CN114656539B - ZmAE1蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用 - Google Patents

ZmAE1蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了ZmAE1蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用。本发明提供的ZmAE1基因经CRISPR‑Cas9基因编辑技术突变后，干旱处理条件下突变体植株生长明显优于对照植株，说明该基因突变能够显著提高植物抗旱性。本发明实例中采用CRISPR‑Cas9基因编辑技术获得了抗旱的植株，与传统育种方式相比时间短，目的性强，为培育和改良抗旱植物新品种提供了基因资源，为阐明ZmAE1在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。

Description

ZmAE1蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及植物抗旱相关蛋白ZmAE1及其编码基因与应用。
背景技术
我国一半以上玉米种植在西北、西南、华北和东北地区依靠自然降水的旱地上，水分流失快且降水变率也很大,严重影响玉米的生长。玉米是我国重要的粮食作物，其抗旱性研究对解决我国的玉米产量问题意义重大。我们旨在找到在玉米过表达株系中的干旱相关基因，研究其基因功能及信号转导途径。通过干旱相关基因的研究，对玉米进行改良，改善玉米的抗旱性，提高玉米的产量。
干旱可引起植物的渗透胁迫，植物体内的渗透压低于环境渗透压(如土壤溶液)，植物体不能吸水甚至失水。渗透胁迫有两条通路：依赖于ABA和不依赖于ABA的通路。当受到环境胁迫时，依赖于ABA通路中，产生ABA，PYL、PYR、RCAR是ABA受体，能与ABA结合。PP2C的蛋白磷酸酶的活性受抑制，使SnRK2具有激酶活性，可以磷酸化下游的转录因子等，从而调控下游逆境响应基因的表达，抑制气孔张开，调控ABA的敏感性，以及产生其他的响应。不依赖于ABA通路中，DREB2A被磷酸化，从而调控下游逆境响应基因表达。旱胁迫能够诱导植物体内产生脱落酸(ABA)，它能够及时的引导气孔关闭而减少植物体内水分的损失，同时它还能激活大量旱相关基因的表达从而造成植物的各种旱胁迫响应。ABA作为极其重要的植物激素，它在气孔关闭和逆境响应基因的表达等方面发挥着关键的作用。
淀粉是由D-葡萄糖分子缩合而成的高分子多糖化合物。根据其分子结构特征可以分为直链淀粉和支链淀粉。淀粉作为玉米籽粒中含量最多的一种营养成分，在籽粒中含量约为70％～75％，因此对ZmAE1蛋白的研究非常重要。植物ZmAE1蛋白它们在非生物胁迫中的功能还不清楚，如何利用基因编辑或其他技术，对这类基因进行突变，研究它们的分子机制，并通过这类遗传改造从而提高植物对非生物逆境胁迫的耐受性还不清楚。
发明内容
本发明一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质名称为ZmAE1，是如下A1)、A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；
A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与植物抗旱性相关的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质中，序列表中的序列2由799个氨基酸残基组成。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
与ZmAE1相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的与蛋白质ZmAE1相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码ZmAE1的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：
b1)编码链的编码序列是序列表中序列1或序列3的核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
b2)编码链的核苷酸是序列表中序列1或序列3的cDNA分子或DNA分子。
其中，序列表中的序列1由18605个核苷酸组成，T01转录本的读码框为序列1第1134位到第17765位核苷酸，CDS为序列表序列3，编码序列表中的序列2所示的蛋白质。
上述蛋白质或上述生物材料在调控植物抗旱性中的应用也是本发明保护的范围。
降低上述蛋白质活性或含量的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用；或，抑制所述编码ZmAE1的核酸分子表达的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述物质为CRISPR/Cas9系统；
所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：
1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1的靶点为序列1第1356-1374位；
所述sgRNA2的靶点为序列1第1826-1844位；
2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。
ZmAE1基因的核苷酸序列如序列1所示，根据本发明公开的核苷酸序列，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸，得到影响ZmAE1蛋白功能的突变序列。具体地说，本发明的技术方案包括：利用网站设计ZmAE1基因的编辑靶点，根据靶点设计引物，通过PCR、酶切、连接等一系列过程，构建CRISPR/Cas9的载体，将载体转入农杆菌，用农杆菌侵染玉米幼胚的方式得到转化苗，用除草剂和PCR鉴定筛选阳性植株，提取突变体植株DNA进行测序，获得具有突变位点的突变体。突变体经自交繁种后进行旱处理实验。ZmAE1基因可进行编辑的靶点不止一个，经过编辑后的突变基因可能会产生一个或多个核苷酸增加或缺失，导致蛋白部分缺失或提前终止，其中有些突变会影响蛋白质的生物学功能。表达无功能蛋白的突变体植株可能会产生响应干旱胁迫的表型，均属于本发明要求保护的范围。获得突变体后，检测ZmAE1突变体在干旱处理下的表型。
本发明还有一个目的是提供一种培育抗旱转基因植物的方法，为如下1)或2)或3)：
1)所示的方法为包括如下步骤：降低目的植物中所述ZmAE1蛋白质活性或含量，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物；
2)所示的方法为包括如下步骤：抑制目的植物中所述编码ZmAE1的核酸分子的表达，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物；
3)所示的方法为包括如下步骤：对目的植物中所述编码ZmAE1的核酸分子进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物。
上述方法中，所述降低目的植物中上述蛋白质活性或含量、所述抑制目的植物中上述DNA分子表达或所述对目的植物中上述DNA分子进行基因编辑，均通过如下实现：将上述所述CRISPR/Cas9系统导入所述目的植物中。
上述CRISPR/Cas9系统也是本发明保护的范围。
上述中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
本发明提供的ZmAE1基因经CRISPR-Cas9基因编辑技术突变后，干旱处理条件下突变体植株生长明显优于对照植株，说明该基因突变能够显著提高植物抗旱性。本发明实例中采用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得了抗旱植株，与传统育种方式相比时间短，目的性强，为培育和改良抗旱植物新品种提供了基因资源，为阐明ZmAE1在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。
本发明构建的CRISPR-Cas9基因编辑技术突变ZmAE1基因的突变体植物的抗旱能力显著提高，在干旱条件下，其叶片萎蔫程度相较于野生型不明显，叶片相对含水量更高。本发明提供的抗旱植物选育方法，与传统育种方式相比，具有育种时间短，目的性强，显著缩短了抗旱育种的周期，提高了抗旱育种的效率。
附图说明
图1为玉米ZmAE1 CRISPR-Cas9突变位点。其中，WT为野生型玉米，ae1-1和ae1-2均为T2代ZmAE1 CRISPR-Cas9突变株系。
图2为野生型玉米(对照)和ZmAE1 CRISPR-Cas9突变株系干旱处理后植株生长情况照片。其中，WT为野生型玉米，ae1-1和ae1-2均为T2代ZmAE1 CRISPR-Cas9突变株系。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
玉米生态型为B73，记载在如下文献中：Zhang et al.The genetic architectureofnodal rootnumber in maize.Plant Journal,93(6):1032-1044,2018.。
以下实施例中所用转录本为T01，仅作为一个例子，不限制应用中的编辑位点。如未特别指明，实例均按照常规实验条件或产品说明书条件进行。
农杆菌菌株是EHA105。
CRISPR/Cas9载体pBUE411，记载在如下文献中：Xing HL,Dong L,Wang ZP,ZhangHY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ BMC Plant Biol.2014Nov 29；14(1):327；A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing inplants。
主要试剂包括：NEB、Toyobo等生物公司的限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶等；Thermo公司的反转录试剂盒；Magen公司的RNA提取试剂盒；Takara公司的定量PCR试剂；质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒购自天根公司；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸庆大霉素、利福平等抗生素等试剂购自sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由英俊公司完成。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
实施例1、ZmAE1基因的获得及CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建和检测
一、ZmAE1基因的获得
为研究植物抗旱的分子机制，利用CRISPR/Cas9技术从玉米(Zea mays L.)B73基因组中定向突变了ZmAE1基因。
玉米ZmAE1基因由18605个核苷酸(核苷酸序列如序列表序列1所示)组成。T01转录本的读码框为序列1第1134位到第17765位核苷酸，CDS为序列表序列3，编码的蛋白序列为序列表序列2，命名为ZmAE1蛋白。T01转录本由22个外显子组成，读码框第1位到第112位核苷酸，第219位到第364位核苷酸，第609位到第763位核苷酸，第1850位到第1948位核苷酸，第2025位到第2067位核苷酸，第2264位到第2323位核苷酸，第2823位到第2903位核苷酸，第2985位到第3101位核苷酸，第3668位到第3751位核苷酸，第4529位到第4650位核苷酸，第5458位到第5550位核苷酸，第9573位到第9702位核苷酸，第9789位到第9899位核苷酸，第10048位到第10176位核苷酸，第13233位到第13336位核苷酸，第14209位到第14353位核苷酸，第14810位到第14957位核苷酸，第15103位到第15203位核苷酸，第15430位到第15507位核苷酸，第15774位到第15929位核苷酸，第16378位到第16452位核苷酸，第16549位到第16632位核苷酸，其余为其内含子序列。基因来源于B73型玉米，由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同具有抗旱功能的蛋白质均在本发明保护范围内。
二、用于基因编辑ZmAE1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
选取ZmAE1基因中TGCTCGAGTTGGATGTTCG(序列1第1356-1374位)和CCAAGCGATGGACAAAAAA(序列1第1826-1844位)作为该基因的两个靶点，设计包含两个靶点信息的引物:
根据靶点设计出的序列如下：
MT1T2-F:AATAATGGTCTCAGGCGTGCTCGAGTTGGATGTTCG(下划线指示的序列为BsaI酶识别位点序列)；
MT1T2-F0:GTGCTCGAGTTGGATGTTCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；
MT1T2-R0:TTTTTTGTCCATCGCTTGGCGCTTCTTGGTGCC；
MT1T2-R:ATTATTGGTCTCTAAACTTTTTTGTCCATCGCTTGG(下划线指示的序列为BsaI酶识别位点序列)。
载体构建方法：
(1)退火
合成引物，稀释后进行退火，得到带粘性末端的双链DNA片段gRNA，具体为：
将引物M1T12-F和M1T12-F0退火获得带粘性末端的双链DNA片段gRNA1，
将引物M1T12-R和M1T12-R0退火获得带粘性末端的双链DNA片段gRNA2。
(2)pBUE411载体(该载体含有3×FLAG-NLS-zCas9-NLS表达系统和用于插入靶序列的gRNA支架)用BsaI(NEB)酶切，得到酶切后的pBUE411。
表1为酶切体系
Figure BDA0002853151860000061
(3)连接体系
将步骤(1)的带粘性末端的双链DNA片段gRNA1、带粘性末端的双链DNA片段gRNA2和步骤(2)得到的酶切后pBUE411连接，得到连接产物，即为重组CRISPR载体pBCXUN-ZmAE1CRISPR-Cas9，该载体表达sgRNA1和sgRNA2。sgRNA1识别区的编码序列为序列1第1356-1374位，sgRNA2识别区的编码序列为序列1第1826-1844位。
上述连接体系如表2所示：
表2为连接体系
Figure BDA0002853151860000062
(4)鉴定
取5μl步骤(3)得到的连接产物，转化大肠杆菌感受态。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选。菌落PCR鉴定单克隆，PCR鉴定所需引物为MT1T2-F和MT1T2-R。
挑选阳性克隆(得到OsU3-FD3+TaU3-RD＝831bp的克隆为阳性)，提取质粒送去测序。
测序引物为OsU3-FD3和TaU3-FD2：
OsU3-FD3:GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC
TaU3-RD:CTCACAAATTATCAGCACGCTAGTC
[rc:GACTAGCGTGCTGATAATTTGTGAG]
TaU3-FD2:TTGACTAGCGTGCTGATAATTTGTG
测序结果显示，阳性克隆的质粒为重组CRISPR载体pBCXUN-ZmAE1CRISPR-Cas9，该载体表达sgRNA1和sgRNA2，sgRNA1识别区的编码序列为序列1第1356-1374位，sgRNA2识别区的编码序列为序列1第1826-1844位。
实施例2、CRISPR/Cas9基因编辑植株的构建和鉴定
将实施例1中构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体pBCXUN-ZmAE1 CRISPR-Cas9通过热激法转化到感受态农杆菌EHA105菌株中，菌落PCR鉴定出阳性克隆，命名为EHA105/pBCXUN-ZmAE1 CRISPR-Cas9。
将鉴定正确的农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmAE1 CRISPR-Cas9单菌落接种于2-3mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，第二天转接大量含有抗生素的液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，重新悬浮至OD600在0.8-1.0之间。
将重组菌EHA105/pBCXUN-ZmAE1 CRISPR-Cas9采用农杆菌介导法转入硬秆自交系B73(以下也称为野生型玉米)，B73的幼胚进行根癌农杆菌EHA105侵染，将被根癌农杆菌EHA105侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织再生成苗，得到T0代转化苗。构建方法参考：Zhang etal.The genetic architectureofnodal rootnumber in maize.PlantJournal,93(6):1032-1044,2018。
提取T0代转化苗的DNA作为模板进行PCR扩增并测序，以B73玉米为对照。
扩增所需引物为M1T12-F和M1T12-R，得到831bp为阳性。
测序引物为OsU3-FD3。测序结果如图1所示，可以看出，与野生型玉米B73(上图的上面序列和下图的上面序列)相比，T0代转化苗中，突变体ae1-1ZmAE1基因中有1bp的插入(上图的下面序列)，突变体ae1-2ZmAE1基因中有1bp的缺失(下图的下面序列)，突变造成移码，导致蛋白序列改变，蛋白功能被破坏。
将含有该突变形式的转化苗命名为阳性T0代CRISPR-Cas9突变玉米。
阳性T0代CRISPR-Cas9突变玉米经过自交去掉Cas9，培育获得T2代CRISPR-Cas9突变玉米，得到的两个T2株系，相应命名为ae1-1和ae1-2。
实施例3、ZmAE1基因CRISPR-Cas9突变玉米旱处理表型检测
1、在装有110g营养土的小盆中播种T2代CRISPR-Cas9突变玉米种子和野生型玉米B73(WT)种子各3盆，每盆播种4粒种子，覆盖50ml土，吸满水后将托盘中剩余的水倒掉，出苗后将长势不齐一株苗去掉，每盆留3株苗，在托盘里加入1L水，吸满后将水倒掉，持续不浇水14天(干旱处理)。观察对照和转基因植株旱处理表型。
图2显示ZmAE1 CRISPR突变的植株生长状况强于对照，叶片萎蔫程度低于对照，说明转基因植株比对照抗旱。
统计干旱处理14天后，各株系的存活率(将表现为能正常生长植株定义为存活植株，将表现为严重受旱害且不能正常生长的植株定义为死亡植株；存活率为各株系中存活植株数目占总植株数的百分比)，可以看出，T2代CRISPR-Cas9突变玉米干旱处理后的存活率为77％；野生型玉米干旱处理后的存活率为48％。
因此，抑制ZmAE1蛋白表达或者敲除ZmAE1基因能够提高玉米耐旱性。
                         序列表
<110>  中国农业大学
<120>  ZmAE1蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用
<130>  GNCSY203232
<160>  3
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  18605
<212>  DNA
<213>  玉米(Zea mays)
<400>  1
tggcatgaac atgtttatgt tgtaatgttc tacgtcagtg cattatgtaa ttgtgtaatt  60
aatttaaggt tgccctagta gcaatgaaat acaaatctcc atcgggatcg gagggaatta 120
aggtgaaaat gaacttattt tctctccaac cccttcaatc tcgaagggga tttgagtttc 180
caaactagat cctaaaagca agtataataa ggtgatgtag gcgagctgta ggatataaca 240
catcagattt gtgatgatat gaaagaaaaa aaatgaagag agaatgaaag cgaactgttg 300
ctcacggact ctaagatata atataagagg aagagatgag ctaagtatta aatgtataaa 360
tatattttta gttagttata tatgatagga caatatcata aaactcactt tgtgccatat 420
cgttaaactt gctgtagctt caccgttaat cgataaaaaa tattaaaaaa gcatctcccg 480
tttgctcgac tgctcgagtg tgcaaaaaaa aaggcacgac ggacccgcgc gctgacgcgg 540
tgagccgcaa gtccgcaacg gcgcggccgc gcgctaggaa aaaagcctcg cccgtgaagc 600
gaactccctc tccttcgacc ttcgttcttc cactgcggcc tgcgcgaccc gtgcagctgc 660
gcgctccacc tggccgcgcc tggggcccac accgcctggc atctggagca ttgcccccgg 720
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ccacgccacc gcgaagcaca aggtccccgc cctgcacgat cagcaggacc tcgccacgcc 840
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tggggtttta gcattggctg atcagttcga tccgatccgg ctgcgaaggc gagatggcgt      1140
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gggagggtag tctagtcttc cggcacaccg gcctcttctt aactcgtaat gatcctgcaa      1260
ctcctcctcc ctctctgatc aagtgtgggc ctgattcggg tctgtatgcg agtgttgtgg      1320
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cgtcatccac tcgtcacttt catgcatttt atcacataat tcacctgaaa gtctacatct      1560
acatgcattt ctgattttta cctctttttg gatgctattt gagaacaatg agacacacga      1620
ttagtgagat gcccaaacgg ttaaacgttc catggagctc cacaagtctg tactgtacca      1680
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ggtaccagac atttctgaag agacaacgtg cggtgctggt gtggctgatg ctcaagcctt      1800
gaacagagtt cgagtggtcc ccccaccaag cgatggacaa aaaatattcc agattgaccc      1860
catgttgcaa ggctataagt accatcttga gtatcggtat gtattacttg cttctactgc      1920
accactactg aacatttcaa gacgttcccg tctgtcatga tatatataag ggtgtgtttg      1980
gttggggagt gagggagaat agagtggttc cattctaatt ttctggacgt ttagtttcca      2040
acaaaataag agtggagcgg ctcctggatc tccatatgga aatttactat aagtagttgg      2100
aacgctcccg ctccacaaaa acgaccggat gcgagcgctc tctcggacgt gagcgctctc      2160
ctggctctcc tcccctctac actcatacgg ctctcaaacc aaacaaagaa tggaatgact      2220
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gtttggttgg ggagccactg ggatggagcg gctccattcc agtttctaaa aattgagcca      2340
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agcgagagca tcccaaatat ttgctattta tagactccag gaaccgctcc gctctcctcc      2580
atggtaacca aacatcaaaa aaataagaat ggagccgttc cattcccctc cgctcttcaa      2640
ccaaacacat tagtcaggtt cttcatagtg ttgctggaag gtcatatgaa tggcttagtc      2700
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ccatcccttc tgtattcttc ttataaggat tcctatatat aacccatgcg aacaccacta      2940
tccatctcac tgtgctttca acttccttga ataaaagaac aggtacagcc tctatagaag      3000
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gtttggtgtt tgggaaattt ttctgcctaa caatgcagat ggtacatcac ctattcctca      4020
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ttctaataat agtaatttag gcaaagatca attaagctaa tatggtttta tgtgaaatat      4440
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tataataatg tgcttggcaa gttactgttt taattttaca ttaatacaca atacaacaag     11580
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cctgcagtcc tgaactcctg attgccggcg actacaccgg cggctacagc accctgcgtc     12480
ccctcagggc cggccctgga caggtgccgg cggtgcggcc gcaccgggcc tccgagaacc     12540
agagggcccc tccccgtgta tacgtgtatg tgtatatata tagaaaatgt ttatgtagat     12600
tacaacacaa agattgataa aaggccaaag cccatcaacg tacaatatgc atgcctgttt     12660
aaactcgatt acgtacttgg cttctcgtgg acgcttgagc tgcaatcctc tttgccttct     12720
cttggaagcc tccgctcatg ttgtccaggc tacaacaatt gttcggcacc agcagtagca     12780
gctagcagcg acagacggga gggatcatct tgtccgttgc tctgtcatct gcccagacca     12840
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tcgtcaagtc tgctactcta ctttcgttgt tcaattttcg cctcaaacca atctttacta     12960
gttaaatgtt cttttatttc tgagtatagg ttattttgtg ttctgatcac cacattccac     13020
atgcatctag tagtgaaaaa ggaaaaaaac ataaagataa gttcaatgca tcgtagtatt     13080
catatttttt tggtatttgt gatgaatggg gccttaattt ttgtctcgca ccgggccacc     13140
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gcactgctgc agtctccaac cgatggtggc tgcgagccag tgacgagatg agcatgtcat     13260
ctgaaagtcc ttcctgctcc ccacttctcc ccctaaaccc taaataaccc taaaccctaa     13320
gcaacatgtt actttattta tcctagttgt ttgttctaat ttatataatg tatacaggta     13380
tatttatata tatacctata taagtataac tactagtcta ggacgaccag ggaccgacta     13440
ggggtcgact agtcgcccta gtcgtcgcct aatcgcgact agtcgcttgg tcggtcacag     13500
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ccttgtcctg tccctggtgg tccttggaac caaacacaca tttagggaag taatcatctg     13620
acctgcaagc acctgggttc atgcaggtgg ataggatctc agctagaggc tctaccaacc     13680
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accaccgtgt tgtacgcata taccagcgta atctccaaca agggctgtca tgtggaatca     13800
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gagaattaac tccttcccat ctgtagttag atattagaat attagaattg catattttta     13920
tgggttcttg aaggaagtgg caaacctcaa tattgaactc taccaacaca tgtataatat     13980
gaaaaataaa gttatggtat atttacgagt aaatatttct atgccttata acgggaggaa     14040
aaatatcgaa ttttgatatt gacttaatag gacattgtca cgttattgtc aatattaact     14100
tatattatgg atgtcatcac aaaataacta taccttttag tttttaaaga aagggtaaaa     14160
catacatata tttgtaacgt ttccgtccat tttccattaa tgtttgattg tttttttctc     14220
tcttgttgca acatagtgac atgtttgcta gtttgacaaa attagggcaa gatcattggc     14280
ttacataaac caataggaaa tttgaattta tctaaaataa tttgtgagtt ttcttggtta     14340
ttcaaaaatt atataacttg ttcaggttag tggaatgcct acatttgccc ttcctgttca     14400
cgatggtggg gtaggttttg actatcggat gcatatggct gtggctgaca aatggattga     14460
ccttctcaag taagtgtttc atatgtatgt ggacgatcat tattttgttt tattgggctg     14520
cttatttaaa taattatttt ttttggcata aatgttataa gtacatacac taatgtttaa     14580
ttgcatgggc catgtgcata tgtatttttt gttgtatttg tcaccacttt tgtggtttac     14640
tctacatagt cataatgaga taatgtttta tgcacatttg catgtggctg cacttatgat     14700
taacgacaca aaatgtactc gagattgatg tatattttca aacttgaaac taatgaacac     14760
atctgatata cattgtacac tccatgttac aaattataag acgtttttgc atttttagat     14820
atattttttt actatgtatc tagacaaagt gtatatttaa gtgcattgca aaggcaatgc     14880
atctagaaaa gccaaaatgc cttagaattt ggaacggaag gagtaatatt gttgcacaaa     14940
tcttgaagtt ttctatgcat aggatattgc acataccagc aatatatcag tggtgcatat     15000
atattttgta taactaacat tacaccattc actgtgttca tatgttttgt gtttaatttt     15060
ctatacaaaa aatctcttga atctggtact caaatcattt gtataagctt ttgtttcaaa     15120
cgggcaacgc tctatctgta atatgccatc tgcgtaaaag acaagtatgt aattttgtga     15180
tcctttggtt gtgtggttgt cggtgtaacc gggattcttt aaccttttat ccttctttta     15240
tataatgata cacaaactct cctgtgcgtt cgagagaaaa aatgccttct gcattcactt     15300
tgagatatgt ggtgagtttc aatttctatt taaccgcaca ggcaaagtga tgaaacttgg     15360
aagatgggtg atattgtgca cacactgaca aataggaggt ggttagagaa gtgtgtaact     15420
tatgctgaaa gtcatgatca agcattagtc ggcgacaaga ctattgcgtt ttggttgatg     15480
gacaaggtta ccctactcat taattttctt ggtgtactta ttgggacata gatcatgttt     15540
cacgtattgt tttttacaat gattaattct atttgtttct tcaagctcaa ggtgtattca     15600
tggttcccac aaaacaaatg ttttattaaa agcaaagagt tagaactttt gttagttttc     15660
tttaatttgg acttgtgtca ctgtttctct gtcatgactc atgagcatta tagttgcaat     15720
ttcacctaag tgagttcctg tttttggaca gttcagagtg aactacgact tattgtttta     15780
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ataaatggta acatgagaac ctcactggtt ctatttatgc aggatatgta tgatttcatg     15960
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catcg                                                           18605
<210>  2
<211>  799
<212>  PRT
<213>  玉米(Zea mays)
<400>  2
Met Ala Phe Ala Val Ser Gly Ala Val Leu Gly Gly Ala Val Arg Ala
1               5                   10                  15
Pro Arg Leu Thr Gly Gly Gly Glu Gly Ser Leu Val Phe Arg His Thr
            20                  25                  30
Gly Leu Phe Leu Thr Arg Gly Ala Arg Val Gly Cys Ser Gly Thr His
        35                  40                  45
Gly Ala Met Arg Ala Ala Ala Ala Ala Arg Lys Ala Val Met Val Pro
    50                  55                  60
Glu Gly Glu Asn Asp Gly Leu Ala Ser Arg Ala Asp Ser Ala Gln Phe
65                  70                  75                  80
Gln Ser Asp Glu Leu Glu Val Pro Asp Ile Ser Glu Glu Thr Thr Cys
                85                  90                  95
Gly Ala Gly Val Ala Asp Ala Gln Ala Leu Asn Arg Val Arg Val Val
            100                 105                 110
Pro Pro Pro Ser Asp Gly Gln Lys Ile Phe Gln Ile Asp Pro Met Leu
        115                 120                 125
Gln Gly Tyr Lys Tyr His Leu Glu Tyr Arg Tyr Ser Leu Tyr Arg Arg
    130                 135                 140
Ile Arg Ser Asp Ile Asp Glu His Glu Gly Gly Leu Glu Ala Phe Ser
145                 150                 155                 160
Arg Ser Tyr Glu Lys Phe Gly Phe Asn Arg Ser Ala Glu Gly Ile Thr
                165                 170                 175
Tyr Arg Glu Trp Ala Pro Gly Ala Phe Ser Ala Ala Leu Val Gly Asp
            180                 185                 190
Phe Asn Asn Trp Asp Pro Asn Ala Asp Arg Met Ser Lys Asn Glu Phe
        195                 200                 205
Gly Val Trp Glu Ile Phe Leu Pro Asn Asn Ala Asp Gly Thr Ser Pro
    210                 215                 220
Ile Pro His Gly Ser Arg Val Lys Val Arg Met Asp Thr Pro Ser Gly
225                 230                 235                 240
Ile Lys Asp Ser Ile Pro Ala Trp Ile Lys Tyr Ser Val Gln Ala Pro
                245                 250                 255
Gly Glu Ile Pro Tyr Asp Gly Ile Tyr Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Val
            260                 265                 270
Lys Tyr Val Phe Arg His Ala Gln Pro Lys Arg Pro Lys Ser Leu Arg
        275                 280                 285
Ile Tyr Glu Thr His Val Gly Met Ser Ser Pro Glu Pro Lys Ile Asn
    290                 295                 300
Thr Tyr Val Asn Phe Arg Asp Glu Val Leu Pro Arg Ile Lys Lys Leu
305                 310                 315                 320
Gly Tyr Asn Ala Val Gln Ile Met Ala Ile Gln Glu His Ser Tyr Tyr
                325                 330                 335
Gly Ser Phe Gly Tyr His Val Thr Asn Phe Phe Ala Pro Ser Ser Arg
            340                 345                 350
Phe Gly Thr Pro Glu Glu Leu Lys Ser Leu Ile Asp Arg Ala His Glu
        355                 360                 365
Leu Gly Leu Leu Val Leu Met Asp Val Val His Ser His Ala Ser Ser
    370                 375                 380
Asn Thr Leu Asp Gly Leu Asn Gly Phe Asp Gly Thr Asp Thr His Tyr
385                 390                 395                 400
Phe His Ser Gly Pro Arg Gly His His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu
                405                 410                 415
Phe Asn Tyr Gly Asn Trp Glu Val Leu Arg Phe Leu Leu Ser Asn Ala
            420                 425                 430
Arg Trp Trp Leu Glu Glu Tyr Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly
        435                 440                 445
Val Thr Ser Met Met Tyr Thr His His Gly Leu Gln Val Thr Phe Thr
    450                 455                 460
Gly Asn Phe Asn Glu Tyr Phe Gly Phe Ala Thr Asp Val Asp Ala Val
465                 470                 475                 480
Val Tyr Leu Met Leu Val Asn Asp Leu Ile His Gly Leu Tyr Pro Glu
                485                 490                 495
Ala Val Thr Ile Gly Glu Asp Val Ser Gly Met Pro Thr Phe Ala Leu
            500                 505                 510
Pro Val His Asp Gly Gly Val Gly Phe Asp Tyr Arg Met His Met Ala
        515                 520                 525
Val Ala Asp Lys Trp Ile Asp Leu Leu Lys Gln Ser Asp Glu Thr Trp
    530                 535                 540
Lys Met Gly Asp Ile Val His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Leu Glu
545                 550                 555                 560
Lys Cys Val Thr Tyr Ala Glu Ser His Asp Gln Ala Leu Val Gly Asp
                565                 570                 575
Lys Thr Ile Ala Phe Trp Leu Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe Met
            580                 585                 590
Ala Leu Asp Arg Pro Ser Thr Pro Thr Ile Asp Arg Gly Ile Ala Leu
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His Lys Met Ile Arg Leu Ile Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr
    610                 615                 620
Leu Asn Phe Met Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe
625                 630                 635                 640
Pro Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Ser Gly Lys Phe Ile Pro Gly Asn
                645                 650                 655
Asn Asn Ser Tyr Asp Lys Cys Arg Arg Arg Phe Asp Leu Gly Asp Ala
            660                 665                 670
Asp Tyr Leu Arg Tyr His Gly Met Gln Glu Phe Asp Gln Ala Met Gln
        675                 680                 685
His Leu Glu Gln Lys Tyr Glu Phe Met Thr Ser Asp His Gln Tyr Ile
    690                 695                 700
Ser Arg Lys His Glu Glu Asp Lys Val Ile Val Phe Glu Lys Gly Asp
705                 710                 715                 720
Leu Val Phe Val Phe Asn Phe His Cys Asn Asn Ser Tyr Phe Asp Tyr
                725                 730                 735
Arg Ile Gly Cys Arg Lys Pro Gly Val Tyr Lys Val Val Leu Asp Ser
            740                 745                 750
Asp Ala Gly Leu Phe Gly Gly Phe Ser Arg Ile His His Ala Ala Glu
        755                 760                 765
His Phe Thr Ala Asp Cys Ser His Asp Asn Arg Pro Tyr Ser Phe Ser
    770                 775                 780
Val Tyr Thr Pro Ser Arg Thr Cys Val Val Tyr Ala Pro Val Glu
785                 790                 795
<210>  3
<211>  2400
<212>  DNA
<213>  玉米(Zea mays)
<400>  3
atggcgttcg cggtttctgg ggcggtgctc ggtggggccg taagggctcc ccgactcacc  60
ggcggcgggg agggtagtct agtcttccgg cacaccggcc tcttcttaac tcggggtgct 120
cgagttggat gttcggggac gcacggggcc atgcgcgcgg cggccgcggc caggaaggcg 180
gtcatggttc ctgagggcga gaatgatggc ctcgcatcaa gggctgactc ggctcaattc 240
cagtcggatg aactggaggt accagacatt tctgaagaga caacgtgcgg tgctggtgtg 300
gctgatgctc aagccttgaa cagagttcga gtggtccccc caccaagcga tggacaaaaa 360
atattccaga ttgaccccat gttgcaaggc tataagtacc atcttgagta tcggtacagc 420
ctctatagaa gaatccgttc agacattgat gaacatgaag gaggcttgga agccttctcc 480
cgtagttatg agaagtttgg atttaatcgc agcgcggaag gtatcacata tcgagaatgg 540
gctcctggag cattttctgc agcattggtg ggtgacttca acaactggga tccaaatgca 600
gatcgtatga gcaaaaatga gtttggtgtt tgggaaattt ttctgcctaa caatgcagat 660
ggtacatcac ctattcctca tggatctcgt gtaaaggtga gaatggatac tccatcaggg 720
ataaaggatt caattccagc ctggatcaag tactcagtgc aggccccagg agaaatacca 780
tatgatggga tttattatga tcctcctgaa gaggtaaagt atgtgttcag gcatgcgcaa 840
cctaaacgac caaaatcatt gcggatatat gaaacacatg tcggaatgag tagcccggaa 900
ccgaagataa acacatatgt aaactttagg gatgaagtcc tcccaagaat aaaaaaactt 960
ggatacaatg cagtgcaaat aatggcaatc caagagcact catattatgg aagctttgga      1020
taccatgtaa ctaatttttt tgcgccaagt agtcgttttg gtaccccaga agaattgaag      1080
tctttgattg atagagcaca tgagcttggt ttgctagttc tcatggatgt ggttcatagt      1140
catgcgtcaa gtaatactct ggatgggttg aatggttttg atggtacaga tacacattac      1200
tttcacagtg gtccacgtgg ccatcactgg atgtgggatt ctcgcctatt taactatggg      1260
aactgggaag ttttaagatt tcttctctcc aatgctagat ggtggctcga ggaatataag      1320
tttgatggtt tccgttttga tggtgtgacc tccatgatgt acactcatca cggattacaa      1380
gtaacattta cggggaactt caatgagtat tttggctttg ccaccgatgt agatgcagtg      1440
gtttacttga tgctggtaaa tgatctaatt catggacttt atcctgaggc tgtaaccatt      1500
ggtgaagatg ttagtggaat gcctacattt gcccttcctg ttcacgatgg tggggtaggt      1560
tttgactatc ggatgcatat ggctgtggct gacaaatgga ttgaccttct caagcaaagt      1620
gatgaaactt ggaagatggg tgatattgtg cacacactga caaataggag gtggttagag      1680
aagtgtgtaa cttatgctga aagtcatgat caagcattag tcggcgacaa gactattgcg      1740
ttttggttga tggacaagga tatgtatgat ttcatggccc tcgatagacc ttcaactcct      1800
accattgatc gtgggatagc attacataag atgattagac ttatcacaat gggtttagga      1860
ggagagggct atcttaattt catgggaaat gagtttggac atcctgaatg gatagatttt      1920
ccaagaggtc cgcaaagact tccaagtggt aagtttattc cagggaataa caacagttat      1980
gacaaatgtc gtcgaagatt tgacctgggt gatgcagact atcttaggta tcatggtatg      2040
caagagtttg atcaggcaat gcaacatctt gagcaaaaat atgaattcat gacatctgat      2100
caccagtata tttcccggaa acatgaggag gataaggtga ttgtgttcga aaagggagat      2160
ttggtatttg tgttcaactt ccactgcaac aacagctatt ttgactaccg tattggttgt      2220
cgaaagcctg gggtgtataa ggtggtcttg gactccgacg ctggactatt tggtggattt      2280
agcaggatcc atcacgcagc cgagcacttc accgccgact gttcgcatga taataggcca      2340
tattcattct cggtttatac accaagcaga acatgtgtcg tctatgctcc agtggagtga      2400

Claims (4)

1.蛋白质ZmAE1或与所述蛋白质ZmAE1相关的生物材料在调控植物抗旱性中的应用；
所述蛋白质ZmAE1，是如下A1)或A2)的蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质；
A2)在A1)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质；
所述生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)编码ZmAE1的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
所述植物为单子叶植物；
所述调控为敲除所述蛋白质ZmAE1的编码基因以提高植物的抗旱性。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，B1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：
b1)编码链的编码序列是序列表中序列3的核苷酸的DNA分子；
b2)编码链的核苷酸是序列表中序列3的DNA分子。
3.抑制权利要求1所述编码ZmAE1的核酸分子表达的物质在提高植物抗旱性或培育抗旱植物中的应用，所述物质为CRISPR/Cas9系统；
所述CRISPR/Cas9系统包括如下1)或2)：
1)sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；
所述sgRNA1的靶点为序列1第1356-1374位；
所述sgRNA2的靶点为序列1第1826-1844位；
2)表达1)所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。
4.一种培育抗旱转基因植物的方法，为如下1)或2)或3)：
1)为包括如下步骤：降低目的植物中权利要求1所述蛋白质ZmAE1含量，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物；
2)为包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求1所述编码ZmAE1的核酸分子的表达，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物；
3)为包括如下步骤：对目的植物中权利要求1所述编码ZmAE1的核酸分子进行基因编辑，使所述蛋白质翻译提前终止，得到抗旱性高于所述目的植物的转基因植物；
所述植物为单子叶植物；
1)所述降低目的植物中权利要求1所述蛋白质ZmAE1含量、2)所述抑制目的植物中权利要求1所述编码ZmAE1的核酸分子的表达或3)所述对目的植物中权利要求1所述编码ZmAE1的核酸分子进行基因编辑，均通过如下实现：将权利要求3中所述CRISPR/Cas9系统导入所述目的植物中。
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