CN102834517A - 编码源自于麻风树属树的nf-yb的多核苷酸及其应用 - Google Patents

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Abstract

通过分析麻风树属树的基因组，发现了编码NF-YB的基因SEQ IDNO：1-11、编码NF-YB的基因的片段SEQ ID NO：12和13、以及与其相关的基因。通过用这些编码NF-YB的基因等转化麻风树属树，可以过表达NF-YB多肽等，并可以显著提高由NF-YB多肽参与的蛋白质合成的生产率以及显著提高例如干旱胁迫抗性。因此，可以产生即使在缺水条件下仍然能够确保高生长的干旱胁迫抗性麻风树属树。

Description

编码源自于麻风树属树的NF-YB的多核苷酸及其应用
技术领域
本发明涉及作为麻风树属树的新基因的、编码NF-YB转录因子的多核苷酸及其应用，特别是用于产生干旱胁迫抗性的麻风树属树的应用。
背景技术
因为从麻风树（Jatropha curcas）可以产生非食用麻风树属树油，因此，麻风树作为用于生产生物柴油燃料的生物资源引起了人们的注意。此外，已知麻风树属树是甚至可以在就水和无机营养物而言不适合其他作物生长的地方栽培的植物，并且麻风树属树被认为非常有利于半干旱地区的有效利用和绿化。另一方面，虽然麻风树属植物生长在贫瘠之地，但通过自然栽培获得的油的生产效率不高，因为该植物的开花结果为一年一次，并且果实的大小显著小于手掌的大小。出于这个原因，需要开发高生产力的麻风树属树。
作为对麻风树属树油生产效率提高的一种度量，已知有一种转化麻风树属树的方法，使得乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）可以被过表达用于提高种子的含油量，例如公开在日本国家专利公布No.2009-536029（PTL 1）中。
另一方面，从提高麻风树属树本身的生产率的角度来说，还可以想到的是赋予耐旱性以确保甚至在缺水条件下的高生存能力。
一般来说，植物的生长受环境因素例如干旱、盐和低温的影响很大，因此，开发赋予了环境胁迫抗性的农作物是所期望的。
可以想到的是干旱胁迫抗性的基因重组植物——其中胁迫响应性信号强度和机制被改变以便适应干旱胁迫或对干旱胁迫有响应，以及用于实现过度生产参与抗性的蛋白质分子（对环境胁迫有响应的蛋白质）的改进的方法等。
植物的环境胁迫响应性信号转导途径一般分为植物激素脱落酸（ABA）介导的途径和非ABA介导的途径，并根据参与的转录调节因子的类型进一步细分。另外已知的是根据参与响应的蛋白质，参与响应的调节性蛋白质例如转录调节因子、蛋白酶和蛋白激酶，以及引起抗性的功能蛋白例如伴侣蛋白，并且它们被认为参与了各种生理反应（Kazuo Shinozaki等，朝仓植物生理学课程5《环境响应》（AsakuraPlant Physiology Course 5，“Environmental response”），pp.106-1145）。
脱落酸（ABA）是一种参与种子的休眠、气孔的打开/关闭以及渗透胁迫抗性的植物激素，并且已知ABA深入地参与一组胁迫响应性基因的表达。
例如，NPL 1（Wen-Xue Li等，“转录和转录后调控拟南芥NFYA5转录因子以促进干旱抗性（The Arabidopsis NFYA5Transcription FactorIs Regulated Transcriptionally and Posttranscriptionally to PromoteDrought Resistance）”，The Plant Cell，Vol.20：2238-2251(2008)）报告了NF-YA5转录因子在拟南芥（Arabidopsis thaliana）的干旱胁迫抗性调控机制中是ABA依赖性的并被干旱胁迫强烈诱导，以及过表达NF-YA5的转化的拟南芥在对干旱胁迫的抗性方面优于野生型拟南芥。
作为制备环境胁迫抗性的拟南芥的方法，日本专利特开No.2005-253395（PTL 2）提出了一种方法，所述方法利用了一组在转录因子调控下的基因的激活功能，所述转录因子通过与由于环境胁迫引起表达的胁迫响应性蛋白质的编码基因上游所存在的顺式元件结合来激活转录（胁迫响应性转录因子）。具体地，所述PTL 2公开了SRK2C基因是诱导DREB/CBF表达的信号转导因子的新编码基因，其中DREB/CBF是胁迫响应性转录因子，并且所述公报还公开了转化后过表达SRK2C基因的拟南芥即使在停止供水后仍显示出显著高于对照的存活率。
此外，NPL 2（Donald E.Nelson等，“植物核因子Y（NF-Y）B亚单位赋予耐旱性并导致玉米在水受限土地上的产率提高（Plantnuclear factor Y(NF-Y)B subunits confer drought tolerance and lead toimproved corn yields on water-limited acres）”，PNAS，vol.104，No.42，16450-16455(2007)）报告了，鉴定了玉米NF-YB因子，并且用该因子转化后的玉米在缺水条件下显示出与野生型相比更高的生产率。
此外，在日本国家专利公布No.2009-540830（PTL 3）中，对于缺水胁迫抗性植物水稻、玉米、大豆和棉花，公开了其中导入了这样的转录单元的植物，即所述转录单元含有与拟南芥、玉米或大豆的NF-YB蛋白的编码DNA可操作地连接的启动子。据报道，通过设计启动子等，被改性成能够过表达NF-YB的转化植物的产率即使在缺水条件下仍高于野生型对照的产率。
引用列表
专利文献
PTL 1：日本国家专利公布No.2009-536029
PTL 2：日本专利特开No.2005-253395
PTL 3：日本国家专利公布No.2009-540830
非专利文献
NPL 1：Wen-Xue Li等，“转录和转录后调控拟南芥NFYA5转录因子以促进干旱抗性（The Arabidopsis NFYA5 Transcription Factor IsRegulated Transcriptionally and Posttranscriptionally to Promote DroughtResistance）”，The Plant Cell，Vol.20：2238-2251(2008)
NPL 2：Donald E.Nelson等，“植物核因子Y（NF-Y）B亚单位赋予干旱抗性并导致玉米在水受限土地上的产率提高（Plant nuclearfactor Y(NF-Y)B subunits confer drought tolerance and lead to improvedcorn yields on water-limited acres）”，PNAS，vol.104，No.42，16450-16455(2007)
发明内容
技术问题
关于环境胁迫的信号转导途径的机制是复杂的，并且如上所述，已提出了用于产生干旱胁迫抗性植物的各种转化方法。然而，就麻风树属树而言，与干旱胁迫相关的调节性蛋白、与抗性相关的功能蛋白等尚未得到阐明。
本发明的目的是产生即使在缺水条件下仍然能够确保高生长的干旱胁迫抗性麻风树属树，以及提供能够将野生型麻风树属树转化成干旱胁迫抗性麻风树属树的基因等。
问题的解决方案
为了实现上述目的，作为用于将麻风树属树转化成干旱胁迫抗性麻风树属树的基因的检查结果，本发明的发明人阐明了麻风树属树的基因组序列，并成功地分离和鉴定了编码NF-YB的13个基因，并完成了本发明。具体而言，本发明如下所述。
[1]分离的多核苷酸，其选自以下多核苷酸：
(a)由SEQ ID NO：1至11中任一个表示的多核苷酸；
(b)编码源自于麻风树属树的NF-YB多肽的多核苷酸，其包括由SEQ ID NO：12或13表示的多核苷酸片段；以及
(c)由与(a)和(b)之一的多核苷酸的核苷酸序列具有90%或更高同源性的核苷酸序列表示的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的多肽保持由(a)和(b)之一的多核苷酸编码的NF-YB多肽的干旱胁迫抗性。
[2]如[1]所述的分离的多核苷酸，其选自(a)和(b)的多核苷酸。
[3]分离的NF-YB多肽，其选自以下多肽：
(a)具有由SEQ ID NO：14至24中任一个表示的氨基酸序列的NF-YB多肽；
(b)源自于麻风树属树的NF-YB多肽，其包括具有由SEQ ID NO：25或26表示的氨基酸序列的多肽；以及
(c)由与(a)和(b)之一的多肽的氨基酸序列具有90%或更高同源性的氨基酸序列表示的多肽，其中所述多肽保持(a)和(b)之一的NF-YB多肽的干旱胁迫抗性。
[4]如[3]所述的分离的NF-YB多肽，其选自(a)和(b)的多肽。
[5]编码如[3]或[4]所述的多肽的多核苷酸。
[6]麻风树属植物的转化载体，其中整合了如[1]、[2]或[5]所述的多核苷酸。
[7]含有如[6]所述的载体的转化体。
[8]用如[6]所述的载体转化的麻风树属植物，其中所述植株是与野生型相比能够过表达NF-YB多肽的干旱胁迫抗性的转化的麻风树属树。
[9]从如[8]所述的干旱胁迫抗性的转化的麻风树属树收获的种子。
[10]通过挤压如[9]所述的种子并将其纯化来生产麻风树属树油的方法。
[11]通过如[10]所述的生产方法生产的麻风树属树油。
发明的有益效果
当用本发明的多核苷酸转化麻风树属树时，转化的麻风树属树允许表达本发明的源自于麻风树属树的NF-YB多肽或与其相等的多肽。通过这些多肽，可以显著提高NF-YB多肽参与其中的蛋白质合成的生产率，以及显著提高例如干旱胁迫抗性。
附图说明
图1是显示拟南芥和麻风树属树的NF-YB的分子系统树的图。
图2是显示NF-YB 1至NF-YB5的琼脂糖电泳结果的照片。
图3是pGWB 11质粒的基因图谱（参见Nakagawa等，“开发用于实现高效构建植物转化用融合基因的Gateway二元载体pGWB（Development of Series of Gateway Binary Vectors，pGWBs，forRealizing Efficient Construction of Fusion Genes for PlantTransformation）”Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.104(2007)，No.1p.38）
具体实施方式
[JcNF-YB基因]
本发明的分离的新麻风树属树基因是编码麻风树属树的野生型转录因子NF-YB的多核苷酸，并且是单独存在于麻风树属树基因组中的13个基因的家族。具体地，本发明包括(a)由SEQ ID NO：1至11表示的多核苷酸（依次命名为“JcNF-YB 1基因”至“JcNF-YB 11基因”）；(b)编码源自于麻风树属树的NF-YB多肽的多核苷酸，其包括由SEQID NO：12和13表示的多核苷酸片段（分别命名为“JcNF-YB12基因”和“JcNF-YB 13基因”）；以及(c)由与(a)和(b)之一的多核苷酸的核苷酸序列具有90%或更高的同源性的核苷酸序列表示的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的多肽保持由(a)和(b)之一的多核苷酸编码的NF-YB多肽的干旱胁迫抗性。(c)的多核苷酸的核苷酸序列与(a)和(b)之一的多核苷酸的核苷酸序列具有优选95%或更高、更优选98%或更高、并特别优选99%或更高的同源性。
可以通过本发明各基因的表达来获得的多肽包括例如(a)麻风树属树野生型转录因子JcNF-YB 1至JcNF-YB 11的NF-YB多肽（具有SEQID NO：14至24的氨基酸序列）；(b)源自于麻风树属树的NF-YB多肽，其包括具有由SEQ ID NO：25和26表示的氨基酸序列的多肽；以及(c)由与(a)和(b)之一的多肽的氨基酸序列具有90%或更高的同源性的氨基酸序列表示的多肽，其中所述多肽保持(a)和(b)之一的NF-YB多肽的干旱胁迫抗性。(c)的多肽与(a)和(b)之一的多肽的氨基酸序列具有优选95%或更高、更优选98%或更高、并特别优选99%或更高的同源性。
本发明基因的核苷酸序列还包括编码上述(a)至(c)的多肽的多核苷酸。例如，只要编码(a)和(b)的多肽，部分碱基可以被取代，并且在由SEQ ID NO：1表示的JcNF-YB 1DNA中，通过用碱基T取代第6位的碱基G（SEQ ID NO：39），可以使翻译效率高于野生型的翻译效率。
在下文中，用术语“JcNF-YB基因”统称本发明的多核苷酸。
没有具体限定本发明的JcNF-YB基因的制备方法。例如，可以通过使用麻风树属树基因组作为模板和为各JcNF-YB基因设计的引物进行PCR反应来直接获得靶基因的PCR产物，或者可以通过使用以下引物组的RT-PCR法从mRNA获得靶多核苷酸的PCR产物，其中通过破碎麻风树属植物的部分、优选暴露于干旱胁迫的叶子来获得所述mRNA，此外，可以根据普通技术取代、删除或添加预定的碱基。
使用根据Sudheer等的方法（Indian Journal of Biotechnology，Vol.8(2009)p.187-192）提取的麻风树属树基因组来直接获得靶基因的PCR产物的方法是优选的。Sudheer等的方法的特点是，对要使用的提取缓冲液直至用于DNA沉淀的溶液中的NaCl浓度进行调整，并且在纯化步骤中用Tris-饱和的苯酚、然后用氯仿和异戊醇的混合物进行处理，并在沉淀步骤中使用80%乙醇。
可以用通常进行的方法来制备mRNA。例如，将冷冻的植物在研钵等中研磨后，可以通过乙二醛法、硫氰酸胍-氯化铯法、氯化锂-脲法、蛋白酶K-脱氧核糖核酸酶法等从获得的研磨后物质中提取并制备粗RNA组分。此外，可以使用可商购的试剂盒。
可以通过常规已知的方法例如Maxim-Gilbert化学修饰法或使用M13噬菌体的双脱氧链终止法对所获得的PCR产物的核苷酸序列进行测定并确认。
[产生干旱胁迫抗性的转化的麻风树属树]
本发明的干旱胁迫抗性的转化的麻风树属树是通过将具有JcNF-YB基因的表达盒基因导入到野生型麻风树属树中来产生的，所述JcNF-YB基因与用于表达或表达调控的启动子可操作地连接。
没有具体限定本发明所意指的麻风树属的物种，并且可以使用麻风树、佛肚树（Jatropha potagurica）、红珊瑚（Jatropha multifida）、锦珊瑚（Jatropha berlandieri）、琴叶珊瑚（Jatropha integerrima）等。其中，从含油量大的角度来看，优选使用麻风树。
可以通过任何方法来实现基因导入，所述方法包括直接将DNA导入细胞中的方法，例如融合原生质体的方法、电穿孔法、和基因鸟枪法；以及通过使用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）或发根农杆菌（R.rhizogenes）间接导入DNA的方法，并且使用农杆菌（agrobacterium）的方法是优选的。在下文中，描述了使用农杆菌的转化方法。
农杆菌是植物病原体并具有Ti质粒，所述Ti质粒具有被夹在LB（左边界）和RB（右边界）之间的、可以被切除并插入到宿主基因组中的区域（T-DNA（转移DNA）区）。当用这样的农杆菌感染宿主植物时，即所述农杆菌具有的质粒在该T-DNA区中整合了待导入的基因、即JcNF-YB基因，T-DNA区被切除并与vir区编码的一组蛋白质形成复合物并进入植物细胞，并实现进一步插入到宿主基因组中。
作为使用农杆菌的转化方法，二元载体法是优选的。二元载体法是通过将外源靶基因整合到具有T-DNA区边界（LB和RB）的质粒的T-DNA区中，将这样的质粒以及Ti质粒的T-DNA缺陷质粒（例如pAL4404）导入农杆菌中，并用该农杆菌感染植物，来将靶基因插入到植物基因组中的方法。
使用二元载体法产生转化的麻风树属树时使用的表达盒在T-DNA区中包含本发明的JcNF-YB基因、用于表达核苷酸的启动子、标记基因和报告基因。
作为启动子，可以列举出35S花椰菜花叶病毒启动子、胭脂碱合酶（NOS）启动子、和其他胚乳特异性启动子例如β菜豆素、芸苔素和泛素。
作为选择标记基因，所使用的基因赋予了对选择剂例如抗生素或除草剂的抗性。其具体实例包括卡那霉素抗性基因、巴龙霉素B抗性基因、或针对除草剂例如草铵膦和草甘膦的抗性基因。还可以使用的是所表达的选择标记使得能够目测识别转化体的基因，或表达β葡萄糖醛酸酶或GUS的基因，其中，所述选择标记例如为发色或荧光蛋白如荧光素酶或绿色荧光蛋白（GFP），所述β葡萄糖醛酸酶或GUS的各种显色底物是已知的。这种选择标记也可以被用作报告基因。
如果必要的话，还可以包含增强子、终止子、标签等。增强子被用于提高靶基因的表达效率，并可以列举出例如包含CaMV 35S启动子的上游序列的增强子区。终止子可以是能够使由启动子转录的基因的转录终止的任何序列，并可以列举出例如胭脂碱合酶（NOS）基因的终止子以及章鱼碱合酶（NOS）和CaMV 35S RNA基因的终止子。
作为用二元载体法转化麻风树属树中使用的二元载体，可以使用那些将上述表达盒包含在T-DNA区中的二元载体，具体地是那些通过将上述表达盒整合到可商购的载体例如pBI系列、pPZP系列、pSMA系列、和pGWB系列中而制备的二元载体。具体而言，Gateway（注册商标）克隆系统适用的植物转化用二元载体是优选的，并且作为这样的载体，可以列举出pGWB系列载体。在这些pGWB系列载体中，使用花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子作为启动子，潮霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因作为选择标记基因，β-葡萄糖醛酸酶（GUS）、绿色荧光蛋白（GFP）、荧光素酶（LUC）、黄色荧光蛋白（YFP）、或青色荧光蛋白（CFP）作为报告子，以及6xHis、FLAG、3xHA、4xMyc、GST、或T7-表位作为标签，可操作地连接靶基因和报告子。此外，还有编码报告子和标签的序列，所述标签使得能够在N端和C端两处进行融合。
Gateway（注册商标）克隆系统通过使用Gateway（注册商标）信号（att）促进了表达载体的构建。在该方法中，通过具有attP1和attP2序列的供体载体与在各端添加有attB1和attB2序列的靶基因之间的反应（BP反应），产生了在其中整合有靶基因的入门载体（各端具有attL1和attL2序列），然后通过该入门载体与在其中整合有表达所需要的启动子的目的载体（添加有attR1和attR2序列）之间的重组反应（LR反应），产生了在其中插入有靶基因的载体（表达载体）。
因此，首先使克隆的JcNF-YB基因经历与供体载体的BP反应，以制备具有整合在供体载体中的克隆的JcPPAT cDNA的入门载体，然后通过入门载体与目的载体（pGWB）之间的LR反应，可以产生其中整合有靶DNA（JcNF-YB）的表达载体。
关于使用Gateway二元载体（pGWB）构建植物转化用表达盒的详细描述可参见Nakagawa等，“开发Gateway二元载体pGWB系列用于实现高效构建植物转化用融合基因（Development of Series ofGateway Binary Vectors，pGWBs，for Realizing Efficient Construction ofFusion Genes for Plant Transformation）”Journal of Bioscience andBioengineering Vol.104，No.1，34-41(2007)）。
如上所述产生的表达载体（植物转化载体）可以在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行扩增。扩增后的转化载体可以通过电穿孔法等导入到农杆菌中。以这种方式导入了表达载体的农杆菌被用于转化麻风树属树。
通过具有植物转化载体的农杆菌的感染将靶基因（JcNF-YB基因）导入到麻风树属树中，这可以通过使用已知的方法例如叶盘法来实现。
具体地，制备感染用菌液，其中将农杆菌悬浮在MS培养基中，并将菌液与宿主麻风树属树的部分（优选地，子叶的剪切碎片，在下文中称作“麻风树属树叶子碎片”）共培养约3天。在共培养前，将麻风树属树的叶子碎片浸泡在MS培养基中约2天，并优选进行超声。用这种方式可以提高导入效率。还优选的是向其中已添加了沙的农杆菌悬浮液施加振动的Sandvortex法，因为该方法提高了农杆菌的可感染性。
作为共培养的培养基，使用掺入了植物激素例如3-吲哚丁酸（IBA）或6-苯甲氨基嘌呤（BA）的MS培养基等。
在共培养后，洗涤麻风树属树叶子碎片，并将其转移到选择培养基（含有与转化载体的表达盒中使用的选择标记基因对应的抗生素）中，并进行孵育，然后将叶子碎片中形成的愈合组织切下，并转移到选择培养基中，并进行进一步筛选转化的麻风树属树（重组细胞）。
作为选择培养基，优选使用的是通过向含有作为植物激素的IBA、BA、噻苯隆（TDZ）等的预培养用培养基（MS培养基等）添加选择用物质、即抗生素（卡那霉素、潮霉素）而制备的选择培养基。
然后，将所选择的愈合组织转移到培养基例如RI培养基或MS培养基中，并让其生根和再分化成植株。通过适当地设定光、温度以及培养基中各种成分包括植物生长调节物质例如植物生长素和细胞分裂素以及碳源的种类和数量等，可以实现诱导再分化。
[转化的麻风树属树]
与野生型相比，本发明的转化的麻风树属树能够从参与干旱胁迫抗性基因转录的转录因子JcNF-YB的编码基因过表达JcNF-YB基因的转录产物。因此，可以激活干旱胁迫抗性基因的转录和表达。因此，与野生型相比，即使在干旱条件下仍然能实现更高的植物生长。
本发明的转化植物不仅涵盖了经历转化处理的“T1代”，还涵盖了后代植物，包括从该植物的种子获得的子代“T2代”，以及通过“T2代”植物的花自体受精获得的、被药物选择或通过Southern法等的分析证明是转化体的下一代（T3代）。
[麻风树属树油的生产].
根据常规方法可以从本发明的转化的麻风树属树收获的种子生产麻风树属树油。例如，通过挤压种子获得原料油并通过滤器过滤原料油，可以生产可用作生物柴油的麻风树属树油。当打算将麻风树属树油进一步纯化时，例如，可以通过蒸馏进行纯化，并可以用日本专利特开No.2010-209177中描述的方法去除佛波酯。
实施例
将通过实施例的方式对用于实践本发明的实施方式进行描述。下面所给出的实施例不限制本发明的范围。
[麻风树属树中JcNF-YB编码DNA的分离和转化质粒的构建]
(1)麻风树属树基因组DNA的制备
使用从鸟取大学（Tottori University）农学系分配的泰国系麻风树属树（麻风树）。根据Sudheer等的方法（Indian Journal of Biotechnology，Vol.8(2009)p 187-192）从该麻风树属树的成熟叶子制备基因组DNA。
用蒸馏水洗涤麻风树属树的叶子，用棉纸吸干水分，并在研钵中将1g研磨成粉末。将得到的粉末在65°C下与10mL提取缓冲液（2%CTAB、100mM Tris-盐酸、3.5M NaCl、20mM EDTA、1%β-巯基乙醇）充分混合。将混合物在65°C水浴中孵育90分钟，然后冷却5分钟。加入等量的氯仿和异戊醇（24:1）的混合物，并缓慢混合以得到均匀的乳液。将该乳液在10,000x g下离心15分钟，然后分离水相。向分离的水相再次加入等量的氯仿和异戊醇（24:1）的混合物，并缓慢混合以得到均匀的乳液。在将该乳液在4°C下以10,000x g离心15分钟后，收集水相。向收集的水相加入等量的异丙醇，在-20°C冷却30分钟，然后在4°C下以10,000x g离心30分钟，以得到DNA沉淀。将该DNA沉淀用70%乙醇洗涤，然后再悬浮于TE缓冲液中。将获得的DNA沉淀溶解在含有20mg/mL RNase的TE缓冲液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 8.0）中，以得到基因组DNA样品。
通过与EcoRI、HindIII和SauIII一起培养来将所获得的提取的基因组DNA切割成片段，并通过测序仪进行测序。
(2)编码JcNF-YB的基因的克隆和扩增
基于从(1)获得的麻风树属树基因组信息（重叠群图谱（ContigMap）），通过TBLASTN检索与拟南芥NF-YB显示出同源性的基因。关于拟南芥的NF-YB基因信息，参考NCBI的基因注册信息（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=818472&itool=HomoloGeneMainReport）。
作为检索结果，被注释为编码JcNF-YB的那些基因如下所示。
Contig1977.1.1
Contig21632.1.1
Contig30054.1.1
Contig31310.1.2
Contig31788.1.2
Contig3182.1.1
Contig8131.1.1
F4IDXKH14IHOZQ.1
HYB_Contig17630.1.2
HYB_Contig31673.1.1
HYB_Contig46618.1.1
HYB_Contig46864.1.1
HYB_Contig61720.1.1.1
Jatropha454_3Run_c74008.1
在这些序列中，由于HYB_Contig46618.1.1和HYB_Contig61720.1.1.1的DNA核苷酸序列除了末端部分以外被证明彼此完全一致，因此，我们决定使用HYB_Contig46618.1.1用于预测JcNF-YB基因。因此，假定麻风树属树中存在13种NF-YB基因（这些基因被命名为NF-YB 1至NF-YB13）。作为同源性检索的结果，在上述各基因组片段中包含的麻风树属树DNA与拟南芥NF-YB基因之间的关系如表1所示。JcNF-YB基因的核苷酸序列如序列表中的SEQID NO：1至13所示。通过翻译这些多核苷酸而获得的多肽的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：14至26所示。此外，对JcNF-YB1至JcNF-YB 13和拟南芥的NF-YB家族（AtNF-YB1至AtNF-YB13）进行CLASTALW分析，并制备分子系统树。制备的结果如图1所示。
表1
Figure BDA00002230818800151
接着，通过使用麻风树属树（泰国系品种）基因组DNA作为模板以及如表2所示的相应的引物组（SEQ ID NO：27至36）进行PCR反应，来扩增JcNF-YB1至JcNF-YB5基因。
表2
Figure BDA00002230818800161
用于PCR的反应液如下所示。
1.25单位的Ex taq（TAKARA BIO）
1x Ex taq缓冲液（TAKARA BIO）
0.2mM dNTP（TAKARA BIO）
1μM正向引物
1μM反向引物
向上述制备的反应液中加入1μL稀释100倍后的麻风树属树基因组DNA溶液，以使总量为50μL，并在下列条件下进行PCR反应。
在96°C保持5分钟后，将[96°C，30秒→60°C，30秒→72°C，1分钟]这个循环重复30次，然后将反应物在72°C保持5分钟，并冷却至4°C。
在反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳鉴定通过扩增获得的DNA。JcNF-YB 1至JcNF-YB5的电泳结果如图2所示。此外，用DNA测序仪确定所获得的PCR产物的序列。JcNF-YB1至JcNF-YB5多核苷酸各自的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：1至5所示。
为了将Gateway（注册商标）克隆系统应用于由SEQ ID NO：1表示的DNA（JcNF-YB1），进行PCR反应，用于添加以下接头序列attB 1（SEQ ID NO：37）和attB2（SEQ ID NO：38）。
[化学式1]
attB1：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’
attB2：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’
向以下反应液中加入各1μL的DNA溶液以使总量为50μL，用由此制备的溶液进行PCR反应。
1.25单位的Ex taq（TAKARA BIO）
1x Ex taq缓冲液（TAKARA BIO）
0.2mM dNTP（TAKARA BIO）
1μM    attB_1衔接子
1μM    attB_2衔接子
用下面的温度循环进行PCR反应。在94°C保持1分钟后，将[94°C，15秒→45°C，30秒→68°C，1分钟]这个循环重复5次，然后将[94°C，15秒→55°C，30秒→68°C，1分钟]这个循环重复20次，然后将反应物冷却至4°C。在反应结束后，通过琼脂糖电泳检查扩增的DNA。
(3)转化质粒的构建
通过使用Invitrogen的Gateway（注册商标）系统的供体载体（pDONR221）来克隆JcNF-YB1基因。具体地，通过在将上面经PCR扩增得到的JcNF-YB1基因（各端具有attB1和attB2）与供体载体pDONR221混合后，用BP克隆酶（Invitrogen）进行重组反应（BP反应），获得了入门载体pENTRJcNF-YB 1，并将其导入到大肠杆菌DH5α菌株中。pDONR221具有被导入作为标记基因的卡那霉素抗性基因。
为了构建植物转化用质粒，从大肠杆菌中提取pENTRJcNF-YB 1质粒，并将其与被限制性内切酶XhoI（TAKARA BIO）直链化的质粒载体（目的载体）pGWB11混合，然后用LR克隆酶（Invitrogen）进行重组反应。
如图3所示，pGWB11具有35S启动子作为启动子，并具有添加到其C端的FLAG标签。此外，35S启动子-R1-Cmr-ccdB-R2-FLAG被插入在HindIII和SacI之间。通过与入门载体进行LR反应后，R1-Cmr-ccdB-R2部分可以被attB1-(PPAT)-attB2取代。以这种方式，获得了植物重组用载体pGWB11JcNF-YB1。
[产生转化体]
(1)制备转化用农杆菌
通过电穿孔法将上述重组用载体导入到农杆菌中，以实现转化。将该转化后的农杆菌在YEB液体培养基（加入50mg/L卡那霉素、50mg/L潮霉素）中在30°C下振荡培养2天，然后通过离心收获。将收获的细菌细胞重悬在YEB培养基中，以制备感染用菌液。
(2)麻风树属树的转化
作为宿主的麻风树属树细胞，使用泰国系麻风树属树（麻风树），这与基因组提取所使用的是同一麻风树属物种。使用麻风树属树的成熟叶子，通过叶盘法进行转化。具体地，首先将宿主麻风树属树的成熟叶子的剪切碎片（约25mm2，在下文中，称为“麻风树属树叶子碎片”）用稀释的厨房用漂白剂进行灭菌，并在25°C下在预处理的琼脂培养基上静置2天，所述预调节琼脂培养基是通过向MS基础培养基添加植物激素（TDZ、BA、IBA）而制备的。通过将农杆菌悬浮在MS培养基中来制备感染用菌液，并将上述麻风树属树叶片浸泡在菌液中并振荡10分钟。然后，在避光环境中，在25°C下在琼脂培养基上进行3天的共培养。作为共培养培养基，使用通过向预调节培养基中添加乙酰丁香酮而制备的共培养培养基。
(3)转化的麻风树属树的筛选
所筛选的转化体具有被稳定地插入到麻风树属树的染色体基因组中的上面所制备的表达盒。
具体地，用头孢噻肟钠水溶液（200mg/L）洗涤共培养后的麻风树属树叶子碎片，并筛选转化的麻风树属树（重组细胞）。使用卡那霉素（20mg/L）作为筛选用抗生素。在转移到芽再生I琼脂培养基（SR-I）中后，将其中在25°C培养后观察到愈合组织形成的叶子碎片转移到芽再生II（SR-II）琼脂培养基中。
接着，将所选择的愈合组织转移到芽伸长I琼脂培养基（SE-I）和芽伸长II琼脂培养基（SE-II）中，让胚状体分化，并在诱导生根的琼脂培养基（RI）中诱导生根，以获得再分化的麻风树属树（T1）。
本文中使用的培养基组合物如下所示。
<MS基础培养基>
MS      1x，（pH 5.8）
蔗糖    3%
肌醇    100mg/L
盐酸硫胺（pH 5.8） 10mg/L
琼脂    0.8%
<预调节培养基>
MS基础培养基
噻苯隆（TDZ）0.5mg/L
6-苯甲氨基嘌呤（BA）1mg/L
3-吲哚丁酸（IBA）0.075mg/L
<共培养培养基>
MS基础培养基
噻苯隆（TDZ）0.5mg/L
6-苯甲氨基嘌呤（BA）1mg/L
3-吲哚丁酸（IBA）0.075mg/L
乙酰丁香酮（AS）20mg/L
<SR-I培养基>
MS基础培养基
噻苯隆（TDZ）0.5mg/L
6-苯甲氨基嘌呤（BA）1mg/L
3-吲哚丁酸（IBA）0.075mg/L
头孢噻肟钠200mg/L
卡那霉素20mg/L
<SR-II培养基>
MS基础培养基
6-苯甲氨基嘌呤（BA）3mg/L
3-吲哚丁酸（IBA）0.5mg/L
头孢噻肟钠200mg/L
卡那霉素20mg/L
<SE-I培养基>
MS基础培养基
6-苯甲氨基嘌呤（BA）2mg/L
头孢噻肟钠200mg/L
卡那霉素20mg/L
<SE-II培养基>
MS基础培养基
6-苯甲氨基嘌呤（BA）2mg/L
卡那霉素20mg/L
<RI培养基>
MS基础培养基（1/2浓度的MS）
3-吲哚丁酸（IBA）0.2mg/L
(4)JcNF-YB基因表达的确认
经检查JcNF-YB1转录因子在通过筛选所选择的转化体中是过表达的。
分别培养转化细胞（通过启动子表达NF-YB多肽的转化的双子叶细胞）和对照（野生型麻风树属树的双子叶细胞），并提取mRNA。将转化细胞的JcNF-YB 1转录因子的mRNA的量与对照中的量进行比较。
(5)转化的麻风树属树的干旱胁迫抗性的确认
将通过再分化获得的转化的植株进行沙基培养，并在任意时间点停止灌溉后培养在缺水的条件下，将转化的植株的光合速率和叶绿素荧光、蒸腾速率、以及成熟叶子的发黄、卷曲和掉落与野生型进行比较，并评估干旱胁迫抗性。
工业适用性
本发明新分离的基因可以用于产生干旱胁迫抗性的麻风树属树，因此可以提供能够在干旱地区生长的麻风树属树。
Figure IDA00002230819800011
Figure IDA00002230819800021
Figure IDA00002230819800031
Figure IDA00002230819800041
Figure IDA00002230819800051
Figure IDA00002230819800061
Figure IDA00002230819800071
Figure IDA00002230819800081
Figure IDA00002230819800091
Figure IDA00002230819800101
Figure IDA00002230819800111
Figure IDA00002230819800121
Figure IDA00002230819800131
Figure IDA00002230819800141
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Figure IDA00002230819800171
Figure IDA00002230819800181
Figure IDA00002230819800191
Figure IDA00002230819800201
Figure IDA00002230819800211
Figure IDA00002230819800221
Figure IDA00002230819800231
Figure IDA00002230819800241

Claims (11)

1.分离的多核苷酸，其选自以下多核苷酸：
(a)由SEQ ID NO：1至11中任一个表示的多核苷酸；
(b)编码源自于麻风树属树的NF-YB多肽的多核苷酸，其包括由SEQ ID NO：12或13表示的多核苷酸片段；以及
(c)由与(a)和(b)之一的多核苷酸的核苷酸序列具有90%或更高同源性的核苷酸序列表示的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的多肽保持由(a)和(b)之一的多核苷酸编码的NF-YB多肽的干旱胁迫抗性。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，其选自(a)和(b)的多核苷酸。
3.分离的NF-YB多肽，其选自以下多肽：
(a)具有由SEQ ID NO：14至24中任一个表示的氨基酸序列的NF-YB多肽；
(b)源自于麻风树属树的NF-YB多肽，其包括具有由SEQ ID NO：25或26表示的氨基酸序列的多肽；以及
(c)由与(a)和(b)之一的多肽的氨基酸序列具有90%或更高同源性的氨基酸序列表示的多肽，其中所述多肽保持(a)和(b)之一的NF-YB多肽的干旱胁迫抗性。
4.权利要求3的分离的NF-YB多肽，其选自(a)和(b)的多肽。
5.编码权利要求3或4的多肽的多核苷酸。
6.麻风树属植物的转化载体，其中整合了权利要求1、2或5的多核苷酸。
7.含有权利要求6的载体的转化体。
8.用权利要求6的载体转化的麻风树属植物，其中所述植物是与野生型相比能够过表达NF-YB多肽的干旱胁迫抗性的转化的麻风树属树。
9.从权利要求8的干旱胁迫抗性的转化的麻风树属树收获的种子。
10.通过挤压权利要求9的种子并对其纯化来生产麻风树属树油的方法。
11.通过权利要求10的生产方法生产的麻风树属树油。
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