CN113265401A

CN113265401A - 一种通过基因编辑提高水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性的方法及其专用sgRNA

Info

Publication number: CN113265401A
Application number: CN202110404367.XA
Authority: CN
Inventors: 吴云雨; 李爱宏; 肖宁; 潘存红; 蔡跃; 余玲; 李育红; 张小祥; 刘广青; 黄年生; 周长海; 戴正元; 季红娟; 刘建菊; 陈梓春; 时微; 王志平
Original assignee: JIANGSU LIXIAHE REGION AGRICULTURAL RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: JIANGSU LIXIAHE REGION AGRICULTURAL RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2021-04-15
Filing date: 2021-04-15
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2041-04-15
Also published as: CN113265401B

Abstract

本发明公开了一种通过基因编辑提高水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性的方法及其专用sgRNA。一种基于CRISPR/Cas9对水稻OsHPPD基因进行编辑的特异sgRNA，编码序列如SEQ ID NO.6所示。一种针对水稻OsHPPD基因的CRISPR/Cas9载体，含有编码所述的特异sgRNA的编码基因序列。一种通过基因编辑提高水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性的方法，包含如下步骤：将所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因导入出发水稻，得到OsHPPD基因发生突变的转基因水稻；与出发水稻相比，转基因水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性得到提高。

Description

一种通过基因编辑提高水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性的方法及其专用sgRNA

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过基因编辑提高水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性的方法及其专用sgRNA。

背景技术

水稻是我国主要的粮食作物之一，杂草危害是制约水稻生产的重要因素之一。我国稻田中发生普遍且最常见的杂草多达40多种，每年稻田草害面积为380万hm²，占水稻种植面积的11.5％以上，每年因草害造成的水稻损失高达1000多万吨，杂草危害严重影响了水稻的产量和品质。

目前，除传统人工除草外，最主要的田间除草方法是化学防治，化学防治具有高效、经济，省力等优点，在杂草防治中占据重要地位。除草剂被杂草根、芽和叶片等吸收后，通过破坏或干扰杂草的一个或多个重要的生理代谢过程(如光合作用、氨基酸或蛋白质合成、脂肪合成、色素合成等)来杀死杂草。这些代谢过程均由不同的酶系统来催化，因此除草剂开发的主要靶标就是杂草体内多种生物合成的酶，通过对靶标酶的抑制，最终干扰杂草的代谢途径从而达到杀灭杂草目的。

对羟苯基丙酮酸双氧化酶(4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPPD)是生物体内酪氨酸代谢过程中重要的酶，它几乎存在于所有需氧生物体内。20世纪90年代，HPPD首次被确定为除草剂作用靶标，该类除草剂的作用机理是竞争性地与HPPD结合，阻断植物体内对羟基苯丙酮酸向尿黑酸的转变，间接抑制类胡萝卜素的生物合成，导致植物体内类胡萝卜素的缺乏，从而诱导叶绿素光氧化作用减弱，影响植物的光合作用，促使植物产生白化症状而死亡。HPPD抑制剂类除草剂具有广谱、高效、低毒、作物安全性高、不易产生抗性、环境相容性好以及对后茬作物安全等一系列优点，从而使其成为化学除草剂研发的新热点，目前已开发出三酮类、吡唑类和异噁唑类等多种类型除草剂，在玉米、小麦、大麦等大田作物中被广泛应用。但是，普通水稻对HPPD抑制剂类除草剂极为敏感，一旦喷施，水稻苗就会发生白化而死亡。因此，如果能够培育对HPPD抑制剂类除草剂具有抗性的水稻品种，在种植时，将HPPD抑制剂类除草剂与相应的抗性水稻配套使用，一方面可有效杀灭稻田中的恶性杂草，另一方面可以解决现有其他类型除草剂(抗ALS抑制剂类、ACCase抑制剂类杂草)抗性水稻存在的农药残留对后茬作物的影响以及抗性杂草的问题。但是，目前尚未有达到商品使用浓度的抗HPPD抑制剂类除草剂水稻种质或品种的报道，相关抗性基因发掘研究也较少。

一般认为对HPPD抑制剂类除草剂产生抗性的是HPPD基因，例如来自黄连的CjHPPD、荧光假单胞杆菌的HPPD(G336W)、燕麦的AvHPPD-03及来自土壤宏基因组分析获得的mHPPD等基因对相应的HPPD抑制剂除草剂都显示出较强的除草剂抗性。在水稻方面，北京未名凯拓作物设计中心有限公司分别将铜绿假单胞菌(Pseudomonas asruginosa)的Pa-HPPD基因、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的Pp-HPPD基因及睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)的Ct2-HPPD基因导入水稻中，获得的转基因水稻可以耐受5mmol/L的异噁唑草酮而存活。但是目前针对水稻自身OsHPPD基因的研究还很少，尚没有对已知位点改变后可以产生抗性的报导。利用水稻自身OsHPPD基因突变创制抗HPPD抑制剂类除草剂水稻种质的难点在于：一方面要通过突变降低水稻对HPPD抑制剂的敏感性，从而产生一定的抗性；另一方面又要保留OsHPPD基因的生物学功能，即催化对羟基苯丙酮酸转化成尿黑酸，促进水稻正常生长。因此，对OsHPPD基因突变靶标位点的选择显得尤为重要。

近年来，以CRISPR/Cas9技术为代表的基因组定点编辑技术成为植物精准育种和基因功能研究的新手段。具有操作简单、试验周期短、费用低，以及可以消除载体序列而创制不含标记基因的新种质等优点。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsHPPD基因特定序列进行定点编辑，发现突变该基因后，能够增强水稻对HPPD抑制剂类除草剂的耐受性，为HPPD抑制剂类除草剂抗性水稻品种培育、经济有效地防治稻田杂草危害提供了基因资源和技术思路。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种通过基因编辑提高水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性的方法及其专用的sgRNA。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种水稻OsHPPD基因特异sgRNA的靶标序列，如SEQ ID NO.5所示。

一种基于CRISPR/Cas9对水稻OsHPPD基因进行编辑的特异sgRNA，编码序列如SEQID NO.6所示。

一种针对水稻OsHPPD基因的CRISPR/Cas9载体，含有编码所述的特异sgRNA的编码基因序列。

本发明所述的特异sgRNA在构建抗HPPD抑制剂类除草剂的转基因水稻中的应用。

本发明所述的CRISPR/Cas9载体在构建抗HPPD抑制剂类除草剂的转基因水稻中的应用。

一种通过基因编辑提高水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性的方法，包含如下步骤：将所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因导入出发水稻，得到OsHPPD基因发生突变的转基因水稻；与出发水稻相比，转基因水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性得到提高。

作为本发明的一种优选，所述的方法，是将所述的CRISPR/Cas9载体导入出发水稻，对水稻OsHPPD基因进行基因编辑，从而产生缺失或插入，形成OsHPPD基因的突变体，得到转基因水稻；与出发水稻相比，转基因水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性得到提高。

作为本发明的进一步优选，所述的出发水稻为粳稻，优选地，所述的出发水稻为适宜直播的粳稻；更优选地，所述出发水稻为扬粳3012；所述的HPPD抑制剂类除草剂选自吡唑类HPPD抑制剂除草剂、三酮类HPPD抑制剂除草剂或异噁唑类HPPD抑制剂除草剂中的一种或多种；优选地，所述的HPPD抑制剂类除草剂为三酮类HPPD抑制剂除草剂，更优选地，所述的HPPD抑制剂类除草剂为硝磺草酮

作为本发明的进一步优选，所述的OsHPPD基因的突变体核苷酸序列如SEQ IDNO.7或8所示。

一种突变的水稻OsHPPD基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.7或8所示。

有益效果：

本发明利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑水稻OsHPPD基因，通过造成移码突变，突变了水稻OsHPPD基因的特定位点，获得了HPPD抑制剂类除草剂耐受性明显提高的水稻新种质。本发明获得的OsHPPD定点编辑株系与野生型相比，对HPPD抑制剂类除草剂产生了明显的耐受性，在水稻遗传育种领域具有重大的应用推广价值。

本发明的发明点在于针对水稻OsHPPD基因第二外显子区域附近获得多个CRISPR/Cas9系统中Cas9酶识别前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM)上游序列，选择预测的打靶效率较高和脱靶效率低的5个序列作为编辑靶标位点，转化受体为扬粳3012。通过CRISPR/Cas9系统产生缺失或插入，形成OsHPPD基因的突变体。硝磺草酮抗性筛选显示只有位于3'UTR区的靶标1特定靶点sgRNA创制出的两个特定突变体材料获得了除草剂抗性，而其他靶标编辑位点创制出的突变体未产生除草剂抗性，且部分大片断缺失突变体材料自身就会发生白化症状而死亡。

附图说明

图1为实施例1中所使用的构建好的有效重组质粒pYLCRISPR/Cas9-OsHPPD图谱。

图2为实施例2中编辑位点及T₀代OsHPPD突变体中的纯合突变类型。A:OsHPPD中CRISPR/Cas9编辑靶标位点。深灰色长方体表示CDS区，浅灰色长方体表示3’UTR区，倒三角表示编辑靶标位点，红色的为有效靶标位点，靶标1的sgRNA序列用绿色表示，PAM用红色表示；B：靶标1T₀代CRISPR/Cas9转基因植株的突变序列信息。

图3为实施例3中喷施10μmol/L硝磺草酮后靶标1创制出的T₂代转基因株系与野生型材料的抗性表现。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面将结合实例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。需要说明的是，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂，若无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1基因编辑载体构建

根据OsHPPD基因组序列，结合华中农业大学CRISPR-P 2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计靶点筛选出预测的打靶效率较高和脱靶效率低的5条特异序列用于产生sgRNA。其中靶标1序列(SEQ ID NO.6)位于OsHPPD基因基因第二外显子的全长451bp(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)的309-328bp处。PAM序列TGG位于靶序列3’末端。其他的sgRNA靶标序列见表1。委托武汉伯远生物科技有限公司利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对目的基因进行编辑，具体操作方法参照文献Ma等(Ma et al.,2015)高效编辑单子叶植物基因组，通过BsaI酶切构建CRISPR/Cas9重组载体(图1)，该重组载体中同时含有编码特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因。重组载体经电击转化农杆菌EHA105,设计特异性检测正向引物Yl-R:5’-ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGT-3’，和反向引物Pbw2-:5’-GCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGG-3’进行农杆菌菌液检测，扩增出目的片段大小的菌液为阳性菌株，然后提取相关阳性质粒备用。

实施例2OsHPPD基因编辑转基因植株的获得及鉴定

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法将构建好的敲除载体pYLCRISPR/Cas9-OsHPPD质粒转入粳稻受体品种扬粳3012中。水稻遗传转化工作委托武汉伯远生物科技有限公司完成。转化的大致过程如下：提取出pYLCRISPR/Cas9-OsHPPD质粒，转化进入农杆菌EHA105中，将含有pYLCRISPR/Cas9-OsHPPD质粒的农杆菌EHA105侵染粳稻受体品种扬粳3012愈伤组织，再转到共培养基上26℃暗培养3天，清洗后的愈伤组织转到含潮霉素的选择培养基上进行抗性筛选，经选择后的抗性愈伤转到预分化培养基14天，再转到分化培养基光照培养，待小苗长至3cm时转至生根培养基诱导不定根的发生。当幼苗长至10cm左右高时，将幼苗取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入泥土中，温室中培育，待植株健壮后取样进行PCR鉴定。

以野生型和T₀代叶片基因组DNA为模板，用Hyg-F/Hyg-R引物进行PCR扩增(Hyg-F：5’-AGCCTGACCTATTGCATCTCCC-3’；Hyg-R:5’-CTGCTCCATACAAGCCAACCAC-3’)，有特异性扩增条带者为转基因阳性植株。然后，在编辑靶标1序列两侧设计特异引物HPPD-24-F和HPPD-24-R(HPPD-24-F:5’-CACAAGCATCACAAGGACAG-3’；HPPD-24-R:5’-CAACTTCTCGGAGCTGTTCAAG-3’)，以阳性转基因植株基因组DNA为模板，对其PCR扩增产物进行测序来检测T₀代靶序列。以野生型DNA序列为对照，T₀代共鉴定了多株转化苗。其中2株为纯合突变体苗分别为OsHPPD-463-12和OsHPPD-463-15，突变序列如图2所示，其中OsHPPD-463-12为单碱基缺失，导致移码突变(OsHPPD-KO1：SEQ ID NO.7)，OsHPPD-463-15为相同位点的单碱基插入，同样导致移码突变(OsHPPD-KO2：SEQ ID NO.8)。，其他靶标创制的T₀代突变体类型见表1。其中N59-52分离株系则在正常情况下自身就发生白化症状而死亡。

表1不同靶点创制的T₀代突变体的测序信息

实施例3OsHPPD基因编辑转基因株系对除草剂硝磺草酮抗性鉴定

将实施例2中靶标1创制的2个纯合的基因编辑T₀代植株及其他转基因植株加代至T₂代获得纯合株系。将T₂代株系和野生型水稻种子用清水冲洗种子多次，采用“浸三催一”法进行浸种催芽，即浸种三天，催芽一晚，待种子露白出芽后即可按顺序条播于秧板田内，出芽期注意保温，出苗后注意控温防止苗窜高，待幼苗长到2-3叶期进行硝磺草酮悬浮液喷雾处理，硝磺草酮悬浮液为含有10μmol/L的硝磺草酮及0.02％的Tween-20,喷至叶片表面全部湿润为止。12天后查看相关材料表型，结果见图3，结果表明靶标1创制的两个OsHPPD基因编辑株系对除草剂硝磺草酮耐受性明显增强，表型基本没有变化，而对照野生型则全部发生白化现象，所有其他突变体材料则全部发生白化症状而死亡，未筛选到抗性株系。

最后所应说明的是，尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 江苏里下河地区农业科学研究所

<120> 一种通过基因编辑提高水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性的方法及其专用sgRNA

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2942

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

accgccacca ccggcgccgt ctcggccgct gcggcggcgg gggagaacgc ggggttccgc 60

ctcgtcgggc accgccgctt cgtccgcgcc aacccgcgga gcgaccggtt ccaggcgctc 120

gcgttccacc acgtcgagct ctggtgcgcc gacgccgcgt ccgccgcggg ccggttcgcc 180

ttcgccctgg gcgcgccgct cgccgccagg tccgacctct ccacggggaa ctccgcgcac 240

gcctccctcc tcctccgctc cgcctccgtc gcgttcctct tcaccgcccc ctacggcggc 300

gaccacggcg tcggcgcgga cgcggccacc accgcctcca tcccttcctt ctccccaggc 360

gccgcgcgga ggttcgccgc ggaccacggc ctcgcggtgc acgccgtggc gctgcgcgtc 420

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cccgccgacc tcggcggtgg cttcggcctc gcggaggtgg agctctacgg cgacgtcgtg 540

ctccgcttcg tcagccaccc ggacggcgcc gacgcgccct tcctcccggg tttcgagggc 600

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gtgccggagc tcgctccggt agccgcgtac atctccgggt tcaccgggtt ccacgagttc 720

gccgagttca ccgccgagga cgtgggcacc gccgagagcg gcctcaactc ggtggtgctc 780

gccaacaacg cggagaccgt gctgctgccg ctcaacgagc cggtgcacgg caccaagcgg 840

cggagccaga tacagacgta cctggaccac cacggcggcc cgggggtgca gcacatcgcg 900

ctggccagcg acgacgtgct cgggacgctg agggagatgc gggcgcgctc cgccatgggc 960

ggcttcgagt tcttggcgcc gccgccgccc aactactacg acggcgtgcg gcggcgcgcc 1020

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cctcacctct ttcatgatga aaatggctta tgaattcaga tttgcagtta tttgttggca 1200

catagcatcg attaggcgca gaaaggtgtc aagcattatg aaattaatcc agaatgcttg 1260

aataatacag tataatatat gatagtgagc tctgtgatac tccatggata ctctttatgt 1320

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ttgatgctaa tctatctaga ttcattagca tcaatatgaa tatgggaaat actagaatga 1620

cttacattgt gaaacggagg aagtattact tactacatct aaggtccatg gattcctttt 1680

tttacaaaag aaagaaagaa tcttatggca actccatcag cataaaccag caatgctgct 1740

gggaacaact taaactttag gttcaggagg ttgtaattgt ctttaagctt aatagtctga 1800

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caaatctaac tggatcagct atttcactca ggccaacctt tttcttggag atgatacaaa 1920

ggattgggtg catggagaag gatgagagtg ggcaggagta ccagaagggc ggctgcggcg 1980

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ctttgtgata tgtgtcatgc aagttgatgt tgtaatttgt ggaagctgaa gacaaatgat 2220

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ggcattgctg ctgtacaatc ttgcttggaa ataaaataat aatcaacctg gagaaagaat 2340

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tagtggtcct ctgctgcctc caaccgtcca gggtaaaagt gtaaaccgtg ggctgagtta 2520

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tgcactaatc acatttcaaa acattatgga agtgtcatac aataaaattg aagtgtttgt 2820

gtcataaaat tgacatggtt attgaggtga atccattcaa aacaaatgta cagaaacagc 2880

ctatggaaca tgtaagcatg gcaactctgc aaacacatcg aggggattat gtataaaaaa 2940

ga 2942

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Val Ser Asn Pro Gly Ala Val Asp Tyr Gly Leu Arg Arg Phe Asp His

1 5 10 15

Val Val Gly Asn Val Pro Glu Leu Ala Pro Val Ala Ala Tyr Ile Ser

20 25 30

Gly Phe Thr Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val

35 40 45

Gly Thr Ala Glu Ser Gly Leu Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ala

50 55 60

Glu Thr Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg

65 70 75 80

Arg Ser Gln Ile Gln Thr Tyr Leu Asp His His Gly Gly Pro Gly Val

85 90 95

Gln His Ile Ala Leu Ala Ser Asp Asp Val Leu Gly Thr Leu Arg Glu

100 105 110

Met Arg Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Glu Phe Leu Ala Pro Pro

115 120 125

Pro Pro Asn Tyr Tyr Asp Gly Val Arg Arg Arg Ala Gly Asp Val Leu

130 135 140

Ser Glu Glu Gln Ile Asn Glu Cys Gln Glu Leu Gly Val Leu Val Asp

145 150 155 160

Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gln Ile Phe Thr Lys Pro Val Gly

165 170 175

Asp Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu Met Ile Gln Arg Ile Gly Cys Met

180 185 190

Glu Lys Asp Glu Ser Gly Gln Glu Tyr Gln Lys Gly Gly Cys Gly Gly

195 200 205

Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys Ser Ile Glu Glu Tyr

210 215 220

Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gln Ala Pro Thr Val Gln Gly Ser

225 230 235

<210> 3

<211> 984

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

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gtgccggagc tcgctccggt agccgcgtac atctccgggt tcaccgggtt ccacgagttc 120

gccgagttca ccgccgagga cgtgggcacc gccgagagcg gcctcaactc ggtggtgctc 180

gccaacaacg cggagaccgt gctgctgccg ctcaacgagc cggtgcacgg caccaagcgg 240

cggagccaga tacagacgta cctggaccac cacggcggcc cgggggtgca gcacatcgcg 300

ctggccagcg acgacgtgct cgggacgctg agggagatgc gggcgcgctc cgccatgggc 360

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gtaggaactg gaggcctgga gcaacagatg taaccagtgt atttgtatta tggagcagaa 780

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tacaagaatg taacctagtg ttggcattgc tgctgtacaa tcttgcttgg aaataaaata 960

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

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caagtccatt gaggagtatg agaaatccct tgaagccaag caagccccta cagttcaagg 180

atcctaggta ggaactggag gcctggagca acagatgtaa ccagtgtatt tgtattatgg 240

agcagaagaa aaaagatgtg ctttcactgc tttgtgatat gtgtcatgca agttgatgtt 300

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gatcacatac aagaatgtaa cctagtgttg gcattgctgc tgtacaatct tgcttggaaa 420

taaaataata atcaacctgg agaaagaatg t 451

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggaagctga agacaaatga 20

<210> 7

<211> 983

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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gccaacaacg cggagaccgt gctgctgccg ctcaacgagc cggtgcacgg caccaagcgg 240

cggagccaga tacagacgta cctggaccac cacggcggcc cgggggtgca gcacatcgcg 300

ctggccagcg acgacgtgct cgggacgctg agggagatgc gggcgcgctc cgccatgggc 360

ggcttcgagt tcttggcgcc gccgccgccc aactactacg acggcgtgcg gcggcgcgcc 420

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taccagaagg gcggctgcgg cgggtttggg aagggcaact tctcggagct gttcaagtcc 660

attgaggagt atgagaaatc ccttgaagcc aagcaagccc ctacagttca aggatcctag 720

gtaggaactg gaggcctgga gcaacagatg taaccagtgt atttgtatta tggagcagaa 780

gaaaaaagat gtgctttcac tgctttgtga tatgtgtcat gcaagttgat gttgtaattt 840

gtggaagctg aagacaatga tggtacaatc actgtaatag ataatagaca tggatcacat 900

acaagaatgt aacctagtgt tggcattgct gctgtacaat cttgcttgga aataaaataa 960

taatcaacct ggagaaagaa tgt 983

<210> 8

<211> 985

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcagcaacc cgggcgccgt ggactacggc ctccgccggt tcgaccacgt cgtcggcaac 60

gtgccggagc tcgctccggt agccgcgtac atctccgggt tcaccgggtt ccacgagttc 120

gccgagttca ccgccgagga cgtgggcacc gccgagagcg gcctcaactc ggtggtgctc 180

gccaacaacg cggagaccgt gctgctgccg ctcaacgagc cggtgcacgg caccaagcgg 240

cggagccaga tacagacgta cctggaccac cacggcggcc cgggggtgca gcacatcgcg 300

ctggccagcg acgacgtgct cgggacgctg agggagatgc gggcgcgctc cgccatgggc 360

ggcttcgagt tcttggcgcc gccgccgccc aactactacg acggcgtgcg gcggcgcgcc 420

ggggacgtgc tctcggagga gcagatcaac gagtgccagg agctcggggt gctcgtggac 480

agggatgacc agggggtgtt gctccagatc ttcaccaagc cagtaggaga caggccaacc 540

tttttcttgg agatgataca aaggattggg tgcatggaga aggatgagag tgggcaggag 600

taccagaagg gcggctgcgg cgggtttggg aagggcaact tctcggagct gttcaagtcc 660

attgaggagt atgagaaatc ccttgaagcc aagcaagccc ctacagttca aggatcctag 720

gtaggaactg gaggcctgga gcaacagatg taaccagtgt atttgtatta tggagcagaa 780

gaaaaaagat gtgctttcac tgctttgtga tatgtgtcat gcaagttgat gttgtaattt 840

gtggaagctg aagacaaatt gatggtacaa tcactgtaat agataataga catggatcac 900

atacaagaat gtaacctagt gttggcattg ctgctgtaca atcttgcttg gaaataaaat 960

aataatcaac ctggagaaag aatgt 985

Claims

1.一种水稻OsHPPD基因特异sgRNA的靶标序列，其特征在于，如SEQ ID NO.5所示。

2.一种基于CRISPR/Cas9对水稻OsHPPD基因进行编辑的特异sgRNA，其特征在于，该sgRNA的编码序列如SEQ ID NO.6所示。

3.一种针对水稻OsHPPD基因的CRISPR/Cas9载体，其特征在于含有编码权利要求2所述的特异sgRNA的编码基因序列。

4.权利要求2所述的特异sgRNA在构建抗HPPD抑制剂类除草剂的转基因水稻中的应用。

5.权利要求3所述的CRISPR/Cas9载体在构建抗HPPD抑制剂类除草剂的转基因水稻中的应用。

6.一种通过基因编辑提高水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性的方法，其特征在于，包含如下步骤：将权利要求2所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因导入出发水稻，得到OsHPPD基因发生突变的转基因水稻；与出发水稻相比，转基因水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性得到提高。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于将权利要求3所述的CRISPR/Cas9载体导入出发水稻，对水稻OsHPPD基因进行基因编辑，从而产生缺失或插入，形成OsHPPD基因的突变体，得到转基因水稻；与出发水稻相比，转基因水稻对HPPD抑制剂类除草剂抗性得到提高。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的出发水稻为粳稻，优选地，所述的出发水稻为适宜直播的粳稻；更优选地，所述出发水稻为扬粳3012；所述的HPPD抑制剂类除草剂选自吡唑类HPPD抑制剂除草剂、三酮类HPPD抑制剂除草剂或异噁唑类HPPD抑制剂除草剂中的一种或多种；优选地，所述的HPPD抑制剂类除草剂为三酮类HPPD抑制剂除草剂，更优选地，所述的HPPD抑制剂类除草剂为硝磺草酮。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的OsHPPD基因的突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.7或8所示。

10.一种突变的水稻OsHPPD基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.7或8所示。