CN108866092A - 抗除草剂基因的产生及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及一种通过植物碱基编辑技术创制新抗除草剂植物以及筛选能够赋予植物除草剂抗性的内源基因突变位点的方法。本发明还涉及所鉴别的突变的内源抗性基因在作物育种中的用途。

Description

抗除草剂基因的产生及其用途
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及一种通过植物碱基编辑技术创制新抗除草剂植物以及筛选能够赋予植物除草剂抗性的内源基因突变位点的方法。本发明还涉及所鉴别的突变的内源基因在作物育种中的用途。
背景技术
杂草是威胁农作物生产的重大有害生物，不仅影响作物的产量和品质，还能够滋生和传播农业病虫害，因此进行有效的杂草防除是实现农业丰产优质的前提。传统的人工除草，效率低成本高，在很多作物的生产中已经逐渐被喷施化学除草剂所替代。目前，我国农业生产中，除草剂的施用面积和用量均已经超过了杀虫剂和杀菌剂，在农药中位居首位。
除草剂的除草机理可分为三大类：一是抑制植物光合作用系统所涉及的酶；二是抑制细胞代谢，例如抑制氨基酸、脂肪酸的合成等；三是抑制细胞生长/分裂，包括抑制微管组装和干扰植物激素系统等。这些除草剂所抑制的酶，在很多作物中也是敏感的；所以，很多除草剂在除草的同时可能会对作物也造成严重伤害，甚至绝产。因此，提高作物对除草剂的抗性具有重大产业意义。
提高作物对除草剂的抗性水平主要有两种方式：一是靶点抗性，即除草剂所抑制的酶发生了突变，造成除草剂不能有效抑制其生理活性，涉及了抗咪唑啉酮除草剂、抗草甘膦、抗磺酰脲、抗莠去津等具体的性状；二是解毒作用，即通过迅速降解除草剂来保护靶点酶的生理功能，涉及了植物内源的P450酶系统以及转基因抗草铵膦、2,4-D、麦草畏等具体性状。
目前有两种不同的技术路线来实现植物的除草剂抗性：一是传统育种方式，包括化学诱变、辐射诱变等；二是转基因，即将抗除草剂基因转入到目标植物中。但是，传统育种产生抗除草剂诱变的概率低成本高，尤其是在同一基因上产生多位点突变概率极低，还有可能产生连锁的不良突变。转基因技术只能将已知的抗除草剂基因转入目标植物中来赋予植物预期的除草剂抗性。
本领域还需要更简单高效的获得除草剂抗性植物的方法以及新的抗除草剂基因。
附图说明
图1示出水稻ALS抗性位点筛选。
图2示出水稻ACCase抗性位点筛选。
图3示出小麦ALS抗性位点筛选。
具体实施方式
一、定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold SpringHarbor，1989(下文称为“Sambrook”)。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
“Cas9核酸酶”和“Cas9”在本文中可互换使用，指的是包括Cas9蛋白或其片段(例如包含Cas9的活性DNA切割结构域和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白)的RNA指导的核酸酶。Cas9是CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统)基因组编辑系统的组分，能在向导RNA的指导下靶向并切割DNA靶序列形成DNA双链断裂(DSB)。
“向导RNA”和“gRNA”在本文中可互换使用，通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成，其中crRNA包含与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性结合的序列。然而，本领域已知可以设计单向导RNA(sgRNA)，其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。
“脱氨酶”是指催化脱氨基反应的酶。在本发明一些实施方式中，所述脱氨酶指的是胞苷脱氨酶，其催化胞苷或脱氧胞苷分别脱氨化为尿嘧啶或脱氧尿嘧啶。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质体、叶绿体)中的细胞器DNA。
如本文所使用的，术语“植物”包括整个植物和任何后代、植物的细胞、组织、或部分。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：种子(包括成熟种子、没有种皮的未成熟胚、和不成熟的种子)；植物插条(plant cutting)；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(例如，花粉、胚、花、果实、芽、叶、根、茎，和相关外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、愈伤组织、或者任何其他被组织成结构或功能单元的植物细胞群体。植物细胞或组织培养物能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并能够再生出与该植物具有基本上相同基因型的植物。与此相反，一些植物细胞不能够再生产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、丝、花、果仁、穗、穗轴、壳、或茎。
植物部分包括可收获的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部分包括，例如但不限于：种子；果实；插条；苗；块茎；和砧木。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。
植物细胞是植物的结构和生理单元。如本文所使用的，植物细胞包括原生质体和具有部分细胞壁的原生质体。植物细胞可以处于分离的单个细胞或细胞聚集体的形式(例如，松散愈伤组织和培养的细胞)，并且可以是更高级组织单元(例如，植物组织、植物器官、和植物)的一部分。因此，植物细胞可以是原生质体、产生配子的细胞，或者能够再生成完整植物的细胞或细胞的集合。因此，在本文的实施方案中，包含多个植物细胞并能够再生成为整株植物的种子被认为是一种“植物部分”。
如本文所使用的，术语“原生质体”是指细胞壁被完全或部分地除去、其脂双层膜裸露的植物细胞。典型地，原生质体是没有细胞壁的分离植物细胞，其具有再生成细胞培养物或整株植物的潜力。
植物“后代”包括植物的任何后续世代。
“经遗传修饰的植物”包括在其基因组内包含外源多核苷酸或修饰的基因或表达调控序列的植物。例如外源多核苷酸能够稳定地整合进基因组中，并遗传连续的世代。外源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。修饰的基因或表达调控序列为在植物基因组中所述序列包含单个或多个脱氧核苷酸取代、缺失和添加。例如，通过本发明获得的经遗传修饰的植物可以相对于野生型植物(相应的未经所述遗传修饰的植物)包含一个或多个C至T的取代。
针对序列而言的“外源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是单链或双链RNA或DNA聚合物，任选地可含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷或脱氧腺苷(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷或脱氧胞苷，“G”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“U”表示尿苷，“T”表示脱氧胸苷，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。
“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在植物中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者，在一些实施方式中，可以是能够翻译的RNA(如mRNA)。
本发明的“表达构建体”可包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。植物表达调控元件指的是能够在植物中控制感兴趣的核苷酸序列转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。
调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方案中，启动子是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。启动子可以是组成型启动子或组织特异性启动子或发育调控启动子或诱导型启动子。
“组成型启动子”指一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。“诱导型启动子”响应内源性或外源性刺激(环境、激素、化学信号等)而选择性表达可操纵连接的DNA序列。
如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。
将核酸分子(例如质粒、线性核酸片段、RNA等)或蛋白质“导入”植物是指用所述核酸或蛋白质转化植物细胞，使得所述核酸或蛋白质在植物细胞中能够发挥功能。本发明所用的“转化”包括稳定转化和瞬时转化。
“稳定转化”指将外源核苷酸序列导入植物基因组中，导致外源基因稳定遗传。一旦稳定转化，外源核酸序列稳定地整合进所述植物和其任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”指将核酸分子或蛋白质导入植物细胞中，执行功能而没有外源基因稳定遗传。瞬时转化中，外源核酸序列不整合进植物基因组中。二、用于产生除草剂抗性植物的碱基编辑系统
本发明提供了一种用于对植物基因组中的除草剂抗性相关基因进行碱基编辑的系统，其包含以下i)至v)中至少一项：
i)碱基编辑融合蛋白，和向导RNA；
ii)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和向导RNA；
iii)碱基编辑融合蛋白，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
iv)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
v)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
其中所述碱基编辑融合蛋白包含核酸酶失活的CRISPR核酸酶(如核酸酶失活的Cas9)结构域和脱氨酶结构域，所述向导RNA能够将所述碱基编辑融合蛋白靶向植物基因组中的除草剂抗性相关基因中的靶序列。
除草剂抗性相关基因可以是编码在植物中具有重要生理活性的蛋白质的基因，其蛋白活性会被除草剂所抑制。在此类野生型除草剂抗性相关基因进行突变，解除除草剂的抑制并保留其生理活性，能够获得对除草剂的抗性。或者，除草剂抗性相关基因编码能够降解除草剂的蛋白。通过突变增强此类除草剂相关基因的表达或增强其表达产生的降解活性能够获得抗性增强的除草剂抗性。
在本发明一些具体实施方式中，除草剂抗性相关基因包括但不限于PsbA基因(抗莠去津等除草剂)、ALS(乙酰乳酸合成酶)基因(抗磺酰脲类除草剂，抗咪唑啉酮除草剂)、EPSPS(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶)基因(抗草甘膦除草剂)、ACCase(乙酰辅酶A羧化酶)基因(抗烯禾啶等除草剂)、PPO(原卟啉原氧化酶)基因(抗唑草酮等除草剂)和HPPD(对羟基苯基丙酮酸双加氧酶)基因(抗硝磺草酮等除草剂)、PDS(八氢番茄红素脱氢酶)(抗吡氟酰草胺等除草剂)、GS(谷氨酰胺合成酶)(草铵膦等除草剂的靶点)、DOXPS(异噁草松等除草剂的靶点)、P450(参与降解除草剂)。
在一些实施方式中，所述向导RNA靶向SEQ ID NO:19-78中一或多个序列。
本发明可使用任何核酸酶失活的CRISPR核酸酶(例如衍生自Cas9，Cpf1等)，只要其保留在gRNA指导下的DNA靶向能力。优选的是核酸酶失活的Cas9。
Cas9核酸酶的DNA切割结构域已知包含两个亚结构域：HNH核酸酶亚结构域和RuvC亚结构域。HNH亚结构域切割与gRNA互补的链，而RuvC亚结构域切割非互补的链。在这些亚结构域中的突变可以使Cas9的核酸酶活性失活，形成“核酸酶失活的Cas9”。所述核酸酶失活的Cas9仍然保留gRNA指导的DNA结合能力。因此，原则上，当与另外的蛋白融合时，核酸酶失活的Cas9可以简单地通过与合适的向导RNA共表达而将所述另外的蛋白靶向几乎任何DNA序列。
胞苷脱氨酶可以催化DNA上胞苷(C)的脱氨化作用形成尿嘧啶(U)。将核酸酶失活的Cas9与胞苷脱氨酶融合，在向导RNA的指导下，融合蛋白可以靶向植物基因组中的靶序列，由于Cas9核酸酶活性缺失，DNA双链不被切割，而融合蛋白中的脱氨酶结构域能够将Cas9-向导RNA-DNA复合物形成中产生的单链DNA的胞苷脱氨转换成U，再通过碱基错配修复实现C至T的取代。
因此，在本发明的一些实施方案中，所述脱氨酶是胞苷脱氨酶，例如载脂蛋白BmRNA编辑复合体(APOBEC)家族脱氨酶。本发明所述脱氨酶特别是可以接受单链DNA作为底物的脱氨酶。
本发明可用的胞苷脱氨酶的实例包括但不限于：APOBEC1脱氨酶、激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)、APOBEC3G或CDA1。
在本发明的一些具体实施方式中，所述胞苷脱氨酶包含SEQ ID NO:10或11中9-235位所示的氨基酸序列。
本发明所述核酸酶失活的Cas9可以衍生自不同物种的Cas9，例如，衍生自化脓链球菌(S.pyogenes)Cas9(SpCas9，氨基酸序列示于SEQ ID NO:5)。同时突变SpCas9的HNH核酸酶亚结构域和RuvC亚结构域(例如，包含突变D10A和H840A)使化脓链球菌(S.pyogenes)Cas9的核酸酶失去活性，成为核酸酶死亡Cas9(dCas9)。突变失活其中一个亚结构域可以使得Cas9具有切口酶活性，即获得Cas9切口酶(nCas9)，例如，仅具有突变D10A的nCas9。
因此，在本发明的一些实施方案中，本发明所述核酸酶失活的Cas9相对于野生型Cas9包含氨基酸取代D10A和/或H840A。
在本发明的一些优选的实施方案中，本发明所述核酸酶失活的Cas9具有切口酶活性。不受任何理论限制，据认为真核生物的错配修复通过DNA链上的切口(nick)来指导该链错配碱基的移除和修复。胞苷脱氨酶作用形成的U:G错配可能被修复为C:G。通过在包含未编辑的G的一条链上引入切口，将能够优先地将U:G错配修复为期望的U:A或T:A。因此，优选地，所述核酸酶失活的Cas9是Cas9切口酶，其保留Cas9的HNH亚结构域的切割活性，而RuvC亚结构域的切割活性失活。例如，所述核酸酶失活的Cas9相对于野生型Cas9包含氨基酸取代D10A。
在本发明的一些具体实施方式中，所述核酸酶失活的Cas9包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些优选实施方式中，所述核酸酶失活的Cas9包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述脱氨酶结构域被融合至所述核酸酶失活的Cas9结构域的N末端。在一些实施方案中，所述脱氨酶结构域被融合至所述核酸酶失活的Cas9结构域的C末端。
在本发明的一些实施方案中，所述脱氨酶结构域和所述核酸酶失活的Cas9结构域通过接头融合。所述接头可以是长1-50个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或20-25个、25-50个)或更多个氨基酸、无二级以上结构的非功能性氨基酸序列。例如，所述接头可以是柔性接头，例如GGGGS、GS、GAP、(GGGGS)x 3、GGS和(GGS)x7等。在一些优选的实施方案中，所述接头是SEQ ID NO:8所示的XTEN接头。
在细胞中，尿嘧啶DNA糖基化酶催化U从DNA上的去除并启动碱基切除修复(BER)，导致将U:G修复成C:G。因此，不受任何理论限制，在本发明的碱基编辑融合蛋白或本发明的系统中包含尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂将能够增加碱基编辑的效率。
因此，在本发明的一些实施方案中，所述碱基编辑融合蛋白还包含尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UBI)。在一些具体实施方式中，所述尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂包含SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施方案中，本发明的碱基编辑融合蛋白还包含核定位序列(NLS)。一般而言，所述碱基编辑融合蛋白中的一个或多个NLS应具有足够的强度，以便在植物细胞的核中驱动所述碱基编辑融合蛋白以可实现其碱基编辑功能的量积聚。一般而言，核定位活性的强度由所述碱基编辑融合蛋白中NLS的数目、位置、所使用的一个或多个特定的NLS、或这些因素的组合决定。
在本发明的一些实施方案中，本发明的碱基编辑融合蛋白的NLS可以位于N端和/或C端。在一些实施方案中，所述碱基编辑融合蛋白包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS。在一些实施方案中，所述碱基编辑融合蛋白包含在或接近于N端的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS。在一些实施方案中，所述碱基编辑融合蛋白包含在或接近于C端约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS。在一些实施方案中，所述碱基编辑融合蛋白包含这些的组合，如包含在N端的一个或多个NLS以及在C端的一个或多个NLS。当存在多于一个NLS时，每一个可以被选择为不依赖于其他NLS。在本发明的一些优选实施方式中，所述碱基编辑融合蛋白包含2个NLS，例如所述2个NLS分别位于N端和C端。
一般而言，NLS由暴露于蛋白表面上的带正电的赖氨酸或精氨酸的一个或多个短序列组成，但其他类型的NLS也是已知的。NLS的非限制性实例包括：KKRKV(核苷酸序列5’-AAGAAGAGAAAGGTC-3’)、PKKKRKV(核苷酸序列5’-CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG-3’或CCAAAGAAGAAGAGGAAGGTT)，或SGGSPKKKRKV(核苷酸序列5’-TCGGGGGGGAGCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTG-3’)。
在本发明的一些实施方式中，所述碱基编辑融合蛋白的N端包含PKKKRKV所示的氨基酸序列的NLS。在本发明的一些实施方式中，所述碱基编辑融合蛋白的C端包含SGGSPKKKRKV所示的氨基酸序列的NLS。
此外，根据所需要编辑的DNA位置，本发明的碱基编辑融合蛋白还可以包括其他的定位序列，例如细胞质定位序列、叶绿体定位序列、线粒体定位序列等。
在本发明的一些具体实施方式中，所述碱基编辑融合蛋白包含SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列。
为了在植物中获得有效表达，在本发明的一些实施方式中，所述编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列针对待进行碱基编辑的植物进行密码子优化。
密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，Nakamura Y.等，“Codon usage tabulatedfrom the international DNA sequence databases:status for theyear2000.Nucl.Acids Res.，28:292(2000)。
在本发明一些具体实施方式中，经密码子优化的所述编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列示于SEQ ID NO:12或13。
在本发明一些实施方式中，所述向导RNA是单向导RNA(sgRNA)。根据给定的靶序列构建合适的sgRNA的方法是本领域已知的。例如，可参见文献：Wang,Y.et al.Simultaneousediting of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritableresistance to powdery mildew.Nat.Biotechnol.32,947-951(2014)；Shan,Q.etal.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cassystem.Nat.Biotechnol.31,686-688(2013)；Liang,Z.et al.Targeted mutagenesis inZea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system.J Genet Genomics.41,63–68(2014)。
在本发明一些实施方式中，所述编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列和/或所述编码向导RNA的核苷酸序列与植物表达调控元件如启动子可操作地连接。
本发明可使用的启动子的实例包括但不限于：花椰菜花叶病毒35S启动子(Odellet al.(1985)Nature 313:810-812)、玉米Ubi-1启动子、小麦U6启动子、水稻U3启动子、玉米U3启动子、水稻肌动蛋白启动子、TrpPro5启动子(美国专利申请No.10/377,318；2005年3月16日提请)、pEMU启动子(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)、MAS启动子(Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723-2730)、玉米H3组蛋白启动子(Lepetit et al.(1992)Mol.Gen.Genet.231:276-285和Atanassova et al.(1992)Plant J.2(3):291-300)和欧洲油菜(Brassica napus)ALS3(PCT申请WO 97/41228)启动子。可用于本发明的启动子还包含Moore et al.(2006)Plant J.45(4):651-683中综述的常用组织特异性启动子。
三、通过碱基编辑产生除草剂抗性植物的方法
在另一方面，本发明提供了一种产生除草剂抗性植物的方法，包括将本发明的用于对植物基因组中的除草剂抗性相关基因进行碱基编辑的系统导入植物，由此所述向导RNA将所述碱基编辑融合蛋白靶向所述植物中的除草剂抗性相关基因的靶序列，导致所述靶序列中的一或多个核苷酸取代。
在一些实施方式中，所述方法还包括针对除草剂抗性筛选对植物进行筛选的步骤。
在一些实施方式中，所述除草剂抗性相关基因编码除草剂抗性相关蛋白。在本发明一些具体实施方式中，除草剂抗性相关蛋白包括但不限于PsbA(抗莠去津等除草剂)、ALS(抗磺酰脲类除草剂，抗咪唑啉酮除草剂)、EPSPS(抗草甘膦除草剂)、ACCase(抗烯禾啶等除草剂)、PPO(抗唑草酮等除草剂)和HPPD(抗硝磺草酮等除草剂)、PDS(抗吡氟酰草胺等除草剂)、GS(草铵膦等除草剂的靶点)、DOXPS(异噁草松等除草剂的靶点)、P450(参与降解除草剂)。
在一些实施方式中，所述核苷酸取代是C至T取代。在一些实施方式中，所述核苷酸取代是C至A或C至G取代。在一些实施方式中，所述核苷酸取代位于除草剂抗性相关基因的非编码区例如表达调控区。在一些实施方式中，所述核苷酸取代导致所述基因编码的除草剂抗性蛋白中的氨基酸取代。在一些实施方式中，所述核苷酸取代和/或氨基酸取代赋予所述植物除草剂抗性。
在本发明的一些实施方式中，所述赋予植物除草剂抗性的核苷酸取代/或氨基酸取代可以是本领域已知的任何除草剂抗性相关基因中赋予植物除草剂抗性的取代。通过本发明的方法，可以在植物中原位创建能够赋予除草剂抗性的单突变、双突变或多突变，无需进行转基因。所述突变可以是本领域已知的，或者可以是通过本发明的方法新鉴定的。
本发明提供了一种产生除草剂抗性植物的方法，包括通过本发明的碱基编辑方法对植物中的ALS基因进行修饰，导致ALS中的一个或多个氨基酸突变，所述氨基酸突变赋予植物除草剂抗性。在一些实施方式中，所述氨基酸突变选自A122T、P197S、P197L、P197F、R198C、D204N、A205T、D204N+A205T、G654K、G655D、G655S、G655N、G654K+G655D、G654K+G655S、G654K+G655N、G659N、P197S、P197L、P197F、D204N、A205T、D204N+A205T、G654D、G654S、G654N、G655D、G655S、G655N、G654D+G655D、G654D+G655S、G654D+G655N、G654S+G655D、G654S+G655S、G654S+G655N、G654N+G655D、G654N+G655S、G654N+G655N、A122T，或其任意组合，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：2(拟南芥中ALS的氨基酸序列，Genbankaccession NO:NP_190425)。在一些具体实施方式中，所述氨基酸突变选自P197A、P197F、P197S、P197Y、P197F+R198C、G654E+G655S、G654K+G655S、G654E+G659N、P197F+G654E+G655S，或其任意组合，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：2(拟南芥中ALS的氨基酸序列，Genbank accession NO:NP_190425)。
因此，在一些实施方式中，所述向导RNA靶向包含选自编码氨基酸A122、P197、R198、D204、A205、G654、G655、G659或其任意组合的序列的靶序列，所述氨基酸位置参考SEQID No：2(拟南芥中ALS的氨基酸序列，Genbank accession NO:NP_190425)。
在一些实施方式中，所述ALS是水稻ALS，其野生型序列示于SEQ ID No：16。在一些实施方式中，所述ALS是小麦ALS，其野生型部分序列示于SEQ ID No：17(部分序列，genbankID:AAO53548.1)。
本发明提供了一种产生除草剂抗性植物的方法，包括通过本发明的碱基编辑方法对植物中的PsbA基因进行修饰，导致PsbA中的一个或多个氨基酸突变，所述氨基酸突变赋予植物除草剂抗性。
本发明提供了一种产生除草剂抗性植物的方法，包括通过本发明的碱基编辑方法对植物中的EPSPS基因进行修饰，导致EPSPS中的一个或多个氨基酸突变，所述氨基酸突变赋予植物除草剂抗性。在一些实施方式中，所述氨基酸突变选自T102I、A103V、T102I+A103V，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：4(小麦A基因组EPSPS氨基酸序列，Genbankaccession NO：ALK27163)。
因此，在一些实施方式中，所述向导RNA靶向包含选自编码氨基酸T102和/或A103的序列的靶序列，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：4。
本发明提供了一种产生除草剂抗性植物的方法，包括通过本发明的碱基编辑方法对植物中的ACCase基因进行修饰，导致ACCase中的一个或多个氨基酸突变，所述氨基酸突变赋予植物除草剂抗性。在一些实施方式中，所述氨基酸突变选自S1768F、R1793K、A1794T、R1793K+A1794T、R1825H、D1827N、R1825H+D1827N、L1815F、A1816V、R1817Stop、L1815F+R1817Stop、A1816V+R1817Stop、L1815F+A1816V、L1815F,A1816V,+R1817Stop、A1837V、G1854D、G1855D、G1855S、G1854N、G1854D+G1855D、G1854D+G1855S、G1854D+G1855N、D1971N、D1972N、D1971N+D1972N、G1983D、P1993S、P1993L、P1993F、R1994C、P1993S+R1994C、P1993L+R1994C、P1993F+R1994C、S2003F、A2004V、T2005I、S2003F+A2004V、S2003F+T2005I、A2004V+T2005I、T2007I、A2008V、T2007I+A2008V、R2028K、W2027C、G2029D、G2029S、G2029N、R2028K+G2029D、R2028K+G2029S、R2028K+G2029N、T2047I、R2070Q、G2071R、R2070Q+G2071R、A2090T、E2091K、A2090T+E2091K、A2090V、E2106K、S2119N、R2220Q、S2119N+R2220Q、A1813V、R1793K、A1794T、R1793K+A1794T、E1796K、E1797K、E1796K+E1797K、T1800M、L1801F、T1800M+L1801F、A1813V、G1854D、G1854S、G1854N、G1855D、G1855S、G1855N、G1854D+G1855D、G1854D+G1855S、G1854D+G1855N、G1854S+G1855D、G1854S+G1855S、G1854S+G1855N、G1854N+G1855D、G1854N+G1855S、G1854N+G1855N、S1849F、H1850Y、S1849F+H1850Y、D1874N、D1875N、D1874N+D1875N、R2028K、G2029D、G2029S、G2029N、R2028K+G2029D、R2028K+G2029S、R2028K+G2029N、L2024F、T2047I、R2070C、A2090V、G1983D、E1989K、R1990Q、E1989K+R1990Q、P1993S、P1993L、P1993F、R1994C、P1993S+R1994C、P1993L+R1994C、P1993F+R1994C、T2007I、A2008V、T2007I+A2008V、S2003L、A2004V、T2005I、S2003L+A2004V、S2003L+T2005I、A2004V+T2005I、S2003L,A2004V+T2005I、L2099F、E2106K、R2220K、G2119D、R2220K+G2119D，或其任意组合，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：1(大穗看麦娘(Alopecurus myosuroides)ACCase氨基酸序，GenBankaccession NO.CAC84161.1)。在一些具体实施方式中，所述氨基酸突变选自W2027C、W2027C+R2028K，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：1(大穗看麦娘(Alopecurus myosuroides)ACCase氨基酸序，GenBank accession NO.CAC84161.1)。
因此，在一些实施方式中，所述向导RNA靶向包含选自编码氨基酸S1768、R1793、A1794、R1825、D1827、L1815、A1816、R1817、A1837、G1854、G1855、D1971、D1972、G1983、P1993、R1994、S2003、A2004、T2005、T2007、A2008、R2028、G2029、T2047、R2070、G2071、A2090、E2091、E2106、S2119、R2220、A1813、E1796、E1797、T1800、L1801、S1849、H1850、D1874、D1875、L2024、E1989、R1990、L2099或其任意组合的序列的靶序列，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：1。
在一些实施方式中，所述ACCase是水稻ACCase，其野生型序列示于SEQ ID No：14(genbank ID:B9FK36)。在一些实施方式中，所述ACCase是小麦ACCase，其野生型序列示于SEQ ID No：15(genbank ID:ACD46684.1)。
本发明提供了一种产生除草剂抗性植物的方法，包括通过本发明的碱基编辑方法对植物中的PPO基因进行修饰，导致PPO中的一个或多个氨基酸突变，所述氨基酸突变赋予植物除草剂抗性。
本发明提供了一种产生除草剂抗性植物的方法，包括通过本发明的碱基编辑方法对植物中的HPPD基因进行修饰，导致HPPD中的一个或多个氨基酸突变，所述氨基酸突变赋予植物除草剂抗性。在一些实施方式中，所述氨基酸突变选自P277S、P277L、V364M、C413Y、G414D、G414S、G414N、G415E、G415R、G415K、G414D+G415E、G414D+G415R、G414D+G415K、G414S+G415E、G414S+G415R、G414S+G415K、G414N+G415E、G414N+G415R、G414N+G415K、C413Y+G415E、C413Y+G415R、C413Y+G415K、C413Y+G414D、C413Y+G414S、C413Y+G414N、C413Y+G414D+G415E、C413Y+G414D+G415R、C413Y+G414D+G415K、C413Y+G414S+G415E、C413Y+G414S+G415R、C413Y+G414S+G415K、C413Y+G414N+G415E、C413Y+G414N+G415R、C413Y+G414N+G415K、P277S、P277L、V366I、C413Y、G414D、G414S、G414N、G415E、G415R、G415K、G414D+G415E、G414D+G415R、G414D+G415K、G414S+G415E、G414S+G415R、G414S+G415K、G414N+G415E、G414N+G415R、G414N+G415K、C413Y+G415E、C413Y+G415R、C413Y+G415K、C413Y+G414D、C413Y+G414S、C413Y+G414N、C413Y+G414D+G415E、C413Y+G414D+G415R、C413Y+G414D+G415K、C413Y+G414S+G415E、C413Y+G414S+G415R、C413Y+G414S+G415K、C413Y+G414N+G415E、C413Y+G414N+G415R、C413Y+G414N+G415K，或其任意组合，所述氨基酸位置参考SEQID No：3(水稻HPPD的氨基酸序列，GenbankAccession NO:XP_015626163)。
因此，在一些实施方式中，所述向导RNA靶向包含选自编码氨基酸P277、V364、C413、G414、G415、V366或其任意组合的序列的靶序列，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：3。
可以被Cas9和向导RNA复合物识别并靶向的靶序列的设计属于本领域普通技术人员的技能范围。一般而言，靶序列是与向导RNA中包含的大约20个核苷酸的引导序列互补的序列，且3’末端紧邻前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif)(PAM)NGG。
例如，在本发明的一些实施方案中，所述靶序列具有以下结构：5’-NX-NGG-3’，其中N独立地选自A、G、C和T；X为14≤X≤30的整数；Nx表示X个连续的核苷酸，NGG为PAM序列。在本发明的一些具体的实施方案中，X为20。
在一些实施方式中，所述向导RNA靶向SEQ ID NO:19-78中一或多个序列。
本发明的碱基编辑系统在植物中具有宽的脱氨化窗口，例如，具有长度为7个核苷酸的脱氨化窗口。在本发明所述方法的一些实施方案中，所述靶序列中第3至第9位内的一或多个C被T取代。例如，如果存在，所述靶序列中第3至第9位内的任意1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个C被T取代。例如，如果所述靶序列的第3至第9位内包含4个C，则其中任意1个、2个、3个、4个C可以被T取代。所述C可以是连续的，也可是由其他核苷酸分隔开。因此，如果靶序列中存在多个C，通过本发明的方法可以获得多种的突变组合。
在本发明所述方法的一些实施方案中，还包括筛选具有期望的核苷酸取代的植物。可以通过T7EI、PCR/RE或测序方法检测植物中的核苷酸取代，例如可参见Shan,Q.,Wang,Y.,Li,J.&Gao,C.Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cassystem.Nat.Protoc.9,2395-2410(2014)。
在本发明的方法中，所述碱基编辑系统可以本领域技术人员熟知的各种方法导入植物。可用于将本发明的碱基编辑系统导入植物的方法包括但不限于：基因枪法、PEG介导的原生质体转化、土壤农杆菌介导的转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法和子房注射法。在一些实施方案中，所述碱基编辑系统通过瞬时转化导入植物。
在本发明的方法中，只需在植物细胞中导入或产生所述碱基编辑融合蛋白和向导RNA即可实现对靶序列的修饰，并且所述修饰可以稳定遗传，无需将所述碱基编辑系统稳定转化植物。这样避免了稳定存在的碱基编辑系统的潜在脱靶作用，也避免外源核苷酸序列在植物基因组中的整合，从而具有更高生物安全性。
在一些优选实施方式中，所述导入在不存在选择压力下进行，从而避免外源核苷酸序列在植物基因组中的整合。
在一些实施方式中，所述导入包括将本发明的碱基编辑系统转化至分离的植物细胞或组织，然后使所述经转化的植物细胞或组织再生为完整植物。优选地，在不存在选择压力下进行所述再生，也即是，在组织培养过程中不使用任何针对表达载体上携带的选择基因的选择剂。不使用选择剂可以提高植物的再生效率，获得不含外源核苷酸序列的经修饰的植物。
在另一些实施方式中，可以将本发明的碱基编辑系统转化至完整植物上的特定部位，例如叶片、茎尖、花粉管、幼穗或下胚轴。这特别适合于难以进行组织培养再生的植物的转化。
在本发明的一些实施方式中，直接将体外表达的蛋白质(如碱基编辑融合蛋白)和/或体外转录的RNA分子(如gRNA)转化至所述植物。所述蛋白质和/或RNA分子能够在植物细胞中实现碱基编辑，随后被细胞降解，避免了外源核苷酸序列在植物基因组中的整合。
因此，在一些实施方式中，所述除草剂抗性植物是非转基因的。
可用于本发明的方法的植物包括单子叶植物和双子叶植物。例如，所述植物可以是作物植物，例如小麦、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯或马铃薯。所述植物还可以是蔬菜作物，包括但不仅限于白菜、甘蓝、黄瓜、番茄。所述植物还可以是花卉作物，包括但不仅限于康乃馨、牡丹、玫瑰等。所述植物还可以是水果作物，包括但不仅限于西瓜、甜瓜、草莓，蓝莓，葡萄，苹果、柑橘、桃子。所述植物还可以是中草药，包括但不仅限于板蓝根、甘草、人参、防风。所述植物还可以是拟南芥。
在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括获得所述除草剂抗性植物的后代。
在另一方面，本发明还提供了除草剂抗性植物或其后代或其部分，其中所述植物通过本发明上述的方法获得。在一些实施方式中，所述除草剂抗性植物是非转基因的。
在另一方面，本发明还提供了一种植物育种方法，包括将通过本发明上述的方法获得的除草剂抗性植物的第一植物与不具有除草剂抗性的第二植物杂交，从而将所述除草剂抗性导入第二植物。
本发明还涵盖通过本发明的方法获得的除草剂抗性植物或其后代。
四、鉴定除草剂抗性相关蛋白的变体
通过本发明的方法，对除草剂抗性相关基因进行靶向碱基修饰，可以容易地获得大量除草剂抗性相关基因的突变体，然后通过抗性筛选鉴定出新的能够赋予除草剂抗性的突变位点。
因此，本发明还提供一种鉴定除草剂抗性相关蛋白的变体的方法，所述变体能够赋予植物除草剂抗性，所述方法包括：
i)通过上述第三项的方法产生除草剂抗性植物；和
ii)鉴定所产生的除草剂抗性植物中所述除草剂抗性相关基因序列和/或其编码的除草剂抗性相关蛋白序列，从而鉴定所述变体的序列。
五、除草剂抗性相关蛋白变体、核酸、表达构建体和其用途
本发明还提供通过本发明上述第四项所述的方法鉴定的除草剂抗性相关蛋白的变体。
本发明还提供一种植物ACCase变体，所述ACCase变体相对于野生型ACCase在选自1768、1793、1796、1797、1794、1800、1801、1813、1813、1815、1825、1827、1815、1816、1817、1837、1838、1849、1850、1854、1855、1874、1875、1971、1872、1983、1989、1990、1993、1994、2003、2004、2005、2007、2008、2024、2027、2028、2029、2047、2070、2071、2090、2091、2090、2106、2099、2106、2119、2220的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQID No：1，所述变体赋予植物除草剂抗性。在一些实施方式中，所述氨基酸突变选自S1768F、R1793K、A1794T、R1793K+A1794T、R1825H、D1827N、R1825H+D1827N、L1815F、A1816V、R1817Stop、L1815F+R1817Stop、A1816V+R1817Stop、L1815F+A1816V、L1815F,A1816V,+R1817Stop、A1837V、G1854D、G1855D、G1855S、G1854N、G1854D+G1855D、G1854D+G1855S、G1854D+G1855N、D1971N、D1972N、D1971N+D1972N、G1983D、P1993S、P1993L、P1993F、R1994C、P1993S+R1994C、P1993L+R1994C、P1993F+R1994C、S2003F、A2004V、T2005I、S2003F+A2004V、S2003F+T2005I、A2004V+T2005I、T2007I、A2008V、T2007I+A2008V、R2028K、G2029D、G2029S、G2029N、R2028K+G2029D、R2028K+G2029S、R2028K+G2029N、T2047I、R2070Q、G2071R、R2070Q+G2071R、A2090T、E2091K、A2090T+E2091K、A2090V、E2106K、S2119N、R2220Q、S2119N+R2220Q、A1813V、R1793K、A1794T、R1793K+A1794T、E1796K、E1797K、E1796K+E1797K、T1800M、L1801F、T1800M+L1801F、A1813V、G1854D、G1854S、G1854N、G1855D、G1855S、G1855N、G1854D+G1855D、G1854D+G1855S、G1854D+G1855N、G1854S+G1855D、G1854S+G1855S、G1854S+G1855N、G1854N+G1855D、G1854N+G1855S、G1854N+G1855N、S1849F、H1850Y、S1849F+H1850Y、D1874N、D1875N、D1874N+D1875N、W2027C、R2028K、W2027C+R2028K、G2029D、G2029S、G2029N、R2028K+G2029D、R2028K+G2029S、R2028K+G2029N、L2024F、T2047I、R2070C、A2090V、G1983D、E1989K、R1990Q、E1989K+R1990Q、P1993S、P1993L、P1993F、R1994C、P1993S+R1994C、P1993L+R1994C、P1993F+R1994C、T2007I、A2008V、T2007I+A2008V、S2003L、A2004V、T2005I、S2003L+A2004V、S2003L+T2005I、A2004V+T2005I、S2003L,A2004V+T2005I、L2099F、E2106K、R2220K、G2119D、R2220K+G2119D，或其任意组合。在一些具体实施方式中，所述氨基酸突变选自W2027C、W2027C+R2028K，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：1(大穗看麦娘(Alopecurus myosuroides)ACCase氨基酸序，GenBank accession NO.CAC84161.1)。
在一些实施方式中，所述ACCase是水稻ACCase，其野生型序列示于SEQ ID No：14(genbank ID:B9FK36)。在一些实施方式中，所述ACCase是小麦ACCase，其野生型序列示于SEQ ID No：15(genbank ID:ACD46684.1)。
该变体的表达能够使植物(如水稻、玉米、小麦等单子叶植物)获得对环己烯酮类除草剂(如烯草酮)、芳氧苯氧丙酸类除草剂(如高效氟吡甲禾灵)、苯基吡唑啉类除草剂(如唑啉草酯)等ACCase酶抑制剂类除草剂中的单一抗性(对其中的一种除草剂有抗性)或交互抗性(对其中的两种或两种以上的除草剂有抗性)。ACCase酶是植物合成脂肪酸通路中的关键酶，抑制其活性最终导致植物因脂肪酸缺乏而死亡。
本发明还提供一种植物ALS变体，所述ALS变体相对于野生型ALS在选自122、197、204、205、653、654、655、659的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQID No：2，所述变体赋予植物除草剂抗性。在一些实施方式中，所述氨基酸突变选自A122T、P197A、P197Y、P197S、P197L、P197F、D204N、A205T、D204N+A205T、E654K、G655D、G655S、G655N、E654K+G655D、E654K+G655S、E654K+G655N、G659N、P197S、P197L、P197F、D204N、A205T、D204N+A205T、G654D、G654S、G654N、G655D、G655S、G655N、G654D+G655D、G654D+G655S、G654D+G655N、G654S+G655D、G654S+G655S、G654S+G655N、G654N+G655D、G654N+G655S、G654N+G655N、A122T，或其任意组合。在一些具体实施方式中，所述氨基酸突变选自P197A、P197F、P197S、P197Y、P197F+R198C、G654E+G655S、G654K+G655S、G654E+G659N、P197F+G654E+G655S，或其任意组合，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：2(拟南芥中ALS的氨基酸序列，Genbank accession NO:NP_190425)。
在一些实施方式中，所述ALS是水稻ALS，其野生型序列示于SEQ ID No：16。在一些实施方式中，所述ALS是小麦ALS，其野生型部分序列示于SEQ ID No：17(部分序列，genbankID:AAO53548.1)。
该变体的表达能够使得植物(如水稻、玉米、小麦等单子叶植物，大豆、棉花、油菜、向日葵等双子植物)对以下一类或多类除草剂具有了更高水平的除草剂抗性：咪唑啉酮类除草剂(如甲咪唑烟酸)，磺酰脲类除草剂(如烟嘧磺隆)，三唑啉酮类除草剂(如氟唑磺隆)，三唑嘧啶类除草剂(如五氟磺草胺)，嘧啶水杨酸类除草剂(如双草醚)。ALS酶是植物中合成支链氨基酸通路中的关键酶，抑制其活性最终导致植物因缺乏支链氨基酸而死亡。
本发明还提供一种植物HPPD变体，所述HPPD变体相对于野生型HPPD在选自277、364、366、413、414、415的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ IDNo：3，所述变体赋予植物除草剂抗性。在一些实施方式中，所述氨基酸突变选自P277S、P277L、V364M、C413Y、G414D、G414S、G414N、G415E、G415R、G415K、G414D+G415E、G414D+G415R、G414D+G415K、G414S+G415E、G414S+G415R、G414S+G415K、G414N+G415E、G414N+G415R、G414N+G415K、C413Y+G415E、C413Y+G415R、C413Y+G415K、C413Y+G414D、C413Y+G414S、C413Y+G414N、C413Y+G414D+G415E、C413Y+G414D+G415R、C413Y+G414D+G415K、C413Y+G414S+G415E、C413Y+G414S+G415R、C413Y+G414S+G415K、C413Y+G414N+G415E、C413Y+G414N+G415R、C413Y+G414N+G415K、P277S、P277L、V366I、C413Y、G414D、G414S、G414N、G415E、G415R、G415K、G414D+G415E、G414D+G415R、G414D+G415K、G414S+G415E、G414S+G415R、G414S+G415K、G414N+G415E、G414N+G415R、G414N+G415K、C413Y+G415E、C413Y+G415R、C413Y+G415K、C413Y+G414D、C413Y+G414S、C413Y+G414N、C413Y+G414D+G415E、C413Y+G414D+G415R、C413Y+G414D+G415K、C413Y+G414S+G415E、C413Y+G414S+G415R、C413Y+G414S+G415K、C413Y+G414N+G415E、C413Y+G414N+G415R、C413Y+G414N+G415K，或其任意组合。
在一些实施方式中，所述HPPD是水稻HPPD，其野生型序列示于SEQ ID No：3。在一些实施方式中，所述HPPD是小麦HPPD，其野生型序列示于SEQ ID No：18。
该变体的表达能够使得植物(如水稻、玉米、小麦等单子叶植物，大豆、棉花、油菜、向日葵等双子植物)对一个或多个HPPD抑制剂类除草剂(如硝磺草酮、苯唑草酮)具有了更高水平的除草剂抗性。HPPD是植物合成叶绿素通路中的关键酶，抑制HPPD酶的活性最终导致植物白化失绿而死亡。
本发明还提供一种植物EPSPS变体，所述EPSPS变体相对于野生型EPSPS在选自102和103的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：4，所述变体赋予植物除草剂抗性。在一些实施方式中，所述氨基酸突变选自T102I、A103V、T102I+A103V。EPSPS酶是植物中合成芳香族氨基酸通路中的关键酶，抑制其活性最终导致植物因缺乏芳香族氨基酸而死亡。
在一些实施方式中，所述EPSPS是小麦EPSPS，其野生型序列示于SEQ ID No：4。
该变体的表达能够使得植物(如水稻、玉米、小麦等单子叶植物，大豆、棉花、油菜、向日葵等双子植物)对草甘膦的抗性显著提高。
在一些实施方式中，本发明的变体还包含本领域已知的其他能够赋予植物除草剂抗性的氨基酸突变。
本发明还提供一种分离的核酸，其包含编码本发明的变体的核苷酸序列。
本发明还提供一种表达盒，其包含与调控序列可操纵地连接的编码本发明的变体的核苷酸序列。
本发明还提供一种表达构建体，其包含编码本发明的变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列与调控序列可操纵地连接。
本发明还提供本发明的变体，以及本发明的分离的核酸、表达盒和表达构建体在产生除草剂抗性植物中的用途。
本发明还提供一种产生除草剂抗性植物的方法，包括将本发明的分离的核酸、本发明的表达盒和/或本发明的表达构建体导入植物中。
本发明还提供一种除草剂抗性植物，所述植物包含本发明的表达盒或者由本发明的分离的核酸或表达构建体转化。本发明还涵盖所述除草剂抗性植物的后代。
所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。例如，所述植物可以是作物植物，例如小麦、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯或马铃薯。所述植物还可以是蔬菜作物，包括但不仅限于白菜、甘蓝、黄瓜、番茄。所述植物还可以是花卉作物，包括但不仅限于康乃馨、牡丹、玫瑰等。所述植物还可以是水果作物，包括但不仅限于西瓜、甜瓜、草莓，蓝莓，葡萄，苹果、柑橘、桃子。所述植物还可以是中草药，包括但不仅限于板蓝根、甘草、人参、防风。所述植物还可以是拟南芥。
实施例
实施例1.碱基编辑载体构建
在本实施例中，构建了针对不同作物的ALS、ACCase、EPSPS、HPPD等除草剂抗性相关基因的碱基编辑载体。
水稻：
根据Yuan Zong报道文章(Zong,Y.et al.Precise base editing in rice,wheatand maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion.Nat.Biotechnol.2017,doi:10.1038/nbt.3811)，使用pH-nCas9-PBE构建靶向OsALS、OsACCase和OsHPPD基因的碱基突变载体。其中靶向OsALS基因的单个位点4个(R1-R4)，靶向OsALS基因的双位点组合3个(R25-R27)，靶向OsACCase基因的单个位点20个(R5-R24)，靶向OsHPPD因的单个位点4个(R28-R30)。实验中sgRNA靶序列表1所示。潜在抗性突变如表3所示。
表1.水稻ALS基因及sgRNA靶序列
下划线字体表示PAM序列
小麦：
根据Yuan Zong报道文章(Zong,Y.et al.Precise base editing in rice,wheatand maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion.Nat.Biotechnol.2017,doi:10.1038/nbt.3811)，使用pTaU6构建靶向TaALS、TaACCase、TaEPSPS和TaHPPD基因的碱基突变载体，其中靶向TaALS基因的单个位点4个(W1-W3，W16)，靶向TaALS基因的双位点组合3个(W31-W33)，靶向TaACCase基因的单个位点20个(W4-W15，W17-W24)，靶向TaEPSPS基因的单个位点3个(W25-W27)，靶向TaHPPD基因的单个位点3个(W28-W30)，同时靶向TaALS和TaACCase基因的双位点组合1个(W34)。实验中sgRNA靶序列表2所示。潜在抗性突变如表4所示。
表2.小麦靶基因及sgRNA靶序列
下划线字体表示PAM序列
表3.水稻潜在除草剂抗性突变位点。
表4.小麦潜在除草剂抗性突变位点。
实施例2.水稻及小麦转化
水稻(农杆菌转化)：
pH-nCas9-PBE载体系列通过电穿孔转化进农杆菌AGL1菌株。根据Shan等人(Shan,Q.et al.Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cassystem.Nat.Biotechnol.31,686-688(2013))进行水稻栽培种中花11的农杆菌介导的转化、组织培养和再生。在全部随后的组织培养过程中使用潮霉素筛选(50μg/ml)。
小麦(基因枪转化)：
质粒DNA(pnCas9-PBE和pTaU6载体系列等比例混合)用于轰击科农199幼胚。如之前描述(Zhang,K.,Liu,J.,Zhang,Y.,Yang,Z.&Gao,C.Biolistic genetictransformation of a wide range of Chinese elite wheat(Triticum aestivum L.)varieties.J.Genet.Genomics.42,39-42(2015))进行基因枪转化。在轰击后，根据文献记载处理胚，不过在组织培养过程中不使用任何选择剂。
实施例3.建立抗性转化植株的抗性筛选体系
选取表5中所列除草剂，配制含有不同浓度除草剂的1/2MS培养基对生长一致的野生型水稻、小麦组培苗进行筛选，7天后选出可抑制植物生长的最低除草剂浓度作为后续转化植株的抗性筛选浓度。
表5.筛选所用除草剂
除草剂名称 抑制基因 水稻筛选浓度PPM 小麦筛选浓度PPM
甲咪唑烟酸 ALS
烟嘧磺隆 ALS 0.012 0.13
甲氧磺草胺 ALS
氟唑磺隆 ALS
双草醚 ALS
精恶唑禾草灵 ACCase 4.5
千金 ACCase 5.3
烯禾啶 ACCase 0.33 0.33
唑啉草酯 ACCase
高效氟吡甲禾灵 ACCase 0.036 0.036
硝磺草酮 HPPD
草甘膦 EPSPS
实施例4.抗性植株的筛选及鉴定
将实施例3获得的转化植物放在相应除草剂筛选培养基上(表5)生长，观察表型，挑出抗性植株(图1-3)。
提取抗性植株DNA后进行T7EI和PCR/RE检测，最后通过Sanger测序确认靶基因的突变类型。
结果，在植物内源性蛋白ALS和ACCase中筛选出以下能够赋予植物除草剂抗性突变位点。本发明的碱基编辑系统除C-T突变外，还可能造成有C-G/A的突变，因此能筛选出预期之外的抗性突变。
表6.水稻ALS抗性突变。
表7.水稻ACCase抗性突变
表8.小麦烟嘧磺隆抗性突变
序列：
SEQ ID NO：1大穗看麦娘ACCase氨基酸序列
MGSTHLPIVGFNASTTPSLSTLRQINSAAAAFQSSSPSRSSKKKSRRVKSIRDDGDGSVPDPAGHGQSIRQGLAGIIDLPKEGASAPDVDISHGSEDHKASYQMNGILNESHNGRHASLSKVYEFCTELGGKTPIHSVLVANNGMAAAKFMRSVRTWANDTFGSEKAIQLIAMATPEDMRINAEHIRIADQFVEVPGGTNNNNYANVQLIVEIAERTGVSAVWPGWGHASENPELPDALTAKGIVFLGPPASSMNALGDKVGSALIAQAAGVPTLAWSGSHVEIPLELCLDSIPEEMYRKACVTTADEAVASCQMIGYPAMIKASWGGGGKGIRKVNNDDEVKALFKQVQGEVPGSPIFIMRLASQSRHLEVQLLCDEYGNVAALHSRDCSVQRRHQKIIEEGPVTVAPRETVKELEQAARRLAKAVGYVGAATVEYLYSMETGEYYFLELNPRLQVEHPVTESIAEVNLPAAQVAVGMGIPLWQIPEIRRFYGMDNGGGYDIWRKTAALATPFNFDEVDSQWPKGHCVAVRITSENPDDGFKPTGGKVKEISFKSKPNVWGYFSVKSGGGIHEFADSQFGHVFAYGETRSAAITSMSLALKEIQIRGEIHTNVDYTVDLLNAPDFRENTIHTGWLDTRIAMRVQAERPPWYISVVGGALYKTITTNAETVSEYVSYLIKGQIPPKHISLVHSTISLNIEESKYTIEIVRSGQGSYRLRLNGSLIEANVQTLCDGGLLMQLDGNSHVIYAEEEAGGTRLLIDGKTCLLQNDHDPSRLLAETPCKLLRFLIADGAHVDADVPYAEVEVMKMCMPLLSPAAGVINVLLSEGQAMQAGDLIARLDLDDPSAVKRAEPFEGSFPEMSLPIAASGQVHKRCAASLNAARMVLAGYDHAANKVVQDLVWCLDTPALPFLQWEELMSVLATRLPRRLKSELEGKYNEYKLNVDHVKIKDFPTEMLRETIEENLACVSEKEMVTIERLVDPLMSLLKSYEGGRESHAHFIVKSLFEEYLSVEELFSDGIQSDVIERLRLQYSKDLQKVVDIVLSHQGVRNKTKLILALMEKLVYPNPAAYRDQLIRFSSLNHKRYYKLALKASELLEQTKLSELRTSIARNLSALDMFTEEKADFSLQDRKLAINESMGDLVTAPLPVEDALVSLFDCTDQTLQQRVIQTYISRLYQPQLVKDSIQLKYQDSGVIALWEFTEGNHEKRLGAMVILKSLESVSTAIGAALKDASHYASSAGNTVHIALLDADTQLNTTEDSGDNDQAQDKMDKLSFVLKQDVVMADLRAADVKVVSCIVQRDGAIMPMRRTFLLSEEKLCYEEEPILRHVEPPLSALLELDKLKVKGYNEMKYTPSRDRQWHIYTLRNTENPKMLHRVFFRTLVRQPSAGNRFTSDHITDVEVGHAEEPLSFTSSSILKSLKIAKEELELHAIRTGHSHMYLCILKEQKLLDLVPVSGNTVVDVGQDEATACSLLKEMALKIHELVGARMHHLSVCQWEVKLKLVSDGPASGSWRVVTTNVTGHTCTVDIYREVEDTESQKLVYHSTALSSGPLHGVALNTSYQPLSVIDLKRCSARNNKTTYCYDFPLTFEAAVQKSWSNISSENNQCYVKATELVFAEKNGSWGTPIIPMQRAAGLNDIGMVAWILDMSTPEFPSGRQIIVIANDITFRAGSFGPREDAFFEAVTNLACEKKLPLIYLAANSGARIGIADEVKSCFRVGWTDDSSPERGFRYIYMTDEDHDRIGSSVIAHKMQLDSGEIRWVIDSVVGKEDGLGVENIHGSAAIASAYSRAYEETFTLTFVTGRTVGIGAYLARLGIRCIQRIDQPIILTGFSALNKLLGREVYSSHMQLGGPKIMATNGVVHLTVPDDLEGVSNILRWLSYVPANIGGPLPITKSLDPIDRPVAYIPENTCDPRAAISGIDDSQGKWLGGMFDKDSFVETFEGWAKTVVTGRAKLGGIPVGVIAVETQTMMQLVPADPGQPDSHERSVPRAGQVWFPDSATKTAQAMLDFNREGLPLFILANWRGFSGGQRDLFEGILQAGSTIVENLRTYNQPAFVYIPKAAELRGGAWVVIDSKINPDRIECYAERTAKGNVLEPQGLIEIKFRSEELKECMGRLDPELIDLKARLQGANGSLSDGESLQKSIEARKKQLLPLYTQIAVRFAELHDTSLRMAAKGVIRKVVDWEDSRSFFYKRLRRRLSEDVLAKEIRGVIGEKFPHKSAIELIKKWYLASEAAAAGSTDWDDDDAFVAWRENPENYKEYIKELRAQRVSRLLSDVAGSSSDLQALPQGLSMLLDKMDPSKRAQFIEEVMKVLK
SEQ ID NO：2拟南芥ALS氨基酸序列：
MAAATTTTTTSSSISFSTKPSPSSSKSPLPISRFSLPFSLNPNKSSSSSRRRGIKSSSPSSISAVLNTTTNVTTTPSPTKPTKPETFISRFAPDQPRKGADILVEALERQGVETVFAYPGGASMEIHQALTRSSSIRNVLPRHEQGGVFAAEGYARSSGKPGICIATSGPGATNLVSGLADALLDSVPLVAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVMDVEDIPRIIEEAFFLATSGRPGPVLVDVPKDIQQQLAIPNWEQAMRLPGYMSRMPKPPEDSHLEQIVRLISESKKPVLYVGGGCLNSSDELGRFVELTGIPVASTLMGLGSYPCDDELSLHMLGMHGTVYANYAVEHSDLLLAFGVRFDDRVTGKLEAFASRAKIVHIDIDSAEIGKNKTPHVSVCGDVKLALQGMNKVLENRAEELKLDFGVWRNELNVQKQKFPLSFKTFGEAIPPQYAIKVLDELTDGKAIISTGVGQHQMWAAQFYNYKKPRQWLSSGGLGAMGFGLPAAIGASVANPDAIVVDIDGDGSFIMNVQELATIRVENLPVKVLLLNNQHLGMVMQWEDRFYKANRAHTFLGDPAQEDEIFPNMLLFAAACGIPAARVTKKADLREAIQTMLDTPGPYLLDVICPHQEHVLPMIPSGGTFNDVITEGDGRIKY
SEQ ID NO：3水稻HPPD氨基酸序列
MPPTPTPTATTGAVSAAAAAGENAGFRLVGHRRFVRANPRSDRFQALAFHHVELWCADAASAAGRFAFALGAPLAARSDLSTGNSAHASLLLRSASVAFLFTAPYGGDHGVGADAATTASIPSFSPGAARRFAADHGLAVHAVALRVADAADAFRASVAAGARPAFQPADLGGGFGLAEVELYGDVVLRFVSHPDGADAPFLPGFEGVSNPGAVDYGLRRFDHVVGNVPELAPVAAYISGFTGFHEFAEFTAEDVGTAESGLNSVVLANNAETVLLPLNEPVHGTKRRSQIQTYLDHHGGPGVQHIALASDDVLGTLREMRARSAMGGFEFLAPPPPNYYDGVRRRAGDVLSEEQINECQELGVLVDRDDQGVLLQIFTKPVGDRPTFFLEMIQRIGCMEKDESGQEYQKGGCGGFGKGNFSELFKSIEEYEKSLEAKQAPTVQGS
SEQ ID NO：4小麦A基因组上EPSPS氨基酸序列
MAMAAAATVAASASSSAVSLDRAAPAHPRRLRMPAARAAHRGAVRLWGPRGAAARATSVAAPAAPAGAEEVVLQPIREISGAVQLPGSKSLSNRILLLSALSEGTTVVDNLLNSEDVHYMLEALEALGLSVEADKVAKRAVVVGCGGRFPVEKDAKEEVKLFLGNAGTAMRPLTAAVVAAGGNATYVLDGVPRMRERPIGDLVVGLQQLGADVDCFLGTNCPPVRINGKGGLPGGKVKLSGSISSQYLSSLLMAAPLALEDVEIEIIDKLISVPYVEMTLKLMEHFGVTAEHSDSWDRFYIKGGQKYKSPGNAYVEGDASSASYFLAGAAITGGTVTVEGCGTTSLQGDVKFAEVLEMMGAKVTWTDTSVTVTGPPRQPFGRKHLKAVDVNMNKMPDVAMTLAVVALFADGPTAIRDVASWRVKETERMVAIRTELTKLGATVEEGPDYCIITPPEKLNITAIDTYDDHRMAMAFSLAACAEVPVTIRDPGCTRKTFPNYFDVLSTFVKN
>SEQ ID NO:5野生型spCas9
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
>SEQ ID NO:6dCas9
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDKRPAATKKAGQAKKKK
>SEQ ID NO:7nCas9(D10A)
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDKRPAATKKAGQAKKKK
>SEQ ID NO:8XTEN
KSGSETPGTSESATPE
>SEQ ID NO:9UGI
TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
>SEQ ID NO:10融合蛋白NLS-APOBEC1-XTEN-nCas9-UGI-NLS
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>SEQ ID NO:11融合蛋白NLS-APOBEC1-XTEN-dCas9-UGI-NLS
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>SEQ ID NO:12融合蛋白NLS-APOBEC1-XTEN-nCas9-UGI-NLS核苷酸序列
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>SEQ ID NO:13融合蛋白NLS-APOBEC1-XTEN-dCas9-UGI-NLS核苷酸序列
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SEQ ID No：14水稻ACCase氨基酸序列
MTSTHVATLGVGAQAPPRHQKKSAGTAFVSSGSSRPSYRKNGQRTRSLREESNGGVSDSKKLNHSIRQGLAGIIDLPNDAASEVDISHGSEDPRGPTVPGSYQMNGIINETHNGRHASVSKVVEFCTALGGKTPIHSVLVANNGMAAAKFMRSVRTWANDTFGSEKAIQLIAMATPEDLRINAEHIRIADQFVEVPGGTNNNNYANVQLIVEIAERTGVSAVWPGWGHASENPELPDALTAKGIVFLGPPASSMHALGDKVGSALIAQAAGVPTLAWSGSHVEVPLECCLDSIPDEMYRKACVTTTEEAVASCQVVGYPAMIKASWGGGGKGIRKVHNDDEVRTLFKQVQGEVPGSPIFIMRLAAQSRHLEVQLLCDQYGNVAALHSRDCSVQRRHQKIIEEGPVTVAPRETVKELEQAARRLAKAVGYVGAATVEYLYSMETGEYYFLELNPRLQVEHPVTEWIAEVNLPAAQVAVGMGIPLWQIPEIRRFYGMNHGGGYDLWRKTAALATPFNFDEVDSKWPKGHCVAVRITSEDPDDGFKPTGGKVKEISFKSKPNVWAYFSVKSGGGIHEFADSQFGHVFAYGTTRSAAITTMALALKEVQIRGEIHSNVDYTVDLLNASDFRENKIHTGWLDTRIAMRVQAERPPWYISVVGGALYKTVTANTATVSDYVGYLTKGQIPPKHISLVYTTVALNIDGKKYTIDTVRSGHGSYRLRMNGSTVDANVQILCDGGLLMQLDGNSHVIYAEEEASGTRLLIDGKTCMLQNDHDPSKLLAETPCKLLRFLVADGAHVDADVPYAEVEVMKMCMPLLSPASGVIHVVMSEGQAMQAGDLIARLDLDDPSAVKRAEPFEDTFPQMGLPIAASGQVHKLCAASLNACRMILAGYEHDIDKVVPELVYCLDTPELPFLQWEELMSVLATRLPRNLKSELEGKYEEYKVKFDSGIINDFPANMLRVIIEENLACGSEKEKATNERLVEPLMSLLKSYEGGRESHAHFVVKSLFEEYLYVEELFSDGIQSDVIERLRLQHSKDLQKVVDIVLSHQSVRNKTKLILKLMESLVYPNPAAYRDQLIRFSSLNHKAYYKLALKASELLEQTKLSELRARIARSLSELEMFTEESKGLSMHKREIAIKESMEDLVTAPLPVEDALISLFDCSDTTVQQRVIETYIARLYQPHLVKDSIKMKWIESGVIALWEFPEGHFDARNGGAVLGDKRWGAMVIVKSLESLSMAIRFALKETSHYTSSEGNMMHIALLGADNKMHIIQESGDDADRIAKLPLILKDNVTDLHASGVKTISFIVQRDEARMTMRRTFLWSDEKLSYEEEPILRHVEPPLSALLELDKLKVKGYNEMKYTPSRDRQWHIYTLRNTENPKMLHRVFFRTLVRQPSVSNKFSSGQIGDMEVGSAEEPLSFTSTSILRSLMTAIEELELHAIRTGHSHMYLHVLKEQKLLDLVPVSGNTVLDVGQDEATAYSLLKEMAMKIHELVGARMHHLSVCQWEVKLKLDCDGPASGTWRIVTTNVTSHTCTVDIYREMEDKESRKLVYHPATPAAGPLHGVALNNPYQPLSVIDLKRCSARNNRTTYCYDFPLAFETAVRKSWSSSTSGASKGVENAQCYVKATELVFADKHGSWGTPLVQMDRPAGLNDIGMVAWTLKMSTPEFPSGREIIVVANDITFRAGSFGPREDAFFEAVTNLACEKKLPLIYLAANSGARIGIADEVKSCFRVGWSDDGSPERGFQYIYLSEEDYARIGTSVIAHKMQLDSGEIRWVIDSVVGKEDGLGVENIHGSAAIASAYSRAYKETFTLTFVTGRTVGIGAYLARLGIRCIQRLDQPIILTGYSALNKLLGREVYSSHMQLGGPKIMATNGVVHLTVSDDLEGVSNILRWLSYVPAYIGGPLPVTTPLDPPDRPVAYIPENSCDPRAAIRGVDDSQGKWLGGMFDKDSFVETFEGWAKTVVTGRAKLGGIPVGVIAVETQTMMQTIPADPGQLDSREQSVPRAGQVWFPDSATKTAQALLDFNREGLPLFILANWRGFSGGQRDLFEGILQAGSTIVENLRTYNQPAFVYIPMAAELRGGAWVVVDSKINPDRIECYAERTAKGNVLEPQGLIEIKFRSEELQDCMSRLDPTLIDLKAKLEVANKNGSADTKSLQENIEARTKQLMPLYTQIAIRFAELHDTSLRMAAKGVIKKVVDWEESRSFFYKRLRRRISEDVLAKEIRAVAGEQFSHQPAIELIKKWYSASHAAEWDDDDAFVAWMDNPENYKDYIQYLKAQRVSQSLSSLSDSSSDLQALPQGLSMLLDKMDPSRRAQLVEEIRKVLG
SEQ ID No：15小麦ACCase氨基酸序列
MGSTHLPIVGFNASTTPSLSTIRPVNSAGAAFQPSAPSRTSKKKSRRVQSLRDGGDGGVSDPNQSIRQGLAGIIDLPKEGTSAPEVDISHGSEEPRGSYQMNGILNEAHNGRHASLSKVVEFCVALGGKTPIHSVLVANNGMAAAKFMRSVRTWANETFGSEKAIQLIAMATPEDMRINAEHIRIADQFVEVPGGTNNNNYANVQLIVEIAVRTGVSAVWPGWGHASENPELPDALNANGIVFLGPPSSSMNALGDKVGSALIAQAAGVPTLPWSGSQVEIPLEVCLDSIPAEMYRKACVSTTEEALASCQMIGYPAMIKASWGGGGKGIRKVNNDDDVRALFKQVQGEVPGSPIFIMRLASQSRHLEVQLLCDQYGNVAALHSRDCSVQRRHQKIIEEGPVTVAPRETVKELEQAARRLAKAVGYVGAATVEYLYSMETGEYYFLELNPRLQVEHPVTEWIAEVNLPAAQVAVGMGIPLWQVPEIRRFYGMDNGGGYDIWRKTAALATPFNFDEVDSQWPKGHCVAVRITSEDPDDGFKPTGGKVKEISFKSKPNVWAYFSVKSGGGIHEFADSQFGHVFAYGVSRAAAITNMSLALKEIQIRGEIHSNVDYTVDLLNASDFKENRIHTGWLDNRIAMRVQAERPPWYISVVGGALYKTITSNTDTVSEYVSYLVKGQIPPKHISLVHSTVSLNIEESKYTIETIRSGQGSYRLRMNGSVIEANVQTLCDGGLLMQLDGNSHVIYAEEEAGGTRLLIDGKTCLLQNDHDPSRLLAETPCKLLRFLVADGAHVEADVPYAEVEVMKMCMPLLSPAAGVINVLLSEGQPMQAGDLIARLDLDDPSAVKRAEPFNGSFPEMSLPIAASGQVHKRCATSLNAARMVLAGYDHPINKVVQDLVSCLDAPELPFLQWEELMSVLATRLPRLLKSELEGKYSEYKLNVGHGKSKDFPSKMLREIIEENLAHGSEKEIATNERLVEPLMSLLKSYEGGRESHAHFIVKSLFEDYLSVEELFSDGIQSDVIERLRQQHSKDLQKVVDIVLSHQGVRNKTKLILTLMEKLVYPNPAAYKDQLTRFSSLNHKRYYKLALKASELLEQTKLSELRTSIARSLSELEMFTEERTAISEIMGDLVTAPLPVEDALVSLFDCSDQTLQQRVIETYISRLYQPHLVKDSIQLKYQESGVIALWEFAEAHSEKRLGAMVIVKSLESVSAAIGAALKDTSRYASSEGNIMHIALLGADNQMHGTEDSGDNDQAQVRIDKLSATLEQNTVTADLRAAGVKVISCIVQRDGALMPMRHTFLLSDEKLCYEEEPVLRHVEPPLSALLELGKLKVKGYNEVKYTPSRDRQWNIYTLRNTENPKMLHRVFFRTLVRQPGASNKFTSGHISDVEVGGAEESLSFTSSSILRSLMTAIEELELHAIRTGHSHMFLCILKEQKLLDLVPVSGNTVVDIGQDEATACSLLKEMALQIHELVGARMHHLSVCQWEVKLKLDSDGPASGTWRVVTTNVTSHTCTVDIYREVEDTESQKLVYHSAPSSSGPLHGVALNTPYQPLSVIDLKRCSARNNRTTYCYDFPLAFETAVQKSWSNISSDNNRCYVKATELVFAHKNGSWGTPVIPMERPAGLNDIGMVAWILDMSTPEYPNGRQIVVIANDITFRAGSFGPREDAFFETVTNLACERKLPLIYLAANSGARIGIADEVKSCFRVGWSDDGSPERGFQYIYLTEEDHARISTSVIAHKMQLDNGEIRWVIDSVVGKEDGLGVENIHGSAAIASAYSRAYEETFTLTFVTGRTVGIGAYLARLGIRCIQRTDQPIILTGFSALNKLLGREVYSSHMQLGGPKIMATNGVVHLTVSDDLEGVSNILRWLSYVPANIGGPLPITKSLDPPDRPVAYIPENTCDPRAAISGIDDSQGKWLGGMFDKDSFVETFEGWAKSVVTGRAKLGGIPVGVIAVETQTMMQLIPADPGQLDSHERSVPRAGQVWFPDSATKTAQAMLDFNREGLPLFILANWRGFSGGQRDLFEGILQAGSTIVENLRTYNQPAFVYIPKAAELRGGAWVVIDSKINPDRIEFYAERTAKGNVLEPQGLIEIKFRSEELQECMGRLDPELINLKAKLQGVKHENGSLPESESLQKSIEARKKQLLPLYTQIAVRFAELHDTSLRMAAKGVIKKVVDWEDSRSFFYKRLRRRISEDVLAKEIRGVSGKQFSHQSAIELIQKWYLASKGAETGSTEWDDDDAFVAWRENPENYQEYIKELRAQRVSQLLSDVADSSPDLEALPQGLSMLLEKMDPSRRAQFVEEVKKVLK
SEQ ID No：16水稻ALS氨基酸序列
MATTAAAAAATLSAAATAKTGRKNHQRHHVLPARGRVGAAAVRCSAVSPVTPPSPAPPATPLRPWGPAEPRKGADILVEALERCGVSDVFAYPGGASMEIHQALTRSPVITNHLFRHEQGEAFAASGYARASGRVGVCVATSGPGATNLVSALADALLDSVPMVAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVLDVEDIPRVIQEAFFLASSGRPGPVLVDIPKDIQQQMAVPVWDTSMNLPGYIARLPKPPATELLEQVLRLVGESRRPILYVGGGCSASGDELRRFVELTGIPVTTTLMGLGNFPSDDPLSLRMLGMHGTVYANYAVDKADLLLAFGVRFDDRVTGKIEAFASRAKIVHIDIDPAEIGKNKQPHVSICADVKLALQGLNALLDQSTTKTSSDFSAWHNELDQQKREFPLGYKTFGEEIPPQYAIQVLDELTKGEAIIATGVGQHQMWAAQYYTYKRPRQWLSSAGLGAMGFGLPAAAGASVANPGVTVVDIDGDGSFLMNIQELALIRIENLPVKVMVLNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPECESEIYPDFVTIAKGFNIPAVRVTKKSEVRAAIKKMLETPGPYLLDIIVPHQEHVLPMIPSEGAFKDMILDGDGRTMY
SEQ ID No：17小麦ALS氨基酸序列(部分)
AASPAATSAAPPATALRPWGPSEPRKGADILVEALERCGIVDVFAYPGGASMEIHQALTRSPVITNHLFRHEQGEAFAASGYARASGRVGVCVATSGPGATNLVSALADALLDSIPMVAITGQVPRRMIGTDAFQETPIVEVTRSITKHNYLVLDVEDIPRVIQEAFFLASSGRPGPVLVDIPKDIQQQMAVPVWDTPMSLPGYIARLPKPPSTESLEQVLRLVGESRRPILYVGGGCAASGEELRRFVELTGIPVTTTLMGLGNFPSDDPLSLRMLGMHGTVYANYAVDKADLLLAFGVRFDDRVTGKIEAFASRSKIVHIDIDPAEIGKNKQPHVSICADVKLALQGLNDLLNGSKAQQGLDFGPWHKELDQQKREFPLGFKTFGEAIPPQYAIQVLDELTKGEAIIATGVGQHQMWAAQYYTYKRPRQWLSSSGLGAMGFGLPAAAGAAVANPGVTVVDIDGDGSFLMNIQELALIRIENLPVKVMILNNQHLGMVVQWEDRFYKANRAHTYLGNPENESEIYPDFVTIAKGFNVPAVRVTKKSEVTAAIKKMLETPGPYLLDIIVPHQEHVLPMIPSGGAFKDMIMEGDGRTSY
SEQ ID No：18小麦HPPD氨基酸序列
MPPTPTTPAATGAGAAAAVTPEHARPRRMVRFNPRSDRFHTLSFHHVEFWCADAASAAGRFAFALGAPLAARSDLSTGNSVHASQLLRSGNLAFLFTAPYANGCDAATASLPSFSADAARRFSADHGLAVRSIALRVADAAEAFRASVDGGARPAFSPVDLGRGFGFAEVELYGDVVLRFVSHPDDTDVPFLPGFEGVSNPDAVDYGLTRFDHVVGNVPELAPAAAYVAGFAGFHEFAEFTTEDVGTAESGLNSMVLANNSEGVLLPLNEPVHGTKRRSQIQTFLEHHGGSGVQHIAVASSDVLRTLREMRARSAMGGFDFLPPRCRKYYEGVRRIAGDVLSEAQIKECQELGVLVDRDDQGVLLQIFTKPVGDRPTLFLEMIQRIGCMEKDERGEEYQKGGCGGFGKGNFSELFKSIEDYEKSLEAKQSAAVQGS

Claims (24)

1.一种产生除草剂抗性植物，优选非转基因除草剂抗性植物的方法，包括将用于对植物基因组中的除草剂抗性相关基因进行碱基编辑的系统导入植物，由此所述向导RNA将所述碱基编辑融合蛋白靶向所述植物中的除草剂抗性相关基因的靶序列，导致所述序列中的一或多个核苷酸取代，所述系统包含以下i)至v)中至少一项：
i)碱基编辑融合蛋白，和向导RNA；
ii)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和向导RNA；
iii)碱基编辑融合蛋白，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
iv)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
v)包含编码碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
其中所述碱基编辑融合蛋白包含核酸酶失活的CRISPR核酸酶(例如核酸酶失活的Cas9)结构域和脱氨酶结构域，所述向导RNA能够将所述碱基编辑融合蛋白靶向植物基因组中的除草剂抗性相关基因的靶序列，
其中所述一或多个核苷酸取代赋予所述植物除草剂抗性，
任选地，所述方法还包括针对除草剂抗性对植物进行筛选的步骤。
2.权利要求1的方法，所述除草剂抗性相关基因编码选自以下的除草剂抗性相关蛋白：PsbA、ALS、EPSPS、ACCase、PPO、HPPD、PDS、GS、DOXPS、P450。
3.权利要求1的方法，所述碱基编辑融合蛋白包含SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列。
4.权利要求1的方法，所述向导RNA靶向SEQ ID NO:19-78中一或多个序列。
5.权利要求1的方法，所述除草剂抗性相关基因编码ACCase，所述一或多个核苷酸取代导致ACCase中选自以下的氨基酸取代：W2027和W2027+R2028，所述氨基酸位置参考SEQ IDNo：1。
6.权利要求1的方法，所述除草剂抗性相关基因编码ALS，所述一或多个核苷酸取代导致ALS中选自以下的氨基酸取代：P197A、P197F、P197S、P197Y、P197F+R198C、G654E+G655S、G654K+G655S、G654E+G659N、P197F+G654E+G655S，或其任意组合，所述氨基酸位置参考SEQID No：2。
7.权利要求1的方法，其中所述除草剂抗性相关基因编码ALS，所述向导RNA靶向包含选自编码氨基酸A122、P197、R198、D204、A205、G654、G655、G659或其任意组合的序列的靶序列，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：2。
8.权利要求1的方法，其中所述除草剂抗性相关基因编码ACCase，所述向导RNA靶向包含选自编码氨基酸S1768、R1793、A1794、R1825、D1827、L1815、A1816、R1817、A1837、G1854、G1855、D1971、D1972、G1983、P1993、R1994、S2003、A2004、T2005、T2007、A2008、R2028、G2029、T2047、R2070、G2071、A2090、E2091、E2106、S2119、R2220、A1813、E1796、E1797、T1800、L1801、S1849、H1850、D1874、D1875、L2024、E1989、R1990、L2099或其任意组合的序列的靶序列，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：1。
9.权利要求1的方法，其中所述除草剂抗性相关基因编码EPSPS，所述向导RNA靶向包含选自编码氨基酸T102和/或A103的序列的靶序列，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：4。
10.权利要求1的方法，其中所述除草剂抗性相关基因编码HPPD，所述向导RNA靶向包含选自编码氨基酸P277、V364、C413、G414、G415、V366或其任意组合的序列的靶序列，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：3。
11.一种鉴定除草剂抗性相关蛋白的变体的方法，所述变体能够赋予植物除草剂抗性，所述方法包括：
i)通过权利要求1的方法产生除草剂抗性植物；和
ii)鉴定所产生的除草剂抗性植物中所述除草剂抗性相关基因序列和/或其编码的除草剂抗性相关蛋白序列，从而鉴定所述变体的序列。
12.权利要求11的方法，所述除草剂抗性相关蛋白选自PsbA、ALS、EPSPS、ACCase、PPO、HPPD、PDS、GS、DOXPS、P450。
13.一种除草剂抗性相关蛋白的变体，其通过权利要求11或12的方法鉴别，所述变体能够赋予植物除草剂抗性。
14.一种ACCase变体，所述ACCase变体相对于野生型ACCase在选自1768、1793、1796、1797、1794、1800、1801、1813、1813、1815、1825、1827、1815、1816、1817、1837、1838、1849、1850、1854、1855、1874、1875、1971、1872、1983、1989、1990、1993、1994、2003、2004、2005、2007、2008、2024、2027、2028、2029、2047、2070、2071、2090、2091、2090、2106、2099、2106、2119、2220的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：1，所述变体赋予植物除草剂抗性。
15.一种ALS变体，所述ALS变体相对于野生型ALS在选自122、197、198、204、205、653、654、655、659的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：2，所述变体赋予植物除草剂抗性。
16.一种HPPD变体，所述HPPD变体相对于野生型HPPD在选自277、364、366、413、414、415的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：3，所述变体赋予植物除草剂抗性。
17.一种EPSPS变体，所述EPSPS变体相对于野生型EPSPS在选自102和103的一或多个位置处具有氨基酸突变，所述氨基酸位置参考SEQ ID No：4，所述变体赋予植物除草剂抗性。
18.一种分离的核酸，其包含编码权利要求13-17中任一项的变体的核苷酸序列。
19.一种表达盒，其包含与调控序列可操纵地连接的编码权利要求9-13中任一项的变体的核苷酸序列。
20.一种表达构建体，其包含编码权利要求13-17中任一项的变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列与调控序列可操纵地连接。
21.权利要求13-17中任一项的变体、权利要求18的分离的核酸、权利要求19的表达盒和/或权利要求20的表达构建体在产生除草剂抗性植物中的用途。
22.一种产生除草剂抗性植物的方法，包括将权利要求18的分离的核酸、权利要求19的表达盒和/或权利要求20的表达构建体导入植物。
23.一种除草剂抗性植物，所述植物由权利要求1或22的方法产生，或者包含权利要求19的表达盒，或者由权利要求18的分离的核酸或权利要求20的表达构建体转化。
24.权利要求1-10中任一项的方法、权利要求13-17中任一项的变体、权利要求21的用途、权利要求22的方法或权利要求23的除草剂抗性植物，其中所述植物选自单子叶植物和双子叶植物，例如，所述植物选自小麦、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯、马铃薯、白菜、甘蓝、黄瓜、番茄、康乃馨、牡丹、玫瑰、西瓜、甜瓜、草莓、蓝莓、葡萄、苹果、柑橘、桃子、板蓝根、甘草、人参、防风和拟南芥。
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