CN104789588A - 一种获得抗白粉病小麦的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种获得抗白粉病小麦的方法。本发明提供的一种获得抗白粉病小麦的方法，包括如下步骤：敲除出发小麦中的MLO基因，得到抗白粉病小麦。本发明对于抗白粉病植物的育种具有重大应用价值。

Description

一种获得抗白粉病小麦的方法
技术领域
本发明涉及一种获得抗白粉病小麦的方法。
背景技术
小麦是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物，起源于中东新月沃土(Levant)地区，是世界上最早栽培的农作物之一。小麦是一种温带长日照植物，适应范围较广，自北纬17°-50°，从平原到海拔约4000m的高原(如中国西藏)均有种植。2010年，小麦是世界上总产量位居第二的粮食作物(6.51亿吨)，仅次于玉米(8.44亿吨)。全世界有43个国家，有35％-40％的人口以小麦为主要粮食。据联合国粮农组织2004年统计，全世界小麦收获面积32.36亿亩，单产193.8千克/亩，总产6.27亿吨。
小麦的颖果是人类的主食之一，磨成面粉后可制作面包、馒头、饼干、面条等食物，发酵后可制成啤酒、酒精、伏特加或生质燃料。小麦富含淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、钙、铁、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素A及维生素C等。
小麦白粉病是一种世界性病害，在各主要产麦国均有分布，我国山东沿海、四川、贵州、云南发生普遍，危害严重。近年来该病在东北、华北、西北麦区，亦有日趋严重之势。该病可侵害小麦植株地上部各器官，但以叶片和叶鞘为主，发病重时颖壳和芒也受害。近年来，由于品种、栽培制度、肥水、气候条件的影响，白粉病大量发生，导致小麦叶片早枯、成穗率减少、千粒重下降，严重影响了小麦的品质与产量。
发明内容
本发明的目的是提供一种获得抗白粉病小麦的方法。
本发明提供的获得抗白粉病小麦的方法，包括如下步骤：敲除出发小麦中的MLO基因，得到抗白粉病小麦。
所述抗白粉病小麦为所述MLO基因被敲除的纯合株。
所述MLO基因为TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因；
所述TaMLO-A1基因编码如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列4衍生的蛋白质；
所述TaMLO-B1基因编码如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列5衍生的蛋白质；
所述TaMLO-D1基因编码如下(e)或(f)：(e)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f)将序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列6衍生的蛋白质。
所述TaMLO-1A基因为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：(1)编码区如序列表的序列1所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
所述TaMLO-B1基因为如下(4)或(5)或(6)的DNA分子：(4)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
所述TaMLO-D1基因为如下(7)或(8)或(9)的DNA分子：(7)编码区如序列表的序列3所示的DNA分子；(8)在严格条件下与(7)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；(9)与(7)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子。
所述“敲除出发小麦中的MLO基因”是通过在所述MLO基因上进行定点敲除实现的。可分别对所述TaMLO-A1基因、所述TaMLO-B1基因和所述TaMLO-D1基因进行定点敲除(即3对3的定点敲除)。由于所述TaMLO-A1基因、所述TaMLO-B1基因和所述TaMLO-D1基因的同源性很高，也可以选择它们的保守区域进行定点敲除(即1对3的定点敲除)。
所述定点敲除的靶序列可位于所述MLO基因的第二个外显子的保守区。
对于所述TaMLO-A1基因来说，定点敲除的靶序列具体如下：
TaMLO-A基因:cacgcaggacccaatctc
对于所述TaMLO-B1基因来说，定点敲除的靶序列具体如下：
TaMLO-B基因:gacgcaggaccccatctc
对于所述TaMLO-D1基因来说，定点敲除的靶序列具体如下：
TaMLO-D基因:gacgcaggacccaatctc
所述定点敲除的实现方式为：基因组定点编辑技术。所述基因组定点编辑技术为锌指核酸酶技术(ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶技术(TALENs)或CRISPR/Cas9系统。所述基因组定点编辑技术为转录激活子样效应因子核酸酶技术。
所述定点敲除是借助TAL-MLO-L蛋白和TAL-MLO-R蛋白实现的；所述TAL-MLO-L蛋白包括两个功能区段，即与靶序列上游部分核苷酸特异结合的TAL-L片段和EL突变型Fok I核酸内切酶；所述TAL-MLO-R蛋白包括两个功能区段，即与靶序列下游部分核苷酸特异结合的TAL-R片段和KK突变型Fok I核酸内切酶。
所述TAL-L片段如序列表的序列12自N末端第138-681位氨基酸残基所示；所述EL突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N末端第733-933位氨基酸残基所示；所述TAL-R片段如序列表的序列12自N末端第1130-1707位氨基酸残基所示；所述KK突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N末端第1759-1954位氨基酸残基所示。
所述TAL-MLO-L蛋白自上游至下游依次包括如下元件：N端片段、所述TAL-L片段、C端片段和所述EL突变型Fok I核酸内切酶；
所述TAL-MLO-R蛋白自上游至下游依次包括如下元件：所述N端片段、所述TAL-R片段、所述C端片段和所述KK突变型Fok I核酸内切酶；
所述N端片段如序列表的序列12自N末端第1-136位氨基酸残基所示；所述C端片段如序列表的序列12自N末端第684-730位氨基酸残基所示。
所述TAL-MLO-L蛋白如序列表的序列12自N末端第1-950位氨基酸残基所示；所述TAL-MLO-R蛋白如序列表的序列12自N末端第951-1954位氨基酸残基所示。
所述定点敲除是通过导入重组载体实现的。所述重组载体为含有特异融合基因的质粒。所述特异融合基因包括区段甲和区段乙；所述区段甲自上游至下游依次包括如下元件：N端片段的编码区、TAL-L片段的编码区、C端片段的编码区和EL突变型Fok I核酸内切酶的编码区；所述区段乙自上游至下游依次包括如下元件：所述N端片段的编码区、TAL-R片段的编码区、所述C端片段的编码区和KK突变型Fok I核酸内切酶的编码区；所述区段甲和所述区段乙之间具有T2A片段；所述TAL-L片段如序列表的序列12自N末端第138-681位氨基酸残基所示；所述EL突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N末端第733-933位氨基酸残基所示；所述TAL-R片段如序列表的序列12自N末端第1130-1707位氨基酸残基所示；所述KK突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N末端第1759-1954位氨基酸残基所示；所述N端片段如序列表的序列12自N末端第1-136位氨基酸残基所示；所述C端片段如序列表的序列12自N末端第684-730位氨基酸残基所示；所述T2A片段如序列表的序列12自N末端第934-951位氨基酸残基所示。所述重组载体具体为将序列10所示双链DNA中的attL1位点和attL2位点之间的部分取代重组质粒pYP010中序列7所示双链DNA分子中的attR1位点和attR2位点之间的部分得到的质粒pYP010-T-MLO。所述重组质粒pYP010为将序列表的序列7所示的双链DNA分子插入pJIT163载体的KpnI和EcoRV酶切位点之间得到的重组质粒。
本发明还保护一种融合基因，包括区段甲和区段乙；所述区段甲自上游至下游依次包括如下元件：N端片段的编码区、TAL-L片段的编码区、C端片段的编码区和EL突变型Fok I核酸内切酶的编码区；所述区段乙自上游至下游依次包括如下元件：所述N端片段的编码区、TAL-R片段的编码区、所述C端片段的编码区和KK突变型Fok I核酸内切酶的编码区；所述区段甲和所述区段乙之间具有T2A片段；所述TAL-L片段如序列表的序列12自N末端第138-681位氨基酸残基所示；所述EL突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N末端第733-933位氨基酸残基所示；所述TAL-R片段如序列表的序列12自N末端第1130-1707位氨基酸残基所示；所述KK突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N末端第1759-1954位氨基酸残基所示；所述N端片段如序列表的序列12自N末端第1-136位氨基酸残基所示；所述C端片段如序列表的序列12自N末端第684-730位氨基酸残基所示；所述T2A片段如序列表的序列12自N末端第934-951位氨基酸残基所示。
含有所述融合基因的重组载体也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为将序列10所示双链DNA中的attL1位点和attL2位点之间的部分取代所述重组质粒pYP010中序列7所示双链DNA分子中的attR1位点和attR2位点之间的部分得到的质粒pYP010-T-MLO。
本发明还保护用于敲除出发小麦中的MLO基因的物质在制作抗白粉病小麦中的应用。所述抗白粉病小麦为所述MLO基因被敲除的纯合株。所述MLO基因为TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因；
所述TaMLO-A1基因编码如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列4衍生的蛋白质；
所述TaMLO-B1基因编码如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列5衍生的蛋白质；
所述TaMLO-D1基因编码如下(e)或(f)：(e)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f)将序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列6衍生的蛋白质。
所述TaMLO-A1基因为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：(1)编码区如序列表的序列1所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
所述TaMLO-B1基因为如下(4)或(5)或(6)的DNA分子：(4)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
所述TaMLO-D1基因为如下(7)或(8)或(9)的DNA分子：(7)编码区如序列表的序列3所示的DNA分子；(8)在严格条件下与(7)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；(9)与(7)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子。
所述“敲除出发小麦中的MLO基因”是通过在所述MLO基因上进行定点敲除实现的。可分别对所述TaMLO-A1基因、所述TaMLO-B1基因和所述TaMLO-D1基因进行定点敲除(即3对3的定点敲除)。由于所述TaMLO-A1基因、所述TaMLO-B1基因和所述TaMLO-D1基因的同源性很高，也可以选择它们的保守区域进行定点敲除(即1对3的定点敲除)。
所述定点敲除的靶序列可位于所述MLO基因的第二个外显子的保守区。
对于所述TaMLO-A1基因来说，定点敲除的靶序列具体如下：
TaMLO-A基因:cacgcaggacccaatctc
对于所述TaMLO-B1基因来说，定点敲除的靶序列具体如下：
TaMLO-B基因:gacgcaggaccccatctc
对于所述TaMLO-D1基因来说，定点敲除的靶序列具体如下：
TaMLO-D基因:gacgcaggacccaatctc
所述定点敲除的实现方式为：基因组定点编辑技术。所述基因组定点编辑技术为锌指核酸酶技术(ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶技术(TALENs)或CRISPR/Cas9系统。所述基因组定点编辑技术为转录激活子样效应因子核酸酶技术。
所述定点敲除是借助TAL-MLO-L蛋白和TAL-MLO-R蛋白实现的；所述TAL-MLO-L蛋白包括两个功能区段，即与靶序列上游部分核苷酸特异结合的TAL-L片段和EL突变型Fok I核酸内切酶；所述TAL-MLO-R蛋白包括两个功能区段，即与靶序列下游部分核苷酸特异结合的TAL-R片段和KK突变型Fok I核酸内切酶。
所述TAL-L片段如序列表的序列12自N末端第138-681位氨基酸残基所示；所述EL突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N末端第733-933位氨基酸残基所示；所述TAL-R片段如序列表的序列12自N末端第1130-1707位氨基酸残基所示；所述KK突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N末端第1759-1954位氨基酸残基所示。
所述TAL-MLO-L蛋白自上游至下游依次包括如下元件：N端片段、所述TAL-L片段、C端片段、所述EL突变型Fok I核酸内切酶；
所述TAL-MLO-R蛋白自上游至下游依次包括如下元件：所述N端片段、所述TAL-R片段、所述C端片段、所述KK突变型Fok I核酸内切酶；
所述N端片段如序列表的序列12自N末端第1-136位氨基酸残基所示；所述C端片段如序列表的序列12自N末端第684-730位氨基酸残基所示。
所述TAL-MLO-L蛋白如序列表的序列12自N末端第1950位氨基酸残基所示；所述TAL-MLO-R蛋白如序列表的序列12自N末端第951-1954位氨基酸残基所示。
所述定点敲除是通过导入重组载体实现的。所述重组载体为含有特异融合基因的质粒。所述特异融合基因包括区段甲和区段乙；所述区段甲自上游至下游依次包括如下元件：N端片段的编码区、TAL-L片段的编码区、C端片段的编码区和EL突变型Fok I核酸内切酶的编码区；所述区段乙自上游至下游依次包括如下元件：所述N端片段的编码区、TAL-R片段的编码区、所述C端片段的编码区和KK突变型Fok I核酸内切酶的编码区；所述区段甲和所述区段乙之间具有T2A片段；所述TAL-L片段如序列表的序列12自N末端第138-681位氨基酸残基所示；所述EL突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N末端第733-933位氨基酸残基所示；所述TAL-R片段如序列表的序列12自N末端第1130-1707位氨基酸残基所示；所述KK突变型Fok I核酸内切酶如序列表的序列12自N末端第1759-1954位氨基酸残基所示；所述N端片段如序列表的序列12自N末端第1-136位氨基酸残基所示；所述C端片段如序列表的序列12自N末端第684-730位氨基酸残基所示；所述T2A片段如序列表的序列12自N末端第934-951位氨基酸残基所示。所述重组载体具体为将序列10所示双链DNA中的attL1位点和attL2位点之间的部分取代重组质粒pYP010中序列7所示双链DNA分子中的attR1位点和attR2位点之间的部分得到的质粒pYP010-T-MLO。所述重组质粒pYP010为将序列表的序列7所示的双链DNA分子插入pJIT163载体的KpnI和EcoRV酶切位点之间得到的重组质粒。
本发明还保护TaMLO-A1蛋白、TaMLO-B1蛋白或TaMLO-D1蛋白；
所述TaMLO-A1蛋白为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列4衍生的蛋白质；
所述TaMLO-B1蛋白为如下(c)或(d)：(c)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列5衍生的蛋白质；
所述TaMLO-D1蛋白为如下(e)或(f)：(e)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(f)将序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列6衍生的蛋白质。
本发明还保护TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因或TaMLO-D1基因；
所述TaMLO-A1基因为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：(1)编码区如序列表的序列1所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
所述TaMLO-B1基因为如下(4)或(5)或(6)的DNA分子：(4)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
所述TaMLO-D1基因为如下(7)或(8)或(9)的DNA分子：(7)编码区如序列表的序列3所示的DNA分子；(8)在严格条件下与(7)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；(9)与(7)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子。
以上任一所述出发小麦具体可为小麦品种“科农199”。
以上任一所述抗白粉病具体可为抗白粉病致病菌E09生理小种、抗白粉病致病菌E22生理小种或抗白粉病致病菌B13生理小种。
基因组定点编辑技术可在靶序列上产生DNA双链断裂(DSB)，细胞启动修复机制，通过非同源末端连接(NHEJ)这种不精确的修复方式可以产生基因定点突变。相对于传统的突变体创制方法，基因定点编辑技术具有高效率、高精度、高通量等优点。
本发明对于培育抗白粉病小麦具有重大价值。
附图说明
图1为小麦MLO基因靶位点的TALENs在小麦原生质体中的活性检测。
图2为用PCR/RE检测TALENs介导的小麦MLO基因的T0代突变体以及测序结果。
图3为不同组合类型的MLO基因的纯合突变体的基因型。
图4为不同组合类型的MLO基因的纯合突变体侵染小麦白粉病小种E09的抗病结果。
图5为小麦MLO基因的纯合突变体tamlo-aabbdd接菌小种E22和B13的抗病结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pJIT163载体：Guerineau,F.,Lucy,A.&Mullineaux,P.Effect of two consensussequences preceding the translation initiator codon on gene expression in plantprotoplasts.Plant Mol.Biol.18,815–818(1992).。
pZHY013载体：Zhang,Y.et al.Transcription activator-like effector nucleasesenable efficient plant genome engineering.Plant Physiol.161,20–27(2013).。
小麦品种“科农199”(WT)：李俊明；张相岐；张爱民；王志国；安调过；纪军；王静.高产广适小麦新品种——科农199.麦类作物学报.2007.368-368；中国科学院遗传发育与生物学研究所农业资源中心。
白粉病致病菌，属于禾本科布氏白粉菌属，B.graminisf.sp.Tritici，实施例中分别采用如下生理小种：E09、E22、B13：李洪杰等，中国小麦品种对白粉病的抗性反应与抗病基因检测.作物学报.2011,37(6):943-954.孙蕾，2014.小偃麦及其衍生后代对白粉病和禾谷孢囊线虫病的抗性研究。
实施例1、方法的建立
普通小麦是六倍体植物，大部分基因都以多个拷贝的形式分布在基因组A、基因组B和基因组D组上。小麦MLO基因在基因组A、基因组B和基因组D上都有分布，分别命名为TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因(TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因又被称为小麦MLO基因的三个位点)，该三个基因编码的蛋白质的相似性达99％。TaMLO-A1基因如序列表的序列1所示，编码序列表的序列4所示的TaMLO-A1蛋白。TaMLO-B1基因如序列表的序列2所示，编码序列表的序列5所示的TaMLO-B1蛋白。TaMLO-D1基因如序列表的序列3所示，编码序列表的序列6所示的TaMLO-D1蛋白。
小麦中，TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因在功能上具有冗余效应，单个位点的突变或其中两个位点的突变均不能显示抗白粉病的表型，只有3个位点同时发生突变时才会显示抗白粉病表型。本发明通过基因组定点编辑技术同时突变小麦中MLO基因的三个位点(即同时敲除TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因)，得到的纯合株即为抗白粉病小麦。
实施例2、重组质粒的构建
一、选择靶序列并设计TALENs
将小麦源MLO基因的第二个外显子的一个保守区作为靶序列，设计一对TALENs(由TAL-MLO-L蛋白和TAL-MLO-R蛋白组成；TAL-MLO-L蛋白包括两个功能区段，即与靶序列上游部分核苷酸特异结合的TAL-L片段和EL突变型Fok I核酸内切酶；TAL-MLO-R蛋白包括两个功能区段，即与靶序列下游部分核苷酸特异结合的TAL-R片段和KK突变型Fok I核酸内切酶)，该TALENs对TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因的靶序列分别如下(参见图2a)：
TaMLO-A1基因:cacgcaggacccaatctc
TaMLO-B1基因:gacgcaggaccccatctc
TaMLO-D1基因:gacgcaggacccaatctc
对于TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因来说，TAL-L片段的结合区为靶序列中左侧方框标注的部分，TAL-R片段的结合区为靶序列中右侧方框标注的部分的反向互补序列。对于TaMLO-A1基因来说，TAL-L片段的结合区为靶序列中左侧方框标注的部分。TaMLO-A1的靶序列中，右侧方框标注的部分的反向互补序列与TAL-R片段的结合区存在一个核苷酸的不匹配。
在小麦细胞中，TAL-L片段和TAL-R片段分别与各自的结合区结合后，两个不同单体形式的Fok I核酸内切酶(EL突变型Fok I核酸内切酶和KK突变型Fok I核酸内切酶)形成具有活性的Fok I二聚体核酸内切酶，在靶序列区域(包括靶序列及其侧翼序列)进行切割，产生一个双链断裂的缺口，细胞自发修复该缺口的过程中会引入大量突变(本处“突变”指的是广义突变，包括插入、缺失、狭义突变等形式，这些突变中绝大多数为基因功能失活突变)。
上述靶序列中，中间未进行方框标记的部分中存在一个AvaII酶切识别序列，可以被限制性内切酶AvaII切割。靶序列区域被切割后：如果发生了突变，则AvaII酶切识别序列被破坏，将不能被限制性内切酶AvaII切割；如果没有发生突变，将可以被限制性内切酶AvaII切割。
二、重组质粒的构建
1、将序列表的序列7所示的双链DNA分子插入pJIT163载体的KpnI和EcoRV酶切位点之间，得到重组质粒pYP010(表达载体)。序列表的序列7中，自5’末端第1-1979位核苷酸为UBI启动子，第1995-2124位核苷酸为attR1位点，第3580-3704位核苷酸为attR2位点，第3760-4014位核苷酸为Nos终止子。
2、合成序列表的序列8所示的双链DNA分子，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切pZHY013载体，回收约4329bp的载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pZHY013-TAL-L。
5、合成序列表的序列9所示的双链DNA分子，用限制性内切酶BamHI和XbaI双酶切，回收酶切产物。
6、用限制性内切酶NheI和BglII双酶切步骤4得到的重组质粒pZHY013-TAL-L，回收约6531bp的载体骨架。
7、将步骤5的酶切产物和步骤6的载体骨架连接，得到重组质粒pZHY013-TAL-L-TAL-R。重组质粒pZHY013-TAL-L-TAL-R中的功能区如序列表的序列10所示。序列表的序列10中，自5’末端第1-100位核苷酸为attL1位点，第239-646位核苷酸为N端片段的编码区，第650-2281位核苷酸为TAL-L片段的编码区，第2288-2428位核苷酸为C端片段的编码区，第2435-3037位核苷酸为EL突变型Fok I核酸内切酶的编码区，第3038-3091位核苷酸为T2A片段(具有自剪切功能的多肽片段)的编码区，第3215-3622位核苷酸为N端片段的编码区，第3626-5359位核苷酸为TAL-R片段的编码区，第5366-5506位核苷酸为C端片段的编码区，第5513-6100位核苷酸为KK突变型Fok I核酸内切酶的编码区，第6107-6219位核苷酸为attL2位点。
8、将重组质粒pYP010与重组质粒pZHY013-TAL-L-TAL-R进行同源重组，得到定向敲除质粒(又称质粒pYP010-T-MLO)(参见图1a)。
重组质粒pYP010中的序列7所示双链DNA分子中的attR1位点和attR2位点与重组质粒pZHY013-TAL-L-TAL-R中的序列10所示双链DNA中的attL1位点和attL2位点发生同源同组，序列10所示双链DNA中的attL1位点和attL2位点之间的部分取代了重组质粒pYP010中序列7所示双链DNA分子中的attR1位点和attR2位点之间的部分，即为质粒pYP010-T-MLO。质粒pYP010-T-MLO中，由UBI启动子启动表达序列表的序列11所示的融合基因，得到序列表的序列12所示的融合蛋白。
序列表的序列12中，自N末端第1-136位氨基酸残基为N端片段，第138-681位氨基酸残基为TAL-L片段，第684-730位氨基酸残基为C端片段，第733-933位氨基酸残基为EL突变型Fok I核酸内切酶，第934-951位氨基酸残基为T2A片段，993-1128位氨基酸残基为N端片段，第1130-1707位氨基酸残基为TAL-R片段，第1710-1756位氨基酸残基为C端片段，第1759-1954位氨基酸残基为KK突变型Fok I核酸内切酶。
序列12所示的融合蛋白中，在T2A片段中发生自剪切，形成两条蛋白片段，其中一条如序列表的序列12自N末端第1-950位氨基酸残基所示，另一条如序列表的序列12自N末端第951-1954位氨基酸残基所示。
三、转化小麦原生质体
将质粒pYP010-T-MLO通过PEG介导的方式转入小麦品种“科农199”的原生质体，然后提取原生质体的基因组DNA，用特异引物通过PCR分别扩增TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因，然后将PCR扩增产物进行AvaII单酶切(如果PCR扩增产物不能被切开，说明步骤一设计的TALENs有活性)，将不能被酶切的PCR扩增产物进行测序。
用于扩增TaMLO-A1基因的引物对如下：
上游引物：TGGCGCTGGTCTTCGCCGTCATGATCATCGTC；
下游引物：TACGATGAGCGCCACCTTGCCCGGGAA。
用于扩增TaMLO-B1基因的引物对如下：
上游引物：ATAAGCTCGGCCATGTAAGTTCCTTCCCGG；
下游引物：CCGGCCGGAATTTGTTTGTGTTTTTGTT。
用于扩增TaMLO-D1基因的引物对如下：
上游引物：TGGCTTCCTCTGCTCCCTTGGTGCACCT；
下游引物：TGGAGCTGGTGCAAGCTGCCCGTGGACATT。
部分AvaII单酶切结果见图1b。
部分测序结果见图1c。
结果表明，步骤一设计的TALENs有活性，对TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因都具有较高的定点敲除活性，TaMLO-A1基因上的单碱基的差异并没有影响TALENs的切割活性，且对TaMLO-A1基因和TaMLO-D1基因的敲除活性大于对TaMLO-B1基因的敲除活性。
四、转化小麦
将质粒pYP010-T-MLO通过基因枪转化的方法导入小麦品种“科农199”。
在T0代，得到小麦源MLO基因发生定点突变的转基因植株，其中包括只有TaMLO-A1基因发生定点突变的杂合株，只有TaMLO-B1基因发生定点突变的杂合株，只有TaMLO-D1基因发生定点突变的杂合株，TaMLO-A1基因和TaMLO-B1基因同时发生定点突变的杂合株，TaMLO-A1基因和TaMLO-D1基因同时发生定点突变的杂合株，TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因同时发生定点突变的杂合株，TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因同时发生定点突变的杂合株(部分杂合株提取基因组DNA并进行AvaII酶切的结果见图2b，部分测序结果见图2c)。
将T0代转基因植株经自交，得到T1代和T2代植株，其中包括TaMLO-A1基因发生定点突变的纯合株(tamlo-aa)，TaMLO-B1基因发生定点突变的纯合株(tamlo-bb)，TaMLO-D1基因发生定点突变的纯合株(tamlo-dd)，TaMLO-A1基因和TaMLO-B1基因同时发生定点突变的纯合株(tamlo-aabb)，TaMLO-A1基因和TaMLO-D1基因同时发生定点突变的纯合株(tamlo-aadd)，TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因同时发生定点突变的纯合株(tamlo-bbdd)，TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因同时发生定点突变的纯合株(tamlo-aabbdd)，参见图3。
将重组质粒pYP010通过基因枪转化的方法导入小麦品种“科农199”，得到转空载体植株。
将小麦品种“科农199”、转空载体植株的T2代植株以及各个MLO基因不同组合纯合突变株的T2代植株进行小麦白粉病致病菌的接菌实验。
1、表型观察
生长一周左右的小麦植株，取叶片，将叶片放置在含8.5μM苯并咪唑的琼脂平板上，将小麦白粉病致病菌均匀散洒在叶片上(每个叶片接菌3000个孢子以上)，静置培养7天后观察表型。
采用E09生理小种时的结果见图4c。小麦品种“科农199”、转空载体植株的T2代植株、各个单位点突变的纯合突变株(tamlo-aa,tamlo-bb,tamlo-dd)的T2代植株、各个双位点突变的纯合突变株(tamlo-aabb,tamlo-aadd)的T2代植株均具有白粉病发病表型。三位点突变的纯合突变株(tamlo-aabbdd)的T2代植株没有白粉病发病表型。
2、计算微菌落指数
(1)生长一周左右的小麦植株，取叶片，将叶片放置在含8.5μM苯并咪唑的琼脂平板上，将小麦白粉病致病菌均匀散洒在在叶片上(每个叶片约800-1000个孢子)。
(2)培养3天后，将叶片在乙醇-醋酸(乙醇：醋酸＝1:1；体积比)里室温固定24小时。
(3)用水洗涤，然后在乳酸-甘油-水(乳酸：甘油：水＝1:1:1；体积比)里室温脱色48小时。
(4)用水洗涤，然后用考马斯亮蓝染液染色5s-10s。
(5)用水洗涤，在显微镜下观察，统计微菌落指数(micro-colony index，％)。
微菌落指数＝发育形成菌丝结构的孢子数/(未萌发的孢子数+发育形成菌丝结构的孢子数)*100％。
采用E09生理小种时的结果见图4a和图4b。小麦品种“科农199”、转空载体植株的T2代植株、各个单位点突变的纯合突变株(tamlo-aa,tamlo-bb,tamlo-dd)的T2代植株、各个双位点突变的纯合突变株(tamlo-aabb,tamlo-aadd)的T2代植株的微菌落指数均为20-25％。三位点突变的纯合突变株(tamlo-aabbdd)的T2代植株的微菌落指数几乎为0％。
小麦植株接种E09生理小种的照片见图4d，小麦品种“科农199”具有白粉病发病表型，三位点突变的纯合突变株(tamlo-aabbdd)的T2代植株没有白粉病发病表型。
采用E22生理小种或B13生理小种时的结果见图5。小麦品种“科农199”、转空载体植株的T2代植株的微菌落指数均为15-25％。三位点突变的纯合突变株(tamlo-aabbdd)的T2代植株的微菌落指数几乎为0％。
结果表明，小麦MLO基因的三位点的纯合突变体(tamlo-aabbdd)对小麦白粉病具有广谱的抗性。
相对于野生型小麦来说，TaMLO-A1基因发生功能缺失突变的纯合株(单位点突变)、TaMLO-B1基因发生功能缺失突变的纯合株(单位点突变)、TaMLO-1D基因发生功能缺失突变的纯合株(单位点突变)、TaMLO-A1基因和TaMLO-B1基因同时发生功能缺失突变的纯合株(双位点突变)、TaMLO-A1基因和TaMLO-D1基因同时发生功能缺失突变的纯合株(双位点突变)、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因同时发生功能缺失突变的纯合株(双位点突变)对白粉病并没有表现出明显的抗病性，而TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因同时发生功能缺失突变的纯合株(三位点突变)对白粉病表现出明显的广谱抗病性。
本发明提出了利用基因组定点编辑技术针对小麦抗白粉基因MLO突变体创制的方法及突变体功能的解析，创制了具有广谱抗性和持久抗性的小麦种质和品种，丰富了小麦抗白病育种的材料。

Claims (10)

1.一种获得抗白粉病小麦的方法，包括如下步骤：敲除出发小麦中的MLO基因，得到抗白粉病小麦。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抗白粉病小麦为所述MLO基因被敲除的纯合株。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述MLO基因为TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因和TaMLO-D1基因；
所述TaMLO-A1基因编码如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列4衍生的蛋白质；
所述TaMLO-B1基因编码如下(c)或(d)：
(c)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(d)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列5衍生的蛋白质；
所述TaMLO-D1基因编码如下(e)或(f)：
(e)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(f)将序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列6衍生的蛋白质。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述“敲除出发小麦中的MLO基因”是通过在所述MLO基因上进行定点敲除实现的。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述定点敲除是借助TAL-MLO-L蛋白和TAL-MLO-R蛋白实现的；所述TAL-MLO-L蛋白包括两个功能区段，即与靶序列上游部分核苷酸特异结合的TAL-L片段和EL突变型Fok I核酸内切酶；所述TAL-MLO-R蛋白包括两个功能区段，即与靶序列下游部分核苷酸特异结合的TAL-R片段和KK突变型Fok I核酸内切酶。
6.一种融合基因，包括区段甲和区段乙；所述区段甲自上游至下游依次包括如下元件：N端片段的编码区、TAL-L片段的编码区、C端片段的编码区和EL突变型Fok I核酸内切酶的编码区；所述区段乙自上游至下游依次包括如下元件：所述N端片段的编码区、TAL-R片段的编码区、所述C端片段的编码区和KK突变型Fok I核酸内切酶的编码区；所述区段甲和所述区段乙之间具有T2A片段。
7.含有权利要求6所述融合基因的重组载体。
8.用于敲除出发小麦中的MLO基因的物质在制作抗白粉病小麦中的应用。
9.TaMLO-A1蛋白、TaMLO-B1蛋白或TaMLO-D1蛋白；
所述TaMLO-A1蛋白为如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列4衍生的蛋白质；
所述TaMLO-B1蛋白为如下(c)或(d)：
(c)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(d)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列5衍生的蛋白质；
所述TaMLO-D1蛋白为如下(e)或(f)：
(e)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(f)将序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由序列6衍生的蛋白质。
10.TaMLO-A1基因、TaMLO-B1基因或TaMLO-D1基因；
所述TaMLO-A1基因为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：
(1)编码区如序列表的序列1所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
所述TaMLO-B1基因为如下(4)或(5)或(6)的DNA分子：
(4)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；
(5)在严格条件下与(4)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
(6)与(4)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
所述TaMLO-D1基因为如下(7)或(8)或(9)的DNA分子：
(7)编码区如序列表的序列3所示的DNA分子；
(8)在严格条件下与(7)限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；
(9)与(7)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子。
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