Rlr1基因和Rlr2基因的VIGS片段，大小分别为393bp和465bp(含LIC接头序列)的DNA片段，用天根的胶回收试剂盒回收目的条带。同时提取pCa-γbLIC质粒(pCa-γbLIC质粒含有大麦条纹花叶病毒(BMSV)的γRNA所对应的DNA序列，同时在质粒中γb基因的下游导入LIC连接位点，用于克隆外源基因片段)，并用NEB ApaⅠ酶切，使质粒线性化，用天根的胶回收试剂盒回收目的条带(记为pCa-γbLIC/ApaⅠ)。
表2 Rlr1和Rlr2的病毒诱导基因沉默(VIGS)实验所用引物
引物名称 引物序列(5’→3’)
Rlr1-VIGS-F <u>AAGGAAGTTTAA</u>-CGCTTGCAATACTGACCATC
Rlr1-VIGS-R <u>AACCACCACCACCGT</u>-TCCAAAAGAGACCAGAAGCA
Rlr2-VIGS-F <u>AAGGAAGTTTAA</u>-GCATTGGAGATTGGTCTTTG
Rlr2-VIGS-R <u>AACCACCACCACCGT</u>-GAGGAACTGGGAGATAGTGAA
将带接头的Rlr1和Rlr2VIGS片段按照下列反应体系用NEB T4 DNA聚合酶处理：VIGS片段40ng；100mM dATP 0.5μl；100×BSA 0.1μl；10×NEB Buffer 2 1μl；NEB T4 DNA聚合酶0.2μl；dd H2O补足至10μl。22℃-25℃反应30min；75℃处理15min使酶失活。
线性化的pCa-γbLIC质粒(即pCa-γbLIC/ApaⅠ)按照下列反应体系用T4 DNA聚合酶处理：pCa-γbLIC/ApaⅠ 200ng；100mM dTTP 1μl；100×BSA 0.2μl；10×NEB Buffer 2 2μl；NEB T4 DNA聚合酶0.4μl；dd H2O补足至20μl。22℃-25℃反应30min。75℃处理15min使酶失活。
取10μl处理的VIGS片段和2μl处理的pCa-γbLIC/ApaⅠ，充分混匀，65℃处理2min，然后使其自然退火冷却至室温。用上述的反应体系转化大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜，挑单克隆，并用菌液PCR鉴定(采用引物为表2中的引物)，将PCR初步鉴定正确的阳性克隆送到上海美吉生物医药科技有限公司测序。
将经测序表明在pCa-γbLIC质粒的酶切位点ApaⅠ处正向插入了“AAGGAAGTTTAA+序列3的第734-1099位+ACGGTGGTGGTGGTT”所示DNA片段的重组质粒命名为pCa-γbRlr1。将经测序表明在pCa-γbLIC质粒的酶切位点ApaⅠ处正向插入了“AAGGAAGTTTAA+序列4的第202-639位+ACGGTGGTGGTGGTT”所示DNA片段的重组质粒命名为pCa-γbRlr2。
二、Rlr1和Rlr2基因沉默大麦的获得
1、转化农杆菌
一方面，将步骤一构建的重组载体pCa-γbRlr1和pCa-γbRlr2通过电击法分别导入农杆菌EHA105感受态。对转化pCa-γbRlr1的重组农杆菌用由引物Rlr1-VIGS-F和Rlr1-VIGS-R(序列同上)组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有大小约为393bp目的片段的重组农杆菌命名为EHA105/pCa-γbRlr1。对转化pCa-γbRlr2的重组农杆菌用由引物Rlr2-VIGS-F和Rlr2-VIGS-R(序列同上)组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有大小约为465bp目的片段的重组农杆菌命名为EHA105/pCa-γbRlr2。
另一方面，将pCa-α质粒和pCa-β质粒分别通过电击法导入不同的农杆菌EHA105感受态，依据导入质粒的不同将得到的重组农杆菌分别命名为EHA105/pCa-α和EHA105/pCa-β。
2、Rlr1和Rlr2基因沉默大麦的获得及功能鉴定
(1)混合菌液的准备
将重组农杆菌EHA105/pCa-γbRlr1、EHA105/pCa-γbRlr2、EHA105/pCa-γbLIC、EHA105/pCa-α和EHA105/pCa-β分别接种到10ml LB(含有20μM AS和10mM MES)，摇菌至OD值为1-1.5。用悬菌液(配方：100μM AS、10mM MES和10mM MgCl2)将各菌液浓度均调至OD值为0.7。
将以上得到的携带了重组农杆菌EHA105/pCa-γb(EHA105/pCa-γbRlr1或EHA105/pCa-γbRlr2或EHA105/pCa-γbLIC)的菌液、携带了重组农杆菌EHA105/pCa-α的菌液和携带了重组农杆菌EHA105/pCa-β的菌液，按照体积比1:1:1的比例混合，得到4份混合菌液。28℃放置3-5h。
(2)Rlr1和Rlr2基因沉默大麦的获得及功能鉴定
将步骤(1)获得的4份混合菌液分别注射6-8叶期的本生烟叶片，一般5ml混合的菌液可以注射3-4棵本生烟，每棵一般注射较大的3-4片叶。
注射后5-12天，采注射叶片加20mM pH7.2的磷酸缓冲液和纯化硅藻土研磨，再用研磨出的汁液摩擦接种2叶期大麦品种Vada。同时设置未经接种处理的大麦品种Vada作为空白对照。
第4叶可以观察到大麦条纹花叶病毒(BMSV)侵染引起的叶片褪绿的表型，4叶期后期可以观察到PDS被沉默引起的光漂白现象。当第5叶完全展开时，取有病毒感染症状的叶片接种新鲜的大麦叶锈菌1.2.1的夏孢子(滑石粉稀释40倍)。同时以感病大麦品种L94做为感病对照。
从第一个夏孢子堆开始，对叶片进行拍照，并统计LP50和RLP50。抗病表型的统计方法为当叶片表面的第一个夏孢子堆出现后，选取接种叶片中部约2cm的范围进行标记。每隔24h统计一次孢子的数目，计算50％的孢子出现时所用的时间，即潜伏期LP50；如果假定感病对照大麦品种L94的相对潜伏期RLP50为100，其用它品种的LP50除以L94的LP50即可得到该品种的相对潜伏期RLP50(Neervoort W J,Parlevliet J E.1978.Partialresistance of barley to leaf rust,Puccinia hordei.V.Analysis of thecomponents of partial resistance in eight barley cultivars.Euphytica,27:33–39)。
结果如图3和图4所示，图3显示Vada的Rlr1和Rlr2分别被沉默后均会导致Vada叶片对大麦叶锈菌的抗性降低，具体表现为和空载体对照相比，Rlr1和Rlr2分别被沉默后的大麦叶锈病发病速度加快，叶片表面的孢子堆数目增加。另外，图4对各处理的RLP50的统计结果显示接种了重组农杆菌EHA105/pCa-γbRlr1和EHA105/pCa-γbRlr2的植株其RLP50值均显著高于接种了重组农杆菌EHA105/pCa-γbLIC的植株(空载体对照)和未经接种处理的植株(空白对照)。以上结果表明Rlr1基因和Rlr2基因分别沉默均会导致大麦对叶锈病的抗性降低。
实施例4、大麦抗叶锈病基因Rlr1和Rlr2的表达载体构建及大麦转化
一、大麦抗叶锈病基因Rlr1和Rlr2的表达载体的构建
本实施例中所用的植物表达载体为pH7GW2D(-p35S)载体。
选取Rlr1基因和Rlr2基因编码区上游3kb的序列作为基因的启动子，在基因启动子上游和基因的3’UTR序列中设计引物，如表3所示。
表3大麦抗叶锈病基因Rlr1和Rlr2的表达载体构建所用引物
引物名称 引物序列(5’→3’)
Rlr1-P-F TTGAAGATGAACAATACATATGCT
Rlr1-R TCACTGCCGACGTGGTGCACA
Rlr2-P-F GCCTGTGCCCCATTCTTG
Rlr2-R TCATTTCCAAAGTAAAG
以Vada的基因组DNA为模板，采用表3中的引物对Rlr1-P-F/Rlr1-R和Rlr2-P-F/Rlr2-R分别进行PCR扩增。用NEB公司的超保真DNA聚合酶Phusion，反应体系如下：5×Phusion HF Buffer 4μl；10mM dNTPs 1μl；Sense primer(10μM)1μl；Anti-sense primer(10μM)1μl；cDNA 2μl；Phusion DNA聚合酶0.2μl；ddH2O补足至20μl。PCR程序如下：98℃30s；98℃10s，58℃20s，72℃2min，30个循环。
PCR完成后，将3管PCR产物混合后冰冷的无水乙醇沉淀，按照下列反应体系(10μl)，72℃反应30min进行末端加A：10×Buffer 1μl；dATP(10mM)1μl；天根Taq 0.1μl；ddH2O补足至10μl。
用Invitrogen公司的TAKit，通过TA克隆的方式将将目的基因连接到pCR8载体(试剂盒中产品)中，具体反应体系如下：末端加A后的PCR片段(100ng/μl)3μl；Salt Solution 1μl；pCR8载体1μl；ddH2O补足至6μl。室温反应1h后转化大肠杆菌DH5α。挑选阳性克隆，进行测序验证。
将经测序表明在pCR8载体中连入序列表中序列7所示DNA片段的重组质粒命名为pCR8-Rlr1；将经测序表明在pCR8载体中连入序列表中序列8所示DNA片段的重组质粒命名为pCR8-Rlr2。
用NEB限制性内切酶XhoⅠ将以上获得的重组质粒pCR8-Rlr1和pCR8-Rlr2分别进行酶切线性化，用天根胶回收试剂盒回收目标线性化质粒片段。利用Invitrogen公司的LR重组反应技术将两个目标基因分别重组到植物表达载体pH7GW2D(-p35S)中，反应体系(10μl)如下：pH7GW2D(-p35S)载体(200ng/μl)2μl；线性化质粒(200ng/μl)4μl；5X LRClonaseTMReaction Buffer 2μl；TE Buffer(pH 8.0)2μl。
25℃反应过夜后，转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR鉴定阳性克隆，然后提取阳性克隆的质粒，进行测序验证。
将经测序表明在pH7GW2D(-p35S)载体的attR1和attR2之间插入序列表中序列7所示DNA片段的重组质粒命名为pH7GW2D(-p35S)-Rlr1；将经测序表明在pH7GW2D(-p35S)载体的attR1和attR2之间插入序列表中序列8所示DNA片段的重组质粒命名为pH7GW2D(-p35S)-Rlr2。
二、Rlr1和Rlr2转基因大麦的获得
1、转化农杆菌
将步骤一构建的重组表达载体pH7GW2D(-p35S)-Rlr1和pH7GW2D(-p35S)-Rlr2分别通过电击法分别导入农杆菌EHA105感受态。
对转化pH7GW2D(-p35S)-Rlr1的重组农杆菌用表3中的引物对Rlr1-P-F/Rlr1-R进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有大小为4353bp目的片段的重组农杆菌命名为EHA105/pH7GW2D(-p35S)-Rlr1。对转化pH7GW2D(-p35S)-Rlr2的重组农杆菌用表3中的引物对Rlr2-P-F/Rlr2-R进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有大小为4581bp目的片段的重组农杆菌命名为EHA105/pH7GW2D(-p35S)-Rlr2。同时设置转入pH7GW2D(-p35S)空载体的对照。将转入pH7GW2D(-p35S)空载体的重组农杆菌命名为EHA105/pH7GW2D(-p35S)。
2、大麦的遗传转化
大麦品种Golden Promise是目前被广泛用来做遗传转化的实验材料，它易于转化易于再生，而且Golden Promise的大麦叶锈菌表现出高度感病，PCR扩增证明GoldenPromise缺失Rlr1和Rlr2(没有扩增出相应的目的条带)。故本实施例选用其用来转化目标基因，并验证基因功能。
用PCR方法检测Golden Promise是否携带Rlr1和Rlr2，PCR所用引物Rlr1-QPCR-F和Rlr1-QPCR-R，Rlr2-QPCR-F和Rlr2-QPCR-R(引物序列见实施例2中的表1)。
PCR反应体系：10×PCR buffer(含Mg2+)2μl；dNTPs(2.5mM)2μl；Sense primer(10μM)1μl；Anti-sense primer(10μM)1μl；DNA模板(50ng/μl)1μl；rTaq(5U/μl,TaKaRa)0.1μl；ddH2O补足至20μl。
PCR程序：94℃1min；94℃30s，50-60℃30s，72℃30s/kb，35个循环；72℃10min；15℃2min。
大麦遗传转化的具体操作步骤如下：
(a)温室种植大麦品种Golden Promise，当麦穗抽出后，随时观察生长的情况，当幼胚长到直径1.5-2mm时，收集麦穗；
(b)将麦穗的麦芒剪掉，超净工作台中用体积分数70％的酒精消毒10min，无菌水冲洗三次；将幼胚从籽粒中取出，盾片朝上放置于平板共培养培养基上，密度为25粒每皿，当天或者第二天进行农杆菌转化；
(c)农杆菌的准备：-70℃取步骤1获得的重组农杆菌(EHA105/pH7GW2D(-p35S)-Rlr1或EHA105/pH7GW2D(-p35S)-Rlr2或EHA105/pH7GW2D(-p35S))先在LB液体培养基(见《分子克隆》第三版1595页)中摇菌活化，然后以体积比1:100的比例接种到10ml LB培养基(含有100μg/ml Spe和50μg/ml Rif)中，180rpm摇菌至菌液浓度达到OD值在1-1.2之间，用于幼胚转化；
(d)用200μl移液枪吸取菌液，向每个幼胚上滴一滴菌液(能覆盖幼胚表面)，大概20min之后，倾斜平板，使多余的菌液流走，将幼胚盾片朝下转移到新鲜的共培养培养基上，置于23-24℃黑暗共培养三天。转移的过程中切记不要将过多的菌液随幼胚一起转移到新的共培养培养基上，可以将幼胚在原来的培养基表面拖动，以移除多余的菌液；
(e)共培养之后将幼胚转移到筛选培养基(含有Hyg 50mg/l和Timentin 160mg/l)上，进行第一次筛选。
(f)两周之后，将幼胚转移到新的筛选培养基上，转移过程中将幼胚整体转移到新的筛选培养基上(不要分离幼胚和新生的愈伤)，进行第二次筛选；
(g)二筛两周之后，将幼胚和新生的愈伤转移到新的筛选培养基，进行第三次筛选，注意将同一个侵染点长处的愈伤放在一起；
(h)经过六周的筛选之后将，就可以将愈伤转移到再生培养基上，并放在较弱的光照条件上培养二周，弱光条件可以通过在培养皿上方盖一张白纸的方法获得；在此过程中，愈伤组织应该开始变绿，并开始长出绿色小芽；
(i)两周之后，将愈伤组织转移到新的再生培养基上，置于正常光照条件下培养。
(j)幼苗长到2cm左右时，将其转移盛有25ml生根培养基的50ml三角瓶中，等生出较多的根后移栽到土壤中。
所用的培养基成分如表4所示。
表4大麦遗传转化过程中所用培养基
(K)等转基因苗长大一些，每株取200mg叶片，用文献报道的CTAB法提取基因组DNA样品，用PCR方法检测转基因植物，PCR所用引物Rlr1-QPCR-F和Rlr1-QPCR-R，Rlr2-QPCR-F和Rlr2-QPCR-R(引物序列见实施例2中的表1)。
PCR反应体系：10×PCR buffer(含Mg2+)2μl；dNTPs(2.5mM)2μl；Sense primer(10μM)1μl；Anti-sense primer(10μM)1μl；DNA模板(50ng/μl)1μl；rTaq(5U/μl,TaKaRa)0.1μl；ddH2O补足至20μl。
PCR程序：94℃1min；94℃30s，50-60℃30s，72℃30s/kb，35个循环；72℃10min；15℃2min。
实验同时设置未经转基因的大麦品种Golden Promise作为阴性对照，设置野生型Vada为阳性对照。
PCR产物用2％的琼脂糖电泳检测，电泳结果如图5所示，A代表Rlr1的36株转化株系的鉴定结果，B代表Rlr2的38株转化株系的鉴定结果，M代表天根的D2000 Marker，a和b分别为Rlr1扩增的隐性对照和阳性对照，c和d分别为Rlr2扩增的隐性对照和阳性对照。其中，扩增出目的条带的阳性转化株系。另外，转入pH7GW2D(-p35S)空载体的大麦植株均与未经转基因的大麦品种Golden Promise一样，所有测试样本均未扩增出相应的目的条带。

Claims (11)

1.蛋白质，为蛋白质A和蛋白质B；
所述蛋白质A为氨基酸序列为序列表中序列1所示的蛋白质；
所述蛋白质B为氨基酸序列为序列表中序列2所示的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；
编码权利要求1中的所述蛋白质A的基因A是序列表中序列3所示的DNA分子；
编码权利要求1中的所述蛋白质B的基因B是序列表中序列4所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。
5.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。
6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。
7.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中，启动所述基因A的转录的启动子的序列为序列表中序列5；启动所述基因B的转录的启动子的序列为序列表中序列6。
9.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4或7或8所述的重组载体或权利要求5所述的表达盒或权利要求6所述的重组菌在如下任一中的应用：
a1)调控植物对叶锈病的抗性；
a2)选育抗叶锈病能力提高的植物品种；
所述植物为大麦。
10.培育抗叶锈病能力提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：
a)向目的植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗叶锈病能力提高的转基因植物；
所述植物为大麦。
11.培育抗叶锈病能力降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：
c)在目的植物中对权利要求1所述蛋白质的编码基因进行抑制表达，得到转基因植物；
d)从步骤c)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗叶锈病能力降低的转基因植物；
所述植物为大麦。
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