JP4580665B2 - 環境ストレス耐性植物 - Google Patents

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Description

本発明は、ストレス応答性転写因子の発現を誘導することによって該転写因子の制御下にある遺伝子群の転写を活性化する作用を有する、プロテインキナーゼタンパク質をコードする遺伝子、及び該遺伝子を導入した環境ストレスに対して耐性の高い形質転換植物に関する。
植物は、乾燥・塩・低温などの環境要因によって生育が大きく左右される。このことは農業生産の問題と直結しており、環境ストレス耐性を付与した農作物の開発は世界の農業生産効率を向上させる技術として期待されている。このような観点から、古典的な育種法及び遺伝子組換え等のバイオテクノロジー的手法を駆使して、様々な環境ストレス耐性植物が開発されるようになった。例えば、アミノ酸の一種であるプロリンやオリゴ糖であるガラクチノールを合成する酵素遺伝子を導入した植物では、プロリンやガラクチノールによる浸透圧調節機能が付与されるため、乾燥や塩ストレスに対して耐性を示すようになる。このように、植物体内で一つの遺伝子を過剰に発現させ、それによって耐性を付与する方法はある程度の成功をおさめているが、生育に影響を及ぼしたり、効果が大きくないなどの障害が生じる場合が多い。上記のような環境ストレス耐性を付与することのできる遺伝子は、実際に植物が持っているものが多く、植物がストレスを感受すると積極的に動き出して耐性獲得に機能している。これらの遺伝子は、ある上流因子の指令を受け取って発現していると考えられることから、そのような上流因子を特定することができれば下流の遺伝子を全て制御し、ストレス耐性を強化することが可能となる。このような考え方は「レギュロンバイオテクロノジー」と呼ばれており、近年注目されている。遺伝子の発現を制御する上流因子としてまず考えられるのは、メッセンジャーRNAの転写を直接的に制御する「転写因子」である。近年、乾燥及び低温ストレスに関わる転写因子としてDRFB/CBFが同定され、その形質転換植物では下流の遺伝子発現が活性化され、乾燥・塩・低温ストレスに対して耐性を示すことが明らかとなった（非特許文献１及び非特許文献２）。しかしながら、DRFB/CBF転写因子を活性化するさらに上流のシグナル伝達因子はこれまで不明であった。従って、そのような環境応答に関わる上流のシグナル伝達因子が明らかになれば、ストレス耐性がより強化された植物の開発に有用であると考えられる。
一方、アブシジン酸（ABA）は、種子休眠、気孔の開閉、浸透圧ストレス耐性に関わる植物ホルモンである。ストレス応答性遺伝子群の発現にはABAが深く関与しており、植物が乾燥などのストレスを受けるとABA依存的経路とABA非依存的経路によりシグナル伝達され、このシグナル伝達によりストレス応答性遺伝子群の発現が調節されていることがわかっている。ABAシグナル伝達には多種多様な因子が関与することが報告されており、プロテインキナーゼはその一つである。本発明者らは、ABAのシグナル伝達系とタンパク質のリン酸化の関係に着目し、ABAにより特異的に活性化されるプロテインキナーゼ群としてSnRK2（SNF1-related protein kinase 2)ファミリーを同定し、その中の一つであるSRK2Eが気孔の開閉を制御し、ABA誘導性遺伝子発現に関与することを明らかにしている（非特許文献３）。
Quiang Liu, et al., The Plant Cell, Vol.10, 1391-1406 (1998) Mie Kasuga, et al., Nature Biotechnology, Vol.17, 287-291 (1999) Riichiro Yoshida, et al., Plant Cell Physiol., 43(12), 1473-1483 (2002)
従って、本発明は、環境応答に関わる遺伝子群の上流のシグナル伝達因子を解明すること、及び該因子を利用してストレス耐性形質転換植物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、SnRK2プロテインキナーゼファミリーの一つであるSRK2C遺伝子を植物体に導入し過剰発現させた結果、DREB/CBF転写因子の発現が上昇するとともに、乾燥・浸透圧・低温ストレスに対して高い耐性を示すことを見出した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) 以下の(a)又は(b)に示すタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつストレス応答性転写因子発現誘導活性とプロテインキナーゼ活性を有するタンパク質
(2) 以下の(c)又は(d)に示すＤＮＡからなる遺伝子。
(c) 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
(d) 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス応答性転写因子発現誘導活性とプロテインキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
(3) ストレス応答性転写因子がDREB/CBFである、(1)又は(2)に記載の遺伝子。
(4) 以下の(a)又は(b)のタンパク質。
(a) 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ストレス応答性転写因子発現誘導活性とプロテインキナーゼ活性を有するタンパク質
(5) (1)〜(3)のいずれかに記載の遺伝子を含む組換えベクター。
(6) (1)〜(3)のいずれかに記載の遺伝子、又は(5)に記載の組換えベクターを導入したストレス耐性形質転換植物。
(7) 植物が、植物体、植物器官、植物組織、又は植物培養細胞である(6)に記載のストレス耐性形質転換植物。
(8) ストレスが、乾燥ストレス、浸透圧ストレス、及び低温ストレスからなる群から選択される少なくとも1つ以上である、(6)又は(7)に記載のストレス耐性形質転換植物。
(9) 植物が、イネ科、ユリ科、ショウガ科、アブラナ科、ナス科、マメ科、ウリ科、セリ科、キク科、アオイ科、アカザ科、フトモモ科、及びヤナギ科からなる群から選択されるいずれかの科に属するものである、(6)〜(8)のいずれかに記載のストレス耐性形質転換植物。
(10) (1)〜(3)のいずれかに記載の遺伝子を植物体内で過剰発現させることを特徴とする、植物体にストレス耐性を付与する方法。
本発明により、環境ストレス （乾燥・浸透圧・低温等）に対して耐性の高いトランスジェニック植物が提供される。本発明のトランスジェニック植物の環境ストレス耐性機構は、環境応答に関わる遺伝子群の上流のシグナル伝達因子の発現上昇によるものであるから、ストレス負荷から耐性獲得までの時間が短い。また、かかるシグナル伝達因子は環境ストレスによる活性化によって機能を発揮するため、通常の生育状態において植物に及ぼす影響も少ない。
１．遺伝子のクローニング
本発明の遺伝子は、乾燥・浸透圧・低温等などの環境ストレスにより発現されるストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子の上流に存在するシスエレメントに結合して転写を活性化する転写因子（以下、「ストレス応答性転写因子」という）の発現を誘導するシグナル伝達因子をコードする遺伝子である。前記「ストレス応答性転写因子」としては、乾燥ストレス応答性エレメント(DRE；dehydration-responsive element)に結合し、該ストレス応答性エレメントの下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有するものが挙げられ、例えば、DREB/CBF転写因子が挙げられる。
本発明の遺伝子のクローニングは例えば以下のようにして行う。
(1) シロイヌナズナのmRNA及びcDNAライブラリーの調製
mRNAの供給源としては、シロイヌナズナの葉、茎、根、花など植物体の一部又は植物体全体が挙げられる。また、シロイヌナズナの種子をGM培地、MS培地、#3培地などの固体培地に播種し、無菌条件下で生育させた植物体も用いることができる。本発明に用いる遺伝子のシロイヌナズナ植物体中のmRNAレベルは、植物体を浸透圧（塩）ストレス(例えば、50〜600mM NaCl）、低温ストレス(例えば、-10〜10℃）に曝露することにより増大するため、これらのストレスに曝露させたシロイヌナズナ植物体を用いてもよい。
mRNAの調製は、例えば、GM培地で生育させたシロイヌナズナの植物体を、乾燥ストレス、浸透圧（塩）ストレス、又は低温ストレスに曝露後、液体窒素で凍結する。その後は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、凍結した植物体を乳鉢などで摩砕後、得られた摩砕物から、グリオキザール法、グアニジンチオシナネート-塩化セシウム法、塩化リチウム-尿素法、プロテイナーゼK-デオキシリボヌクレアーゼ法などにより、粗RNA画分を抽出調製する。RNAの抽出は、市販のキット(Total RNA Extraction Kit;Amersham製）を用いてもよい。
このようにして得られた粗RNA画分を鋳型として、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて、一本鎖cDNAを合成した後、該一本鎖cDNAを鋳型として、シロイヌナズナのゲノム情報を基にAGI code: At1g78290のコード領域を増幅するように作製したプライマーを用いてRT-PCRを行い、SRK2CのcDNAを増幅する。
得られた目的とするクローンのcDNAの塩基配列を決定する。塩基配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばApplied Biosystems社製ABI373シークエンサー、同社310 DNAシークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。得られた塩基配列を、DNASIS（日立ソフトウエアエンジニアリング社）等のDNA解析ソフトによって解析し、得られたDNA鎖中にコードされているタンパク質コード部分を見出すことができる。
本発明の遺伝子の塩基配列を配列番号１に、本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
但し、植物間でも品種等によって多少のアミノ酸配列の相違はありえる。また、同一植物品種であっても突然変異等によってアミノ酸が変化する場合もある。
よって、本発明の遺伝子には、配列番号２に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつストレス応答性転写因子発現誘導活性とプロテインキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をも含まれる。
ここで、欠失、置換若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、好ましくは、１個から数個である。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示すアミノ酸配列に１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示すアミノ酸配列の１〜10個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
また、本発明の遺伝子には、配列番号２に示すアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する遺伝子であって、かつストレス応答性転写因子発現誘導活性とプロテインキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
上記７０％以上の相同性は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性をいう。
ここで、「ストレス応答性転写因子発現誘導活性」とは、ストレス応答性転写因子、例えばDREB/CBFの発現を増強させる活性をいう。
また、「プロテインキナーゼ活性」とは、タンパク質を構成する特定のアミノ酸残基をリン酸化する活性をいう。プロテインキナーゼ活性は、例えば、形質転換植物体の葉から調製したタンパク質抽出物について、ヒストンを基質として用いるゲル内リン酸化法（Riichiro Yoshida, et al., Plant Cell Physiol., 43(12), 1473-1483 (2002))により確認することができ、SDS-PAGE(ゲル濃度8％)において分子量35〜75kDaにスポットが現われる場合を「活性あり」と評価することができる。
また、「ストレス応答性転写因子発現誘導活性とプロテインキナーゼ活性を有する」とは、上記の両活性が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
本発明の遺伝子はまた、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス応答性転写因子発現誘導活性とプロテインキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号１で表わされる塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましく９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。
上記アミノ酸の欠失、付加、及び置換は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のcDNAないしゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
２．組換えベクター及び形質転換植物の作製
(1) 組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、上記１．の遺伝子（以下、「目的遺伝子」ともいう）を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ここで、ベクターとしては、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、pBI系、pPZP系、pSMA系のベクターなどが好適に用いられる。特にpBI系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3等が挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌（Escherichia coli）及びアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるLB配列とRB配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のDNAを植物核DNAに組み込むことが可能である（EMBO Journal, 10(3), 697-704 (1991)）。一方、pUC系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、pUC18、pUC19、pUC9等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV)、インゲンマメモザイクウイルス（BGMV)、タバコモザイクウイルス（TMV）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列(LB,RB)間に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスC58、LBA4404、EHA101、EHA105等に、エレクトロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウムを植物の形質導入に用いる。
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
また、目的遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、上記１．の遺伝子の上流、内部、あるいは下流に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリA付加シグナル、5'-UTR配列、選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。
「プロモーター」としては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos)、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来PRタンパク質プロモーター等が挙げられる。
エンハンサーとしては、例えば、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、CaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域などが挙げられる。
ターミネーターとしては、プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（NOS)遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素(OCS)遺伝子のターミネーター、CaMV 35S RNA遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
選抜マーカー遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子などが挙げられる。
また、選抜マーカー遺伝子は、上記のように目的遺伝子とともに同一のプラスミドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、あるいは、選抜マーカー遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターと、目的遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合は、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。
(2) 形質転換植物の作製
本発明の形質転換植物は、上記(1)の組換えベクターを用いて、対象植物を形質転換し、形質転換植物体を調製することができる。
形質転換植物体を調製する際には、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、その好ましい例として、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、及び植物体そのものを用いる場合（in planta法）がある。プロトプラストを用いる場合は、Tiプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルスに感染させる等により行うことができる。また種子あるいは植物体を用いるin planta法を適用する場合、すなわち植物ホルモン添加の組織培養を介さない系では、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物などへのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。
アグロバクテリウム感染法により遺伝子を導入する場合、目的の遺伝子を含むプラスミドを保有するアグロバクテリウムを植物に感染させる工程が必須であるが、これは、減圧浸潤法により行うことができる。すなわち、バーミキュライトとパーライトを等量ずつ合わせた土で生育させたシロイヌナズナに、目的遺伝子を含むプラスミドを含むアグロバクテリウムの培養液に直接のシロイヌナズナを浸し、これをデシケーターに入れバキュームポンプで65〜70mmHgになるまで吸引後、5〜10分間、室温に放置する。鉢をトレーに移しラップで覆い湿度を保つ。翌日ラップを取り、植物をそのまま生育させ種子を収穫する。次いで、目的遺伝子を保有する個体を選択するために、種子を適切な抗生物質を加えたMS寒天培地に播種する。この培地で生育したシロイヌナズナを鉢に移し、生育させることにより、目的遺伝子が導入された形質転換植物の種子を得ることができる。
遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法等により行うことができる。例えば、形質転換植物体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。
あるいは、種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ（LUC）、Green fluorescent protein（GFP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ベータガラクトシダーゼ（LacZ）等の遺伝子を目的遺伝子の下流域に連結したベクターを作製し、該ベクター導入したアグロバクテリムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認できる。
本発明において形質転換に用いられる植物としては単子葉植物又は双子葉植物のいずれであってもよい。単子葉植物としては、例えばイネ科（イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、ヒエ等）、ユリ科（アスパラガス、ユリ、タマネギ、ニラ、カタクリ等）、ショウガ科（ショウガ、ミョウガ、ウコン等）に属する植物が挙げられ、双子葉植物としては、例えばアブラナ科(シロイヌナズナ、キャベツ、ナタネ、カリフラワー、ブロッコリー、ダイコン等）、ナス科（トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ等）、マメ科（ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ等）、ウリ科（キュウリ、メロン、カボチャ等）、セリ科（ニンジン、セロリ、ミツバ等）、キク科（レタス等）、アオイ科（ワタ、オクラ等）、アカザ科（シュガービート、ホウレンソウ等）、フトモモ科（ユーカリ、クローブ等）、ヤナギ科（ポプラ等）に属する植物が挙げられるが、これらに限定はされない。これらの中でも、アブラナ科に属する植物、タバコ、ダイズ、コムギ等が特に好ましく用いられる。
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂（植物の芽の先端の生長点）、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、それを酵素処置して細胞壁を除いたプロプラスト等の植物培養細胞が挙げられる。またin planta法適用の場合、吸水種子や植物体全体を利用し得る。
また、本発明において形質転換植物体とは、植物体全体、植物器官（例えば根、茎、葉、花弁、種子、種子、実等）植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)、植物培養細胞のいずれをも意味するものである。
植物培養細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、以下のように行うことができる。
まず、形質転換の対象とする植物材料して植物組織又はプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。
カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシンやサイトカイニン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、更に完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（例えばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞及び組織等）で貯蔵等を行ってもよい。
本発明の形質転換植物体は、形質転換処理を施した再分化当代である「T1世代」のほか、その植物の種子から得られた後代である「T2世代」、薬剤選抜あるいはサザン法等による解析によりトランスジェニックであることが判明した「T2世代」植物の花を自家受粉して得られる次世代（T3世代）などの後代植物をも含む。
上記のようにして得られる形質転換植物は、環境ストレスに対して耐性を獲得する。従って、当該形質転換植物は、環境ストレス耐性植物として使用することができる。ここで、「環境ストレス」とは、一般には非生物的ストレスを意味し、例えば乾燥ストレス、浸透圧ストレス、低温ストレス等をいう。これらのストレスは１種または複数種であってもよい。
「乾燥ストレス」とは、水分欠乏状態が持続的に負荷されたときに起こるストレスをいう。「浸透圧ストレス」とは、水分ポテンシャルを低下させ、水分吸収を妨げる物質が持続的に負荷されたときに起こるストレスをいう。かかる物質には、イオン性物質（NaCl、CaCl2など）と非イオン性物質（ポリエチレングリコール、マンニトールなど）の両方が含まれる。浸透圧ストレスの代表例は、高塩濃度のNaClの負荷による「塩ストレス」であり、「塩ストレス」とは、例えば50mM〜600mMの濃度のNaClが1時間〜数週間継続的に負荷されたときに起こるストレスをいう。
また、「低温ストレス」とは、それぞれの生物種の生活至適温度よりも低い温度が持続的に負荷（例えばシロイヌナズナの場合、-10〜5℃の温度を継続的に1時間〜数週間負荷）されたときに起こるストレスをいう。
３．形質転換植物体内における各種遺伝子のmRNAレベルの変化
形質転換植物体内において、本発明の遺伝子の作用により、発現レベルが変化したと考えられる遺伝子はノーザンブロット法によって同定することができる。ノーザンブロット法は、本発明の遺伝子が導入された形質転換植物と導入されていない植物とを用いて、環境ストレスを負荷し、遺伝子の発現を比較することによって検定することができる。
例えば、GM寒天培地などで育てた植物に、所定期間、環境ストレス（乾燥、浸透圧、低温）を負荷する。
乾燥ストレスは、例えば、給水状態を１〜２週間停止、あるいは、植物個体全体を土壌又は水耕液等から引き抜いて空気中で一定時間さらすことにより負荷する。浸透圧ストレスは、例えば、所定の水耕液に50〜600mMになるように塩化ナトリウムを添加し、1時間〜数週間栽培することによって、あるいは、水耕液、培地等にポリエチレングリコール(50g/L〜200g/L)などを添加することにより負荷する。低温ストレスは、例えば、植物体を-10〜5℃で10分間〜24時間保持することにより負荷する。
環境ストレスの負荷は、１種類であってもよく、複数種であってもよい。
ストレスを与えないコントロール植物とストレスを与えた植物から全RNAを調製して電気泳動を行い、ノーザンブロット法又はRT-PCRによって発現している遺伝子を検定する。
４．形質転換植物の環境ストレスに対する耐性の評価
本発明の形質転換植物の環境ストレスに対する耐性は、バーミキュライト、パーライトなどを含む土を入れた植木鉢に形質転換植物を植え、乾燥、浸透圧、低温などの各種ストレスを負荷した場合の植物体の状態（例えば、生育速度、生存率、草丈、重量、収量、あるいはこれらの組合せ）を調べることによって評価することができる。ここで、各種ストレスの負荷条件は前項の通り行うことができる。
「環境ストレスに対する耐性」とは、上記の環境ストレス耐性を負荷した場合にあっても、生育が阻害されず、生存できる能力をいう。
５．本発明タンパク質の生産
本発明のタンパク質は、上記１．で単離した本発明の遺伝子をプラスミド DNA、ファージ DNA等の宿主中で複製可能な組換えベクターに連結(挿入)し、該ベクターを大腸菌等の植物宿主以外の宿主に導入して形質転換体を得、該形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。ここで、「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
上記のプラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
植物宿主以外の宿主としては、大腸菌(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf9等の昆虫細胞などを用いることができる。
大腸菌、酵母等の細菌を宿主とする場合は、上記組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli) DH5α、HB101などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。この場合、プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであれば特に限定はされず、例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターを用いることができる。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichea pastris)などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等を用いることができる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞などが用いられる。この場合、プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
上記の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、37℃で行う。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには IPTG等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはIAA等を培地に添加することができる。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％CO2存在下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより目的のタンパク質採取する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
６．植物の環境ストレス耐性調節物質のスクリーニング方法
本発明の遺伝子は、植物の環境ストレス耐性を調節する物質のスクリーニングに用いることができる。植物体または植物細胞における本発明の遺伝子の発現量が増加すれば、その植物の環境ストレス耐性は上昇し、該遺伝子の発現量が減少すれば、環境ストレス耐性は低下する。従って、本発明の遺伝子の植物体または植物細胞における発現量の増減を指標とすることにより、環境ストレス耐性の調節物質をスクリーニングすることができる。具体的には、環境ストレス耐性調節物質の候補物質を、本発明の遺伝子を発現可能な植物、例えばシロイヌナズナに添加し、該植物細胞内における本発明の遺伝子の発現レベルの変化を、定量的PCR法、ノーザン法等で測定する。物質を添加することにより本発明の遺伝子の発現量が増加した場合には、該物質は植物の環境ストレス耐性を強化させる物質の候補物質とすることができ、物質を添加することにより本発明の遺伝子の発現量が減少した場合には、該物質は植物の環境ストレス耐性を弱化させる物質の候補物質とすることができる。スクリーニングの対象となる候補物質の種類は特に限定されない。例えば、天然に生じる分子(例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸など)；脂質、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体(例えば、ペプチド擬態物など)；及び天然に生じない分子(例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作成した低分子有機化合物)；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
（実施例１） SRK2C遺伝子の植物体への導入
シロイヌナズナゲノム上には10個のSnRK2プロテインキナーゼ（SRK2A〜J）が存在し、系統分類によってSnRK2aおよびSnRK2bサブファミリーに分けられている（図１Ａ）。本実施例においては、SnRK2プロテインキナーゼファミリーの一つであるSRK2Cの全長cDNA単離し、このSRK2C遺伝子をシロイヌナズナ培養細胞に導入して形質転換体を得、この形質転換体にストレス負荷処理を行ってSRK2Cの活性化を調べた。
(1) SRK2C遺伝子のクローニング
Total RNA Extraction Kit（Amersham社）を用いてシロイヌナズナ実生より全RNAを抽出した。全RNAは、RNase free DNaseを用いて、ゲノムDNAを消化し除いた。これをcDNA合成の鋳型に用い、oligo-dTをプライマーとしてSuperScriptII逆転写酵素（Invitrogen社）作用させ、1本鎖cDNAを合成した。この1本鎖cDNAを鋳型として、センスプライマー：5’- TCTAGAATGGAGAGGTACGAAATAG -3’(配列番号３）、アンチセンスプライマー：5’- GGATCCCAAAGGGGAAAGGAGATCAG -3’（配列番号４）を用いてPCRを行い、SRK2CのcDNAを増幅した。PCR条件は98℃２分、（95℃30秒、55℃30秒、72℃１分）×30サイクル、74℃５分の後、４℃で維持とした。増幅した断片長は約１kbであり、目的の長さであった。
(2) 植物形質転換用プラスミドの構築
RT-PCRによって得られたSRK2CのcDNA断片をpGEM-T easyベクター（プロメガ社）にサブクローニングし、大腸菌DH5α株を用いてプラスミドDNAを大量調製した。このプラスミドをBamHIおよびXbaIの二種類の制限酵素で処理してSRK2C cDNA断片を切り出し、pBE2113GFPベクターのBamHIおよびXbaI部位に挿入してpBE2113:SRK2C-GFPを構築した。
(3) シロイヌナズナの形質転換
pBE2113:SRK2C-GFP及びpBE2113GFPをアグロバクテリウムC58株にエレクトロポレーション法によって導入し、形質転換用アグロバクテリウムを得た。このアグロバクテリウム株を用いて減圧浸潤法によりシロイヌナズナT87培養細胞およびシロイヌナズナ植物体（Columbia)に形質転換した。形質転換体をカナマイシン30 mg/mLおよびクラフォラン100 mg/mLを含む培地で選抜し、導入したSRK2C-GFPの発現を蛍光検出器FLA2000（富士写真フイルム）によって検出して複数のSRK2C-GFP過剰発現株を得た。
(4) SRK2Cプロテインキナーゼ活性の検出
SRK2C-GFPを過剰発現させた培養細胞に、50μM アブシジン酸（ABA）、0.5 M NaCl、0.8 Mマンニトール、10mM H2O2、5％グルコース溶液をそれぞれ30分間処理し、直ちに液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。これらの培養細胞から粗タンパク抽出液を調製し、粗タンパク量として10μgをSDS-PAGE法によって分画した。SDS-PAGEに用いるゲルは、ポリアクリルアミド濃度を8%とし、ヒストンH3（シグマ社）を5 mg/mL加えた。電気泳動の終了したゲルを洗浄バッファー（組成：25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.1 mM Na3VO4, 5 mM NaF, 0.5 mg/mL BSA, 0.1% Triton X-100）で30分間２回洗浄し、Renatureバッファー（組成：25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.1 mM Na3VO4, 5 mM NaF）に入れ16時間4℃でインキュベートした。ゲルを反応バッファー（組成：25 mM HEPES, pH 7.5, 2 mM EGTA, 12 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 mM Na3VO4）に30分間浸した後、200 nM ATPと50 μCi [γ-32P] ATP (Perkin Elmer社)を加えて、室温で1時間ゲル内リン酸化反応を行った。反応後、ゲルを５％トリクロロ酢酸／１％ピロリン酸ナトリウムで洗浄・固定化し、ゲル乾燥機によって乾燥させた後、放射活性をオートラジオグラフィーによって検出した。その結果、SRK2Cは50μM ABA、0.5 M NaClおよび0.8 Mマンニトール処理によって活性化が認められ、特に0.5 M NaClおよび0.8 Mマンニトール処理で強く活性化することが明らかとなった（図２Ａ）。
また、SRK2C-GFP過剰発現植物を4℃の冷蔵庫の中に所定時間（0,1/4,1/2,1,2,4,8,12時間）入れて低温処理を施し、上記の方法によってキナーゼ活性を検出したところ、SRK2Cは低温によっても活性化することが明らかとなった（図２Ｂ）。
（実施例２） SRK2C-GFP過剰発現植物の乾燥耐性および凍結耐性試験
pBE2113GFP形質転換植物（ベクターコントロール植物）およびSRK2C-GFP過剰発現植物を4週間育成した後、給水を停止して乾燥耐性試験を行った。給水停止後14日後の生存率を計測したところ、SRK2C-GFP過剰発現植物(ライン＃１〜３）はベクターコントロール植物（VC)に比べて有意に高い生存率を示し、乾燥ストレスに対して耐性を示すことが明らかとなった（図３Ａ）。
また、同様の植物を-10℃で6時間処理し、その後の生存率を計測した結果、SRK2C-GFP過剰発現植物では凍結耐性も有意に向上していることが明らかとなった（図３Ｂ）。
（実施例３）DREB/CBF転写因子、その下流遺伝子群の発現解析
SRK2C過剰発現植物およびベクターコントロール植物からRNAを抽出し、常法に従い10μgを電気泳動によって分画した。分画したRNAをナイロン膜にブロットし、32Pで標識したRD29A, Cor15a, kin1, AtGolS3特異的DNAプローブとハイブリダイズさせ、ストリンジェントな条件で洗浄した後、放射活性をオートラジオグラフィーによって検出した。
SRK2C過剰発現植物では乾燥や低温ストレス応答性の遺伝子であるRD29A、Cor15a、kin1、AtGolS3などの発現が増加しており、転写因子であるDREB/CBFの発現も誘導されていることが明らかとなった（図４Ａ）。
SRK2C過剰発現植物でDREB/CBF転写因子の発現が増加していたことで、RD29Aなどはこの転写因子の影響によって増加していることが予想される。したがって、SRK2Cは植物の乾燥および低温ストレス応答のシグナル伝達系を正に制御しているプロテインキナーゼであり、SRK2C過剰発現植物のストレス耐性の向上はDREB/CBFレギュロンの制御下にある遺伝子の発現増強によってもたらされていると考えられた（図４Ｂ）。
図１Ａは、SnRK2プロテインキナーゼファミリーを示す。図１Ｂは、植物体におけるSRK2C機能解析方法のスキームを示す。 図２Ａは、高浸透圧ストレス負荷後のSRK2Cのプロテインキナーゼ活性をゲル内リン酸化アッセイによって解析した結果を示す（矢印部分が該当するキナーゼ活性）。 図２Ｂは、低温ストレス負荷後のSRK2Cのプロテインキナーゼ活性をゲル内リン酸化アッセイによって解析した結果を示す（矢印部分が該当するキナーゼ活性）。 図３Ａは、SRK2C過剰発現植物の乾燥ストレス耐性試験結果を示す（写真：乾燥ストレス処理後の各ライン（２ポットずつ）植物体の写真、グラフ：乾燥ストレス処理後の各ライン植物の生存率）。 図３Ｂは、SRK2C過剰発現植物の凍結耐性試験結果を示す（写真上：低温ストレス未処理の各ライン植物体の写真、写真下：低温ストレス処理後の各ライン植物体の写真、グラフ：低温ストレス処理後の各ライン植物の生存率）。 図４Ａは、SRK2C過剰発現植物における遺伝子発現解析結果を示す。図４Ｂは、SRK2Cの作用機構のモデル図を示す。

Claims (5)

  1. 以下の(a)又は(b)又は(c)に示すタンパク質をコードする遺伝子を植物体内で過剰発現させることを特徴とする、植物体にストレス耐性を付与する方法。
    (a) 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
    (b) 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつストレス応答性転写因子発現誘導活性とプロテインキナーゼ活性を有するタンパク質
    (c) 配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつストレス応答性転写因子発現誘導活性とプロテインキナーゼ活性を有するタンパク質
  2. 以下の(d)又は(e)に示すＤＮＡからなる遺伝子を植物体内で過剰発現させることを特徴とする、植物体にストレス耐性を付与する方法。
    (d) 配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
    (e) 配列表の配列番号１に示す塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつストレス応答性転写因子発現誘導活性とプロテインキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
  3. ストレス応答性転写因子がDREB/CBFである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ストレスが、乾燥ストレス、浸透圧ストレス、及び低温ストレスからなる群から選択さ
    れる少なくとも1つ以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 植物が、イネ科、ユリ科、ショウガ科、アブラナ科、ナス科、マメ科、ウリ科、セリ科
    、キク科、アオイ科、アカザ科、フトモモ科、及びヤナギ科からなる群から選択されるい
    ずれかの科に属するものである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
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