CN113999858B - 一种调控谷子生长发育的SiPLATZ12基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控谷子生长发育的SiPLATZ12基因及其应用。本发明从谷子中分离和克隆到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因SiPLATZ12，将该基因在谷子中超量表达后，得到株高变矮、茎杆变粗、穗和籽粒显著增大的转基因植株，具体表现为：超表达SiPLATZ12基因的株系与野生型株系相比，谷子的株高和穗位茎长明显降低，谷子的茎宽、单穗的穗长、穗宽和单穗产量、籽粒的粒长、粒宽和千粒重均明显增加，从而能够实现促进谷子穗和籽粒发育而提高谷子产量的作用。因此，SiPLATZ12基因对于提高谷子产量具有重要的理论及实际意义，将在作物高产品种改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一种调控谷子生长发育的SiPLATZ12基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种调控谷子生长发育的SiPLATZ12基因及其应用。

背景技术

谷子属于禾本科黍亚科狗尾草属，被誉为“五谷之首”，是重要的粮食作物。谷子具有丰富的营养，其蛋白质含量高，籽粒中含有17种氨基酸，不饱和脂肪酸约占85％，且含有丰富的维生素A、B1、B2和E、铁、镁、硒等微量元素。谷子是自花授粉的二倍体C4植物，基因组小，生长周期短，单穗结实多，目前已经获得了多套参考基因组；作为我国起源的特色杂粮作物，目前正在发展成为禾本科尤其是黍亚科作物功能基因研究的模式作物，是禾本科作物C4光合和逆境响应研究的优良研究材料。

PLATZ是植物特有的一类转录因子，首次是在豌豆中发现的。豌豆PLATZ1是一种锌离子依赖的DNA结合蛋白，能非特异地结合在富含A/T碱基的序列上发挥转录抑制的作用。PLATZ1具有C-x2-H-x11-C-x2-C-x(4-5)-C-x2-C-x(3-7)-H-x2-H和C-x2-C-x(10-11)-C-x3-C两个锌指结构域。在拟南芥中，PLATZ共有12个同源基因，其中AtPLATZ1和AtPLATZ2参与调节种子脱水耐性，AtPLATZ3调控叶的大小和衰老，AtPLATZ负调控拟南芥的耐盐性和生长。玉米中PLATZ1(FL3)参与调控胚乳发育。棉花中PLATZ1响应渗透胁迫和盐胁迫。PLATZ家族基因在植物的生长发育过程中起着非常重要且独特的作用。因此，对于PLATZ家族蛋白的研究具有十分重要的意义。但目前谷子中PLATZ家族成员尚未有报道。

发明内容

本发明提供了一种调控谷子生长发育的SiPLATZ12基因及其应用。本发明从谷子中分离和克隆到SiPLATZ12基因，将其全长cDNA连接到35S启动子启动的表达载体上，利用农杆菌侵染转化谷子，实验证实SiPLATZ12基因能使谷子表现出株高变矮、茎杆变粗、籽粒明显增大的表型，显著提高了谷子单株产量。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种调控谷子生长发育的SiPLATZ12基因，所述SiPLATZ12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述SiPLATZ12基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其编码产生的PLATZ12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了所述的SiPLATZ12基因在促进谷子穗和籽粒发育及提高谷子产量中的应用。

进一步的，将含有SiPLATZ12基因的超表达载体转化到谷子中获得具有株高变矮、茎杆变粗、穗和籽粒增大，且高产量的谷子株系。

进一步的，所述含有SiPLATZ12基因的超表达载体是通过提取谷子RNA、RNA反转录成cDNA、基因克隆，再与35S启动的pCAMBIA 1305.1表达载体连接获得的。

进一步的，所述基因克隆的引物序列为：

P1：5′-ATGGCAATCGAAGATGAATCG-3′；

P2：5′-GAACTCCACCATGAGGCTGC-3′。

进一步的，超表达SiPLATZ12基因的株系与野生型株系相比，谷子的株高和穗位茎长明显降低，谷子的茎宽明显增加。

进一步的，超表达SiPLATZ12基因的株系与野生型株系相比，谷子单穗的穗长、穗宽和单穗产量明显增加，从而提高谷子产量。

进一步的，在不同的谷子发育时期，超表达SiPLATZ12基因的株系的谷子籽粒的粒长、粒宽和千粒重均明显高于野生型株系，从而促进谷子籽粒发育。

进一步的，所述谷子发育时期包括谷子的营养生长期、授粉期、花粉期、灌浆期、成熟前期、成熟后期。

进一步的，在不同的谷子发育时期，包括植株生长期、授粉期、花粉期、灌浆期、成熟前期、成熟后期，SiPLATZ12均能够促进谷子生长发育。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

本发明将SiPLATZ12基因全长cDNA连接到35S启动的1305.1表达载体上，利用农杆菌侵染转化谷子，经实验验证SiPLATZ12基因过表达可以使模式植物谷子转基因株系籽粒增大，穗长、穗重明显增加，千粒重明显增加，并且明显提高单株产量。SiPLATZ12基因属于植物中特有的PLATZ家族基因。鉴于SiPLATZ12基因在植物中的保守性以及在转基因谷子呈现的表型，能够认为该基因具有潜在的应用价值。SiPLATZ12基因对于提高谷子产量具有重要的理论及实际意义，将在作物高产品种改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

附图说明

图1是构建的表达载体的示意图以及酶切位点。其中，表达载体为1305.1，启动子为35S，目的基因SiPLATZ12两端的酶切位点分别为BglII和PmlI。

图2A为克隆得到目的基因SiPLATZ12的示意图，大小为756bp；图2B为目的基因连到1305.1表达载体所得到的阳性克隆；图2C为带有SiPLATZ12基因的表达载体质粒酶切结果示意图。

图3为转基因株系阳性苗表达量鉴定。

图4A、4B、4C分别为转基因株系35S::SiPLATZ12与野生型Ci846成苗、茎宽和穗位茎长度示意图；图4D、4E、4F分别为转基因株系35S::SiPLATZ12与野生型Ci846株高、茎宽和穗位茎长度的统计数据。

图5A、5B分别为转基因株系35S::SiPLATZ12与野生型Ci846的穗、小穗发育示意图；图5C、5D、5E、5F分别为转基因株系35S::SiPLATZ12与野生型Ci846穗长、穗宽、单穗产量、单穗重的统计数据。

图6为转基因株系35S::SiPLATZ12与野生型Ci846不同种子发育阶段示意图。

图7A为转基因株系35S::SiPLATZ12与野生型Ci846成熟种子大小示意图；

图7B、7C、7D分别为转基因株系35S::SiPLATZ12与野生型Ci846穗长、穗宽、单穗重的统计数据。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

实施例1：SiPLATZ12转基因株系的获得

一、谷子SiPLATZ12基因的序列分析、克隆与载体构建：

本发明利用谷子基因组数据库网站phytozome找到基因SiPLATZ12，利用NCBI分析可知，此基因与所有的PLATZ蛋白家族成员一样，具有保守的锌指结构域。SiPLATZ12基因组序列全长为1827bp(序列如SEQ ID NO.1所示)，CDS序列为756bp(序列如SEQ ID NO.2所示)，其编码产生的PLATZ12蛋白的序列如SEQ ID NO.3所示。

根据SiPLATZ12基因的CDS序列设计引物，进行克隆，克隆方法如下：

(1)RNA的提取：使用百泰克通用植物总RNA提取试剂盒提取谷子的总RNA。

(2)反转录cDNA第一链的合成：将提取的RNA溶解后测定RNA浓度，然后使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒进行反转录。

取5μg总RNA，加入2×反应缓冲液10μL，引物oligo dT(0.5μg/μL)1μL，反转录酶1μL，去基因组酶1μL，补水到20μL，在42℃孵育30分钟，85℃酶失活5分钟。

(3)SiPLATZ12基因的克隆：

上游引物5’-CCATGGATGGCAATCGAAGATGAATCG-3’(SEQ ID NO.4)；

下游引物5’-CACGTGGAACTCCACCATGAGGCTGC-3’(SEQ ID NO.5)；

其中下划线处为酶切位点，上游引物的酶切位点为BglII，下游引物的酶切位点为PmlI。

使用诺唯赞高保真酶(Vazyme#P505)进行扩增，反应体系为：2×反应缓冲液12.5μL，脱氧核糖核酸(dNTP)0.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，高保真酶0.5μL，cDNA模板1μL，水补齐到25μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃后延伸5分钟；16℃保温。

反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测到目的条带后，如图2A所示，切胶并进行胶回收，胶回收方法根据BioTeke公司的快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Cat#DP1722)进行。

(4)取上述3.5μL胶回收产物与35S启动的pCAMBIA 1305.1表达载体进行连接(图1)，操作步骤按照新赛美公司的产品EasyFusion Assembly Master Mix说明书进行。连接产物使用热激法转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有卡那霉素的LB平板上生长过夜，得到的阳性克隆如图2B所示。挑取白色单个菌落进行菌落PCR，反应体系同上，选取阳性菌落在LB液体培养基中过夜。

(5)质粒DNA的提取：使用康为世纪高纯度质粒小提取试剂盒(CW0500A)提取质粒DNA。

(6)序列测定：将提取的质粒DNA送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。

二、谷子SiPLATZ12的遗传转化和纯合转基因株系的筛选

取2μL已经构建好的载体质粒转化至农杆EHA105，侵染谷子胚性愈伤组织细胞。谷子胚性愈伤组织细胞来自谷子的野生型品种Ci846。通过潮霉素筛选，得到35S::SiPLATZ12/Ci846的过表达材料。通过RT-qPCR检测，获得#22、#24、#28三个稳定过表达的转基因材料。

实施例2：SiPLATZ12影响植株生长发育

一、过表达SiPLATZ12转基因株系的发育表型

1、将野生型谷子Ci846作为对照，对获得的纯合转基因材料35S::SiPLATZ12进行SiPLATZ12基因表达量检测。结果如图3所示，与野生型Ci846相比，转基因材料35S::SiPLATZ12#22、#24和#28中的SiPLATZ12基因的表达量均明显上升，证明本发明确实获得了过表达SiPLATZ12的谷子转基因株系。

2、将谷子转基因株系35S::SiPLATZ12和野生型谷子Ci846于相同条件下进行栽培种植。对生长发育期间的转基因株系35S::SiPLATZ12与野生型Ci846的成苗、株高、茎宽、穗位茎长进行观察，并统计，结果如图4所示，与野生型相比，谷子转基因株系的株高和穗位茎长明显降低，而茎宽则明显增长，具体表现为株高降低约36.3％，茎宽增加约40.7％，穗位茎变短。

对转基因株系35S::SiPLATZ12与野生型Ci846的同时期未成熟穗及小穗进行观察比较，并对穗长、穗宽进行测量统计，结果如图5所示，与野生型相比，谷子转基因株系的穗长和穗宽以及单穗重量均明显增加，且穗显著增大，具体表现为单穗穗长约32.2％、穗宽增加约36.7％、单穗重量增加约24.5％。

二、过表达SiPLATZ12转基因株系籽粒发育表型

收集并在实体解剖镜下对不同发育时期(授粉期、花粉期、灌浆期、成熟前期、成熟后期)的转基因株系与野生型Ci846籽粒进行形态观察，结果如图6所示，在任何发育时期，转基因株系的籽粒均较野生型Ci846籽粒明显增大。

对成熟后的转基因株系与野生型Ci846的种子进行观察比较，并对粒宽、粒长、千粒重进行测量和统计，结果如图7所示，过表达SiPLATZ12的转基因株系的粒长、粒宽、千粒重均高于野生型，具体表现为粒长增加约29.7％、粒宽增加约36.5％，千粒重增加约40.3％。

上述结果表明，SiPLATZ12基因可以显著提高谷子籽粒的大小和千粒重，以及提高谷子的穗长、穗重和单株产量，进而SiPLATZ12基因在提高谷子产量上具有重要的意义。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种调控谷子生长发育的SiPLATZ12基因及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1827

<212> DNA

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 1

cacaccggtg ctgtgatact tgtcgctgct tgctttcctt tcccccgccc ggtctacaaa 60

gacctcagct ttcctacccc cacttctttc ttccaaagcc tcgccttttt cccttcctct 120

cgtcttccct ctcgtctctc tctctctccc tccaaatccc tccttccttc tctctttcca 180

cattcatcct gctctgcagc tagctgcttt ggttgaggat cggaaatggc aatcgaagat 240

gaatcgccgc agctcagagt caacaccacc agaggcggcg ccatgggagg aggggagtgc 300

gacggggcgg agaaccagcg gtggccgccg tggctcaagc cgctgctggg gacgagcttc 360

ttcggtcaat gcaagctgca cgcggacgcg cacaagagcg agtgcaacat gtactgcctc 420

gactgcatga acggcgcact ctgctcccag tgcctcgcct accaccgcga tcaccacgcc 480

atccagatac ggaggtcctc ctaccacgac gtgatccggg tgtcggagat tcagaaggtg 540

ctggacatca ccggcgtgca gacgtacatc atcaacagcg cgcgcgtggt gttcctgaac 600

gagcgcccgc agccgaggcc cggcaagggc gtcaccaaca cctgcgaggt ctgcgagcgc 660

agcctcctcg acaccttccg cttctgctcc ctcggctgca agatcgtggg cacctccggc 720

gagttccgca tccggaagaa gcacgccgcc atcaagaaga agaagaagct gccgcacaag 780

ggcggcgccg cggcggcggc ggcgtcggac tcggaggacg actcgtcgac gagcacgagc 840

ggcgggagcg acaagagcag cgtggtgcag agcttcaccc cgtcgacccc gccggccacc 900

gccaacagct tccgcaccgg gaagcggcgc aagggcgtgc cgcaccggtc gccgttcggc 960

agcctcatgg tggagttcta gaacgcggcc acgcggccgc ccctcgccaa ggaagaaacc 1020

agcggtacac cacaccactg tagcatacgc acccctacat accatactac tctatagctg 1080

ttggatcgac cgatctgcat accatagcca gccaaaaagg aggtaatgca agcaataacg 1140

aagggcccca ttgcacgcct gcgcttctgg taggtttcaa aaaaaagagg aggccggtgc 1200

agtgcggcac ggttacttca catagtagtc ttactgtgct agtgggcctt gtttagttgg 1260

ccaatttggg agatgcaaaa ttcctgttcc agcactgtag cacactgtag cgtttcgttt 1320

gtatttgtga attattgtcc aaatattgac taattaggct caaaagattc gtctcgcaaa 1380

gtacaacaaa actgtgcaat tagtttttaa tttcatctac atttagtact acatgcatgt 1440

accgtaagtt tgatgtgatg gggaatcttc tttttgcata gtgtcaaaat tgggagttgg 1500

ggagtaacta aacatggcct aacaaacggt ttgggtctgg taccagcctc tgaaaggaaa 1560

acgaggtagt tgtggcagtt actctctcct ccctcctctc gtcatcagtc cctactccct 1620

actaagtttt gcgagtttta ccataggggt tttctctagt taccagtgct tgatgtagta 1680

gtagtagctg tacatattca tatatactgt cacagatgag atggggaatg gtaggagtcg 1740

agctccggtg ttcatattcg tgtgtaataa agagatataa gaatgctgct cctggatggc 1800

cttcaatgtc aaatgtggtt cgcttgc 1827

<210> 2

<211> 756

<212> DNA

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 2

atggcaatcg aagatgaatc gccgcagctc agagtcaaca ccaccagagg cggcgccatg 60

ggaggagggg agtgcgacgg ggcggagaac cagcggtggc cgccgtggct caagccgctg 120

ctggggacga gcttcttcgg tcaatgcaag ctgcacgcgg acgcgcacaa gagcgagtgc 180

aacatgtact gcctcgactg catgaacggc gcactctgct cccagtgcct cgcctaccac 240

cgcgatcacc acgccatcca gatacggagg tcctcctacc acgacgtgat ccgggtgtcg 300

gagattcaga aggtgctgga catcaccggc gtgcagacgt acatcatcaa cagcgcgcgc 360

gtggtgttcc tgaacgagcg cccgcagccg aggcccggca agggcgtcac caacacctgc 420

gaggtctgcg agcgcagcct cctcgacacc ttccgcttct gctccctcgg ctgcaagatc 480

gtgggcacct ccggcgagtt ccgcatccgg aagaagcacg ccgccatcaa gaagaagaag 540

aagctgccgc acaagggcgg cgccgcggcg gcggcggcgt cggactcgga ggacgactcg 600

tcgacgagca cgagcggcgg gagcgacaag agcagcgtgg tgcagagctt caccccgtcg 660

accccgccgg ccaccgccaa cagcttccgc accgggaagc ggcgcaaggg cgtgccgcac 720

cggtcgccgt tcggcagcct catggtggag ttctag 756

<210> 3

<211> 251

<212> PRT

<213> 谷子(Setaria italica)

<400> 3

Met Ala Ile Glu Asp Glu Ser Pro Gln Leu Arg Val Asn Thr Thr Arg

1               5                   10                  15

Gly Gly Ala Met Gly Gly Gly Glu Cys Asp Gly Ala Glu Asn Gln Arg

            20                  25                  30

Trp Pro Pro Trp Leu Lys Pro Leu Leu Gly Thr Ser Phe Phe Gly Gln

        35                  40                  45

Cys Lys Leu His Ala Asp Ala His Lys Ser Glu Cys Asn Met Tyr Cys

    50                  55                  60

Leu Asp Cys Met Asn Gly Ala Leu Cys Ser Gln Cys Leu Ala Tyr His

65                  70                  75                  80

Arg Asp His His Ala Ile Gln Ile Arg Arg Ser Ser Tyr His Asp Val

                85                  90                  95

Ile Arg Val Ser Glu Ile Gln Lys Val Leu Asp Ile Thr Gly Val Gln

            100                 105                 110

Thr Tyr Ile Ile Asn Ser Ala Arg Val Val Phe Leu Asn Glu Arg Pro

        115                 120                 125

Gln Pro Arg Pro Gly Lys Gly Val Thr Asn Thr Cys Glu Val Cys Glu

    130                 135                 140

Arg Ser Leu Leu Asp Thr Phe Arg Phe Cys Ser Leu Gly Cys Lys Ile

145                 150                 155                 160

Val Gly Thr Ser Gly Glu Phe Arg Ile Arg Lys Lys His Ala Ala Ile

                165                 170                 175

Lys Lys Lys Lys Lys Leu Pro His Lys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala

            180                 185                 190

Ala Ser Asp Ser Glu Asp Asp Ser Ser Thr Ser Thr Ser Gly Gly Ser

        195                 200                 205

Asp Lys Ser Ser Val Val Gln Ser Phe Thr Pro Ser Thr Pro Pro Ala

    210                 215                 220

Thr Ala Asn Ser Phe Arg Thr Gly Lys Arg Arg Lys Gly Val Pro His

225                 230                 235                 240

Arg Ser Pro Phe Gly Ser Leu Met Val Glu Phe

                245                 250

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccatggatgg caatcgaaga tgaatcg 27

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacgtggaac tccaccatga ggctgc 26

Claims (7)

1.SiPLATZ12基因在用于促进谷子穗和籽粒发育及提高谷子产量中的应用，其特征在于：所述SiPLATZ12基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将含有SiPLATZ12基因的超表达载体转化到谷子中获得具有株高变矮、茎杆变粗、穗和籽粒增大，且高产量的谷子株系。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述含有SiPLATZ12基因的超表达载体是通过提取谷子RNA、RNA反转录成cDNA、基因克隆，再与35S启动的pCAMBIA 1305.1表达载体连接获得的。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因克隆的引物序列为：

P1：5′-ATGGCAATCGAAGATGAATCG-3′；

P2：5′-GAACTCCACCATGAGGCTGC-3′。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，超表达SiPLATZ12基因的株系与野生型株系相比，谷子的株高和穗位茎长明显降低，谷子的茎宽明显增加。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，超表达SiPLATZ12基因的株系与野生型株系相比，谷子单穗的穗长、穗宽和单穗产量明显增加，从而提高谷子产量。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，超表达SiPLATZ12基因的株系与野生型株系相比，谷子籽粒的粒长、粒宽和千粒重均明显增加，从而促进谷子籽粒发育。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在不同的谷子发育时期，包括授粉期、花粉期、灌浆期、成熟前期、成熟后期，SiPLATZ12均能够促进谷子籽粒生长发育。

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