ES2950027T3 - Trigo con alto contenido en amilosa - Google Patents

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Abstract

Se proporciona un grano de trigo (Triticum aestivum) que comprende un embrión, almidón y una, dos o tres proteínas SBEIIa, comprendiendo dicho embrión dos alelos idénticos de un gen SBEIIa-A, dos alelos idénticos de un gen SBEIIa-B y dos alelos idénticos de un gen SBEIIa-D, en el que el almidón tiene un contenido de amilosa de al menos el 50 % (p/p) como proporción del almidón extraíble del grano, y en el que al menos una de las proteínas SBEIIa se produce en el endospermo del trigo en desarrollo y tiene actividad enzimática ramificadora del almidón. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Trigo con alto contenido de amilosa
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/410.288, presentada el 4 de noviembre de 2010.
Sector de la técnica
La memoria descriptiva describe plantas de trigo hexaploide que tienen alto contenido de almidón de amilosa y el uso de tales plantas, y en particular grano o almidón de estas en una variedad de alimentos y productos no alimenticios.
Estado de la técnica
Los detalles bibliográficos de las publicaciones mencionadas por el autor en esta memoria descriptiva se reúnen al fin de la descripción.
La referencia a cualquier técnica previa en esta memoria descriptiva no es, ni se debe considerar como, un reconocimiento o alguna forma de sugerencia de que esta técnica previa forma parte del conocimiento general común en ningún país.
En la última década, se ha aprendido mucho acerca de los eventos moleculares, genéticos y celulares que sustentan los ciclos de vida de la planta y la producción de la planta. Un producto vegetal particularmente importante es el grano de trigo. El grano de trigo es un alimento principal en muchos países y suministra al menos 20 % de los kilojoules alimenticios para la población mundial total. El almidón es el principal componente del grano de trigo y se usa en una vasta variedad de alimentos y productos no alimenticios. Las características del almidón varían y cumplen un papel clave en la determinación de la adecuación del almidón de trigo para un uso final particular. A pesar de este enorme consumo global y a pesar del aumento de conciencia respecto de la importancia de la funcionalidad del almidón sobre la calidad del producto final, la investigación sobre la variación genética en el trigo y su preciso impacto sobre las características del almidón va a la zaga de otras plantas de cultivo comercialmente importantes.
El trigo para pan (Triticum aestivum) es un hexaploide que tiene tres pares de cromosomas homeólogos que definen los genomas, A, B y D. El endospermo del grano comprende 2 complementos haploides de la célula materna y 1 de una célula paterna. El embrión del grano de trigo comprende un complemento haploide de cada una de las células maternas y paternas. Se ha considerado que la hexaploidia es un obstáculo significativo para la investigación y desarrollo de las variantes útiles del trigo. En efecto, se conoce muy poco respecto de cómo interactúan los genes homeólogos del trigo, cómo se regula su expresión, y si las diferentes producidas por los genes homeólogos actúan en forma separada o en conjunto.
El almidón del cereal está compuesto de dos polímeros de glucosa, amilasa y amilopectina. La relación de amilasa a amilopectina parece ser un determinante mayor en (i) el beneficio de salud del grano de trigo y el almidón de trigo y (ii) la calidad de los productos finales que comprenden almidón de trigo.
La amilosa es un polímero esencialmente lineal de unidades de glucosa ligadas a-1,4, mientras que la amilopectina es altamente ramificada con enlaces de las unidades glucosídicas a-1,6 que unen las cadenas lineales.
Los almidones con alto contenido de amilosa son de particular interés para sus beneficios de salud. Se ha hallado inter alia que los alimentos que comprenden alto contenido de amilasa tienen naturalmente un contenido más alto de almidón resistente (una forma de fibra dietaria). RS es almidón o productos digestivos de almidón que no se digieren o absorben en el intestino delgado. Se ha observado en forma creciente que el almidón resistente tiene un papel importante para promover la salud intestinal y proteger contra enfermedades tales como cáncer colorrectal, diabetes tipo II, obesidad, enfermedad cardíaca y osteoporosis. Los almidones con alto contenido de amilasa se han desarrollado en determinados granos tales como maíz y cebada para uso en alimentos como medio de promover la salud intestinal. Los efectos beneficiosos del almidón resistente resultan de la provisión de un nutriente a intestino grueso donde se da a la microflora intestinal una fuente de energía que fermenta para formar entre otros ácidos grasos de cadena corta. Estos ácidos grasos de cadena corta proporcionan nutrientes para los colonocitos, aumentan la absorción de determinados nutrientes a través del intestino grueso y promueven la actividad fisiológica del colon. Generalmente, si no se proporcionan almidones resistentes u otras fibras dietarias al colon, este se vuelve relativamente inactivo desde el punto de vista metabólico. En consecuencia, los productos ricos en amilasa tienen el potencial para facilitar el aumento de consumo de fibra. Algunos de beneficios potenciales de consumir granos de trigo ricos en amilasa o sus productos tales como almidón incluyen su papel en la regulación de los niveles de azúcar e insulina y lípidos, promoción de la salud intestinal, producción de alimentos de bajo valor calórico que promueven la saciedad, mejora del efecto laxante, volumen acuoso de las heces, promoción del crecimiento de bacterias probióticos, y aumento de la excreción de ácido biliar fecal.
La mayor parte de los alimentos amiláceos procesados contienen muy poco RS. Los panes fabricados mediante harina de trigo tipo salvaje y un proceso de formulación y horneado convencional contenían <1 % RS. En comparación, los panes horneados mediante las mismas condiciones del proceso y almacenamiento pero que contienen los trigos con alto contenido de amilasa modificada tenían niveles de RS hasta 10 veces más alto (ver Publicación internacional N.° WO 2006/069422). Las legumbres, que son una de las pocas fuentes ricas de RS en la dieta humana, contienen niveles de RS que son normalmente <5 %. En consecuencia, el consumo de pan de trigo rico en amilasa en las cantidades consumidas normalmente por los adultos (por ejemplo, 200 g/d) puede suministrar fácilmente al menos 5-12 g de RS. En consecuencia, la incorporación del trigo con alto contenido de amilasa en los productos alimenticios tiene el potencial de hacer una considerable contribución a las ingestas dietarias de RS de las naciones desarrolladas, donde se estima que las ingestas diarias promedio de RS son solo de aproximadamente 5 g.
El almidón se usa ampliamente en las industrias de alimentos, papel y químicas. La estructura física del almidón puede tener un impacto importante en las propiedades nutricionales y de manipulación del almidón para los productos alimenticios o no alimenticios o industriales. Ciertas características que se pueden tomar como una indicación de la estructura del almidón incluyen la distribución de la longitud de la cadena de la amilopectina, el grado y tipo cristalinidad y propiedades tales como temperatura de gelatinización, viscosidad y volumen de hinchamiento. Los cambios en la longitud de la cadena de amilopectina pueden ser un indicador de alteraciones de la cristalinidad, gelatinización o retrogradación de la amilopectina.
Mientras que los almidones modificados químicamente o de otro modo se pueden usar en alimentos que proporcionan funcionalidad no provista normalmente por las fuentes no modificadas, tal procesamiento tiene una tendencia a alterar otros componentes de valor o conlleva la percepción de ser no deseable debido a los procesos involucrados en la modificación. En consecuencia, es preferible proveer fuentes de constituyentes que se puedan usar en forma no modificada en los alimentos.
El almidón se sintetiza inicialmente en las plantas en cloroplastos de tejidos de fotosíntesis tales como hojas, en la forma de almidón transitorio. Esto se moviliza durante los períodos de oscuridad posteriores para suministrar carbón para exportar a órganos sumidero y metabolismo energético o para almacenamiento en órganos tales como semillas o tubérculos. La síntesis y almacenamiento a largo plazo de almidón ocurre en los amiloplastos de los órganos de almacenamiento, tales como el endospermo, donde el almidón se deposita como gránulos semicristalinos de hasta 100 μm de diámetro. Los gránulos contienen amilosa y amilopectina, el primero normalmente como material amorfo en el gránulo de almidón nativo mientras el último es semicristalino a través del apilamiento de las cadenas glucosídicas lineales. Los gránulos también contienen alguna de las proteínas involucradas en la biosíntesis de almidón.
La síntesis de almidón en el endospermo se lleva a cabo en cuatro etapas esenciales. La pirofosforilasa ADP-glucosa (ADGP) cataliza la síntesis de ADP-glucosa de glucosa-1-fosfato y ATP. Las sintasas de almidón luego promueven la transferencia de ADP-glucosa al extremo de una unidad de glucosa unida a-1,4. En tercer lugar, las enzimas de ramificación de almidón (SBE) forman nuevas uniones a-1,6 en los a-poliglucanos. Las enzimas de desramificación de almidón (SDBE) luego eliminan algunas de las uniones de la rama a través de un mecanismo que no se ha resuelto por completo.
Si bien es evidente que al menos estas cuatro actividades son necesarias para la síntesis de gránulos de almidón normales en las plantas superiores, múltiples isoformas de enzimas que forman parte en una de las actividades se hallan en el endospermo de las plantas superiores. Las funciones específicas para algunas isozimas propuestas sobre el análisis por mutación o a través de la modificación de los niveles de expresión génica mediante los métodos transgénicos Abel et al., 1996; Jobling et al., 1999; Schwall et al., 2000). Sin embargo, las contribuciones precisas de cada isoforma de cada actividad a la biosíntesis del almidón aún no son conocidas, y estas contribuciones parecen diferir notoriamente entre las especies.
En el endospermo del cereal, están presentes dos isoformas de ADP-glucosa piofosforilasa (ADGP), una forma dentro del amiloplasto, y una forma en el citoplasma. Cada forma está compuesta de dos tipos de subunidades. Los mutantes de encogido (sh2) y quebradizo (bt2) del maíz representan lesiones en las subunidades grande y pequeña respectivamente.
Algunos esfuerzos se han centrado en las enzimas de síntesis del almidón para investigar las estrategias para modular la relación de amilosa/amilopectina en trigo (ver Sestili et al. 2010).
Cuatro clases de almidón sintasa (SS) se hallan en el endospermo del cereal, una isoforma exclusivamente localizada dentro del gránulo de almidón (sintasa de almidón unida al gránulo (GBSS)), dos formas que se dividen entre el gránulo y la fracción soluble (SSI y SSII) y una cuarta forma que está completamente ubicada en la fracción soluble (SSIII). Se ha demostrado que la GBSS es esencial para la síntesis de amilosa y se han mostrado mutaciones en SSII y SSIII para alterar la estructura de la amilopectina.
Una planta de trigo imitante que carece completamente de la proteína SGP-1 (SSIIa) se produjo por el cruzamiento de líneas que carecen de las formas específicas del genoma A, B y D de la proteína SGP-1 (SSII) (Yamamori et al., 2000). El exagente de las semillas nulas SSII mostraron que la mutación produjo alteraciones en la estructura de amilopectina, gránulos de almidón deformados y un contenido de amilasa elevado a aproximadamente 30-37 % del almidón, que fue un aumento de aproximadamente 8 % respecto del nivel de tipo salvaje (Yamamori et al., 2000). La amilasa se midió por medición colorimétrica, titulación amperométrica (ambas por unión de yodo) y un método de concanavalina. El almidón de la mutante nula SSII exhibió una disminución de la temperatura de gelatinización en comparación con el almidón de una planta no mutante, equivalente. El contenido de almidón se redujo de 60 % en el tipo salvaje a menos de 50 % en el grano nulo SSII.
En el maíz, la mutación dulll causa disminución del contenido de almidón y aumento de los niveles de amilasa en el endospermo, el grado de cambio dependió de los antecedentes genéticos, y el aumento del grado de cambio de la ramificación de la amilopectina restante. El gen correspondiente a la mutación se identificó y aisló por una estrategia de marcación de transposón usando el mutador de transposón (Mu) y se mostró que codifica la enzima denominada almidón sintasa II (SSII). La enzima es reconocida actualmente como un miembro de la familia SSIII en los cereales. El endospermo mutante tenía niveles reducidos de actividad SBEIIa asociados con la mutación dull1. No se sabe si estos hallazgos son relevantes para otros cereales.
Se ha identificado líneas de cebada que tienen una elevada proporción de amilasa en el grano de almidón. Estas incluyen High Amylose Glacier (AC38) que tiene un contenido de amilosa relativo de aproximadamente 45 %, y mutaciones inducidas químicamente en el gen SSIIa de cebada que aumentó los niveles de amilosa en el almidón en grano a aproximadamente 65-70 % (WO 02/37955 A1; Morell et al., 2003). El almidón redujo las temperaturas de gelatinización.
Se conocen dos clases principales de SBE en las plantas, SBEI y SBEII. SBEII también se puede categorizar en dos tipos de cereales, SBEIIa y SBEIIb. Las formas adicionales de las SBE también se informan en algunos cereales, una SBEI putativa de 149 kDa de trigo y SBE de 50/51 de cebada.
El alineamiento de secuencia revela un alto grado de semejanza de secuencia en los niveles de nucleótido y aminoácido y permite el agrupamiento en clases SBEI, SBEIIa y SBEIIb. Las SBEIIa y SBEIIb generalmente exhiben alrededor de 80 % de identidad de la secuencia de nucleótidos entre sí, en particular en las regiones centrales de los genes.
En maíz y arroz, se ha mostrado que los fenotipos con alto contenido de amilosa provienen de lesiones en el gen SBEIIb, también conocido como el gen extensor de amilosa (ae) (Boyer and Preiss, 1981, Mizuno et al., 1993; Nishi et al., 2001). En estas mutantes SBEIIb, los granos de almidón del endospermo mostraron una morfología anormal, el contenido de amilosa se elevó significativamente, se redujo la frecuencia de ramificación de la amilopectina residual y la proporción de cadenas cortas (<DP17, especialmente DP8-12) fue más baja. Además, la temperatura de gelatinización del almidón aumentó. Además, hubo una mezcla significativa de material que se definió como "intermedio" entre amilosa y amilopectina (Boyer et al., 1980, Takeda et al., 1993b). En contraste, las mutantes de las plantas de maíz en el gen SBEIIa debido a un elemento de inserción mutador (Mu) y en consecuencia que carece de la expresión de la proteína SBEII fueron indistinguibles de las plantas de tipo salvaje en la ramificación del almidón del endospermo (Blauth et al., 2001), aunque se alteraron en el almidón de la hoja. Tanto en maíz como arroz, los genes de SBEIIa y SBEIIb no se unen en el genoma.
SBEIIa, SBEIIb y SBEI también se pueden distinguir por sus patrones de expresión, tanto temporales como espaciales, en endospermo y en otros tejidos. SBEI se expresa a partir del desarrollo del endospermo medio hacia delante en trigo y maíz (Morell et al., 1997). En contraste, SBEIIa y SBEIIb se expresan de una etapa temprana del desarrollo del endospermo. En maíz, SBEIIb es la forma predominante en el endospermo mientras que SBEIIa está presente en los niveles de expresión alta en la hoja (Gao et al., 1997). En arroz, SBEIIa y SBEIIb se hallan en el endospermo en cantidades aproximadamente iguales. Sin embargo, hay diferencias en el tiempo y los tejidos de expresión. SBEIIa se expresa en una etapa previa del desarrollo de la semilla, que se detecta a los 3 días después de la floración, y se expresó en las hojas, mientras que SBEIIb no fue detectable a los 3 días después de la floración y fue más abundante en las semillas en desarrollo a 7-10 días después de la floración y no se expresó en las hojas. En el endospermo de trigo, SBEI (Morell et al, 1997) se halla exclusivamente en la fracción soluble, mientras que SBEIIa y SBEIIb se hallan en fracciones en almidón soluble y en gránulo (Rahman et al 1995).
Se han conocido variedades de amilosa muy alta por algún tiempo. El almidón de amilopectina baja del maíz que contiene un contenido de amilosa muy alto (>90 %) se obtuvo por una reducción considerable en la actividad de SBEI junto con una inactivación casi completa de actividad de SBEII (Sidebottom et al., 1998).
En la papa, la regulación por disminución de la principal SBE en tubérculos (SBE B, equivalente a SBEI) por los métodos antisentido produjo alguna de las características de almidón nuevas, pero no alteró el contenido de amilosa (Safford et al., 1998). La inhibición de antisentido de la forma menos abundante de SBE (SBE A, análogo al SBEII en cereales) produjo un aumento moderado en el contenido de amilosa a 38 % (Jobling et al., 1999). Sin embargo, la regulación por disminución de SBEII y SBEI dio aumentos muchos mayores en el contenido de amilosa respectivo, a 60-89 %, que la regulación por disminución de SBEII solo (Schwall et al., 2000).
La Publicación internacional N.° WO 2005/001098 y Publicación internacional N.° WO 2006/069422 describe inter alia hexaploide transgénico de trigo que comprende constructos de ARN dúplex que reducen la expresión de SBEIIa y/o SBEIIb en el endospermo. El grano de líneas transgénicas no portaba las proteínas de SBEIIa y/o SBEIIb o niveles de proteína reducidos. Una pérdida de proteína SBEII del endospermo se asoció con aumento de niveles de amilosa relativos de más de 50 %. Una pérdida de los niveles de proteína SBEIIb no pareció alterar sustancialmente la proporción de amilosa en el almidón en grano. Se propuso, pero no se estableció que una mutante nula triple SBEIIa y/o SBEIIb que carece sustancialmente de la expresión de las proteínas de SBEIIa y SBEIIb puede producir adicionales elevaciones de los niveles de amilosa. Sin embargo, no fue conocido o posible de predecir a partir de la técnica previa cuantos alelos mutantes de SBEIIa y/o SBEIIb se pueden requerir para proporcionar altos niveles de amilosa de al menos 50 % como una proporción del almidón total. Tampoco se conoció si el grano de los genotipos nulos triples puede ser viable o si las plantas de trigo pueden ser fértiles.
Es necesario en la técnica para las plantas de trigo con alto contenido de amilosa mejoradas y para métodos de producir los mismos.
Objeto de la invención
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá implicar la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros indicados, pero no la exclusión de ningún otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.
Como se usa en la presente las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen aspectos plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En consecuencia, por ejemplo, la referencia a "una mutación" incluye una mutación única, así como dos o más mutaciones; la referencia a "una planta" incluye una planta, así como dos o más plantas; y demás.
Cada forma de realización en esta memoria descriptiva se aplica mutatis mutandis a todas las demás formas de realización a menos que se indique expresamente lo contrario.
Los genes y otro material genético (por ejemplo, ARNm, constructos, etc.) se representan en cursiva y sus productos de expresión proteináceos se representan en forma no cursiva. En consecuencia, por ejemplo, SBEIIa es un producto de expresión de SBEIIa.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se denominan con un número identificador de secuencia (SEQ ID NO:). Las SEQ ID NO: corresponden numéricamente a los identificadores de secuencia <400>1 (SEQ ID NO:1), <400>2 (SEQ ID NO:2), etc. Se proporciona una lista de secuencias después de las reivindicaciones.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que es comúnmente entendido por los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Si bien cualquier método y material similar o equivalente a los descriptos en la presente se puede usar en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen métodos y materiales preferidos.
La presente invención proporciona una variedad de plantas de trigo que tienen características de almidón modificado.
En una forma de realización, la invención proporciona un grano de trigo (Triticum aestivum) que comprende un embrión, un endospermo, almidón y un nivel o actividad reducidos de proteína SBEII total donde el embrión comprende una mutación de pérdida de función en cada uno de los 5 a 12 alelos de los genes SBEII endógenos seleccionados del grupo que consiste en SBEIIa-A, SBEIIa-B, SBEIIa-D, SBEIIb-A, SBEIIb-B y SBEIIb-D, de forma que es 2 % a 30 % del nivel o actividad de la proteína SBEII total un grano de trigo tipo salvaje, incluyendo dichos 5 a 12 alelos 4, 5 o 6 alelos de SBEIIa que comprenden cada uno una mutación de pérdida de función, donde cuando el número de alelos de SBEIIa que comprenden una mutación de pérdida de función es sólo 4 entonces el número de alelos de SBEIIb que comprenden una mutación de pérdida de función es 6, donde el grano comprende un contenido de amilosa de al menos 50 % (p/p), o al menos 60 % (p/p), o al menos 67 % (p/p) como una proporción del almidón total en el grano, y donde el grano da lugar a una planta de trigo que es masculina y femenina fértil. En una forma de realización, la invención proporciona grano de trigo que comprende un embrión y almidón, donde el embrión comprende dos alelos idénticos de un gen de SBEIIa-A, dos alelos idénticos de un gen de SBEIIa-B y dos alelos idénticos de un gen de SBEIIa-D, donde cada uno de los genes de SBEIIa originan una cantidad de proteína (p/p) una proteína que tiene actividad de SBEIIa que es menor que es menor que la del correspondiente gen tipo salvaje, y al menos uno de dichos genes comprende una mutación puntual, donde el almidón comprende amilosa de modo tal que el grano tiene un contenido de amilosa de al menos 50 % (p/p) como una proporción del almidón total del grano.
%
En algunas formas de realización, la cantidad y actividad de la proteína SBEII están reducidas. En consecuencia, por ejemplo, un grano de la invención puede comprender una cantidad reducida de proteína SBEIIa (p/p) que tiene actividad de SBEIIa reducida.
En varias formas de realización, el nivel o actividad de la proteína SBEII en el grano es menor de 2 % o 2 % a 15 %, o 3 % a 10 %, o 2 % a 20 % o 2 % a 25 % del nivel o actividad de la proteína SBEII en el grano tipo salvaje.
En diversas realizaciones, el nivel o la actividad de la proteína SBEII total en el grano es de entre 2 % y 15 %, o de entre 3 % y 10 %, o de entre 2 % y 20 % o de entre 2 % y 25 % del nivel o la actividad de la proteína SBEII total en el grano de tipo salvaje.
En algunas formas de realización, la cantidad y actividad de la proteína SBEIIa en el grano es menor de 2 % de la cantidad de actividad de la proteína SBEIIa en un grano de trigo de tipo salvaje.
El grano es de trigo hexaploide (Triticum aestivum).
En una forma de realización, cuando el número de alelos de SBEIIa que comprende una mutación de pérdida de función es 6, por ende, al menos dos alelos SBEIIb comprenden una mutación de pérdida parcial de función. En una forma de realización adicional, el embrión de trigo hexaploide no tiene alelos nulos de genes de SBEIIb, o solo 1, solo 2, solo 3, solo 4, solo 5 o 6 alelos nulos de los genes de SBEIIb.
En una forma de realización adicional, el embrión de trigo hexaploide tiene solo 2, solo 3, solo 4 o solo 5 alelos nulos de los genes SBEIIa.
En algunas formas de realización, el embrión de trigo hexaploide tiene 6 alelos nulos de los genes de SBEIIa.
En algunas formas de realización, el grano o embrión tiene solo 1 gen nulo de SBEIIa.
En algunas formas de realización, el grano o embrión tiene solo 2 genes nulos de SBEIIa.
En una forma de realización adicional, el embrión de trigo hexaploide no tiene alelos nulos de genes SBEIIb, o solo 1, solo 2, solo 3, solo 4, solo 5 o 6 alelos nulos de los genes SBEIIb.
En otra forma de realización, los alelos nulos de los genes de SBEIIa o SBEIIb están sobre el genoma A, genoma B, genoma D, genomas A y B, genomas A y D, genomas A y D, o los tres genomas A, B y D.
En otra forma de realización, el embrión de trigo hexaploide comprende 0, 1, 2, 3, 4, 5, o 6 alelos de pérdida parcial de función de los genes SBEIIa. En algunos casos de alelos de pérdida parcial de función del gen SBEIIa está sobre el genoma A, genoma B, genoma D, genomas A y B, genomas A y D, genomas A y D, o tres de los genomas A, B y D.
En forma adicional, en algunas formas de realización, el embrión de trigo hexaploide comprende 0, 1, 2, 3, 4, 5, o 6 alelos de pérdida parcial de función de los genes de SBEIIb. En algunos casos los alelos de pérdida parcial de función del gene SBEIIb está sobre en el genoma A, genoma B, genoma D, genomas A y B, genomas A y D, genomas A y D, o los tres genomas A, B y D.
En otras formas de realización, los alelos de pérdida parcial de función de los genes de SBEIIa o SBEIIb están sobre el genoma A, genoma B, genoma D, genomas A y B, genomas A y D, genomas A y D, o los tres genomas A, B y D. En otra forma de realización, el embrión de trigo hexaploide comprende 5 alelos de SBEIIa que comprende una mutación de pérdida de función nula o parcial y 1 SBEIIa alelo que es tipo salvaje.
En algunas formas de realización, la mutación nula se selecciona de modo independiente del grupo que consiste en una mutación por supresión, una mutación por inserción, una mutación del sitio de empalme, una mutación por terminación de la traducción prematura, y una mutación por cambio de marco.
En algunas formas de realización, el embrión es homocigota para los alelos mutantes en cada 2 o 3 genes SBEIIa y/o cada uno de 2 o 3 genes de SBEIIb.
En otras formas de realización, el embrión es heterocigota para cada uno de los 2 o 3 genes SBEIIa y/o cada uno de 2 o 3 genes de SBEIIb.
En forma provechosa, en varias formas de realización de la presente invención el grano comprende alelos nulos y alelos de pérdida parcial de función de SBEIIa y/o SBEIIb, donde cada uno de los alelos nulos está ubicado en un genoma diferente que cada uno de los alelos de pérdida parcial de función.
En algunas formas de realización en relación con los alelos nulos, cada mutación nula se selecciona de modo independiente del grupo que consiste en una mutación por supresión, una mutación por inserción, una mutación por empalme del sitio, una mutación por terminación de la traducción prematura, y una mutación por cambio de marco. En una forma de realización, una o más de las mutaciones nulas son mutaciones por sustitución no conservadora de aminoácido o una mutación nula tiene una combinación de dos o más sustituciones no conservadora de aminoácido. En este contexto, las sustituciones no conservadoras de aminoácido son como se definen en la presente. El grano puede comprender mutaciones en cada uno de los dos genes de SBEIIa, cada uno de los cuales son mutaciones nulas, y una mutación por sustitución de aminoácido en un tercer gen de SBEIIa, donde cada una de las mutaciones nulas con preferencia son mutaciones por terminación de la traducción prematura o mutaciones por supresión o una mutación por terminación de la traducción prematura y una mutación por supresión, y la mutación por sustitución de aminoácido es una sustitución conservadora de aminoácido o con preferencia, una sustitución no conservadora de aminoácido.
En algunas formas de realización amplias, el grano de la presente invención incluye una o más de mutaciones nulas o mutaciones de pérdida parcial de función que son mutaciones por sustitución de aminoácidos, que son de modo independiente sustitución conservadora o no conservadora de aminoácidos.
En algunas formas de realización, el grano de la presente invención comprende una mutación puntual, que es una mutación por sustitución de aminoácido.
En algunas formas de realización de la invención, uno de los genes de SBEIIa-A, SBEIIa-B o SBEIIa-D comprende una a mutación puntual de modo tal que la proteína codificada por dicho gen carece de actividad de la enzima ramificadora del almidón.
En algunas formas de realización, el grano de la presente invención tiene alelos nulos que son mutaciones por supresión en los genomas B y D que suprimen al menos parte de los genes de SBEIIa-B y SBEIIa-D, respectivamente y donde el gen de SBEIIa-A comprende la mutación puntual; o que tiene alelos nulos que son mutaciones por supresión en los genomas A y D que suprimen al menos parte de los genes SBEIIa-A y SBEIIa-D, respectivamente y donde el gen de SBEIIa-B comprende la mutación puntual; o tiene alelos nulos que son mutaciones por supresión en los genomas A y B que suprimen al menos parte de los genes SBEIIa-A y SBEIIa-B, respectivamente y donde el gen de SBEIIa-D comprende la mutación puntual.
En algunas formas de realización de la invención, el embrión comprende 6 alelos de SBEIIb de los cuales al menos uno tiene una mutación por pérdida de función.
En algunas formas de realización de la invención, el embrión no tiene alelos nulos de los genes de SBEIIb, o solo 2, solo 4 o 6 alelos nulos de los genes de SBEIIb.
En algunas formas de realización, el grano comprende una mutación nula que es una mutación por supresión en el genoma A, B o D, que suprime al menos parte de un gen de SBEIIa y al menos una parte de un gen de SBEIIb, con preferencia que suprime el total del gen de SBEIIa y/o el gen de SBEIIb gene.
En algunas formas de realización, el grano de la invención comprende a mutación nula que es una mutación por supresión en el genoma B que suprime al menos parte del gen SBEIIa-B y al menos una parte del gen SBEIIb-B, con preferencia que suprime el total del gen de SBEIIa-B y/o el gen de SBEIIb-B; o que comprende una mutación nula que es una mutación por supresión en el genoma D que suprime al menos parte del gen de SBEIIa-D y al menos una parte del gen de SBEIIb-D, con preferencia que suprime el total del gen de SBEIIa-D y/o el gen de SBEIIb-D; o que comprende una mutación nula que es una mutación por supresión en el genoma B que suprime al menos parte del gen SBEIIa-A y al menos una parte del gen SBEIIb-A, con preferencia que suprime el total del gen de SBEIIa-A y/o el gen SBEIIb-A.
En ejemplos ilustrativos, se proporciona un grano donde los alelos que comprenden una mutación parcial de pérdida de función, cada una expresa una enzima SBEIIa o SBEIIb que corresponde en cantidad y/o actividad a 2 % a 60 %, o 10 % a 50 %, de la cantidad o actividad del correspondiente alelo tipo salvaje.
En algunas formas de realización, el grano comprende al menos una proteína SBEIIa que tiene actividad ramificadora del almidón cuando se expresa en el endospermo en desarrollo, la proteína está presente en una cantidad o tiene actividad de la enzima ramificadora del almidón entre 2 % a 60 %, o entre 10 % a 50 %, o entre 2 % a 30 %, o entre 2 % a 15 %, o entre 3 % a 10 %, o entre 2 % a 20 % o entre 2 % a 25 % de la cantidad o actividad de la correspondiente proteína en un grano de trigo de tipo salvaje.
En algunas formas de realización de la invención, n existe actividad de la proteína SBEIIa en el grano.
En forma específica, en algunas formas de realización, el grano no es transgénico, es decir, no comprende ningún transgén, o en una forma de realización más específica no comprende un ácido nucleico exógeno que codifica un ARN que reduce la expresión de un gen de SBEIIa, es decir, si comprende un transgén, este transgén codifica un ARN diferente de un ARN que reduce la expresión de un gen de SBEIIa. Tales ARN incluyen ARN que codifican proteínas que o confieren, por ejemplo, tolerancia a herbicida, tolerancia a enfermedad, aumento de la eficiencia de uso de nutrientes, o tolerancia a la sequía u otros estreses.
En algunas formas de realización, el grano tiene solo una proteína SBEIIa determinada por el análisis de transferencia Western, y donde la proteína está codificada por uno de los genes de SBEIIa-A, SBElIa-B y SBEIIa-D y tiene actividad reducida de la enzima ramificadora del almidón cuando se produce en endospermo en desarrollo cuando se compara con una proteína SBEIIa codificada por el correspondiente gen tipo salvaje.
En algunas formas de realización, la proteína SBEIIa tiene una movilidad alterada con respecto a su correspondiente proteína SBEIIa tipo salvaje, determinada por electroforesis por afinidad del gel en geles que contienen almidón. En algunas formas de realización, el grano carece de proteína SBEIIa detectable determinada por análisis de transferencia Western.
En algunas formas de realización, el embrión comprende solo una o solo dos proteínas de SBEIIb que tienen actividad de la enzima ramificadora del almidón cuando se producen en el endospermo en desarrollo, o solo una o solo dos proteínas de SBEIIb que son detectable por análisis de transferencia Western.
En relación con las mutaciones de pérdida de función, en algunas formas de realización, al menos una, más de una o todas las mutaciones de pérdida de función son i) mutaciones introducidas, ii) se indujeron en una planta de trigo progenitora o semilla por mutagénesis con un agente mutagénico tal como un agente químico, agente biológico o irradiación, o iii) se introdujeron a fin de modificar el genoma de planta.
En otra forma de realización ilustrativa, el grano comprende un ácido nucleico exógeno que codifica un ARN que reduce la expresión de un gen SBEIIa, un gen SBEIIb, o ambos.
Como se determina en la presente, el grano proporciona en algunas formas de realización particulares donde el grano tiene una velocidad de germinación de aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 %, o aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 % con respecto a la velocidad de germinación de un grano tipo salvaje en condiciones estándares. Las condiciones estándares con preferencia son las que se definen en la presente.
En una forma de realización particular, la actividad de SBEII o actividad de SBEIIa se determina por el ensayo de la actividad enzimática en el grano mientras que se desarrolla en una planta de trigo, o por el ensayo de la cantidad de proteína SBEII tal como la proteína SBEIIa, en grano cosechado por medios inmunológicos u otros medios.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el grano como se describe anteriormente, donde el almidón del grano es al menos 50 % (p/p), o al menos 60 % (p/p), o al menos 67 % (p/p) de amilosa como una proporción del almidón total y se caracteriza por uno o más de:
(i) que comprende al menos 2 % de almidón resistente;
(ii) que comprende un índice glucémico relativo bajo (GI);
(iii) que comprende niveles de amilopectina relativamente bajos;
(iv) gránulos de almidón distorsionados;
(v) birrefringencia del gránulo reducida;
(vi) volumen de hinchamiento reducido;
(vii) distribución de longitud de cadena y/o frecuencia de ramificación modificadas;
(viii) retraso del fin de la gelatinización y temperatura del pico superior;
(ix) viscosidad reducida (viscosidad del pico, temperatura de la pasta, etc.);
(x) aumento del peso molecular de amilopectina;
(xi) un porcentaje de cristalinidad del almidón modificado, y
(xii) un porcentaje de cristalinidad del almidón de tipo A o de tipo B modificado, con respecto a gránulos de almidón o almidón de trigo de tipo salvaje.
En algunas formas de realización, el grano está comprendido en una planta de trigo.
En otras formas de realización, el grano es grano en desarrollo, o grano cosechado y maduro. Con preferencia la cantidad de grano es al menos de 1 kg de peso, o al menos 1 tonelada de peso.
De modo conveniente, el grano se procesa de modo que ya no sea capaz de germinar tal como granos quebrados, triturados, precocido, aplastados, perlados, desmenuzados o molidos.
En otro aspecto la presente invención proporciona una planta de trigo (Triticum aestivum) que es capaz de producir el grano que se define en la presente que incluye el grano que comprende un embrión, un endospermo, almidón y un nivel o actividad reducidos de la proteína SBEII total donde el embrión comprende una mutación de pérdida de función en cada uno de los 5 a 12 alelos de los genes SBEII endógenos seleccionados del grupo que consiste en SBEIIa-A, SBEIIa-B, SBEIIa-D, SBEIIb-A, SBEIIb-B y SBEIIb-D, de forma que el nivel o la actividad de la proteína SBEII total en el grano es 2 % a 30 % del nivel o actividad de la proteína SBEII total en un grano de trigo tipo salvaje, incluyendo dichos 5 a 12 alelos 4, 5 o 6 alelos de SBEIIa que comprenden cada uno una mutación de pérdida de función, donde cuando el número de alelos de SBEIIa que comprenden una mutación de pérdida de función es sólo
4 entonces el número de alelos de SBEIIb que comprenden una mutación de pérdida de función es 6, y donde el grano comprende un contenido de amilosa de al menos 50 % (p/p), o al menos 60 % (p/p), o al menos 67 % (p/p) como una proporción del almidón total en el grano; y donde la planta de trigo es tanto masculina como femenina fértil.
La planta de trigo es trigo para pan tal como Triticum aestivum L. ssp. aestium. En otras formas de realización, la planta de trigo se caracteriza por uno o más rasgos del grano como se describe en la presente, con preferencia que incluye los números y tipos mutaciones de SBEIIa y SBEIIb descriptas en la presente. Se proporcionan todas las combinaciones de tales características.
En otra forma de realización, la invención proporciona harina integral o harina producida del grano que se define en la presente incluyen el grano que comprende un endospermo y un nivel o actividad bajo de la proteína SBEII total que es 2 % a 30 % del nivel o actividad de la proteína SBEII total en un grano de trigo tipo salvaje, y donde el grano comprende un contenido de amilosa de al menos 50 % (p/p), o al menos 60 % (p/p), o al menos 67 % (p/p) com una proporción del almidón total en el grano. La harina integral o harina se puede refinar por fraccionamiento, blanqueado, tratamiento térmico para estabilizar el ingrediente, tratar con enzimas o combinar con otros ingredientes alimenticios tales como harina o harina de un trigo tipo salvaje. La harina con preferencia es harina blanca, que tiene especificaciones conocidas en la técnica del horneado. En una forma de realización preferida, la harina integral o harina se envasa para la venta como un ingrediente alimenticio, tal envase puede incluir instrucciones de recetas para su uso.
La presente invención además contempla gránulos de almidón de trigo o almidón de trigo producido del presente grano. En algunas formas de realización, el almidón de trigo de la harina integral o harina comprenden al menos
50 % (p/p) de amilosa como una proporción del almidón y también se caracteriza por uno o más de los rasgos:
(i) que comprende al menos 60% (p/p), o al menos 67% (p/p) de amilosa;
(ii) que comprende al menos 2 % de almidón resistente;
(iii) que comprende un índice glucémico relativo bajo (GI);
(iv) que comprende niveles de amilopectina relativamente bajos;
(v) gránulos de almidón distorsionados;
(vi) birrefringencia del gránulo reducida;
(vii) volumen de hinchamiento reducido;
(viii) distribución de longitud de cadena y/o frecuencia de ramificación modificadas;
(ix) retraso del fin de la gelatinización y temperatura del pico superior;
(x) viscosidad reducida (viscosidad del pico, temperatura de la pasta, etc.);
(xi) aumento del peso molecular de amilopectina; y/o
(xii) porcentaje de cristalinidad modificado %,
(xiii) porcentaje de cristalinidad modificado de almidón de tipo A o tipo B,
con respecto a gránulos de almidón o almidón de trigo salvaje.
La invención también proporciona productos alimenticios que comprenden un ingrediente de alimento a un nivel de al menos 10 % sobre una base de peso seco, donde el ingrediente alimenticio es el grano de trigo, integral o harina que se define en la presente. Con preferencia el producto alimenticio se envasa listo para la venta.
Aunque no está cubierto por las reivindicaciones, también se proporcionan métodos para obtener o identificar o seleccionar o producir una planta de trigo que produce grano que comprende un contenido de amilosa de al menos
50 % (p/p), o al menos 60 % (p/p), o al menos 67 % (p/p) como una proporción del almidón total en el grano. La planta de trigo se puede identificar o seleccionar de una población de múltiples plantas candidatas, tales como una población mutagenizada o una población de plantas resultantes de un proceso de cruzamiento o un proceso de retrocruzamiento/reproducción.
En algunas formas de realización no cubiertas por las reivindicaciones, el método comprende: (i) cruzar dos plantas progenitoras de trigo, cada una que comprende una mutación de pérdida de función en cada uno, dos o tres genes de SBEIIa o SBEIIb seleccionados del grupo que consiste en SBEIIa-A, SBEIIa-B, SBEIIa-D, SBEIIb-A, SBEIIb-B y SBEIIb-D, o de mutagenizar una planta progenitora que comprende dichas mutaciones de pérdida de función; y (ii) identificar plantas o granos obtenidos de la cruza o mutagénesis, o plantas de progenie o granos obtenidos de estas, por el análisis de ARN, ARN, proteína, gránulos de almidón o almidón de las plantas o grano, y (iii) seleccionar una planta fértil que exhibe un nivel o actividad de SBEII o SBEIIa en su grano que es 2 % a 30 % el nivel o actividad de la proteína respectiva en un grano tipo salvaje. En forma alternativa, el método comprende etapas (ii) y (iii) anteriores, la etapa (i) es opcional, tal como cuando se selecciona o identifica una planta de una población de múltiples plantas candidatas.
En algunas formas de realización de la etapa del método (ii) incluye seleccionar la primera, segunda y/o posterior generación de plantas o grano de la progenie para una mutación de pérdida de función en 5 a 12 alelos de 6 genes endógenos que codifican la proteína SBEII que incluye 4, 5 o 6 alelos de SBEIIa, y donde cuando el número de alelos mutantes de SBEIIa es 4 entonces el número de alelos mutantes de SBEIIb es 6, y cuando el número de alelos mutantes de SBEIIa es 6 entonces al menos dos de dichos mutantes son mutaciones parciales.
En algunas formas de realización, el grano de la planta de trigo fértil seleccionada se caracteriza por los rasgos definidos anteriormente.
La descripción además proporciona métodos, no cubiertos por las reivindicaciones, de obtención de una planta de trigo hexaploide que produce grano que comprende un contenido de amilosa de al menos 50 % (p/p), o al menos 60 % (p/p) o al menos 67 % (p/p) como una proporción del almidón total en el grano. En algunas formas de realización, el método comprende (i) introducir en una célula de trigo un ácido nucleico exógeno que codifica un ARN que reduce la expresión de la proteína SBEII total o proteína SBEII, (ii) regeneración de una planta de trigo transgénica que comprende el ácido nucleico exógeno de la célula de la etapa (i), y (iii) detección y selección de primera, segunda o posterior generación de la progenie de la planta de trigo transgénica que produce grano que tiene 2 % a 30 % del nivel o actividad de proteína SBEII total o SBEII en una planta de tipo salvaje. Con preferencia, la molécula de ARN es una molécula de ARN de cadena doble o una molécula precursora de micro-ARN, que con preferencia se expresa a partir de un ADN quimérico que comprende una región de ADN que cuando se transcribe produce la molécula de ARN, unida operativamente a un promotor heterólogo tal como un promotor específico del endospermo. El ADN quimérico se puede introducir en una célula de trigo que comprende una o más mutaciones de SBEIIa o SBEIIb, de modo que la actividad total de SBEII se reduce en la planta transgénica por una combinación de mutaciones y moléculas de ARN inhibidoras.
En algunas formas de realización, el grano que tiene 2 % a 30 % del nivel o actividad de la proteína SBEII total o SBEII en una planta tipo salvaje es indicativa de que al menos 3 genes de SBEIIa o 2 genes de SBEIIa y 3 genes de SBEIIb de la planta comprende una mutación de pérdida de función y en consecuencia este grano de la planta comprende más que 50 % (p/p), o al menos 60 % (p/p), o al menos 67 % (p/p) de amilosa como una proporción del almidón total en el grano.
En algunas formas de realización, la presencia de al menos un bajo nivel de proteína SBEII es indicativo de que la planta es fértil.
En otra forma de realización, no cubierta por las reivindicaciones, la descripción proporciona un método de selección de una planta o grano de trigo, el método que comprende seleccionar una planta o grano para determinar las mutaciones en un gen SBEIIa o genes de SBEIIa y SBEIIb en cada uno de los genomas A, B y D del trigo hexaploide usando uno o más de los cebadores seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36 a 149. En otra forma de realización, la invención proporciona un método de selección de una planta o grano de trigo, el método que comprende (i) determinar el nivel o actividad de SBEIIa y/o SBEIIb con respecto al nivel o actividad en una planta o grano tipo salvaje y (ii) seleccionar la planta o grano fértil que tiene 2 % a 30 % del nivel o actividad de la proteína SBEII total en una planta o grano tipo salvaje, donde la planta o el grano seleccionado comprende una mutación de pérdida de función en cada uno de 5 a 12 alelos de genes SBEII endógenos seleccionados del grupo que consiste en SBEIIa-A, SBEIIa-B, SBEIIa-D, SBEIIb-A, SBEIIb-B y SBEIIb-D, de forma que el nivel o la actividad de la proteína SBEII total en el grano es de entre 2% y 30% del nivel o la actividad de la proteína SBEII total en el grano de trigo tipo salvaje, incluyendo dichos 5 a 12 alelos 4, 5 o 6 alelos de SBEIIa que comprenden cada uno mutación de pérdida de función, donde cuando el número de alelos de SBEIIa que comprenden una mutación de pérdida de función es sólo 4, entonces el número de alelos de SBEIIb que comprenden una mutación de pérdida de función es 6, y donde el grano comprende un contenido de amilosa de al menos 50% (p/p) como una proporción del almidón total del grano.
En otra forma de realización, la invención proporciona un método de producir un alimento o bebida que comprende (i) obtener el grano de la invención, (ii) procesar el grano para producir un ingrediente de alimento o bebida, y (iii) añadir el ingrediente de alimento o bebida de (ii) a otro ingrediente de alimento o bebida, de este modo se produce el alimento o bebida.
En otro aspecto no reivindicado, la invención proporciona un método para mejorar uno o más parámetros de la salud metabólica, salud intestinal o salud cardiovascular en un sujeto, o de prevenir o reducir la gravedad o incidencia de una enfermedad metabólica tal como diabetes, enfermedad intestinal o enfermedad cardiovascular, que comprende proveer al sujeto el grano, alimento o bebida que se define en la presente. La invención también proporciona el uso del grano, o productos derivados de este, para usar en la terapia o profilaxis de la enfermedad metabólica, enfermedad intestinal o enfermedad cardiovascular.
Por consiguiente, aspectos similares no reivindicados proporcionan al sujeto grano, alimento o bebida para usar en la mejora de uno o más parámetros de la salud metabólica, salud intestinal o salud cardiovascular en un sujeto, o de prevenir o reducir la gravedad o incidencia de una enfermedad metabólica tal como diabetes, enfermedad intestinal o enfermedad cardiovascular.
Por consiguiente, aspectos similares no reivindicados proporcionan el uso del presente grano, alimento o bebida para mejorar uno o más parámetros de la salud metabólica, salud intestinal o salud cardiovascular en un sujeto, o de prevenir o reducir la gravedad o incidencia de una enfermedad metabólica tal como diabetes, enfermedad intestinal o enfermedad cardiovascular.
Por consiguiente, en algunas formas de realización no reivindicadas la descripción proporciona el producto de alimento o bebida que se define en la presente para usar en la mejora de uno o más parámetros de la salud metabólica, salud intestinal o salud cardiovascular, o de prevenir o reducir la gravedad o incidencia de una enfermedad metabólica, intestinal o cardiovascular en un sujeto.
En otra forma de realización, la invención proporciona un método de producir grano, que comprende las etapas de i) obtener una planta de trigo que comprende el grano de trigo que se define en la presente que comprende un embrión, un endospermo y un nivel o actividad reducidos de proteína SBEII total, donde el embrión comprende una mutación de pérdida de función en cada uno de los 5 a 12 alelos de los genes SBEII endógenos seleccionados del grupo que consiste en SBEIIa-A, SBEIIa-B, SBEIIa-D, SBEIIb-A, SBEIIb-B y SBEIIb-D, de forma que el nivel o la actividad de la proteína SBEII total en el grano es 2 % a 30 % del nivel o actividad de proteína SBEII total en un grano de trigo tipo salvaje, incluyendo dichos 5 a 12 alelos 4, 5 o 6 alelos de SBEIIa que comprenden cada uno una mutación de pérdida de función, donde cuando el número de alelos de SBEIIa que comprenden una mutación de pérdida de función es sólo 4 entonces el número de alelos de SBEIIb que comprenden una mutación de pérdida de función es 6, y donde el grano comprende un contenido de amilosa de al menos 50 % (p/p), o al menos 60 % (p/p), o al menos 67 % (p/p) como una proporción del almidón total en el grano y, ii) recolectar el grano de trigo de la planta, y iii) opcionalmente, procesar el grano.
En algunas formas de realización, obtener el grano de trigo comprende cultivar o cosechar el grano de trigo.
En algunas formas de realización, la obtención del grano de trigo comprende cosechar el grano de trigo.
En algunas formas de realización, obtener el grano de trigo también comprende almacenar el grano de trigo.
En algunas formas de realización, obtener el grano de trigo además comprende transportar el grano de trigo a un lugar diferente.
El anterior sumario no es ni se debe observar de ninguna manera como una mención exhaustiva de todas las formas de realización de la presente invención.
Descripción de las figuras
La Figura 1 es una representación que muestra un alineamiento de la proteína SBE IIa (AAK26821,1 es del genoma D, CAR95900,1 del genoma B y CAA72154 del genoma A). Los puntos en el alineamiento indican el aminoácido idéntico en la secuencia más superior
La Figura 2 es una representación que muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de SBEIIb codificadas por los exones 1 a 3 de los genomas A, B y D de trigo. Las rayas indican los aminoácidos que están presentes en la proteína, pero la secuencia no es conocida, los puntos en el alineamiento indican que el aminoácido idéntico está presente como en la secuencia más superior.
La Figura 3 es una representación de un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de SBE11b.
La Figura 4 es una representación gráfica que muestra un diagrama de dispersión del contenido de amilosa de las líneas mutantes transgénicas (ver Ejemplo 5).
La Figura 5 es una representación gráfica de los datos que muestran un modelo de amilosa derivado del comportamiento de las líneas transgénicas de SBEII.
La Figura 6 es una representación gráfica de los datos que muestran un modelo de amilosa derivado del comportamiento de las líneas transgénicas de SBEII.
La Figura 7 es una representación que muestra un alineamiento de las secuencias de ADN de la región de los exones 12 a 14 de los genes homeólogos de SBEIIa obtenidos de la variedad de trigo Chara. La secuencia de nucleótidos para el fragmento del genoma B de Chara se muestra en su totalidad, mientras que los nucleótidos correspondientes para los fragmentos homeólogos del genoma A y D se muestran solo cuando hay polimorfismos. Los puntos indican los correspondientes nucleótidos idénticos al fragmento del genoma B de Chara. Las rayas indican que el correspondiente nucleótido está ausente de la secuencia.
La Figura 8 es una representación que muestra un alineamiento de secuencias de ADN de la región del intrón 3 de los genes de SBEIIa obtenidos de las variedades de trigo Sunco y Tasman. La secuencia de nucleótidos para el fragmento G del genoma Tasman se muestra en su totalidad, mientras que los correspondientes nucleótidos para los fragmentos homeólogos se muestran solo cuando hay polimorfismos. Los puntos indican los correspondientes nucleótidos son idénticos con el fragmento del genoma D de Tasman. Las rayas indican que el correspondiente nucleótido está ausente de la secuencia.
La Figura 9 es una representación que muestra un alineamiento de secuencias de ADN de la región del exón 3 de genes homeólogos de SBEIIa obtenidos de la variedad de trigo Chinese Spring. La secuencia de nucleótidos para el fragmento del genoma D de Chinese Spring se muestra en su totalidad, mientras que los correspondientes nucleótidos para los fragmentos homeólogos del genoma A y B se muestran solo cuando hay polimorfismos. Los puntos indican que los correspondientes nucleótidos son idénticos al fragmento del genoma D de Chinese Spring.
La Figura 10 es una representación que muestra una secuencia de ADN de la región del exón 1 del gen SBEIIa del trigo hexaploide variedad Chinese Spring.
La Figura 11 es una representación que muestra una amplificación PCR de la región que abarca los exones 12­ 14 de los genes de SBEIIa de las líneas tetrasómica-nulisómicas CS. La línea denominada BDD es nula para el genoma A, ADD es un nulo para el genoma B y AAB es un nulos para el genoma D.
La Figura 12 es la representación fotográfica de una transferencia Western que muestra en la expresión de proteína SBEII en endospermos en desarrollo de la línea S28. Los extractos de proteína de los endospermos se analizaron por análisis de transferencia Western como se describe en el Ejemplo 1, usando anticuerpos específicos de SBEIIa. La última calle de la parte derecha muestra las bandas que aparecen del endospermo tipo salvaje (variedad NB1). Se indican las posiciones de las proteínas SBEII codificadas por los genomas A, B y D. La Figura 13 es un gráfico de la relación de movilidad de la interacción de SBEIIa en ausencia(m0) y presencia (m) de dextrina p-límite en PAGE 1-D Nativa contra la concentración de dextrina p-límite (S). La constante de disociación (Kd) deriva de la ecuación n m0/m=1 [S]/Kd.
La Figura 14 muestra la relación del contenido de amilosa y almidón resistente a la enzima en muestras de almidón de trigo mezclado derivado de las líneas de trigo transgénicas descriptas en el Ejemplo 2.
La Figura 15 proporciona representaciones del diagrama de dispersión de los valores de referencia predichos por NIRS y bioquímicos ahora el contenido aparente de amilosa en las semillas individuales de trigo.
La Figura 16 es una representación gráfica que muestra la distribución del contenido de amilosa aparente sobre las poblaciones de WM y WMC determinada por NIRS.
Las Figura. 17 (a) y (b) son representaciones gráficas de los datos que muestran el efecto de añadir las cantidades crecientes de las líneas de trigo sobre la absorción de agua (a) y el tiempo de mezclado Mixograph (b).
Las Figura. 18 (a) y (b) son representaciones gráficas de los datos que ilustran el efecto de añadir cantidades crecientes de trigo con harina de alto contenido de amilosa sobre la resistencia del almidón (a) y GI predicha (b) (HI %) de los panes en pequeña escala.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS TABLAS
La Tabla 1 proporciona los genes de la enzima ramificadora del almidón caracterizado de los cereales.
La Tabla 2 proporciona una subclasificación de aminoácidos.
La Tabla 3 proporciona ejemplos de sustituciones de aminoácido.
La Tabla 4 proporciona cebadores específicos del genoma para el gen de SBEIIa de trigo.
La Tabla 5 proporciona secuencias de nucleótidos de los cebadores específicos del genoma para SBEIIa.
La Tabla 6 proporciona cebadores diseñados para amplificar las partes del gel de SBEIIa específicamente del genoma A de trigo.
La Tabla 7 proporciona cebadores diseñados para amplificar las partes del gen SBEIIa específicamente del genoma B del trigo.
La Tabla 8 proporciona cebadores diseñados para amplificar las partes del gen SBEIIa específicamente del genoma D del trigo.
La Tabla 9 proporciona cebadores específicos del genoma para el gen SBEIIb del trigo.
La Tabla 10 proporciona secuencias de nucleótidos de los cebadores específicos del genoma para SBEIIb.
La Tabla 11 proporciona la expresión total de SBEII y SBEIIa y SBEIIb y el contenido de amilosa de las líneas ARNi del trigo como se describe en el Ejemplo 4.
La Tabla 12 proporciona una lista de marcadores microsatélite analizados en las mutantes descriptas en el Ejemplo 5.
La Tabla 13 proporciona mutantes identificadas de la población de HIB y los datos de mapeo de microsatélite como se describe en el Ejemplo 5.
La Tabla 14 proporciona una descripción de las mutantes doble nulas de SBEII identificadas como se describe en el Ejemplo 5.
La Tabla 15 proporciona una descripción de las cruzas realizadas entre las mutantes nulas dobles y simples como se describe en el Ejemplo 5.
La Tabla 16 proporciona la tabulación del contenido de amilosa en almidón en grano de mutantes nulas triples como se describe en el Ejemplo 5.
La Tabla 17 proporciona observaciones de fertilidad en las plantas de plantas de progenie F2.
La Tabla 18 proporciona datos de las composiciones alélicas SBEII y proporción de amilosa para nulos dobles identificadas.
La Tabla 19 proporciona detalles de adicionales cruzas entre mutantes nulas simples y dobles.
la tabla 20 proporciona la frecuencia observada de los genotipos del grano que normalmente germina de una cruza a2b2d2. los números entre paréntesis indican la frecuencia esperada basada en la segregación mendeliana.
La Tabla 21 proporciona adicionales cruzas entre mutaciones simples y dobles nulas.
La Tabla 22 proporciona mutantes putativas nulas dobles y triples en los genes de SBEIIa identificadas en una prueba inicial usando marcadores dominantes.
La Tabla 23 proporciona las características de almidón del almidón de grano de las líneas de trigo transgénicas. La Tabla 24 proporciona distribución del peso molecular de las fracciones de almidón de las líneas transgénicas de trigo.
La Tabla 25 proporciona los parámetros RVA de almidón de trigo transgénico hp5'-SBEIIa.
La Tabla 26 proporciona los parámetros de DSC del pico de gelatinización de almidón de trigo transgénico hp5'-SBEIIa en comparación con el control NB1.
La Tabla 27 proporciona el contenido de RS en los productos de grano aplastados y quebrados.
La Tabla 28 proporciona el contenido de almidón resistente en los productos alimenticios a niveles variables de incorporación del trigo con alto contenido de amilosa (HAW).
La Tabla 29 proporciona cebadores específicos del genoma denominados en el Ejemplo 18.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en parte en las observaciones hechas en los experimentos descriptos en la presente de que las plantas de trigo que carecen completamente de actividad de SBEIIa en la planta no se pueden recuperar de las cruzas diseñadas para producirlas, en efecto se concluyó que la carencia completa de SBEIIa es letal para el desarrollo y/o fertilidad de la semilla. Esto fue sorprendente ya que estudios previos han mostrado que las mutantes nulas únicas de SBEIIa se pueden obtener fácilmente en el trigo y fueron fértiles. Además, se observó que el nivel mínimo de actividad de SBEIIa que se necesita retener en la planta de trigo para producir semillas viables, normales fue aproximadamente 2 % del nivel de tipo salvaje.
También se observó que las plantas y granos mutantes que comprende al menos una mutación puntual en un gen de SBEIIa estaban favorecidas respecto de las plantas y granos que tenían supresiones en cada uno de los genes de SBEIIa para combinar genes de SBEIIa mutantes, en particular para obtener plantas fértiles masculinas y femeninas fenotípicamente normales que germinaron a tasas similares con el grano tipo salvaje. Una explicación posible de esta observación fue que las supresiones tienden a eliminar importantes elementos genéticos adyacentes a los genes de SBEIIa.
También se observó que para obtener un contenido de amilosa de al menos 50 % (p/p) en el almidón en grano, nivel en el que la cantidad de almidón resistente y los beneficios de salud asociados aumentaron sustancialmente, la actividad de SBEII total y en particular la actividad de SBEIIa en el grano se debe reducir a menos de 30 % del nivel tipo salvaje.
Además, se determinó que, en el trigo hexaploide, reducir el nivel y/o actividad de la proteína SBEII de cada uno de los tres genes homeólogos de SBEIIa o de al menos dos genes homeólogos de SBEIIa y dos o tres genes homeólogos de SBEIIb lleva a un aumento no lineal sustancial de la proporción de amilosa en el almidón del endospermo del trigo en comparación con las plantas que tienen mutación nula en dos genes homeólogos de SBEIIa. Esta relación no lineal entre el contenido de amilosa y los niveles de SBEII en el grano de trigo hexaploide se ilustra gráficamente en las Figuras 5 y 6.
Por el estudio de la mutación de pérdida de función parcial y completa en las combinaciones de los alelos de SBEIIa y/o SBEIIb de los genomas A, B y D, se ha establecido el papel de múltiples genes de SBEII en los genes en la modulación de las características del almidón. En forma específica, se han investigado y determinado el número de alelos mutantes y las combinaciones de los alelos mutantes requeridos para obtener plantas de trigo fértiles que tienen niveles muy altos de amilosa.
La síntesis del almidón en el endospermo de las plantas superiores que incluyen trigo se realiza por un conjunto de enzimas que catalizan cuatro etapas clave. En primer lugar, la ADP-glucosa pirofosforilasa (EC 2,7,7,27) activa el precursor monómero del almidón a través de la síntesis de ADP-glucosa de G-1-P y ATP. En segundo lugar, el donante de glucosilo activado, ADP-glucosa, se transfiere al extremo no reductor de una unión pre-existente aD1-4) por las sintasas de almidón (EC 2,4,1,24). En tercer lugar, las enzimas ramificadoras de almidón introducen puntos de ramificación a través de la escisión de una región de glucano ligado a(1-4) seguido por la transferencia de la cadena escindida a una cadena aceptora, que forma una nueva unión de a(1-6). Las enzimas ramificadoras de almidón son las únicas enzimas que pueden introducir las uniones a(1-6) en los a-polilucanos y en consecuencia cumplen un papel esencial en la formación de amilopectina. En cuarto lugar, las enzimas ramificadoras de almidón (EC 2,4,4,18) eliminan alguna de las uniones de las ramas.
El almidón es el principal carbohidrato de almacenamiento en plantas tales como cereales, que incluyen el trigo. El almidón se sintetiza en los amiloplastos y se forma y almacena en los gránulos en el órgano de almacenamiento en desarrollo tal como el grano; se denomina en la presente como "almidón de almacenamiento" o "almidón en grano". En los granos de cereal, la vasta mayoría del almidón almacenado se deposita en el endospermo. "Almidón" se define en la presente como un polisacárido compuesto de unidades de glucopiranosa polimerizadas a través de una combinación de uniones a(1-4) y a(1-6). Las moléculas polidispersas de almidón se clasifican como pertenecientes a dos fracciones de componentes, conocidas como amilosa y amilopectina, sobre la base de su grado de polimerización (DP) y la relación de las uniones de a(1-6) a a(1-4). El almidón en grano de las plantas de cereal tipo salvaje, que incluyen trigo, que comprende aproximadamente 20 %-30 % de amilosa y aproximadamente 70 %-80 % de amilopectina.
"Amilosa" se define en la presente como que incluye moléculas esencialmente lineales de unidades a-1,4 glucosídicas unidas (glucopiranosa), algunas veces denominadas como "amilosa verdadera", y almidón de cadena larga tipo amilosa que es algunas veces denominado como "material intermedio" o "amilopectina tipo amilosa" que parece como material que se une al yodo en un ensayo yodométrico junto con la amilosa verdadera (Takeda et al., 1993b); Fergason, 1994). Normalmente, las moléculas lineales en la amilosa verdadera tienen un DP de entre 500 y 5000 y contiene menos de 1 % de uniones a(1-6). Estudios recientes han demostrado que aproximadamente 0,1 % de sitios de ramificación a(1-6)-glucosídicos pueden producir en amilosa, en consecuencia, se describe como "esencialmente lineal". En contraste, la amilopectina es una molécula mucho más grande con un DP que varía de 5000 a 50,000 y contiene 4-5 % de uniones a(1-6). Las moléculas de amilopectina son en consecuencia más altamente ramificadas. La amilosa tiene una conformación helicoidal con un peso molecular de aproximadamente 104 a aproximadamente 106 dalton mientras que la amilopectina tiene un peso molecular de aproximadamente 107 a aproximadamente 108 dalton. Estos dos tipos de almidón se pueden distinguir o separar por métodos bien conocidos en la técnica.
La proporción de amilosa en el almidón que se define en la presente se basa en peso/peso (p/p), es decir, el peso de la amilosa como un porcentaje del peso del almidón total extraíble del grano, con respecto al almidón antes de cualquiera fraccionamiento en fracciones de amilosa y amilopectina. Los términos "proporción de amilosa en el almidón" y "contenido de amilosa" cuando se usan en la presente en el contexto del grano, harina u otro producto de la invención son términos esencialmente indistintos. El contenido de amilosa se puede determinar por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica que incluyen métodos de cromatografía de alto rendimiento de exclusión por tamaño (HPLC), por ejemplo, en 90 % (p/v) DMSO, concanavalina A (Megazyme Int, Irlanda), o con preferencia por un método yodométrico, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1. El método de HPLC puede incluir desramificación del almidón (Batey y Curtin, 1996) o no involucra la desramificación. Se apreciará que métodos tales como el método de HPLC de Batey y Curtin, 1996 (supra) tal ensayo solo de "amilosa verdadera" puede subestimar el contenido de amilosa que se define en la presente. Métodos tales como HPLC o cromatografía de permeación de geles dependen del fraccionamiento del almidón en las fracciones de amilosa y amilopectina, tales métodos yodométricos dependen de la unión de yodo diferencial y en consecuencia no requieren fraccionamiento.
A partir del peso del grano y el contenido de amilosa, se puede calcular la cantidad de amilosa depositada por grano y comparar con líneas de ensayo y control.
El almidón se sintetiza y acumula inicialmente en las hojas y otros tejidos verdes de una planta como producto de fotosíntesis. Este almidón se denomina en la presente como "almidón transitorio" o similares porque, en contraste al almidón de semilla o tubérculo, se acumula en los plástidos de los tejidos fotosintéticos durante el día y se degrada al menos durante la noche. En la noche, el almidón transitorio se hidroliza a azúcares que se transportan, principalmente como sacarosa, a partir de los tejidos fuente a los tejidos sumidero para usar en el crecimiento de la planta, como una fuente de energía para el metabolismo o para almacenamiento en los tejidos como almidón de almacenamiento.
Como se usa en la presente, "sintasa de almidón" significa una enzima que transfiere ADP-glucosa al extremo no reductor de uniones a1-4 preexistentes. Se hallan cuatro clases de almidón sintasa en el endospermo del cereal, una isoforma exclusivamente localizada dentro del gránulo de almidón, sintasa de almidón unida al gránulo (GBSS), dos formas que se dividen entre el gránulo y la fracción soluble (SSI, Li et al., 1999a; SSII, Li et al., 1999b) y una cuarta forma que está completamente ubicada en la fracción soluble, SSIII (Cao et al., 2000; Li et al., 1999b); Li et al., 2000). Se ha mostrado que GBSS es esencial para la síntesis de amilosa (Shure et al., 1983), y se han mostrado que las mutaciones en SSII y SSIII alteran la estructura de la amilopectina (Gao et al., 1998; Craig et al., 1998). Los mutantes en cereales que carecen de GBSS también carecen de amilosa verdadera y de este modo se acumula solo amilopectina; estos comúnmente se denominan como mutantes "cerosas". No se han descritos mutaciones que definen un papel para la actividad de SSI. La síntesis de amilopectina es más compleja que la síntesis de amilosa, lo que requiere una combinación de sintasas de almidón diferentes de GBSS, múltiples enzimas ramificadoras y enzima desramificadora de almidón.
Como se usa en la presente, "enzima desramificadora" significa una enzima que elimina alguna de las ramas de amilopectina formadas por las enzimas ramificadoras de almidón. Dos tipos de enzimas desramificadoras están presentes en plantas superiores y se definen sobre la base de sus especificidades de sustrato, enzimas desramificadoras tipo isoamilasa, y enzimas desramificadoras tipo pululanasa (Myers et al., 2000). Las mutaciones Sugary-1 en maíz y arroz se asocian con deficiencia de ambas enzimas desramificadoras (James et al., 1995; Kubo et al., 1999) sin embargo los mapas de mutación causal al mismo lugar que el gen de la enzima desramificadora tipo isoamilasa.
Los ejemplos de genes que codifican enzimas ramificadoras de almidón de cereales que incluyen trigo se dan en la Tabla 1. Como se usa en la presente, la "enzima ramificadora del almidón" significa una enzima que introduce enlaces glucosídicos 1,6 alfa entre cadenas de residuos de glucosa (EC 2,4,1,18). Tres formas de enzima ramificadora del almidón se expresan en cereales tales como arroz, maíz, cebada y trigo, que incluyen en el endospermo del cereal, a saber, enzima ramificadora del almidón I (SBEI), enzima ramificadora del almidón IIa (SBEIIa) y enzima ramificadora del almidón IIb (SBEIIb) (Hedman y Boyer, 1982; Boyer y Preiss, 1978; Mizuno et al., 1992, Sun et al., 1997). Se han caracterizado las secuencias genómicas y de ADNc para los genes que codifican estas enzimas para arroz, cebada y trigo (Tabla 1). El alineamiento de secuencia revela un alto grado de semejanza de secuencia en los niveles de nucleótido y aminoácido, pero también las diferencias de secuencias y permite el agrupamiento en las clases SBEI, SBEIIa y SBEIIb. SBEIIa y SBEIIb de cualquier especie generalmente exhibe alrededor de 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos entre sí, en particular en las regiones centrales de los genes. SBEIIa y SBEIIb también se pueden distinguir por sus patrones de expresión, pero esto difiere en diferentes especies. En maíz, SBEIIb está más altamente expresada en el endospermo mientras que SBEIIa está presente en cada tejido de la planta. En la cebada, SBEIIa y SBEIIb están presentes en aproximadamente cantidades iguales en el endospermo, mientras que el endospermo del trigo, SBEIIa se expresa aproximadamente 4 veces más alta que SBEIIb. En consecuencia, las especies de cereal muestran diferencias significativas en la expresión de SBEIIa y SBEIIb, y las conclusiones extraídas en una especie no se pueden aplicar fácilmente a otras especies. En el trigo, las proteínas de SBEIIa y SBEIIb son de diferente tamaño (ver más adelante) y esta es una manera conveniente de distinguirlas. También se pueden usar anticuerpos específicos para distinguirlos.
En el maíz, se ha mostrado que los fenotipos de amilosa alta ser el resultado de lesiones en el gen SBEIIb, también conocido como el gen extensor de amilosa (ae) (Boyer y Preiss, 1981, Mizuno et al., 1993; Nishi et al., 2001). En estas mutantes SBEIIb, los granos de almidón del endospermo mostraron una morfología anormal, el contenido de amilosa se elevó significativamente, se redujo la frecuencia de ramificación de amilopectina residual y la proporción de cadenas cortas (<DP17, especialmente DP8-12) fue mejor. Además, aumentó la temperatura de gelatinización del almidón. Además, hubo una mezcla de material significativa que se definió como "intermedia" entre amilosa y amilopectina (Boyer et al., 1980; Takeda, et al., 1993b). En contraste, las mutantes de las plantas de maíz del gen SBEIIa debido a un elemento de inserción mutador (Mu) y en consecuencia que carecen de la expresión de la proteína SBEII fueron indistinguible de las plantas de tipo salvaje en la ramificación del almidón del endospermo (Blauth et al., 2001), aunque se alteraron en el almidón de la hoja. De modo similar, las plantas de arroz deficientes en la actividad de SBEIIa no exhibió ningún cambio significativo en el perfil de la cadena de la amilopectina en el endospermo (Nakamura, 2002), mientras que los mutantes en SBEIIb mostraron un aumento modesto en los niveles de amilosa, hasta aproximadamente 35 % en antecedentes indica y hasta 25-30 % en un antecedente de japónica (Mizuno et al., 1993; Nishi et al., 2001). En maíz y arroz, los genes de SBEIIa y SBEIIb no están ligados en el genoma. En la cebada, se usó un constructo de silenciamiento génico que redujo la expresión de SBEIIa y SBEIIb en el endospermo para generar el grano de cebada con alto contenido de amilosa (Regina et al., 2010).
En el endospermo del trigo en desarrollo, SBEI (Morell et al., 1997) se halla exclusivamente en la fracción soluble (estroma de amiloplasto), mientras que SBEIIa y SBEIIb se hallan en fracciones solubles y asociados en almidón en gránulo en el endospermo (Rahman et al., 1995). En el trigo, los eventos de duplicación del gen aparente han aumentado el número de genes SBEI en cada genoma (Rahman et al., 999). La eliminación de más de 97 % de la actividad de SBEI por combinación de las mutaciones en las formas de mayor expresión de los genes SBEI de los genomas A, B y D no tuvo impacto medible en la estructura o función del almidón (Regina et al., 2004). En contraste, la reducción de la expresión de SBEIIa por un constructo de silenciamiento génico en el trigo produjo niveles de amilosa altos (>70 %), mientras que un correspondiente constructo que redujo la expresión de SBEIIb, pero no de SBEIIa tuvo efecto mínimo (Regina et al, 2006).
La actividad de la enzima ramificadora del almidón (SBE) se puede medir por el ensayo enzimático, por ejemplo, por el ensayo de estimulación de fosforilasa (Boyer y Preiss, 1978). Este ensayo mide la estimulación por SBE de la incorporación de glucosa 1-fosfato en polímero insoluble en metanol (a-D-glucano) por la fosforilasa A. La actividad de SBE se puede medir por el ensayo de coloración de yodo, que mide la disminución de la absorbancia de un complejo de glucan-poliyodo resultante de la ramificación de los polímeros de glucano. La actividad de SBE también se puede analizar por el ensayo de unión de la rama que mide la generación de extremos reductores a partir de la amilosa reducida como sustrato, después de la digestión con isoamilosa (Takeda et al., 1993a). Con preferencia, la actividad se mide en ausencia de actividad de SBEI. Las isoformas de SBE muestran diferentes especificidades de sustrato, por ejemplo, SBEI exhibe mayor actividad en la ramificación de la amilosa, mientras que SBEIIa y SBEIIb muestran tasas de ramificación más altas con un sustrato de amilopectina. Las isoformas también se pueden distinguir sobre la base de la longitud de la cadena de glucano que se transfiere. La proteína SBE también se puede medir por medio de anticuerpos específicos tales como los que se describen en la presente. La actividad de SBEII se puede medir durante el desarrollo del grano en el endospermo en desarrollo. En forma alternativa, los niveles de SBEII se miden en el grano maduro donde la proteína está aún presente y se puede analizar por métodos inmunológicos.
En algunas formas de realización, el nivel o actividad de SBEII o SBEIIa se puede evaluar por la medición de los niveles de transcripto tales como por análisis Northern o RT-PCR. En algunas formas de realización, el nivel o actividad de SBEII o SBEIIa puede evaluarse mediante la evaluación de los niveles de transcritos, por ejemplo, mediante análisis de Northern o RT-PCR. En un método preferido, la cantidad de proteína SBEIIa en el grano o endospermo en desarrollo se mide por la separación de proteínas en extractos del grano/endospermo sobre geles por electroforesis, luego se transfieren las proteínas a una membrana de transferencia Western, seguido por la detección cuantitativa de la proteína sobre la membrana mediante anticuerpos específicos ("análisis de transferencia Western"). Esto se ejemplifica en el Ejemplo 11.
Como se muestra en la presente, endospermo de trigo hexaploide en desarrollo expresa SBEIIa y SBEIIb de cada uno de los genomas A, B y D. Como se usa en la presente, "SBEIIa expresado a partir del genoma A" o "SBEIIa-A" significa una enzima ramificadora del almidón cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 1 o que es al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o que comprende tal secuencia. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (Acceso Genbank N.° CAA72154) corresponde a una SBEIIa expresada a partir del genoma A de trigo, que se usa en la presente como la secuencia de referencia para SBEIIa-A tipo salvaje. La proteína de la SEQ ID NO: 1 es 823 aminoácidos de largo. Las variantes activas de esta enzima existen en el trigo, por ejemplo, en el cultivar Cheyenne, ver Acceso N.° AF286319 que es 99,88 % (822/823) idéntico a la SEQ ID NO. 1. Tales variantes e incluyen en "SBEIIa-A" con la condición de que presenten esencialmente actividad de enzima ramificadora del almidón tipo salvaje para la SEQ ID NO: 1.
Como se usa en la presente, "SBEIIa expresada a partir del genoma B" o "SBEIIa-B" significa una enzima ramificadora del almidón cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 2 o que es al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 o que comprende tal secuencia. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (Acceso Genbank N.° CAR95900) corresponde a la SBEIIa expresada a partir del genoma B de la variedad de trigo Chinese Spring, que se usa en la presente como las secuencias de referencia para la SBEIIa-B tipo salvaje. La proteína de la SEQ ID NO: 2 es 823 aminoácidos de largo. Las variantes activas de esta pueden existir en el trigo y se incluyen en la SBEIIa-B con la condición de que presenten esencialmente actividad de enzima ramificadora del almidón tipo salvaje para la SEQ ID NO: 2. SEQ i D n O : 2 es 98,42 % (811/824) idéntica a la SEQ ID NO: 1. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la Figura 1 muestra las diferencias de aminoácido que se pueden usar para distinguir las proteínas o variantes como SBEIIa-A o SBEIIa-B.
Como se usa en la presente, "SBEIIa expresada a partir del genoma D" o "SBEIIa-D" significa una enzima ramificadora del almidón cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 3 o que es al menos 98 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o que comprende tal secuencia. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 (Acceso Genbank N.° AAK26821) corresponde a la SBEIIa expresada a partir del genoma D en A. tauschii, un probable progenitor del genoma D del trigo hexaploide, que se usa en la presente como la secuencia de referencia para SBEIIa-D tipo salvaje. La proteína de la SEQ ID NO: 3 es 819 aminoácidos de largo. Las variantes activas de esta enzima puede existir en el trigo y se incluyen en la SBEIIa-D con la condición de que presenten esencialmente actividad de enzima ramificadora del almidón tipo salvaje para la SEQ ID NO: 3. La SEQ ID NO: 3 es 97,57 % (803/823) idéntica a la SEQ ID NO: 1 y 97,81 % (805/823) idéntica a la SEQ ID NO: 2. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la Figura 1 muestra las diferencias de aminoácidos que se pueden usar para distinguir las proteínas o para clasificar variantes como SBEIIa-A, SBEIIa-B o SBEIIa-D.
Cuando se comparan las secuencias de aminoácidos para determinar el porcentaje de identidad en este contexto, por ejemplo, por Blastn, las secuencias de longitud completa se deben comparar, y las brechas de una secuencia se cuentan como diferencias de aminoácido.
Como se usa en la presente, una "proteína SBEIIa" incluye variantes de proteína que tienen actividad de la enzima ramificadora del almidón reducida o ninguna, así como las proteínas que tienen esencialmente actividad de la enzima tipo salvaje. También se considera que las proteínas de SBEIIa pueden estar presentes en el grano, en particular el grano latente cosechado comúnmente comercial, pero en un estado inactivo a causa de las condiciones fisiológicas del grano. Tales proteínas se incluyen en "proteínas de SBEIIa" como se usa en la presente. Las proteínas de SBEIIa pueden ser enzimáticamente activas durante solo parte del desarrollo del grano, en particular en el endospermo en desarrollo cuando normalmente se deposita el almidón almacenado, pero de otro modo en estado inactivo. Tal proteína SBEIIa se puede detectar y cuantificar fácilmente usando métodos inmunológicos tales como análisis de transferencia Western. Una "proteína SBEIIb" como se usa en la presente tiene un significado análogo.
Como se usa en la presente, "SBEIIb expresada a partir del genoma A" o "SBEIIb-A" significa una enzima ramificadora del almidón que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o que es al menos 98 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o que comprende tal secuencia. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 corresponde a la secuencia amino terminal de SBEIIb expresada a partir del genoma A del trigo, que se usa en la presente como la secuencia de referencia para SBEIIb-A tipo salvaje.
Como se usa en la presente, "SBEIIb expresada a partir del genoma B" o "SBEIIb-B" significa una enzima ramificadora del almidón que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o que es al menos 98 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 o que comprende tal secuencia. La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, que se usa en la presente como la secuencia de referencia para SBEIIb-B tipo salvaje, es una secuencia de aminoácidos parcial codificada por los exones 2-3 del gen SBEIIb-B en el trigo. Una variante de la secuencia de SBEIIb-B es la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos del Acceso NO. AK335378 aislado del cv. Chinese Spring.
Como se usa en la presente, "SBEIIb expresada a partir del genoma D" o "SBEIIb-D" significa una enzima ramificadora del almidón cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 6 o que es al menos 98 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 o que comprende tal secuencia. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 (Acceso Genbank N.° AAW80631) corresponde a la SBEIIb expresada a partir del genoma D de A. tauschii, un progenitor probable del genoma D del trigo hexaploide, y se usa en la presente como la secuencia de referencia para la SBEIIa-D tipo salvaje. Las variantes activas de esta enzima existen en el trigo y se incluyen en la SBEIIb-D con la condición de que presenten esencialmente actividad de enzima ramificadora del almidón tipo salvaje para la SEQ ID NO: 6. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 4 de la Publicación de la solicitud de patente US N.° 20050074891, comenzando en la primera metionina, muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína SBEIIb-D que es 99,5 % idéntica a la SEQ ID NO: 6 en esta solicitud. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la Figura 2 muestra las diferencias de aminoácidos que se puede usar para distinguir las proteínas de SBEIIb o clasificar variantes como SBEIIb-A, SBEIIb-B o SBEIIb-D.
En consecuencia, "tipo salvaje" como se usa en la presente cuando se refiere a SBEIIa-A significa una enzima ramificadora de almidón cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 1; "tipo salvaje" como se usa en la presente cuando se refiere a SBEIIa-B significa una enzima ramificadora de almidón cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 2; "tipo salvaje" como se usa en la presente cuando se refiere a SBEIIa-D significa una enzima ramificadora de almidón cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 3; "tipo salvaje" como se usa en la presente cuando se refiere a SBEIIb-A significa una enzima ramificadora de almidón cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 4; "tipo salvaje" como se usa en la presente cuando se refiere a SBEIIb-B significa una enzima ramificadora de almidón cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 5; y, "tipo salvaje" como se usa en la presente cuando se refiere a SBEIIb-D significa una enzima ramificadora de almidón cuya secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO: 6.
Como se usa en la presente, los términos "gen de SBEIIa del trigo" y "gen de SBEIIb del trigo" se refieren a los genes que codifican las enzimas funcionales SBEIIa o SBEIIb, respectivamente, en el trigo, que incluyen genes homólogos presentes en otras variedades de trigo y también formas mutantes de los genes que codifican las enzimas con actividad reducida o actividad no detectable. Estas incluyen, pero sin limitación, a los genes de SBEII del trigo que han sido clonados, incluyendo las secuencias genómicas y de ADNc listadas en la Tabla 1. Los genes que se usan en la presente abarcan las formas mutantes que no codifican ninguna proteína en absoluto, en tal caso las formas mutantes representan los alelos nulos de los genes.
Un "gen de SBEII endógeno" se refiere a un gen de SBEII que está en su lugar nativo en el genoma del trigo, que incluye las formas tipo salvaje y mutante. En contraste, los términos "gen de SBEII aislado" y "gen de SBEII exógeno" se refieren a un gen de SBEII que no está en su lugar nativo, por ejemplo, que se ha clonado, sintetizado, compuesto en un vector o en la forma de un transgén en una célula, con preferencia como transgén en una planta de trigo transgénica. El gen de SBEII en este contexto puede ser cualquiera de las formas específicas que se describen a continuación.
Como se usa en la presente, "el gen de SBEIIa en el genoma A del trigo" o "gen de SBEIIa-A" significa cualquier polinucleótido que codifica SBEIIa-A que se define en la presente o que se deriva de un polinucleótido que codifica SBEIIa-A, que incluye polinucleótidos naturales, variantes de secuencia o polinucleótidos sintéticos, que incluyen "gen de SBEIIa-A tipo salvaje" que codifica un SBEIIa-A con esencialmente actividad tipo salvaje, y "gen de SBEIIa-A mutante" que no codifica una SBEIIa-A con esencialmente actividad tipo salvaje pero derivan de modo reconocible de ungen de SBEIIa-A tipo salvaje. La comparación de la secuencia de nucleótidos de una forma mutante de un gen de SBEII con un conjunto de genes de SBEII tipo salvaje se usa para determinar cuál de los genes de SBEII deriva de este y de este clasificarlo. Por ejemplo, un gen de SBEII mutante se considera un gen de SBEIIa-A mutante si su secuencia de nucleótidos está más estrechamente relacionada, es decir, que tienen un grado más de alto de identidad de secuencia, con un gen de SBEIIa-A tipo salvaje que con cualquier otro gen de SBEII. Un gen de SBEIIa-A mutante codifica una SBE con actividad de la enzima ramificadora del almidón reducida (mutante parcial), o una proteína que carece de actividad de SBE o ninguna proteína en absoluto (gen mutante nula). Un ejemplo de la secuencia de nucleótidos de un ADNc correspondiente a un gen de SBEIIa-A se da en el Acceso Genbank N.° Y11282. Las secuencias de las partes de los genes de SBEIIa-A también se dan en la presente con referencia a las Figures 7, 8, 9 y 10 y SEQ ID NOs 13, 14 y 15.
Como se usa en la presente, los términos "SBEIIa expresada a partir del genoma B" o "SBEIIa-B", "SBEIIa expresada a partir del genoma D" o "SBEIIa-D", "SBEIIb expresada a partir del genoma A" o "SBEIIb-A", "SBEIIb expresada a partir del genoma B" o "SBEIIb-B" y "SBEIIb-D" tienen los significados correspondientes a los de SBEIIa-A de los párrafos previos.
Las secuencias de las proteínas SBEIIb-A, SBEIIb-B y SSBEII-D parciales ilustrativas se proporcionan en la Figura 2. Las secuencias de aminoácidos de SBEIIb-A ilustrativas se exponen en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4 (secuencia amino terminal codificada por el exón 1-3). Las secuencias de aminoácidos de SBEIIb-B secuencias de aminoácidos ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5. Las secuencias de aminoácidos de SBEIIb-D ilustrativas se exponen en SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 9.
Los genes de SBEII definidos anteriormente incluyen cualquiera de las secuencias regulatorias que son 5' o 3' de la región transcripta, que incluyen la región promotora, que regula la expresión de la región transcripta asociada y los intrones dentro de las regiones transcriptas.
Se debe entender que existe una variación natural en las secuencias de los genes de SBEIIa y SBEIIb de diferentes variedades de trigo. Los expertos en la técnica pueden reconocer fácilmente los genes homólogos sobre la base de la identidad de secuencia. Se considera que el grado de identidad de secuencia entre los genes de SBEIIa o las proteínas homólogas es de al menos 90 %, de modo similar para los genes o proteínas de SBEIIb. Los de SBEIIa de trigo son aproximadamente 80 % idénticos en la secuencia con los genes de SBEIIb del trigo. Las proteínas codificadas también son aproximadamente 80 % idénticos en la secuencia.
Un alelo es una variante de un gen en un locus genético único. Un organismo diploide tiene dos conjuntos de cromosomas. Cada cromosoma tiene una copia de cada gen (un alelo). Si ambos alelos son iguales, el organismo es homocigota con respecto al gen, si los alelos son diferentes, el organismo es heterocigota, con respecto al gen. La interacción entre los alelos en un locus se describe generalmente como dominantes o recesivos. Una mutación de pérdida de función es una mutación en un alelo que lleva a un nivel o actividad indetectable o reducido de la enzima SBEII, SBEIIa o SBEIIb en el grano. La mutación puede significar, por ejemplo, que nada de ARN o menos se transcribe del gen que comprende la mutación o que la proteína producida tiene ninguna o reducida actividad. Los alelos que no codifican o no son capaces de conducir la producción de cualquiera enzima activa son alelos nulos. Una mutación de pérdida de función que incluye la mutación de pérdida de función parcial en un alelo significa una mutación en el alelo que lleva a un nivel o actividad reducidos de la enzima de SBEII, SBEIIa o SBEIIb en el grano. La mutación en el alelo puede significar, por ejemplo, que se traduce menos proteína que tiene actividad tipo salvaje o reducida o que los niveles de transcripción tipo salvaje o reducida van seguidos de la traducción de una enzima con actividad enzimática reducida. Una "reducción" de la cantidad o nivel de proteína significa reducido respecto de la cantidad o nivel producido por el correspondiente alelo tipo salvaje. Una actividad "reducida" significa reducida respecto de la correspondiente enzima SBEII, SBEIIa o SBEIIb tipo salvaje. Diferentes alelos en el embrión pueden tener una mutación igual o diferente y diferentes alelos se pueden combinar usando métodos conocidos en la técnica. En algunas formas de realización, la cantidad de proteína SBEIIa o proteína SBEIIb está reducida porque hay menos transcripción o traducción del gen de SBEIIa o gen de SBEIIb, respectivamente. En algunas formas de realización, la cantidad en peso de proteína SBEIIa o proteína SBEIIb está reducida aun cuando existe una cantidad de moléculas de proteína SBEIIa o proteína SBEIIb tipo salvaje en el grano, porque algunas de las proteínas producidas son más cortas que la proteína SBEIIa o proteína SBEIIb tipo salvaje, por ejemplo, la proteína SBEIIa o proteína SBEIIb mutante está truncada debido a una señal de terminación de traducción prematura.
Los genes de biosíntesis del almidón representativos que se han clonado de los cereales se listan en la Tabla 1.
Como se usa en la presente, "dos alelos idénticos de un gen de SBEIIa-A" significa que los dos alelos del gen SBEIIa-A son idénticos entre sí; "dos alelos idénticos de un gen de SBEIIa-B", significa que los dos alelos del gen SBEIIa-B gene son idénticos entre sí; "dos alelos idénticos de un gen de SBEIIa-D', significa que los dos alelos del gen SBEIIa-D gene son idénticos entre sí; "dos alelos idénticos de un gen de SBEIIb-A", significa que los dos alelos del gen SBEIIb-A gene son idénticos entre sí; "dos alelos idénticos de un gen de SBEIIb-B", significa que los dos alelos del gen SBEIIb-B gene son idénticos entre sí; y, "dos alelos idénticos de un gen de SBEIIb-D', significa que los dos alelos del gen SBEIIb-D son idénticos entre sí.
Las plantas de trigo de la invención se pueden producir e identificar después de la mutagénesis. Esto puede proporcionar una planta de trigo que es no transgénica, que es conveniente en algunos mercados o que está libre de cualquier molécula de ácido nucleico exógeno que reduce la expresión de un gen de SBEIIa. Las plantas de trigo mutantes que tiene una mutación en un gen único de SBEII que se pueden combinar por la cruza y selección con otras mutaciones de SBEII para generar las plantas de trigo de la invención pueden ser sintéticos, por ejemplo, por la realización de la mutagénesis dirigida al sitio en el ácido nucleico, o inducida por el tratamiento mutagénico o puede ser natural, es decir, aislado de una fuente natural. En general, una célula, tejido, semilla o planta progenitora se puede someter a la mutagénesis para producir mutaciones únicas o múltiples, tales como sustituciones, supresiones, adicionales de nucleótido y/o modificación del codón. Las plantas de trigo y granos preferidos de la invención comprenden al menos una mutación de SBEII introducida, con más preferencia dos o más mutaciones de SBEII introducidas y no pueden comprender mutaciones de una fuente natural, es decir, el total de los alelos SBEIIa y SBEIIb mutantes en la planta se obtuvieron por medios sintéticos o por tratamiento mutagénicos.
La mutagénesis se puede obtener por medios químicos o radiación, por ejemplo, tratamiento de semilla con EMS o azida sódica (Zwar y Chandler, 1995) o irradiación gamma, bien conocido en la técnica. La mutagénesis química tiende a favorecer las sustituciones de nucleótidos más que las supresiones. Se sabe que la irradiación de haz iónico pesado (HIB) es una técnica efectiva para el mejoramiento genético por mutación para producir nuevos cultivares de planta, ver, por ejemplo, Hayashi et al., 2007 y Kazama et al., 2008. La irradiación del haz iónico tiene dos factores físicos, la dosis (gy) y LET (transferencia de energía lineal, keV/um) para efectos biológicos que determina la cantidad de daño de ADN y el tamaño de supresión de ADN, y estos se pueden ajustar de acuerdo con el grado deseado de mutagénesis. HIB genera una colección de mutantes, muchos de ellos que comprenden supresiones, que se pueden analizar para determinar las mutaciones en los genes de SBEII específicos como se muestra en los Ejemplos. Los mutantes que se identifican se pueden retrocruzar con plantas de trigo no mutadas como progenitores recurrentes a fin de eliminar y en consecuencia reducir el efecto de las mutaciones no ligadas en el genoma mutagenizado, ver Ejemplo 9.
Los agentes biológicos útiles para producir mutantes específicos del sitio incluyen las enzimas que incluyen rupturas de cadena doble en el ADN que estimulan los mecanismos de reparación endógena. Estos incluyen endonucleasas, nucleasas de dedo de cinc, transposasas y recombinasas específicas de sitio. Las nucleasas del dedo de cinc (ZFN), por ejemplo, facilitan la escisión específica del sitio dentro de un genoma que permite que los mecanismos de reparación endógenos u otros de unión en el extremo introduzcan supresiones o inserciones para reparar la brecha. La tecnología de nucleasa del dedo de cinc se revisa en Le Provost et al., 2009, Ver también Durai et al., 2005 y Liu et al, 2010.
El aislamiento de mutantes se puede obtener por la detección de plantas o semillas mutagenizadas. Por ejemplo, una población de trigo mutagenizada se puede detectar directamente por el genotipo de SBEIIa y/o SBEIIb o indirectamente por la detección de un fenotipo que resulta de las mutaciones en los genes de SBEII. La detección directa por el genotipo con preferencia incluye analizar para determinar la presencia de mutaciones en los genes de SBEII, que se pueden observar en los ensayos de PCR por la ausencia de marcadores de SBEIIa o SBEIIb específicos como se espera cuando se suprimen algunos de los genes, o ensayos basados en heterodúplex como en Tilling. La detección del fenotipo puede comprender detectar la pérdida o reducción en la cantidad de una o más proteína SBEIIa o SBEIIb por ELISA o cromatografía de afinidad, o aumento del contenido de amilosa en el almidón en grano. En el trigo hexaploide, la detección con preferencia se realiza en un genotipo que ya carece de uno o dos de las actividades de SBEII, por ejemplo, en una planta de trigo ya mutante en los genes de SBEIIa o SBEIIb en dos de los tres genomas, de modo que también se busca una mutante que también carece de actividad. La cromatografía de afinidad se puede llevar a cabo como se demostró en el Ejemplo 11. Las poblaciones grandes de las semillas mutagenizadas (miles o decenas de semillas) se pueden analizar para determinar fenotipos con alto contenido de amilosa mediante espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR) que se demuestra en el Ejemplo 10. Por medio de la NIR, se puede obtener una subpoblación enriquecida en candidatos con alto contenido de amilosa. Por estos medios, se puede conseguir la detección de alto rendimiento y permite el aislamiento de las mutantes a una frecuencia de aproximadamente uno por varios cientos de semillas.
Las plantas y semillas de la invención se pueden producir mediante el proceso conocido como TILLING (lesiones locales inducidas dirigidas en los genomas), ya que una o más de las mutaciones de las plantas de trigo o grano se pueden producir por este método. En una primera etapa, las mutaciones introducidas tales como nuevos cambios de pares de bases son inducidos en una población de plantas por el tratamiento de semillas o polen con un mutágeno químico o radiación, y luego las plantas se promueven a una generación donde las mutaciones se heredarán en forma estable, normalmente una generación M2 donde se pueden identificar los homocigotas. El ADN se extrae y se almacenan las semillas de todos los miembros de la población para crear un recurso que al que se puede acceder repetidamente con el tiempo. En un ensayo TILLING, los cebadores de PCR se diseñan para amplificar específicamente un blanco génico de interés único. A continuación, los cebadores marcados con colorante se pueden usar para amplificar por PCR productos del ADN mezclado de individuos múltiples. Estos productos por PCR se desnaturalizan y reaparean para permitir la formación de pares de bases mal apareados. Los apareamientos erróneos o heterodúplex representan polimorfismos de nucleótido único naturales (SNP) (es decir, varias plantas de la población probablemente portan el mismo polimorfismo) e inducen SNP (es decir, es probable que solo plantas individuales raras exhiban la mutación). Después de la formación del heterodúplex, el uso de una endonucleasa, tales como Cel I, que reconoce y escinde el ADN mal apareado es la clave para descubrir nuevos SNP en una población TILLING.
Mediante este abordaje, se pueden seleccionar muchos miles de plantas para identificar individuos con un solo cambio de base, así como inserciones o supresiones pequeñas (1-30 pb) en cualquier gen o región específica del genoma. Los fragmentos genómicos analizados pueden variar de tamaño en cualquier parte desde 0,3 a 1,6 kb. Por la mezcla y amplificación 8 veces de los fragmentos de 1,4 kb con 96 bandas por ensayo, esta combinación permite detectar hasta un millón de pares de bases del ADN genómico por ensayo único, lo que hace que el TILLING es una técnica de alto rendimiento. TILLING se describe adicionalmente en Slade y Knauf, 2005, y Henikoff et al., 2004.
Además de permitir la eficiente detección de las mutaciones, la tecnología TILLING de alto rendimiento es ideal para la detección de polimorfismos naturales. En consecuencia, interrogar un ADN homólogo desconocido por la capacidad de formar un heterodúplex en una secuencia conocida revela el número y posición de sitios polimórficos. Se identifican cambios de nucleótido e inserciones y supresiones pequeñas, que incluyen al menos algunos polimorfismos de número repetido. Esto se ha llamado Ecotilling (Comai et al., 2004). Las placas que contienen ADN ecotípico dispuestos se pueden detectar más que las mezclas de ADN de las plantas mutagenizadas. Debido a que la detección es en los geles con patrones de resolución y antecedentes de pares de bases son uniformes a través de las calles, se pueden combinar bandas que son de tamaño idéntico, en consecuencia, se descubren y genotipifican mutaciones en una sola etapa. De esta manera, la secuenciación del gen mutante es simple y eficiente.
Las mutaciones identificadas luego se pueden introducir en trasfondos genéticos deseados por la cruza de la mutante con una planta del trasfondo genético deseado y se realiza una cantidad adecuada de retrocruzas para cruzar el trasfondo del progenitor no deseado originalmente.
En el contexto de esta solicitud, una "mutación inducida" o "mutación introducida" es una variación genética inducida artificialmente que puede ser el resultado de la mutagénesis química, por radiación o con base biológica, por ejemplo, inserción de transposón o T-ADN. Las mutaciones preferidas son mutaciones nulas tales como mutaciones sin sentido, mutaciones con cambio de marco, supresiones, inserción o variantes de empalme del sitio que inactivan completamente el gen. Otras mutaciones preferidas son mutaciones parciales que retienen alguna actividad de SBEII, pero menos de los niveles de la enzima tipo salvaje. Los derivados de la inserción de nucleótidos incluyen fusiones 5' y 3' terminal, así como inserciones intra-secuencia de nucleótidos únicos o múltiples. Las variantes de inserción de la secuencia de nucleótidos son aquellas en que se introducen uno o más nucleótidos en un sitio en la secuencia de nucleótidos, sea en un sitio predeterminado cómo es posible con las nucleasas de dedo de cinc (ZFN) u otros métodos de recombinación homóloga o por inserción aleatoria con la detección adecuada del producto resultante. Las variantes de supresión se caracterizan por la remoción de uno o más nucleótidos de la secuencia. Con preferencia, un gen mutante tiene solo una inserción o supresión única de una secuencia de nucleótidos con respecto al gen tipo salvaje. La supresión puede ser suficientemente intensiva para incluir uno o más exones o intrones, tanto exones e intrones, un límite de intrón-exón, una parte del promotor, el sitio de comienzo de la traducción o incluso el gen completo. Las supresiones pueden extender lo suficiente para incluir al menos parte de, o el total de, ambos genes de SBEIIa y SBEIIb sobre el genoma A, B o D, sobre la base de la unión genética cercana de los dos genes. Las inserciones o supresiones dentro de los exones de la región codificadora de la proteína de un gen que insertan o suprimen un número de nucleótidos que no es un múltiplo exacto de tres, de este modo causan un cambio en el marco de lectura durante la traducción, casi siempre anulan la actividad del gen mutante que comprende tal inserción o supresión.
Las variantes por sustitución de nucleótidos son aquellas en las que al se ha eliminado un nucleótido de la secuencia y se ha insertado un nucleótido diferente en su lugar. El número preferido de nucleótidos afectados por las sustituciones en un gen mutante con respecto al gen tipo salvaje es un máximo de diez nucleótidos, con más preferencia un máximo de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2, o con máxima preferencia solo un nucleótido. Las sustituciones pueden ser "silentes" ya que la sustitución no cambia el aminoácido definido por el codón. Las sustituciones de nucleótidos pueden reducir la eficiencia de traducción y de este modo reducen el nivel de expresión de SBEII, por ejemplo, por la reducción de la estabilidad del ARNm o, si está cerca de un límite del empalme exón-intrón, alteran la eficiencia del empalme. No es de esperar que las sustituciones silentes que no alteran la eficiencia de traducción de un gen SBEIIa o SBEIIb alteren la actividad de los genes y en consecuencia en la presente se consideran como no mutante, es decir, tales genes son las variantes activas y no abarcan los "alelos mutantes". Alternativamente, la sustitución de nucleótido puede cambiar la secuencia de aminoácidos codificada y de este modo alterar la actividad de la enzima codificada, en particular si los aminoácidos conservados se sustituyen con otro aminoácido que es relativamente diferente, es decir, una sustitución no conservadora. Las sustituciones conservadoras típicas son las obtenidas de acuerdo con la Tabla 3.
El término "mutación" como se usa en la presente no incluye las sustituciones de nucleótidos silentes que no afectan la actividad del gene, y en consecuencia incluye solo alteraciones en la secuencia del gen que afecta la actividad del gen. El término "polimorfismo" se refiere a cualquier cambio en la secuencia de nucleótidos que incluyen tales sustituciones de nucleótidos silentes. Los métodos de detección primero pueden involucrar primero de analizar polimorfismos y en segundo lugar para las mutaciones dentro de un grupo de variantes polimórficas.
Como se entiende en la técnica, los trigos hexaploides tales como trigo de pan comprenden tres genomas que solo se denominaron comúnmente los genomas A, B y D, mientras los trigos tetraploides tales como el trigo sarraceno comprenden dos genomas comúnmente denominados los genomas A y B. Cada genoma comprende 7 pares de cromosomas que se pueden observar por métodos citológicos durante la meiosis y de este modo se identifican, como es bien conocido en la técnica.
Los términos "plantas" y "plantas de trigo" como se usa en la presente como un sustantivo generalmente se refiere a las plantas totales, pero cuando la "planta" o "trigo" se usa como un adjetivo, los términos se refieren a cualquier sustancia que está presente en, se obtiene de, deriva de, o se relaciona a una planta o una planta de trigo, tales como por ejemplo, órganos de planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, flores), células únicas (por ejemplo, polen), semillas, células vegetales que incluyen por ejemplo, células cultivadas de tejido, productos producidos de la planta tal como "harina de trigo", "grano de trigo", "almidón de trigo", "gránulos de almidón de trigo" y similares. Las plántulas y semillas germinadas de las que han emergido raíces y brotes se incluyen dentro del significado de la "planta". El término "partes de planta" como se usa en la presente se refiere a uno o más tejidos u órganos de planta que se obtienen de una planta completa, con preferencia una planta de trigo. Las partes de planta incluyen estructuras vegetativas (por ejemplo, hojas, tallos), raíces, órganos/estructuras florales, semilla (que incluyen embrión, endospermo, y envoltura de semilla), tejido de planta (por ejemplo, tejido vascular, tejido fundamental, y similares), células y progenie del mismo. El término "célula de planta" como se usa en la presente se refiere a una célula obtenida de una planta o en una planta, con preferencia una planta de trigo, e incluye protoplastos u otras células derivadas de las plantas, células productoras de gametos, y células que se regeneran en plantas completa. Las células de planta pueden ser células en cultivo. Por "tejido de planta" se entiende tejido diferenciado en una planta u obtenido de una planta ("explante") o tejido no diferenciado derivado de embriones inmaduros o maduros, semillas, raíces, brotes, frutas, polen, y varias formas de agregaciones de las células de planta en cultivo, tales como callos. Los tejidos de platas en o de semillas tales como semillas de trigo son envolturas de semilla, endospermo, escutelo, capa de aleurona y embrión.
Los cereales como se usa en la presente significa plantas o grano de las familias monocotiledóneas Poaceae o Graminae que se cultivan por los componentes comestibles de sus semillas, e incluye trigo, cebada, maíz, avenas, centeno, arroz, sorgo, tritical, mijo, trigo negro. Con preferencia, la planta o grano de cereal es planta o grano de trigo o cebada, con más preferencia planta o grano de trigo. En una forma de realización más preferida, la planta de cereal no es arroz o maíz o ambos de estos.
Como se usa en la presente, el término "trigo" se refiere a ninguna especie del género Triticum, que incluye sus progenitores, así como su progenie producida por las cruzas con otras especies. El trigo incluye "trigo hexaploide" que tiene una organización del genoma de AABBDD, compuesto de 42 cromosomas, y "trigo tetraploide" que tiene una organización del genoma de AABB, compuesto de 28 cromosomas. El trigo hexaploide incluye T. aestivum, T. spelta, T. macha, T. compactum, T. sphaerococcum, T. vavilovii, y sus interespecies. El trigo tetraploide incluye T. durum (también denominado como trigo sarraceno o Triticum turgidum ssp. durum), T. dicoccoides, T. dicoccum, T. polonicum, y sus cruzas de interespecie. Además, el término "trigo" incluye los posibles progenitores del Triticum sp. hexaploide o tetraploide tales como T. uartu, T. monococcum o T. boeoticum para el genoma A, Aegilops speltoides para el genoma B, y T. tauschii (también conocido como Aegilops squarrosa o Aegilops tauschii) para el genoma D. Una planta o grano de trigo de acuerdo con la invención es un trigo o grano de la especie T. aestivum. Con preferencia la planta de trigo es adecuada para la producción comercial de grano, que tienen características agronómicas adecuadas que son conocidas por los expertos en la técnica. Con más preferencia, el trigo es Triticum aestivum ssp. aestivum, en la presente también denominado como "trigo de pan".
Las plantas de trigo de la invención pueden tener muchos usos diferentes de los usos para alimentos o alimentos de animales, por ejemplo, usos en investigación o mejoramiento genético. En los cultivos propagados por semilla tales como trigo, las plantas se pueden autofecundar para producir una planta que es homocigota para los genes deseados, o tejidos haploides tales como células germinales en desarrollo que se pueden inducir para duplicar el complemento del cromosoma para producir plantas homocigotas. La planta de trigo endogámica de la invención de este modo produce semillas que contiene la combinación de alelos de SBEII mutantes que pueden ser homocigotas. Estas semillas se pueden cultivar para producir plantas que pueden tener el fenotipo seleccionado tal como, por ejemplo, alto contenido de amilosa en su almidón.
Las plantas de trigo de la invención se pueden cruzar con plantas que contienen un trasfondo genético más deseable y en consecuencia la invención incluye la transferencia del rasgo de SBEII bajo a otros trasfondos genéticos. Después de la cruza inicial, se puede llevar a cabo un número adecuados de retrocruzas para eliminar un trasfondo no deseable. Los marcadores basados en PCR específica del alelo de SBEII tales como los que se describen en la presente se pueden usar para analizar o identificar plantas de la progenie o granos con la combinación deseada de alelos, de este modo se rastrea la presencia de los alelos del programa de mejoramiento genético. El trasfondo genético deseado puede incluir una combinación adecuada de genes que proporcionan rendimiento comercial y otras características tales como rendimiento agronómico o resistencia al estrés abiótico. El trasfondo genético también podría genes de biosíntesis o modificación del almidón alterados, por ejemplo, genes de otras líneas de trigo. El trasfondo genético puede comprender uno o más transgenes tales como, por ejemplo, un gen que confiere tolerancia a un herbicida tal como glifosato.
El trasfondo genético deseado de la planta de trigo incluirá consideraciones del rendimiento agronómico y otras características. Tales características pueden incluir si se desea tener un tipo invierno o primavera, rendimiento agronómico, resistencia a la enfermedad y resistencia al estrés abiótico. Para usar en Australia, se puede desear cruzar el rasgo de almidón alterado de la planta de trigo de la invención en cultivares de trigo tales como Baxter, Kennedy, Janz, Frame, Rosella, Cadoux, Diamondbird u otras variedades comúnmente cultivadas. Otras variedades se adecuarán para otras regiones de cultivo. Se prefiere que la planta de trigo de la invención proporcione un rendimiento de grano de al menos 80 % con respecto al rendimiento de la variedad tipo salvaje correspondiente en al menos algunas regiones de cultivo, con más preferencia al menos 85 % o al menos 90 %, y aun con más preferencia al menos 95 % con respecto a una variedad tipo salvaje que tiene aproximadamente el mismo trasfondo genético, que se cultiva en las mismas condiciones. Con máxima preferencia, el rendimiento de grano de la planta de trigo de la invención es al menos tan grande como el rendimiento de la planta tipo salvaje de trigo que tiene aproximadamente el mismo trasfondo genético, cultivada en las mismas condiciones. El rendimiento se puede medir fácilmente en los ensayos de campo controlados, o en ensayos de campo simulados en el invernadero, con preferencia en el campo.
La selección asistida por marcador es un método bien reconocido de seleccionar plantas heterocigotas obtenidas cuando se retrocruzan con un progenitor recurrente en un programa de cruzamiento clásico. La población de plantas en cada generación de retrocruza será heterocigota para el gen de interés normalmente presente en una relación 1:1 en una población de retrocruza, y el marcador molecular se puede usar para distinguir los dos alelos del gen. Por la extracción del ADN, por ejemplo, de brotes jóvenes y el análisis con un marcador específico para el rasgo deseable introgresado, la selección temprana de plantas para posterior retrocruza se realiza mientras que la energía y los recursos se concentran en pocas plantas.
Los procedimientos tales como cruzamiento de plantas de trigo, autofertilización de plantas de trigo o selección asistida con marcador son procedimientos estándares y bien conocidos en la técnica. La transferencia de alelos del trigo tetraploide tal como trigo sarraceno a un hexaploide, u otras formas de hibridación, es más difícil pero también es más conocida en la técnica.
Para identificar las características fenotípicas deseadas, las plantas de trigo que contienen una combinación de alelos de SBEIIa y SBEIIb mutantes u otros genes deseados normalmente se comparan con las plantas control. Cuando se evalúa una característica fenotípica asociada con la actividad enzimática tal como contenido de amilosa en el almidón en grano, las plantas por analizar y plantas de control se cultivan bajo cámara de crecimiento, invernadero, cámara superior abierta y/o condiciones de campo. La identificación de un rasgo fenotípicos particular y la comparación con los controles se basa en el análisis y clasificación estadística de rutina. Las diferencias estadísticas entre las líneas de las plantas se pueden evaluar por la comparación de la actividad enzimática entre las líneas de plantas dentro de cada tipo de tejido que expresa la enzima. La expresión y actividad se comparan en con los parámetros de crecimiento, desarrollo y rendimiento que incluyen la morfología de la parte de planta, color, número, tamaño, dimensiones, peso seco y húmedo, maduración, relaciones de biomasa aérea y subterránea, y tiempo, tasas y duración de varias etapas de cultivo a través de la senescencia, que incluye crecimiento vegetativo, fructificación, floración, y contenido de carbohidratos solubles que incluye niveles de sacarosa, glucosa, fructosa y almidón así como niveles de almidón endógeno. Con preferencia, las plantas de trigo de la invención difieren de las plantas tipo salvaje en uno o más de estos parámetros en menos de 50 %, con más preferencia menos de 40 %, menos de 30 %, menos de 20 %, menos de 15 %, menos de 10 %, menos de 5 %, menos de 2 % o menos de 1 % cuando se cultivan en las mismas condiciones.
Como se usa en la presente, el término "ligado" se refiere a un locus marcador y un segundo locus que está suficientemente cercano en un cromosoma que se heredarán juntos en más de 50 % de las meiosis, por ejemplo, en forma no aleatoria. Esta definición incluye la situación en que el locus marcador y el segundo locus forman parte del mismo gen. Además, esta definición incluye la situación en que el locus marcador comprende un polimorfismo que es responsable por el rasgo de interés (en otras palabras, el locus marcador está directamente "ligado" en el fenotipo). El término "ligado genéticamente" como se usa en la presente es más estrecho, solo se usa en relación con un locus marcador y un segundo locus es suficientemente cercano en un cromosoma que ellos se heredarán juntos en más de 50 % de la meiosis. En consecuencia, el porcentaje de recombinación observado entre los locus por generación (centimorgan (cM)), será menos de 50. En formas de realización particulares de la invención, el locus genéticamente ligado puede ser 45, 35, 25, 15, 10, 5, 4, 3, 2, o 1 o menos de cM separados en un cromosoma. Con preferencia, los marcadores están menos de 5 cM o 2cM separados y con máxima preferencia aproximadamente 0 cM separado. Como se describe en el Ejemplo 5 en la presente, los genes de SBEIIa y SBEIIb están ligados genéticamente en la rama larga del cromosoma 2 de cada uno de los genomas del trigo, que está aproximadamente 0,5 cM separado, lo que corresponde a aproximadamente 100-200 kb de distancie física.
Como se usa en la presente, los "otros marcadores genéticos" pueden ser cualquiera de las moléculas que se ligan a un rasgo deseado en las plantas de trigo de la invención. Tales marcadores son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen marcadores moleculares ligados a los genes que determinan rasgos tales como resistencia a la enfermedad, rendimiento, morfología de la planta, calidad del grano, otros rasgos de estado latente tales como color del grano, contenido de ácido gibberélico en la semilla, altura de la planta, color de la harina y similares. Ejemplos de tales genes con genes de resistencia a la roya del tallo Sr2 o Sr38, los genes de resistencia a la roya amarilla Yr10 o Yr17, los genes de resistencia a los nematodos tales como Creí y Cre3, alelos en el locus de glutenina que determinan la resistencia de la masa tales como los alelos Ax, Bx, Dx, Ay, By y Dy, los genes Rht que determinan un hábito de crecimiento semi-enano y en consecuencia resistencia al resistencia al volcado (Eagles et al., 2001; Langridge et al., 2001; Sharp et al., 2001).
Las plantas de trigo, partes de la planta de trigo y los productos de estas de la invención con preferencia son no transgénicos para los genes que inhiben la expresión de SBEIIa, es decir, no comprenden un transgén que codifica una molécula de ARN que reduce la expresión de los genes endógenos de SBEIIa, sin bien en esta forma de realización pueden comprender otros transgenes, por ejemplo, genes de tolerancia a herbicidas. Con más preferencia, la planta de trigo, grano y productos de estos son no transgénicos, es decir, no contienen ningún transgén, lo que se prefiere en algunos mercados. Tales productos también se describen en la presente como productos "no transformados". Tales plantas y grano no transgénicos comprenden múltiples alelos de SBEII mutantes que se describen en la presente, tales como los producidos después de la mutagénesis.
Los términos "planta transgénica" y "planta transgénica de trigo" como se usan en la presente se refieren a una planta que contiene un constructo génico ("transgén") no hallado en una planta tipo salvaje de la misma especie, variedad o cultivar. Es decir, las plantas transgénicas (plantas transformadas) contienen material genético que no contenían antes de la transformación. Un "transgén" mencionado en la presente tiene el significado normal en la técnica de la biotecnología y se refiere a una secuencia genética que se ha producido o alterado por tecnología de ADN o ARN recombinante y que se ha introducido en la célula de planta. El transgén puede incluir secuencias genéticas obtenidas de o derivadas de una célula de planta, u otra célula de planta o fuente no vegetal, o una secuencia sintética. Normalmente, el transgén se ha introducido en la planta por manipulación humana tal como, por ejemplo, por la transformación, pero se puede usar cualquier método reconocido por un experto en la técnica. El material genético normalmente se integra en forma estable en el genoma de la planta. El material genético introducido puede comprender secuencias que se producen naturalmente en la misma especie, pero en un orden reordenado o en una disposición diferente de los elementos, por ejemplo, una secuencia antisentido. Las plantas que contienen tales secuencias se incluyen en la presente en las "plantas transgénicas". Las plantas transgénicas que se definen en la presente incluyen toda la progenie de una planta transformada y regenerada inicial (planta T0) que se ha modificado genéticamente usando técnicas recombinantes, donde la progenie comprende el transgén. Tal progenie se puede obtener por autofertilización de la planta transgénica primaria o por cruzamiento de tales plantas con otra planta de la misma especie. En una forma de realización, las plantas transgénicas son homocigotas para cada uno y todos los genes que se han introducido (transgén) de modo que su progenie no segrega para el fenotipo deseado. Las partes de la planta transgénica incluyen todas las partes y células de dichas plantas que comprenden el transgén tal como, por ejemplo, semillas, tejidos cultivados, callos y protoplastos. Una "planta no transgénica", con preferencia una planta no transgénica de trigo es una que no se ha modificado genéticamente por la introducción del material genético por técnicas de ADN recombinante.
Como se usa en la presente, el término "correspondiente planta no transgénica" se refiere a una planta que es la misma o similar en la mayor parte de las características, con preferencia isogénica o casi isogénica relativa a la planta transgénica, pero sin el transgén de interés. Con preferencia, la correspondiente planta no transgénica es del mismo cultivar o variedad que el progenitor de la planta transgénica de interés, o una línea de planta hermana que carece del constructo, a menudo denominada una "segregante", o una planta del mismo cultivar o variedad transformada con un contracto de "vector vacío", y puede ser una planta no transgénica. "Tipo salvaje", como se usa en la presente, se refiere a una célula, tejido o planta que no se ha modificado de acuerdo con la invención. Las células, tejido o plantas de tipo salvaje se conocen en la técnica y se pueden usar como controles para comparar los niveles de expresión de un ácido nucleico exógeno o la medida y naturaleza de la modificación del rasgo con células, tejido o plantas modificadas como se describe en la presente. Como se usa en la presente, "grano de trigo de tipo salvaje" significa un correspondiente grano de trigo no transgénico, no mutagenizado. Los granos de trigo tipo salvaje específicos como se usa en la presente incluyen, pero sin limitación Sunstate y Cadoux.
Se pueden emplear alguno de diversos métodos para determinar la presencia de un transgén en una planta transformada. Por ejemplo, se puede usar la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar secuencias que son únicas para la planta transformada, con detección de los productos amplificados por electroforesis en gel u otros métodos. El ADN se puede extraer de las plantas usando métodos convencionales y la reacción de PCR realizada usando cebadores que distinguirán las plantas transformadas y no transformadas. Un método alternativo para confirmar un transformante positivo es por la hibridación por transferencia Southern, bien conocido en la técnica. Las plantas de trigo que se transforman también se pueden identificar, es decir, distinguir de las plantas no transformadas o tipo salvaje de trigo por su fenotipo, por ejemplo, conferido por la presencia de un gen del marcador seleccionable, o por inmunoensayos que detectan o cuantifican la expresión de una enzima codificada por el transgén, o cualquier otro fenotipo conferido por el transgén.
Las plantas de trigo de la presente invención se pueden cultivar o cosechar para el grano, principalmente para usar como alimento para consumo humano o como alimento para animales, o para fermentación o producción de materias primas industriales tales como producción de etanol, entre otros usos. En forma alternativa, las plantas de trigo se pueden usar directamente como alimento para animales. La planta de la presente invención con preferencia es útil para la producción de alimentos y en particular para la producción de alimento comercial. Tal producción de alimento puede incluir la preparación de la harina, masa, semolina u otros productos del grano que pueden ser un ingrediente en la producción de alimento comercial.
Como se usa en la presente, el término "grano" generalmente se refiere a la semilla cosechada madura de una planta, pero también se puede referir al grano después de la imbibición o germinación, de acuerdo con el contexto. El grano de cereal maduro tal como trigo comúnmente tiene un contenido de humedad de menos de aproximadamente 18-20 %. Como se usa en la presente, el término "semilla" incluye la semilla recolectada pero también incluye la semilla que está en desarrollo en la planta post antesis y semilla madura comprendida en la planta antes de la cosecha.
Como se usa en la presente, "germinación" se refiere a la emergencia de la punta de la raíz de la envoltura de la semilla después de la imbibición. "Tasa de germinación" se refiere al porcentaje de semillas en una población que ha germinado durante un período de tiempo, por ejemplo, 7 o 10 días, después de la imbibición. Las tasas de germinación se pueden calcular usando técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, una población de semillas se puede evaluar diariamente durante varios días para determinar el porcentaje de germinación con el tiempo. Con respecto al grano de la presente invención, como se usa en la presente el término "tasa de germinación que es sustancialmente igual" significa que la velocidad de germinación del grano es al menos 90 %, el del correspondiente grano tipo salvaje.
El almidón se aísla fácilmente del grano de trigo usando métodos estándares, por ejemplo, el método de Schulman y Kammiovirta, 1991. En una escala industrial, se puede usar molienda seca o húmeda. El tamaño del gránulo de almidón es importante en la industria del procesamiento del almidón donde hay separación de los gránulos de A más grandes a partir de los gránulos B más pequeños.
El trigo tipo salvaje cultivado comercialmente tiene un contenido de almidón en el grano que está usualmente en el rango de 55-65 %, que depende algo del cultivar cultivado. En comparación, la semilla o grano de la invención tiene un contenido de almidón de al menos 90 % con respecto al del grano tipo salvaje, y con preferencia al menos 93 %, al menos 95 %, o al menos 98 % con respecto al contenido de almidón del grano tipo salvaje cuando las plantas se cultivan en las mismas condiciones. En formas de realización adicionales, el contenido de almidón del grano es al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 45 %, o al menos aproximadamente 55 % a aproximadamente 65 % como porcentaje del peso del grano (p/p). Otras características deseables incluyen la capacidad de moler el grano, en particular la dureza del grano. Otro aspecto que puede hacer una planta de trigo de valor mayor es el grado de extracción del almidón del grano, las tasas de extracción más altas son las más útiles. La forma del grano también es otro rasgo que puede impactar en la utilidad comercial de una planta, en consecuencia, la forma del grano puede tener un impacto sobre la facilidad con la que se pueden moler el grano.
En otro aspecto no cubierto por las reivindicaciones, la descripción proporciona gránulos de almidón o almidón obtenidos del grano de la planta como se describió antes, que tiene un aumento de proporción de amilosa y una reducción de la proporción de amilopectina. El almidón purificado se puede obtener del grano por un proceso de molienda, por ejemplo, un proceso de molienda húmedo, que involucra la separación del almidón de la proteína, aceite y fibra. El proceso inicial del proceso de molienda es una mezcla o composición de gránulos de almidón, y la invención en consecuencia abarca tales gránulos. Los gránulos de almidón del trigo comprenden proteínas unidas al gránulo de almidón que incluyen GBSS, SBEIIa y SBEIIb entre otras proteínas y en consecuencia la presencia de estas proteínas distingue los gránulos de almidón del trigo de los gránulos de almidón de otros cereales. El almidón de los gránulos de almidón se puede purificar por la eliminación de las proteínas después de la ruptura y dispersión de los gránulos de almidón por tratamiento térmico y/o químico. Los gránulos de almidón del grano de trigo de la invención son normalmente de forma y morfología de superficie distorsionada, cuando se observan con microscopía óptica, como se ejemplifica en presente, en particular para el grano de trigo que tiene un contenido de amilosa de al menos 50 % como un porcentaje del almidón total del grano. En una forma de realización, al menos 50 %, con preferencia al menos 60 % o al menos 70 % de los gránulos de almidón obtenidos del grano muestran la forma o morfología de superficie distorsionada. Los gránulos de almidón también muestran una pérdida de birrefringencia cuando se observan con la luz polarizada.
El almidón del grano, el almidón de los gránulos de almidón, y el almidón purificado comprende al menos 50% (p/p) de amilosa en proporción al almidón total y se puede caracterizar adicionalmente por una o más de las siguientes propiedades:
(i) al menos 60 % (p/p), o al menos 67 % (p/p) de amilosa como una proporción del almidón total;
(ii) volumen de hinchamiento modificado;
(iii) distribución de la longitud de la cadena y/o frecuencia de ramificación modificadas;
(iv) temperatura de gelatinización modificada;
(v) viscosidad modificada (viscosidad pico, temperatura de la pasta, etc.);
(vi) masa molecular de amilopectina y/o amilosa modificada;
(vii) % de cristalinidad modificado
(viii) que comprende al menos 2 % de almidón resistente; y/o
(ix) que comprende un índice glicérico relativo bajo (GI).
El almidón también se puede caracterizar por su volumen de hinchamiento calentado en exceso de agua en comparación con un almidón tipo salvaje. El volumen de hinchamiento se mide normalmente por la mezcla de almidón o harina con exceso de agua y calentamiento a temperaturas elevadas, normalmente mayor de 90 °C. La muestra luego se recolecta por centrifugación y el volumen de hinchamiento se expresa como la masa del material sedimentado dividido por el peso seco de la muestra. Una característica de hinchamiento bajo es útil cuando se desea aumentar el contenido de almidón de una preparación alimenticia, en particular una preparación alimenticia hidratada.
Una medida de una estructura de amilopectina alterada es la distribución de longitudes de cadena, o el grado de polimerización, del almidón. La distribución de la longitud de la cadena se puede determinar por el uso de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforo (FACE) después de la desramificación de la isoamilosa. La amilopectina del almidón de la invención puede tener una distribución de la longitud de la cadena en el rango de 5 a 60 que es mayor que la distribución de almidón de las plantas tipo salvaje después de la desramificación. El almidón con longitudes de cadena más largas también tendrá una disminución proporcional en la frecuencia de ramificación. En consecuencia, el almidón también puede tener una distribución de longitudes de cadena más largas de amilopectina en la amilopectina aún presente. La amilopectina del grano se puede caracterizar porque comprende una proporción reducida de la fracción de longitud de cadena de 4 - 12 dp con respecto a la amilopectina del grano tipo salvaje, medida después de la desramificación con isoamilasa de la amilopectina.
En otro aspecto de la invención, el almidón de trigo puede tener una temperatura de gelatinización alterada, que se puede medir fácilmente por calorimetría de barrido diferencial (DSC). La gelatinización es el colapso impulsado por el calor (ruptura) del orden molecular dentro del gránulo de almidón en exceso de agua, con cambios concomitantes e irreversibles en propiedades tales como hinchamiento granular, fusión cristalina, pérdida de birrefringencia, desarrollo de viscosidad y solubilización del almidón. La temperatura de gelatinización puede estar aumentada o disminuida en comparación con el almidón de las plantas tipo salvaje, de acuerdo con la longitud de cadena de la amilopectina restante. El almidón con alto contenido de amilosa de los mutantes extensores de amilosa (ae) del maíz mostró una mayor temperatura de gelatinización que el maíz normal (Fuwa et al., 1999; Krueger et al. 1987). A la inversa, el almidón de los mutantes de cebada sex6 que carecen de actividad de almidón sintasa IIa presentaron menor temperatura de gelatinización y la entalpía para el pico de gelatinización estaba reducida cuando se la comparó con la de las plantas control (Morell et al., 2003).
La temperatura de gelatinización, en particular la temperatura de inicio del primer pico o la temperatura para el ápice el primer pico, se puede elevar en al menos 3 °C, con preferencia al menos 5 °C o con más preferencia al menos 7 °C medido por DSC en comparación con el almidón extraído de un grano similar pero no alterado. El almidón puede comprender un nivel elevado de almidón resistente, con una estructura alterada indicada por las características físicas específicas que incluyen una o más del grupo que consiste en la inaccesibilidad física a las enzimas digestivas que puede ser por la razón de tener la morfología del gránulo del almidón alterada, la presencia de apreciable lípido asociado al almidón, cristalinidad alterada, y distribución de la longitud de la cadena de amilopectina alterada. La alta proporción de amilosa también contribuye al nivel de almidón resistente.
La estructura del almidón del trigo de la presente invención también puede diferir en que el grado de cristalinidad está reducido en comparación con el almidón normal aislado del trigo. También se considera que la cristalinidad reducida de un almidón se asocia con la mejora de las propiedades organolépticas y contribuye a una sensación en boca más suave. En consecuencia, el almidón en forma adicional puede exhibir reducción de la cristalinidad resultante de los niveles reducidos de actividad de una o más enzimas de síntesis de amilopectina. La cristalinidad normalmente se investiga por cristalografía de rayos X.
En algunas formas de realización, el presente almidón proporciona propiedades digestivas modificadas tales como aumento del almidón resistente que incluye entre 1 % a 20 %, 2 % a 18 %, 3 % a 18 % o 5 % a 15 % de almidón resistente y un Índice glicérico disminuido (GI).
La invención también proporciona harina, sémola u otros productos producidos del grano. Estos pueden ser no procesados o procesados, por ejemplo, por fraccionamiento o blanqueado.
La invención también proporciona almidón del grano de las plantas ejemplificadas de trigo que comprenden aumento de la fibra dietaria, con preferencia en combinación con un elevado nivel de almidón resistente. Este aumento es también al menos en parte un resultado del nivel relativo alto de la amilosa.
El término "fibra dietaria" como se usa en la presente incluye los carbohidratos y los productos de digestión de los carbohidratos que no se absorben en el intestino delgado de los seres humanos sanos pero que ingresan en el intestino grueso. Esto incluye el almidón resistente y otros polímeros de carbohidratos solubles e insolubles. Se considera que comprende la porción de carbohidratos que son fermentables, al menos parcialmente, en el intestino grueso por la microflora residente. El almidón de la invención contiene niveles relativamente altos de fibra dietaria, más particularmente amilosa. El contenido de fibra dietaria del grano de la presente invención resulta al menos en parte del aumento del contenido de amilosa en el almidón del grano, y también o en combinación con un aumento del contenido del almidón como un porcentaje del almidón total. "Almidón resistente" se define en la presente como la suma de almidón y productos de la digestión del almidón no absorbidos en el intestino delgado de los seres humanos sanos pero que ingresa en el intestino grueso. Esto se define en términos de un porcentaje de almidón total del grano, o un porcentaje del contenido de almidón total, de acuerdo con el contexto, En consecuencia, el almidón resistente excluye los productos digeridos y absorbidos en el intestino delgado. Los almidones resistentes incluyen almidón físicamente inaccesible (forma RS1), gránulos de almidón nativos resistentes (RS2), almidones retrogradados (RS3), y almidones químicamente modificados (RS4). La estructura del almidón alterada y en particular los niveles de amilosa altos del almidón de la invención dan origen a un aumento del almidón resistente cuando se consume en los alimentos. El almidón puede estar en forma de una forma de RS1, que es algo inaccesible a la digestión. La asociación de almidón-lípido medida por cristalinidad del complejo V también es probable que contribuya al nivel del almidón resistente.
Mientras que la invención puede ser particularmente útil en el tratamiento o profilaxis de los seres humanos, se entiende que la invención también es aplicable a los sujetos no humanos que incluyen, pero sin limitación a animales agrícolas tales como vacas, ovejas, cerdos y similares, animales domésticos tales como perros o gatos, animales de laboratorio tales como conejos o roedores tales como ratones, ratas, hámsteres, o animales que se pueden usar para deportes tales como caballos. El método puede ser particularmente aplicable a mamíferos no rumiantes o animales tales como mamíferos monogástricos. La invención también puede ser aplicable a otros animales agrícolas, por ejemplo, aves que incluyen, por ejemplo, pollos, gansos, patos, pavos o codornices, o pescado.
De acuerdo con una realización no reivindicada, el método de tratar el sujeto, en particular seres humanos, puede comprender la etapa de administrar el grano de trigo, harina, almidón alterado o un producto de alimento o bebida como se define en la presente al sujeto, en una o más dosis, en una cantidad y durante un período de tiempo en el cual el aumento el nivel de uno o más indicadores de la salud intestinal o metabólicos. El indicador puede cambiar con respecto al consumo del almidón de trigo o trigo no alterado o sus productos, dentro de un período de tiempo de horas, como en el caso de alguno de los indicadores tales como pH, elevación de los niveles de SCFA, fluctuación de glucosa posprandial, o puede llevar días tal como en el caso del aumento de masa fecal o mejora del efecto laxante, o quizás más largo en el orden de semanas o meses tales como en el caso donde el butirato se mide el aumento de la proliferación de los colonocitos normales. Puede ser conveniente que la administración del almidón o trigo o producto de trigo alterado sea para toda la vida. Sin embargo, existen buenas perspectivas para el cumplimiento por parte del individuo que se trata dada la facilidad con que se puede administrar el almidón alterado. Las dosis pueden variar de acuerdo con la condición de que se trata o previene, pero se prevé para los seres humanos que sea al menos 1 g de grano de trigo o almidón de la invención por día, con más preferencia al menos 2 g por día, con preferencia al menos 10 o al menos 20 g por día. La administración de más de aproximadamente 100 gramos por día puede requerir volúmenes considerables de administración y reducir el cumplimiento. Con máxima preferencia la dosis para un ser humano es de entre 5 y 60 g de grano de trigo o almidón por día, o para adultos entre 5 y 100 g por día.
El índice glicémico (GI) se refiere a la tasa de digestión de los alimentos que comprende el almidón, y es una comparación del efecto de un alimento de ensayo con el efecto del pan blanco o glucosa en las excursiones de la concentración de glucosa sanguínea. El índice glicémico es una medida del efecto probable del alimento afectado en la concentración de glucosa sérica posprandial y la demanda de insulina para la homeostasis de la glucemia. Una característica importante provista por los alimentos de la invención es una reducción del índice glicémico. Los niveles de glucemia fueron menores 30 min después de la digestión de productos de trigo con alto contenido de amilosa por voluntarios humanos en comparación con el trigo con contenido de amilosa bajo (Goddard et al., 1984). Además, los alimentos pueden tener un nivel bajo de digestión final y en consecuencia ser de calorías relativamente bajas. Un producto de calorías bajas se puede basar en la inclusión de harina producida del grano de trigo molido. Tales alimentos pueden tener el efecto de saciedad, potenciar la salud intestinal, reducir la glucosa sérica posprandial y la concentración de lípidos, así como proporcionar un producto alimenticio de bajas calorías.
Los indicadores de mejor salud intestinal pueden comprender, pero sin limitarse necesariamente a estos:
i) disminución del pH de los contenidos intestinales,
ii) aumento de la concentración de SCFA total o cantidad total de SCFA en los contenidos intestinales, iii) aumento de la concentración o cantidad de uno o más SCFAs en los contenidos intestinales, iv) aumento de masa fecal,
v) aumento del volumen de agua total o heces, sin diarrea,
vi) aumento del efecto laxante,
vii) aumento del número o actividad de una o más especies de bacterias probióticas,
viii) aumento de la excreción de ácido biliar fecal,
ix) reducción de los niveles urinarios de los productos de putrefacción,
x) reducción de los niveles de productos de putrefacción,
xi) aumento de proliferación de los colonocitos normales,
xii) reducción de inflamación en el intestino de los individuos con intestino inflamado,
xiii) reducción de los niveles fecales o del intestino grueso de cualquiera de urea, creatinina y fosfato en los pacientes urémicos, y
xiv) cualquier combinación de los anteriores.
Los indicadores de mejor salud metabólica pueden comprender, pero sin limitarse necesariamente a estos:
i) estabilización de la fluctuación de la glucosa posprandial,
ii) aumento de la respuesta glicérica (reducción),
iii) reducción de la concentración de insulina plasmática pre-prandial,
iv) mejora del perfil lipídico en sangre,
v) reducción del colesterol LDL plasmático,
vi) reducción de los niveles plasmáticos de uno o más de urea, creatinina y fosfato en los pacientes urémicos, vii) una mejora de la respuesta disglicémica, o
viii) cualquier combinación de los anteriores.
Se considerará que un beneficio de la presente invención es que proporciona productos tales como pan que son de particular beneficio nutricional, y más aún realiza esto sin la necesidad de modificar pos-recolección del almidón u otros constituyentes del grano de trigo. Sin embargo, se puede desear realizar modificaciones en el almidón u otro constituyente del grano y la invención abarca tal constituyente modificado. Los métodos de modificación son bien conocidos e incluyen la extracción del almidón u otro constituyente por métodos convencionales y la modificación de los almidones para aumentar la forma resistente. El almidón se puede modificar por el tratamiento con calor y/o humedad, forma física (por ejemplo, molienda de bola), en forma enzimática (usando, por ejemplo, a- o p-amilasa, pulalanasa o similares), hidrólisis química (húmeda o seca usando reactivos líquidos o gaseosos), oxidación, enlace cruzado con reactivos disfuncionales (por ejemplo, trimetafosfato de sodio, oxicloruro de fósforo), o carboximetilación.
El almidón de trigo de la presente invención será un sustrato adecuado para la fermentación para etanol (biocombustible) o bebidas que contienen etanol y el grano de trigo o almidón de trigo para otros productos de fermentación tales como alimentos, agentes nutracéuticos (fibra insoluble o soluble), enzimas y materiales industriales. Los métodos para la fermentación que usan almidón derivado de planta son bien conocidos por los expertos en la técnica, con procesos establecidos para varios productos de fermentación (ver, por ejemplo, Vogel et al., 1996 y las referencias allí citadas). En una forma de realización, los carbohidratos de almidón se pueden extraer por el triturado de las partes de la planta de trigo de la invención tales como grano, o por la difusión desde los tejidos de planta en el agua u otro solvente adecuado. Los tejidos de trigo o almidón de la invención se pueden usar directamente como sustrato para la fermentación o bioconversión en un proceso discontinuo, continuo o con célula inmovilizada.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan generalmente en forma indistinta en la presente. Los términos "proteínas" y "polipéptidos" como se usan en la presente también incluyen variantes, mutantes, modificaciones y/o derivados de los polipéptidos de la invención como se describe en la presente. Como se usa en la presente, "polipéptido sustancialmente purificado" se refiere a un polipéptido que se ha separado de los lípidos, ácidos nucleicos, otros péptidos y otras moléculas con las que se asocia en su estado nativo. Con preferencia, el polipéptido sustancialmente purificado está al menos 60 % libre, con más preferencia al menos 75 % libre, y con más preferencia al menos 90 % libre de otros componentes con los que se asocia naturalmente. Por "polipéptido recombinante" se entiende un polipéptido obtenido mediante técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un polinucleótido recombinante en una célula, con preferencia una célula de planta y con más preferencia una célula de trigo. En una forma de realización, el polipéptido tiene actividad de enzima ramificadora del almidón, en particular actividad de SBEII, y es al menos 90 % idéntica a una SBEII descripta en la presente.
Como se usa en la presente un fragmento "biológicamente activo" es una porción de un polipéptido de la invención que mantiene una actividad definida del polipéptido de longitud completa. En una forma de realización particularmente preferida, el fragmento biológicamente activo tiene actividad de enzima ramificadora del almidón. Los fragmentos biológicamente activos pueden ser de cualquier tamaño siempre que mantengan la actividad definida, pero con preferencia tienen al menos 700 o 800 residuos de aminoácidos de largo.
El % de identidad de un polipéptido con respecto a otro polipéptido se puede determinar por el análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización de la creación de brecha=5, y una penalización de extensión de la brecha =0,3. La secuencia incógnita tiene al menos 50 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 50 aminoácidos. Con más preferencia, la secuencia incógnita tiene al menos 100 aminoácidos de longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 100 aminoácidos. Aun con más preferencia, secuencia incógnita tiene al menos 250 aminoácidos de longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 250 aminoácidos. Con máxima preferencia, dos SBEII polipéptidos se alinea sobre las secuencias de aminoácidos.
Con respecto a un polipéptido definido, se apreciará que las cifras de % de identidad más altas que las provistas anteriormente comprenderán las formas de realización preferidas. En consecuencia, cuando sea aplicable, a la luz de las mínimas cifras del % de identidad, se prefiere que el polipéptido comprenda una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, con más preferencia al menos 80 %, con más preferencia al menos 85 %, con más preferencia al menos 90 %, con más preferencia al menos 91 %, con más preferencia preferencia al menos 93 %, con más preferencia al menos 94 %, con más preferencia preferencia al menos 96 %, con más preferencia al menos 97 %, con más preferencia preferencia al menos 99 %, con más preferencia al menos 99,1 %, con más preferencia al menos 99,2 %, co preferencia al menos 99,3 %, con más preferencia al menos 99,4 %, con más preferencia al menos 99,5 %, con más preferencia al menos 99,6 %, con más preferencia al menos 99,7 %, con más preferencia al menos 99,8 %, e incluso con más preferencia al menos 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO nominada relevante.
Las mutantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar por la introducción de los cambios de nucleótido apropiados en un ácido nucleico de la presente invención o por mutagénesis in vivo tal como por tratamiento químico o radiación. Tales mutantes incluyen, por ejemplo, supresiones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. Los polinucleótidos de la invención se pueden someter a técnicas de transposición de ADN descriptas por Harayama, 1998 u otros métodos in vitro para producir polinucleótidos alterados que codifican variantes de polipéptido. Estas técnicas de transposición de ADN pueden usar secuencias genéticas relacionadas a las de la presente invención, tales como genes de SBE de especies de planta diferentes del trigo. Los productos derivados del ADN mutado/alterado se pueden detectar fácilmente usando técnicas descriptas en la presente para determinar si poseen, por ejemplo, actividad de SBE.
Las supresiones de la secuencia de aminoácidos generalmente varían de aproximadamente 1 a 15 residuos, con más preferencia aproximadamente 1 a 10 residuos y normalmente aproximadamente 1 a 5 residuos contiguos.
Los mutantes por sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de polipéptido eliminado y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución se identifican como sitios activos. Otros sitios de interés son aquellos en los residuos particulares obtenidos de varias cepas o especies son idénticos, es decir, aminoácidos conservados. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica. Estos aminoácidos, especialmente los que se incluyen dentro de una secuencia contigua de al menos otros tres aminoácidos idénticamente conservados, con preferencia se sustituyen en una manera relativamente conservadora a fin de retener funciones tales como actividad de SBEII. Tales sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el título "ejemplos de sustituciones". "Las sustituciones no conservadoras de aminoácidos" se definen en la presente como sustituciones diferentes de las listadas en la Tabla 3 (Ejemplos de sustituciones conservadoras). Se espera que las sustituciones no conservadoras en una SBEII reduzcan la actividad de la enzima y muchas corresponderán a una SBEII codificada por una "pérdida parcial de función del gen de SBEII mutante".
Aunque no se incluyen dentro del alcance de la invención, también se divulgan polipéptidos de que se modificaron de modo diferencial durante o después de la síntesis, por ejemplo, por fosforilación, como se ha demostrado para SBEI, SBEIIa y SBEIIb en los amiloplastos de trigo (Tetlow et al., 2004). Estas modificaciones pueden servir para regular la actividad de la enzima, por ejemplo, por la regulación de la formación de la proteína en los amiloplastos durante la síntesis del almidón (Tetlow et al., 2008), o para aumentar la estabilidad y/o bioactividad del polipéptido de la invención, o servir como un ligando para la unión de otra molécula.
En algunas formas de realización, la presente invención involucra la modificación de la actividad del gen, particularmente la actividad del gen de SBEII, combinaciones de genes mutantes y la construcción y uso de genes quiméricos. Como se usa en la presente, el término "gen" incluye una secuencia de desoxirribonucleótidos que incluye una región codificadora de proteína o que se transcribe en una célula, pero no se traduce, junto con las regiones no codificadoras y regulatorias asociadas. Tales regiones asociadas se ubican normalmente adyacentes a la región codificadora en ambos extremos 5' y 3' para una distancia de aproximadamente 2 kb en cada lado. En este aspecto, el gen incluye señales de control tales como promotores, potenciadores, señales de terminación de la transcripción y/o poliadenilación que se asocian naturalmente con un gen dado, o señales de control heterólogas en cuyo caso el gen se denomina como "gen quimérico". Las secuencias que se ubican 5' de la región codificadora de la proteína y que están presentes en el ARNm denominan como secuencias no traducidas 5'. Las secuencias que se ubican 3' o corriente abajo de la región codificadora de la proteína y que están presentes en el ARNm denominan como secuencias no traducidas 3'. El término "gen" abarca las formas de ADNc y genómicas de un gen. El término
"gen" incluye moléculas sintéticas o de fusión que codifican las proteínas de la invención descriptas en la presente. Los genes están comúnmente presentes en el genoma del trigo como ADN de cadena doble. Un gen quimérico se puede introducir en un vector apropiado para el mantenimiento extracromosómico en una célula o para la integración en el genoma de huésped. Los genes o genotipos se mencionan en la presente en forma cursiva (por ejemplo, SBEIIa) mientras que las proteínas, enzimas o fenotipos se mencionan en la presente en forma no cursiva (SBEIIa).
Una forma genómica o clon de un gen que contiene la región codificadora se puede interrumpir con secuencias no codificadoras denominadas "intrones" o "región interviniente" o "secuencia interviniente". Un "intrón" como se usa en la presente es un segmento de un gen que se transcribe como parte de un transcripto de ARN primario, pero no está presente en la molécula de ARN madura. Los intrones se eliminan o "empalman afuera" del transcripto nuclear o primario; en consecuencia, los intrones están ausentes en el ARN mensajero (ARNm). Los intrones pueden contener elementos regulatorios tales como potenciadores. "Exones" como se usa en la presente se refieren las regiones de ADN correspondientes a las secuencias de ARN que están presentes en el ARNm maduro o la molécula de ARN maduro en casos en que la molécula de ARN no se traduce. Un ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia u orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente.
La presente invención se refiere a varios polinucleótidos. Como se usa en la presente, un "polinucleótido" o "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" significa un polímero de nucleótidos, que puede ser ADN o ARN o una combinación de estos, por ejemplo, un heterodúplex de ADN y ARN, e incluye, por ejemplo, ARNm, ARNc, ADNc, ARNt, ARNsi, ARNsh, ARNhp, y ADN de cadena simple o doble. Puede ser ADN o ARN de origen celular, orgánico, genómico o sintético, por ejemplo, obtenido en un sintetizador automatizado, y se puede combinar con carbohidratos, lípidos, proteínas u otros materiales, marcar con grupos fluorescentes u otros, o unirse a un soporte sólido para realizar una actividad particular definida en la presente. Con preferencia el polinucleótido es únicamente ADN o únicamente ARN que se produce en una célula, y algunas bases se pueden metilar o modificar de otro modo como se produce en una célula de trigo. El polímero puede ser de cadena simple, esencialmente de cadena doble o parcialmente de cadena doble. Un ejemplo de una molécula de ARN parcialmente de cadena doble es un ARN en horquilla ARN (ARNhp), ARN de horquilla corta (ARNsh) o ARN autocomplementario que incluye un tallo de cadena doble formado por el apareamiento de bases entre una secuencia de nucleótidos y su complemento y una secuencia del bucle que une en forma covalente la secuencia de nucleótidos y su complemento. Apareamiento de bases como se usa en la presente se refiere al apareamiento de bases estándar entre los nucleótidos, que incluye los pares de bases G:U en una molécula de ARN. "Complementario" significa que dos polinucleótidos son capaces del apareamiento de bases a lo largo de parte de sus longitudes o a lo largo de la longitud completa de una o ambas.
Por "aislado" se entiende el material que está sustancialmente o esencialmente libre de sus componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. Como se usa en la presente, un "polinucleótido aislado" o "molécula de ácido nucleico aislado" significa un polinucleótido que está al menos parcialmente separado de, con preferencia sustancialmente o esencialmente libre de, las secuencias de polinucleótidos del mismo tipo con los que se asocia o liga en su estado nativo. Por ejemplo, un "polinucleótido aislado" incluye un polinucleótido que ha sido purificado o separado de las secuencias que lo flanquean en un estado natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha eliminado de las secuencias que están normalmente adyacentes al fragmento. Con preferencia, el polinucleótido aislado también está al menos 90 % libre de otros componentes tales como proteínas, carbohidratos, lípidos, etc. El término "polinucleótido recombinante" como se usa en la presente se refiere a un polinucleótido formado in vitro por la manipulación del ácido nucleico en una forma que no se halla normalmente en la naturaleza. Por ejemplo, el polinucleótido recombinante puede estar en la forma de un vector de expresión. En general, tales vectores de expresión incluyen ácido nucleico regulatorio de la transcripción y traducción conectado operativamente a la secuencia de nucleótidos que se transcribe en la célula.
La presente invención se refiere al uso de oligonucleótidos que se pueden usar como "sondas" o "cebadores". Como se usa en la presente, "oligonucleótidos" son polinucleótidos de hasta 50 nucleótidos de longitud. Estos pueden ser ARN, ADN, o combinaciones o derivados de ellos. Los oligonucleótidos normalmente son moléculas de cadena relativamente corta de 10 a 30 nucleótidos, comúnmente 15-25 nucleótidos de longitud, normalmente compuestos de 10-30 o 15-25 nucleótidos que son idénticos a, o complementarios con, parte de un gen de SBEIIa o SBEIIb o ADNc correspondiente al gen de SBEIIa o SBEIIb. Cuando se usan como sonda o cebador en una reacción de amplificación, el tamaño mínimo de tal oligonucleótido es el tamaño requerido para la formación de un híbrido estable entre el oligonucleótido y una secuencia complementaria con una molécula de ácido nucleico blanco. Con preferencia, los oligonucleótidos son al menos 15 nucleótidos, con más preferencia al menos 18 nucleótidos, con más preferencia al menos 19 nucleótidos, con más preferencia al menos 20 nucleótidos, incluso con más preferencia al menos 25 nucleótidos de longitud. Los polinucleótidos usados como una sonda se conjugan normalmente con una marca detectable tal como un radioisótopo, una enzima, biotina, una molécula fluorescente o una molécula quimioluminiscente. Los oligonucleótidos y sondas de la invención son útiles en los métodos de detectar un alelo de un gen SBEIIa, SBEIIb u otro gen asociado con un rasgo de interés, por ejemplo, almidón modificado. Tales métodos emplean la hibridación del ácido nucleico y en muchos casos incluyen la extensión del cebador de oligonucleótidos por una polimerasa adecuada, por ejemplo, como se usa en la PCR para la detección o identificación de los alelos tipos salvaje o mutantes. Los oligonucleótidos y las sondas hibridan a una secuencia génica SBEIIa o SBEIIb del trigo, que incluye cualquiera de las secuencias divulgadas en la presente, por ejemplo, SEQ ID NOs: 36 a 149. Los pares de oligonucleótido preferidos son los que abarcan uno o más intrones, o una parte de un intrón y en consecuencia se puede usar para amplificar una secuencia de intrón en una reacción de PCR. Se proporcionan numerosos ejemplos en los Ejemplos de la presente.
Los términos "variante de polinucleótido" y "variante" y similares se refieren a polinucleótidos que exhiben identidad de secuencia sustancial con una secuencia de polinucleótidos de referencia y que son capaces de funcionar de una manera análoga, o con la misma actividad que, la secuencia de referencia. Estos términos también abarcan los polinucleótidos que se distinguen de un polinucleótido de referencia por la adición, supresión o sustitución de al menos un nucleótido, o que tiene, en comparación con las moléculas naturales, una o más mutaciones. Por consiguiente, los términos "variante de polinucleótido" y "variante" incluyen polinucleótidos en los que se han adicionado o suprimido uno o más nucleótidos o se reemplazaron con diferentes nucleótidos. En este aspecto, es bien entendido en la técnica que ciertas alteraciones que incluyen mutaciones, adiciones, supresiones y sustituciones, se pueden realizar a un polinucleótido de referencia por las cuales el polinucleótido alterado retiene la función o actividad biológica del polinucleótido de referencia. Por consiguiente, estos términos abarcan polinucleótidos que codifican polipéptidos que exhiben actividad enzimática u otra regulatoria o polinucleótidos capaces de servir como sondas selectivas u otros agentes hibridantes. Los términos "variante de polinucleótido" y "variante" también incluyen variantes alélicas naturales. Los mutantes pueden ser naturales (es decir, aislado de una fuente natural) o sintética (por ejemplo, por la realización de mutagénesis dirigida al sitio en el ácido nucleico). Con preferencia, una variante de polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido con actividad enzimática es mayor de 400, con más preferencia mayor de 500, con más preferencia mayor de 600, con más preferencia mayor de 700, con más preferencia mayor de 800, con más preferencia mayor de 900, e incluso con más preferencia mayor de 1,000 nucleótidos de longitud, hasta la longitud completa del gen.
Una variante de un oligonucleótido de la invención incluye las moléculas de tamaños variados que son capaces de hibridar, por ejemplo, al genoma del trigo en una posición cercana a la de las moléculas de oligonucleótido específicas definidas en la presente. Por ejemplo, las variantes pueden comprender nucleótidos adicionales (tales como 1, 2, 3, 4, o más), o menos nucleótidos siempre que aún hibriden a la región blanco. Además, unos pocos nucleótidos se pueden sustituir sin influir en la capacidad del oligonucleótido de hibridar a la región blanco. Además, se pueden diseñar fácilmente variantes que hibriden cerca (por ejemplo, pero sin limitación, dentro de 50 nucleótidos) de la región del genoma de la planta donde hibridan los oligonucleótidos específicos definidos en la presente.
Por "corresponde a" o "correspondiente a" en el contexto de polinucleótidos o polipéptidos se entiende un polinucleótido (a) que tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica o complementaria al total o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia o (b) que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos en un péptido o proteína. Esta frase también incluye dentro de su alcance un péptido o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos en un péptido o proteína de referencia. Los términos usados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen la "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de la identidad de secuencia", "sustancial identidad" y "idéntica", y se definen con respecto a un número definido de residuos de nucleótidos o aminoácidos o con preferencia respecto de la longitud completa. Los términos "identidad de secuencia" y "identidad" se usan en forma indistinta en la presente para referirse a la medida en que las secuencias son idénticas sobre una base de nucleótido-por-nucleótido o una base de aminoácido-por-aminoácido respecto de una ventana de comparación. En consecuencias, un "porcentaje de la identidad de secuencia" se calcula por la comparación de dos secuencias alineadas óptimamente respecto de la ventana de comparación, determinación del número de posiciones en las que aparecen bases de ácido nucleico idénticas (por ejemplo, A, T, C, G, U) o los residuos de aminoácidos idénticos (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, división del número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana), y multiplicación del resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.
El % de identidad de un polinucleótido se puede determinar por el análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización de la creación de brecha=5, y una penalización de extensión de la brecha =0,3. A menos que se indique lo contrario la secuencia incógnita tiene al menos 45 nucleótidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 45 nucleótidos. Con preferencia, la secuencia incógnita tiene al menos 150 nucleótidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 150 nucleótidos. Con más preferencia, la secuencia incógnita tiene al menos 300 nucleótidos de longitud y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 300 nucleótidos, o al menos 400, 500 o 600 nucleótidos en cada caso. También se hace referencia a la familia de programas BLAST de acuerdo con el ejemplo divulgado por Altschul et al., 1997. Una discusión detallada del análisis de secuencia se puede hallar en la Unidad 19.3 de Ausubel et al., 1994-1998, capítulo 15.
Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos se indican como "esencialmente similares" cuando tales secuencias tienen una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 95 %, en particular al menos aproximadamente 98 %, más particularmente al menos aproximadamente 98,5 %, quite en particular aproximadamente 99 %, en especial aproximadamente 99,5 %, más especialmente aproximadamente 100 %, completamente especial son idénticas. Es evidente que cuando las secuencias de ARN se describen como esencialmente similares a, o tienen un cierto grado de identidad de secuencia con, las secuencias de ADN, timina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN.
Con respecto a los polinucleótidos definidos, se apreciará que las cifras de % de identidad más altas que las provistas abarcaran las formas de realización preferidas. En consecuencia, cuando sea aplicable, a la luz de las mínimas cifras del % de identidad, se prefiere que el polinucleótido comprenda una secuencia de polinucleótidos que es al menos 75 %, con más preferencia al menos 80 %, con más preferencia al menos 85 %, con más preferencia al menos 90 %, con más preferencia al menos 91 %, con más preferencia al menos 92 %, con más pref menos 93 %, con más preferencia al menos 94 %, con más preferencia al menos 95 %, con más pref menos 96 %, con más preferencia al menos 97 %, con más preferencia al menos 98 %, con más pref menos 99 %, con más preferencia al menos 99,1 %, con más preferencia al menos 99,2 %, con más preferencia al menos 99,3 %, con más preferencia al menos 99,4 %, con más preferencia al menos 99,5 %, con más preferencia al menos 99,6 %, con más preferencia al menos 99,7 %, con más preferencia al menos 99,8 %, e incluso con más preferencia al menos 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO nominada relevante.
Como se usa en la presente, un "gen quimérico" o "constructo genético" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo en su lugar nativo, es decir, se ha manipulado artificialmente, que incluye un gen quimérico o constructo genético que se integra en el genoma del trigo. Normalmente un gen quimérico o constructo genético comprende secuencias regulatorias y codificadoras transcriptas o proteína que no se hallan juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico o constructo genético puede comprender secuencias regulatorias y secuencias codificadoras que derivan de fuentes diferentes, o secuencias regulatorias y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente que la hallada en la naturaleza. El término "endógeno" se usa en la presente para referirse a una sustancia que se produce en una planta no modificada en la misma etapa de desarrollo que la planta bajo investigación, con preferencia una planta de trigo, tal como almidón o una SBEIIa o SBEIIb. Un "gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su lugar natural en el genoma de un organismo, con preferencia un gen de SBEIIa o SBEIIb en una planta de trigo. Como se usa en la presente, "molécula de ácido nucleico recombinante" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha construido o modificado por tecnología de ADN recombinante. Los términos "polinucleótido extraño" o "polinucleótido exógeno" o "polinucleótido heterólogo" y similares se refieren a cualquier ácido nucleico que se introduce en el genoma de una célula por manipulaciones experimentales, con preferencia el genoma del trigo, pero que no se produce naturalmente en la célula. Estas incluyen las formas modificadas de las secuencias génicas halladas en esta célula siempre que el gen introducido contenga alguna modificación, por ejemplo, una mutación introducida o la presencia de un gen del marcador seleccionable, con respecto al gen natural. Los genes extraños o exógenos pueden ser genes hallados en la naturaleza que se insertan en un organismo no nativo, genes nativos introducidos en una nueva ubicación dentro del huésped nativo, o genes quiméricos o constructos genéticos. Un "transgén" es un gen que se ha introducido en el genoma por un procedimiento de transformación. El término "genéticamente modificado" incluye introducir genes en las células, mutar genes de las células y alterar o modular la regulación de un gen en una célula u organismos en que estos actos se han realizado o su progenie.
En algunas formas de realización, el nivel de actividad de ramificación del almidón endógeno u otra actividad enzimática se modula por la disminución del nivel de expresión de los genes que codifica proteínas involucradas en estas actividades en la planta de trigo, o aumentar el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima en una planta de trigo. El aumento de la expresión se puede lograr en el nivel de transcripción por el uso de promotores de diferentes concentraciones o promotores inducibles, que son capaces de controlar el nivel de transcripto expresado de la secuencia codificadora. Se pueden introducir secuencias heterólogas que codifican factores de transcripción que modulan o potencian la expresión de genes cuyos productos regulan por disminución del almidón ramificación. El nivel de expresión del gen se puede modular por la alteración del número de copias por célula de un constructo que comprende la secuencia codificadora y un elemento de control de transcripción que está conectado operativamente a esto y que es funcional en la célula. De modo alternativo, una pluralidad de transformantes se puede seleccionar, y detectar con un nivel y/o especificidad favorable de la expresión del transgén que surge de las influencias de secuencias endógenas en la vecindad del sitio de integración del transgén. Un nivel y patrón favorable de la expresión del transgén es uno que produce un aumento sustancial de la síntesis de almidón o el contenido de amilosa en la planta de trigo. Esto se puede detectar por un ensayo simple de transformantes.
La reducción de la expresión del gen se puede lograr a través de la introducción y transcripción de un "gen quimérico por silenciamiento génico" introducido en la planta de trigo. El gen quimérico por silenciamiento génico con preferencia se introduce en forma estable en el genoma del trigo, con preferencia el genoma nuclear del trigo. Como se usa en la presente "efecto de silenciamiento génico" se refiere a la reducción de la expresión de un ácido nucleico blanco en una célula de trigo, con preferencia una célula del endospermo, que se puede obtener por la introducción de un ARN de silenciamiento. En una forma de realización preferida, se introduce un gen quimérico por silenciamiento génico que codifica una molécula de ARN que reduce la expresión de uno o más genes endógenos, con preferencia los genes SBEIIa y/o SBEIIb. Los genes blanco del trigo también incluyen los genes listados en la
Tabla 1. Tal reducción puede ser el resultado de la reducción de la transcripción, que incluye por medio de la metilación de la remodelación de la cromatina, o modificación post-transcripción de las moléculas de ARN, que incluye por medio de la degradación del ARN, o ambos. El silenciamiento génico no se debe interpretar necesariamente como una abolición de la expresión del ácido nucleico o gen blanco. Es suficiente que el nivel de expresión del ácido nucleico blanco en presencia del ARN silenciamiento es más bajo que en su ausencia. El nivel de expresión del gen dirigido se puede reducir en al menos aproximadamente 40 % o al menos aproximadamente 45 % o al menos aproximadamente 50 % o al menos aproximadamente 55 % o al menos aproximadamente 60 % o al menos aproximadamente 65 % o al menos aproximadamente 70 % o al menos aproximadamente 75 % o al menos aproximadamente 80 % o al menos aproximadamente 85 % o al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 95 % o efectivamente anulado a un nivel no detectable.
Como se usa en la presente, "molécula de ARNsd introducida artificialmente" se refiere a la introducción de una molécula de ARN de cadena doble (ARNsd), que con preferencia se sintetiza en la célula de trigo por la transcripción de un gen quimérico que codifica tal molécula de ARNsd. La interferencia de ARN (ARNi) es particularmente útil para reducir específicamente la expresión de un gen o inhibición de la producción de una proteína particular, también en el trigo (Regina et al., 2006). Esta tecnología depende de la presencia de las moléculas de ARNsd que contiene una secuencia que es esencialmente idéntica al ARNm del gen de interés o parte de esta, y su complemento, de este modo se forma un ARNsd. En forma conveniente el ARNsd se puede producir de un promotor único en la célula huésped, donde las secuencias sentido y antisentido se transcriben para producir un ARN de horquilla en que las secuencias sentido y antisentido se hibridan para formar la región de ARNsd con una secuencia relacionada (a un gen de SBEII) o no relacionada que forma una estructura de bucle, de modo que el ARN de horquilla comprende una estructura de tallo-bucle. El diseño y la producción de las moléculas de ARNsd adecuadas para la presente invención están dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, en particular considerando Waterhouse et al 1998; Smith et al., 2000; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 99/49029; y WO 01/34815.
El ADN que codifica el ARNsd normalmente comprende las secuencias sentido y antisentido dispuestas como una repetición invertida. En una forma de realización preferida, las secuencias sentido y antisentido están separadas por una región espaciadora que comprende un intrón que, cuando se transcribe en ARN, se empalma afuera. Se ha mostrado que esta disposición produce mayor eficiencia del silenciamiento del gen (Smith et al., 2000). La región de cadena doble puede comprender una o dos moléculas de ARN, transcriptas de una región o dos del ADN. El ARNsd se puede clasificar como ARNhp largo, que tiene regiones sentido y antisentido largas que puede ser complementarias en gran parte, pero que no necesitan ser totalmente complementarias (normalmente más grande de aproximadamente 200 pb, que varían entre 200-1000 pb). ARNhp también puede ser relativamente pequeño con la porción de cadena doble con un tamaño que varía de aproximadamente 30 a aproximadamente 42 pb, pero no mucho más larga que 94 pb (ver WO04/073390). Se considera que la presencia de la región de ARN de cadena doble desencadena una respuesta de un sistema de planta endógena que destruye el ARN de cadena doble y también el transcripto de ARN homólogo del gen de la planta blanco, lo que reduce o elimina eficientemente la actividad del gen blanco.
La longitud de las secuencias sentido y antisentido que se hibridan deben tener al menos 19 nucleótidos contiguos, con preferencia al menos 30 o 50 nucleótidos, y con más preferencia al menos 100, 200, 500 o 1000 nucleótidos. Se puede usar la secuencia de longitud completa correspondiente al transcripto del gen entero. Las longitudes tienen con máxima preferencia 100-2000 nucleótidos. El grado de identidad de las secuencias sentido y antisentido para el transcripto específico debe ser de al menos 85 %, con preferencia al menos 90 % y con más preferencia 95-100 %. Cuanto más larga la secuencia, menos riguroso el requerimiento para la identidad de secuencia total. La molécula de ARN obviamente puede comprender secuencias no relacionadas que pueden actuar para estabilizar la molécula. El promotor usado para expresar el constructo formador del ARNsd puede ser cualquier tipo de promotor que se expresa en las células que expresan el gen blanco. Cuando el gen blanco es SBEIIa o SBEIIb u otro gen expresado selectivamente en el endospermo, se prefiere un promotor del endospermo, de modo que no afecte la expresión del gen blanco en los otros tejidos.
Los ejemplos de moléculas de ARNsd que se pueden usar para regular por disminución los genes de SBEII se proporcionan en el Ejemplo 4.
Como se usa en la presente, "ARN de silenciamiento" son las moléculas de ARN que tienen 21 a 24 nucleótidos contiguos que son complementarios a una región del ARNm transcripto del gen blanco, con preferencia SBEIIa o SBEIIb. La secuencia de los 21 a 24 nucleótidos con preferencia es completamente complementaria a la secuencia de 21 a 24 nucleótidos contiguos del ARNm, es decir, idéntico al complemento de los 21 a 24 nucleótidos de la región del ARNm. Sin embargo, también se pueden usar secuencias de ARNmi que tienen hasta cinco apareamientos erróneos en la región del ARNm (Palatnik et al., 2003), y el apareamiento de bases puede involucrar uno o dos pares de bases G-U. Cuando no todos los 21 a 24 nucleótidos del ARN de silenciamiento son capaces de aparear las bases con el ARNm, se prefiere que existan solo uno o dos apareamientos erróneos entre los 21 a 24 nucleótidos del ARN de silenciamiento y la región del ARNm. Con respecto a los ARNml, se prefiere que cualquier apareamiento erróneo, hasta un máximo de cinco, se hallan hacia el extremo 3' del ARNmi. En una forma de realización preferida, o existen más de uno o dos apareamientos erróneos entre las secuencias del ARN de silenciamiento y su ARNm blanco.
Los ARN de silenciamiento derivan de moléculas de ARN más largas que son codificadas por los ADN quiméricos de la invención. Las moléculas de ARN más largas, también mencionadas en la presente como "ARN precursores", son los productos iniciales producidos por la transcripción de los ADN quiméricos de las células de trigo y tienen carácter de cadena doble parcial formada por el apareamiento de bases intramolecular entre las regiones complementarias. Los ARN precursores se procesan con una clase especializada de ARNsas, comúnmente llamadas "Dícer", en los ARN de silenciamiento, normalmente de 21 a 24 nucleótidos de largo. Los ARN de silenciamiento como se usan en la presente incluyen ARN de interferencia cortas (ARNsi) y los microARN (ARNmi), que difieren en su biosíntesis. Los ARNsi derivan de ARN de cadena doble total o parcial que tienen al menos 21 pares de bases contiguos, que incluyen posibles pares de bases G-U, sin apareamientos erróneos o nucleótidos con bases no apareadas sobresalientes de la región de cadena doble. Estos ARN de cadena doble se forman de un transcripto autocomplementario único que se forma por el replegado sobre sí mismo y formar una estructura de tallo-bucle, mencionado en la presente como un "ARN de horquilla", o de dos ARN separados que son al menos parcialmente complementarios y que se hibridan para formar una región del ARN de cadena doble. Los ARNmi se producen por el procesamiento de transcriptos de cadena simple más larga que incluyen regiones complementarias que no son completamente complementarias y así forman una estructura con apareamiento de bases imperfecto, de este modo tienen apareamientos erróneos o nucleótidos con bases no apareadas dentro de la estructura de cadena doble parcial. La estructura con apareamiento de bases también puede incluir pares de bases G-U. El procesamiento de los precursores ARN para formar los ARNmi lleva a la acumulación preferencial de un ARN pequeño, distinto que tiene una secuencia específica, el ARNmi. Se deriva de una cadena del ARN precursor, normalmente la cadena "antisentido" del ARN precursor, mientras que el procesamiento del ARN precursor complementario largo para formar los ARNsi produce una población de ARNsi que no son de secuencia uniforme, pero corresponden a muchas porciones y de ambas cadenas del precursor.
Los ARNmi se descubrieron primero como un ARN regulatorio pequeño que controla el gen lin-4 en C. elegans (Lee et al., 1993). Desde entonces, se han informado que grandes cantidades de otros ARNmi naturales están involucrados en la función de la regulación del gen en animales y plantas. Los ARN precursores ARNmi de la invención, también denominadas en la presente como "precursores de ARNmi artificiales", derivan normalmente de ARNmi precursores naturales por la alteración de la secuencia de nucleótidos de la porción del ARNmi del precursor natural de modo que es complementario, con preferencia completamente complementario, con la región de 21 a 24 nucleótidos del ARNm blanco, y alterar la secuencia de nucleótidos de la región complementaria del ARNmi precursor que aparea las bases con la secuencia de ARNmi para mantener el apareamiento de bases. El resto del ARN precursor ARNmi no se puede alterar y de este modo tiene la misma secuencia que el precursor de ARNmi natural o también se puede alterar en la secuencia por sustituciones del nucleótido, inserciones del nucleótido, o con preferencia supresiones del nucleótido, o cualquier combinación de estos. Se considera que el resto del ARN precursor ARNmi está involucrado en el reconocimiento de la estructura por la enzima Dícer llamada Dicer tipo 1 (DCL1), y en consecuencia se prefiere que se realicen pocos o ningún cambio en el resto de la estructura. Por ejemplo, los nucleótidos con bases apareadas se pueden sustituir con otros nucleótidos con bases apareadas sin mayores cambios en la estructura total. El ARNmi precursor natural el cual deriva el ARNmi precursor artificial de la invención puede ser del trigo, otra planta tal como otra planta de cereal o fuentes no vegetales. Los ejemplos de tales ARN precursores son el precursor de arroz mi395, el precursor de Arabidopsis mi159b, o el precursor de mi172.
Se han demostrado ARNmi artificiales en las plantas, por ejemplo, Alvarez et al., 2006; Parizotto et al., 2004; Schwab et al.
Alguna de estas tecnologías para reducir la expresión del gen se puede usar para reducir coordinadamente la actividad de múltiples genes. Por ejemplo, una molécula de ARN se puede dirigir contra una familia de genes relacionados por el direccionamiento a una región de los genes que está en común. De modo alternativo, los genes no relacionados se pueden dirigir por la inclusión de regiones múltiples en una molécula de molécula de ARN, cada región que se dirige a un gen diferente. Esto se puede realizar fácilmente por la fusión de las múltiples regiones bajo el control de un solo promotor.
Numerosas técnicas están disponibles para la introducción de las moléculas de ácido nucleico en una célula de trigo, bien conocido por los trabajadores en la técnica. El término "transformación" como se usa en la presente significa alteración del genotipo de una célula, por ejemplo, una bacteria o una planta, en particular una planta de trigo, por la introducción de un ácido nucleico extraño o exógeno. Por "transformante" se entiende un organismo alterado de este modo. La introducción del ADN en una planta de trigo por el cruzamiento de plantas progenitoras o por mutagénesis per se no se incluyen en la transformación. Como se usa en la presente el término "transgénico" se refiere a una planta modificada genéticamente en la que el genoma endógeno se suplementa o modifica por la integración aleatoria o dirigido al sitio o mantenimiento estable en una forma no integrada no replicable, de un gen o transgén extraño o exógeno introducido. Por "transgén" se entiende un gen o secuencia extraña o exógena que se introduce en una planta. La molécula de ácido nucleico se puede replicar como elemento extracromosómico o con preferencia se integra en forma estable en el genoma de la planta. Por "genoma" se entiende el complemento genético heredado total de la célula, plante o parte de planta e incluye las moléculas de ADN cromosómico, ADN del plástido, ADN mitocondrial y ADN extracromosómico ADN. En una forma de realización, un transgén está integrado en el genoma nuclear del trigo en que el trigo hexaploide incluye los subgenomas A, B y D, en la presente mencionados como "genomas" A, B y D.
Los métodos usados más comúnmente para producir plantas transgénicas de trigo fértiles comprenden dos etapas: la administración del ADN en células de trigo regenerables y la regeneración de la planta a través del cultivo de tejido in vitro. Dos métodos usados comúnmente para administrar el ADN: transferencia del T-ADN usando Agrobacterium tumefaciens o bacterias relacionadas y la introducción directa del ADN por medio del bombardeo de partículas, aunque se pueden usar otros métodos para integrar las secuencias de ADN en el trigo u otros cereales. Será evidente para los expertos que la elección particular de un sistema de transformación para introducir un constructo de ácido nucleico en las células de planta no es esencial o una limitación de la invención, con la condición de obtener un nivel aceptable de transferencia del ácido nucleico. Tales técnicas para el trigo son bien conocidas en la materia.
Las plantas de trigo transformadas se pueden producir por la introducción de un constructo de ácido nucleico en una célula receptora y cultivar una nueva planta que comprende y expresa un polinucleótido. El proceso de cultivar una nueva planta a partir de una célula transformada que está en cultivo celular se menciona en la presente como "regeneración". Las células de trigo regenerables incluyen células de embriones maduros, tejido meristemático tal como las células del mesófilo de la base de la hoja o con preferencia del escutelo de los embriones inmaduros, obtenidos 12-20 días pos-antesis, o callo derivado de cualquiera de estos. La vía más comúnmente usada para recuperar plantas de trigo regeneradas es la embriogénesis somática en medios tales como MS-agar suplementado con una auxina tal como 2,4-D y un nivel bajo de citoquinina, ver Sparks y Jones 2004).
La transformación mediada por Agrobacterium del trigo se puede realizar por los métodos de Cheng et al., 1997; Weir et al2001; Kanna y Daggard, 2003 o Wu et al., 2003. Se puede usar cualquier cepa de Agrobacterium con suficiente virulencia, con preferencia cepas que tienen funciones del gen de virulencia adicionales tales como LBA4404, AGL0 o AGL1 (Lazo et al., 1991) o versiones de C58. Las bacterias relacionadas con el Agrobacterium también se pueden usar. El ADN que se transfiere (T-ADN) del Agrobacterium a las células de trigo receptoras está comprendido en un constructo genético (plásmido quimérico) que contiene una o dos regiones límite de una región de ADN-T de un plásmido Ti tipo salvaje que flanquea el ácido nucleico por transferir. El constructo genético puede contener dos o más T-ADN, por ejemplo, cuando un T-ADN contiene el gen de interés y un segundo T-ADN contiene un gen del marcador seleccionable, lo que proporciona la inserción independiente de los dos T-ADN y la posible segregación del gen del marcador seleccionable lejos del transgén de interés.
Se puede usar cualquier tipo de trigo que es regenerable; se han informado variedades Bob White, Fielder, Veery-5, Cadenza y Florida con éxito. Los eventos de transformación en una o más de estas variedades más fácilmente regenerables se pueden transferir a cualquier otro cultivar de trigo que incluye las variedades de elite por retrocruza estándar. Un método alternativo que usa Agrobacterium utiliza un método de inoculación in vivo seguido por la regeneración y selección de plantas transformadas usando cultivo de tejido y se ha comprobado que es eficiente, ver WO00/63398. Otros métodos que involucran el uso de Agrobacterium incluyen: co-cultivo de Agrobacterium con protoplastos aislados cultivados; transformación de semillas, ápices o meristemas con Agrobacterium, o inoculación in planta tal como el método de inmersión floral para Arabidopsis descripto en Bechtold et al., 1993. Este último abordaje se basa en la infiltración con vacuna de una suspensión de las células de Agrobacterium. De modo alternativo, el constructo quimérico se puede introducir usando plásmidos inductores de raíz (Ri) de Agrobacterium como vectores.
Otro método comúnmente usado para introducir el constructo de ácido nucleico en una célula de planta es la penetración balística de alta velocidad por partículas pequeñas (también conocidas como bombardeo de partículas o bombardeo de microproyectiles) con el ácido nucleico por introducir contenido dentro de la matriz de perlas o partículas pequeñas, o en su superficie, como, por ejemplo, descripto por Klein et al., 1987. Este método se ha adaptado para el trigo (Vasil,). Se puede usar el bombardeo de microproyectiles para inducir la lesión seguido por el cocultivo con Agrobacterium (EP-A-486233). El constructo genético también se puede introducir en las células de planta por electroporación como, por ejemplo, se describe en Fromm et al., 1985 y Shimamoto et al., 1989. De modo alternativo, el constructo de ácido nucleico se puede introducir en una célula de trigo tal como una célula de polen por el contacto de la célula con el ácido nucleico usando medios mecánicos o químicos.
Los genes marcadores seleccionables preferidos para usar en la transformación del trigo incluyen el gen bar de Streptomyces hygroscopicus o gen pat en conjunto con la selección mediante el herbicida glufosinato de amonio, el gen hpt en conjunto con el antibiótico higromicina, o el gen nptII con kanamicina o G418. De modo alternativo, se pueden usar marcadores seleccionables positivos tales como el gen manA que codifica fosfomanosa isomerasa (PMI) con el azúcar manosa-6 -fosfato somo fuente sola C.
La presente invención se describe adicionalmente con los siguientes Ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1: MÉTODOS y MATERIALES
Determinación y análisis de carbohidratos
El almidón se aisló en pequeña escala de grano de trigo en desarrollo y maduro usando el método de Regina et al., 2006. La extracción de almidón en gran escala se llevó a cabo siguiendo el método de Regina et al., 2004. El contenido de almidón se determinó usando el kit de análisis total de almidón provisto por Megazyme (Bray, Co Wicklow, República de Irlanda) y se calculó sobre una base de peso como porcentaje del peso del grano no molido, maduro. El contenido de almidón luego se comparó con las plantas control. La sustracción del peso de almidón del peso de grano total para dar un contenido de no almidón total de grano determinó si la reducción del peso total se debió a una reducción del contenido de almidón.
El contenido de amilosa de las muestras de almidón se determinó por el método colorimétrico (yodométrico) de Morrison y Laignelet, 1983 con ligeras modificaciones de la siguiente manera. Se pesaron aproximadamente 2 mg de almidón con precisión (precisión a 0,1 mg) en un tubo a rosca de ml provisto de una junta de goma en la tapa. Para eliminar los lípidos, se mezcló 1 ml de 85 % (v/v) de metanol con el almidón y el tubo se calentó en un baño de agua de 65°C durante 1 hora con agitación en vórtex ocasional. Después de la centrifugación a 13.000 g durante 5 min, el sobrenadante se extrajo con cuidado y se repitieron las etapas de extracción. El almidón luego se secó a 65°C durante 1 hora y se disolvió en una solución de urea-dimetil sulfóxido (UDMSO; 9 volúmenes de dimetil sulfóxido a 1 volumen de urea 6 M), usando 1 ml de UDMSO per 2 mg de almidón (pesado como antes). La mezcla inmediatamente se agitó en vórtex vigorosamente y se incubó en un baño de agua 95°C durante 1 hora con agitación en vórtex intermitente para la disolución completa del almidón. Una alícuota de la solución de almidón-UDMSO (50 μl) se trató con 20 μl de reactivo I2-KI que contenía 2 mg de yodo y 20 mg de yoduro de potasio per ml de agua. La mezcla se llevó a 1 ml con agua. Se midió la absorbancia de la mezcla a 620 nm por la transferencia de 200 μl a la microplaca y se leyó la absorbancia usando un lector de microplaca de precisión Emax (Molecular Devices, USA). Las muestras estándares que contienen de 0 a 100 % de amilosa y 100 % a 0 % de amilopectina se obtuvieron de amilosa de papa y amilopectina de maíz (o papa) (Sigma) y se trataron como para las muestras de ensayo. Se determinó el contenido de amilosa (porcentaje de amilosa) a partir de los valores de absorbancia usando una ecuación de regresión derivada de las absorbancias para las muestras estándares. El análisis de la relación de amilosa/amilopectina de los almidones no desramificados también se pueden llevar a cabo de acuerdo con Case et al., Journal of Cereal Science 27: 301-314, 1998 o por un método de HPLC usando 90 % de DMSO para separar almidones desramificados como se describe en Batey y Curtin, 1996.
El análisis estadístico de los datos de amilosa se llevó a cabo mediante 8 ' edición de Genstat para Windows (VSN International Ltd, Herts, UK).
La distribución de las longitudes de cadena en el almidón se analizó por electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforo (FACE) usando un kit de electroforesis capilar de acuerdo con Morell et al., 1998, después de la desramificación de las muestras de almidón. Los perfiles de la temperatura de gelatinización de las muestras de almidón se midieron en un calorímetro de barrido diferencial Pyris 1 (Perkin Elmer, Norwalk CT, USA). La viscosidad de las soluciones de almidón se midó en un Rapid-Visco-Analyser (RVA, Newport Scientific Pty Ltd, Warriewood, Sydney), por ejemplo, usando condiciones como se informan en Batey et al., 1997. Los parámetros medidos incluyeron viscosidad pico (la viscosidad de la pasta caliente máxima), fuerza de sujeción, viscosidad final y temperatura de la pasta. El volumen de hinchamiento de la harina o almidón se determinó de acuerdo con el método de Konik-Rose et al., 2001. La absorción de agua se midió por el pesado de la muestra antes y después de mezclar la muestra de harina o almidón en agua a temperaturas definidas y siguiente recolección del material gelatinizado. La morfología del gránulo de almidón se analizó por microscopía. Las suspensiones del gránulo de almidón purificado en agua se examinaron bajo luz normal y polarizada usando un microscopio compuesto Leica-DMR para determinar la morfología del gránulo de almidón. La microscopía de barrido electrónico se llevó a cabo usando un instrumento Joel JSM 35C. Los almidones purificados se recubrieron por atomización con oro y se escanearon a 15 kV a temperatura ambiente.
Se determinaron los niveles de p-Glucano usando el kit provisto por Megazyme (Bray, Co, Wicklow, República de Irlanda).
Análisis de la expresión de proteína en el endospermo.
La expresión específica de las proteínas de SBEI, SBEIIa y SBEIIb en el endospermo, en particular el nivel de expresión o acumulación de estas proteínas se analizó por procedimientos de transferencia Western. El endospermo se seccionó de todos los tejidos maternos y las muestras de aproximadamente 0 ,2 mg se homogenizaron en 600 μl de 50 mM de buffer fosfato de K (42 mM de K2HPO4 y 8 mM de KH2PO4), pH 7,5, que contiene 5 mM de E D t A , 20 % de glicerol, 5 mM de DTT y 1 mM de Pefabloc. Las muestras molidas se centrifugaron durante 10 minutos a 13.000 g y el sobrenadante se alicuotó y congeló a -80°C hasta el uso. Para la estimación de la proteína total, se montó una curva estándar de BSA usando alícuotas de 0, 20, 40, 60, 80 y 100 μl de 0,25 mg/ml de estándar de BSA. Las muestras (3 μl) se llevaron a 100 μl con agua destilada y se añadió 1 ml de reactivo Coomassie Plus Proteína a cada una. Se leyó la absorbancia después de 5 min a 595 nm, usando la muestra de BSA cero de la curva estándar como el blanco, y se determinaron los niveles de proteína en las muestras. Las muestras que contienen 20 μg de proteína total de cada endospermo se corrieron en un gel de poliacrilamida 8 % no desnaturalizante que contiene 0,34 M de Tris-HCl (pH 8 ,8 ), acrilamida (8,0 %), persulfato de amonio (0,06 %) y TEMED (0,1 %). Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de acuerdo con Morell et al., 1997 e inmunorreaccionaron con los anticuerpos específicos de SBEIIa, SBEIIb o SBEI. El antisuero contra la proteína de trigo SBEII (anti-wBEIIa) se generó usando un péptido sintético que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia N-terminal del SBEIIa de trigo maduro, AASPGKVLVPDg Es DDL (SEQ ID NO: 16) (Rahman et al., 2001). El antisuero contra la proteína de trigo SBEIIb (anti-wBEIIb) se generó de manera análoga usando el péptido sintético N-terminal, AGGPSGEVMI (SEQ ID NO: 17) (Regina et al., 2005).
Se consideró que este péptido representa la secuencia N-terminal del péptido de SBEIIb maduro y además fue idéntico al extremo N-terminal de la proteína de cebada SBEIIb (Sun et al., 1998). Un anticuerpo policlonal contra el trigo SBEI se sintetizó de una manera análoga usando el péptido sintético N-terminal VSAPRDYTMATAEDGV (SEQ ID NO: 18) (Morell et al., 1997). Tales antisueros se obtuvieron de conejos inmunizados con los péptidos sintéticos de acuerdo con métodos estándares.
Ensayo enzimático para SBE
Los ensayos de actividad enzimática de las enzimas de ramificación para detectar la actividad de las tres isoformas, SBEI, SBEIIa y SBEIIb se basó sobre el método de Nishi et al., 2001 con modificación menos. Después de la electroforesis, el gel se lavó dos veces en 50 mM de HEPES, pH 7,0 que contiene 10 % de glicerol y se incubó a temperatura ambiente en una mezcla de reacción que consiste en 50 mM de HEPES, pH 7,4, 50 mM de glucosa-1-fosfato, 2,5 mM de AMP, 10 % de glicerol, 50 U de fosforilasa a 1 mM de DTT y 0,08 % de maltotriosa durante 16 horas. Las bandas se visualizaron con una solución de 0,2 % (PN) I2 y 2 % de KI. Las actividades específicas de las isoformas SBEI, SBEIIa y SBEIIb se separaron en estas condiciones de electroforesis. Esto se confirmó por inmunotransferencia usando los anticuerpos anti-SBEI, anti-SBEIIa y anti-SBEIIb. El análisis densitométrico de las inmunotransferencias usando el paquete de software TotalLab (Nonlinear Dynamics Ltd, Newcastle, UK) que mide la intensidad de cada banda se realizó para determinar el nivel de actividad enzimática de cada isoforma.
La actividad de la enzima ramificadora de almidón (SBE) se puede medir por el ensayo enzimático, por ejemplo, por el ensayo de estimulación de la fosforilasa (Boyer y Preiss, 1978). Este ensayo mide la estimulación por SBE de la incorporación de glucosa 1-fosfato en polímero insoluble en metanol (a-D-glucano) por la fosforilasa A. La actividad de las isoformas específicas de SBE se puede medir por este ensayo después de la purificación de las isoformas individuales que se describe en Regina et al., 2004. Los extractos de proteína soluble totales se aplicaron a 3 ml una columna de afinidad de p-ciclodextrina (p-CD) preequilibrada con el buffer de extracción descripto anteriormente. La columna se preparó por el acoplamiento de p-CD a sefarosa 6 B activada con epoxi (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las proteínas unidas (que contienen SBE) se eluyeron usando 1 % de p-CD en buffer fosfato y luego se dializó contra buffer A (20 mM de buffer fosfato, pH 8,0, 1 mM de EDTA y 1 mM de DTT). Las muestras dializadas se sometieron a cromatografía de intercambio iónico usando 1 ml de columna MonoQ (Amersham Pharmacia), preequilibrada con buffer A. Después de la elución de las proteínas no unidas, se aplicó un gradiente lineal de 30 min por la introducción de buffer B (500 mM de buffer fosfato, pH 8,0, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT) en buffer A para eluir las proteínas unidas.
La actividad de SBE también se puede medir por el ensayo de tinción de yodo, que mide la disminución de absorbancia de un complejo de glucano-poliyodo resultante de la ramificación de polímeros de glucano. La actividad de SBE también se puede evaluar por el ensayo de unión de la rama que mide la generación de los extremos reductores a partir de amilosa reducida como sustrato, después de la digestión de la isoamilosa (Takeda et al., 1993a). Con preferencia, la actividad se mide en ausencia de actividad de SBEI. Las isoformas de SBE muestran diferentes especificidades de sustrato, por ejemplo, SBEI exhibe mayor actividad en la ramificación de amilosa, mientras que SBEIIa y SBEIIb muestras tasas de ramificación superiores con un sustrato de amilopectina. Las isoformas también se pueden distinguir sobre la base de la longitud de la cadena de glucano que se transfiere. La proteína SBE también se puede medir por el uso de anticuerpos específicos tales como los que describen en la presente. Con preferencia, la actividad SBEII se mide durante el desarrollo del grano en el endospermo en desarrollo. Los niveles de la proteína SBEII con preferencia se miden en el grano maduro donde la proteína está todavía presente por métodos inmunológicos tales como análisis de transferencia Western.
Análisis del ADN de las plantas de trigo
El análisis PCR de las plantas de trigo transformadas o de las plantas que se analizan para determinar la presencia de los transgenes se realizó sobre el ADN genómico extraído de 1-2 cm2 de material de hoja fresco usando el método mini-prep descripto por Stacey y Isaac, 1994. Los ensayos de PCR para determinar la presencia de los constructos del Ar N de horquilla usaron los cebadores SBEIIa-For: 5'-CCCGCTGCTTTCGCTCATTTTG-3' (SEQ ID NO: 19) y SBEIIa-Rev: 5'-GACTACCGGAGCTCCCACCTTC-3' (SEQ ID NO: 20) diseñados para amplificar un fragmento (462 pb) del gen de SBEIIa. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: "inicio en caliente" (94 °C, 3 min) seguido por 30 ciclos de desnaturalización (95 °C, 30 sec), apareamiento (55 °C, 30 sec), extensión (73 °C, 2 min) seguido por 1 ciclo a 73 °C (5 min). Los productos de reacción se analizaron con electroforesis por agarosa o poliacrilamida.
El análisis de hibridación de transferencia Southern se realizó en ADN a partir de una extracción en gran escala (9 ml) de tejido fundamental liofilizado (Stacey y Isaac, 1994). Las muestras de ADN se ajustaron a 0,2 mg/ml y se digirieron con enzimas de restricción tales como HindIII, EcoRI y KpnI. La digestión con la enzima de restricción, electroforesis en gel y transferencia al vacío se llevan a cabo como se describe en Stacey y Isaac, 1994. Las sondas marcadas con digoxigenina que incluyen la región del intrón 3 de los constructos de ds-SBEII se producen por PCr de acuerdo con el método de McCreery y Helentjaris, 1994. La hibridación de las sondas a para la transferencia Southern y la detección por quimioluminiscencia se realizaron de acuerdo con el método de McCreery y Helentjaris, 1994.
Transformación de trigo por Agrobactaerium
Los constructos genéticos para la transformación de trigo se introdujeron por electroporación en la cepa desarmada de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 portadora del plásmido vir pAL4404 y pSB1, con selección posterior en el medio con espectinomicina. Las cepas de Agrobacterium transformadas se incubaron en medio de YEP solidificado a 27 °C durante 2 días. Las bacterias luego se recolectaron y resuspendieron en TSIM1 (medio MS con 100 mg/l mio-inositol, 10 g/l de glucosa, 50 mg/l de buffer MES pH5,5) que contiene 400 mM de acetosiringona a una densidad óptica de 2,4 a 650 nm para la inoculación de trigo.
Las plantas de trigo (variedad NB1, una variedad de trigo de primavera obtenida de Nickerson Seeds Ltd, Rothwell, Lincs.) se cultivaron en un invernadero a una temperatura de 22/15 °C día/noche con suplementación de luz para dar un día de 16 horas. Los macollos se recolectaron aproximadamente 14 días pos-antesis (embriones aproximadamente 1 mm de longitud) para incluir 50 cm de vástago del macollo. Todas las hojas luego se retiraron de los macollos excepto la hoja bandera, que se limpió para eliminar las esporas fúngicas contaminantes. Luego se extrajeron con cuidado las glumas de cada espiguilla y el lema de los primeros dos flósculos para exponer la semilla inmadura. En general, solo estas dos semillas de cada espiguilla estaban no cubiertas. Este procedimiento se realizó a lo largo de la longitud completa de la inflorescencia. Luego las espigas se rociaron con 70 % de IMS como una breve esterilización de superficie.
Las suspensiones de Agrobacterium (1 pl) se inocularon usando una jeringa Hamilton de 10 μl en la semilla inmadura aproximadamente en la posición de la interfaz de escutelo:endospermo de modo que se inocularon las semillas expuestas. Los macollos luego se colocaron en agua, se cubrieron con una bolsa de plástico translúcida para evitar la deshidratación de la semilla, y se coloca en una incubadora encendida durante 3 días a 23 °C, 16 horas por día, 45 pEmrVPAR. Después de 3 días de cocultivo, las semillas inmaduras inoculadas se extrajeron y esterilizaron en superficie con 70 % de etanol (30 seg), luego 20 % de blanqueado (Domestos, 20 min), seguido por medio de lavado en agua destilada estéril. Los embriones inmaduros se aislaron asépticamente y colocaron en el medio W3 (MS suplementado con 20 g/l de sacarosa y 2 mg/l de 2,4-D y solidificaron con 6 g/l de agarosa Tipo I, Sigma) con la adición de 150 mg/l de Timentina (medio W3T) y con el escutelo más alto (20 embriones por placa). Los cultivos se colocaron a 25 °C a la luz (16 horas día, 80 pEmr2s'1PAR). El desarrollo del eje embrionario sobre los embriones se evaluó aproximadamente 5 días después del aislamiento y se extrajo el eje cuando sea necesario para mejorar la producción del callo. Los embriones se mantuvieron en W3T durante 4 semanas, con una transferencia al medio fresco a 2 semanas pos-aislamiento y se evaluó la capacidad embriogénica.
Después de 4 semanas de cultivo, el callo derivado de los embriones inoculados fue muy similar al callo control obtenido de los embriones no inoculados sembrados en el medio de W3T. La presencia de las bacterias no pareció tener capacidad embriogénica sustancialmente reducida del callo derivado de los embriones inoculados. Los callos embrionarios se transfirieron al medio W3 con 2 mg/l de Asulam o geneticina a razón de 25 mg/l y 150 mg/l de Timentina (medio W32AT). Los callos se mantuvieron en este medio durante 2 semanas adicionales y luego cada callo se dividió en trozos de 2 mm de tamaño y se re-sembraron en W32AT. Los embriones de control derivados de las inoculaciones con el LBA4404 sin constructos del vector binario no produjeron el callo transformado sobre el medio de selección.
Después de 2 semanas adicionales de cultivo, se evaluó todo el tejido para el desarrollo del callo embriogénico: cualquier callo que muestra signos de desarrollo continuado después de 4 semanas de selección se transfirió al medio de regeneración (RMT - MS con 40 g/l de maltosa y 150 mg/l de Timentina, pH 5,8, solidificado con 6 g/l de agarosa, Sigma tipo 1). Los brotes se regeneraron dentro de 4 semanas en este medio y luego se transfirieron a MS30 con 150 mg/l de Timentina para la elongación de brotes y enraizamiento. Las plantas juveniles luego se transfirieron a la mezcla del suelo y se mantuvieron sobre un banco de nebulización durante dos semanas y finalmente se transfirieron a un invernadero.
Las cepas de Agrobacterium alternativas tales como la cepa AGL1 o marcadores seleccionables tales como genes que codifican la resistencia a higromicina también se pueden usar en este método.
Ejemplo 2: Inhibición de los genes SBEIIa en trigo mediante cuatro constructos de ARN de horquilla
Se obtuvieron cuatro constructos de ARN de horquilla (ARNsd) para reducir la expresión de i) la SBEIIa, o ii) los genes de SBEIIa, SBEIIb y SBEI de trigo. En cada constructo, el ADN que codifica el ARN de horquilla se ligó a una secuencia promotora de glutenina de alto peso molecular (HMWG) obtenida de un gen Dx5 de trigo para proporcionar la expresión específica del endospermo del ARN de horquilla, y una secuencia terminadora de la transcripción del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium (nos3'). Este promotor proporcionó la expresión específica del endospermo de los genes sintéticos que codifican los ARN de horquilla.
hp5'-SBEIIa. La construcción y el uso del primero de los constructos, denominados como hp5'-SBEIIa, se describen en Regina et al., 2006. El constructo hp5'-SBEIIa contenía 1536 pb de la secuencia de nucleótidos amplificada por PCR del gen de SBEIIa de trigo (Acceso Genbank número AF338431). Este incluyó una secuencia de 468 pb que comprende el total de los exones 1 y 2 y parte del exón 3 (posiciones de nucleótido 1058 a 1336, 1664 a 1761 y 2038 a 2219 (que incluye las posiciones de nucleótido 1 a 578 de ADNc de Aegilops tauschii que codifica SBEIIa, Acceso Genbank número AF338431,1) con sitios de restricción EcoRI y KpnI en cada lado (fragmento 1), una secuencia de 512 pb que consiste en parte de los exones 3 y 4 y el total del intrón 3 de SBEIIa (posiciones de nucleótido 2220 a 2731) con los sitios KpnI y SacI en cada lado (fragmento 2) y un fragmento de 528 pb que consiste en los exones completos 1 , 2 y 3 de SBEIIa (posiciones de nucleótido 1058 a 1336, 1664 a 1761 y 2038 a 2279 en AF338431, que incluye las posiciones de nucleótido 1 a 638 de ADNc de SBEIIa Aegilops tauschii, Acceso Genbank número AF338431,1) con los sitios BamHI y SacI en cada lado (fragmento 3). Los fragmentos 1, 2 y 3 luego se ligaron de modo que la secuencia del fragmento 3 se ligó en el fragmento 2 en la orientación antisentido con respecto al fragmento 1. Los constructos de ARN de horquilla se generaron inicialmente en el vector pDVO3000 que contiene la secuencia promotora de HMWG y el terminador nos3'.
hpc-SBEIIa. El constructo de SBEIIa denominado hpc-SBEIIa comprendió un fragmento de ADN de 293 pares de bases correspondiente a los nucleótidos 1255 a 1547 del ADNc de SBEIIa (Acceso Genbank N.° AF338432,1), que corresponde una parte del exón 12, exones 13 y 14 y parte del exón 15 del gen de SBEIIa. Esta región de SBEIIa se eligió porque solo tenía aproximadamente 81 % de identidad con la secuencia de nucleótidos de la correspondiente región del ADNc de SBEIIb, de este modo aumenta la oportunidad de especificidad del silenciamiento de SBEIIa, pero no de SBEIIb.
hp3'-SBEIIa. El constructo de SBEIIa denominado hp3'-SBEIIa comprendió un fragmento de ADN de 130 pares de bases correspondiente a los nucleótidos 2305 a 2434 del ADNc de SBEIIa, correspondiente una parte del exón 21, exón 22 y parte de la región no traducida 3' (3' UTR) del gen de SBEIIa.
hp-combo. El constructo del ARN de horquilla denominado hp-combo comprendió las regiones del gen SBEI de trigo además de las partes del gen de SBEIIa, y contenía i) una secuencia de 417 pares de bases correspondiente a los nucleótidos 1756 a 2172 del ADNc de SBEIIa, correspondiente a una parte de exón 16, exones 17 a l9, y parte del exón 20, y ii) una secuencia de 357 pares de bases correspondiente a los nucleótidos 267 a 623 de un ADNc de SBEI (Acceso Genbank N.° AF076679), correspondiente a parte del exón 3, exón 4, y parte del exón 5 del gen SBEI. El fragmento del gen SBEIIa presentó aproximadamente 86 % de identidad con la correspondiente región del gen de SBEIIb, que incluye varias regiones de 23 nucleótidos consecutivos con 100 % de identidad con sus correspondientes regiones de SBEIIb, y en consecuencia el constructo de la combinación se diseñó con la expectativa de que pueda reducir la expresión de los genes que codifican SBEIIb, así como los genes que codifican SBEIIa y SBEI en el trigo.
Dos copias de cada uno de los fragmentos descriptos anteriormente se insertaron, uno en orientación sentido y otro en antisentido, en un vector adecuado, de modo que un intrón del gen tubulina del arroz estuvo presente entre las dos copias. El gen sintético se insertó en un vector binario y se usó para transformar el trigo.
Estos constructos se usaron para transformar el trigo como se describe en el Ejemplo 1. Los números de líneas transgénicas de trigo independientes que fueron positivas por PCR para los respectivos constructos fueron los siguientes: hp5'-SBEIIa, 27; hpc-SBEIIa, 10; hp3'-SBEIIa, 10; y hp-combo, 63.
Análisis de planta transgénicas: análisis de ADN: El análisis de PCR se realizó para detectar uno o más transgenes en las plantas regeneradas usando ADN genómico extraído de 1-2 cm2 de material de hoja fresco usando el método mini-prep descripto por Stacey y Isaac, Methods in 1994. Las reacciones de PCR para determinar las plantas transformadas con el transgén hp5'-SBEIIa, por ejemplo, usando los cebadores SBEIIa-For: 5'-CCCGCTGCTTTCGCTCATTTTG-3' (SEQ ID NO: 19) y SBEIIa-Rev: 5'-GACTACCGGAGCTCCCACCTTC-3' (SEQ ID NO: 20). Estas reacciones de PCR se diseñaron para amplificar un fragmento de aproximadamente 462 pb del gen de SBEIIa. Las condiciones de reacción fueron las siguientes: "inicio en caliente" (94 °C, 3 min) seguido por 30 ciclos de desnaturalización (95 °C, 30 sec), apareamiento (55 °C, 30 sec) y extensión (73 °C, 2 min), seguido por 1 ciclo a 73 °C (5 min).
Morfología del gránulo de almidón. La morfología de los gránulos de almidón de la semilla de T1 madura obtenida de las plantas de trigo transformadas T0 se observó por microscopía óptica. Se analizaron diez granos individuales de cada una de 25 plantas T0 hp5'-SBEIIa. Cada endospermo se trituró suavemente para liberar los gránulos de almidón que se dispersaron en agua y se visualizaron bajo microscopía óptica. De las 25 líneas analizadas, 12 presentaron granos con gránulos distorsionados si bien la observación visual reveló niveles variados de distorsión en diferentes semillas. Nueve semillas de cada una de las plantas transformadas con los transgenes hpc-SBEIIa, hp3'-SBEIIa y hp-combo se analizaron de modo similar para determinar alteraciones morfológicas en los gránulos de almidón. En este caso, se analizaron la mitad de las semillas de modo que cada mitad de semilla restante se puede cultivar en una planta T1 , de este modo se preserva cada línea. Cincuenta y cinco líneas de 63 hp-combo presentaron semillas con morfología del gránulo alterada con variados niveles de distorsión. Las diez líneas de hp5'-SBEIIa presentaron semillas con morfología del gránulo de almidón alterada, nuevamente con variados niveles de distorsión. No se observó alteración significativa de la morfología del gránulo de almidón en ninguna de las líneas SBEIIa 3'. Los gránulos de almidón distorsionados son un indicador de niveles de amilosa elevados en el almidón del endospermo, normalmente por encima de 50 % de amilosa o por encima de 70 % de amilosa para gránulos de almidón muy distorsionados. Esto indicó que se observó una variedad en el grado del fenotipo para cada uno de los constructos de silenciamiento efectivos.
Expresión de proteína por transferencia Western en endospermo en desarrollo. Se analizaron cuatro a siete endospermos en desarrollo T2 de las líneas transgénicas T1 para el nivel de las proteínas de SBEIIa y SBEIIb por transferencia Western usando anticuerpos anti-SBEIIa y anti-SBEIIb, respectivamente. En el caso de las líneas hpcombo, también se analizó la expresión de SBEI mediante el anticuerpo anti-SBEI. Los niveles de proteína SBEII total (SBEIIa y SBEIIb) de las líneas transgénicas seleccionadas se calcularon como un porcentaje del nivel en el tipo salvaje (variedad NB1) y se muestra en la Tabla 11. Los niveles de amilosa en el grano maduro de las líneas transgénicas, calculados como un porcentaje del almidón total en el grano, también se determinaron (Tabla 11) usando un método yodométrico que se describe en el Ejemplo 1. Esto se representa gráficamente en la Figura 5. Se obtuvo un rango de niveles de expresión de SBEIIa y SBEIIb en el grano de las plantas transgénicas de las líneas independientes. Tal rango se espera normalmente en las líneas transgénicas obtenidas con cualquier constructo, debido a la variación en los sitios de integración del transgén en diferentes eventos transgénicos, comúnmente denominada como "efecto de la posición". El rango de niveles de expresión en estos experimentos se extendió porque se observó que los cuatro constructos no eran igualmente eficientes para reducir la expresión de los genes de SBEIIa y SBEIIb. En particular, el grado de reducción en la expresión de SBEIIb causado por el constructo hp-combo en algunas líneas transformadas no correlacionaron con el grado de reducción la expresión de SBEIIa, por ejemplo, líneas 679.5.3 y 672.2.3. Sin embargo, todos los constructos redujeron la expresión de los correspondientes genes en una mayoría de las líneas transformadas.
Cuando el porcentaje de amilosa se graficó contra el nivel de proteína SBEII total y se generó una curva de mejor ajuste a partir de los puntos de datos (ver Figura 5), se observó que la reducción de SBEII total en al menos 75 % con respecto al tipo salvaje produjo un contenido de amilosa de 50 % (p/p) o mayor en el almidón del endospermo. La reducción de la actividad de SBEII total en al menos 40 % con respecto al tipo salvaje produjo un contenido de amilosa de al menos 40 % (p/p).
Cuando el porcentaje de amilosa se graficó contra el nivel de proteína SBEII restante, se obtuvo una curva muy similar (ver Figura 6 ), que lleva a la conclusión de que el nivel de SBEIIa en el endospermo del trigo fue el determinante primario del nivel de amilosa en el almidón, y que los niveles de SBEIIb y SBEI eran determinantes secundarios.
El modelo de amilosa se desarrolló adicionalmente sobre la base de tres conjuntos de entradas (Figure 6 ):
(1) datos teóricos basados en los niveles de expresión relativos de SBEIIa y SBEIIb y los datos de amilosa de los transgénicos
(2 ) datos de amilosa para los nulos simples y dobles y los datos teóricos basados en los niveles de expresión relativa de SBEIIa y SBEIIb
(3) datos de amilosa medidos y niveles de SBEIIa y SBEIIb medidos de los transgénicos del "constructo adicional"
En la Figura 6 , una curva de potencia se ha ajustado a estos datos. Reuniendo estos tres conjuntos de datos se generó un modelo que fue muy congruente entre los tipos de entrada, lo que refuerza el modelo como una herramienta predictiva. El modelo predijo la importancia de generar mutaciones múltiples en los genes de SBEII a fin de generar amilosa alta en trigo de pan o trigo tetraploide.
EJEMPLO 3: CLONACIÓN Y COMPARACIÓN DE LAS SECUENCIAS DEL GEN DE S B E II DEL TRIGO
El aislamiento de los genes de SBEII de una biblioteca genómica de Aegilops tauschii y su caracterización por PCR se describen en WO99/14314 y WO200162934-A (ambos incorporados en la presente por referencia). Las secuencias de ADN de la región del intrón 5 del gen de SBEIIa de los genomas A, B y D se describen en WO200162934-A. La investigación posterior ha llevado a obtener secuencias de otras regiones de los genes de SBEIIa del trigo de diferentes genotipos del trigo y la posterior caracterización de los genes homeólogos, por ejemplo, de la siguiente manera. La región de los exones 12 a 14 de SBEIIa se amplificó de la variedad Chara del trigo hexaploide usando los cebadores AR2aE12F07 (5'-CATTCGTCAAATAATACCCTTGACGG-3' (SEQ ID NO: 21)) y AR2aE14R07 (5'-CTTCACCAATGGATACAGCATCAG-3' (SEQ ID NO: 22)). Esto produjo un producto de PCR de aproximadamente 656 pb que se supuso era una mezcla de los fragmentos amplificados de cada uno de los tres genes homeólogos. Este producto se secuenció después de la clonación en un vector TOPO. Se obtuvieron tres secuencias polimórficas que cubrieron la región entre el exón 12 a 14 (Figura 7). Sobre la base del análisis de PCR de las líneas manipuladas genéticamente del cromosoma Chinese Spring usando marcadores polimórficos amplificados por escisión (CAP), la secuencia F1-1 se asignó al genoma D, la secuencia F1-13 se asignó al genoma B y la secuencia F1-15 se asignó al genoma A como se detalla en el Ejemplo 4.
La región del intrón 3 de SBEIIa se amplificó a partir de dos variedades de trigo hexaploide, Sunco y Tasman, usando el par cebador AR2akpnIF (5'-GGTACCGGCAAATATACGAG ATTGACCCG-3' (SEQ ID NO: 23)) y AR2aSacIR (5'-GAGCTCCCACCTTCATGTT GGTCAATAGC-3' (SEQ ID NO: 24)). Se obtuvieron tres secuencias polimórficas de cada una de Sunco y Tasman (Figura 8 ). Por comparación con la secuencia del genoma D de SBEIIa del trigo (Acceso Genbank N.° AF338431,1), las secuencias Tasman 0257 y Sunco 0242 se asignaron al genoma D. Las secuencias Tasman 0272 y Sunco 0241 se asignaron al genoma B sobre la base del mapeo de un marcador polimórfico basado en un polimorfismo de nucleótido único en una población segregante. Las secuencias Tasman 0264 y Sunco 0243 parecieron diferentes de las secuencias del genoma B y D y se concluyó que deben ser del genoma A. Los polimorfismos específicos del genotipo también se observaron para esta región de SBEIIa entre Sunco y Tasman en cada uno de los tres genomas.
La región del exón 3 de SBEIIa de Chinese Spring (CS) se amplificó usando los cebadores AR2aexon3F (5'-GATACCTGAAGATATCGAGGAGC-3' (SEQ ID NO: 25)) y AR2aexon3R (5'-CGGTAGTCAAGATGGCTCCG-3' (SEQ ID NO: 26)). Se obtuvieron tres secuencias polimórficas (Figure 9). La comparación con el gen de SBEIIa del trigo (Acceso Genbank N.° AF338431,1) reveló que las secuencias CS del exón 3 era del genoma D. Se halló que la secuencia CS del exón 3b era del genoma B sobre la base del 100 % de identidad con el Acceso Genbank N.° FM865435 que se informó que es de un cromosoma 2B del trigo de pan. La tercera secuencia CS del exón 3d mostró 99 % de identidad con el Acceso Genbank N.° Y11282.1, que a su vez tenía un alto grado de identidad (99 %) con una secuencia codificadora parcial informada del genoma A de Chinese Spring (Acceso Genbank N.° EU670724). Esto llevó a la predicción de que la secuencia CS del exón 3d era del genoma A.
La región del exón 1 de SBEIIa de CS se amplificó usando los cebadores AR2aexon1F (5'-CACACGTTGCTCCCCCTTCTC-3' (SEQ ID NO: 29)) y AR2aexon1R (5'-GAGAGGAGTCCTTCTTCCTGAGG-3' (SEQ ID NO: 28)). Se obtuvieron las secuencias (Figura 10). El alineamiento con los Accesos Genbank de SBEII llevaron a la asignación de la secuencia CS del exón 1a al genoma B (100 % de homología con FM865435), CS exón 1b al genoma A (99 % de homología con Y11282,1) y CS exón 1c al genoma D (100 % de homología con AF338431,1).
Las secuencias del gen de SBEIIa también se obtuvieron de los progenitores diploides o parientes del trigo de pan, Triticum urartu que se considera es el progenitor de genoma A del trigo de pan, Aegilops speltoides (también conocido como Triticum speltoides) que se considera es el progenitor de genoma B, y Aegilops tauschii que se considera estrechamente relacionado con el progenitor de genoma D. Lo fragmentos del gen se obtuvieron de estas especies de la siguiente manera: Se diseñaron diez cebadores sobre la base de la secuencia de nucleótidos del gen de SBEIIa del genoma D (Acceso N.° AF338432) o su complemento y que cubre el total de esta secuencia. Estos conjuntos del cebador se usaron para amplificar fragmentos os de los genes de SBEIIa de la especie diploide por PCR. Por medio de los 10 cebadores, se usaron 16 combinaciones en las PCR con ADN de la especie diploide T. urartu (Agenoma A), A. speltoides (BB), A. tauschii (DD) y la especie tetraploide T. durum (genoma AABB). En total, se seleccionaron 35 fragmentos de estas amplificaciones que fueron de calidad suficiente para la secuenciación, para determinar sus secuencias de nucleótidos. Las secuencias se compararán y editarán usando Contig Express y las secuencias combinadas se determinarán para los genes progenitores de SBEIIa de los diploides. Se identificarán polimorfismos tales como SNP o inserciones/supresiones que se pueden usar para distinguir los genes en los genomas A, B y D, y se diseñarán cebadores específicos usado el amplificador para la identificación de mutantes.
La secuencia de nucleótidos de la región del exón 11-22 del gen de SBEIIa de T. urartu se muestra en la SEQ ID NO: 13, de los exones 3-8 como la SEQ ID NO: 15 y de los exones 1-3 como la SEQ ID NO: 14. La secuencia de nucleótidos del gen de SBEIIa completo de A. tauschii se proporciona en WO2005001098.
Mapeo de unión genética de SBEIIa y SBEIIb de SBEIIa y SBEIIb en trigo. Los genes de SBEIIa y SBEIIb se ubicaron ambos en la rama larga del cromosoma 2 del trigo (Regina et al., 2005; Rahman et al., 2001) y sobre la base de estos informes se pensó que están ligados, si bien no se sabía exactamente qué cerca estaba la unión. El mapeo genético de los genes de SBEIIa y SBEIIb se llevó a cabo usando una población segregante obtenida de un cruzamiento de 4 vías que involucra los cultivares progenitores Baxter, Yitpi, Chara y Westonia. El análisis de la población por recombinantes entre los genes reveló un solo recombinante de aproximadamente 900 progenies. A partir de estos datos, se calculó que la distancia genética entre SBEIIa y SBEIIb era solo de 0,5 cM, lo que era una unión muy estrecha entre dos genes.
Para determinar la distancia física entre los dos genes, se analizó una biblioteca BAC de Aegilops tauschii construida por Moullet et al., 1999 para identificar clones que contienen SBEII. Las sondas de hibridación marcadas con 32P se prepararon a partir de las regiones 5' y 3' de cada uno de los genes de SBEIIa y SBEIIb y se usaron para analizar la biblioteca BAC. Cuando se analizaron con una mezcla de cuatro sondas, se identificaron nueve clones con señales de hibridación positivas. Los nueve clones luego se analizaron por separado con cada una de las sondas y se seleccionaron tres clones. Uno de ellos (BAC2) se secuenció por completo y mostró que contiene un gen de SBEIIb de longitud completa. De los otros clones, se demostró que BAC1 contiene un gen de SBEIIa por la secuenciación directa parcial y BAC3 pareció contener porciones de ambos genes SBEIIa y SBEIIb como se muestra por PCR. Esto indicó qué estrechamente están físicamente unidos los dos genes. BAC1 y BAC3 se secuenciaron completamente. Estos datos físicos confirmaron la unión genética cercana.
En consecuencia, se predijo que las mutaciones por supresión creadas por los agentes tales como radiación que afectaron uno de los genes probablemente se extendieron en o a través de ambos genes, es decir, son nulas para ambos genes. Además, esto nos sugirió la posibilidad de que tales mutantes por supresión podían ser viables y tener aptitudes tipo salvaje. Al menos, la unión estrecha observada originó la posibilidad de obtener mutantes con supresiones relativamente pequeñas que no se extendieron a los otros genes ligados necesarios para la viabilidad o conveniencia. Tales mutantes se buscaron en consecuencia como se describe a continuación en los Ejemplos 5-7.
Ejemplo 4: Distinción de los genes homeólogos de SBEIIa y SBEIIb en trigo
Sobre la base de los polimorfismos de secuencia obtenidos en el Ejemplo 2, se diseñaron y prepararon ensayos de PCR para distinguir los genes homeólogos de SBEIIa en trigo de pan. Se diseñó un par cebador anidado, AR2aI13genomaF2 (5'-GTACAATTTTACCTGATGAGATC ATGG-3' (SEQ ID NO: 29)) y AR2aI13genomaR2 (5'-CTTCAGGAATGGA TACAGCATCAG-3' (SEQ ID NO: 30)) para amplificar un producto de 207 pb de la región entre los exones 12 a 14 de SBEIIa de trigo. Cuando se digirieron con dos enzimas de restricción, Ssp1 y Mse1, el producto amplificado mediante estos cebadores de Chinese Spring (CS) produjo cuatro bandas claras de tamaños de 207 pb, 147 pb, 99 pb y 108 pb. El uso de este ensayo marcador de PCR en las líneas manipuladas genéticamente en el cromosoma CS reveló que el producto de 207 pb provino del genoma A, el producto de 147 pb provino del genoma B y los productos de 99 pb y 108 pb provinieron del genoma D (Figura 11).
Sobre la base de las secuencias de SBEIIa de los ancestros diploides de trigo a saber Triticum urartu para el genoma A, Aegilops speltoides para el genoma B y Aegilops tauschii para el genoma D, se diseñaron pares de cebadores que podían amplificar específicamente fragmentos de regiones diferentes de los genes de SBEIIa de los diferentes genomas y distinguirlos (Tablas 4 a 8 ). Las Tablas 6 a 8 listan algunos de los polimorfismos de nucleótidos (columna marcada SNP) y los tamaños de los fragmentos amplificados obtenidos cuando se usan los pares de cebadores designados. Estas mismas combinaciones de cebador se pueden usar para distinguir los genes homeólogos de SBEIIa del genoma A y B del trigo sarraceno.
El desarrollo de algunos conjuntos de cebadores de PCR que distinguen los genes homeólogos de SBEIIb de los genomas A, B y D del trigo de pan y la identificación de SBEIIb en cada uno de estos genomas en el trigo hexaploide se describen en WO200162934-A. Sobre la base de las secuencias de SBEIIb de los ancestros diploides de trigo a saber Triticum urartu para el genoma A, Aegilops speltoides para el genoma B y Aegilops tauschii para el genoma D, se diseñaron pares de cebadores que podían amplificar específicamente fragmentos de regiones diferentes de SBEIIb (Tablas 9 a 10). Estas mismas combinaciones de cebador se pueden usar para distinguir los genes homeólogos de SBEIIb del genoma A y B del trigo sarraceno.
Ejemplo 5: Generación E identificación de MUTANTES DE SBE II
Mutagénesis de trigo por bombardeo con iones pesados. Se generó una población de trigo mutagenizado en la variedad de trigo Chara, una variedad comúnmente usada, por bombardeo con ion pesado (HIB) de las semillas de trigo. Se usaron dos fuentes de iones pesados, a saber, carbono y neón, para la mutagénesis que se realizó en Riken Nishina Centre, Wako, Saitama, Japón. Las semillas mutagenizadas se sembraron en el invernadero para obtener las plantas M1. Estas se autofecundaron para producir la generación M2. Las muestras de ADN aislado de cada una de aproximadamente 15.000 plantas M2 se analizaron individualmente para determinar mutaciones en cada uno de los genes de SBEIIa y SBEIIb usando los cebadores de PCR específicos del genoma para SBEIIa (ARIIaF2/ARIIaR2) y SBEIIb (ARA19HARA23R) (PCR diagnóstica). Cada una de las reacciones de PCR en las muestras de ADN tipo salvaje produjo 3 productos de amplificación distintos que correspondieron a las regiones amplificadas de los genes de SBEIIa o SBEIIb en los genomas A, B y D, mientras que la ausencia de uno de los fragmentos en las PCR de las muestras M2 mutagenizadas indicó la ausencia de la región correspondiente en uno de los genomas, es decir, la presencia de un alelo mutante en el cual se suprimió al menos parte del gen. Tales alelos mutantes pueden ser ciertamente alelos nulos.
El análisis de las líneas M2 mediante los pares cebadores específicos del genoma identificaron un total de 34 mutantes que fueron mutantes para los genes de SBEIIa y/o SBEIIb. Los mutantes de SBEIIa luego se analizaron para determinar la presencia de los genes de SBEIIb, y viceversa. Los mutantes identificados de este modo se clasificaron en tres grupos: "Tipo 1" donde ambos genes de SBEIIa y SBEIIb eran mutantes, es decir, que carecen de ambos genes de tipo salvaje en un genoma, "Tipo 2", donde solo el gen de SBEIIa fue mutante mientras que el gen SBEIIb era tipo salvaje, y "Tipo 3", donde solo el gen SBEIIb era mutante y el gen de SBEIIa era tipo salvaje en el genoma particular. Debido a que los genes de SBEIIa de los genomas A, B y D se distinguieron por las reacciones de PCR diagnóstica, y asimismo los genes de SBEIIb, los alelos mutantes se pudieron asignar a uno de los genomas de acuerdo con el cual estaba ausente el producto de amplificación. Como se usa en la presente, la denominación "A1" se refiere al genotipo donde ambos genes SBEIIa y SBEIIb del genoma A eran mutantes, "A2" se refiere al genotipo donde el gen de SBEIIa era mutante y el gen SBEIIb del genoma A era tipo salvaje, y "A3" se refiere al genotipo donde el gen de SBEIIa era tipo salvaje y el gen SBEIIb del genoma A era imitante. Las denominaciones "B1", "B2", "B3", "D1", "D2" y "D3" tienen significados análogos para los genomas B y D. los imitantes de cada uno de estos nueve tipos posibles se identificaron entre la colección de 34 mutantes.
El grado de supresión del cromosoma en cada uno de los 34 mutantes se determinó por mapeo microsatelital. Los marcadores microsatelitales previamente mapeados en la rana larga de los cromosomas 2A, 2B y 2D (Tabla 12) se analizaron en estos mutantes para determinar la presencia o ausencia de cada marcador de cada mutante. Las plantas mutantes en las que se retuvo el total o la mayor parte de los marcadores microsatelitales específicos del cromosoma, sobre la base de la producción del producto de amplificación apropiado en las reacciones, se consideraron mutantes por supresión relativamente pequeñas. Se prefirieron tales mutantes, considerando que es menos probable que otros genes importantes fueran afectados por las mutaciones. Los mutantes identificados y los resultados del mapeo microsatelital se sintetizan en la Tabla 13.
Cruzamiento de mutantes. Las plantas mutantes que eran homocigotas para supresiones menores a juzgar por el análisis del marcador microsatelital se seleccionaron para cruzar las plantas de progenie que tenían alelos mutantes de SBEII en múltiples genomas. Las plantas de progenie F1 de los cruzamientos se autofecundaron y se obtuvo la semilla F2 y se analizó para determinar su genotipo de SBEII. El análisis de 12 de estas poblaciones F2 llevó a la identificación de 11 combinaciones diferentes de alelos mutantes ("nulos dobles) (Tabla 14). La combinación nula doble del genotipo B1D1 no se obtuvo en el duodécimo cruzamiento a pesar de analizar más de 1200 progenie F2 de este cruzamiento particular. Una explicación posible para eso podría ser la presencia de un gen crítico en la vecindad del locus de SBEII en los genomas B y D, pero no en el genoma A, y en consecuencia la combinación de las mutaciones doble nula B1 y D1 podrían producir semillas no viables. Son teóricamente posibles veintisiete combinaciones de mutantes dobles nulas, y se analizarán más poblaciones F2 para identificar las otras combinaciones.
Ejemplo 6: CONTENIDO DE AMILOSA DE las mutantes nulas simples y dobles de SBE II de TRIGO
El porcentaje de amilosa en el almidón en el grano de las plantas nulas simple y doble descriptas en el Ejemplo 5 se determinó usando el método yodométrico como se describe en el Ejemplo 1. Un diagrama de dispersión que grafica el contenido de amilosa (eje Y) contra el número de línea mutante (eje X) se muestra en la Figura 4. El contenido de amilosa en los granos mutantes varió de 27,3 a 38,7 %. El contenido de amilosa de las muestras de Chara tipo salvaje (no mutagenizada) varió de 27,4 % a 29,5 %. Veintiséis líneas registraron un contenido de amilosa de más de 34 %. Se observó que, de estas 26 líneas, 20 eran nulas dobles, de las cuales algunas eran replicados del mismo cruzamiento, sea de las combinaciones Tipo 1 o Tipo 2. En otras palabras, hubo una tendencia para aumentar significativamente el contenido de amilosa en las combinaciones nula doble Tipo 1 y Tipo 2 en comparación con el contenido de amilosa en los gránulos nulos simples.
De modo importante e inesperado antes de este estudio, ninguno de los granos mutantes nulos dobles tenía almidón con más de 40 % de amilosa. Esto incluyó los genotipos A1B1, A1D1 y B1D1, cada uno contenía cuatro alelos nulos SBEIIa y cuatro SBEIIb y retenían dos alelos SBEIIa tipo salvaje y dos SBEIIb tipo salvaje. Esta observación fue compatible, sin embargo, con la predicción obtenida a partir de los datos del Ejemplo 2. En consecuencia, se concluyó que para obtener un grano de trigo con más de 40 % de amilosa por la combinación de mutaciones, el grano necesitaba tener más de cuatro alelos mutantes de SBEIIa, o de modo alternativo, si solo estaban presentes cuatro alelos mutantes de SBEIIa, más de cuatro alelos mutantes de SBEIIb en combinación con los cuatro alelos de SBEIIa, con preferencia los seis genes de SBEIIb son mutantes. También se sugirió a partir de los datos que los genes de SBEIIa de cada uno de los genomas A, B y D se expresaron en niveles similares entre sí, es decir, la expresión de SBEIIa en el trigo de pan no fue predominantemente de ningún genoma.
Fue interesante destacar que los genotipos "A3" y "A3D3" presentaban bajos contenidos de amilosa compatibles con los datos del Ejemplo 2, lo que confirma que SBEIIb tuvo un menor papel en la determinación del contenido de amilosa en el trigo con respecto a SBEIIa.
Ejemplo 7: CRUZAMIENTOS EN INTENTOS DE CREAR MUTANTES NULAS TRIPLES
A fin de crear líneas mutantes con más de cuatro alelos mutantes de SBEIIa, algunas de las líneas nulas simples y nulas dobles se cruzaron y la progenie F2 de estos se analizó usando los ensayos de PCR diagnóstica. Los ensayos analizados para determinar la presencia de los tres genes de SBEIIa y tres de SBEIIb y se usaron por consiguiente en un intento para identificar plantas que tuvieran mutaciones nulas en los genes de SBEIIa y/o SBEIIb en cada uno de los genomas A, B y D (líneas nulas triples para SBEIIa y/o SBEIIb). Los cruzamientos que se realizaron en un primer experimento y los genotipos de las líneas progenitoras y potencial progenie F2 nula triple se listan en la Tabla 15.
Se analizó la morfología del gránulo de almidón por microscopía de las semillas F2 seleccionadas de aspecto normal y arrugadas/encogidas provenientes de estos cruzamientos. Se seleccionaron seis semillas arrugadas/encogidas, 5 de los cruzamientos 08/dd y 1 del cruzamiento 08/bb, cada uno de los cuales se obtuvo de los cruzamientos entre una planta progenitora nula simple D2 y una planta progenitora nula doble A1B2. Cada una de las seis semillas mostró severa distorsión de los gránulos de almidón, lo que muestra formas distorsionadas, anormales para la mayor parte de los gránulos en las semillas que eran similares a los gránulos observados en las semillas transgénicas con niveles elevados de amilosa (Ejemplo 2). La inspección de una cantidad de semillas arrugadas/ encogidas y las semillas de aspecto extraño seleccionadas de los otros cruzamientos no revelaron morfología alterada del gránulo de almidón, lo que indica que el fenotipo observado en las semillas 08/dd y 08/bb fue específico del genotipo y no se debió a problemas de desarrollo durante el desarrollo de la semilla.
El almidón aislado de 6 de las semillas que tienen gránulos de almidón distorsionados se mezcló y analizó para determinar el contenido de amilosa usando el método yodométrico como se describe en el Ejemplo 1. Se midió el contenido de amilosa de la muestra que es de 67 % (Tabla 16). Los niveles de amilosa en las semillas tipo salvaje (control) de los cultivares Cadoux y Chara fueron de aproximadamente 35 %.
Análisis genotípico de semillas con morfología alterada del gránulo de almidón. Las semillas de los cruzamientos 08/dd y 08/bb con morfología alterada del gránulo de almidón se sembraron y las plantas resultantes se cultivaron en el invernadero. El ADN extraído de las plantas se analizó usando los cebadores específicos del genoma para SBEIIa y SBEIIb se describen el Ejemplo 3. Los resultados de los ensayos de PCR indicaron que cada una de estas semillas fueron mutantes nulas dobles homocigotas con un genotipo A1B2, B2D2 o A1D2 mientras que el tercer gen (tipo salvaje) estaba presente en el estado homocigota o heterocigota. El ADN de estas plantas se analizó adicionalmente usando PCR cuantitativa (PCR de tiempo real, Rotorgene 6000) usando pares cebadores individuales específicos del genoma para analizar la presencia o ausencia y la homocigosidad o heterocigosidad de los 3 genes de SBEIIa en las plantas. Los pares cebadores usados para SBEIIa fueron Snp6for/Arev5 (SEQ ID NO: 51/SEQ ID NO: 61) (genoma A, producto de amplificación de 205 pb), BSnp4/Arev5 (SeQ ID NO: 55/SEQ ID NO: 61) (genoma B, producto de amplificación de 494 pb) y DSnp7for/Drev1 (SEQ ID NO: 58/SEQ ID NO: 62) (genoma D, producto de amplificación de 278 pb). A fin de normalizar las reacciones de amplificación de SBEIIa, un par cebador (SJ156/SJ242) que amplificó un producto de 190 pb del gen de ClF6, que es un gen de la biosíntesis de la pared celular que se espera que se exprese igualmente en todas las plantas y se ubica en el Cromosoma 7 del trigo, se usó en las amplificaciones de control. El ADN de una planta tipo salvaje de la población mutagenizada, denominada 2B2, y del cv. Chinese Spring (CS) tipo salvaje se usaron como moldes control. Los valores de concentración relativa generados en las reacciones con los cebadores de SBEIIa se normalizaron con el valor de los cebadores de Clf6 para cada preparación del ADN molde. Los valores de las potenciales plantas nulas triples y los CS se calcularon con respecto a la línea 2B2.
De estos tres pares cebadores, los cebadores del genoma D produjeron una banda única clara para una planta denominada como S14 que posibilitó la cuantificación. No se obtuvieron bandas para los genes de SBEIIa en los genomas A y B de S14, lo que indica que este era homocigota para los alelos mutantes en estos genomas. La cuantificación indicó que S14 tenía aproximadamente 30-50 % del complemento del alelo D en comparación con 2B2 mientras que CS dio un valor de aproximadamente 95 % de 2B2 para el gen SBEIIa del genoma D. Esto mostró que S14 que dio semilla con niveles de amilosa de aproximadamente 67 % era homocigota para las mutaciones nulas SBEIIa para dos de los genomas (A y B) y heterocigota para el tercer genoma (D), además de ser homocigotas para la mutación nula SBEIIb en el genoma A. Es decir, S14 tenía un genotipo A1 (homocigota), B2 (homocigota), D2/+ (heterocigota). De un modo similar, la PCR cuantitativa mostró que la planta denominada S24 tenía un genotipo B2 (homocigota), D2 (homocigota) y A1 (heterocigota). El análisis de PCR mostró que las restantes 5 plantas tenían los siguientes genotipos: 08dd9-B4 era homocigota para un genotipo A1B2, es decir, mutante homocigota para SBEIIa y SBEIIb en el genoma A, mutante homocigota SBEIIa y tipo salvaje SBEIIb en el genoma B y homocigota tipo salvaje para ambos genes del genoma D, mientras que 08bb11-D9 fue homocigota para un genotipo B2D2 y s 28 y S22 eran homocigotas para un genotipo A1D2.
Análisis de las semillas F3. Las semillas de las líneas S28, S22, S14 y S24 se sembraron en el invernadero, las plantas resultantes se autofecundaron, y se obtuvieron las semillas (generación F3) de cada planta. Se observó que la fertilidad de las plantas fue afectada, ya que se redujeron significativamente el número de semillas per cabeza y el porcentaje de espigas que eran fértiles en comparación con las semillas tipo salvaje, nula simple y otras mutantes doble nulas cultivadas en el mismo momento y en las mismas condiciones, pero no se abolió (Tabla 17).
Se determinó la morfología del gránulo de almidón por microscopía óptica en 100-200 semillas de cada una de las líneas S28, S14 y S22. A partir de la línea S22, se identificaron 102 semillas F3 con los gránulos de almidón distorsionados entre 200 semillas analizadas. Los datos revelaron una distorsión de las relaciones de segregación alejadas de la esperada 1:2:1 (mutante homocigota: heterocigota: tipo salvaje) con un número más alto de fenotipos normales que el esperado. A fin de observar si se puede identificar una planta homocigota con un fenotipo de amilosa alta, 102 semillas con gránulos distorsionados se colocaron en condiciones adecuadas para la germinación. Sesenta de las 102 semillas germinaron. El ADN de estas 61 plantas se analizó por PCR específica del genoma SBEIIa y las 61 plantas parecieron ser nulas dobles de un genotipo A1D2, sin homocigotas nulas triples identificadas. Se mostró que el gen SBEIIa tipo salvaje del genoma B es heterocigota, es decir, tanto los alelos tipo salvaje como mutantes estaban presentes en el genoma B.
Las 41 semillas que tenían gránulos de almidón distorsionados, pero no habían germinado se analizaron para determinar su genotipo SBEIIa. Se observó que muchas de estas eran nulas triples, es decir, que muestran la ausencia de cualquier producto de amplificación para los genes de SBEIIa y por ende tienen seis alelos nulos para SBEIIa. Esto confirmó que las semillas nulas triples se pudieron generar, pero estas semillas tenían defectos que afectaron la germinación. Los embriones de algunas de estas semillas se escindieron y cultivaron usando medio de cultivo de tejido en condiciones para promover la germinación de los embriones. Algunos embriones germinaron con éxito, dando origen a plántulas verdes. Sin embargo, cuando estas plántulas se transfirieron al suelo, crecieron escasamente y no produjeron plantas de trigo fértiles.
A partir de estos datos, se concluyó que una semilla mutante nula triple homocigota basada en las mutaciones por supresión generaras por HIB, y las plántulas derivadas de estas semillas que tienen seis alelos nulos de SBEIIa y que carecen completamente de SBEIIa fueron recuperables de estos cruzamientos, pero fueron afectadas en la germinación y el crecimiento, lo que indica un papel esencial para alguna SBEIIa en estos procesos. En contraste, las mutantes dobles nulas para SBEIIa que se recuperaron, que eran heterocigotas para el tercer alelo nulo y que por ende tenían cinco alelos nulos de SBEIIa, crecieron normalmente y fueron fértiles, aunque con fertilidad reducida.
Análisis de la expresión de proteína de la línea S28. La expresión de la proteína SBEII en los endospermos en desarrollo obtenidos de una espiga entera de una planta S28 se analizó por transferencia Western usando un anticuerpo específico para SBEIIa. Los 15 endospermos de la espiga mostraron un patrón carente de las isoformas de SBEIIa del genoma A y D (AD nula doble) con solo una banda de SBEIIa presente, expresada a partir del genoma B. De los 15 endospermos, 7 presentaron un nivel de expresión de SBEIIa del genoma B considerablemente más bajo que los otros y de la línea control, NB1. Sobre la base de la intensidad de banda, se cuantificó la expresión de SBEIIa en cada endospermo.
Los restantes gránulos de almidón de los endospermos se purificaron usando 90 % de Percoll. Después de la resuspensión en 200 μl de agua, los gránulos se examinaron microscópicamente. Se observó que todos los endospermos que tienen un nivel de expresión de SBEIIa que era menor de aproximadamente 36 % del tipo salvaje presentaron gránulos de almidón con morfología distorsionada típica de un fenotipo de amilosa alta. Se observó un rango de niveles de expresión de la proteína SBEII en los grupos de granos en desarrollo de una espiga de una planta S24, que descendió a menos de 5 % del tipo salvaje. Los endospermos con niveles menores de SBEIIa también mostraron la morfología alterada del gránulo de almidón; los fenotipos en consecuencia se correlacionaron completamente en este experimento. Los niveles de expresión de SBEIIb en todos estos endospermos también se analizaron por medio de un anticuerpo específico de SBEIIb. Los resultados mostraron claramente que hubo una reducción concomitante de la expresión de SBEIIb que corresponde a la reducción de la expresión de SBEIIa.
Discusión. El análisis de la semilla de las plantas con el genotipo mutante A1B2 (sintetizado en la Tabla 18) que tiene cuatro alelos mutantes de SBEIIa indicó que el contenido de amilosa estaba solo ligeramente elevado para este genotipo, lo que produce un nivel de amilosa de menos de 40 %. En comparación, los datos de las semillas S14, S22, S24 y S28 demostraron que la adición del quinto alelo mutante de SBEIIa elevó el nivel de amilosa a aproximadamente 67 %. Por consiguiente, el aumento del número de cuatro alelos nulos SBEIIa a un mínimo de cinco alelos mutantes de SBEIIa fue crítico para aumentar el nivel de amilosa a más de 50 % (p/p), en efecto más de 60 % (p/p). Esta conclusión se ajustó con las predicciones realizadas a partir de los datos del Ejemplo 2. La relación observada de la composición alélicas al contenido de amilosa indicó que el número total de alelos mutantes de SBEIIa en la planta fue importante para determinar el contenido de amilosa (Tabla 18). También se concluyó que el número de alelos mutantes de SBEIIb también cumplió un papel, aunque menos importante que el número de alelos mutantes de SBEIIa.
También se concluyó que las semillas mutantes nulas triples homocigotas y las plántulas que tienen seis alelos nulos de SBEIIa y que carecen completamente de SBEIIa se pueden generar de las mutantes nulas simples que contienen las supresiones generadas por HIB, pero fueron afectadas en la germinación y el crecimiento, lo que indica un papel esencial para alguna SBEIIa en estos procesos. En contraste, las mutantes dobles nulas para SBEIIa que estas que se recuperaron, que eran heterocigotas para el tercer alelo nulo y que por ende tenían cinco alelos nulos de SBEIIa, crecieron normalmente y fueron fértiles.
Ejemplo 8: INTENTOS ADICIONALES para producir mutantes NULAS TRIPLES QUE CARECEN COMPLETAMENTE DE SBEIIa o SBEIIB
La incapacidad observada para generar una mutante nula triple que carece completamente de SBEIIa en el Ejemplo anterior puede haber sido dependiente de las plantas mutantes particulares usadas como progenitoras en el cruzamiento. Para analizar esto, se llevó a cabo un segundo conjunto de cruzamientos usando mutantes progenitoras adicionales, también obtenidas de la mutagénesis con HIB que se sintetiza en la Tabla 19. Se recolectaron las semillas F2 de 38 cruzamientos y se extrajo ADN. Al menos 96 ADN de cada uno de los 25 cruzamientos, 12 de los cuales eran de cruzamientos destinados a producir un genotipo A1B2D2 (mutante nula triple) pero usando diferentes líneas progenitoras que las que se describen en el Ejemplo 7, se analizaron por PCR para determinar la tendencia a la segregación. No se identificaron mutantes nulas triples viables de ninguno de estos cruzamientos. La recuperación de las mutantes nulas dobles también varió de acuerdo con el cruzamiento, pero en la mayoría de los casos se obtuvieran los genotipos esperados. Las semillas F2 de seis de los cruzamientos A1B2D2 también se analizaron microscópicamente para identificar las semillas que tienen un fenotipo de amilosa alta. Tales semillas se identificaron con frecuencia moderada.
Análisis de semillas del cruzamiento A2B2D2, 08/mm-1. Entre los cruzamientos listados en la Tabla 19, 12 fueron cruzamientos entre un progenitor con un genotipo A2 y un progenitor con un genotipo B2D2, es decir, ambos progenitores eran tipo salvaje para los tres genes de SBEIIb, con el propósito de generar mutantes nulas triples de SBEIIa que tienen el genotipo A2B2D2. Las preparaciones de ADN de aproximadamente 672 semillas F2 obtenidas del cruzamiento 08/mm-1 se analizaron por PCR. Las relaciones de segregación están distorsionadas respecto de las relaciones Mendelianas esperadas, con significativamente menos nulas dobles identificadas que las esperadas (Tabla 20). No obstante, se identificaron todas las combinaciones posibles de mutaciones nulas dobles en las semillas viables. No se identificaron nulas triples del genotipo A2B2D2 entre las 672 semillas, aun cuando por la segregación Mendeliana se hubieran esperado aproximadamente 10.
En paralelo, las semillas F2 del cruzamiento 08/mm-1 se analizaron por microscopía para identificar las semillas con un fenotipo amilosa alta/gránulo de almidón distorsionado (HA). De 576 semillas F2 que se analizaron, no se identificaron semillas con el fenotipo HA. Esta población de semillas debe haber incluido una baja frecuencia de semillas que tienen 5 alelos mutantes de SBEIIa, que son mutantes homocigotas en dos genomas y mutante/tipo salvaje heterocigota en el tercer genoma para SBEIIa. La carencia observada de semillas con un fenotipo HA en el cruzamiento A2B2D2 indico que 5 alelos mutantes de SBEIIa, en ausencia de cualquier alelo mutante de SBEIIb, no pareció suficiente para proporcionar un fenotipo de amilosa alta (>50 % de amilosa). Es decir, fue necesario la reducción de los niveles de SBEIIb con respecto al tipo salvaje además del nivel de SBEIIa muy reducido en el contexto de 5 alelos mutantes o un nivel equivalente de actividad de SBEIIa en un endospermo que tiene mutaciones de pérdida parcial de función en uno o más genes de SBEIIa para proporcionar más de 50 % de amilosa.
El análisis de las semillas F2 de once cruzamientos adicionales entre progenitores mutantes simples de SBEIIa (tipo salvaje para SBEIIb) y progenitores mutantes dobles de SBEIIa en los otros dos genomas no identificó ninguna semilla mutante nula triple viable del genotipo A2B2D2.
Cruzamientos que involucran mutaciones Tipo 3. Los cruzamientos que incluyen mutaciones Tipo 3 se realizaron con el objetivo de hallar mutantes homocigotas que tengan dos, cuatro o seis alelos mutantes de SBEIIb combinados con cuatro alelos mutantes de SBEIIa, y determinar el fenotipo de las plantas resultantes y su grano. Se recolectarán las semillas F1 de los siguientes cruzamientos. La Tabla 21 sintetiza los resultados del análisis de cruzamientos que involucran mutaciones Tipo 3. Las mutantes nulas triples se identificaron a partir de los cruzamientos A3B3D3 y A3B2D2, los cuales mostraron morfología del gránulo de almidón de tipo salvaje.
EJEMPLO 9: ANÁLISIS ADICIONAL PARA LAS MUTANTES DE AMILOSA ALTA
En intentos adicionales para producir mutantes nulas triples de SBEIIa a partir de mutantes simples identificadas, se adoptó una estrategia alterada. Esta estrategia añadió la etapa de algunos retrocruzamientos iniciales de las mutantes simples después de su identificación, a fin de eliminar las mutaciones no unidas y no relacionadas de las plantas M2 que tienen las mutaciones simples de SBEIIa. Esto se incluyó para reducir el efecto del trasfondo mutado, debido al alto nivel de tratamiento mutagénico usado, que puede haber producido mutaciones adicionales en las plantas independientes de las mutaciones deseadas de SBEIIa que pueden tener efectos perjudiciales cuando se combinaron las mutaciones. Estos retrocruzamientos iniciales se llevaron a cabo por el cruzamiento de las mutantes M2 con las plantas del cultivar de trigo de invierno Apache o cultivar de trigo de primavera Chara. Inicialmente, se realizaron 13 cruzamientos para combinar las mutaciones en los tres genomas y se realizó el análisis molecular sobre el ADN de 21.400 mitades de semillas F2, con la segunda mitad de cada semilla retenida para preservar la línea. Un análisis preliminar para detectar mutaciones usó marcadores SSR dominantes que fueron específicos del genoma de SBEIIa o SBEIIb. A partir de esto, se identificaron 21 semillas como mutantes nulas triples putativas y 793 semillas como mutantes dobles putativas (Tabla 22) por la ausencia de los productos de amplificación.
Ensayos basados en Q-PCR TaqMan de los genotipos de la semilla de trigo. La primera ronda de análisis usando marcadores dominantes como se describió anteriormente no pudo distinguir entre las semillas que eran heterocigotos u homocigota tipo salvaje para cualquier gen de SBEIIa. En consecuencia, se desarrolló un ensayo de PCR basado en TaqMan para distinguir heterocigotas y homocigotas para el gen de SBEIIa del tercer genoma, y para confirmar los genotipos del análisis inicial. Debido que el análisis TaqMan se realizó en las mitades de semillas y porque el endospermo del trigo es triploide (3n) para cada genoma, fueron posibles dos tipos de perfiles para el endospermo heterocigota para el alelo tipo salvaje de SBEIIa del tercer genoma, sea 2n, donde el alelo tipo salvaje fue provisto por la progenitora materna, o 1n, donde el alelo tipo salvaje fue provisto por el progenitor paterno a través del polen. Los ensayos Q-PCR basados en TaqMan usaron el sistema de PCR de tiempo real Applied Biosystems 7900HT Fast (ABI, Foster City, CA) para detectar el número de copias del gen de SBEIIa en el tercer genoma de las semillas mutantes dobles putativas de trigo. Los ensayos usaron ADN genómico extraído de mitades de semillas por los métodos de microesferas magnéticas (Nucleomag, cat ref: 744400,24). Se cargó ADN en placas de 384 pocilios y se realizaron reacciones de Q-PCR dúplex por duplicado para cada placa. Las reacciones de PCR se diseñaron para amplificar un fragmento de 65 pb del exón 21 de los genes de SBEIIa usando los cebadores SBE2a QPCRABDF4 (cebador delantero): 5'-ACGATGCA CTCTTTGGTGGAT-3' (SEQ ID NO: 31) y SBE2a QPCRABDR4 (cebador inverso): 5'-ACTTACGGTT GTGAAGTAGTCGACAT (SEQ ID NO: 32). La sonda usada para administrar la señal fluorescente durante las reacciones de Q-PCR fue SBE2a QPCRABDS4 (sonda TaqMan® MGB, FAM) 5'-CAGCAGGCTTGATCAT-3' (SEQ ID NO: 33). Una secuencia de un gen endógeno, GamyB, se usó como un control interno para normalizar el valor de señal de cada muestra, usando los cebadores GamyB1F (cebador delantero): 5'-GATCCGAATAGCTGGCTCAAGTAT-3' (SEQ ID NO: 34) y GamyB2R (cebador inverso): 5'-GGAGACTGCAGGTAGGGATCAAC-3' (SEQ ID NO: 35). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: "inicio en caliente" (95 °C, 10 min) seguido por 40 ciclos de desnaturalización (95 °C, 15 sec), apareamiento (58 °C, 60 sec). Los productos de reacción se analizaron mediante el administrador de software Relative Quantification integrado en el sistema de PCR de tiempo real 7900HT Fast.
Usando este ensayo TaqMan, las 21 mutantes nulas triples putativas se confirmaron como nulas dobles, no nulas triples. Se consideró que la identificación incorrecta del análisis inicial se debe a falsos negativos, quizás por mala calidad del molde de ADN. Cuando se examinaron 14 de las semillas en cuanto a la morfología del gránulo de almidón por microscopía óptica, se observó que las 14 tienen un fenotipo de gránulo tipo salvaje, que fue compatible con las semillas que son mutantes dobles nulas, no mutantes nulas triples. Los ensayos también identificaron unas pocas semillas mutantes dobles putativas que eran heterocigotas 2 n en el tercer genoma, a partir de los cruzamientos M76, M77, M82, M83 y M86. Sin embargo, estos resultados no necesitan confirmarse ya que fue difícil distinguir el genotipo 2n heterocigota del genotipo 3n homocigota, incluso en presencia del trasfondo de SBEIIa nula doble. Esto se confirmará en la próxima generación de progenie. Los ensayos también mostraron que no se obtuvieron mutantes doble nulas SBEIIa que fueron mutante SBEIIa heterocigota /tipo salvaje en el tercer genoma a partir de los cruzamientos M79, M81, M74, M75, M78 y M80. Los cruzamientos M84 y M85 dieron el número más alto de mutantes homocigotas dobles nulas de SBEIIa claramente identificados que fueran buenos candidatos para ser heterocigotos 1n (mutante SBEIIa/tipo salvaje) en el tercer genoma. También se identificaron heterocigotas 2n pero se deben confirmar.
En estos cruzamientos, las cantidades de mutantes nulas simples y dobles de SBEIIa fueron más bajas que la frecuencia esperada de la segregación Mendeliana. Esta distorsión de la segregación se estudió posteriormente. Cuando la frecuencia esperada de mutantes simples homocigotas debería haber sido 25 %, en algunos cruzamientos la frecuencia fue mucho más baja, variando de 1 % a 25 %. El número de mutantes dobles homocigotas en la progenie de cruzamientos para producir mutantes nulas triples debería ser teóricamente alrededor de 6 % (1/4*1/4) por combinación (6 % AB, 6 %AD, y 6 %AB). El número real de mutantes dobles identificadas fue mucho más bajo y varió de 0 a 5,2 %. Esto sugirió que algunas combinaciones de mutaciones eran perjudiciales para la planta, por ejemplo, para el desarrollo de la semilla, lo que lleva a una recuperación más baja de las combinaciones de mutaciones que la esperada. Dos cruzamientos, M74 y M75, proporcionaron las frecuencias más bajas en comparación con la esperada. Se observó que los progenitores usados en estos cruzamientos no se han retrocruzado con Apache o Chara antes de realizar los cruzamientos, lo que sugiere que mutaciones no relacionadas, adicionales de los progenitores provenientes del tratamiento mutagénico pueden haber tenido un papel en la distorsión de las relaciones de segregación. Incluso en los cruzamientos M76 y M86 que dieron un mayor número de mutantes simples, la frecuencia de mutantes dobles nulas fue baja, en particular para algunas combinaciones. Por ejemplo, para el cruzamiento M76 las frecuencias de nulas simples en el genoma D y el genoma A fueron 23 % y 17 %, respectivamente, mientras que la frecuencia de las mutantes dobles nulas en ambos genomas A y D fue solo 0,8 %. Esto sugirió que algunas combinaciones de mutaciones de SBEIIa eran menos favorables para la planta que otras, y en consecuencia se seleccionaron de nuevo. La proporción de mutantes que contienen cinco alelos mutantes de SBEIIa (nulas dobles que fueron mutantes heterocigotos en el tercer genoma) también fue muy baja. La frecuencia esperada puede ser 9 % (1/4*1/4*1/2*3) mientras que el porcentaje observado más alto fue 1,1 % para los cruzamientos M84 y M85.
La correlación entre las frecuencias de mutantes simples y mutantes dobles homocigotas en los cruzamientos M74 y M75 fue bastante buena para las mutaciones SBEIIa en los genomas A y D (0,789 y 0,558 respectivamente) mientras que fue mucho más baja (0,386) para el genoma B. Una explicación posible puede ser que uno de los progenitores (19,832 (D1)/20,257(A2) [08/b12]) usado en los cruzamientos M74 y M75 fue un heterocigota en primer lugar más que una mutante doble homocigota.
En estas condiciones, la probabilidad de obtener una mutante nula triple (6 alelos mutantes nulos de SBEIIa) fue muy baja y mucho menor de la frecuencia esperada de 1/64. Sin embargo, se espera que la autofecundación de las mutantes dobles que también eran heterocigotos en el tercer genoma, en particular de los cruzamientos M84 y M85, confirme si las mutantes nulas triples se pueden recuperar de estas mutantes progenitoras. La progenie de las plantas autofecundadas se analizará para identificar la semilla triple mutante.
EJEMPLO 10: SELECCIÓN DE SEMILLAS DE TRIGO MUTANTES POR NIR
Se desarrolló un método rápido, no destructivo y de alto rendimiento para seleccionar semillas individuales por un fenotipo que se asoció con alto contenido de amilosa. Los métodos de análisis basados en PCR descriptos en los Ejemplos 4-6, si bien exitosos para detectar imitantes en una población de 15.000 semillas, requerían la preparación de ADN de cada mitad de semilla después de cortar cada semilla manualmente, y de este modo laborioso y tedioso. Se determinó que la espectroscopia de infrarrojo cercano (NIRS) se puede usar para distinguir los fenotipos de amilosa alta y amilosa normal. La espectroscopia de infrarrojo cercano (NIRS) es una tecnología no destructiva que se ha usado para determinar algunas propiedades de la semilla de trigo (McClure, J, 2003). El análisis NIRS de la semilla individual de trigo para determinar un fenotipo de almidón ceroso (amilosa baja) se desarrollado en trigo sarraceno por Delwiche et al. 2006. Dowell et al 2009 desarrollaron un sistema de clasificación NIR de semillas individuales automatizado para separar trigo sarraceno ceroso, parcialmente ceroso y normal y trigo hexaploide. A nuestro entender, este método no se ha usado previamente para distinguir semillas de amilosa alta en el trigo hexaploide.
Desarrollo y validación del método de referencia bioquímico reducido para medir el contenido de amilosa aparente en material de semilla molido. A fin de calibrar las mediciones de NIRS de acuerdo con el contenido de amilosa aparente en semillas individuales, se debe establecer un modelo matemático para correlacionar los datos del espectro NIRS y un método bioquímico que mide el contenido aparente de amilosa en la misma muestra, en este caso semillas individuales. Los métodos yodométricos estándares, por ejemplo, el método descripto en el Ejemplo 1, emplea de rutina una cantidad de semillas que se combina antes de la solubilización del almidón, lo que proporciona almidón a granes (combinado) que normalmente se desgrasa antes de la medición colorimétrica del contenido de amilosa sobre la base de la unión del yodo. Para ser adecuado para usar con fines de calibración de NIRS, este método se modificó, simplificó y redujo en proporción para permitir la medición del contenido aparente de amilosa en las semillas individuales, de este modo permite la variación en el contenido de amilosa entre las semillas. El término "contenido aparente de amilosa" se usa en este contexto porque el método modificado no purificó el almidón del grano molido, los lípidos que interactúan con la amilosa del almidón no se eliminaron y los resultados se expresaron como porcentaje de peso de semilla fresco más que como un porcentaje del almidón aislado de la semilla. Por estas razones, los valores obtenidos para "contenido aparente de amilosa" fueron mucho más bajos que los valores obtenidos usando el método estándar que se describe en el Ejemplo 1.
En una primera etapa, este método se desarrolló por la evaluación de la linealidad entre la respuesta colorimétrica y el contenido de amilosa usando grano de trigo molido sin purificación del almidón. El material de amilosa alta usado para esto fue el grano de trigo transformado con el constructo hp5'-SBEIIa y que tiene reducido SBEIIa (WM, Línea 85,2c, ver Ejemplo 2) y trigo con el nivel normal de amilosa que fue un trigo tipo salvaje (WMC) cultivado en el mismo momento y bajo las mismas condiciones. El grano WM molido contenía aproximadamente 80 % de amilosa determinado por el método estándar del Ejemplo 1, mientras que el grano w Mc molido tenía un contenido de amilosa de aproximadamente 25 %. Se prepararon muestras con diferentes relaciones de WM a WMC a partir de material de semilla molida pero no se purificaron adicionalmente. Se usaron aproximadamente 17 mg de muestras para el ensayo. Las mezclas de WM y WMC se pesaron con precisión en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Para solubilizar el almidón en las muestras, se añadió 1 ml de DMSO por 17 mg de muestra y luego las mezclas se calentaron en un baño de agua a 95 °C durante 90 min con agitación en vórtex ocasional. Se añadió una alícuota de 10 μl de cada mezcla a 1,98 ml de agua y se trató con 10 μl de I20,3 % 3 % de KI en solución de NaOH 0,01 N. Se midió la absorbancia de cada mezcla a 605 nm y los valores de absorbancia se convirtieron a por ciento de amilosa usando una curva estándar. La curva estándar se obtuvo usando amilopectina de maíz (Sigma catálogo N.° A7780) y amilosa de papa (Sigma, A0512) en relaciones de 0 % a 100 % de amilosa y se trató de la misma manera que las muestras de trigo molido.
Los resultados mostraron una relación lineal entre el nivel de incorporación de WM y el contenido aparente de amilosa, lo que muestra que el método iodométrico simplificado se puede usar para la calibración NIRS y que la purificación del almidón no fue necesaria para este propósito.
Ensayo del método de referencia bioquímico para medir el contenido de amilosa aparente en mitades de semillas Las semillas de las líneas WM y WMC (control) obtenidas de los experimentos de ensayo de campo realizados en Arizona y Washington se usaron para este ensayo. En total, 47 mitades de semillas con embriones eliminados se colocaron en forma individual en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y se pesaron con precisión antes de la adición de 0,6 ml de DMSO a cada uno. Los tubos se incubaron en un baño de agua a 95 °C durante 20 min después de lo cual las muestras se trituraron en los tubos usando una varilla de vidrio. El volumen de cada muestra se ajustó con precisión a 1 ml de DMSO por 17 mg de muestra después de lo cual los tubos se incubaron a 95 °C en un baño de agua durante otros 70 min con agitación en vórtex ocasional. La amilosa aparente se midió por la toma de alícuotas de 10 μl de cada mezcla y se las trató con 10 μl de 0,3 % de I2 + 3 % de KI en solución de NaOH 0,01 N y se diluyó a 2 ml con H2O, como antes. La absorbancia de cada muestra se midió a 605 nm y los valores de absorbancia se convirtieron a por ciento de "amilosa aparente" usando una curva estándar como se describió anteriormente.
Por medio de este método, el contenido aparente de amilosa de las semillas WM varió de 20 % a 41 % (27 % promedio) mientras que el contenido aparente de amilosa de las semillas WMC varió de 7,5 % a 17 % (promedio 11,4 %). Las razones por las que estos valores fueron mucho más bajos que el contenido de amilosa determinado por el método del Ejemplo 1 se describieron anteriormente. Este método simplificado por ende permitió distinguir las semillas con amilosa alta de las de contenido de amilosa tipo salvaje.
Calibración de NIRS. Los barridos de NIRS de semilla individual de las semillas WM y WMC se obtuvieron usando un espectrómetro de NIRS Multi Purpose Analyser (MPA) (Bruker Optics, F-77420 Champs Sur Marnes, Francia). Cada semilla se colocó en la parte inferior de un tubo de vidrio envuelto con papel de aluminio y se barrió dos veces. Los espectros se registraron mediante un espectrómetro Bruker MPA Multi-Purpose-Analyser (Bruker Optics) provisto con una sonda de fibra. Los espectros se registraron mediante 32 barridos de referencia y 16 barridos de muestra para el rango de 4000 - 12,500 cm-1 a una resolución de 16 cm-1 que da como resultado 1100 puntos de datos. La sonda de fibra óptica usada fue la sonda en N 261 para sólidos.
Para determinar la correlación entre el nivel aparente de amilosas y las lecturas NIR, se analizaron 226 semillas individuales WM o WMC con contenidos aparentes de amilosa que varían de 6 a 44 %. Primero, se obtuvieron los espectros de NIRS duplicados para cada semilla, después de lo cual el contenido aparente de amilosa se midió en forma bioquímica para cada semilla de acuerdo con el método descripto anteriormente. Los valores atípicos del espectro (6 muestras) se identificaron como espectros que fueron anormales en comparación con los espectros del conjunto de datos completo y se eliminaron y los espectros restantes se analizaron con el pretratamiento de Min-max de normalización. Se usó el software de cuadrado mínimo parcial con validación del cruzamiento completo (uno afuera) para crear el modelo. La ventana espectral usada para el desarrollo del modelo fue 9827-7150 cm-1 y 6271­ 4481 cm-1. El número de factores PLS usado para desarrollar la calibración fue 14. La precisión del modelo de calibración se expresó por el error estándar de la validación del cruzamiento (SECV) y el coeficiente de determinación (R2). La eficiencia de una calibración se mostró por RPD que es la relación del error estándar de predicción (RMSECV) al desvío estándar de los datos de referencia del conjunto.
Se obtuvo una correlación positiva (R2 = 0,702) entre los datos bioquímicos y los datos espectrales de NIR (Figura 15). Se concluyó que el modelo fue suficientemente robusto para distinguir las semillas de trigo con alto contenido de amilosa de las semillas de trigo de amilosa normal, pero aún no suficientemente exacto para medir con precisión el contenido de amilosa en cualquier semilla. El método por lo tanto fue capaz de analizar una población de semillas muy grande para enriquecer granos con fenotipo de amilosa alta. Esto se validó de la siguiente manera.
Validación de NIRS. Para validar el método NIR para distinguir grano de amilosa alta y grano control, 60 semillas WM y 34 semillas WMC se barrieron dos veces por NIR y se calculó el contenido aparente de amilosa predicho. Cuando los valores de amilosa aparente así determinados se graficaron para obtener un perfil de distribución para las poblaciones de WM y WMC, se observó que separaban principalmente dos grupos con una ligera superposición (Figura 16). De acuerdo con estos resultados, las semillas que tienen un fenotipo de amilosa aparente determinado por NIRS igual o superior a 30 % se pueden considerar como buenos candidatos para la semilla con amilosa alta. Análisis NIRS de semillas F2 de los cruzamientos del trigo. El análisis NIRS se llevó a cabo para detectar semillas mutantes que tienen alto contenido de amilosa. El análisis usó 2.700 semillas F2 de dos cruzamientos diferentes: M80 y M85 que fueron, respectivamente: 21.142(B2)/Tipo I-20257(A1) [08/h-111]//Tipo I-19.832 (D1)/CHARA y 5.706 (D2)/21.668 (B2)//20,257 (A1)/CHARA. El análisis en consecuencia se dirigió a identificar semillas con un genotipo A1B2D1 o A1B2D2, respectivamente. Se registraron dos espectros NIRS por semilla como se describió anteriormente.
Las semillas que dieron un valor de amilosa aparente predicho superior a 34 % en al menos una de las dos pruebas duplicadas se seleccionaron primero para el análisis posterior. De las 2.700 semillas, se seleccionaron 27 semillas y se evaluaron después por microscopía óptica para determinar la morfología del gránulo de almidón. Cada semilla se raspó con cuidado para preservar el embrión, para obtener aún suficiente material de endospermo material por examinar. Se observó que cuatro semillas de las 27 tienen morfología distorsionada del gránulo de almidón. Estas cuatro semillas pasaron a tener el contenido aparente de amilosa predicho más alto de la prueba NIR y fueron las únicas donde los valores de amilosa aparente predichos fueron superiores a 30 %. Las otras 23 semillas mostraron morfología del gránulo normal (tipo salvaje).
Datos moleculares de las semillas seleccionadas por el análisis NIRS. El análisis de PCR se llevó a cabo en las cuatro semillas para determinar el genotipo de SBEIIa de cada una. Los ensayos iniciales usaron marcadores de PCR dominantes que mostraron la presencia o ausencia de cada gen de SBEIIa en los tres genomas. Se mostró que tres de las semillas eran mutantes doble nulas mientras que la cuarta era una mutante nula triple putativa. Sin embargo, cuando se analizaron adicionalmente con un marcador de PCR co-dominante (ver más adelante), las cuatro semillas mostraron ser mutantes dobles nulas para SBEIIa (es decir, que carecen de SBEIIa en dos genomas) y heterocigota para un gen de SBEIIa mutante en el tercer genoma. Por lo tanto, estas semillas contenían 5 alelos mutantes de SBEIIa y al menos dos alelos mutantes de SBEIIb.
Cuando el embrión de cada semilla se colocó en condiciones de germinar, ninguno de ellos germinó con éxito, quizás debido a que estaban demasiado dañados o que la combinación de mutaciones fue demasiado perjudicial. A fin de tratar de identificar más candidatos, se realizó el análisis NIRS adicional en más semillas F2 de progenie de los cruzamientos M80 y M85, con menos rigurosidad en la selección de semillas candidatas. Los criterios de selección para la segunda prueba fueron que uno de los valores de amilosa aparente predicho debía ser superior a 30 % y el segundo al menos 23 %. Se seleccionó un nuevo conjunto de 22 semillas para la evaluación del gránulo de almidón por microscopía óptica. De las 22 candidatas, 1 semilla, BD85;9F08 (P279-F08-834), mostró un fenotipo de gránulo de almidón distorsionado. Esta mutante se analizó adicionalmente por PCR y se mostró que era una mutante nula doble de SBEIIa de los genomas A y B y heterocigota para el gen de SBEIIa mutante en el genoma D. Esta semilla germinó con éxito por multiplicación.
EJEMPLO 11: DETECCIÓN DE ALELOS DE LA ENZIMA RAMIFICADORA DEL ALMIDÓN CON AFINIDAD DE UNIÓN AL ALMIDÓN ALTERADA
Las poblaciones de los granos de trigo mutagenizados, producidos por el tratamiento con mutágenos químicos tales como azida sódica o EMS o radiación tales como rayos gamma o iones pesados se analizaron para identificar mutantes que tenían mutaciones puntuales en los genes de SBEIIa y en consecuencia potencialmente reducida pero no anulada de SBEIIa-A, -B o -D, o actividad de SBEIIb-A, -B o -D (mutantes parciales) con respecto al trigo tipo salvaje. La prueba para mutantes se basó en la medición de la cantidad de las proteínas SBEIIa o SBEIIb, por ejemplo, usando transferencia Western con anticuerpos específicos para SBEIIa o SBEIIb (ver Ejemplo 2), o por técnicas basadas en afinidad. de la siguiente manera. También se esperaba que esta prueba detecte mutantes mutaciones puntuales que carecían de actividad de SBEIIa-A, -B, o -D por completo, así como mutantes con actividad parcial.
La electroforesis en gel nativo de los extractos de proteína del grano que incluyen las enzimas ramificadoras de almidón a través de una matriz de poliacrilamida que contiene glucógeno, amilopectina, amilosa o dextrina p-límite (electroforesis de gel de afinidad) proporciona un método para identificar alelos de SBEIIa o SBEIIb que codifican SBEIIa o SBEIIb con capacidad de unión al almidón alterada. Dado que el sitio activo de las enzimas ramificadoras de almidón contiene un sitio de unión del almidón, es probable que los polipéptidos de SBEII con eficiencia de unión de alterada tengan alteraciones en la velocidad catalítica y/o afinidad. En particular, es de esperar que los polipéptidos con eficiencia de unión reducida tengan actividad de SBEII reducida.
Se usaron los siguientes métodos basados en Morell et al., 1997; y Kosar-Hashemi et al., 2006 con algunas modificaciones.
Preparación de proteínas. Las proteínas solubles se extrajeron por la homogenización de los endospermos aislados de semillas en desarrollo (aproximadamente 15 días pos-antesis) en 50 mM de buffer fosfato, pH 7,5 que contiene 5 mM de EDTA, 5 mM de DTT, 0,4 % de cóctel inhibidor de proteasa y 20 % de glicerol. Después de la centrifugación a 14.000 g durante 10 min el sobrenadante se usó para la electroforesis en gel. La concentración de proteína en los extractos se estimó mediante el reactivo de ensayo Coomassie Plus Protein.
Electroforesis de afinidad. En una técnica de electroforesis de afinidad bidimensional (2-D) para separar isoformas de la proteína SBEIIa, se cargaron alícuotas de los extractos de proteína (40 o 100 μg) se cargaron en el gel de primera dimensión, un molde de gel de poliacrilamida no desnaturalizante en una unidad de gel de placa de 16 cm vertical Hoefer SE600. El componente de resolución del gel de segunda dimensión fue 6 % de gel desnaturalizante (14 x 16 cm o 16 x 16 cm, 1,5 mm de espesor) que contiene 10 % de glicerol con una cantidad apropiada de polisacárido blanco (amilopectina, dextrina p-límite o glucógeno) inmovilizado en la estructura del gel. Un gel concentrador (libre de polisacáridos) se vertió a 1 cm de la parte superior de las placas de vidrio que se formando por medio de un peine para formar los pocillos. Los geles se corrieron toda la noche a 4 °C a voltaje constante (100 V para glucógeno y dextrina p-límite y 135 V para geles que contienen amilopectina).
De modo alternativo, se usó un sistema dimensional para separar las proteínas de SBEII en el que se cargaron los extractos de proteína (20 μg) en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. El componente de resolución fue un gel no desnaturalizante 6 % que contiene 10 % de glicerol con 0,15 % de dextrina p-límite inmovilizada en la estructura del gel, mientras que el gel concentrador estaba libre de polisacáridos. Los geles se corrieron a 4 °C a corriente constante de 20 mA por gel y voltaje máximo de 200 V.
Las proteínas de SBEIIb también se pueden separar en un gel con gradiente de Bis-Tris 4-12 % (Invitrogen). El gel se corre a 4 °C a corriente constante de 20 mA por gel y voltaje máximo de 200 V.
Detección inmunológica. Para la detección inmunoquímica de las proteínas SBEII después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron de los geles a las membranas de nitrocelulosa usando una unidad de transferencia semiseca TE 70 PWR (Amersham Biosciences). El buffer de transferencia contenía 39 mM de glicina, 48 mM de Tris, 0,0375 % de SDS y 20 % de metanol. La transferencia se llevó a cabo durante 1-1,5 h con una corriente constante de 0,8 mN cm2. La membrana se bloqueó con 5 % de leche descremada antes de la transferencia Western usando anticuerpo policlonal de conejo primario específico para trigo SBEIIa.
Los patrones de migración de las isoformas de SBEII codificadas por los homeoalelos de los genomas A, B y D de trigo mostraron diferencias entre diferentes variedades de trigo cuando se analizaron por el método de electroforesis en gel de afinidad unidimensional. En algunas variedades, la separación clara de las homeoformas A, B y D fue posible, lo que permite la clasificación simple de los polimorfismos en las poblaciones mutagenizadas de estas variedades. Por ejemplo, la electroforesis en gel de afinidad de los extractos de proteína de los endospermos de las variedades de trigo tipo salvaje Sunstate y NB1 mostraron una separación clara de las isoformas SBEIIa-A, -B y -D. Los alelos de la enzima de ramificación con una afinidad reducida por el almidón migraron a una distancia mayor a través del gel de poliacrilamida que contiene polisacáridos que los respectivos homeoalelos nativos. Las líneas que contienes alelos con expresión reducida o ausencia de expresión de un homeoalelo particular se identificarán por la presencia/ausencia de una banda en estado homocigota y a través de densitometría pera medir la intensidad de banda en las líneas heterocigotas. Para validar este método, se confirmó que las plantas mutantes SBEIIa-y SBEIIb que se identificaron por el análisis genotípico (Ejemplo 6 ) carecen de las proteínas SBEIIa o SBEIIb específicas por electroforesis en gel de afinidad, compatible con sus genotipos. Estos experimentos validaron este método de análisis de proteína para la detección de mutantes que tienen una reducción de la cantidad o actividad de una isoforma de SBEII.
El análisis de una población de 2100 líneas mutagenizadas de trigo de la variedad Sunstate, tratadas con azida sódica como se describió en Zwar y Chandler (1995), usando electroforesis en gel de afinidad de dextrian p-límite llevó a la identificación de 18 mutantes que tenían movilidad alterada en los geles de afinidad de una de las proteínas de SBEIIa (mutantes de afinidad) o mutantes nulas para uno de los genes de las SBEIIa sobre la base de la carencia de proteína detectable codificada por este gen. La constante de disociación (Kd) de las interacciones de almidón-enzima para cada una de las isoformas de SBEIIa en una de las mutantes de afinidad se calculó por la medición del cambio en la movilidad de la enzima en función de la concentración de dextrina p-límite en un gel de afinidad 1-D como se describió en Kosar-Hashemi et al., 2006. Esta mutante de afinidad presentó proteínas de SBEIIa con los siguientes valores de Kd: 0,53 g/l, 0,52 g/l y 1,69 g/l para las isoformas SBEIIa-A, SBEIIa-B y SBEIIa-D respectivamente (Figura 13). El valor de Kd observado más alto para la isoforma D en comparación con el de las isoformas A y B indicó una afinidad reducida, inferior de esta isoforma para la unión al almidón, lo que indica que esta línea era una mutante de afinidad para el gen de SBEIIa-D. Se espera que la isoforma del genoma D (SBEIIa-D) de esta línea tenga una actividad enzimática más baja, pero no pérdida total de actividad, en comparación con las otras dos isoformas. Esta expectativa se confirmó con los ensayos de actividad de SBEII en presencia de los alelos nulos de SBEIIa-A y SBEIIa-B.
Las mutantes simples de SBEIIa identificadas a partir de la población Sunstate mutagenizada con azida sódica luego se cruzaron con las mutantes nulas dobles HIB previamente identificadas para aislar mutantes triples que carecen de la actividad de SBEIIa de dos genomas con pérdida total o parcial de actividad del tercer genoma. Se llevaron a cabo cuatro cruzamientos para aislar A1B2D2, dos cruzamientos para cada cepa A2B2D2 y A2B2D1 y un cruzamiento para aislar los genotipos A1B2D1. El examen de la morfología de los gránulos de almidón de las semillas F2 de uno de los cruzamientos A1B2D2 por microscopía identificó semillas con gránulos de almidón severamente distorsionados similares a los que se hallan en los almidones con alto contenido de amilosa (al menos 70 % de amilosa). El genotipo y fenotipo de amilosa de estas semillas se confirma por análisis de los alelos de SBEIIa en las semillas y progenie y por la extracción y análisis del almidón del grano de la progenie. También se realizaron ocho cruzamientos entre las mutantes de afinidad única para producir mutantes de SBEIIa de afinidad doble. Esto incluyó los cruzamientos generados con el fin de aislar las mutantes de afinidad doble A2B2, A2D2 y B2D2. Las progenies de F2 se analizan por los métodos descriptos anteriormente para identificar los mutantes de afinidad homocigota doble.
EJEMPLO 12: PROPIEDADES DE LOS GRÁNULOS DE ALMIDÓN Y ALMIDÓN DEL GRANO DE TRIGO DE ALTO CONTENIDO DE AMILOSA.
Cambios de la morfología del granulo de almidón y birrefringencia Las propiedades del almidón y gránulo de almidón se examinaron en el trigo transgénico con alto contenido de amilosa descripto en el Ejemplo 2. La microscopia de barrido electrónico se usó para identificar los cambios gruesos del tamaño y estructura del gránulo de almidón. En comparación con los controles, no transformados, los gránulos de almidón de los endospermos que tienen expresión de SBEIIa reducida exhibieron alteraciones morfológicas. Estos eran de forma muy irregular y muchos de los gránulos A (> 10 μm de diámetro) parecían de forma de hoz. En contraste, los gránulos de almidón A y B (< 10 μm de diámetro) de los endospermos que tienen expresión de SBEIIb reducida y expresión sin alteraciones de SBEIIa eran de superficie lisa, de forma esférica o elipsoidal e indistinguibles de los gránulos de almidón de trigo tipo salvaje.
Cuando se observan microscópicamente bajo luz polarizada, los gránulos de almidón tipo salvaje normalmente muestran un patrón de birrefringencia fuerte. Sin embargo, la birrefringencia se redujo mucho en los gránulos que contienen almidón de amilosa alta. Menos de 10 % de los gránulos de almidón de las líneas que tienen expresión reducida de SBEIIa y 70 %-80 % de contenido de amilosa eran birrefringentes cuando se visualizaron bajo luz polarizada. En las líneas que no tienen esencialmente expresión de SBEIIb, pero con expresión de SBEIIa tipo salvaje, no se observaron cambios en la birrefringencia en comparación con los controles no transformados. En las líneas tipo salvaje y SBEIIb-suprimida, aproximadamente 94 % de los gránulos de almidón exhibieron birrefringencia completa. Los datos se dan en la Tabla 23. La pérdida de birrefringencia en consecuencia se correlacionó estrechamente con el alto contenido de amilosa.
Contenido de amilosa de grano de trigo transgénico. El contenido de amilosa del grano de trigo transgénico se analizó por dos métodos independientes, a saber, un método yodométrico y un método de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). La determinación yodométrica del contenido de amilosa se basó en la medición del cambio de color cuando el yodo se une a las regiones lineales de a-1,4 glucano, con referencia a una curva estándar generada mediante concentraciones conocidas de amilosa y amilopectina de papa purificadas, como se describe en el Ejemplo 1. El método de cromatografía de exclusión por tamaño se basó en la separación, por cromatografía en columna, de amilosa y amilopectina que no se había desramificado, seguido por la medición de la concentración de almidón en las fracciones eluidas de la columna. Se analizaron tres genotipos de grano. En primer lugar, las plantas transformadas con el constructo de hp-SBEIIa y que tienen niveles muy bajos de expresión de SBEIIa; en segundo lugar, plantas que contienen el constructo de hp-SBEIIb y que no tienen expresión detectable de SBEIIb, pero tipo salvaje para SBEIIa; y, en tercer lugar, el control tipo salvaje no transformado (NB1). El grano de las plantas que carecen de expresión de SBEIIb (008) tenían un contenido de amilosa de 27,3 % determinado por el método yodométrico y 32 % por el método SEC. Esto no fue significativamente diferente para el contenido de amilosa del grano de la línea control no transformada NB1 (31,8 % yodométrico, 25,5 % SEC). Sin embargo, en el grano que tiene la expresión reducida de SBEIIa (línea 087) el contenido de amilosa estaba significativamente elevado (88,5 % yodométrico, 74,4 % SEC). Se consideró que la diferencia en estas dos cifras para la línea 087 es la presencia de algún "material intermedio" que une yodo al igual que la amilosa y se midió en el ensayo yodométrico como amilosa, pero se separó en la cromatografía en columna con la amilopectina más grande.
Distribución de la longitud de la cadena de almidón por FACE. La distribución de la longitud de la cadena de almidón desramificado con isoamilasa se determinó por electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforo (FACE). Esta técnica proporciona un análisis de alta resolución de la distribución de longitudes de cadena en el rango de DP 1 a 50. A partir del gráfico de diferencia molar en que distribución de la longitud de la cadena normalizada del control no transformado se sustrajo de la distribución normalizada de las líneas transgénicas, se observó que hubo una disminución marcada de la proporción de longitudes de cadena de DP 6-12 y un correspondiente aumento de las longitudes de cadena mayor de DP12 en el almidón del grano que tiene expresión reducida de SBEIIa. No se observó una alteración estadísticamente significativa de la distribución de la longitud de la cadena de almidón de las líneas hp-SBEIIb en comparación con tipo salvaje.
Peso molecular de amilopectina y amilosa. La distribución del peso molecular del almidón se determinó por la HPLC de exclusión por tamaño (SE-HPLC). El sistema de HPLC estaba compuesto de una bomba GBC (LC 1150, GBC Instruments, Vic, Australia) equipado con automuestreador (GBC, LC1610) y detector de dispersión luminosa evaporativa (ELSD) (ALLTech, Deerfield, USA). Se usaron la columna Ultrahydrogel™ 1000, columna Ultrahydrogel™ 250 y columna de protección (7,8 mm x 300 mm, Waters, Japón) y se mantuvieron a 35°C durante la operación de HPLC. Se usó buffer de acetato de amonio (0,05 M; pH 5,2) como fase móvil a una velocidad de flujo de 0,8 ml mim 1
El peso molecular de la amilopectina en el almidón del grano con SBEIIa reducido pareció mucho menos que el de la amilopectina en los almidones de NB1 (tipo salvaje, no transgénico) y el grano de SBEIIb reducida (posición pico de 7166 kDa versus 45523, 43646 kDa). En contraste, el peso molecular de la amilosa del grano de SBEIIb reducida no fue significativamente diferente en comparación con el del grano tipo salvaje de la variedad no transformada NB1. Los datos están en la Tabla 24.
Contenido de almidón total en endospermo de trigo con expresión reducida de SBEIIa. El análisis del contenido de almidón total en el grano como un porcentaje de peso del grano reveló una ligera reducción del contenido de almidón del endospermo de la línea de hp-SBEIIa (43,4 %) en comparación con 52 % de la línea control y 50,3 % de hp-SBEIIb (Tabla 23). Esto indicó que hubo algo de reducción de la síntesis de almidón total cuando la expresión de SBEIIa se redujo con el constructo inhibidor.
Potencia de hinchamiento del almidón (SSP). La potencia de hinchamiento del almidón gelatinizado se determinó siguiendo la prueba de pequeña escala de Konik-Rose et al., 2001 que midió la absorción de agua durante la gelatinización del almidón. El valor estimado de la SSP fue significativamente más bajo para el almidón de la línea de SBEIIa reducida con una cifra de 3,51 en comparación con el almidón del control (9,31) y el grano de SBEIIb reducida (10,74) (Tabla 23).
Propiedades de formación de la pasta de almidón. Se determinaron los parámetros de viscosidad de la pasta de almidón usando un Rapid Visco Analyzer (RVA) esencialmente como se describe en Regina et al., 2004. El perfil de temperatura para la RVA comprendió las siguientes etapas: mantenimiento a 60°C durante 2 min, calor a 95°C durante 6 min, mantenimiento a 95°C durante 4 min, enfriamiento a 50°C durante 4 min, y mantenimiento a 50°C durante 4 min. Los resultados (Tabla 25) mostraron que las viscosidades pico y final estaban significativamente más bajas en el almidón del grano de SBEIIa reducida en comparación con el almidón de trigo control.
Propiedades de gelatinización del almidón. Las propiedades de gelatinización del almidón se estudiaron usando calorimetría de barrido diferencial (DSC) que se describe en Regina et al., 2004. La DSC se llevó a cabo en un calorímetro de barrido diferencial Perkin Elmer Pyris 1. Almidón y agua se premezclaron en una relación de 1:2 y se pesaron aproximadamente 50 mg en una placa de DSC que se selló y dejó equilibrar durante la noche. Se usó una velocidad de calentamiento de 10 °C por minuto para calentar las muestras de ensayo y de referencia desde 30 a 130 °C. Los datos se analizaron usando el software disponible con el instrumento. Los resultados (Tabla 26) mostraron claramente una demora final de la temperatura de gelatinización (72,6 °C) para el almidón del grano de SBEIIa reducida en comparación con el control (66 ,6 °C). La temperatura de gelatinización pico también fue más alta en el almidón de SBEIIa reducida (63,51 °C) en comparación con el almidón control (61,16 °C).
EJEMPLO 13: ANÁLISIS DE HARINA DE TRIGO CON ALTO CONTENIDO DE AMILOSA DURANTE EL PROCESAMIENTO.
Estudios de procesamiento de presión en colaboración con CSIRO Food y Nutritional Sciences, Werribee. La caracterización estructural de los almidones de trigo con alto contenido de amilosa en comparación con almidón nativo se realizó usando dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS). El estudio fue diseñado para incluir a) caracterizar la harina de trigo cruda y b) análisis de tiempo del proceso de gelatinización durante la cocción a presión de las muestras de harina o almidón a temperaturas mayores de 100 °C y c) cambios estructurales en el enfriamiento durante un período de 0 a 10 días, y retrogradación. El estudio usó muestras de harina de trigo de variado contenido de amilosa que varía de aproximadamente 25 % (tipo salvaje) a aproximadamente 75 %, aumentado en incrementos de aproximadamente 10 %.
Se incluyeron tres conjuntos de muestras de harina en los experimentos. En primer lugar, con líneas sin mezclas de trigo con alto contenido de amilosa de las líneas de SBEIIa reducida, una línea de trigo con nivel medio de amilosa AC45.1 que se transformó con el constructo hp-combo que tiene aproximadamente 50 % de amilosa (Ejemplo 2) y del trigo control (NB1). En segundo lugar, con material de trigo mezclado de las líneas transformadas como se describe en el Ejemplo 2, mezcla de muestras con incrementos de 10 % que aumentan el contenido de amilosa. En tercer lugar, comparación de la harina de diferentes especies que incluyen trigo (amilosa alta, tipo salvaje, y trigo carente de SSIIa), cebada (tipo salvaje, amilosa alta por SBEIIa y SBEIIb reducida, y amilosa alta por SSII reducida), y maíz con alto contenido de amilosa. Los resultados del análisis de almidón resistente sobre el material de trigo mezclado con un rango de contenido de amilosa revelaron un aumento lineal en el almidón resistente de un contenido de amilosa de >40 %.
Ejemplo 14: PRODUCCIÓN DE PANES Y OTROS PRODUCTOS ALIMENTICIOS
Una de las maneras más efectivas de administrar un grano tal como trigo con alto contenido de amilosa en la dieta es a través del pan. Para mostrar que el trigo con alto contenido de amilosa se puede incorporan fácilmente en los panes y examinar los factores que permitieron la retención de la calidad de fabricación del pan, las muestras de harina se produjeron, analizaron y usaron en el horneado. Se emplearon los siguientes métodos.
Métodos. Los granos de trigo se acondicionaron a un contenido de humedad de 16,5 % durante la noche y se molieron con un molino de escala de laboratorio Buhler de BRI Ltd, Australia, o mediante un molino Quadromat Junior seguido por tamizado para obtener un tamaño de partícula final de 150 μm. El contenido de proteína y humedad de las muestras se determinó por reflectancia infrarroja (NIR) de acuerdo con el método de AACC 39-11 (1999), o por el método de Dumas y horno de aire caliente de acuerdo con el método AACC 44- 15 A (AACC51999). Mezclado de Micro Z-rama. Se determinaron los valores de absorción de agua óptima de las harinas de trigo con el mezclador Micro Z-arm, usando 4 g de harina de ensayo por mezcla (Gras et al., 2001; Bekes et al., 2002). Se usaron la velocidad angular constante con velocidades de eje para las paletas rápida y lenta de 96 y 64 rpm, respectivamente, durante todas las mezclas. El mezclado se llevó a cabo por triplicado, cada uno durante 20 minutos. Antes de añadir agua a la harina, se registró automáticamente el nivel basal (30 seg) por mezclado de los componentes sólidos solos. La adición de agua se llevó a cabo en una etapa usando una bomba de agua automática. Se determinaron los siguientes parámetros a partir de los experimentos de mezclado individuales tomando los promedios: WA %-La absorción de agua se determinó a una consistencia de masa de 500 unidades Brabender (BU); tiempo de desarrollo de la masa (DDT): tiempo a la resistencia pico (seg).
Mixogramas. Para determinar los parámetros de mezclado de masa óptimos con la harina de trigo modificada, las muestras con absorción de agua variable correspondiente a la absorción de agua determinada por el mezclador Micro Z-arm, se mezclaron en un Mixograph prototipo de 10 g CSIRO que mantiene la masa de la pasta total constante. En cada una de las muestras de harina, se registraron los siguientes parámetros: MT - tiempo de mezclad (seg); PR - resistencia del pico de Mixograph (Unidades arbitrarias, AU); BWPR - ancho de banda en la resistencia pico (Unidades arbitrarias, AU); RBD - resistencia a la degradación (%); BWBD - ancho de banda de la degradación (%); TMBW - tiempo al ancho de banda máximo (s); y MBW - ancho de banda máximo (Unidades arbitrarias, A.U.).
Ensayo de micro extensión. Los parámetros de extensibilidad de la masa se midieron de la siguiente manera: Las masas se mezclaron al desarrollo de la masa pico en 10 g prototipo Mixograph. Las pruebas de extensión a 1 cm/s se llevaron a cabo en un analizador de textura TA.XT2i con una masa de Kieffer de geometría modificada y equipo de extensibilidad del gluten (Mann et al., En 'Workshop on gluten proteins' Eds. Lafiandra et al., The Royal Society de Chemistry: Cambridge, UK, pp. 215-218, 2003). Las muestras de masa para el ensayo de extensión (~1,0 g /ensayo) se moldearon con un moldeador de Kieffer y dejaron reposar a 30 °C y 90 % de R h durante 45 min antes del ensayo de extensión. Se determinaron la R_Máx y Ext_Rmáx a< partir de los datos con ayuda del software Exceed Expert (Smewing, The measurement of dough and gluten extensibility using the SMS/Kieffer rig and the TA.TX2 texture analyzer handbook, SMS Ltd: Surrey, UK, 1995; Mann, 2002).
Una receta ilustrativa basada en 14 g de harina como 100 % fue la siguiente: harina 100 %, sal 2 %, levadura seca 1,5 %, aceite vegetal 2 %, y mejorador (ácido ascórbico 100 ppm, amilosa fúngica 15 ppm, xilanasa 40 ppm, harina de soja 0,3 %, obtenida de Goodman Fielder Pty Ltd, Australia) 1,5 %. El nivel de adición de agua se basó en los valores de absorción de agua micro Z-arm que se ajustaron para la fórmula completa. La harina (14 g) y los otros ingredientes se mezclaron en el tiempo de desarrollo de la masa máximo en un Mixograph 35 g. El moldeado y lavado se llevó a cabo en etapas de prueba de dos pasos a 40 C y 85 % de RH. El horneado se llevó a cabo en un horno Rotel durante 15 min a 190 °C. El volumen de la hogaza (determinado por el método de desplazamiento de la semilla de canola) y las mediciones de peso se tomaron después del enfriamiento en una rejilla durante dos 2 horas. Se midió la pérdida de agua neta por pesado de las hogazas con el tiempo.
La harina o harina integral se pueden mezclar con harina o integral de trigos no modificador u otros cereales tales como cebada para proporcionar la masa y elaboración de pan o calidades nutricionales deseadas. Por ejemplo, la harina de los cvs Chara o Glenlea tiene una resistencia de masa alta mientras que la de cv Janz tiene una resistencia de masa media. En particular, los niveles de las subunidades de glutenina de peso molecular alto y bajo en la harina se correlacionan positivamente con la resistencia de la masa y también están influidos por la naturaleza de los alelos presentes.
La harina de las líneas de trigo transgénico que tienen SBEIIa reducida se usó en los niveles de adición de 100 %, 60 % y 30 %, por ejemplo, todas las harinas provinieron de diversas líneas de trigo o se añadieron 60 % o 30 % a la harina de control de horneado (B. extra). Los porcentajes son de harina total en la formulación del pan. Se usaron cuatro líneas de trigo transgénico de la siguiente manera: 072 (SBEIIa reducida), 212 (una línea de trigo derivada del cruzamiento, SBEIIa reducida x SBEI triple nula de trigo), H7 (una línea de trigo derivada del cruzamiento, SBEIIa reducida x SSIIa triple nula del trigo) y 008 (SBEIIb reducida) se ensayaron junto con un trigo control no transformado (NB1). Todos los trigos se molieron en un molino Brabender Quadramat Junior. Todas las mezclas tenían absorciones de agua determinadas en un mezclador 4 g Z-army tiempos de mezclado óptimos determinados en 10 g Mixograph como se describió anteriormente. Estas condiciones se usaron para preparar las hogazas de horneado de ensayo de 10 g.
Propiedades de mezclado. Además de las líneas control (Control de horneado, NB1 y 008), todas las otras líneas de trigo dieron valores de absorción de agua muy elevados (Figura 17 (a)). Las líneas 212 y 072 proporcionaron valores de absorción de agua crecientes con niveles de adición crecientes, que incluyen hasta un máximo de 95 % absorción de agua a 100 % de adición de harina 212. Los niveles de incorporación aumentados de harina de estas líneas también llevaron a una disminución de los tiempos de mezclado de Mixograph óptimos (Figura 17 (b)). Al igual que con los datos de absorción de agua, las líneas no control mostraron una fuerte reducción en el volumen de hogaza específico (volumen de hogaza/peso de hogaza) con niveles crecientes de adición. El efecto fue particularmente fuerte para la línea 212.
Estos estudios muestran que panes con potencial comercial, que incluyen estructura, textura y aspecto de la miga aceptables, se pueden obtener usando la harina de trigo con alto contenido de amilosa mezclado con muestras de harina control. Además, los trigos con alto contenido de amilosa se usan en combinación con características del trasfondo genético preferidas (por ejemplo, gluteninas de peso molecular alto y bajo), la adición de mejoradores tales como gluten, ascorbato o emulsionantes, o el uso de diferentes estilos de elaboración de pan (por ejemplo, elaboración de pan de esponja y molde, masa fermentada, grano mixto, o integral) para proporcionar una variedad de productos con utilidad particular y eficacia nutricional para mejorar la salud intestinal y metabólica.
Otros productos alimenticios: Se prepararon fideos alcalinos amarillos (YAN) (100 % de harina, 32 % de agua, 1 % de Na2CÜ3) en un mezclador Hobart usando el método de fabricación de fideos estándar BRI Research (AFL 029). Se formó la lámina para fideos en los rodillos de acero inoxidable de una máquina de fideos Otake. Después de reposar (30 min) la lámina de fideos se redujo y cortó en hilos. Las dimensiones de los fideos fueron 1,5 x 1,5 mm. Se prepararon fideos instantáneos (100 % de harina, 32 % de agua, 1 % de NaCl y 0,2 % de Na2CO3) en un mezclador Hobart usando el método de fabricación de fideos estándar BRI Research (AFL 028). Se formó la lámina para fideos en los rodillos de acero inoxidable de una máquina de fideos Otake. Después de reposar (5 min) la lámina de fideos se redujo y cortó en hilos. Las dimensiones de los fideos fueron 1,0 x 1,5 x 25 mm. Los hilos de fideos se cocieron al vapor durante 3,5 min y luego se frieron en aceite a 150 C durante 45 seg.
Pan de esponja y de molde (S&D). El horneado de esponja y masa de BRI Research involucró un proceso de dos etapas. En la primera etapa, se elaboró la esponja por mezclado de la harina total con agua, levadura y alimento con levadura. La esponja se dejó fermentar durante 4 horas. En la segunda etapa, la esponja se incorporó al resto de la harina, agua y otros ingredientes para obtener la masa. La etapa de esponja del proceso se obtuvo con 200 g de harina y se proporcionaron 4 horas de fermentación. La masa se preparó por el mezclado de los restantes 100 g de harina y otros ingredientes a la esponja fermentada.
Pasta-Spaghetti. El método usado para la producción de pasta se describió en Sissons et al, 2007. Las muestras harina de ensayo de trigo con alto contenido de amilosa (SBEIIa reducida) y trigo control (NB1) se mezclaron con semolina Manildra en varios porcentajes (muestra de ensayo: 0, 20, 40, 60, 80, 100 %) para obtener mezclas de harina para la preparación de pasta en pequeña escala. Las muestras se corrigieron a 30 % de humedad. Se añadió la cantidad deseada de agua a las muestras y se mezclaron brevemente antes de transferirse a un bol farinógrafo de 50 g para un mezclado adicional de 2 min. La masa resultante, que parece migas del tamaño del grano de café, se transfirió a una cámara de acero inoxidable y reposó a presión de 7000 kPa durante 9 min a 50 C. Luego la pasta se extrudió a una velocidad constante y se cortó en extensiones de aproximadamente 48 cm. Se prepararon dos lotes de pasta para cada muestra. La pasta se secó usando un gabinete de temperatura y humedad Thermoline (TEC 2604) (Thermoline Scientific Equipment, Smithfield, Australia). El ciclo de secado consistió en una temperatura de mantenimiento de 25 C seguido por un aumento a 65 C durante 45 min luego un período de aproximadamente 13 h a 50 °C seguido por enfriamiento a 25 °C. Se controló la humedad durante el ciclo. La pasta seca se cortó en tiras de 7 cm para los ensayos posteriores.
Ejemplo 15: MEDICIONES In vitro DEL Índice glicémico (GI) y Almidón resistente (RS) de LAS muestras DE ALIMENTOS
El Índice glicémico (GI) de las muestras de alimentos que incluyen el pan obtenido como se describió en la presente se midió in vitro de la siguiente manera: Las muestras de alimentos se homogenizaron con un procesador de alimentos doméstico. Se peso una cantidad de muestra que representa aproximadamente 50 mg de carbohidrato en un recipiente de muestra de plástico de 120 ml y se añadieron 100 μl de buffer carbonato sin a-amilasa. Aproximadamente 15-20 segundos después de la adición de buffer carbonato, se añadieron 5 ml de solución de pepsina (65 mg de pepsina (Sigma) disuelta en 65 ml de HCl 0,02 M, pH 2,0, preparad en el día de uso), y la mezcla se incubó a 37 °C durante 30 minutos en un baño de agua oscilante a 70 rpm. Después de la incubación, la muestra se neutralizó con 5 ml de NaOH (0,02 M) y se añadieron 25 ml de buffer acetato 0,2 M, pH 6. Luego se añadieron 5 ml de la mezcla de enzima que contiene 2 mg/ml de pancreatina (a-amilasa, Sigma) y 28 U/ml de amiloglucosidasa de Aspergillus niger (AMG, Sigma) disueltos en buffer de acetato de Na (buffer de acetato de sodio, 0,2 M, pH 6,0, que contiene 0,20 M de cloruro de calcio y luego se añadieron 0,49 mM de cloruro de magnesio), y la mezcla se incubó durante 2-5 minutos. Se transfirió 1 ml de solución de cada matraz en un tubo de 1,5 ml y se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y se conservó en un congelador. El resto de cada muestra se cubrió con papel de aluminio y los recipientes se incubaron a 37 °C durante 5 horas en un baño de agua. Luego se recogió 1 ml adicional de solución de cada matraz, se centrifugó y el sobrenadante se transfirió como se realizó previamente. Esto también se almacenó en un congelador hasta que se pudieron leer las absorbancias.
Todas las muestras se descongelaron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos. Las muestras se diluyeron según sea necesario (dilución 1 en 10 usualmente suficiente), se transfirieron 10 μl de sobrenadante de cada muestra a placas de microtitulación de 96 pocillos por duplicado o triplicado. Una curva estándar para cada placa de microtitulación se preparó usando glucosa (0 mg, 0,0625 mg, 0,125 mg, 0,25 mg, 0,5 mg y 1,0 mg). Se añadieron 200 ul de reactivo Glucose Trinder (Microgenetics Diagnostics Pty Ltd, Lidcombe, NSW) a cada pocillo y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. La absorbancia de cada muestra se midió a 505 nm usando un lector de placa y la cantidad de glucosa se calculó con referencia a la curva estándar.
El nivel de almidón resistente (RS) en las muestras de alimentos que incluyen el pan obtenido como se describió en la presente se midió in vitro de la siguiente manera. Este método describe preparación de la muestra y la digestión in vitro del almidón en alimentos, como se ingieren normalmente. El método tiene dos secciones: primero, el almidón del alimento se hidrolizó en condiciones fisiológicas simuladas; segundo, los subproductos se extrajeron a través del lavado y el almidón residual se determinó después de la homogenización y secado de la muestra. El almidón cuantificado al final del tratamiento de digestión representó el contenido de almidón resistente del alimento.
En el día 1, las muestras de alimentos se procesaron de una manera que simula el consumo, por ejemplo, por homogenizado con un procesador de alimentos doméstico a una consistencia que se puede obtener por masticado. Después de la homogenización, se pesó una cantidad de alimento que representa hasta 500 mg de carbohidrato en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Se preparó un buffer carbonato por la disolución de 121 mg de NaHCO3 y 157 mg de KCl en aproximadamente 90 ml de agua purificada, se añaden 159 μl de solución 1 M de CaCl2,6 H2O y 41 μl de 0,49 M de MgCl2,6 H2O, ajustando el pH a 7 a 7,1 con 0,32 M HCl, y ajustando el volumen a 100 ml. Este buffer se almacenó a 4 °C durante hasta cinco días. Se preparó una solución de saliva artificial que contiene 250 unidades de a-amilasa (Sigma A-3176 Tipo VI-B de páncreas porcino) por ml del buffer carbonato. Se añadió una cantidad de solución de saliva artificial, aproximadamente igual al peso del alimento, al matraz. Aproximadamente 15-20 segundos después de añadir la saliva, 5 ml de solución de pepsina en HCl (1 mg/ml de pepsina (Sigma) en HCl 0,02 M, pH 2,0, preparada en el día de uso) se añadieron a cada matraz. La mezcla de la amilasa y luego la pepsina imitaron el masticado humano del alimento antes de tragarlo. La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 min con agitación a 85 rpm. La mezcla luego se neutralizó con 5 ml de NaOH 0,02 M. Se añadieron 25 ml de buffer acetato (0,2 M, pH 6 ) y 5 ml de mezcla de enzima pancreatina que contiene 2 mg/ml de pancreatina (Sigma, páncreas porcino con actividad de 4 x USP) y 28 U de amiloglucosidasa (AMG, Sigma) de Aspergillus niger en buffer acetato, pH6 , por matraz. Cada matraz se tapó con papel de aluminio y se incubó a 37 °C durante 16 horas en un baño de agua oscilante ajustado a 85 rpm.
En el día 2, los contenidos de cada matraz se transfirieron cuantitativamente a un tubo de propileno de 50 ml y se centrifugaron a 2000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se descartaron y cada pellet se lavó tres veces con 20 ml de agua, el tubo se agitó suavemente en vórtex con cada lavado para romper el pellet, seguido por centrifugación. Se analizaron 50 μl de del último lavado con agua con reactivo de Glucose Trinder para determinar la ausencia de glucosa libre. Cada pellet luego se resuspendió en aproximadamente 6 ml de agua purificada y se homogenizó tres veces durante 10 segundos mediante un Ultra Turrax TP18/10 con una herramienta de dispersión S25N-8G. Los contenidos se transfieren cuantitativamente a un matraz volumétrico de 25 ml y se llevaron a volumen. Los contenidos se mezclaron por completo y retornaron al tubo de polipropileno. Una muestra de 5 ml de cada suspensión se transfirió al tubo de cultivo de 25 ml e inmediatamente se congeló en cáscara en nitrógeno líquido y liofilizó.
En el día 3, el almidón total de cada muestra se midió usando reactivos provistos en el kit de procedimiento de almidón total Megazyme. Se prepararon estándares de almidón (Regular Maize Starch, Sigma S- 5296) y un reactivo de blanco de ensayo. Las muestras, controles y blancos de reactivo se humectaron con 0,4 ml de etanol 80 % para ayudar a la dispersión, seguido por agitación en vórtex. Inmediatamente se añadieron 2 ml de DMSO y las soluciones se mezclaron por agitación en vórtex. Los tubos se colocaron en un baño de agua hirviente durante 5 min, y se añadieron inmediatamente 3 ml de a-amilasa termoestable (100 U/ml) en buffer MOPS (pH 7, que contiene 5 mM de CaCl2 y 0,02 % de azida sódica). Las soluciones se incubaron en el baño de agua hirviente durante 12 min adicionales, con mezclado en vórtex en intervalos de 3 minutos. Los tubos luego se colocaron en un baño de agua a 50 °C y se añadieron 4 ml de buffer de acetato de sodio (200 mM, pH 4,5, que contiene 0,02 % de azida sódica) y 0,1 ml de amiloglucosidasa a 300 U/ml. Las mezclas se incubaron a 50 °C durante 30 min con mezclado suave en intervalos de 10 min. Los volúmenes se llevaron a 25 ml en un matraz volumétrico y se mezclaron bien. Las alícuotas se centrifugaron a 2000 x g durante 10 min. La cantidad de glucosa en 50 μl de sobrenadante se determinó con 1,0 ml de reactivo de Glucose Trinder y se midió la absorbancia a 505 nm después de la incubación de los tubos a temperatura ambiente en la oscuridad durante un mínimo de 18 min y un máximo de 45 min.
Las hogazas de pan horneadas de harina de cuatro líneas de trigo transgénico, a saber 072 (SBEIIa reducida), 212 (una línea de trigo derivada del cruzamiento, SBEIIa reducida x SBEI triple nula de trigo), H7 (una línea de trigo derivada del cruzamiento, SBEIIa reducida x SSIIa triple nula de trigo) y 008 (SBEIIb reducida) se ensayaron junto con un trigo control no transformado (NB1 para RS y Gi después de la incorporación de los niveles de 100 %, 60 % y 30 % de harina, el restante 40 % o 70 % de harina es del grano tipo salvaje. El aumento de incorporación de harina 212, 072, y H7 produjo aumentos significativos del RS y reducciones del GI predicho (Figura 16). La magnitud de los cambios fue más grande cuando se usa harina de la línea 212. Por ejemplo, el pan elaborado con 100 % de adición de esta harina con amilosa alta presentó un contenido de RS de aproximadamente 10 % que representó un aumento de 150 % por encima de este para el nivel de 30 % de inclusión y un aumento de 9 veces en comparación con los controles NB1. El aumento del grado de incorporación de la harina de las líneas 008 no tuvo efecto sobre el RS y GI de las hogazas resultantes y los resultados fueron comparables con los de la harina control de horneado.
EJEMPLO 16: PROCESAMIENTO DE TRIGO CON ALTO CONTENIDO DE AMILOSA Y NIVELES DE RS RESULTANTES
Se realizó un estudio en pequeña escala para determinar el contenido de almidón resistente (RS) en el grano procesado del trigo con alto contenido de amilosa que ha sido aplastado o desmenuzado. La técnica involucró el acondicionamiento de los granos a un nivel de humedad de 25 % durante una hora, seguido por la cocción a vapor de los granos. Después del tratamiento de vapor, los granos se desmenuzaron usando un rodillo de pequeña escala. Las hojuelas luego se tostaron en un horno a 120 °C durante 35 min. Se usaron dos anchos de rodillo y tres tiempos del tratamiento de vapor sobre aproximadamente 200 g de muestras de trigo con alto contenido de amilosa que tiene SBEIIa reducida (HAW, línea 85,2c) y tipo salvaje, trigo control (cv. Hartog). Los anchos de rodillo examinados fueron 0,05 mm y 0,15 mm. Los tiempos del tratamiento de vapor probados fueron 60', 45' y 35'.
Este estudio mostró un aumento claro y sustancial de la cantidad de RS en el trigo procesado con alto contenido de amilosa en comparación con el control (Tabla 27, Figura 16). También apareció algún efecto de las condiciones de procesamiento sobre el nivel de RS. Por ejemplo, con el grano de alto contenido de amilosa, los tiempos del tratamiento de vapor aumentados llevaron a una ligera reducción del nivel de RS, más probablemente debido al aumento de la gelatinización del almidón durante el tratamiento de vapor (Tabla 27). La brecha del rodillo más ancho generó un nivel de RS más alto excepto en el tiempo del tratamiento de vapor más largo. Esto pudo deberse al aumento de daño de cizallamiento de los gránulos de almidón cuando los granos rodaron en las brechas más angostas, lo que reduce ligeramente los niveles de RS. Las brechas más angostas del redilo también llevaron a mayores niveles de RS en el control Hartog, aunque en niveles de RS totales mucho menores. En contraste con los resultados de la amilosa alta, el aumento de los tiempos de tratamiento de vapor llevó a mayores niveles de RS, posiblemente debido al aumento de gelatinización del almidón a tiempos de almidón más largos contribuyendo a más retrogradación del almidón durante el posterior procesamiento y enfriamiento.
Datos consolidados del RS de varios productos. Los datos de RS obtenidos de varios productos tales como fideos, pan de esponja y de molde y spaghetti, preparados como se describió en el Ejemplo 10, se presentan en la Tabla 28. No se ensayaron todos los niveles de incorporación para todos los productos, pero los niveles de incorporación de 20 %, 40 % y 60 % se usaron en la mayoría de los productos analizados. Los resultados mostraron una relación lineal entre el contenido de RS y el nivel de incorporación de la harina con alto contenido de amilosa.
EJEMPLO 17: AISLAMIENTO DE PLANTAS QUE TIENEN MUTACIONES PUNTUALES EN SBEIIA
Se desarrolló una población de líneas de planta mutadas después de la mutagénesis EMS de las semillas del cultivar de trigo Arche o Apache, usando las condiciones de tratamiento EMS estándares. Aproximadamente 5000 plantas Apache y 900 Arche individuales M1 se cultivaron a partir de la semilla mutagenizada, autofertilizada y semillas de cada planta y las posteriores generaciones de progenie mantenidas como líneas potencialmente mutantes, cada una derivada de una planta individual M1. Las líneas se analizaron para determinar mutaciones en los tres genes homeólogos de SBEIIa por silenciamiento de Solexa de la próxima generación (Illumina). Para realizar esto, se prepararon 7 mezclas de ADN, cada una por la combinación de ADN de aproximadamente 130 familias de la población Arche y 96 de la población Apache. Se llevó a cabo la PCR en los ADN mezclados para 3 o 4 regiones por gen homoeólogo, que se dirigen a las regiones exónicas que incluyen sitios de empalme de los genes. Los cebadores específicos del genoma se exponen en la Tabla 29.
Los 10 amplicones (productos de amplificación) de las mismas mezclas de ADN se unieron después de la normalización de los productos de PCR, y se realizó la secuenciación con una cela de flujo por mezcla de ADN. Los datos de secuencia se analizaron para seleccionar de todos los polimorfismos los más probablemente debidos a las mutaciones más que a errores de secuenciación, sobre la base de las frecuencias de los polimorfismos observados. Se observaron 64 mutantes putativas de la población Arche y 48 de la población Apache del primer análisis de secuencia que cubre las regiones exónicas y los sitios de empalme. Los ensayos de SNP se diseñaron para cada polimorfismo sobre la base de la tecnología kaspar, y se realizó la genotipificación de las 130 familias 130 en cada mezcla que fue positiva para el polimorfismo particular. De este modo, se identificó la línea mutante individual que contiene cada gen mutante y se confirmaron las secuencias de SBEIIa mutante.
Por este método, se identificaron 31 líneas mutantes de la población Apache y 9 de la población Arche que tienen una mutación de SBEIIa, y los granos M2 de cada una se retuvieron. De cada línea mutante, según la disponibilidad, se cortaron por la mitad alrededor de 10 semillas M2, la mitad sin el embrión se usó para la extracción y el análisis de ADN, la otra mitad con el embrión se guardó para sembrar. Se confirmó un total de 5 mutantes en las mitades de semilla de la población Arche y 28 de la población Apache. Las semillas correspondientes se sembraron para producir las plantas de progenie para confirmar que las mutaciones se heredaron de modo Mendelianp por la repetición del análisis en el material de hoja de planta M2, proporcionando ADN de calidad mucho mejor. Estos análisis confirmaron 19 mutantes, 4 de la población Arche y 15 de la población Apache y permitió que su clasificación de acuerdo con el ADN y las secuencias de proteínas deducidas codificadas por las mutantes.
Las mutantes obtenidas incluyeron las que tenían los genes de SBEIIa mutados con los codones de detención en las regiones codificadoras de proteína de los genes de SBEIIa sobre los genomas B o D, lo que causa terminación prematura de la traducción de las proteínas de SBEIIa, y líneas con mutaciones del sitio de empalme en los genes de SBEIIa-B o -D. Se esperó que tales mutaciones sean mutaciones nulas. También se obtuvieron mutaciones puntuales de los genes SBEIIa-A, SBEIIa-B y SBEIIa-D tales como la mutación por sustitución de aminoácidos y su impacto sobre la estructura de las proteínas codificadas predichas por medio de las marices Blosum 62 y Pam 250. Las plantas de las 8 líneas mutantes más promisorias se cruzaron con mutantes dobles nulas de SBEIIa del genotipo apropiado que incluye los genotipos A1D2, A2D2, A1B2, B2D2 a fin de producir las plantas y semillas triple mutantes en la generación F2. Se seleccionan las plantas fértiles que producen semillas con al menos 50 % de amilosa en el contenido de almidón. Las plantas mutantes también se cruzaron con trigo sarraceno (cultivar Soldur) para introducir las mutaciones en el trigo tetraploide.
Tabla 1. Genes de la enzim a ram ificadora de l alm idón caracterizada de los cereales
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continuación
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Tabla 2. S ubclasificación de am inoácidos
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T l . i i n n rv r m in i m lifi iv r f ri
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continuación
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Tabla 4. Cebadores específicos del genom a p ara genes de trigo de SBEIIa
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T l . n i n l i r ífi l n m BEII
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continuación
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Tabla 6. Cebadores d iseñados para am plificar las p artes de l gen de SBEIIa específicam ente de l genom a A de trigo-polim orfism os y tam años de fragm ento detectados
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Tabla 7. Cebadores d iseñados para am plificar las p artes de l gen de SBEIIa específicam ente de l genom a B de trigo- polim orfism os y tam años de fragm ento detectados
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Tabla 8. Cebadores d iseñados p ara am plificar p artes de ll gen de SBEIIa específicam ente de l genom a D de trigo
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(continuación)
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T l . r ífi l n m r l n BEII l ri
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T l 1. n i n l i r ífi l n m BEII
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Tabla 11. Expresión de S B E II versus contenido de am ilosa de A R N i de líneas de trigo Línea Constructo Amilosa % Expresión de SBEIIa con Expresión de SBEIIb Expresión de seleccionada respecto a WT (%) con respecto a WT (%) SBEII total (% de WT) 673.2.1 hp-combo 35 108 91 100 679.5.3 hp-combo 40 81 1 41
670.1.4 hp-combo 45 35 10 23 (continuación)
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Tabla 12. Lista de m arcadores m icrosatelita les analizados en las m utantes
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Tabla 13. M utantes identificadas de la pob lación H IB y datos de l m apeo m icrosatelita l
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(continuación)
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Tabla 14. M utantes doble nulas de SB E II identificadas
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Tabla 15. Cruzam ientos realizados entre m utantes nulas dobles y sim ples
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Tabla 16. Contenido de am ilosa en alm idón en grano de la p rogen ie de cruzam ientos entre m utantes dobles m n n l im l n l m n n l im l
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Tabla 17. O bservaciones de fertilidad de las p lantas de la p rogenie F2
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T l 1. r z mi n i i n l nr m n n l im l l
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continuación
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Tabla 20. Frecuencia observada de genotipos de grano de germ inación norm al de un cruzam iento A2B2D2.
N úm eros entre p aréntesis indican la frecuencia esperada basada en la segregación M endeliana
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T l 21. r z m i n i i n l ^ n r m n n l im l l
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Tabla 22. M utantes nulas dobles y triples p utativas en genes de SBEIIa identificados en la prueba in ic ia l usando m arcadores dom inantes
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Ta l 24. D i ri i n l m l l r l fr i n lm i n l lín r n ni rigo
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T l 2. P r m r RVA lm i n ri h '- BEII r n ni
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Tabla 26. Parám etros D SC del p ico de gelatin ización de alm idón de trigo hp5'-SBEIIa transgénico en com paración con e l contro l NB1
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Tabla 29. Cebadores específicos de l genom a
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Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Grano de trigo (Triticum aestivum) que comprende un embrión, un endospermo, almidón y un nivel o actividad reducidos de la proteína enzima de ramificación de almidón II (SBEII) total, donde el embrión comprende una mutación de pérdida de función en cada uno de 5 a 12 alelos de genes SBEII endógenos seleccionados del grupo que consiste en SBEIIa-A, SBEIIa-B, SBEIIa-D, SBEIIb-A, SBEIIb-B y SBEIIb-D,
de forma que el nivel o actividad de la proteína SBEII total en el grano es de entre 2 % y 30 % del nivel o actividad de la proteína SBEII total en un grano de trigo de tipo salvaje, incluyendo dichos 5 a 12 alelos 4, 5 o 6 alelos de SBEIIa que comprenden cada uno una mutación de pérdida de función,
donde cuando el número de alelos de SBEIIa que comprenden una mutación de pérdida de función es sólo 4 entonces el número de alelos de SBEIIb que comprenden una mutación de pérdida de función es 6, y donde el grano comprende un contenido de amilosa de al menos 50 % (p/p) como una proporción del almidón total del grano,
y donde el grano da lugar a una planta de trigo que es masculina y femenina fértil.
2. El grano de trigo de la reivindicación 1, donde
a) el embrión del grano es homocigota para alelos en cada uno de 2 o 3 genes SBEIIa, comprendiendo cada uno de los alelos homocigotas una mutación de pérdida de función,
b) el grano comprende un alelo que comprende una mutación de pérdida de función parcial que expresa una enzima SBEIIa o SBEIIb que en cantidad y/o actividad corresponde a entre 2 % y 60 %, o entre 10 % y 50 %, de la cantidad o actividad del alelo de tipo salvaje correspondiente,
c) el número de alelos nulos de genes SBEIIa en el embrión es de 2 o 4,
d) los 4, 5 o 6 alelos de SBEIIa que comprenden cada uno una mutación de pérdida de función son cada uno alelos nulos,
e) el embrión no tiene alelos nulos de genes SBEIIb, o el número de alelos nulos de genes SBEIIb en el embrión es 2, 4 o 6,
f) el embrión comprende dos alelos de SBEIIb, comprendiendo cada uno una mutación de pérdida de función parcial,
g) el grano comprende alelos nulos del gen SBEIIa en el genoma A, el genoma B, el genoma D, los genomas A y B, los genomas A y D, o los genomas B y D,
h) el grano comprende alelos nulos del gen SBEIIb en el genoma A, el genoma B, el genoma D, los genomas A y B, los genomas A y D, los genomas B y D, o los tres genomas A, B y D,
i) el grano comprende sólo una o sólo dos proteínas SBEIIb que tienen actividad de enzima de ramificación de almidón cuando se producen en el endospermo en desarrollo, o sólo una o sólo dos proteínas SBEIIb que son detectables mediante análisis de transferencia Western,
j) el grano comprende una mutación nula que es una mutación por supresión en el genoma A, B o D que suprime al menos parte de un gen SBEIIa y al menos una parte de un gen SBEIIb en el genoma,
k) el grano comprende una mutación nula que es una mutación por supresión en el genoma A, B o D que suprime la totalidad del gen SBEIIa y/o la totalidad del gen SBEIIb en el genoma,
l) el grano comprende una mutación nula en un gen SBEIIa que es una mutación por sustitución de aminoácido, m) el embrión comprende una mutación nula en un gen SBEIIa, o mutaciones nulas en más de un gen SBEIIa, donde cada mutación se selecciona independientemente del grupo que consiste en una mutación por supresión, una mutación por inserción, una mutación del sitio de empalme, una mutación por terminación de la traducción prematura y una mutación por cambio de marco,
n) el grano tiene solamente una proteína de SBEIIa según se determina mediante análisis de transferencia Western, donde dicha proteína está codificada por uno de los genes SBEIIa-A, SBEIIa-B y SBEIIa-D y tiene una actividad de enzima de ramificación de almidón reducida cuando se produce en el endospermo de trigo en desarrollo cuando se compara con una proteína SBEIIa codificada por el gen de tipo salvaje correspondiente, o o) una combinación de más de uno de a) a n).
3. El grano de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en que el nivel o actividad de la proteína SBEII total en el grano es de entre 2 % y 15 %, o entre 3 % y 10 %, o entre 2 % y 20 % o entre 2 % y 25 %, del nivel o actividad de la proteína SBEII total en el grano de trigo de tipo salvaje.
4. El grano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que la cantidad o actividad de la proteína SBEIIa en el grano es menor de 2 %, o de entre 2 % y 15 %, o entre 3 % y 10 %, o entre 2 % y 20 % o entre 2 % y 25 %, de la cantidad o actividad de la proteína SBEIIa en el grano de trigo de tipo salvaje.
5. El grano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende un contenido de amilosa de al menos 60 % (p/p) o al menos 67 % (p/p) como una proporción del almidón total del grano.
6. El grano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que no es transgénico o está libre de cualquier ácido nucleico exógeno que codifique un ARN que reduzca la expresión de un gen SBEIIa.
7. El grano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que tiene una tasa de germinación de entre aproximadamente 70 % y aproximadamente 100 % con respecto a la tasa de germinación de un grano de tipo salvaje.
8. El grano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el nivel o actividad de la proteína SBEII total se determina sometiendo a ensayo la proteína SBEII en el grano mientras se desarrolla en una planta de trigo, o sometiendo a ensayo el nivel o actividad de la proteína SBEII por medios inmunológicos.
9. El grano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el almidón del grano se caracteriza por una o más propiedades seleccionadas del grupo que consiste en:
(i) comprender al menos 2 % de almidón resistente,
(ii) comprender un índice glucémico (GI) reducido,
(iii) comprender un nivel de amilopectina reducido,
(iv) comprender gránulos de almidón deformados,
(v) birrefringencia del gránulo de almidón reducida,
(vi) volumen de hinchamiento reducido,
(vii) distribución de longitud de cadena y/o frecuencia de ramificación modificadas,
(viii) retraso de la temperatura de fin de gelatinización y aumento de la temperatura de pico,
(ix) viscosidad reducida,
(x) aumento del peso molecular de la amilopectina,
(xi) un porcentaje de cristalinidad del almidón modificado, y
(xii) un porcentaje de cristalinidad del almidón de tipo A o de tipo B modificado,
con respecto a los gránulos de almidón o el almidón de trigo de tipo salvaje.
10. El grano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que es grano quebrado, triturado, precocido, aplastado, perlado, desmenuzado o molido.
11. Una planta de trigo (Triticum aestivum) que produce grano, comprendiendo el grano un embrión, un endospermo, almidón y un nivel o actividad reducidos de proteína SBEII total,
donde el embrión comprende una mutación de pérdida de función en cada uno de 5 a 12 alelos de genes SBEII endógenos seleccionados del grupo que consiste en SBEIIa-A, SBEIIa-B, SBEIIa-D, SBEIIb-A, SBEIIb-B y SBEIIb-D, de manera que el nivel o actividad de la proteína SBEII total en el grano es de entre 2 % y 30 % del nivel o actividad de la proteína SBEII total en un grano de trigo de tipo salvaje, incluyendo dichos 5 a 12 alelos 4, 5 o 6 alelos de SBEIIa que comprenden cada uno una mutación de pérdida de función,
donde cuando el número de alelos de SBEIIa que comprenden una mutación de pérdida de función es sólo 4, entonces el número de alelos de SBEIIb que comprenden una mutación de pérdida de función es 6,
donde el grano comprende un contenido de amilosa de al menos 50 % (p/p) como una proporción del almidón total del grano,
y donde la planta de trigo es masculina y femenina fértil.
12. Harina integral o harina de trigo producida a partir del grano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo la harina integral o harina un nivel o actividad reducidos de proteína SBEII total y una mutación de pérdida de función en cada uno de 5 a 12 alelos de genes SBEII endógenos seleccionados del grupo que consiste en SBEIIa-A, SBEIIa-B, SBEIIa-D, SBEIIb-A, SBEIIb-B y SBEIIb-D, de manera que el nivel o actividad de la proteína SBEII total en la harina integral o harina es de entre 2 % y 30 % del nivel o actividad de la proteína SBEII total en una harina integral o harina de trigo de tipo salvaje, incluyendo dichos 5 a 12 alelos 4, 5 o 6 alelos de SBEIIa que comprenden cada uno una mutación de pérdida de función, donde cuando el número de alelos de SBEIIa que comprenden una mutación de pérdida de función es sólo 4 entonces el número de alelos de SBEIIb que comprenden una mutación de pérdida de función es 6, y donde el almidón de la harina integral o harina tiene un contenido de amilosa de al menos 50 % (p/p).
13. La harina integral o harina de la reivindicación 12 donde el almidón de la harina integral o harina se caracteriza por uno o más de:
(i) comprender al menos 60 % (p/p), o al menos 67 % (p/p) de amilosa,
(ii) comprender al menos 2 % de almidón resistente,
(iii) comprender un índice glucémico (GI) reducido,
(iv) comprender un nivel de amilopectina reducido,
(v) comprender gránulos de almidón deformados,
(vi) birrefringencia del gránulo de almidón reducida,
(vii) volumen de hinchamiento reducido,
(viii) distribución de longitud de cadena y/o frecuencia de ramificación modificadas,
(ix) retraso de la temperatura de fin de gelatinización y mayor temperatura de pico,
(x) viscosidad reducida,
(xi) aumento del peso molecular de la amilopectina,
(xii) % de cristalinidad modificado
(xiii) porcentaje de cristalinidad del almidón de tipo A o de tipo B modificado,
con respecto a los gránulos de almidón o al almidón de trigo de un tipo salvaje.
14. Un producto alimenticio que comprende un ingrediente alimenticio en un nivel de al menos 10 % sobre una base de peso seco, donde el ingrediente es el grano de trigo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la harina integral o harina de la reivindicación 12 o la reivindicación 13.
15. Un producto alimenticio de acuerdo con la reivindicación 14 donde el contenido de almidón resistente es de entre 1 % y 20 %
16. Un método de producción de almidón, que comprende las etapas de i) obtención de grano de trigo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y ii) extracción de almidón del grano, produciendo así el almidón.
17. Un método de detección de una planta de trigo o grano de trigo, comprendiendo el método (i) determinar la cantidad o actividad de SBEIIa y/o SBEIIb en una planta de trigo o grano de trigo con respecto a la cantidad o actividad en una planta o grano de tipo salvaje y (ii) seleccionar una planta o grano fértil que tenga entre 2 % y 30 % de la cantidad o actividad de la proteína SBEII total en una planta o grano de tipo salvaje, donde la planta o grano seleccionado comprende una mutación de pérdida de función en cada uno de 5 a 12 alelos de genes de SBEII endógenos seleccionados del grupo que consiste en SBEIIa-A, SBEIIa-B, SBEIIa-D, SBEIIb-A, SBEIIb-B y SBEIIb-D, de manera que el nivel o actividad de la proteína SBEII total en el grano es de entre 2 % y 30 % del nivel o actividad de la proteína SBEII total en el grano de trigo de tipo salvaje, incluyendo dichos 5 a 12 alelos 4, 5 o 6 alelos de SBEIIa que comprenden cada uno una mutación de pérdida de función, donde cuando el número de alelos de SBEIIa que comprenden una mutación de pérdida de función es sólo 4 entonces el número de alelos de SBEIIb que comprenden una mutación de pérdida de función es 6, y donde el grano comprende un contenido de amilosa de al menos 50 % (p/p) como una proporción del almidón total del grano.
18. Un método de producción de un alimento o una bebida que comprende las siguientes etapas: (i) obtener el grano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, (ii) procesar el grano para producir un ingrediente de alimento o bebida, y (iii) añadir un ingrediente de alimento o bebida de (ii) a otro ingrediente de alimento o bebida, produciendo así el alimento o bebida.
19. Un método de producción de grano, que comprende las etapas de i) obtener una planta de trigo de acuerdo con la reivindicación 11 que comprende dicho grano de trigo, ii) cosechar dicho grano de trigo de la planta, y iii) opcionalmente, procesar el grano.
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