CN109503703A - 抗旱耐盐基因IpNY-B1及其编码蛋白和应用 - Google Patents

抗旱耐盐基因IpNY-B1及其编码蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗旱耐盐基因IpNY‑B1及其编码蛋白和应用，发明人从一种沙砾海滩重要野生植物‑厚藤中克隆得到IpNY‑B1基因，将该基因导入宿主植物细胞、组织或植株个体中，能提高植物抗旱和耐盐性；导入酿酒酵母中，能提高工程菌株对高盐和氧化胁迫耐受性。该基因在提高植物和工程菌株抗逆性领域具有显著的应用前景。

Description

抗旱耐盐基因IpNY-B1及其编码蛋白和应用
技术领域
本发明属于植物基因工程和分子生物学技术领域，涉及一种抗旱耐盐基因IpNY-B1及其编码蛋白和应用。
背景技术
非生物逆境胁迫(如干旱、盐、重金属和极端温度)等不利因素使许多植物生存受到严重危害，全球每年因此造成的农作物损失高达数千亿元。此外，人口增长、耕地面积减少、农业减产等问题的出现，迫切需要提高作物的产量。了解植物抗逆性形成机制，挖掘重要抗逆基因资源，培育具有抗逆性的农作物新品种，具有重要应用价值和战略意义。我国是土壤盐碱化最严重的国家之一，研究并提高植物抗逆能力对改良与利用盐荒地、改善生态环境以及促进农业可持续发展具有重要的现实意义。因此，通过基因工程手段克隆、鉴定得到具有自主知识产权的抗旱、耐盐功能基因，将其转入植物体内提高植物抗旱、耐盐的能力具有重要的研究和应用价值，并符合我国战略需要。
NY-B是一类重要的调控因子，可以调控基因的表达。其确切的生化功能和作用机制仍不完全清楚。近年来，有研究发现其在开花时间调控、胚胎发育、光合作用和非生物逆境胁迫响应等方面起着重要作用。目前，厚藤的NY-B编码蛋白及其基因的作用还有待开发。
发明内容
发明人从一种沙砾海滩重要野生植物-厚藤中克隆得到IpNY-B1基因，该基因导入宿主植物细胞、组织或植株个体中，能提高植物抗旱和耐盐性；导入酿酒酵母中，能提高工程菌株对高盐和氧化胁迫耐受性。该基因在提高植物和工程菌株抗逆性领域具有显著的应用前景。
其技术方案如下：
本发明的目的之一是提供一种抗旱和耐盐性蛋白IpNY-B1，其氨基酸序列为SEQID NO.4。
本发明的另一个目的是提供编码所述IpNY-B1蛋白的核苷酸序列，优选地，该序列具有SEQ ID NO.所示的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种重组表达载体，该载体含有上述核苷酸序列，并且所述核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。
在其中一个实施例中，所述重组载体为转基因过表达载体pCAMBIA1300(m)-IpNY-B1，通过农杆菌介导法将重组表达载体导入宿主植物细胞、组织或植株个体，并使所述核苷酸序列表达，从而提高植物抗旱和耐盐性。在其中一个实施例中，所述宿主植物是水稻、大豆、玉米、小麦或拟南芥。
在其中一个实施例中，所述载体为酿酒酵母重组表达载体pYES2-IpNY-B1，将重组表达载体导入工程菌株，并使所述核苷酸序列表达，从而提高工程菌株酿酒酵母对高盐和氧化胁迫耐受性。
本发明的另一个目的是提供一种重组菌，所述重组菌含有IpNY-B1基因核苷酸序列或者重组表达载体pYES2-IpNY-B1。
本发明的另一个目的是提供本发明所述IpNY-B1蛋白、IpNY-B1基因核苷酸序列、重组表达载体pYES2-IpNY-B1在提高工程菌株酿酒酵母对高盐和氧化胁迫耐受性的用途。
本发明的有益效果：
本发明提供的厚藤抗旱、耐盐基因名称为IpNY-B1，所述基因编码的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。本发明首次克隆得到了厚藤基因IpNY-B1，并通过酵母互补实验比较分析证明，该基因具有抗旱、耐盐功能。该基因的发掘与利用为抗旱、耐盐农作物的培育研究提供了基因资源，将在植物基因工程改良植物的抗逆性研究中发挥重要作用。
附图说明
图1.IpNY-B1基因扩增结果。M为DNAMarker；
图2.酿酒酵母重组表达载体pYES2-IpNY-B1示意图；
图3.转化pYES2-IpNY-B1的转基因酵母对盐敏感的突变株AXT3对盐胁迫的耐受性提高；
图4.转化pYES2-IpNY-B1的转基因野生型酵母W303对盐胁迫的耐受性提高；
图5.转化pYES2-IpNY-B1的转基因酵母对H2O2敏感的突变株skn7Δ(B)对氧化胁迫的耐受性提高；
图6.转化pYES2-IpNY-B1的转基因酵母对H2O2敏感的突变株yap1Δ(A)对氧化胁迫的耐受性提高；
图7.植物转基因过表达载体pCAMBIA1300(m)-IpNY-B1示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例进行详细说明。
实验例1：厚藤IpNY-B1基因克隆及pYES2-IpNY-B1载体构建。
具体包括以下步骤：总RNA提取、cDNA文库构建和基因克隆三个步骤。各步骤主要概述如下：
(1)总RNA提取
取大约2g的厚藤幼根、叶片、藤及叶芽混合样品，加入液氮充分研磨，采用MAGENRNA提取试剂盒，参考说明书操作提取RNA。将获得的RNA用50μlRNase-free水溶解。用Nanodrop微量分光光度计测定RNA的质量和浓度。
(2)cDNA初级文库的构建
采用PromegaM-MLV Reverse Transcriptase逆转录试剂盒，合成cDNA第一链，取约2μgRNA，加入0.5μg Oligo(dT)Primer及RNase-free的H2O至总体积为15μL；70℃孵育5min，冰上冷却后加入5μLM-MLV 5X Reaction Buffer和5μL10mM dNTP，25单位的RecombinantRibonuclease Inhibitor,最后加入200单位的M-MLV RT逆转录酶至反应体积为25μL，混匀后置于37℃金属浴上反应60分钟；最后置于42℃20分钟。
(3)厚藤IpNY-B1基因克隆
以厚藤cDNA为模板，设计以下引物扩增IpNY-B1基因的序列，引物序列分别为SEQID NO.1(5’-GGGGAATTCATGGAACCTATGGACATC-3’)和SEQ ID NO.2(5’-GGGGGATCCTTAGCTGTTTGTGTTGTG-3’)所示。通过在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站上进行BLAST等序列分析，结果表明本研究成功克隆出厚藤IpNY-B1基因(图1)，其基因编码核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
(4)IpNY-B1-pYES2载体构建
将上述扩增产物插入酵母表达载体pYES2，得到IpNY-B1-pYES2重组载体。
实验例2：IpNY-B1基因在酵母中过表达提高酵母的耐盐性及氧化胁迫耐受性
(1)pYES2-IpNY-B1转化酵母菌株
将pYES2-IpNY-B1重组质粒浓度调整到1μg/μL，采用乙酸锂转化法分别转化对盐敏感的酵母突变株AXT3和对应的野生型酵母株系(W303)。此外，用同样方法转化对H2O2敏感的酵母突变株skn7Δ和yap1Δ及对应的野生型酵母株系(WT)。同时，采用酵母表达载体空载体pYES2做对照，分别转化上述酵母株系。
(2)在酵母盐敏感突变株AXT3和野生型菌株W303中过表达IpNY-B1提高转基因酵母的抗性
分别挑取转化IpNY-B1基因过表达载体pYES2-IpNY-B1和空载体pYES2酵母菌株AXT3的单克隆，接种到2ml添加了半乳糖的酵母极限液体培养基中，转速200rpm，30℃恒温摇床，培养至菌液OD600＝2。然后按照1:1、1:10、1:100、1:1000分别将菌液进行稀释，分别吸取2μl稀释的菌液滴至添加有50mM，75mM和200mMNaCl的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。如图3所示，在添加50mMNaCl的培养基平板上，过表达IpNY-B1基因的转基因酵母可以正常生长，在添加75mM和200mM NaCl的培养基平板上也可以轻微生长；而没有过表达IpNY-B1基因的酵母则不能生长，以上实验表明IpNY-B1基因在酵母中的过量表达能够提高酵母盐敏感突变株AXT3对盐胁迫的耐受性。
此外，分别挑取转化IpNY-B1基因过表达载体pYES2-IpNY-B1和空载体pYES2酵母菌株W303的单克隆，按照上述同样方法进行液体培养，转速200rpm，30℃恒温摇床，培养至菌液OD600＝2，并按1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释后滴至添加了质量体积比为8.8％NaCl的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。如图4所示，与转化空载体pYES2的W303酵母突变株相比，过表达IpNY-B1基因的转基因酵母能够在添加8.8％NaCl的培养基平板上生长；而没有过表达IpNY-B1的酵母空载体pYES2则不能生长，以上实验表明IpNY-B1基因在酵母中的过表达能够提高野生型酵母株系W303对盐胁迫的耐受性。
(3)在酵母H2O2敏感突变株skn7Δ和yap1Δ中过表达IpNY-B1基因能提高转基因酵母对氧化胁迫的耐受性
按照上述同样方法，分别挑取酵母对H2O2敏感突变株skn7Δ和yap1Δ转化空载体pYES2和pYES2-IpNY-B1的单克隆，以及对照野生型酵母WT转化空载体pYES2的单克隆，将上述克隆分别接种于2ml添加了半乳糖的酵母极限液体培养基中，转速200rpm，30℃恒温摇床，培养至菌液OD600＝2。按1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释后，取2μl滴至添加有0.25mM和0.5mM的H2O2的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。如图5所示，与转化空载体pYES2的skn7Δ酵母突变株相比，过表达IpNY-B1的转基因酵母skn7Δ也能够在添加0.5mMH2O2的培养基平板上生长；而没有过表达IpNY-B1的酵母skn7Δ几乎不能生长。同样，过表达IpNY-B1的转基因酵母yap1Δ能够在添加0.5mM H2O2的培养基平板上生长，而没有过表达IpNY-B1的酵母yap1Δ则几乎不能生长(图6)。以上结果表明IpNY-B1基因在H2O2敏感酵母突变株skn7Δ和yap1Δ中的表达能够提高酵母对氧化胁迫的耐受性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院华南植物园
<120> 抗旱耐盐基因IpNY-B1及其编码蛋白和应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggaattca tggaacctat ggacatc 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggggatcct tagctgtttg tgttgtg 27
<210> 3
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaaccta tggacatcgt tggtagaacg aaagaggatg cttcgcttcc taaagcaact 60
atgacaaaaa ttattaaaga aatgctgcct ccagatgttc gtgtagcccg ggattgtcag 120
gaccttttga ttgaatgttg tgtagagttt atcaatctga tttcctcaga atctaatgaa 180
gtttgtaata gagaagacaa gcggacaatt gcaccagaac atgtcctcaa ggcgctagag 240
gttcttggat ttggtgacta tattgaagaa gtttatgctg catacgaaca acacaggctt 300
gaaaccatgg atactgtcag ggccgggaag ttgagcaatg gagctgaaat gacggaagaa 360
gaagctttgg ctgcgcagca gaggatgttt gcggaggcga gggcaaggat gaacaacggc 420
attacagtcc ccaaacaact gaatcccgag ccagaacaac acaacacaaa cagctaa 477
<210> 4
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Glu Pro Met Asp Ile Val Gly Arg Thr Lys Glu Asp Ala Ser Leu
1 5 10 15
Pro Lys Ala Thr Met Thr Lys Ile Ile Lys Glu Met Leu Pro Pro Asp
20 25 30
Val Arg Val Ala Arg Asp Cys Gln Asp Leu Leu Ile Glu Cys Cys Val
35 40 45
Glu Phe Ile Asn Leu Ile Ser Ser Glu Ser Asn Glu Val Cys Asn Arg
50 55 60
Glu Asp Lys Arg Thr Ile Ala Pro Glu His Val Leu Lys Ala Leu Glu
65 70 75 80
Val Leu Gly Phe Gly Asp Tyr Ile Glu Glu Val Tyr Ala Ala Tyr Glu
85 90 95
Gln His Arg Leu Glu Thr Met Asp Thr Val Arg Ala Gly Lys Leu Ser
100 105 110
Asn Gly Ala Glu Met Thr Glu Glu Glu Ala Leu Ala Ala Gln Gln Arg
115 120 125
Met Phe Ala Glu Ala Arg Ala Arg Met Asn Asn Gly Ile Thr Val Pro
130 135 140
Lys Gln Leu Asn Pro Glu Pro Glu Gln His Asn Thr Asn Ser
145 150 155

Claims (10)

1.一种抗旱和耐盐性蛋白IpNY-B1，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
2.一种核苷酸序列，其特征在于，编码权利要求1所述抗旱和耐盐性蛋白IpNY-B1。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，含有SEQ ID NO.3所示的序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2或3所述核苷酸序列，并且所述核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体为转基因过表达载体pCAMBIA1300(m)-IpNY-B1。
6.一种提高植物抗旱和耐盐性的方法，其特征在于，将权利要求2或3所述核苷酸序列、权利要求4或5所述的重组表达载体导入宿主植物细胞、组织或植株个体，并使所述核苷酸序列表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述宿主植物是水稻、大豆、玉米、小麦或拟南芥。
8.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体为酿酒酵母重组表达载体pYES2-IpNY-B1。
9.一种提高工程菌株酿酒酵母对高盐和氧化胁迫耐受性的方法，其特征在于，将权利要求2或3所述核苷酸序列、权利要求4或8所述的重组表达载体导入工程菌株，并使所述核苷酸序列表达。
10.权利要求1的蛋白、权利要求2或3所述的核苷酸序列、权利要求4或8所述的重组表达载体用于提高工程菌株酿酒酵母对高盐和氧化胁迫耐受性的用途。
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