CN114085848B - 马铃薯StSUMO1和StSCE1的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了马铃薯StSUMO1和StSCE1协同提高抗旱性的应用，通过共过表达StSUMO1和StSCE1基因予以实现。本发明所述StSCE1和StSUMO1基因共过表达的马铃薯在PEG胁迫下MDA含量降低，脯氨酸、MDA、SOD和TAC含量升高，抗胁迫能力增强；同时共过表达StSCE1和StSUMO1基因的拟南芥在干旱胁迫下的存活率显著升高。本发明是首次提供StSUMO1和StSCE1协同提高抗旱性的应用。
Description
技术领域
本发明属于马铃薯基因工程领域，具体涉及马铃薯StSUMO1和StSCE1协同提高抗旱性的应用。
背景技术
马铃薯是世界继水稻，小麦，玉米后的第四大粮食作物。是我国极为重要的粮菜兼用作物，我国马铃薯种植面积和产量均居世界第一，约占四分之一。马铃薯在保障世界和我国粮食安全中具有十分重要的作用。截止2018年5月全球共有163个国家种植马铃薯（http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC），且种植面积近年来持续增加，许多贫困地区居民的粮食和营养主要来源于马铃薯。马铃薯也是一种理想的食品，含有丰富的淀粉、蛋白质、维生素C、B族维生素、矿物质、β-胡萝卜素、有机酸等营养物质，马铃薯还广泛用作工业原料和燃料生产。
类泛素蛋白修饰分子（Small ubiquitin-like modifier，SUMO）修饰是重要的蛋白质翻译后修饰之一，它在改变蛋白质稳定性、亚细胞定位和蛋白质互作关系中起着重要作用。SUMO化修饰广泛参与植物应对干旱、极端温度、盐和营养素缺乏等非生物胁迫。马铃薯根系浅，容易受到多种非生物胁迫的影响，特别是干旱胁迫。
现有技术存在的问题：1. 现有技术未见马铃薯SUMO成员参与提高抗旱性的报道；2. 现有技术未见马铃薯SUMO通路多成员联合提高抗旱性的报道。
发明内容
本发明要解决的关键技术问题在于通过系统筛选SUMO干旱响应成员，并构建StSUMO1和StSCE1双基因共过表达载体，验证双基因联合调控耐旱性的应用。为解决上述技术问题，本申请采用如下技术方案：
1. 马铃薯StSUMO1和StSCE1基因，包括：StSUMO1的ID为：Soltu.DM.09G017670.1；StSCE1的ID为：Soltu.DM.04G033370.1；所述StSUMO和StSCE1序列登记在马铃薯数据库，网址为：http://spuddb.uga.edu/。StSUMO1的转录本序列如序列表SEQ No.1所示，StSCE1序列的转录本序列如序列表SEQ No.2所示。
2. 一种载体，包含马铃薯StSUMO1和StSCE1基因的植物过表达载体。
3. 马铃薯StSUMO1和StSCE1协同提高抗旱性的应用。所述应用为StSCE1和StSUMO1基因降低马铃薯PEG胁迫下MDA含量，提高马铃薯PEG胁迫下脯氨酸、MDA、SOD和TAC含量。所述应用为StSCE1和StSUMO1基因提高拟南芥干旱胁迫下的存活率。
4. 马铃薯干旱响应SUMO化途径成员的方法，包括：（1）马铃薯SUMO成员筛选；（2）马铃薯SUMO成员表达谱分析；（3）马铃薯SUMO成员表达量qRT-PCR分析。
5. StSCE1互作蛋白筛选方法，包括：（1）构建pGBKT7-StSCE1诱饵载体；（2）pGBKT7-StSCE1文库筛选；（3）pGBKT7-StSCE1和pGADT7-StSUMO1回转验证。
6. 马铃薯StSUMO1和StSCE1协同提高抗旱性功能的验证方法，包括：（1）共过表达载体构建；（2）马铃薯和拟南芥转化；（3）转基因植株的生理生化分析。
有益效果：本申请首次提供StSUMO1和StSCE1协同提高抗旱性的应用。StSUMO1和StSCE1既能提高马铃薯抗PEG胁迫能力，也能提高拟南芥干旱胁迫下的存活率。
附图说明
图1 StSCEs基因在盐和PEG处理下的qRT-PCR相对表达量；
图中，不同字母表示相同处理下不同组别具有显著差异（p < 0.05），所有组均进行三次生物学重复。
图2 StSUMOs基因在盐和PEG处理下的qRT-PCR相对表达量；
图中，不同字母表示相同处理下不同组别具有显著差异（p < 0.05），所有组均进行三次生物学重复。
图3靶蛋白全长克隆酵母双杂交回转验证。
图4 20% PEG6000处理下WT和共过表达转基因马铃薯株系的理化参数测定；
图中，（A）SOD 活性，（B）MDA 含量，（C）总抗氧化能力，（D）脯氨酸含量。
图5 转基因拟南芥和野生型在干旱胁迫和复水后的表型。
具体实施方法
本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。
实施例1
本实施例提供马铃薯StSUMO1和StSCE1基因，包括：
StSUMO1的ID为：Soltu.DM.09G017670.1；StSCE1的ID为：Soltu.DM.04G033370.1；所述StSUMO和StSCE1序列登记在马铃薯数据库，网址为：http://spuddb.uga.edu/。StSUMO1的转录本序列如序列表SEQ No.1所示，StSCE1序列的转录本序列如序列表SEQNo.2所示。
实施例2
本实施例提供筛选马铃薯干旱响应SUMO化途径成员的方法，包括：
1.马铃薯SUMO成员筛选
采用申请人发表的论文所述方法筛选马铃薯SUMO成员（Shantwana Ghimire,2020）。共鉴定到马铃薯SUMO基因7个，SCE基因9个。
2.马铃薯SUMO成员表达谱分析
采用申请人发表的论文所述方法分析马铃薯SUMO基因和SCE基因的表达谱（Shantwana Ghimire,2020）；结果显示在ABA处理下，与对照条件相比，StSCE5/6/7和StSUMO3表达量升高，而StSCE1/3/4/9和StSUMO1在盐和甘露醇处理的条件下表达升高；StSCE2和StSUMO2和StSUMO4在盐处理下表达量升高，而在甘露醇处理下表达量下调；StSCE3/6和StSUMO4在热处理条件下表达量升高，而其他基因表达量下调。
3.马铃薯SUMO成员表达量qRT-PCR分析
如图1和图2所示，为了进一步验证响应干旱和盐胁迫的SUMO成员，将StSCE1、StSCE5、StSCE6、StSCE7、StSCE9、StSUMO1、StSUMO2、StSUMO4表达量进行qRT-PCR分析；qRT-PCR分析进行三次生物学重复，详细实验方法参考（唐勋，2018；Livak，2001）。结果表明，在盐和PEG处理条件下，除StSCE9外，上述所有qRT-PCR分析的StSCE基因均上调表达；同样，StSUMO1、2和4在盐和PEG胁迫条件下上调。因此，StSCE1、StSCE5、StSCE6、StSCE7、StSUMO1、StSUMO2、StSUMO4的表达受到盐胁迫诱导；StSCE1、StSCE5、StSCE6、StSCE7、StSUMO1的表达受到PEG胁迫诱导。
实施例3
本实施例提供干旱响应SUMO化途径组合的筛选方法，即选择同一条SUMO化途径的成员的方法，挑选在盐胁迫和PEG胁迫下均上调表达的StSCE1，筛选其互作蛋白，具体过程如下：
1.构建pGBKT7-StSCE1诱饵载体
采用天根公司植物总RNA试剂盒按说明书操作提取马铃薯“Atlantic”总RNA；利用天根公司反转录试剂盒按说明书操作将马铃薯RNA反转录得到cDNA。利用引物pGBKT7-StSCE1:F5'-ATGGCCATGGAGGGCCGAATTCATGTCTAGTGGAATTGCGCG-3'（EcoRI）；pGBKT7-StSCE1:R5'-ATGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCTAGAGTAGAGCTGGATACTG-3'（SalI）克隆StSCE1全长序列，并采用EcoRI和SalI进行双酶切连接。扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，58℃退火30s，68℃延伸2min，40循环，68℃终延伸8min。
2.pGBKT7-StSCE1文库筛选
按上海唯地生物酵母试剂盒说明书将pGBKT7-StSCE1转化酵母AH109感受态细胞。将液体细胞沉淀倒入50ml容量的离心管中，以6000rpm的速度离心10分钟，弃去上清液，将新鲜制备的5ml SDO液体培养基加入细胞沉淀中，然后将YPDA液体培养基加入到上述混合物中，最后将马铃薯cDNA文库HKL186-Liang AH109细胞添加到最终混合物中，并置于12rpm的振荡器中24小时。24小时后，将生长的细胞以6000rpm的速度离心10分钟，弃去上清液。制备1000毫升的四缺培养基，并倒入培养皿中，将上述离心收集的细胞沉淀与5mlYPDA+5mlddH2O+50μl卡那霉素混合，涂布在培养基上，倒置培养5天。然后选择的单菌落通过PCR验证并测序。结果发现在互作的23个蛋白中含有StSUMO1。
3.pGBKT7-StSCE1和pGADT7-StSUMO1回转验证
采用上述步骤1的方法克隆StSUMO1全长序列，并构建pGADT7-StSUMO1载体。克隆引物如下：pGADT7-StSUMO1: F5'-GCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGTCTGCTAGCGG CGGCGC-3'（EcoRI）；pGADT7-StSUMO1: R5'-ACGATTCATCTGCAGCTCGAGTTAAAAA TTAGAGAAAGAAG-3'（XhoI），并采用EcoRI和XhoI进行双酶切连接。扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，57℃退火30s，68℃延伸1min，40循环，68℃终延伸8min。采用上述步骤2的方法，共转化酵母细胞，验证StSCE1和StSUMO1互作，结果如图3所示，StSCE1和StSUMO1互作，因此StSCE1和StSUMO1处于同一条SUMO化途径中。
实施例4
本实施例提供马铃薯StSUMO1和StSCE1协同提高抗旱性的应用，包括：
1.共过表达载体构建
共过表达载体pRI201-AN购于takara公司，按说明书操作构建pRI201-AN-StSUMO1-StSCE1载体。基因扩增引物如下：StSCE1F（NdeI）TCTTCACTGTTGATACATATGATGTCTAGTGGAATTGCGCG，StSCE1R（SalI）TGTTGATTCAGAATTGTCGACCTAGAGTAGAGCTGGATACTG；StSUMO1F（KpnI）TAAAGATAAGGAATTGGTACCGCATGCCTGCAGGTCCCCAG，StSUMO1R（EcoRI）GATTACGAATTCCCGGGATCCTCTTTAATCATATTCCATAG。
2. 马铃薯和拟南芥转化
收集马铃薯块茎用灭菌蒸馏水冲洗3次，然后切成0.5cm的薄片，将薯片放入含有25ml含有pRI201-AN-StSUMO1-StSCE1的农杆菌悬浮液的培养皿中，并置于振荡器中在25°C下振荡45分钟。将切片在无菌滤纸中轻轻吸干，然后转移到愈伤组织诱导培养基、生根培养基中。大约5周内从愈伤组织再生的植物转移到含有卡那霉素的筛选培养基中，然后选择生根植株进一步确认阳性转化。设计新霉素磷酸转移酶（NptII）引物（F:5'TGGAACGGGAAAAGGACATGA; R:5'TCGCCGTGGGAAAAGACAAG）用于确认植物中的阳性转化。同时，StSUMO1和StSCE1共过表达载体采用花序浸染法转化拟南芥，具体转化方法参考刘敏，2011。
3. 转基因植株的生理生化分析
为了研究StSCE1和StSUMO1基因在干旱胁迫响应和调控中的关联，检测并分析正常和胁迫条件下WT和转基因品系中脯氨酸、MDA、SOD和TAC的含量。在WT品系中，SOD活性在无压力和压力条件下没有显著差异。如4所示，应激后转基因株系的SOD活性显著增加，达到无应激条件的3倍。检测PEG诱导干旱胁迫前后WT和转基因品系的MDA含量，并观察到WT中MDA含量显著高于胁迫前后的转基因品系，WT中的MDA含量在24小时胁迫下增加了3倍，然而，在转基因品系中没有观察到显著增加。类似地，在WT和转基因品系中测量了总抗氧化能力，并观察到转基因品系组内和组间的水平显著增加，但在胁迫后WT中没有显著差异。在胁迫前后测定WT组和转基因株系的脯氨酸含量，观察到胁迫后转基因株系脯氨酸含量显著增加。在对照组中，脯氨酸含量没有显著差异，但随着胁迫时间的增加，WT和转基因株系表现出显著差异，与胁迫0小时相比，脯氨酸水平增加了3倍以上。因此，StSCE1和StSUMO1共转化植株的抗旱能力显著增强，且强于StSCE1转化植株。
评估转基因拟南芥耐受干旱的能力。将Col-0和转基因品系的31天龄幼苗置于相同条件下进行比较。土壤水分低于10%后停水7天，再浇水培养7天，计算成活率。如图5所示，与共过表达的转基因品系相比，Col-0品系受干旱胁迫的影响较大。在干旱胁迫下，Col-0中存活率为12.5%，转基因系存活率为87.5%。因此，StSCE1和StSUMO1共转化植株的抗旱能力显著增强。
上述实施例记载在申请日之后的学位论文《马铃薯SUMO化成员鉴定及StSUMO1和StSCE1功能研究》中，本领域的普通技术人员可以获取与本申请相关的其他技术方案。以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
参考文献：
[1] Shantwana Ghimire, 马铃薯SUMO化成员鉴定及StSUMO1和StSCE1功能研究[D].甘肃农业大学,2021.
[2] Shantwana Ghimire., Tang Xun., Zhang Ning., et al. GenomicAnalysis of the SUMO-Conjugating Enzyme and Genes under Abiotic Stress inPotato （Solanum tuberosum L.） [J]. International journal of genomics 2020:9703638.
[3] 唐勋. 马铃薯泛素化蛋白质组学分析及StPUB27基因功能研究[D].甘肃农业大学,2018.
[4] Livak K. J. and Schmittgen T. D. Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method [J]. Methods, 2001, 25 （4）:402-408.
[5]刘敏. 采用花序浸染法将线性基因表达框导入拟南芥[D].大连理工大学,2011.
序列表：
（1）StSUMO1：
AAAACGAAACGCTCACCGTATTAAAGGAAGGAGGCCAAGCTTGAAGAATTATCTCAGTTGGGCGGAAGAAGAAGAATTATAGAAGTGTGATCATAATGTCTGCTAGCGGCGGCGCCGGAGATGAAGATAAGAAGCCTAATGATCAGATGGTTCATATCAATCTCAAGGTTAAGGGTCAGGATGGGAATGAAGTGTTTTTCAGGATCAAGCGTAGCACACAGATGCGCAAGCTCATGAATGCTTATTGTGACCGGCAGTCAGTGGACATGAACTCAATTGCATTCTTATTTGATGGGCGCAGGCTTAGGGCAGAGCAAACTCCTGATGAGCTGGAGATGGAGGAGGGTGATGAAATCGATGCAATGCTACATCAAACTGGAGGCAGCGATACTGGATGCTGCGCTTCTTTCTCTAATTTTTAACTTGGTTTATGTTTGTAGATTGTTTAGGGTGATACTTTCAGAGTGTTGGTATAACTCCCTCATCTGCTTTAAGATGGTAAATTTATGAATGTTTAGTTTTCAGTATTAGATATGACGACACTACTAAATGGTTCAATTTCCATCGCATTTGTCAAAAACACTCTGAATATGGTTTCAGATGGTGTCTTGCAGCTCACTTTGCCTAATAATATTTCATACCCATCATAATATTGTA
（2）StSCE1：
ATGTCTAGTGGAATTGCGCGTGGTCGTCTCGCTGAGGAGAGGAAAGCATGGCGTAAGAATCATCCTCATGGTTTTGTGGCAAAGCCGGAGACTGGTCCTGATGGTACTGTCAATTTGATGGTCTGGCAATGTTCTATCCCGGGTAAACCTTCGACTGACTGGGAGGGCGGTCACTATCCAATAACGATGCATTTCAGTGAAGACTATCCAAGCAAACCCCCGAAGTGCAAGTTTCCAGCAGGTTTCTTTCATCCAAATGTCTATCCTTCAGGAACTGTTTGTTTGTCCATCCTCAACGAGGACAGTGGATGGAGGCCAGCCATTACAGTGAAGCAAATTTTGGTGGGTATACAAGATTTGCTTGACCAGCCAAATCCCGATGATCCAGCACAAACCGAGGGCTATCAGCTTTATATGCAGGATACAGATGAGTACAAGAAGCGAGTGAAGCAGCAGGCTAAGCAGTATCCAGCTCTACTCTAG。
序列表
<110> 甘肃农业大学
<120> 马铃薯StSUMO1和StSCE1的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 657
<212> DNA
<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)
<400> 1
aaaacgaaac gctcaccgta ttaaaggaag gaggccaagc ttgaagaatt atctcagttg 60
ggcggaagaa gaagaattat agaagtgtga tcataatgtc tgctagcggc ggcgccggag 120
atgaagataa gaagcctaat gatcagatgg ttcatatcaa tctcaaggtt aagggtcagg 180
atgggaatga agtgtttttc aggatcaagc gtagcacaca gatgcgcaag ctcatgaatg 240
cttattgtga ccggcagtca gtggacatga actcaattgc attcttattt gatgggcgca 300
ggcttagggc agagcaaact cctgatgagc tggagatgga ggagggtgat gaaatcgatg 360
caatgctaca tcaaactgga ggcagcgata ctggatgctg cgcttctttc tctaattttt 420
aacttggttt atgtttgtag attgtttagg gtgatacttt cagagtgttg gtataactcc 480
ctcatctgct ttaagatggt aaatttatga atgtttagtt ttcagtatta gatatgacga 540
cactactaaa tggttcaatt tccatcgcat ttgtcaaaaa cactctgaat atggtttcag 600
atggtgtctt gcagctcact ttgcctaata atatttcata cccatcataa tattgta 657
<210> 2
<211> 483
<212> DNA
<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)
<400> 2
atgtctagtg gaattgcgcg tggtcgtctc gctgaggaga ggaaagcatg gcgtaagaat 60
catcctcatg gttttgtggc aaagccggag actggtcctg atggtactgt caatttgatg 120
gtctggcaat gttctatccc gggtaaacct tcgactgact gggagggcgg tcactatcca 180
ataacgatgc atttcagtga agactatcca agcaaacccc cgaagtgcaa gtttccagca 240
ggtttctttc atccaaatgt ctatccttca ggaactgttt gtttgtccat cctcaacgag 300
gacagtggat ggaggccagc cattacagtg aagcaaattt tggtgggtat acaagatttg 360
cttgaccagc caaatcccga tgatccagca caaaccgagg gctatcagct ttatatgcag 420
gatacagatg agtacaagaa gcgagtgaag cagcaggcta agcagtatcc agctctactc 480
tag 483
Claims (5)
1. 马铃薯StSUMO1和StSCE1协同提高植物抗旱性的应用，其特征在于StSUMO1的转录本序列如序列表SEQ No.1所示，StSCE1序列的转录本序列如序列表SEQ No.2所示。
2.根据权利要求1所述的马铃薯StSUMO1和StSCE1协同提高植物抗旱性的应用，其特征在于所述提高抗旱性的应用通过共过表达StSUMO1和StSCE1基因予以实现。
3.根据权利要求1所述的马铃薯StSUMO1和StSCE1协同提高植物抗旱性的应用，其特征在于StSCE1和StSUMO1基因降低马铃薯PEG胁迫下MDA含量，提高马铃薯PEG胁迫下脯氨酸、MDA、SOD和TAC含量。
4.根据权利要求1所述的马铃薯StSUMO1和StSCE1协同提高植物抗旱性的应用，其特征在于StSCE1和StSUMO1基因提高拟南芥干旱胁迫下的存活率。
5. 马铃薯StSUMO1和StSCE1协同提高植物抗旱性功能的验证方法，其特征在于包括：（1）共过表达载体构建；（2）马铃薯和拟南芥转化；（3）转基因植株的生理生化分析；StSUMO1的转录本序列如序列表SEQ No.1所示，StSCE1序列的转录本序列如序列表SEQ No.2所示。
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| Genomic Analysis of the SUMO-Conjugating Enzyme and Genes under Abiotic Stress in Potato (Solanum tuberosum L.);Shantwana Ghimire等;International Journal of Genomics;第2020卷;文章号9703638 * |
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