CN108026540A

CN108026540A - 抗白粉病的小麦植物

Info

Publication number: CN108026540A
Application number: CN201680041922.4A
Authority: CN
Inventors: 高彩霞; 邱金龙; 王延鹏
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2015-07-17
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2018-05-11
Also published as: CA2992799A1; RU2018105883A; WO2017013409A3; EP3325629A2; WO2017013409A2; US10988775B2; US20180208939A1; AU2016295291A1

Abstract

本发明涉及使用靶向基因组修饰在小麦植物中赋予增强的病原体抗性。

Description

抗白粉病的小麦植物

发明领域

本发明涉及在小麦植物中赋予病原体抗性。

引言

在植物中，对病原的抗性通常由识别事件触发，并且之后是协调的复杂防御反应，导致侵入物的局部遏制。

白粉病(Powdery mildew,Pm)是世界范围内最重要的谷物疾病之一。由白粉菌目(Erysiphales)的专性活体营养子囊菌真菌导致的白粉病温带气候中对谷物(例如，小麦和大麦)农业的主要阻碍。小麦中的白粉病由禾本科布氏白粉菌小麦专化型(Blumeriagraminis f.sp.tritici)(Bgt)(也被称为禾谷白粉菌小麦专化型(Erysiphe graminisf.sp.tritici))的感染导致。

MLO蛋白起植物对白粉病的防御的负调节剂的作用²⁵。大麦^26,40、拟南芥(Arabidopsis)²⁷和番茄²⁸中的功能丧失的mlo等位基因得到对导致白粉病的真菌病原的广谱且耐久的抗性。

对白粉病病原的抗性反应已经在遗传上被充分表征。在大多数分析的情况中，抗性由种特异性的抗性基因根据Flor的基因对基因假说的规则指定。在这种类型的植物-病原相互作用中，抗性由两个互补基因(一个来自宿主并且一个来自真菌病原)的存在指定并且取决于这两个互补基因的存在。互补基因在操作上分别被称为(病原)抗性(“R”)基因和无毒力(“Avr”)基因。大多数白粉病抗性基因(Mlx)起显性或半显性性状的作用。

然而，由Mlo基因座的隐性(mlo)等位基因介导的单基因抗性是不同的。除了是隐性的，其与对单一病原株的种特异性抗性的不同在于，其赋予对病原的几乎所有已知分离株的广谱抗性并且在不存在病原的情况下mlo抗性等位基因展现出防御模拟表型。因此，遗传数据表明，Mlo野生型等位基因对针对病原攻击的防御反应发挥负调节功能(WO98/04586)。

面包小麦(普通小麦(Triticum aestivum L.)，2n＝42，AABBDD)是世界范围内的主要主食作物并且提供人所消耗的热量的约20％。由于其经济重要性，总是寻找新的性状以提高产量、质量和对生物和非生物胁迫的适应，大多数通过经典育种。面包小麦是异源六倍体，在其基因的大多数中具有三个相似但不相同的拷贝⁵。其大基因组(17,000兆碱基)、高倍数性水平和高的重复DNA含量(80％至90％)使其成为正向和反向遗传学研究的最具挑战性的物种⁶。

在小麦中，白粉病由禾本科布氏白粉菌小麦专化型(Blumeria graminisf.sp.tritici)(Bgt)导致，并且在世界范围内是最具破坏性的疾病之一。小麦中MLO基因的修饰可以提供育种具有对Bgt的广谱且耐久的抗性的机会。在面包小麦中，存在三个MLO同源物(TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1)，其在核苷酸和蛋白水平分别98％和99％相同²⁹。TaMLO-B1可以拯救大麦mlo突变体对白粉病的抗性，表明这些MLO基因的功能在进化期间是保守的²⁹。然而，迄今为止，在面包小麦中尚未报道自发的或诱导的mlo突变体，很可能是由于其六倍体性质以及在使全部三个MLO同源等位基因突变的固有难度。此外，尚未做出利用转基因方法下调小麦中的MLO的成功进展。对白粉病的广谱抗性是尚未在天然小麦群体中发现的抗性性状⁴。因此，对于开发对Pm具有抗性的小麦基因型来说，存在显著的需求。

近来，基因组编辑技术已经作为常规诱变方法(如物理和化学诱变)或利用植物中转基因的表达的方法的备选方法而出现，以产生具有在农业中重要的改善表型的突变体植物。这些技术采用序列特异性核酸酶(SSN)¹，包括锌指核酸酶(ZFN)⁷，切点罕见核酸内切酶，例如转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN²)，RNA指引的核酸酶Cas9(CRISPR/Cas9)^41,38,3，其产生靶向的DNA双链断裂(DSB)，其之后主要通过易错非同源末端连接(NHEJ)⁸或高保真同源重组(HR)^1,9来修复。SSN已经用于在多个物种中形成靶向敲除植物，所述物种范围从模式植物拟南芥^10,11和烟草¹²，到重要作物如大麦^13,14、大豆¹⁵、水稻^16-21和玉米^22,23。已经使用CRISPR/Cas9系统和TALEN在拟南芥^10,11,24和水稻¹⁸证实了可遗传的基因修饰。已经证实了使用瞬时原生质体表达系统的面包小麦中单一MLO基因的基因组编辑¹⁷，并且已经显示在小麦中的全部三个MLO同源等位基因的编码区中引入突变赋予了可遗传的对白粉病真菌的抗性⁴³。然而，发明人已经发现，与野生型植物相比，当在无疾病条件下生长时，这些突变体还显示出有害的发育相关的表型。

在本文中所述的本发明因此目标在于提供与野生型植物相比当在无疾病条件下生长时不显示出有害的发育相关的表型的对白粉病具有抗性的备选突变体小麦植物和相关方法，因此提供农业上重要的产品和方法。

发明概述

发明人已经产生了具有使赋予可遗传的对白粉病真菌的抗性的全部三个MLO同源等位基因失活的突变的突变体小麦系。这些植物未显示出在非疾病条件下负面影响作物产量和质量的衰老状的表型。因此，本发明涉及这些突变体小麦系和相关方法。

尤其是，在第一方面中，本发明涉及小麦植物、植物部分或植物细胞，所述小麦植物、植物部分或植物细胞具有与野生型小麦植物相比增加的对白粉病的抗性和与野生型小麦植物相比相当的在非疾病条件下的产量，其中所述植物包含在选自TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1的两个等位基因的编码区中的功能丧失突变和第三TaMLO等位基因的减少的表达。

在另一个方面中，本发明涉及小麦植物、植物部分或植物细胞，所述小麦植物、植物部分或植物细胞具有与野生型植物相比增加的对白粉病的抗性，所述小麦植物、植物部分或植物细胞包含在选自TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1的两个等位基因的编码区中的功能丧失突变和第三TaMLO等位基因的减少的表达，其中所述第三TaMLO等位基因不具有在其编码区中的突变。

在一个具体的方面中，本发明涉及小麦植物、植物部分或植物细胞，所述小麦植物、植物部分或植物细胞具有与野生型小麦植物相比增加的对白粉病的抗性和与野生型小麦植物相比相当的在非疾病条件下的产量，其中所述植物包含在TaMLO-A1和TaMLO-D1的编码区中的功能丧失突变和TaMLO-B1的减少的表达，其中与来自野生型植物的TaMLO-B1的编码区相比，TaMLO-B1的编码区不含有突变。

在一个具体的方面中，本发明涉及小麦植物、植物部分或植物细胞，所述小麦植物、植物部分或植物细胞具有与野生型小麦植物相比增加的对白粉病的抗性和与野生型小麦植物相比相当的在非疾病条件下的产量，所述小麦植物、植物部分或植物细胞包含如在SEQ ID No.38中所示的Tamlo-a序列、如在SEQ ID No.39中所示的Tamlo-d序列和具有SEQID NO.2的野生型序列的TaMLO-B1序列。

在另一个具体的方面中，本发明涉及小麦植物、植物部分或植物细胞或其部分，其中所述小麦基因型具有CGMCC登录号10951。

在另一个方面中，本发明涉及用于使用靶向的基因组修饰来制备小麦植物、植物部分或植物细胞的方法，所述小麦植物、植物部分或植物细胞具有与野生型植物相比增加的对白粉病的抗性和与野生型小麦植物相比相当的在非疾病条件下的产量，所述方法包括将功能丧失突变引入至选自TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1的两个MLO等位基因的编码区中并且减少第三TaMLO等位基因的表达。

在另一个方面中，本发明涉及通过这种方法获得或可获得的植物、植物部分或植物细胞。

附图描述

在以下非限制性的附图中进一步说明了本发明。

图1.TaMLO同源三倍体突变体当TaMLO同源三倍体突变体⁴²(tamlo-aabbdd)在无菌(无疾病)条件下生长时，这些三倍体突变体植物显示出发育相关的表型，包括大约在12周时的细胞死亡和衰老状萎黄病(chlorosis)。

图2.使用TALEN的TaMLO基因的靶向敲除。(a)TALEN靶向的小麦TaMLO同源物的外显子2的保守区域内的位点。在MLO-A1、MLO-B1和MLO-D1中的TALEN靶向的序列是下划线的，并且在间隔区中的AvaII限制性位点是GGACC(SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ IDNO.45)。存在三个SNP，两个在间隔区区域中。第一个是分别与下划线的5’区域直接相邻的C/G/G。第二个是在AvaII区域的3’在与AvaII区域直接相邻的残基C之后的A/C/A。第三个位于TALEN结合位点的极右侧(倒数第二个3’残基)。(b)在TaMLO同源“三倍体”突变体中的突变位于A和D编码序列中。Tamlo-R(具有遗传谱tamlo-AaBBDd)在基因组A和D中是杂合的。在T0植物中的基因组B(SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48)中的靶位点处没有鉴别出突变。(c)纯合T1突变体系的表型。当用毒性Bgt种的分生孢子攻击全部7个纯合T1植物时，仅纯合植物R32赋予对白粉病的抗性。R32未显示出衰老状萎黄病，并且所述植物与野生型一样旺盛地生长。

图3.纯合T1突变体系的表型。R32的全部子代显示出对Bgt的抗性，并且R26、R40和R54后代的约1/3对Bgt具有抗性。R51的全部子代对Bgt易感。与完全抗性的突变体tamlo-aabbdd植物相比，抗性突变体植物允许形成孢子的Bgh的低水平生长。

图4.突变体系中的mlo的转录水平。这些抗性植物的基因组B的TaMLO蛋白(TaMLO-B1)的转录与野生型相比较低。

图5.GFP供体表达盒的DNA序列。表达盒含有GFP编码序列(粗体)和CaMV 35S终止子序列(斜体)，并且两侧末端是两个T-MLO靶序列(下划线)。

图6.载体序列。(a)载体pYP010中的UBI-attr1-attr2-Nos的序列：4047bp。Ubi-1的序列是下划线的，并且attr1和attr2是斜体。Nos以粗体表示。(SEQ ID NO.7)(b)载体pZHY500中的TAL-L的序列：2202bp。N末端和C末端的序列是下划线的。TAL-L以粗体标记。(SEQ ID NO.8)(c)载体pZHY501中的TAL-R的序列：2304bp。指出了N末端和C末端的序列。TAL-R以粗体标记。(SEQ ID NO.9)(d)载体pZHY013中的TALEN(TAL-L+TAL-R)的序列。斜体的序列是attr1和attr2。N末端和C末端部分的序列以下划线表示。TAL-L和TAL-R是粗体。FokI序列是斜体且下划线的。T2A基序是下划线的并且是粗体。(SEQ ID NO.10)。

图7.基因定位。

图8：mlo突变体R32的表型分析。(A)与野生型Bobwhite对照(WT)相比的在Bobwhite背景下的R32突变体的千粒重(TKW)。值是平均值±s.d**P<0.01(t-检验)。(B)(C)和(D)，与WT相比的R32突变体植物的种子周长、长度和宽度。全部数据来自R32和WT的9个系重复。

图9：mlo-aabbdd突变体的表型分析。(A)与野生型Kn199(WT)相比的在Kn199背景下的mlo-aabbdd突变体的千粒重(TKW)。(B)(C)和(D)，与WT相比的mlo-aabbdd突变体植物的种子周长、长度和宽度。全部数据来自mlo-aabbdd和WT的8个系重复。

详细描述

现在将进一步描述本发明。在以下途径中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确地相反指出，如此定义的每个方面均可以与任何其他一个方面或多个方面组合。具体地，指出作为优选的或有利的任何特点均可以与指出作为优选的或有利的任何其他一个特征或多个特征组合。

除非另外指出，本发明的实施将会采用本领域技术内的植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术、生物信息学的常规技术。这样的技术在文献中充分解释。

如在本文中所使用的，词语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”意在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如，mRNA)，自然存在的、突变的、合成的DNA或RNA分子，以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。其可以是单链的或双链的。这样的核酸或多核苷酸包括但不限于结构基因的编码序列、反义序列、和不编码mRNA或蛋白产物的非编码调节序列。这些术语还包括基因。术语“基因”、“等位基因”或“基因序列”广义地用于指与生物功能相关的DNA核酸。因此，基因可以包括在基因组序列中的内含子和外显子，或可以仅包括在cDNA中的编码序列，和/或可以包括与调节序列组合的cDNA。因此，根据本发明的多个方面，可以使用基因组DNA、cDNA或编码DNA。在一个实施方案中，核酸是cDNA或编码DNA。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用并且是指通过肽键连接在一起的任何长度的聚合形式的氨基酸。

术语“等位基因”表示在特定基因座的基因的一种或多种备选形式中的任何一种。杂合等位基因是在同一基因座的两个不同的等位基因。纯合等位基因是在特定基因座的两个相同的等位基因。野生型等位基因是自然存在的等位基因。

对于本发明的目的来说，“突变体”植物是与自然存在的野生型(WT)植物相比已经改变的植物。具体地，与野生型序列相比，使用如在本文中所描述的诱变方法改变了小麦中MLO同源物中的每一个的内源性核酸序列(野生型核酸序列TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1)。这导致了内源性Mlo基因的失活并且因此使Mlo功能丧失。这样的植物具有改变的表型并且与野生型植物相比显示出对Pm的抗性或增加的抗性。因此，抗性由使用靶向的基因组修饰特异性靶向的小麦植物基因组中的突变的内源性TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1基因的存在赋予，而不是由小麦中表达的转基因的存在赋予。

如在本文中所使用的，野生型等位基因的野生型核酸序列使用大写字母表示，即TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1。突变体mlo核酸序列使用非大写形式，即taml-aa1、tamlo-bb1、tamlo-dd1。与野生型植物相比，本发明的小麦植物是突变体植物，其包含并且表达突变体mlo等位基因。

下调或干扰野生型Mlo序列的功能表达的mlo突变是隐性的，从而它们由野生型序列的表达补充。因此，可以通过评估植物对病原如，例如白粉病的组成型防御反应和/或易感性的水平来确定“Mlo功能”。因此，根据本发明，可以在补充适合的mlo突变体后测试推定的具有Mlo功能的核苷酸序列。术语“mlo功能”用于指在植物上赋予mlo突变体表型的序列。“Mlo”的大写形式和“mlo”的非大写形式因此用于区分“野生型和突变体”功能。

根据本发明的mlo突变体表型的特征在于展现出增加的对Pm的抗性。换句话说，根据本发明的mlo突变体赋予对导致Pm的病原的抗性。此外，根据本发明的突变体的特征在于，当在无疾病条件下生长时，与影响作物产量和质量的野生型相比，其未显示出任何阴性表型。换句话说，当在无疾病条件下生长时，与野生型(wt)植物相比，本发明的突变体未显示出任何产量和质量的不利后果。

与影响作物产量和质量的野生型相比的阴性表型包括衰老状表型、与野生型植物相比降低的生长或降低的种子产量。可以通过萎黄病的外观来评估衰老状表型。降低可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。

野生型小麦植物是不具有任何突变体Mlo等位基因的植物。

本发明的多个方面包括靶向的诱变方法，具体是基因组编辑，并且排除了仅基于通过常规育种方法产生植物的实施方案。如在本文中解释的，疾病抗性性状并非归因于转基因的存在。

发明人已经产生了具有使赋予可遗传的对白粉病真菌的抗性的全部三个MLO同源等位基因失活的突变的突变体小麦系，从而没有制备功能性TaMLO-B1、TaMLO-A1或TaMLO-D1蛋白。这些植物未显示出负面影响作物产量和质量的衰老状表型。因此，本发明涉及这些突变体小麦系和相关方法。

如在图1中所示，当TaMLO同源三倍体突变体⁴²(基因型：tamlo-aabbdd)在无菌(无疾病)条件下生长时，这些三倍体突变体植物显示出发育相关的表型，包括在大约12周时的细胞死亡和衰老状萎黄病。如之前报道的，在大麦⁴²和拟南芥⁴⁴中也存在这些表型。衰老状表型可能会负面影响小麦作物产量和质量。

然而，在使用TALEN产生的小麦mlo突变体中，我们鉴别了一个系，Tamlo-R(具有遗传谱tamlo-AaBBDd)，其在基因组A和D中是杂合的，但是其在T0植物中的基因组B中的靶位点不具有突变(图2)。在分离之后，在T1代中，我们鉴别了对于在基因组A和D中的突变来说纯合的7个植物(tamlo-aaBBdd)，命名为R4、R25、R26、R32、R40、R51和R54。当用毒性Bgt种的分生孢子攻击全部7个纯合T1植物时，我们发现仅纯合植物R32赋予对白粉病的抗性(图2)。有趣的是，R32未显示出衰老状萎黄病，并且在无疾病条件下植物与野生型一样旺盛地生长。

我们还评估了系Tamlo-R(R4、R25、R26、R32、R40、R51和R54)的全部纯合突变体子代的后代对白粉病的抗性。我们发现R32的全部子代显示出对Bgt的抗性，并且R26、R40和R54后代的约1/3对Bgt具有抗性。R51的全部子代对Bgt易感(图3)。与完全抗性的突变体tamlo-aabbdd植物相比，抗性突变体植物允许形成孢子的Bgh的低水平生长(图3)。这种表型与公知且广泛使用的(在农业中)大麦mlo突变体mlo-11相似⁴²。这些白粉病抗性突变体植物都未显示出发育相关的阴性表型，如细胞死亡或衰老状萎黄病。

我们分别评估了在基因组A、B和D中的这些突变体的mlo的转录水平。我们发现这些抗性植物的基因组B的TaMLO蛋白(TaMLO-B1)的转录与野生型相比较低(图4)。这个结果还与在大麦突变体mlo-11中描述的类似⁴²。在R32系中损害了Mlo-B转录本和蛋白二者的积累，但是突变不存在于TaMLO-B1的编码区中。

因此，本发明涉及通过基因组编辑技术产生的小麦植物、植物部分或植物细胞，所述小麦植物、植物部分或植物细胞具有与野生型小麦植物相比增加的对白粉病的抗性并且与野生型植物相比在非疾病条件下未显示出生长或产量的不利后果。与完全抗性突变体tamlo-aabbdd植物相比，这样的植物显示出在非疾病条件下更好的生长和/或产量。因此，在非疾病条件下，即在植物不暴露于白粉病的情况下，本发明的植物的产量可与野生型植物的产量相比。这意味着，基本上不存在产量的降低或存在不多于1-5％的产量的降低。

具体地，在第一方面中，本发明涉及小麦植物、植物部分或植物细胞，所述小麦植物、植物部分或植物细胞具有与野生型植物相比增加的对白粉病的抗性和与野生型小麦植物相比相当的在非疾病条件下的产量，其中所述植物包含在选自TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1的两个等位基因的编码区中的功能丧失突变和第三TaMLO等位基因的减少的表达或第三TaMLO蛋白的功能失活。

在一个实施方案中，与来自野生型植物的TaMLO等位基因的编码区相比，所述第三TaMLO等位基因的编码区不含有突变。

在一个实施方案中，与来自野生型植物的TaMLO等位基因的编码区相比，所述第三TaMLO等位基因的编码区不含有使得蛋白成为非功能性或减少基因表达的突变。

例如，第三TaMLO等位基因可以包含减少第三TaMLO等位基因的表达或使第三TaMLO蛋白的功能失活的突变，其中所述突变不在所述第三TaMLO等位基因的编码区中。

在一个实施方案中，本发明涉及小麦植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物包含在TaMLO-A1和TaMLO-D1的编码区中的功能丧失突变和TaMLO-B1的减少的表达，其中与来自野生型植物的TaMLO-B1的编码区相比，TaMLO-B1的编码区不含有突变。

在两个MLO等位基因中的功能丧失突变导致了受损害的转录本和/或蛋白积累。与野生型表达相比，第三TaMLO等位基因的表达减少了例如至少5-50％。在一个实施方案中，基本上不存在表达。减少第三TaMLO等位基因的表达或使第三TaMLO等位基因失活的突变不存在于所述等位基因的编码区中，但是导致了第三TaMLO等位基因的转录本的积累受损和/或由第三TaMLO等位基因编码的蛋白的积累受损。例如，突变可以在等位基因的调节区中(例如在SEQ ID No.40、41或42或其5’中)。备选地，使第三TaMLO等位基因失活的突变可以是在与所述TaMLO等位基因相互作用的途径中的另一个基因中发现的突变，或者归因于影响调节区的序列的表观遗传因素。因此，所述TaMLO等位基因例如TaMLO-B1的减少的表达由在TaMLO等位基因例如TaMLO-B1的调节区中的突变、在MLO病原体反应途径下游的基因中的突变导致，或者归因于表观遗传因素。

因此，根据本发明的突变体小麦植物是三倍体突变体并且包括选自tamlo-aaBBdd、tamlo-aabbDD或tamlo-AAbbdd的基因型。在选自TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1的TaMLO等位基因中的一个中的编码区中，三倍体突变体不具有突变。因此，不能在所述TaMLO等位基因的外显子中发现突变。

使用靶向的基因组修饰将突变引入至野生型TaMLO等位基因中，优选将它们同时引入。

在一个实施方案中，所述靶向的基因组修饰包括使用SSN。这些可以选自ZFN、切点罕见(rare-cutting)核酸内切酶，例如TALEN或CRISPR/Cas9。

切点罕见核酸内切酶是具有核酸内切酶活性的天然或改造的蛋白。它们与具有通常长度为12-40bp的识别序列的核酸靶序列结合。在一个实施方案中，SSN选自TALEN。在另一个实施方案中，SSN选自CRISPR/Cas9。这在以下更详细地描述。

功能丧失突变可以是相对于在本文中示出的野生型TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1等位基因序列的缺失或插入(“插入缺失(indel)”)。缺失可以包括在一个或多个链中的1-20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、18或20个核苷酸。插入可以包括在一个或多个链中的1-20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、18或20个核苷酸。

本发明的植物包括这样的植物，其中所述植物对于突变中的每一个是杂合的。然而，在优选的实施方案中，所述植物对于突变是纯合的。也是纯合的子代可以由这些植物根据本领域中已知的方法产生。

根据本发明的多个方面，野生型TaMLO-A1等位基因包含SEQ ID NO.1或其片段或功能变体，或者由SEQ ID NO.1或其片段或功能变体组成。相应的氨基酸序列是SEQ IDNO.4。根据本发明的多个方面，野生型TaMLO-B1等位基因包含SEQ ID NO.2或其片段或功能变体，或者由SEQ ID NO.1或其片段或功能变体组成。相应的氨基酸序列是SEQ ID NO.5。根据本发明的多个方面，野生型TaMLO-D1等位基因包含SEQ ID NO.3或其片段或功能变体，或者由SEQ ID NO.3或其片段或功能变体组成。相应的氨基酸序列是SEQ ID NO.6。

例如，对于SEQ ID NO:1、2或3来说，如在本文中所使用的术语“核酸或蛋白质序列的功能变体”是指保留完整非变体TaMLO等位基因的生物功能并且因此用于调节对Pm的反应的基因序列。功能变体还包括编码具有不影响所得蛋白的功能的序列改变(例如在非保守残基中)的多肽的目标基因的变体。还包括与如在本文中示出的等位基因的野生型核酸序列基本相同(即仅具有一些序列变化，例如在非保守残基中)并且具有生物活性的变体。

如在本文中所使用的，根据本发明的多个方面的特定TaMLO核苷酸或氨基酸序列的变体将会与如在SEQ ID NO.1、2或3或4、5或6中所示的TaMLO等位基因的特定非变体TaMLO核苷酸序列具有至少约50％-99％，例如至少75％，例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的序列同一性。确定序列同一性的序列比对程序是在本领域内公知的。

此外，本发明的多个方面不仅包括TaMLO核酸序列，而且还包括其片段。“片段”预期是核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分以及因此由其编码的蛋白的一部分。核苷酸序列的片段可以编码保留天然蛋白的生物活性并且因此用于调节对Pm的反应的蛋白片段。

在一个实施方案中，所述突变使用TALEN引入并且其中所述TAL效应子结合外显子2中的序列。在一个实施方案中，所述TAL效应子结合TCGCTGCTGCTCGCCGTgacgcaggaccccatctcCGGGATATGCATCTCCGA(SEQ ID NO.13)。

具体地，这些TALEN所结合的第二外显子保守区域TaMLO-A、TaMLO-B和TaMLO-D的结合位点序列是：

MLO-A:

MLO-B:

MLO-D:

三个SNP是粗体的并且下划线的。AvaII限制性位点以小写字母表示并且是下划线的。

TALEN对具有例如核酸序列SEQ ID NO.11。相应的氨基酸序列是SEQ ID NO.12。

在一个实施方案中，本发明的植物包含如在图1中所示的TaMLO-A1和/或TaMLO-D1中的突变。在一个实施方案中，突变如对于tamlo-aaBBdd所示出的。换句话说，在所述小麦植物中，内源性TaMLO-A1等位基因是突变体Tamlo-a1等位基因并且包含SEQ ID NO.38，内源性TaMLO-B1等位基因是野生型TaMLO-B1等位基因并且包含SEQ ID NO.2，并且内源性TaMLO-D1等位基因是突变体Tamlo-d1等位基因并且包含SEQ ID NO.39。

在一个方面中，突变体植物无TALEN。

小麦植物选自包括但不限于下列各项的清单，普通小麦(Triticum aestivum)、埃塞俄比亚小麦(T.aethiopicum)、阿拉拉特小麦(T.araraticum)、野生一粒小麦(T.boeoticum)、波斯小麦(T.carthlicum)、密穗小麦(T.compactum)、野生二粒小麦(T.dicoccoides)、栽培二粒小麦(T.dicoccum)、硬粒小麦(T.durum)、依斯帕汗小麦(T.ispahanicum)、科尔希二粒小麦(T.karamyschevii)、马卡小麦(T.macha)、T.militinae、一粒小麦(T.monococcum)、波兰小麦(T.polonicum)、T.repens、斯佩耳特小麦(T.spelta)、印度圆粒小麦(T.sphaerococcum)、提莫非维小麦(T.timopheevii)、东方小麦(T.turanicum)、圆锥小麦(T.turgidum)、乌拉尔图小麦(T.urartu)、瓦维洛夫小麦(T.vavilovii)和茹科夫斯基小麦(T.zhukovskyi)。

根据在本文中所述的本发明的多个方面的另一个实施方案，植物属于物种普通小麦(Triticum aestivum)或圆锥小麦(Triticum turgidum)。根据另一个优选的实施方案，植物属于栽培品种Bobwhite或栽培品种Don Pedro。更优选地，选择属于小麦物种普通小麦亚种普通小麦(Triticum aestivum L.ssp aestivum)的栽培品种BW208和BW2003(Bobwhite)，以及属于小麦物种圆锥小麦亚种硬粒小麦(Triticum turgidum L.sspdurum)的变种Don Pedro。

Bobwhite是是从国际玉米和小麦改良中心(International Maize and WheatImprovement Center,CIMMYT)获得的栽培品种的名称。BW208和BW2003是不同的Bobwhite系。Don Pedro是硬质小麦变种，也来自CIMMYT。

特别地，本发明涉及突变体小麦基因型(普通小麦)，指定登录号CGMCC 10951，根据布达佩斯条约由中国科学院遗传与发育生物学研究所(北京市朝阳区北辰西路1号，100101)于2015年6月29日保藏在中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京市朝阳区北辰西路1号，100101)。保藏物的参考名称是Tamlo-R32。在2015年7月6日进行的试验中发现被保藏的材料是存活的。本发明因此涉及具有这种基因型的任何小麦植物，其部分，包括种子。这个突变体在本文中被描述为Tamlo-aaBBdd(图1)。

与对照植物，优选野生型植物相比，根据本发明的三倍体突变体小麦植物显示出对Pm的抗性或增加的抗性，因为突变损害了TaMLO等位基因转录本和/或蛋白的积累。与野生型对照植物相比，在生物胁迫条件下，根据本发明的小麦植物显示出增加的产量，其中所述胁迫是Pm。

例如，可以通过评估病原克隆的存活、生长、产量或大小来评估抗性。

术语“增加”、“改善”或“增强“是可互换的。例如，与对照植物相比，产量增加了至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％、40％或50％或更多。术语“产量”通常意指经济价值的可测量的产生，通常与指定的作物、面积、和时间段相关。个体植物部分基于它们的数量、大小和/或重量直接构成产量，或者实际产量是对于作物和一年来说每平方米的产量，其通过总产量(包括收获的和评估的产量二者)除以种植的平方米确定。植物的术语“产量”可以涉及营养器官生物量(根和/或新枝生物量)，涉及生殖器官，和/或该植物的繁殖体(如种子)。因此，根据本发明，产量包括下列各项中的一种或多种并且可以通过评估下列各项中的一种或多种来测量：每个植物的增加的种子产量、增加的种子饱满率、增加的饱满种子的数量、增加的收获指数、增加的种皮和/或荚的数量、增加的种子大小、增加的生长或增加的分支，例如具有更多分支的花序。优选地，产量包括增加的种皮/荚的数量和/或增加的分支。产量相对于对照植物增加。

如在本文中所使用的对照植物是未根据本发明的方法修饰的植物。因此，对照植物不具有如在本文中所描述的突变体tamlo核酸序列。在一个实施方案中，对照植物是野生型小麦植物。在另一个实施方案中，对照植物是不具有如在本文中所描述的突变体tamlo核酸序列、但是被另外修饰的植物。对照植物通常属于与待评估的植物相同的植物物种，优选相同的生态型或相同或相似的遗传背景。

如在本文中所使用的术语“植物”包括完整的植物、植物的原种和子代以及植物部分，包括种子、果实、新枝、茎、叶、根(包括块茎)、花、和组织和器官，其中前述中的每一个包含目标基因/核酸。术语“植物”还包括植物细胞、悬浮培养物、原生质体、愈伤组织、胚、分生组织区域、配子体、孢子体、花粉和小孢子，再次其中前述中的每一个包含目标基因/核酸。

本发明还扩展至如上所述的本发明的突变体植物的可收获部分，如，但不限于种子、叶、花、茎和根。本发明此外涉及源自，优选直接源自这样的植物的可收获部分的产物，如干燥球粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、面粉、淀粉或蛋白质。本发明还涉及包含本发明的植物或其部分的食品和食物补充剂。

在一个方面中，本发明涉及本发明的突变体小麦植物的种子。从对于mlo突变纯合的突变体植物收获的种子是优选的。

在另一个实施方案中，本发明提供用于组织培养的如在本文中所描述的可再生突变体植物细胞。组织培养将会优选能够再生具有前述突变体小麦植物的基本上所有生理和形态特征的植物，并且能够再生具有基本相同基因型的植物。优选地，在这样的组织培养物中的可再生细胞将会是愈伤组织、原生质体、分生细胞、子叶、胚轴、叶、花粉、胚、根、根尖、花药、雌蕊、新枝、茎、叶柄、花、和种子。更进一步地，本发明提供从本发明的组织培养物再生的小麦植物。

在优选的实施方案中，突变体小麦植物通过靶标Mlo序列的同时编辑产生。

本发明还涉及如在SEQ ID NO.38或39中所定义的分离核酸序列。还在本发明的范围内的是包含这样的序列的载体和包含这样的序列或这样的载体的宿主细胞。

植物的制备方法

在另一个方面中，本发明涉及用于使用靶向的基因组修饰来制备小麦植物、植物部分或植物细胞的方法，所述小麦植物、植物部分或植物细胞具有与野生型小麦植物相比对白粉病的抗性和与野生型小麦植物相比相当的在非疾病条件下的产量，所述方法包括将功能丧失突变引入至选自TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1的两个TaMLO等位基因的编码区中并且减少第三TaMLO等位基因的表达。例如，可以引入减少第三TaMLO等位基因的表达的突变，其中所述突变不在所述第三TaMLO等位基因的编码区中。

在一个实施方案中，在TaMLO-A1和TaMLO-D1的编码区中引入功能丧失突变并且减少TaMLO-B1的表达。

第三突变导致第三TaMLO等位基因的转录本的积累受损和/或由第三TaMLO等位基因编码的蛋白的积累受损，但是不在所述第三TaMLO等位基因的编码区中。

可以将根据本发明的在一个或两个MLO基因中具有功能丧失突变的植物杂交以获得功能丧失三倍体突变体。例如，可以将通过以上方法获得的具有在TaMLO-A1等位基因中的功能丧失突变的植物与通过以上方法获得的具有在TaMLO-B1等位基因或TaMLO-D1等位基因中的功能丧失突变的植物杂交。可以将所得的双倍体突变体与通过以上方法获得的具有使其余等位基因失活的突变的另一种植物杂交。

在本文中所述的方法的一个实施方案中，使用靶向的基因组修饰将全部突变同时引入至小麦植物中。之后可以产生对于突变纯合的子代。

靶向的基因组修饰或靶向的基因组编辑是使用靶向的DNA双链断裂(DSB)以通过同源重组(HR)介导的重组事件促进基因组编辑的基因组工程技术。为了通过引入位点特异性DNADSB来实现有效的基因组编辑，可以使用四种主要类型的可定制DNA结合蛋白：来源于微生物可移动基因元件的大范围核酸酶(meganuclease)、基于真核转录因子的ZF核酸酶、切点罕见核酸内切酶例如TALEN、来自黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌的转录激活因子样效应物(TALE)、和来自II型细菌适应性免疫系统CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列)的RNA指引的DNA核酸内切酶Cas9。大范围核酸酶、ZF和TALE蛋白全部通过蛋白质-DNA相互作用来识别特定的DNA序列。尽管大范围核酸酶整合其核酸酶和DNA-结合结构域，ZF和TALE蛋白分别由靶向DNA的3个或1个核苷酸(nt)的个体模块组成。ZF和TALE可以以所需组合组装并且连接至FokI的核酸酶结构域以指导针对特定基因组基因座的溶核活性。

引入突变的步骤包括使一群小麦植物细胞与靶向至内源性TaMLOA、B和D序列的DNA结合蛋白(例如选自以上列出的DNA结合蛋白)接触。

在一个实施方案中，所述方法包括使一群小麦植物细胞与靶向至内源性TaMLO-A、B和D序列的一种或多种切点罕见核酸内切酶接触。

所述方法还可以包括从所述群体中选择其中已经使TaMLOA、B和D失活的细胞并且将所述选择的植物细胞再生为小麦植物的步骤。

在通过细菌III型分泌系统递送至宿主细胞中时，TAL效应物进入细胞核，与宿主基因启动子中的效应物特异性序列结合并且激活转录。其靶向特异性通过串联的33-35个氨基酸重复序列的中央结构域确定。这之后是20个氨基酸的单个截短的重复序列。所检查的大多数自然存在的TAL效应物具有12个至27个之间的完整重复序列。

这些重复序列彼此仅两个相邻氨基酸不同，即它们的重复可变双残基(repeat-variable di-residue,RVD)。确定TAL效应物将会识别哪个单一核苷酸的RVD：一个RVD对应于一个核苷酸，并且四种最常见的RVD各自优先与四种碱基中的一种结合。自然存在的识别位点均匀地在所需TAL效应物的T之后。TAL效应物可以与FokI核酸酶的催化结构域融合以形成TAL效应物核酸酶(TALEN)，其使得靶向的DNA双链断裂(DSB)在体内用于基因组编辑。在本领域中充分描述了这种技术在基因组编辑中的用途，例如在US 8,440,431、US 8,440,432和US 8,450,471中。参考文献30描述了一组定制的质粒，其可以与Golden Gate克隆方法一起使用以组装多个DNA片段。如在其中描述的，Golden Gate方法使用IIS型限制性核酸内切酶，其在它们的识别位点外侧切割以形成独特的4bp突出端。通过在相同反应混合物中消化和连接来加速克隆，因为正确的组装消除了酶识别位点。定制TALEN或TAL效应物构建体的组装包括两个步骤：(i)将重复序列模块组装为1-10个重复序列的中间阵列和(ii)将中间阵列连接为骨架以制备最终构建体。

可以根据本发明的多个方面使用的另一种基因组编辑方法是CRISPR。在本领域中充分描述了这种技术在基因组编辑中的用途，例如在US 8,697,359和在本文中引用的参考文献中。简而言之，CRISPR是参与针对入侵的噬菌体和质粒的防御的微生物核酸酶系统。在微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相关(Cas)基因以及能够编程CRISPR介导的核酸切割的特异性的非编码RNA元件(sgRNA)的组合。已经在大范围的细菌宿主中鉴别了三种类型(I-III)的CRISPR系统。每个CRISPR基因座的一个关键特征是存在由非重复序列的短区段(间隔区)间隔的重复序列(直接重复序列)的阵列。非编码CRISPR阵列在直接重复序列被转录并且切割为含有个体间隔区序列的短crRNA，其将Cas核酸酶引导至靶位点(原型间隔区)。II型CRISPR是最充分表征的系统之一并且在四个连续步骤中进行靶向的DNA双链断裂。首先，从CRISPR基因座转录两个非编码RNA，pre-crRNA阵列和tracrRNA。第二，tracrRNA与pre-crRNA的重复序列区域杂交并且介导将pre-crRNA加工为含有个体间隔区序列的成熟crRNA。第三，通过在crRNA上的间隔区和紧邻原型间隔区相邻基序(PAM)(用于靶标识别的额外要求)的靶标DNA上的原型间隔区之间的沃森-克里克碱基配对，成熟的crRNA:tracrRNA复合物将Cas9引导至靶标DNA。最后，Cas9介导靶标DNA的切割以在原型间隔区内形成双链断裂。

因此Cas9是II型CRISPR-Cas系统的标志蛋白，并且是通过两个非编码RNA：CRIPSRRNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的复合物引导至与PAM(原型间隔区相邻基序)序列基序相邻的DNA靶序列的大的单体DNA核酸酶。Cas9蛋白含有与RuvC和HNH核酸酶同源的两个核酸酶结构域。HNH核酸酶结构域切割互补DNA链，而RuvC样结构域切割非互补链，并且作为结果，在靶标DNA中引入钝性切割(blunt cut)。Cas9连同sgRNA一起的异源表达可以将位点特异性双链断裂(DSB)引入至来自多种生物的活细胞的基因组DNA中。对于在真核生物中的应用来说，已经使用Cas9的密码子优化的形式，其最初来自细菌酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。

单向导RNA(sgRNA)是与Cas9核酸酶形成复合物的CRISPR/Cas系统的第二成分。sgRNA是通过将crRNA与tracrRNA融合形成的合成的RNA嵌合体。位于其5'末端的sgRNA向导序列赋予DNA靶标特异性。因此，通过修饰向导序列，可以形成具有不同靶标特异性的sgRNA。向导序列的典型长度是20bp。在植物中，已经使用植物RNA聚合酶III启动子如U6和U3来表达sgRNA。

可以如在本领域中所描述的来构建用于在本发明的方法中使用的Cas9表达质粒。如在本文中的实施例部分中所描述的，提供了一个实例。

用于使用基因组编辑制备对Pm具有抗性的根据本发明的突变体小麦植物的方法包括使用SSN。这可以选自大范围核酸酶、ZFN、TALEN、或CRISPR/Cas9。在一个实施方案中，SSN是TALEN。

因此，在一个实施方案中，所述方法包括使用TALEN。在这个实施方案中，所述方法包括将包含TALEN的表达载体引入至小麦植物中和筛选TaMLO-A1、TaMLO-B1和/或TaMLO-D1基因中的TALEN诱导的靶向突变。所述方法还可以包括再生植物和选取或选择对Pm具有抗性的植物的另外的步骤。

在一个实施方案中，所述载体包含靶向外显子2中的保守区域的一对TALEN(T-MLO)(图1a、9和表1)。载体构建体编码在靶标在小麦的全部三个同源物MLO基因之间保守的序列的一对TALEN。

因此，在一个实施方案中，在TaMLO中的靶序列位点是TCGCTGCTGCTCGCCGTgacgcaggaccccatctcCGGGATATGCATCTCCGA(SEQ ID NO.13，表1)。

MLO-A:

MLO-B:

MLO-D:

在这个实施方案中，如以上所示(表1)，TALEN对分别识别通过含有AvaII限制性位点的18bp间隔区DNA隔开的连续DNA的16bp和17bp。TALEN识别序列在TaMLO-B1和TaMLO-D1中严格保守，但是与同源TaMLO-A1靶位点具有一个核苷酸错配(图2a)。此外，在三个MLO同源等位基因中，图2a中的保守的间隔区区域含有两个单核苷酸多态性(SNP)。

如在实施例中所示，为了检测在通过基因编辑技术靶向的位点处的突变，Ava II酶消化基因座选自的位点；如果突变发生，则Ava II酶消化基因座被破坏并且不能被消化。然而，非突变的PCR产物对消化易感。

在一个实施方案中，TALEN通过Golden Gate克隆方法组装，并且如在实施例中所描述的，构建至单一质粒中。

在一个实施方案中，筛选TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1基因中的TALEN诱导的靶向突变包括从转化的植物获得DNA样品以及进行DNA扩增和任选的限制性酶消化以检测在TaMLO-A1、TaMLO-B1和/或TaMLO-D1中的突变。当靶位点如以上所示时，限制性酶是AvaII。

之后使用基于凝胶电泳的测定来评估从转化的植物扩增的PCR片段。在另外的步骤中，可以通过对TaMLO-A1、TaMLO-B1和/或TaMLO-D1基因进行测序来确认突变的存在。

在另一个实施方案中，所述方法包括使用CRISPR/Cas9。在这个实施方案中，所述方法因此包括在小麦植物中引入并且共表达靶向至TaMLO-A1、TaMLO-B1和/或TaMLO-D1的Cas9和sgRNA以及筛选TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1基因中的诱导的靶向突变。所述方法还可以包括再生植物和选取或选择对Pm具有抗性的植物的另外的步骤。

Cas9和sgRNA可以包含在单一或两个表达载体中。

在TaMLO-A1中的靶序列可以是CCGTCACGCAGGACCCAATCTCC(SEQ ID NO.17，参见表1)。

在一个实施方案中，筛选TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1基因中的CRISPR诱导的靶向突变包括从转化的植物获得DNA样品以及进行DNA扩增和任选的限制性酶消化以检测在TaMLO-A1、TaMLO-B1和/或TaMLO-D1中的突变。

在一个实施方案中，限制性酶是错配敏感的T7核酸内切酶。T7E1酶对由基因组编辑得到的异源双链体DNA具有特异性。

之后使用基于凝胶电泳测定的测定来评估从转化的植物扩增的PCR片段。在另外的步骤中，可以通过对TaMLO-A1、TaMLO-B1和/或TaMLO-D1基因进行测序来确认突变的存在。

如在实施例中所示，可以由每个样品制备基因组DNA(即wt和突变体)，并且通过PCR扩增包含每个靶位点的DNA片段(参见表)。通过限制性酶消化PCR产物，因为靶基因座包括限制性酶位点。限制性酶位点被由NHEJ或HR导致的CRISPR或TALEN诱导的突变破坏，因此突变体扩增子对限制性酶消化具有抗性，并且得到未切割的条带。备选地，PCR产物通过T7E1(由对由基因组编辑得到的异源双链体DNA特异性的T7E1酶产生的切割的DNA)消化并且通过琼脂糖凝胶电泳可视化。在另外的步骤中，对它们进行测序。

在另一个方面中，本发明涉及用于为小麦植物、植物部分或植物细胞赋予对Pm的抗性的方法，所述方法包括将功能丧失突变引入至选自TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1的两个MLO等位基因的编码区中并且减少第三TaMLO等位基因的表达，例如，通过引入导致第三TaMLO等位基因的转录本的积累受损和/或由第三TaMLO等位基因编码的蛋白的积累受损的另外的突变，其中所述突变不在第三TaMLO等位基因的编码区中，其中所述突变使用靶向的基因组修饰引入。

在一个实施方案中，使用ZFN、切点罕见核酸内切酶例如TALEN、或CRISPR/Cas9。在一个实施方案中，所述方法包括制备如上所述的突变体植物。

在以上方法中，优选使用PCR和特异性扩增TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1(表2)和如下所示的引物进行扩增：

以下引物对扩增TaMLO-A1靶位点：

MLO-A1-F(SEQ ID NO.18)

TGGCGCTGGTCTTCGCCGTCATGATCATCGTC

MLO-A1-R(SEQ ID NO.19)

TACGATGAGCGCCACCTTGCCCGGGAA

以下引物对扩增TaMLO-B1靶位点：

MLO-B1-F(SEQ ID NO.20)

ATAAGCTCGGCCATGTAAGTTCCTTCCCGG

MLO-B1-R(SEQ ID NO.21)

CCGGCCGGAATTTGTTTGTGTTTTTGTT

以下引物对扩增TaMLO-D1靶位点：

MLO-D1-F(SEQ ID NO.22)

TGGCTTCCTCTGCTCCCTTGGTGCACCT

MLO-D1-R(SEQ ID NO.23)

TGGAGCTGGTGCAAGCTGCCCGTGGACATT

以下引物对扩增全部三个等位基因

MLO-F(SEQ ID NO.24)

GTCTTCGCCGTCATGATCATCGTCTCC

MLO-R(SEQ ID NO.25)

TGGTATTCCAAGGAGGCGGTCTCTGTCT

在优选的实施方案中，以上方法通过转化小麦胚进行。在进一步优选的实施方案中，所述方法包括产生优选对于突变纯合的稳定T2植物。

在一个实施方案中，所述方法不包括转化小麦原生质体。

以上方法利用植物转化以将包含SSN的表达载体引入至植物中。如在本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括外源性多核苷酸向宿主细胞中的转移，而不用考虑用于转移的方法。可以用本发明的遗传构建体和由其再生的整个植物来转化能够随后克隆繁殖(通过器官发生或胚胎发生)的植物组织。所选择的特定组织将会取决于可用于并且最适于被转化的特定物种的克隆繁殖系统而改变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、雌配子体、愈伤组织、存在的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽、和根分生组织)、和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和胚轴分生组织)。所得的转化的植物细胞之后可以用于以本领域技术人员已知的方式再生被转化的植物。

外源基因向植物的基因组中的转移被称为转化。在许多物种中，植物的转化现在是常规技术。有利地，多种转化方法中的任何一种可以用于将目标基因引入至适合的祖细胞中。对于从植物组织或植物细胞转化和再生植物所描述的方法可以用于瞬时或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、直接将DNA注入至植物中、如在实施例中描述的粒子轰击、使用病毒或花粉的转化和显微喷射(microprojection)。方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法、原生质体的电穿孔、向植物材料中的显微注射、涂布有DNA或RNA的粒子轰击、用病毒感染(非整合性)等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选通过根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化而制备。

为了选择转化的植物，通常使在转化中得到的植物材料经历选择性条件，从而可以将转化的植物与未转化的植物区分。例如，可以种植以上述方式得到的种子，并且在初始生长期之后，通过喷雾进行适合的选择。进一步的可能性是，如果适当，在灭菌之后使用适合的选择剂使种子在琼脂平板上生长，从而仅转化的种子可以生长为植物。备选地，筛选转化的植物的可选择标记物的存在。

在DNA转移和再生之后，例如，也可以使用Southern分析来评价推定转化的植物的目标基因的存在、拷贝数和/或基因组组织。备选地或另外地，可以使用Northern和/或Western分析来监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员公知的。

所产生的转化的植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可以自交，并且选择纯合的第二代(或T2)转化子，并且T2植物之后可以进一步通过经典育种技术繁殖。

优选将SSN引入至植物中作为表达载体的一部分。载体可以含有允许其在宿主细胞中重复的一个或多个复制系统。自我复制载体包括质粒、粘粒和病毒载体。备选地，载体可以是允许DNA序列整合至宿主细胞的染色体中的整合载体。载体还理想地具有用于DNA序列的插入的独特限制性位点。如果载体不具有独特限制性位点，可以将其修饰以引入或消除限制性位点，以使其更适用于进一步操作。适合在表达核酸中使用的载体是技术人员已知的并且非限制性实例是pYP010。

将核酸插入至载体中，从而其可操作地连接至适合的植物活性启动子。用于与核酸一起使用的适合的植物活性启动子包括，但不限于CaMV35S、小麦U6、或玉米泛素启动子。

如在实施例和在附图中解释的，载体还可以包含GFP序列或其他标记物。

通过上述方法得到或可以得到的植物、植物部分或植物细胞也在本发明的范围内。

在一个方面中，突变体无TALEN。因此，根据以上方法，可以如在实施例中描述的评估TALEN的存在。

在额外步骤中，所述方法可以包括确定突变体tamlo-a1、tamlo-b1和/或tamlo-d1核酸的存在或检测小麦植物中TaMLO-A、B或D蛋白的存在或不存在。

确定突变体tamlo-a1、tamlo-b1和/或tamlo-d1核酸的存在的诊断试验可以包括适合的寡核苷酸或多核苷酸如Mlo基因的片段的杂交。杂交可以包括设计为从mlo的给定等位基因形式扩增核酸产物的PCR，随后通过多种可能方法中的任何一种检测扩增的产物，所述方法包括但不限于凝胶电泳、毛细管电泳和核苷酸序列探针的直接杂交。诊断试验可以基于设计为从Mlo基因座扩增多种突变体核酸的PCR，以及通过多种可能方法中的任何一种将不同的可能突变体核酸与野生型区分的试验，所述方法包括DNA片段尺寸、限制性位点差异(例如，CAPS切割的扩增的多态性位点)等等。诊断试验还可以基于对本领域技术人员来说将会是显而易见的核酸分析的大量可能的变化形式，如使用合成的源自mlo的序列作为杂交探针。

根据本发明的用于评估突变体等位基因的存在的适合的试验包括但不限于，尤其是，同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹印迹(DAF)、序列表征的扩增的区域(SCAR)、扩增的片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR——其也被称为微卫星)、和单核苷酸多态性(SNP)。在一个实施方案中，使用Kompetitive等位基因特异性PCR(KASP)基因分型。

在一个实施方案中，所述方法包括

a)从小麦植物获得核酸样品和

b)使用选自SEQ ID NO 18至25或SEQ ID NO.34-37的一种或多种引物对进行一个或多个TaMLO等位基因的核酸扩增。

MLO-R32-A1-F：TGATGATGATGATGATGGAACTTGTTCTCG SEQ ID NO.34

MLO-R32-A1-R：AAGGAGGCGGTCTCTGTCTCCCATTTCTTC SEQ ID NO.35

MLO-R32-D1-F：TTCATCTCGCTGCTGCTCCATCTCCG SEQ ID NO.36

MLO-R32-D1-R：AGCCATGATGATGACGCTGTAGGTGACATG SEQ ID NO.37

在一个实施方案中，所述方法包括确定TaMLO蛋白是否在植物中积累。因此，检测了植物中的TaMLO-A、B或D蛋白的存在或不存在。如果蛋白不存在，则损害蛋白积累的突变存在于植物的基因组中。在一个实施方案中，检测了植物中TaMLO-B蛋白的存在或不存在。

用于评估蛋白的存在的适合的试验是本领域中已知的并且包括但不限于凝胶电泳(如聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳或2D凝胶电泳)、比色测定、蛋白质印迹、免疫测定(如ELISA、横向流动试纸条(lateral flow strip)或免疫染色)或分光光度法。

本发明还涉及包含选自SEQ ID NO.34-37的一种或多种引物的分离核酸序列。本发明还涉及包含选自SEQ ID NO.34-37的一种或多种引物的检测试剂盒。

在本文中所述的本发明的多种方面明确地扩展至通过在本文中所述的方法制备、得到或可以得到的任何植物细胞或任何植物，并且扩展至所有植物部分和其繁殖体，除非另外指定。本发明进一步扩展以包括已经通过前述方法中的任何一种制备的突变体植物细胞、组织、器官或完整植物，唯一的要求是子代展现出与在根据本发明的方法中的亲代所产生的那些的相同的一种或多种基因型和/或表型特征。

尽管前述公开内容提供了在本发明的范围内包括的主题的概括描述，包括方法制造和使用本发明的方法以及其最佳方式，提供了以下实施例以进一步使得本领域技术人员能够实施本发明并且提供其全部书面描述。然而，本领域技术人员将会理解的是，这些实施例的细节不应被理解为限制本发明，其范围应当根据本公开所附的权利要求及其等同物理解。考虑到本公开，本发明的多种另外的方面和实施方案对本领域技术人员来说将会是显而易见的。

在本说明书中提及的全部文献，包括序列数据库编号的引用，通过引用整体结合在本文中。除非另外指定，当引用序列数据库编号时，版本号是1。

在本文中使用的情况下，“和/或”应理解为具体公开了两指定特征或要素中的每一个，并且具有或不具有另一个特征或要素。例如，“A和/或B”应理解为具体公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一种，如同各自在本文中单独给出一样。

除非上下文另外指出，以上给出的特点的描述和定义不限于本发明的任何具体的方面或实施方案并且等同地应用于所描述的所有方面和实施方案。

在以下非限制性实施例中进一步描述了本发明。

实施例

TALEN设计和构建

使用TAL效应物-核苷酸Targeter 2.0(TALE-NT)程序(https://tale-nt.cac.cornell.edu/)设计TALEN靶位点。所有靶位点在-1位置具有T，并且使用如之前描述的Golden Gate方法构建相应的TAL效应物阵列³³。关于所有TAL效应物阵列和靶位点的信息在表1中给出。在具有截短的N152/C63骨架结构的载体(pZHY500和pZHY501)中组装TALEN。使用Gateway相容进入质粒pZHY013作为中间载体以形成TALEN表达载体³⁴。这种质粒含有两个被T2A翻译跳跃序列(skipping sequence)隔开的异二聚体FokI核酸酶结构域。质粒pZHY500和pZHY501中的TAL阵列通过用XbaI/BamHI消化而释放并且一个接一个地亚克隆至pZHY013中^34,35。一个阵列(左侧阵列)首先作为XbaI/BamHI片段克隆至pZHY013中；另一个(右侧阵列)之后克隆至NheI/BglII位点中，其具有与XbaI和BamHI相容的末端。进行Gateway LR反应以将TALEN编码序列克隆至目的载体中，pYP010(通过用玉米泛素启动子代替35S启动子得到的pZHY05134的衍生物)。

Cas9和sgRNA表达载体的构建

使用质粒pJIT163构建Cas9表达质粒。将其用KpnI和HindIII消化并且与玉米泛素1启动子(Ubi)融合以构建载体pJIT163-Ubi。将全长Cas9(植物密码子优化的)产物用BamHI和MfeI消化并且插入至质粒pJIT163-Ubi中在BamHI和MfeI位点之间，以得到表达载体pJIT163-Ubi-Cas9。由GenScript合成小麦U6启动子和小麦gRNA支架并且克隆至pEASY钝性载体(TransGen Biotech)中。Cas9和gRNA的序列在之前的出版物中给出¹⁷。选择在5’-NGGPAM之前紧接的小麦基因组DNA区域，如5’-G-N(20)-GG-3’或5’-N(21)-GG-3’作为靶标。

在三个同源等位基因中，TaMLO中的CRISPR/Cas9靶位点含有两个单核苷酸多态性(SNP)。我们设计了sgRNA(sgMLO-A1)以特异性地靶标TaMLO-A1。我们的结果显示，sgRNA-A1诱导的突变仅在TaMLO-A1中出现，因此确认了sgRNA对TaMLO-A1的特异性。因此，脱靶切割(off-target cleavage)不在TaMLO-B1和TaMLO-D1中出现。结果显示，CRISPR/Cas9在小麦植物中具有活性并且可以产生转基因突变体系。可以使用Cas9/sgRNA通过靶向保守靶位点得到其他突变体，包括三倍体突变体AA、BB和DD。

小麦原生质体转化

如之前描述的分离和转化小麦原生质体³。平均转化效率是60-80％。用每次转化20μg的TALEN质粒，或10μg pJIT163-Ubi-Cas9质粒和10μg pU6-gRNA质粒的混合物，进行原生质体转化。

小麦的基因枪转化(biolistic transformation)

使用PDS1000/He粒子轰击系统(Bio-Rad,Hercules,CA)，以与终止板6.0cm的靶距离，以氦压1100psi进行基因枪转化。将质粒DNA(T-MLO和pAHC20)以1:1(对于Cas9、sgRNA和pAHC20来说为1:1:1)摩尔比混合，之后轰击。在轰击后，将胚转移至愈伤诱导培养基。在第三或第四周，将所有愈伤组织至含有5mg/l草丁膦(PPT)的选择性再生培养基。PPT存在于所有后续组织培养过程中，包括2轮的再生(4周)和2轮的生根(4周)。在10-12周之后，获得T0转基因植物，转移至土壤中并且在管理温室中生长³⁷。

SSN诱导的突变的筛选

使用高通量Automation Workstation FX(Beckmen)，利用基于磁珠的DNA提取试剂盒(GeneOn Biotech)，提取来自个体小麦植物的基因组DNA。如之前描述的，使用PCR/RE消化筛选测定和T7E1测定鉴别突变^35,36_,37。将用TaMLO特异性引物(表3)从个体突变体植物扩增的PCR产物克隆至pUC-T载体(CWBIO)中以用于测序。通过用UVP VisionWorksLS图像获取分析软件7.0测量条带强度来计算原生质体中的突变频率(插入缺失(％))³⁶。

白粉病感染和显微分析

在受控环境腔室中，以22℃和16h的光周期，使用在400-1,000μmol m^-2s^-1范围内的光强度，使小麦植物在土壤上生长。如之前报道的³⁹，利用一些改进，进行白粉病感染和显微分析。将来源于主茎的叶片(叶片2、3、和4)切成5cm片段并且立刻放置在含有1％(w/v)蒸馏水琼脂和8.5mM苯并咪唑的培养皿(Petri dish)中。将叶片片段在22℃下在连续光(100μmol m^-2s^-1)中温育四小时，然后用禾本科布氏白粉菌小麦专化型(Blumeria graminisf.sp.tritici)(Bgt)的毒性株E09、E22和B13接种以得到大约15至20个形成孢子的克隆/cm²，并且在22℃下在连续光(100umol m^-2s^-1)中温育。在接种之后七十二小时，将叶片片段用1:1(v/v)乙醇:乙酸固定24h，用乳酸甘油(1:1:1[v/v]乳酸:甘油:H2O)澄清48h，并且用考马斯蓝(在甲醇中0.6％[w/v]考马斯亮蓝R 250[Sigma])染色7秒以使真菌结构可视化，最后在蒸馏水中冲洗并且固定在50％(v/v)甘油中，之后进行显微镜检查。在Olympus BX51光学显微镜下观察并且分析样品，并且使用软件Cellsens Entry 1.21拍摄照片。

mlo突变体的产量指数试验

在标准小麦田地中以20×10cm的地块(20个植物)在常规栽培条件下使植物生长。在田地中不存在白粉病并且不使用杀真菌剂。测量包括千粒重(TKW)、种子周长、种子长度和种子宽度在内的所有表型数据。数据分别来自突变体R32和野生型对照(Bobwhite)的9个重复，突变体mlo-aabbdd和野生型对照(Kn199)的8个重复。

挑取每个重复中一个5植物样品的突变体系和野生型植物的约400个饱满的谷物，以用于使用电子天平进行TKW测量。通过Wanshen kaozhong检查分析仪，使用每个样品中的一次处理的约150个饱满的突变体和野生型谷物测量种子周长、种子长度和种子宽度。

结果和讨论

我们开发了靶向外显子2中保守区域的一对TALEN(T-MLO)(图2a)。TALEN对分别识别通过含有AvaII限制性位点的18bp间隔区DNA隔开的连续DNA的16bp和17bp(图1a和表1)。TALEN识别序列在TaMLO-B1和TaMLO-D1中严格保守，但是与同源TaMLO-A1靶位点具有一个核苷酸错配(图2a)。此外，在三个MLO同源等位基因中，图2a中的保守的间隔区区域含有两个单核苷酸多态性(SNP)。TALEN通过Golden Gate克隆方法³⁰组装，并且通过由玉米泛素启动子驱动的T2A翻译跳跃序列构建至单一质粒中。首先通过将携带TALEN的质粒转化至小麦原生质体中来评价所得的T-MLO的活性。使用之前开发的PCR限制性酶消化测定(PCR/RE)¹⁶的来自转化的原生质体的基因组DNA的分析证实了在靶位点的突变的出现。

我们之后通过粒子轰击方法将T-MLO质粒和pAHC20³¹(含有可选择的bar基因的质粒)共转化至未成熟的小麦胚中。在5μg/ml草丁膦(PPT)上选择6-8周之后，从除草剂耐药性愈伤组织再生小麦幼苗。首先使用保守引物组(表2)从这些转基因幼苗(T0植物)的基因组DNA扩增MLO靶位点(在TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1中)，并且通过PCR/RE测定分析以检测潜在的突变。为了鉴别在哪个TaMLO基因中出现突变，我们设计了引物以特异性扩增TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1，并且用特定引物进行PCR扩增子的PCR/RE测定(表2)。这揭示了如在图1中所示的T-MLO诱导的突变。

我们鉴别了Tamlo-R(具有遗传谱tamlo-AaBBDd)，其在基因组A和D中杂合，但是没有在T0植物中的基因组B中的靶位点鉴别出突变(图2)。在分离之后，在T1代中，我们鉴别了对于在基因组A和D中的突变来说纯合的7个植物(tamlo-aaBBdd)，命名为R4、R25、R26、R32、R40、R51和R54。当用毒性Bgt种的分生孢子攻击全部7种纯合T1植物时，我们发现仅纯合植物R32赋予对白粉病的抗性(图2)。有趣的是，R32未显示出衰老状萎黄病，并且植物与野生型一样旺盛地生长。

为了确认这个观点，我们测试了在产量中的R32突变体和野生型植物的千粒重(TKW)。结果显示，与在Bobwhite WT对照中的野生型相比，R32(在Bobwhite背景下)具有显著提高的千粒重(TKW)(P<0.01)，但是在mlo-aabbdd突变体(在Kn199背景下)和Kn199WT对照之间没有这样的差异(图8A和图9A)。此外，在突变体(R32和mlo-aabbdd)和在Bobwhite和Kn199二者中的野生型之间，在包括种子周长、种子长度和种子宽度在内的其他参数方面不存在明显变化(图8和9)。

我们还评估了系Tamlo-R(R4、R25、R26、R32、R40、R51和R54)的全部纯合突变体子代的后代对白粉病的抗性。我们发现R32的全部子代显示出对Bgt的抗性，并且R26、R40和R54后代的约1/3对Bgt具有抗性。R51的全部子代对Bgt易感(图3)。与完全抗性的突变体tamlo-aabbdd植物相比，抗性突变体植物允许形成孢子的Bgh的低水平生长(图3)。

我们分别评估了在基因组A、B和D中的这些突变体的mlo的转录水平。我们发现这些抗性植物的基因组B的TaMLO蛋白(TaMLO-B1)的转录与野生型相比较低(图4)。

迄今为止，受抗性(R)基因控制的种特异性抗性通常用于形成抗性小麦变种，但是这倾向于失败，因为在田地中出现了新的Bgt种³²。相比之下，功能丧失mlo突变赋予的对白粉病的抗性从其三十年前基因渗入精品大麦变种起未被破坏。因此，我们在精品小麦栽培品种中产生的mlo-aaBBdd等位基因可以提供用于在面包小麦中产生耐久且广谱抗性的优异起始材料。

基因定位

进行如在图7中所示的基因定位。

表1.SSN靶基因座和序列

表2.所使用的PCR引物和它们的应用

参考文献

所有参考文献通过引用结合在本文中。

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序列信息

SEQ ID NO.1野生型TaMLO-A1的编码序列：1605bp；TALEN靶位点以下划线表示。

ATGGCGGAGGACGACGGGTACCCCCCGGCGCGGACGCTGCCGGAGACGCCGTCCTGGGCGGTGGCGCTGGTCTTCGCCGTCATGATCATCGTCTCCGTCCTCCTGGAGCACGCGCTCCACAAGCTCGGCCAGTGGTTCCACAAGCGGCACAAGAACGCGCTGGCGGAGGCGCTGGAGAAGATGAAGGCGGAGCTGATGCTGGTGGGATTCATCTCGCTGCTGC TCGCCGTCACGCAGGACCCAATCTCCGGGATATGCATCTCCCAGAAGGCCGCCAGCATCATGCGCCCCTGCAAGGTGGAACCCGGTTCCGTCAAGAGCAAGTACAAGGACTACTACTGCGCCAAAGAGGGCAAGGTGGCGCTCATGTCCACGGGCAGCCTGCACCAGCTCCACATATTCATCTTCGTGCTAGCCGTCTTCCATGTCACCTACAGCGTCATCATCATGGCTCTAAGCCGTCTCAAGATGAGAACATGGAAGAAATGGGAGACAGAGACCGCCTCCTTGGAATACCAGTTCGCAAATGATCCTGCGCGGTTCCGCTTCACGCACCAGACGTCGTTCGTGAAGCGGCACCTGGGCCTGTCCAGCACCCCCGGCGTCAGATGGGTGGTGGCCTTCTTCAGGCAGTTCTTCAGGTCGGTCACCAAGGTGGACTACCTCACCTTGAGGGCAGGCTTCATCAACGCGCACTTGTCGCAGAACAGCAAGTTCGACTTCCACAAGTACATCAAGAGGTCCATGGAGGACGACTTCAAAGTCGTCGTTGGCATCAGCCTCCCGCTGTGGGCTGTGGCGATCCTCACCCTCTTCCTTGATATCGACGGGATCGGCACACTCACCTGGGTTTCTTTCATCCCTCTCATCATCCTCTTGTGTGTTGGAACCAAGCTAGAGATGATCATCATGGAGATGGCCCTGGAGATCCAGGACCGGTCGAGCGTCATCAAGGGGGCACCCGTGGTCGAGCCCAGCAACAAGTTCTTCTGGTTCCACCGCCCCGACTGGGTCCTCTTCTTCATACACCTGACGCTGTTCCAGAACGCGTTTCAGATGGCACATTTCGTGTGGACAGTGGCCACGCCCGGCTTGAAGGACTGCTTCCATATGAACATCGGGCTGAGCATCATGAAGGTCGTGCTGGGGCTGGCTCTCCAGTTCCTGTGCAGCTACATCACCTTCCCCCTCTACGCGCTAGTCACACAGATGGGATCAAACATGAAGAGGTCCATCTTCGACGAGCAGACAGCCAAGGCGCTGACCAACTGGCGGAACACGGCCAAGGAGAAGAAGAAGGTCCGAGACACGGACATGCTGATGGCGCAGATGATCGGCGACGCAACACCCAGCCGAGGCACGTCCCCGATGCCTAGCCGGGGCTCATCGCCGGTGCACCTGCTTCAGAAGGGCATGGGACGGTCTGACGATCCCCAGAGCGCACCGACCTCGCCAAGGACCATGGAGGAGGCTAGGGACATGTACCCGGTTGTGGTGGCGCATCCTGTACACAGACTAAATCCTGCTGACAGGAGAAGGTCGGTCTCTTCATCAGCCCTCGATGCCGACATCCCCAGCGCAGATTTTTCCTTCAGCCAGGGATGA

SEQ ID NO.2野生型TaMLO-B1的编码序列：1605bp；TALEN靶位点以下划线表示。

ATGGCGGAGGACGACGGGTACCCCCCAGCGAGGACGCTGCCGGAGACGCCGTCCTGGGCGGTGGCCCTCGTCTTCGCCGTCATGATCATCGTGTCCGTCCTCCTGGAGCACGCGCTCCATAAGCTCGGCCAGTGGTTCCACAAGCGGCACAAGAACGCGCTGGCGGAGGCGCTGGAGAAGATCAAGGCGGAGCTCATGCTGGTGGGCTTCATCTCGCTGCTGC TCGCCGTGACGCAGGACCCCATCTCCGGGATATGCATCTCCGAGAAGGCCGCCAGCATCATGCGGCCCTGCAAGCTGCCCCCTGGCTCCGTCAAGAGCAAGTACAAAGACTACTACTGCGCCAAACAGGGCAAGGTGTCGCTCATGTCCACGGGCAGCTTGCACCAGCTGCACATATTCATCTTCGTGCTCGCCGTCTTCCATGTCACCTACAGCGTCATCATCATGGCTCTAAGCCGTCTCAAGATGAGAACCTGGAAGAAATGGGAGACAGAGACCGCCTCCCTGGAATACCAGTTCGCAAATGATCCTGCGCGGTTCCGCTTCACGCACCAGACGTCGTTCGTGAAGCGGCACCTGGGCCTCTCCAGCACCCCCGGCGTCAGATGGGTGGTGGCCTTCTTCAGGCAGTTCTTCAGGTCGGTCACCAAGGTGGACTACCTCACCTTGAGGGCAGGCTTCATCAACGCGCATTTGTCGCATAACAGCAAGTTCGACTTCCACAAGTACATCAAGAGGTCCATGGAGGACGACTTCAAAGTCGTCGTTGGCATCAGCCTCCCGCTGTGGTGTGTGGCGATCCTCACCCTCTTCCTTGACATTGACGGGATCGGCACGCTCACCTGGATTTCTTTCATCCCTCTCGTCATCCTCTTGTGTGTTGGAACCAAGCTGGAGATGATCATCATGGAGATGGCCCTGGAGATCCAGGACCGGGCGAGCGTCATCAAGGGGGCGCCCGTGGTTGAGCCCAGCAACAAGTTCTTCTGGTTCCACCGCCCCGACTGGGTCCTCTTCTTCATACACCTGACGCTATTCCAGAACGCGTTTCAGATGGCACATTTCGTGTGGACAGTGGCCACGCCCGGCTTGAAGAAATGCTTCCATATGCACATCGGGCTGAGCATCATGAAGGTCGTGCTGGGGCTGGCTCTTCAGTTCCTCTGCAGCTATATCACCTTCCCGCTCTACGCGCTCGTCACACAGATGGGATCAAACATGAAGAGGTCCATCTTCGACGAGCAGACGGCCAAGGCGCTGACAAACTGGCGGAACACGGCCAAGGAGAAGAAGAAGGTCCGAGACACGGACATGCTGATGGCGCAGATGATCGGCGACGCGACGCCCAGCCGAGGGGCGTCGCCCATGCCTAGCCGGGGCTCGTCGCCAGTGCACCTGCTTCACAAGGGCATGGGACGGTCCGACGATCCCCAGAGCACGCCAACCTCGCCAAGGGCCATGGAGGAGGCTAGGGACATGTACCCGGTTGTGGTGGCGCATCCAGTGCACAGACTAAATCCTGCTGACAGGAGAAGGTCGGTCTCGTCGTCGGCACTCGATGTCGACATTCCCAGCGCAGATTTTTCCTTCAGCCAGGGATGA

SEQ ID NO.3野生型TaMLO-D1的编码序列：1605bp；TALEN靶位点以下划线表示。

ATGGCGGAGGACGACGGGTACCCCCCGGCGCGGACGCTGCCGGAGACGCCGTCCTGGGCGGTGGCGCTCGTCTTCGCCGTCATGATCATCGTGTCCGTCCTCCTGGAGCACGCGCTCCACAAGCTCGGCCAGTGGTTCCACAAGCGGCACAAGAACGCGCTGGCGGAGGCGCTGGAGAAGATCAAAGCGGAGCTGATGCTGGTGGGGTTCATCTCGCTGCTGC TCGCCGTGACGCAGGACCCAATCTCCGGGATATGCATCTCCGAGAAGGCCGCCAGCATCATGCGGCCCTGCAGCCTGCCCCCTGGTTCCGTCAAGAGCAAGTACAAAGACTACTACTGCGCCAAAAAGGGCAAGGTGTCGCTAATGTCCACGGGCAGCTTGCACCAGCTCCACATATTCATCTTCGTGCTCGCCGTCTTCCATGTCACCTACAGCGTCATCATCATGGCTCTAAGCCGTCTCAAGATGAGGACATGGAAGAAATGGGAGACAGAGACCGCCTCCTTGGAATACCAGTTCGCAAATGATCCTGCGCGGTTCCGCTTCACGCACCAGACGTCGTTCGTGAAGCGTCACCTGGGCCTCTCCAGCACCCCCGGCATCAGATGGGTGGTGGCCTTCTTCAGGCAGTTCTTCAGGTCGGTCACCAAGGTGGACTACCTCACCCTGAGGGCAGGCTTCATCAACGCGCATTTGTCGCATAACAGCAAGTTCGACTTCCACAAGTACATCAAGAGGTCCATGGAGGACGACTTCAAAGTCGTCGTTGGCATCAGCCTCCCGCTGTGGTGTGTGGCGATCCTCACCCTCTTCCTTGATATTGACGGGATCGGCACGCTCACCTGGATTTCTTTCATCCCTCTCGTCATCCTCTTGTGTGTTGGAACCAAGCTGGAGATGATCATCATGGAGATGGCCCTGGAGATCCAGGACCGGGCGAGCGTCATCAAGGGGGCGCCCGTGGTTGAGCCCAGCAACAAGTTCTTCTGGTTCCACCGCCCCGACTGGGTCCTCTTCTTCATACACCTGACGCTGTTCCAGAATGCGTTTCAGATGGCACATTTCGTCTGGACAGTGGCCACGCCCGGCTTGAAGAAATGCTTCCATATGCACATCGGGCTGAGCATCATGAAGGTCGTGCTGGGGCTGGCTCTTCAGTTCCTCTGCAGCTATATCACCTTCCCGCTCTACGCGCTCGTCACACAGATGGGATCAAACATGAAGAGGTCCATCTTCGACGAGCAGACGGCCAAGGCGCTGACAAACTGGCGGAACACGGCCAAGGAGAAGAAGAAGGTCCGAGACACGGACATGCTGATGGCGCAGATGATCGGCGACGCGACGCCCAGCCGAGGGGCGTCGCCCATGCCTAGCCGGGGCTCGTCGCCAGTGCACCTGCTTCACAAGGGCATGGGACGGTCCGACGATCCCCAGAGCACGCCAACCTCGCCAAGGGCCATGGAGGAGGCTAGGGACATGTACCCGGTTGTGGTGGCGCATCCAGTGCACAGACTAAATCCTGCTGACAGGAGAAGGTCGGTCTCTTCGTCGGCACTCGATGCCGACATCCCCAGCGCAGATTTTTCCTTCAGCCAGGGATGA

SEQ ID NO.4野生型TaMLO-A1的氨基酸序列：534aa。

MAEDDGYPPARTLPETPSWAVALVFAVMIIVSVLLEHALHKLGQWFHKRHKNALAEALEKMKAELMLVGFISLLLAVTQDPISGICISQKAASIMRPCKVEPGSVKSKYKDYYCAKEGKVALMSTGSLHQLHIFIFVLAVFHVTYSVIIMALSRLKMRTWKKWETETASLEYQFANDPARFRFTHQTSFVKRHLGLSSTPGVRWVVAFFRQFFRSVTKVDYLTLRAGFINAHLSQNSKFDFHKYIKRSMEDDFKVVVGISLPLWAVAILTLFLDIDGIGTLTWVSFIPLIILLCVGTKLEMIIMEMALEIQDRSSVIKGAPVVEPSNKFFWFHRPDWVLFFIHLTLFQNAFQMAHFVWTVATPGLKDCFHMNIGLSIMKVVLGLALQFLCSYITFPLYALVTQMGSNMKRSIFDEQTAKALTNWRNTAKEKKKVRDTDMLMAQMIGDATPSRGTSPMPSRGSSPVHLLQKGMGRSDDPQSAPTSPRTMEEARDMYPVVVAHPVHRLNPADRRRSVSSSALDADIPSADFSFSQG

SEQ ID NO.5野生型TaMLO-B1的氨基酸序列：534aa。

MAEDDGYPPARTLPETPSWAVALVFAVMIIVSVLLEHALHKLGQWFHKRHKNALAEALEKIKAELMLVGFISLLLAVTQDPISGICISEKAASIMRPCKLPPGSVKSKYKDYYCAKQGKVSLMSTGSLHQLHIFIFVLAVFHVTYSVIIMALSRLKMRTWKKWETETASLEYQFANDPARFRFTHQTSFVKRHLGLSSTPGVRWVVAFFRQFFRSVTKVDYLTLRAGFINAHLSHNSKFDFHKYIKRSMEDDFKVVVGISLPLWCVAILTLFLDIDGIGTLTWISFIPLVILLCVGTKLEMIIMEMALEIQDRASVIKGAPVVEPSNKFFWFHRPDWVLFFIHLTLFQNAFQMAHFVWTVATPGLKKCFHMHIGLSIMKVVLGLALQFLCSYITFPLYALVTQMGSNMKRSIFDEQTAKALTNWRNTAKEKKKVRDTDMLMAQMIGDATPSRGASPMPSRGSSPVHLLHKGMGRSDDPQSTPTSPRAMEEARDMYPVVVAHPVHRLNPADRRRSVSSSALDVDIPSADFSFSQG

SEQ ID NO.6野生型TaMLO-D1的氨基酸序列：534aa

MAEDDGYPPARTLPETPSWAVALVFAVMIIVSVLLEHALHKLGQWFHKRHKNALAEALEKIKAELMLVGFISLLLAVTQDPISGICISEKAASIMRPCSLPPGSVKSKYKDYYCAKKGKVSLMSTGSLHQLHIFIFVLAVFHVTYSVIIMALSRLKMRTWKKWETETASLEYQFANDPARFRFTHQTSFVKRHLGLSSTPGIRWVVAFFRQFFRSVTKVDYLTLRAGFINAHLSHNSKFDFHKYIKRSMEDDFKVVVGISLPLWCVAILTLFLDIDGIGTLTWISFIPLVILLCVGTKLEMIIMEMALEIQDRASVIKGAPVVEPSNKFFWFHRPDWVLFFIHLTLFQNAFQMAHFVWTVATPGLKKCFHMHIGLSIMKVVLGLALQFLCSYITFPLYALVTQMGSNMKRSIFDEQTAKALTNWRNTAKEKKKVRDTDMLMAQMIGDATPSRGASPMPSRGSSPVHLLHKGMGRSDDPQSTPTSPRAMEEARDMYPVVVAHPVHRLNPADRRRSVSSSALDADIPSADFSFSQG

SEQ ID NO.11在载体pYP010中的TALEN(TAL-L+TAL-R)的编码序列。

ATGGTGGATCTACGCACGCTCGGCTACAGTCAGCAGCAGCAAGAGAAGATCAAACCGAAGGTGCGTTCGACAGTGGCGCAGCACCACGAGGCACTGGTGGGCCATGGGTTTACACACGCGCACATCGTTGCGCTCAGCCAACACCCGGCAGCGTTAGGGACCGTCGCTGTCACGTATCAGCACATAATCACGGCGTTGCCAGAGGCGACACACGAAGACATCGTTGGCGTCGGCAAACAGTGGTCCGGCGCACGCGCCCTGGAGGCCTTGCTCACGGATGCGGGGGAGTTGAGAGGTCCGCCGTTACAGTTGGACACAGGCCAACTTGTGAAGATTGCAAAACGTGGCGGCGTGACCGCAATGGAGGCAGTGCATGCATCGCGCAATGCACTGACGGGTGCCCCCCTGAACCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCCACGATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACAATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCCACGATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACGGTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACAATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCCACGATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACGGTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACAATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCCACGATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACGGTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCCACGATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACAATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCCACGATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCCACGATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACAATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACGGTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAAGCATTGTGGCCCAGCTGAGCCGGCCTGATCCGGCGTTGGCCGCGTTGACCAACGACCACCTCGTCGCCTTGGCCTGCCTCGGCGGACGTCCTGCCATGGATGCAGTGAAAAAGGGATTGCCGCACGCGCCGGAATTGATCAGAAGAGTCAATCGCCGTATTGGCGAACGCACGTCCCATCGCGTTGCCGGATCCCAGCTGGTGAAGTCCGAGCTGGAAGAAAAAAAGAGCGAGCTGCGCCACAAGCTCAAGTACGTGCCCCACGAGTACATCGAGCTGATCGAGATCGCCCGCAACAGCACCCAAGACCGCATCCTGGAGATGAAAGTGATGGAGTTCTTCATGAAGGTGTACGGCTACCGCGGCAAGCACCTGGGCGGCTCCCGCAAGCCCGATGGCGCCATCTACACCGTGGGCTCCCCCATCGACTATGGCGTCATTGTCGACACCAAGGCCTACTCCGGCGGCTACAACTTACCCATCGGTCAGGCCGACGAGATGCAACGCTACGTGAAGGAGAACCAGACCCGCAATAAGCACATTAATCCCAACGAGTGGTGGAAGGTGTACCCCTCCTCCGTGACCGAGTTCAAATTCCTGTTCGTGTCCGGCCACTTCAAGGGCAATTATAAGGCCCAACTGACCCGCCTGAACCACAAGACCAACTGCAACGGCGCCGTGCTGTCCGTGGAGGAACTGCTGATCGGCGGCGAGATGATCAAGGCTGGTACCCTGACCCTGGAAGAGGTGCGCCGCAAGTTCAACAATGGTGAAATCAATTTCAGGTCCGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACGGGGTGCCGGCTAGCATGGTGGATCTACGCACGCTCGGCTACAGTCAGCAGCAGCAAGAGAAGATCAAACCGAAGGTGCGTTCGACAGTGGCGCAGCACCACGAGGCACTGGTGGGCCATGGGTTTACACACGCGCACATCGTTGCGCTCAGCCAACACCCGGCAGCGTTAGGGACCGTCGCTGTCACGTATCAGCACATAATCACGGCGTTGCCAGAGGCGACACACGAAGACATCGTTGGCGTCGGCAAACAGTGGTCCGGCGCACGCGCCCTGGAGGCCTTGCTCACGGATGCGGGGGAGTTGAGAGGTCCGCCGTTACAGTTGGACACAGGCCAACTTGTGAAGATTGCAAAACGTGGCGGCGTGACCGCAATGGAGGCAGTGCATGCATCGCGCAATGCACTGACGGGTGCCCCCCTGAACCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACAAGGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACAAGGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACAAGGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACATTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACAAGGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACATTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACGGTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACAAGGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCCACGATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACATTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACGGTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACATTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACGGTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCCACGATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCCACGATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCCACGATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTGACCCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACAAGGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAAGCATTGTGGCCCAGCTGAGCCGGCCTGATCCGGCGTTGGCCGCGTTGACCAACGACCACCTCGTCGCCTTGGCCTGCCTCGGCGGACGTCCTGCCATGGATGCAGTGAAAAAGGGATTGCCGCACGCGCCGGAATTGATCAGAAGAGTCAATCGCCGTATTGGCGAACGCACGTCCCATCGCGTTGCCAGATCTCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGGAGCGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATCTCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTGAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTTAATAG

SEQ ID NO.12TALEN的氨基酸序列。

MVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVTYQHIITALPEATHEDIVGVGKQWSGARALEALLTDAGELRGPPLQLDTGQLVKIAKRGGVTAMEAVHASRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPAMDAVKKGLPHAPELIRRVNRRIGERTSHRVAGSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVKENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHKTNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINFRSGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPRMDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPASMVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVTYQHIITALPEATHEDIVGVGKQWSGARALEALLTDAGELRGPPLQLDTGQLVKIAKRGGVTAMEAVHASRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNKGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNKGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNKGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNKGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNKGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNKGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPAMDAVKKGLPHAPELIRRVNRRIGERTSHRVARSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMERYVEENQTRNKHLNPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF

在lineTamlo-R32中的Tamlo-A的核酸序列(编码序列)

SEQ ID NO.38

在lineTamlo-R32中的Tamlo-D1的核酸序列(编码序列)

SEQ ID NO.39

Tamlo-R32-A上游序列(～3000bp)；ATG起始密码子是粗体的并且下划线的

SEQ ID NO.40

Tamlo-R32-B上游序列(～3500bp)；ATG起始密码子是粗体的并且下划线的

SEQ ID NO.41

Tamlo-R32-D上游序列(～3500bp)；ATG起始密码子是粗体的并且下划线的

SEQ ID NO.42

Claims

1.小麦植物、植物部分或植物细胞，所述小麦植物、植物部分或植物细胞具有与野生型小麦植物相比增加的对白粉病的抗性和与野生型小麦植物相比相当的在非疾病条件下的产量，其中所述植物包含在选自TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1的两个等位基因的编码区中的功能丧失突变和第三TaMLO等位基因的减少的表达。

2.根据权利要求1所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，其中与野生型等位基因相比，所述第三TaMLO等位基因不含有在编码区中的突变。

3.根据权利要求1所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物包含在TaMLO-A1和TaMLO-D1的编码区中的功能丧失突变和TaMLO-B1的减少的表达。

4.根据权利要求3所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，其中所述TaMLO-B1的减少的表达由在TaMLO-B1的调节区中的突变、在MLO病原体反应途径下游的基因中的突变或表观遗传因素导致。

5.根据权利要求1所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，其中所述突变使用靶向的基因组修饰引入。

6.根据权利要求5所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，其中所述突变使用切点罕见核酸内切酶例如TALEN、ZFN或CRISPR/Cas9引入。

7.根据权利要求6所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，其中所述突变使用TALEN引入并且其中所述TAL效应子结合TCGCTGCTGCTCGCCGTgacgcaggaccccatctcCGGGATATGCATCTCCGA(SEQ ID NO.13)。

8.根据权利要求1所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，其中所述突变是插入、缺失或置换。

9.根据权利要求1所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，其中所述小麦植物选自包括但不限于下列各项的清单，普通小麦(Triticum aestivum)、埃塞俄比亚小麦(T.aethiopicum)、阿拉拉特小麦(T.araraticum)、野生一粒小麦(T.boeoticum)、波斯小麦(T.carthlicum)、密穗小麦(T.compactum)、野生二粒小麦(T.dicoccoides)、栽培二粒小麦(T.dicoccum)、硬粒小麦(T.durum)、依斯帕汗小麦(T.ispahanicum)、科尔希二粒小麦(T.karamyschevii)、马卡小麦(T.macha)、T.militinae、一粒小麦(T.monococcum)、波兰小麦(T.polonicum)、T.repens、斯佩耳特小麦(T.spelta)、印度圆粒小麦(T.sphaerococcum)、提莫非维小麦(T.timopheevii)、东方小麦(T.turanicum)、圆锥小麦(T.turgidum)、乌拉尔图小麦(T.urartu)、瓦维洛夫小麦(T.vavilovii)和茹科夫斯基小麦(T.zhukovskyi)。

10.根据权利要求1所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，其中所述突变在TaMLO-A1等位基因中，所述TaMLO-A1等位基因具有SEQ ID NO.1的野生型序列或与所述野生型序列具有至少75％序列同一性的其功能变体。

11.根据权利要求1所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，其中所述突变在TaMLO-B1等位基因中，所述TaMLO-B1等位基因具有SEQ ID NO.2的野生型序列或与所述野生型序列具有至少75％序列同一性的其功能变体。

12.根据权利要求1所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，其中所述突变在TaMLO-D1等位基因中，所述TaMLO-D1等位基因具有SEQ ID NO.3的野生型序列或与所述野生型序列具有至少75％序列同一性的其功能变体。

13.根据权利要求1所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物不包含转基因。

14.根据权利要求1所述的小麦植物、植物部分或植物细胞，所述小麦植物、植物部分或植物细胞包含如在SEQ ID No.38中所示的Tamlo-a序列、如在SEQ ID No.39中所示的Tamlo-d序列和具有SEQ ID NO.2的野生型序列的TaMLO-B1序列。

15.小麦植物、植物部分或植物细胞或其一部分，其中所述小麦基因型已经以CGMCC登录号10951保藏。

16.根据前述权利要求所述的植物部分或植物种子。

17.使用靶向的基因组修饰来制备小麦植物、植物部分或植物细胞的方法，所述小麦植物、植物部分或植物细胞具有与野生型植物相比增加的对白粉病的抗性和与野生型小麦植物相比相当的在非疾病条件下的产量，所述方法包括将功能丧失突变引入至选自TaMLO-A1、TaMLO-B1和TaMLO-D1的两个MLO等位基因的编码区中并且减少第三TaMLO等位基因的表达。

18.根据权利要求17所述的方法，其中与野生型等位基因相比，所述第三TaMLO等位基因不包含在编码区中的突变。

19.根据权利要求17所述的方法，所述方法包括在TaMLO-A1、TaMLO-D1的编码区中引入功能丧失突变并且减少TaMLO-B1的表达。

20.根据权利要求19所述的方法，其中TaMLO-B1包含在调节区中的突变。

21.根据权利要求17和20所述的方法，其中所述突变使用切点罕见核酸内切酶例如TALEN、ZFN或CRISPR/Cas9引入。

22.根据权利要求21所述的方法，其中筛选TaMLO-A1、TaMLO-B1和/或TaMLO-D1等位基因中的诱导的靶向突变包括从所述植物获得核酸样品以及进行核酸扩增和任选的限制性酶消化以检测在TaMLO-A1、TaMLO-B1和/或TaMLO-D1等位基因中的突变。

23.根据权利要求22所述的方法，所述方法包括通过对TaMLO-A1、TaMLO-B1和/或TaMLO-D1核酸进行测序来确认所述突变的存在。

24.根据权利要求21所述的方法，所述方法还包括将植物再生并且筛选对白粉病具有抗性的植物的步骤。

25.为小麦植物赋予对白粉病的抗性的方法，所述方法包括制备根据权利要求17所述的植物。

26.根据权利要求17所述的方法，其中所述植物不含有转基因。

27.通过权利要求17所述的方法获得或可获得的植物、植物部分或植物细胞。

28.根据权利要求27所述的植物部分，其中所述植物部分是种子。

29.分离的Tamlo核酸序列，所述Tamlo核酸序列在SEQ ID NO.38或39中限定。