CN106222171B - 一种利用RNAi技术提高大豆产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用RNAi技术提高大豆产量的方法，本发明发现核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的序列编码的RNA分子能够抑制大豆FT家族基因的表达，该FT家族基因包括SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的至少19个连续核苷酸和/或其互补序列。本发明首次利用RNAi技术获得了大豆FT家族基因的抑制表达株系，所述株系中大豆FT家族基因表达明显降低，大豆花期延迟5‑7天，单株产量增幅达50％以上，达到极显著水平。本发明为大豆高产新品种的培育提供了新的方法及资源，具有重要的理论及经济价值。

Description

一种利用RNAi技术提高大豆产量的方法
技术领域
本发明涉及植物分子生物学与生物技术领域，具体地，涉及一种利用RNAi技术提高大豆产量的方法。
背景技术
随着生物科技的不断发展，近年来转基因技术在农作物生产中已有广泛的应用，人们通过基因工程的方法使农作物具有所需要的目标性状。由于大豆遗传转化效率普遍较低，转基因大豆高产品种的培育一直落后于水稻、小麦及玉米等其它作物，目前仅有较少的相关文献报道。日本国际农业科学研究中心的研究人员通过图位克隆的方法找到一个调控Na+、K+和Cl-转运及积累的Ncl基因，过表达Ncl基因的转基因大豆具有较高的耐盐性；转基因大豆尽管在正常条件下没有产量提高的表型，但是在高盐地区其产量比野生型可提高3.6-5.5倍。中国农业大学植物生理与生物化学国家重点实验室在大豆中表达拟南芥来源的脱落酸醛脱氢氧化酶活性相关基因LOS5/ABA3，获得的转基因大豆在干旱条件下气孔开放大小及蒸腾速率降低，因而抗旱性明显增强，在干旱条件下的产量比野生型约提高21％。
作物的花期及生育期与其产量密切相关，国内外已有多篇文献报道，在水稻、番茄等农作物中，利用转基因手段改变花期相关基因的表达水平可提高其产量。Gao等通过图位克隆揭示DTH7编码一个a pseudo-response regulator蛋白，其表达受到光周期调控。在长日条件下DTH7抑制Ehd1从而来延迟开花。作者进一步发现DTH7与Ghd7和DTH8的不同单倍型组合能够在不同的光周期环境中与水稻抽穗期和谷粒产量成显著的相关性。但目前尚未有报道利用花期相关基因培育高产大豆的研究成果。
FT蛋白或(和)mRNA是成花素的重要组分。在拟南芥中，FT是一个开花途径整合因子，特异在长日条件下起开花促进作用(Kardailsky et al.，1999；Kobayashi et al.，1999)。Hd3a是水稻中FT的同源基因，主要在短日条件下起开花促进作用。不同植物如水稻、番茄、南瓜、矮牵牛、杨树和葡萄的FT同源基因在拟南芥中组成型表达后，都能在非诱导型光周期条件下促进拟南芥开花(Hsu et al.，2006；Lifschitz and Eshed，2006；Carmonaet al.，2007；Hayama et al.，2007；Lin et al.，2007)。本课题组将克隆到的大豆FT同源基因GmFTL1/2/3/4/5/6在拟南芥中过表达，同样也能促进拟南芥开花(Fan et al.,2014)。在木本植物杨树中FT同源基因的组成型表达显著地缩短童期并促进了成花转变(Hsu etal.，2006)。这些研究结果表明不同植物来源的FT序列和功能高度保守，都具有抑制营养生长促进植物开花的功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用RNAi技术提高大豆产量的方法。
本发明的另一目的在于提供一种能够能够提高大豆产量的RNA。
首先，本发明提供一种核苷酸序列，该核苷酸序列转录得到的RNA分子能够抑制植物FT家族6个基因的表达，所述植物FT家族6个基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-SEQID No.6所示。优选地，所述植物为大豆。
进一步地，本发明所述的核苷酸序列由SEQ ID NO.7、间隔序列和SEQ ID NO.7的互补序列组成。
优选地，本发明所述核苷酸序列为含有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
更优选地，本发明所述核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
本发明提供一种生物材料，含有本发明上述的核苷酸序列，所述生物材料为重组载体、重组微生物、细胞系或表达盒。
本发明提供一种RNA序列，其由本发明所述的核苷酸序列转录得到。
进一步地，本发明提供的上述RNA序列能够抑制植物FT基因表达。
优选地，所述植物为大豆。
进一步地，本发明提供了上述核苷酸序列或含有其的生物材料或该核苷酸序列转录得到的RNA序列在抑制植物FT家族6个基因的表达中的应用，所述植物FT家族6个基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-SEQ ID No.6所示。
所述的植物优选为大豆。
本发明提供了上述核苷酸序列或含有其的生物材料或该核苷酸序列转录得到的RNA序列在延迟植物花期，提高植物产量中的应用。
所述的植物优选为大豆。
本发明提供了上述核苷酸序列或含有其的生物材料或该核苷酸序列转录得到的RNA序列在制备转基因植物中的应用。
本发明提供了上述核苷酸序列或含有其的生物材料或该核苷酸序列转录得到的RNA序列在植物种质资源改良中的应用。
所述的植物优选为大豆。
本发明还提供了一种利用RNAi技术提高植物产量的方法，将本发明所述的核苷酸序列引入植物细胞，转录得到的RNA能够抑制植物FT家族6个基因的表达，所述大豆FT家族6个基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-SEQ ID No.6所示。
本发明还提供了一种利用RNAi技术提高大豆产量的方法，将本发明所述的核苷酸序列引入大豆细胞，转录得到的RNA能够抑制大豆FT家族6个基因的表达，所述大豆FT家族6个基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1-SEQ ID No.6所示。
本发明首次利用RNAi技术降低大豆中FT家族6个基因的基因的表达量来培育高产大豆的分子育种方法。转基因大豆花期延迟5-7天，单株产量增幅在50％以上，达到极显著水平。本发明为大豆高产培育提供了新的方法及相关资源，具有重要的理论及经济价值。FT基因在不同植物中的序列和功能都高度保守，过表达FT基因促进植物开花，抑制FT基因的表达而延迟开花。因此，本方法在不同植物中具有普遍的应用价值。
附图说明
图1为本发明的克隆载体pGWCm结构示意图。
图2为本发明的RNAi表达载体pB7GWIWG2(I)结构示意图。
图3为本发明的转基因大豆中FT家族6个基因的表达水平检测。
图4为本发明的转基因大豆单株产量示意图。
图5为本发明的转基因大豆根、茎、叶表型示意图，其中A图为转基因大豆叶面表型图，B图为转基因大豆根表型图，显示根系发达，C图为转基因大豆茎杆表型图，显示茎杆粗壮。
图6为本发明的转基因大豆干旱胁迫下的产量示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 大豆FT家族基因干扰片段iFT的克隆
利用正向引物5’-GGTAATAAAGAAGTGGGCAATGGTT-3’和反向引物5’-CACAAACACGAAACGATGAATCCCC-3’从大豆垦农18(Glycine m ax(L.)Merr.Kennong 18)中克隆并测序获得iFT，其序列如SEQ ID NO.7所示。
PCR反应程序为:95℃5min预变性；95℃30s，55℃35s，72℃1m in，25个循环；72℃10min延伸。
实施例2 构建大豆FT家族基因干扰片段iFT的克隆载体
从实施例1中扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到如图1所示的pGWCm载体(Chen et al.,2006)上。先将pGWCm载体用Ahd I内切酶水解后用凝胶回收试剂盒回收酶切产物以获得T载体。然后PCR产物和T载体于16℃进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩增，筛选阳性克隆并测序，测序正确的即为iFT片段的克隆载体。
实施例3 构建大豆FT家族基因干扰片段iFT的表达载体
分别将从实施例2中得到的大豆FT家族基因干扰片段iFT与如图2所示的植物RNAi表达载体pB7GWIWG2(I)等比例混合后通过LR反应(两种质粒各50ng，LR酶1μl，补H2O至终体积5μl，混匀后25℃反应6小时以上)，将iFT构建在pB7GWIWG2(I)上，编码RNA的DNA序列如SEQ ID NO.8所示(序列组成为Seq No.7+LR反应后的盒子+间隔序列+LR反应后的盒子+SeqNo.7反向互补序列)，利用RNAi技术抑制大豆FT家族基因的表达。通过农杆菌介导的大豆子叶节转化法获得GmFTL-RNAi转基因植株，植物中的筛选标记为Bar。
实施例4 转基因大豆中FT家族基因的表达水平检测
利用实时定量荧光PCR(quantitative real time RT-PCR)测定野生型及上述实施例3中获得的GmFTL-RNAi转基因大豆中FT家族基因的表达水平。实时荧光定量PCR采用ABI StepOne仪器上进行，用SYBR Green I检测荧光信号。反应体系为：
Figure BDA0001072583950000051
反应参数为两步法：95℃10s，热启动；95℃5s，60℃1min，40个循环。用基因芯片数据分析软件Genesis对基因的表达进行标准化并作图。大豆开花基因GmFTL1/2/3/4/5/6，(其DNA序列如SEQ ID NO.1-6所示)的表达水平有不同程度的下调，如图3所示。用于检测大豆开花基因GmFTL1、2、3、4、5、6的上、下游引物序列见SEQ ID NO.9-20。
实施例5 FT-RNAi转基因大豆单株产量测定
选取上述实施例3中获得的5个FT-RNAi转基因株系，每个转基因株系取15株，称取其单株收获的籽粒重量，如图4所示，转基因株系对比野生型产量显著提高达50％以上。此外，FT-RNAi转基因大豆还具有叶面积增大、根系发达及茎杆粗壮等表型，见图5。同时进行了FT-RNAi转基因大豆与野生型大豆抗旱性的分析，研究结果表明GC1大豆比野生型大豆无论在正常处理及干旱条件下都显著增产(图6)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA0001072586030000011
Figure IDA0001072586030000021
Figure IDA0001072586030000031
Figure IDA0001072586030000041
Figure IDA0001072586030000051
Figure IDA0001072586030000061

Claims (3)

1.一种核苷酸片段或含有该核苷酸片段的生物材料或该核苷酸片段转录得到的RNA在提高大豆产量中的应用，所述核苷酸片段的序列如SEQ ID NO.8所示，所述生物材料为重组载体、重组微生物、细胞系或表达盒。
2.一种核苷酸片段或含有该核苷酸片段生物材料或该核苷酸片段转录得到的RNA在制备产量高的转基因大豆中的应用，所述核苷酸片段的序列如SEQ ID NO.8所示，所述生物材料为重组载体、重组微生物、细胞系或表达盒。
3.一种利用RNAi技术提高大豆产量的方法，其特征在于，将序列如SEQ ID NO.8所示的核苷酸片段引入大豆细胞，转录得到的RNA能够抑制大豆FT家族6个基因的表达，所述大豆FT家族6个基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1- SEQ ID No.6所示。
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