JP2018518973A - 穀物種子デンプン合成酵素ｉｉ対立遺伝子およびその使用 - Google Patents

穀物種子デンプン合成酵素ｉｉ対立遺伝子およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、コムギ表現型を改変／改善する組成物および方法を提供する。さらに、改変または改善された表現型を有する植物を生成するためのコムギおよび／または他の密接に関連する種を育種する方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１５年７月９日に出願された米国仮特許出願第６２／１９０，３８１号に対する優先権を主張し、それは、すべての説明、参考文献、図および特許請求の範囲を含むその全体があらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。
電子的に提出されるテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出されるテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される：配列表のコンピュータ読み取り可能フォーマットコピー（ファイル名：MONT_155_02_SeqList_ST25.txt、記録日：２０１６年７月５日；ファイルサイズ：４６３キロバイト）。
技術分野
本発明は、概して、コムギの最終生成物の品質特性を改善することに関する。より詳細には、本発明は、１つ以上のデンプン合成遺伝子を修飾することにより、コムギの１つ以上の最終生成物の品質特性を改善するための組成物および方法に関する。
背景
デンプンは、穀物粒の乾燥重量の約７０％を形成し、α−１，４結合を有する直鎖アミロースならびにα−１，４結合およびα−１，６分枝点を有する分岐アミロペクチンといった２形態のグルコースポリマーからなる。パンコムギでは、アミロースはデンプンの約２５％を占め、アミロペクチンは残りの７５％を占める（Tetlow ２００６で検討された）。デンプン粒の合成は、複合体中で会合する幾つかの酵素を含む複雑な過程である（Tetlowら、２００８；Tetlowら、２００４ｂ）。パンコムギでは、遺伝子Ｗｘ−Ａ１ａ、Ｗｘ−Ｂ１ａ、およびＷｘ−Ｄ１ａによってコードされる「モチ様」タンパク質（顆粒結合デンプン合成酵素Ｉ）は、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰアーゼ）によるＡＤＰ−グルコースの生成後のアミロース合成に単独で関与する（Denyerら、１９９５；Miuraら、１９９４；Yamamoriら、１９９４）。それに対し、アミロペクチン合成は、ＡＧＰアーゼ、デンプン合成酵素（ＳＳ）Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、デンプン分枝酵素（ＳＢＥ）ＩおよびＩＩ、ならびにデンプン脱分枝酵素などの多数の酵素を含む（Tetlowら、２００４ａ）。
幾つかのデンプン生合成タンパク質は、デンプン粒タンパク質（ＳＧＰ）と称されるこれらのタンパク質のサブセットとともにデンプン粒の内部に結合された状態を維持する。ＳＧＰ−１タンパク質は、グループ７染色体の短いアーム上の遺伝子ＳＳＩＩａ−Ａ、ＳＳＩＩａ−Ｂ、ＳＳＩＩａ−ＤによってコードされるＳＳＩＩのアイソフォームである（Liら、１９９９）。アミロースが増加したコムギ品種を作出することに多くの関心が払われている。６倍体コムギ生殖質の調査により、ＳＧＰ−Ａ１、ＳＧＰ−Ｂ１、またはＳＧＰ−Ｄ１が欠如した系統が同定され（YamamoriおよびEndo、１９９６）、それらは交配されてＳＧＰ−１ヌルが作出された（Yamamoriら、２０００）。ＳＧＰ−１ヌルは、アミロース含量における２９％の増加を有し（３７．３％のヌル対２８．９％の野生型）、デンプン粒を変形させ、デンプン含量を減少させ、またＳＧＰ−２およびＳＧＰ−３のデンプン粒への結合を低下させた。
ＳＧＰ−１ヌル系統の主な利点は、その増加したアミロース、タンパク質含量、および食物繊維にある。しかし、ＳＧＰ−１ヌルの主な欠陥は、その減少した種子サイズおよび農学的収量における全体的減少にある。したがって、コムギのアミロース含量を増加させる一方、種子サイズおよび収量における大幅な減少を緩和する組成物および方法に対する大きい必要性が存在する。
発明の概要
本発明は、通常の植物育種および／または分子的方法を通じて改善されたコムギ植物を生成するための組成物および方法を提供する。かかる組成物の中で、本発明は、高アミロースコムギ穀粒を提供する。一部の実施形態では、穀粒は本発明のデュラムコムギ植物から生成される。一部の実施形態では、穀粒は本発明のパンコムギ植物から生成される。
したがって、一部の実施形態では、本開示のコムギ植物は、第１および第２のゲノムを含む４倍体である。他の実施形態では、本開示のコムギ植物は、第１、第２、および第３のゲノムを含む６倍体である。
一部の実施形態では、穀粒は、１つ以上のデンプン合成遺伝子の１つ以上の突然変異を含むコムギから生成される。
一部の実施形態では、本発明は、漏出性デンプン合成酵素ＩＩ対立遺伝子およびデンプン合成酵素ＩＩ対立遺伝子を含むコムギ穀粒を教示する。一部の実施形態では、本発明は、１つ以上の漏出性デンプン合成酵素ＩＩ対立遺伝子を含むコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本開示は、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ７８５Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ２５１Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ３１９Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｅ６６３Ｋ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ａ６８１Ｔ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｇ７２１Ｅ、およびＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ６９３Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するＳＳＩＩタンパク質をコードするミスセンス変異を含むＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を教示する。
一部の実施形態では、本開示は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含むＤＮＡ構築物を教示し、ここで、前記漏出性対立遺伝子は、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ７８５Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ２５１Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ３１９Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｅ６６３Ｋ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ａ６８１Ｔ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｇ７２１Ｅ、およびＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ６９３Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するＳＳＩＩタンパク質をコードするミスセンス変異を含む。
したがって、一部の実施形態では、本開示は、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４２、配列番号２６、配列番号１１、配列番号４５、配列番号４８、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８６からなる群から選択されるペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ構築物を教示する。
一部の実施形態では、本開示は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含む単離されたＤＮＡを教示し、ここで、前記漏出性対立遺伝子は、前記ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ７８５Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ２５１Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ３１９Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｅ６６３Ｋ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ａ６８１Ｔ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｇ７２１Ｅ、およびＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ６９３Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するＳＳＩＩタンパク質をコードするミスセンス変異を含む。
したがって、一部の実施形態では、本開示は、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４２、配列番号２６、配列番号１１、配列番号４５、配列番号４８、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号８６からなる群から選択されるペプチドをコードする配列を含む単離されたＤＮＡを教示する。
一部の実施形態では、本開示は、ＳＳＩＩヌル植物のＳＳＩＩ遺伝子活性を超えるが野生型レベルを有意に下回る、低いＳＳＩＩ遺伝子活性を有するコムギ植物を教示する。したがって、一部の実施形態では、本開示は、唯一の機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子が漏出性対立遺伝子である植物を教示する。
一部の実施形態では、本開示の穀粒またはコムギ植物細胞は、デンプン合成酵素（ＳＳＩＩ）遺伝子の１つ以上の突然変異を含むコムギから生成される。一部の実施形態では、本発明は、ａ）少なくとも１つのＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含み、かつｂ）ＳＳＩＩ野生型機能的対立遺伝子を含まないコムギ植物から生成される高アミロース穀粒を教示し、ここで、高アミロース穀粒は、類似の圃場条件下で生育された適切な野生型コムギ指標品種に由来する対照穀粒のデンプンアミロースの割合と比べて増加した割合のデンプンアミロースを有し、高アミロース穀粒は、類似の圃場条件下で生育された適切なヌルコムギ指標品種に由来する穀粒と比べてより高い種子重量を有し、ヌルコムギ指標品種は、ＳＳＩＩヌル対立遺伝子のみを含む。
したがって、一部の実施形態では、本開示は、ａ）少なくとも１つのＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含み、かつｂ）ＳＳＩＩ野生型機能的対立遺伝子を含まない植物細胞、植物部分、または組織培養物を教示し、ここで、前記植物細胞、植物部分、または植物組織培養物から再生される植物から生成される穀粒は、類似の圃場条件下で生育された適切な野生型コムギ指標品種に由来する対照穀粒のデンプンアミロースの割合と比べて増加した割合のデンプンアミロースを有し、その穀粒は、類似の圃場条件下で生育された適切なヌルコムギ指標品種に由来する穀粒と比べてより高い種子重量も有し、ヌルコムギ指標品種は、ＳＳＩＩヌル対立遺伝子のみを含む。
一部の実施形態では、本開示のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、非天然対立遺伝子である。例えば、一部の実施形態では、本開示の漏出性対立遺伝子は、突然変異誘発対立遺伝子である。
一部の実施形態では、本開示のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、１つ以上のｉ）ミスセンス変異、ｉｉ）ナンセンス突然変異、ｉｉｉ）サイレント突然変異（例えば、希少コドン使用）、ｉｖ）スプライスジャンクション突然変異（例えば、転写物プロセシングに影響する）、ｖ）挿入／もしくは欠失、ｖｉ）プロモーターおよびもしくはＵＴＲ突然変異、またはそれらの組み合わせを含む。
一部の実施形態では、本発明は、高アミロース穀粒の生成元であるコムギ植物が１つ以上のＳＳＩＩヌル対立遺伝子をさらに含む、高アミロース穀粒を教示する。
一部の実施形態では、高アミロース穀粒または植物細胞の生成元であるコムギ植物は、例えばデュラムまたはパンコムギ植物であり得る。
一部の実施形態では、本発明は、前記高アミロース穀粒を生成する植物を再生する能力がある高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示し、ここで、前記穀粒のデンプン中のアミロースの割合は、類似の圃場条件下で生育された適切な野生型コムギ指標品種に由来する対照穀粒のデンプンアミロースと比べて少なくとも２５％高い。
一部の実施形態では、本発明は、前記高アミロース穀粒を生成する植物を再生する能力がある高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示し、ここで、高アミロース穀粒は、類似の圃場条件下で生育された適切なヌルコムギ指標品種に由来する穀粒よりも少なくとも１０％高い種子重量を有し、ヌルコムギ指標品種は、ヌルＳＳＩＩ対立遺伝子のみを含む
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ７８５Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ２５１Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ３１９Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｅ６６３Ｋ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ａ６８１Ｔ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｇ７２１Ｅ、およびＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ６９３Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するＳＳＩＩタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋおよび／またはＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ７８５Ｖアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ２５１Ｓアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ３１９Ｌアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３ＳＬアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｅ６６３Ｋアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ａ−Ａ６８１Ｔアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｇ７２１Ｅアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ６９３Ｓアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、配列番号４０または配列番号４４のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌおよび／またはＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、配列番号４６または配列番号４８のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、Ｅ６５６Ｋアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが配列番号４０のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、Ａ４２１Ｖアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが配列番号４４のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが配列番号４２のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが配列番号２６のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが配列番号１１のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが配列番号４５のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが配列番号４８のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが配列番号６８のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが配列番号７０のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが配列番号７２のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが配列番号８６のタンパク質をコードする、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、前記高アミロース穀粒を生成する植物を再生する能力がある高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示し、ここで、高アミロース穀粒は、約７．５未満の小麦粉膨潤度（ＦＳＰ）を有する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の高アミロース穀粒から生産される小麦粉およびそれを生成する方法を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の高アミロース穀粒から生産されるデンプンおよびそれを生成する方法を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の高アミロース穀粒を含む小麦粉ベース製品およびそれを生成する方法を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示し、ここで、コムギ植物は、第１、第２、および第３のゲノムを含む６倍体コムギである。
一部の実施形態では、６倍体コムギまたはコムギ植物細胞は、第１および第２のゲノム中にホモ接合性ＳＳＩＩヌル対立遺伝子と、第３のゲノム中にＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子とを含む。
一部の実施形態では、本発明は、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示し、ここで、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、第３のゲノム中でホモ接合性である。
一部の実施形態では、本発明は、１つ以上のコムギデンプン合成酵素（ＳＳＩＩ）漏出性対立遺伝子を有するコムギ植物、１つ以上のＳＳＩＩヌル対立遺伝子を有するコムギ植物、および野生型機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子を有しないコムギ植物を生成する方法であって、Ａ）穀粒の突然変異誘発集団を形成するためにコムギ穀粒を突然変異誘発することと；Ｂ）前記突然変異誘発コムギ穀粒から１つ以上のコムギ植物を生育することと；Ｃ）ＳＳＩＩ漏出性突然変異体対立遺伝子を有するコムギ植物を同定するために、得られた植物をスクリーニングすることと；Ｄ）ステップ（ｃ）から誘導されるＳＳＩＩ漏出性コムギ植物を、少なくとも１つのＳＳＩＩヌル対立遺伝子または少なくとも１つのＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含む第２のコムギ植物と交配させることと；Ｅ）得られた穀粒を収穫することと；Ｆ）収穫された穀粒を植物に生育することと；Ｇ）１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含み、かつ野生型機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子を含まないコムギ植物を選択することを含む方法を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、１つ以上のコムギデンプン合成酵素（ＳＳＩＩ）漏出性対立遺伝子を有し、かつ野生型機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子を有しないコムギ植物を生成する方法であって、Ａ）１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含むコムギ植物を第２のコムギ植物と交配させることであって、すべてのＳＳＩＩ対立遺伝子は、ヌル遺伝子、漏出性対立遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、交配させることと；Ｂ）得られた穀粒を収穫することと；Ｃ）収穫された穀粒を植物に生育することと；Ｄ）１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含み、かつ野生型機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子を含まないコムギ植物を選択することを含む方法を教示する。
一部の実施形態では、１つ以上のコムギデンプン合成酵素（ＳＳＩＩ）漏出性対立遺伝子を有するコムギ植物、１つ以上のＳＳＩＩヌル対立遺伝子を有するコムギ植物、および野生型機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子を有しないコムギ植物を生成する方法であって、ａ）１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含むコムギ植物を第２のデュラムコムギ植物と交配させることであって、すべてのＳＳＩＩ対立遺伝子は、ヌルである、交配させることと；ｂ）得られた穀粒を収穫することと；ｃ）収穫された穀粒を植物に生育することと；ｄ）１つ以上のコムギデンプン合成酵素（ＳＳＩＩ）漏出性対立遺伝子を含み、１つ以上のＳＳＩＩヌル対立遺伝子を含み、かつ野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を含まないコムギ植物を選択することを含み、選択されたコムギ植物は、１つ以上のコムギデンプン合成酵素（ＳＳＩＩ）漏出性対立遺伝子を含み、１つ以上のＳＳＩＩヌル対立遺伝子を含み、かつ野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を含まず、前記植物は、高アミロース穀粒を生成する、方法である。
一部の実施形態では、本発明は、高アミロースコムギ植物を生成する方法を教示し、ここで、選択されたコムギ植物は、１つ以上のＳＳＩＩヌル対立遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ７８５Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ２５１Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ３１９Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｅ６６３Ｋ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ａ６８１Ｔ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｇ７２１Ｅ、およびＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ６９３Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するＳＳＩＩタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、方法を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、高アミロース穀粒を有するコムギ植物を育種する方法であって、ａ）本発明の方法によって生成される第１の植物と、Ｆ１植物を生成するための第２の植物との間で交配させることと；ｂ）Ｆ１植物を第２の植物に戻し交配することと；ｃ）近同質遺伝子または同質遺伝子系統を作製するために、戻し交配することを１回以上にわたって反復することを含む方法を教示し、ここで、同質遺伝子または近同質遺伝子のコムギ植物は、１つ以上のコムギデンプン合成酵素（ＳＳＩＩ）漏出性対立遺伝子を含み、１つ以上のＳＳＩＩヌル対立遺伝子を含み、かつ野生型機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子を含まず、前記植物は、高アミロース穀粒を生成する。
一部の実施形態では、本発明は、高アミロース穀粒を有するコムギ植物を育種する方法であって、ａ）本発明の方法によって生成される第１の植物と、Ｆ１植物を生成するための第２の植物との間で交配させることと；ｂ）Ｆ１植物を第２の植物に戻し交配することと；ｃ）近同質遺伝子または同質遺伝子系統を作製するために、戻し交配することを１回以上にわたって反復することを含む方法を教示し、ここで、同質遺伝子または近同質遺伝子のコムギ植物は、１つ以上のコムギデンプン合成酵素（ＳＳＩＩ）漏出性対立遺伝子を含み、かつ野生型機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子を含まず、前記植物は、高アミロース穀粒を生成する。
一部の実施形態では、本発明は、同質遺伝子または近同質遺伝子のコムギ植物が１つ以上のＳＳＩＩヌル対立遺伝子をさらに含む、育種方法を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、ａ）１つ以上のデンプン合成酵素（ＳＳＩＩ）ヌル対立遺伝子を含み；ｂ）ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ７８５Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ２５１Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ３１９Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｅ６６３Ｋ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ａ６８１Ｔ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｇ７２１Ｅ、およびＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ６９３Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するＳＧＰ−１タンパク質をコードするミスセンス変異を含む、少なくとも１つのＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含み；かつｃ）ＳＳＩＩ野生型機能的対立遺伝子を含まない、コムギ植物から生成される高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示し、ここで、高アミロース穀粒は、類似の圃場条件下で生育された適切な野生型コムギ指標品種に由来する対照穀粒のデンプンアミロースの割合と比べて増加した割合のデンプンアミロースを有し、その穀粒は、類似の圃場条件下で生育された適切なヌルコムギ指標品種に由来する穀粒と比べてより高い種子重量も有し、ヌルコムギ指標品種は、ＳＳＩＩヌル対立遺伝子のみを有する。一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つが、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ７８５Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ２５１Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ３１９Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌ、およびＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するＳＧＰ−１タンパク質をコードするミスセンス変異を含む、高アミロース穀粒またはコムギ植物細胞を教示する。
一部の実施形態では、本発明は、１つ以上の漏出性ＳＳＩＩ対立遺伝子を有するコムギを教示する。一部の実施形態では、本開示の漏出性対立遺伝子は、少量のデンプン合成酵素の機能を保持するために選択される。一部の実施形態では、漏出性ＳＳＩＩ対立遺伝子は、精製されたデンプン中での低下したＳＧＰ−１の蓄積に基づいて選択される。一部の実施形態では、漏出性ＳＳＩＩ対立遺伝子は、ＳＳＩＩヌルバックグラウンドで低下した小麦粉膨潤度をもたらすその能力について選択される。さらに他の実施形態では、本開示の漏出性ＳＳＩＩ対立遺伝子は、野生型対照植物と比べて上昇したアミロースレベルを有するが、完全にＳＳＩＩヌルの植物と比べてより高い種子重量を有するコムギ穀粒を生成するその能力について選択される。
一部の実施形態では、本発明は、１つ以上の漏出性ＳＳＩＩ対立遺伝子を有する高アミロースコムギの植物細胞を教示する。特定の実施形態では、コムギ植物細胞は、本開示の漏出性ＳＳＩＩ対立遺伝子の任意の組み合わせを含む、具体的に開示される漏出性ＳＳＩＩ対立遺伝子の１つ以上を含む。一部の実施形態では、植物細胞は、植物プロトプラスト、コムギ植物が再生され得る植物細胞組織培養物、植物カルス、胚、花粉、穀粒、胚珠、果実、花、葉、種子、根、根端などの任意の植物部分に由来する細胞を含む。
一部の実施形態では、本開示は、製粉製品を生産する方法であって、ａ）本開示のコムギ植物の高アミロース穀粒を製粉し、それにより製粉製品を生産することを含む方法を教示する。
本発明の一態様では、６２４、１２２、４１４、１０２、４２、２１３、２１７、１１７４、１５１３、１３４、および１７０４と称される、新規なパンおよびデュラムコムギ系統が提供される。したがって、本発明の一態様は、コムギ系統６２４、１２２、４１４、１０２、４２、２１３、２１７、１１７４、１５１３、１３４、および１７０４のいずれか１つの穀粒、コムギ系統６２４、１２２、４１４、１０２、４２、２１３、２１７、１１７４、１５１３、１３４、および１７０４、およびそれらの一部の植物、例えば、花粉、胚珠、穀粒、ならびにコムギ系統６２４、１２２、４１４、１０２、４２、２１３、２１７、１１７４、１５１３、１３４、および１７０４をそれら自体または別のコムギ系統と交配させることにより、コムギ植物を生成する方法に関する。さらなる態様は、コムギ系統６２４、１２２、４１４、１０２、４２、２１３、２１７、１１７４、１５１３、１３４、および１７０４を別のコムギ系統と交配させることによって生成されるコムギ種子に関する。
本発明の別の態様はまた、１つ以上の特定の単一遺伝子形質、例えば導入遺伝子が別のコムギ系統から遺伝子移入されており、本質的にコムギ系統６２４、１２２、４１４、１０２、４２、２１３、２１７、１１７４、１５１３、１３４、および１７０４の形態学的および生理学的特性のすべてを有する、コムギ系統６２４、１２２、４１４、１０２、４２、２１３、２１７、１１７４、１５１３、１３４、および１７０４を対象とする。本発明の別の態様はまた、１つ以上の特定の単一遺伝子形質が遺伝子移入されているコムギ系統６２４、１２２、４１４、１０２、４２、２１３、２１７、１１７４、１５１３、１３４、および１７０４の種子、ならびに１つ以上の特定の単一遺伝子形質が遺伝子移入されているコムギ系統６２４、１２２、４１４、１０２、４２、２１３、２１７、１１７４、１５１３、１３４、および１７０４の植物に関する。本発明のさらなる態様は、１つ以上の特定の単一遺伝子形質が遺伝子移入されているコムギ系統６２４、１２２、４１４、１０２、４２、２１３、２１７、１１７４、１５１３、１３４、および１７０４の植物をそれら自体または別のコムギ系統と交配させることにより、コムギ植物を生成する方法に関する。
本発明の別の態様は、１つ以上の特定の単一遺伝子形質が遺伝子移入されているコムギ系統６２４、１２２、４１４、１０２、４２、２１３、２１７、１１７４、１５１３、１３４、および１７０４の植物を別のコムギ系統と交配させることによって生成される雑種コムギ種子および植物に関する。本発明のさらなる態様はまた、同系交配系を生成する方法であって、雑種種子の収集物を植えることと、その収集物から植物を生育することと、雑種植物中で同系交配系を同定することと、その同系交配系植物を選択することと、それらのホモ接合性を保存するようにそれらの受粉を制御することを含む方法を対象とする。
一部の実施形態では、本開示は、本発明の植物から生成される細胞の組織培養物を教示する。
本発明の他の実施形態は、１つ以上の漏出性ＳＳＩＩ対立遺伝子を含み、かつ野生型ＳＳＩＩ機能的対立遺伝子を含まないコムギ植物から生成される高アミロース穀粒、ならびにパンおよびデュラムコムギ穀粒から得られる小麦粉ベース製品を含む。一部の実施形態では、高アミロース穀粒は、小麦粉ベース製品を生産するために用いることができる。一部の実施形態では、高アミロース穀粒から生産される製粉製品は、特に、小麦粉、デンプン、セモリナである。一部の実施形態では、高アミロース穀粒から生産される小麦粉ベース製品は、特にパスタおよび麺類である。本発明は、高アミロース穀粒から生産される小麦粉ベース製品を教示する。一部の実施形態では、本発明は、高アミロース穀粒から生産される小麦粉を教示する。他の実施形態では、高アミロース穀粒によって生産される小麦粉ベース製品は、乾燥パスタである。
一部の実施形態では、小麦粉ベース製品は、少なくとも１７％のタンパク質含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、少なくとも２０％のタンパク質含量を有する。一部の実施形態では、小麦粉ベース製品は、少なくとも３％の食物繊維含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、少なくとも７％の食物繊維含量を有する。一部の実施形態では、小麦粉ベース製品は、少なくとも２％の難消化性デンプン含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、少なくとも３％の難消化性デンプン含量を有する。
他の実施形態では、小麦粉ベース製品のタンパク質、難消化性デンプンおよび食物繊維含量は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標系統から得られる小麦粉ベース製品と比べて増加する。本発明の一部の実施形態では、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標系統と比べて、本発明のコムギ系統、次いで指標系統は、同じ時間および／または位置で生育される。
例えば、一部の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産される小麦粉ベース製品よりも少なくとも１０％高い増加したタンパク質含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産される小麦粉ベース製品よりも少なくとも２０％高い増加したタンパク質含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産される小麦粉ベース製品よりも少なくとも３０％高い増加したタンパク質含量を有する。一部の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産される小麦粉ベース製品よりも少なくとも５０％高い増加した食物繊維含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産される小麦粉ベース製品よりも少なくとも１００％高い増加した食物繊維含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産される小麦粉ベース製品よりも少なくとも２００％高い増加した食物繊維含量を有する。一部の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産される小麦粉ベース製品よりも少なくとも５０％高い増加した難消化性デンプン含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産される小麦粉ベース製品よりも少なくとも１００％高い増加した難消化性デンプン含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産される小麦粉ベース製品よりも少なくとも２００％高い増加した難消化性デンプン含量を有する。一部の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産される小麦粉ベース製品よりも少なくとも１２％高い増加したアミロース含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産される小麦粉ベース製品よりも少なくとも２５％高い増加したアミロース含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産される小麦粉ベース製品よりも少なくとも４０％高い増加したアミロース含量を有する。一部の実施形態では、小麦粉ベース製品は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒から生産されるパスタと比べて調理後での改善された硬さを有する乾燥パスタである。
一部の実施形態では、高アミロース穀粒は、８．４未満の小麦粉膨潤度（ＦＳＰ）を有する。他の実施形態では、高アミロース穀粒は、７．５未満のＦＳＰを有する。
一部の実施形態では、前記高アミロース穀粒中で増加する食物繊維、難消化性デンプン、およびタンパク質含量の割合は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムまたはパンコムギ指標品種の穀粒と比べて増加する。一部の実施形態では、高アミロース穀粒から製造されるデンプンのアミロース含量は、類似の圃場条件下で生育された適切なコムギ指標品種の穀粒から製造されるデンプンのアミロース含量よりも少なくとも１２％高い。他の実施形態では、高アミロース穀粒から製造されるデンプンのアミロース含量は、類似の圃場条件下で生育された適切なコムギ指標品種の穀粒から製造されるデンプンのアミロース含量より少なくとも２５％高い。他の実施形態では、高アミロース穀粒から製造されるデンプンのアミロース含量は、類似の圃場条件下で生育された適切なコムギ指標品種の穀粒から製造されるデンプンのアミロース含量よりも少なくとも４０％高い。一部の実施形態では、適切なデュラムコムギ指標品種は、同じ時間および／または位置で生育される。
一部の実施形態では、高アミロース穀粒のデンプンは、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムコムギ指標品種の穀粒由来のデンプンと比べて改変された糊化特性を有する。
一部の実施形態では、高アミロース穀粒から製造されるパスタまたは麺類は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムコムギ指標品種の穀粒から生産されるパスタまたは麺類と比べて低下したグリセミック指数を有する。
一部の実施形態では、高アミロース穀粒から製造されるパスタまたは麺類は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造されるパスタまたは麺類と比べて増加した硬さを有する。
一部の実施形態では、高アミロース穀粒から製造されるパスタまたは麺類は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造されるパスタまたは麺類と比べて増加した加熱過多への耐性を有する。
一部の実施形態では、高アミロース穀粒から製造されるパスタまたは麺類は、類似の圃場条件下で生育された適切なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造されるパスタまたは麺類と比べて増加したタンパク質含量を有する。
突然変異穀粒から製造されるパスタも、野生型デュラムコムギ植物の穀粒から製造されるパスタと比べて食物繊維含量、難消化性デンプン含量および／またはタンパク質含量の増加した割合を有する。
一部の実施形態では、穀粒は、野生型デュラムまたはパンコムギ植物の穀粒と比べて増加したアミロース含量を有する。
一部の実施形態では、穀粒は、野生型デュラムまたはパンコムギ植物の穀粒と比べて増加した食物繊維含量および増加したアミロース含量を有する。
一部の実施形態では、穀粒は、野生型デュラムまたはパンコムギ植物の穀粒と比べて増加したタンパク質含量および増加したアミロース含量を有する。
一部の実施形態では、穀粒は、野生型デュラムまたはパンコムギ植物の穀粒と比べて増加した食物繊維、ならびに減少したふすまに対する胚乳の比および／または減少した製粉収量を有する。
一部の実施形態では、穀粒は、野生型デュラムまたはパンコムギ植物の穀粒と比べて増加した食物繊維および増加した灰分を有する。
一部の実施形態では、穀粒は、野生型デュラムまたはパンコムギ植物の穀粒と比べて増加したタンパク質および減少したデンプン含量を有する。
ＳＳＩＩヌルおよび野生型のMountrail／５５およびMountrail／１７５デュラムコムギ品種における個体種子重量と平均二条収量との間の関係を示す。Mountrail／５５（ａｂ）およびMountrail／１７５（ａｂ）ＳＳＩＩヌル系統は、Mountrail／５５およびMountrail／１７５（ＡＢ）ＳＳＩＩ野生型系統と比べてより低い種子重量および収量を示す。
詳細な説明
本明細書中で引用される、任意の図面および付録を含むすべての刊行物、特許および特許出願、ならびにジェンバンク受入番号によって同定されるすべての核酸配列およびポリペプチド配列は、あたかも個別の刊行物または特許出願の各々が具体的かつ個別に参照により援用されるように示された場合と同じ程度まで、参照により援用される。
以下の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。それは、本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であるか、あるいはここで特許請求される本発明に関連するまたは具体的もしくは暗示的に参照される任意の刊行物が先行技術であることの承認ではない。
定義
本明細書で用いられるとき、本明細書および特許請求の範囲およびその活用において用いられる動詞「含む」は、その非限定的意味において、その用語に後続する項目が含まれるが、具体的に言及されない項目が除外されないことを意味するように用いられる。
本発明は、植物の最終生成物の品質特性を改善するための組成物および方法を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「植物」は、他に特定されない限り、コムギ（例えば、パンコムギまたはデュラムコムギ）を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「植物」はまた、植物全体またはその任意の部分もしくは誘導体、例えば植物細胞、植物プロトプラスト、コムギ植物が再生され得る植物細胞組織培養物、植物カルス、胚、花粉、穀粒、胚珠、果実、花、葉、種子、根、根端などを含む。
本明細書で用いられるとき、用語「適切なデュラムコムギ指標」、「適切なパンコムギ指標」、または「適切なコムギ指標」は、本発明の実験植物の評価のための基礎を提供するコムギ植物（例えば、実験品種の遺伝的変化を伴わない対応するデュラムまたはパンコムギ品種）を表すように意味する。適切な指標は、実験株の場合と同じ環境条件下で生育され、また実験株とほぼ同じ成熟度である。適切なコムギ指標という用語は、実際には実験株において試験されている修飾または因子に対する対照系統を表すように選択される複数の適切な品種を反映する場合がある。一部の実施形態では、適切なパンまたはデュラムコムギ指標品種は、実験的突然変異を伴わない対応する野生型パンまたはデュラムコムギ品種（すなわち「野生型コムギ指標品種」）であり得る。一部の実施形態では、適切なパンまたはデュラムコムギ指標品種は、対応するＳＧＰヌル突然変異パンまたはデュラムコムギ品種（すなわち「ヌルコムギ指標品種」）であり得る。一部の実施形態では、デュラムコムギ指標系統は、「Mountrail」、「Divide」、「Strongfield」、または「Alzada」野生型品種であり得る。一部の実施形態では、パンコムギ指標系統は、「ＲＪ−５９７／３０２」または他の「Alpowa」品種であり得る。
本発明は、植物部分を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「植物部分」は、限定されないが、シュート、根、茎、種子、托葉、葉、花弁、花、胚珠、苞葉、分枝、葉柄、節間部、樹皮、軟毛、分げつ、根茎、葉状体、葉身、花粉、雄ずい、植物細胞、子実などを含む、植物の任意の部分を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「高アミロース植物細胞」は、高アミロース穀粒を生成するコムギ植物を再生する能力がある植物細胞を指す。一部の実施形態では、高アミロース植物細胞は、少なくとも１つの漏出性ＳＳＩＩ対立遺伝子を含む。
用語「１つの（a）」または「１つの（an）」は、その実体の１つ以上を指し、例えば「遺伝子」は、１つ以上の遺伝子または少なくとも１つの遺伝子を指す。このように、「１つの（a）」（または「１つの（an）」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書で交換可能に用いられる。さらに、不定冠詞「１つの（a）」または「１つの（an）」による「要素」に対する参照では、文脈が１つのみの要素があることを明確に要求するのでない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を除外しない。
本発明は、選択可能なマーカーを提供する。本明細書で用いられるとき、語句「植物の選択可能またはスクリーニング可能なマーカー」は、植物細胞内で機能的な遺伝子マーカーを指す。選択可能なマーカーは、そのマーカーを含有し、発現する細胞が、そのマーカーを発現しない細胞の成長に対して好ましくない条件下で成長することを可能にする。スクリーニング可能なマーカーは、そのマーカーを発現する細胞の同定を容易にする。
本発明は、同系交配系植物を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「同系交配系」および「同系交配系植物」は、本発明に関連して用いられる。これはまた、その同系交配系の任意の単一遺伝子変換を含む。
用語「単一対立遺伝子変換植物」は、本明細書で用いられるとき、戻し交配と称される植物育種技術により発育させた植物を指し、この技術では、戻し交配技術により同系交配系に進化された単一対立遺伝子に加えて、同系交配系の本質的にすべての所望される形態学的および生理学的特性が回復される。
本発明は、植物試料を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「試料」は、植物、植物部分、植物細胞に由来する試料、または伝播ベクターに由来する試料、または土壌、水もしくは気体試料を含む。
本発明は、子植物を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「子孫」は、１つ以上の親植物またはその子孫からの栄養生殖または有性生殖から後代として得られる任意の植物を指す。例えば、子孫植物は、親植物のクローニングもしくは自家受精、または２つの親植物の交配により得て、自家受精体およびＦ１もしくはＦ２またはさらなる世代を含んでもよい。Ｆ１は、親の少なくとも一方が形質のドナーとして第１回目に用いられる親から生成される第１世代の子孫であるが、第２世代（Ｆ２）または後続の世代（Ｆ３、Ｆ４など）の子孫は、Ｆ１、Ｆ２などの自家受精から生成される標本である。したがって（かつ通常）、Ｆ１は、２つの固定種の親（固定種は形質についてホモ接合性である）間の交雑から得られる雑種であり得るが、Ｆ２は、（かつ通常）前記Ｆ１雑種の自家受粉から得られる子孫であり得る。
本発明は、組換え配列を含む第１植物を第２植物と交配する方法を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「交配する」、「交配」、「他家受粉」または「交雑する」は、一方の植物にある１つの花の花粉を別の植物にある花の胚珠（柱頭）に（人工的または自然に）つける過程を指す。
本発明は、植物栽培変種を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「栽培変種」は、園芸または耕種技術により生成されている、野生集団中では通常見出されない植物の品種、株または種族を指す。
本発明は、植物遺伝子を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連したＤＮＡの任意のセグメントを指す。したがって、遺伝子は、限定されないが、その発現に要求されるコード配列および／または制御配列を含む。遺伝子はまた、例えば他のタンパク質における認識配列を形成する、発現されていないＤＮＡセグメントを含み得る。遺伝子は、種々の供給源、例えば目的の供給源からのクローニングまたは公知のもしくは予測される配列情報からの合成などから得ることができ、所望されるパラメータを有するように設計された配列を含んでもよい。
本発明は、植物遺伝子型を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「遺伝子型」は、個別の細胞、細胞培養物、組織、生物（例えば、植物）、または生物群の遺伝子構造を指す。
一部の実施形態では、本発明は、植物のホモ接合体を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「ヘミ接合性」は、半数体細胞もしくは生物における遺伝子、異型配偶子性における伴性遺伝子、またはパートナーセグメントが欠失された２倍体細胞もしくは生物における染色体のセグメント中の遺伝子（そのパートナーセグメントが欠失している）のように、遺伝子が遺伝子型において１つのみ存在する細胞、組織または生物を指す。
一部の実施形態では、本発明は、異種核酸を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」または「外因性ＤＮＡセグメント」は、特定の宿主細胞に対して外来性の供給源に由来するか、または同じ供給源に由来する場合、その元の形態から修飾されるポリヌクレオチド、核酸またはＤＮＡセグメントを指す。したがって、宿主細胞内の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、修飾されている遺伝子を含む。したがって、この用語は、その細胞に対して外来性もしくは異種性であるか、またはその細胞に対して相同であるがそのエレメントが通常見出されない宿主細胞核酸中の位置に存在するＤＮＡセグメントを指す。外因性ＤＮＡセグメントは、発現されて、外因性ポリペプチドを生成する。
一部の実施形態では、本発明は、異種形質を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「異種形質」は、外因性ＤＮＡセグメント、異種ポリヌクレオチドまたは異種核酸により形質転換宿主細胞またはトランスジェニック生物に与えられる表現型を指す。
一部の実施形態では、本発明は、ヘテロ接合体を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「ヘテロ接合体」は、少なくとも１つの遺伝子座に存在する異なる対立遺伝子（ある所定遺伝子の形態）を有する２倍体または多数体の個別の細胞または植物を指す。
一部の実施形態では、本発明は、ヘテロ接合性形質を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「ヘテロ接合性」は、特定の遺伝子座での異なる対立遺伝子（ある所定遺伝子の形態）の存在を指す。
一部の実施形態では、本発明は、相同体を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「相同体（homolog）」または「相同体（homologue）」は、共通の起源を有し、別の種由来の核酸またはペプチド配列と同様に機能する核酸またはペプチド配列を指す。
一部の実施形態では、本発明は、ホモ接合体を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「ホモ接合体」は、１つ以上またはすべての遺伝子座に同じ対立遺伝子を有する個別の細胞または植物を指す。この用語が特定の遺伝子座または遺伝子との関連で用いられるとき、それは、少なくともその遺伝子座または遺伝子が同じ対立遺伝子を有することを意味する。
一部の実施形態では、本発明は、ホモ接合性形質を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「ホモ接合性」または「HOMO」は、相同染色体セグメント中の１つ以上またはすべての遺伝子座での同一対立遺伝子の存在を指す。この用語が特定の遺伝子座または遺伝子との関連で用いられるとき、それは少なくともその遺伝子座または遺伝子が同じ対立遺伝子を有することを意味する。
一部の実施形態では、本発明は、雑種を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「雑種」は、１つ以上の遺伝子が異なる親間の交雑から得られる任意の個別の細胞、組織または植物を指す。
一部の実施形態では、本発明は、突然変異体を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「突然変異体」または「突然変異」は、変異体表現型を生じ得る異常な遺伝子構成を有する遺伝子、細胞、または生物を指す。
本発明は、放任受粉集団を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「放任受粉集団」または「放任受粉品種」は、変動を示し得るが、その集団または品種を他のものから区別できる１つ以上の遺伝子型または表現型の特性も有する、通常、少なくとも一部の他家受精が可能で標準に対して選択される植物を指す。他家受粉に対する障壁のない雑種は、放任受粉集団または放任受粉品種である。
本発明は、植物胚珠および花粉を提供する。本明細書で用いられるとき、植物について論じる場合、用語「胚珠」は雌性体を指す一方、用語「花粉」は雄性体を指す。
本発明は、植物表現型を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「表現型」は、個別の遺伝子的構成（すなわち遺伝子型）と環境との間の相互作用に起因する、個別の細胞、細胞培養物、生物（例えば、植物）、または生物群の観察可能な特性を指す。
本発明は、植物組織を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「植物組織」は、植物の任意の部分を指す。植物器官の例として、限定されないが、葉、茎、根、塊茎、種子、枝、軟毛、根粒、葉腋、花、花粉、雄蕊、雌蕊、花弁、花柄、柄、柱頭、花柱、苞葉、果実、幹、心皮、萼片、葯、胚珠、小花柄、針状葉、球果、根茎、匍匐枝、シュート、果皮、胚乳、胎座、液果、雄蕊および葉鞘が挙げられる。
本発明は、自家受粉集団を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「自家受精」、「自己授粉した」または「自家受粉」は、一方の植物にある１つの花の花粉を同じ植物にある同じまたは異なる花の胚珠（柱頭）に（人工的または自然に）つけることを意味する。
本明細書で用いられるとき、用語「種子重量」または「穀粒重量」は、コムギ植物から生成される種子の平均重量を指す。一部の実施形態では、種子重量は、１，０００穀粒種子重量を単位として表される（例えば、３０〜５０グラム／１０００コムギ種子）。他の実施形態では、種子重量は、個体種子の平均重量を単位として表される（例えば、３０〜５０ｍｇ／種子）。
本明細書で用いられるとき、用語「アミロース含量」は、コムギデンプン中のアミロースの量を指す。アミロースは、比較的少ない側鎖を有する、α−１，４結合したＤ−グルコースの直鎖状ポリマーである。アミロースは、α−１，４結合したＤ−グルコースの直鎖状ポリマーを有しつつも、多数のα−１，６Ｄ−グルコース側鎖を有するアミロペクチンよりも緩徐に消化される。アミロースは、加熱時、アミロペクチンよりも少ない水を吸収し、より緩徐に消化される。アミロース含量は、ヨウ素−ヨウ化カリウムアッセイを含む熱量測定アッセイにより、ＤＳＣ、ＣｏｎＡにより測定され得るか、または加熱後に小麦粉もしくはデンプンの水吸収能を測定することにより評価され得る。
本明細書で用いられるとき、用語「デンプン合成遺伝子」は、植物中でのデンプン合成に対して直接的または間接的に寄与、調節または影響する任意の遺伝子を指す。かかる遺伝子として、限定されないが、モチ様タンパク質（別名、顆粒結合デンプン合成酵素（ＧＢＳＳ）、例えばＧＢＳＳＩ、ＧＢＳＳＩＩ）、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰアーゼ）、デンプン分枝酵素（別名、ＳＢＥ、例えばＳＢＥＩおよびＳＢＥＩＩ）、デンプン脱分枝酵素（別名、ＳＤＢＥ）、ならびにデンプン合成酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶをコードする遺伝子が挙げられる。
本明細書で用いられるとき、用語「モチ様タンパク質」、「顆粒結合デンプン合成酵素」、ＧＢＳＳ、または「ＡＤＰ−グルコース：（１−＞４）−α−Ｄ−グルカン４−α−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼ」は、以下の反応：
ＡＤＰ−グルコース＋（１，４−α−Ｄ−グルコシル）ｎ＝ＡＤＰ＋（１，４−α−Ｄ−グルコシル）ｎ＋１
を触媒可能なＥＣ番号２．４．１．２１を有するタンパク質を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ」、ＡＧＰアーゼ、「アデノシンニリン酸グルコースピロホスホリラーゼ」、または「アデノシン−５’−ジホスホグルコースピロホスホリラーゼ」は、以下の反応：
ＡＴＰ＋α−Ｄ−グルコース１−リン酸＝二リン酸＋ＡＤＰ−グルコース
を触媒可能なＥＣ番号２．７．７．２７を有するタンパク質を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「デンプン分枝酵素」、ＳＢＥ、「分枝酵素」、ＢＥ、「グリコゲン分枝酵素」、「１，４−α−グルカン分枝酵素」、「α−１，４−グルカン：α−１，４−グルカン６−グリコシルトランスフェラーゼ」または「（１−＞４）−α−Ｄ−グルカン：（１−＞４）−α−Ｄ−グルカン６−α−Ｄ−［（１−＞４）−α−Ｄ−グルカノ］−トランスフェラーゼ」は、以下の反応：
２１，４−α−Ｄ−グルカン＝α−１，４−Ｄ−グルカン−α−１，６−（α−１，４−Ｄ−グルカン）
を触媒可能なＥＣ番号２．４．１．１８を有するタンパク質を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「デンプン脱分枝酵素」、ＳＤＢＥ、またはイソアミラーゼは、α−１，４およびα−１，６の両方の連結を有するグルカン中のα−１，６グルコシド結合を加水分解し得る、ＥＣ番号２．４．１．１、２．４．１．２５、３．２．１．６８または３．２．１．４１を有するタンパク質を指す。
本明細書で用いられるとき、デンプン合成酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ（ＳＳＩまたはＳＩ、ＳＳＩＩまたはＳＩＩ、ＳＳＩＩＩまたはＳＯＯＯ、およびＳＳＩＶまたはＳＩＶ）という用語は、それぞれデンプン合成酵素クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ、またはクラスＩＶのタンパク質を指す。例えば、アミロペクチン合成に関与するタンパク質である。
本明細書で用いられるとき、デンプン粒タンパク質−１またはＳＧＰ−１という用語は、コムギデンプン粒に含有される、デンプン合成酵素クラスＩＩに属するタンパク質を指す（YamamoriおよびEndo，１９９６）。
本明細書で用いられるとき、コムギという用語は、限定されないが、２倍体、４倍体、および６倍体のコムギ種を含む、トリチカム属（Triticum）またはコムギ連（Triticeae）の中の任意のコムギ種を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「製粉製品」は、（コムギまたはその他の穀粒生成植物に由来する）穀粒を粉砕することから生産される製品を指す。製粉製品の非限定例として、特に、小麦粉、中力粉、デンプン、パン用小麦粉、ケーキ用小麦粉、セルフライジング小麦粉、ペストリー用小麦粉、セモリナ、デュラム小麦粉、パン用小麦粉、全粒小麦粉、石臼挽小麦粉、グルテン粉、およびグラハム粉が挙げられる。
本明細書で用いられるとき、用語「小麦粉ベース製品」は、特に、パスタ、麺類、パン製品、クッキーおよびペストリーを含む、小麦粉から製造される製品を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「高アミロース穀粒」は、アミロースを高レベルで有するデンプンを含むコムギ穀粒（例えば、パンコムギ穀粒）を指す。一部の実施形態では、高アミロースレベルは、類似の圃場条件下で同じ時間生育された野生型またはその他の適切なコムギ指標品種からのコムギ穀粒のアミロース含量と比べて上昇する。他の実施形態では、アミロースレベルは、示差走査熱量測定分析により測定されるとき、絶対百分率において高い。
本明細書で用いられるとき、２倍体コムギという用語は、各染色体の２つの相同コピーを有するコムギ種、例えばゲノムＡＡを有するヒトツブコムギ（Einkorn wheat）（Ｔ．モノコックム（T.monococcum））を指す。
本明細書で用いられるとき、４倍体コムギという用語は、各染色体の４つの相同コピーを有するコムギ種、例えば、野生エマー（T.dicoccoides）に由来するエマーおよびデュラムコムギを指す。野生エマーは、それ自体で、２つの２倍体野生イネ科植物、すなわちＴ．ウラルトゥ（T.urartu）と、アエギロップス・セアルシー（Aegilopssearsii）またはクサビコムギ（Ae.speltoides）などの野生ゴートグラスとの間の雑種形成の結果である。（ゲノムＡＡＢＢを有する）野生エマーを形成した雑種形成は、栽培化よりはるか以前に野生で生じ、自然選択により駆動された。
本明細書で用いられるとき、６倍体コムギという用語は、各染色体の６つの相同コピーを有するコムギ種、例えばパンコムギを指す。栽培化されたエマーまたはデュラムコムギのいずれかを別の野生２倍体イネ科植物（ゲノムＤＤを有するタルホコムギ（Aegilops tauschii））と雑種形成させて、（ゲノムＡＡＢＢＤＤを有する）６倍体コムギを作製した。
本明細書で用いられるとき、ＳＳＩＩａ−Ａａは、存在している両方の野生型「ａａ」対立遺伝子を指すが、ＳＳＩＩａ−Ａｂは、存在している両方の「ｂｂ」対立遺伝子を指す。ＳＳＩＩａおよびＳＳＩＩｂであれば、同じ酵素の２つの異なる形態となる。
本明細書で用いられるとき、用語「糊化温度」は、デンプンが加熱中に水に溶解する温度を指す。糊化温度は、アミロース含量に関係し、アミロース含量の増加は、糊化温度の増加に関連する。
本明細書で用いられるとき、用語「デンプン老化」は、デンプン水ゲルの硬さを指し、アミロースの増加は、デンプン老化の増加およびより硬いデンプンベースゲルに関連する。
本明細書で用いられるとき、用語「小麦粉膨潤度」またはＦＳＰは、過剰な水の存在下で加熱後の、元の試料の重量に対する小麦粉またはデンプンベースゲルの重量を指す。アミロースの増加は、ＦＳＰの減少に関連する。
本明細書で用いられるとき、用語「穀粒硬度」は、穀粒を破壊するために必要な圧力を指し、製粉後の粒子サイズ、製粉収量、および幾つかの最終生成物の品質形質に関係する。穀粒硬度の増加は、小麦粉粒子サイズの増加、デンプン損傷の増加および分割小麦粉収量の減少に関連する。
本明細書で用いられるとき、用語「セモリナ」は、デュラムコムギの粗い精製コムギミドリング粉を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「難消化性アミロース」は、消化に対して耐性があり、したがってグリセミック指数が低減した食品の製造における目的に応えるアミロースを指す。
本明細書で用いられるとき、用語「難消化性デンプン」は、消化に対して耐性があり、食物繊維のように挙動するデンプンを指す。増加したアミロースは、増加した難消化性デンプンに関連すると考えられる。
本明細書で用いられるとき、用語「対立遺伝子」は、ある遺伝子の幾つかの代替形態のいずれかを指す。
本明細書で用いられるとき、用語「野生型機能的対立遺伝子」は、正常な遺伝子機能を示す対立遺伝子を指す。例えば、一部の実施形態では、野生型機能的対立遺伝子は、野生種における対応する対立遺伝子の場合と同等の正常な遺伝子機能を示す。例えば、一部の実施形態では、野生型機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子であれば、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル中で野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子に対して類似レベルのＳＳＩＩタンパク質蓄積を示すことになる（例えば、ＳＳＩＩ−Ａ、ＳＳＩＩ−Ｂ、またはＳＳＩＩ、Ｄ）。
一部の実施形態では、本発明は、遺伝子の正常機能が欠如した（例えば、微量である、または遺伝子機能がない）対立遺伝子である「ヌル」対立遺伝子の使用を教示する。一部の実施形態では、ヌル対立遺伝子は、１つ以上の遺伝子突然変異によって生じ得る。例えば、一部の実施形態では、ヌル対立遺伝子をもたらす突然変異は、遺伝子のコード部分上に位置する。一部の実施形態では、漏出性対立遺伝子は、ｉ）ミスセンス突然変異、ｉｉ）ナンセンス突然変異、ｉｉｉ）サイレント突然変異（例えば、希少コドン使用）、ｉｖ）スプライスジャンクション突然変異（例えば、転写物プロセシングに影響する）、ｖ）挿入およびもしくは欠失、ｖｉ）プロモーター／もしくはＵＴＲ突然変異（例えば、転写物発現または半減期に影響する）、またはそれらの組み合わせの１つ以上を含み得る。
本明細書で用いられるとき、用語「漏出性対立遺伝子」は、野生型対立遺伝子の表現型と、同じ遺伝子のヌル対立遺伝子の表現型との間の中間表現型を与える対立遺伝子を指す。例えば、漏出性対立遺伝子は、野生型対立遺伝子よりも低いが、「ヌル」対立遺伝子よりも高い活性を示す遺伝子産物をコードし得る。したがって、酵素をコードする遺伝子の場合、漏出性対立遺伝子にコードされる酵素であれば、対応する野生型対立遺伝子にコードされる酵素よりも低い速度／レベルであっても、同じ遺伝子の完全ヌル対立遺伝子よりも高い速度／レベルで基質を消費しかつ／または産物を生成することになる。一部の実施形態では、漏出性対立遺伝子は、１つ以上の遺伝子突然変異によって生じ得る。例えば、一部の実施形態では、漏出性対立遺伝子をもたらす突然変異は、遺伝子のコード部分上に位置する。一部の実施形態では、漏出性対立遺伝子は、ｉ）ミスセンス突然変異、ｉｉ）ナンセンス突然変異、ｉｉｉ）サイレント突然変異（例えば、希少コドン使用）、ｉｖ）スプライスジャンクション突然変異（例えば、転写物プロセシングに影響する）、ｖ）プロモーターおよびもしくはＵＴＲ突然変異（例えば、転写物発現または半減期に影響する）、またはそれらの組み合わせの１つ以上を含み得る。
本明細書で用いられるとき、ＳＳＩＩ漏出性コムギという用語は、１つ以上のデンプン合成酵素ＩＩ漏出性対立遺伝子を含むコムギ植物を指す。一部の実施形態では、ＳＳＩＩ漏出性コムギは、いずれのＳＳＩＩ野生型対立遺伝子も含まない。例えば、ＳＳＩＩ「漏出性対立遺伝子」コムギ植物は、ヌルＳＳＳＩＩ対立遺伝子の種子サイズよりも測定可能な程度に大きいが野生型対立遺伝子（正常な種子サイズ）以下である中間サイズの種子を生成し得る。
本明細書で用いられるとき、「デンプン」は、その自然または天然の形態のデンプンを指し、かつ物理的、化学的、酵素的および生物学的過程によって修飾されたデンプンも指す。
本明細書で用いられるとき、「アミロース」は、α−１，６−Ｄ−グルコシド結合によって連結されたＤ−無水グルコース単位の本質的に直線状の集合体であるデンプンポリマーを指す。
本明細書で用いられるとき、「アミロース含量」は、アミロペクチンなどの他のデンプンポリマーとの関係でのアミロース型ポリマーの百分率を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「穀粒」は、その種を生育または繁殖させる以外の目的で栽培業者によって生産される成熟コムギの穀粒を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「穀粒」は、重複受精の生成物である、成熟胚および胚乳を含むコムギ頴果を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「系統」は、限定されないが、組織培養技術により単一の親植物から栄養繁殖された植物の群、または共通の親からの子孫であることに起因して遺伝子的に酷似する同系交配系植物の群を含むように広義に用いられる。植物は、それが（ａ）その系統の材料から再生された初代形質転換体（Ｔ０）植物であるか、（ｂ）その系統のＴ０植物で構成される家系を有するか、または（ｃ）共通の先祖が理由で（例えば、近親交配または自家受精を介することで）遺伝子的に酷似する場合、特定の系統に「属する」と言われる。これに関連して、用語「家系」は、例えば、遺伝子または遺伝子の組み合わせが、ヘテロ接合性（ヘミ接合性）またはホモ接合性の条件で、植物に所望される形質を与えるようになされた有性交雑の観点での植物の系統を意味する。
本明細書で用いられるとき、用語「遺伝子座（locus）」（複数形：「遺伝子座（loci）」）は、遺伝子的に定義されている任意の部位を指す。遺伝子座は、遺伝子もしくは遺伝子の一部、または一部の調節的役割を有するＤＮＡ配列であってもよく、同じまたは異なる配列によって占有されてもよい。
本発明は、形質転換を通じて植物または植物細胞を得る方法を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「形質転換」は、核酸（すなわちヌクレオチドポリマー）の細胞への移入を指す。本明細書で用いられるとき、用語「遺伝子形質転換」は、ＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの細胞への移入および取り込みを指す。
本発明は、植物および植物細胞形質転換体を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「形質転換体」は、形質転換を経ている細胞、組織または生物を指す。元の形質転換体は、「Ｔ０」または「Ｔ０」と称される。Ｔ０の自家受精により、「Ｔ１」または「Ｔ１」と称される形質転換第１世代が生成される。
本発明は、植物導入遺伝子を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「導入遺伝子」は、核酸の機能を確実にする様式で生物、宿主細胞またはベクターに挿入された核酸を指す。
本発明は、植物トランスジェニック植物、植物部分および植物細胞を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「トランスジェニック」は、形質転換の様々な方法の１つにより外来または修飾遺伝子を受容している細胞、細胞培養物、生物（例えば、植物）および後代を指し、ここで、外来または修飾遺伝子は、外来または修飾遺伝子を受容している生物の種と同じまたは異なる種に由来する。
本発明は、植物転位事象を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「転位事象」は、トランスポゾンのドナー部位から標的部位への移動を指す。
本発明は、植物品種を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「品種」は、ある種の下位区分を指し、それは形態または機能が他の類似する一連の個体と異なる種の中の個体の群からなる。
本発明は、植物ベクター、プラスミド、または構築物を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「ベクター」、「プラスミド」、または「構築物」は、広義には、外因性核酸をコードする任意のプラスミドまたはウイルスを指す。この用語はまた、核酸のビリオンまたは細胞への移入を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物、例えばポリリジン化合物などを含むように解釈されるべきである。ベクターは、核酸またはその突然変異体を細胞に送達するための送達媒体として好適なウイルスベクターであってもよく、またはベクターは、同じ目的に適した非ウイルスベクターであってもよい。ＤＮＡを細胞および組織に送達するためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は、当該技術分野で周知であり、例えばMaら（1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:12744-12746）に記載されている。
本発明は、単離された、キメラ、組換えまたは合成ポリヌクレオチド配列を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、または「核酸」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態またはその類似体を指す。この用語は、その分子の一次構造を指し、したがって二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。それはまた、メチル化核酸および／またはキャッピングされた核酸、修飾塩基、骨格修飾などを有する核酸などの修飾核酸を含む。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、交換可能に用いられる。ポリヌクレオチドは、任意選択的に、合成、非自然または改変ヌクレオチド塩基を有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよい。ＤＮＡのポリマーの形態でのポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つ以上のセグメントで構成されてもよい。ヌクレオチド（通常、その５’−一リン酸形態で見出される）は、アデニル酸またはデオキシアデニル酸（各々、ＲＮＡまたはＤＮＡに対応）に対して「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸に対して「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸に対して「Ｇ」、ウリジル酸に対して「Ｕ」、デオキシチミジル酸に対して「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対して「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対して「Ｙ」、ＧまたはＴに対して「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対して「Ｈ」、イノシンに対して「Ｉ」、ならびに任意のヌクレオチドについて「Ｎ」のように１文字表記で示される。
本発明は、単離されたキメラ、組換えまたはポリペプチド配列を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように本明細書中で交換可能に用いられる。これらの用語はまた、グリコシル化、アセチル化およびリン酸化を含む反応を通じて翻訳後修飾されるタンパク質を含む。
本発明は、相同およびオルソロガスなポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。本明細書で用いられるとき、用語「相同な」または「相同体」または「オルソログ」は、当該技術分野で公知であり、共通の先祖またはファミリーメンバを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指す。用語「相同」、「相同な」、「実質的に類似の」および「実質的に対応する」は、本明細書中で交換可能に用いられる。それらは、１つ以上のヌクレオチド塩基における変化が遺伝子発現を媒介するかまたは特定の表現型を生成する核酸断片の能力に影響しない核酸断片を指す。これらの用語はまた、得られる核酸断片の機能的特性を初期の未修飾断片に対して実質的に改変しない１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾を指す。したがって、当業者が理解するように、本発明は特定の例示的な配列を超える範囲を包含することが理解されている。これらの用語は、１つの種、亜種、品種、栽培変種または株において見出される遺伝子と別の種、亜種、品種、栽培変種または株における対応するまたは均等な遺伝子との間の関係について説明する。本発明の目的として、相同配列が比較される。「相同配列」または「相同体」または「オルソログ」は、機能的に関係すると考えられるか、信じられるかまたは認知される。機能的関係は、限定されないが、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じまたは類似の生物学的機能を含む幾つかの方式のいずれか１つで示されてもよい。好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方が示される。配列同一性の程度は変動することがあるが、一実施形態では、少なくとも５０％（当該技術分野で公知の標準的な配列アラインメントプログラムを用いるとき）、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも９８．５％、もしくは少なくとも約９９％、もしくは少なくとも９９．５％、もしくは少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％である。相同性は、当該技術分野において容易に利用可能なソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, section 7.718, Table 7.71で論じられているものを用いて決定され得る。一部のアラインメントプログラムが、MacVector (Oxford Molecular Ltd, Oxford, U.K.)、ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania)およびAlignX (Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, CA)である。別のアラインメントプログラムが、デフォルトパラメータを用いるSequencher (Gene Codes, Ann Arbor, Michigan)である。一部の実施形態では、本発明の配列アラインメントおよび配列同一性は、(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)に見出されるClustalOmegaツールの標準的設定を用いて計算される。
本発明は、野生型参照配列と比べたヌクレオチド変化を有するポリヌクレオチドを提供する。本明細書で用いられるとき、用語「ヌクレオチド変化」は、当該技術分野で十分に理解されている通り、例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入を指す。例えば、突然変異は、サイレント置換、付加、または欠失をもたらすが、コードされるタンパク質の特性もしくは活性またはタンパク質がどのように作製されるかを変更しない改変を含む。
本発明は、野生型参照配列と比べてタンパク質修飾を有するポリペプチドを提供する。本明細書で用いられるとき、用語「タンパク質修飾」は、当該技術分野で十分に理解されている通り、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸修飾、欠失、および／または挿入を指す。
本発明は、野生型参照配列に由来するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。本明細書で用いられるとき、用語「に由来する」は、起源または供給源を指し、天然分子、組換え分子、非精製分子、または精製分子を含んでもよく、また起源が植物または植物部分である細胞を含んでもよい。ある起源または供給源に由来する核酸またはアミノ酸は、本明細書中の他の箇所で定義されるようなヌクレオチド変化またはタンパク質修飾のすべての種類を有してもよい。
本発明は、本発明の核酸配列およびポリペプチド配列の部分または断片を提供する。本明細書で用いられるとき、核酸またはポリペプチドの用語「少なくとも一部」または「断片」は、かかる配列に特徴的な最小限のサイズを有する一部分、または全長分子を含んで全長分子までの、全長分子の任意のより大きい断片を意味する。例えば、核酸の一部分は、最大で全長核酸に至る、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチドなどであってもよい。同様に、ポリペプチドの一部分は、最大で全長ポリペプチドに至る、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであってもよい。用いられるべき部分の長さは、特定用途に依存することになる。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の一部分は、１２ヌクレオチド程度に短くてもよく、一実施形態では、それは２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの一部分は、４アミノ酸程度に短くてもよい。全長ポリペプチドの機能を実行するポリペプチドの一部分であれば、一般に４アミノ酸より長いことになる。
本発明は、本発明の核酸配列およびポリペプチド配列に対して高い類似性または同一性を有する配列を提供する。本明細書で用いられるとき、２つの核酸またはポリペプチド配列の関係における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウインドウにわたって最大限に対応するように整列されるとき、同じである２つの配列内の残基に対する参照を含む。配列同一性の百分率がタンパク質に関連して用いられるとき、同一でない残基の位置は、アミノ酸残基が同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換されることから、分子の機能的特性を変化させない保存的アミノ酸置換により異なることが多いことが理解される。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質について補正するために、上方に調節されてもよい。かかる保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調節を設けるための手段は、当業者に周知である。典型的には、この手段には、保存的置換を完全なミスマッチよりもむしろ部分的なミスマッチとしてスコア化することを含み、それにより配列同一性百分率が増加する。したがって、例えば、同一アミノ酸のスコアが１であり、非保存的置換のスコアがゼロである場合、保存的置換には０〜１のスコアが与えられる。保存的置換のスコア化は、例えばMeyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4:11-17 (1988)のアルゴリズムに従って算出される。
本発明は、本発明の核酸配列と実質的に相補的な配列を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「実質的に相補的な」は、２つの核酸配列が、互いに少なくとも約６５％、好ましくは７０％または７５％、より好ましくは約８０％または８５％、さらにより好ましくは９０％または９５％、最も好ましくは約９８％または９９％の配列相補性を有することを意味する。これは、プライマーおよびプローブが、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするため、それらの鋳型および標的核酸の各々に対して十分な相補性を示さなければならないことを意味する。したがって、プライマーおよびプローブ配列は、鋳型上の結合領域の正確な相補的配列を反映する必要はなく、縮重プライマーを用いることができる。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの５’末端に結合させ、残りのプライマー配列がその鎖に相補的であってもよい。あるいは、プライマーが増幅されるべき鎖の一方の配列と十分な相補性を有してそれとハイブリダイズし、それにより重合手段により伸長され得る二重鎖構造を形成すると仮定すると、非相補的塩基またはより長い配列がプライマー中に散在され得る。プライマーの非相補的ヌクレオチド配列は、制限酵素部位を含んでもよい。標的配列の末端に制限酵素部位を付加することは、標的配列のクローニングのために特に有用であろう。実質的に相補的なプライマー配列は、プライマー結合および第２鎖合成をもたらすように増幅鋳型に対して十分な配列相補性を有するものである。当業者は、増幅鋳型に対して十分な配列相補性を有するプライマーの要件について熟知している。
本発明は、本発明の核酸配列およびポリペプチド配列の生物活性変異体または機能的変異体を提供する。本明細書で用いられるとき、タンパク質との関連での語句「生物活性変異体」または「機能的変異体」は、参照配列に対して１つ以上のアミノ酸のみ改変されるが、参照配列の実質的な生物学的活性を依然として維持しているアミノ酸配列を指す。変異体は、例えばロイシンとイソロイシンとの置換のような置換されたアミノ酸が類似構造または化学的特性を有する場合の「保存的」変化を有し得る。あるいは、変異体は、例えばグリシンとトリプトファンとの置換のような「非保存的」変化を有し得る。類似の少数の変動は、アミノ酸の欠失もしくは挿入またはその両方も含み得る。生物学的または免疫学的活性を排除することなく、いずれのアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失され得るかを判定する場合の指針は、当該技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばDNASTARソフトウェアを用いて見出すことができる。ポリヌクレオチドの場合、変異体は、５’および／もしくは３’末端での欠失（すなわち短縮）；参照ポリヌクレオチド中の１つ以上の内部部位での１つ以上のヌクレオチドの欠失および／もしくは付加；ならびに／または参照ポリヌクレオチド中の１つ以上の部位での１つ以上のヌクレオチドの置換を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書で用いられるとき、「参照」ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される方法によって生成されるヌクレオチド配列を含む。変異ポリヌクレオチドはまた、合成的に誘導されるポリヌクレオチド、例えば部位特異的突然変異誘発を用いることにより作製されても遺伝子調節エレメント活性を依然として含むものなどを含む。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチドまたは核酸分子の変異体は、本明細書中の他の箇所に記載の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによる判定として、その特定のポリヌクレオチドに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％以上の配列同一性を有することになる。
変異ポリヌクレオチドはまた、ＤＮＡシャフリングなどの変異原性および組換え誘導手順から誘導される配列を包含する。かかるＤＮＡシャフリングにおける方法は当該技術分野で公知である。例えば、Stemmer (1994) PNAS 91:10747-10751；Stemmer (1994) Nature 370:389-391；Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438；Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347；Zhang et al. (1997) PNAS 94:4504-4509；Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および米国特許第５，８３７，４５８号を参照されたい。本明細書で開示されるポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅では、オリゴヌクレオチドプライマーは、目的の任意の植物から抽出されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ由来の対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応における使用を意図して設計され得る。ＰＣＲプライマーを設計し、かつＰＣＲクローニングを行うための方法は、一般に当該技術分野で公知であり、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)に開示されている。Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York)；Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York)；およびInnis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)も参照されたい。ＰＣＲの公知の方法は、限定されないが、プライマー対、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチプライマーなどを用いる方法を含む。
本発明は、本発明の核酸配列およびポリペプチド配列に由来するプライマーを提供する。用語「プライマー」は、本明細書で用いられるとき、増幅標的に対してアニールでき、ＤＮＡポリメラーゼが結合することを可能にし、それにより、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの重合剤の存在下で好適な温度およびｐＨに置かれるときのＤＮＡ合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは、増幅における最大効率のため、好ましくは一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成を開始するために十分に長い必要がある。正確なプライマー長は、温度およびプライマーの組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含量）を含む多数の要素に依存することになる。２方向プライマーの対は、例えばＰＣＲ増幅におけるＤＮＡ増幅の技術分野で汎用されるように、１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーからなる。
本発明は、本発明の核酸配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列を提供する。用語「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリッドの安定性に影響するハイブリダイゼーション条件、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などを指す。これらの条件は、プライマーまたはプローブのその標的核酸配列への特異的結合を最大化し、非特異的結合を最小限にするように経験的に最適化される。この用語は、用いられるとき、プローブまたはプライマーがその標的配列に、他の配列よりも検出可能な程度に（例えば、バックグラウンドよりも少なくとも２倍）大きくハイブリダイズする条件に対する参照を含む。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境下で異なることになる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低下するように選択される。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が完全に一致したプローブまたはプライマーに（規定のイオン強度およびｐＨ下で）ハイブリダイズする温度である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍ未満のＮａ＋イオン濃度、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（または他の塩）であり、また温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃であり、かつ長いプローブまたはプライマー（例えば、５０超のヌクレオチド）について少なくとも約６０℃である場合である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加により達成されることがある。例示的な低ストリンジェントな条件または「低下したストリンジェンシーの条件」は、３０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液を用いて３７℃でのハイブリダイゼーションと、４０℃、２×ＳＳＣでの洗浄とを含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中で３７℃でのハイブリダイゼーションと、６０℃、０．１×ＳＳＣでの洗浄とを含む。ハイブリダイゼーション手順は当該技術分野で周知であり、例えば、Ausubelら、１９９８およびSambrookら、２００１により記載されている。
本発明は、コード配列を提供する。本明細書で用いられるとき、「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。
本発明は、制御配列を提供する。「制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、かつ関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。
本発明は、プロモーター配列を提供する。本明細書で用いられるとき、「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御する能力があるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、またプロモーターの先天的エレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来するか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されるか、または合成ＤＮＡセグメントをさらに含んでもよい。異なるプロモーターが異なる組織もしくは細胞型において、または発生の異なる段階において、または異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を誘導し得ることが当業者によって理解されている。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に定義されていないことから、一部の変動性を有するＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに理解されている。
一部の実施形態では、本発明は、植物プロモーターを提供する。本明細書で用いられるとき、「植物プロモーター」は、その起源が植物細胞であるか否かに関わらず、植物細胞において転写を開始させる能力があるプロモーターであり、例えば、アグロバクテリウムプロモーターが植物細胞において機能的であることは周知である。したがって、植物プロモーターは、植物、植物ウイルスおよび細菌、例えばアグロバクテリウム（Agrobacterium）およびブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）細菌から得られるプロモーターＤＮＡを含む。植物プロモーターは、構成的プロモーターまたは非構成的プロモーターであり得る。
本発明は、３’非コード配列または３’非翻訳領域を含む組換え遺伝子を提供する。本明細書で用いられるとき、「３’非コード配列」または「３’非翻訳領域」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響し得る調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することによって特徴づけられる。異なる３’非コード配列の使用は、Ingelbrecht, I. L., et al. (1989) Plant Cell 1:671-680に例示されている。
本発明は、ＲＮＡ転写物を提供する。本明細書で用いられるとき、「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼに触媒されるＤＮＡ配列の転写から得られる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであるとき、それは一次転写物と称される。ＲＮＡ転写物は、一次転写物の転写後プロセシングから誘導されるＲＮＡ配列であるとき、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを有さず、細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型に相補的であり、かつ逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは、一本鎖であり得るか、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて二重鎖形態に変換され得る。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、かつ細胞内またはインビトロでタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部もしくは一部に対して相補的であり、かつ標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写産物の任意の部分とともに、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、またはコード配列に存在してもよい。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されないことがあるにもかかわらず、細胞プロセスに対する影響を有する他のＲＮＡを指す。用語「相補体」および「逆相補体」は、ｍＲＮＡ転写物に関連して本明細書中で交換可能に用いられ、メッセージのアンチセンスＲＮＡを規定することを意味する。
本発明は、目的の遺伝子がプロモーター配列に作動可能に連結される場合の組換え遺伝子を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「作動可能に連結される」は、単一核酸断片上の核酸配列同士が、一方の機能が他方により調節されるように関連することを指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を調節する能力がある（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）とき、コード配列に作動可能に連結される。コード配列は、制御配列に対してセンスまたはアンチセンスの方向に作動可能に連結され得る。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’側、または標的ｍＲＮＡの３’側、または標的ｍＲＮＡ内部に、直接的または間接的のいずれかで作動可能に連結され得るか、あるいは第１の相補的領域が標的ｍＲＮＡの５’側であり、かつその相補体が標的ｍＲＮＡの３’側である。
本発明は、組換え発現カセットおよび組換え構築物を提供する。本明細書で用いられるとき、用語「組換え」は、例えば化学合成によるまたは遺伝子工学技術による核酸の単離されたセグメントの操作により、配列の２つの通常分かれているセグメントを人工的に組み合わせることを指す。本明細書で用いられるとき、語句「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えＤＮＡ構築物」は、本明細書で交換可能に用いられる。組換え構築物は、核酸断片、例えば天然には一緒に見出されることのない制御およびコード配列の人工的な組み合わせを含む。例えば、キメラ構築物は、異なる供給源に由来する制御配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、天然に見出される場合と異なる様式で配置される制御配列およびコード配列を含んでもよい。かかる構築物は、単独で用いられてもよく、またはベクターと併用されてもよい。ベクターが用いられる場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために用いられる方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを用いることができる。当業者は、本発明の単離された核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を良好に形質転換し、選択し、かつ増殖させるため、ベクター上に存在する必要がある遺伝要素を熟知している。当業者はまた、異なる独立の形質転換事象が発現の異なるレベルおよびパターンをもたらし（Jones et al., (1985) EMBO J. 4:2411-2418；De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86）、したがって所望される発現レベルおよびパターンを呈する系統を得るため、複数の事象がスクリーニングされる必要があることを理解するであろう。かかるスクリーニングは、特に、ＤＮＡのサザン解析、ｍＲＮＡ発現のノーザン解析、タンパク質発現の免疫ブロット解析、または表現型分析によって行われてもよい。ベクターは、自己複製するかまたは宿主細胞の染色体に組み込まれ得るプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターはまた、自己複製しないネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内でＤＮＡおよびＲＮＡの両方で構成されるポリヌクレオチド、ポリリジン結合ＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド結合ＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソーム結合ＤＮＡなどであり得る。
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のコムギ系統（例えば、パンコムギ）から得られるコムギ植物の再生可能な細胞の組織培養物を提供し、ここで、組織は、本発明により提供されるコムギ植物のすべてまたは実質的にすべての形態学的および生理学的特性を有する植物を再生する。１つのかかる実施形態では、組織培養物は、葉、根、根端、根毛、葯、雌蕊、雄蕊、花粉、胚珠、花、種子、胚、茎、芽、子葉、胚軸、細胞およびプロトプラストからなる群から選択される植物の部分に由来する。別のかかる実施形態では、本発明は、上記の組織培養物から再生されるコムギ植物を含む。
本発明は、漏出性親「１２２」もしくは「６２４」と称されるかまたは漏出性親「１２２」もしくは「６２４」またはその子孫のいずれかに由来するパンコムギ生殖質の細胞、細胞培養物、組織、組織培養物、種子、植物全体および植物部分を提供する。
本発明は、漏出性親「２１３」もしくは「２１７」と称されるかまたは漏出性親「２１３」もしくは「２１７」またはその子孫のいずれかに由来するデュラムコムギ生殖質の細胞、細胞培養物、組織、組織培養物、種子、植物全体および植物部分を提供する。
本発明は、漏出性親「１１７４」、「１５１３」、「１３４」、もしくは「１７０４」と称されるかまたは漏出性親「１１７４」、「１５１３」、「１３４」、「１７０４」またはその子孫のいずれかに由来するデュラムコムギ生殖質の細胞、細胞培養物、組織、組織培養物、種子、植物全体および植物部分を提供する。
例えば、コムギ組織培養の方法は、（Altpeterら、１９９６；Smidanskyら、２００２）を参照されたい。
コムギ
コムギは、トリチカム属（Triticum）に属する植物種である。コムギ種の非限定例として、トリチカム・エスチバム（T.aestivum）（別名：コムギまたはパンコムギ、６倍体）、Ｔ．エチオピカム（T.aethiopicum）、Ｔ．アララチカム（T.araraticum）、Ｔ．ベオチカム（T.boeoticum）、Ｔ．カルシリカム（T.carthlicum）、Ｔ．コンパクタム（T.compactum）、Ｔ．ディココイデス（T.dicoccoides）、Ｔ．ディコッカム（T.dicoccum）（別名：エマーコムギ、４倍体）、Ｔ．デュラム（T.durum）（別名：デュラムコムギ、４倍体）、Ｔ．イスパーニカム（T.ispahanicum）、Ｔ．カラミシェビイ（T.karamyschevii）、Ｔ．マチャ（T.macha）、Ｔ．ミリチネ（T.militinae）、Ｔ．モノコッカム（T.monococcum）（ヒトツブコムギ、２倍体）、Ｔ．ポロニカム（T.polonicum）、Ｔ．スペルタ（T.spelta）（別名：スペルト、６倍体）、Ｔ．スフェロコッカム（T.sphaerococcum）、Ｔ．チモフェービイ（T.timopheevii）、Ｔ．テュラニカム（T.turanicum）、トリチカム・ツルギダム（T.turgidum）、Ｔ．ウラルツ（T.urartu）、Ｔ．バビロビイ（T.vavilovii）、Ｔ．ズコブスキイ（T.zhukovskyi）およびそれらの任意の雑種が挙げられる。
一部のコムギ種は、２組の染色体を有する２倍体であるが、多くは、染色体の４組（４倍体）または６組（６倍体）を有する安定な多数体である。
ヒトツブコムギ（Ｔ．モノコッカム（T.monococcum））は、２倍体（ＡＡ、７つの染色体の２つの相補体、２ｎ＝１４）である。ほとんどの４倍体コムギ（例えば、エマーおよびデュラムコムギ）は、野生エマーのＴ・ディココイデス（T.dicoccoides）に由来する。野生エマーは、それ自体で、２つの２倍体野生イネ科植物、すなわちＴ．ウラルトゥ（T.urartu）と、野生ゴートグラス、例えばアエギロップス・セアルシー（Aegilops searsii）またはクサビコムギ（Aegilops speltoides）との間の雑種形成の結果である。野生エマー（ＡＡＢＢ）を形成する雑種形成は、栽培化のはるか以前に野生で生じ、自然選択により駆動された（Hancock, James F. (2004) Plant Evolution and the Origin of Crop Species. CABI Publishing. ISBN 0-85199-685-X）。６倍体コムギ（ＡＡＢＢＤＤ）は農場で進化した。栽培化されたエマーまたはデュラムコムギのいずれかをさらに別の野生２倍体イネ科植物（タルホコムギ（Aegilops tauschii））と雑種形成させることで、６倍体コムギ、スペルトコムギおよびパンコムギが得られた。これらは、３組の対合された染色体を有する。
したがって、６倍体コムギでは、ほとんどの遺伝子が各ゲノム（すなわちＡゲノム、ＢゲノムまたはＤゲノム）から１組ずつの相同な３重組として存在する一方、４倍体コムギでは、ほとんどの遺伝子が各ゲノム（すなわちＡゲノムまたはＢゲノム）から１組ずつの相同な２重組として存在する。ゲノムに沿って生じるランダム突然変異が理由で、異なるゲノムから単離された対立遺伝子は必ずしも同一でない。
コムギ遺伝子の特定の対立遺伝子の存在は、作物表現型にとって重要である。一部の対立遺伝子は、参照対立遺伝子と等しいかまたは実質的に等しい活性を有する機能的ポリペプチドをコードする。一部の対立遺伝子は、参照対立遺伝子と比べて増加した活性を有するポリペプチドをコードする。一部の対立遺伝子は、機能的ポリペプチドをコードしない破壊されたバージョンであるか、または参照対立遺伝子と比べて低下した活性を有するポリペプチドのみをコードする。異なる対立遺伝子の各々は、育種プログラムの具体的な目標に応じて利用され得る。
コムギデンプン合成遺伝子
デンプンは、植物中の主要な保留炭水化物である。デンプンは、実際上すべての組織タイプ、すなわち、葉、果実、根、シュート、茎、花粉および種子に存在する。穀物粒では、デンプンは、貯蔵エネルギーの主要な供給源である。穀物粒中に含有されるデンプンの量は、種および発生段階に応じて変動する。
２種のデンプン粒がコムギ胚乳中に見出される。コムギの大型（Ａ型）デンプン粒は、形状が円盤状またはレンズ状であり、平均直径が１０〜３５μｍであるが、小型（Ｂ型）デンプン粒は、形状がほぼ球状または多角形であり、直径が１〜１０μｍの範囲である。
パンコムギ（トリチクム・アエスチブムＬ．（Triticum aestivum L.））デンプンは、通常、ほぼ２５％のアミロースおよび７５％のアミロペクチンからなる（HannahおよびJames、２００８で検討された）。アミロースは、α−１，４結合により連結された直鎖のグルコース分子である。アミロペクチンは、α−１，６分枝点を有してα−１，４結合により連結されたグルコース残基からなる。
デンプン合成は、デンプン合成酵素により触媒される。アミロースおよびアミロペクチンは、共通の基質ＡＤＰ−グルコースを有する２つの経路により合成される。ＡＧＰアーゼは、植物におけるデンプン合成の最初のステップを触媒する。モチ様タンパク質顆粒結合デンプン合成酵素Ｉ（ＧＢＳＳＩ）は、アミロース合成を担うＷｘ遺伝子によりコードされる。可溶性デンプン合成酵素、例えばデンプン合成酵素Ｉ（ＳＳＩまたはＳＩ）、ＩＩ（ＳＳＩＩまたはＳＩＩ）、およびＩＩＩ（ＳＳＩＩＩまたはＳＩＩＩ）、デンプン分枝酵素（例えば、ＳＢＥＩ、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ）、ならびにイソアミラーゼ型および限界デキストリナーゼ型（ＩＳＡおよびＬＤ）のデンプン脱分枝酵素は、アミロペクチン合成において重要な役割を果たすと考えられている。
コムギのＳＳＩは、顆粒と可溶性画分との間で区画化される（Liら、１９９９、Pengら、２００１）。コムギＳＳＩＩは、主に顆粒に結合し、少量のみが可溶性画分中に存在する（GaoおよびChibbar、２０００）。ＳＳＩＩＩは、コムギ胚乳の可溶性画分中に排他的に見出される（Liら、２０００）。
一部の実施形態では、本開示は、特定のアミノ酸またはヌクレオチド配列突然変異を有するＳＳＩＩ対立遺伝子を指すことになる。例えば、一部の実施形態では、本開示は、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋを教示する。この表記は、対象の対立遺伝子の遺伝子−ゲノム−置換を指す。したがって、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋは、６倍体コムギのＤゲノムにおけるデンプン合成酵素ＩＩ遺伝子を指し、ここで、その配列は、ＳＳＩＩタンパク質が３６５位のＥのＫへのアミノ酸変化を示す原因になる突然変異を含む。
ＳＢＥは、２つの主要な群に分けることができる。Ｉ型ＳＢＥ（またはクラスＢ）は、トウモロコシ（Morellら、１９９１）、コムギ（Morellら、１９９７、Repellinら、１９９７、Bagaら、１９９９ｂ）、ジャガイモ（Kossmanら、１９９１）、コメ（Kawasakiら、１９９３）、およびキャッサバ（Salehuzzamanら、１９９２）から得られるＳＢＥＩ、ならびにエンドウ（Burtonら、１９９５）から得られるＳＢＥＩＩを含む。他方の群であるＩＩ型ＳＢＥ（またはクラスＡ）は、トウモロコシ（Gaoら、１９９７）、コムギ（Nairら、１９９７）、ジャガイモ（Larssonら、１９９６）、およびアラビドプシス（Arabidopsis）（Fisherら、１９９６）から得られるＳＢＥＩＩ、コメ（Mizunoら、１９９３）から得られるＳＢＥＩＩＩ、ならびにエンドウ（Bhattacharyyaら、１９９０）から得られるＳＢＥＩを含む。ＳＢＥＩおよびＳＢＥＩＩは、一般に、免疫学的に無関係であるが、異なる触媒活性を有する。ＳＢＥＩは、長いグルカン鎖を移行し、基質としてアミロースを好むが、ＳＢＥＩＩは、主にアミロペクチンに対して作用する（GuanおよびPreiss、１９９３）。ＳＢＥＩＩは、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂにさらに細分類され、それら各々は、触媒特性がわずかに異なる。２つのＳＢＥＩＩ形態は、異なる遺伝子によってコードされ、組織特異的様式で発現される（Gaoら、１９９７、Fisherら、１９９６）。特定組織内でのＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂの発現パターンは、植物種に特異的である。例えば、コメにおける胚乳に特異的なＳＢＥＩＩはＳＢＥＩＩａである（YamanouchiおよびNakamura、１９９２）一方、オオムギにおけるものはＳＢＥＩＩｂである（Sunら、１９９８）。
ＳＢＥは、α−１，４−標的化酵素、例えば、アミラーゼ、デンプンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．１）、不均化酵素（ＥＣ２．４．１．２５）、またはα−１，６−標的化酵素、例えば、直接的脱分枝酵素（例えば、限界デキストリナーゼ、ＥＣ３．２．１．４１、またはイソアミラーゼ、ＥＣ３．２．２．６８）、間接的脱分枝酵素（例えば、α−１，４−およびα−４，６−標的化酵素）のいずれかであり得る。幾つかのデンプン生合成タンパク質は、デンプン粒の内部に結合したものが見出され得る。これらのタンパク質のサブセットは、デンプン粒タンパク質（ＳＧＰ）と称されている。パンコムギデンプン粒タンパク質（ＳＧＰ）は、少なくとも、分子量が＞８０ｋｄであるＳＧＰ−１、ＳＧＰ−２およびＳＧＰ−３のすべて、ならびにモチ様タンパク質（ＧＢＳＳ）を含む。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて、YamamoriおよびEndo（１９９６）は、パンコムギデンプン由来のＳＧＰをＳＧＰ−１、ＳＧＰ−２、ＳＧＰ−３およびＷＸに分離した。ＳＧＰ−１画分は、ＳＧＰ−Ａ１、ＳＧＰ−Ｂ１およびＳＧＰ−Ｄ１にさらに分割され、関連する遺伝子が相同な第７群染色体に局在化された（YamamoriおよびEndo、１９９６）。ＳＧＰ−１タンパク質は、第７群染色体の短いアーム上の遺伝子ＳＳＩＩ−Ａ、ＳＳＩＩａ−Ｂ、ＳＳＩＩ−ＤによってコードされるＳＳＩＩのアイソフォームである（Liら、１９９９）。
一部の実施形態では、本明細書は、ＳＧＰ１としてのＳＧＰ−１突然変異、またはＳＧＰ−１突然変異をもたらすＳＳＩＩ対立遺伝子を指すことになる。
ＳＧＰ−１ヌル株では、野生型と比べて約８％増加したアミロースが認められ、これは、ＳＧＰ−１がアミロペクチン合成に関与することが推測される（Yamamoriら（２０００）。ＳＧＰ−１ヌル株はまた、デンプン粒の変形、総デンプン含量の減少、アミロペクチン含量の変更、およびＳＧＰ−２およびＳＧＰ−３のデンプン粒への結合の低下を示す。ＳＧＰ−１タンパク質は、デンプン合成酵素クラスＩＩ酵素であり、これらの酵素をコードする遺伝子は、ＳＳＩＩ−Ａ１、ＳＳＩＩ−Ｂ１、およびＳＳＩＩ−Ｄ１と称される（Liら、１９９９）。
４倍体であるデュラムコムギ（Triticum turgidum L.var.durum）は、パンコムギのＤゲノムが欠如するが、ＳＧＰ−１タンパク質をコードする遺伝子についての同質対立遺伝子は、ＡおよびＢゲノム上に存在する（Lafiandraら、２０１０）。
ＳＧＰ−１変異は、他の顆粒結合酵素の相互作用を、デンプン粒中でのそれらの捕捉を低減することにより改変すると考えられる。同様に、オオムギＳＳＩＩａ ｓｅｘ６遺伝子座突然変異は、デンプン含量が減少し、アミロース含量が増加し（＋４５％）（２つのＳＧＰ−１突然変異体について７０．３％に対して野生型２５．４％）、デンプン粒が変形され、他のＳＧＰとの結合が低下した種子を有する（Morellら、２００３）。これらのオオムギｓｓｌｌａ突然変異体は、可溶性タンパク質画分のウェスタンブロット分析に基づいてＳＳＩ、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂの通常の発現を有し、これは、デンプン合成遺伝子の全体的な下方制御がなかったことを示した。パンコムギにおけるＳＧＰ−１三重突然変異体では、ＳＳＩ、ＳＢＥＩＩａ、およびＳＢＥＩＩｂタンパク質は、発生中の種子において、それらがデンプン粒画分中に存在しないとはいえ、安定に発現された（Kosar-Hashemiら、２００７）。ＳＳＩＩの欠損およびアミロースの増加に関係する同様の結果が、トウモロコシ（Zhangら、２００４）およびエンドウ（Craigら、１９９８）の両方で観察されている。
ＲＮＡ干渉を通じてデュラムコムギでアミロペクチン合成についての別の重要な遺伝子ＳｂｅＩＩａを除去した結果、＋８％〜＋５０％（２４％の野生型に対して３１〜７５％のＳｂｅＩＩａ ＲＮＡｉ系統）の範囲のアミロース増加が得られたが、タンパク質含量は、野生型と同様であるかか、または場合により野生型よりも低いことが見出された（Sestiliら、２０１０ｂ）。ｑＲＴ−ＰＣＲを通じて、ＳｂｅＩＩａのサイレンシングの結果、モチ様遺伝子、ＳＳＩＩＩ、限界デキストリナーゼ（Ｌｄｌ）、およびイソアミラーゼ−１（Ｉｓｏ１）の発現が増加すると判定された。Sestiliら（２０１０ｂ）により、そのトランスジェニック系統の一部で認められた非常に高いアミロースの結果は、ＳｂｅＩＩａ発現の減少のみに起因していない可能性がある。なぜなら、ＳｂｅＩＩａ突然変異誘発は、ＳＳＩＩａ突然変異の場合により類似するアミロースレベルの増加をもたらしたからである（２８％のｓｂｅＩＩａ二重突然変異体に対して２３％の野生型）（Hazardら、２０１２）。現在まで、ＳＧＰ−１ヌルバックグラウンドにおけるデンプン合成遺伝子の詳細な発現特性は報告されていない。ＲＮＡ−Ｓｅｑは、転写物レベルでの遺伝子発現解析を可能にする次世代配列決定技術を採用する新たに出現した方法である。ＲＮＡ−Ｓｅｑは、再現性が高い単ヌクレオチド分解能をもたらし（Marioniら、２００８）、他の方法と比較してより大きい配列決定感度、大きいダイナミックレンジ、および発現される遺伝子の異なる対立遺伝子間またはアイソフォーム間を区別する能力を有する。ＲＮＡ−Ｓｅｑは、したがって、ヌルＳＧＰ−１遺伝子型が他のデンプン合成遺伝子の発現に対して有する効果を判定するために用いるための理想的な方法である。
高アミロース含量を有する穀類は、より多くの難消化性デンプンを有することから望ましい。難消化性デンプンは、ヒトおよび動物の腸管における分解に対して耐性があり、したがって食物繊維により類似した作用を示すが、微生物発酵を促進するデンプンである（Nugent ２００５で検討された）。高レベルの難消化性デンプンを有する製品は、全体的な大腸の健康を増進し、食物消化中での糖放出を低減する程に健康的であるとみなされる。８０％のアミロース含量を有するＳｂｅＩＩａがＲＮＡｉサイレンシングされたパンコムギ由来の全種子食が与えられたラットは、腸健康指数における改善と、微生物発酵の最終生成物である短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）における増加とを示した（Reginaら、２００６）。同様に、ヌルｓｓＩＩａオオムギがヒトに与えられたとき、幾つかの腸健康指数の著しい改善と、ＳＣＦＡの増加とが認められた（Birdら、２００８）。ｓｓＩＩａヌルオオムギから作製される押出シリアルも、ヒトに与えられたとき、グリセミック指数の低下および血漿インスリン応答の低下をもたらした（Kingら、２００８）。Yamamoriら（２０００）のＳＧＰ−１単一突然変異体をイタリアの育種系統と交配させ、それに戻し交配させ、次いで異種交配させることで、３重ヌル系統が生成され、全粒粉パンが準備された。乳酸の添加により得られたパンは、増加した難消化性デンプンおよび低下したグリセミック指数を有したが、インスリンレベルに影響しなかった（Hallstromら、２０１１）。最近、高アミローストウモロコシが、過体重の男性でのインスリン感受性を変化させ、糖尿病の病態生理学的特徴であるインスリン抵抗性を有する可能性を低下させることが示された（Makiら、２０１２）。
グリセミック指数に対するアミロースの増加の肯定的な影響に加えて、より高いアミロースは、コムギ製品の品質向上をもたらし得る。調理されるときに硬化するパスタは、加熱過多に耐えることから好ましく、高アミロースが麺硬さの増加をもたらすことが期待される。一部の実施形態では、加熱過多に対する耐性は、パスタの硬さと正に相関する。現在の高アミロースコムギベース食品は、高アミローストウモロコシデンプンの添加とともに標準的なアミロース含量の小麦粉を用いて調製される（Thompson、２０００）。デュラム品質に対する高アミロースの影響を試験するため、Sohら（２００６）は、デュラム小麦粉のアミロース含量を、高アミローストウモロコシデンプンおよびコムギグルテンの添加とともにデュラム小麦粉を再構成することにより変動させた。アミロース増加小麦粉は、より弱くて伸びにくい生地を有したが、より硬いパスタが得られた。パスタは、世界的に人気の高い食品であり、主に多数の他の文化的に重要な食品でも用いられるデュラムセモリナから作られる。
一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ中の漏出性突然変異の作出または同定を通じて高アミロースコムギ系統を開発する。一部の実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩ漏出性遺伝子型のデンプン合成に関与する他の遺伝子の発現に対する効果を試験するためのＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定を教示する。これらの系統は、それらの最終生成物の品質および潜在的な健康上の利益について試験される。
アミロペクチンに対するアミロースの比は、Ｗｘ遺伝子座またはその他のデンプン合成酵素遺伝子座の代替形態を選択することにより変化され得る。３つすべてのＷｘ遺伝子座にヌル対立遺伝子を有するパンコムギ（Nakamuraら、１９９５）および両方のＷｘ遺伝子座にヌル対立遺伝子を有するデュラムコムギ（Lafiandraら、２０１０およびVignauxら、２００４）は、アミロースをほとんど含まない。他方、３つのＳＧＰ−１遺伝子座がヌルであるパンコムギ系統は、示差走査熱量分析による測定では、野生型遺伝子型における２４．９％のアミロースと比べて３７．５％のアミロースを有した（Moritaら、２００５）。両方のＳＧＰ−１遺伝子座についてヌル対立遺伝子を有するデュラムコムギ系統は、野生型遺伝子型についての２３．０％と比べて、４３．６％のアミロースを有した（Lafiandraら、２０１０）。Ｗｘ遺伝子座の一方のみにヌル対立遺伝子を有する遺伝子型（部分的モチ様）は、アミロース含量におけるごくわずかな減少を示す。例えば、Martinら（２００４）は、Ｗｘ−Ｂ１について分離している組換え同系交配系集団において、野生型およびヌル対立遺伝子間でのアミロースにおける２．４％の差を示した。Vignauxら（２００４）は、部分的モチ様デュラム遺伝子型がアミロースを１％低減するが、その差は有意でないことを示した。
高繊維およびアミロース小麦粉ならびに得られる製品
一部の実施形態では、本発明のＳＳＩＩ漏出性コムギ植物は、より高い線維含量を有する。欧州および北米では、パスタは、従来、１００％デュラム小麦粉を用いて調製される（FuadおよびPrabhasanker、２０１０）。実際に、デュラム小麦粉に固有の特性により、その小麦粉はパスタ製造に理想的に適したものになる。なぜなら、比較的高い黄色色素レベルによる優れた色と、天然グルテニンタンパク質に固有の良好な混合特性とを与えるからである（DexterおよびMatson、１９７９；FuadおよびPrabhasanker、２０１０）。最近、増加した繊維およびアミロース含量を含む改善された栄養特性を有する小麦粉製品、ならびに増加したタンパク質含量を有する小麦粉製品の生産に向けての動きがある。
増加した食物繊維を有する小麦粉は、胃腸の健康増進ならびに糖尿病および心臓病のリスク低減と関連する。高アミロース含量を有する小麦粉も、消化中に吸収されず、したがって食物繊維の場合と同様の健康上の利益をもたらす難消化性デンプンをより高い含量で有することから望ましい。小麦粉のアミロース含量の増加はまた、デンプンの糊化およびペースト化特性に影響する。ラピッドビスコアナライザ（ＲＶＡ）により測定されたピーク粘度、最終粘度、ブレークダウン、セットバックおよびピーク時間がすべてデュラムコムギにおけるアミロース含量の増加とともに低下した（Lafiandraら、２０１０）。デンプン特性の改変は、硬さの増加および加熱過多に対する耐性などの最終生成物特性における変化に転換される。
小麦粉製品の食物繊維、アミロースおよび／またはタンパク質含量の増加は、エンドウ粉、穀類可溶性もしくは不溶性繊維などの様々なタンパク質または食物繊維富化画分を組み込むことにより達成され得る。しかし、これらのタイプの混合富化した小麦粉ブレンドは、消費者受容性の問題を招き得る。例えば、デュラムコムギにオオムギ粉をブレンドしてパスタ中の食物繊維を増やすことで、暗色の製品が得られた（Casiraghiら、２０１３）。エンドウ粉によるパスタの栄養強化により、生地の取り扱い特性を悪化させ、パスタ調理上の損失が増加し、加熱過多に対する耐性低下をもたらした（Nielsenら、１９８０）。デュラムコムギを改変してアミロース、タンパク質および食物繊維を増加させることは、改善された栄養を有するとともにデュラム小麦粉の望ましい特性の多くを保持しているパスタを得ることになるため、デュラム小麦粉添加剤にとって好ましい。その場合、最終製品は、１００％デュラムパスタに対する北米および欧州での嗜好性に適合することになる。パスタの調製で用いられるアミロース、タンパク質および食物繊維が増加したデュラム小麦粉は、外見がはるかに暗く、調理後の低下した硬さを有するため、消費者受容性の低下を招く標準的な全粒粉デュラムパスタの場合よりも好ましくなる可能性が高い（MantheyおよびSchorno、２００２）。
一部の実施形態では、本発明のＳＳＩＩ漏出性コムギ品種は、アミロース含量を有するデンプンを含有する。最近、食品用の増加したアミロースを有する小麦粉に対して関心が払われている。主な理由は、高アミロースのデンプンが難消化性デンプンの増加した画分を有することにある。難消化性デンプンは、消化中に小腸で吸収されない画分である（Nugent、２００５で検討された）。難消化性デンプンは、食物繊維と同様の健康上の利益をもたらすと考えられる。商業的な高アミロース食品は、従来、高アミローストウモロコシデンプンを用いて開発されている（Thompson、２０００）。高アミロースパンコムギ遺伝子型の開発により、最終生成物の品質に対する高アミロースコムギデンプンの影響を試験することが可能になっている。高アミロース小麦粉は、普通の小麦粉よりも固い質感の生地およびより粘稠性のもの、またより小さいブレッドローフをもたらした（Moritaら、２００２）。最大５０％の高アミロース小麦粉を置換し、残りに通常の小麦粉を用いることで、１００％通常の小麦粉対照との差異が顕著でないパン品質が得られた（Hungら、２００５）。アミロース含量が可変のデュラムおよびパン小麦粉は、高アミローストウモロコシデンプンを用いてそれらを再構成することにより製造され得る（Sohら、２００６）。高アミロースのデュラム小麦粉は、より弱く伸びにくい生地を有した。これらの小麦粉から生産されるパスタは、アミロース含量の増加とともに調理上の損失が増加し、より硬い傾向があった。
たとえアミロースにおける小さい漸増であっても、最終生成物の品質に影響する場合がある。消費者は、硬く、加熱過多に対して耐性があるパスタを好む。アミロースの低下は、テクスチャがより柔らかい麺類をもたらす（Odaら、１９８０；MiuraおよびTanii、１９９４；Zhaoら、１９９８）。デュラム製品の品質に対してアミロース含量が若干増加する影響は未知である。例えば、部分的モチ様小麦粉から得られるアジアの麺品質が注目されている。部分的モチ様軟コムギ栽培変種は、Ｗｘ遺伝子座の１つでの突然変異に起因し、麺により柔らかいテクスチャを与えることから、うどん麺類用に好まれる（Odaら、１９８０；MiuraおよびTanii、１９９４；Zhaoら、１９９８）。部分的モチ様遺伝子型は、硬質コムギ組換え同系交配系集団内で、白い加塩麺の硬さについて野生型と異ならなかった（Martinら、２００４）。しかし、部分的モチ様遺伝子型は、より大きいローフ体積を与え、パンは野生型から得られるものよりも軟らかいテクスチャであった。
コムギにおける突然変異デンプン合成遺伝子の同定および作出
１つ以上のデンプン合成遺伝子の１つ以上の突然変異体対立遺伝子を有するコムギが作出および同定され得る。一部の実施形態では、かかる突然変異体対立遺伝子は、進化の過程で天然に生じる。一部の実施形態では、かかる突然変異体対立遺伝子は、人工的方法、例えば、突然変異誘発（例えば、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発、トランスポゾン突然変異誘発、挿入突然変異誘発、符号タグ化突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、および天然突然変異誘発）、アンチセンス、ノックアウト、および／またはＲＮＡ干渉によって作出される。一部の実施形態では、本発明の突然変異体対立遺伝子は、遺伝子機能が皆無かほとんど残存しないヌル対立遺伝子である。他の実施形態では、本発明の突然変異体対立遺伝子は、中間表現型を作出するために部分的な遺伝子機能が残存する場合、漏出性対立遺伝子である。
タンパク質分子をコードする変異体核酸を生成および／または単離するため、および／またはデンプン合成遺伝子のタンパク質をさらに修飾する／突然変異させるため、様々なタイプの突然変異誘発を用いることができる。それらは、限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え（ＤＮＡシャフリング）、ウラシル含有鋳型を用いる突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを用いる突然変異誘発などを含む。さらなる好適な方法は、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いる突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、二本鎖切断修復などを含む。例えばキメラ構築物を含む突然変異誘発も本発明に含まれる。一実施形態では、突然変異誘発は、天然分子または改変もしくは突然変異された天然分子の既知情報、例えば、配列、配列比較、物理的特性、結晶構造などにより導くことができる。植物における突然変異誘発に関するさらなる情報、例えば、作用剤、プロトコルについては、Acquaahら（Principles of plant genetics and breeding, Wiley-Blackwell, 2007, ISBN 1405136464, 9781405136464（その存在において参照により本明細書に援用される））を参照されたい。ＲＮＡ干渉を用いて植物遺伝子を破壊する方法は、本明細書で後述される。
遺伝子機能は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によっても中断および／または改変され得る。ＲＮＡｉは、配列が発現抑制遺伝子に対して相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される、動物および植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングまたは転写遺伝子サイレンシングの過程である。本発明において有用な好ましいＲＮＡエフェクター分子は、本発明の方法のいずれかが実施された後に機能が乱されないように意図された任意の宿主ポリヌクレオチド配列と配列が十分に異なる必要がある。ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列と宿主の必須な正常配列との間での相同性の本質的欠如を規定するため、コンピュータアルゴリズムが用いられてもよい。
用語「ｄｓＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ分子」または「二本鎖ＲＮＡエフェクター分子」は、二本鎖立体構造中に存在する少なくとも約１９以上のヌクレオチドの領域を有する少なくとも部分的に二本鎖のリボ核酸分子を指す。二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、２つの別々のＲＮＡ鎖から形成される二重鎖の二本鎖ＲＮＡであってもよいか、または少なくとも部分的に二本鎖のヘアピン立体構造を仮定することができる、自己相補性の領域を有する単一ＲＮＡ鎖（すなわち、ヘアピンｄｓＲＮＡまたはステムループｄｓＲＮＡ）であってもよい。様々な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、全体的にリボヌクレオチドからなるか、またはリボヌクレオチドとデオキシヌクレオチドとの混合物、例えばＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからなる。ｄｓＲＮＡは、分子のあるセグメント内のヌクレオチドが分子の別のセグメント内のヌクレオチドと塩基対を形成するように自己相補性の領域を有する単一分子であってもよい。一態様では、自己相補性の領域は、分子の別の部分に対する相補性が欠如し、したがって一本鎖のままである（すなわち「ループ領域」）、少なくとも約３〜４ヌクレオチド、または約５、６、７、９〜１５以上のヌクレオチドの領域によって連結される。かかる分子は、任意選択的に短い一本鎖５’および／もしくは３’末端を伴う部分的に二本鎖のステムループ構造をとることになる。一態様では、ヘアピンｄｓＲＮＡの自己相補性の領域または二重鎖ｄｓＲＮＡの二本鎖領域は、エフェクター配列およびエフェクター補体（例えば、ヘアピンｄｓＲＮＡ中の一本鎖ループ領域によって連結される）を含むことになる。エフェクター配列またはエフェクター鎖は、ＲＩＳＣに組み込まれるかまたはＲＩＳＣと関連する二本鎖領域の鎖または二重鎖である。一態様では、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、デンプン合成遺伝子に対する逆相補体である、少なくとも１９の隣接ヌクレオチド、好ましくは１９〜２９、１９〜２７、もしくは１９〜２１ヌクレオチドのエフェクター配列を含むことになる。
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子は、「ヘアピンｄｓＲＮＡ」、「ｄｓＲＮＡヘアピン」、「短いヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」、すなわち、約４００〜５００ヌクレオチド（ｎｔ）未満、または１００〜２００ｎｔ未満のＲＮＡ分子であって、少なくとも１５〜１００ヌクレオチド（例えば、１７〜５０ｎｔ、１９〜２９ｎｔ）の少なくとも１つのストレッチが同じＲＮＡ分子（一本鎖ＲＮＡ）上に位置する相補的配列と塩基対合され、前記配列および相補的配列が、塩基相補性の２つの領域によって作出されるステム構造の上方に一本鎖ループを形成する少なくとも約４〜７ヌクレオチド（または約９〜約１５ｎｔ、約１５〜約１００ｎｔ、約１００〜約１０００ｎｔ）の非対合領域によって分かれる、ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡ分子は、阻害されるべき標的配列に対して相同的かつ相補的である、約１７〜約５００ｂｐ；約１７〜約５０ｂｐ；約４０〜約１００ｂｐ；約１８〜約４０ｂｐ；もしくは約１９〜約２９ｂｐの二本鎖ステム領域；および塩基相補性の２つの領域によって作出されるステム構造の上方に一本鎖ループを形成する少なくとも約４〜７ヌクレオチド、または約９〜約１５ヌクレオチド、約１５〜約１００ｎｔ、約２５０〜５００ｂｐ、約１００〜約１０００ｎｔの非対合ループ領域を含む、少なくとも１つのステムループ構造を含む。しかし、逆相補体が直後に位置する配列を含むＲＮＡ分子は、たとえ無関係の「スタッファー」配列によって分けられない場合でもステムループ立体構造をとる傾向があることから、「ループ領域」または「ループ配列」を含むことが厳密には必要でないことは理解されるであろう。
１つ以上の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子に転写され得るＤＮＡ配列を含む本発明の発現構築物は、コムギ植物に形質転換され得、ここで、形質転換植物は、非形質転換植物と異なるデンプン組成をもたらす。ｄｓＲＮＡエフェクター分子によって阻害されるべき標的配列は、限定されないが、脂肪酸合成遺伝子のコード領域、５’ＵＴＲ領域、３’ＵＴＲ領域を含む。
ＲＮＡｉの効果は、植物において全身性および遺伝性の両方であり得る。植物では、ＲＮＡｉは、原形質連絡を介する細胞間でのｓｉＲＮＡの移動により伝播すると考えられる。遺伝性は、ＲＮＡｉによって標的化されるプロモーターのメチル化から生じ、新しいメチル化パターンは、細胞の各々の新たな世代でコピーされる。植物と動物との間の幅広い一般的な差異は、内因的に生成されるｍｉＲＮＡの標的化にあり、植物では、ｍｉＲＮＡは、通常、それらの標的遺伝子に対して完全またはほぼ完全に相補的であり、ＲＩＳＣにより直接的なｍＲＮＡ切断を誘導する一方、動物のｍｉＲＮＡは、配列がより多様である傾向があり、翻訳抑制を誘導する。植物におけるＲＮＡｉについての詳細な方法は、David Allisら（Epigenetics, CSHL Press, 2007, ISBN 0879697245, 9780879697242）、Sohailら（Gene silencing by RNA interference: technology and application, CRC Press, 2005, ISBN 0849321417, 9780849321412）、Engelkeら（RAN Interference, Academic Press, 2005, ISBN 0121827976, 9780121827977），およびDoranら（RNA Interference: Methods for Plants and Animals, CABI, 2009, ISBN 1845934105, 9781845934101）（あらゆる目的でそれら全体が参照により本明細書にすべて援用される）に記載されている。
遺伝子編集技術
一部の実施形態では、本発明のコムギ品種は、遺伝子編集技術を介して作製される１つ以上の遺伝子修飾を含む。一部の実施形態では、本発明のＳＧＰ突然変異体対立遺伝子は、遺伝子編集技術を介して作出される。一部の実施形態では、本開示のコムギ植物は、限定されないが、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮＳ、ＣＲＩＳＰＲ、およびＭｅｇａヌクレアーゼ技術などのツールを含む、任意のゲノム編集ツールを用いて修飾されている１つ以上の突然変異遺伝子を含む。一部の実施形態では、当業者は、本発明のＳＧＰ突然変異体対立遺伝子が他の多くの遺伝子編集技術を用いて作出され得ることを理解するであろう。
一部の実施形態では、本開示の遺伝子編集ツールは、特定のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列で標的化し、切断するようにカスタム設計されているタンパク質またはポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、選択されたＤＮＡ配列に対して直接的に認識し、結合する能力がある。他の実施形態では、本開示の遺伝子編集ツールは複合体を形成し、ここで、ヌクレアーゼ成分は複合体を標的ＤＮＡ配列に結合させ、動員するための核酸分子に依存する。
一部の実施形態では、単一成分遺伝子編集ツールは、植物のゲノム内の特定ＤＮＡ配列を認識する能力がある結合ドメインおよび二本鎖ＤＮＡを切断するヌクレアーゼを含む。植物育種のために遺伝子編集技術を開発する根本的理由は、植物ゲノムへの部位特異的突然変異の導入または遺伝子の部位特異的組込みを可能にするツールの創出にある。
遺伝子を植物細胞に送達するための多くの方法、例えば、遺伝子移入、電気穿孔、ウイルスベクターおよびアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性移入が利用可能である。遺伝子は、プラスミドベクターから一過性に発現され得る。発現されると、遺伝子は、たとえその遺伝子を含むプラスミドの分解後であっても安定的に継承されることになる標的化された突然変異をもたらす。
一部の実施形態では、本発明のＳＧＰ突然変異体対立遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを通じて修飾されている。ＺＦＮ技術の３つの変異体は、（ＺＦＮ−１および−２技術の場合における単一突然変異または短い欠失／挿入をもたらすことからＺＦＮ−３技術の場合における新たな遺伝子の標的化移入までの範囲の用途を伴う）植物育種において認識されている。
ＺＦＮ−１：ＺＦＮをコードする遺伝子が、修復鋳型を有しない植物細胞に送達される。ＺＦＮは、植物ＤＮＡに結合し、部位特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす。（非相同末端連結（ＮＨＥＪ）を通じて生じる）天然ＤＮＡ修復プロセスは、１個もしくはわずか数個の塩基対における部位特異的突然変異、または短い欠失もしくは挿入を導く。
ＺＦＮ−２：ＺＦＮをコードする遺伝子が、数キロ塩基対に及ぶ標的化領域に相同な修復鋳型とともに植物細胞に送達される。ＺＦＮは、植物ＤＮＡに結合し、部位特異的なＤＳＢをもたらす。天然遺伝子修復機構は、部位特異的な点突然変異、例えば相同組換えを通じた１個または数個の塩基対に対する変化および修復鋳型のコピーをもたらす。
ＺＦＮ−３：ＺＦＮをコードする遺伝子が、数キロ塩基対長であり得、かつその末端が切断部位に隣接するＤＮＡ配列に相同であるＤＮＡのストレッチとともに植物細胞に送達される。その結果、ＤＮＡストレッチは、植物ゲノムに部位特異的様式で挿入される。
一部の実施形態では、本開示のＳＧＰ突然変異体対立遺伝子は、転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を通じて修飾されている植物と適合できる。ＴＡＬＥＮは、特定の核酸領域に対して認識し、結合する能力がある反復ポリペプチドアームを有するポリペプチドである。選択された標的配列を認識するようにポリペプチドアームを改変することにより、ＴＡＬヌクレアーゼを用いて、二本鎖ＤＮＡ切断を特定のゲノム領域に誘導することができる。次に、これらの切断は、宿主生物のＤＮＡに対して編集、欠失、挿入、または他の修飾を施すための組換えを介して修復され得る。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、遺伝子編集のため（例えば、遺伝子の欠失または破壊のため）、単独で用いられる。他の実施形態では、ＴＡＬは、ドナー配列および／または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）プロセスを補助する他の組換え因子タンパク質と併用することで、標的化ＤＮＡ領域が置き換わる。本開示のＴＡＬ媒介性遺伝子編集のための組成物および方法に関するさらなる情報については、米国特許第８，４４０，４３２号；同第８，４４０，４３２号；同第８，４５０，４７１号；同第８，５８６，５２６号；同第８，５８６，３６３号；同第８，５９２，６４５号；同第８，６９７，８５３号；同第８，７０４，０４１号；同第８，９２１，１１２号；および同第８，９１２，１３８号（それらの各々はあらゆる目的でその全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
一部の実施形態では、本開示のＳＧＰ突然変異体対立遺伝子は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）またはＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子編集ツールを通じて生成される。ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、当初、細菌をウイルスおよびプラスミド侵入に対して保護する細菌獲得免疫系として発見された。
少なくとも３つの主なＣＲＩＳＰＲシステムタイプ（タイプＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ）および少なくとも１０の異なるサブタイプが存在する（Makarova, K.S., et al., Nat Rev Microbiol. 2011 May 9;9(6):467-477）。タイプＩおよびＩＩＩシステムでは、Ｃａｓタンパク質複合体および短いガイドポリヌクレオチド配列が用いることで、選択されたＤＮＡ領域を標的化する。タイプＩＩシステムは、単一タンパク質（例えば、Ｃａｓ９）および標的化ガイドポリヌクレオチドに依存し、ここで、ガイド配列の５’末端の一部分が標的核酸に対して相補的である。本開示のＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集のための組成物および方法に関するさらなる情報については、米国特許第号８，６９７，３５９号；同第８，８８９，４１８号；同第８，７７１，９４５号；および同第８，８７１，４４５号（それらの各々はあらゆる目的でその全体が本明細書に援用される）を参照されたい。本発明はまた、（Zetsche, B. et al. Cell. 2015 163, 759-771）に記載のようなＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１シテムと適合できる。
一部の実施形態では、本開示のＳＧＰ突然変異体対立遺伝子は、メガヌクレアーゼを通じて修飾されている。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、選択されたＤＮＡ配列を標的化し、ＤＮＡ切断を誘導する能力がある改変されたエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、特定領域を標的化する新たなメガヌクレアーゼが、様々な他の同定されたヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合モチーフを組み合わせた組換え技術を通じて開発される。他の実施形態では、新たなメガヌクレアーゼは、追加配列に対する特異性を得るために既存の結合ドメインの構造を変更することを試みる、半合理的な突然変異分析を通じて作出される。ゲノム編集におけるメガヌクレアーゼの使用に関するさらなる情報については、Silva et al., 2011 Current Gene Therapy 11 pg. 11-27；およびStoddard et al., 2014 Mobile DNA 5 pg. 7（それらの各々はあらゆる目的でその全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
一部の実施形態では、コムギ中の突然変異デンプン合成遺伝子は、コムギ集団を１つ以上の表現型に基づいてスクリーニングすることにより同定できる。
一部の実施形態では、表現型は、小麦粉膨潤度における変化である。
一部の実施形態では、コムギ中の突然変異デンプン合成遺伝子は、コムギ集団をコムギ中の１つ以上のデンプン合成遺伝子のＰＣＲ増幅および配列決定に基づいてスクリーニングすることにより同定され得る。
一部の実施形態では、本発明は、パンコムギおよび／またはデュラムコムギ中のデンプン合成漏出性対立遺伝子を教示する。
一部の実施形態では、コムギ中の突然変異デンプン合成遺伝子は、TILLING（登録商標）により同定され得る。TILLING（登録商標）での方法および組成物についての詳細な説明は、米国特許第５９９４０７５号、米国特許出願公開第２００４／００５３２３６Ａ１号、国際公開第２００５／０５５７０４号および国際公開第２００５／０４８６９２号（あらゆる目的でそれらの各々が参照により本明細書に援用される）に見出され得る。
TILLING（登録商標）（標的化により誘導されるゲノム中の局所的損傷）は、特定遺伝子中の突然変異の指定された同定を可能にする、分子生物学における方法である。TILLING（登録商標）は、モデル植物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いて２０００年に導入された。TILLING（登録商標）は、それ以来、ゼブラフィッシュ、トウモロコシ、コムギ、コメ、ダイズ、トマトおよびレタスなどの他の生物での逆遺伝学的方法として用いられている。本方法は、化学変異原（例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ））を用いる突然変異誘発の標準の効率的技術を、標的遺伝子中の単一塩基突然変異（点突然変異とも称される）を同定する高感度ＤＮＡスクリーニング技術と組み合わせる。EcoTILLINGは、通常、集団遺伝学的分析のため、TILLING（登録商標）技術を用いて個体中の天然突然変異を探す方法である。Comai, et al., 2003, Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by EcoTILLING. The Plant Journal 37, 778-786、Gilchrist et al. 2006. Use of EcoTILLING as an efficient SNP discovery tool to survey genetic variation in wild populations of Populus trichocarpa. Mol. Ecol. 15, 1367-1378、Mejlhede et al. 2006. EcoTILLING for the identification of allelic variation within the powdery mildew resistance genes mlo and Mla of barley. Plant Breeding 125, 461-467、Nieto et al. 2007, EcoTILLING for the identification of allelic variants of melon eIF4E, a factor that controls virus susceptibility. BMC Plant Biology 7, 34-42（それらの各々はあらゆる目的で参照により本明細書に援用される）を参照されたい。DEcoTILLINGは、安価な方法を用いて断片を同定するTILLING（登録商標）およびEcoTILLINGの改良である（Garvin et al., 2007, DEco-TILLING: An inexpensive method for SNP discovery that reduces ascertainment bias. Molecular Ecology Notes 7, 735-746）。
本発明はまた、デンプン合成遺伝子の変異体を包含する。一部の実施形態では、デンプン合成遺伝子は、ＧＢＳＳ、モチ様タンパク質、ＳＢＥＩおよびＩＩ、デンプン脱分枝酵素、ならびにＳＳＩ、ＳＳＩＩ，ＳＳＩＩＩ、およびＳＳＩＶをコードする遺伝子からなる群から選択される。一部の実施形態では、デンプン合成遺伝子は、ＳＳＩＩである。突然変異体は、構成タンパク質のアミノ酸配列中の改変を含んでよい。ポリペプチドに関しての用語「突然変異体」は、参照配列に対して１つ以上のアミノ酸が改変されたアミノ酸配列を指す。突然変異体は、「保存的」変化または「非保存的」変化を有し得、例えば類似するわずかな変動もアミノ酸欠失もしくは挿入または両方を含み得る。
デンプン合成遺伝子中の突然変異は、デンプン合成遺伝子のコード領域または非コード領域内に存在し得る。突然変異は、コードされるデンプン合成遺伝子中のアミノ酸変化を導くか、または導かない可能性がある。一部の実施形態では、突然変異は、ミスセンス、重度のミスセンス、サイレント、ナンセンス突然変異であり得る。例えば、突然変異は、ヌクレオチド置換、挿入、欠失、またはゲノム再構成であり得、それらは、次いでリーディングフレームシフト、アミノ酸置換、挿入、欠失、および／またはポリペプチド短縮を導く場合がある。その結果、突然変異デンプン合成遺伝子は、参照対立遺伝子によりコードされるポリペプチドと比べて改変された活性を有するデンプン合成ポリペプチドをコードする。
本明細書で用いられるとき、ナンセンス突然変異は、転写されたｍＲＮＡ中で未熟な停止コドンまたはナンセンスコドン、および短縮され、不完全でかつ通常非機能的なタンパク質生成物をもたらすＤＮＡの配列内の点突然変異、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である。ミスセンス変異（非同義突然変異の１種）は、単一ヌクレオチドが変化して、異なるアミノ酸をコードするコドンをもたらす点突然変異である（アミノ酸を停止コドンに変化させる突然変異は、ミスセンス変異ではなくナンセンス変異とみなされる）。これにより、得られるタンパク質は非機能的になり得る。サイレント突然変異は、タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらさないＤＮＡ突然変異である。それらは、非コード領域内（遺伝子の外側またはイントロン内）で生じることがあるか、または最終のアミノ酸配列を改変しない様式でエキソン内で生じることがある。重度のミスセンス突然変異は、アミノ酸を変化させ、それにより立体構造、電荷状態などでの劇的な変化を導く。
突然変異は、デンプン合成遺伝子の任意の部分、例えばデンプン合成遺伝子の５’側、中間、または３’側に位置することで、コードされるデンプン合成タンパク質の任意の部分に突然変異をもたらし得る。他の実施形態では、本発明の突然変異は、デンプン合成遺伝子のプロモーター領域上に位置することで、遺伝子の改変された発現を導き得る。例えば、一部の実施形態では、本発明は、デンプン合成酵素遺伝子のプロモーターの１つ以上における突然変異に起因して、低下したデンプン合成酵素活性を有するコムギ植物を教示する。一部の実施形態では、本発明は、デンプン合成酵素対立遺伝子の各々に異なる突然変異を有してもよい。他の実施形態では、デンプン合成酵素対立遺伝子は、同じ突然変異を有し得る。
例えば、一部の実施形態では、本発明は、デンプン合成酵素遺伝子の転写領域内に１つ以上の突然変異、およびデンプン合成酵素プロモーター中に１つ以上の突然変異を有するコムギ植物を教示する。
他の実施形態では、本発明は、デンプン合成酵素対立遺伝子の非コード領域内（例えば、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、イントロン、スプライスジャンクション）に１つ以上の突然変異を有するコムギ植物を教示する。
本発明の突然変異体デンプン合成タンパク質は、参照対立遺伝子もしくは生物活性変異体またはそれらの断片に１つ以上の修飾を有し得る。特に好適な修飾は、アミノ酸置換、挿入、欠失、または短縮を含む。一部の実施形態では、タンパク質活性を破壊または改変するため、タンパク質中に少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失が設けられる。置換は、分子中の１つのアミノ酸のみが置換されている場合、単一であり得るか、または２つ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換されている場合、複数であり得る。挿入突然変異体は、参照タンパク質分子、生物活性変異体、またはそれらの断片における特定位置のアミノ酸の直ぐ隣に挿入された１つ以上のアミノ酸を有するものである。挿入は、１つ以上のアミノ酸であり得る。挿入は、例えば１つまたは２つの保存的アミノ酸からなり得る。挿入部位の隣のアミノ酸に対して電荷および／または構造が類似するアミノ酸は、保存的と定義される。あるいは、突然変異体デンプン合成タンパク質は、挿入部位の隣のアミノ酸と実質的に異なる電荷および／または構造を有するアミノ酸の挿入を含む。一部の他の実施形態では、突然変異体デンプン合成タンパク質は、参照タンパク質と比べて１つ以上のドメインを喪失した短縮タンパク質である。
幾つかの例では、突然変異体は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００アミノ酸の変化を有することができる。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸変化は、保存的置換である。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸変化は、非保存的置換である。一部の実施形態では、突然変異タンパク質は、野生型対立遺伝子と比べて改変された酵素活性を有する。一部の実施形態では、突然変異タンパク質は、野生型対立遺伝子と比べて低下または増加した酵素活性を有する。一部の実施形態では、野生型対立遺伝子と比べて低下または増加した酵素活性は、コムギにおけるアミロース含量変化を導く。
保存的アミノ酸置換は、設けられるとき、元のタンパク質の特性に対する干渉が最小である、すなわちタンパク質の構造および特に機能が、かかる置換により保存され、顕著に改変されない置換である。保存的置換は、一般に、（ａ）置換の領域内のポリペプチド主鎖の例えばシートもしくはらせん立体構造としての構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持する。保存的置換についてのさらなる情報は、例えば、Ben Bassatら（J. Bacteriol., 169:751-757, 1987）、O’Reganら（Gene, 77:237-251, 1989）、Sahin Tothら（Protein Sci., 3:240-247, 1994）、Hochuliら（Bio/Technology, 6:1321-1325, 1988）、ならびに遺伝学および分子生物学の広範に用いられる参考書において見出され得る。Blosum行列は、ポリペプチド配列の関連度を決定するために一般的に用いられた。Blosum行列は、信頼されるアラインメントの大規模データベース（BLOCKSデータベース）を用いて作出されたが、ここでは幾らかの閾値パーセンテージ同一性よりも小さく関連するペアワイズ配列アラインメントが計算された（Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992）。９０％同一性の閾値が、BLOSUM90行列の高度に保存された標的頻度に対して用いられた。６５％同一性の閾値が、BLOSUM65行列に対して用いられた。Blosum行列中のゼロ以上のスコアは、選択されるパーセンテージ同一性で「保存的置換」と見なされる。下表は、例示的な保存的アミノ酸置換を示す。
一部の実施形態では、突然変異体デュラムコムギは、１つの共有先祖、例えばデュラムコムギの「Ａ」型ゲノムまたはデュラムコムギの「Ｂ」型ゲノムをたどることができる同じゲノムのデンプン合成遺伝子に関連した突然変異を含む。例えば、突然変異ＳＳＩＩ−Ａまたは突然変異ＳＳＩＩ−Ｂを有する突然変異体デュラムコムギが含まれる。一部の実施形態では、所定のゲノム型の中のデンプン合成遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が突然変異される。
一部の実施形態では、突然変異体デュラムコムギは、２つの共有先祖、例えばデュラムコムギの「Ａ」型ゲノムおよび「Ｂ」型ゲノムをたどることができる異なるゲノムの同じデンプン合成遺伝子に関連した突然変異を含む。例えば、突然変異ＳＳＩＩ−Ａおよび突然変異ＳＳＩＩ−Ｂを有する突然変異体デュラムコムギが含まれる。一部の実施形態では、２つのゲノム型の中のデンプン合成遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が突然変異される。
一部の実施形態では、突然変異体デュラムコムギは、１つの共有先祖、例えばパンコムギの「Ａ」型ゲノムまたはパンコムギの「Ｂ」型ゲノム、またはパンコムギの「Ｄ」型ゲノムをたどることができる同じゲノムのデンプン合成遺伝子に関連した突然変異を含む。例えば、突然変異ＳＳＩＩ−Ａ、突然変異ＳＳＩＩ−Ｂまたは突然変異ＳＳＩＩ−Ｄを有する突然変異体パンコムギが含まれる。一部の実施形態では、所定のゲノム型の中のデンプン合成遺伝子の１つ以上の対立遺伝子が突然変異される。
一部の実施形態では、突然変異体パンコムギは、２つまたは３つの共有先祖、例えばパンコムギの「Ａ」型ゲノム、「Ｂ」型ゲノムおよび「Ｄ」型ゲノムをたどることができる異なるゲノムの同じデンプン合成遺伝子に関連した突然変異を含む。例えば、突然変異ＳＳＩＩ−Ａ、突然変異ＳＳＩＩ−Ｂおよび突然変異ＳＳＩＩ−Ｄを有する突然変異体パンコムギが含まれる。一部の実施形態では、２つのタイプのゲノム型内部のデンプン合成遺伝子の１つ以上の対立遺伝子が突然変異される。
一部の実施形態では、本発明は、突然変異体ＳＳＩＩ対立遺伝子の１つ以上が漏出性であることを教示する。一部の実施形態では、ＳＳＩＩ対立遺伝子の２つがヌルであり、かつ１つが漏出性である。一部の実施形態では、ＳＳＩＩ対立遺伝子の１つがヌルであり、かつ２つが漏出性である。さらに別の実施形態では、すべてのＳＳＩＩ対立遺伝子が漏出性である。
一部の実施形態では、１つのＳＳＩＩ対立遺伝子がヌルであり、かつ１つが漏出性である。一部の実施形態では、両方のＳＳＩＩ対立遺伝子が漏出性である。
小麦穀粒の製粉
製粉された小麦材料を調製するためのプロセスの有用例が、現在公知であるかまたは将来開発されるものとして、製粉および分離ステップを関連のプロセスステップとともに含むことは、当業者により理解されるであろう。かかる例示的な方法によると、製粉品質の小麦穀粒は、精白などのふすま除去、胚芽を除去するための精白、研磨、粉砕、サイジング、調整などの他の形態の１つ以上を含み得る製粉ステップにより加工され得る。
従来の製粉方法では、精白小麦粉およびミルフィード（粗粒分）を形成するため、小麦は、集められ、精選され、調整され、次いで、粉砕される。このプロセスにおける第１ステップ、すなわち小麦の精選は、雑草種子、石、泥ボール、および金属部分などの様々な不純物の小麦からの除去を含む。小麦の精選は、典型的には、振動篩を用いて、木片および麦わら片、ならびに小麦より大き過ぎるかまたは小さ過ぎる他のすべてを除去する選別機を用いることにより始まる。次に、気流を利用する風選機を用いて、埃およびより軽い不純物を除去する。次いで、除石機を用いて、小麦と同じ大きさの石などの重い混入物を分離する。振動デッキ上のワイヤクロス織布で覆った小麦のベッドに空気が通される。比重および表面摩擦の違いに基づいて分離がなされる。次いで、小麦は、形状および長さに基づいて分離する一連の円盤または円筒分離機を通して、代表的な小麦粒より長い、より短い、より丸い、またはより角張った混入物が排除される。最後に、研磨機により、ふすま層の一部、粒溝の汚れ、および他のより小さい不純物が除去される。
小麦が精選されると、製粉用に条件を整えるために調整される。ふすま層を強靭にするため、小麦粒に水分を加える一方、胚乳を柔らかくする。したがって、小麦粒の各部分は、分離がより容易であり、かつより容易に分離する傾向がある。製粉に先立ち、水分が小麦粒に充分に吸収できるように、調整された小麦が８〜２４時間にわたり貯蔵される。製粉プロセスは、基本的に小麦粒を漸減させることである。粉砕プロセスでは、ふすまおよび胚乳を含むグラニュライトの混合物が生じ、それは篩機および純化機を用いて分級される。次いで、胚乳の粗粒子は、一連のロール機により、小麦粉に粉砕される。小麦を製粉する場合、小麦粒は、典型的には７５％の精白小麦粉（細粒分）および２５％の粗粒分を生じる。粗粒分は、小麦粒の精白小麦粉にまで加工されていない部分であり、典型的には、ふすま、胚芽、および少量の残留胚乳を含む。
次いで回収された粗粒分は、粉砕機、好ましくはギャップミルを通して粉砕され、約１５０μｍ以下の粒径分布を有する超微粉加工粗粒分を形成し得る。ギャップミルのチップ速度は、通常、１１５ｍ／ｓ〜１３０ｍ／ｓである。加えて、篩別後、１５０μｍを上回る粒径を有する粉砕された粗粒分はすべて、さらなる製粉のため、プロセスに戻され得る。
細粒分（精白小麦粉）および粗粒分（粗粒状製品）が分離されてから、粗粒分は、分割され、粗粒分の各部分は、別個の粉砕機を通してさらなる下流プロセスに送られる。
従来の小麦製粉は、最大で３つの別々の製品を生成し得る。第１の製品は、細粒分からなる精白小麦粉であり、それは小麦粒の胚乳を含有する。第２の製品は、超微粉加工粗粒分であり、また第３の製品は、超微粉加工全粒小麦粉である。
当業者は、本開示の小麦品種が任意の小麦製粉プロセスに適合できることを理解するであろう。例示的な従来の小麦製粉プロセスの説明があくまで例示目的で提供されるが、決して本開示の製粉ステップを限定するものとして解釈されるべきではない。
コムギ表現型を修飾する方法
本発明は、コムギ表現型を修飾／改変／改善する方法をさらに提供する。本明細書で用いられるとき、用語「修飾する」または「改変する」は、参照品種と比べて表現型の任意の変化、例えばデンプン特性およびまたは種子重量特性に関連した変化を指す。用語「改善する」は、工業的または栄養的な用途のために１つ以上の品質がより優れたコムギを作製する任意の変化を指す。かかる改善は、限定されないが、粗びき粉としての品質の改善、広範囲の最終生成物を生産するための原料としての品質の改善を含む。
一部の実施形態では、修飾／改変／改善された表現型は、デンプンに関する。デンプンは、ヒトの食事において最も一般的な炭水化物であり、多くの食物に含有されている。世界的なデンプン摂取の主な供給源は、穀類（コメ、コムギおよびトウモロコシ）および根菜（ジャガイモおよびキャッサバ）である。デンプンを含有する広く用いられている調理済み食品は、パン、パンケーキ、穀類、麺類、パスタ、ポリッジおよびトルティーヤである。デンプン工業は、湿式粉砕、洗浄、ふるい分けおよび乾燥により、種子、根および塊茎からデンプンを抽出および精製する。今日、主な商業的な精製デンプンは、トウモロコシ、タピオカ、コムギおよびジャガイモデンプンである。
デンプンは、酸、様々な酵素、またはその２つの組み合わせにより、より単純な炭水化物に加水分解され得る。得られる断片は、デキストリンとして知られる。変換の程度は、典型的にはブドウ糖等量（ＤＥ）により定量され、それは、概ね、切断されているデンプン中のグリコシド結合の割合である。
一部のデンプン糖は、とりわけ最も一般的なデンプンベースの食品材料であり、多くの飲料および食品中で甘味剤として用いられている。それらは、限定されないが、マルトデキストリン、様々なグルコースシロップ、ブドウ糖、高果糖シロップ、および糖アルコールを含む。
加工デンプンは、高熱、高せん断力、低ｐＨ、凍結／融解および冷却などの加工または貯蔵中に頻繁に遭遇する条件下でデンプンが適正に機能できるように化学的に修飾されているデンプンである。技術的用途のための典型的な加工デンプンは、カチオンデンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチル化デンプンである。
食品加工用の添加剤として、食品用デンプンは、典型的には、プリン、カスタード、スープ、ソース、グレイビー、パイの中味、およびサラダドレッシングなどの食品中の増粘剤および安定化剤として、また麺類およびパスタを製造するために用いられる。
製薬業界では、デンプンは、賦形剤として、錠剤崩壊剤としてまたは結合剤としても用いられる。
デンプンはまた、工業的用途、例えば、製紙、段ボール接着剤、衣類の糊、建築業界、製本のための様々な接着剤もしくは糊の製造、壁紙接着剤、紙袋製造、チューブ巻取り、粘着紙、封筒接着剤、木工用ボンドおよび瓶のラベル付けに用いることができる。黄色デキストリンなどのデンプン誘導体は、幾らかの化学物質の添加により修飾することで、ペーパーワーク用の固い糊を形成することができる一方、これらの形態の一部では、ホウ砂またはソーダ灰が用いられ、これらをデンプン溶液と５０〜７０℃で混合することで非常に優れた接着剤が創出される。
デンプンはまた、幾つかのピーナツ状梱包材、および幾つかのつり天井タイルを製造するために用いられる。デンプン由来の織物用化学物質は、織りの最中の紡ぎ糸の切れを低減する（縦糸がサイジングされる）ために用いられる。デンプンは、主に、綿ベースの紡ぎ糸をサイジングするために用いられる。加工デンプンも織物用捺染糊剤として用いられる。印刷業界では、食品グレードデンプンが、湿ったインクが裏移りすることを回避するための、印刷された紙のシートを分離するために用いられる裏移り防止スプレー粉末の製造において用いられる。デンプンは、様々なバイオプラスチック、生分解性である合成ポリマーを生産するために用いられる。例として、ポリ乳酸が挙げられる。ボディーパウダーでは、粉末状デンプンがタルク粉末用の基材として用いられ、また他の健康および美容製品でも同様に用いられる。石油探査では、デンプンは、ドリル頭部を潤滑させ、石油抽出物中に粉砕残渣を懸濁するために用いられる掘削流体の粘度を調整するために用いられる。デンプン由来のグルコースは、いわゆる湿式粉砕プロセスを用いて、バイオ燃料トウモロコシエタノールまでさらに発酵され得る。今日、ほとんどのバイオエタノール製造工場では、乾式粉砕プロセスを用いて、トウモロコシまたはその他の供給原料が直接エタノールに発酵される。水素製造では、酵素を用いて、原料としてデンプンを用いることができる。
難消化性デンプンは、健常個体の小腸における消化を逃れるデンプンである。トウモロコシからの高アミロースデンプンは、他のタイプのデンプンよりも高い糊化温度を有し、ベーキング、穏やかな押し出しおよびその他の食品加工技術を通じて難消化性デンプン含量を保持する。それは、パン、パスタ、クッキー、クラッカー、プレッツェルおよび他の低含水食品などの加工食品中の不溶性食物繊維として用いられる。それはまた、その健康上の利益のための栄養補助食品として利用される。公表された試験によると、２型耐性トウモロコシが、インスリン感受性の改善を促進し、満腹感を増進し、結腸機能のマーカーを改善することが示されている。難消化性デンプンが無傷の全粒粉の健康上の利益に寄与することが示唆されている。
難消化性デンプンは、本発明のコムギ植物から生成され得る。難消化性デンプンは、以下の特徴の１つ以上を有してもよい。
１）繊維強化：難消化性デンプンは、良好なまたは優れた繊維供給源である。米国農務省およびそれ以外の外国の健康機関は、食物繊維の良好なまたは優れた供給源を構成するものについての基準を設定している。
２）低カロリーへの寄与：そのデンプンは、約１０ｋｃａｌ／ｇ、５ｋｃａｌ／ｇ、１ｋｃａｌ／ｇまたは０．５ｋｃａｌ／ｇ未満を有してもよく、これは典型的なデンプンと比べて約９０％のカロリー低減をもたらす。
３）低い血糖／インスリン応答
４）良好な小麦粉代替物、なぜなら、それは、（１）必要な処方の変化が最小限であるかまたは全くない処方に組み込まれ易く、（２）コムギベース製品に自然に適合し、かつ（３）老化および劣化を低減する能力があるからである。劣化は、パンおよびその他の食品においておいしさを低減する化学的および物理的プロセスである。
５）低い水結合能：そのデンプンは、他のタイプの難消化性デンプンを含む他の大部分の繊維源よりも低い水保持能を有する。それは、パリパリ感を目指すのに理想的である、処方中の水を低減し、微生物活性および老化に関連する有効期限を改善する。
６）加工耐性：そのデンプンは、押し出し、圧力調理などのエネルギー集約型手順に対して安定性がある。
７）官能特性：スムーズでざらつきがないテクスチャ、白色、「見えない」繊維源、および自然な風味など。
したがって、本発明のコムギから生産される小麦粉またはデンプンは、パン小麦粉またはデンプンを置き換えて、コムギパン、マフィン、バン、パスタ、麺類、トルティーヤ、ピザ生地、朝食用シリアル、クッキー、ワッフル、ベーグル、ビスケット、スナック食品、ブラウニー、プレッツェル、ロール、ケーキ、およびクラッカーを生産するために用いることができ、それらの食品は１つ以上の所望される特徴を有してもよい。
一部の実施形態では、本発明の漏出性対立遺伝子のコムギは、同じ種の野生型コムギと比べて、限定されないが、糊化温度の変更（例えば、アミロペクチン糊化ピークの変更および／またはエンタルピーの変更）、アミロース含量の変更、難消化性アミロース含量の変更、デンプン品質の変更、小麦粉膨潤度の変更、タンパク質含量の変更（例えば、より高いタンパク質含量）、穀粒重量の改変、穀粒硬度の変更およびセモリナ収量の変更を含む、１つ以上の顕著な表現型を有する。一部の実施形態では、本発明の漏出性ＳＳＩＩ（すなわちＳＧＰ−１）対立遺伝子を有する突然変異体コムギも、ＳＳＩＩ−ヌル（ＳＧＰ−ヌル）対立遺伝子変異体を有する対応する植物に対して比較されるとき、増加した種子重量または種子サイズを有する。特定の実施形態では、本発明の漏出性対立遺伝子のコムギは、（ｉ）増加した種子重量またはサイズと、（ｉｉ）前述の顕著な表現型の１つ以上との両方を提供する。
一部の実施形態では、本方法は、コムギの糊化温度の変更、例えばアミロペクチン糊化ピークの変更および／またはエンタルピーの変更に関する。糊化温度の変更は、デンプンベース製品を調理するのに要求される温度の変更をもたらす。異なる度合いのデンプン糊化は、難消化性デンプンのレベルに影響する。例えば、図５の吸熱ピークＩおよびＩＩは、それぞれ脂肪／アミロース複合体の分解した糊化および融解に起因する。一部の実施形態では、本発明のコムギのアミロペクチン糊化特性は、参照コムギ、例えば野生型コムギと比べて変更される。一部の実施形態では、本発明のコムギのアミロペクチン糊化温度は、野生型対照の場合よりも有意に低い。例えば、本発明のコムギのアミロペクチン糊化温度は、同じ加熱速度下で、示差走査熱量分析（ＤＳＣ）サーモグラムでのピーク高さを基準として、野生型対照の場合よりも約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃以上低い。低下した糊化を有するデンプンは、増加したアミロースおよび低下したグリセミック指数を有するデンプンに関連する。それはまた、冷製パスタなどでの老化時に硬化したデンプンベースゲルを有することに関連する。
一部の実施形態では、本発明のコムギデンプンのエンタルピーにおける変化は、野生型対照の場合と比べて劇的により小さい。例えば、ＤＳＣサーモグラムによる測定として、本発明のコムギデンプンにおける熱流転移は、野生型対照の場合の約１／２、１／３または１／４に過ぎない。
デンプン糊化は、水および熱の存在下でのデンプン分子の分子間結合を切断する過程であり、水素結合部位（ヒドロキシ水素および酸素）がより多くの水と会合することを可能にする。この不可逆性により、デンプン粒が溶解される。水の浸透により、全般的なデンプン粒構造における無秩序性を増大させ、結晶領域の数およびサイズが減少する。結晶領域は水を浸入させない。熱によりかかる領域は拡散化し、それにより鎖が非晶質形態に分かれ始める。偏光顕微鏡下で、デンプンはその複屈折およびその減衰断面を失う。この過程は、ルーソースを作る調理において用いられる。デンプンの糊化温度は、植物タイプおよび存在する水の量、ｐＨ、レシピ中の塩、糖、脂質およびタンパク質のタイプおよび濃度、ならびに用いられる誘導体化技術に依存する。糊化温度は、アミロペクチンの架橋の度合いに依存し、デンプン合成酵素遺伝子の遺伝子操作により変更され得る。
一実施形態では、本方法は、コムギのアミロース含量、例えば難消化性アミロース含量を変更することに関する。パスタをより硬くし、加熱過多に対する耐性を高めるとともに、グリセミック指数を低下させ、かつ食物繊維および難消化性デンプンを増加させるため、増加した難消化性アミロース含量を有する小麦粉を用いることができる。一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品のアミロース含量および／または難消化性アミロース含量は、野生型コムギ、またはすべての野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を有する指標コムギ品種の場合と比べて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上変更される（例えば、増加する）。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品のアミロース含量および／または難消化性アミロース含量は、約２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である。したがって、本明細書に記載の例示的方法によって分析されるすべての野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を有するコムギは、３０％を有意に超えるアミロース含量、例えば約４２．４％のアミロースを有することが見出された本発明の高アミロースコムギと比べて、約３０％のアミロース含量を有することが見出された。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品のアミロース含量および／または難消化性アミロース含量は、約２０％超、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である。
一部の実施形態では、本方法は、コムギのデンプン品質を変更することに関する。
一部の実施形態では、本方法は、コムギの小麦粉膨潤度（ＦＳＰ）を変更することに関する。ＦＳＰが低下すると、麺類の重量減少および硬さの増加がもたらされる。一部の実施形態では、本発明のコムギのＦＳＰは、Mukasaら（Comparison of flour swelling power and water-soluble protein content between self-pollinating and cross-pollinating buckwheat,Fagopyrum 22:45-50(2005)に記載の方法に基づき、野生型コムギ、またはすべての野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を有する指標コムギ品種の場合と比べて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上変更される（例えば、低下する）。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品のＦＳＰは、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、もしくは１０．０（ｇ／ｇ）である。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品のＦＳＰは、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、もしくは１０．０未満（ｇ／ｇ）である。
一部の実施形態では、本方法は、コムギのアミロペクチン含量を変更することに関する。一部の実施形態では、アミロースおよびアミロペクチンは、アミロペクチンの減少がアミロースの増加と同じ利益があることから相関している。一部の実施形態では、アミロースの減少（および／またはアミロペクチンの増加）は、ＦＳＰの増加、レトログラデーションの低下ならびに焼いた製品および麺類の軟化に関連する。一部の実施形態では、アミロペクチンの増加はまた、劣化速度の低下に関連する。一部の実施形態では、本発明のコムギのアミロペクチン含量は、野生型コムギ、またはすべての野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を有する指標コムギ品種の場合と比べて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％以上変更される（例えば、減少する）。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品のアミロペクチン含量は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品のアミロペクチン含量は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％未満である。
一部の実施形態では、本方法は、コムギのタンパク質含量を変更することに関する。一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品のタンパク質含量は、野生型コムギ、またはすべての野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を有する指標コムギ品種の場合と比べて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上変更される（例えば、増加する）。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品のタンパク質含量は、約１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品のタンパク質含量は、約１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％超である。
タンパク質含量の増加は、栄養値（低下したグリセミック指数）の増加ならびに機能性の増強を意味する。パスタ品質の観点では、タンパク質含量の増加の場合、ＦＳＰの低下およびパスタの硬さの増加に関連することになる。
一部の実施形態では、本方法は、コムギ穀粒中の食物繊維含量を変更することに関する。一部の実施形態では、本発明のコムギ穀粒および前記コムギから生産される製品における食物繊維含量は、野生型コムギ、またはすべての野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を有する指標コムギ品種の場合と比べて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上変更される（例えば、増加する）。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品の食物繊維含量は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品の食物繊維含量は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％超である。
増加した食物繊維を有する穀粒から製造される消費製品の利点は、限定されないが、食物繊維の発酵中での健康に良い化合物の生成、ならびに体積増加、便の軟化、および腸管を通る移行時間の短縮化を含む。
一部の実施形態では、本方法は、コムギ穀粒中の脂肪含量を変更することに関する。一部の実施形態では、本発明のコムギ穀粒中の脂肪含量は、野生型コムギ、またはすべての野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を有する指標コムギ品種の場合と比べて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上変更される（例えば、増加する）。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品の脂肪含量は、約０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、もしくは４０％である。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品の脂肪含量は、約０％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、もしくは４０％超である。
一部の実施形態では、本方法は、コムギ穀粒中の難消化性デンプン含量を変更することに関する。一部の実施形態では、本発明のコムギ穀粒中の難消化性デンプン含量は、野生型コムギ、またはすべての野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を有する指標コムギ品種の場合と比べて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上変更される（例えば、増加する）。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品の難消化性デンプン含量は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％である。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品の難消化性デンプン含量は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％超である。
一部の実施形態では、本方法は、コムギ穀粒中の灰分含量を変更することに関する。一部の実施形態では、本発明のコムギ穀粒中の灰分含量は、野生型コムギ、またはすべての野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を有する指標コムギ品種の場合と比べて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上変更される（例えば、増加する）。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品の灰分含量は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、もしくは４０％である。
一部の実施形態では、本発明のコムギおよび前記コムギから生産される製品の灰分含量は、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、もしくは４０％超である。
一部の実施形態では、本方法は、コムギの穀粒重量を変更することに関する。一部の実施形態では、本発明のコムギの穀粒重量は、野生型コムギ、またはすべての野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を有するコムギの場合と比べて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上変更される（例えば、減少する）。
一部の実施形態では、本発明のコムギの穀粒重量は、完全ＳＳＩＩヌル突然変異体コムギ植物（例えば、ＳＳＩＩ−ＡおよびＳＳＩＩ−Ｂヌルデュラム、またはＳＳＩＩ−Ａ、ＳＳＩＩ−Ｂ、およびＳＳＩＩ−Ｄヌルパンコムギ）の場合と比べて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上変更される（例えば、増加する）。
例えば、一部の実施形態では、本発明のＳＧＰ１漏出性コムギは、ＳＧＰヌル分離個体または他の適切な指標系統と比べて増加した穀粒重量を有する場合がある。種子数に影響することなく増加した種子重量は、収量の増加と一般にはデンプン含量の増加を導く。
一部の実施形態では、本発明のコムギ穀粒の穀粒重量は、約１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、３１ｍｇ、３２ｍｇ、３３ｍｇ、３４ｍｇ、３５ｍｇ、３６ｍｇ、３７ｍｇ、３８ｍｇ、３９ｍｇ、４０ｍｇ、４１ｍｇ、４２ｍｇ、４３ｍｇ、４４ｍｇ、４５ｍｇ、４６ｍｇ、４７ｍｇ、４８ｍｇ、４９ｍｇ、もしくは５０ｍｇである。
一部の実施形態では、本発明のコムギ穀粒の穀粒重量は、約１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、３１ｍｇ、３２ｍｇ、３３ｍｇ、３４ｍｇ、３５ｍｇ、３６ｍｇ、３７ｍｇ、３８ｍｇ、３９ｍｇ、４０ｍｇ、４１ｍｇ、４２ｍｇ、４３ｍｇ、４４ｍｇ、４５ｍｇ、４６ｍｇ、４７ｍｇ、４８ｍｇ、４９ｍｇ、または５０ｍｇ超である。
したがって、本明細書に記載の例示的方法によって分析されるＳＳＩＩ三重ヌル対立遺伝子のコムギは、例えば約２８ｍｇを含む、２５ｍｇを有意に超える穀粒重量を有することが見出された本発明の高アミロースのＳＳＩＩ漏出性および２つのＳＳＩＩヌル対立遺伝子のコムギ製品と比べて、約２５ｍｇの穀粒重量を有することが見出された。
一部の実施形態では、本方法は、コムギの穀粒硬度を変更することに関する。一部の実施形態では、本発明のコムギの穀粒硬度は、野生型デュラムコムギ、またはすべての野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子を有するコムギの場合と比べて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上変更される（例えば、増加または減少する）。
一部の実施形態では、本発明のコムギ穀粒の穀粒硬度は、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７９、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００である。
一部の実施形態では、穀粒硬度は、Osborne, B. G., Z. Kotwal, et al. (1997). “Application of the Single-Kernel Characterization System to Wheat Receiving Testing and Quality Prediction.” Cereal Chemistry Journal 74(4): 467-470（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載の方法により測定される。穀粒硬度は、コムギの製粉特性に影響する。例えば、一部の実施形態では、本発明のＳＧＰ１漏出性コムギは、野生型と比べて低下した穀粒硬度を有してもよい。一部の実施形態では、穀粒硬度の低下は、増加したブレーキ粉収量および減少した小麦粉灰およびデンプンの損傷に関連する。一部の実施形態では、さらに製粉エネルギーであれば、減少することになる。一部の実施形態では、増加した穀粒硬度は、増加した製粉エネルギー、製粉後の増加したデンプン損傷および増加した小麦粉粒径に関連する。
一部の実施形態では、二重、三重、四重などの突然変異を有する突然変異体植物を作出するため、１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の１つ以上のコピーにおける突然変異が一緒に組み込まれる。一部の実施形態では、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、デュラムコムギのＡゲノムおよび／またはＢゲノム、または６倍体パンコムギのＡ、Ｂ、およびＤゲノムの１つ以上に位置した。かかる突然変異体は、トランスジェニック技術を用いて、古典的な育種方法により、または両方の技術を用いて、作出され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の突然変異は、マーカー促進性遺伝子移入法を用いてまたは用いずに、古典的な育種方法により、コムギ種、例えば、トリチカム・エスチバム（T.aestivum）、Ｔ．エチオピカム（T.aethiopicum）、Ｔ．アララチカム（T.araraticum）、Ｔ．ベオチカム（T.boeoticum）、Ｔ．カルシリカム（T.carthlicum）、Ｔ．コンパクタム（T.compactum）、Ｔ．ディココイデス（T.dicoccoides）、Ｔ．ディコッカム（T.dicoccum）、Ｔ．イスパーニカム（T.ispahanicum）、Ｔ．カラミシェビイ（T.karamyschevii）、Ｔ．マチャ（T.macha）、Ｔ．ミリチネ（T.militinae）、Ｔ．モノコッカム（T.monococcum）、Ｔ．ポロニカム（T.polonicum）、Ｔ．スペルタ（T.spelta）、Ｔ．スフェロコッカム（T.sphaerococcum）、Ｔ．チモフェービイ（T.timopheevii）、Ｔ．テュラニカム（T.turanicum）、トリチカム・ツルギダム（T.turgidum）、Ｔ．ウラルツ（T.urartu）、Ｔ．バビロビイ（T.vavilovii）、およびＴ．ズコブスキイ（T.zhukovskyi）に組み込むことができる。
一実施形態では、改善または改変された表現型を有するコムギ植物を生成するため、進化的に保存された領域または部位に、突然変異を有するデンプン合成遺伝子の突然変異体を用いることができる。一実施形態では、改善または改変された表現型を有するコムギ植物を生成するため、ナンセンス突然変異（未熟停止コドン）による突然変異体を用いることができる。一実施形態では、改善または改変された表現型を有するコムギ植物を生成するため、進化的に保存された領域または部位に位置しない突然変異体も用いることができる。
一部の他の実施形態では、ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子に他の突然変異遺伝子および／または導入遺伝子を組み込むことができる。本発明の教示に基づき、当業者は、好ましい標的遺伝子、例えば、植物健康、植物バイオマス、生物的および非生物的因子に対する植物耐性、植物収量（最終の好ましい脂肪酸産生が増加する）を一般に改善することができる突然変異体および／または導入遺伝子を選抜し、特定の目標を達成するのに破壊または過剰発現が必要であるときを決定できるであろう。かかる突然変異体および／または導入遺伝子は、限定されないが、病原体耐性遺伝子および種子収量に関する植物形質を制御する遺伝子を含む。
最終的にデンプン合成に影響し得るポリペプチドをコードするさらなる遺伝子は、所望されるデンプン生成を達成するように調節され得る。かかるポリペプチドは、限定されないが、可溶性デンプン合成酵素（ＳＳＳ）、顆粒結合デンプン合成酵素（ＧＢＳＳ）、例えば、ＧＢＳＳＩ、ＧＢＳＳＩＩ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰアーゼ）、デンプン分枝酵素（別名、ＳＢＥ、例えばＳＢＥＩおよびＳＢＥＩＩ）、デンプン脱分枝酵素（別名、ＳＤＢＥ）、ならびにデンプン合成酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶを含む。
その調節は、所望される対立遺伝子を単一のコムギ植物に組み込む育種方法を通じて達成され得る。所望される対立遺伝子は、天然起源のものまたは突然変異誘発を通じて作出されるもののいずれかであり得る。一部の実施形態では、所望される対立遺伝子は、参照対立遺伝子と比べて植物細胞内でのコードポリペプチドの活性増加をもたらす。例えば、所望される対立遺伝子は、植物細胞内でのポリペプチド濃度の増加、および／または参照対立遺伝子と比べて増加した酵素活性および／または増加した安定性を有するポリペプチドをもたらし得る。一部の実施形態では、所望される対立遺伝子は、参照対立遺伝子と比べて植物細胞内でのコードポリペプチドの活性低下をもたらす。例えば、所望される対立遺伝子は、ヌル突然変異であるか、または参照対立遺伝子と比べて植物細胞内で活性の低下、安定性の低下を有する、かつ／または不正確に標的化されているポリペプチドをコードするかのいずれかであり得る。
調節はまた、導入遺伝子をコムギ品種に導入することを通じて達成され得、ここで、導入遺伝子は、目的の遺伝子を過剰発現するかまたは目的の遺伝子を負に調節するかのいずれかであり得る。
一部の実施形態では、本発明のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、コムギ植物に導入される、アミロース合成の増加をもたらす１つ以上の対立遺伝子、例えば修飾された可溶性デンプン合成酵素活性または修飾された顆粒結合デンプン合成酵素活性をもたらす対立遺伝子と組み合わされる。一部の実施形態では、前記対立遺伝子は、デュラムコムギのＡゲノムおよび／もしくはＢゲノム、または６倍体パンコムギのＡ、Ｂ、およびＤゲノムの１つ以上に位置する。
一部の実施形態では、本発明のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、コムギ植物に導入される、アミロース合成の低下をもたらす１つ以上の対立遺伝子、例えば修飾された可溶性デンプン合成酵素活性または修飾された顆粒結合デンプン合成酵素活性をもたらす対立遺伝子と組み合わされる。一部の実施形態では、前記対立遺伝子は、デュラムコムギのＡゲノムおよび／もしくはＢゲノム、または６倍体パンコムギのＡ、Ｂ、およびＤゲノムの１つ以上に位置する。
一部の実施形態では、本発明のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、コムギ植物に導入される、アミロペクチン合成の増加をもたらす１つ以上の対立遺伝子、例えば修飾されたＳＳＩ、および／またはＳＳＩＩＩ活性、修飾されたデンプン分枝酵素（例えば、ＳＢＥＩ、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ）活性、または修飾されたデンプン脱分枝酵素活性をもたらす対立遺伝子と組み合わされる。一部の実施形態では、前記対立遺伝子は、デュラムコムギのＡゲノムおよび／もしくはＢゲノム、または６倍体パンコムギのＡ、Ｂ、およびＤゲノムの１つ以上に位置する。
一部の実施形態では、本発明のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、コムギ植物に導入される、アミロペクチン合成の低下をもたらす１つ以上の対立遺伝子、例えば修飾されたＳＳＩ、および／またはＳＳＩＩＩ活性、修飾されたデンプン分枝酵素（例えば、ＳＢＥＩ、ＳＢＥＩＩａおよびＳＢＥＩＩｂ）活性、または修飾されたデンプン脱分枝酵素活性をもたらす対立遺伝子と組み合わされる。一部の実施形態では、前記対立遺伝子は、デュラムコムギのＡゲノムおよび／もしくはＢゲノム、または６倍体パンコムギのＡ、Ｂ、およびＤゲノムの１つ以上に位置する。
標的遺伝子を破壊および／または改変する方法は当業者に知られている。これらの方法は、限定されないが、突然変異誘発（例えば、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発、トランスポゾン突然変異誘発、挿入突然変異誘発、符号タグ化突然変異誘発、部位特異的変異誘発、および天然突然変異誘発）、ノックアウト／ノックイン、アンチセンス、ＲＮＡ干渉、および遺伝子編集、ならびに本願中に記載の他のツールを含む。
本発明はまた、種子油および／または食事において脂肪酸を変更したレベルで生成するコムギ種を育種する方法を提供する。一実施形態では、かかる方法は、
ｉ）本発明のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子のコムギと、Ｆ１植物を生成するための第２のコムギ種との間で交配させることと；
ｉｉ）前記Ｆ１植物を前記第２のコムギ種に戻し交配することと；
ｉｉｉ）前記漏出性対立遺伝子突然変異が前記第２のコムギ種のゲノムに組み込まれるまで戻し交配することを反復することと
を含む。任意選択的に、かかる方法は、分子マーカーによって容易化され得る。
本発明は、改変／改善されたデンプンを生成するコムギ近縁種を育種する方法を提供する。一実施形態では、かかる方法は、
ｉ）本発明のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子のコムギと、Ｆ１植物を生成するためのコムギ近縁種との間で交配させることと；
ｉｉ）前記Ｆ１植物を前記コムギ近縁種に戻し交配することと；
ｉｉｉ）前記漏出性対立遺伝子突然変異が前記コムギ近縁種のゲノムに組み込まれるまで戻し交配することを反復することと
を含む。コムギから別の種および／または属へ遺伝子を巧みに導入するため、特別な技術（例えば、体細胞ハイブリダイゼーション）が必要な場合がある。任意選択的に、かかる方法は、分子マーカーによって容易化され得る。
本発明はまた、固有のデンプン組成物を提供する。
一部の実施形態では、提供されるのは、参照コムギ種、例えば野生型コムギ種に由来するデンプン組成物と比べて修飾されたデンプン品質を有するコムギデンプン組成物である。特定の実施形態では、修飾されたデンプン組成物を有するコムギデンプン組成物は、１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含む穀粒から作製される。コムギデンプン組成物は、本発明に従い、例えば、ＳＳＩＩ野生型対立遺伝子を含まず、少なくとも１つのＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含み、かつ任意選択的に１つ以上のＳＳＩＩヌル対立遺伝子を含む穀粒から作製され得る。
一部の実施形態では、提供されるのは、参照コムギ種、例えば野生型コムギ種に由来するデンプン組成物と比べて変更された糊化温度を有するコムギデンプン組成物である。一部の実施形態では、本発明のコムギデンプン組成物は、変更されたアミロペクチンの糊化ピークおよび／または変更されたエンタルピーを有する。一部の実施形態では、本発明のコムギデンプンのアミロペクチンの糊化温度は、同じ発熱率下での示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムのピーク高さに基づき、またはラピッドビスコアナライザ（Rapid Visco Analyzer）試験に基づき、約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃であるか、または野生型対照の場合よりも高いかもしくは低い。一部の実施形態では、アミロースが増加する場合、糊化温度、アミロペクチン糊化の温度が上昇することになる。
本願の方法を用いて、有利な特徴を備えたコムギ穀粒が生成され得る。かかる特徴として、限定されないが、変更された食物繊維含量、変更されたタンパク質含量、変更された脂肪含量、変更された難消化性デンプン含量、変更された灰分含量；および変更されたアミロース含量が挙げられる。一部の実施形態では、対照コムギ植物から作製される穀粒と比べて、以下の特徴：（１）増加した食物繊維含量；（２）増加したタンパク質含量；（３）増加した脂肪含量；（４）増加した難消化性デンプン含量；（５）増加した灰分含量；および（６）増加したアミロース含量のうちの１つ以上を備えたコムギ穀粒が作出される。食品、例えば麺類およびパスタを生産するため、前記の有利な特徴を備えたコムギ穀粒を用いることができる。
植物形質転換
本発明は、１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を有するトランスジェニックコムギ植物を提供する。修飾は、破壊または過剰発現のいずれかであり得る。
コムギ形質転換に適したバイナリーベクターは、限定されないが、 Zhang et al., 2000 (An efficient wheat transformation procedure: transformed calli with long-term morphogenic potential for plant regeneration, Plant Cell Reports (2000) 19: 241-250)、Cheng et al., 1997(Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens, Plant Physiol. (1997) 115: 971-980)、Abdul et al.(Genetic Transformation of Wheat (Triticum aestivum L): A Review, TGG 2010, Vol.1, No.2, pp 1-7)、Pastori et al., 2000 (Age dependent transformation frequency in elite wheat varieties, J. Exp. Bot. (2001) 52 (357): 857-863)、Jones 2005 (Wheat transformation: current technology and applications to grain development and composition, Journal of Cereal Science Volume 41, Issue 2, March 2005, Pages 137-147)、Galovic et al., 2010 (MATURE EMBRYO-DERIVED WHEAT TRANSFORMATION WITH MAJOR STRESS MODULATED ANTIOXIDANT TARGET GENE, Arch. Biol. Sci., Belgrade, 62 (3), 539-546)により記載されたベクター、または類似物を含む。コムギ植物は、上記参考文献に記載の任意の方法を用いることにより形質転換される。
形質転換ベクターを構築するため、骨格ベクターのＴ−ＤＮＡ境界の左側と右側との間の領域は、構成的に発現される選択マーカー遺伝子（例えば、ＮｐｔＩＩカナマイシン耐性遺伝子）と後続するレポーター遺伝子（例えば、ＧＵＳまたはＧＦＰ）に作動可能に連結される１つ以上の発現エレメントからなる発現カセットと置き換えられる。最終構築物は、コムギ植物への形質転換のため、Zhangら、２０００、Chengら、１９９７、Abdulら、Pastoriら、２０００、Jones、２００５、Galovicら、２０１０、米国特許第７，１９７，９９６４号に記載の方法または類似方法のいずれかにより、アグロバクテリウム（Agrobacterium）に導入され、ポリヌクレオチド：：ＧＦＰ融合体がトランスジェニック植物中で作製される。
効率的な植物形質転換のため、選択方法は、植物全体が単一の形質転換細胞から再生されるように用いられる必要があり、形質転換植物のすべての細胞が目的のＤＮＡを保有する。これらの方法では、陽性選択を用いることができ、それにより、外来遺伝子が、通常であれば用いることができない培地中に存在する基質、例えばマンノースまたはキシロースを利用可能にする植物細胞に供給される（例えば、米国特許第５７６７３７８号；米国特許第５９９４６２９号を参照されたい）。しかし、より典型的には、陰性選択が、非形質転換植物細胞の成長を殺滅または阻害し、キメラの可能性を低減する、除草剤または抗生物質などの選択剤を用いることでより効率的であることから、陰性選択が用いられる。陰性選択剤に対して有効な耐性遺伝子が、植物形質転換に用いられる導入外来ＤＮＡに対して提供される。例えば、最も有名な選択剤の１つが、抗生物質カナマイシンであり、カナマイシンおよび関連の抗生物質に耐性を与える耐性遺伝子ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）と一緒に用いられる（例えば、Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982)；Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)を参照されたい）。しかし、多種の抗生物質および抗生物質耐性遺伝子を形質転換目的で用いることができる（米国特許第５０３４３２２号、米国特許第６１７４７２４号および米国特許第６２５５５６０号を参照されたい）。さらに、幾つかの除草剤および除草剤耐性遺伝子、例えば除草剤ホスフィノトリシンに耐性を与えるｂａｒ遺伝子などが形質転換目的で用いられている（White et al., Nucl Acids Res 18: 1062 (1990)、Spencer et al., Theor Appl Genet 79: 625-631(1990)、米国特許第４７９５８５５号、米国特許第５３７８８２４号および米国特許第６１０７５４９号）。さらに、抗がん剤メトトレキサートに耐性を与えるｄｈｆｒ遺伝子が選択用に用いられている（Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)。
所定のタンパク質の発現を調節するのに用いられる発現制御エレメントは、通常、コード配列に伴うことが見出されている発現制御エレメント（相同発現エレメント）または異種発現制御エレメントのいずれかであり得る。種々の相同および異種発現制御エレメントは、当該技術分野で公知であり、本発明で用いるための発現ユニットを作成するため、容易に用いることができる。例えば、転写開始領域は、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Agrobacterium tumefaciens）のＴｉプラスミド中に見出される様々なオピン開始領域のいずれか、例えば、オクトピン、マンノピン、ノパリンなどを含み得る。あるいは、植物ウイルスプロモーター、例えば植物における遺伝子発現を制御するためのカリフラワーモザイクウイルス１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター（各々、ＣａＭＶ １９ＳおよびＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）も用いることができる（例えば、米国特許第５，３５２，６０５号；同第５，５３０，１９６号および同第５，８５８，７４２号）。ＣａＭＶから誘導されるエンハンサー配列も用いることができる（例えば、米国特許第５，１６４，３１６号；同第５，１９６，５２５号；同第５，３２２，９３８号；同第５，５３０，１９６号；同第５，３５２，６０５号；同第５，３５９，１４２号；および同第５，８５８，７４２号）。最後に、プロリフェラプロモーター、果実特異的プロモーター、Ａｐ３プロモーター、熱ショックプロモーター、種子特異的プロモーターなどの植物プロモーターも用いることができる。
トランスジェニック植物を作製する方法は、当業者に周知である。ここで、トランスジェニック植物は、限定されないが、電気穿孔；マイクロインジェクション；粒子加速銃または遺伝子銃としても知られる微粒子銃；ウイルス媒介性形質転換；およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換を含む、種々の異なる形質転換方法により作製され得る。例えば、米国特許第５，４０５，７６５号；同第５，４７２，８６９号；同第５，５３８，８７７号；同第５，５３８，８８０号；同第５，５５０，３１８号；同第５，６４１，６６４号；同第５，７３６，３６９号および同第５，７３６３６９号；国際特許出願公開の国際公開第２００２／０３８７７９号および国際公開第２００９／１１７５５５号；Lu et al., (Plant Cell Reports, 2008, 27:273-278)；Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books (1992)；Hinchee et al., Bio/Tech. 6:915-922 (1988)；McCabe et al., Bio/Tech. 6:923-926 (1988)；Toriyama et al., Bio/Tech. 6:1072-1074 (1988)；Fromm et al., Bio/Tech. 8:833-839 (1990)；Mullins et al., Bio/Tech. 8:833-839 (1990)；Hiei et al., Plant Molecular Biology 35:205-218 (1997)；Ishida et al., Nature Biotechnology 14:745-750 (1996)；Zhang et al., Molecular Biotechnology 8:223-231 (1997)；Ku et al., Nature Biotechnology 17:76-80 (1999)；およびRaineri et al., Bio/Tech. 8:33-38 (1990)）（これらの各々はその全体が参照により本明細書中に明示的に援用される）を参照されたい。
育種方法
本発明の１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子突然変異を他の植物品種、または本発明のトランスジェニック植物との交配に適合できる他の近縁種に導入するため、本発明に古典的な育種方法を含めることができる。
放任受粉集団。かかる作物の、ライ麦、多くのトウモロコシおよびテンサイ、草本類、マメ科植物、例えばアルファルファおよびクローバ、および熱帯樹作物、例えばカカオ、ココナツ、油やしおよび一部のゴムとしての放任受粉集団の改善は、本質的に、高度な（しかし決して最高度ではない）ヘテロ接合性を維持しつつも、好ましい対立遺伝子の固定に向けて遺伝子頻度を変化させることに依存する。かかる集団における均一性は不可能であり、放任受粉品種におけるタイプに対する純粋度（trueness-to-type）は、全体としての集団の統計学的特徴であり、個体植物の特徴ではない。したがって、放任受粉集団の異質性は、同系交配系統、クローンおよび雑種の均一性（または実質的均一性）と対照をなす。
集団改善方法は、本質的に、通常、集団選択と称される純粋な表現型選択に基づくもの、および子孫試験による選択に基づくものといった２つのグループに分かれる。集団間の改善は、開放型育種集団の概念を利用し、遺伝子がある集団から別の集団へ流れることを可能にする。一方の集団での植物（栽培変種、株、生態型、または任意の生殖質源）は、自然に（例えば、風により）、または手により、またはミツバチ（一般に、アピス・メリフェラ・エル．（Apis mellifera L.）またはメガチレ・ロツンダタ・エフ．（Megachile rotundata F.））により、他方の集団からの植物と交配される。選択は、望ましい形質を有する植物を両方の源から単離することにより、一方（または時として両方）の集団を改善するため、適用される。
放任受粉集団改善には、基本的に２つの主要な方法がある。第１に、集団が、選ばれた選択方法により一斉に変化を受ける状況がある。成果は、隔離されてそれ自体の中での任意交配により際限なく繁殖可能な改善された集団である。第２に、合成品種は、集団改善と同じ最終結果を成し遂げるが、それ自体でそのように繁殖できるわけでなく、親系統またはクローンから再構築される必要がある。放任受粉集団を改善するためのこれらの植物育種方法は当業者に周知であり、異花受粉植物を改善するために通常用いられる育種方法の包括的検討が、Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, Inc. (1960)；Simmonds, Principles of Crop Improvement, Longman Group Limited (1979)；Hallauer and Miranda, Quantitative Genetics in Maize Breeding, Iowa State University Press (1981)；およびJensen, Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc. (1988)を含む極めて多数の教科書および論文で提供されている。
集団選択。集団選択では、後続世代をもたらすため、望ましい個体植物が選択され、収穫され、種子は子孫試験なしに複合される。選択は、母親のみに基づき、受粉に対する制御がなされないことから、集団選択は、選択を伴う任意交配形態に等しい。本明細書で既に述べたように、集団選択の目的は、集団内での優れた遺伝子型の割合を増加させることである。
合成。合成品種は、あらゆる可能な雑種の組み合わせにおける良好な組み合わせ能力について選択された幾つかの遺伝子型を同一育種間で交配させ、続いて放任受粉により品種を維持することにより生成される。親が（概ね同系交配系の）種子繁殖系統、例えば一部のテンサイおよびマメ（ソラマメ属（Vicia））またはクローン、例えば草本類、クローバおよびアルファルファであるか否かは原則的に重要ではない。親は、一般的な組み合わせ能力に基づいて、時として検定交雑または品種系統間交雑により、より一般には多系統交雑により選択される。親の種子系統は、計画的に（例えば、自家受精または兄妹交配により）同系交配系であってもよい。しかし、たとえ親が計画的に同系交配系でなくても、系統維持期間中の系統内での選択は、幾らかの近親交配が確実に生じる。クローン親は、当然のことながら変化しないままであり、高度にヘテロ接合性である。
合成種が親の種子生成計画から農家まで迅速に到達できるか、または最初に１つもしくは２つの増殖サイクルを経る必要があるかは、種子生産および種子に対する要求の規模に依存する。実際上、草本類およびクローバは、一般に１または２回繁殖されることから、元の合成種から大幅に除去される。
集団選択が時として用いられるが、後代検定は、操作が単純であり、目的、すなわち合成種における全般的な組み合わせ能力の活用に対して明らかに適切であるため、多系統交雑のために一般的に好まれる。
合成種に入る親系統またはクローンの数は幅広く変動する。実際上、親系統の数は、１０〜数百の範囲であり、１００〜２００が平均である。１００以上のクローンから形成される広範囲に基づく合成種であれば、種子繁殖期間中に狭い範囲に基づく合成種よりも安定であることが期待される。
血統が明らかな品種。血統が明らかな品種は、分離集団から個体植物を選択し、その後に自家受粉した子孫の繁殖および種子増加ならびに数世代にわたって遺伝子型を注意深く試験することから発展した優れた遺伝子型である。これは、自然に自家受粉する種で十分に機能する放任受粉方法である。この方法は、品種開発において集団選択と組み合わせて用いることができる。系統および集団選択の組み合わせにおける多様性は、自己授粉作物における品種を作製するための最も一般的な方法である。
雑種。雑種は、異なる遺伝子型の親間の交配から得られる個体植物である。商業的な雑種は現在、トウモロコシ（corn）（トウモロコシ（maize））、モロコシ、テンサイ、ヒマワリおよびブロッコリーを含む多くの作物で広く用いられている。雑種は、幾つかの異なる方法で、例えば、２つの親を直接交配させること（単交配雑種）により、単交配雑種を別の親と交配させること（三系または三重交配雑種）により、または２つの異なる雑種を交配させること（四系または二重交配雑種）により形成され得る。
厳密に言うと、異系交配（すなわち放任受粉した）集団内の大部分の個体は雑種であるが、その用語は、通常、親が異種または亜種として認識できるほど十分に異なるゲノムを有する個体である場合に用いられる。雑種は、２つの親のゲノムにおける定性的および／または定量的差異に応じて稔性または不稔性であり得る。雑種強勢（heterosis）または雑種強勢（hybrid vigor）は、通常、雑種を形成するために用いられた親系統と比べて、雑種の成長の活力、生存および稔性の増加をもたらすヘテロ接合性の増加に関連する。最大の雑種強勢は、通常、２つの遺伝的に異なる高度同系交配系統を交配することによって達成される。
雑種の生成は、親系統と、それらの系統の交配から得られる雑種との両方の別々の生成を含む十分に発達した産業である。雑種生成プロセスの詳細な議論については、例えば、Wright, Commercial Hybrid Seed Production 8:161-176, In Hybridization of Crop Plantsを参照されたい。
示差走査熱量測定
示差走査熱量測定またはＤＳＣは、試料および参照の温度を増加させるのに要する熱の量における差異が温度の関数として測定される熱分析技術である。試料と参照の両方は、実験全体を通してほぼ同じ温度で維持される。一般に、ＤＳＣ分析用の温度プログラムは、試料保持器温度が時間の関数として線形に増加するように設計される。参照試料であれば、走査されるべき温度の範囲にわたって明確に規定された熱容量を有する必要がある。熱相変化、熱ガラス転移温度（Ｔｇ）、結晶溶融温度、吸熱効果、発熱効果、熱安定性、熱組成安定性、酸化安定性研究、転移現象、固体構造、および様々な範囲の材料を分析するため、ＤＳＣを用いることができる。Ｔｇガラス転移温度、Ｔｍ融解点、ΔＨｍ吸収エネルギー（ジュール／グラム）、Ｔｃ結晶化点、およびΔＨｃ放出エネルギー（ジュール／グラム）を測定するため、ＤＳＣサーモグラムを用いることができる。
デンプンの糊化を測定するため、ＤＳＣを用いることができる。Application Brief, TA No.6, SII Nanotechnology Inc., “Measurements of gelatinization of starch by DSC”, 1980; Donovan 1979 Phase transitions of the starch-water system. Bio-polymers, 18, 263-275.; Donovan, J. W., & Mapes, C. J. (1980). Multiple phase transitions of starches and Nageli arnylodextrins. Starch, 32, 190-193. Eliasson, A. -C. (1980). Effect of water content on the gelatinization of wheat starch. Starch, 32, 270-272. Lund, D. B. (1984). Influence of time, temperature, moisture, ingredients and processing conditions on starch gelatinization. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 20 (4), 249-257. Shogren, R. L. (1992). Effect of moisture content on the melting and subsequent physical aging of cornstarch. Carbohydrate Polymers, 19, 83-90. Stevens, D. J., & Elton, G. A. H. (1971). Thermal properties of the starch water system. Staerke, 23, 8-11. Wootton, M., & Bamunuarachchi, A. (1980). Application of differential scanning calorimetry to starch gelatinization. Starch, 32, 126-129. Zobel, H. F., & Gelation, X. (1984). Gelation. Gelatinization of starch and mechanical properties of starch pastes. In R. Whistler, J. N. Bemiller & E. F. Paschall, Starch: chemistry and technology (pp. 285-309). Orlando, FL: Academic Press.を参照されたい。糊化特性は、加熱速度および水含量に依存する。特に規定されない限り、本願のコムギに由来するデンプンと野生型参照または他の参照コムギに由来するデンプンとの間のＤＳＣにおける比較は、同じ加熱速度および／または同じ水含量下でなされる。一部の実施形態では、本願は、ＤＳＣによる測定として変更された糊化温度を有するデンプン組成物を提供する。
デンプンのガラス転移温度を測定するため、ＤＳＣを用いることができる。Chinachoti, P. (1996). Characterization of thermomechanical properties in starch and cereal products. Journal of Thermal Analysis, 47, 195-213. Maurice et al. 1985 Polysaccharide-water interactions - thermal behavior of rice starch. In D. Simatos & S. L. Multon, Properties of water in foods
[0378] (pp. 211-227). Dordrecht: Nilhoff.; Slade, L., & Levine, H. (1987). Recent advances in starch retrogradation. In S. S. Stivala, V. Crescenzi & I. C. M. Dea, Industrial polysaccharides (pp. 387-430). New York: Gordon and Breach. Stepto, R. F. T., & Tomka, I. (1987). Chimia, 41 (3), 76-81. Zeleznak, K. L., & Hoseney, R. C. (1997). The glass transition in starch. Cereal Chemistry, 64 (2), 121-124.を参照されたい。一部の実施形態では、本願は、ＤＳＣによる測定として変更されたガラス転移温度を有するデンプン組成物を提供する。
デンプンの結晶化を測定するため、ＤＳＣを用いることができる。Biliaderis, C. G., Page, C. M., Slade, L., & Sirett, R. R. (1985). Thermal behavior of amylose-lipid complexes. Carbohydrate Polymers, 5, 367-389. Ring, S. G., Colinna, P., I’Anson, K. J., Kalichevsky, M. T., Miles, M. J., Morris, V. J., & Orford, P. D. (1987). Carbohydrate Research, 162, 277-293を参照されたい。一部の実施形態では、本願は、ＤＳＣによる測定として変更された結晶化温度を有するデンプン組成物を提供する。
本願のコムギ植物と野生型コムギ植物とから作製されたデンプンとの間の熱容量変化を算出するため、ＤＳＣを用いることができる。試料の熱容量は、開始時遷移でのベースラインにおけるシフト：
Ｃｐ＝ｄＨ／ｄｔ×ｄｔ／ｄＴ
（式中、ｄＨ／ｄｔはサーモグラムのベースラインにおける変化であり、かつｄｔ／ｄＴは加熱速度の逆数である）から算出される。熱流の単位は、ｍＷまたはｍｃａｌ／秒であり、加熱速度の単位は、℃／分または℃／秒であり得る。一部の実施形態では、１０℃／分の加熱速度で、ＤＳＣによる測定としての本願のコムギから作製されるデンプンの熱容量は、野生型コムギ、または２つの野生型ＳＳＩＩ対立遺伝子およびただ１つのＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を有するコムギから作製されるデンプンの場合と比べて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上変更される（例えば、増加または減少する）。
本発明は、限定するものとして解釈されるべきでない以下の実施例により、さらに例示される。本願全体を通じて引用されるすべての参考文献、特許および公開された特許出願の内容、ならびに図面および配列表は、参照により本明細書に援用される。
実施例１ − ＳＳＩＩ漏出性突然変異体の同定および新しいｓｇｐ６倍体コムギ突然変異体品種の作出
以下の実施例は、精製デンプン中に減少したＳＳＩＩタンパク質存在量を有するＳＳＩＩ突然変異体対立遺伝子に対してスクリーニングおよび選択することによる、（ヌル対立遺伝子と比べて）アミロースの増加とほぼ正常な種子重量との両方を含む改善された特性を有するＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子突然変異体６倍体パンコムギ植物の作出および同定を示す。
ＳＳＩＩ−ＡおよびＳＳＩＩ−ＢおよびＳＳＩＩ−ＤにおけるＥＭＳ突然変異に対するＰＣＲスクリーニング
漏出性突然変異体対立遺伝子を有することが疑われるAlpowa ＲＪ突然変異体植物集団からの葉組織をFeekes成長段階１．３で回収し、−８０℃で貯蔵し、ＤＮＡをRiedeおよびAnderson（１９９６）に従って抽出した。前述のプライマーおよびＰＣＲ条件を用いて、二重のＤＮＡ試料からのＳＳＩＩ−ＡおよびＳＳＩＩ−ＢおよびＳＳＩＩ−Ｄのコード領域を増幅した（Chibbarら、２００５，Shimbataら、２００５，Sestiliら、２０１０ａ）。増幅産物を配列決定し、得られたＤＮＡ配列を、単一ヌクレオチド多型について、Lasergene 10.1 Suite (DNASTAR, Madison, WI)中のSeqman Proを用いて分析した。表２は、本実施例で同定されたＳＳＩＩ突然変異体の非排他的リストを提示する。
デンプン抽出
ＳＧＰ−１タンパク質存在量を測定するため、種子をBraunコーヒーミル（Proctor Gamble, Cincinnati, OH）内で１０秒間粉砕することによりデンプンを抽出し、次いで、２ｍｌの微量遠心管に６．５ｍｍのジルコニアボール２つとともに入れ、ミニ−ビーズビーター−９６内で３０秒間撹拌した。ジルコニアボールを遠心管から取り除き、０．１Ｍ ＮａＣｌを全粒粉小麦粉に１．０ｍｌ添加し、次いでそれを室温で３０分間浸した状態で放置した。３０分後、プラスチックのKontesペレットペッスル（Kimble Chase, Vineland, NJ）を用いて湿潤小麦粉を混合することにより生地のボールを作り、デンプンを圧搾後、そのグルテンボールを試料から取り除いた。次いで、液体デンプン懸濁物を予め秤量した新しい２．０ｍｌチューブに移し、ｄｄＨ２Ｏを最初のチューブ内の残存デンプンペレットに０．５ｍｌ添加した。最初のチューブをボルテックスし、１分間静置状態で放置し、液体デンプン懸濁物を第２のチューブに移した。デンプン懸濁物含有チューブを５，０００ｇで遠心分離し、液体を吸引除去した。次に、ＳＤＳ抽出緩衝液（５５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ６．８、２．３％ＳＤＳ、５％ＢＭＥ、１０％グリセロール）を０．５ｍｌ添加し、試料を懸濁されるまでボルテックスし、次いで５，０００ｇで遠心分離した。ＳＤＳ緩衝液を吸引除去し、ＳＤＳ緩衝液抽出をもう１度繰り返した。次に、８０％ＣｓＣｌをデンプンペレットに０．５ｍｌ添加し、試料を懸濁されるまでボルテックスし、次いで７，５００ｇで遠心分離した。ＣｓＣｌを吸引除去し、デンプンペレットを０．５ｍｌのｄｄＨ２Ｏで２回、およびアセトンで１回洗浄した（遠心分離速度は１０，０００ｇであった）。上清を吸引後、デンプンペレットをドラフト内で乾燥状態で一晩放置した。
デンプン粒タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
ＳＧＰ−１タンパク質存在量を測定するため、ＳＤＳローディング緩衝液（ＳＤＳ抽出緩衝液＋ブロモフェノールブルー）をデンプン１ｍｇあたり７．５μｌ添加した。試料を７０℃で１５分間加熱し、１０，０００ｇで１分間遠心分離し、次いで試料４０μｌを、３０％アクリルアミド／０．８％ピペラジンジアクリルアミドｗ／ｖ保存液を用いて調製した１０％（ｗ／ｖ）アクリルアミドゲルに負荷した。ゲルは、３０％アクリルアミド／０．８％ピペラジンジアクリルアミドｗ／ｖ保存液を用いて調製した標準的な４％ｗ／ｖアクリルアミドスタッキングゲルを有した。ゲルを泳動し（２５ｍＡ／ゲルで４５分、次いで３５ｍＡ／ゲルで３時間）、標準的手順に従って銀染色し、デジタルカメラを用いてライトボックス上で撮影した。
本実施例に記載のAlpowa集団において、小麦粉膨潤度（ＦＳＰ）も決定した。本願中に記載の育種方法で用いるため、ＳＧＰ−１タンパク質存在量が減少し、かつ小麦粉膨潤度が低下したデンプン合成酵素突然変異を示す品種を選択した。これらの判定基準を有する品種は、少量のＳＧＰ−１デンプン合成酵素活性を保持する漏出性対立遺伝子（Ａ、Ｂ、またはＤのいずれか）を含むと仮定された。このスクリーニングから選択された親を下の表３に示す。
２つのヌル突然変異体対立遺伝子および少なくとも１つの漏出性対立遺伝子を有する植物を開発するため、表３の品種をＲＪ−５９７／３０２ ＳＳＩＩ三重ヌル＃７２品種への交配とともに交配させた。得られたＦ２集団（６，０００＋植物）を圃場内で生育し、表３からの漏出性植物、およびＲＪ−５９７／３０２のＳＳＩＩヌル突然変異のために開発したマーカーを用いて、圃場で生育した植物から３〜４の葉段階で遺伝子型を同定した。３つの主要な対立遺伝子群、すなわち（ｉ）ＳＳＩＩヌル突然変異の３つすべてに対してホモ接合性であるもの、（ｉｉ）１つの漏出性対立遺伝子とともにＳＳＩＩヌル突然変異の２つに対してホモ接合性であるもの、および（ｉｉｉ）漏出性対立遺伝子および２つのＳＳＩＩ野生型対立遺伝子に対してホモ接合性であるものを収穫した。種子サイズが過剰に減少したＦ２種子を植えたことから、予想されたよりも多いＳＳＩＩ三重突然変異体が偶然に得られた（表４）。各集団における１０２３の個別のＦ２植物をBozemanにおける圃場内で採取し、圃場で生育した植物から３〜４の葉段階で遺伝子型を同定した。各ホモ接合性クラスの予想された頻度は、各群につき、１／６４（１．５６％）または約１６のホモ接合体であった。表中に示される３つのホモ接合性クラスの各々について、すべてのホモ接合体を収穫した。減少した種子サイズについてのＦ２種子の表現型決定により、ＳＳＩＩヌルは大きい比率を占める（表４）。
実施例２ − ＳＳＩＩ漏出性品種のアミロース含量
デンプンを、表４に記載の６つの集団の各々における３つのホモ接合性クラスの各々から調製した。
デンプン抽出
各遺伝子型および株からの種子をBraunコーヒーミル（Proctor Gamble, Cincinnati, OH）内で１０秒間粉砕し、次いで２ｍｌの微量遠心管に６．５ｍｍのイットリア安定化ジルコニアセラミックボール２つ（Stanford Materials, Irvine, CA）とともに入れ、ミニ−ビーズビーター−９６（Biospec Products, Bartlesville, OK）内で、振動距離３．２ｃｍおよび振とう速度３６回の振動／秒で３０秒間撹拌した。ジルコニアボールを遠心管から取り除き、０．１Ｍ ＮａＣｌを全粒粉小麦粉に１．０ｍｌ添加し、次いでそれを室温で３０分間浸した状態で放置した。３０分後、プラスチックのKontesペレットペッスル（Kimble Chase, Vineland, NJ）を用いて湿潤小麦粉を混合することにより生地のボールを作り、デンプンを圧搾後、そのグルテンボールを試料から取り除いた。次いで、液体デンプン懸濁物を予め秤量した新しい２．０ｍｌチューブに移し、ｄｄＨ２Ｏを最初のチューブ内の残存デンプンペレットに０．５ｍｌ添加した。最初のチューブをボルテックスし、１分間静置状態で放置し、液体デンプン懸濁物を第２のチューブに移した。デンプン懸濁物含有チューブを５，０００ｇで遠心分離し、液体を吸引除去した。デンプンペレットに、ＳＤＳ抽出緩衝液（５５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ６．８、２．３％ＳＤＳ、５％ＢＭＥ、１０％グリセロール）を０．５ｍｌ添加し、試料を懸濁されるまでボルテックスし、次いで５，０００ｇで遠心分離した。ＳＤＳ緩衝液を吸引除去し、ＳＤＳ緩衝液抽出をもう１度繰り返した。次に、８０％ＣｓＣｌをデンプンペレットに０．５ｍｌ添加し、試料を懸濁されるまでボルテックスし、次いで７，５００ｇで遠心分離した。ＣｓＣｌを吸引除去し、デンプンペレットを０．５ｍｌのｄｄＨ２Ｏで２回、およびアセトンで１回洗浄した（遠心分離速度は１０，０００ｇであった）。アセトンを吸引除去後、ペレットをドラフト内で乾燥状態で一晩放置した。
Hansenら（２０１０）に記載の方法に従い、Pyris 7 Diamond DSC (Perkin Elmer, Norwalk CT, USA)での示差走査熱量測定分析（ＤＳＣ）を用いて、アミロース含量を測定した。アミロースの結果を各群に対して平均化し、Ｐ値を算出し、野生型および漏出性のアミロース値を比較した（表５）。
結果は、６つの最初に同定された「漏出性」対立遺伝子のうちの４つが、アミロース含量を野生型レベルで蓄積したことから、過剰に漏出性である可能性が高かったこと（表５中の漏出性の親４２、１０２、４１４、および５１４）を示唆する。２つの残存する「漏出性」対立遺伝子（１２２および６２４）は、野生型を超える程に増加したアミロース含量を示したが、ＳＳＩＩヌル群を下回った。
実施例３ − ＳＳＩＩ漏出性品種の種子サイズ
種子重量に対するＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の効果を判定するため、「６２４」、「１２２」、および「４１４」コムギ系統からのホモ接合性種子を個別に秤量した。２００種子／株に対して種子サイズを測定した。ミリグラム単位での平均重量および野生型分離個体に対するパーセント差異の比較（ＳＳＩＩ二重ｗｔ＋１つの漏出性）を表６にまとめる。
個体種子サイズに対する漏出性対立遺伝子の影響は、漏出性対立遺伝子クラス（ＳＳＩＩ二重ヌルおよび１つの漏出性）を有する植物がＳＳＩＩヌルと野生型の中間の種子重量を有する程度に、アミロースデータに合致した（表６）。
実施例４ − ＳＳＩＩヌルデュラム品種の種子重量の減少
圃場データの概要は、ＳＳＩＩヌル４倍体デュラムコムギ品種、例えばＭ１７５およびＭ５５において達成された高アミロース含量が種子サイズおよび条収量における有意な減少に関連することが示された（表７および図１）。Ｍ１４７およびＭ５５ ＳＳＩＩヌル突然変異体を野生型指標系統と一緒に圃場内で生育した。
３つすべての別々の試験は、１年目および２年目の期間ではBozeman Montana (BZ)において、また２年目ではアリゾナ州（AZ）において実施した。得られたコムギ穀粒を収集し、総収量、種子重量、および栄養組成物について分析した。
Ｍ１７５およびＭ５５（ａｂ）系統から収穫した穀粒は、それらの指標系統対応物（ＡＢ）よりも高いアミロース含量を示した（データは示さず）。しかし、ＳＳＩＩヌル品種Ｍ１７５およびＭ５５は、それらのＡＢ指標系統対応物と比べて減少した収量および減少した種子重量を一貫して示した。
実施例５ − ＳＳＩＩ漏出性突然変異体の同定および新たなｓｇｐ突然変異体デュラムコムギ品種の作出
変異誘発デュラムコムギ集団の作出およびスクリーニング
USDA National Small Grains Collection (NSGC, Aberdeen, ID)およびICARDAから得たデュラムコムギ受託物を、ＳＧＰ−Ａ１および／またはＳＧＰ−Ｂ１についてヌルのものについて、デンプン粒結合タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いてスクリーニングした。スクリーニングした２００のＮＳＧＣデュラムコムギ（Triticum durum）コア収集受託物からは、１つの系統ＰＩ−３３０５４６はＳＧＰ−Ａ１が欠如したが、ＳＧＰ−Ｂ１が欠如するものはなかった。スクリーニングした５５のＩＣＡＲＤＡデュラムコムギ（Triticum durum）受託物からは、１つの系統ＩＧ−８６３０４はＳＧＰ−Ａ１が欠如したが、ＳＧＰ−Ｂ１が欠如するものはなかった。これら２つの系統を栽培変種「Mountrail」(PVP 9900266)と独立して交配させ（EliasおよびMiller、２０００）、単粒系統法によりＦ５世代に進化させた。次いで、各交雑種からのMountrailと同様の種子および植物特性を有するＳＧＰ−Ａ１ヌル形質についてホモ接合性の系統を、ＥＭＳ０．５％を用いる以外にはFeizら（２００９）に記載されるように、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）で処理した。
ＳＳＩＩ−Ｂ中のＥＭＳ突然変異についてのＰＣＲスクリーニング
Mountrail／Ｍ１２３と称されるMountrail ＳＳＩＩ−Ａ突然変異体植物集団、および漏出性ＳＳＩＩ−Ｂ突然変異体対立遺伝子を有することが疑われるMountrail／ＭＳ４２からの葉組織を回収し、実施例１に記載のようにＳＳＩＩ−Ｂ遺伝子領域内の漏出性突然変異についてＰＣＲスクリーニングした。
これら２つの集団間でＳＳＩＩ−Ｂ遺伝子の３つのセグメントを５００系統にわたりスクリーニングし、５つのミスセンス突然変異体を同定した（表８）。
実施例６ − 新たなＳＳＩＩ漏出性デュラムコムギ突然変異体の特徴づけ
種子サイズおよびアミロース含量
実施例５からの同定されたヘテロ接合性Ｍ１突然変異体を温室内で１世代進化させ、Ｍ２植物の遺伝子型を同定した。Ｍ２ホモ接合性漏出性突然変異体系統から収穫した種子を、個体種子サイズおよび見かけ上のアミロース含量について、実施例２および３に記載され、当業者に公知であるようなヨウ素染色により、姉妹野生型系統からの種子と比較した。これらの比較結果を下の表９に示す。ＭＳ４２−３８−４６２−２２４系統は、Ｍ１世代においてホモ接合性であったことから、比較群を有しなかった。また、Ｍ１２３−３−６−２８０−４系統が発見され、他の４つの漏出性突然変異体よりも後に植えた。現在、この系統からのＭ２植物に対して遺伝子型を同定することで、ホモ接合性姉妹突然変異体および野生型系統を同定しつつあり、次にアミロース含量について測定することができる。
試験した４つの系統から、１つの系統（Ｍ１２３−１−５−２２−２１３）が、アミロース含量が有意により高い（３９％対２６％）が、個別の穀粒重量で有意な減少を有しない種子を伴い、最も望ましい表現型を示した（表９）。２つの他の系統（Ｍ１２３−１−５−３９−２１７およびＭＳ４２−３８−４６２−２２４）は、アミロース含量において適度な変化を有し（約３０％）、ＭＳ４２−３５−３２６−２７５系統は、アミロース含量における変化を示さなかった（表９）。
実施例７ − ＳＳＩＩ漏出性デュラムコムギ突然変異体のさらなる圃場の特徴抽出
温室で生育された植物が時として突然変異の効果を測定するのに理想的でないことから、種子を増加させ、その圃場性能を検証するため、実施例６からのMountrail ＳＧＰ突然変異体系統に対して、アリゾナ州で一条としての圃場試験を実施した。
この試験用の種子を収穫して、現在、種子形質（単一穀粒のタンパク質に対する特徴抽出および近赤外反射分光法）および見かけ上のアミロース含量について特徴抽出を行っている。加えて、これらの知見を確認するため、最も有望な系統をエリートデュラム品種と交配し、Ｆ２世代に進化させることになり、ここで、アミロース含量の比較は適切なハプロタイプ間で行うことができる。
Ｍ１２３−１−５−２２−２１３が、有意に増加したアミロース含量を示すとともに、その野生型指標系統対応物と同様の穀粒重量を維持することが予想される。
実施例８ − さらなるＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の同定
漏出性機能の所望される量を有するさらなる対立遺伝子を同定するため、新しいＥＭＳ集団を「Divide」バックグラウンドで作出した。Divideは、ＳＳＩＩ−ＡおよびＳＳＩＩ−Ｂの両方の野生型機能的対立遺伝子を保有する。ＳＳＩＩ−ＡおよびＳＳＩＩ−Ｂに突然変異を有する単一のＭ１植物を、本願の実施例１に記載のように１，０００を超えるＭ１系統からの各遺伝子の２つのセグメントをスクリーニングすることにより同定した。９つのＳＳＩＩ−Ａおよび９つのＳＳＩＩ−Ｂのミスセンス対立遺伝子の全部を進化について選択し、さらなる遺伝子型の同定および交配のために温室内に植えた（表１０）。タンパク質機能に対する悪影響を示すＳＩＦＴ値を有するミスセンス対立遺伝子のみを示す。
次に、デンプン粒タンパク質を、実施例１に記載のようにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いることにより各系統から抽出した。これらのＳＳＩＩタンパク質分析から得た結果を下の表１０にまとめる。ＳＳＩＩタンパク質の蓄積がそれらの野生型対応物と差がないことを示す系統を「ＷＴ」と表示する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のＳＳＩＩタンパク質の蓄積の低下を示す系統を「パーシャル」と表示する。
４つの系統（＃１３４、１１７４、１５１３、および１７０４；３つのＳＳＩ−Ａおよび１つのＳＳＩＩ−Ｂ）が、対応するＳＳＩＩタンパク質の存在量における「パーシャル」減少を示すものとして同定された。したがって、これらの系統は、ＳＳＩＩヌル対立遺伝子と対合されるとき、植物に適度なアミロースレベルを与える漏出性機能の所望される量を示す可能性がより高い。他のすべての系統は野生型と同定された。
実施例９ − ＳＳＩＩヌルバックグラウンドでｓｓｉｉ漏出性突然変異体を有するデュラムコムギ植物の作出
実施例８からの「Divide」突然変異体が、依然としてＳＳＩＩ−ＡおよびＳＳＩＩ−Ｂ遺伝子の両方の少なくとも１つの野生型コピーを有することから、これらの潜在的に漏出性の突然変異体をＳＳＩＩ二重ヌル系統と交配させ、漏出性対立遺伝子の影響を判定する必要がある。１８すべての潜在的に漏出性の突然変異を、以前のDivide／／Mountrail／１７５集団からのＳＳＩＩ二重ヌル系統＃１２７と巧みに交配させた。これらの交配から得られたＦ１世代が温室内で確認され、進化を受けることになる。
次に、得られたＦ２世代の遺伝子型を同定し、種子におけるアミロースおよびサイズが試験可能である、適切なＳＳＩＩ対立遺伝子の組み合わせを保有する系統を同定することになる。Ｆ２ Divide試験から得られた種子は、先行する実施例で記載のように、アミロース含量、タンパク質含量、種子サイズ、および総収量について試験することになる。
表１０で同定されたＳＳＩＩ Ａおよび／またはＳＳＩＩ Ｂ対立遺伝子の１つ以上が、野生型対照植物と比べて増加したアミロース含量を示すが、ＳＳＩＩ二重ヌル植物に対して実質的に同様かまたは増加した穀粒重量を伴うことが予想される。
実施例１０ − 漏出性ＳＳＩＩの発現を有するコムギ植物を用いるコムギ育種プログラム
コムギ育種についての非限定的方法および農業上重要な形質（例えば、改善されたコムギ収量、生物的ストレス耐性および非生物的ストレス耐性など）は、Slafer and Araus, 2007, (“Physiological traits for improving wheat yield under a wide range of conditions”, Scale and Complexity in Plant Systems Research: Gene-Plant-Crop Relations, 147-156); Reynolds (“Physiological approaches to wheat breeding”, Agriculture and Consumer Protection. Food and Agriculture Organization of the United Nations); Richard et al., (“Physiological Traits to Improve the Yield of Rainfed Wheat: Can Molecular Genetics Help”, published by International Maize and Wheat Improvement Center.); Reynolds et al. (“Evaluating Potential Genetic Gains in Wheat Associated with Stress-Adaptive Trait Expression in Elite Genetic Resources under Drought and Heat Stress Crop science”, Crop Science 2007 47: Supplement_3: S-172-S-189); Setter et al., (Review of wheat improvement for waterlogging tolerance in Australia and India: the importance of anaerobiosis and element toxicities associated with different soils. Annals of Botany, Volume 103(2): 221-235); Foulkes et al., (Major Genetic Changes in Wheat with Potential to Affect Disease Tolerance. Phytopathology, July, Volume 96, Number 7, Pages 680-688 (doi: 10.1094/PHYTO-96-0680); Rosyara et al., 2006 (Yield and yield components response to defoliation of spring wheat genotypes with different level of resistance to Helminthosporium leaf blight. Journal of Institute of Agriculture and Animal Science 27. 42-48.)；米国特許第７，６５２，２０４号、同第６，１９７，５１８号、同第７，０３４，２０８号、同第７，５２８，２９７号、同第６，４０７，３１１号；米国特許出願公開第２００８００４０８２６号、同第２００９０３００７８３号、同第２００６０２２３７０７号、同第２０１１００２７２３３号、同第２００８００２８４８０号、同第２００９０３２０１５２号、同第２００９０３２０１５１号；国際公開第２００１／０２９２３７Ａ２号；国際公開第２００８／０２５０９７Ａ１号；ならびに国際公開第２００３／０５７８４８Ａ２号に記載されている。
本発明の特定の漏出性ＳＳＩＩ対立遺伝子を有する修飾されたデンプンを含むコムギ植物は、自家交配させて、同じ表現型を含む子孫を得ることができる。
本発明の修飾されたデンプンまたはデンプン合成遺伝子の特定の対立遺伝子を含むコムギ植物（「ドナー植物」）はまた、別の植物（「レシピエント植物」）と交配させて、Ｆ１雑種植物を得ることができる。Ｆ１雑種植物の一部は、レシピエント植物に１、２、３、４、５、６、７回以上戻し交配させることができる。各戻し交配後、種子を収穫し、植えて、修飾されたデンプン、およびレシピエント植物から受け継いだ好ましい形質を含む植物を選択する。かかる選択された植物は、レシピエント植物と戻し交配させるための雄または雌植物のいずれかとして用いることができる。
実施例１１ − さらなる特徴抽出
デンプン含量
ＳＳＩＩ漏出性系統および野生型対照コムギ系統のデンプン含量は、本明細書に記載の１つ以上の方法、またはMoreels et al. (Measurement of Starch Content of Commercial Starches, Starch 39(12):414-416, 1987)または(Measurement of Total and Gelatinized Starch by Glucoamylase and o-toluidine reagent, Cereal Chem. 54(3):429-435)（それら各々はその全体が参照により援用される）に記載される方法により測定することができる。ＳＳＩＩ漏出性系統におけるデンプン含量は、野生型対照コムギ系統の場合と比べてわずかに低減されると予想される。
グリセミック指数
ＳＳＩＩ漏出性系統および野生型対照コムギ系統のグリセミック指数は、本明細書に記載の１つ以上の方法、またはBrouns et al. (Glycemic index methodology, Nutrition Research Reviews, 18(1):145-171, 2005), Wolever et al. (The glycemic index: methodology and clinical implications, Am. J. Clin. Nutr. 54(5):846-54, 1991)、またはGoni et al., A starch hydrolysis procedure to estimate glycemic index, Human Study, 17(3):427-437, 1997)（それら各々はその全体が参照により援用される）に記載される方法により測定することができる。
グリセミック指数またはＧＩは、炭水化物消費からのグルコース（血糖）レベル増加の尺度である。グルコースは、定義により１００のグリセミック指数を有し、他の食品は、より低いグリセミック指数を有する。コムギパスタまたはパンのグリセミック指数は、１２時間の絶食およびＤＨＡ１７５または野生型パスタの有効炭水化物５０ｇの摂取後の、２時間血糖応答曲線下面積（ＡＵＣ）の増加を算出することにより測定することができる。試験食品のＡＵＣを標準物質のＡＵＣ（グルコースまたは白パンのいずれか、２つの異なる定義を与える）で除し、１００を乗じる。平均ＧＩ値を、５名のヒト被験者で回収したデータから算出する。標準および試験食品は、等量の有効炭水化物を含有しなければならない。
パスタ品質
ＳＳＩＩ漏出性系統および野生型対照コムギ系統の小麦粉から製造されるパスタの品質は、本明細書に記載の１つ以上の方法、またはLandi (Durum wheat, semolina and pasta quality characteristics for an Italian food company, Cheam-Options Mediterraneennes, pages 33-42)またはCole (Prediction and measurement of pasta quality, International Journal of Food Science and Technology, 26(2):133-151, 1991)（それら各々はその全体が参照により援用される）に記載される方法により試験することができる。
パスタの硬さおよび加熱過多に対する耐性を測定することができる。ＳＳＩＩ漏出性系統では、野生型対照コムギ系統の場合と比べて、パスタ硬さが劇的に増加し、加熱過多が低減することが期待される。
パスタ品質を評価する場合、限定されないが、以下：（１）小麦粉が生産されるコムギの原産地のタイプ、（２）小麦粉の特性、（３）こね、引き延ばしおよび乾燥の製造プロセス、（４）可能性のある添加成分、ならびに（５）保存の衛生状態を含むパスタの他の品質因子も考慮することができる。
ラピッドビスコアナライザ（ＲＶＡ）
ＳＳＩＩ漏出性系統および野生型対照コムギ系統のデンプンは、ラピッドビスコアナライザ（ＲＶＡ）で、本明細書に記載の１つ以上の方法、またはNewport Scientific Method ST-00 Revision 3 (General Method for Testing Starch in Rapid Visco Analyzer, 1998), Ross (Amylose, amylopectin, and amylase: Wheat in the RVA, Oregon State University, 55th Conference Presentation, 2008), Bao et al., (Starch RVA profile parameters of rice are mainly controlled by Wx gene, Chinese Science Bulletin, 44(22):2047-2051, 1999), Ravi et al., (Use of Rapid Visco Analyzer (RVA) for measuring the pasting characteristics of wheat flour as influenced by additives, Journal of the Science of Food and Agriculture, 79(12):1571-1576, 1999)またはGamel et al. (Application of the Rapid Visco Analyzer (RVA) as an Effective Rheological Tool for Measurement of β-Glucan Viscosity, 89(1):52-58, 2012)（それら各々はその全体が参照により援用される）に記載される方法により試験することができる。
ＳＳＩＩ漏出性系統は、野生型対照コムギ系統の場合と比べて低下したピーク粘度を有することが予想される。
難消化性デンプン
ＳＳＩＩ漏出性系統および野生型対照コムギ系統の難消化性デンプン含量は、本明細書に記載の１つ以上の方法、またはMcCleary et al., (Measurement of resistant starch, J. AOAC Int. 2002, 85(3):665-675), Muir and O’Dea (Measurement of resistant starch: factors affecting the amount of starch escaping digestion in vitro, Am. J. Clin. Nutr. 56:123-127, 1992), Berry (Resistant starch: Formation and measurement of starch that survives exhaustive digestion with amylolytic enzymes during the determination of dietary fibre, Journal of Cereal Science, 4(4):301-314, 1986), Englyst et al., (Measurement of resistant starch in vitro and in vivo, British Journal of Nutrition, 75(5):749-755, 1996)（それら各々はその全体が参照により援用される）に記載される方法により試験することができる。
ＳＳＩＩ漏出性系統は、乾燥および調理後パスタ試験の両方において、野生型対照コムギ系統と比べて増加した難消化性デンプンを有することが予想される。
特に定義されない限り、本明細書中のすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解される場合と同じ意味を有する。本明細書に記載される場合と同様または均等な任意の方法および材料を本発明の実施または試験において用いることができるが、非限定的な例示的方法および材料が本明細書に記載される。
本明細書で言及されるすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の水準を示す。すべての刊行物および特許出願は、あたかもそれぞれ個別の刊行物または特許出願が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されたのと同じ程度で、参照により本明細書に援用される。本明細書において、本発明が先行発明によりかかる刊行物に先行して権利を有さないことの承認として解釈されるべき事項はない。
上記の説明および関連する図面に示される教示の利益を有する本発明が属する技術分野の当業者は、本明細書に示される本発明の多くの修飾形態および他の実施形態を想到することになる。したがって、本発明が開示される具体的な実施形態に限定されることなく、修飾形態および他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれるように意図されることは理解されるべきである。本明細書中で特定の用語が用いられるが、それらはあくまで包括的でありかつ説明的意味で用いられ、限定目的として用いられない。
本発明は、その具体的な実施形態との関連で記載されているが、さらなる修飾形態が可能であり、かつ本願が本発明の原理に全般的に従う本発明の任意の変形形態、使用または適合形態を包含することが意図されており、本発明が属する技術分野で公知のまたは慣例的な実施に付属し、また本明細書で上述されるおよび添付の特許請求の範囲における本質的特徴に適用され得る本開示からの逸脱を含むと理解される。
参考文献
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Claims (25)

  1. コムギ植物から生成される高アミロース穀粒であって、
    ａ）少なくとも１つのＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含み；かつ
    ｂ）ＳＳＩＩ野生型機能的対立遺伝子を含まず、
    前記高アミロース穀粒は、類似の圃場条件下で生育された適切な野生型コムギ指標品種に由来する対照穀粒のデンプンアミロースの割合と比べて増加した割合のデンプンアミロースを有し、前記高アミロース穀粒は、類似の圃場条件下で生育された適切なヌルコムギ指標品種に由来する穀粒と比べてより高い種子重量を有し、前記ヌルコムギ指標品種は、ＳＳＩＩヌル対立遺伝子のみを含む、高アミロース穀粒。
  2. 前記穀粒のデンプンアミロースの前記割合は、類似の圃場条件下で生育された適切な野生型コムギ指標品種に由来する対照穀粒の前記デンプンアミロースと比べて少なくとも２５％高い、請求項１に記載の高アミロース穀粒。
  3. 類似の圃場条件下で生育された適切なヌルコムギ指標品種に由来する前記穀粒よりも少なくとも１０％高い種子重量を有する、請求項１に記載の高アミロース穀粒。
  4. 前記コムギ植物は、第１、第２、および第３のゲノムを含む６倍体コムギである、請求項１に記載の高アミロース穀粒。
  5. 前記６倍体コムギは、前記第１および第２のゲノム中のホモ接合性ＳＳＩＩヌル対立遺伝子と、前記第３のゲノム中の前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子とを含む、請求項４に記載の高アミロース穀粒。
  6. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、前記第３のゲノム中でホモ接合性である、請求項５に記載の高アミロース穀粒。
  7. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋおよび／またはＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、請求項１、５または６のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  8. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、配列番号４０または配列番号４４のタンパク質をコードする、請求項１、５または６のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  9. 前記コムギ植物は、第１および第２のゲノムを含む４倍体コムギである、請求項１に記載の高アミロース穀粒。
  10. 前記４倍体コムギは、前記第１のゲノム中のホモ接合性ＳＳＩＩヌル対立遺伝子と、前記第２のゲノム中の前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子とを含む、請求項９に記載の高アミロース穀粒。
  11. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、前記第２のゲノム中でホモ接合性である、請求項１０に記載の高アミロース穀粒。
  12. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌおよび／またはＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、請求項１、１０または１１のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  13. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子は、配列番号４６または配列番号４８のタンパク質をコードする、請求項１、１０または１１のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  14. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の前記少なくとも１つは、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ７８５Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ２５１Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ３１９Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｅ６６３Ｋ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ａ６８１Ｔ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｇ７２１Ｅ、およびＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ６９３Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するＳＳＩＩタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  15. 製粉製品を生産する方法であって、ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒を製粉し、それにより前記製粉製品を生産することを含む方法。
  16. １つ以上のコムギデンプン合成酵素（ＳＳＩＩ）漏出性対立遺伝子を有し、かつＳＳＩＩ野生型機能的対立遺伝子を有しないコムギ植物を生成する方法であって、
    ａ．穀粒の突然変異誘発集団を形成するためにコムギ穀粒を突然変異誘発することと；
    ｂ．前記変異誘発されたコムギ穀粒から１つ以上のコムギ植物を生育することと；
    ｃ．ＳＳＩＩ漏出性突然変異体対立遺伝子を有するコムギ植物を同定するために、ステップ（ｂ）からの前記得られた植物をスクリーニングすることと；
    ｄ．ステップ（ｃ）から誘導されるＳＳＩＩ漏出性コムギ植物を、少なくとも１つのＳＳＩＩヌル対立遺伝子または少なくとも１つのＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含む第２のコムギ植物と交配させることと；
    ｅ．ステップ（ｄ）からの得られた穀粒を収穫することと；
    ｆ．前記収穫された穀粒を植物に生育することと；
    ｇ．１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含み、かつ野生型機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子を含まないコムギ植物を選択することと
    を含み、前記得られた植物は、１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含み、かつＳＳＩＩ野生型機能的対立遺伝子を含まない、方法。
  17. １つ以上のコムギデンプン合成酵素（ＳＳＩＩ）漏出性対立遺伝子を有し、かつ野生型機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子を有しないコムギ植物を生成する方法であって、
    ａ．少なくとも１つのＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含むコムギ植物を第２のコムギ植物と交配させることであって、すべての前記ＳＳＩＩ対立遺伝子は、ヌル遺伝子、漏出性対立遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、交配させることと；
    ｂ．得られた穀粒を収穫することと；
    ｃ．前記収穫された穀粒を植物に生育することと；
    ｄ．１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含み、かつ野生型機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子を含まないコムギ植物を選択することと
    を含み、前記得られた植物は、１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含み、かつＳＳＩＩ野生型機能的対立遺伝子を含まない、方法。
  18. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の前記少なくとも１つは、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ７８５Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ２５１Ｓ、ＳＳＩＩ−Ａ−Ｐ３１９Ｌ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌ、およびＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するＳＧＰ−１タンパク質をコードするミスセンス変異を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の前記少なくとも１つは、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋおよび／またはＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
  20. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の前記少なくとも１つは、配列番号４０または配列番号４４のタンパク質をコードする、請求項１６または１７に記載の方法。
  21. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の前記少なくとも１つは、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌおよび／またはＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
  22. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つは、配列番号４６または配列番号４８のタンパク質をコードする、請求項１６または１７に記載の方法。
  23. 高アミロース穀粒を有するコムギ植物を育種する方法であって、
    ａ）Ｆ１植物を生成するために、請求項１に記載の植物を第２の植物と交配させることと；
    ｂ）前記Ｆ１植物を前記第２の植物に戻し交配することと；
    ｃ）近同質遺伝子または同質遺伝子系統を作製するために、前記戻し交配することを１回以上にわたって反復することと
    を含み、同質遺伝子または近同質遺伝子のコムギ植物は、１つ以上のＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子を含み、かつ野生型機能的ＳＳＩＩ対立遺伝子を含まず、前記植物は、高アミロース穀粒を生成する、方法。
  24. 前記同質遺伝子または近同質遺伝子のコムギ植物は、１つ以上のＳＳＩＩヌル対立遺伝子をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ＳＳＩＩ漏出性対立遺伝子の少なくとも１つは、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ｅ６５６Ｋ、ＳＳＩＩ−Ｄ−Ａ４２１Ｖ、ＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｓ、およびＳＳＩＩ−Ｂ−Ｐ３３３Ｌからなる群から選択されるアミノ酸置換を有するタンパク質をコードするミスセンス変異を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
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