CN113774043A

CN113774043A - 一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白及其编码基因

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Publication number: CN113774043A
Application number: CN202111005511.9A
Authority: CN
Inventors: 吴挺开; 徐培洲; 吴先军; 王锦豪; 宋佳贺; 方永琼; 周婷婷; 夏俭西经; 廖泳祥; 陈晓琼
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2021-08-30
Filing date: 2021-08-30
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2041-08-30
Also published as: CN113774043B

Abstract

本发明提供了一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白，属于水稻基因工程技术领域，所述相关蛋白命名为OsBG1，所述相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，通过基因编辑敲除OsBG1蛋白的编码基因能够获得使水稻黄色颖壳变为棕色的基因，可用于三系杂交制种中筛选杂合或纯合杂交种。本发明还提供了一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白的编码基因。

Description

一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白及其编码基因

技术领域

本发明属于水稻基因工程技术领域，特别涉及一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白及其编码基因。

背景技术

我国的三系杂交水稻制种技术经过多年的研究开发，其体系的日益成熟为我国水稻生产提供了有力的保障。但是，杂交水稻制种技术仍然存在制种效率不高，种子纯合性筛选工作繁杂等问题。因此，相继开发的全程机械化的混播制种已成为解决该问题的有效路径。由于混播制种中存在父母本和杂交亲本的混收混种，因此需要适当的分子标记或种子性状标记来区分杂交种子和亲本。目前，水稻颖壳的颜色被认为是最具实用化前景的区分标记之一，因此发展快速改造水稻品种颖壳颜色的育种技术将有效促进杂交水稻混播制种技术的发展。

与正常水稻颖壳颜色相比，异常的水稻颖壳颜色存在多种，常出现的如：褐色、金黄色、黑色等。黄酮类化合物与木质素代谢途径相关且引起水稻颖壳颜色变化的已克隆的基因主要有3个。位于水稻3号染色体上、黄酮类化合物代谢途径中的一个重要基因查耳酮异构酶基因OsCHI，在Dasheng转座子插入突变体ghl中，OsCHI基因完全不表达，导致ghl颖壳和节间中总类黄酮物质含量剧增，表现为颖壳与节间均为金黄色。褐色颖壳抑制因子IBFl编码一个包含Kelch重复序列结构域F-box蛋白，在类黄酮化合物生物合成过程中，作为抑制剂，能够抑制褐色素在水稻颖壳沟纹中沉积。肉桂醇脱氢酶基因OsCAD2具有强脱氢酶活性，是参与木质素前体物质松柏醇和芥子醇的合成所必需的，主要负责水稻茎杆木质素单体生物合成，该基因定位在2号染色体上，在gh2中，由于OsCAD2突变，使得木质素含量和组成变化，从而出现水稻金黄色颖壳与节间表型。此外位于第4号染色体长臂控制野生稻黑色颖壳的基因Bh4编码一个氨基酸转运蛋白，其碱基22bp的缺失导致该蛋白功能紊乱，从而使得野生稻黑色颖壳向普通栽培稻正常颖壳颜色转变，且经过进化分析发现，这是一个长期的人工选择的过程。

植物体在其长期进化过程中，为了适应生活环境，合成了各种各样的次级代谢产物。类黄酮化合物就是植物体在适应自然环境过程中产生的一大类次级代谢物。到目前为止，大概发现了4000多种类黄酮化合物，黄酮类化合物是植物体内普遍存在的苯丙类代谢产物，在植物的生长发育过程中起着重要的作用。类黄酮(Flavonoids)化合物在抗氧化、抗菌、抗病毒等方面功能显著，因此它在作为药品、食品添加剂等方面前景深远。类黄酮多以结合态或自由态形式存在于植物中。黄酮和花青素积累能够明显增强植物的抗逆境胁迫能力。

在植物体内类黄酮化合物的合成途径中主要包括两种基因，一种是化合物合成途径中的结构基因，另一种是合成途径中的调控基因。植物体内类黄酮化合物合成途径(图18)：查尔酮合成酶(CHS)通过将碳通量从一般的苯丙代谢引向黄酮类化合物的代谢途径，催化黄酮类化合物生物合成的第一步。CHS是类黄酮化合物合成途径中的第一个关键酶，4一香豆酞-COA及丙二酞-COA在该酶的作用下生成二氢黄酮醇查尔酮异构酶(CHI)催化二氢黄酮醇，进入类黄酮化合物代谢途径，从生成各种黄酮类物质。

类黄酮化合物在植物的整个生长发育的过程中有着至关重要的作用，同时对人体健康有益，营养价值极高。根据己有的文献证明，类黄酮化合物主要有以下几方面的作用。第一，类黄酮化合物参与植物对生物胁迫和非生物胁迫的抗性反应。Righin通过构建表达FNS的拟南芥转基因植株，验证了黄酮在植物抗UV-B辐射中的作用。第二，类黄酮化合物参与到植物的生殖发育过程中。在玉米、矮牵牛花中缺少黄酮类物质时，正常的花粉管就无法形成。这种功能缺陷在外源添加黄酮醇，花粉的功能随即被恢复。第三，与植物花色形成有关，玉米的DFR基因转入到牵牛花中，新的花色在牵牛花中出现。而反义的CHS基因序列导入到牵牛花中，花色由紫色变成了白色。第四，类黄酮化合物具有抗癌作用，在许多水果和蔬菜中发现的膳食类黄酮非瑟酮己在临床前研宄中显示可通过改变细胞周期、血管生成、侵袭和转移来抑制癌症生长，而不会对正常细胞产生任何毒性。另外，类黄酮化合物还能抑制细菌和抗生素。类黄酮化合物是植物体内重要的次级代谢物，但是目前对于类黄酮化合物在植物体内的作用机制仍然不是很清楚。

在植物中，黄酮类化合物因为具有十分重要的生物学功能而被人们所重视。例如花青素就可以吸收可见光来促进植物的光合作用，同时花青素也是植物的花和果实的颜色必要物质。类黄酮在动物与植物之间的相互作用中发挥作用，例如在植物中叶片的涩味是由于植物中含有大量的多胺，从而阻止了草食动物对植物的啃食，对植物的叶片起到了很好的保护作用。此外还有研究显示植物中花粉育性是受到类黄酮通路的影响，通过影响类黄酮的含量来调节生长素的运输，最终使得花粉发育。类黄酮除了在控制植物的生理发育具有重要作用之外，还对一系列非生物胁迫起到保护作用。黄酮醇和花青素积累在叶表皮中与DNA结合形成复合体，保护植物免受氧化损伤。同样，通过低温胁迫实验发现，在低温条件下玉米和拟南芥幼苗中花青素出现了明显的积累，说明花青素在抵御植物低温胁迫方面发挥着潜在的巨大作用。酚类物质(如水杨酸)的合成代谢是植物抵御微生物入侵的重要内源性物质，而黄酮类化合物又与水杨酸的分解合成代谢具有十分重要的关系。

参与类黄酮生物合成途径的酶在几种模式植物如拟南芥、玉米、水稻中已经被鉴定出来。通过对合成途径中的所有基因和酶进行结构域的归类以及保守特征的比较发现，这些结构基因表达的调控似乎在时间和空间上紧密结合在一起，并由R2R3-MYB、碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和WD40类转录因子组成的三元复合体协调。这个MYB-bHLH-WD40(MBW)复合体是负责调节编码酶的基因，这些酶涉及花青素和缩合单宁生物合成的途径的后期步骤。虽然目前已鉴定出几个编码这三个家族转录因子的基因，但对于这一生物合成途径的调控，尤其是bHLH和WD40蛋白各自的作用。目前的理解还存在许多空白，而更好地了解类黄酮途径的调控机制可能有利于开发新的生物技术工具，以产生具有最佳类黄酮含量的增值植物。

MYB是一种具的N-末端MYB结构域，并且由50多个氨基酸(R1、R2和R3)所组成一种植物体内重要的转录因子。经过研究发现MYB转录因子发挥作用主要是由两个R重复序列(R2R3MYB蛋白)所决定的。在众多关于MYB转录因子的功能研究中，以MYB介导的类黄酮通路最为重要。第一批调节类黄酮途径的MYB转录因子于1987年在玉米中被发现，除P1外，还包括C1(无色1)和PL1(紫叶1)。当时对C1的鉴定表明，植物转录因子与哺乳动物的转录因子关系密切，构成了植物分子生物学的里程碑。例如PA和花青素途径的调节主要是靠MYB中的R3与bHLH相互作用所决定的。然而，并不是所有的类黄酮调节因子都完全符合这一分类。例如在马铃薯的研究中鉴定出了一个与大豆中MYB73相类似的单个的结构域。MYB蛋白在紫肉中的表达是在白肉中的44倍，这些都表明R2R3型MYB转录因子在花青素生物合成的控制中发挥了作用。

bHLH蛋白又称为MYC，是存在于类黄酮途径中的调节因子。bHLH蛋白因其保守结构域而得名，构成了一个从酵母到人类，并广泛分布于植物中的转录因子家族。最早的bHLH转录因子在20世纪90年代初被确定为细胞增殖和分化、肌肉发生或神经基因的调节因子，但它们也参与哺乳动物一系列额外的发育过程。在植物中，第一批调节类黄酮途径的bHLH转录因子于1989年在玉米中被发现，其中包括B/R家族成员B和R，后来又发现了LC、Sn。

WD40或WDR(WD重复)蛋白参与许多真核细胞过程，包括细胞分裂、囊泡形成和运输、信号转导、RNA处理和转录调控。它们特别参与染色质的重塑，通过修饰组蛋白，从而可以影响转录。WD40蛋白被认为没有任何催化活性(DNA结合或调节目标基因的表达)，似乎是一个对接平台，因为它们可以同时与几种蛋白质相互作用。

发明内容

为了解决快速改造水稻品种颖壳颜色的技术问题，本发明提供了一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白，命名为OsBG1，通过基因编辑敲除OsBG1蛋白的编码基因能够获得使水稻黄色颖壳变为棕色的基因，可用于三系杂交制种中筛选杂合或纯合杂交种。

本发明还提供了一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白的编码基因。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白，所述相关蛋白命名为OsBG1，所述相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

基于同一发明构思，本发明提供了一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白的编码基因在培育棕色颖壳水稻品种和/或三系杂交制种筛选杂合中的应用。

基于同一发明构思，本发明提供了一种控制水稻产生棕色颖壳的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5中的任意一项所示。

进一步的，所述基因通过对相关蛋白OsBG1的编码基因进行基因编辑获得，所述基因编辑通过CRISPR/CAS9系统进行，所述基因编辑采用的靶标序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。

一种控制水稻产生棕色颖壳的基因在三系杂交制种筛选杂合杂交种或纯合杂交种中的应用。

一种用于敲除相关蛋白OsBG1的编码基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQID No.7和SEQ ID No.8所示。

一种用于敲除相关蛋白OsBG1的编码基因的敲除载体，所述敲除载体OsU6启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。

一种用于敲除相关蛋白OsBG1的编码基因的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。

一种棕色颖壳水稻株系的制备方法，所述制备方法包括：

构建含有所述靶标序列的CRISPR/CAS9系统表达载体；

将所述表达载体转化到非棕色颖壳的水稻品种中；

筛选并鉴定出相关蛋白OsBG1的编码基因被敲除的转基因纯合株系，获得棕色颖壳水稻株系。

一种棕色颖壳水稻品种的育种方法，所述育种方法包括：

以棕色颖壳水稻株系为非轮回亲本，以农艺性状优良的恢复系或保持系品种作为轮回亲本进行杂交，获得杂交后代，所述棕色颖壳水稻株系通过上述一种棕色颖壳水稻株系的制备方法制备；

采用分子标记对所述杂交后代进行辅助选择，获得带有上述一种控制水稻产生棕色颖壳的基因且农艺性状倾向于轮回亲本的材料，连续回交5-8代后自交1代得到BC_5-8F₂，选择棕色颖壳性状不分离的株系，获得稳定遗传的棕色颖壳水稻品种。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1.本发明一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白，将其命名为OsBG1，通过基因编辑敲除OsBG1蛋白的编码基因能够获得使水稻黄色颖壳变为棕色的基因，可用于三系杂交制种中筛选杂合或纯合杂交种。

2.本发明一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白的编码基因，可编码相关蛋白OsBG1，通过基因编辑敲除OsBG1的编码基因后可获得深棕色颖壳的水稻品种，可用三系杂交制种中筛选杂合或纯合杂交种，并且，OsBG1的编码基因在控制水稻颖壳色彩领域中的应用为本发明首次提出。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为野生宜香YX1B和突变体bg1的植株对比照片：其中1为野生型宜香1B，2为突变体为bg1。

图2为野生型宜香1B和突变体bg1的稻穗对比图：其中1为野生型宜香1B，2为突变体为bg1。

图3分别为野生型宜香1B和突变体bg1的颖壳比对图：其中1为野生型宜香1B，2为突变体为bg1。

图4为OsBG1基因初步定位图：其中初步定为在标记引物1-19至1-21之间。

图5为叶色素a含量测定图：其中1为幼穗期野生型宜香1B，2为幼穗期突变体bg1，3为蜡熟期野生型宜香1B，4为蜡熟期突变体bg1。

图6为叶色素b含量测定图：其中1为幼穗期野生型宜香1B，2为幼穗期突变体bg1，3为蜡熟期野生型宜香1B，4为蜡熟期突变体bg1。

图7为花青素含量测定图：其中1为野生型宜香1B，2为突变体为bg1。

图8为基因定位结合Mutatmap全基因组重测序的连说染色体曼哈顿分析图。

图9为OsBG1基因SNP位点Sanger测序图：其中1为野生型宜香1B，2为突变体为bg1。

图10为碱基序列图：所标位点即为突变体bg1的突变位点。

图11为氨基酸序列图：所标207位点即为突变体bg1的突变位点。

图12为基因敲除载体构建示意图。

图13为CRISPR/Cas9转基因植株图：其中1为受体背景材料Nip，2、3、4为基因敲除阳性纯合株系KO-1、KO-2、KO-3。

图14为CRISPR/Cas9转基因植株小穗图：其中1为受体背景材料Nip，2、3、4为基因敲除阳性纯合株系KO-1、KO-2、KO-3。

图15为CRISPR/Cas9转基因植株籽粒图：其中1为受体背景材料Nip，2、3、4为基因敲除阳性纯合株系KO-1、KO-2、KO-3。

图16为转录组分析图：其中1为差异基因统计，2为差异基因韦恩图，3为差异转录因子统计饼状图，4为差异转录因子分类图。

图17为代谢组分析中差异物质的统计热图。

图18为背景技术中黄酮代谢途径示意图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

本发明对于OsBG1蛋白及其编码基因的功能探究，是基于我国杂交稻骨干亲本宜香1B，经过在化学诱变试剂甲基磺酸乙酯(Ethylmethane sulphonate，EMS)诱变库中筛选得到一份颖壳颜色突变体，命名为bg1(brown grain 1)。通过遗传分析发现颖壳颜色转变的性状由单隐性核基因控制。进一步研究后发现，该基因突变体在在抽穗破口期后，自其整个穗部颖壳开始陆续出现针状棕色斑点，随着发育进程的推进，颖壳上斑点的颜色逐渐加深为深棕色。

LOC_Os01g67220基因(暂时命名为OsBG1,brown grain1)编码的是一个胞质β-葡萄糖苷酶(相关蛋白OsBG1)，其主要生物学功能是水解水杨苷，介导颖壳花青素的积累，使其颜色从黄色转变为棕色,目前，尚未发现OsBG1基因被克隆或涉及到介导颖壳花青素形成的生物学途径。

基于此，本申请提供一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白及其编码基因。

下面将结合实施例及实验数据对本申请一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白及其编码基因进行详细说明。

实施例1

本实施例提供了棕色颖壳突变体bg1及野生型宜香1B的颖壳颜色表型鉴定及遗传分析，通过分析该基因所编码的胞质β-葡萄糖苷酶在颖壳花色苷的生成机理研究及培育综色颖壳水稻品种中的作用，以解决三系杂交制种中筛选杂合/纯合杂交种过程中的应用。

(一)试验材料

(1)野生型宜香YX1B(籼型水稻保持系)由四川宜宾农科院选育，由四川农业大学水稻研究所引进并保存。

(2)棕色颖壳突变体bg1，是本发明人从以籼稻保持系品种宜香1B为背景构建的EMS(甲基磺酸乙酯)诱变构成的突变体库中筛选获得的综色颖壳突变体，该突变体与野生型宜香1B进行多代回交，颖壳颜色的突变性状能够稳定遗传(如图1-3所示)。

(二)试验方法

籼稻品种YX1B经EMS化学诱变，通过多代自交获得一份穗部颜色异常、结实率降低的稳定遗传突变体，将其命名为bg1(brown grain1)。以bg1为母本，以野生型YX1B为父本进行杂交，构建BC1F2群体供Mutmap测序使用。同时又以粳稻品种NIP为父本与之进行杂交，构建F₂遗传定位群体供基因定位使用。所有实验材料分别在海南陵水和成都温江交替种植

(2)综色颖壳变体的遗传分析试验

2018年夏在四川温江以突变体bg1为母本，以野生型粳稻品种02408、籼稻品种YX1B为父本进行杂交，将所收F0种子于2018年冬种植于海南陵水，将所收获的F₁自交种于2019年夏种植于四川温江，并对F₁及F₂群体进行表型统计分析。

通过对bg1与粳稻品种02428杂交后发现，F₁中子代都出现为正常的性状，在F₂群体中正常性状与突变性状呈现3:1(P＜0.05)的分离比例，证实本实施例中所用突变体bg1是由一个核单基因控制的隐性性状(表1)。

表1：bg1的遗传分析

实施例2

本实施例进行野生型宜香YX1B(简称1B)和综色颖壳突变体bg1、CRISPR/Cas9-OsBG1敲除株系KO-1、KO-2、KO-3(控制水稻产生棕色颖壳的基因分别对应为SEQ ID NO.3、4和5)与野生型Nip的农艺性状观察统计。

自2018年夏起，在四川温江和海南陵水交替播种bg1和野生型YX1B。在进行农艺性状调查时，分别选取野生型和突变体bg1的非边行内单株随机调查10株，具体调查的性状包括：株高(Plant height)主穗长度(Panicle length)剑叶长度(Flag length)，并取其平均值；分别把这两组随机的10株材料带到实验室内考种，每个材料重复三次，主要包括千粒重(1000-grain weight)结实率(Seed setting rate)退化率(Degeneration rate)，并取其平均值。

实施例3

本实施例进行水稻颖壳变体bg1候选基因的定位及克隆试验

(一)试验材料

突变体bg1，野生型宜香1B和Nip(粳型水稻品种)均来自四川农业大学水稻研究所遗传研究实验室提供。

(二)试验方法

(1)将突变体bg1与粳稻品种Nip杂交构建F₁代群体，并自交得到F₂代群体用于遗传定位。将突变体bg1与宜香1B回交构建BC₁F₃代群体用于MutMap测序进行基因精细定位。

(2)近等基因池构建

将bg1与NIP杂交得到的F₁代，F₁自交得到的F₂分离群体，采用BAS法(bulksegregation analysis)进行基因定位与分析。首先，随机分别选取10个单株的bg1和Nip的叶片，每10株的叶片等量混合提取DNA建池，得到2个亲本DNA混池用于筛选亲本间多态性分子标记。然后，在突变体bg1与Nip杂交得到的F₂分离群体中选10份具有棕色表型的单株叶片和10份具有野生型黄色颖壳正常表型单株的叶片，每10株的叶片等量混合提取DNA建池，分别获得显性混池和隐性混池用于分析突变性状与染色体的连锁关系。最后，在突变体bg1与Nip杂交得到的F₂群体中选择100个具有棕色颖壳表型的单株叶片，采用改进CTAB法分单株提取DNA，用于进行基因定位。

(3)定位引物合成和基因定位

先利用本研究室保存的平均分布于水稻12条染色体上的512对SSR引物(具体序列详见http://www.gramene.org/bd/markers)进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳筛选出在bg1与NIP基因组之间具有多态性的引物68对；随后用筛选出的27对多态性引物检测显性混池和隐性混池，以及bg1与NIP构建的F₂群体中隐性单株，进行基因初步定位；在已初定位的区间内，依据(http://www.gramene.org)网站公布的籼稻品种9311和粳稻品种日本晴目标区域的核苷酸序列之间的差异，设计Inde1引物Indel 13和Indel 14(见表2)，试验结果见电泳图4(初定为在标记引物1-19与1-21之间)，继续检测近等基因池和bg1与Nip构建的F₂群体中的198个隐性单株，进行定位。

表2本试验所使用的PCR引物

引物名称	正向引物序列(5’-3’)	反向引物序列(5’-3’)
			1-19	GTGATGGGAGAGCAGGAGAAGG	CGCAAGTGGACCTCTTATTGTGC
1-21	GTTAGGTTAACGGGATCTTGTTCG	ATGCAGTCTCCATCATCGAAGC
			Indel 13	TAATTTCTGGCACGTACGCATGG	GTAGCGATGCAACTACCAGTGAGC
Indel 14	AACGTGCTACGAGATAGTGTTTGC	CGTACGACATATCGACTATACAGAGG

其中PCR反应体系(20uL)：Taq酶(5U/uL)0.2uL，Primer(10mmol/L)2uL，dNTP(10mmol/L)0.3uL，DNA模板(50-200ng/μL)2uL，10×Buffer(25mM)2uL，ddH₂O 13.5uL。PCR反应程序：95℃/5min；95℃/30s，55℃/30s，72℃/1min，第2-4步，34个循环；72℃/10min，12℃/1min。

将PCR扩增产物在3.0％(7.5g琼脂粉溶于300ml ddH₂O)的琼脂糖凝胶、恒压180V-200V条件下电泳45min-1h左右，用凝胶扫描成像仪(Bio-rad Gel Doc 2000)成像并保存记录。

(4)连锁图谱的构建

将与bg1电泳带型一致的单株标为Ⅰ，与Nip电泳带型一致的单株标为Ⅱ，杂合双带型单株标为Ⅲ，没有跑出条带的单株标为Ⅳ，统计结果通过用生物学分析软件Mapmake3.0软件对F₂分离群体中分子标记和突变性状的分离数据进行连锁分析，再将重组值转化为遗传图距(cent Morgan,cM)。

结果发现第1号染色体的短臂端两个SSR标记1-19和2-21性状存在紧密连锁关系，遗传距离分别为0.16cM和0.23cM，因此初步将OsBG1基因定位于该区间。

(5)候选基因精细定位和基因预测

为了进一步缩小定位区间及确认候选基因，本研究室利用突变体bg1与野生型宜香1B回交后，在BCF₃群体中分别随机选表型为棕色颖壳的突变体单株与表型为野生型黄色颖壳的单株各30株，以等量的DNA分别构成突变体混池与野生型混池，用于MutMap全基因组测序。以野生型表型混池基因组序列为参照组，对突变体的全基因组高通量测序结果进行分析解读，测序深度为30层。用SOAP2软件将测序数据与已发表的日本晴参考基因组(MSUOsa1 Release 7Annotation)进行全完比对，根据初定位区间筛选出染色体特定位置的短序列片段。运用SOAPsnp、SOAPsv、SOAPindel等数据分析软件对突变体与日本晴参考组之间的单核苷酸多态性(SNP)SVs、InDels进行分析解读，筛选出突变体bg1在定位区间内特异存在3个分值为1的SNPs位点。通过计算△SNP index，挑选出在F2-read≥15且连续分布的高△SNP index读值，并经过数据分析得到12条染色体上SNP位点的散点分散图。在第一号染色体长臂上出现高△SNP index分值且连续分布的情况，与我们初定位区间相吻合(如图4所示)。由此得到我们候选基因所在的区间定位于三号染色体短臂物理距离40M～41M之间，其中没有已报道与颖壳颜色相关的基因，故研究结果表明OsBG1为一个控制颖壳颜色从黄色转变为棕色的新基因。

将Mutmap全基因组测序数据分析结果与突变体bg1突变表型、水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.ed/cgi-bin)与(http://plants.ensembl.org/ index.html)中籼稻数据库相结合，根据基因功能注释进行筛选在定位区间内，进一步分析得到这几个SNP位点多处于基因间、内含子上或同义突变，仅有一个SNP位点位于基因LOC_Os01g67220的第5外显子属于非同义突变。为了确认Mutmap重测序结果的可靠性，对分析公司给出的三个SNP位点与deletion片段设计引物，分别在在野生型与突变体中进行PCR扩增并进行Sanger测序(如图8所示)，结果表明其中非同义突变的SNP为位点在野生型与突变体中的确发生了单碱基突变，与分析公司给予的结果相吻合。在该编码蛋白基因的CDS区第671位碱基由C(胞嘧啶)转换成T(腺嘌呤)，造成编码的第234位氨基酸由G(苷氨酸)突变为V(缬氨酸)，该碱基突变可能破坏了蛋白的正常编码序列，导致蛋白的功能发生破坏，故将该基因LOC_Os01g67220列为bg1突变体的候选基因。

实施例4

棕色颖壳突变体bg1候选基因CRISPR/CAS9(基因敲除)实验

(一)试验材料

本试验所用大肠杆菌感受态DH5α购于北京全式金生物有限公司、农杆菌EHA105感受态菌株购于四川辰马生物科技有限公司。

(二)试验方法

1、CRISPR/Cas9-OsBG1基因敲除载体构建

分别以突变体bg1、宜香1B、Nip的cDNA为模板对该基因进行扩增，发现该基因在籼稻宜香1B与粳稻Nip中编码区氨基酸序列存在高度同源的情况，说明该基因编码的蛋白在籼稻宜香1B和粳稻Nip中可能行使相近的生物学功能。

以粳稻品种日本晴(Nip)中OsBG1(LOC_Os01g67220)基因的核苷酸序列为模板，选择特异的区域，设计1个独立的敲除靶位点，利用BWA(V)H-CAS9 BGK03基因敲除载体，参照试剂盒(杭州百格生物公司)构建CRISPR/CAS9-OsBG1载体。具体构建流程如下：

(1)设计并合成下述接头引物以形成sgRNA靶点序列：

F:5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT-3’(SEQ ID NO.7)；

R:5’-CAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTA-3’(SEQ ID NO.8)；

用于敲除的OsU6启动子：

F:5’-AACTTATAAACCGCGCGCT-3’(SEQ ID NO.9)；

R:5’-TTGAATATTTGGGCGCGCGA-3’(SEQ ID NO.10)。

用于敲除目的基因的靶序列为：

5’-TGTGTGGAAACTGCTAGATGCTACT-3’(SEQ ID NO.11)；

5’-AAACAGTAGCATCTAGCAGTTTCCA-3’(SEQ ID NO.12)。

(2)制备引物二聚体

将步骤(1)合成的引物对加水溶解至10μM，按下列反应体系混合后，在PCR仪95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃，得引物二聚体。所述的反应体系为：退火Buffer 18ul,gRNA靶点引物各1ul，加ddH₂O,补足至20ul。

(3)将引物二聚体构建至BWA(V)H载体。按下列反应体系在冰上混合各个组分，混匀后20℃反应1小时后转化大肠杆菌备用，获得包含启动子、靶序列、gRNA等元件的表达载体。所述的反应体系：BWA(V)H载体2ul，Oligo二聚体1ul，酶混合液1ul，加ddH₂O,补足至10ul。

2、大肠杆菌转化

(1)从-80℃冰箱中取出一管制备好的大肠杆菌感受态细胞，置于冰上融化；

(2)每100ng连接产物加入100μL感受态细胞悬浮液，混匀后在冰上放置30min；

(3)42℃热激30s，迅速取出立即置于冰上2min；

(4)加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，在37℃、200rpm培养1小时，得活化菌液；

(5)将活化的菌液以5000rpm离心1min，在无菌条件下倒掉大部分上清夜，用移液枪轻轻吸打混匀沉淀，吸取100μL，在超净台上把菌液转移并涂到含有卡那霉素的LB筛选平板上；

(6)将涂有菌液的LB固体培养基平板正面向上放置10分钟左右，待菌液完全被LB固体培养基吸收后将涂板的培养基倒置，于恒温箱中37℃过夜培养；

(7)挑取单菌落，利用P-OsBG1引物对菌液进行PCR检测。所述的P-OsBG1引物对为：

P-OsBG1 KO-F:5'CCCAGTCACGACGTTGTAAA 3'(SEQ ID NO.13)；

P-OsBG1 KO-R:5'TCTCCAGCTTTGGTTTTT 3'(SEQ ID NO.14)。

其中PCR反应程序：95℃/5min；95℃/30s，55℃/30s，72℃/30s，35个循环；72℃/10min，12℃/1min。

(8)将阳性克隆挑入5ml含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养液中，在37℃、200rpm下培养约16h，保存菌液并提取质粒。

3、按照OMEGA Plasmid Extraction Kit产品说明书提取大肠杆菌质粒，将提取的质粒DNA收集到干净的离心管中，-20℃保存。

4、质粒序列的测定和序列分析

将阳性克隆质粒送到成都擎科科技股份有限公司进行测序。用DNAMAN软件对测序结果进行序列比对，确证gRNA序列的正确性，将阳性克隆质粒命名为CRISPR/Cas9-OsBG1。

5、农杆菌转化

(1)农杆菌化学转化法

按照一个质粒：100ul感受态细胞从-80℃拿出来时快速放手心化冻；将构建好的CRISPR/Cas9-OsBG1质粒10ul加入到100ul感受态细胞中，冰上放置1h；液氮中冷冻1min；37℃水浴2min,溶化细胞；立即加入5倍体积的无抗生素LB液体培养基，在28℃、170rpm下摇床培养2～3h；7000rpm离心2分钟，在100ul LB液体培养基中悬浮细胞；涂在利福平加卡那抗性板，吹干，28℃培养2-3天；用潮霉素分子标记P-OsBG1引物进行菌液PCR检测，将能扩增出目的条带的阳性农杆菌单克隆，加入甘油作为保护剂，置于-80℃保存备用。

(2)农杆菌浸染法转化水稻

(a)愈伤组织的诱导：先用75％酒精将日本晴种子消毒1分钟，用无菌水漂洗3次，然后用40％的次氯酸钠漂洗30min，再用无菌水冲洗5次，放置于带滤纸的培养皿中滤干，用镊子接种于NMB培养基上，于28℃、光照条件下培养7天。每7天继代一次。继代2～3次后，挑取从种子上生长出的良好愈伤组织，把它们继代于NMB培养基上，于28℃、黑暗条件下培养4天。

(b)农杆菌菌株的活化：将(1)中-80℃保存的30ul农杆菌加入3mL含有利福平和卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃下振荡培养14h；再取其中1mL于含有利福平和卡那霉素的50mLYEP液体培养基中，28℃再振荡培养4h，得活化的农杆菌菌液。

(c)共培养转化：将(b)活化好的菌液在5000rpm下离心收集菌体，用含有100μM/L乙酰丁香酮的AAM液体培养基30mL重悬菌体，将(a)中预先挑好的愈伤组织浸于菌液中20min，吸去多余的菌液，平铺于共培养固体培养基上，28℃暗培养2d。

(d)愈伤脱菌培养与愈伤抗性筛选：将共培养2d后的愈伤组织用无菌水冲洗至水澄清，然后用含头孢霉素(500mg/L)的无菌水振荡30min杀菌，将愈伤组织用无菌滤纸或吸水纸彻底吸干，然后接种于选择培养基上培养3周左右。

(e)转基因植株的分化与生根：将(d)中新长出的抗性愈伤组织接种到分化培养基上，光照培养1～2个月，然后将长出的3cm左右高的幼苗转到生根培养基上进行生根培养，当苗长至约10cm时，取叶片提取DNA，利用扩增目的基因全长DNA的p-OsBG1性植株苗，最终获得3株转基因阳性植株。将5个转基因阳性植株分别命名为：KO-1、KO-2、KO-3；

(f)将阳性转基因植株室内炼苗2-3天后，移栽于大田。

6、转基因水稻的检测

(1)应用改进的CTAB法提取步骤5中所得的阳性转基因植株的DNA，用Pemf1-2引物对扩增出转基因植株中的敲除靶基因的全长序列，PCR产物片段大小为600bp。所述的Pemf1-2引物对为：

Pemf1-2引物对为：

Pemf1-2 F:5'TGGGATCTTCCACATAAT 3'(SEQ ID NO.15)，

Pemf1-2 R:5'AACCAAGCCTACTTCACC 3'(SEQ ID NO.16)；

其中PCR反应体系(25uL)：Tap酶(5U/μL)0.5ul，Primer(10mmol/L)2ul，dNTP(2.5mmol/L)0.5ul，DNA(20-100ng/μL)2ul，2×Buffer(25mM)12.5ul，ddH₂O 7.5ul。PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，56℃5s，72℃2.5min，30个循环；72℃10min，12℃1min。

(2)PCR产物的回收和测序

进行PCR扩增后反应结束后在产物中加入溴酚蓝指示剂，并在2％的琼脂糖中电泳，并用天根PCR产物回收试剂盒进行回收，保存，反应体系与具体如下：

1)待片段完全分离后，在紫外灯下用小刀快速切取目的条带，放入新的EP管里

2)在电子天平上称取凝胶块重量，按照1g凝胶加入1ml Binding Buffer的比例，加入适量的Binding Buffer并在60℃水浴锅中水浴10min，至凝胶块完全溶解，其间每隔2-3min轻柔倒置一次

3)将HiBind DNA柱子套入2ml收集管

4)将凝胶混合液转移至HiBind DNA柱子中，10000xg/min离心1min

5)弃虑液，将柱子重新装回收集管中(HiBind柱一次能装700μl溶液)，重复4～5步骤。

6)把柱子重新装回收集管，加入300μl Bind Buffer，10000xg/min离心1min，弃虑液

7)把柱子重新装回收集管，加入700μl SPW Wash Buffer，10000xg/min离心1皿，弃底液(SPW Wash Buffer先用无水乙醇进行稀释)

8)重复步骤8一次

9)弃滤液，把柱子重新撞毁收集管，13000xg空转离心2min

10)将柱子重新装在灭菌的1.5ml EP管中，加入40μl经65℃水浴浴热的ElutionBuffer，室温静置2min，13000xg/min离心2min洗脱出DNA，再进行凝胶电泳，点上Maker，分析提纯的DNA的完整性与浓度，检测后送成都擎科科技股份有限公司测序。

相较于野生型Nip，(如图13-15所示)3个独立转基因阳性株系均表现棕色颖壳的突变突变表型。与阴性对照对比发现，3个转基因植株在OsBG1基因的CDS编码区分别发生了单碱基突变(见SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.5)。经OsBG1基因的敲除实验，说明OsBG1基因是控制颖壳颜色改变的基因，也证明OsBG1是控制突变体bg1棕色颖壳表型的基因。

7、采用实施例2中所述的方法，对转基因敲除株系KO-1、KO-2、KO-3和对照品种日本晴进行花青素含量的测定。

结果发现敲除株系KO-1、KO-2、KO-3和突变体bg1的一样具有颖壳颜色由黄色变成棕色的突变表型，与对照Nip相比，敲除OsBG1基因的转基因株系KO-1、KO-2、KO-3花青素含量显著低于阴性对照日本晴(Nip)，说明对OsBG1基因其它CDS编码区(相对突变体bg1突变位点而言)进行编辑(包括进行一个或几个添加、替换和缺失)同样可以获得突变体bg1棕色颖壳的突变表型，说明OsBG1基因是调控水稻花青素合成的相关基因，将该基因敲除后可以使水稻颖壳花青素(花色苷)含量减少，影响其颖壳颜色的改变。

实施例5

本实施例进行棕色颖壳突变体bg1与野生型宜香1B的光合色素的测定。

为了确定突变体的棕色颖壳的产生和籽粒变小是否与植株叶片中的光合速率有关，分别对幼苗期和开花灌浆期bg1与YX1B的叶绿素a与叶绿素b进行光合色素的测定，结果发现幼苗期两者没有明显的差异，而开花灌浆期时，bg1中的光合作用的主要色素叶绿素a显著低于同时期的YX1B。在检测了光合速率时发现，野生型YX1B的光合作用明显高于突变体bg1。因此，本申请认为籽粒变小可能是由于bg1的光合作用减弱导致灌浆不足引起的。

附图1～16的详细说明：

如图1-3所示：在整个生长发育周期，对突变体bg1和野生型YX1B进行表型观察，发现主要区别在于：突变体bg1在抽穗后约两周，穗部颖壳上开始出现针状棕色色素。至破口期后，整个小穗出现片状浅棕色色斑，随着发育进程，颖壳上的颜色逐渐变为深棕色并延展到整个穗部，并且颖果会出现空粒不结实现象；

如图5-7所示：为了确定突变体的棕色颖壳的产生和籽粒变小是否与植株叶片中的光合速率有关，分别对幼苗期和开花灌浆期bg1与YX1B的叶绿素a与叶绿素b进行光合色素的测定，结果发现幼穗期两者没有明显的差异，而蜡熟期期时，bg1中的光合作用的主要色素叶绿素a显著低于同时期的YX1B，同时突变体bg1的花青素也显著定于野生型YX1B；

如图4、8-11所示：以突变体bg1与02428构建的F₂分离群体作为基因定位群体，同时利用显性单株和隐性单株各10株构建显池和隐池，利用本实验室现有的456对SSR引物进行初筛，将bg1基因定位于一号染色体长臂端1-20～1-21之间(图4)，后续通过基因重测序发现基因为LOC_Os01g67220编码区第5个外显子中的671位碱基由C变成T，导致第234位氨基酸由甘氨酸变为了缬氨酸(图8-11)；

如图12-15所示：为了验证LOC_Os01g67220为bg1的致病基因，特在突变位点前25bp处设计一个敲除靶位点(图12)粳稻品种NIP为背景进行遗传转化，并对获得的转基因株系进行阳性鉴定。经观察发现：抽穗期2-3天后敲除阳性株系的颖壳呈现出棕色斑点(图13-15)；

如图16所示：为了研究bg1与YX1B基因表达是否存在差异，本发明选取了病斑出现前后的相应组织材料进行转录组测定，其结果显示一共有1343个基因上调和1275个基因下调(图16-1)。通过对病斑前后的YX1B和bg1进行两两比较后发现一共有13个基因同时发生了改变(图16-2)。对差异基因通过Go富集分析显示，差异基因主要集中于糖类的积累代谢，脂膜的损伤，植物信号传导等生物生长发育进程。同时对差异转录因子(FC＞2，p＜0.05)进行分析，绝大部分的差异转录因子都富集MBW(MYB-bHTH-WD40)模块(其中MYB转录因子家族占据20.47％，bHLH转录因子家族占据18.64％)(图16-3、图16-4)。MBW调控模块在植物生长发育以及应对胁迫都具有重要作用。

(1)本发明一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白，将其命名为OsBG1，通过基因编辑敲除OsBG1蛋白的编码基因能够获得使水稻黄色颖壳变为棕色的基因，可用于三系杂交制种中筛选杂合或纯合杂交种。

(2)本发明一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白的编码基因，可编码相关蛋白OsBG1，通过基因编辑敲除OsBG1的编码基因后可获得深棕色颖壳的水稻品种，可用三系杂交制种中筛选杂合或纯合杂交种，并且，OsBG1的编码基因在控制水稻颖壳色彩领域中的应用为本发明首次提出。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白及其编码基因

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 483

<212> PRT

<213> 1(人工序列)

<400> 1

Met Gly Ser Thr Gly Arg Asp Ala Glu Val Thr Arg Gly Asp Phe Pro

1 5 10 15

Asp Gly Phe Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Tyr Gln Ile Glu Gly

20 25 30

Ala Arg Arg Glu Gly Gly Lys Gly Asp Asn Ile Trp Asp Val Phe Thr

35 40 45

Glu Asn Lys Glu Arg Ile Leu Asp Gly Ser Ser Gly Glu Val Ala Val

50 55 60

Asp His Tyr His Arg Tyr Lys Glu Asp Ile Glu Leu Met Ala Ser Leu

65 70 75 80

Gly Phe Arg Ala Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Pro Arg Ile Phe Pro

85 90 95

Asp Gly Leu Gly Lys Asn Val Asn Glu Gln Gly Val Ala Phe Tyr Asn

100 105 110

Asp Leu Ile Asn Phe Met Ile Glu Lys Gly Ile Glu Pro Tyr Ala Thr

115 120 125

Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro His Asn Leu Gln Gln Thr Val Gly Gly

130 135 140

Trp Leu Ser Asp Lys Ile Val Glu Tyr Phe Ala Leu Tyr Ala Glu Ala

145 150 155 160

Cys Phe Ala Asn Phe Gly Asp Arg Val Lys His Trp Ile Thr Ile Asn

165 170 175

Glu Pro Leu Gln Thr Ala Val Asn Gly Tyr Gly Ile Gly His Phe Ala

180 185 190

Pro Gly Gly Cys Glu Gly Glu Thr Ala Arg Cys Tyr Leu Ala Ala His

195 200 205

Tyr Gln Ile Leu Ala His Ala Ala Ala Val Asp Val Tyr Arg Arg Lys

210 215 220

Phe Lys Ala Val Gln Gly Gly Glu Val Gly Leu Val Val Asp Cys Glu

225 230 235 240

Trp Ala Glu Pro Phe Ser Glu Lys Thr Glu Asp Gln Val Ala Ala Glu

245 250 255

Arg Arg Leu Asp Phe Gln Leu Gly Trp Tyr Leu Asp Pro Ile Tyr Phe

260 265 270

Gly Asp Tyr Pro Glu Ser Met Arg Gln Arg Leu Gly Asp Asp Leu Pro

275 280 285

Thr Phe Ser Glu Lys Asp Lys Glu Phe Ile Arg Asn Lys Ile Asp Phe

290 295 300

Val Gly Ile Asn His Tyr Thr Ser Arg Phe Ile Ala His His Gln Asp

305 310 315 320

Pro Glu Asp Ile Tyr Phe Tyr Arg Val Gln Gln Val Glu Arg Ile Glu

325 330 335

Lys Trp Asn Thr Gly Glu Lys Ile Gly Glu Arg Ala Ser Ser Glu Trp

340 345 350

Leu Phe Ile Val Pro Trp Gly Leu Arg Lys Leu Leu Asn Tyr Ala Ala

355 360 365

Lys Arg Tyr Gly Asn Pro Val Tyr Tyr Val Thr Glu Asn Gly Met Asp

370 375 380

Glu Glu Asp Asp Gln Ser Ala Thr Leu Asp Gln Val Leu Asn Asp Thr

385 390 395 400

Thr Arg Val Gly Tyr Phe Lys Gly Tyr Leu Ala Ser Val Ala Gln Ala

405 410 415

Ile Lys Asp Gly Ala Asp Val Arg Gly Tyr Phe Ala Trp Ser Phe Leu

420 425 430

Asp Asn Phe Glu Trp Ala Met Gly Tyr Thr Lys Arg Phe Gly Ile Val

435 440 445

Tyr Val Asp Tyr Lys Asn Gly Leu Ser Arg His Pro Lys Ala Ser Ala

450 455 460

Arg Trp Phe Ser Arg Phe Leu Lys Gly Asp Asp Ala Glu Asn Lys Ala

465 470 475 480

Asp Met Asn

<210> 2

<211> 1452

<212> DNA

<213> 2(人工序列)

<400> 2

atggggagca cggggcgcga cgcggaggtg acccgcggcg acttccccga cggcttcgtc 60

ttcggcgtcg ccacctccgc ttaccagatt gaaggggcga gacgggaggg aggcaaagga 120

gataacatat gggatgtttt cacagaaaac aaagaacgta tcttagatgg gagcagtgga 180

gaagttgcag ttgatcatta ccatcgatac aaggaagaca ttgaactcat ggccagtttg 240

ggtttccgtg cttatagatt ttctatatct tggccacgca tatttcctga tggcctgggg 300

aaaaatgtca atgagcaagg agttgccttt tataatgacc ttataaattt catgattgag 360

aaaggtattg agccatacgc aactctgtat cattgggatc ttccacataa tcttcagcag 420

actgtgggtg gttggctttc tgataagatc gtggagtact ttgcactgta tgcagaagct 480

tgctttgcaa attttggaga cagagtaaag cattggataa caatcaatga gcctcttcaa 540

actgcagtta atggttacgg aattggacat tttgcacctg gaggatgtga aggggaaact 600

gctagatgct acttggccgc ccactaccaa atcttggctc atgctgctgc tgttgatgtt 660

tacagaagga aatttaaggc tgtgcaaggt ggtgaagtag gcttggttgt cgattgtgaa 720

tgggcagagc cattttcaga gaaaacagaa gatcaggttg ctgcagaacg aaggcttgac 780

tttcagctag gatggtacct ggacccaata tatttcggtg attacccaga aagtatgcgt 840

cagcgactgg gcgatgatct tccaaccttc tcggagaaag ataaagaatt tatcaggaac 900

aaaattgact ttgttggaat aaatcaatat acttcaagat tcattgctca tcatcaggat 960

ccagaagata tttattttta ccgagtacaa caagtggaga gaatagaaaa atggaacact 1020

ggtgaaaaaa ttggtgaaag ggccgcatct gagtggcttt tcatagttcc ttggggcctc 1080

cggaaattac ttaattatgc agcaaagaga tatggaaatc ctgtgatata tgtaactgag 1140

aatggcatgg atgaggaaga tgatcaatcg gcaacgcttg accaagtctt gaatgatacg 1200

acgagggttg gttacttcat aggatacctc gcgtcagttg cacaagcaat caaggatggt 1260

gctgatgttc gtgggtactt cgcatggtcg ttcctggaca acttcgagtg ggctatggga 1320

tacaccaaga ggtttggcat tgtttatgtt gattacaaaa atgggctttc ccggcatccc 1380

aaagcatcgg cccggtggtt ctcgcgcttc ttaaagggcg atgacgctga gaacaaagct 1440

gacatgaact ag 1452

<210> 3

<211> 1451

<212> DNA

<213> 3(人工序列)

<400> 3

atggggagca cggggcgcga cgcggaggtg acccgcggcg acttccccga cggcttcgtc 60

ttcggcgtcg ccacctccgc ttaccagatt gaaggggcga gacgggaggg aggcaaagga 120

gataacatat gggatgtttt cacagaaaac aaagaacgta tcttagatgg gagcagtgga 180

gaagttgcag ttgatcatta ccatcgatac aaggaagaca ttgaactcat ggccagtttg 240

ggtttccgtg cttatagatt ttctatatct tggccacgca tatttcctga tggcctgggg 300

aaaaatgtca atgagcaagg agttgccttt tataatgacc ttataaattt catgattgag 360

aaaggtattg agccatacgc aactctgtat cattgggatc ttccacataa tcttcagcag 420

actgtgggtg gttggctttc tgataagatc gtggagtact ttgcactgta tgcagaagct 480

tgctttgcaa attttggaga cagagtaaag cattggataa caatcaatga gcctcttcaa 540

actgcagtta atggttacgg aattggacat tttgcacctg gaggatgtga aggggaaact 600

gctagatgca cttggccgcc cactaccaaa tcttggctca tgctgctgct gttgatgttt 660

acagaaggaa atttaaggct gtgcaaggtg gtgaagtagg cttggttgtc gattgtgaat 720

gggcagagcc attttcagag aaaacagaag atcaggttgc tgcagaacga aggcttgact 780

ttcagctagg atggtacctg gacccaatat atttcggtga ttacccagaa agtatgcgtc 840

agcgactggg cgatgatctt ccaaccttct cggagaaaga taaagaattt atcaggaaca 900

aaattgactt tgttggaata aatcaatata cttcaagatt cattgctcat catcaggatc 960

cagaagatat ttatttttac cgagtacaac aagtggagag aatagaaaaa tggaacactg 1020

gtgaaaaaat tggtgaaagg gccgcatctg agtggctttt catagttcct tggggcctcc 1080

ggaaattact taattatgca gcaaagagat atggaaatcc tgtgatatat gtaactgaga 1140

atggcatgga tgaggaagat gatcaatcgg caacgcttga ccaagtcttg aatgatacga 1200

cgagggttgg ttacttcata ggatacctcg cgtcagttgc acaagcaatc aaggatggtg 1260

ctgatgttcg tgggtacttc gcatggtcgt tcctggacaa cttcgagtgg gctatgggat 1320

acaccaagag gtttggcatt gtttatgttg attacaaaaa tgggctttcc cggcatccca 1380

aagcatcggc ccggtggttc tcgcgcttct taaagggcga tgacgctgag aacaaagctg 1440

acatgaacta g 1451

<210> 4

<211> 1453

<212> DNA

<213> 4(人工序列)

<400> 4

atggggagca cggggcgcga cgcggaggtg acccgcggcg acttccccga cggcttcgtc 60

ttcggcgtcg ccacctccgc ttaccagatt gaaggggcga gacgggaggg aggcaaagga 120

gataacatat gggatgtttt cacagaaaac aaagaacgta tcttagatgg gagcagtgga 180

gaagttgcag ttgatcatta ccatcgatac aaggaagaca ttgaactcat ggccagtttg 240

ggtttccgtg cttatagatt ttctatatct tggccacgca tatttcctga tggcctgggg 300

aaaaatgtca atgagcaagg agttgccttt tataatgacc ttataaattt catgattgag 360

aaaggtattg agccatacgc aactctgtat cattgggatc ttccacataa tcttcagcag 420

actgtgggtg gttggctttc tgataagatc gtggagtact ttgcactgta tgcagaagct 480

tgctttgcaa attttggaga cagagtaaag cattggataa caatcaatga gcctcttcaa 540

actgcagtta atggttacgg aattggacat tttgcacctg gaggatgtga aggggaaact 600

gctagatgct tacttggccg cccactacca aatcttggct catgctgctg ctgttgatgt 660

ttacagaagg aaatttaagg ctgtgcaagg tggtgaagta ggcttggttg tcgattgtga 720

atgggcagag ccattttcag agaaaacaga agatcaggtt gctgcagaac gaaggcttga 780

ctttcagcta ggatggtacc tggacccaat atatttcggt gattacccag aaagtatgcg 840

tcagcgactg ggcgatgatc ttccaacctt ctcggagaaa gataaagaat ttatcaggaa 900

caaaattgac tttgttggaa taaatcaata tacttcaaga ttcattgctc atcatcagga 960

tccagaagat atttattttt accgagtaca acaagtggag agaatagaaa aatggaacac 1020

tggtgaaaaa attggtgaaa gggccgcatc tgagtggctt ttcatagttc cttggggcct 1080

ccggaaatta cttaattatg cagcaaagag atatggaaat cctgtgatat atgtaactga 1140

gaatggcatg gatgaggaag atgatcaatc ggcaacgctt gaccaagtct tgaatgatac 1200

gacgagggtt ggttacttca taggatacct cgcgtcagtt gcacaagcaa tcaaggatgg 1260

tgctgatgtt cgtgggtact tcgcatggtc gttcctggac aacttcgagt gggctatggg 1320

atacaccaag aggtttggca ttgtttatgt tgattacaaa aatgggcttt cccggcatcc 1380

caaagcatcg gcccggtggt tctcgcgctt cttaaagggc gatgacgctg agaacaaagc 1440

tgacatgaac tag 1453

<210> 5

<211> 1452

<212> DNA

<213> 5(人工序列)

<400> 5

atggggagca cggggcgcga cgcggaggtg acccgcggcg acttccccga cggcttcgtc 60

ttcggcgtcg ccacctccgc ttaccagatt gaaggggcga gacgggaggg aggcaaagga 120

gataacatat gggatgtttt cacagaaaac aaagaacgta tcttagatgg gagcagtgga 180

gaagttgcag ttgatcatta ccatcgatac aaggaagaca ttgaactcat ggccagtttg 240

ggtttccgtg cttatagatt ttctatatct tggccacgca tatttcctga tggcctgggg 300

aaaaatgtca atgagcaagg agttgccttt tataatgacc ttataaattt catgattgag 360

aaaggtattg agccatacgc aactctgtat cattgggatc ttccacataa tcttcagcag 420

actgtgggtg gttggctttc tgataagatc gtggagtact ttgcactgta tgcagaagct 480

tgctttgcaa attttggaga cagagtaaag cattggataa caatcaatga gcctcttcaa 540

actgcagtta atggttacgg aattggacat tttgcacctg gaggatgtga aggggaaact 600

gctagatgct ccttggccgc ccactaccaa atcttggctc atgctgctgc tgttgatgtt 660

tacagaagga aatttaaggc tgtgcaaggt ggtgaagtag gcttggttgt cgattgtgaa 720

tgggcagagc cattttcaga gaaaacagaa gatcaggttg ctgcagaacg aaggcttgac 780

tttcagctag gatggtacct ggacccaata tatttcggtg attacccaga aagtatgcgt 840

cagcgactgg gcgatgatct tccaaccttc tcggagaaag ataaagaatt tatcaggaac 900

aaaattgact ttgttggaat aaatcaatat acttcaagat tcattgctca tcatcaggat 960

ccagaagata tttattttta ccgagtacaa caagtggaga gaatagaaaa atggaacact 1020

ggtgaaaaaa ttggtgaaag ggccgcatct gagtggcttt tcatagttcc ttggggcctc 1080

cggaaattac ttaattatgc agcaaagaga tatggaaatc ctgtgatata tgtaactgag 1140

aatggcatgg atgaggaaga tgatcaatcg gcaacgcttg accaagtctt gaatgatacg 1200

acgagggttg gttacttcat aggatacctc gcgtcagttg cacaagcaat caaggatggt 1260

gctgatgttc gtgggtactt cgcatggtcg ttcctggaca acttcgagtg ggctatggga 1320

tacaccaaga ggtttggcat tgtttatgtt gattacaaaa atgggctttc ccggcatccc 1380

aaagcatcgg cccggtggtt ctcgcgcttc ttaaagggcg atgacgctga gaacaaagct 1440

gacatgaact ag 1452

<210> 6

<211> 1020

<212> DNA

<213> 6(人工序列)

<400> 6

atggggagca cggggcgcga cgcggaggtg acccgcggcg acttccccga cggcttcgtc 60

ttcggcgtcg ccacctccgc ttaccagatt gaaggggcga gacgggaggg aggcaaagga 120

gataacatat gggatgtttt cacagaaaac aaagaacgta tcttagatgg gagcagtgga 180

gaagttgcag ttgatcatta ccatcgatac aaggaagaca ttgaactcat ggccagtttg 240

ggtttccgtg cttatagatt ttctatatct tggccacgca tatttcctga tggcctgggg 300

aaaaatgtca atgagcaagg agttgccttt tataatgacc ttataaattt catgattgag 360

aaaggtattg agccatacgc aactctgtat cattgggatc ttccacataa tcttcagcag 420

actgtgggtg gttggctttc tgataagatc gtggagtact ttgcactgta tgcagaagct 480

tgctttgcaa attttggaga cagagtaaag cattggataa caatcaatga gcctcttcaa 540

actgcagtta atggttacgg aattggacat tttgcacctg gaggatgtga aggggaaact 600

gctagatgct acttggccgc ccactaccaa atcttggctc atgctgctgc tgttgatgtt 660

tacagaagga aatttaaggc tgtgcaaggt ggtgaagtag gcttggttgt cgattgtgaa 720

tgggcagagc cattttcaga gaaaacagaa gatcaggttg ctgcagaacg aaggcttgac 780

tttcagctag gatggtacct ggacccaata tatttcggtg attacccaga aagtatgcgt 840

cagcgactgg gcgatgatct tccaaccttc tcggagaaag ataaagaatt tatcaggaac 900

aaaattgact ttgttggaat aaatcaatat acttcaagat tcattgctca tcatcaggat 960

ccagaagata tttattttta ccgagtacaa caagtggaga gaatagaaaa atggaacact 1020

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 7(人工序列)

<400> 7

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 8(人工序列)

<400> 8

caaaatctcg atctttatcg ttcaatttta 30

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 9(人工序列)

<400> 9

aacttataaa ccgcgcgct 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 10(人工序列)

<400> 10

ttgaatattt gggcgcgcga 20

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 11(人工序列)

<400> 11

tgtgtggaaa ctgctagatg ctact 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 12(人工序列)

<400> 12

aaacagtagc atctagcagt ttcca 25

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 13(人工序列)

<400> 13

cccagtcacg acgttgtaaa 20

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 14(人工序列)

<400> 14

tctccagctt tggttttt 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 15(人工序列)

<400> 15

tgggatcttc cacataat 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 16(人工序列)

<400> 16

aaccaagcct acttcacc 18

Claims

1.一种控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白，其特征在于，所述相关蛋白命名为OsBG1，所述相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种如权利要求1所述的控制水稻颖壳色彩性状的相关蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种如权利要求2所述的编码基因在培育棕色颖壳水稻品种和/或三系杂交制种筛选杂合中的应用。

4.一种控制水稻产生棕色颖壳的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5中的任意一项所示。

5.根据权利要求4所述的一种控制水稻产生棕色颖壳的基因，其特征在于，所述基因通过对如权利要求2所述的编码基因进行基因编辑获得，所述基因编辑通过CRISPR/CAS9系统进行，所述基因编辑采用的靶标序列的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

6.一种如权利要求4或5所述的控制水稻产生棕色颖壳的基因在三系杂交制种筛选杂合杂交种或纯合杂交种中的应用。

7.一种用于敲除如权利要求2所述的编码基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。

8.一种用于敲除如权利要求2所述的编码基因的敲除载体，其特征在于，所述敲除载体OsU6启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。

9.一种用于敲除如权利要求2所述的编码基因的靶序列，其特征在于，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示。

10.一种棕色颖壳水稻株系的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

构建含有如权利要求5中所述靶标序列的CRISPR/CAS9系统表达载体；

将所述表达载体转化到非棕色颖壳的水稻品种中；

筛选并鉴定出如权利要求2所述的编码基因被敲除的转基因纯合株系，获得棕色颖壳水稻株系。