CN111732645B

CN111732645B - 盐角草SeEXPB蛋白及其编码基因及应用

Info

Publication number: CN111732645B
Application number: CN202010645167.9A
Authority: CN
Inventors: 李银心; 娄腾雪; 吕素莲
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2040-07-07
Also published as: CN111732645A

Abstract

本发明公开了盐角草SeEXPB蛋白及其编码基因及应用。本发明提供的蛋白，命名为SeEXPB蛋白，为如下(1)或(2)：(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。本发明首次从盐角草中克隆到了编码蛋白的基因(命名为SeEXPB)，并对其在植物提高植物抗盐性和耐镉能力方面的功能进行了研究，为抗盐和耐镉作物遗传改良提供了理论基础和基因资源。

Description

盐角草SeEXPB蛋白及其编码基因及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种盐角草SeEXPB蛋白及其编码基因及应用。

背景技术

盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤中高浓度Na⁺对许多植物的生长和发育造成很大的伤害。盐胁迫对植物的伤害主要有两方面的因素引起的，一是离子胁迫，二是渗透胁迫。由于离子胁迫的毒害作用，大量的Na⁺进入到植物内，不但打破了植物体内的离子平衡，而且植物细胞内过量的Na⁺可以影响植物细胞的生化代谢(Maathuis andAmtmann,1999)。盐分也使土壤内渗透压升高，使得正常植物细胞壁与细胞膜通透性发生改变，造成植物体内水分大量丢失，最终严重抑制了植物的生长发育和物质的积累。随着植物遗传学和分子生物学的发展，人们对植物对盐胁迫反应的分子机制有了较为深入的认识。目前，许多植物耐盐相关基因已相继被克隆，而且这些基因与植物耐盐性状的关系也得到初步确认。

镉是危害植物和动物的最严重、毒性最大的重金属污染物之一，镉毒害对植物的生长发育有严重的抑制作用。过量的镉能够通过降低光合速率、引发氧化胁迫、干扰营养代谢等生理过程来抑制植物生长，甚至导致植物死亡。植物为缓解镉离子的毒害，形成一系列应对机制，主要包括细胞壁对镉的结合、螯合物对镉的解毒、液泡对镉的区隔化等策略。细胞壁不仅对重金属离子有固定作用，也是响应重金属胁迫的信号分子及相关代谢活动的位点，在植物应对重金属胁迫过程中发挥重要作用(Chen et al.,2013；DalCorso et al.,2010)。

细胞壁是植物细胞的第一道屏障，在植物抗逆中发挥重要作用。细胞壁的松弛和重排依赖于一些和细胞壁重塑相关的酶，如扩展蛋白、木葡聚糖内转糖苷酶和β-1,4-葡聚糖酶等(Cosgrove，2005)。其中，扩展蛋白是一种调节细胞壁松弛和细胞延伸生长的细胞壁蛋白，普遍存在于植物所有的细胞、组织和器官中。它是由多基因家族编码，主要包括α-expansin(EXPA)、β-expansin(EXPB)、expansin-like A(EXLA)和expansin-like B(EXLB)四个亚家族。扩展蛋白分子一般有250-275个氨基酸，由两个结构域(DPBB domain和Pollenallergen domain)及一段位于N端长度为20-30个氨基酸残基的信号肽组成(Sampedro andCosgrove.,2005)。Cosgrove(2000)提出了一种关于扩展蛋白作用模式的假说，认为扩展蛋白弱化细胞壁多聚糖间的非共价键，导致一些聚合体滑动，从而引起细胞壁松弛和伸展。

盐角草(Salicornia europaea)是属于藜科的一种肉质化真盐生植物，广泛分布在沿海和内陆盐湖附近，能够积累高到干重50％的NaCl，被认为是世界上最耐盐的一种高等植物(Davy et al.,2001；Ushakova et al.,2005)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白。

本发明提供的蛋白，命名为SeEXPB蛋白，为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述蛋白的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子是如下1)-5)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

3)编码区为序列表中序列3第17-843所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

序列3第27-836位为SeEXPB基因序列(序列1)，序列3第17-843为含有同源臂和SeEXPB基因的片段。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也是本发明保护的范围。

在本发明的实施例中，含有上述核酸分子的重组载体为pGWB502Ω-35S::SeEXPB融合载体，其为将序列3第17-843所示的DNA片段替换pGWB502Ω载体的attR1和attR2位点间的片段得到的，由CaMV35S启动子驱动SeEXPB基因表达。

具体构建方法如下：

以pEASY-SeEXPB质粒作为模板，Not I-SeEXPB-Entry-F和Asc I-SeEXPB-Entry-R为引物，进行PCR扩增，得到810bp PCR产物。再将PCR产物与入门载体pENTR^TM/D-TOPO连接，构建pENTR^TM/D-TOPO-SeEXPB中间载体。再采用Gateway^TMLR Clonase^TM II Enzyme Mix将pENTR^TM/D-TOPO-SeEXPB中间载体质粒与pGWB502Ω目的载体通过同源重组技术相连接，构建了pGWB502Ω-35S::SeEXPB融合表达载体。

上述蛋白、上述核酸分子或上述的重组载体、表达盒或重组菌在调控植物耐逆性中的应用也是本发明保护的范围。

上述蛋白、上述核酸分子或上述的重组载体、表达盒或重组菌在培育高耐逆性植物中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述耐逆性为耐盐性或耐重金属性；

或，所述为耐盐性或耐重金属性，所述耐重金属性为对镉的耐受性。

本发明另一个目的是提供一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为如下1)或2)：

1)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中上述蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；

2)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码上述蛋白的核酸分子的表达，得到转基因植物；

所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。

上述方法中，所述提高目的植物中上述蛋白的含量和/或活性，或，提高目的植物中编码上述蛋白的核酸分子的表达，均通过上述核酸分子导入目的植物实现。

上述方法中，所述耐逆性为耐盐性或耐重金属性；

本发明首次从盐角草中克隆到了编码蛋白的基因(命名为SeEXPB)，并对其在植物提高植物抗盐性和耐镉能力方面的功能进行了研究，为抗盐和耐镉作物遗传改良提供了理论基础和基因资源。

附图说明

图1为NaCl胁迫下，SeEXPB在盐角草根和地上部分中的转录本相对表达量。

图2为CdCl₂胁迫下，SeEXPB在盐角草地上部分中的转录本相对表达量。

图3为SeEXPB蛋白的亚细胞定位研究；(A)pCAMBIA1300-35S::GFP空载体未质壁分离时的亚细胞定位；(B)SeEXPB蛋白在发生质壁分离时的亚细胞定位；(C)为(B)的局部放大图；白色方框为发生质壁分离放大的区域；标尺均为50μm。

图4为SeEXPB在各拟南芥转基因株系中的转录本相对表达情况；WT为野生型；OE-1,-2,-3,-4,-5,-6为过表达SeEXPB的六个转基因株系。

图5为拟南芥野生型和转基因株系对NaCl的耐受能力；(A)0和125mM NaCl处理下拟南芥野生型和转基因株系的表型；WT，野生型；OE-2、OE-4和OE-5，过表达SeEXPB的转基因株系；(B)植株鲜重；(C)主根长；(D)侧根数；(E)叶绿素含量。标尺为1.5cm。数据为平均值±SE(n＝10)，*和**表示在同一处理条件下，与野生型相比，该值分别在P<0.05和P<0.01水平上达到显著差异。

图6为拟南芥野生型和转基因株系对CdCl₂的耐受能力；(A)0和60μM CdCl₂处理下拟南芥野生型和转基因株系的表型；WT，野生型；OE-2、OE-4和OE-5，过表达SeEXPB的转基因株系；(B)植株鲜重；(C)主根长；(D)侧根数；(E)叶绿素含量。标尺为1.5cm。数据为平均值±SE(n＝10)，*和**表示在同一处理条件下，与野生型相比，该值分别在P<0.05和P<0.01水平上达到显著差异。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、SeEXPB基因的克隆

一、SeEXPB基因全长CDS克隆及生物信息学分析

利用Trizol试剂(Takala公司，9109)小量提取盐角草(盐角草种子购自江苏省大丰市晶隆海洋产业发展有限公司)地上部分总RNA，并利用全式金公司的反转录酶获得第一链cDNA。

分别设计正向引物F(5'-ATGGCCTCCCATCCTCATTT-3')，和反向引物R(5'-TTAATTATTAAAATTGACATGAGAACGG-3')。

以盐角草cDNA为模板，用的全式金公司的HiFi DNA polymerse来扩增目的基因全长cDNA。具体反应条件如下：95℃，5min；35cycles：95℃，30sec，55℃，30sec，72℃，1min30sec；72℃，10min。将得到的全长cDNA连入

-T₁ Simple Cloning Vector载体(全式金公司，CT111-01)，得到pEASY-目的片段载体，进行测序确认。

测序结果表明，扩增目的基因的CDS序列全长为810bp，其核苷酸序列为序列1，编码了269个氨基酸，将该基因命名为SeEXPB，将编码的氨基酸组成的蛋白命名为SeEXPB蛋白，该蛋白的氨基酸序列为序列2。pEASY-目的片段载体命名为pEASY-SeEXPB。

二、盐和镉条件下基因表达分析

盐处理：将盐角草种子播种于7cm×7cm的花盆中(营养土:蛭石，1:1)，萌发后用1/2Hoagland营养液浇灌，每周一次。4周后采用含有0、200或800mM NaCl的1/2Hoagland营养液浇灌，分别在处理0、3h、12h、24h、3d、7d时，取地上部分和根，用于基因表达检测。

镉处理：由于盐角草的最适生长需要200-400mM NaCl，所以镉处理实验是在含有200mM NaCl的1/2Hoagland营养液的基础上展开的。种子萌发后用含有200mM NaCl的1/2Hoagland营养液浇灌，每周一次。4周后采用未添加和添加5mM CdCl₂的营养液进行浇灌。分别在处理0、3d、30d时，取地上部分，用于基因表达检测。

使用Trizol试剂提取总RNA，反转录后，利用THUNDERBIRD

qPCR mix(Toyobo,QPS-201)进行荧光定量qRT-PCR检测。以盐角草α-tubulin基因作为内参，通过2^-ΔΔCt的方法对基因表达进行相对定量。

荧光定量qRT-PCR中所用引物序列如下：

盐角草内标α-tubulin引物：

α-tubulin-qPCR-F：5'-CAGTGCCTTTGAGCCATCTTC-3'

α-tubulin-qPCR-R：5'-CTGAATGGTTCGCTTGGTCTT-3'

盐角草SeEXPB基因引物：

SeEXPB-qPCR-F：5'-TCTGATTCCGCTTGGTCTCC-3'

SeEXPB-qPCR-R：5'-TGAGCAGAAGCACAACTTGGAC-3'

荧光定量qRT-PCR检测结果如图1所示，在根部，SeEXPB的表达在NaCl处理下下调。在地上部分中，SeEXPB的表达在NaCl处理下显著提高。200mM NaCl处理下时，3h、3d和7d的表达量显著上调。800mM NaCl处理下时，3h和7d的表达量显著上调。这说明SeEXPB基因在地上部中受盐诱导表达。

利用qRT-PCR方法检测SeEXPB基因在镉处理下的表达模式，结果如图2所示，在地上部分中，SeEXPB的表达在CdCl₂处理3d时，显著上调；随着处理天数增加，表达量降低。这说明SeEXPB基因在特定时间内受镉诱导表达。

三、SeEXPB蛋白亚细胞定位

1、蛋白亚细胞定位载体构建

选用载体为pCAMBIA1300-35S::GFP(记载在文献“Juanjuan Feng,PengxiangFan,Ping Jiang,Sulian Lv,Xianyang Chen,Yinxin Li.(2014)Chloroplast-targetedHsp90 plays essential roles in plastid development and embryogenesis inArabidopsis possibly linking with VIPP1.Physiologia Plantarum,150(2):292-307”中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用)，设计引物Sal I-SeEXPB-1300-F/BglⅡ-SeEXPB-1300-R。

以上述一制备的pEASY-SeEXPB质粒作为模板，Sal I-SeEXPB-1300-F和Bgl Ⅱ-SeEXPB-1300-R作为引物，使用HiFi DNA polymerse进行PCR扩增，得到PCR产物。

将回收的PCR产物插入经过Sal I和BglⅡ酶切的pCAMBIA1300-35S::GFP载体中，得到pCAMBIA1300-35S::SeEXPB-GFP融合载体。

通过双酶切反应对融合载体进行验证。

上述盐角草SeEXPB基因引物：

Sal I-SeEXPB-1300-F：

5'-GCGTCGACATGGCCTCCCATCCTCATTT-3'

BglⅡ-SeEXPB-1300-R：

5'-GAAGATCTATTATTAAAATTGACATGAGAACGGTAT-3'

2、蛋白亚细胞定位

将pCAMBIA1300-35S::SeEXPB-GFP载体转入C58农杆菌(北京华越洋生物公司，huayueyang1728s)中，得到重组农杆菌C58/pCAMBIA1300-35S::SeEXPB-GFP。

将pCAMBIA1300-35S::GFP载体转入C58农杆菌(北京华越洋生物公司，huayueyang1728s)中，得到对照农杆菌C58/pCAMBIA1300-35S::GFP。

重组农杆菌和对照农杆菌在含有20μM AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)，10mMMES，100μM Kan(Kanamycin，卡那霉素)和100μM Rif(Rifampicin，利福平)的LB液体培养基中振荡过夜培养(28℃，180rpm)至OD₆₀₀≈2.0。离心收集菌体后，用含有200μM AS，10mMMgCl₂，10mM MES的溶液重悬至OD₆₀₀＝1.8-2.0，静置5-6h。用注射器将菌液注射到本生烟草(记载在文献“Xianyang Chen,Hexigeduleng Bao,Jie Guo,Weitao Jia,Fang Tai,Lingling Nie,Ping Jiang,Juanjuan Feng,Sulian Lv,Yinxin Li.(2014)Na⁺/H⁺exchanger 1participates in tobacco disease defence against Phytophthoraparasitica var.nicotianae by affecting vacuolar pH and priming theantioxidative system.Journal of Experimental Botany,65:6107-6122”.材料在文献中的名称为Nicotiana benthamiana)叶片中，烟草正常培养2d后，用激光扫描共聚焦显微镜观察蛋白亚细胞定位。

结果如图3所示，35S::SeEXPB-GFP为重组农杆菌C58/pCAMBIA1300-35S::SeEXPB-GFP注射到烟草，35S::GFP为对照农杆菌C58/pCAMBIA1300-35S::GFP注射到烟草，通过烟草瞬时表达体系研究蛋白亚细胞定位，发生质壁分离后，在质膜和细胞壁上均可以看到GFP荧光，表明SeEXPB蛋白均定位于质膜和细胞壁上。这说明SeEXPB蛋白可以跨膜运输到细胞壁上。

实施例2、SeEXPB在植物抗逆性中的研究

一、基因过表达载体构建

选用pENTR^TM/D-TOPO(Invitrogen,K240020)为入门载体，设计引物Not I-SeEXPB-Entry-F/Asc I-SeEXPB-Entry-R。

盐角草SeEXPB基因引物：

Not I-SeEXPB-Entry-F：

5'-ATAAGAATGCGGCCGCCCCCTTCACCATGGCCTCCCATCCTCATTT-3'

Asc I-SeEXPB-Entry-R：

5'-AGGCGCGCCCACCCTTTTAATTATTAAAATTGACATGAGAACGG-3'

以pEASY-SeEXPB质粒作为模板，Not I-SeEXPB-Entry-F和Asc I-SeEXPB-Entry-R为引物，使用HiFi DNA polymerase进行PCR扩增，得到852bp PCR产物(序列3，其中序列3第27-836位为SeEXPB基因序列，序列3第17-843为含有同源臂和SeEXPB基因的片段)。

将回收的PCR产物与入门载体pENTR^TM/D-TOPO通过T₄连接酶(全式金公司，FL101-01)连接，构建pENTR^TM/D-TOPO-SeEXPB中间载体，进行测序确认。

然后采用Gateway^TM LR Clonase^TM II Enzyme Mix(Invitrogen,11791-020)将pENTR^TM/D-TOPO-SeEXPB中间载体质粒与pGWB502Ω目的载体(Addgene,74844)通过同源重组技术相连接，构建了pGWB502Ω-35S::SeEXPB融合表达载体。

通过SnapGene Viewer软件选择三对酶切位点，对该融合表达载体进行酶切验证。采用HindⅢ酶切，得到1006bp产物，采用BamH I得到272bp产物，采用Xba I和Bsa I得到200bp产物。三对酶切结果均验证了基因片段正确插入载体。

pGWB502Ω-35S::SeEXPB融合载体为将序列3第17-843所示的DNA片段替换pGWB502Ω载体的attR1和attR2位点间的片段得到的，由CaMV35S启动子驱动SeEXPB基因表达。

二、转基因拟南芥的获得及筛选

1、转基因拟南芥的获得

用构建的植物表达载体pGWB502Ω-35S::SeEXPB转化农杆菌C58菌株，得到重组菌C58/pGWB502Ω-35S::SeEXPB。

将重组菌C58/pGWB502Ω-35S::SeEXPB转入野生型拟南芥(Columbia-0，WT，该材料记载在文献“Sulian Lv*,Ping Jiang*,Lingling Nie,Xianyang Chen,Fang Tai,Duoliya Wang,Pengxiang Fan,Juanjuan Feng,Hexigeduleng Bao,Jinhui Wang,YinxinLi.(2015)H⁺-pyrophosphatase from Salicornia europaea confers tolerance tosimultaneously occurring salt stress and nitrogen deficiency in Arabidopsisand wheat.Plant Cell&Environment,38(11):2433-2449.”)中，获得T₀代转SeEXPB拟南芥。

上述转入方法参照Zhang等人(2006)的方法(参考文献“Zhang XR,Henriques R,Lin SS,et al.(2006)Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana using the floral dip method.Nature Protocols,1:641-646.”)，利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥。

2、转基因拟南芥纯合系的筛选

将T₀代转SeEXPB拟南芥种子经表面灭菌后均匀地撒播于含25mg/L潮霉素(Hygromycin，Hyg)的1/2MS固体培养基上，首先暗处于4℃下放置2天，然后置于22℃光照下培养7天。挑选阳性苗转入培养土中生长至种子成熟。分单株收取T₁代种子。

参照T₀代种子，对T₁代种子进行表面消毒和播种。种子萌发7d后对后代分离比进行统计，选择分离比为3:1的株系，将阳性苗转移至营养土中生长，直至种子成熟，分单株收取T₂代种子。

参照T₀代种子，对T₂代种子进行表面消毒和播种。种子萌发7d后，选择后代不分离的株系(即为纯合系)，对阳性苗进行转移和培养，直至收取T₃代种子。

3、转基因拟南芥纯合株系SeEXPB基因表达量测定

对野生型拟南芥和T₃代转SeEXPB拟南芥的种子表面灭菌后，播种于1/2MS培养基上，在4℃下暗培养2天，于22℃光照下培养两周后，各取10株(约100ng)，提取总RNA经DNase消化，反转录得到的cDNA作为模板，利用THUNDERBIRD

qPCR mix进行荧光定量RT-PCR检测。

以拟南芥AtActin8基因作为内参，通过2^-ΔΔCt的方法对基因表达进行相对定量。

荧光定量RT-PCR中所用引物序列如下：

拟南芥内标AtActin8基因引物：

AtActin8-qPCR-F：5'-ATATGCCTATCTACGAGGGTT-3'

AtActin8-qPCR-R：5'-ATACAATTTCCCGTTCTGCTGT-3'

盐角草SeEXPB基因特异引物：

SeEXPB-CHqPCR-F：5'-AATGCTTCAAAATTTTATTATGGTTCT-3'

SeEXPB-CHqPCR-R：5'-TTCTCAGTGCATTTCACCTCATAA-3'

结果如图4所示，T₃代转SeEXPB拟南芥纯合株系(OE1-OE6)中SeEXPB的转录本水平均比野生型拟南芥显著提高，这说明SeEXPB已经转入拟南芥，并能稳定表达，将这些T₃代转SeEXPB拟南芥纯合株系命名为T₃代转SeEXPB拟南芥纯系。

二、转基因拟南芥的抗盐性检测

用70％乙醇和1％次氯酸钠(购自北京化工厂)对野生型拟南芥、T₃代转SeEXPB拟南芥纯系OE-2、OE-4和OE-5种子进行表面消毒，灭菌水清洗3-5次后播种到1/2MS培养基上。在4℃条件下暗处理2d后，转至人工气候室(温度22-23℃，相对湿度60-70％，光照条件16h光照/8h黑暗)培养。种子萌发5d后，挑取生长一致的小苗分别转到1/2MS培养基和含有125mM NaCl的1/2MS培养基(将NaCl添加到1/2MS培养基中，且使其浓度为125mM)上，然后在光照下(光照条件16h光照/8h黑暗)进行竖直盐胁迫培养。盐胁迫培养10天后，测定植株鲜重、主根长、侧根数及叶绿素含量。

叶绿素含量测定方法：将植株称鲜重后，浸泡于95％的乙醇中，3天后，分别测定浸提液在波长665、649和470nm处的吸光度，并进一步计算叶绿素含量(参考文献：“Lichtenthaler HK.(1987)Chlorophylls and carotenoids:Pigments ofphotosynthetic biomembranes.Method in Enzymology,148:350-382.”)。

表型结果如图5A所示，在正常生长条件下，T₃代转SeEXPB拟南芥纯系和野生型没有明显差别，在125mM NaCl胁迫处理10天时，T₃代转SeEXPB拟南芥纯系和野生型的生长均受到抑制，但是T₃代转SeEXPB拟南芥纯系受到的抑制作用小于野生型。

统计植株鲜重、主根长、侧根数及叶绿素含量这些生理指标，结果如图5B-5E所示，盐处理10天时，T₃代转SeEXPB拟南芥纯系OE-2、OE-4和OE-5的主根长、侧根数和叶绿素含量几乎都显著高于野生型。

上述结果说明SeEXPB的过表达提高了拟南芥苗期的抗盐性。

三、转基因拟南芥的耐镉性检测

将萌发后的野生型拟南芥、T₃代转SeEXPB拟南芥纯系OE-2、OE-4和OE-5在1/2MS培养基上生长5d后，挑取生长一致的小苗分别转到1/2MS和含有60μM CdCl₂的1/2MS培养基(将CdCl₂添加到1/2MS培养基中，且使其浓度为60μM)上进行竖直镉胁迫培养。镉胁迫培养10天后，测定植株鲜重、主根长、侧根数及叶绿素含量。

表型结果如图6A所示，在正常生长条件下，T₃代转SeEXPB拟南芥纯系和野生型没有明显差别，在镉处理10天时，T₃代转SeEXPB拟南芥纯系和野生型的生长均受到抑制，但是T₃代转SeEXPB拟南芥纯系受到的抑制作用小于野生型。

统计植株鲜重、主根长、侧根数及叶绿素含量这些生理指标，结果图6B-6E所示，镉处理10天时，T₃代转SeEXPB拟南芥纯系的鲜重略高于野生型，主根长显著增长，侧根数目显著增多，而叶绿素含量无显著差异。

上述结果说明SeEXPB的过表达提高了拟南芥苗期的耐镉性。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院植物研究所

<120> 盐角草SeEXPB蛋白及其编码基因及应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 810

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atggcctccc atcctcattt ttacaactct tgtttaatat ttgctctcat tgtttctctt 60

cttcttagtg attcagaatg tttgaatccg aagcttttaa atgcttcaaa attttattat 120

ggttctgatt ccgcttggtc tcctgccggt gctacttggt atggcagccc tacaggcgcc 180

ggaagcgacg gtggagcatg tggatataca aatacagtgg aaaagccgcc atattcttca 240

atggtatcag cagctggatc ctcaatctat gagtttggtg atggatgtgg agtttgttat 300

gaggtgaaat gcactgagaa tgaagcatgt tcaggaaatg taataactgt tacaataact 360

gatcaatgtc caagttgtgc ttctgctcat tttgacttaa gtggaacagc ttttggagct 420

atggctaagc ctggtcttgc tggtcagctc caaaatgctg gagttcttaa cgttcaatac 480

aaaagagtaa aatgcaagta tccaggagca acagtagagg tacgagtgga tccgggttca 540

aatccatcgt attttgcatc aacagttgag tacgtagatg gagaaggatt agaaagcgtg 600

aaattgaaac aacaatcggg tgaatggatt acaatggaac aatcatgggg cgcagtttgg 660

gagctaaatc ctggacatgt tctacaacca cctttctctt tacaattagt tgaagctaaa 720

tctggaaata cattaacttt gaataatgtc atcccaagta attggaaccc tggtcaaaca 780

taccgttctc atgtcaattt taataattaa 810

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Ala Ser His Pro His Phe Tyr Asn Ser Cys Leu Ile Phe Ala Leu

1 5 10 15

Ile Val Ser Leu Leu Leu Ser Asp Ser Glu Cys Leu Asn Pro Lys Leu

20 25 30

Leu Asn Ala Ser Lys Phe Tyr Tyr Gly Ser Asp Ser Ala Trp Ser Pro

35 40 45

Ala Gly Ala Thr Trp Tyr Gly Ser Pro Thr Gly Ala Gly Ser Asp Gly

50 55 60

Gly Ala Cys Gly Tyr Thr Asn Thr Val Glu Lys Pro Pro Tyr Ser Ser

65 70 75 80

Met Val Ser Ala Ala Gly Ser Ser Ile Tyr Glu Phe Gly Asp Gly Cys

85 90 95

Gly Val Cys Tyr Glu Val Lys Cys Thr Glu Asn Glu Ala Cys Ser Gly

100 105 110

Asn Val Ile Thr Val Thr Ile Thr Asp Gln Cys Pro Ser Cys Ala Ser

115 120 125

Ala His Phe Asp Leu Ser Gly Thr Ala Phe Gly Ala Met Ala Lys Pro

130 135 140

Gly Leu Ala Gly Gln Leu Gln Asn Ala Gly Val Leu Asn Val Gln Tyr

145 150 155 160

Lys Arg Val Lys Cys Lys Tyr Pro Gly Ala Thr Val Glu Val Arg Val

165 170 175

Asp Pro Gly Ser Asn Pro Ser Tyr Phe Ala Ser Thr Val Glu Tyr Val

180 185 190

Asp Gly Glu Gly Leu Glu Ser Val Lys Leu Lys Gln Gln Ser Gly Glu

195 200 205

Trp Ile Thr Met Glu Gln Ser Trp Gly Ala Val Trp Glu Leu Asn Pro

210 215 220

Gly His Val Leu Gln Pro Pro Phe Ser Leu Gln Leu Val Glu Ala Lys

225 230 235 240

Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Asn Asn Val Ile Pro Ser Asn Trp Asn

245 250 255

Pro Gly Gln Thr Tyr Arg Ser His Val Asn Phe Asn Asn

260 265

<210> 3

<211> 852

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ataagaatgc ggccgccccc ttcaccatgg cctcccatcc tcatttttac aactcttgtt 60

taatatttgc tctcattgtt tctcttcttc ttagtgattc agaatgtttg aatccgaagc 120

ttttaaatgc ttcaaaattt tattatggtt ctgattccgc ttggtctcct gccggtgcta 180

cttggtatgg cagccctaca ggcgccggaa gcgacggtgg agcatgtgga tatacaaata 240

cagtggaaaa gccgccatat tcttcaatgg tatcagcagc tggatcctca atctatgagt 300

ttggtgatgg atgtggagtt tgttatgagg tgaaatgcac tgagaatgaa gcatgttcag 360

gaaatgtaat aactgttaca ataactgatc aatgtccaag ttgtgcttct gctcattttg 420

acttaagtgg aacagctttt ggagctatgg ctaagcctgg tcttgctggt cagctccaaa 480

atgctggagt tcttaacgtt caatacaaaa gagtaaaatg caagtatcca ggagcaacag 540

tagaggtacg agtggatccg ggttcaaatc catcgtattt tgcatcaaca gttgagtacg 600

tagatggaga aggattagaa agcgtgaaat tgaaacaaca atcgggtgaa tggattacaa 660

tggaacaatc atggggcgca gtttgggagc taaatcctgg acatgttcta caaccacctt 720

tctctttaca attagttgaa gctaaatctg gaaatacatt aactttgaat aatgtcatcc 780

caagtaattg gaaccctggt caaacatacc gttctcatgt caattttaat aattaaaagg 840

gtgggcgcgc ct 852

Claims

1.一种蛋白，为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的核酸分子，是如下1）-3）中任一种的DNA分子：

1）编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2）编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

3）编码区为序列表中序列3第17-843所示的DNA分子。

3.含有权利要求2所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。

4.权利要求1所述蛋白、权利要求2所述核酸分子或权利要求3所述的重组载体、表达盒或重组菌在提高拟南芥耐逆性中的应用；

所述耐逆性为耐盐性或耐镉性。