CN110250000A - 利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法 - Google Patents

利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法，将隐性异色颖壳可育水稻材料培育成双色选遗传工程核不育系；将包含黄颖基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的四元连锁载体导入至双色选遗传工程核不育系的基因组中培育双色选遗传工程繁殖系；将双色选遗传工程繁殖系和与双色选遗传工程核不育系混植，混收全部种子；第一次荧光筛选，分离无荧光的不育系种子和发荧光的繁殖系种子；第二次颖壳颜色筛选，提纯异色颖壳不育系种子。本发明利用水稻隐性异色颖壳作为新的色选标记提高遗传工程核不育系种子在分选过程中的纯度，实现遗传工程核不育系纯度达到生产应用标准的目标。

Description

利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选 精度的方法
技术领域
本发明涉及水稻基因工程技术领域，尤其涉及利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法。
背景技术
遗传工程核不育系的本质是普通核不育水稻，因而继承了普通核不育水稻具有的育性稳定、不育彻底和易于配制高产、优质、多抗杂交组合的优点，可避免当前三系不育系配组受严格的恢保关系限制和两系不育系制种受气温波动的影响。以遗传工程核不育系为基础的第三代杂交水稻育种技术是目前最理想、最便捷、最高效的杂种优势利用方式，该技术的规模化和产业化的应用，必将全面促进我国水稻生产向优质、稳产、绿色、高效、可持续发展的方式转变，对确保我国杂交水稻技术世界领先地位具有重要意义。
遗传工程核不育系的繁殖和分选是第三代杂交水稻技术的核心技术，现已实现了遗传工程不育系种子的批量繁殖和胚乳荧光分选技术(参见专利ZL201210426678.7)，为遗传工程核不育系的产业化奠定了基础。然而，在利用现有荧光分选技术分离不育系种子的过程中，由于水稻胚乳被颖壳包裹，降低了荧光蛋白从胚乳往颖壳外散发荧光的强度，干扰了色选机的色选精度，所分选出的遗传工程不育系往往含有少数几粒带有转基因成分的繁殖系种子。由于当前公众对转基因非常敏感，国家也未放开对转基因产品的限制，如果在制种环节不育系种子中混入几粒携带转基因成分的繁殖系种子，将会导致生产出来的杂交种子中含有少数携带转基因成分的种子，从而严重阻碍第三代杂交水稻的推广和应用。
水稻正常的颖壳颜色为黄色，而黑色、褐色或红色等不同于黄色的颖壳则称为异色颖壳。如果可以通过水稻隐性异色颖壳性状作为第二色选标记，构建遗传工程核不育系的双色选分离体系，通过胚乳是否发荧光和谷壳的不同颜色这两种色选性状建立两套色选程序，可以显著提高色选精度，实现遗传工程不育系纯度达到生产应用的标准。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法，利用水稻隐性异色颖壳作为新的色选标记提高遗传工程核不育系种子在分选过程中的纯度，实现遗传工程核不育系纯度达到生产应用标准的目标。利用该方法获得的遗传工程不育系种子的颖壳颜色不同于正常水稻的黄色，能够用于机械化制种。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法，包括以下步骤：
S1、将隐性异色颖壳可育水稻材料培育成双色选遗传工程核不育系；
S2、将包含黄颖基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的四元连锁载体导入至所述S1中所述双色选遗传工程核不育系的基因组中培育双色选遗传工程繁殖系；
S3、将所述S2中所述双色选遗传工程繁殖系和与所述S1中所述双色选遗传工程核不育系混植，开花期将所述双色选遗传工程繁殖系的花粉赶到所述双色选遗传工程核不育系植株上，混收全部种子；
S4、根据胚乳是否发荧光对所述S3中混收的种子进行第一次筛选，将发荧光的黄颖遗传工程繁殖系种子和不发荧光的遗传工程核不育系种子分选出来；所述不发荧光的遗传工程核不育系种子包括异色颖壳不育系种子和黄色颖壳不育系种子，所述异色颖壳不育系种子来源于双色选遗传工程核不育系植株，所述黄色颖壳不育系种子来源于双色选遗传工程繁殖系植株；
S5、根据颖壳颜色对所述S4中不育系种子进行第二次色选，将黄色颖壳不育系种子及第一次色选过程中混入的少量黄颖遗传工程繁殖系种子分选出来，提纯异色颖壳不育系种子。
上述的方法，进一步的，所述隐性异色颖壳可育水稻材料采用以下方法培育：通过编辑水稻野生型隐性颖壳颜色控制基因培育；或，通过回交方法导入突变的隐性颖壳颜色控制基因培育。
上述的方法，进一步的，所述S1中所述隐性异色颖壳可育水稻材料的培育方法为：
S1-A1、根据OsCHI基因的cDNA序列设计靶位点接头引物Seq2和Seq 3，所述Seq2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述Seq 3的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；
S1-A2、将所述靶位点接头引物Seq2和Seq 3制成具有粘性末端的双链接头OsCHI-T1；
S1-A3、将所述双链接头OsCHI-T1与载体连接得到pU3-OsCHI-T1-gRNA重组载体；
S1-A4、将所述pU3-OsCHI-T1-gRNA重组载体连接到pCRISPR/Cas9载体得到pCas9-OsCHI-T1敲除载体；
S1-A5、将所述pCas9-OsCHI-T1敲除载体转化至水稻愈伤组织中，获得带有隐性异色颖壳的可育水稻。
上述的方法，进一步的，所述S1中所述双色选遗传工程核不育系通过编辑水稻野生型隐性雄性核不育基因获得；或，通过回交方法导入突变的隐性核不育基因获得。
上述的方法，进一步的，所述S1中所述双色选遗传工程核不育系采用以下方法获得：
S1-B1、根据PTC1基因的cDNA序列设计靶位点接头引物Seq7和Seq 8,所述Seq7的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；所述Seq 8的DNA序列如SEQ ID NO.8所示；
S1-B2、将所述靶位点接头引物Seq7和Seq 8制成具有粘性末端的双链接头PTC1-T1；
S1-B3、将所述双链接头PTC1-T1与载体连接得到pU3-PTC1-T1-gRNA重组载体；
S1-B4、将所述pU3-PTC1-T1-gRNA重组载体连接到pCRISPR/Cas9载体得到pCas9-PTC1-T1敲除载体；
S1-B5、将所述pCas9-PTC1-T1敲除载体导入带有隐性异色颖壳的可育水稻的愈伤组织中，转育成双色选遗传工程核不育系。
上述的方法，进一步的，所述S2具体为：
S2-1、设计扩增黄颖基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的引物，进行PCR扩增获得基因片段，
S2-2、将所述四个基因的基因片段构建到同一植物表达载体中得到四元连锁载体；
S2-3、将所述四元连锁载体导入到所述双色选遗传工程核不育系的基因组中获得转基因植株；
S2-4、从所述转基因植株中选择颖壳颜色恢复为黄色且后代种子中50％为荧光种子的株系，即为双色选遗传工程繁殖系。
上述的方法，进一步的，所述黄颖基因为OsCHI、OsCAD2或IBF1；
所述育性恢复基因为PTC1、EAT1、TDR或CYP704B2；
所述花粉失活基因为ZMAA；
所述荧光标记基因为DsRed。
上述的方法，进一步的，所述黄颖基因为OsCHI，扩增所述OsCHI基因的引物为CHI-F和CHI-R，所述CHI-F的DNA序列如SEQ ID NO.19所示；所述CHI-R的DNA序列如SEQ IDNO.20所示；
所述育性恢复基因为PTC1基因，扩增所述PTC1基因的引物为PTC1-F和PTC1-R，所述PTC1-F的DNA序列如SEQ ID NO.21所示；所述PTC1-R的DNA序列如SEQ ID NO.22所示；
扩增所述ZMAA基因的引物为ZMAA-F和ZMAA-R，所述ZMAA-F的DNA序列如SEQ IDNO.23所示；所述ZMAA-R的DNA序列如SEQ ID NO.24所示；
扩增所述DsRed基因的引物为DsRed-F和DsRed-R，所述DsRed-F的DNA序列如SEQID NO.25所示；所述DsRed-R的DNA序列如SEQ ID NO.26所示。
上述的方法，进一步的，所述S4中经第一次荧光筛选获得的黄颖遗传工程繁殖系种子继续用于下一代不育系的繁殖。
上述的方法，进一步的，所述S5中经第二次颖壳筛选获得的黄色颖壳不育系种子继续用于下一代不育系的繁殖。
上述的方法，进一步的，所述S5中经第二次颖壳筛选提纯的异色颖壳不育系种子与黄颖恢复系进行机械化制种。
上述方法中，所述OsCHI、OsCAD2、IBF1、PTC1、EAT1、TDR和CYP704B2的基因组DNA序列和cDNA序列可从“国家水稻数据中心”下载获得，对应的登录号分别为Os03g0819600、Os02g0187800、Os09g0292900、Os09g0449000、Os04g0599300、Os02g0120500和Os03g0168600。
与现有的技术相比，本发明的有益技术效果是：
(1)本发明提供了一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法，在已有遗传工程核不育系种子的胚乳荧光蛋白色选方法的基础之上，利用更加直观的水稻隐性异色颖壳性状作为第二色选标记，构建遗传工程核不育系的双色选分离体系，通过胚乳是否发荧光和谷壳的不同颜色这两种色选性状建立两套色选程序，彻底解决现有遗传工程核不育系种子在利用荧光分选过程中色选精度不够的技术难题。利用简单可控的异色颖壳性状色选分离遗传工程核不育系种子更直观和彻底，能显著提高不育系种子纯度，使所繁殖的不育系种子不含携带转基因成分的繁殖系种子。
(2)本发明提供了一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法，由于遗传工程不育系种子的颖壳颜色不同于正常恢复系水稻的黄色，可用于机械化杂交制种，为第三代杂交水稻实现机械化“混播混收”的制种模式提供了便利，可以大幅提高第三代杂交水稻的制种效率和效益，并有效降低种子生产成本和直接提高农民种植杂交水稻的积极性。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中利用红色颖壳性状提高遗传工程核不育系繁殖后种子纯度的技术流程图。
图2为本发明实施例1中pCas9-OsCHI-T1敲除载体的结构图。
图3为本发明实施例1中pCas9-PTC1-T1敲除载体的结构图。
图4为本发明实施例1中红颖双色选遗传工程核不育系的外观。a为红颖双色选遗传工程核不育系的植株；b为红颖双色选遗传工程核不育系的颖壳颜色。
图5为本发明实施例1中四元连锁载体pCDPZ的结构图。
图6为本发明实施例1中双色选遗传工程繁殖系的外观图。a为双色选遗传工程繁殖系，颍壳颜色转换成黄色；b为双色选遗传工程繁殖系自交后产生的黄色颍壳种子，其中约有一半为不发荧光的不育系，一半为发荧光的繁殖系。
图7为本发明实施例1中色选效果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法，应用的具体对象为OsCHI突变的红色颖壳和PTC1基因突变的遗传工程核不育系水稻，具体流程参见图1，具体包括以下步骤：
(1)隐性红色颖壳水稻的培育：
1.1、水稻OsCHI基因编码查尔酮异构酶，它的突变将导致隐性红色颖壳性状的表型。OsCHI基因cDNA序列(Seq1)来源水稻，DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
根据OsCHI基因的cDNA序列(Seq1)设计靶位点并合成靶位点接头引物：Seq2和Seq3。
Seq2(SEQ ID NO.2):ggcacggcgtcgtgttcccgccgg。
Seq3(SEQ ID NO.3):aaacccggcgggaacacgacgccg。
1.2、构建CRISPR/Cas9-OsCHI敲除载体：
将步骤1.1中互补配对的两条核苷酸单链Seq2和Seq3等量混合后，经过90℃变性3min和20℃退火5min后形成具有粘性末端的双链接头OsCHI-T1。用BsaI酶切环状pU3-gRNA载体，然后与双链接头OsCHI-T1连接，得到重组的guide-RNA中间表达盒：pU3-OsCHI-T1-gRNA。将pU3-OsCHI-T1-gRNA经BsaI酶切后，连接到pCRISPR/Cas9载体上构建成pCas9-OsCHI-T1敲除载体。pCas9-OsCHI-T1敲除载体的结构参见图2。
1.3、采用农杆菌介导的遗传转化方法将pCas9-OsCHI-T1敲除载体转化R299的胚性愈伤组织并通过愈伤的分化获得18株T0代转基因植株。提取18株T0代转基因植株的DNA，经PCR检测潮霉素基因，获得7株转基因阳性植株。
1.4、根据OsCHI基因靶位点的位置设计突变位点检测引物Seq4和Seq5：
Seq4(SEQ ID NO.4):tgtctccacgttttcttggatagttagttgct；
Seq5(SEQ ID NO.5):ttcagagatggaacggaagaacagccgc。
以7株步骤1.3的转基因阳性植株DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物。扩增体系包括：10μl PCR Mix，正向和反向引物各0.2μl，DNA模板1μl，补充8.6μl ddH2O至总体积20μl。扩增程序：①98℃预变性3min；②30循环(98℃10s，65℃30s，72℃30s)；③最后延伸72℃1min；④4℃保存。
将扩增产物送测序公司测序。测序结果显示7个阳性植株中有5个株系打靶成功，5个打靶成功的株系种子的颖壳的颜色为红色，即为隐性红色颖壳水稻。
(2)红颖双色选遗传工程核不育系的培育
2.1、水稻PTC1基因编码PHD锌指蛋白，是调控绒毡层发育和花粉形成的关键基因。PTC1基因发生突变，将导致水稻花粉败育，产生一种遗传工程核不育系。根据PTC1基因的cDNA序列(Seq6)设计双靶位点并合成靶位点接头引物Seq7和Seq8。
Seq6：PTC1基因cDNA序列来源水稻，DNA序列如SEQ ID NO.6所示。
Seq7(SEQ ID NO.7):ggcacatggtggtcaccaagtacc。
Seq8(SEQ ID NO.8):aaacggtacttggtgaccaccatg。
2.2、构建CRISPR/Cas9-PTC1敲除载体：
将步骤2.1中互补配对的两条核苷酸单链Seq7和Seq8等量混合后，经过90℃变性3min和20℃退火5min后形成具有粘性末端的双链接头PTC1-T1。用BsaI酶切环状pU6a-gRNA载体，然后与双链接头PTC1-T1连接，得到重组的guide-RNA中间表达盒：pU3-PTC1-T1-gRNA。将pU3-PTC1-T1-gRNA经BsaI酶切后，连接到pCRISPR/Cas9载体上构建成pCas9-PTC1-T1敲除载体，Cas9-PTC1-T1敲除载体的结构参见图3。
2.3、采用农杆菌介导的方法将pCas9-PTC1-T1敲除载体转化步骤1所培育的隐性红色颖壳水稻的胚性愈伤组织并通过愈伤的分化获得23株T0代转基因植株(农杆菌介导的遗传转化方法参照Hiei等(1997)的方法)。提取23株T0代转基因植株的DNA，经PCR检测潮霉素基因，获得11株转基因阳性植株。
2.4、根据PTC1基因靶位点的位置设计突变位点检测引物Seq9和Seq10，
Seq9(SEQ ID NO.9):cctccgacatgatgccccggtagtccat；
Seq10(SEQ ID NO.10):gagctccccatggtggtcaccaagtaccag。
以步骤2.3中11株阳性株DNA为模板，以Seq9和Seq10为引物进行PCR扩增得到扩增产物。扩增体系包括：10μl PCR Mix，正向和反向引物各0.2μl，DNA模板1μl，补充8.6μlddH2O至总体积20μl。扩增程序：①98℃预变性3min；②30循环(98℃10s，65℃30s，72℃30s)；③最后延伸72℃1min；④4℃保存。
将扩增产物送测序公司测序。测序结果显示11个阳性植株中有8个株系为纯合突变且不能正常结实，为所需要的红颖双色选遗传工程核不育系。图4中，a为红颖双色选遗传工程核不育系的植株；b为红颖双色选遗传工程核不育系的颖壳颜色。
(3)双色选遗传工程繁殖系的创制
3.1、设计引物分别扩增OsCHI基因(SEQ ID NO.11)表达框(包括OsCHI基因自身启动子序列、编码区基因组序列和终止子序列)、育性恢复基因PTC1(SEQ ID NO.12)表达框(包括PTC1基因自身启动子序列、编码区基因组序列和终止子序列)、花粉失活基因ZMAA表达框(包括Pg47启动子(SEQ ID NO.13)、ZMAA基因cDNA序列(SEQ ID NO.14)、IN2-1终止子(SEQ ID NO.15))和荧光标记基因DsRed的表达框(包括ltp启动子序列(SEQ ID NO.16)、DsRed基因cDNA序列(SEQ ID NO.17)、PINII终止子(SEQ ID NO.18))
扩增OsCHI基因的引物对：
CHI-F(SEQ ID NO.19):gcgttagatcggaagtggccagatttatcggattgc；
CHI-R(SEQ ID NO.20):gctccagttgggccggaccatattagcagaaacag。
扩增PTC1基因的引物对：
PTC1-F(SEQ ID NO.21):gtcatgcattcagccgtcagaaaggctcaga；
PTC1-R(SEQ ID NO.22):gcatgtggactgtggaggtggccagtaatt。
扩增ZMAA基因的引物对：
ZM AA-F(SEQ ID NO.23):ggcataccagacagtccggtgtgccagatca；
ZMAA-R(SEQ ID NO.24):ggagatataggggaaagagaacgctgatgtgacaagtgagt。
扩增DsRed基因的引物对：
DsRed-F(SEQ ID NO.25):aaaccgtctcttcgtgagaataaccgtggcct；
DsRed-R(SEQ ID NO.26):ggccgcattcgcaaaacacacctagactagat。
扩增体系包括：10μl PCR Mix，正向和反向引物各0.2μl，DNA模板1μl，补充8.6μlddH2O至总体积20μl。扩增程序：①98℃预变性3min；②30循环(98℃10s，65℃30s，72℃3-5min)；③最后延伸72℃1min；④4℃保存。
3.2、将OsCHI基因、PTC1基因、ZMAA基因、DsRed基因片段逐步连接到植物表达载体pCAMBIA1300上，形成四元连锁载体：pCDPZ载体。图5为载体的结构图。
3.3、利用农杆菌介导的遗传转化方法，将pCDPZ载体转化红颖双色选遗传工程核不育系的愈伤组织并通过愈伤的分化获得15株T0代转基因植株，经PCR检测有12株T0代阳性转基因植株。
3.4、将12株T0代阳性转基因植株移栽至大田，于开花期观察花粉育性、收获期调查结实率和观察颖壳颜色，12株阳性植株当中有3株花粉可育率为50％、结实率恢复正常且颖壳颜色恢复为黄色的株系，这样的株系即双色选遗传工程繁殖系。
(4)遗传工程核不育系种子的繁殖与分选：
将步骤(3)选育的双色选遗传工程繁殖系和步骤(2)培育的红颖双色选遗传工程核不育系种子按照2:8的比例混植200株，开花期利用小型四旋翼飞机将繁殖系花粉赶到不育系植株，待种子成熟后混收所有的种子约5.11kg。将色选机调至荧光色选模式对混收的5.11kg种子进行第一次筛选，分离胚乳发荧光的繁殖系种子0.95kg和胚乳无荧光的不育系种子4.16kg。其中发荧光的繁殖系种子为黄色颖壳来源于原繁殖系植株，可继续用作繁殖系。不发荧光的不育系种子含有红色颖壳和黄色颖壳两种颜色的种子，红颖不育系种子来源于原不育系植株，黄颖不育系种子来源于原繁殖系植株。利用颖壳颜色对含有两种颖壳颜色的不育系种子进行第二次筛选，将黄颖不育系种子及混入的少量黄颖繁殖系种子筛选出来，只余下3.17kg红色颖壳的遗传工程核不育系种子。
图6为本发明实施例1中双色选遗传工程繁殖系的外观图。a为双色选遗传工程繁殖系，颍壳颜色转换成黄色；b为双色选遗传工程繁殖系自交后产生的黄色颍壳种子，其中约有一半为不发荧光的不育系，一半为发荧光的繁殖系。
(5)红颖遗传工程核不育系在混播制种中的应用：
将步骤(4)提纯的红颖双色选遗传工程核不育系种子与黄颖恢复系R299按照2:8的比例混植0.1亩，开花期利用小型四旋翼飞机将繁殖系花粉赶到不育系植株，待种子成熟后混收所有的种子。图7为本发明实施例1中色选效果图。
利用安科公司设计的CF1种子色选机，选择“灰度杂质A-红选亮”模式进行种子分选出，从杂物口收集恢复系植株繁殖的黄颖恢复系的种子，从净样口收集红颖遗传工程核不育系植株所结出的红颖杂交种子，其一次色选率达到了99.83％，经对净样口出来的红颖杂交种子进行二次色选后将不再掺杂黄颖恢复系种子，其色选率达到了100％，符合商业用种子的纯度要求。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南杂交水稻研究中心
<120> 利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 水稻(rice)
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tgcggcggcg gcccgacccc gccctccagc ggtggcggca gcggcgtcgc ctccatcata 240
tcgccctcgc tcttcgacca gatgctgctc caccgcaacg accaggcgtg cgccgctaag 300
ggcttctaca cctacgacgc cttcgtcgcc gccgccaacg cctacccgga cttcgccacc 360
accggcgacg ccgacacctg caagcgcgag gtcgccgcct tcctggcgca gacgtcccac 420
gagaccaccg gcggctggcc cacggcgccc gacggcccct actcctgggg ctactgcttc 480
aaggaggaga acaacggcaa cgcccccaca tactgcgagc ccaagccgga gtggccgtgc 540
gccgccggca agaagtacta cggccgggga cccatccaga tcacctacaa ctacaactac 600
ggcccggcgg ggcaggccat cggctccgac ctgctcaaca acccggacct ggtggcgtcg 660
gacgccaccg tctccttcaa gacggcgttc tggttctgga tgacgccgca gtcgcccaag 720
ccgtcgtgcc acgcggtgat caccggccag tggacgccgt ccgccgacga ccaggcggcg 780
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cacggcgcgg acgacaaggt ggccgaccgg atcgggttct acaagcgcta ctgcgacatg 900
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 根据OsCHI基因的cDNA序列设计靶位点并合成的靶位点接头引物
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<220>
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<222> (1)..(30)
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gagctcccca tggtggtcac caagtaccag 30
<210> 11
<211> 4269
<212> DNA
<213> 水稻(rice)
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<212> DNA
<213> 水稻(rice)
<400> 12
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gcaccctgct tattcccctt atcaaaacac tagcaactaa tttatcagta caggctagat 2160
atcattattc aaaatcgcaa caagtatggt atactcacat taccaaaact tgccatactt 2220
catttagcta acatgtctaa catgtggcca acaaaattaa agccacactt tagccatagg 2280
agagtaaact tgccacactt ttatgtgcca atgacatgta ggacccacat catggtgaag 2340
gaatcttgtt aaaagtgtgg caccaaccaa acgaatgcct aactaagtca aacctggcta 2400
acttgagttg tggcatgatg aggcaaattg tggtagtgaa ccaaacaacc ccttaatatc 2460
tacttcctcc gtttcaggtt ataagacttc attgcctaca ttcatataga tgttaacgaa 2520
tctagacaca tttatataaa tgtgtctaga ttcgttaaca tctatatgaa tgtatataaa 2580
tgtgtctaga ttcgttaaac atctatatga atgtgggcaa tactagaaat tcttataacc 2640
tgaaatggat gtagtactag attgtgtaac aattcagata gctagtgcaa ttggtgattg 2700
attaatttta cagtccttat gtatttggag gtatcataat cttaagtgtt aatttgtgat 2760
acctcctggt cctcaacact agagagatac taagtggtaa cactgcaaaa tgtggcatct 2820
cctggtacct tttaagtacc aaatgcacta ggtgcctttg cgcaaaattc ccagatgaga 2880
ggacccaatt tgtgatcgtg tgcgacatgt ctagaagggt ggcccattgt ttacattcct 2940
tcaccagatc gccgaagctt tctaaatcgc gggcacttaa cgcgtgagaa gcccaatgag 3000
acctccaaat gctaacctta aaatcgcagc gctgcacggc gacatggtct cctagctagc 3060
tgcctagctt ctcggcgacg ttgattggca gcaactagct agctcgccgt ccggccggcc 3120
ggccatggcg cctaagatgg tgatcagcct ggggagctcg cggcggcgga agcgcggcga 3180
gatgctgttc cggttcgagg ccttctgcca gcccggctac ccggcgaact tcgccggcgc 3240
cggcggcttc agggacaacg tgaggacgct gctcggcttc gcgcacctgg aggccggcgt 3300
ccacggcgag accaagtgct ggtcgttcca gctcgagctg caccgccacc cccccaccgt 3360
cgtgaggctc ttcgtcgtcg aggaggaggt cgccgcctcg ccgcaccgcc agtgccacct 3420
ctgccgccat attggtccgt cgaacaaact acaattaatc aatcaacctt tacataggat 3480
tgatccgatc gatgccatgg tgttgtaggg tgggggaggc atctgatatg cagcaagagg 3540
tatcacttct tgctgccgag gagggaatcg gcggcggaag ccgacggcct gtgcttcgcg 3600
atcaaccacg gcggcggcgg tggcgcggag aaagcgtcgt cgaaagggac gacgacgacg 3660
gcctccagca gaggccacct gctacacggc gtcgtgcacc tcaacggcta cggccacctc 3720
gtcgccctcc acggcctcga gggcggctcc gacttcgtct ccggccacca gatcatggac 3780
ctctgggacc gcatttgctc agccttgcac gtaaggtagt agtagtatac atgtgcgtgt 3840
gcatgcatgc aagcaatgca acgatgtcgg gctgcgtgtg agaacatttg cttgggcatg 3900
gtgtggtgta tgcaaggacg gtgagcctgg tggacacggc gaggaagggc cacatggagc 3960
tgaggctgct gcacggcgtc gcgtacggcg agacgtggtt cgggcggtgg gggtacaggt 4020
acggccggcc gagctacggc gtcgcgctgc cgtcgtaccg gcagtcgctg cacgtgctcg 4080
gctccatgcc gctctgcgtg ctggtgccgc acctgtcgtg cttcagccag gagctcccca 4140
tggtggtcac caagtaccag gccatcagcg gccacaagct gctcagcctc ggcgacctcc 4200
tccgcttcat gctcgagctg cgcgcccgcc tgccggccac ctccgtcacg gccatggact 4260
accggggcat catgtcggag gcctcgtgcc ggtggtcggc gaagcgcgtc gacatggcgg 4320
cgcgcgccgt cgtggacgcg ctccgccgcg ccgagccggc ggcgcggtgg gtcacgcggc 4380
aggaggtgcg cgacgcggcg cgcgcctaca tcggcgacac gggcctcctc gacttcgtgc 4440
tcaagtccct cggcaaccac atcgtcggca actacgtcgt gcgccgcacc atgaacccgg 4500
tgaccaaggt gctcgagtac tgcctcgagg acgtctccag cgtgctcccg gcggtcgccg 4560
ccggcggcgg cgtgccggcg cagggcaaga tgagggtgag gttccagctc acgcgtgcgc 4620
agctcatgag ggacctggtg cacctgtacc ggcacgtgct caaggagccc agccaggcgc 4680
tcaccggcgg cgcgttcggc gcgatcccgg tggcggtgcg gatggtcctg gacatcaagc 4740
acttcgtcaa agattaccac gaaggacaag ccgcggcgag cagcaatggc ggtggcggat 4800
tcgggcatcc ccacatcaac ctgtgctgca cgctgctcgt gagcaacggg agcccggagc 4860
tagctccacc gtacgagacg gtgaccctgc cggcgcacgc gacggtgggc gagctgaagt 4920
gggaggcgca gagggtgttc agcgagatgt acctcggcct gaggagcttc gcggcggact 4980
ccgtcgtcgg ggtcggcgcc gaccaggagg gcctcccggt gctcgggctg gtcgacgtcg 5040
gaagcgccgt cgtggtgcaa gggagcgtgg gcgagcagat aaacggggag gaccacgaga 5100
ggaaggagga ggcggcggcg gcggccgtgt gcgaggggag cggcggcggc gagcgcgtcg 5160
tggactgcgc gtgcggcgcg gtggacgacg acggcgagcg catggcgtgc tgcgacatct 5220
gcgaggcgtg gcagcacacg cggtgcgccg ggatcgcgga caccgaggac gcgccgcacg 5280
tcttcctctg cagccggtgc gacaacgacg tcgtgtcgtt cccgtccttc aactgttaga 5340
tgtgatgctg ctgctgctac tgctactact actgcctctg ctgctatata tgatgctacc 5400
tagtacaagt gatcgagaat tcaatttgtt ttctcggcaa aaccaaaatg aaaacgaagg 5460
taaaaccaag tgaacttcag atcaattcag acttctcaac tttcctccca agagaaaaaa 5520
aagaatatga aaaaccatcg agcccactta atgtgggccg gtgtttgttt attccagccc 5580
aggaggatcc atggttagaa tcacccaatc aggccaggag cccaggacaa catcttctaa 5640
caaatgggtc tcctagaggt gaattacggc tataccatga tgggctgggc cgtgaccatg 5700
taacctacct gaaatgaggt gcccatgaat tttattgctt ccaagttcaa ctcatcttca 5760
taagatagtt ttcttcaact gtgtgattat tatgtcagtg gcttagagca ggagaggctt 5820
gatgaccagc ttaagggttg cacctaatgt ctaatgacta agttaagtac ctatcaggta 5880
acagtgctac taaactggca agtgaccacc aaaagatgag ctattcacat ggcctgcttg 5940
gaggggccca cttggtggtg tcatgaaagg ccttttagga aaggggcttc cctacactgt 6000
ggacactgct gctgctacta ctatcctatt cctactccac gtttgcatgc atccatggga 6060
gaagggagaa gctagccatg gtttctggtt ggaagcatcc aactaacatc ctgaatgatt 6120
catgtctagc tttgatggca agaaacatgc tttagcccac caacgcaaaa gctaaactga 6180
acctgcaaca atgtgctccc catcgtgctt gcacgcttaa ttacctttca gatgcttgag 6240
atttgagatc ctcactttct ttccttactg ttagaacagt gaacagatca ttctccattt 6300
tatctcttcc aaaagccaag tggctgctga gtagtgatta gcaagaaggt agaaatttca 6360
gtagaaaaag ggactagtac atagtgacat actgcacact ttgaccattg caacagcaaa 6420
gaagtgggaa ttgttctgaa gaagaacaaa gcaagaagaa acaaatgact tatcattgaa 6480
gcaatgaaaa gagagggagg aaagttgttt tgcttttatc tctctcactg tcactctctc 6540
tgccagtaga gggactccat ttgtcctgtg tccctagtga gacaacctag ctagcctttt 6600
cttttcccct ctctctttct gttcttttgc agttttgcat tgcaaggact gaaggccccc 6660
tttgttaggg ctctttcact caccctgatg agatgcctgt ttctctctcc atctttttcc 6720
cgtctctttt tgtttcatta atctgtctct gacatgttga ggtgatccac cactatggtg 6780
tgagggcgat aggggcacat ggtctggtgg ctcggctaaa aagggactca tcaactaaaa 6840
ggaagggagc aagtagctta agctagcaac agagtgaaga taggaagatc gatgtggaag 6900
tgactagaga acggcatctt ggaagcaagc cagcaagagg agctactaac tgcttttgct 6960
ccgttttctg actaataatg tgctcatttg ccactctcat tttgcctagt tcaggacact 7020
ctctgaagct cttactaact aattcaaaag caacattaat tttaattact ggccacctcc 7080
acagtccaca tgc 7093
<210> 13
<211> 2717
<212> DNA
<213> 玉米(corn)
<400> 13
ggcataccag acagtccggt gtgccagatc agggcaccct tcggttcctt tgctcctttg 60
cttttgaacc ctaactttga tcgtttattg gtttgtgttg aacctttatg cacctgtgga 120
atatataatc tagaacaaac tagttagtcc aatcatttgt gttgggcatt caaccaccaa 180
aattatttat aggaaaaggt taaaccttat ttccctttca atctccccct ttttggtgat 240
tgatgccaac acaaaccaaa gaaaatatat aagtgcagaa ttgaactagt ttgcataagg 300
taagtgcata ggttacttag aattaaatca atttatactt ttacttgata tgcatggttg 360
ctttctttta ttttaacatt ttggaccaca tttgcaccac ttgttttgtt ttttgcaaat 420
ctttttggaa attctttttc aaagtctttt gcaaatagtc aaaggtatat gaataagatt 480
gtaagaagca ttttcaagat ttgaaatttc tccccctgtt tcaaatgctt ttcctttgac 540
taaacaaaac tccccctgaa taaaattctc ctcttagctt tcaagagggt tttaaataga 600
tatcaattgg aaatatattt agatgctaat tttgaaaata taccaattga aaatcaacat 660
accaatttga aattaaacat accaatttaa aaaatttcaa aaagtggtgg tgcggtcctt 720
ttgctttggg cttaatattt ctcccccttt ggcattaatc gccaaaaacg gagactttgt 780
gagccattta tactttctcc ccattggtaa atgaaatatg agtgaaagat tataccaaat 840
ttggacagtg atgcggagtg acggcgaagg ataaacgata ccgttagagt ggagtggaag 900
ccttgtcttc gccgaagact ccatttccct ttcaatctac gacttagcat agaaatacac 960
ttgaaaacac attagtcgta gccacgaaag agatatgatc aaaggtatac aaatgagcta 1020
tgtgtgtaat gtttcaatca aagtttcgag aatcaagaat atttagctca ttcctaagtt 1080
tgctaaaggt tttatcatat aatggtttgg taaagatatc gactaattgt tctttggtgc 1140
taacataagc aatctcgata tcaccccttt gttggtgatc cctcaaaaag tgataccgaa 1200
tgtctatgtg cttagtgcgg ctgtgttcaa cgggattatc cgccatgcag atagcactct 1260
cattgtcaca taggagaggg actttgctca atttgtagcc atagtcccta aggttttgcc 1320
tcatccaaag taattgcaca caacaatgtc ctgcggcaat atacttggct tcggcggtag 1380
aaagagctat tgagttttgt ttctttgaag tccaagacac cagggatctc cctagaaact 1440
gacaagtccc tgatgtgctc ttcctatcaa ttttacaccc tgcccaatcg gcatctgaat 1500
atcctattaa atcaaaggtg gatcccttgg ggtaccaaag accaaattta ggagtgtaaa 1560
ctaaatatct catgattctt ttcacggccc taaggtgaac ttccttagga tcggcttgga 1620
atcttgcaca catgcatata gaaagcatac tatctggtcg agatgcacat aaatagagta 1680
aagatcctat catcgaccgg tatacctttt ggtctacgga tttacctccc gtgtcgaggt 1740
cgagatgccc attagttccc atgggtgtcc tgatgggctt ggcatccttc attccaaact 1800
tgttgagtat gtcttgaatg tactttgttt ggctgatgaa ggtgccatct tggagttgct 1860
tgacttgaaa tcctagaaaa tatttcaact tccccatcat agacatctcg aatttcggaa 1920
tcatgatcct actaaactct tcacaagtag atttgttagt agacccaaat ataatatcat 1980
caacataaat ttggcataca aacaaaactt ttgaaatggt tttagtaaag agagtaggat 2040
cggctttact gactctgaag ccattagtga taagaaaatc tcttaggcat tcataccatg 2100
ctgttggggc ttgcttgagc ccataaagcg cctttgagag tttataaaca tggttagggt 2160
actcactatc ttcaaagccg agaggttgct caacatagac ctattcaccc catttgatca 2220
cttttttggt ccttcaggat ctaatagtta tgtataattt agagtctctt gtttaatggc 2280
cagatatttc taattaatct aagaatttat gatatttttt aattttttat catgtctgat 2340
gagaattaac ataaaggctc aattgggtcc tgaattaata atagagtgaa aattaatcca 2400
gaggctctat tagaaccttc aattagtaat accaagatat atataagata gtagagtata 2460
gtttaaatgt tggcattgtt cattctttct tttgttattt aatttatgct ttccacggtg 2520
gttagtggtt acttctgaag ggtccaaata atgcatgaag agtttgagga caagaagtct 2580
gccctaaaaa tagcgatgca aaggcatggt gtccaagcca tacatatagc gcactaattt 2640
tatcagcaga acaatggtat ttataggtcc tagtgcccag gcaacaagag acacgaataa 2700
agcatcgatc acgacac 2717
<210> 14
<211> 1616
<212> DNA
<213> 玉米(corn)
<400> 14
atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca 60
ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc 120
gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg 180
gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcggcctg cggcctggtc 240
caggcacaag tcctcttcca ggggtttaac tgggagtcgt gcaagcagca gggaggctgg 300
tacaacaggc tcaaggccca ggtcgacgac atcgccaagg ccggcgtcac gcacgtctgg 360
ctgcctccac cctcgcactc cgtctcgcca caaggctaca tgccaggccg cctatacgac 420
ctggacgcgt ccaagtacgg cacggcggcg gagctcaagt ccctgatagc ggcgttccac 480
ggcaggggcg tgcagtgcgt ggcggacatc gtcatcaacc accggtgcgc ggaaaagaag 540
gacgcgcgcg gcgtgtactg catcttcgag ggcgggactc ccgacgaccg cttggactgg 600
ggccccggga tgatctgcag cgacgacacg cagtactcgg acgggacggg gcaccgcgac 660
acgggcgagg ggttcgcggc ggcgcccgac atcgaccacc tcaacccgcg cgtgcagcgg 720
gagctctccg cctggctcaa ctggctcagg tccgacgccg tggggttcga cggctggcgc 780
ctcgacttcg ccaagggcta ctcgccggcc gtcgccagaa tgtacgtgga gagcacgggg 840
ccgccgagct tcgtcgtcgc ggagatatgg aactcgctga gctacagcgg ggacggcaag 900
ccggcgccca accaggacca gtgccggcag gagctgctgg actggacgcg ggccgtcggc 960
gggcccgcca tggcgttcga cttccccacc aagggcctgc tgcaggcggg cgtgcagggg 1020
gagctgtggc ggctgcgcga cagctccggc aacgcggccg gcctgatcgg gtgggcgccc 1080
gagaaggccg tcaccttcgt cgacaaccat gacaccgggt cgacgcagaa gctctggccg 1140
ttcccatccg acaaggtcat gcagggctac gcctacatcc tcacccatcc aggagtcccc 1200
tgcattttct acgaccacat gttcgactgg aacctgaagc aggagatatc cacgctgtct 1260
gccatcaggg cgcggaacgg catccgcgcc gggagcaagc tgcggatcct cgtggcggac 1320
gcggacgcgt acgtggccgt cgtcgacgag aaggtcatgg tgaagatcgg gacaaggtac 1380
ggcgtgagca gcgtggtccc gtcggatttc cacccggcgg cgcacggcaa ggactactgc 1440
gtctgggaga aagcgagcct ccgcgtcccg gcggggcgcc acctctagca gctcagattg 1500
ctcagtcttg tgctgcattg caaacacagc agcacgacac tgcataacgt cttttccttg 1560
agatctgaca aagcagcatt agtccgttga tcggtggaag accactcgtc agtgtt 1616
<210> 15
<211> 293
<212> DNA
<213> 玉米(corn)
<400> 15
gagttgaatg tttgatcaat aaaatacggc aatgctgtaa gggttgtttt ttatgccatt 60
gataatacac tgtactgttc agttgttgaa ctctatttct tagccatgcc aagtgctttt 120
cttattttga ataacattac agcaaaaagt tgaaagacaa aaaaaaaaac ccccgaacag 180
agtgctttgg gtcccaagct actttagact gtgttcggcg ttccccctaa atttctcccc 240
ctatatctca ctcacttgtc acatcagcgt tctctttccc ctatatctcc acg 293
<210> 16
<211> 831
<212> DNA
<213> 大麦(barley)
<400> 16
aaaccgtctc ttcgtgagaa taaccgtggc ctaaaaataa gccgatgagg ataaataaaa 60
tgtggtggta cagtacttca agaggtttac tcatcaagag gatgcttttc cgatgagctc 120
tagtagtaca tcggacctca catacctcca ttgtggtgaa atattttgtg ctcatttagt 180
gatgggtaaa ttttgtttat gtcactctag gttttgacat ttcagttttg ccactcttag 240
gttttgacaa ataatttcca ttccgcggca aaagcaaaac aattttattt tacttttacc 300
actcttagct ttcacaatgt atcacaaatg ccactctaga aattctgttt atgccacaga 360
atgtgaaaaa aaacactcac ttatttgaag ccaaggtgtt catggcatgg aaatgtgaca 420
taaagtaacg ttcgtgtata agaaaaaatt gtactcctcg taacaagaga cggaaacatc 480
atgagacaat cgcgtttgga aggctttgca tcacctttgg atgatgcgca tgaatggagt 540
cgtctgcttg ctagccttcg cctaccgccc actgagtccg ggcggcaact accatcggcg 600
aacgacccag ctgacctcta ccgaccggac ttgaatgcgc taccttcgtc agcgacgatg 660
gccgcgtacg ctggcgacgt gcccccgcat gcatggcggc acatggcgag ctcagaccgt 720
gcgtggctgg ctacaaatac gtaccccgtg agtgccctag ctagaaactt acacctgcaa 780
ctgcgagagc gagcgtgtga gtgtagccga gtagatccac cggtcgccac c 831
<210> 17
<211> 678
<212> DNA
<213> 珊瑚虫(coralline)
<400> 17
atggcctcct ccgagaacgt catcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60
accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120
cacaacaccg tgaagctgaa ggtgacgaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180
ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240
gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300
gacggcggcg tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360
aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420
atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480
acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540
tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600
atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660
caccacctgt tcctgtag 678
<210> 18
<211> 342
<212> DNA
<213> 马铃薯(potato)
<400> 18
cggcccatgg atattcgaac gcgtagactt gtccatcttc tggattggcc aacttaatta 60
atgtatgaaa taaaaggatg cacacatagt gacatgctaa tcactataat gtgggcatca 120
aagttgtgtg ttatgtgtaa ttactagtta tctgaataaa agagaaagag atcatccata 180
tttcttatcc taaatgaatg tcacgtgtct ttataattct ttgatgaacc agatgcattt 240
cattaaccaa atccatatac atataaatat taatcatata taattaatat caattgggtt 300
agcaaaacaa atctagtcta ggtgtgtttt gcgaatgcgg cc 342
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<223> 根据实验要求而设计，做为扩增OsCHI基因的引物
<400> 19
gcgttagatc ggaagtggcc agatttatcg gattgc 36
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> 根据实验要求而设计，做为扩增OsCHI基因的引物
<400> 20
gctccagttg ggccggacca tattagcaga aacag 35
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> 根据实验要求而设计，做为扩增PTC1基因的引物
<400> 21
gtcatgcatt cagccgtcag aaaggctcag a 31
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> 根据实验要求而设计，做为扩增PTC1基因的引物
<400> 22
gcatgtggac tgtggaggtg gccagtaatt 30
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> 根据实验要求而设计，做为扩增ZMAA基因的引物
<400> 23
ggcataccag acagtccggt gtgccagatc a 31
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 根据实验要求而设计，做为扩增ZMAA基因的引物
<400> 24
ggagatatag gggaaagaga acgctgatgt gacaagtgag t 41
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> 根据实验要求而设计，做为扩增DsRed基因的引物
<400> 25
aaaccgtctc ttcgtgagaa taaccgtggc ct 32
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> 根据实验要求而设计，做为扩增DsRed基因的引物
<400> 26
ggccgcattc gcaaaacaca cctagactag at 32

Claims (10)

1.一种利用隐性颖壳颜色性状提高水稻遗传工程核不育系种子色选精度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将隐性异色颖壳可育水稻材料培育成双色选遗传工程核不育系；
S2、将包含黄颖基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的四元连锁载体导入至所述S1中所述双色选遗传工程核不育系的基因组中培育双色选遗传工程繁殖系；
S3、将所述S2中所述双色选遗传工程繁殖系和与所述S1中所述双色选遗传工程核不育系混植，开花期将所述双色选遗传工程繁殖系的花粉赶到所述双色选遗传工程核不育系植株上，混收全部种子；
S4、根据胚乳是否发荧光对所述S3中混收的种子进行第一次筛选，将发荧光的黄颖遗传工程繁殖系种子和不发荧光的遗传工程核不育系种子分选出来；所述不发荧光的遗传工程核不育系种子包括异色颖壳不育系种子和黄色颖壳不育系种子，所述异色颖壳不育系种子来源于双色选遗传工程核不育系植株，所述黄色颖壳不育系种子来源于双色选遗传工程繁殖系植株；
S5、根据颖壳颜色对所述S4中不育系种子进行第二次色选，将黄色颖壳不育系种子及第一次色选过程中混入的少量黄颖遗传工程繁殖系种子分选出来，提纯异色颖壳不育系种子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述隐性异色颖壳可育水稻材料采用以下方法培育：通过编辑水稻野生型隐性颖壳颜色控制基因培育；或，通过回交方法导入突变的隐性颖壳颜色控制基因培育。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中所述隐性异色颖壳可育水稻材料的培育方法为：
S1-A1、根据OsCHI基因的cDNA序列设计靶位点接头引物Seq2和Seq3，所述Seq2的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述Seq3的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；
S1-A2、将所述靶位点接头引物Seq2和Seq3制成具有粘性末端的双链接头OsCHI-T1；
S1-A3、将所述双链接头OsCHI-T1与载体连接得到pU3-OsCHI-T1-gRNA重组载体；
S1-A4、将所述pU3-OsCHI-T1-gRNA重组载体连接到pCRISPR/Cas9载体得到pCas9-OsCHI-T1敲除载体；
S1-A5、将所述pCas9-OsCHI-T1敲除载体转化至水稻愈伤组织中，获得带有隐性异色颖壳的可育水稻。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中所述双色选遗传工程核不育系通过编辑水稻野生型隐性雄性核不育基因获得；或，通过回交方法导入突变的隐性核不育基因获得。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中所述双色选遗传工程核不育系采用以下方法获得：
S1-B1、根据PTC1基因的cDNA序列设计靶位点接头引物Seq7和Seq8；所述Seq7的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；所述Seq8的DNA序列如SEQ ID NO.8所示；
S1-B2、将所述靶位点接头引物Seq7和Seq8制成具有粘性末端的双链接头PTC1-T1；
S1-B3、将所述双链接头PTC1-T1与载体连接得到pU3-PTC1-T1-gRNA重组载体；
S1-B4、将所述pU3-PTC1-T1-gRNA重组载体连接到pCRISPR/Cas9载体得到pCas9-PTC1-T1敲除载体；
S1-B5、将所述pCas9-PTC1-T1敲除载体导入带有隐性异色颖壳的可育水稻的愈伤组织中，转育成双色选遗传工程核不育系。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述S2具体为：
S2-1、设计扩增黄颖基因、育性恢复基因、花粉失活基因和荧光标记基因的引物，进行PCR扩增获得基因片段；
S2-2、将所述四个基因的基因片段构建到同一植物表达载体中得到四元连锁载体；
S2-3、将所述四元连锁载体导入到所述双色选遗传工程核不育系的基因组中获得转基因植株；
S2-4、从所述转基因植株中选择颖壳颜色恢复为黄色且后代种子中50％为荧光种子的株系，即为双色选遗传工程繁殖系。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述黄颖基因为OsCHI、OsCAD2或IBF1；
所述育性恢复基因为PTC1、EAT1、TDR或CYP704B2；
所述花粉失活基因为ZMAA；
所述荧光标记基因为DsRed。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述黄颖基因为OsCHI，扩增所述OsCHI基因的引物为CHI-F和CHI-R，所述CHI-F的DNA序列如SEQ ID NO.19所示；所述CHI-R的DNA序列如SEQ ID NO.20所示；
所述育性恢复基因为PTC1基因，扩增所述PTC1基因的引物为PTC1-F和PTC1-R，所述PTC1-F的DNA序列如SEQ ID NO.21所示；所述PTC1-R的DNA序列如SEQ ID NO.22所示；
扩增所述ZMAA基因的引物为ZMAA-F和ZMAA-R，所述ZMAA-F的DNA序列如SEQ ID NO.23所示；所述ZMAA-R的DNA序列如SEQ ID NO.24所示；
扩增所述DsRed基因的引物为DsRed-F和DsRed-R，所述DsRed-F的DNA序列如SEQ IDNO.25所示；所述DsRed-R的DNA序列如SEQ ID NO.26所示。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述S4中经第一次荧光筛选获得的黄颖遗传工程繁殖系种子继续用于下一代不育系的繁殖。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述S5中经第二次颖壳筛选获得的黄色颖壳不育系种子继续用于下一代不育系的繁殖；所述S5中经第二次颖壳筛选提纯的异色颖壳不育系种子与黄颖恢复系进行机械化制种。
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