CN114656537B

CN114656537B - Grmzm2g071330蛋白及其应用

Info

Publication number: CN114656537B
Application number: CN202011527967.7A
Authority: CN
Inventors: 王瑜; 巩志忠; 王亚琳
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2023-02-21
Anticipated expiration: 2040-12-22
Also published as: CN114656537A

Abstract

本发明公开了一种GRMZM2G071330蛋白及其应用，本发明提供的GRMZM2G071330蛋白过表达后，干旱处理条件下转基因植株生长明显差于野生型。本发明实例中采用转基因过表达技术获得了敏感的植株，与传统育种方式相比时间短，目的性强，为培育和改良抗旱植物新品种提供了基因资源，为阐明GRMZM2G071330在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。

Description

GRMZM2G071330蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种GRMZM2G071330蛋白及其应用。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是禾本科的一年生草本植物。又名苞谷、苞米棒子、玉蜀黍、珍珠米等。原产于中美洲和南美洲，它是世界重要的粮食作物，广泛分布于美国、中国、巴西和其他国家。由于玉米与传统的水稻、小麦等粮食作物相比，玉米具有很强的耐旱性，故而玉米的种植区域分配上，我国一半以上玉米种植在西北、西南、华北和东北地区依靠自然降水的旱地上，水分流失快且降水变率也很大,严重影响玉米的生长。玉米是我国主要的粮食作物和饲料作物，常年种植面积2450万hm²左右，其抗旱性研究对解决我国的玉米产量问题意义重大。如何找到在玉米过表达株系中的干旱相关基因，研究其基因功能及信号转导途径，通过干旱相关基因的研究，对玉米进行改良，改善玉米的抗旱性，提高玉米的产量有着十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新蛋白GRMZM2G071330蛋白及其应用GRMZM2G071330蛋白及其应用。

本发明提供一种GRMZM2G071330蛋白，所述GRMZM2G071330蛋白为如下b1)-b3)任意一种蛋白质：

b1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2的蛋白质；

b2)将序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同生物学功能的蛋白质；

b3)与序列表中SEQ ID No.2限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同一性，来源于玉米且具有相同生物学功能的蛋白质。

本发明提供所述GRMZM2G071330蛋白的相关生物材料，所述相关生物材料为下述B1)至B9)中的任意一种：

B1)编码权利要求2所述GRMZM2G071330蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)提高或促进所述GRMZM2G071330蛋白表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、85％、86％、88％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述B1)至B9)中的任意一种所述GRMZM2G071330蛋白的相关生物材料也属于本发明的保护范围之内。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述植物表达载体具体可为pBCXUN载体。

上述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码GRMZM2G071330蛋白的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。

可选的，玉米GRMZM2G071330基因由1818个核苷酸组成，转录本的读码框为自5'端第601位到第1218位核苷酸。该基因由1个外显子组成，其中转录本编码外显子1个，读码框第1位到第618位核苷酸，其余为其内含子序列。基因来源于B73-329型玉米，在玉米基因组数据库中的编号为GRMZM2G071330。由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同蛋白质均在本专利保护范围内。

所述B1)的核酸分子为如下a1)-a3)中的任意一种：

a1)编码区如SEQ ID No.1中第601-1218位所示的DNA分子；

a2)核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；

a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于玉米且编码所述GRMZM2G071330蛋白的DNA分子。

本发明还提供一种培育干旱敏感植物的方法，包括促进或提高目的植物中GRMZM2G071330蛋白的核酸的表达，得到干旱敏感植物，所述目的植物为含有所述GRMZM2G071330蛋白的核酸的植物，所述干旱敏感植物的抗旱性低于所述目的植物的抗旱性；其中所述蛋白为GRMZM2G071330蛋白，所述GRMZM2G071330蛋白为如下b1)-b3)任意一种蛋白质：

b1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2的蛋白质；

本发明还提供一种培育抗旱植物的方法，包括抑制或降低目的植物中GRMZM2G071330蛋白的核酸的表达，得到抗旱植物，所述目的植物为抑制或者降低所述GRMZM2G071330蛋白表达的植物，所述抗旱植物的抗旱性高于所述目的植物的抗旱性。

所述的相关生物材料在调控植物抗旱性中的应用也应在本发明的保护范围之内。

所述的相关生物材料在选育抗旱植物品种中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中所述蛋白质的含量和/或活性，从而使植物对干旱敏感性增高。

上文中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

所述植物为禾本科植物。

所述植物为玉米。

本发明提供的GRMZM2G071330基因过表达后，干旱处理条件下转基因植株生长明显差于野生型。本发明实例中采用转基因过表达技术获得了敏感的植株，与传统育种方式相比时间短，目的性强，为培育和改良抗旱植物新品种提供了基因资源，为阐明GRMZM2G071330在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。本发明构建的过表达GRMZM2G071330基因的转基因植物的抗旱能力显著减弱，在干旱条件下，具有更好的生长状况，其叶片抗旱程度明显减弱。本发明提供的抗旱植物选育的方法，与传统育种方式相比，具有育种时间短，目的性强，显著缩短了抗旱育种的周期，提高了抗旱育种的效率。

附图说明

图1，对照和GRMZM2G071330过表达株系干旱处理表型，其中WT为作为对照的野生型，OE-1和OE-2为GRMZM2G071330过表达株系。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

玉米生态型为B73；农杆菌菌株是EHA105。主要试剂包括：NEB、Toyobo等生物公司的限制性内切酶、DNA聚合酶、T4连接酶等；Thermo公司的反转录试剂盒；Magen公司的RNA提取试剂盒；Taraka公司的定量PCR试剂；质粒提取试剂盒以及DNA回收试剂盒购自天根公司；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素、卡那霉素、硫酸庆大霉素、利福平等抗生素等试剂购自sigma；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂；引物合成和测序由英俊公司完成。

实施例1

1.玉米GRMZM2G071330蛋白的发现

在玉米B73-329中发现一种与植物耐旱相关的新蛋白，命名为GRMZM2G071330，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

在玉米B73-329基因组DNA中，对应的玉米GRMZM2G071330基因由1818个核苷酸组成，T01转录本的读码框为自5'端第601位到第1218位核苷酸。该基因由1个外显子组成，其中T01转录本编码外显子1个，读码框第1位到第618位核苷酸，其余为其内含子序列。基因来源于B73-329型玉米，在玉米基因组数据库中的编号为GRMZM2G071330。由于玉米同一DNA段序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同蛋白质均在本专利保护范围内。

2.GRMZM2G071330基因过表达载体的构建

将序列表中的序列1中第601位到第1218位核苷酸所示的DNA分子插入到pBCXUN载体中，得到重组质粒pBCXUN-GRMZM2G071330，并进行测序验证。重组质粒pBCXUN-GRMZM2G071330中，序列表的序列1中第601位到第1218位核苷酸所示的DNA分子由Ubi启动子启动并由Nos终止子终止，从而表达GRMZM2G071330蛋白。

pBCXUN载体是将pCXUN载体(GenBank:FJ905215.1，06-JUL-2009)的HYG基因(hptII，潮霉素抗性基因)替换为Bar基因(编码膦丝菌素乙酰转移酶)(GenBank:MG719235.1中的第284-835位核苷酸，02-OCT-2018)，保持pCXUN的其它核苷酸不变得到的表达载体。

3.GRMZM2G071330基因过表达玉米旱处理表型检测

选取T3代植株中的转基因株系OE1和OE2(构建方法如下所示)的种子、并以玉米B73的种子作为野生型对照，进行玉米旱处理表型检测，对照及转基因植株各5盆重复，重复实验三次。

具体步骤为：

1、在每个小盆中加入100g土，托盘里加上水，每小盆放4粒种子，覆盖50ml土，吸满水后将托盘中剩余的水倒掉，出苗后将长势不齐的一棵苗去掉，在托盘里加入1L水，吸满后将水倒掉，开始旱处理，观察对照和转基因植株旱处理表型，一周后结果如图1所示。图1显示转基因过表达GRMZM2G071330的植株生长状况弱于对照，叶片萎蔫程度高于对照，说明转基因植株比对照植株对干旱敏感。

2、在步骤1的基础上，持续不浇水20天，恢复正常浇水并培养7天，然后统计存活率。活率即存活植株占总植株数量的百分比。记过表明，取T3代植株中的转基因株系OE1的存活率为23.45％，取T3代植株中的转基因株系OE2的存活率为22.94％，野生型的的存活率为45.11％。

4.GRMZM2G071330基因过表达植物的构建

3.1将pBCXUN-GRMZM2G071330过表达质粒通过热激法转化到感受态农杆菌EHA105菌株中，菌落PCR鉴定出阳性克隆，得到重组农杆菌。

3.2将重组农杆菌单菌落接种于2-3mL含有100μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的液体培养基中，28℃振荡培养过夜，第二天转接大量含有抗生素的液体培养基中震荡培养，转接几次后收集菌体，重新悬浮至OD₆₀₀在0.8-1.0之间。采用获得的重组农杆菌菌悬液侵染无菌条件下扒出的B73玉米幼胚后，诱导愈伤成苗，得到T₀代再生植株。

3.3转基因植株经自交繁种后获得T3代进行后续实验。其中T3代植株的培育方法为：将T₀代再生植株进行PCR鉴定，筛选获得转基因植株；将T₀代转基因植株自交，得到的种子即为T₁代种子，T₁代种子长成的植株即为T₁代植株；将T₁代植株自交，得到的种子即为T₂代种子，T₂代种子长成的植株即为T₂代植株；将T₂代植株自交，得到的种子即为T₃代种子，T₃代种子长成的植株即为T₃代植株。

转基因植株的筛选方法为：提取植株叶片的基因组DNA，，采用UbiP-seq(对应于Ubi启动子中)和NosR-seq(对应于Nos终止子中)组成的引物对进行PCR扩增，如果得到特异性扩增产物，该植株为转基因植株。其中UbiP-seq:

TTTTAGCCCTGCCTTCATACGC；NosR-seq:AGACCGGCAACAGGATTCAATC。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> GRMZM2G071330蛋白及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1818

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctccacagtc cacaccccac ccccacccca aaaaaaactc agaatttgtc tagagtcgtc 60

gttgatatga ttcattgatt ctagctttct tcattcgttt attttttccc ctatagctag 120

ctgatgatcg aagacaacgt acaccagtgc atgcacgcag agaaattgtg aagaagatcc 180

gaagatactt accatgcaaa tgaaataaac gccataaact aacgatttat ccgatatata 240

tagatgatcc agattatatt tttgacgata tcctgatgat tggccgccga tctatgagac 300

ctgcattcta tcttctgaag cagatacttg aaataaacct cataaacgct ggcatcgtac 360

gctgcggaga tcgcggtgaa tgggtgacac attcccgtac acgcgcgcga ggagcgagtg 420

ccggcccgtc ccgtccctat ataaagggca cggactagca ccggcggggc gccgtcgatc 480

gacgcgtaca cctccacctc cgtccccgtc tctgtctctc caccgtaccg gcgcgcgcca 540

gcagtgccac cacctgatcc gcccggccag ctagctagct ccaccaccac tactctccac 600

atggaggcgc tgctcccgag gtccggcggc gtcatctcgc caaagatcag cacgatcctg 660

cagtcgcacg tgtacccgcg gttcggccgc gtgctgcgcg cgctcgcccg ggtcaagtcg 720

gcgctcctcg acgccctcgg caagaccaag tggggcgcgc ggcggcggaa gcagcacgcg 780

ccctccatcg cccgcggccg ccgctcgaag aagaggaaga gcagcaaggg cgaattttcg 840

aagaagccgc cgcacctcac ctggtccggc ggcctgtcgc cgcttcgagg cgcggccgtg 900

gatgcgctgg acgtggacta ccacgtgtac ccgtcctgtg actatgagtc ggtgtggaac 960

gcggtcgtcg tgcccgcggc gaccggtgag tactgtgggt acctgcgctg gctcgaggag 1020

gagatgccgg acgaggtggg ggtcgtggag gaggaggagg aggaggaggt ggaggaagac 1080

gacggcgtcg cctctggcgg cgggaacgag atcgaccggc tagcggagca gttcatcgcg 1140

aggtgtcgtg ccaacttctt gctggagaag caggagtcgt acgaccggcg tcaggagatg 1200

atcgccagga gcctctgaat ccgccatcgt cttcgtcgtc agggttgtta atcgtaatcg 1260

atgctttttt ttttccttct agctcttctt cccctacata gcactctgga gttggcgatg 1320

tcgagattga tcgatgaatg atgattatat agcatgcagt atacgtgaat tcattgtgca 1380

gccgctgtgg ctttcttgct gcaccctgac aacactgaag aatgctagct tcttcgatca 1440

gttcaacagg atttgttgga cgaccggcgt atgcttcgtt tgaaatgtct aaaggctccg 1500

tttggatgtc gatatacatt ggagagtgca tcaaattgaa ttaggtttga ttccaaatca 1560

accataggat tgaaatgaga tacaattaca attgtaatat ttggatgtca ttgtgactga 1620

tgaattccgg ttggcattgg agtccatttc tatttttcta attccaaatt ctaggacacc 1680

caaactgaac agctagatat tcgggatctc aatgccaatt cttaattcca aggctcaatg 1740

catacatcca aacggagtgt aagagatata agatctctag cgctagaaaa gatgtttgag 1800

ttgagtccaa aacaatcg 1818

<210> 2

<211> 205

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Ala Leu Leu Pro Arg Ser Gly Gly Val Ile Ser Pro Lys Ile

1 5 10 15

Ser Thr Ile Leu Gln Ser His Val Tyr Pro Arg Phe Gly Arg Val Leu

20 25 30

Arg Ala Leu Ala Arg Val Lys Ser Ala Leu Leu Asp Ala Leu Gly Lys

35 40 45

Thr Lys Trp Gly Ala Arg Arg Arg Lys Gln His Ala Pro Ser Ile Ala

50 55 60

Arg Gly Arg Arg Ser Lys Lys Arg Lys Ser Ser Lys Gly Glu Phe Ser

65 70 75 80

Lys Lys Pro Pro His Leu Thr Trp Ser Gly Gly Leu Ser Pro Leu Arg

85 90 95

Gly Ala Ala Val Asp Ala Leu Asp Val Asp Tyr His Val Tyr Pro Ser

100 105 110

Cys Asp Tyr Glu Ser Val Trp Asn Ala Val Val Val Pro Ala Ala Thr

115 120 125

Gly Glu Tyr Cys Gly Tyr Leu Arg Trp Leu Glu Glu Glu Met Pro Asp

130 135 140

Glu Val Gly Val Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Glu Asp

145 150 155 160

Asp Gly Val Ala Ser Gly Gly Gly Asn Glu Ile Asp Arg Leu Ala Glu

165 170 175

Gln Phe Ile Ala Arg Cys Arg Ala Asn Phe Leu Leu Glu Lys Gln Glu

180 185 190

Ser Tyr Asp Arg Arg Gln Glu Met Ile Ala Arg Ser Leu

195 200 205

Claims

1.一种培育干旱敏感单子叶植物的方法，其特征在于：包括促进或提高目的单子叶植物中GRMZM2G071330蛋白的核酸的表达，得到干旱敏感单子叶植物，所述目的单子叶植物为含有GRMZM2G071330蛋白的核酸的单子叶植物，所述干旱敏感单子叶植物的抗旱性低于所述目的单子叶植物的抗旱性；所述GRMZM2G071330蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.2所示。

2.GRMZM2G071330蛋白在培育干旱敏感单子叶植物中的应用，所述GRMZM2G071330蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

3.一种单子叶植物育种方法，包括如下步骤：增加目的单子叶植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，从而使目的单子叶植物对干旱敏感性增高。

4.如权利要求2所述的应用或如权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为玉米。